精度管理用疑似組織及びそれを用いた精度管理方法
【課題】遺伝子検査における前処理の精度管理に用いることのできる精度管理用疑似組織を提供する。
【解決手段】核酸又は細胞と、前記核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなる精度管理用疑似組織。
【解決手段】核酸又は細胞と、前記核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなる精度管理用疑似組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精度管理用疑似組織（以下、単に疑似組織ともいう）及び該疑似組織を用いた精度管理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年臨床診断の分野において遺伝子検査が急速に普及している。遺伝子検査とは、核酸や染色体などを分析して疾患に関連する変異や核型などの有無を臨床目的で検査することである。遺伝子検査の一例として、生体から切除した組織内に癌細胞由来の核酸が存在するかどうかを判定する検査がある。その検査工程は、主に前処理、核酸増幅、及び検出の三工程からなる。
【０００３】
前処理には様々な方法がある。例として、先ず検査目的で生体から切除した組織に前処理用の試薬を加える。次に試薬を添加された切除組織をホモジナイズし、得られたホモジネートから核酸を含む測定用試料を調製する。
核酸増幅では、前記測定用試料をサンプル容器に収容してそこに酵素やプライマなどの試薬を加え、核酸増幅反応によって標的核酸を増幅する。
検出では、蛍光染色された標的核酸の蛍光測定や増幅に比例して産生される副産物の濁度測定などにより、切除組織中の標的核酸の有無の判定又は濃度の算出を行う。
【０００４】
上述のような遺伝子検査では、各工程（前処理、核酸増幅、及び検出）における様々な要素が測定結果に影響を与える。このため、遺伝子検査の分野において、各工程の精度及び信頼性の確保のための精度管理の充実が重要となる。
【０００５】
核酸増幅及び検出に関しては、ポジティブコントロールとして濃度既知の標的核酸を含むコントロール溶液、及びネガティブコントロールとして増幅されるべきではない核酸を含むコントロール溶液を用いて精度管理を行っている。
【０００６】
ポジティブコントロールは標的核酸の増幅及び増幅された標的核酸の検出が正常に行われているかどうかを確認するためのものであり、ネガティブコントロールは増幅されるべきではない核酸が増幅しないことを確認するためのものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前処理に関しては、精度管理が行われていないことが現状である。ホモジナイズを手動で行う場合、前処理を行う者の技量によって切除組織のホモジナイズの程度に差がある。また、ホモジナイズを自動破砕装置などによって自動的に行う場合、ブレンダの回転数等のホモジナイズ条件の設定や継続使用によるブレンダの磨耗などにより切除組織のホモジナイズの程度に差が生じる。従って、ホモジナイズを手動で行う場合も、自動破砕装置などによって行う場合も、ホモジナイズ条件等の前処理の精度管理が必要である。従って、前処理の精度を管理するための精度管理用物質及びこの精度管理用物質を用いた精度管理方法の開発が望まれている。
【０００８】
本発明は、遺伝子検査における前処理の精度管理に用いることのできる精度管理用疑似組織を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、核酸又は細胞と、前記核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなる精度管理用疑似組織を提供する。
【００１０】
また、本発明は、核酸又は細胞と、前記核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織にホモジナイズを含む核酸抽出処理を施して測定した核酸濃度測定値と、表示値とを比較して、前記核酸抽出処理が適切になされたかどうかを判定する精度管理方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、標的核酸又は標的核酸を含む細胞と、前記標的核酸又は標的核酸を含む細胞を保持することのできる保持体とからなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織をホモジナイズしてホモジネートを作製するホモジナイズ工程と、前記ホモジネートに含まれる標的核酸を増幅する増幅工程と、増幅された標的核酸を検出し疑似組織に由来する標的核酸濃度を測定する測定工程と、前記精度管理用疑似組織の標的核酸濃度の測定値と表示値とを比較して前記ホモジナイズ工程、増幅工程、及び測定工程が適切になされたどうかを判定する工程と、を有する精度管理方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、遺伝子検査における前処理の精度管理に用いることのできる精度管理用疑似組織が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の一実施形態を説明する。
本実施形態における疑似組織は疑似的な生体組織、具体的には生体から切除されたリンパ節と想定され、遺伝子検査における前処理の精度管理に用いられる。
この疑似組織は、核酸又は細胞と、核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなる。
【００１４】
本発明の核酸は、ＤＮＡやＲＮＡだけでなく、ＰＮＡ、ＢＮＡ、これらの類縁体などの人工核酸をも含む。また、本発明の核酸として、例えばArmored RNA（米国特許５６７７１２４号公報参照）などのように核酸をタンパク質等に封入したものを用いてもよい。
これら核酸の由来は特に限定されず、細胞から抽出したものでも、人工的に合成したものであってもよい。
【００１５】
細胞としては、核酸を含有する細胞であれば特に限定されないが、遺伝子検査における被検査物質の一部又は全部をコードする遺伝子、この遺伝子に対応するｍＲＮＡ、及び／又はこれらの一部配列を含有する細胞であることが好ましい。遺伝子検査における被検査物質としては、腫瘍マーカーが挙げられる。腫瘍マーカーとしては、サイトケラチン（ＣＫ）、癌胎児性抗原、α胎児タンパク、組織ポリペプチド抗原、免疫抑制酸性タンパク、αフェトプロテイン、塩基性フェトプロテイン、ＰＩＶＫＡ、ＤＵＰＡＮ、エラスターゼ、ＳＣＣ抗原、Ｐｒｏ ＧＲＰ、神経特異エノラーゼ、尿中ＮＭＰ−２２、前立腺酸性フォスファターゼ、γセミノプロテインなどを例示することができる。
【００１６】
保持体としては、室温では固形形態を呈し、一定温度迄加温する事によって固形形態が崩壊して流動化するものが好ましい。また、固形形態において生体組織と同程度の固さを有するものが好ましい。
保持体は、ゲル化剤を含むのが好ましい。ゲル化剤とは、溶媒に添加することによって溶液をゲル化させる性質を持つ物質である。ゲル化剤としては、例えば、寒天、アガロース、カラギーナン、アルギン酸、アルギン酸塩、ペクチン、コラーゲン、ゼラチン、グルテンなどの天然高分子や、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）などの合成高分子などが挙げられる。本実施形態の疑似組織には、これら合成高分子及び天然高分子のうち、一種又は二種以上を用いることができる。また、ゲル化剤を添加する溶媒としては特に限定されないが、例えば水、TE（Tris EDTA)、TAE（Tris-Acetate EDTA）、TBE（Tris-Borate EDTA）などを用いることができる。
【００１７】
寒天は、紅藻類の細胞壁に含まれるガラクトース及びガラクトース誘導体から構成される多糖である。ゲル化剤として用いることができれば寒天の起源は特に限定されず、例えばテングサ属、オゴノリ属、ムカデノリ属、イバラノリ属、スギノリ属、ヒラクサ、オニクサなどから精製されたものを用いることができる。
【００１８】
アガロースは、交互に結合したＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとを主構造とする多糖であり、Ｄ−ガラクトースの１位と３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの４位がβグリコシド結合で、また、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの１位とＤ−ガラクトースの３位がαグリコシド結合で結合している。ゲル化剤として用いることができればアガロースの起源は特に限定されない。アガロースは寒天中に通常約７０％の割合で含まれ、精製すると高純度のものを得ることができる。アガロースは精製度の低いものから高いものまで、様々なアガロース含量のものを使用できる。
【００１９】
カラギーナンは紅藻類に含まれる多糖である。ゲル化剤として用いることができればカラギーナンの起源は特に限定されず、例えばスギノリ科、ミリン科、イバラノリ科に属する生物などから精製されたものを用いることができる。本実施形態には例えばκ−カラギーナン、λ−カラギーナンなどを用いることができる。
κ−カラギーナンは、Ｄ−ガラクトース−４−硫酸の１位と３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースの４位がβグリコシド結合で、 また、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースの１位とＤ−ガラクトース−４−硫酸の３位がαグリコシド結合で交互に繰り返された基本構造を持つ。
λ−カラギーナンは、Ｄ−ガラクトースの１位とＤ−ガラクトース−２，６−二硫酸の４位とがβグリコシド結合で、また、Ｄ−ガラクトース−２，６−二硫酸の１位とＤ−ガラクトースの３位とがαグリコシド結合で交互に繰り返された基本構造を持つ。
【００２０】
アルギン酸は褐藻類の細胞壁に含まれる多糖であり、β−１，４結合のＤ−マンヌロン酸とα−１，４結合のＬ−グルロン酸が連なった鎖状構造を有する。ゲル化剤として用いることができればアルギン酸の起源は特に限定されず、本実施形態には、例えばアルギン酸又はその塩（ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩など）などを用いることができる。
【００２１】
ペクチンは、植物の細胞壁に含まれる多糖であり、その主成分はα−１，４結合したＤ−ガラクツロン酸の一部にα−１，２結合したＬ−ラムノースが混在する主鎖を有し、アラビノース、ガラクトースなどの中性糖に富んだ側鎖を有する酸性多糖、即ちラムノガラクツロナン−Ｉである。ゲル化剤として用いることができればペクチンの起源は特に限定されない。
【００２２】
コラーゲンは、動物の細胞外マトリックスの主成分となるタンパク質で、３本のポリペプチド鎖からなる３重螺旋構造をとる。また、ゼラチンは、コラーゲンを熱湯で処理して得られる誘導タンパク質の一種である。ゲル化剤として用いることができればコラーゲン及びゼラチンの起源は特に限定されず、本実施形態には動物の組織から精製したもの、人工的に合成したものなどを用いることができる。
【００２３】
グルテンは、穀類に含まれる粘着性タンパク質で、グルテリン系のタンパク質とプロラミン系のタンパク質との会合によって形成される。ゲル化剤として用いることができればグルテンの起源は特に限定されず、本実施形態には例えばコムギやオオムギから抽出したもの、人工的に合成したものなどを用いることができる。
【００２４】
ＰＶＡはポリ酢酸ビニルの加水分解によって得られ、ビニルアルコール単位を主体としてなる合成高分子である。
【００２５】
ＰＥＧはエチレンオキシドのアルカリによるアニオン重合又はプロトン開始によるカチオン重合によって得られ、エチレングリコール単位を主体としてなる合成高分子である。
【００２６】
ＰＡＡはアクリルアミドのビニル基の重合又はアミド基の水素移動重合によって得られ、アクリルアミド単位を主体としてなる合成高分子である。
【００２７】
本実施形態に用いられるＰＶＡ、ＰＥＧ及びＰＡＡは、ゲル化剤として用いることができればその重合度などは特に限定されない。
【００２８】
上述の疑似組織を用いて吸光度測定や、核酸増幅及び核酸検出などによって、遺伝子検査における前処理の精度管理が行われる。
以下、実施例を示し、吸光度測定による前処理の精度管理（実施例１）と、核酸増幅及び核酸検出による前処理の精度管理（実施例２）とについて説明する。
【００２９】
（実施例１）
吸光度測定による前処理の精度管理は、核酸及び前記核酸を内部に保持することのできる保持体からなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織にホモジナイズを含む核酸抽出処理を施して測定した核酸濃度測定値と、表示値とを比較して、前記核酸抽出処理が適切になされたかどうかを判定することによって行う。
【００３０】
＜表示値αの算出＞
先ず、表示値を算出する。
表示値とは、定められたプロトコルによって作製された疑似組織に所定の前処理を施し、吸光度測定を行って算出された核酸濃度測定値のことである。この表示値と測定対象の核酸濃度測定値とを比較することによって測定対象に対して行った前処理の精度管理が行われる。
【００３１】
以下、表示値を算出するための疑似組織αの作製に関して説明する。
疑似組織αの吸光度測定に先立ち、核酸を含む核酸溶液又は細胞を含む細胞溶液と緩衝剤を含む試薬（以下、ホモジナイズ試薬とする）とを混和して、この混合物を基準試料αとする。核酸溶液を用いた場合、この基準試料αを吸光度測定して基準試料α中の核酸濃度を算出し、これを基準値αとする。細胞溶液を用いた場合、細胞溶液とホモジナイズ試薬との混合物を十分にホモジナイズしてこれを基準試料αとする。基準試料αの吸光度を測定して核酸濃度を算出し、これを基準値αとする。なお、細胞溶液中の細胞数は予め細胞計数盤（例えば、カウンティングチェンバー8100105；アズワン）や細胞計数装置（例えば、粒子計数分析装置CDA-500;シスメックス）などを用いて計数しておく。
【００３２】
次に、基準試料α作製に用いられた核酸溶液又は細胞溶液と同じものを同量用いて疑似組織αを作製する。
疑似組織αの作製に際し、先ずマイクロチューブなどの容器に溶媒を収容する。
ゲル化剤を容器中の溶媒に添加し、ゲル化剤と溶媒の混合物及び該混合物を収容した容器を恒温槽や電子レンジなどで加温し、ゲル化剤を溶媒中に完全に溶解させ、ゲル化剤溶液を作製する。
ゲル化剤溶液を収容した容器を常温下又は冷蔵庫内などの冷温下に放置し、ゲル化剤溶液を冷却する。
ゲル化剤溶液は一定温度以下になると固まってゲル状の固形形態をとるが、固形形態となる直前にピペットなどによりゲル化剤溶液に基準試料α作製の際に用いた核酸溶液又は細胞溶液と同じものを同量添加し、ゲル化剤溶液と核酸溶液又は細胞溶液との混合液中に核酸又は細胞の偏在が起こらないよう混和させる。
さらにゲル化剤溶液がゲル状の固形形態をとるまで液温を低下させると、核酸又は細胞を含むゲル化剤溶液はゲル化し、核酸又は細胞と核酸又は細胞を保持した保持体とからなる疑似組織αとなる。
【００３３】
上述のようにして作製された疑似組織αに、遺伝子検査における前処理と同様の処理を施す。
先ず疑似組織αにホモジナイズ試薬を添加する。ホモジナイズ試薬の添加量は、疑似組織αとホモジナイズ試薬との混合物の体積が基準試料αの体積と等しくなるよう調整する。
次に、疑似組織αとホモジナイズ試薬との混合物をホモジナイズし、ホモジネートを作製する。
疑似組織αから得られたホモジネートを遠心分離して、上清を別の容器に収容する。この上清の２６０ｎｍにおける吸光度測定を行い、核酸濃度を測定する。
【００３４】
疑似組織αから得られた上清中の核酸濃度が基準値αと等しいか、近似した場合（具体的には、該核酸濃度が基準値αの７０％以上、好ましくは８０％以上の値を示した場合）、疑似組織αホモジネートの上清に含まれる核酸がホモジナイズによって効果的に抽出できたことを示し、その核酸濃度測定値を表示値αとすることができる。
【００３５】
＜吸光度測定による前処理の精度管理＞
次に、表示値αに基づく精度管理方法について説明する。
精度管理用に疑似組織βを用意する。疑似組織βは上述した疑似組織αと同ロットの疑似組織である。
疑似組織βに対するホモジナイズ、遠心、上清回収などの前処理は、疑似組織αに施した前処理と同様にして行われる。
前処理によって得られた上清の２６０ｎｍにおける吸光度測定を行い、核酸濃度を測定する。
【００３６】
疑似組織βを前処理して得られた上清の核酸濃度測定値が、上述した表示値αと比較したときに表示値αと等しいか近似した値を示した場合、疑似組織βに対して施した前処理が適切であったことを確認できる。
【００３７】
（実施例２）
核酸増幅及び核酸検出による前処理の精度管理は、標的核酸又は標的核酸を含む細胞と、前記標的核酸又は標的核酸を含む細胞とを内部に保持することのできる保持体からなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織をホモジナイズしてホモジネートを作製するホモジナイズ工程と、前記ホモジネートに含まれる標的核酸を増幅する増幅工程と、増幅された標的核酸を検出し疑似組織に由来する標的核酸濃度を測定する測定工程と、前記精度管理用疑似組織の標的核酸濃度の測定値と表示値とを比較して前記ホモジナイズ工程、増幅工程、及び測定工程が適切になされたどうかを判定する工程と、からなる。
【００３８】
＜表示値γの算出＞
以下、表示値を算出するための疑似組織γの作製に関して説明する。
疑似組織γの核酸増幅及び核酸検出に先立ち、先ず標的核酸又は標的核酸を含む細胞を含む細胞溶液とホモジナイズ試薬とを混和して基準試料γを作製する。溶液に細胞を含有させる場合は、細胞溶液とホモジナイズ試薬との混合物を十分にホモジナイズしたものを基準試料γとする。なお、細胞溶液中の細胞数は予め計数しておく。
【００３９】
次に、基準試料γ作製に用いられた標的核酸又は細胞を含む溶液と同じものを同量用いて疑似組織γを作製する。
前述した疑似組織αの作製と同様にして疑似組織γを作製する。
疑似組織γにホモジナイズ試薬を添加する。ホモジナイズ試薬の添加量は、疑似組織γとホモジナイズ試薬との混合物の体積が基準試料γの体積と等しくなるよう調整する。
疑似組織γとホモジナイズ試薬との混合物をホモジナイズし、ホモジネートを作製する。
疑似組織γから得られたホモジネートを遠心分離して、上清を別の容器に収容する。以下、この上清を測定用試料γとする。
【００４０】
上述の基準試料γ及び測定用試料γに対して核酸増幅及び核酸検出を行う。
核酸増幅として、基準試料γ及び測定用試料γの上清に酵素試薬を加え、公知の核酸増幅法によって標的核酸を増幅させる（標的核酸がＲＮＡである場合は、このＲＮＡの塩基配列に対応するｃＤＮＡを増幅させる）。
【００４１】
検出としては、公知の核酸検出法の何れも用いることができる。
核酸増幅に伴って同時にピロリン酸マグネシウムなどの不溶性物質が精製される場合、反応液の上清の濁りを目視により確認する、或いは反応液の吸光度や散乱光強度を測定して濁度測定する、又は反応液を有色のフィルターで濾過し、フィルター上の残渣を確認することにより標的核酸を検出することができる（国際公開ＷＯ ０１／８３８１７号パンフレット参照）。
また、エチジウムブロマイド、SYBR GREEN I、或いはPico Greenのような二本鎖インターカレータである蛍光色素の存在下で核酸増幅を実施すれば、反応液の蛍光を測定することによって標的核酸検出を行うことができる。
濁度測定又は蛍光測定においては核酸増幅による生成物の増加に伴って濁度又は蛍光の増大が観察される。この増大をリアルタイムでモニターすれば、閉鎖系で核酸の増幅と濁度又は蛍光の増加とが同時に追跡可能である。
【００４２】
核酸検出を目視によって行う場合、基準試料γの濁りと測定用試料γの濁りを比較して、測定用試料γに対する前処理が正確に行われたかどうかを確認できる。
核酸検出を濁度測定によって行う場合は、測定用試料γの標的核酸濃度と基準試料γの標的核酸濃度（以下、基準値γとする）とを比較する。これらが等しいか、或いは近似した値を示した場合（具体的には、測定用試料γの標的核酸濃度が基準値γの７０％以上、好ましくは８０％以上の値を示した場合）、疑似組織γに由来する測定用試料γに含まれる標的核酸がホモジナイズによって効果的に抽出できたことを示し、その標的核酸濃度測定値を表示値γとすることができる。また、濁度又は蛍光の増大をリアルタイムでモニターする場合、測定用試料γに含まれる核酸が増幅し始めるまでの時間（以下、増幅立ち上がり時間とする）と基準試料γの増幅立ち上がり時間（以下、基準値γｔとする）とを比較する。これらが等しいか近似した値を示した場合、測定用試料γに含まれる標的核酸がホモジナイズによって効果的に抽出できたことを示し、その立ち上がり時間を表示値γｔとすることができる。
【００４３】
＜核酸増幅及び核酸検出による前処理の精度管理＞
次に、表示値γ又はγｔに基づく精度管理方法について説明する。
精度管理用に疑似組織δを用意する。疑似組織δは上述した疑似組織γと同ロットの疑似組織である。
疑似組織δに対するホモジナイズ、遠心、上清回収などの前処理は、疑似組織γに施した前処理と同様にして行われ、測定用試料δが作製される。
測定用試料δに、上述の測定用試料γに対して行った核酸増幅及び核酸検出と同様の操作を施し、測定用試料δの標的核酸濃度及び／又は増幅立ち上がり時間を測定する。
【００４４】
測定用試料δの標的核酸濃度測定値又は増幅立ち上がり時間が、上述の表示値γ又はγｔと等しいか近似した値を示した場合、疑似組織δに対して施した処理が適切であったことを確認できる。
【００４５】
なお、上述した前処理、核酸増幅、及び核酸検出のうち少なくとも一つの工程を装置によって自動的に行ってもよい。
例えば、核酸増幅及び核酸検出を自動的に行うものとして核酸増幅検出装置が挙げられる。
【００４６】
例えば癌手術での切除組織における癌転移診断を支援する核酸増幅検出装置を用いることができる。この装置によると、切除組織内のｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＬＡＭＰ （Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification、栄研化学）法によってｍＲＮＡからｃＤＮＡに逆転写し、このｃＤＮＡを増幅させ、増幅に伴い増大する溶液の濁度を測定することにより切除組織内のｍＲＮＡの増幅立ち上がり時間及びコピー数を算出する装置である。
【００４７】
以下、図面に基づき核酸増幅検出装置について説明する。
この核酸検出装置は、生体から切除した組織中に癌マーカー（例えば、サイトケラチン１９）に関する核酸がどのくらい含まれるかを定量する装置である。
図１は、核酸増幅検出装置及びその周辺機器の全体構成を示した斜視図である。
図２は図１に示した核酸増幅検出装置の測定部の全体構成を示した図である。
【００４８】
先ず、図１を参照して核酸増幅検出装置及びその周辺機器の全体構成について説明する。核酸増幅検出装置１００は、図１に示すように測定部１０１と、測定部１０１に通信回線で接続されたデータ処理部１０２とによって構成されている。データ処理部１０２は、キーボード１０２ａ及びマウス１０２ｂを含むパーソナルコンピュータからなる。また、データ処理部１０２には、周辺機器としてのプリンタ２００及びホストコンピュータ３００が通信回線を介して接続されている。プリンタ２００は、グラフィックデータやテキストデータなどを印刷するために設けられている。また、ホストコンピュータ３００にはデータ処理部１０２から測定データが出力される。
【００４９】
測定部１０１は、図２に示すように、分注機構部１０と、サンプル容器セット部２０と、試薬容器セット部３０と、チップセット部４０と、チップ廃棄部５０と、５つの反応検出ブロック６０ａからなる反応検出部６０とを含む。
測定部１０１には、図２に示すように、マイクロコンピュータにより装置を制御すると共に、装置外部との入出力を制御する制御部７０と、制御部７０を含む装置全体に電源を供給する電源部８０とが内蔵されている。また、測定部１０１の正面の所定箇所に緊急停止スイッチ９０が配置されている。
【００５０】
サンプル容器セット部２０と、試薬容器セット部３０と、チップセット部４０とは、Ｘ軸方向に沿って配置されている。また、サンプル容器セット部２０は、装置正面手前側に配置されており、試薬容器セット部３０は、装置正面奥側に配置されている。また、５つの反応検出ブロック６０ａと、チップ廃棄部５０とは、サンプル容器セット部２０、試薬容器セット部３０、及びチップセット部４０に対して、Ｙ軸方向に所定の間隔を隔てた位置に、Ｘ軸方向に沿って配置されている。即ち、サンプル容器セット部２０、試薬容器セット部３０、チップセット部４０、チップ廃棄部５０及び５つの反応検出ブロック６０ａが方形状（長方形状）に配置されている。
【００５１】
また、分注機構部１０は、Ｘ軸及びＹ軸方向（平面方向）に移動可能なアーム部１１と、アーム部１１に対してそれぞれ独立してＺ軸方向（垂直方向）に移動可能な２連（２本）のシリンジ部１２とを含んでいる。２本のシリンジ部１２は先端にピペットチップを装着することができるノズル部１２ａをそれぞれ備えている。
【００５２】
また、図２に示すように、サンプル容器セット部２０の凹部には、５つのサンプル容器セット孔２１ａと、把持部２１ｂとを有するサンプル容器セット台２１が取り外し可能にはめ込まれている。サンプル容器セット台２１の５つのサンプル容器セット孔２１ａは、Ｘ軸方向に沿って１つの列状に所定の感覚を隔てて設けられている。このサンプル容器セット台２１の５つのサンプル容器セット孔２１ａには、切除組織及び／又は疑似組織を前処理して作製された測定用試料が収容されたサンプル容器２２がセットされる。
【００５３】
試薬容器セット部３０の凹部には、２つのプライマ試薬容器セット孔３１ａ及び２つの酵素試薬容器セット孔３１ｂと、把持部３１ｃとを有する試薬容器セット台３１が、取り外し可能にはめ込まれている。試薬容器セット台３１のプライマ試薬容器セット孔３１ａ及び酵素試薬セット孔３１ｂは、それぞれ、Ｙ軸方向に沿って所定の間隔を隔てて２つずつ設けられている。この試薬容器セット台３１のプライマ試薬容器セット孔３１ａ及び酵素試薬セット孔３１ｂには、２種類のプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器３２ａ及びその２種類のプライマ試薬に対応する酵素試薬が収容された酵素試薬容器３２ｂがそれぞれ各２本ずつセットされる。なお、正面左側のプライマ試薬容器セット孔３１ａ及び酵素試薬容器セット孔３１ｂに、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）のｍＲＮＡに対応するプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器３２ａ及びＣＫ１９ｍＲＮＡの酵素試薬が収容された酵素試薬容器３２ｂが配置される。また、正面右側のプライマ試薬容器セット孔３１ａ及び酵素試薬容器セット孔３１ｂに、内部標準物質としてβアクチンのｍＲＮＡのプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器３２ａ及びβアクチンｍＲＮＡの酵素試薬が収容された酵素試薬容器３２ｂが配置される。
なお、内部標準物質としては、βアクチンに限らず、例えばハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡなどを用いることもできる（国際公開ＷＯ ０３／０７０９３５号パンフレット参照）。
【００５４】
チップセット部４０の２つの凹部には、３６本のピペットチップ４１を収納可能な収納孔４２ａを有する２つのラック４２がそれぞれ着脱可能にはめ込まれている。また、チップセット部４０には、２つの取り外しボタン４３が設けられている。この取り外しボタン４３を押すことにより、ラック４２が取り外し可能な状態になる。
【００５５】
反応検出部６０の各反応検出ブロック６０ａは、図２に示すように、反応部６１と、２つの濁度検出部６２と、蓋閉機構部６３とから構成されている。各反応部６１は検出セル６５を備えている。蓋閉機構部６３は、検出セル６５にセル部６７ａを装着する機能を有している。
【００５６】
（実施例３）
上述の核酸増幅検出装置による核酸検出を行う場合の操作手順及び装置の動作を具体的に説明する。ここでは、細胞と細胞を保持した保持体とからなる疑似組織を用いた場合について述べる。
【００５７】
＜表示値εｔの算出＞
疑似組織の核酸増幅及び核酸検出に先立ち、先ずＣＫ１９ｍＲＮＡを含むと考えられる細胞を含有させた細胞溶液とホモジナイズ試薬とを混和して試料作製を行い、十分にホモジナイズして、これを基準試料εとする。なお、細胞溶液中の細胞数は予め計数しておく。
【００５８】
次に、基準試料ε作製に用いられた細胞溶液と同じものを同量用い、前述した疑似組織αの作製と同様にして疑似組織εを作製する。
疑似組織εにホモジナイズ試薬を添加する。ホモジナイズ試薬の添加量は、疑似組織εとホモジナイズ試薬との混合物の体積が基準試料εの体積と等しくなるよう調整する。
疑似組織εとホモジナイズ試薬との混合物をホモジナイズし、ホモジネートを作製する。
疑似組織εから得られたホモジネートを遠心分離して、上清を別の容器に収容する。以下、この上清を測定用試料εとする。
【００５９】
基準試料ε及び測定用試料εを収容した容器を、サンプル容器セット台２１のサンプル容器セット孔２１ａにそれぞれセットする。
また、正面左側のプライマ試薬容器セット孔３１ａ及び酵素試薬容器セット孔３１ｂに、ＣＫ１９ｍＲＮＡのプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器３２ａ及びＣＫ１９ｍＲＮＡの酵素試薬が収容された酵素試薬容器３２ｂをセットする。
また、正面右側のプライマ試薬容器セット孔３１ａ及び酵素試薬容器セット孔３１ｂに、βアクチンｍＲＮＡのプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器３２ａ及びβアクチンｍＲＮＡの酵素試薬が収容された酵素試薬容器３２ｂをセットする。
また、チップセット部４０の凹部に、それぞれ３６本の使い捨て用ピペットチップ４１が収納された二つのラック４２を嵌め込む。さらに、各反応検出ブロック６０ａの反応部６１の二つの検出セルセット孔６１ａに、検出セル６５の二つのセル部６７ａをセットする。
【００６０】
そして、図１に示したデータ処理部１０２のキーボード１０２ａ及びマウス１０２ｂを用いて、測定項目の登録やサンプルＩＤの登録などを行った後、キーボード１０２ａ又はマウス１０２ｂにより測定部１０１の動作をスタートさせる。
【００６１】
測定部１０１の動作がスタートすると、分注機構部１０のアーム部１１がチップセット部４０に移動し、２つのシリンジ部１２が下方向に移動することによりノズル部１２ａの先端にピペットチップ４１が自動的に装着される。そして、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、試薬容器セット台３１にセットされたＣＫ１９ｍＲＮＡ及びβアクチンｍＲＮＡのプライマ試薬が収容された２つのプライマ試薬容器３２ａの上方に向かってＸ軸方向に移動される。そして、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、それぞれのピペットチップ４１の先端が、２つのプライマ試薬容器３２ａ内のＣＫ１９ｍＲＮＡ及びβアクチンｍＲＮＡのプライマ試薬の液面に挿入され、ピペットチップ４１内に各プライマ試薬が吸引される。
【００６２】
プライマ試薬吸引後、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、反応検出ブロック６０ａの上方に移動される。そして、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、２つのシリンジ部１２のノズル部１２ａに装着された２つのピペットチップ４１が、それぞれ、検出セル６５のセル部６７ａ内に挿入され、ＣＫ１９ｍＲＮＡ及びβアクチンｍＲＮＡのプライマ試薬がそれぞれ２つのセル部６７ａに吐出される。
【００６３】
プライマ試薬吐出後、２つのシリンジ部１２が上方に移動され、分注機構部１０のアーム部１１は、チップ廃棄部５０の上方に向かってＸ軸方向に移動される。チップ廃棄部５０において、ピペットチップ４１の廃棄が行われる。
【００６４】
次に、分注機構部１０のアーム部１１が再びチップセット部４０に移動し、チップセット部４０において上記と同様の動作により２つのシリンジ部１２のノズル部１２ａの先端に新しい２つのピペットチップ４１が自動的に装着される。そして、分注機構部１０のアーム部１１は、試薬容器セット台３１にセットされたＣＫ１９ｍＲＮＡ及びβアクチンｍＲＮＡの２つの酵素試薬がそれぞれ収容された２つの酵素試薬容器３２ｂの上方に向かってＸ軸方向に移動される。その後、２つのシリンジ部１２がした方向に移動されることにより、２つの酵素試薬容器３２ｂ内のＣＫ１９ｍＲＮＡ及びβアクチンｍＲＮＡの２つの酵素試薬が吸引され、２つのシリンジ部１２が上方向に移動される。そして、分注機構部１０のアーム部１１は、反応検出ブロック６０ａの上方に移動された後、ＣＫ１９ｍＲＮＡ及びβアクチンｍＲＮＡの２つの酵素試薬が、それぞれ検出セル６５の２つのセル部６７ａに吐出される。酵素試薬の吐出後、分注機構部１０のアーム部１１は、チップ廃棄部５０の上方に移動された後、ピペットチップ４１の廃棄が行われる。
【００６５】
次に、分注機構部１０のアーム部１１が再びチップセット部４０に移動された後、２つのシリンジ部１２のノズル部１２ａの先端に新しい２つのピペットチップ４１が自動的に装着される。そして、分注機構部１０のアーム部１１は、サンプル容器セット台２１にセットされた基準試料ε及び測定用試料εがそれぞれ収容された２つのサンプル容器２２の上方に向かってＸ軸方向に移動された後、基準試料ε及び測定用試料εがそれぞれピペットチップ４１内に吸引される。
【００６６】
検出セル６５の２つのセル部６７ａに基準試料ε及び測定用試料εがそれぞれ吐出される際、２つのシリンジ部１２が自動的にピペッティングを行うことにより、２つのセル部６７ａ内の混合液が混和される。この後、分注機構部１０のアーム部１１が、チップ廃棄部５０の上方に移動された後、ピペットチップ４１の廃棄が行われる。
【００６７】
上記のセル部６７ａへ各試薬、基準試料ε及び測定用試料εがそれぞれ収容され、蓋閉機構部６３によって検出セル６５のセル部６７ａの蓋が閉められた後、検出セル６５内の液温を約６５℃に加温することにより、前述したＲＴ−ＬＡＭＰにより、ＣＫ１９のｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを増幅させる。そして、増幅に伴い生成されるピロリン酸マグネシウムの白濁を濁度測定によりリアルタイムでモニターする。具体的には、ＬＥＤ光源（図示せず）から光を増幅反応時の検出セル６５のセル部６７ａに照射する。照射した光を受光素子で受光することにより、増幅反応時の検出セル６５のセル部６７ａ内の液濁度をリアルタイムでモニターし、基準試料ε及び測定用試料εに含まれているＣＫ１９ｍＲＮＡの増幅立ち上がり時間をそれぞれ算出する。ここでは、濁度が０．１に達した時間を増幅立ち上がり時間として算出する。
【００６８】
濁度測定によって算出された基準試料εの増幅立ち上がり時間を基準値εｔとする。測定用試料εのＣＫ１９ｍＲＮＡの増幅立ち上がり時間が、基準値εｔと等しいか、近似した値を示した場合、測定用試料εに含まれるＣＫ１９ｍＲＮＡがホモジナイズによって効果的に抽出できたことを示し、そのＣＫ１９ｍＲＮＡ増幅立ち上がり時間を表示値εｔとすることができる。
【００６９】
＜核酸増幅及び核酸検出による前処理の精度管理＞
次に、表示値εｔに基づく精度管理方法について説明する。
精度管理用に疑似組織ηを用意する。疑似組織ηは上述した疑似組織εと同ロットの疑似組織である。
疑似組織ηに対するホモジナイズ、遠心、上清回収などの前処理は、疑似組織εに施した前処理と同様にして行われる。
この疑似組織ηの上清に、上述の測定用試料εに対して行った核酸増幅及び核酸検出を施し、疑似組織ηの上清のＣＫ１９ｍＲＮＡの増幅立ち上がり時間を測定する。
【００７０】
疑似組織ηの上清のＣＫ１９ｍＲＮＡ増幅立ち上がり時間が、上述の表示値εｔと比較したときに表示値εｔと等しいか近似した値を示した場合、疑似組織ηに対して施した処理が適切であったことを確認できる。
【００７１】
なお、実施例１〜３において、基準試料や疑似組織に対するホモジナイズはペッスルなどによって手動で行ってもよい。また、特公平６−３６７３２記載の細胞破砕装置や特開２００４−２０９３２２記載の自動破砕装置を用いてもよい。ホモジナイズを手動で行う場合、実施例の疑似組織はペッスルなどによる細胞の破砕動作の精度が管理される。ホモジナイズを装置によって行う場合、装置のホモジナイズ条件の設定やブレンダの磨耗状態が管理される。
【００７２】
なお、実施例１〜３において、遠心分離の前に公知の核酸抽出法によってホモジネートから核酸を抽出精製してもよい。核酸抽出法の具体例としては、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝子包含体を分解し、その後、フェノール法、アルカリ法、あるいはフェノール・クロロホルム法等を用いて、遺伝子包含体の分解物から核酸を抽出する方法が従来使用される。最近では、核酸抽出の過程に置いて、イオン交換樹脂、ガラスフィルタ、ガラスビーズ或いは蛋白凝集作用を有する試薬等が使用されている。また核酸の抽出に核酸結合用担体を用いる系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウムを用いる方法、ヒドロキシアパタイトを用いる方法などが知られている。
【００７３】
以下、実験例を示す。
（実験例１）
実験例１では、核酸と核酸を保持する保持体とからなる疑似組織を作製し、ホモジナイズなどの所定の処理を施して２６０ｎｍの波長における吸光度測定によって疑似組織から核酸を抽出できるか否かを確認した。この疑似組織は生体から切除したリンパ節を想定して作製されたものである。
【００７４】
下記の組成を含むホモジナイズ試薬を調製した。
２００ｍＭ（ｐＨ３．０） Glycin-HCl （Glycin、HCl共に和光純薬工業）
５％ Brij35 （Sigma）
０．０５％ KS-538 （信越化学工業）
上記濃度は試薬中の濃度を示す。
【００７５】
以下に示すように、ホモジナイズ試薬及び／又はアガロース溶液を用いて、測定用試料i及びiiを作製した。
本実験例で行われた測定用試料作製の概略は図３に示される。
【００７６】
＜測定用試料iの作製＞
先ずマイクロチューブに、ピペットチップを装着したピペットを用いてマウス細胞から抽出したＲＮＡを４．６μｇ含む溶液（以下、ＲＮＡ溶液とする）を１０μＬ収容し、これをコントロールＡとした。さらにコントロールＡにホモジナイズ試薬６５０μＬを添加し、ピペッティングによってこの混合液を混和した。この混合液のうち１００μＬを回収してこれを測定用試料iとし、キュベットａに収容した。
【００７７】
＜測定用試料iiの作製＞
先ずマイクロチューブに精製水を収容した。さらにマイクロチューブ内にゲル化剤としてアガロース（商品名：NuSieve GTC Agarose; CAMBREX社）を６μｇ添加し、さらに精製水を加えて合計体積が１５０μＬとなるようメスアップした。このマイクロチューブを、約７０℃に温度設定した恒温槽内で、精製水中のアガロースが完全に溶解するまで加温した。精製水にアガロースが完全に溶解すると、恒温槽から取り出して、常温下でアガロース溶液の液温を低下させた。該アガロース溶液のアガロース濃度は４ｗ／ｖ％である。アガロース溶液がゲル化する直前（アガロース溶液の液温が約４０℃となったとき）、アガロース溶液にＲＮＡ溶液を１０μＬ添加した。アガロース溶液中にＲＮＡが偏在しないよう、ピペッティングによってＲＮＡ溶液を添加したアガロース溶液を混和させた。ＲＮＡ溶液添加後、さらにアガロース溶液を常温下に置き、アガロース溶液をゲル化させて内部にＲＮＡを保持する保持体（アガロースゲル）とした。マイクロチューブ内に収容されたアガロースゲルをコントロールＢとした。コントロールＢは本発明の精度管理用疑似組織に相当する。
図４は上述のようにして作製した疑似組織と、該疑似組織を収容したマイクロチューブとを模式的に示した図である。マイクロチューブ２は疑似組織を収容する収容部５及び収容部を封じる蓋６を備えており、収容部５には保持体としてアガロースゲル３と、該アガロースゲル３に保持されたＲＮＡ４が収容されている。
コントロールＢ１６０μＬにホモジナイズ試薬５００μＬ添加して、ペッスルで１０往復破砕動作を行い、さらに約一分間、約２０００ｇで遠心して上清１００μＬを回収してこれを測定用試料iiとし、キュベットｂに収容した。
測定用試料iiは、前処理で疑似組織を充分にホモジナイズでき、均一なホモジネートを得られた場合を想定して作製されたものである。
【００７８】
ここで用いられるホモジナイズ試薬、マイクロチューブ、ピペットチップ、精製水、アガロース、キュベットａ及びｂはＲＮａｓｅフリーであることが望ましい。
【００７９】
＜吸光度の測定＞
測定に際しては、分光光度計（ＵＶ−２５００ＰＣ：島津製作所）を用いて、キュベットａ及びｂに収容された各測定用試料の吸光度（O. D. 260nm）を測定し、各測定用試料に含まれるＲＮＡ濃度を算出した。
測定結果を以下の表１に示す。また、表１のＲＮＡ濃度をグラフにしたものを図５に示す。
表１中の「吸光度測定値」の欄には、上述の実験と同様の実験を計３回行い、その測定値の平均を示す。
「ＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）」の欄には、吸光度測定値から算出した各測定用試料に含まれるＲＮＡの濃度を示す。
「測定用試料iに対する回収率」の欄には、測定用試料iのＲＮＡ濃度（又は吸光度測定値）を１００％としたときの測定用試料iiの相対値を百分率で示す。
【００８０】
【表１】
【００８１】
表１及び図５より、測定用試料iのＲＮＡ濃度測定値は７．１μｇ／ｍＬであった。これは、コントロールＡ作製時にマイクロチューブ内に収容したＲＮＡ溶液中のＲＮＡ濃度に対応している。
測定用試料iiのＲＮＡ濃度測定値は５．８μｇ／ｍＬとなり、測定用試料iに対する回収率は８１．８％となった。
【００８２】
測定結果より、核酸を保持した保持体に前処理を施すことによって、本実験例における測定用試料iに比べて８０％以上の核酸を検出することができた。これは、ホモジナイズを１０往復行うことによって保持体から核酸を効果的に回収できたことを示す。
従って測定用試料iiのＲＮＡ濃度測定値を後述する実験例２における表示値とすることができる。
【００８３】
（実験例２）
実験例２では、核酸と核酸を保持する保持体とからなる疑似組織を作製し、ホモジナイズなどの所定の処理を施して核酸濃度測定した場合と、ホモジナイズを行わずに核酸濃度測定した場合とのそれぞれの核酸濃度を算出し、実験例１で算出した表示値と比較した。
【００８４】
以下に示すように、ホモジナイズ試薬及び／又はアガロース溶液を用いて、測定用試料iii及びivを作製した。
本実験例で行われた測定用試料作製の概略は図６に示される。
【００８５】
＜測定用試料iii及びivの作製＞
測定用試料iiiの作製に際して、先ず実験例１におけるコントロールＢと同ロットのコントロールＣに、ホモジナイズ試薬５００μＬ添加した。さらに、測定用試料iiを作製するのと同様の処理を施し、上清１００μＬをキュベットｃに回収した。
測定用試料ivの作製に際して、先ず実験例１におけるコントロールＢと同ロットのコントロールＤに、ホモジナイズ試薬５００μＬ添加した。このコントロールＤとホモジナイズ試薬との混合物から上清を１００μＬ回収し、キュベットｄに回収した。測定用試料ivは、ホモジナイズを行わずに作製したものである。
【００８６】
＜吸光度の測定＞
測定に際しては、分光光度計（UV-2500PC：島津製作所製）を用いて、キュベットｃ及びｄに収容された各測定用試料の吸光度（O. D. 260nm）を測定し、各測定用試料に含まれるＲＮＡ濃度を算出した。
測定結果を以下の表２に示す。また、表２のＲＮＡ濃度をグラフにしたものを図７に示す。
表２中の「吸光度測定値」の欄には、上述の実験例と同様の実験を計３回行い、その測定値の平均を示す。
「ＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）」の欄には、吸光度測定値から算出した各測定用試料に含まれるＲＮＡの濃度を示す。
「表示値に対する回収率」の欄には、実験例１で算出した表示値を１００％としたときの測定用試料iii及びivの相対値を百分率で示す。
【００８７】
【表２】
【００８８】
表２及び図７より、測定用試料iiiのＲＮＡ濃度測定値は５．８μｇ／ｍＬとなった。この値は表示値に比べて１００％の回収率である。
また、ホモジナイズをせずに測定を行った測定用試料iiiのＲＮＡ濃度測定値は１．２μｇ／ｍＬとなった。この値は表示値に比べて２０．４％の回収率である。
【００８９】
以上の測定結果より、ホモジナイズを行わないと疑似組織から効果的に核酸を抽出できないということが分かった。
従って、表示値と疑似組織の核酸濃度測定値とを比較することにより、ホモジナイズが正確に行われているかどうかを確認できる。
【００９０】
実験例１及び２により、各実験例で作製した疑似組織（コントロールＢ〜Ｄ）は遺伝子検査におけるホモジナイズの精度管理に適しているということが確認された。
【００９１】
（実験例３）
実験例３では、標的核酸を含む細胞と標的核酸を含む細胞を保持する保持体とからなる疑似組織を用いて、細胞に含まれるＣＫ１９ｍＲＮＡの増幅立ち上がり時間を測定することによって、疑似組織から核酸を抽出し、増幅できるか否かを確認した。この疑似組織は生体から切除したリンパ節を想定して作製されたものである。ここでは、濁度が０．１に達した時間を増幅立ち上がり時間として算出する。
【００９２】
以下に示すように、ホモジナイズ試薬及び／又はアガロース溶液を用いて、測定用試料v、vi及びviiを作製した。測定用試料vの増幅立ち上がり時間は本実験のポジティブコントロールとして用いられ、測定用試料viiはネガティブコントロールとして用いられる。
本実験例で行われた測定用試料作製の概略は図８に示される。
【００９３】
＜測定用試料vの作製＞
先ず，ヒト乳癌由来の細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１；大日本製薬）をカウンティングチェンバー（アズワン）を用いて顕微鏡で計数し、溶液中に２×１０６個の細胞が含まれるよう、細胞溶液を調製した。マイクロチューブにこの細胞溶液を収容し、これをコントロールＥとした。コントロールＥに実験例１で用いたホモジナイズ試薬で１ｍｌまでメスアップした。コントロールＥとホモジナイズ試薬との混合物に対してペッスルで１０往復破砕動作を行った。得られたホモジネートを約一分間約２０００ｇで遠心し上清２０μｌを回収してこれを測定用試料vとし、マイクロチューブｅに収容した。
【００９４】
＜測定用試料viの作製＞
先ず、マイクロチューブに精製水を収容した。ここにゲル化剤としてアガロース（CAMBREX社）を８μｇ添加した。このマイクロチューブを、約７０℃に温度設定した恒温槽内で、精製水中のアガロースが完全に溶解するまで加温した。精製水にアガロースが完全に溶解すると、恒温槽から取り出し、アガロース溶液に測定用試料v作製の際に用いた細胞溶液と同じものを添加した。アガロース溶液中に細胞が偏在しないよう、ピペッティングによってアガロース溶液と細胞溶液の混合液を混和させた。−２０℃の冷凍庫内でこの混合液の液温を低下させて混合液をゲル化させ、これをコントロールＦとした。なお、アガロース溶液と細胞溶液との合計体積は、２００μｌとなるように調整された。アガロース溶液のアガロース濃度は４ｗ／ｖ％である。コントロールＦは本発明の精度管理用疑似組織に相当する。
コントロールＦを解凍した後、ホモジナイズ試薬８００μｌを添加して、ペッスルで１０往復破砕動作を行った。得られたホモジネートを約一分間、約２０００ｇで遠心して上清２０μｌを回収してこれを測定用試料viとし、マイクロチューブｆに回収した。
【００９５】
＜測定用試料viiの作製＞
先ず、コントロールＧが作製された。コントロールＧは、細胞溶液を用いないこと以外はコントロールＦと同様にして作製された。
コントロールＧにホモジナイズ試薬８００μｌを添加して、ペッスルで１０往復破砕動作を行った。得られたホモジネートを約一分間、約２０００ｇで遠心して上清２０μｌを回収してこれを測定用試料viiとし、マイクロチューブｇに回収した。
【００９６】
＜増幅立ち上がり時間の測定＞
マイクロチューブｅ、ｆ、及びｇにそれぞれ１８０μｌのホモジナイズ試薬を添加し、測定用試料v、vi、及びviiを１０倍に希釈した。
遺伝子増幅検出装置ＧＤ−１００（シスメックス）を用いて、希釈された各測定用試料のＣＫ１９ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを増幅し、増幅に伴って増大する濁度の変化をリアルタイムでモニターした。
測定結果を図９に示す。
図９（１）、（２）及び（３）はそれぞれ測定用試料v、vi及びviiの増幅立ち上がり時間を示すグラフである。
【００９７】
ポジティブコントロールである測定用試料vの増幅立ち上がり時間は１２．７分であり、測定用試料viの増幅立ち上がり時間は１２．９分であった。また、ネガティブコントロールである測定用試料viiは増幅の立ち上がりが見られなかった。
以上の測定結果より、疑似組織のホモジナイズが正確に行われれば、疑似組織から得られた測定用試料の増幅立ち上がり時間は、ポジティブコントロールである測定用試料vの増幅立ち上がり時間と非常に近似した値を示すことが確認され、この疑似組織を精度管理物質として用いることが可能であると判断できた。
【００９８】
本明細書では、生体から切除した組織に前処理を施し、切除組織に含まれる核酸を検出して疾患の有無を推定する場合について述べたが、切除組織に含まれる特定のタンパク質の発現量や活性を検出して疾患の有無を推定することも可能である。タンパク質を検出する場合も切除組織の前処理が必要であるため、細胞と細胞を保持する保持体とからなる疑似組織を用いてタンパク質を検出することにより前処理の精度管理を行うことができる。前処理された疑似組織に含まれるタンパク質は吸光度測定や、タンパク質発現・活性解析により検出され得る。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】核酸増幅検出装置及びその周辺機器の全体構成を示した斜視図である。
【図２】核酸増幅検出装置の測定部の全体構成を示した図である。
【図３】実験例１で行われた測定用試料i及びii作製の概略である。
【図４】疑似組織と、該疑似組織を収容したマイクロチューブとを模式的に示した図である。
【図５】測定用試料i及びiiのＲＮＡ濃度を示したグラフである。
【図６】実験例２で行われた測定用試料iii及びiv作製の概略である。
【図７】測定用試料iii及びivのＲＮＡ濃度を示したグラフである。
【図８】実験例３で行われた測定用試料v，vi及びvii作製の概略である。
【図９】測定用試料v、vi、及びviiの増幅立ち上がり時間を示したグラフである。
【符号の説明】
【０１００】
２ マイクロチューブ
３ アガロースゲル
４ ＲＮＡ
５ 収容部
６ 蓋
１０ 分注機構部
１１ アーム部
１２ シリンジ部
１２ａ ノズル部
２０ サンプル容器セット部
２１ａ サンプル容器セット孔
２１ｂ 把持部
３０ 試薬容器セット部
３１ａ プライマ試薬容器セット孔
３１ｂ 酵素試薬容器セット孔
３１ｃ 把持部
３２ａ プライマ試薬容器
３２ｂ 酵素試薬容器
４０ チップセット部
４１ ピペットチップ
４２ ラック
４２ａ 収納孔
４３ 取り外しボタン
５０ チップ廃棄部
６０ 反応検出部
６０ａ 反応検出ブロック
６１ 反応部
６２ 濁度検出部
６３ 蓋閉機構部
６５ 検出セル
６７ａ セル部
７０ 制御部
８０ 電源部
９０ 緊急停止スイッチ
１００ 核酸増幅検出装置
１０１ 測定部
１０２ データ処理部
１０２ａ キーボード
１０２ｂ マウス
２００ プリンタ
３００ ホストコンピュータ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、精度管理用疑似組織（以下、単に疑似組織ともいう）及び該疑似組織を用いた精度管理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年臨床診断の分野において遺伝子検査が急速に普及している。遺伝子検査とは、核酸や染色体などを分析して疾患に関連する変異や核型などの有無を臨床目的で検査することである。遺伝子検査の一例として、生体から切除した組織内に癌細胞由来の核酸が存在するかどうかを判定する検査がある。その検査工程は、主に前処理、核酸増幅、及び検出の三工程からなる。
【０００３】
前処理には様々な方法がある。例として、先ず検査目的で生体から切除した組織に前処理用の試薬を加える。次に試薬を添加された切除組織をホモジナイズし、得られたホモジネートから核酸を含む測定用試料を調製する。
核酸増幅では、前記測定用試料をサンプル容器に収容してそこに酵素やプライマなどの試薬を加え、核酸増幅反応によって標的核酸を増幅する。
検出では、蛍光染色された標的核酸の蛍光測定や増幅に比例して産生される副産物の濁度測定などにより、切除組織中の標的核酸の有無の判定又は濃度の算出を行う。
【０００４】
上述のような遺伝子検査では、各工程（前処理、核酸増幅、及び検出）における様々な要素が測定結果に影響を与える。このため、遺伝子検査の分野において、各工程の精度及び信頼性の確保のための精度管理の充実が重要となる。
【０００５】
核酸増幅及び検出に関しては、ポジティブコントロールとして濃度既知の標的核酸を含むコントロール溶液、及びネガティブコントロールとして増幅されるべきではない核酸を含むコントロール溶液を用いて精度管理を行っている。
【０００６】
ポジティブコントロールは標的核酸の増幅及び増幅された標的核酸の検出が正常に行われているかどうかを確認するためのものであり、ネガティブコントロールは増幅されるべきではない核酸が増幅しないことを確認するためのものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前処理に関しては、精度管理が行われていないことが現状である。ホモジナイズを手動で行う場合、前処理を行う者の技量によって切除組織のホモジナイズの程度に差がある。また、ホモジナイズを自動破砕装置などによって自動的に行う場合、ブレンダの回転数等のホモジナイズ条件の設定や継続使用によるブレンダの磨耗などにより切除組織のホモジナイズの程度に差が生じる。従って、ホモジナイズを手動で行う場合も、自動破砕装置などによって行う場合も、ホモジナイズ条件等の前処理の精度管理が必要である。従って、前処理の精度を管理するための精度管理用物質及びこの精度管理用物質を用いた精度管理方法の開発が望まれている。
【０００８】
本発明は、遺伝子検査における前処理の精度管理に用いることのできる精度管理用疑似組織を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、核酸又は細胞と、前記核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなる精度管理用疑似組織を提供する。
【００１０】
また、本発明は、核酸又は細胞と、前記核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織にホモジナイズを含む核酸抽出処理を施して測定した核酸濃度測定値と、表示値とを比較して、前記核酸抽出処理が適切になされたかどうかを判定する精度管理方法を提供する。
【００１１】
また、本発明は、標的核酸又は標的核酸を含む細胞と、前記標的核酸又は標的核酸を含む細胞を保持することのできる保持体とからなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織をホモジナイズしてホモジネートを作製するホモジナイズ工程と、前記ホモジネートに含まれる標的核酸を増幅する増幅工程と、増幅された標的核酸を検出し疑似組織に由来する標的核酸濃度を測定する測定工程と、前記精度管理用疑似組織の標的核酸濃度の測定値と表示値とを比較して前記ホモジナイズ工程、増幅工程、及び測定工程が適切になされたどうかを判定する工程と、を有する精度管理方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、遺伝子検査における前処理の精度管理に用いることのできる精度管理用疑似組織が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の一実施形態を説明する。
本実施形態における疑似組織は疑似的な生体組織、具体的には生体から切除されたリンパ節と想定され、遺伝子検査における前処理の精度管理に用いられる。
この疑似組織は、核酸又は細胞と、核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなる。
【００１４】
本発明の核酸は、ＤＮＡやＲＮＡだけでなく、ＰＮＡ、ＢＮＡ、これらの類縁体などの人工核酸をも含む。また、本発明の核酸として、例えばArmored RNA（米国特許５６７７１２４号公報参照）などのように核酸をタンパク質等に封入したものを用いてもよい。
これら核酸の由来は特に限定されず、細胞から抽出したものでも、人工的に合成したものであってもよい。
【００１５】
細胞としては、核酸を含有する細胞であれば特に限定されないが、遺伝子検査における被検査物質の一部又は全部をコードする遺伝子、この遺伝子に対応するｍＲＮＡ、及び／又はこれらの一部配列を含有する細胞であることが好ましい。遺伝子検査における被検査物質としては、腫瘍マーカーが挙げられる。腫瘍マーカーとしては、サイトケラチン（ＣＫ）、癌胎児性抗原、α胎児タンパク、組織ポリペプチド抗原、免疫抑制酸性タンパク、αフェトプロテイン、塩基性フェトプロテイン、ＰＩＶＫＡ、ＤＵＰＡＮ、エラスターゼ、ＳＣＣ抗原、Ｐｒｏ ＧＲＰ、神経特異エノラーゼ、尿中ＮＭＰ−２２、前立腺酸性フォスファターゼ、γセミノプロテインなどを例示することができる。
【００１６】
保持体としては、室温では固形形態を呈し、一定温度迄加温する事によって固形形態が崩壊して流動化するものが好ましい。また、固形形態において生体組織と同程度の固さを有するものが好ましい。
保持体は、ゲル化剤を含むのが好ましい。ゲル化剤とは、溶媒に添加することによって溶液をゲル化させる性質を持つ物質である。ゲル化剤としては、例えば、寒天、アガロース、カラギーナン、アルギン酸、アルギン酸塩、ペクチン、コラーゲン、ゼラチン、グルテンなどの天然高分子や、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）などの合成高分子などが挙げられる。本実施形態の疑似組織には、これら合成高分子及び天然高分子のうち、一種又は二種以上を用いることができる。また、ゲル化剤を添加する溶媒としては特に限定されないが、例えば水、TE（Tris EDTA)、TAE（Tris-Acetate EDTA）、TBE（Tris-Borate EDTA）などを用いることができる。
【００１７】
寒天は、紅藻類の細胞壁に含まれるガラクトース及びガラクトース誘導体から構成される多糖である。ゲル化剤として用いることができれば寒天の起源は特に限定されず、例えばテングサ属、オゴノリ属、ムカデノリ属、イバラノリ属、スギノリ属、ヒラクサ、オニクサなどから精製されたものを用いることができる。
【００１８】
アガロースは、交互に結合したＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースとを主構造とする多糖であり、Ｄ−ガラクトースの１位と３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの４位がβグリコシド結合で、また、３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースの１位とＤ−ガラクトースの３位がαグリコシド結合で結合している。ゲル化剤として用いることができればアガロースの起源は特に限定されない。アガロースは寒天中に通常約７０％の割合で含まれ、精製すると高純度のものを得ることができる。アガロースは精製度の低いものから高いものまで、様々なアガロース含量のものを使用できる。
【００１９】
カラギーナンは紅藻類に含まれる多糖である。ゲル化剤として用いることができればカラギーナンの起源は特に限定されず、例えばスギノリ科、ミリン科、イバラノリ科に属する生物などから精製されたものを用いることができる。本実施形態には例えばκ−カラギーナン、λ−カラギーナンなどを用いることができる。
κ−カラギーナンは、Ｄ−ガラクトース−４−硫酸の１位と３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースの４位がβグリコシド結合で、 また、３，６−アンヒドロ−Ｄ−ガラクトースの１位とＤ−ガラクトース−４−硫酸の３位がαグリコシド結合で交互に繰り返された基本構造を持つ。
λ−カラギーナンは、Ｄ−ガラクトースの１位とＤ−ガラクトース−２，６−二硫酸の４位とがβグリコシド結合で、また、Ｄ−ガラクトース−２，６−二硫酸の１位とＤ−ガラクトースの３位とがαグリコシド結合で交互に繰り返された基本構造を持つ。
【００２０】
アルギン酸は褐藻類の細胞壁に含まれる多糖であり、β−１，４結合のＤ−マンヌロン酸とα−１，４結合のＬ−グルロン酸が連なった鎖状構造を有する。ゲル化剤として用いることができればアルギン酸の起源は特に限定されず、本実施形態には、例えばアルギン酸又はその塩（ナトリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩など）などを用いることができる。
【００２１】
ペクチンは、植物の細胞壁に含まれる多糖であり、その主成分はα−１，４結合したＤ−ガラクツロン酸の一部にα−１，２結合したＬ−ラムノースが混在する主鎖を有し、アラビノース、ガラクトースなどの中性糖に富んだ側鎖を有する酸性多糖、即ちラムノガラクツロナン−Ｉである。ゲル化剤として用いることができればペクチンの起源は特に限定されない。
【００２２】
コラーゲンは、動物の細胞外マトリックスの主成分となるタンパク質で、３本のポリペプチド鎖からなる３重螺旋構造をとる。また、ゼラチンは、コラーゲンを熱湯で処理して得られる誘導タンパク質の一種である。ゲル化剤として用いることができればコラーゲン及びゼラチンの起源は特に限定されず、本実施形態には動物の組織から精製したもの、人工的に合成したものなどを用いることができる。
【００２３】
グルテンは、穀類に含まれる粘着性タンパク質で、グルテリン系のタンパク質とプロラミン系のタンパク質との会合によって形成される。ゲル化剤として用いることができればグルテンの起源は特に限定されず、本実施形態には例えばコムギやオオムギから抽出したもの、人工的に合成したものなどを用いることができる。
【００２４】
ＰＶＡはポリ酢酸ビニルの加水分解によって得られ、ビニルアルコール単位を主体としてなる合成高分子である。
【００２５】
ＰＥＧはエチレンオキシドのアルカリによるアニオン重合又はプロトン開始によるカチオン重合によって得られ、エチレングリコール単位を主体としてなる合成高分子である。
【００２６】
ＰＡＡはアクリルアミドのビニル基の重合又はアミド基の水素移動重合によって得られ、アクリルアミド単位を主体としてなる合成高分子である。
【００２７】
本実施形態に用いられるＰＶＡ、ＰＥＧ及びＰＡＡは、ゲル化剤として用いることができればその重合度などは特に限定されない。
【００２８】
上述の疑似組織を用いて吸光度測定や、核酸増幅及び核酸検出などによって、遺伝子検査における前処理の精度管理が行われる。
以下、実施例を示し、吸光度測定による前処理の精度管理（実施例１）と、核酸増幅及び核酸検出による前処理の精度管理（実施例２）とについて説明する。
【００２９】
（実施例１）
吸光度測定による前処理の精度管理は、核酸及び前記核酸を内部に保持することのできる保持体からなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織にホモジナイズを含む核酸抽出処理を施して測定した核酸濃度測定値と、表示値とを比較して、前記核酸抽出処理が適切になされたかどうかを判定することによって行う。
【００３０】
＜表示値αの算出＞
先ず、表示値を算出する。
表示値とは、定められたプロトコルによって作製された疑似組織に所定の前処理を施し、吸光度測定を行って算出された核酸濃度測定値のことである。この表示値と測定対象の核酸濃度測定値とを比較することによって測定対象に対して行った前処理の精度管理が行われる。
【００３１】
以下、表示値を算出するための疑似組織αの作製に関して説明する。
疑似組織αの吸光度測定に先立ち、核酸を含む核酸溶液又は細胞を含む細胞溶液と緩衝剤を含む試薬（以下、ホモジナイズ試薬とする）とを混和して、この混合物を基準試料αとする。核酸溶液を用いた場合、この基準試料αを吸光度測定して基準試料α中の核酸濃度を算出し、これを基準値αとする。細胞溶液を用いた場合、細胞溶液とホモジナイズ試薬との混合物を十分にホモジナイズしてこれを基準試料αとする。基準試料αの吸光度を測定して核酸濃度を算出し、これを基準値αとする。なお、細胞溶液中の細胞数は予め細胞計数盤（例えば、カウンティングチェンバー8100105；アズワン）や細胞計数装置（例えば、粒子計数分析装置CDA-500;シスメックス）などを用いて計数しておく。
【００３２】
次に、基準試料α作製に用いられた核酸溶液又は細胞溶液と同じものを同量用いて疑似組織αを作製する。
疑似組織αの作製に際し、先ずマイクロチューブなどの容器に溶媒を収容する。
ゲル化剤を容器中の溶媒に添加し、ゲル化剤と溶媒の混合物及び該混合物を収容した容器を恒温槽や電子レンジなどで加温し、ゲル化剤を溶媒中に完全に溶解させ、ゲル化剤溶液を作製する。
ゲル化剤溶液を収容した容器を常温下又は冷蔵庫内などの冷温下に放置し、ゲル化剤溶液を冷却する。
ゲル化剤溶液は一定温度以下になると固まってゲル状の固形形態をとるが、固形形態となる直前にピペットなどによりゲル化剤溶液に基準試料α作製の際に用いた核酸溶液又は細胞溶液と同じものを同量添加し、ゲル化剤溶液と核酸溶液又は細胞溶液との混合液中に核酸又は細胞の偏在が起こらないよう混和させる。
さらにゲル化剤溶液がゲル状の固形形態をとるまで液温を低下させると、核酸又は細胞を含むゲル化剤溶液はゲル化し、核酸又は細胞と核酸又は細胞を保持した保持体とからなる疑似組織αとなる。
【００３３】
上述のようにして作製された疑似組織αに、遺伝子検査における前処理と同様の処理を施す。
先ず疑似組織αにホモジナイズ試薬を添加する。ホモジナイズ試薬の添加量は、疑似組織αとホモジナイズ試薬との混合物の体積が基準試料αの体積と等しくなるよう調整する。
次に、疑似組織αとホモジナイズ試薬との混合物をホモジナイズし、ホモジネートを作製する。
疑似組織αから得られたホモジネートを遠心分離して、上清を別の容器に収容する。この上清の２６０ｎｍにおける吸光度測定を行い、核酸濃度を測定する。
【００３４】
疑似組織αから得られた上清中の核酸濃度が基準値αと等しいか、近似した場合（具体的には、該核酸濃度が基準値αの７０％以上、好ましくは８０％以上の値を示した場合）、疑似組織αホモジネートの上清に含まれる核酸がホモジナイズによって効果的に抽出できたことを示し、その核酸濃度測定値を表示値αとすることができる。
【００３５】
＜吸光度測定による前処理の精度管理＞
次に、表示値αに基づく精度管理方法について説明する。
精度管理用に疑似組織βを用意する。疑似組織βは上述した疑似組織αと同ロットの疑似組織である。
疑似組織βに対するホモジナイズ、遠心、上清回収などの前処理は、疑似組織αに施した前処理と同様にして行われる。
前処理によって得られた上清の２６０ｎｍにおける吸光度測定を行い、核酸濃度を測定する。
【００３６】
疑似組織βを前処理して得られた上清の核酸濃度測定値が、上述した表示値αと比較したときに表示値αと等しいか近似した値を示した場合、疑似組織βに対して施した前処理が適切であったことを確認できる。
【００３７】
（実施例２）
核酸増幅及び核酸検出による前処理の精度管理は、標的核酸又は標的核酸を含む細胞と、前記標的核酸又は標的核酸を含む細胞とを内部に保持することのできる保持体からなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織をホモジナイズしてホモジネートを作製するホモジナイズ工程と、前記ホモジネートに含まれる標的核酸を増幅する増幅工程と、増幅された標的核酸を検出し疑似組織に由来する標的核酸濃度を測定する測定工程と、前記精度管理用疑似組織の標的核酸濃度の測定値と表示値とを比較して前記ホモジナイズ工程、増幅工程、及び測定工程が適切になされたどうかを判定する工程と、からなる。
【００３８】
＜表示値γの算出＞
以下、表示値を算出するための疑似組織γの作製に関して説明する。
疑似組織γの核酸増幅及び核酸検出に先立ち、先ず標的核酸又は標的核酸を含む細胞を含む細胞溶液とホモジナイズ試薬とを混和して基準試料γを作製する。溶液に細胞を含有させる場合は、細胞溶液とホモジナイズ試薬との混合物を十分にホモジナイズしたものを基準試料γとする。なお、細胞溶液中の細胞数は予め計数しておく。
【００３９】
次に、基準試料γ作製に用いられた標的核酸又は細胞を含む溶液と同じものを同量用いて疑似組織γを作製する。
前述した疑似組織αの作製と同様にして疑似組織γを作製する。
疑似組織γにホモジナイズ試薬を添加する。ホモジナイズ試薬の添加量は、疑似組織γとホモジナイズ試薬との混合物の体積が基準試料γの体積と等しくなるよう調整する。
疑似組織γとホモジナイズ試薬との混合物をホモジナイズし、ホモジネートを作製する。
疑似組織γから得られたホモジネートを遠心分離して、上清を別の容器に収容する。以下、この上清を測定用試料γとする。
【００４０】
上述の基準試料γ及び測定用試料γに対して核酸増幅及び核酸検出を行う。
核酸増幅として、基準試料γ及び測定用試料γの上清に酵素試薬を加え、公知の核酸増幅法によって標的核酸を増幅させる（標的核酸がＲＮＡである場合は、このＲＮＡの塩基配列に対応するｃＤＮＡを増幅させる）。
【００４１】
検出としては、公知の核酸検出法の何れも用いることができる。
核酸増幅に伴って同時にピロリン酸マグネシウムなどの不溶性物質が精製される場合、反応液の上清の濁りを目視により確認する、或いは反応液の吸光度や散乱光強度を測定して濁度測定する、又は反応液を有色のフィルターで濾過し、フィルター上の残渣を確認することにより標的核酸を検出することができる（国際公開ＷＯ ０１／８３８１７号パンフレット参照）。
また、エチジウムブロマイド、SYBR GREEN I、或いはPico Greenのような二本鎖インターカレータである蛍光色素の存在下で核酸増幅を実施すれば、反応液の蛍光を測定することによって標的核酸検出を行うことができる。
濁度測定又は蛍光測定においては核酸増幅による生成物の増加に伴って濁度又は蛍光の増大が観察される。この増大をリアルタイムでモニターすれば、閉鎖系で核酸の増幅と濁度又は蛍光の増加とが同時に追跡可能である。
【００４２】
核酸検出を目視によって行う場合、基準試料γの濁りと測定用試料γの濁りを比較して、測定用試料γに対する前処理が正確に行われたかどうかを確認できる。
核酸検出を濁度測定によって行う場合は、測定用試料γの標的核酸濃度と基準試料γの標的核酸濃度（以下、基準値γとする）とを比較する。これらが等しいか、或いは近似した値を示した場合（具体的には、測定用試料γの標的核酸濃度が基準値γの７０％以上、好ましくは８０％以上の値を示した場合）、疑似組織γに由来する測定用試料γに含まれる標的核酸がホモジナイズによって効果的に抽出できたことを示し、その標的核酸濃度測定値を表示値γとすることができる。また、濁度又は蛍光の増大をリアルタイムでモニターする場合、測定用試料γに含まれる核酸が増幅し始めるまでの時間（以下、増幅立ち上がり時間とする）と基準試料γの増幅立ち上がり時間（以下、基準値γｔとする）とを比較する。これらが等しいか近似した値を示した場合、測定用試料γに含まれる標的核酸がホモジナイズによって効果的に抽出できたことを示し、その立ち上がり時間を表示値γｔとすることができる。
【００４３】
＜核酸増幅及び核酸検出による前処理の精度管理＞
次に、表示値γ又はγｔに基づく精度管理方法について説明する。
精度管理用に疑似組織δを用意する。疑似組織δは上述した疑似組織γと同ロットの疑似組織である。
疑似組織δに対するホモジナイズ、遠心、上清回収などの前処理は、疑似組織γに施した前処理と同様にして行われ、測定用試料δが作製される。
測定用試料δに、上述の測定用試料γに対して行った核酸増幅及び核酸検出と同様の操作を施し、測定用試料δの標的核酸濃度及び／又は増幅立ち上がり時間を測定する。
【００４４】
測定用試料δの標的核酸濃度測定値又は増幅立ち上がり時間が、上述の表示値γ又はγｔと等しいか近似した値を示した場合、疑似組織δに対して施した処理が適切であったことを確認できる。
【００４５】
なお、上述した前処理、核酸増幅、及び核酸検出のうち少なくとも一つの工程を装置によって自動的に行ってもよい。
例えば、核酸増幅及び核酸検出を自動的に行うものとして核酸増幅検出装置が挙げられる。
【００４６】
例えば癌手術での切除組織における癌転移診断を支援する核酸増幅検出装置を用いることができる。この装置によると、切除組織内のｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−ＬＡＭＰ （Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification、栄研化学）法によってｍＲＮＡからｃＤＮＡに逆転写し、このｃＤＮＡを増幅させ、増幅に伴い増大する溶液の濁度を測定することにより切除組織内のｍＲＮＡの増幅立ち上がり時間及びコピー数を算出する装置である。
【００４７】
以下、図面に基づき核酸増幅検出装置について説明する。
この核酸検出装置は、生体から切除した組織中に癌マーカー（例えば、サイトケラチン１９）に関する核酸がどのくらい含まれるかを定量する装置である。
図１は、核酸増幅検出装置及びその周辺機器の全体構成を示した斜視図である。
図２は図１に示した核酸増幅検出装置の測定部の全体構成を示した図である。
【００４８】
先ず、図１を参照して核酸増幅検出装置及びその周辺機器の全体構成について説明する。核酸増幅検出装置１００は、図１に示すように測定部１０１と、測定部１０１に通信回線で接続されたデータ処理部１０２とによって構成されている。データ処理部１０２は、キーボード１０２ａ及びマウス１０２ｂを含むパーソナルコンピュータからなる。また、データ処理部１０２には、周辺機器としてのプリンタ２００及びホストコンピュータ３００が通信回線を介して接続されている。プリンタ２００は、グラフィックデータやテキストデータなどを印刷するために設けられている。また、ホストコンピュータ３００にはデータ処理部１０２から測定データが出力される。
【００４９】
測定部１０１は、図２に示すように、分注機構部１０と、サンプル容器セット部２０と、試薬容器セット部３０と、チップセット部４０と、チップ廃棄部５０と、５つの反応検出ブロック６０ａからなる反応検出部６０とを含む。
測定部１０１には、図２に示すように、マイクロコンピュータにより装置を制御すると共に、装置外部との入出力を制御する制御部７０と、制御部７０を含む装置全体に電源を供給する電源部８０とが内蔵されている。また、測定部１０１の正面の所定箇所に緊急停止スイッチ９０が配置されている。
【００５０】
サンプル容器セット部２０と、試薬容器セット部３０と、チップセット部４０とは、Ｘ軸方向に沿って配置されている。また、サンプル容器セット部２０は、装置正面手前側に配置されており、試薬容器セット部３０は、装置正面奥側に配置されている。また、５つの反応検出ブロック６０ａと、チップ廃棄部５０とは、サンプル容器セット部２０、試薬容器セット部３０、及びチップセット部４０に対して、Ｙ軸方向に所定の間隔を隔てた位置に、Ｘ軸方向に沿って配置されている。即ち、サンプル容器セット部２０、試薬容器セット部３０、チップセット部４０、チップ廃棄部５０及び５つの反応検出ブロック６０ａが方形状（長方形状）に配置されている。
【００５１】
また、分注機構部１０は、Ｘ軸及びＹ軸方向（平面方向）に移動可能なアーム部１１と、アーム部１１に対してそれぞれ独立してＺ軸方向（垂直方向）に移動可能な２連（２本）のシリンジ部１２とを含んでいる。２本のシリンジ部１２は先端にピペットチップを装着することができるノズル部１２ａをそれぞれ備えている。
【００５２】
また、図２に示すように、サンプル容器セット部２０の凹部には、５つのサンプル容器セット孔２１ａと、把持部２１ｂとを有するサンプル容器セット台２１が取り外し可能にはめ込まれている。サンプル容器セット台２１の５つのサンプル容器セット孔２１ａは、Ｘ軸方向に沿って１つの列状に所定の感覚を隔てて設けられている。このサンプル容器セット台２１の５つのサンプル容器セット孔２１ａには、切除組織及び／又は疑似組織を前処理して作製された測定用試料が収容されたサンプル容器２２がセットされる。
【００５３】
試薬容器セット部３０の凹部には、２つのプライマ試薬容器セット孔３１ａ及び２つの酵素試薬容器セット孔３１ｂと、把持部３１ｃとを有する試薬容器セット台３１が、取り外し可能にはめ込まれている。試薬容器セット台３１のプライマ試薬容器セット孔３１ａ及び酵素試薬セット孔３１ｂは、それぞれ、Ｙ軸方向に沿って所定の間隔を隔てて２つずつ設けられている。この試薬容器セット台３１のプライマ試薬容器セット孔３１ａ及び酵素試薬セット孔３１ｂには、２種類のプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器３２ａ及びその２種類のプライマ試薬に対応する酵素試薬が収容された酵素試薬容器３２ｂがそれぞれ各２本ずつセットされる。なお、正面左側のプライマ試薬容器セット孔３１ａ及び酵素試薬容器セット孔３１ｂに、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）のｍＲＮＡに対応するプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器３２ａ及びＣＫ１９ｍＲＮＡの酵素試薬が収容された酵素試薬容器３２ｂが配置される。また、正面右側のプライマ試薬容器セット孔３１ａ及び酵素試薬容器セット孔３１ｂに、内部標準物質としてβアクチンのｍＲＮＡのプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器３２ａ及びβアクチンｍＲＮＡの酵素試薬が収容された酵素試薬容器３２ｂが配置される。
なお、内部標準物質としては、βアクチンに限らず、例えばハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡなどを用いることもできる（国際公開ＷＯ ０３／０７０９３５号パンフレット参照）。
【００５４】
チップセット部４０の２つの凹部には、３６本のピペットチップ４１を収納可能な収納孔４２ａを有する２つのラック４２がそれぞれ着脱可能にはめ込まれている。また、チップセット部４０には、２つの取り外しボタン４３が設けられている。この取り外しボタン４３を押すことにより、ラック４２が取り外し可能な状態になる。
【００５５】
反応検出部６０の各反応検出ブロック６０ａは、図２に示すように、反応部６１と、２つの濁度検出部６２と、蓋閉機構部６３とから構成されている。各反応部６１は検出セル６５を備えている。蓋閉機構部６３は、検出セル６５にセル部６７ａを装着する機能を有している。
【００５６】
（実施例３）
上述の核酸増幅検出装置による核酸検出を行う場合の操作手順及び装置の動作を具体的に説明する。ここでは、細胞と細胞を保持した保持体とからなる疑似組織を用いた場合について述べる。
【００５７】
＜表示値εｔの算出＞
疑似組織の核酸増幅及び核酸検出に先立ち、先ずＣＫ１９ｍＲＮＡを含むと考えられる細胞を含有させた細胞溶液とホモジナイズ試薬とを混和して試料作製を行い、十分にホモジナイズして、これを基準試料εとする。なお、細胞溶液中の細胞数は予め計数しておく。
【００５８】
次に、基準試料ε作製に用いられた細胞溶液と同じものを同量用い、前述した疑似組織αの作製と同様にして疑似組織εを作製する。
疑似組織εにホモジナイズ試薬を添加する。ホモジナイズ試薬の添加量は、疑似組織εとホモジナイズ試薬との混合物の体積が基準試料εの体積と等しくなるよう調整する。
疑似組織εとホモジナイズ試薬との混合物をホモジナイズし、ホモジネートを作製する。
疑似組織εから得られたホモジネートを遠心分離して、上清を別の容器に収容する。以下、この上清を測定用試料εとする。
【００５９】
基準試料ε及び測定用試料εを収容した容器を、サンプル容器セット台２１のサンプル容器セット孔２１ａにそれぞれセットする。
また、正面左側のプライマ試薬容器セット孔３１ａ及び酵素試薬容器セット孔３１ｂに、ＣＫ１９ｍＲＮＡのプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器３２ａ及びＣＫ１９ｍＲＮＡの酵素試薬が収容された酵素試薬容器３２ｂをセットする。
また、正面右側のプライマ試薬容器セット孔３１ａ及び酵素試薬容器セット孔３１ｂに、βアクチンｍＲＮＡのプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器３２ａ及びβアクチンｍＲＮＡの酵素試薬が収容された酵素試薬容器３２ｂをセットする。
また、チップセット部４０の凹部に、それぞれ３６本の使い捨て用ピペットチップ４１が収納された二つのラック４２を嵌め込む。さらに、各反応検出ブロック６０ａの反応部６１の二つの検出セルセット孔６１ａに、検出セル６５の二つのセル部６７ａをセットする。
【００６０】
そして、図１に示したデータ処理部１０２のキーボード１０２ａ及びマウス１０２ｂを用いて、測定項目の登録やサンプルＩＤの登録などを行った後、キーボード１０２ａ又はマウス１０２ｂにより測定部１０１の動作をスタートさせる。
【００６１】
測定部１０１の動作がスタートすると、分注機構部１０のアーム部１１がチップセット部４０に移動し、２つのシリンジ部１２が下方向に移動することによりノズル部１２ａの先端にピペットチップ４１が自動的に装着される。そして、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、試薬容器セット台３１にセットされたＣＫ１９ｍＲＮＡ及びβアクチンｍＲＮＡのプライマ試薬が収容された２つのプライマ試薬容器３２ａの上方に向かってＸ軸方向に移動される。そして、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、それぞれのピペットチップ４１の先端が、２つのプライマ試薬容器３２ａ内のＣＫ１９ｍＲＮＡ及びβアクチンｍＲＮＡのプライマ試薬の液面に挿入され、ピペットチップ４１内に各プライマ試薬が吸引される。
【００６２】
プライマ試薬吸引後、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、反応検出ブロック６０ａの上方に移動される。そして、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、２つのシリンジ部１２のノズル部１２ａに装着された２つのピペットチップ４１が、それぞれ、検出セル６５のセル部６７ａ内に挿入され、ＣＫ１９ｍＲＮＡ及びβアクチンｍＲＮＡのプライマ試薬がそれぞれ２つのセル部６７ａに吐出される。
【００６３】
プライマ試薬吐出後、２つのシリンジ部１２が上方に移動され、分注機構部１０のアーム部１１は、チップ廃棄部５０の上方に向かってＸ軸方向に移動される。チップ廃棄部５０において、ピペットチップ４１の廃棄が行われる。
【００６４】
次に、分注機構部１０のアーム部１１が再びチップセット部４０に移動し、チップセット部４０において上記と同様の動作により２つのシリンジ部１２のノズル部１２ａの先端に新しい２つのピペットチップ４１が自動的に装着される。そして、分注機構部１０のアーム部１１は、試薬容器セット台３１にセットされたＣＫ１９ｍＲＮＡ及びβアクチンｍＲＮＡの２つの酵素試薬がそれぞれ収容された２つの酵素試薬容器３２ｂの上方に向かってＸ軸方向に移動される。その後、２つのシリンジ部１２がした方向に移動されることにより、２つの酵素試薬容器３２ｂ内のＣＫ１９ｍＲＮＡ及びβアクチンｍＲＮＡの２つの酵素試薬が吸引され、２つのシリンジ部１２が上方向に移動される。そして、分注機構部１０のアーム部１１は、反応検出ブロック６０ａの上方に移動された後、ＣＫ１９ｍＲＮＡ及びβアクチンｍＲＮＡの２つの酵素試薬が、それぞれ検出セル６５の２つのセル部６７ａに吐出される。酵素試薬の吐出後、分注機構部１０のアーム部１１は、チップ廃棄部５０の上方に移動された後、ピペットチップ４１の廃棄が行われる。
【００６５】
次に、分注機構部１０のアーム部１１が再びチップセット部４０に移動された後、２つのシリンジ部１２のノズル部１２ａの先端に新しい２つのピペットチップ４１が自動的に装着される。そして、分注機構部１０のアーム部１１は、サンプル容器セット台２１にセットされた基準試料ε及び測定用試料εがそれぞれ収容された２つのサンプル容器２２の上方に向かってＸ軸方向に移動された後、基準試料ε及び測定用試料εがそれぞれピペットチップ４１内に吸引される。
【００６６】
検出セル６５の２つのセル部６７ａに基準試料ε及び測定用試料εがそれぞれ吐出される際、２つのシリンジ部１２が自動的にピペッティングを行うことにより、２つのセル部６７ａ内の混合液が混和される。この後、分注機構部１０のアーム部１１が、チップ廃棄部５０の上方に移動された後、ピペットチップ４１の廃棄が行われる。
【００６７】
上記のセル部６７ａへ各試薬、基準試料ε及び測定用試料εがそれぞれ収容され、蓋閉機構部６３によって検出セル６５のセル部６７ａの蓋が閉められた後、検出セル６５内の液温を約６５℃に加温することにより、前述したＲＴ−ＬＡＭＰにより、ＣＫ１９のｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを増幅させる。そして、増幅に伴い生成されるピロリン酸マグネシウムの白濁を濁度測定によりリアルタイムでモニターする。具体的には、ＬＥＤ光源（図示せず）から光を増幅反応時の検出セル６５のセル部６７ａに照射する。照射した光を受光素子で受光することにより、増幅反応時の検出セル６５のセル部６７ａ内の液濁度をリアルタイムでモニターし、基準試料ε及び測定用試料εに含まれているＣＫ１９ｍＲＮＡの増幅立ち上がり時間をそれぞれ算出する。ここでは、濁度が０．１に達した時間を増幅立ち上がり時間として算出する。
【００６８】
濁度測定によって算出された基準試料εの増幅立ち上がり時間を基準値εｔとする。測定用試料εのＣＫ１９ｍＲＮＡの増幅立ち上がり時間が、基準値εｔと等しいか、近似した値を示した場合、測定用試料εに含まれるＣＫ１９ｍＲＮＡがホモジナイズによって効果的に抽出できたことを示し、そのＣＫ１９ｍＲＮＡ増幅立ち上がり時間を表示値εｔとすることができる。
【００６９】
＜核酸増幅及び核酸検出による前処理の精度管理＞
次に、表示値εｔに基づく精度管理方法について説明する。
精度管理用に疑似組織ηを用意する。疑似組織ηは上述した疑似組織εと同ロットの疑似組織である。
疑似組織ηに対するホモジナイズ、遠心、上清回収などの前処理は、疑似組織εに施した前処理と同様にして行われる。
この疑似組織ηの上清に、上述の測定用試料εに対して行った核酸増幅及び核酸検出を施し、疑似組織ηの上清のＣＫ１９ｍＲＮＡの増幅立ち上がり時間を測定する。
【００７０】
疑似組織ηの上清のＣＫ１９ｍＲＮＡ増幅立ち上がり時間が、上述の表示値εｔと比較したときに表示値εｔと等しいか近似した値を示した場合、疑似組織ηに対して施した処理が適切であったことを確認できる。
【００７１】
なお、実施例１〜３において、基準試料や疑似組織に対するホモジナイズはペッスルなどによって手動で行ってもよい。また、特公平６−３６７３２記載の細胞破砕装置や特開２００４−２０９３２２記載の自動破砕装置を用いてもよい。ホモジナイズを手動で行う場合、実施例の疑似組織はペッスルなどによる細胞の破砕動作の精度が管理される。ホモジナイズを装置によって行う場合、装置のホモジナイズ条件の設定やブレンダの磨耗状態が管理される。
【００７２】
なお、実施例１〜３において、遠心分離の前に公知の核酸抽出法によってホモジネートから核酸を抽出精製してもよい。核酸抽出法の具体例としては、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝子包含体を分解し、その後、フェノール法、アルカリ法、あるいはフェノール・クロロホルム法等を用いて、遺伝子包含体の分解物から核酸を抽出する方法が従来使用される。最近では、核酸抽出の過程に置いて、イオン交換樹脂、ガラスフィルタ、ガラスビーズ或いは蛋白凝集作用を有する試薬等が使用されている。また核酸の抽出に核酸結合用担体を用いる系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウムを用いる方法、ヒドロキシアパタイトを用いる方法などが知られている。
【００７３】
以下、実験例を示す。
（実験例１）
実験例１では、核酸と核酸を保持する保持体とからなる疑似組織を作製し、ホモジナイズなどの所定の処理を施して２６０ｎｍの波長における吸光度測定によって疑似組織から核酸を抽出できるか否かを確認した。この疑似組織は生体から切除したリンパ節を想定して作製されたものである。
【００７４】
下記の組成を含むホモジナイズ試薬を調製した。
２００ｍＭ（ｐＨ３．０） Glycin-HCl （Glycin、HCl共に和光純薬工業）
５％ Brij35 （Sigma）
０．０５％ KS-538 （信越化学工業）
上記濃度は試薬中の濃度を示す。
【００７５】
以下に示すように、ホモジナイズ試薬及び／又はアガロース溶液を用いて、測定用試料i及びiiを作製した。
本実験例で行われた測定用試料作製の概略は図３に示される。
【００７６】
＜測定用試料iの作製＞
先ずマイクロチューブに、ピペットチップを装着したピペットを用いてマウス細胞から抽出したＲＮＡを４．６μｇ含む溶液（以下、ＲＮＡ溶液とする）を１０μＬ収容し、これをコントロールＡとした。さらにコントロールＡにホモジナイズ試薬６５０μＬを添加し、ピペッティングによってこの混合液を混和した。この混合液のうち１００μＬを回収してこれを測定用試料iとし、キュベットａに収容した。
【００７７】
＜測定用試料iiの作製＞
先ずマイクロチューブに精製水を収容した。さらにマイクロチューブ内にゲル化剤としてアガロース（商品名：NuSieve GTC Agarose; CAMBREX社）を６μｇ添加し、さらに精製水を加えて合計体積が１５０μＬとなるようメスアップした。このマイクロチューブを、約７０℃に温度設定した恒温槽内で、精製水中のアガロースが完全に溶解するまで加温した。精製水にアガロースが完全に溶解すると、恒温槽から取り出して、常温下でアガロース溶液の液温を低下させた。該アガロース溶液のアガロース濃度は４ｗ／ｖ％である。アガロース溶液がゲル化する直前（アガロース溶液の液温が約４０℃となったとき）、アガロース溶液にＲＮＡ溶液を１０μＬ添加した。アガロース溶液中にＲＮＡが偏在しないよう、ピペッティングによってＲＮＡ溶液を添加したアガロース溶液を混和させた。ＲＮＡ溶液添加後、さらにアガロース溶液を常温下に置き、アガロース溶液をゲル化させて内部にＲＮＡを保持する保持体（アガロースゲル）とした。マイクロチューブ内に収容されたアガロースゲルをコントロールＢとした。コントロールＢは本発明の精度管理用疑似組織に相当する。
図４は上述のようにして作製した疑似組織と、該疑似組織を収容したマイクロチューブとを模式的に示した図である。マイクロチューブ２は疑似組織を収容する収容部５及び収容部を封じる蓋６を備えており、収容部５には保持体としてアガロースゲル３と、該アガロースゲル３に保持されたＲＮＡ４が収容されている。
コントロールＢ１６０μＬにホモジナイズ試薬５００μＬ添加して、ペッスルで１０往復破砕動作を行い、さらに約一分間、約２０００ｇで遠心して上清１００μＬを回収してこれを測定用試料iiとし、キュベットｂに収容した。
測定用試料iiは、前処理で疑似組織を充分にホモジナイズでき、均一なホモジネートを得られた場合を想定して作製されたものである。
【００７８】
ここで用いられるホモジナイズ試薬、マイクロチューブ、ピペットチップ、精製水、アガロース、キュベットａ及びｂはＲＮａｓｅフリーであることが望ましい。
【００７９】
＜吸光度の測定＞
測定に際しては、分光光度計（ＵＶ−２５００ＰＣ：島津製作所）を用いて、キュベットａ及びｂに収容された各測定用試料の吸光度（O. D. 260nm）を測定し、各測定用試料に含まれるＲＮＡ濃度を算出した。
測定結果を以下の表１に示す。また、表１のＲＮＡ濃度をグラフにしたものを図５に示す。
表１中の「吸光度測定値」の欄には、上述の実験と同様の実験を計３回行い、その測定値の平均を示す。
「ＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）」の欄には、吸光度測定値から算出した各測定用試料に含まれるＲＮＡの濃度を示す。
「測定用試料iに対する回収率」の欄には、測定用試料iのＲＮＡ濃度（又は吸光度測定値）を１００％としたときの測定用試料iiの相対値を百分率で示す。
【００８０】
【表１】
【００８１】
表１及び図５より、測定用試料iのＲＮＡ濃度測定値は７．１μｇ／ｍＬであった。これは、コントロールＡ作製時にマイクロチューブ内に収容したＲＮＡ溶液中のＲＮＡ濃度に対応している。
測定用試料iiのＲＮＡ濃度測定値は５．８μｇ／ｍＬとなり、測定用試料iに対する回収率は８１．８％となった。
【００８２】
測定結果より、核酸を保持した保持体に前処理を施すことによって、本実験例における測定用試料iに比べて８０％以上の核酸を検出することができた。これは、ホモジナイズを１０往復行うことによって保持体から核酸を効果的に回収できたことを示す。
従って測定用試料iiのＲＮＡ濃度測定値を後述する実験例２における表示値とすることができる。
【００８３】
（実験例２）
実験例２では、核酸と核酸を保持する保持体とからなる疑似組織を作製し、ホモジナイズなどの所定の処理を施して核酸濃度測定した場合と、ホモジナイズを行わずに核酸濃度測定した場合とのそれぞれの核酸濃度を算出し、実験例１で算出した表示値と比較した。
【００８４】
以下に示すように、ホモジナイズ試薬及び／又はアガロース溶液を用いて、測定用試料iii及びivを作製した。
本実験例で行われた測定用試料作製の概略は図６に示される。
【００８５】
＜測定用試料iii及びivの作製＞
測定用試料iiiの作製に際して、先ず実験例１におけるコントロールＢと同ロットのコントロールＣに、ホモジナイズ試薬５００μＬ添加した。さらに、測定用試料iiを作製するのと同様の処理を施し、上清１００μＬをキュベットｃに回収した。
測定用試料ivの作製に際して、先ず実験例１におけるコントロールＢと同ロットのコントロールＤに、ホモジナイズ試薬５００μＬ添加した。このコントロールＤとホモジナイズ試薬との混合物から上清を１００μＬ回収し、キュベットｄに回収した。測定用試料ivは、ホモジナイズを行わずに作製したものである。
【００８６】
＜吸光度の測定＞
測定に際しては、分光光度計（UV-2500PC：島津製作所製）を用いて、キュベットｃ及びｄに収容された各測定用試料の吸光度（O. D. 260nm）を測定し、各測定用試料に含まれるＲＮＡ濃度を算出した。
測定結果を以下の表２に示す。また、表２のＲＮＡ濃度をグラフにしたものを図７に示す。
表２中の「吸光度測定値」の欄には、上述の実験例と同様の実験を計３回行い、その測定値の平均を示す。
「ＲＮＡ濃度（μｇ／ｍＬ）」の欄には、吸光度測定値から算出した各測定用試料に含まれるＲＮＡの濃度を示す。
「表示値に対する回収率」の欄には、実験例１で算出した表示値を１００％としたときの測定用試料iii及びivの相対値を百分率で示す。
【００８７】
【表２】
【００８８】
表２及び図７より、測定用試料iiiのＲＮＡ濃度測定値は５．８μｇ／ｍＬとなった。この値は表示値に比べて１００％の回収率である。
また、ホモジナイズをせずに測定を行った測定用試料iiiのＲＮＡ濃度測定値は１．２μｇ／ｍＬとなった。この値は表示値に比べて２０．４％の回収率である。
【００８９】
以上の測定結果より、ホモジナイズを行わないと疑似組織から効果的に核酸を抽出できないということが分かった。
従って、表示値と疑似組織の核酸濃度測定値とを比較することにより、ホモジナイズが正確に行われているかどうかを確認できる。
【００９０】
実験例１及び２により、各実験例で作製した疑似組織（コントロールＢ〜Ｄ）は遺伝子検査におけるホモジナイズの精度管理に適しているということが確認された。
【００９１】
（実験例３）
実験例３では、標的核酸を含む細胞と標的核酸を含む細胞を保持する保持体とからなる疑似組織を用いて、細胞に含まれるＣＫ１９ｍＲＮＡの増幅立ち上がり時間を測定することによって、疑似組織から核酸を抽出し、増幅できるか否かを確認した。この疑似組織は生体から切除したリンパ節を想定して作製されたものである。ここでは、濁度が０．１に達した時間を増幅立ち上がり時間として算出する。
【００９２】
以下に示すように、ホモジナイズ試薬及び／又はアガロース溶液を用いて、測定用試料v、vi及びviiを作製した。測定用試料vの増幅立ち上がり時間は本実験のポジティブコントロールとして用いられ、測定用試料viiはネガティブコントロールとして用いられる。
本実験例で行われた測定用試料作製の概略は図８に示される。
【００９３】
＜測定用試料vの作製＞
先ず，ヒト乳癌由来の細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１；大日本製薬）をカウンティングチェンバー（アズワン）を用いて顕微鏡で計数し、溶液中に２×１０６個の細胞が含まれるよう、細胞溶液を調製した。マイクロチューブにこの細胞溶液を収容し、これをコントロールＥとした。コントロールＥに実験例１で用いたホモジナイズ試薬で１ｍｌまでメスアップした。コントロールＥとホモジナイズ試薬との混合物に対してペッスルで１０往復破砕動作を行った。得られたホモジネートを約一分間約２０００ｇで遠心し上清２０μｌを回収してこれを測定用試料vとし、マイクロチューブｅに収容した。
【００９４】
＜測定用試料viの作製＞
先ず、マイクロチューブに精製水を収容した。ここにゲル化剤としてアガロース（CAMBREX社）を８μｇ添加した。このマイクロチューブを、約７０℃に温度設定した恒温槽内で、精製水中のアガロースが完全に溶解するまで加温した。精製水にアガロースが完全に溶解すると、恒温槽から取り出し、アガロース溶液に測定用試料v作製の際に用いた細胞溶液と同じものを添加した。アガロース溶液中に細胞が偏在しないよう、ピペッティングによってアガロース溶液と細胞溶液の混合液を混和させた。−２０℃の冷凍庫内でこの混合液の液温を低下させて混合液をゲル化させ、これをコントロールＦとした。なお、アガロース溶液と細胞溶液との合計体積は、２００μｌとなるように調整された。アガロース溶液のアガロース濃度は４ｗ／ｖ％である。コントロールＦは本発明の精度管理用疑似組織に相当する。
コントロールＦを解凍した後、ホモジナイズ試薬８００μｌを添加して、ペッスルで１０往復破砕動作を行った。得られたホモジネートを約一分間、約２０００ｇで遠心して上清２０μｌを回収してこれを測定用試料viとし、マイクロチューブｆに回収した。
【００９５】
＜測定用試料viiの作製＞
先ず、コントロールＧが作製された。コントロールＧは、細胞溶液を用いないこと以外はコントロールＦと同様にして作製された。
コントロールＧにホモジナイズ試薬８００μｌを添加して、ペッスルで１０往復破砕動作を行った。得られたホモジネートを約一分間、約２０００ｇで遠心して上清２０μｌを回収してこれを測定用試料viiとし、マイクロチューブｇに回収した。
【００９６】
＜増幅立ち上がり時間の測定＞
マイクロチューブｅ、ｆ、及びｇにそれぞれ１８０μｌのホモジナイズ試薬を添加し、測定用試料v、vi、及びviiを１０倍に希釈した。
遺伝子増幅検出装置ＧＤ−１００（シスメックス）を用いて、希釈された各測定用試料のＣＫ１９ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを増幅し、増幅に伴って増大する濁度の変化をリアルタイムでモニターした。
測定結果を図９に示す。
図９（１）、（２）及び（３）はそれぞれ測定用試料v、vi及びviiの増幅立ち上がり時間を示すグラフである。
【００９７】
ポジティブコントロールである測定用試料vの増幅立ち上がり時間は１２．７分であり、測定用試料viの増幅立ち上がり時間は１２．９分であった。また、ネガティブコントロールである測定用試料viiは増幅の立ち上がりが見られなかった。
以上の測定結果より、疑似組織のホモジナイズが正確に行われれば、疑似組織から得られた測定用試料の増幅立ち上がり時間は、ポジティブコントロールである測定用試料vの増幅立ち上がり時間と非常に近似した値を示すことが確認され、この疑似組織を精度管理物質として用いることが可能であると判断できた。
【００９８】
本明細書では、生体から切除した組織に前処理を施し、切除組織に含まれる核酸を検出して疾患の有無を推定する場合について述べたが、切除組織に含まれる特定のタンパク質の発現量や活性を検出して疾患の有無を推定することも可能である。タンパク質を検出する場合も切除組織の前処理が必要であるため、細胞と細胞を保持する保持体とからなる疑似組織を用いてタンパク質を検出することにより前処理の精度管理を行うことができる。前処理された疑似組織に含まれるタンパク質は吸光度測定や、タンパク質発現・活性解析により検出され得る。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】核酸増幅検出装置及びその周辺機器の全体構成を示した斜視図である。
【図２】核酸増幅検出装置の測定部の全体構成を示した図である。
【図３】実験例１で行われた測定用試料i及びii作製の概略である。
【図４】疑似組織と、該疑似組織を収容したマイクロチューブとを模式的に示した図である。
【図５】測定用試料i及びiiのＲＮＡ濃度を示したグラフである。
【図６】実験例２で行われた測定用試料iii及びiv作製の概略である。
【図７】測定用試料iii及びivのＲＮＡ濃度を示したグラフである。
【図８】実験例３で行われた測定用試料v，vi及びvii作製の概略である。
【図９】測定用試料v、vi、及びviiの増幅立ち上がり時間を示したグラフである。
【符号の説明】
【０１００】
２ マイクロチューブ
３ アガロースゲル
４ ＲＮＡ
５ 収容部
６ 蓋
１０ 分注機構部
１１ アーム部
１２ シリンジ部
１２ａ ノズル部
２０ サンプル容器セット部
２１ａ サンプル容器セット孔
２１ｂ 把持部
３０ 試薬容器セット部
３１ａ プライマ試薬容器セット孔
３１ｂ 酵素試薬容器セット孔
３１ｃ 把持部
３２ａ プライマ試薬容器
３２ｂ 酵素試薬容器
４０ チップセット部
４１ ピペットチップ
４２ ラック
４２ａ 収納孔
４３ 取り外しボタン
５０ チップ廃棄部
６０ 反応検出部
６０ａ 反応検出ブロック
６１ 反応部
６２ 濁度検出部
６３ 蓋閉機構部
６５ 検出セル
６７ａ セル部
７０ 制御部
８０ 電源部
９０ 緊急停止スイッチ
１００ 核酸増幅検出装置
１０１ 測定部
１０２ データ処理部
１０２ａ キーボード
１０２ｂ マウス
２００ プリンタ
３００ ホストコンピュータ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸又は細胞と、前記核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなる精度管理用疑似組織。
【請求項２】
前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である請求項１記載の精度管理用疑似組織。
【請求項３】
前記核酸がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である請求項１記載の精度管理用疑似組織。
【請求項４】
前記細胞が癌細胞である請求項１記載の精度管理用疑似組織。
【請求項５】
前記保持体がゲル化剤を含む請求項１記載の精度管理用疑似組織。
【請求項６】
前記保持体が加温することによって流動化する請求項１記載の精度管理用疑似組織。
【請求項７】
前記保持体が天然高分子及び合成高分子からなる群より選択される少なくとも一種を含む請求項１記載の精度管理用疑似組織。
【請求項８】
前記保持体が寒天、アガロース、カラギーナン、アルギン酸、アルギン酸塩、ペクチン、コラーゲン、ゼラチン、グルテン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、及びポリアクリルアミドからなる群より選択される少なくとも一種を含む請求項１記載の精度管理用疑似組織。
【請求項９】
核酸又は細胞と、前記核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織にホモジナイズを含む核酸抽出処理を施して測定した核酸濃度測定値と、表示値とを比較して、前記核酸抽出処理が適切になされたかどうかを判定する精度管理方法。
【請求項１０】
標的核酸又は標的核酸を含む細胞と、前記標的核酸又は標的核酸を含む細胞を保持することのできる保持体とからなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織をホモジナイズしてホモジネートを作製するホモジナイズ工程と、前記ホモジネートに含まれる標的核酸を増幅する増幅工程と、増幅された標的核酸を検出し疑似組織に由来する標的核酸濃度を測定する測定工程と、前記精度管理用疑似組織の標的核酸濃度の測定値と表示値とを比較して前記ホモジナイズ工程、増幅工程、及び測定工程が適切になされたどうかを判定する工程と、を有する精度管理方法。
【請求項１１】
前記標的核酸が腫瘍マーカーの一部又は全部をコードする遺伝子又はその遺伝子の一部である請求項１０記載の精度管理方法。
【請求項１２】
前記腫瘍マーカーがサイトケラチンである請求項１１記載の精度管理方法。
【請求項１】
核酸又は細胞と、前記核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなる精度管理用疑似組織。
【請求項２】
前記核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）である請求項１記載の精度管理用疑似組織。
【請求項３】
前記核酸がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である請求項１記載の精度管理用疑似組織。
【請求項４】
前記細胞が癌細胞である請求項１記載の精度管理用疑似組織。
【請求項５】
前記保持体がゲル化剤を含む請求項１記載の精度管理用疑似組織。
【請求項６】
前記保持体が加温することによって流動化する請求項１記載の精度管理用疑似組織。
【請求項７】
前記保持体が天然高分子及び合成高分子からなる群より選択される少なくとも一種を含む請求項１記載の精度管理用疑似組織。
【請求項８】
前記保持体が寒天、アガロース、カラギーナン、アルギン酸、アルギン酸塩、ペクチン、コラーゲン、ゼラチン、グルテン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、及びポリアクリルアミドからなる群より選択される少なくとも一種を含む請求項１記載の精度管理用疑似組織。
【請求項９】
核酸又は細胞と、前記核酸又は細胞を保持することのできる保持体とからなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織にホモジナイズを含む核酸抽出処理を施して測定した核酸濃度測定値と、表示値とを比較して、前記核酸抽出処理が適切になされたかどうかを判定する精度管理方法。
【請求項１０】
標的核酸又は標的核酸を含む細胞と、前記標的核酸又は標的核酸を含む細胞を保持することのできる保持体とからなり、所定の表示値を有する精度管理用疑似組織をホモジナイズしてホモジネートを作製するホモジナイズ工程と、前記ホモジネートに含まれる標的核酸を増幅する増幅工程と、増幅された標的核酸を検出し疑似組織に由来する標的核酸濃度を測定する測定工程と、前記精度管理用疑似組織の標的核酸濃度の測定値と表示値とを比較して前記ホモジナイズ工程、増幅工程、及び測定工程が適切になされたどうかを判定する工程と、を有する精度管理方法。
【請求項１１】
前記標的核酸が腫瘍マーカーの一部又は全部をコードする遺伝子又はその遺伝子の一部である請求項１０記載の精度管理方法。
【請求項１２】
前記腫瘍マーカーがサイトケラチンである請求項１１記載の精度管理方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００６−１３６３１０（Ｐ２００６−１３６３１０Ａ）
【公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２４９１８（Ｐ２００５−２４９１８）
【出願日】平成１７年２月１日（２００５．２．１）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月１日（２００６．６．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１日（２００５．２．１）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
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