粘膜髄膜炎菌性ワクチン
本発明は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのうちの少なくとも二つに由来する莢膜サッカリドを含む粘膜性送達のための免疫原性組成物を提供する。本発明の組成物中の莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に結合されおよび／またはオリゴ糖であることが好ましい。結合体化オリゴ糖抗原が特に好ましい。本発明はまた、（ａ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃに由来する莢膜サッカリド抗原および（ｂ）キトサンアジュバントを含む免疫原性組成物も提供する。この組成物は好ましくは（ｃ）一以上のさらなる抗原および／または（ｄ）一以上のさらなるアジュバントを含む。この組成物は特に、鼻腔内送達を含む粘膜性送達に適している。キトサンおよび／または解毒化されたＡＤＰ−リボシル化毒素アジュバントの使用は、抗髄膜炎菌性粘膜性免疫応答を増強し、その応答のＴｈ１／Ｔｈ２の偏りを変化させ得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ワクチン、特に髄膜炎菌性の感染および疾患に対するワクチンの分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、グラム陰性のヒト病原菌であり［例えば、参考文献１の２８章を参照のこと］、これは細菌性髄膜炎を引き起こす。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅと密接に関連するが、髄膜炎菌と明確に区別する一つの特徴は、全ての病原性髄膜炎菌に存在する多糖類の莢膜の存在である。
【０００４】
生物体の莢膜多糖類に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１２個の血清群が、同定されている（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、２９Ｅ、Ｗ１３５、Ｘ、ＹおよびＺ）。Ａ群は、サハラ砂漠以南のアフリカにおける流行性疾患の最も一般的な原因である。血清群Ｂおよび血清群Ｃは、先進国における大部分の症例の原因であり、残りの症例は、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙによって引き起こされる。
【０００５】
分類のために用いられる上に、この莢膜多糖類は、ワクチン接種のために用いられている。血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｙおよび血清群Ｗ１３５に由来する莢膜多糖類の注射可能な四価のワクチンは、複数年の間公知であり［２、３］、ヒトへの使用が認可されている。青年期および成人において効果的であるが、乏しい免疫反応および短期間の保護を誘導し、幼児において使用され得ない［例えば、４］。このワクチンにおける多糖類は、非複合型であり、１：１：１：１の重量比率で存在する［５］。ＭＥＮＣＥＶＡＸ ＡＣＷＹＴＭおよびＭＥＮＯＭＵＮＥＴＭの両方は、凍結乾燥された形態から一度再編成され精製された多糖類の各々を５０μｇ含む。
【０００６】
複合化血清群Ｃのオリゴ糖は、ヒトへの使用が承認されている［例えば、ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭ、参考文献６］。しかし、血清群Ａ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに対する複合ワクチンならびにその製造における改善の要求が存在し続ける。この要求は、参考文献８に開示される産物、方法および使用によって対処されるが、さらなる改変および改良の余地が、特に送達ならびに処方に関して存在し続ける。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
本発明は、免疫原性組成物を提供し、この組成物は、（ａ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃに由来する莢膜サッカリド抗原、および（ｂ）キトサンアジュバントを含む。この組成物は好ましくは、（ｃ）一以上のさらなる抗原および／または（ｄ）一以上のさらなるアジュバントを含む。
【０００８】
本発明はまた、粘膜送達のための免疫原性組成物を提供し、この組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの少なくとも二つに由来する莢膜サッカリドを含む。
【０００９】
好ましくは、本発明の組成物におけるこの莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に複合体化され、および／またはオリゴ糖である。複合体化オリゴ糖抗原（図１）が特に好ましい。
【００１０】
（血清群Ｃの髄膜炎菌に由来する莢膜サッカリド抗原）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃの莢膜サッカリドは、抗原として広範に用いられている。例えば、ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭの活性構成要素は、ＣＲＭ１９７キャリアタンパク質に結合された莢膜多糖類のオリゴ糖フラグメントである。
【００１１】
本発明の組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃに由来する莢膜サッカリド抗原を含むため、莢膜多糖類のオリゴ糖フラグメントの使用および／またはキャリアタンパク質へのサッカリド抗原の結合が好ましい。特に好ましいＭｅｎＣサッカリド抗原は、参考文献６および参考文献９に開示される。
【００１２】
オリゴ糖生成および結合のさらなる詳細は、以下に提供される。
【００１３】
（サッカリド混合物）
本発明の組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの少なくとも二つ（すなわち２、３または４）に由来する莢膜サッカリドを含み得る。
【００１４】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの一よりも多い血清群に由来するサッカリドの混合物が好ましく、例えば、血清群Ａ＋Ｃ、血清群Ａ＋Ｗ１３５、血清群Ａ＋Ｙ、血清群Ｃ＋Ｗ１３５、血清群Ｃ＋Ｙ、血清群Ｗ１３５＋Ｙ、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｙ、血清群Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙなど由来のサッカリドを含む組成物が好ましい。好ましくは、個々のサッカリド抗原の保護効力は、これらを組み合わせることによって取り除かれないが、実際の免疫原性（例えば、ＥＬＩＳＡ力価）は減少され得る。
【００１５】
好ましい組成物は、血清群Ｃおよび血清群Ｙに由来するサッカリドを含む。他の好ましい組成物は、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに由来するサッカリドを含む。
【００１６】
混合物が、血清群Ａおよび血清群Ｃの両方に由来する莢膜サッカリドを含む場合、ＭｅｎＡサッカリド：ＭｅｎＣサッカリドの比率（ｗ／ｗ）は、１よりも大きくあり得る（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはこれ以上）。
【００１７】
混合物が、血清群Ｙならびに血清群Ｃおよび血清群Ｗ１３５のうちの一つまたは両方に由来する莢膜サッカリドを含む場合、ＭｅｎＹサッカリド：ＭｅｎＷ１３５サッカリドの比率（ｗ／ｗ）は、１よりも大きくあり得（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはこれ以上）および／またはＭｅｎＹサッカリド：ＭｅｎＣサッカリドの比率（ｗ／ｗ）は、１よりも小さくあり得る（例えば、１：２、１：３、１：４、１：５またはこれよりも小さい）。
【００１８】
血清群Ａ：血清群Ｃ：血清群Ｗ１３５：血清群Ｙに由来するサッカリドについての好ましい比率（ｗ／ｗ）は、１：１：１：１；１：１：１：２；２：１：１：１；４：２：１：１；８：４：２：１；４：２：１：２；８：４：１：２；４：２：２：１；２：２：１：１；４：４：２：１；２：２：１：２；４：４：１：２；および２：２：２：１である。
【００１９】
（莢膜多糖類の精製）
髄膜炎菌の莢膜多糖類は代表的に、多糖類の沈降（例えば、カチオン性界面活性剤を用いる）、エタノール分画、冷フェノール抽出（タンパク質を除去するため）および超遠心分離（ＬＰＳを除去するため）の工程を包含する方法によって調製される［例えば、参考文献１０］。
【００２０】
しかし、より好ましい方法［８］は、多糖類の沈降、続いて低級アルコールを用いて沈殿した多糖類を可溶化する工程を包含する。沈降は、例えばテトラブチルアンモニウム塩およびセチルトリメチルアンモニウム塩（例えば、臭化物塩）またはヘキサジメチレン（ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ）臭化物ならびにミリスチルトリメチルアンモニウム塩のようなカチオン性界面活性剤を用いて達成され得る。セチルトリメチルアンモニウム臭化物（「ＣＴＡＢ」）は、特に好ましい［１１］。沈殿物質の可溶化は、メタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオールなどのような低級アルコールを用いて達成され得るが、エタノールは特に、ＣＴＡＢ−多糖類の複合体を可溶化するのに適している。エタノールは好ましくは、沈殿した多糖類に添加され、５０％と９５％との間の最終エタノール濃度（エタノールと水との総含有量に基づく）を提供する。
【００２１】
再可溶化の後、多糖類をさらに処理し混入物を除去し得る。これは、たとえささいな混入物であっても容認できない状況（例えば、ヒトのワクチン産生のため）において特に重要である。これは代表的に、濾過（例えば、深層濾過、活性炭を通す濾過が用いられ得る、サイズ濾過および／または限外濾過）の一以上の工程を包含する。
【００２２】
混合物を除去するために一度濾過されると、この多糖類は、さらに処理および／または加工するために沈殿され得る。これは、カチオンを交換することによって容易に達成され得る（例えば、カルシウム塩またはナトリウム塩を添加することによって）。
【００２３】
多糖類は、化学的に改変され得る。例えば、改変され一以上のヒドロキシル基が保護基と置換され得る。これは特に血清群Ａに有用である［１２］。
【００２４】
（オリゴ糖）
莢膜サッカリドは一般に、オリゴ糖の形態である。これらは精製された莢膜多糖類の分解によって（例えば、加水分解、マイルドな酸または加熱によって）都合よく形成され、通常その後所望される大きさのフラグメントを精製する。
【００２５】
多糖類の分解は好ましくは、３０未満（例えば、１０と２０との間、好ましくは血清群Ａについておよそ１０；血清群Ｗ１３５および血清群Ｙについて１５と２５との間、好ましくはおよそ１５〜２０；血清群Ｃについて１２と２２との間など）のオリゴ糖の最終の平均の重合度（ＤＰ）を提供するように実施される。ＤＰは、イオン交換クロマトグラフィーまたは比色分析アッセイ［１３］によって都合よく測定され得る。
【００２６】
加水分解が実施された場合、加水分解物は一般に短い長さのオリゴ糖を除去するための大きさにされる。これは、イオン交換クロマトグラフィーが続く限外濾過のような種々の方法で達成され得る。約６以下の重合度を有するオリゴ糖は好ましくは、血清群Ａについて除去され、そしておよそ４未満のものは好ましくは、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙについて除去される。
【００２７】
（共有結合）
本発明の組成物中の莢膜サッカリドは普通キャリアタンパク質に結合される。一般に結合体は、サッカリドをＴ−非依存性抗原からＴ−依存性抗原へ変換するので、サッカリドの免疫原性を高め、従って免疫記憶のプライミングを可能とする。
【００２８】
結合体化は特に小児科のワクチンのために有用であり［例えば、参考文献１４］かつ周知の技術ある［例えば、参考文献１５〜２３などに概説される］。
【００２９】
好ましいキャリアタンパク質は、ジフテリアまたは破傷風類毒素のような細菌性毒素または類毒素である。ＣＲＭ１９７ジフテリア類毒素［２４、２５、２６］が特に好ましい。他の好ましいキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質［２７］、合成ペプチド［２８、２９］、ヒートショックタンパク質［３０、３１］、百日咳タンパク質［３２、３３］、サイトカイン［３４］、リンホカイン［３４］、ホルモン［３４］、成長因子［３４］、種々の病原体由来抗原に由来する多数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［３５］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに由来するタンパク質Ｄ［３６］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに由来する毒素ＡまたはＢ［３７］などが挙げられる。
【００３０】
本発明の組成物内において、一より多いキャリアタンパク質を使用することが可能である。従って、異なるキャリアタンパク質が、異なる血清群のために使用され得る（例えば、血清群Ａのサッカリドは、ＣＲＭ１９７に結合され得る一方、血清群Ｃのサッカリドは、破傷風類毒素に対して結合され得る。また特定のサッカリド抗原のために一以上のキャリアタンパク質が使用され得る（例えば、血清群Ａサッカリドは、二つの群にあり得、いくつかはＣＲＭ１９７に結合され、他は破傷風類毒素に対して結合される）。しかし、一般に全てのサッカリドについて同一のキャリアタンパク質を使用することが好ましい。
【００３１】
単一のキャリアタンパク質は、一より多いサッカリド抗原を保有し得る［３８］。例えば、単一のキャリアタンパク質は、血清群Ａおよび血清群Ｃに由来するサッカリドに対して結合されている。
【００３２】
０．５：１（すなわち、過剰のタンパク質）と５：１（すなわち過剰のサッカリド）との間のサッカリドを有する結合体：タンパク質の比率（ｗ／ｗ）が好ましく、１：１．２５と１：２．５との間の比率を有するものがより好ましい。
【００３３】
結合体は、キャリアタンパク質を有さない結合体に使用され得る［３９］。
【００３４】
任意の適切な結合反応が使用され得、必要な場合、任意の適切なリンカーを用いて使用され得る。
【００３５】
サッカリドは代表的に、結合前に活性化または機能化される。活性化は例えば、ＣＤＡＰのようなシアン化試薬（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸塩［４０、４１など］）を含み得る。他の適切な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボレン（ｎｏｒｂｏｒａｎｅ）、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する。（参考文献２１の序論をまた参照のこと）
リンカー基を介する結合は、任意の公知の方法、例えば、参考文献４２および参考文献４３に記載される手順を用いてなされ得える。結合の一つの型は、多糖類の還元性のアミノ化、アジピン酸リンカー基の一末端とのアミノ基を生じる結合、および次いでアジピン酸リンカー基のもう一方の末端へのタンパク質の結合を含む［１９、４４、４５］。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド［４６］、ニトロフェニル−エチルアミン［４７］、ハロアシルハロゲン化物［４８］、グルコシド結合［４９］、６−アミノカプロン酸［５０］、ＡＤＨ［５１］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［５２］などが挙げられる。選択的にリンカーを使用する場合、直接的な結合が使用され得る。タンパク質に対する直接的な結合は、例えば、参考文献５３および５４に記載されるような、タンパク質の還元性のアミノ化が続く多糖類の酸化を含み得る。
【００３６】
アジピンジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドドジエステル）を用いた誘導体化およびキャリアタンパク質との反応が続く、サッカリドへのアミノ基の導入を包含するプロセス（例えば、末端の＝Ｏ基を−ＮＨ２と置換することによる）が、好ましい。
【００３７】
結合の後、遊離サッカリドおよび結合体化サッカリドが、分離され得る。疎水性クロマトグラフィー、接線限外濾過、ダイアフィルトレーションなどを含む多数の適切な方法が存在する［参考文献５５および参考文献５６などをまた参照のこと］。
【００３８】
本発明の組成物が、結合体化オリゴ糖を含む場合、オリゴ糖の調製は、結合よりも前に行われることが好ましい。
【００３９】
（本発明の組成物の調製）
本発明の組成物が、一より多い型の莢膜サッカリドを含む場合、これらは別々に調製されることが好ましく（任意の分解、結合などを含む）、次いで混合され本発明の組成物を提供する。
【００４０】
しかし、この組成物が、血清群Ａに由来する莢膜サッカリドを含む場合、血清群Ａのサッカリドは、加水分解の可能性を最小化するために、使用直前まで他のサッカリドと混合されないことが好ましい。これは、凍結乾燥された形態の血清群Ａの構成要素および液状形態の他の血清群の構成要素とを有することによって容易に達成され得、使用の準備が整った場合、液状構成要素が使用され凍結乾燥された構成要素を再編成する。
【００４１】
このように本発明の組成物は、キットから調製され得、このキットは、（ａ）凍結乾燥された形態のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａに由来する莢膜サッカリド、ならびに（ｂ）液状形態の、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの一以上（例えば、１、２、３）に由来する莢膜サッカリドを備える。本発明はまた、本発明の組成物を調製するための方法を提供し、この方法は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａに由来する凍結乾燥された莢膜サッカリドとＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの一以上（例えば、１、２、３）に由来する莢膜サッカリドとを混合する工程を包含し、この一以上のサッカリドは、液状形態である。
【００４２】
本発明はまた、本発明の組成物を提供し、この組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに由来する莢膜サッカリドを含み、このサッカリドは、液状形態である。この組成物は、再編成のために凍結乾燥された血清群Ａのサッカリド抗原と共にパッケージングされ得るか、または例えば、血清群Ａに対する免疫化は、所望されない場合そのままで組成物として使用され得る。
【００４３】
（本発明の組成物の調製）
本発明の組成物は、種々の方法で提示されかつパッケージングされ得る。
【００４４】
組成物が、注射用である場合、これらは、バイアル中に提示され得るか、またはシリンジに予め充填されて提示され得る。このシリンジは、針を伴って供給されても、針を伴わずに供給されても良い。シリンジは、組成物の単一用量を含み、ここでバイアルは、単一用量または複数回の用量を含み得る。注射用の組成物は一般に、溶液または懸濁液である。あるいは、注射前に液状ビヒクル中に溶解または懸濁するための固体形態で提示され得る。
【００４５】
本発明の組成物が、使用の前に即座に調製され（例えば、血清群Ａのサッカリドが、凍結乾燥された形態で提示される）、そしてキットとして提示される場合、このキットは、二つのバイアルを含み得、または一つは予め充填されたシリンジおよび一つのバイアルとを含み得、そのシリンジの内容物は、注射前にバイアルの内容物を再活性化させるために使用される。
【００４６】
しかし、好ましい組成物は、粘膜送達用である。種々の粘膜送達の選択肢が利用可能であり、既に大量に生産されている比較的単純なデバイスを用いて容易なアクセスを提供するので鼻腔内経路が、最も実用的である。このように本発明の組成物は好ましくは、鼻内噴霧、点鼻薬、ゲルまたは散剤のような鼻腔内投与のために適合され、そして／またはパッケージングされる［例えば、参考文献５７および参考文献５８］。
【００４７】
この組成物の粘膜送達のための選択的な経路は、経口、胃内、肺内、腸内、経皮、直腸、眼内および膣内の経路である。このように本発明の組成物は、粘膜投与に対して適合されそして／またはパッケージングされ得る［例えば、参考文献５９、参考文献６０および参考文献６１を参照のこと］。この組成物が、経口投与用である場合、例えば、錠剤またはカプセル（必要に応じて腸溶性コートされる）、液体、遺伝子組換え植物の物質、点滴薬、吸入器、エアロゾル、腸溶性コート、坐薬、膣坐薬などの形態であり得る［また参考文献６２および参考文献７３の１７章を参照のこと］。
【００４８】
どのような送達経路であれ、本発明の組成物は好ましくは、単位用量形態にパッケージングされる。効果的な用量は、慣用的に確立され得る。注射または鼻腔内用途のための組成物の代表的なヒト用量は、０．１ｍｌ〜０．５ｍｌとの間の容量を有する（例えば、一つの鼻孔あたり１００μｌづつ２回のスプレーする）。
【００４９】
各用量内において、個々のサッカリド抗原の量は一般に、１μｇ〜５０μｇの間であり（サッカリドの質量として測定される）、それぞれ約１０μｇが好ましい。
【００５０】
本発明の組成物は、好ましくは無菌である。この組成物は好ましくは、発熱物質なしである。この組成物は好ましくは、例えば、ｐＨ ６とｐＨ ８との間に緩衝され、一般的に約ｐＨ ７である。組成物が、水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジン緩衝液を用いることが好ましい［６３］。
【００５１】
（アジュバント）
この組成物は一般に、一以上のアジュバントを含む。このアジュバントは、混合され本発明の組成物を形成する前および／または後にサッカリドに添加され得るが、異なるサッカリドと混合する前にサッカリド抗原とアジュバントとを混合することが好ましい。
【００５２】
しかし、各サッカリドが、このような混合の前にアジュバント化されなければならないという必要はない。さらなる非アジュバント化サッカリド抗原が添加される場合、過剰なアジュバントは、一つのサッカリド調製物に含まれ得、その結果この過剰量は所望される終濃度まで希釈される。一つの特定の実施形態において、本発明の組成物が、凍結乾燥された抗原（例えば、凍結乾燥された血清群Ａの構成要素）から調製される場合、これは凍結乾燥された物質中にアジュバントを含まないことが好ましくあり得る。
【００５３】
粘膜送達のために、粘膜アジュバントを用いることが好ましい。粘膜アジュバントとしては、（Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン（「ＬＴ」）、もしくはその解毒化変異体［例えば、参考文献６４の５章］；（Ｂ）コレラ毒素（「ＣＴ」）、もしくはその解毒化変異体［例えば、参考文献６４の５章］；または（Ｃ）生体分解可能かつ無毒性の物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、多無水物、ポリカプロラクトンなど（ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）などのような））から形成される微粒子（すなわち直径約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍの粒子、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、および最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍ）であり、必要に応じて負電荷を帯びた表面（例えば、ＳＤＳを有する）もしくは正電荷を帯びた表面（例えば、ＣＴＡＢのようなカチオン性界面活性剤を有する）を有するように処理される；（Ｄ）ポリオキシエチレンエーテルもしくはポリオキシエチレンエステル［６５］；（Ｅ）オクトキシノール［６６］もしくはポリオキシエチレンアルキルエーテルとの組合せにおけるポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤またはオクトキシノール［６７］のような少なくとも一つのさらなる非イオン性界面活性剤との組合せにおけるエステル界面活性剤；（Ｆ）キトサン［例えば、６８］；（Ｇ）免疫賦活性のオリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびサポニン［６９］；（Ｈ）リポソーム［参考文献７３の１３章および１４章］；（Ｉ）アミノアルキルグルコサミニドリン酸塩誘導体（例えば、ＲＣ−５２９）のようなモノホスホリル脂質Ａ模倣物［７０］；（Ｊ）ポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）（ＰＣＰＰ）；（Ｋ）エステル化ヒアルロン酸微粒子［７２］のような生体接着剤（７１）もしくはポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体からなる群より選択された粘膜付着性物質が挙げられるが、これらに限定されない。他の粘膜アジュバントはまた、利用され得る［例えば、参考文献７３の７章を参照のこと］。
【００５４】
上に提供される粘膜アジュバントに加えて、本発明の組成物は、以下の群：（Ａ）水酸化アルミニウム（オキシ水酸化物を含む）のようなアルミニウム塩（ミョウバン）、リン酸アルミニウム（ヒドロキシホスフェート（ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含む）、硫酸アルミニウムなど［参考文献７３の８章および９章］；（Ｂ）油中水エマルジョン処方物（ムラミルペプチド［ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥなどを含む］または細菌の細胞壁の構成要素のような他の特定の免疫賦活性因子を伴うかまたは伴わない）、例えば、（ａ）ＭＦ５９ＴＭ［参考文献７３；７４、７５の１０章］であって、５％スクアレン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ ８５を含有し（必要に応じてＭＴＰ−ＰＥを含有する）、マイクロフリューダイザーを用いて１ミクロン未満の粒子へ処方される、（ｂ）ＳＡＦであって、１０％スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％プロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、１ミクロン未満のエマルジョンへマイクロ流動化されるかまたはより大きな粒子サイズのエマルジョンを生じるためにボルテックスされる、ならびに（ｃ）ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）であって、２％スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、およびモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）からなる群に由来する一以上の細菌性の細胞壁の構成要素を含有する；（Ｃ）ＱＳ２１またはＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）のようなサポニンアジュバント［参考文献７３の２２章］であって、単純な形態またはＩＳＣＯＭ（免疫賦活性複合体；参考文献７３の２３章）のようにそこから生じた粒子の形態のいずれかであり、このＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を欠いたものであり得る（例えば、参考文献７６）；（Ｄ）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（Ｅ）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［７７］など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのようなサイトカイン、（Ｆ）モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、参考文献７８および７９）であって、肺炎球菌のサッカリド（例えば、参考文献８０）と一緒に用いる場合、必要に応じてミョウバンを実質的に含まない；（Ｇ）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または油中水エマルジョン（例えば、参考文献８１、参考文献８２および参考文献８３）との組合せ；（Ｈ）ＣｐＧモチーフ（すなわち、少なくとも一つのＣＧジヌクレオチドを含有する）を含むオリゴヌクレオチドであって、必要に応じてシトシンの代わりに５−メチルシトシンが用いられる；（Ｉ）免疫賦活剤および金属塩の粒子（例えば、参考文献８４）；（Ｊ）サポニンおよび油中水エマルジョン（例えば、参考文献８５）；（Ｋ）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて、＋ステロール）（例えば、参考文献８６）；（Ｌ）二本鎖ＲＮＡ；（Ｍ）組成物の効果を増強するために免疫腑活性因子として作用する他の物質［例えば、参考文献７３の７章］から選択される一以上のさらなるアジュバントを含有し得る。
【００５５】
リン酸アルミニウムが使用される場合、一以上のサッカリドをこのアルミニウム塩へ吸着することが可能であるが、そのように吸着しないことが好ましく、そして溶液中にリン酸イオン（例えば、リン酸緩衝液の使用による）を含まないことによって有利に働く。水酸化アルミニウムが用いられる場合、サッカリドをこの塩に吸着させることが好ましい。アジュバントとしての水酸化アルミニウムの使用は、血清群Ａに由来するサッカリドについて好ましくあり得る。
【００５６】
好ましい粘膜アジュバントは、キトサン（トリメチルキトサンを含む）および細菌毒素（特にＬＴ）の解毒された変異物である。これらは、単独で使用され得るか、または同時投与が、用いられる毒素の用量を減少させ、それによって安全性を改善するように、有利に組み合わせて用いられ得る。さらに、キトサン単独が、Ｔｈ２に偏向される反応を生じさせるのに対して、ＬＴＫ６３の添加は、Ｔｈ１に偏向される反応に対する変化を引き起こし得る。
【００５７】
（キトサン）
キトサンは、アジュバントとしての用途が公知であり［例えば、参考文献８７〜参考文献９８］、特に粘膜（例えば、鼻腔内）用途について公知である。キトサン（図１１）は、外骨格（ｅｘｏｓｋｅｌｅｔａｌ）ポリマーのキトサンのＮ−脱アセチル化誘導体であるが（図１２）、Ｎ−脱アセチル化はほとんど完了しない。脱アセチル化とは、キトサンと異なり、キトサンが、希釈した酢酸水溶液およびギ酸水溶液中に可溶であることを意味する。キトサンはまた、ワクチンのない製薬分野において広範な適用性が見出されている［９９］。
【００５８】
キトサンのグルコサミドモノマーの反復は、アミン基を含む。この基は、遊離アミン（−ＮＨ２）またはポリマーの溶解性に影響するプロトン化を伴ったカチオン性アミン（−ＮＨ３＋）として存在し得る。アミン基は、化学的に活性でありかつ置換され得る。本発明の特定の目的について、このアミン基は、一以上のアルキル基（「Ａ」例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルなど）で置換され得、例えば、−ＮＨＡ、−ＮＨ２Ａ＋、−ＮＡ１Ａ２、−ＮＨＡ１Ａ２＋、−ＮＡ１Ａ２Ａ３＋である。好ましい誘導体は、トリ−アルキル化であり、そして特に好ましい誘導体は、トリメチル化である（すなわち、トリメチルキトサン、または「ＴＭＣ」−図１３）。これらの誘導体は、より広いｐＨの範囲にわたって非改変のキトサンよりもより高い水溶性を有する。
【００５９】
キトサンポリマー中の全てのアミンが、この様に置換される必要は無い。キトサン鎖の長さに従った置換の程度は、１Ｈ−ＮＭＲによって決定され得、反応工程の数および時間によって制御され得る［１００］。少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはこれ以上）のモノマーが、置換アミンを有することが好ましい。
【００６０】
キトサン中の１００％のモノマーが、アルキル化アミンを保有することが稀であることの２つの主な理由が存在する。第一に、置換反応は、通常１００％の効率ではない。第二に、１００％のモノマー単位がアミン基を保有しているキトサンを見出すことは稀であり、それはキトサンの脱アセチル化が通常１００％の効率ではないためである。従って本発明に用いられるアルキル化キトサン誘導体は、いくつかのモノマー単位にアミド基および／または非アルキル化基を有し、そしてキトサンは、いくつかのアミド基を保有し得る。本発明と共に用いられるキトサンおよび誘導体は好ましくは、少なくとも７５％脱アセチル化されている。
【００６１】
キトサンは、種々の分子量があり、例えば、分子量およそ５，０００〜１０，０００を有するオリゴ糖から高分子量（例えば、６００，０００〜１，０００，０００）のポリマーがある。
【００６２】
カチオン性キトサンまたは誘導体が使用される場合、塩、例えば塩化物または乳酸塩の形態である。
【００６３】
キトサンまたは誘導体は、種々の物理学的な形態、例えば、溶液中粉末として、または粒子形態を取り得る。粒子形態（微粒子を含む）は、好ましく、交差結合または非交差結合されていなくてもよく、かつ噴霧乾燥によって好都合に形成され得る［１０１、１０２］。他の物理学的な形態としては、ゲル、ビーズ、フィルム、スポンジ、ファイバー、エマルジョンなどが挙げられる。
【００６４】
本発明の組成物、プロセス、方法および使用をいうために用いられた場合、用語「キトサン」は、キトサンのこれら全ての形態ならびに誘導体を含む。
【００６５】
（解毒化された変異毒素）
ＮＡＤ＋から標的タンパク質へのＡＤＰ−リボース単位の移動を触媒するＡＤＰ−リボシル化細菌性外毒素は、広く知られている。例としては、ジフテリア毒素（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、外毒素Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、コレラ毒素（ＣＴ；Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ；Ｅ．ｃｏｌｉ）および百日咳毒素（ＰＴ）が挙げられる。さらなる例は、参考文献１０３および参考文献１０４にある。
【００６６】
この毒素は代表的に、機能的に異なるドメイン−ＡおよびＢの二つに分けられる。Ａサブユニットは、毒素の酵素活性を担い、一方Ｂサブユニットは、細胞性結合を担う。このサブユニットは、同一のポリペプチド鎖上のドメインであり得るか、または別々のポリペプチド鎖であり得る。このサブユニットは、それ自体がオリゴマーであり得、例えば、ＣＴのＡサブユニットは、Ａ１およびＡ２から構成され、これらはジスルフィド結合によって結合され、そしてそのＢサブユニットは、ホモペンタマーである。代表的に、標的細胞との最初の接触は、Ｂサブユニットによって媒介され、次いでサブユニットＡのみが、細胞へ入る。
【００６７】
この毒素は代表的に、免疫原性であるが、ワクチンにこれらを含めることは、それらの毒性によって阻害される。免疫原性までも除去されることなく毒性を除去するために、この毒素は、グルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドのような化学薬品を用いて処理されている。さらに合理的なアプローチは、重要な活性部位の残基の部位特異的変異誘発に依存して、免疫原性を保持しながら毒素の酵素活性を除去する［例えば、参考文献１０５（ＣＴおよびＬＴ）、１０６（ＰＴ）、６４など］。現在の無細胞性の百日咳ワクチンは、二つのアミノ酸置換（Ａｒｇ９→ＬｙｓおよびＧｌｕ１２９→Ｇｌｙ；「ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ」［１０７］）を伴う百日咳毒素の形態を含む。
【００６８】
これらの免疫原性の特性と同様に、この毒素は、アジュバントとして用いられている。非経口的なアジュバント活性は初めに１９７２年［１０８］に観察され、そして粘膜アジュバント活性は、１９８４［１０９］に観察された。驚くべきことに、この毒素の解毒化形態は、アジュバント活性を保持していることが１９９３年に見出された［１１０］。
【００６９】
本発明の組成物は、解毒化されたＡＤＰ−リボシル化毒素を含む。この毒素は、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａまたは百日咳毒素であり得るが、好ましくはコレラ毒素（ＣＴ）またはより好ましくはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）である。用いられ得る他の毒素は、参考文献１０４（その中で配列番号１〜７、およびその変異体）に開示されるものである。
【００７０】
免疫原性および／またはアジュバント活性を損なうことのないこれら毒素の解毒化は、任意の適切な方法によって達成され得、変異誘発が好ましい。変異誘発は、一以上の置換、欠失、および／または挿入を含み得る。
【００７１】
好ましい解毒化変異は、Ａｒｇ−７残基での変異（例えば、Ｌｙｓ置換）を有するＬＴ；Ａｒｇ−７残基での変異（例えば、Ｌｙｓ置換）を有するＣＴ；Ａｒｇ−１１残基での変異（例えば、Ｌｙｓ置換）を有するＣＴ；Ｖａｌ−５３での変異を有するＬＴ；Ｖａｌ−５３での変異を有するＣＴ；Ｓｅｒ−６１残基での変異（例えば、Ｐｈｅ置換）を有するＣＴ；Ｓｅｒ−６３残基での変異（例えば、ＬｙｓまたはＴｙｒ置換）を有するＬＴ［例えば、参考文献６４〜Ｋ６３の５章；参考文献１１１−Ｙ６３）；Ｓｅｒ−６３残基での変異（例えば、ＬｙｓまたはＴｙｒ置換）を有するＣＴ；Ａｌａ−７２残基での変異（例えば、Ａｒｇ置換）を有するＬＴ［１１２−Ｒ７２］；Ｖａｌ−９７での変異を有するＬＴ；Ｖａｌ−９７での変異を有するＣＴ；Ｔｙｒ−１０４での変異を有するＬＴ；Ｔｙｒ−１０４での変異を有するＣＴ；Ｐｒｏ−１０６残基での変異（例えば、Ｓｅｒ置換）を有するＬＴ；Ｐｒｏ−１０６残基での変異（例えば、Ｓｅｒ置換）を有するＣＴ；Ｇｌｕ−１１２での変異（例えば、Ｌｙｓ置換）を有するＬＴ；Ｇｌｕ−１１２での変異（例えば、Ｌｙｓ置換）を有するＣＴ；Ａｒｇ−１９２残基での変異（例えば、Ｇｌｙ置換）を有するＬＴ；Ａｒｇ−９残基での変異（例えば、Ｌｙｓ置換）を有するＰＴ；Ｇｌｕ−１２９での変異（例えば、Ｇｌｙ置換）を有するＰＴ；および参考文献１０５に開示されるいずれかの変異体である。
【００７２】
これら変異は、例えば、ＰＴまたはＬＴにおけるＡｒｇ−９−Ｌｙｓ＋Ｇｌｕ−１２９−ＧｌｙとＤ５３およびＫ６３変異の両方との組合せなどであり得る。
【００７３】
６３残基または７２残基での変異を有するＬＴは、好ましい解毒化された毒素である。ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の毒素が特に好ましい［１１３］。
【００７４】
これら残基の番号付けは、原型の配列に基づくことが理解され、例えば、Ｓｅｒ−６３は実際には、所定のＬＴ改変体の第６３番目のアミノ酸でなくても良いが、アミノ酸配列のアライメントは、Ｓｅｒ−６３に対応する位置を示すことが理解される。
【００７５】
解毒化された毒素は、アジュバント活性に適するようにＡサブユニットおよび／またはＢサブユニットの形態であり得る。
【００７６】
（組成物のさらなる構成要素）
髄膜炎菌性のサッカリド抗原に加えて、本発明の組成物は、髄膜炎菌性のタンパク質抗原を含み得る。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ［例えば、参考文献１１４〜１１９など］またはＯＭＶ調製物［例えば、参考文献１２０〜１２３など］に由来するタンパク質を含むことが好ましい。
【００７７】
非髄膜炎菌性抗原および非ナイセリア抗原（好ましくは髄膜炎菌性の構成要素に対する免疫反応を減少させないもの）もまた、含まれ得る。例えば、参考文献１２４は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂおよび血清群Ｃに由来するオリゴ糖と一緒にＨｉｂサッカリドとの組合せを開示する。肺炎球菌、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、ジフテリア、破傷風、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、ポリオおよび／またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅが好ましい。特に好ましくは、非ナイセリア抗原は、以下：
−ＣａｇＡ［１２５〜１２８］、ＶａｃＡ［１２９、１３０］、ＮＡＰ［１３１、１３２、１３３］、ＨｏｐＸ［例えば、１３４］、ＨｏｐＹ［例えば、１３４］および／またはウレアーゼのようなＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに由来する抗原
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来するサッカリドまたはタンパク質抗原［例えば、１３５、１３６、１３７］
−不活化ウィルスのようなＡ型肝炎ウィルスに由来する抗原［例えば、１３８、１３９］
−表面抗原および／またはコア抗原のようなＢ型肝炎ウィルスに由来する抗原であって［例えば、１３９、１４０］、好ましくは表面抗原はリン酸アルミニウムへ吸着される［１４１］
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂに由来するサッカリド抗原であって［例えば、９］、好ましくは、リン酸アルミニウムへ吸着されないか、または吸着される［１４２］
−Ｃ型肝炎ウィルスに由来する抗原［例えば、１４３］
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに由来する抗原［例えば、１１４〜１１７］
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する抗原［例えば、参考文献１４４〜１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０］
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに由来する抗原［例えば、１５１］
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来する抗原［例えば、１５２］
−ＩＰＶのようなポリオ抗原［例えば、１５３、１５４］
−凍結乾燥された不活化ウィルス［例えば、１５６、ＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ］のような狂犬病の抗原［例えば、１５５］
−はしか、おたふくかぜおよび／または風疹の抗原［例えば、参考文献１の１２章、１３章および１７章］
−赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質のようなインフルエンザ抗原［例えば参考文献１の２１章］
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに由来する抗原［例えば、１５７］
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）に由来する抗原［例えば、１５８、１５９］
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）に由来する抗原［例えば、１５９、１６０、１６１］
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに由来する抗原［例えば、１６２］
−呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ［１６３、１６４］）および／またはパラインフルエンザウィルス（ＰＩＶ３［１６５］）のようなパラミクソウィルスに由来する抗原
−Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓに由来する抗原［例えば、１６６、１６７、１６８］
−黄熱病ウィルス、日本脳炎ウィルス、テング熱ウィルスの四つの血清型、ダニ媒介性脳炎ウィルス、西ナイルウィルスのようなフラビファミリー（フラビウィルス属）のウィルスに由来する抗原
−古典的なブタの発熱ウィルス、ウシのウィルス性下痢ウィルス、および／またはボーダー病ウィルスに由来するようなペスチウィルス
−例えば、パルボウィルスＢ１９に由来するパルボウィルス抗原
−破傷風トキソイド［例えば、参考文献１の１８章］
−Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、必要に応じてまたパートアクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）ならびに／または凝集原２および凝集原３との組合せに由来する百日咳ホロトキシン（ＰＴ）および糸状の赤血球凝集素（ＦＨＡ）［例えば、参考文献１６９および１７０］
−細胞性百日咳抗原
を、含む。
【００７８】
この混合物は、一以上のこれらのさらなる抗原を含み得、これらは必要な場合には解毒化され得る（例えば、化学的手段および／または遺伝的手段による百日咳毒素の解毒化）。
【００７９】
ジフテリア抗原が、この混合物中に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原もまた含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が、含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原もまた含まれることが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含むことが好ましい。
【００８０】
混合物中の抗原は代表的に、少なくとも各１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般に、いずれかの所定の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫反応を誘発するのに十分である。
【００８１】
本発明の組成物と一緒に（１）髄膜炎菌性サッカリド、（２）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する免疫反応を誘導する抗原、および（３）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫反応を誘導する抗原の三つ全てを含まないことが好ましくあり得る。しかし、これら三つの抗原が同一の組成物中に含まれる場合、この組成物は、アジュバントとしてキトサンのアルキル化誘導体（例えば、トリメチルキトサン）を含むことが好ましい。
【００８２】
混合物中にタンパク質抗原を用いることの代替として、抗原をコードする核酸が用いられ得る。従って混合物のタンパク質の構成要素は、タンパク質をコードする核酸（好ましくは、例えばプラスミド形態のＤＮＡ）によって置換され得る。同様に、本発明の組成物は、サッカリド抗原（例えば、ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）［１７１］または抗イデオタイプ抗体を模倣するタンパク質を含み得る。これらは個々のサッカリド構成要素を置換し得るか、またはこれらを補充し得る。例としては、このワクチンは、サッカリド自体の代わりにＭｅｎＣ［１７２］莢膜多糖類またはＭｅｎＡ［１７３］莢膜多糖類のペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｉｃ）を含み得る。
【００８３】
本発明の組成物は、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０のようなＴｗｅｅｎ）を低レベル（例えば、０．０１％未満）で含み得る。本発明の組成物は、糖アルコール（例えば、マンニトール）またはトレハロースを例えば、およそ１５ｍｇ／ｍｌで含み得る（特に、これらが凍結乾燥されている場合、または凍結乾燥された物資から再構成される物質を含む場合）。
【００８４】
（免疫原性）
本発明の組成物は、免疫原性である。好ましい免疫原性組成物は、ワクチンである。本発明によるワクチンは予防的（すなわち、感染を防ぐため）または治療的（すなわち、感染後に疾患を処置するため）のいずれかであり得るが、代表的に予防的である。
【００８５】
本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、髄膜炎菌のサッカリドに加えて、代表的に「薬学的に受容可能なキャリア」を含む。薬学的に受容可能なキャリアは、それ自体が組成物を受容する個体に有害な抗体の産生を誘導しない任意のキャリアを含む。適切なキャリアは代表的に大きく、ゆっくりと代謝される高分子であり、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体のアミノ酸、アミノ酸コポリマー、トレハロース［１７４］、脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）および不活化ウィルス粒子である。このようなキャリアは、当業者に周知である。このワクチンはまた、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロールなど）も含み得る。さらに、補助的な物質（保湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）も存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤の詳細な考察は、参考文献１７５に利用可能である。
【００８６】
ワクチンとして用いられる免疫原性組成物は、免疫学的有効量のサッカリド抗原、および必要とされる場合、上記のいずれか他の構成要素を含む。「免疫学的有効量」によって、単一用量または一連の一部としてのいずれかにおいて、個体に対する量が、処置または予防について有効であることを意味する。この量は処置されるべき個体の健康状態および物理的状態、年齢、処置されるべき個体の分類学的な群（例えば、ヒトではない霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望される保護の程度、ワクチンの処方、処置する医師による医学的状態の評価ならびに他の関連因子に依存して変化する。この量は、慣用的な試行により決定され得る比較的広い範囲であることが予期される。
【００８７】
本発明の組成物の免疫原性は、試験被験体に対してこれらを投与し、（１２月齢〜１６月齢の子供、または動物モデル［１７６］）、次いで血清の殺菌性抗体（ＳＢＡ）および抗莢膜ＩｇＧの総結合力および高結合力のＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）を含む標準的なパラメーターを決定することによって決定され得る。これらの免疫反応は一般に、組成物の投与後およそ４週間で決定され、組成物の投与前に決定された値と比較される。少なくとも４倍または８倍のＳＢＡ増加が好ましい。一よりも多い用量の組成物が、投与される場合、一回よりも多い投与後の判定がなされ得る。
【００８８】
（本発明の組成物の投与）
上記のように、本発明の組成物は、種々の経路（非経口的および粘膜を含む）によって投与され得る。非経口的投与の好ましい経路は、注射である。注射は、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内であり得る。大腿部への筋肉内投与が、好ましい。針の無い注射が用いられ得る。粘膜投与の好ましい経路は、鼻腔内である。経皮（Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）投与または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与もまた可能である（例えば、参考文献１７７を参照のこと）。
【００８９】
投与は、単一用量スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。最初の用量スケジュールに続いてブースター量スケジュールであり得る。初回刺激と追加免疫との間の適切な時期は、慣用的に決定され得る。
【００９０】
投与は一般に、動物に対するものであり、特にヒト被験体が、処置され得る。この組成物は特に、子供および十代の若者のワクチン接種に有用である。
【００９１】
（医療方法および使用）
本発明は、患者において免疫反応を惹起する方法を提供する。この方法は、本発明の組成物を患者に投与する行程を包含する。免疫反応は好ましくは、髄膜炎疾患に対して保護するものであり、体液性免疫反応および／または細胞性免疫反応を含み得る。この免疫反応および／または投与は好ましくは両方とも粘膜性である。
【００９２】
患者は好ましくは、子供である。さらに好ましい患者の部類としては、成人女性であり、特に出産適齢期の女性または妊娠女性である。本発明の組成物は、母体経路を介して子供を受動的に免疫することに特に適している。
【００９３】
本方法は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対して既に刺激されている患者において追加免疫反応を生じ得る。
【００９４】
本発明はまた、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの内の少なくとも二つに由来する莢膜サッカリドの使用を提供し、ここでこの莢膜サッカリドは、免疫反応を生じるための動物に対する鼻腔内送達のための医薬品の製造においてキャリアタンパク質に結合され、および／またはオリゴ糖である。本発明はまた、免疫反応を生じるための動物に対する鼻腔内送達のための医薬品の製造において、（１）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの少なくとも一つに由来する莢膜サッカリドであって、この莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に対して結合され、ならびに／またはオリゴ糖である莢膜サッカリド、そして（２）キトサンの使用も提供する。この使用はまた、（３）解毒化されたＡＤＰ−リボシル化毒素も含み得る。
【００９５】
これら医薬品は好ましくは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、髄膜炎、敗血症、淋病など）によって引き起こされる疾患の予防および／または処置のためのものである。これらは好ましくは、鼻腔内投与用である。これらは好ましくは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの少なくとも二つ（すなわち、２、３または４）に由来する莢膜サッカリドを含む。
【００９６】
（Ｔｈ１／Ｔｈ２偏り）
キトサン（その誘導体を含む）および抗原を含むワクチン組成物は、当該分野に公知である。キトサンは、Ｔｈ２に偏った免疫反応を生じる。これらワクチンへの解毒化されたＡＤＰ−リボシル化毒素アジュバント（例えば、ＬＴＫ６３のようなＬＴ変異物）の添加が、Ｔｈ１偏りを有するようにこの免疫反応を変化させ得ることが見出されている。従って本発明は、キトサンアジュバント、変異ＡＤＰ−リボシル化毒素および抗原を含むワクチンを提供し、このワクチン組成物は、被験体への投与後Ｔｈ１に偏った免疫反応を提供する。本発明はまた、キトサン含有ワクチンのＴｈ１／Ｔｈ２のバランスを変えるための方法も提供し、この方法は、このワクチンに解毒化されたＡＤＰ−リボシル化毒素を添加する工程を包含する。
【００９７】
（定義）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を意味し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみを含み得るか、または付加物を含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【００９８】
数値ｘに関連する用語「約」は、例えばｘ±１０％を意味する。
【００９９】
単語「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」は、「完全に（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ）」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に有さない」組成物は、Ｙを完全に有さなくてもよい。必要な場合、この単語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１００】
（発明を実施するための様式）
（髄膜炎菌性血清群Ｃワクチン［１８２］）
ＣＲＭ１９７髄膜炎菌Ｃオリゴ糖結合体［６、９］を、一用量あたり１μｇでＮ−トリメチル−キトサンクロリドアジュバント［１７８］および／またはＬＴ−Ｋ６３アジュバントを用いてマウスに鼻腔内投与した。ＴＭＣを、一用量あたり８μｇで使用し、１８．９％の代替品と共にエビの殻に由来するキトサン（「Ｃｈｉｔｏｃｌｅａｒ」Ｐｒｉｍｅｘ ｅｈｆ、Ｉｃｅｌａｎｄ）（９４．５％アセチル化）から調製した［１７９］。ＬＴ−Ｋ６３を、一用量あたり１μｇまたは０．１μｇで用いた。麻酔されていない雌性ＢＡＬＢ／ｃを、１０μｌ量の処方物（一鼻孔あたり５μｌ）を用いて０日、２１日、３５日目に鼻腔内免疫化した。血清サンプルを、各免疫化の前後に採取した。鼻孔の洗浄を、三度目の免疫化の後１０日間行った。ＭｅｎＣおよびＬＴに対して特異的なＩｇＧ抗体およびＩｇＡ抗体の力価を、ＥＬＩＳＡによって決定した［１８０］。コントロールのマウスに、水酸化アルミニウムアジュバント５００μｇを含む４００μｌ量を皮下的（ｓ．ｃ．）に与えた。全ての処方物を、ＬＴＫ６３粘膜アジュバントを、加えてもしくは加えずに、皮下免疫のためにＣＲＭ−ＭｅｎＣ結合体ワクチンとアジュバント、またはＴＭＣの粉末懸濁物とを混合することによって使用直前にｐＨ７．４のＰＢＳ中に調製した。
【０１０１】
血清サンプルを０日目、２０日目（ポスト−１）、３４日目（ポスト−２）、および４５日目（ポスト−３）に取り、この日にマウスを屠殺し、鼻の洗浄を行い、そして脾臓を取り除いた。鼻の洗浄を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含有する１ｍｌ ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を流しそして吸引することを繰り返すことによって実施した。
【０１０２】
血清および粘膜の抗ＭｅｎＣ−特異的ＩｇＧ抗体、抗−ＣＲＭ１９７−特異的ＩｇＧ抗体および抗−ＬＴＫ６３特異的ＩｇＧ抗体ならびに抗ＭｅｎＣ−特異的ＩｇＡ抗体、抗−ＣＲＭ１９７−特異的ＩｇＡ抗体および抗−ＬＴＫ６３特異的ＩｇＡ抗体の滴定を、以前に詳細に述べられたように［１８０〜１８２］、個々の血清サンプルについてＥＬＩＳＡによって実施した。抗体滴定を、両側スチューデント検定によって統計学的に比較した。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＣ群Ｃ１１系統に対する血清の殺菌活性を、補体の供給源として胎児ウサギ血清を用い、既に記載された標準的な方法［１１９、１８０］に従ってプールした血清サンプルについて滴定した。
【０１０３】
血清ＩｇＧ反応を、図１４に示す：（Ａ）ＥＬＩＳＡおよび（Ｂ）殺菌性（対数目盛）。図１５は、（Ａ）血清および（Ｂ）鼻の洗浄液におけるＩｇＡ力価を示す。図１６は、脾臓増殖アッセイの結果を示す。
【０１０４】
このデータは、ＴＭＣのみが、免疫原性を増強することを示し、またＬＴ−Ｋ６３アジュバントと共に同時投与した場合、ＴＭＣが免疫原性を増強することを示す。１μｇのＬＴ−Ｋ６３とＴＭＣとの混合物を受けているマウスは、皮下免疫によって得られるＩｇＧ力価に匹敵するＩｇＧ力価を得た。さらに、両方の用量の混合アジュバントは、皮下免疫と同等のまたは皮下免疫よりも良好な血清殺菌性抗体反応を生じた。皮下免疫は、鼻の洗浄液においてＭｅｎＣ−特異的ＩｇＡ反応を生じなかった。
【０１０５】
従って、ＴＭＣおよびＬＴＫ−６３は、ＭｅｎＣサッカリド抗原（単独または組合せのいずれか）について効果的な鼻腔内アジュバントである。有利なことには、ＬＴ−Ｋ６３へのＴＭＣの添加は、免疫原性の減少を伴うことなくＬＴ−Ｋ６３の用量を９０％減少させることが可能である。従って、ＴＭＣは、免疫原性の減少を伴うことなく潜在的な残留毒性を有する構成要素を減少させることが可能である。
【０１０６】
さらなる実験において、以下の九つの組成物を比較した。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
図２０に示すように、これらの結果は、最高の血清抗ＭｅｎＣ ＩｇＧ抗体力価が、ＬＴＫ６３変異体およびキトサンまたはＴＭＣの両方と一緒にＣＲＭ−ＭｅｎＣワクチンを用いて鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫されているマウスの群（第７群〜第９群）において得られたことを確認する。抗体の力価は、同一用量のワクチンを用いて皮下免疫化したマウスで見出された抗体力価に匹敵した（Ｐ＞０．０５）（皮下免疫したマウスにおいてのみ検出可能な抗体を誘導した、第一回の免疫化後の反応は除く）。１０μｇから５０μｇへのＴＭＣ用量の増加は、血清抗ＭｅｎＣ抗体反応の有意な増強を（ＴＭＣ １０μｇ［第４群］対ＴＭＣ ５０μｇ［第６群］についてＰ＜０．０１）、１μｇのＬＴＫ６３変異体のみを含むワクチンを用いて鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫したマウス（第３群）において観察されたレベルに匹敵するレベルまで誘導した。ワクチン処方物へ１μｇのＬＴＫ６３変異体を添加することによる抗ＭｅｎＣ抗体反応の有意な増強は、ＴＭＣの最小用量（１０μｇ）を受けているマウスの群において明白であった（第７群対第４群についてＰ＜０．０１）。アジュバントを加えたＣＲＭ−ＭｅｎＣワクチンを用いて鼻腔内免疫したマウスのみが、利用したアジュバント／ＴＭＣ用量に関係なく、ＭｅｎＣに対する検出可能な血清ＩｇＡ抗体を有したが、皮下（ｓ．ｃ．）免疫したマウスは有さなかった。最終的に、ＬＴＫ６３粘膜アジュバントおよびＴＭＣの両方の同時使用は、ＬＴＫ６３のみで誘導した殺菌性力価（１：４０００）、ＴＭＣのみで誘導した殺菌性力価（１：１，０００〜１：４，０００）、および皮下で与えられたワクチンのみで誘導した殺菌性力価（１：４，０００）よりもより高い殺菌性力価（１：１６，０００）を誘導した。
【０１０９】
同様の実験を、アジュバントとして非メチル化「Ｃｈｉｔｏｃｌｅａｒ」キトサンを用いて実施した。マウスに、同一の経路で、一用量あたり２．５μｇのサッカリドで同一の結合体抗原を与えたが、ＬＴ−Ｋ６３（１μｇ）および／またはキトサン（１０μｇまたは２０μｇ）を伴う。六つの群のマウスを使用した。
【０１１０】
【表２】
【０１１１】
図１７〜図１９に示すように、ミョウバンを用いた皮下投与と比べて、ＬＴ−Ｋ６３およびキトサンを用いた鼻腔内投与は、同等のＩｇＧ反応および血清殺菌性反応を生じ、鼻のＩｇＡ反応を生じた。
【０１１２】
（ＬＫＫ６３用量の減少）
補助剤としてのＴＭＣの使用が、全体的な粘膜免疫賦活作用を損失することなく、ＬＴＫ６３用量の減少を可能とするか否かについて調べるために、以下の組成物を試験した。
【０１１３】
【表３】
【０１１４】
図２１に示すように、一用量あたり１μｇでのＬＴＫ６３の強力な免疫賦活作用（第６群）は、この変異物を、０．１μｇまたは０．０５μｇ（第４群および第５群）の投薬量で用いた場合、劇的に低下する。ＬＴＫ６３変異体とＴＭＣとの同時使用は、血清抗ＭｅｎＣ抗体反応を完全に回復させた（第７群〜第９群）。
【０１１５】
殺菌性抗体反応は、限定的な用量のＬＴＫ６３変異体を用いて免疫されたマウスにおいてごく僅かであった（第４群および第５群）。しかし、ＬＴＫ６３を、ＴＭＣと同時投与した場合（第７群〜第９群）、ＣＲＭ−ＭｅｎＣ結合体ワクチンを皮下に受けたマウス（第１群）において見出される殺菌性抗体力価に匹敵するか、またはより高いレベルで殺菌性抗体力価は増加した。ＬＴＫ６３を加えたＣＲＭ−ＭｅｎＣワクチンと共にＴＭＣを用いて、または用いずに鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫したマウスは、鼻の洗浄液においてＭｅｎＣに対する検出可能なＩｇＡ抗体を有するが、皮下（ｓ．ｃ．）免疫したマウスは有さなかった。
【０１１６】
従って、ＴＭＣおよびＬＴＫ６３変異体の付加的な効果は、互いに限定された用量で非常に良好に効果を与え、その結果ＬＴＫ６３変異体の総量の使用は、ＴＭＣについての必要量を減少させ、そしてＴＭＣ総量の使用は、ＭｅｎＣに対する強力な抗体反応および防御抗体反応の誘導に必要なＬＴＫ６３変異体の量を限定する。実際に、非常に少量のＬＴＫ６３アジュバント（すなわち、０．１μｇまたは０．０５μｇ）で、ＣＲＭ−ＭｅｎＣ結合体ワクチンを、ＴＭＣと一緒に同時投与した場合、高殺菌性抗体力価が、誘導されたが、ＴＭＣが存在しない場合には誘導されなかった。これはまた、ＣＲＭキャリアおよびＬＴＫ６３自体に対する免疫反応の増強にも当てはまった（示さず）。
【０１１７】
これらのデータは、これらの分子の内因性粘膜免疫賦活作用が、適切な生体接着性物質と一緒に処方されることによって効率的に増強され得ることを明瞭に示す。従って、鼻腔内（ｉ．ｎ．）送達したワクチンの安全なプロフィールを、非毒性のＬＴ変異物およびＴＭＣの同時使用によってさらに増強されることが予測される。このデータは、髄膜炎菌性結合体ワクチンに対する保護免疫反応が、二つの適切な粘膜アジュバントの会合を用いる粘膜免疫によって改善され得ることを示す。特に、この保護免疫反応の質は、適切な用量の粘膜アジュバントに依存して改変され得る。
【０１１８】
（Ｔｈ１／Ｔｈ２偏り）
キトサンを用いて処方したＣＲＭ１９７を用いた鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫は、優先的に機能的Ｔｈ２型表現型に向かって免疫反応を誘導し［１８３、１８４］、その一方でＬＴ変異物、特に非毒性ＬＴＫ６３変異体は、Ｔｈ１／Ｔｈ０機能的表現型に向かう鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫の後、抗原特異的免疫反応に優先的に偏る［１８５〜１５７］。本発明の組成物のＴｈ１／Ｔｈ２のバランスを研究し、そしてＬＴＫ６３アジュバントまたはＴＭＣアジュバントの使用を、用いた用量に依存するＴｈ１型反応またはＴｈ２型反応を誘導するためにこれら二つの成分の性質を微細に調節することを見出した。
【０１１９】
マウスを、上記のように免疫化した。群は、以下を受けた。
【０１２０】
【表４】
【０１２１】
個々のマウスに由来する脾臓を、切除し、マウスの各群に由来する細胞を、一緒にプールし、１０％胎仔ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００Ｕペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびに５ｍＭ ２−メルカプト−エタノールを含有するＤＭＥＭ中に懸濁した。２×１０５細胞を、Ｕ底９６ウェルプレート中の２００μｌの培地に播種し、そして示したように異なる濃度でＣＲＭ−ＭｅｎＣ結合体を用いて５日間刺激した。細胞増殖を、培養を終了する前に１６時間、１ウェルあたり１μＣｉの３［Ｈ］−チミジンを添加することによって決定した。次いで細胞を、濾紙上に回収し、取り込まれた放射活性を、シンチレーションカウンターで測定した。
【０１２２】
最高濃度の抗原を用いて刺激した三連の細胞培養に由来する上清を、プールし、そしてラット抗マウスサイトカイン特異的モノクローナル抗体を用いてＩＦＮ−γおよびＩＬ−５のレベルを調べるためにＥＬＩＳＡによって試験した。手短に言えば、９６穴プレートを、０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液で希釈した適切な量の抗マウスＩＦＮ−γ抗体または抗マウスＩＬ−５抗体を用いてコートした。４℃で一晩のインキュベーション、洗浄および室温で２時間１％ ＢＳＡを用いてコートされていない部位の浸潤の後、上清を、ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。結合したサイトカインを、ビオチン化抗ＩＦＮ−γ抗体または抗ＩＬ−５抗体を用いて決定し、その後ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジンを３７℃で１時間添加した。結合した抗体を、ｏ−フェニレンジアミン基質を用いて示し、その後マイクロプレートＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍでプレートを読んだ。サイトカイン濃度は、組換えマウスＩＦＮ−γまたは組換えマウスＩＬ−５の既知の量を用いて作製された検量線生成によって決定した。
【０１２３】
図２２に示したように、ＬＴＫ６３のみを加えたＣＲＭ−ＭｅｎＣワクチンを用いた鼻腔内免疫は、最高用量で与えた場合（１μｇ、第６群）、ＩｇＧ１アイソタイプおよびＩｇＧ２ａアイソタイプの両方の抗ＭｅｎＣ ＩｇＧ抗体を誘導した。しかし、より少量の用量では（すなわち、０．１μｇおよび０．０５μｇ）、抗ＭｅｎＣ ＩｇＧ１は、検出可能であったが、低い力価では、ＩｇＧ２ａは、検出できなかった。ＴＭＣのみを用いた場合、抗ＭｅｎＣ ＩｇＧ１抗体のみが、検出可能であった。ＣＲＭ−ＭｅｎＣワクチンを伴うＬＴＫ６３変異体とＴＭＣとの同時投与は、抗ＭｅｎＣ ＩｇＧ１抗体の力価を増強する（第７群、第８群、および第９群対第３群についてｐ＜０．０５）だけでなく、特に少用量のＬＴＫ６３において（第７群および第８群）ＩｇＧ２ａ抗体を誘導した。予測したように、水酸化アルミニウムの存在下での皮下免疫は、ＩｇＧ２ａと比較した場合、ＭｅｎＣに対するＩｇＧ１のより高い力価を誘導し、重要なことに、鼻腔内ワクチンを受けているマウスにおいて決して検出されないＩｇＥも誘導した。全てのこれらのデータにより、Ｔｈ２反応をプライムし得るＴＭＣ様化合物の存在下においてすら、Ｔｈ１依存性抗原特異的ＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ２ａ）を誘導するＬＴＫ６３の性質が強く確認される。
【０１２４】
ＬＴＫ６３またはＴＭＣの存在下においてＣＲＭ−ＭｅｎＣワクチンによる鼻腔内免疫は、インビトロでの抗原による再刺激により特異的に増殖するＴ−細胞のプライミングを誘導した。さらに、マウスが、皮下に結合体ワクチンを受けているマウスにおいて観察されるレベルと同様かまたはより高いレベルでＬＴＫ６３およびＴＭＣの両方を伴うワクチンを受けている場合、この増殖反応は、増強した。
【０１２５】
図２３に示すように、ＴＭＣのみを加えたワクチンを用いた鼻腔内免疫は、ＩＬ−５とＩＦＮ−γとの両方の産生を誘導した。免疫化のために用いられたＴＭＣ量の増加は、ＩＦＮ−γの産生量を強く抑制したが、ＩＬ−５の産生量を抑制しなかった。ＴＭＣを伴うワクチン処方物へのＬＴＫ６３変異体（一用量あたり１μｇ）の添加は、細胞のＩＬ−５を産生する能力を劇的に抑制し、同時に、ＬＴＫ６３のみを加えたワクチンを用いて免疫化したマウスに由来する培養物の上清において検出可能であるのと同様に高レベルのＩＦＮ−γを誘導した。ＩＦＮ−γの産生を誘導するＬＴＫ６３の能力は、鼻腔内免疫のためにより少用量（０．１μｇまたは０．０５μｇ）を用いた場合、顕著に減少した（図２４）。ワクチン処方物へのＴＭＣの添加は、ＬＴＫ６３の最高用量（１μｇ）でのＩＦＮ−γ産生のパターンを変化させなかった；逆に、ＬＴＫ６３を、より少用量で与えた場合、ＩＬ−５の産生を有利にした。まとめると、これらのデータは、（ｉ）機能的Ｔｈ１型表現型に向かう免疫反応を偏らせるＬＴＫ６３の性質（主により高用量で）、（ｉｉ）機能的Ｔｈ２型免疫反応を促進するＴＭＣの性質、（ｉｉｉ）二つの成分の適切な用量および「混合」によりＴｈ１型免疫反応とＴｈ２型免疫反応との間のバランスを調節する可能性を示す。
【０１２６】
キトサンおよびＬＴＫ３６についてのＴｈ１／Ｔｈ２バランスのこれまでの研究は、固定した、高用量のＬＴＫ６３（１μｇ以上）またはキトサンを用いている。しかし、両成分の減少した用量を用いて、ＴＭＣおよびＬＴＫ６３によってプライムしたＴｈ２型反応およびＴｈ１型反応は、より容易に観察され得る。ＴＭＣおよびＬＴＫ６３の最低用量において、免疫反応の偏りは、ほとんど明らかでなかった。１μｇのＬＴＫ６３が、ＴＭＣの任意の用量を含有するワクチン処方物に添加された場合、免疫反応は、Ｔｈ１型反応に向かって一貫して偏らされ、ＩＦＮ−γの産生およびＩＬ−５産生の全体的な抑制を伴う。これらのデータは、ＴＭＣのＴｈ２に偏った（ＩＬ−５産生）反応をしのぐＬＴＫ６３の顕著なＴｈ１誘導の役割を強く示唆する。実際、ＩＬ−５の産生は、最低用量のＬＴＫ６３と一緒に最高用量のＴＭＣを受けている群においてのみ維持された。ＬＴＫ６３変異体の含有は、Ｔｈ１型免疫反応を有利にし、さもなければ単独で用いた鼻腔内のＴＭＣまたは皮下のミョウバンによってＴｈ２機能的表現型に向かって駆動されている。
【０１２７】
まとめると、このデータは、優先的なＴｈ１機能的表現型またはＴｈ２機能的表現型に向かう免疫反応の偏りは、ワクチン処方物に存在する特定の粘膜アジュバントによって駆動されるだけでなく、重要なことに、鼻腔内送達したワクチン処方物に存在する成分の各々の相対量によっても駆動される。従って、本保護免疫反応の特性を、適切な用量の粘膜アジュバントおよび送達系によって、保護に必要とされるエフェクターの機能に応じて、微細に調整し得る。
【０１２８】
（混合性ワクチン）
オリゴ糖結合体の混合性ＡＣＷＹ組成物を、参考文献８に記載される物質を用いて調製した。この組成物を、ＰＢＳを用いてｐＨ ７．４に緩衝した。結合体の各々の濃度は、以下であった。
【０１２９】
【表５】
【０１３０】
この組成物を、アジュバントを用いないかまたは以下の粘膜アジュバントのうちの一つを用いて、１０μｌの容量（一方の外鼻孔につき５μｌ）でマウスに鼻腔内投与した。
【０１３１】
【表６】
【０１３２】
比較のために、同一の抗原組成物を、水酸化アルミニウムアジュバントを用いて皮下に投与した。
【０１３３】
コントロールとして、ＭｅｎＣ結合体のみを、組合せの組成物におけるＭｅｎＣと同じ濃度で同一の経路によって、同一のアジュバントを用いて投与した。
【０１３４】
従って、１０個の群のマウスは、以下の組成物を受けた。
【０１３５】
【表７】
【０１３６】
実験の最初の組において、以下の３つの鼻腔内用量（ミョウバンについては皮下）の血清ＩｇＧレベルは、以下のとおりであって、ＧＭＴ（ＭＥＵ／ｍｌ）±標準偏差として表した（図２）：
【０１３７】
【表８】
【０１３８】
同一の動物を、胎児ウサギの補体存在下で血清殺菌性抗体について試験した。用いた株は、Ａ−Ｆ６１２４、Ｃ−Ｃ１１、Ｗ１３５−５５５４およびＹ−２４０５３９であった。
【０１３９】
結果は、以下のとおりであった（図３）：
【０１４０】
【表９】
【０１４１】
脾臓における細胞の増殖もまた、同一の１０群について試験した。ＭｅｎＡＣＷＹ抗原を受けた奇数の群についての結果を図４Ａに示し、ＭｅｎＣのみを受けた偶数の群は、図４Ｂである。
【０１４２】
実験の第二組において、マウスは、鼻腔内に２０μｌの以下のＡＣＷＹ組成物（各抗原として２μｇのサッカリド）を受けた（皮下にＡＣＷＹ組成物を受けた１群を除く）：
【０１４３】
【表１０】
【０１４４】
三回の免疫化後の血清ＩｇＧを、図５に示し、血清ＢＣＡを、図６に示し、そして細胞増殖を、図７Ａおよび図７Ｂに示す。
【０１４５】
同様の実験の第三組において、マウスは、鼻腔内に２０μｌの以下のＡＣＷＹ組成物（各抗原として２μｇのサッカリド）を受けた（皮下にＡＣＷＹ組成物を受けた第１群を除く）：
【０１４６】
【表１１】
【０１４７】
三回の免疫化後の血清ＩｇＧを、図８に示し、血清ＢＣＡを、図９に示し、そして細胞増殖を、図１０Ａおよび図１０Ｂに示す。
【０１４８】
従って、ＬＴＫ６３およびＴＭＣの両方、特にこれらの組み合わせは、髄膜炎菌の血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに対する混合性ワクチンの鼻腔内送達のための高度に効果的なアジュバントである。
【０１４９】
本発明は、例のみによって記載され、本発明の範囲内および精神内にある限り、改変がなされ得ると理解される。
【０１５０】
【数１】
【０１５１】
【数２】
【０１５２】
【数３】
【０１５３】
【数４】
【０１５４】
【数５】
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、オリゴ糖結合体の調製を例示する。
【図２】図２、図５および図８は、例に由来する血清ＩｇＧデータを示す。
【図３】図３、図６、および図９は、実施例に由来する血清ＢＣＡデータを示す。
【図４】図４、図７および図１０は、実施例に由来する脾臓の増殖データを示す。
【図５】図２、図５および図８は、実施例に由来する血清ＩｇＧデータを示す。
【図６】図３、図６、および図９は、実施例に由来する血清ＢＣＡデータを示す。
【図７】図４、図７および図１０は、実施例に由来する脾臓の増殖データを示す。
【図８】図２、図５および図８は、実施例に由来する血清ＩｇＧデータを示す。
【図９】図３、図６、および図９は、実施例に由来する血清ＢＣＡデータを示す。
【図１０】図４、図７および図１０は、実施例に由来する脾臓の増殖データを示す。
【図１１】図１１は、キトサンの繰り返し構造を示す。
【図１２】図１２は、キチンの繰り返し構造を示す。
【図１３】図１３は、トリメチルキトサンの繰り返し構造を示す。
【図１４】図１４は、ＴＭＣおよび／またはＬＴ−Ｋ６３を用いたＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価（１４Ａ）および殺菌性力価（１４Ｂ）を示す。
【図１５】図１５は、同一の実験についての血清（１５Ａ）および鼻の洗浄液（１５Ｂ）におけるＩｇＡ力価を示す。
【図１６】図１６は、ＣＲＭ１９７濃度（μｇ／ｍｌ）と共に変化する脾臓増殖アッセイの結果を示す。
【図１７】図１７は、キトサンアジュバントと共に三用量のＭｅｎＣ抗原を与えた後得られた血清ＩｇＧ力価を示す。
【図１８】図１８は、同一の実験についての鼻のＩｇＡ力価を示す。
【図１９】図１９は、同一の実験についての血清殺菌性抗体を示す。
【図２０】図２０および図２１は、第一回免疫後（ポスト−１）、第二回免疫後（ポスト−２）、および第三回免疫後（ポスト−３）のＥＬＩＳＡによって測定された血清抗ＭｅｎＣ ＩｇＧ抗体の力価（上；力価±ＳＤを意味する）を示し、三回の免疫後得られたプールサンプルにおいて試験された血清殺菌性抗体の力価（下）を示す。
【図２１】図２０および図２１は、第一回免疫後（ポスト−１）、第二回免疫後（ポスト−２）、および第三回免疫後（ポスト−３）のＥＬＩＳＡによって測定された血清抗ＭｅｎＣ ＩｇＧ抗体の力価（上；力価±ＳＤを意味する）を示し、三回の免疫後得られたプールサンプルにおいて試験された血清殺菌性抗体の力価（下）を示す。
【図２２】図２２は、三回の免疫後、ＥＬＩＳＡによるＭｅｎＣ−特異的ＩｇＧ１抗体力価、ＭｅｎＣ−特異的ＩｇＧ２ａ抗体力価およびＭｅｎＣ−特異的ＩｇＥ抗体力価を示す。各値は、平均力価±ＳＤを示す。
【図２３】図２３は、ＴＭＣを用いたＩＬ−５反応およびＩＦＮ−γ反応を示す。
【図２４】図２４は、ＬＴＫ６３を用いたＩＬ−５反応およびＩＦＮ−γ反応を示す。
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用される全ての文書は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ワクチン、特に髄膜炎菌性の感染および疾患に対するワクチンの分野にある。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、グラム陰性のヒト病原菌であり［例えば、参考文献１の２８章を参照のこと］、これは細菌性髄膜炎を引き起こす。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅと密接に関連するが、髄膜炎菌と明確に区別する一つの特徴は、全ての病原性髄膜炎菌に存在する多糖類の莢膜の存在である。
【０００４】
生物体の莢膜多糖類に基づいて、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの１２個の血清群が、同定されている（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、２９Ｅ、Ｗ１３５、Ｘ、ＹおよびＺ）。Ａ群は、サハラ砂漠以南のアフリカにおける流行性疾患の最も一般的な原因である。血清群Ｂおよび血清群Ｃは、先進国における大部分の症例の原因であり、残りの症例は、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙによって引き起こされる。
【０００５】
分類のために用いられる上に、この莢膜多糖類は、ワクチン接種のために用いられている。血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｙおよび血清群Ｗ１３５に由来する莢膜多糖類の注射可能な四価のワクチンは、複数年の間公知であり［２、３］、ヒトへの使用が認可されている。青年期および成人において効果的であるが、乏しい免疫反応および短期間の保護を誘導し、幼児において使用され得ない［例えば、４］。このワクチンにおける多糖類は、非複合型であり、１：１：１：１の重量比率で存在する［５］。ＭＥＮＣＥＶＡＸ ＡＣＷＹＴＭおよびＭＥＮＯＭＵＮＥＴＭの両方は、凍結乾燥された形態から一度再編成され精製された多糖類の各々を５０μｇ含む。
【０００６】
複合化血清群Ｃのオリゴ糖は、ヒトへの使用が承認されている［例えば、ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭ、参考文献６］。しかし、血清群Ａ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに対する複合ワクチンならびにその製造における改善の要求が存在し続ける。この要求は、参考文献８に開示される産物、方法および使用によって対処されるが、さらなる改変および改良の余地が、特に送達ならびに処方に関して存在し続ける。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の開示）
本発明は、免疫原性組成物を提供し、この組成物は、（ａ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃに由来する莢膜サッカリド抗原、および（ｂ）キトサンアジュバントを含む。この組成物は好ましくは、（ｃ）一以上のさらなる抗原および／または（ｄ）一以上のさらなるアジュバントを含む。
【０００８】
本発明はまた、粘膜送達のための免疫原性組成物を提供し、この組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの少なくとも二つに由来する莢膜サッカリドを含む。
【０００９】
好ましくは、本発明の組成物におけるこの莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に複合体化され、および／またはオリゴ糖である。複合体化オリゴ糖抗原（図１）が特に好ましい。
【００１０】
（血清群Ｃの髄膜炎菌に由来する莢膜サッカリド抗原）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃの莢膜サッカリドは、抗原として広範に用いられている。例えば、ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭの活性構成要素は、ＣＲＭ１９７キャリアタンパク質に結合された莢膜多糖類のオリゴ糖フラグメントである。
【００１１】
本発明の組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃに由来する莢膜サッカリド抗原を含むため、莢膜多糖類のオリゴ糖フラグメントの使用および／またはキャリアタンパク質へのサッカリド抗原の結合が好ましい。特に好ましいＭｅｎＣサッカリド抗原は、参考文献６および参考文献９に開示される。
【００１２】
オリゴ糖生成および結合のさらなる詳細は、以下に提供される。
【００１３】
（サッカリド混合物）
本発明の組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの少なくとも二つ（すなわち２、３または４）に由来する莢膜サッカリドを含み得る。
【００１４】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの一よりも多い血清群に由来するサッカリドの混合物が好ましく、例えば、血清群Ａ＋Ｃ、血清群Ａ＋Ｗ１３５、血清群Ａ＋Ｙ、血清群Ｃ＋Ｗ１３５、血清群Ｃ＋Ｙ、血清群Ｗ１３５＋Ｙ、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｙ、血清群Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙなど由来のサッカリドを含む組成物が好ましい。好ましくは、個々のサッカリド抗原の保護効力は、これらを組み合わせることによって取り除かれないが、実際の免疫原性（例えば、ＥＬＩＳＡ力価）は減少され得る。
【００１５】
好ましい組成物は、血清群Ｃおよび血清群Ｙに由来するサッカリドを含む。他の好ましい組成物は、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに由来するサッカリドを含む。
【００１６】
混合物が、血清群Ａおよび血清群Ｃの両方に由来する莢膜サッカリドを含む場合、ＭｅｎＡサッカリド：ＭｅｎＣサッカリドの比率（ｗ／ｗ）は、１よりも大きくあり得る（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはこれ以上）。
【００１７】
混合物が、血清群Ｙならびに血清群Ｃおよび血清群Ｗ１３５のうちの一つまたは両方に由来する莢膜サッカリドを含む場合、ＭｅｎＹサッカリド：ＭｅｎＷ１３５サッカリドの比率（ｗ／ｗ）は、１よりも大きくあり得（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはこれ以上）および／またはＭｅｎＹサッカリド：ＭｅｎＣサッカリドの比率（ｗ／ｗ）は、１よりも小さくあり得る（例えば、１：２、１：３、１：４、１：５またはこれよりも小さい）。
【００１８】
血清群Ａ：血清群Ｃ：血清群Ｗ１３５：血清群Ｙに由来するサッカリドについての好ましい比率（ｗ／ｗ）は、１：１：１：１；１：１：１：２；２：１：１：１；４：２：１：１；８：４：２：１；４：２：１：２；８：４：１：２；４：２：２：１；２：２：１：１；４：４：２：１；２：２：１：２；４：４：１：２；および２：２：２：１である。
【００１９】
（莢膜多糖類の精製）
髄膜炎菌の莢膜多糖類は代表的に、多糖類の沈降（例えば、カチオン性界面活性剤を用いる）、エタノール分画、冷フェノール抽出（タンパク質を除去するため）および超遠心分離（ＬＰＳを除去するため）の工程を包含する方法によって調製される［例えば、参考文献１０］。
【００２０】
しかし、より好ましい方法［８］は、多糖類の沈降、続いて低級アルコールを用いて沈殿した多糖類を可溶化する工程を包含する。沈降は、例えばテトラブチルアンモニウム塩およびセチルトリメチルアンモニウム塩（例えば、臭化物塩）またはヘキサジメチレン（ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ）臭化物ならびにミリスチルトリメチルアンモニウム塩のようなカチオン性界面活性剤を用いて達成され得る。セチルトリメチルアンモニウム臭化物（「ＣＴＡＢ」）は、特に好ましい［１１］。沈殿物質の可溶化は、メタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオールなどのような低級アルコールを用いて達成され得るが、エタノールは特に、ＣＴＡＢ−多糖類の複合体を可溶化するのに適している。エタノールは好ましくは、沈殿した多糖類に添加され、５０％と９５％との間の最終エタノール濃度（エタノールと水との総含有量に基づく）を提供する。
【００２１】
再可溶化の後、多糖類をさらに処理し混入物を除去し得る。これは、たとえささいな混入物であっても容認できない状況（例えば、ヒトのワクチン産生のため）において特に重要である。これは代表的に、濾過（例えば、深層濾過、活性炭を通す濾過が用いられ得る、サイズ濾過および／または限外濾過）の一以上の工程を包含する。
【００２２】
混合物を除去するために一度濾過されると、この多糖類は、さらに処理および／または加工するために沈殿され得る。これは、カチオンを交換することによって容易に達成され得る（例えば、カルシウム塩またはナトリウム塩を添加することによって）。
【００２３】
多糖類は、化学的に改変され得る。例えば、改変され一以上のヒドロキシル基が保護基と置換され得る。これは特に血清群Ａに有用である［１２］。
【００２４】
（オリゴ糖）
莢膜サッカリドは一般に、オリゴ糖の形態である。これらは精製された莢膜多糖類の分解によって（例えば、加水分解、マイルドな酸または加熱によって）都合よく形成され、通常その後所望される大きさのフラグメントを精製する。
【００２５】
多糖類の分解は好ましくは、３０未満（例えば、１０と２０との間、好ましくは血清群Ａについておよそ１０；血清群Ｗ１３５および血清群Ｙについて１５と２５との間、好ましくはおよそ１５〜２０；血清群Ｃについて１２と２２との間など）のオリゴ糖の最終の平均の重合度（ＤＰ）を提供するように実施される。ＤＰは、イオン交換クロマトグラフィーまたは比色分析アッセイ［１３］によって都合よく測定され得る。
【００２６】
加水分解が実施された場合、加水分解物は一般に短い長さのオリゴ糖を除去するための大きさにされる。これは、イオン交換クロマトグラフィーが続く限外濾過のような種々の方法で達成され得る。約６以下の重合度を有するオリゴ糖は好ましくは、血清群Ａについて除去され、そしておよそ４未満のものは好ましくは、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙについて除去される。
【００２７】
（共有結合）
本発明の組成物中の莢膜サッカリドは普通キャリアタンパク質に結合される。一般に結合体は、サッカリドをＴ−非依存性抗原からＴ−依存性抗原へ変換するので、サッカリドの免疫原性を高め、従って免疫記憶のプライミングを可能とする。
【００２８】
結合体化は特に小児科のワクチンのために有用であり［例えば、参考文献１４］かつ周知の技術ある［例えば、参考文献１５〜２３などに概説される］。
【００２９】
好ましいキャリアタンパク質は、ジフテリアまたは破傷風類毒素のような細菌性毒素または類毒素である。ＣＲＭ１９７ジフテリア類毒素［２４、２５、２６］が特に好ましい。他の好ましいキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質［２７］、合成ペプチド［２８、２９］、ヒートショックタンパク質［３０、３１］、百日咳タンパク質［３２、３３］、サイトカイン［３４］、リンホカイン［３４］、ホルモン［３４］、成長因子［３４］、種々の病原体由来抗原に由来する多数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［３５］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに由来するタンパク質Ｄ［３６］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに由来する毒素ＡまたはＢ［３７］などが挙げられる。
【００３０】
本発明の組成物内において、一より多いキャリアタンパク質を使用することが可能である。従って、異なるキャリアタンパク質が、異なる血清群のために使用され得る（例えば、血清群Ａのサッカリドは、ＣＲＭ１９７に結合され得る一方、血清群Ｃのサッカリドは、破傷風類毒素に対して結合され得る。また特定のサッカリド抗原のために一以上のキャリアタンパク質が使用され得る（例えば、血清群Ａサッカリドは、二つの群にあり得、いくつかはＣＲＭ１９７に結合され、他は破傷風類毒素に対して結合される）。しかし、一般に全てのサッカリドについて同一のキャリアタンパク質を使用することが好ましい。
【００３１】
単一のキャリアタンパク質は、一より多いサッカリド抗原を保有し得る［３８］。例えば、単一のキャリアタンパク質は、血清群Ａおよび血清群Ｃに由来するサッカリドに対して結合されている。
【００３２】
０．５：１（すなわち、過剰のタンパク質）と５：１（すなわち過剰のサッカリド）との間のサッカリドを有する結合体：タンパク質の比率（ｗ／ｗ）が好ましく、１：１．２５と１：２．５との間の比率を有するものがより好ましい。
【００３３】
結合体は、キャリアタンパク質を有さない結合体に使用され得る［３９］。
【００３４】
任意の適切な結合反応が使用され得、必要な場合、任意の適切なリンカーを用いて使用され得る。
【００３５】
サッカリドは代表的に、結合前に活性化または機能化される。活性化は例えば、ＣＤＡＰのようなシアン化試薬（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸塩［４０、４１など］）を含み得る。他の適切な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボレン（ｎｏｒｂｏｒａｎｅ）、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する。（参考文献２１の序論をまた参照のこと）
リンカー基を介する結合は、任意の公知の方法、例えば、参考文献４２および参考文献４３に記載される手順を用いてなされ得える。結合の一つの型は、多糖類の還元性のアミノ化、アジピン酸リンカー基の一末端とのアミノ基を生じる結合、および次いでアジピン酸リンカー基のもう一方の末端へのタンパク質の結合を含む［１９、４４、４５］。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド［４６］、ニトロフェニル−エチルアミン［４７］、ハロアシルハロゲン化物［４８］、グルコシド結合［４９］、６−アミノカプロン酸［５０］、ＡＤＨ［５１］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［５２］などが挙げられる。選択的にリンカーを使用する場合、直接的な結合が使用され得る。タンパク質に対する直接的な結合は、例えば、参考文献５３および５４に記載されるような、タンパク質の還元性のアミノ化が続く多糖類の酸化を含み得る。
【００３６】
アジピンジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドドジエステル）を用いた誘導体化およびキャリアタンパク質との反応が続く、サッカリドへのアミノ基の導入を包含するプロセス（例えば、末端の＝Ｏ基を−ＮＨ２と置換することによる）が、好ましい。
【００３７】
結合の後、遊離サッカリドおよび結合体化サッカリドが、分離され得る。疎水性クロマトグラフィー、接線限外濾過、ダイアフィルトレーションなどを含む多数の適切な方法が存在する［参考文献５５および参考文献５６などをまた参照のこと］。
【００３８】
本発明の組成物が、結合体化オリゴ糖を含む場合、オリゴ糖の調製は、結合よりも前に行われることが好ましい。
【００３９】
（本発明の組成物の調製）
本発明の組成物が、一より多い型の莢膜サッカリドを含む場合、これらは別々に調製されることが好ましく（任意の分解、結合などを含む）、次いで混合され本発明の組成物を提供する。
【００４０】
しかし、この組成物が、血清群Ａに由来する莢膜サッカリドを含む場合、血清群Ａのサッカリドは、加水分解の可能性を最小化するために、使用直前まで他のサッカリドと混合されないことが好ましい。これは、凍結乾燥された形態の血清群Ａの構成要素および液状形態の他の血清群の構成要素とを有することによって容易に達成され得、使用の準備が整った場合、液状構成要素が使用され凍結乾燥された構成要素を再編成する。
【００４１】
このように本発明の組成物は、キットから調製され得、このキットは、（ａ）凍結乾燥された形態のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａに由来する莢膜サッカリド、ならびに（ｂ）液状形態の、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの一以上（例えば、１、２、３）に由来する莢膜サッカリドを備える。本発明はまた、本発明の組成物を調製するための方法を提供し、この方法は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａに由来する凍結乾燥された莢膜サッカリドとＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの一以上（例えば、１、２、３）に由来する莢膜サッカリドとを混合する工程を包含し、この一以上のサッカリドは、液状形態である。
【００４２】
本発明はまた、本発明の組成物を提供し、この組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに由来する莢膜サッカリドを含み、このサッカリドは、液状形態である。この組成物は、再編成のために凍結乾燥された血清群Ａのサッカリド抗原と共にパッケージングされ得るか、または例えば、血清群Ａに対する免疫化は、所望されない場合そのままで組成物として使用され得る。
【００４３】
（本発明の組成物の調製）
本発明の組成物は、種々の方法で提示されかつパッケージングされ得る。
【００４４】
組成物が、注射用である場合、これらは、バイアル中に提示され得るか、またはシリンジに予め充填されて提示され得る。このシリンジは、針を伴って供給されても、針を伴わずに供給されても良い。シリンジは、組成物の単一用量を含み、ここでバイアルは、単一用量または複数回の用量を含み得る。注射用の組成物は一般に、溶液または懸濁液である。あるいは、注射前に液状ビヒクル中に溶解または懸濁するための固体形態で提示され得る。
【００４５】
本発明の組成物が、使用の前に即座に調製され（例えば、血清群Ａのサッカリドが、凍結乾燥された形態で提示される）、そしてキットとして提示される場合、このキットは、二つのバイアルを含み得、または一つは予め充填されたシリンジおよび一つのバイアルとを含み得、そのシリンジの内容物は、注射前にバイアルの内容物を再活性化させるために使用される。
【００４６】
しかし、好ましい組成物は、粘膜送達用である。種々の粘膜送達の選択肢が利用可能であり、既に大量に生産されている比較的単純なデバイスを用いて容易なアクセスを提供するので鼻腔内経路が、最も実用的である。このように本発明の組成物は好ましくは、鼻内噴霧、点鼻薬、ゲルまたは散剤のような鼻腔内投与のために適合され、そして／またはパッケージングされる［例えば、参考文献５７および参考文献５８］。
【００４７】
この組成物の粘膜送達のための選択的な経路は、経口、胃内、肺内、腸内、経皮、直腸、眼内および膣内の経路である。このように本発明の組成物は、粘膜投与に対して適合されそして／またはパッケージングされ得る［例えば、参考文献５９、参考文献６０および参考文献６１を参照のこと］。この組成物が、経口投与用である場合、例えば、錠剤またはカプセル（必要に応じて腸溶性コートされる）、液体、遺伝子組換え植物の物質、点滴薬、吸入器、エアロゾル、腸溶性コート、坐薬、膣坐薬などの形態であり得る［また参考文献６２および参考文献７３の１７章を参照のこと］。
【００４８】
どのような送達経路であれ、本発明の組成物は好ましくは、単位用量形態にパッケージングされる。効果的な用量は、慣用的に確立され得る。注射または鼻腔内用途のための組成物の代表的なヒト用量は、０．１ｍｌ〜０．５ｍｌとの間の容量を有する（例えば、一つの鼻孔あたり１００μｌづつ２回のスプレーする）。
【００４９】
各用量内において、個々のサッカリド抗原の量は一般に、１μｇ〜５０μｇの間であり（サッカリドの質量として測定される）、それぞれ約１０μｇが好ましい。
【００５０】
本発明の組成物は、好ましくは無菌である。この組成物は好ましくは、発熱物質なしである。この組成物は好ましくは、例えば、ｐＨ ６とｐＨ ８との間に緩衝され、一般的に約ｐＨ ７である。組成物が、水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジン緩衝液を用いることが好ましい［６３］。
【００５１】
（アジュバント）
この組成物は一般に、一以上のアジュバントを含む。このアジュバントは、混合され本発明の組成物を形成する前および／または後にサッカリドに添加され得るが、異なるサッカリドと混合する前にサッカリド抗原とアジュバントとを混合することが好ましい。
【００５２】
しかし、各サッカリドが、このような混合の前にアジュバント化されなければならないという必要はない。さらなる非アジュバント化サッカリド抗原が添加される場合、過剰なアジュバントは、一つのサッカリド調製物に含まれ得、その結果この過剰量は所望される終濃度まで希釈される。一つの特定の実施形態において、本発明の組成物が、凍結乾燥された抗原（例えば、凍結乾燥された血清群Ａの構成要素）から調製される場合、これは凍結乾燥された物質中にアジュバントを含まないことが好ましくあり得る。
【００５３】
粘膜送達のために、粘膜アジュバントを用いることが好ましい。粘膜アジュバントとしては、（Ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン（「ＬＴ」）、もしくはその解毒化変異体［例えば、参考文献６４の５章］；（Ｂ）コレラ毒素（「ＣＴ」）、もしくはその解毒化変異体［例えば、参考文献６４の５章］；または（Ｃ）生体分解可能かつ無毒性の物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、多無水物、ポリカプロラクトンなど（ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）などのような））から形成される微粒子（すなわち直径約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍの粒子、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、および最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍ）であり、必要に応じて負電荷を帯びた表面（例えば、ＳＤＳを有する）もしくは正電荷を帯びた表面（例えば、ＣＴＡＢのようなカチオン性界面活性剤を有する）を有するように処理される；（Ｄ）ポリオキシエチレンエーテルもしくはポリオキシエチレンエステル［６５］；（Ｅ）オクトキシノール［６６］もしくはポリオキシエチレンアルキルエーテルとの組合せにおけるポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤またはオクトキシノール［６７］のような少なくとも一つのさらなる非イオン性界面活性剤との組合せにおけるエステル界面活性剤；（Ｆ）キトサン［例えば、６８］；（Ｇ）免疫賦活性のオリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびサポニン［６９］；（Ｈ）リポソーム［参考文献７３の１３章および１４章］；（Ｉ）アミノアルキルグルコサミニドリン酸塩誘導体（例えば、ＲＣ−５２９）のようなモノホスホリル脂質Ａ模倣物［７０］；（Ｊ）ポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）（ＰＣＰＰ）；（Ｋ）エステル化ヒアルロン酸微粒子［７２］のような生体接着剤（７１）もしくはポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体からなる群より選択された粘膜付着性物質が挙げられるが、これらに限定されない。他の粘膜アジュバントはまた、利用され得る［例えば、参考文献７３の７章を参照のこと］。
【００５４】
上に提供される粘膜アジュバントに加えて、本発明の組成物は、以下の群：（Ａ）水酸化アルミニウム（オキシ水酸化物を含む）のようなアルミニウム塩（ミョウバン）、リン酸アルミニウム（ヒドロキシホスフェート（ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を含む）、硫酸アルミニウムなど［参考文献７３の８章および９章］；（Ｂ）油中水エマルジョン処方物（ムラミルペプチド［ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥなどを含む］または細菌の細胞壁の構成要素のような他の特定の免疫賦活性因子を伴うかまたは伴わない）、例えば、（ａ）ＭＦ５９ＴＭ［参考文献７３；７４、７５の１０章］であって、５％スクアレン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ ８５を含有し（必要に応じてＭＴＰ−ＰＥを含有する）、マイクロフリューダイザーを用いて１ミクロン未満の粒子へ処方される、（ｂ）ＳＡＦであって、１０％スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％プロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、１ミクロン未満のエマルジョンへマイクロ流動化されるかまたはより大きな粒子サイズのエマルジョンを生じるためにボルテックスされる、ならびに（ｃ）ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）であって、２％スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、およびモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）からなる群に由来する一以上の細菌性の細胞壁の構成要素を含有する；（Ｃ）ＱＳ２１またはＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）のようなサポニンアジュバント［参考文献７３の２２章］であって、単純な形態またはＩＳＣＯＭ（免疫賦活性複合体；参考文献７３の２３章）のようにそこから生じた粒子の形態のいずれかであり、このＩＳＣＯＭは、さらなる界面活性剤を欠いたものであり得る（例えば、参考文献７６）；（Ｄ）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）；（Ｅ）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２［７７］など）、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのようなサイトカイン、（Ｆ）モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、参考文献７８および７９）であって、肺炎球菌のサッカリド（例えば、参考文献８０）と一緒に用いる場合、必要に応じてミョウバンを実質的に含まない；（Ｇ）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または油中水エマルジョン（例えば、参考文献８１、参考文献８２および参考文献８３）との組合せ；（Ｈ）ＣｐＧモチーフ（すなわち、少なくとも一つのＣＧジヌクレオチドを含有する）を含むオリゴヌクレオチドであって、必要に応じてシトシンの代わりに５−メチルシトシンが用いられる；（Ｉ）免疫賦活剤および金属塩の粒子（例えば、参考文献８４）；（Ｊ）サポニンおよび油中水エマルジョン（例えば、参考文献８５）；（Ｋ）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて、＋ステロール）（例えば、参考文献８６）；（Ｌ）二本鎖ＲＮＡ；（Ｍ）組成物の効果を増強するために免疫腑活性因子として作用する他の物質［例えば、参考文献７３の７章］から選択される一以上のさらなるアジュバントを含有し得る。
【００５５】
リン酸アルミニウムが使用される場合、一以上のサッカリドをこのアルミニウム塩へ吸着することが可能であるが、そのように吸着しないことが好ましく、そして溶液中にリン酸イオン（例えば、リン酸緩衝液の使用による）を含まないことによって有利に働く。水酸化アルミニウムが用いられる場合、サッカリドをこの塩に吸着させることが好ましい。アジュバントとしての水酸化アルミニウムの使用は、血清群Ａに由来するサッカリドについて好ましくあり得る。
【００５６】
好ましい粘膜アジュバントは、キトサン（トリメチルキトサンを含む）および細菌毒素（特にＬＴ）の解毒された変異物である。これらは、単独で使用され得るか、または同時投与が、用いられる毒素の用量を減少させ、それによって安全性を改善するように、有利に組み合わせて用いられ得る。さらに、キトサン単独が、Ｔｈ２に偏向される反応を生じさせるのに対して、ＬＴＫ６３の添加は、Ｔｈ１に偏向される反応に対する変化を引き起こし得る。
【００５７】
（キトサン）
キトサンは、アジュバントとしての用途が公知であり［例えば、参考文献８７〜参考文献９８］、特に粘膜（例えば、鼻腔内）用途について公知である。キトサン（図１１）は、外骨格（ｅｘｏｓｋｅｌｅｔａｌ）ポリマーのキトサンのＮ−脱アセチル化誘導体であるが（図１２）、Ｎ−脱アセチル化はほとんど完了しない。脱アセチル化とは、キトサンと異なり、キトサンが、希釈した酢酸水溶液およびギ酸水溶液中に可溶であることを意味する。キトサンはまた、ワクチンのない製薬分野において広範な適用性が見出されている［９９］。
【００５８】
キトサンのグルコサミドモノマーの反復は、アミン基を含む。この基は、遊離アミン（−ＮＨ２）またはポリマーの溶解性に影響するプロトン化を伴ったカチオン性アミン（−ＮＨ３＋）として存在し得る。アミン基は、化学的に活性でありかつ置換され得る。本発明の特定の目的について、このアミン基は、一以上のアルキル基（「Ａ」例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルなど）で置換され得、例えば、−ＮＨＡ、−ＮＨ２Ａ＋、−ＮＡ１Ａ２、−ＮＨＡ１Ａ２＋、−ＮＡ１Ａ２Ａ３＋である。好ましい誘導体は、トリ−アルキル化であり、そして特に好ましい誘導体は、トリメチル化である（すなわち、トリメチルキトサン、または「ＴＭＣ」−図１３）。これらの誘導体は、より広いｐＨの範囲にわたって非改変のキトサンよりもより高い水溶性を有する。
【００５９】
キトサンポリマー中の全てのアミンが、この様に置換される必要は無い。キトサン鎖の長さに従った置換の程度は、１Ｈ−ＮＭＲによって決定され得、反応工程の数および時間によって制御され得る［１００］。少なくとも１０％（例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはこれ以上）のモノマーが、置換アミンを有することが好ましい。
【００６０】
キトサン中の１００％のモノマーが、アルキル化アミンを保有することが稀であることの２つの主な理由が存在する。第一に、置換反応は、通常１００％の効率ではない。第二に、１００％のモノマー単位がアミン基を保有しているキトサンを見出すことは稀であり、それはキトサンの脱アセチル化が通常１００％の効率ではないためである。従って本発明に用いられるアルキル化キトサン誘導体は、いくつかのモノマー単位にアミド基および／または非アルキル化基を有し、そしてキトサンは、いくつかのアミド基を保有し得る。本発明と共に用いられるキトサンおよび誘導体は好ましくは、少なくとも７５％脱アセチル化されている。
【００６１】
キトサンは、種々の分子量があり、例えば、分子量およそ５，０００〜１０，０００を有するオリゴ糖から高分子量（例えば、６００，０００〜１，０００，０００）のポリマーがある。
【００６２】
カチオン性キトサンまたは誘導体が使用される場合、塩、例えば塩化物または乳酸塩の形態である。
【００６３】
キトサンまたは誘導体は、種々の物理学的な形態、例えば、溶液中粉末として、または粒子形態を取り得る。粒子形態（微粒子を含む）は、好ましく、交差結合または非交差結合されていなくてもよく、かつ噴霧乾燥によって好都合に形成され得る［１０１、１０２］。他の物理学的な形態としては、ゲル、ビーズ、フィルム、スポンジ、ファイバー、エマルジョンなどが挙げられる。
【００６４】
本発明の組成物、プロセス、方法および使用をいうために用いられた場合、用語「キトサン」は、キトサンのこれら全ての形態ならびに誘導体を含む。
【００６５】
（解毒化された変異毒素）
ＮＡＤ＋から標的タンパク質へのＡＤＰ−リボース単位の移動を触媒するＡＤＰ−リボシル化細菌性外毒素は、広く知られている。例としては、ジフテリア毒素（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、外毒素Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、コレラ毒素（ＣＴ；Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ；Ｅ．ｃｏｌｉ）および百日咳毒素（ＰＴ）が挙げられる。さらなる例は、参考文献１０３および参考文献１０４にある。
【００６６】
この毒素は代表的に、機能的に異なるドメイン−ＡおよびＢの二つに分けられる。Ａサブユニットは、毒素の酵素活性を担い、一方Ｂサブユニットは、細胞性結合を担う。このサブユニットは、同一のポリペプチド鎖上のドメインであり得るか、または別々のポリペプチド鎖であり得る。このサブユニットは、それ自体がオリゴマーであり得、例えば、ＣＴのＡサブユニットは、Ａ１およびＡ２から構成され、これらはジスルフィド結合によって結合され、そしてそのＢサブユニットは、ホモペンタマーである。代表的に、標的細胞との最初の接触は、Ｂサブユニットによって媒介され、次いでサブユニットＡのみが、細胞へ入る。
【００６７】
この毒素は代表的に、免疫原性であるが、ワクチンにこれらを含めることは、それらの毒性によって阻害される。免疫原性までも除去されることなく毒性を除去するために、この毒素は、グルタルアルデヒドまたはホルムアルデヒドのような化学薬品を用いて処理されている。さらに合理的なアプローチは、重要な活性部位の残基の部位特異的変異誘発に依存して、免疫原性を保持しながら毒素の酵素活性を除去する［例えば、参考文献１０５（ＣＴおよびＬＴ）、１０６（ＰＴ）、６４など］。現在の無細胞性の百日咳ワクチンは、二つのアミノ酸置換（Ａｒｇ９→ＬｙｓおよびＧｌｕ１２９→Ｇｌｙ；「ＰＴ−９Ｋ／１２９Ｇ」［１０７］）を伴う百日咳毒素の形態を含む。
【００６８】
これらの免疫原性の特性と同様に、この毒素は、アジュバントとして用いられている。非経口的なアジュバント活性は初めに１９７２年［１０８］に観察され、そして粘膜アジュバント活性は、１９８４［１０９］に観察された。驚くべきことに、この毒素の解毒化形態は、アジュバント活性を保持していることが１９９３年に見出された［１１０］。
【００６９】
本発明の組成物は、解毒化されたＡＤＰ−リボシル化毒素を含む。この毒素は、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａまたは百日咳毒素であり得るが、好ましくはコレラ毒素（ＣＴ）またはより好ましくはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）である。用いられ得る他の毒素は、参考文献１０４（その中で配列番号１〜７、およびその変異体）に開示されるものである。
【００７０】
免疫原性および／またはアジュバント活性を損なうことのないこれら毒素の解毒化は、任意の適切な方法によって達成され得、変異誘発が好ましい。変異誘発は、一以上の置換、欠失、および／または挿入を含み得る。
【００７１】
好ましい解毒化変異は、Ａｒｇ−７残基での変異（例えば、Ｌｙｓ置換）を有するＬＴ；Ａｒｇ−７残基での変異（例えば、Ｌｙｓ置換）を有するＣＴ；Ａｒｇ−１１残基での変異（例えば、Ｌｙｓ置換）を有するＣＴ；Ｖａｌ−５３での変異を有するＬＴ；Ｖａｌ−５３での変異を有するＣＴ；Ｓｅｒ−６１残基での変異（例えば、Ｐｈｅ置換）を有するＣＴ；Ｓｅｒ−６３残基での変異（例えば、ＬｙｓまたはＴｙｒ置換）を有するＬＴ［例えば、参考文献６４〜Ｋ６３の５章；参考文献１１１−Ｙ６３）；Ｓｅｒ−６３残基での変異（例えば、ＬｙｓまたはＴｙｒ置換）を有するＣＴ；Ａｌａ−７２残基での変異（例えば、Ａｒｇ置換）を有するＬＴ［１１２−Ｒ７２］；Ｖａｌ−９７での変異を有するＬＴ；Ｖａｌ−９７での変異を有するＣＴ；Ｔｙｒ−１０４での変異を有するＬＴ；Ｔｙｒ−１０４での変異を有するＣＴ；Ｐｒｏ−１０６残基での変異（例えば、Ｓｅｒ置換）を有するＬＴ；Ｐｒｏ−１０６残基での変異（例えば、Ｓｅｒ置換）を有するＣＴ；Ｇｌｕ−１１２での変異（例えば、Ｌｙｓ置換）を有するＬＴ；Ｇｌｕ−１１２での変異（例えば、Ｌｙｓ置換）を有するＣＴ；Ａｒｇ−１９２残基での変異（例えば、Ｇｌｙ置換）を有するＬＴ；Ａｒｇ−９残基での変異（例えば、Ｌｙｓ置換）を有するＰＴ；Ｇｌｕ−１２９での変異（例えば、Ｇｌｙ置換）を有するＰＴ；および参考文献１０５に開示されるいずれかの変異体である。
【００７２】
これら変異は、例えば、ＰＴまたはＬＴにおけるＡｒｇ−９−Ｌｙｓ＋Ｇｌｕ−１２９−ＧｌｙとＤ５３およびＫ６３変異の両方との組合せなどであり得る。
【００７３】
６３残基または７２残基での変異を有するＬＴは、好ましい解毒化された毒素である。ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２の毒素が特に好ましい［１１３］。
【００７４】
これら残基の番号付けは、原型の配列に基づくことが理解され、例えば、Ｓｅｒ−６３は実際には、所定のＬＴ改変体の第６３番目のアミノ酸でなくても良いが、アミノ酸配列のアライメントは、Ｓｅｒ−６３に対応する位置を示すことが理解される。
【００７５】
解毒化された毒素は、アジュバント活性に適するようにＡサブユニットおよび／またはＢサブユニットの形態であり得る。
【００７６】
（組成物のさらなる構成要素）
髄膜炎菌性のサッカリド抗原に加えて、本発明の組成物は、髄膜炎菌性のタンパク質抗原を含み得る。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂ［例えば、参考文献１１４〜１１９など］またはＯＭＶ調製物［例えば、参考文献１２０〜１２３など］に由来するタンパク質を含むことが好ましい。
【００７７】
非髄膜炎菌性抗原および非ナイセリア抗原（好ましくは髄膜炎菌性の構成要素に対する免疫反応を減少させないもの）もまた、含まれ得る。例えば、参考文献１２４は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂおよび血清群Ｃに由来するオリゴ糖と一緒にＨｉｂサッカリドとの組合せを開示する。肺炎球菌、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、ジフテリア、破傷風、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、ポリオおよび／またはＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅが好ましい。特に好ましくは、非ナイセリア抗原は、以下：
−ＣａｇＡ［１２５〜１２８］、ＶａｃＡ［１２９、１３０］、ＮＡＰ［１３１、１３２、１３３］、ＨｏｐＸ［例えば、１３４］、ＨｏｐＹ［例えば、１３４］および／またはウレアーゼのようなＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに由来する抗原
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来するサッカリドまたはタンパク質抗原［例えば、１３５、１３６、１３７］
−不活化ウィルスのようなＡ型肝炎ウィルスに由来する抗原［例えば、１３８、１３９］
−表面抗原および／またはコア抗原のようなＢ型肝炎ウィルスに由来する抗原であって［例えば、１３９、１４０］、好ましくは表面抗原はリン酸アルミニウムへ吸着される［１４１］
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂに由来するサッカリド抗原であって［例えば、９］、好ましくは、リン酸アルミニウムへ吸着されないか、または吸着される［１４２］
−Ｃ型肝炎ウィルスに由来する抗原［例えば、１４３］
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに由来する抗原［例えば、１１４〜１１７］
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに由来する抗原［例えば、参考文献１４４〜１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０］
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓに由来する抗原［例えば、１５１］
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓに由来する抗原［例えば、１５２］
−ＩＰＶのようなポリオ抗原［例えば、１５３、１５４］
−凍結乾燥された不活化ウィルス［例えば、１５６、ＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ］のような狂犬病の抗原［例えば、１５５］
−はしか、おたふくかぜおよび／または風疹の抗原［例えば、参考文献１の１２章、１３章および１７章］
−赤血球凝集素および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質のようなインフルエンザ抗原［例えば参考文献１の２１章］
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに由来する抗原［例えば、１５７］
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）に由来する抗原［例えば、１５８、１５９］
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）に由来する抗原［例えば、１５９、１６０、１６１］
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに由来する抗原［例えば、１６２］
−呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ［１６３、１６４］）および／またはパラインフルエンザウィルス（ＰＩＶ３［１６５］）のようなパラミクソウィルスに由来する抗原
−Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓに由来する抗原［例えば、１６６、１６７、１６８］
−黄熱病ウィルス、日本脳炎ウィルス、テング熱ウィルスの四つの血清型、ダニ媒介性脳炎ウィルス、西ナイルウィルスのようなフラビファミリー（フラビウィルス属）のウィルスに由来する抗原
−古典的なブタの発熱ウィルス、ウシのウィルス性下痢ウィルス、および／またはボーダー病ウィルスに由来するようなペスチウィルス
−例えば、パルボウィルスＢ１９に由来するパルボウィルス抗原
−破傷風トキソイド［例えば、参考文献１の１８章］
−Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、必要に応じてまたパートアクチン（ｐｅｒｔａｃｔｉｎ）ならびに／または凝集原２および凝集原３との組合せに由来する百日咳ホロトキシン（ＰＴ）および糸状の赤血球凝集素（ＦＨＡ）［例えば、参考文献１６９および１７０］
−細胞性百日咳抗原
を、含む。
【００７８】
この混合物は、一以上のこれらのさらなる抗原を含み得、これらは必要な場合には解毒化され得る（例えば、化学的手段および／または遺伝的手段による百日咳毒素の解毒化）。
【００７９】
ジフテリア抗原が、この混合物中に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原もまた含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が、含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原もまた含まれることが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含むことが好ましい。
【００８０】
混合物中の抗原は代表的に、少なくとも各１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般に、いずれかの所定の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫反応を誘発するのに十分である。
【００８１】
本発明の組成物と一緒に（１）髄膜炎菌性サッカリド、（２）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する免疫反応を誘導する抗原、および（３）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫反応を誘導する抗原の三つ全てを含まないことが好ましくあり得る。しかし、これら三つの抗原が同一の組成物中に含まれる場合、この組成物は、アジュバントとしてキトサンのアルキル化誘導体（例えば、トリメチルキトサン）を含むことが好ましい。
【００８２】
混合物中にタンパク質抗原を用いることの代替として、抗原をコードする核酸が用いられ得る。従って混合物のタンパク質の構成要素は、タンパク質をコードする核酸（好ましくは、例えばプラスミド形態のＤＮＡ）によって置換され得る。同様に、本発明の組成物は、サッカリド抗原（例えば、ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）［１７１］または抗イデオタイプ抗体を模倣するタンパク質を含み得る。これらは個々のサッカリド構成要素を置換し得るか、またはこれらを補充し得る。例としては、このワクチンは、サッカリド自体の代わりにＭｅｎＣ［１７２］莢膜多糖類またはＭｅｎＡ［１７３］莢膜多糖類のペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｉｃ）を含み得る。
【００８３】
本発明の組成物は、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０のようなＴｗｅｅｎ）を低レベル（例えば、０．０１％未満）で含み得る。本発明の組成物は、糖アルコール（例えば、マンニトール）またはトレハロースを例えば、およそ１５ｍｇ／ｍｌで含み得る（特に、これらが凍結乾燥されている場合、または凍結乾燥された物資から再構成される物質を含む場合）。
【００８４】
（免疫原性）
本発明の組成物は、免疫原性である。好ましい免疫原性組成物は、ワクチンである。本発明によるワクチンは予防的（すなわち、感染を防ぐため）または治療的（すなわち、感染後に疾患を処置するため）のいずれかであり得るが、代表的に予防的である。
【００８５】
本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、髄膜炎菌のサッカリドに加えて、代表的に「薬学的に受容可能なキャリア」を含む。薬学的に受容可能なキャリアは、それ自体が組成物を受容する個体に有害な抗体の産生を誘導しない任意のキャリアを含む。適切なキャリアは代表的に大きく、ゆっくりと代謝される高分子であり、例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体のアミノ酸、アミノ酸コポリマー、トレハロース［１７４］、脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）および不活化ウィルス粒子である。このようなキャリアは、当業者に周知である。このワクチンはまた、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロールなど）も含み得る。さらに、補助的な物質（保湿剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）も存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤の詳細な考察は、参考文献１７５に利用可能である。
【００８６】
ワクチンとして用いられる免疫原性組成物は、免疫学的有効量のサッカリド抗原、および必要とされる場合、上記のいずれか他の構成要素を含む。「免疫学的有効量」によって、単一用量または一連の一部としてのいずれかにおいて、個体に対する量が、処置または予防について有効であることを意味する。この量は処置されるべき個体の健康状態および物理的状態、年齢、処置されるべき個体の分類学的な群（例えば、ヒトではない霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望される保護の程度、ワクチンの処方、処置する医師による医学的状態の評価ならびに他の関連因子に依存して変化する。この量は、慣用的な試行により決定され得る比較的広い範囲であることが予期される。
【００８７】
本発明の組成物の免疫原性は、試験被験体に対してこれらを投与し、（１２月齢〜１６月齢の子供、または動物モデル［１７６］）、次いで血清の殺菌性抗体（ＳＢＡ）および抗莢膜ＩｇＧの総結合力および高結合力のＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）を含む標準的なパラメーターを決定することによって決定され得る。これらの免疫反応は一般に、組成物の投与後およそ４週間で決定され、組成物の投与前に決定された値と比較される。少なくとも４倍または８倍のＳＢＡ増加が好ましい。一よりも多い用量の組成物が、投与される場合、一回よりも多い投与後の判定がなされ得る。
【００８８】
（本発明の組成物の投与）
上記のように、本発明の組成物は、種々の経路（非経口的および粘膜を含む）によって投与され得る。非経口的投与の好ましい経路は、注射である。注射は、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内であり得る。大腿部への筋肉内投与が、好ましい。針の無い注射が用いられ得る。粘膜投与の好ましい経路は、鼻腔内である。経皮（Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）投与または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与もまた可能である（例えば、参考文献１７７を参照のこと）。
【００８９】
投与は、単一用量スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。最初の用量スケジュールに続いてブースター量スケジュールであり得る。初回刺激と追加免疫との間の適切な時期は、慣用的に決定され得る。
【００９０】
投与は一般に、動物に対するものであり、特にヒト被験体が、処置され得る。この組成物は特に、子供および十代の若者のワクチン接種に有用である。
【００９１】
（医療方法および使用）
本発明は、患者において免疫反応を惹起する方法を提供する。この方法は、本発明の組成物を患者に投与する行程を包含する。免疫反応は好ましくは、髄膜炎疾患に対して保護するものであり、体液性免疫反応および／または細胞性免疫反応を含み得る。この免疫反応および／または投与は好ましくは両方とも粘膜性である。
【００９２】
患者は好ましくは、子供である。さらに好ましい患者の部類としては、成人女性であり、特に出産適齢期の女性または妊娠女性である。本発明の組成物は、母体経路を介して子供を受動的に免疫することに特に適している。
【００９３】
本方法は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対して既に刺激されている患者において追加免疫反応を生じ得る。
【００９４】
本発明はまた、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの内の少なくとも二つに由来する莢膜サッカリドの使用を提供し、ここでこの莢膜サッカリドは、免疫反応を生じるための動物に対する鼻腔内送達のための医薬品の製造においてキャリアタンパク質に結合され、および／またはオリゴ糖である。本発明はまた、免疫反応を生じるための動物に対する鼻腔内送達のための医薬品の製造において、（１）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの少なくとも一つに由来する莢膜サッカリドであって、この莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に対して結合され、ならびに／またはオリゴ糖である莢膜サッカリド、そして（２）キトサンの使用も提供する。この使用はまた、（３）解毒化されたＡＤＰ−リボシル化毒素も含み得る。
【００９５】
これら医薬品は好ましくは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（例えば、髄膜炎、敗血症、淋病など）によって引き起こされる疾患の予防および／または処置のためのものである。これらは好ましくは、鼻腔内投与用である。これらは好ましくは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのうちの少なくとも二つ（すなわち、２、３または４）に由来する莢膜サッカリドを含む。
【００９６】
（Ｔｈ１／Ｔｈ２偏り）
キトサン（その誘導体を含む）および抗原を含むワクチン組成物は、当該分野に公知である。キトサンは、Ｔｈ２に偏った免疫反応を生じる。これらワクチンへの解毒化されたＡＤＰ−リボシル化毒素アジュバント（例えば、ＬＴＫ６３のようなＬＴ変異物）の添加が、Ｔｈ１偏りを有するようにこの免疫反応を変化させ得ることが見出されている。従って本発明は、キトサンアジュバント、変異ＡＤＰ−リボシル化毒素および抗原を含むワクチンを提供し、このワクチン組成物は、被験体への投与後Ｔｈ１に偏った免疫反応を提供する。本発明はまた、キトサン含有ワクチンのＴｈ１／Ｔｈ２のバランスを変えるための方法も提供し、この方法は、このワクチンに解毒化されたＡＤＰ−リボシル化毒素を添加する工程を包含する。
【００９７】
（定義）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を意味し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみを含み得るか、または付加物を含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ）。
【００９８】
数値ｘに関連する用語「約」は、例えばｘ±１０％を意味する。
【００９９】
単語「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」は、「完全に（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ）」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に有さない」組成物は、Ｙを完全に有さなくてもよい。必要な場合、この単語「実質的に」は、本発明の定義から省略され得る。
【０１００】
（発明を実施するための様式）
（髄膜炎菌性血清群Ｃワクチン［１８２］）
ＣＲＭ１９７髄膜炎菌Ｃオリゴ糖結合体［６、９］を、一用量あたり１μｇでＮ−トリメチル−キトサンクロリドアジュバント［１７８］および／またはＬＴ−Ｋ６３アジュバントを用いてマウスに鼻腔内投与した。ＴＭＣを、一用量あたり８μｇで使用し、１８．９％の代替品と共にエビの殻に由来するキトサン（「Ｃｈｉｔｏｃｌｅａｒ」Ｐｒｉｍｅｘ ｅｈｆ、Ｉｃｅｌａｎｄ）（９４．５％アセチル化）から調製した［１７９］。ＬＴ−Ｋ６３を、一用量あたり１μｇまたは０．１μｇで用いた。麻酔されていない雌性ＢＡＬＢ／ｃを、１０μｌ量の処方物（一鼻孔あたり５μｌ）を用いて０日、２１日、３５日目に鼻腔内免疫化した。血清サンプルを、各免疫化の前後に採取した。鼻孔の洗浄を、三度目の免疫化の後１０日間行った。ＭｅｎＣおよびＬＴに対して特異的なＩｇＧ抗体およびＩｇＡ抗体の力価を、ＥＬＩＳＡによって決定した［１８０］。コントロールのマウスに、水酸化アルミニウムアジュバント５００μｇを含む４００μｌ量を皮下的（ｓ．ｃ．）に与えた。全ての処方物を、ＬＴＫ６３粘膜アジュバントを、加えてもしくは加えずに、皮下免疫のためにＣＲＭ−ＭｅｎＣ結合体ワクチンとアジュバント、またはＴＭＣの粉末懸濁物とを混合することによって使用直前にｐＨ７．４のＰＢＳ中に調製した。
【０１０１】
血清サンプルを０日目、２０日目（ポスト−１）、３４日目（ポスト−２）、および４５日目（ポスト−３）に取り、この日にマウスを屠殺し、鼻の洗浄を行い、そして脾臓を取り除いた。鼻の洗浄を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を含有する１ｍｌ ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）を流しそして吸引することを繰り返すことによって実施した。
【０１０２】
血清および粘膜の抗ＭｅｎＣ−特異的ＩｇＧ抗体、抗−ＣＲＭ１９７−特異的ＩｇＧ抗体および抗−ＬＴＫ６３特異的ＩｇＧ抗体ならびに抗ＭｅｎＣ−特異的ＩｇＡ抗体、抗−ＣＲＭ１９７−特異的ＩｇＡ抗体および抗−ＬＴＫ６３特異的ＩｇＡ抗体の滴定を、以前に詳細に述べられたように［１８０〜１８２］、個々の血清サンプルについてＥＬＩＳＡによって実施した。抗体滴定を、両側スチューデント検定によって統計学的に比較した。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＣ群Ｃ１１系統に対する血清の殺菌活性を、補体の供給源として胎児ウサギ血清を用い、既に記載された標準的な方法［１１９、１８０］に従ってプールした血清サンプルについて滴定した。
【０１０３】
血清ＩｇＧ反応を、図１４に示す：（Ａ）ＥＬＩＳＡおよび（Ｂ）殺菌性（対数目盛）。図１５は、（Ａ）血清および（Ｂ）鼻の洗浄液におけるＩｇＡ力価を示す。図１６は、脾臓増殖アッセイの結果を示す。
【０１０４】
このデータは、ＴＭＣのみが、免疫原性を増強することを示し、またＬＴ−Ｋ６３アジュバントと共に同時投与した場合、ＴＭＣが免疫原性を増強することを示す。１μｇのＬＴ−Ｋ６３とＴＭＣとの混合物を受けているマウスは、皮下免疫によって得られるＩｇＧ力価に匹敵するＩｇＧ力価を得た。さらに、両方の用量の混合アジュバントは、皮下免疫と同等のまたは皮下免疫よりも良好な血清殺菌性抗体反応を生じた。皮下免疫は、鼻の洗浄液においてＭｅｎＣ−特異的ＩｇＡ反応を生じなかった。
【０１０５】
従って、ＴＭＣおよびＬＴＫ−６３は、ＭｅｎＣサッカリド抗原（単独または組合せのいずれか）について効果的な鼻腔内アジュバントである。有利なことには、ＬＴ−Ｋ６３へのＴＭＣの添加は、免疫原性の減少を伴うことなくＬＴ−Ｋ６３の用量を９０％減少させることが可能である。従って、ＴＭＣは、免疫原性の減少を伴うことなく潜在的な残留毒性を有する構成要素を減少させることが可能である。
【０１０６】
さらなる実験において、以下の九つの組成物を比較した。
【０１０７】
【表１】
【０１０８】
図２０に示すように、これらの結果は、最高の血清抗ＭｅｎＣ ＩｇＧ抗体力価が、ＬＴＫ６３変異体およびキトサンまたはＴＭＣの両方と一緒にＣＲＭ−ＭｅｎＣワクチンを用いて鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫されているマウスの群（第７群〜第９群）において得られたことを確認する。抗体の力価は、同一用量のワクチンを用いて皮下免疫化したマウスで見出された抗体力価に匹敵した（Ｐ＞０．０５）（皮下免疫したマウスにおいてのみ検出可能な抗体を誘導した、第一回の免疫化後の反応は除く）。１０μｇから５０μｇへのＴＭＣ用量の増加は、血清抗ＭｅｎＣ抗体反応の有意な増強を（ＴＭＣ １０μｇ［第４群］対ＴＭＣ ５０μｇ［第６群］についてＰ＜０．０１）、１μｇのＬＴＫ６３変異体のみを含むワクチンを用いて鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫したマウス（第３群）において観察されたレベルに匹敵するレベルまで誘導した。ワクチン処方物へ１μｇのＬＴＫ６３変異体を添加することによる抗ＭｅｎＣ抗体反応の有意な増強は、ＴＭＣの最小用量（１０μｇ）を受けているマウスの群において明白であった（第７群対第４群についてＰ＜０．０１）。アジュバントを加えたＣＲＭ−ＭｅｎＣワクチンを用いて鼻腔内免疫したマウスのみが、利用したアジュバント／ＴＭＣ用量に関係なく、ＭｅｎＣに対する検出可能な血清ＩｇＡ抗体を有したが、皮下（ｓ．ｃ．）免疫したマウスは有さなかった。最終的に、ＬＴＫ６３粘膜アジュバントおよびＴＭＣの両方の同時使用は、ＬＴＫ６３のみで誘導した殺菌性力価（１：４０００）、ＴＭＣのみで誘導した殺菌性力価（１：１，０００〜１：４，０００）、および皮下で与えられたワクチンのみで誘導した殺菌性力価（１：４，０００）よりもより高い殺菌性力価（１：１６，０００）を誘導した。
【０１０９】
同様の実験を、アジュバントとして非メチル化「Ｃｈｉｔｏｃｌｅａｒ」キトサンを用いて実施した。マウスに、同一の経路で、一用量あたり２．５μｇのサッカリドで同一の結合体抗原を与えたが、ＬＴ−Ｋ６３（１μｇ）および／またはキトサン（１０μｇまたは２０μｇ）を伴う。六つの群のマウスを使用した。
【０１１０】
【表２】
【０１１１】
図１７〜図１９に示すように、ミョウバンを用いた皮下投与と比べて、ＬＴ−Ｋ６３およびキトサンを用いた鼻腔内投与は、同等のＩｇＧ反応および血清殺菌性反応を生じ、鼻のＩｇＡ反応を生じた。
【０１１２】
（ＬＫＫ６３用量の減少）
補助剤としてのＴＭＣの使用が、全体的な粘膜免疫賦活作用を損失することなく、ＬＴＫ６３用量の減少を可能とするか否かについて調べるために、以下の組成物を試験した。
【０１１３】
【表３】
【０１１４】
図２１に示すように、一用量あたり１μｇでのＬＴＫ６３の強力な免疫賦活作用（第６群）は、この変異物を、０．１μｇまたは０．０５μｇ（第４群および第５群）の投薬量で用いた場合、劇的に低下する。ＬＴＫ６３変異体とＴＭＣとの同時使用は、血清抗ＭｅｎＣ抗体反応を完全に回復させた（第７群〜第９群）。
【０１１５】
殺菌性抗体反応は、限定的な用量のＬＴＫ６３変異体を用いて免疫されたマウスにおいてごく僅かであった（第４群および第５群）。しかし、ＬＴＫ６３を、ＴＭＣと同時投与した場合（第７群〜第９群）、ＣＲＭ−ＭｅｎＣ結合体ワクチンを皮下に受けたマウス（第１群）において見出される殺菌性抗体力価に匹敵するか、またはより高いレベルで殺菌性抗体力価は増加した。ＬＴＫ６３を加えたＣＲＭ−ＭｅｎＣワクチンと共にＴＭＣを用いて、または用いずに鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫したマウスは、鼻の洗浄液においてＭｅｎＣに対する検出可能なＩｇＡ抗体を有するが、皮下（ｓ．ｃ．）免疫したマウスは有さなかった。
【０１１６】
従って、ＴＭＣおよびＬＴＫ６３変異体の付加的な効果は、互いに限定された用量で非常に良好に効果を与え、その結果ＬＴＫ６３変異体の総量の使用は、ＴＭＣについての必要量を減少させ、そしてＴＭＣ総量の使用は、ＭｅｎＣに対する強力な抗体反応および防御抗体反応の誘導に必要なＬＴＫ６３変異体の量を限定する。実際に、非常に少量のＬＴＫ６３アジュバント（すなわち、０．１μｇまたは０．０５μｇ）で、ＣＲＭ−ＭｅｎＣ結合体ワクチンを、ＴＭＣと一緒に同時投与した場合、高殺菌性抗体力価が、誘導されたが、ＴＭＣが存在しない場合には誘導されなかった。これはまた、ＣＲＭキャリアおよびＬＴＫ６３自体に対する免疫反応の増強にも当てはまった（示さず）。
【０１１７】
これらのデータは、これらの分子の内因性粘膜免疫賦活作用が、適切な生体接着性物質と一緒に処方されることによって効率的に増強され得ることを明瞭に示す。従って、鼻腔内（ｉ．ｎ．）送達したワクチンの安全なプロフィールを、非毒性のＬＴ変異物およびＴＭＣの同時使用によってさらに増強されることが予測される。このデータは、髄膜炎菌性結合体ワクチンに対する保護免疫反応が、二つの適切な粘膜アジュバントの会合を用いる粘膜免疫によって改善され得ることを示す。特に、この保護免疫反応の質は、適切な用量の粘膜アジュバントに依存して改変され得る。
【０１１８】
（Ｔｈ１／Ｔｈ２偏り）
キトサンを用いて処方したＣＲＭ１９７を用いた鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫は、優先的に機能的Ｔｈ２型表現型に向かって免疫反応を誘導し［１８３、１８４］、その一方でＬＴ変異物、特に非毒性ＬＴＫ６３変異体は、Ｔｈ１／Ｔｈ０機能的表現型に向かう鼻腔内（ｉ．ｎ．）免疫の後、抗原特異的免疫反応に優先的に偏る［１８５〜１５７］。本発明の組成物のＴｈ１／Ｔｈ２のバランスを研究し、そしてＬＴＫ６３アジュバントまたはＴＭＣアジュバントの使用を、用いた用量に依存するＴｈ１型反応またはＴｈ２型反応を誘導するためにこれら二つの成分の性質を微細に調節することを見出した。
【０１１９】
マウスを、上記のように免疫化した。群は、以下を受けた。
【０１２０】
【表４】
【０１２１】
個々のマウスに由来する脾臓を、切除し、マウスの各群に由来する細胞を、一緒にプールし、１０％胎仔ウシ血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００Ｕペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびに５ｍＭ ２−メルカプト−エタノールを含有するＤＭＥＭ中に懸濁した。２×１０５細胞を、Ｕ底９６ウェルプレート中の２００μｌの培地に播種し、そして示したように異なる濃度でＣＲＭ−ＭｅｎＣ結合体を用いて５日間刺激した。細胞増殖を、培養を終了する前に１６時間、１ウェルあたり１μＣｉの３［Ｈ］−チミジンを添加することによって決定した。次いで細胞を、濾紙上に回収し、取り込まれた放射活性を、シンチレーションカウンターで測定した。
【０１２２】
最高濃度の抗原を用いて刺激した三連の細胞培養に由来する上清を、プールし、そしてラット抗マウスサイトカイン特異的モノクローナル抗体を用いてＩＦＮ−γおよびＩＬ−５のレベルを調べるためにＥＬＩＳＡによって試験した。手短に言えば、９６穴プレートを、０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液で希釈した適切な量の抗マウスＩＦＮ−γ抗体または抗マウスＩＬ−５抗体を用いてコートした。４℃で一晩のインキュベーション、洗浄および室温で２時間１％ ＢＳＡを用いてコートされていない部位の浸潤の後、上清を、ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。結合したサイトカインを、ビオチン化抗ＩＦＮ−γ抗体または抗ＩＬ−５抗体を用いて決定し、その後ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジンを３７℃で１時間添加した。結合した抗体を、ｏ−フェニレンジアミン基質を用いて示し、その後マイクロプレートＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍでプレートを読んだ。サイトカイン濃度は、組換えマウスＩＦＮ−γまたは組換えマウスＩＬ−５の既知の量を用いて作製された検量線生成によって決定した。
【０１２３】
図２２に示したように、ＬＴＫ６３のみを加えたＣＲＭ−ＭｅｎＣワクチンを用いた鼻腔内免疫は、最高用量で与えた場合（１μｇ、第６群）、ＩｇＧ１アイソタイプおよびＩｇＧ２ａアイソタイプの両方の抗ＭｅｎＣ ＩｇＧ抗体を誘導した。しかし、より少量の用量では（すなわち、０．１μｇおよび０．０５μｇ）、抗ＭｅｎＣ ＩｇＧ１は、検出可能であったが、低い力価では、ＩｇＧ２ａは、検出できなかった。ＴＭＣのみを用いた場合、抗ＭｅｎＣ ＩｇＧ１抗体のみが、検出可能であった。ＣＲＭ−ＭｅｎＣワクチンを伴うＬＴＫ６３変異体とＴＭＣとの同時投与は、抗ＭｅｎＣ ＩｇＧ１抗体の力価を増強する（第７群、第８群、および第９群対第３群についてｐ＜０．０５）だけでなく、特に少用量のＬＴＫ６３において（第７群および第８群）ＩｇＧ２ａ抗体を誘導した。予測したように、水酸化アルミニウムの存在下での皮下免疫は、ＩｇＧ２ａと比較した場合、ＭｅｎＣに対するＩｇＧ１のより高い力価を誘導し、重要なことに、鼻腔内ワクチンを受けているマウスにおいて決して検出されないＩｇＥも誘導した。全てのこれらのデータにより、Ｔｈ２反応をプライムし得るＴＭＣ様化合物の存在下においてすら、Ｔｈ１依存性抗原特異的ＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ２ａ）を誘導するＬＴＫ６３の性質が強く確認される。
【０１２４】
ＬＴＫ６３またはＴＭＣの存在下においてＣＲＭ−ＭｅｎＣワクチンによる鼻腔内免疫は、インビトロでの抗原による再刺激により特異的に増殖するＴ−細胞のプライミングを誘導した。さらに、マウスが、皮下に結合体ワクチンを受けているマウスにおいて観察されるレベルと同様かまたはより高いレベルでＬＴＫ６３およびＴＭＣの両方を伴うワクチンを受けている場合、この増殖反応は、増強した。
【０１２５】
図２３に示すように、ＴＭＣのみを加えたワクチンを用いた鼻腔内免疫は、ＩＬ−５とＩＦＮ−γとの両方の産生を誘導した。免疫化のために用いられたＴＭＣ量の増加は、ＩＦＮ−γの産生量を強く抑制したが、ＩＬ−５の産生量を抑制しなかった。ＴＭＣを伴うワクチン処方物へのＬＴＫ６３変異体（一用量あたり１μｇ）の添加は、細胞のＩＬ−５を産生する能力を劇的に抑制し、同時に、ＬＴＫ６３のみを加えたワクチンを用いて免疫化したマウスに由来する培養物の上清において検出可能であるのと同様に高レベルのＩＦＮ−γを誘導した。ＩＦＮ−γの産生を誘導するＬＴＫ６３の能力は、鼻腔内免疫のためにより少用量（０．１μｇまたは０．０５μｇ）を用いた場合、顕著に減少した（図２４）。ワクチン処方物へのＴＭＣの添加は、ＬＴＫ６３の最高用量（１μｇ）でのＩＦＮ−γ産生のパターンを変化させなかった；逆に、ＬＴＫ６３を、より少用量で与えた場合、ＩＬ−５の産生を有利にした。まとめると、これらのデータは、（ｉ）機能的Ｔｈ１型表現型に向かう免疫反応を偏らせるＬＴＫ６３の性質（主により高用量で）、（ｉｉ）機能的Ｔｈ２型免疫反応を促進するＴＭＣの性質、（ｉｉｉ）二つの成分の適切な用量および「混合」によりＴｈ１型免疫反応とＴｈ２型免疫反応との間のバランスを調節する可能性を示す。
【０１２６】
キトサンおよびＬＴＫ３６についてのＴｈ１／Ｔｈ２バランスのこれまでの研究は、固定した、高用量のＬＴＫ６３（１μｇ以上）またはキトサンを用いている。しかし、両成分の減少した用量を用いて、ＴＭＣおよびＬＴＫ６３によってプライムしたＴｈ２型反応およびＴｈ１型反応は、より容易に観察され得る。ＴＭＣおよびＬＴＫ６３の最低用量において、免疫反応の偏りは、ほとんど明らかでなかった。１μｇのＬＴＫ６３が、ＴＭＣの任意の用量を含有するワクチン処方物に添加された場合、免疫反応は、Ｔｈ１型反応に向かって一貫して偏らされ、ＩＦＮ−γの産生およびＩＬ−５産生の全体的な抑制を伴う。これらのデータは、ＴＭＣのＴｈ２に偏った（ＩＬ−５産生）反応をしのぐＬＴＫ６３の顕著なＴｈ１誘導の役割を強く示唆する。実際、ＩＬ−５の産生は、最低用量のＬＴＫ６３と一緒に最高用量のＴＭＣを受けている群においてのみ維持された。ＬＴＫ６３変異体の含有は、Ｔｈ１型免疫反応を有利にし、さもなければ単独で用いた鼻腔内のＴＭＣまたは皮下のミョウバンによってＴｈ２機能的表現型に向かって駆動されている。
【０１２７】
まとめると、このデータは、優先的なＴｈ１機能的表現型またはＴｈ２機能的表現型に向かう免疫反応の偏りは、ワクチン処方物に存在する特定の粘膜アジュバントによって駆動されるだけでなく、重要なことに、鼻腔内送達したワクチン処方物に存在する成分の各々の相対量によっても駆動される。従って、本保護免疫反応の特性を、適切な用量の粘膜アジュバントおよび送達系によって、保護に必要とされるエフェクターの機能に応じて、微細に調整し得る。
【０１２８】
（混合性ワクチン）
オリゴ糖結合体の混合性ＡＣＷＹ組成物を、参考文献８に記載される物質を用いて調製した。この組成物を、ＰＢＳを用いてｐＨ ７．４に緩衝した。結合体の各々の濃度は、以下であった。
【０１２９】
【表５】
【０１３０】
この組成物を、アジュバントを用いないかまたは以下の粘膜アジュバントのうちの一つを用いて、１０μｌの容量（一方の外鼻孔につき５μｌ）でマウスに鼻腔内投与した。
【０１３１】
【表６】
【０１３２】
比較のために、同一の抗原組成物を、水酸化アルミニウムアジュバントを用いて皮下に投与した。
【０１３３】
コントロールとして、ＭｅｎＣ結合体のみを、組合せの組成物におけるＭｅｎＣと同じ濃度で同一の経路によって、同一のアジュバントを用いて投与した。
【０１３４】
従って、１０個の群のマウスは、以下の組成物を受けた。
【０１３５】
【表７】
【０１３６】
実験の最初の組において、以下の３つの鼻腔内用量（ミョウバンについては皮下）の血清ＩｇＧレベルは、以下のとおりであって、ＧＭＴ（ＭＥＵ／ｍｌ）±標準偏差として表した（図２）：
【０１３７】
【表８】
【０１３８】
同一の動物を、胎児ウサギの補体存在下で血清殺菌性抗体について試験した。用いた株は、Ａ−Ｆ６１２４、Ｃ−Ｃ１１、Ｗ１３５−５５５４およびＹ−２４０５３９であった。
【０１３９】
結果は、以下のとおりであった（図３）：
【０１４０】
【表９】
【０１４１】
脾臓における細胞の増殖もまた、同一の１０群について試験した。ＭｅｎＡＣＷＹ抗原を受けた奇数の群についての結果を図４Ａに示し、ＭｅｎＣのみを受けた偶数の群は、図４Ｂである。
【０１４２】
実験の第二組において、マウスは、鼻腔内に２０μｌの以下のＡＣＷＹ組成物（各抗原として２μｇのサッカリド）を受けた（皮下にＡＣＷＹ組成物を受けた１群を除く）：
【０１４３】
【表１０】
【０１４４】
三回の免疫化後の血清ＩｇＧを、図５に示し、血清ＢＣＡを、図６に示し、そして細胞増殖を、図７Ａおよび図７Ｂに示す。
【０１４５】
同様の実験の第三組において、マウスは、鼻腔内に２０μｌの以下のＡＣＷＹ組成物（各抗原として２μｇのサッカリド）を受けた（皮下にＡＣＷＹ組成物を受けた第１群を除く）：
【０１４６】
【表１１】
【０１４７】
三回の免疫化後の血清ＩｇＧを、図８に示し、血清ＢＣＡを、図９に示し、そして細胞増殖を、図１０Ａおよび図１０Ｂに示す。
【０１４８】
従って、ＬＴＫ６３およびＴＭＣの両方、特にこれらの組み合わせは、髄膜炎菌の血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙに対する混合性ワクチンの鼻腔内送達のための高度に効果的なアジュバントである。
【０１４９】
本発明は、例のみによって記載され、本発明の範囲内および精神内にある限り、改変がなされ得ると理解される。
【０１５０】
【数１】
【０１５１】
【数２】
【０１５２】
【数３】
【０１５３】
【数４】
【０１５４】
【数５】
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、オリゴ糖結合体の調製を例示する。
【図２】図２、図５および図８は、例に由来する血清ＩｇＧデータを示す。
【図３】図３、図６、および図９は、実施例に由来する血清ＢＣＡデータを示す。
【図４】図４、図７および図１０は、実施例に由来する脾臓の増殖データを示す。
【図５】図２、図５および図８は、実施例に由来する血清ＩｇＧデータを示す。
【図６】図３、図６、および図９は、実施例に由来する血清ＢＣＡデータを示す。
【図７】図４、図７および図１０は、実施例に由来する脾臓の増殖データを示す。
【図８】図２、図５および図８は、実施例に由来する血清ＩｇＧデータを示す。
【図９】図３、図６、および図９は、実施例に由来する血清ＢＣＡデータを示す。
【図１０】図４、図７および図１０は、実施例に由来する脾臓の増殖データを示す。
【図１１】図１１は、キトサンの繰り返し構造を示す。
【図１２】図１２は、キチンの繰り返し構造を示す。
【図１３】図１３は、トリメチルキトサンの繰り返し構造を示す。
【図１４】図１４は、ＴＭＣおよび／またはＬＴ−Ｋ６３を用いたＩｇＧ ＥＬＩＳＡ力価（１４Ａ）および殺菌性力価（１４Ｂ）を示す。
【図１５】図１５は、同一の実験についての血清（１５Ａ）および鼻の洗浄液（１５Ｂ）におけるＩｇＡ力価を示す。
【図１６】図１６は、ＣＲＭ１９７濃度（μｇ／ｍｌ）と共に変化する脾臓増殖アッセイの結果を示す。
【図１７】図１７は、キトサンアジュバントと共に三用量のＭｅｎＣ抗原を与えた後得られた血清ＩｇＧ力価を示す。
【図１８】図１８は、同一の実験についての鼻のＩｇＡ力価を示す。
【図１９】図１９は、同一の実験についての血清殺菌性抗体を示す。
【図２０】図２０および図２１は、第一回免疫後（ポスト−１）、第二回免疫後（ポスト−２）、および第三回免疫後（ポスト−３）のＥＬＩＳＡによって測定された血清抗ＭｅｎＣ ＩｇＧ抗体の力価（上；力価±ＳＤを意味する）を示し、三回の免疫後得られたプールサンプルにおいて試験された血清殺菌性抗体の力価（下）を示す。
【図２１】図２０および図２１は、第一回免疫後（ポスト−１）、第二回免疫後（ポスト−２）、および第三回免疫後（ポスト−３）のＥＬＩＳＡによって測定された血清抗ＭｅｎＣ ＩｇＧ抗体の力価（上；力価±ＳＤを意味する）を示し、三回の免疫後得られたプールサンプルにおいて試験された血清殺菌性抗体の力価（下）を示す。
【図２２】図２２は、三回の免疫後、ＥＬＩＳＡによるＭｅｎＣ−特異的ＩｇＧ１抗体力価、ＭｅｎＣ−特異的ＩｇＧ２ａ抗体力価およびＭｅｎＣ−特異的ＩｇＥ抗体力価を示す。各値は、平均力価±ＳＤを示す。
【図２３】図２３は、ＴＭＣを用いたＩＬ−５反応およびＩＦＮ−γ反応を示す。
【図２４】図２４は、ＬＴＫ６３を用いたＩＬ−５反応およびＩＦＮ−γ反応を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粘膜送達のための免疫原性組成物であって、該組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの少なくとも二つの血清群に由来する莢膜サッカリドを含む、組成物。
【請求項２】
免疫原性組成物であって、該組成物は、（ａ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃに由来する莢膜サッカリド抗原、および（ｂ）キトサンアジュバントを含む、組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物であって、該組成物は、（ｃ）一以上のさらなる抗原および／または（ｄ）一以上のさらなるアジュバントを含む、組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかの請求項に記載の組成物であって、ここで前記莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に結合され、および／またはオリゴ糖である、組成物。
【請求項５】
請求項３に記載の組成物であって、ここで前記莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に結合されたオリゴ糖である、組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかの請求項に記載の組成物であって、該組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの２個、３個または４個に由来する莢膜サッカリドを含む、組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物であって、該組成物は、血清群Ａ＋Ｃ、血清群Ａ＋Ｗ１３５、血清群Ａ＋Ｙ、血清群Ｃ＋Ｗ１３５、血清群Ｃ＋Ｙ、血清群Ｗ１３５＋Ｙ、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｙ、血清群Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ、または血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙに由来するサッカリドを含む、組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかの請求項に記載の組成物であって、該組成物は、鼻腔内投与のために適合および／またはパッケージ化される、組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物であって、該組成物は、鼻内噴霧または点鼻液の形態である、組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかの請求項に記載の組成物であって、該組成物は、キトサンアジュバントおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素の解毒変異体を含む、組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物であって、ここで前記キトサンは、トリ−アルキル化キトサンである、組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物であって、ここで前記キトサンは、トリメチルキトサンである、組成物。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組成物であって、ここで前記Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素の解毒変異体は、残基６３でセリンからリジンへの置換を有する、組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかの請求項に記載の組成物であって、ここで該組成物は、（１）髄膜炎菌のサッカリド、（２）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する免疫反応を誘導する抗原、および（３）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫反応を誘導する抗原の三つ全てを含まない、組成物。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれかの請求項に記載の組成物であって、ここで該組成物は、（１）髄膜炎菌のサッカリド、（２）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する免疫反応を誘導する抗原、および（３）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫反応を誘導する抗原の三つ全て、ならびにキトサンのアルキル化誘導体を含む、組成物。
【請求項１６】
キットであって、（ａ）凍結乾燥された形態のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａに由来する莢膜サッカリド、ならびに（ｂ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの一以上に由来する莢膜サッカリドを含み、ここで（ａ）および（ｂ）は、組み合わされた場合、粘膜投与に適しているように処方されている、キット。
【請求項１７】
患者において免疫反応を惹起する方法であって、該方法は、請求項１〜１５のいずれか一項による組成物を患者へ投与する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの少なくとも二つに由来する莢膜サッカリドの使用であり、ここで該莢膜サッカリドは、免疫反応を惹起するために、動物へ粘膜送達するための医薬品の製造において、キャリアタンパク質に結合され、および／またはオリゴヌクレオチドである、使用。
【請求項１９】
免疫反応を惹起するために、動物へ粘膜送達するための医薬品の製造における、（１）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの少なくとも一つに由来する莢膜サッカリドであって、ここで該莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に対して結合され、および／またはオリゴ糖である、莢膜サッカリド、ならびに（２）キトサン、の使用。
【請求項２０】
請求項１８または請求項１９に記載の使用であって、ここで前記医薬品は、鼻腔内送達用である、使用。
【請求項２１】
ワクチン組成物であって、該組成物は、キトサンアジュバント、変異ＡＤＰ−リボシル化毒素および抗原を含み、ここで該ワクチン組成物は、被験体への投与後、Ｔｈ１に偏った免疫反応を生じる、ワクチン組成物。
【請求項１】
粘膜送達のための免疫原性組成物であって、該組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの少なくとも二つの血清群に由来する莢膜サッカリドを含む、組成物。
【請求項２】
免疫原性組成物であって、該組成物は、（ａ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃに由来する莢膜サッカリド抗原、および（ｂ）キトサンアジュバントを含む、組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物であって、該組成物は、（ｃ）一以上のさらなる抗原および／または（ｄ）一以上のさらなるアジュバントを含む、組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかの請求項に記載の組成物であって、ここで前記莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に結合され、および／またはオリゴ糖である、組成物。
【請求項５】
請求項３に記載の組成物であって、ここで前記莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に結合されたオリゴ糖である、組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかの請求項に記載の組成物であって、該組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの２個、３個または４個に由来する莢膜サッカリドを含む、組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物であって、該組成物は、血清群Ａ＋Ｃ、血清群Ａ＋Ｗ１３５、血清群Ａ＋Ｙ、血清群Ｃ＋Ｗ１３５、血清群Ｃ＋Ｙ、血清群Ｗ１３５＋Ｙ、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、血清群Ａ＋Ｃ＋Ｙ、血清群Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙ、または血清群Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙに由来するサッカリドを含む、組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかの請求項に記載の組成物であって、該組成物は、鼻腔内投与のために適合および／またはパッケージ化される、組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の組成物であって、該組成物は、鼻内噴霧または点鼻液の形態である、組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかの請求項に記載の組成物であって、該組成物は、キトサンアジュバントおよび／またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素の解毒変異体を含む、組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物であって、ここで前記キトサンは、トリ−アルキル化キトサンである、組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の組成物であって、ここで前記キトサンは、トリメチルキトサンである、組成物。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組成物であって、ここで前記Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性毒素の解毒変異体は、残基６３でセリンからリジンへの置換を有する、組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかの請求項に記載の組成物であって、ここで該組成物は、（１）髄膜炎菌のサッカリド、（２）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する免疫反応を誘導する抗原、および（３）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫反応を誘導する抗原の三つ全てを含まない、組成物。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれかの請求項に記載の組成物であって、ここで該組成物は、（１）髄膜炎菌のサッカリド、（２）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに対する免疫反応を誘導する抗原、および（３）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対する免疫反応を誘導する抗原の三つ全て、ならびにキトサンのアルキル化誘導体を含む、組成物。
【請求項１６】
キットであって、（ａ）凍結乾燥された形態のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａに由来する莢膜サッカリド、ならびに（ｂ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの一以上に由来する莢膜サッカリドを含み、ここで（ａ）および（ｂ）は、組み合わされた場合、粘膜投与に適しているように処方されている、キット。
【請求項１７】
患者において免疫反応を惹起する方法であって、該方法は、請求項１〜１５のいずれか一項による組成物を患者へ投与する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの少なくとも二つに由来する莢膜サッカリドの使用であり、ここで該莢膜サッカリドは、免疫反応を惹起するために、動物へ粘膜送達するための医薬品の製造において、キャリアタンパク質に結合され、および／またはオリゴヌクレオチドである、使用。
【請求項１９】
免疫反応を惹起するために、動物へ粘膜送達するための医薬品の製造における、（１）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの少なくとも一つに由来する莢膜サッカリドであって、ここで該莢膜サッカリドは、キャリアタンパク質に対して結合され、および／またはオリゴ糖である、莢膜サッカリド、ならびに（２）キトサン、の使用。
【請求項２０】
請求項１８または請求項１９に記載の使用であって、ここで前記医薬品は、鼻腔内送達用である、使用。
【請求項２１】
ワクチン組成物であって、該組成物は、キトサンアジュバント、変異ＡＤＰ−リボシル化毒素および抗原を含み、ここで該ワクチン組成物は、被験体への投与後、Ｔｈ１に偏った免疫反応を生じる、ワクチン組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【公表番号】特表２００６−５１６６０９（Ｐ２００６−５１６６０９Ａ）
【公表日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０２４８６（Ｐ２００６−５０２４８６）
【出願日】平成１６年１月３０日（２００４．１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／０００６７３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６７０３３
【国際公開日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【出願人】（５９２２４３７９３）カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (107)
【出願人】（５０５２８５６５２）ユニバーシタイト ライデン (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１月３０日（２００４．１．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００４／０００６７３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６７０３３
【国際公開日】平成１６年８月１２日（２００４．８．１２）
【出願人】（５９２２４３７９３）カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (107)
【出願人】（５０５２８５６５２）ユニバーシタイト ライデン (2)
【Ｆターム（参考）】
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