細胞の培養寿命の延長および培養細胞からのタンパク質収量を増加させるための改良された方法および組成物
細胞培養物の寿命を延長させ、タンパク質（好ましくは抗体、ペプチド、酵素、成長因子、インターロイキン、インターフェロン、ホルモン、およびワクチンなどの組換えタンパク質）の生産増加を可能にするための組成物および方法が開示される。三重突然変異型Ｂｃｌ−２遺伝子などのアポトーシス阻害遺伝子またはベクターをトランスフェクトした細胞は、培養下で、より長く生存することができ、タンパク質生合成の状態および収量の拡大をもたらす。前記トランスフェクト細胞は、親細胞株によって達成される最大密度に等しいか、それを上回る最大細胞密度を示す。トランスフェクト細胞を無血清培地における成長に前適応させて、無血清培地におけるタンパク質生産を獲得するのに必要な時間を著しく短縮することもできる。特定の方法では、前適応細胞を使って、無血清条件下での形質転換後に、タンパク質生産を行うことができる。本方法では、好ましくは真核細胞、より好ましくは哺乳動物細胞を使用する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明のさまざまな実施形態は、細胞株の寿命延長および／または細胞株からのタンパク質収量を増加させるための方法および組成物に関する。具体的な実施形態において、細胞株は、抗体または抗体フラグメントを産生するハイブリドーマ細胞株であってもよい。さらに具体的な実施形態において、本方法は、一つ以上の遺伝子（例えばＥ６、Ｅ７および／もしくはＢｃｌ−２または関連タンパク質をコードする遺伝子）を細胞株にトランスフェクトすることを含み得る。そのようなタンパク質はそのネイティブ配列に限定されるわけではなく、例えばＴ６９Ｅ、Ｓ７０ＥおよびＳ８７Ｅに点突然変異を持つＢｃｌ−２などのように、置換されたアミノ酸を一つ以上含んでいてもよい。別の実施形態は、無血清培地中で成長しタンパク質を産生する能力を持つ哺乳動物細胞株に関する。そのような細胞株は、抗体、二重特異性抗体、多価抗体もしくは多重特異性抗体またはそのフラグメントなどの異種タンパク質を発現させる発現ベクターを、その細胞株にトランスフェクトすることによる、タンパク質生産の方法に使用することができる。好ましい実施形態では、その細胞株を無血清培地中でトランスフェクトすることにより、トランスフェクト細胞株を無血清増殖成長および無血清タンパク質生産に適応させる必要を回避して、かなりの時間を節約することができる。
【背景技術】
【０００２】
細胞をインビトロで（特に大きなバイオリアクターで）培養することは、数多くのバイオテクノロジー製品を生産する基礎を成している。これは、細胞による培地中へのタンパク質産物の産出を伴い、これらの産物はその培地から単離され、さらに加工された後、臨床的に使用される。培養下で増殖成長する細胞から生産されるタンパク質の量は、例えば細胞密度、細胞周期の位相、そのタンパク質の細胞生合成速度、細胞の生存および成長を支えるために用いられる培地の条件、ならびにその細胞の培養下での寿命（すなわち、それらの細胞がプログラム細胞死またはアポトーシスで死ぬまでの時間）などといった、いくつかの因子に依存する。培養細胞の生存率および寿命を改善する方法は、例えば栄養素、細胞密度、酸素含量および二酸化炭素含量、乳酸デヒドロゲナーゼ、ｐＨ、容量オスモル濃度、異化産物などを制御することによって所望するタンパク質の生産性を増加させる方法と共に、種々開発されてきた。例えば、細胞密度を増加させることで、生産性を高めることはできるが、それは培養細胞の寿命を縮めることにもなり得る。そこで、細胞集団ができるだけ長く最も生産的な状態に維持されるように、最大密度に到達した時には培養細胞の増殖速度を低下させることが望まれるだろう。これにより、バイオリアクター周期をその生産ピークにおいて増加または延長させて、所望するタンパク質産物をより長期間産出させることができ、そしてそれは、バイオリアクター周期からの収量を高めることになる。
【０００３】
バイオリアクター周期の時間を増加させるために、例えば細胞増殖のための培地を調節すること、一定の成長促進因子を添加すること、ならびにタンパク質合成に影響を及ぼさずに細胞増殖を阻害することなど、多種多様なアプローチが探究されてきた。ある具体的アプローチでは、細胞周期因子に影響を及ぼすための遺伝子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを使って細胞周期を制御することにより、培養細胞の寿命を増加させることを目指す。この方法では、細胞周期進行を妨げて、いわゆる擬似老化状態（これは、さらなる細胞分裂を遮断し培養細胞のタンパク質合成能力を拡大する）を誘導するベクターをトランスフェクトし、または形質転換し、または感染させることにより、細胞を擬似老化段階へと誘導する。言い換えると、細胞周期阻害剤を発現させるベクターを細胞にトランスフェクトすることにより、擬似老化状態を誘導することができる（Ｂｕｃｃｉａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願公開第２００２／０１６０４５０号Ａ１；ＷＯ ０２／１６５９０ Ａ２）。後者の方法は、細胞増殖を阻害することにより、ＧｏｌｄｓｔｅｉｎとＳｉｎｇａｌが記述しているように延長された細胞培養寿命を持ち（Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ８８，３５９−６４，１９７４；Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７：１９９−２０５，１９９８）、アポトーシスに対して耐性を持つ（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７，４２９１−６，２０００；Ｊａｖｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９，６１−８，２０００）ことができる状態に、細胞を強制的に陥らせようとするものである。
【０００４】
さらにもう一つのアプローチでは、アデノウイルスＥ１遺伝子のトランスフェクション後に無限増殖性を持つ初代二倍体ヒト細胞またはその誘導体を樹立する。機能的なＡｄ５ Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子産物を発現させる新しい細胞株（その一つがＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ受託番号９６０２２９４０）である）は、遺伝子治療およびワクチン用ならびに組換え治療タンパク質（例えばヒト成長因子およびヒト抗体）の生産用に設計された組換えアデノウイルスならびに他のウイルス（例えばインフルエンザ、単純ヘルペス、ロタウイルス、麻疹）を産生することができる（Ｖｏｇｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ０２／４０６６５ Ａ２）。
【０００５】
別のアプローチでは、細胞におけるアポトーシスを防止または遅延させるためのカスパーゼ阻害剤の使用に、焦点が当てられた。例えば米国特許第６，５８６，２０６号を参照されたい。さらに別のアプローチでは、細胞におけるアポトーシスを防止または遅延させるために、Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーなどといったアポトーシス阻害剤を使用することが試みられた。Ａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ，３：２３−２８（２００４）を参照されたい。これらのアプローチは予測不可能な結果をもたらした。例えばある研究では、Ｂｃｌ−２の発現によって細胞の生存率は増加したが、タンパク質生産は増加しなかった（Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６８：３１−４３，２０００参照）。もう一つの例では、ＣＨＯ細胞におけるアポトーシスを遅延させることを目的とするＢｃｌ−２タンパク質の過剰発現が開示されたが、Ｂｃｌ−ｘＬはタンパク質生産を増加させたものの、Ｂｃｌ−２はタンパク質生産を減少させた（ＷＯ０３／０８３０９３参照）。さらにもう一つの例では、培養Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５８１、以下Ｓｐ２／０という）の生存を延長するためにＢｃｌ−２タンパク質の発現を使用する実験が開示された。しかし、Ｂｃｌ−２発現クローンの細胞密度は、その親培養物の細胞密度よりも２０〜５０％低く、生物医薬産業での実用化には懸念が生じた（ＷＯ０３／０４０３７４；Ｕ．Ｓ．６，９６４，１９９参照）。
【０００６】
したがって、組換えタンパク質を高レベルに発現させるための改良された宿主細胞および組換えタンパク質生産（特に、宿主細胞における抗体および抗体フラグメント、多重特異性抗体、フラグメントおよび単鎖構築物、ペプチド、酵素、成長因子、ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、ならびにワクチンの生産）を確実に増加させるための方法が、当分野において必要とされていることは、明らかである。また、無血清成長および無血清タンパク質生産の前に非常に長い適応期間を経ることなく、無血清条件下で発現ベクターをトランスフェクトし、タンパク質生産に使用することができる、無血清培地または血清枯渇培地中で成長するように前適応させた細胞株も必要とされている。
【発明の開示】
【０００７】
したがって、老化を阻害する薬剤または細胞生存を促進する薬剤（例えば抗アポトーシス剤）を細胞中に導入することにより、細胞培養の寿命および／または組換えタンパク質収量を増加させるための改良された宿主細胞および方法を提供することが、本発明の目的である。そのような薬剤の使用は、所望する組換えタンパク質の生産に用いられる培養細胞の寿命および生存率を優先的に増加させると同時に、培養細胞の生産性を増加させ、それによって所望するタンパク質の最適収量を増加させる。好ましくは、本発明の方法で使用されるアポトーシス阻害因子には、Ｂｃｌ−２およびそのファミリーメンバーが含まれるが、これらに限るわけではない。あるいは、細胞内アポトーシス促進性タンパク質のレベルをダウンレギュレートする因子（例えばｐ５３およびＲｂ）または細胞内抗アポトーシスタンパク質（例えばＢｃｌ−２）をアップレギュレートする因子を細胞中に導入することによって、細胞クローンの寿命および組換えタンパク質収量を改良することもできる。
【０００８】
好ましくは、本発明の方法で使用される調節剤には、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ−１６）がんタンパク質Ｅ６およびＥ７、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２、ならびにその組合わせが含まれるが、これらに限るわけではない。また、本明細書に記載するカスパーゼ阻害剤も、アポトーシスを遮断または減少させ、よって細胞生存を増加させ、前記培養細胞による組換えタンパク質の生産を増加させる一因となり得る。組換えタンパク質の生産を強化するためにこれらの培養物に使用することができる抗アポトーシス剤のさらにもう一つのクラスには、Ｉ型サイトカインスーパーファミリーの一定のメンバー、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）などが含まれる。ＥＰＯは、このクラスのプロトタイプ分子として、赤血球だけでなく、複数の細胞タイプのアポトーシスの主要調整因子であり、それゆえに、例えば内皮細胞、心筋細胞、腎臓の尿細管上皮細胞、皮膚、およびニューロンなどにおいて、より普遍的な細胞保護機能を持つ［Ｐ．ＧｈｅｚｚｉおよびＭ．Ｂｒｉｎｅｓによる総説、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｅｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １１（ｓｕｐｐｌ．１），ｓ３７−ｓ４４，Ｊｕｌｙ ２００４を参照のこと］。
【０００９】
さまざまな実施形態で、ＨＰＶ−１６のＥ６、Ｅ７および／またはＢｃｌ−２などの一つ以上の調節因子をトランスフェクトした細胞株を、無血清培地での成長に前適応させることができる。そのような前適応細胞株、例えばＳｐ／ＥＳＦ細胞株（下記実施例参照、ただしこれに限るわけではない）は、一つ以上の発現ベクターにより、無血清条件下で、さらなる形質転換を起こすことができ、したがって無血清成長への適応に長い時間を必要とせずに、無血清条件下での発現およびタンパク質生産を可能にすることができる。この驚くべき結果は、無血清条件下または低血清条件下でのタンパク質生産を可能にし、培地コストの著しい節約をもたらす。同時に、標準的な哺乳動物細胞株（これは、血清リッチな条件下でしかトランスフェクション可能でなく、無血清タンパク質生産への適応には、さらに６〜１２ヶ月を必要とする）を使った場合に要求される、無血清適応に必要なかなりの時間が、無血清条件下でのトランスフェクションおよびタンパク質生産によって不要になる。
【００１０】
本発明は、細胞培養物の寿命を延長し、かつ／または最適化され、所望する組換えタンパク質の収量が増加するような細胞培養条件を作り出すために、例えばトランスフェクションベクター、望ましい性質を持つ細胞クローンのスクリーニングおよび選択、細胞培養培地、成長条件、バイオリアクター構成、ならびに細胞タイプなどといった因子（ただしこれらに限るわけではない）の新規な組合わせを取り入れた細胞培養方法も教示する。これらの細胞培養方法には、懸濁培養法、潅流培養法および半回分培養法が含まれる。Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７９：１４７−１５９（２０００）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７９：１７１−１８１（２００４）；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５５：７８３−７９２（１９９７）を参照されたい。
【００１１】
別段の定義をしない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、その平易な通常の意味を持つ。また、本明細書で言及する特許および他の参考文献の内容は、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において、「ある（ａまたはａｎ）」は、ある項目について、一つまたはそれ以上を意味し得る。
【００１３】
本明細書で使用する用語「および（ａｎｄ）」および「または（ｏｒ）」は、接続詞または離接的接続詞を意味するために使用され得る。すなわち、どちらの用語も、別段の表示がない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」に等価であると理解すべきである。
【００１４】
本明細書で使用する用語「約」は±１０％を意味する。すなわち「約１００」は９０〜１１０の数字を意味する。
【００１５】
本明細書にいう抗体とは、完全長の（すなわち天然の、または通常の免疫グロブリン遺伝子フラグメント組換えプロセスによって形成された）免疫グロブリン分子（例えばＩｇＧ抗体）または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（すなわち、特異的に結合する）部分もしくは類似物、例えば抗体フラグメントを指す。
【００１６】
抗体フラグメントは、例えばＦ（ａｂ）2、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどといった抗体の一部分である。構造がどうであれ、抗体フラグメントは、完全な抗体によって認識される抗原と同じ抗原に結合する。「抗体フラグメント」という用語は、特異的抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のように作用する任意の合成タンパク質または遺伝子操作タンパク質も包含する。例えば抗体フラグメントには、可変領域からなる単離されたフラグメント、例えば重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とがペプチドリンカーによってつながれている組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、および超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識ユニット（ＣＤＲ）が含まれる。
【００１７】
本明細書で使用する抗体融合タンパク質という用語は、同じまたは異なる特異性を持つ二つ以上の同じまたは異なるｓｃＦｖまたは抗体フラグメントが連結されるように組み換えられて生産された抗原結合分子を指す。融合タンパク質の結合価は、その融合タンパク質が単一の抗原またはエピトープに対して持つ結合アームまたは結合部位の数、すなわち一価、二価、三価または多価を示す。抗体融合タンパク質の多価結合性は、抗原への結合に複数の相互作用を利用することができ、したがってその抗原への結合のアビディティを増加させ得ることを意味する。特異性は、抗体融合タンパク質が結合することのできる抗原またはエピトープの数、すなわち単一特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性を示す。これらの定義を使った場合、天然の抗体、例えばＩｇＧは、二つの結合アームを持つので二価であるが、一つのエピトープに結合するので単一特異性である。単一特異性多価融合タンパク質は、例えば同じ抗原と反応する二つの結合部位を持つダイアボディなど、あるエピトープに対して二つ以上の結合部位を持つが、単一のエピトープにしか結合しない。融合タンパク質は、単一の抗体構成要素を含むか、異なる抗体構成要素の多価的または多重特異性的組合わせを含むか、または同じ抗体構成要素の複数コピーを含み得る。融合タンパク質はさらに、抗体または抗体フラグメントおよび治療剤を含み得る。そのような融合タンパク質に適した治療剤の例には、免疫調整剤（「抗体−免疫調整剤融合タンパク質」）および毒素（「抗体−毒素融合タンパク質」）が含まれる。好ましい毒素の一つは、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、好ましくは組換えＲＮアーゼを含む。
【００１８】
細胞株
本発明のさまざまな実施形態は、宿主細胞株を含む改良された組成物、およびそのような細胞株で組換えタンパク質の強化された生産を行うための方法に関する。一つ以上の抗アポトーシス遺伝子を構成的に発現させ、関心対象のタンパク質またはペプチドをコードする発現構築物をトランスフェクトすることができる細胞株であって、抗アポトーシス遺伝子の発現が培養下でのトランスフェクト細胞の生存を延長し、関心対象のタンパク質またはペプチドの収量を高め得るような細胞株を作出した。
【００１９】
特定の実施形態は、回分培養下で強化された生存を示すＳｐ−Ｅ２６、Ｓｐ−ＥＥＥおよびＳｐ−ＥＳＦと呼ばれる新規細胞株をもたらすＳｐ２／０骨髄腫細胞株の派生細胞株に関する。Ｓｐ−Ｅ２６は、ＨＰＶ−１６のＥ６タンパク質およびＥ７タンパク質を構成的に発現させる。Ｓｐ−ＥＥＥおよびＳｐ−ＥＳＦは、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥと呼ばれるＢｃｌ−２突然変異体を構成的に発現する。さらにまた、Ｓｐ−Ｅ２６、Ｓｐ−ＥＥＥまたはＳｐ−ＥＳＦに関心対象の組換えタンパク質の発現ベクターをトランスフェクトすれば、組換えタンパク質生産、特に組換え抗体および抗体フラグメントの生産を改良することもできる。Ｅ６／Ｅ７タンパク質またはＢｃｌ−２−ＥＥＥタンパク質は、宿主細胞におけるアポトーシスの誘導を遅延させ、宿主細胞における強化された組換えタンパク質生産を可能にする。タンパク質生産は、その細胞の成長培地に、一つ以上のカスパーゼ阻害剤（例えばカスパーゼ１および／または３阻害剤）を添加することによって（Ｂｉｎ Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ ２００４；９６：ｅ３９−ｅ５１）、そして／またはＩ型サイトカインスーパーファミリーの一つ以上のメンバー、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）を添加することによって、さらに増強することができる。これに関して、汎カスパーゼ阻害剤は特に有効である。
【００２０】
さらに、Ｓｐ−ＥＥＥ細胞株を、無血清条件下または低血清条件下での成長およびタンパク質生産に前適応させて、Ｓｐ−ＥＳＦなどの無血清前適応細胞株を生じさせることもできる。Ｓｐ−ＥＳＦおよび類似の細胞株には、関心対象のタンパク質、例えば抗体、抗体フラグメント、二重特異性抗体などをコードする一つ以上の発現ベクターをトランスフェクトすることができる。トランスフェクションへの無血清条件の使用は、トランスフェクションおよびタンパク質生産に利用することができる哺乳動物細胞株では類を見ないものであり、無血清成長への適応に要するかなりの時間を不要にする。
【００２１】
Ｂｃｌ−２などのアポトーシス阻害因子の同時発現により、宿主細胞における組換えタンパク質、例えば抗体または抗体フラグメントの生産を著しく強化することができる。特に、抗体または抗体フラグメントをコードする発現ベクターを安定にトランスフェクトすると共に、Ｂｃｌ−２などのアポトーシス阻害因子をコードする発現ベクターをコトランスフェクトしたＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株では、タンパク質生産が著しく強化される。増加した抗体生産は、Ｅ６／Ｅ７遺伝子をトランスフェクトした宿主細胞からも得ることができる。組換えタンパク質生産は、細胞の成長培地に一つ以上のカスパーゼ阻害剤を添加することによって、さらに増強することができる。これに関して、汎カスパーゼ阻害剤は特に有効である。また、組換えタンパク質生産は、細胞培養物の培地にＥＰＯまたは他の抗アポトーシス性サイトカインを供給することによって強化することもできる。
【００２２】
アポトーシスと呼ばれる生理的細胞死またはプログラム細胞死（Ｋｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．，２６：２３９−２５７，１９７２）は、適正な組織の発生および維持にとって不可欠であり、進化の過程で保存されてきた固有の遺伝的プログラムによって制御される（Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，７，６６３−６９８，１９９１）。そのため、エクスビボ培養物などの人工的環境で細胞が成長する場合は、この遺伝的資質が有限の寿命をもたらす。したがって、医学および産業ならびに研究で用いられるタンパク質の生産にとって、そのような細胞培養物の有用性は、そのような培養物がアポトーシス機構によって死ぬまで、より長い寿命またはサイクルにわたって、そのような培養物を維持することに依存する。
【００２３】
細胞周期をアポトーシス作用と区別することにより、細胞増殖イベントおよび細胞死イベントに独立して作用する方法および薬剤が発見されている。アポトーシスの周知の細胞内調節因子であるＢｃｌ−２（Ｖａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３５，４４０−２，１９８８）は、細胞周期進入に対するその阻害的影響とは遺伝的に異なる抗アポトーシス作用を持つことがわかっているがん原遺伝子である（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ １６，４６２８−３８，１９９７）。Ｂｃｌ−２の二つのホモログＢｃｌ−ｘLおよびＢｃｌ−ｗも細胞生存を延長させるが、Ｂｃｌ−２ファミリーの他のメンバー、例えばＢａｘおよびＢａｋは、アポトーシス促進性である（Ｏｌｔｖａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７４，６０９−１９，１９９３；Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７４，７３３−６，１９９５；Ｆａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７４，７３１−３，１９９５；Ｋｉｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７４，７３６−９，１９９５）。他の抗アポトーシス遺伝子にはＢｃｌ−６およびＭｃｌ−１が含まれる。
【００２４】
このように、Ｂｃｌ−２とそのファミリーの一定のメンバーはアポトーシスに対する防御作用を持ち、これを、タンパク質の生産に使用される一定の培養宿主細胞の寿命を増加させ、それによって生産、単離されるタンパク質の量を高めるための方法に使用することができる。抗アポトーシス性のＢｃｌ−２ファミリーメンバー、例えばＢｃｌ−２、ＢＣｌ−ｘL、Ｂｃｌ−ｗ、またはこれらのタンパク質の突然変異体種の過剰発現は、アポトーシスを阻害し、その結果として細胞密度を増加させ、培養物の生存を延長する。そのため、抗アポトーシス性のＢｃｌ−２ファミリー遺伝子をトランスフェクトすれば、他の研究者ら（前掲書）が提案しているように細胞周期そのものを妨害することによって細胞培養物を延命する必要は回避される。同様に、Ｂｃｌ−２遺伝子の線維芽細胞へのトランスフェクションは、これらの細胞におけるＢｃｌ−２の過剰発現をもたらし、その結果として、アポトーシスの拮抗作用と細胞の寿命の増加が起こり、それに付随して組換えタンパク質の生産および単離が増加する。インターロイキン−６（ＩＬ−６）依存性マウス骨髄腫細胞は、サイトカイン離脱時に、あたかもアポトーシスを起こすかのように死ぬことも観察されている。そのような細胞中のＩＬ−６受容体は、アポトーシスの延期に関して、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ｘLによって調節され得ることも、見出されている（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：２２６２−５，１９９５）。
【００２５】
三つの点突然変異（Ｔ６９Ｅ、Ｓ７０ＥおよびＳ８７Ｅ）を有する突然変異型Ｂｃｌ−２は、野生型または単一点突然変異体と比較して有意に高い抗アポトーシス活性を示すことが、報告されている（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１０１）１５３−１５８，２００４）。したがって、さまざまな実施形態が、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ三重突然変異体の発現ベクターの構築に関するものであり、その発現ベクターは、改良された寿命および組換えタンパク質生産を示すＳｐ−ＥＥＥクローンおよびサブクローンを作出するために、Ｓｐ２／０細胞のトランスフェクションに使用された。
【００２６】
発がんウイルスなどの他の因子も、例えば高リスク型ＨＰＶがんタンパク質Ｅ６およびＥ７など、それらが誘発する細胞不死化および最終的には完全な悪性トランスフォーメーションの一部として、アポトーシスに対抗することができる（Ｆｉｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ １８８，１５−２４，２００２）。例えば、ウイルスＥ６タンパク質は、紫外線に対する表皮のアポトーシス応答を効果的に遮断する（Ｓｔｏｒｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ ＭｏＩ Ｍｅｄ ８，４１７−２１，２００２）。間接的な証拠から、ヒトパピローマウイルスが扁平上皮癌におけるアポトーシスの減少を引き起こし得る（ただし基底細胞癌におけるアポトーシスは減少させない）ことも示唆されている（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８７，３１９−２３，２００２）。しかし、パピローマウイルスがんタンパク質の全てが、抗アポトーシス作用を持つわけではない。例えば別の研究では、ウシ種のパピローマウイルスＥ６タンパク質はアポトーシスに対する細胞の感受性を高めることが報告されており（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９５，２３０−７，２００２）、これは、ＨＰＶ−１６ Ｅ７遺伝子が一定の刺激によって誘導されるアポトーシスからアストロサイトを保護することを示す別の研究とは対照的である（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｙｏｎｓｅｉ Ｍｅｄ Ｊ ４２，４７１−９，２００１）。Ｅ６結合性ペプチドアプタマーの使用により、ＨＰＶ Ｅ６がんタンパク質がＨＰＶ陽性腫瘍細胞において抗アポトーシス活性を持つことを示す直接的な実験的証拠が得られた（Ｂｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７，６６９３−７，２０００）。しかし他のＨＰＶがんタンパク質は反対の作用を持ち得る。Ｅ２タンパク質は、他のＨＰＶタンパク質の不在下で、アポトーシスを誘導する（Ｗｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５，８７−９４，２０００）。
【００２７】
Ｅ６タンパク質とＥ７タンパク質の両方の持続的発現が、子宮頸がん細胞の最適な増殖には必要であることが知られており、これら二つのウイルスタンパク質は、細胞生存に対して異なる作用を発揮する（ＤｅＦｉｌｉｐｐｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７，１５５１−６３，２００３）。ＨＰＶ−１６ Ｅ６による主要細胞内ターゲットはｐ５３である。Ｅ６は、ｐ５３および細胞ユビキチンリガーゼＥ６ＡＰと三元複合体を形成して、ｐ５３のユビキチン化およびプロテアソーム経路による分解ならびにｐ５３の不活化をもたらす。これに対し、ＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質は、腫瘍抑制タンパク質Ｒｂと相互作用し、それを不安定化する。さらにまた、例えばＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘL、ｐ７３、ＭＤＭ２、ｐ２１、サイクリンおよびｃｄｃ、ｃｄｋタンパク質など、アポトーシス経路および細胞周期経路に関与するさまざまな他の細胞内タンパク質のレベルが、Ｅ６およびＥ７トランスフォーメーションによって調節されると報告された。これらのタンパク質の発現の変化は、細胞の生理学的性質に著しい影響を与えるだろう。そこで本発明者らは、老化培養条件により誘導されるアポトーシスに対して耐性である遺伝子改変クローンを生成させるためにＨＰＶ−１６ Ｅ６およびＥ７による培養細胞のトランスフェクションは有効であり、その結果として細胞培養物の寿命を延長させることができるだろうという仮説を立てた。ＨＰＶ−１６がんタンパク質Ｅ７またはＥ６の単独での細胞への導入が、老化培養条件により誘導されるアポトーシスに対して改良された耐性を持つ遺伝子改変クローンを生成させるのに十分であるかもしれないとも推測した。細胞が組換えタンパク質産生クローンである場合、生理学的性質の改良は、結果的に、総合的なタンパク質生産性の強化につながるだろう。
【００２８】
ウイルス抗アポトーシス遺伝子を発現させる新しい宿主細胞の生成
ＨＰＶ−１６ Ｅ６タンパク質およびＥ７タンパク質などのウイルス抗アポトーシス遺伝子を構成的に発現させる骨髄腫宿主細胞などの宿主細胞を生成させることができる。これらの宿主細胞には、関心対象の組換えタンパク質をコードする発現ベクターをトランスフェクトすることができ、抗アポトーシス遺伝子の同時発現は、著しく増加した組換えタンパク質の生産をもたらす。
【００２９】
宿主細胞は、基本的に、ウイルス抗アポトーシス遺伝子で安定に形質転換することができる組換えタンパク質生産に適した任意の宿主細胞であることができる。多くの組換えタンパク質にとっては、ＣＨＯ細胞およびＣＯＳ細胞などの宿主細胞が好都合であり、一方、抗体などの他のタンパク質には、骨髄腫細胞およびＣＨＯ細胞などの宿主細胞が一般に好んで選択される。有用な宿主細胞株の他の例は、ＶＥＲＯ細胞およびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＲＩＮおよびＭＤＣＫ細胞株である。有用な細胞株は、ＣＯＳ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０）、Ｐ３Ｘ３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１０）およびＢＳＣ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６）細胞株など、商業的供給源から入手することができる。ウイルス遺伝子（例えばＥ６／Ｅ７８）および／または真核生物遺伝子は、それらの遺伝子の構成的発現または誘導性発現をもたらす任意の適切な方法によって、すなわち宿主細胞染色体へのそれらの遺伝子の安定な組込みを可能にすると同時にそれらの遺伝子の発現も可能にする任意の方法によって、宿主細胞中に導入することができる。宿主細胞を関心対象の遺伝子で安定に形質転換するための方法は、当分野では周知である。とりわけ好都合な方法は、ウイルス抗アポトーシス遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを使用することである。適切なベクターとして、ＬＳＸＮベクター（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７，９８０−９０，１９８９）が挙げられる。しかし、エレクトロポレーションまたは細胞融合など、当分野で知られる任意の代替方法を利用することができる。
【００３０】
宿主細胞のトランスフェクションに使用するベクターは、そのベクターを含有する細胞の選択を可能にする選択可能マーカーを含有すると好都合である。トランスフェクト細胞に抗生物質耐性を付与する酵素など、適切な選択マーカーは、当分野では周知である。トランスフェクション後は、抗生物質などの選択剤を含有する培地で細胞を維持し、マーカーに対する耐性についてスクリーニングする。通常の方法を使って、細胞を選択し、限界希釈法でクローニングすることができる。
【００３１】
細胞生存率を増加させるウイルス抗アポトーシス遺伝子の能力は、アポトーシスを誘導する薬剤、例えばシクロヘキシミド（ＣＨＸ）などで、細胞を攻撃することによって、試験することができる。ウイルス抗アポトーシス遺伝子を発現させない細胞がアポトーシスの著しい発生を示しがちであるのに対し、それらの遺伝子を発現させる細胞は、激しく低下したアポトーシス活性を示す。アポトーシスを検出する方法は当分野で周知であり、例えば細胞表面ＦＩＴＣ−アネキシンＶ結合アッセイ、ＤＮＡラダーリングアッセイおよびＴＵＮＥＬアッセイなどがある。
【００３２】
ウイルス抗アポトーシス遺伝子を発現させる適切な細胞を選択したら、その細胞に、選択した組換えタンパク質をコードする発現ベクターをトランスフェクトすることができる。発現ベクターは、一過性発現に適したベクターであるか、好都合には、真核生物複製起点を含有するエピソームベクター、または発現カセットの安定な組込みとそれに続く遺伝子増幅とを可能にする増幅可能ベクターであることができる。適切なベクターは当分野では周知であり、例えば、抗体および抗体フラグメントの生産にとりわけ適しているｐｄＨＬ２ベクターなどがある。増幅可能な発現カセットを使用する場合、それは、トランスフェクト細胞の選択が可能なように、レトロウイルスベクターに使用する選択可能マーカーとは異なる選択可能マーカーを含有すると好都合である。ここでもまた、適切にトランスフェクトされた細胞を選択し、次に限界希釈法によってクローニングすることができる。
【００３３】
適切なクローンを選択したら、所望する関心対象のタンパク質を生産するために、細胞を適切な培地に入れて培養することができる。培地は、血清を含有するか、好ましくは無血清であることができる。また、培養培地に一つ以上のカスパーゼ阻害剤（例えばカスパーゼ１または３）を添加することにより、細胞の寿命およびタンパク質生産を増加させることもできる。好ましくは、カスパーゼ阻害剤は、カスパーゼ３、カスパーゼ９および／またはカスパーゼ１２の一つ以上を阻害するように作用する。細胞透過性カスパーゼ阻害剤を使用すると好都合であり、汎カスパーゼ阻害剤はとりわけ好都合である。Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびＡｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏ（配列番号７）などの適切な阻害剤は、当分野では周知である。あるいは、アポトーシスに影響を与えることによってその成長特性を強化するために、その細胞株をさらにトランスフェクトして、ＡｖｅｎまたはＸＩＡＰなどのカスパーゼ阻害剤を発現させることもできる。これに関して、ＥＰＯなど、Ｉ型サイトカインスーパーファミリーの一定のメンバーも、抗アポトーシス作用および細胞保護作用を持つことにより、細胞生存を増加させることができる。
【００３４】
上述の方法により、基本的に任意の所望する遺伝子によるトランスフェクションに使用することができる細胞株が生成する。しかし、所望するタンパク質（特に組換えタンパク質）を構成的に発現させる樹立細胞株に、後から、ウイルスまたはＢｃｌ−２ファミリー抗アポトーシス遺伝子をコードする適切なベクターをトランスフェクトしてもよいことは、当業者には理解されるだろう。下記実施例２を参照されたい。
【００３５】
関心対象のタンパク質は、宿主細胞において検出可能な量で生産され得る基本的に任意のタンパク質であることができる。例として、従来のＩｇＧ型抗体、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2もしくはＦ（ａｂ）2フラグメント、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖもしくはＦａｂ−ｓｃＦｖ融合抗体、ＩｇＧ−もしくはＦａｂ−ペプチド毒素融合タンパク質、またはワクチン［例えば、限定するわけではないが、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎；ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、ハンターンウイルス、エボラウイルス、ロタウイルス、サイトメガロウイルス、リーシュマニアＲＮＡウイルス、ＳＡＲＳ、マラリア、結核（マイコバクテリア）、炭疽、痘瘡、野兎病、その他、参照によりそのまま本明細書に組み入れられるｗｗｗ．ｖａｃｃｉｎｅｓ．ｏｒｇに列挙されているもの］が挙げられる。本明細書に記載する宿主細胞は、実施例１および実施例２で述べる骨髄腫細胞における抗体および抗体フラグメント、ならびに組換え成長因子（例えばＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、トロンボポエチン）、ホルモン、インターロイキン（例えばＩＬ−１〜ＩＬ−３１）、インターフェロン（例えばα、β、γ、およびコンセンサス）、ならびに酵素の高効率生産には、とりわけ適している。これらの方法は、他の骨髄腫細胞株、例えばマウスＮＳＯまたはラットＹＢ２／０；上皮株、例えばＣＨＯおよびＨＥＫ２９３；間葉系細胞株、例えば線維芽細胞株ＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７；およびニューロン細胞、例えば網膜細胞、ならびにグリア細胞およびグリア腫細胞など、組換えタンパク質の生産に用いられるいくつもの細胞株に適用することができるだろう。
【００３６】
アポトーシス阻害剤を発現させる細胞における組換え抗体発現
先行の研究では、キメラ抗体を産生する組換えＣＨＯ細胞中で天然のアポトーシス阻害剤であるＢｃｌ−２を同時発現させることの効果が述べられている（Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６８：３１−４３（２０００）参照）。細胞培養寿命の増加は観察されたが、抗体生産は、Ｂｃｌ−２発現を欠く等価な細胞と比較して増加しなかった。しかし本発明者らは、骨髄腫細胞からの組換え抗体の生産が、その細胞がＢｃｌ−２も発現させる場合には、著しく増加することを見出した。
【００３７】
骨髄腫細胞株に、抗体または抗体フラグメントをコードする発現カセットを安定にトランスフェクトすると、好都合である。適切な発現カセットは、抗体重鎖および軽鎖（ｓｃＦｖの場合は単鎖）の発現を制御する一つ以上のプロモーターを、上述の選択可能マーカーと共に含有する。とりわけ有用なベクターはｐｄＨＬ２であり、これは、選択可能マーカー酵素をコードするＤＮＡ配列に作動的に連結されたプロモーターを含む選択可能マーカー遺伝子；関心対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動的に連結されたプロモーターを持つ転写単位；選択可能マーカー遺伝子と転写単位との間にあって、選択可能マーカー遺伝子と第１転写単位の両方の転写を、第１エンハンサーの非存在下における選択可能マーカー遺伝子と第１転写単位の両方の転写と比較して刺激する、エンハンサーエレメントを含有する。
【００３８】
ベクターは、第１エンハンサーと選択可能マーカー遺伝子との間に置かれたプロモーターから構成されるブロッキングエレメントも含有し、これは、選択可能マーカー遺伝子の転写の刺激を選択的に弱めるのに潜在的に役立つ。ＶH配列およびＶL配列は、ヒト軽鎖定常領域、重鎖定常領域、および増幅可能なｄｈｆｒ遺伝子の配列（それぞれが別々のプロモーターによって制御されるもの）を含有する増幅可能ベクターであるｐｄＨＬ２に、連結することができる。Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ２：１８４，（１９９６）およびＬｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ８０：２６６０−２６６７，（１９９７）を参照されたい。このベクターは、例えばエレクトロポレーションによって、細胞にトランスフェクトすることができる。選択は、０．１μＭまたは適切な濃度のメトトレキサート（ＭＴＸ）を培養培地に添加することによって行うことができる。増幅は、ＭＴＸの濃度を３μＭまたはそれ以上まで増加させることで、段階的に行うことができる。したがって、発現カセットを安定にトランスフェクトされると共に、関心対象の抗体を構成的に発現させる細胞を、当分野では周知である方法を使って取得し、特徴づけることができる。下記実施例４も参照されたい。選択およびクローニングの後、次に、抗体発現細胞株には、Ｂｃｌ−２などの抗アポトーシス遺伝子をコードする発現ベクターを、トランスフェクトすることができる。例えば、ＳＶ４０プロモーターに融合されたＢｃｌ−２遺伝子を含有するベクターｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールズバッド）を、エレクトロポレーションなどの適切な方法を使って、細胞にトランスフェクトし、必要に応じて、選択および遺伝子増幅を行うことができる。
【００３９】
あるいは、適切な宿主細胞に、突然変異型Ｂｃｌ−２遺伝子などのアポトーシス阻害剤をトランスフェクトし、次に無血清培地での成長に適応させてから、所望する関心対象のタンパク質をコードする発現ベクターを、好ましくは無血清培地中で、さらにトランスフェクトすることもできる。その結果生じた細胞株を用いる抗体生産を上述のように行い、アポトーシス阻害剤を発現させない細胞における生産と比較することができる。
【００４０】
本発明を例証するために代表的な例を以下に示す。実施例１では、ＨＰＶ−１６ Ｅ６／Ｅ７をＳｐ２／０細胞に組み入れることにより、アポトーシスが減少／遅延するという特徴を示す改良型細胞クローンＳｐ−Ｅ２６がもたされることを説明する。実施例２では、ＨＰＶ−１６ Ｅ７エレメントのみの過剰発現によって宿主細胞株を改良するための方法を説明する。実施例３では、組換えＡｂを産生するトランスフェクタントを開発するための宿主としてＳｐ−Ｅ２６を使用することを説明する。実施例４では、Ｅ６／Ｅ７エレメントを同時発現させる抗体産生細胞株で観察される、強化されたＭａｂ生産を説明する。実施例５では、寿命の改良をもたらす三つの点突然変異を有する突然変異型Ｂｃｌ−２（Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ）を構成的に発現させる改変Ｓｐ２／０細胞株（Ｓｐ−ＥＥＥと呼ぶ）の生成および特徴付けを説明する。実施例６では、Ｂｃｌ−２を発現させる抗体産生細胞株の改良された成長特性を説明する。実施例７では、実施例６のＢｃｌ−２発現細胞株に観察される、強化されたＭＡｂ生産を説明する。実施例８では、低レベルの組換えタンパク質を産生する細胞クローンを、その細胞にＢｃｌ−２発現を導入することによって改良する方法を説明する。実施例９では、Ｓｐ−Ｅ２６を、その細胞にＢｃｌ−２発現を導入することによって改良するための方法を説明する。実施例１０では、組換えＡｂを産生するトランスフェクタントを開発するための宿主としてのＳｐ−ＥＥＥの使用を説明する。実施例１１では、収量を最適化するための半回分式リアクタープロファイルおよび供給スケジュールの使用を説明する。実施例１２では、無血清培地における成長およびトランスフェクションが可能なＳｐ−ＥＥＥのサブクローンの生成を説明する。
【００４１】
本明細書では、当分野で知られるアポトーシス阻害剤をコードする一つ以上の遺伝子をトランスフェクトした細胞株を使って、好ましい実施形態を例示するが、代替実施形態として、コードされるタンパク質がネイティブタンパク質と同じ生理学的機能（抗アポトーシス）を示す限り、そのような遺伝子のコード配列および／または非コード配列に、本願に係る方法および組成物の範囲内で、さまざまな置換、欠失または挿入を加え得ることは、当業者には理解されるだろう。一定の実施形態では、コードされるタンパク質が天然（野生型）タンパク質と８０％以上の配列一致度、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、最も好ましくは９９．５％以上の配列一致度を示し得る。
【００４２】
抗体
さまざまな実施形態が、関心対象のトランスフェクト細胞株から発現される抗体および／または抗体フラグメントに関し得る。「抗体」という用語は、本明細書では、抗原結合領域を持つ任意の抗体様分子を指すために使用され、これには、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）などの抗体フラグメントが包含される。抗体に基づく種々の構築物およびフラグメントを製造し使用するための技法は、当分野では周知である。抗体を製造し特徴づけるための手段も、当分野では周知である（例えばＨａｒｌｏｗｅおよびＬａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照）。有用な抗体には、数多くのさまざまな公知供給源から市販されているものもある。例えば、さまざまな抗体分泌ハイブリドーマ株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）から入手することができる。例えば腫瘍関連抗原など（ただしこれに限らない）のさまざまな疾患ターゲットに対する数多くの抗体がＡＴＣＣに寄託されており、本願に係る方法および組成物で使用するために入手することができる（例えば以下の米国特許番号を参照されたい：７，０６０，８０２；７，０５６，５０９；７，０４９，０６０；７，０４５，１３２；７，０４１，８０３；７，０４１，８０２；７，０４１，２９３；７，０３８，０１８；７，０３７，４９８；７，０１２，１３３；７，００１，５９８；６，９９８，４６８；６，９９４，９７６；６，９９４，８５２；６，９８９，２４１；６，９７４，８６３；６，９６５，０１８；６，９６４，８５４；６，９６２，９８１；６，９６２，８１３；６，９５６，１０７；６，９５１，９２４；６，９４９，２４４；６，９４６，１２９；６，９４３，０２０；６，９３９，５４７；６，９２１，６４５；６，９２１，６４５；６，９２１，５３３；６，９１９，４３３；６，９１９，０７８；６，９１６，４７５；６，９０５，６８１；６，８９９，８７９；６，８９３，６２５；６，８８７，４６８；６，８８７，４６６；６，８８４，５９４；６，８８１，４０５；６，８７８，８１２；６，８７５，５８０；６，８７２，５６８；６，８６７，００６；６，８６４，０６２；６，８６１，５１１；６，８６１，２２７；６，８６１，２２６；６，８３８，２８２；６，８３５，５４９；６，８３５，３７０；６，８２４，７８０；６，８２４，７７８；６，８１２，２０６；６，７９３，９２４；８，７８３，７５８；６，７７０，４５０；６，７６７，７１１；６，７６４，６８１；６，７６４，６７９；６，７４３，８９８；６，７３３，９８１；６，７３０，３０７；６，７２０，１５；６，７１６，９６６；６，７０９，６５３；６，６９３，１７６；６，６９２，９０８；６，６８９，６０７；６，６８９，３６２；６，６８９，３５５；６，６８２，７３７；６，６８２，７３６；６，６８２，７３４；６，６７３，３４４；６，６５２，８５２；６，６３５，４８２；６，６３０，１４４；６，６１０，８３３；６，６１０，２９４；６，６０５，４４１；６，６０５，２７９；６，５９６，８５２；６，５９２，８６８；６，５７６，７４５；６，５７２；８５６；６，５６６，０７６；６，５６２，６１８；６，５４５，１３０；６，５４４，７４９；６，５３４，０５８；６，５２８，６２５；６，５２８，２６９；６，５２１，２２７；６，５１８，４０４；６，５１１，６６５；６，４９１，９１５；６，４８８，９３０；６，４８２，５９８；６，４８２，４０８；６，４７９，２４７；６，４６８，５３１；６，４６８，５２９；６，４６５，１７３；６，４６１，８２３；６，４５８，３５６；６，４５５，０４４；６，４５５，０４０；６，４５１，３１０；６，４４４，２０６；６，４４１，１４３；６，４３２，４０４；６，４３２，４０２；６，４１９，９２８；６，４１３，７２６；６，４０６，６９４；６，４０３，７７０；６，４０３，０９１；６，３９５，２７４；６，３８３，７５９；６，３８３，４８４；６，３７６，６５４；６，３７２，２１５；６，３５９，１２６；６，３５５，４８１；６，３５５，４４４；６，３５５，２４５；６，３５５，２４４；６，３４６，２４６；６，３４４，１９８；６，３４０，５７１；６，３４０，４５９（これらの米国特許はそれぞれ、抗体分泌ハイブリドーマ細胞株のＡＴＣＣ受託番号および当該抗体もしくはそのフラグメントの関連ターゲット抗原に関して、参照により本明細書に組み入れられる））。これらは典型例に過ぎず、当分野では他にも多種多様な抗体分泌ハイブリドーマが知られている。選択した関心対象の疾患関連ターゲットに対する抗体についてＡＴＣＣ、ＰｕｂＭｅｄおよび／またはＵＳＰＴＯデータベースを簡単に検索するだけで、ほとんどどの疾患関連抗原に対する抗体分泌ハイブリドーマでも入手し得ることは、当業者には理解されるだろう。当分野で周知の標準的技法を使って、クローン化抗体の抗原結合ドメインを増幅し、切り出し、発現ベクターに連結し、適応宿主細胞中に形質転換し、タンパク質生産に使用することができる。
【００４３】
抗体フラグメントの生産
本願に係る方法および／または組成物のいくつかの実施形態は、抗体フラグメントに関し得る。抗体フラグメントを生産するための典型的な方法は、米国特許第４，０３６，９４５号；米国特許第４，３３１，６４７号；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ，１９６０，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８９：２３０；Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：１１９；Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６７，ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ｐａｇｅ ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、およびＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９１，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）に開示されている。
【００４４】
抗体フラグメントを形成させる他の方法、例えば、一価軽鎖−重鎖フラグメントを形成させるための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝子技法も、そのフラグメントが完全な抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用することができる。例えばＦｖフラグメントはＶH鎖とＶL鎖の会合体を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２６５９に記述されているように、非共有結合的であることができる。あるいは、可変鎖を分子間ジスルフィド結合によって連結するか、グルタルアルデヒドなどの化学薬品によって架橋してもよい。Ｓａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照されたい。
【００４５】
好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによってつながれたＶH鎖およびＶL鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドリンカー配列でつながれたＶHおよびＶLドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって製造される。構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、次にその発現ベクターを宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は、上記二つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを持つ一本のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生産するための方法は当分野では周知である。Ｗｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：９７；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３；米国特許第４，９４６，７７８号；Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１２７１、およびＳａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照されたい。
【００４６】
抗体フラグメントのもう一つの形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、関心対象の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使って抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することなどによって製造される。Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６；Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，ｐａｇｅｓ １６６−１７９（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ｐａｇｅｓ １３７−１８５（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照されたい。抗体分泌ハイブリドーマ細胞株が公開されている場合は、抗原結合特異性をコードするＣＤＲ配列を入手し、それをキメラ抗体またはヒト化抗体に組み入れて、使用することができる。
【００４７】
キメラ抗体およびヒト化抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むマウス抗体の可変領域で置き換えられている組換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象に投与された場合に、低下した免疫原性と、増加した安定性とを示す。キメラ抗体を構築するための方法は当分野では周知である（例えばＬｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １３：４６９）。
【００４８】
マウス免疫グロブリンの可変重鎖および可変軽鎖に由来するマウスＣＤＲを、ヒト抗体の対応する可変ドメイン中に移すことにより、キメラモノクローナル抗体をヒト化することができる。キメラモノクローナル抗体中のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）もヒトＦＲ配列で置き換えられる。ヒト化モノクローナルの安定性および抗原特異性を保存するために、一つ以上のヒトＦＲ残基をマウスの対応する残基で置き換えてもよい。ヒト化モノクローナル抗体は対象の治療的処置に使用することができる。ＣＤＲ配列の選ばれた修飾によって、ターゲットに対するヒト化抗体のアフィニティを増加させることもできる（ＷＯ００２９５８４Ａ１）。ヒト化モノクローナル抗体を生産するための技法は当分野では周知である（例えばＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９２，１２：４３７；Ｔｅｍｐｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６；Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９３，１５０：２８４４を参照されたい）。
【００４９】
別の実施形態は非ヒト霊長類抗体に関し得る。治療的に有用な抗体をヒヒで生じさせるための一般技法は、例えばＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９１／１１４６５（１９９１）、およびＬｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：３１０（１９９０）に見出すことができる。
【００５０】
ヒト抗体
コンビナトリアルアプローチまたはヒト免疫グロブリン遺伝子座で形質転換されたトランスジェニック動物を使って完全ヒト抗体を生産するための方法は、当分野では知られている（例えばＭａｎｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３１５−２８；ＣｏｎｒａｄおよびＳｃｈｅｌｌｅｒ，２００５，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．８：１１７−２６；ＢｒｅｋｋｅおよびＬｏｓｅｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．３：５４４−５０；それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）。そのような完全ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体よりもさらに少ない副作用を示し、インビボでは基本的に内在性ヒト抗体のように機能すると予想される。一定の実施形態において、本願に係る方法および手法は、そのような技法によって生産されるヒト抗体を利用し得る。
【００５１】
代替方法の一つでは、ファージディスプレイ技法を使って、ヒト抗体を生成させることができる（例えばＤａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．４：１２６−４０、これは参照により本明細書に組み入れられる）。ヒト抗体は、正常なヒトから、またはがんなどの特定疾患状態を示すヒトから、生成させることができる（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。罹患個体からヒト抗体を構築することの利点は、循環抗体レパートリーが疾患関連抗原に対する抗体に偏っている可能性があることである。
【００５２】
この方法論に限定されない一例として、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ ｅｔ ａｌ．（２００５）は、骨肉腫患者からヒトＦａｂ抗体フラグメントのファージディスプレイライブラリーを構築した。概説すると、循環血リンパ球から全ＲＮＡが得られた（前掲書）。組換えＦａｂがμ鎖、γ鎖およびκ鎖抗体レパートリーからクローニングされ、ファージディスプレイライブラリーに挿入された（前掲書）。重鎖および軽鎖免疫グロブリン配列に対する特異的プライマーを使って、ＲＮＡがｃＤＮＡに変換され、Ｆａｂ ｃＤＮＡライブラリーの作製に使用された（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７、これは参照により本明細書に組み入れられる）。ライブラリーの構築は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ ｅｔ ａｌ．（２０００、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）の９．１〜９．２２頁、これは参照により本明細書に組み入れられる）に従って行われた。最終Ｆａｂフラグメントを制限エンドヌクレアーゼで消化し、バクテリオファージゲノムに挿入することによって、ファージディスプレイライブラリーが作製された。そのようなライブラリーは、当分野で知られる標準的なファージディスプレイ法によってスクリーニングすることができる。この技法は典型例に過ぎず、ファージディスプレイによってヒト抗体または抗体フラグメントを作製しスクリーニングするための既知の方法をどれでも利用し得ることは、当業者には理解されるだろう。
【００５３】
もう一つの代替方法として、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたトランスジェニック動物を使用することにより、基本的に任意の免疫原ターゲットに対する抗体を、標準的な免疫化プロトコールを使って生成させることができる。そのようなシステムの限定でない一例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（カリフォルニア州フリーモント）のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１−２３、これは参照により本明細書に組み入れられる）である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）および類似の動物では、マウス抗体遺伝子が不活化されて、機能的なヒト抗体遺伝子で置き換えられているが、マウス免疫系の残りの部分は完全なまま保たれている。
【００５４】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、可変領域配列の大部分を補助遺伝子および調節配列に沿って含んでいるヒトＩｇＨ遺伝子座およびＩｇκ遺伝子座の一部を含有する生殖細胞系列構成のＹＡＣ（酵母人工染色体）で、形質転換された。そのヒト可変領域レパートリーを使って抗体産生Ｂ細胞を生成させることができ、それを既知の技術によってハイブリドーマに加工することができる。ターゲット抗原で免疫されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、通常の免疫応答によってヒト抗体を産生し、それは、上述の標準的技法によって収集および／または生産することができる。さまざまなＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株を利用することができ、それらはそれぞれが、異なる抗体クラスを産生する能力を持つ。そのようなヒト抗体は、化学的架橋または他の既知の方法論によって、他の分子にカップリングすることができる。トランスジェニックに生産されたヒト抗体は、通常のヒト抗体の薬物動態特性を保ちつつ、治療薬としての可能性を持つことが示されている（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。本願に係る組成物および方法がＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）システムの使用に限定されることはなく、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作されている任意のトランスジェニック動物を利用し得ることは、当業者には理解されるだろう。
【実施例１】
【００５５】
ＨＰＶ−１６ Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子の安定発現によるアポトーシス耐性細胞クローンの生成
ＣＨＸ処理に耐性な細胞クローンの選択
ＨＰＶ−１６ Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子の発現カセットを含有するＬＸＳＮレトロウイルスベクターを、１０：１のＭＯＩ（多重感染度）で、Ｓｐ２／０細胞に形質導入した。２４時間の回復後に、感染細胞をＧ４１８（１０００μｇ／ｍｌ）中で１０日間選択した。Ｇ４１８耐性細胞を限界希釈法（０．５細胞／ウェル）により９６ウェル細胞培養プレートでクローニングした。安定な感染物を、強力なアポトーシス誘導剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）による処理に対する耐性についてスクリーニングした。簡単に述べると、健常細胞（生存率＞９５％、図１ＣおよびＤ）を、２５μｇ／ｍｌのＣＨＸを含有する培地中でインキュベートし、細胞形態を顕微鏡で調べた。２〜３時間のインキュベーション後に５０％を超える親Ｓｐ２／０細胞が形態変化を起こし、断片化したが（図１Ａ）、いくつかのＥ６／Ｅ７トランスフェクトクローンは形態変化の程度が小さく、アポトーシスに対する耐性を示した。Ｓｐ−Ｅ２６と呼ぶ最良のクローンは、４時間処理しても、明白な形態変化を示さなかった（図１Ｂ）。
【００５６】
冗長な目視検査を避けるために、ＭＴＴアッセイを使って、生存細胞集団における変化にアクセスした。健常細胞を通常の培養条件下にＣＨＸありまたはＣＨＸなしで２〜３時間インキュベートした後、ＭＴＴ色素をウェルに加えた。さらに２時間インキュベートした後、ＳＤＳおよびＨＣｌを含有する溶解バッファーを加えることによって、細胞を可溶化した。プレートを３７℃で終夜インキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使って、ＯＤの読み取りを５９０ｎｍで行った。図２に示すように、Ｓｐ２／０細胞をＣＸＨで処理した場合、生存細胞集団は有意に減少した。これに対し、同じ処理条件（ＣＨＸの濃度および時間）下で、Ｓｐ−Ｅ２６細胞は、ＣＨＸ処理に対して、より良く耐えた。この方法により、多数のクローンをスクリーニングし、さらなる分析のために選択することができる（図２）。
【００５７】
Ｓｐ−Ｅ２６の抗アポトーシス特性
Ｓｐ−Ｅ２６細胞および親Ｓｐ２／０細胞におけるＣＨＸ誘導アポトーシスを、アネキシンＶ染色およびＤＮＡ断片化アッセイによって評価した。２５μｇ／ｍｌのＣＨＸを含有する培地中でインキュベートした後、細胞を収集し、Ｇｕａｖａネキシン試薬で染色し（アネキシンＶ染色と等価）、Ｇｕａｖａ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓシステム（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。図３は、ＣＨＸ処理に約１．５時間ばく露した場合、３０％を上回るＳｐ２／０細胞がアネキシンＶ陽性になってアポトーシスを示すのに対して、Ｓｐ−Ｅ２６は健常なままで、初期アポトーシス細胞の増加を示さなかったことを表している。
【００５８】
ＣＨＸによるアポトーシスの誘導は、アポトーシスの特徴である細胞内オリゴヌクレオソームＤＮＡフラグメントの形成を分析することによって明らかにすることができる。ＣＨＸ処理したおよび無処理のＳｐ−Ｅ２６細胞およびＳｐ２／０細胞から細胞ＤＮＡを抽出し、ＤＮＡラダーリングアッセイを行った。ＣＨＸで処理したＳｐ２／０細胞では、大規模なＤＮＡ断片化が検出された（図４）。これに対し、同一の処理条件で、Ｓｐ−Ｅ２６のゲノムＤＮＡは完全なままであり、ＤＮＡ断片化の外観を示さなかった（図４）。
【００５９】
Ｓｐ−Ｅ２６細胞におけるＨＰＶ Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子の存在
Ｓｐ−Ｅ２６細胞のゲノム中にＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子が安定に存在することを確認するために、Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、Ｓｐ−Ｅ２６から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとするＰＣＲ反応に使用したところ、約７００ｂｐのＤＮＡフラグメントが生じた。そのＰＣＲ産物をクローニングし、ＤＮＡ配列決定により、Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子であることを確認した。Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子は、親Ｓｐ２／０細胞には検出されなかった。
【００６０】
Ｓｐ−Ｅ２６の改良された成長特性
Ｓｐ−Ｅ２６の成長特性をＴフラスコ（図５）および３Ｌ回分式バイオリアクター（図６）で評価した。Ｓｐ−Ｅ２６は、回分培養において親Ｓｐ２／０に比べて改良された成長特性を示し、より高い最大細胞密度と、より長い生存期間を達成した。
【実施例２】
【００６１】
ＨＰＶ１６ Ｅ７遺伝子の安定過剰発現によるアポトーシス耐性細胞クローンの生成
クローンＳｐ−Ｅ２６のゲノムに組み込まれたポリシストロン性のＨＰＶ１６ Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子の構造を、プライマーペアＥ６−Ｎ８+（ＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＡＣＣＣＡＣＡＧＧＡＧＣＧＡ；配列番号８）およびＥ７−Ｃ８-（ＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡ ＡＣＡＧＡＴＧＧＧ；配列番号９）を用いるＰＣＲならびにＤＮＡ配列決定によって分析した。プライマーＥ６−Ｎ８+およびＥ７−Ｃ８-の配列は、それぞれＥ６のＮ末端の８アミノ酸残のコード配列およびＥ７のＣ末端の８コドンの相補配列と合致するので、完全長Ｅ６およびＥ７のアンプリコンは、約８５０ｂｐであると予想される。しかし、Ｅ６−Ｎ８+およびＥ７−Ｃ８-を使ってＳｐ−Ｅ２６細胞から調製されたゲノムＤＮＡを増幅したところ、約７００ｂｐしかないＰＣＲフラグメントが得られた。この７００ｂｐ ＰＣＲ産物をＤＮＡ配列決定したところ、１８２ポリヌクレオチドフラグメントがＥ６遺伝子から欠失していることが明らかになった。この欠損Ｅ６遺伝子は、おそらくスプライシングによって生じたものと思われ、Ｎ末端の４３アミノ酸残基を持つ切断型Ｅ６ペプチドをコードする。Ｅ６に起因すると考えられる主な生理学的活性が、ｐ５３発現をダウンレギュートするその能力であることを考慮すると、この切断型Ｅ６タンパク質はおそらく完全には機能しないだろう。なぜなら、Ｓｐ−Ｅ２６におけるｐ５３の発現レベルは、Ｓｐ２／０における発現レベルよりも安定していることがわかったからである。
【００６２】
そこで、抗アポトーシス作用を持ち、Ｓｐ２／０細胞の成長特性を改良するには、ＨＰＶ−１６ Ｅ７遺伝子だけで十分であるかどうかを調べるために、ＨＰＶ−１６ Ｅ７によるＳｐ２／０細胞のトランスフェクションを、以下のように行う：
（ｉ）Ｅ７をコードするＤＮＡ配列をＳｐ−Ｅ２６細胞からＲＴ−ＰＣＲによってクローニングする。哺乳類発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への遺伝子の連結が容易になるように、適切な制限部位を導入する。Ｅ７ｐＲｃと名付けたベクター内のウイルス遺伝子の転写は、ＣＭＶプロモーター−エンハンサー配列から指示される。このベクターはネオマイシン耐性を付与する遺伝子も含有し、その遺伝子はＳＶ４０プロモーターから転写される。
（ｉｉ）ＨＰＶ−１６ Ｅ７遺伝子の発現カセットを含有する発現ベクターをＳｐ２／０細胞にトランスフェクトする。簡単に述べると、５μｇのＥ７ｐＲｃをＳｃａＩで線状化し、エレクトロポレーションによって細胞にトランスフェクトする。
（ｉｉｉ）２４時間の回復後に、トランスフェクト細胞をＧ４１８（１０００μｇ／ｍｌ）中で１０日間選択する。
（ｉｖ）次にＧ４１８耐性細胞を、限界希釈法（０．５細胞／ウェル）により、９６ウェル細胞培養プレートでクローニングする。安定なトランスフェクタントを選択し、強力なアポトーシス誘導剤であるシクロヘキシミド（ＣＨＸ）による処理に対する耐性についてスクリーニングする。
（ｖ）健常細胞（生存率＞９５％）を、２５μｇ／ｍｌのＣＨＸを含有する培地中、またはＣＨＸの非存在下に、通常の培養条件で３〜４時間インキュベートした後、ウェルにＭＴＴ色素を添加する。さらに２時間インキュベートしてから、ＳＤＳおよびＨＣｌを含有する溶解バッファーを加えることにより、細胞を可溶化する。プレートを３７℃で終夜インキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使ってＯＤの読み取りを５９０ｎｍで行う。ＣＨＸ処理に対して耐性を示す細胞クローンを選択し、さらなる分析のために拡大する。
（ｖｉ）Ｅ７−トランスフェクト細胞の抗アポトーシス特性を、アネキシンＶ染色およびＤＮＡ断片化アッセイによって評価する。アネキシンＶアッセイでは、２５μｇ／ｍｌのＣＨＸを含有する培地中でインキュベートしてから、細胞を収集し、Ｇｕａｖａネキシン試薬で染色し（アネキシンＶ染色と等価）、Ｇｕａｖａ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓシステム（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で分析する。ＤＮＡ断片化アッセイでは、ＣＨＸ処理したおよび無処理のＥ７−トランスフェクタントおよびＳｐ２／０細胞から細胞ＤＮＡを抽出し、それをアガロースゲル電気泳動で分析する。
（ｖｉｉ）Ｅ７−トランスフェクタントにおけるウイルスがん遺伝子の発現を、サザンブロット（ゲノムレベル）分析、ノーザンブロット（ｍＲＮＡレベル）分析、およびイムノブロット（タンパク質レベル）分析によって評価する。アポトーシス過程に関与しＥ７タンパク質による影響を受ける細胞内タンパク質の発現を、イムノブロッティング分析によって調べる。
（ｖｉｉｉ）選択したＥ７−トランスフェクタントの成長特性を、Ｔフラスコおよび３Ｌ回分式バイオリアクターで評価する。トランスフェクタントは、回分培養した親Ｓｐ２／０と比較して、改良された成長特性を示す。すなわち、より高い最大細胞密度と、より長い生存期間とを達成する。
【実施例３】
【００６３】
Ｓｐ−Ｅ２６におけるｈＬＬ２ ＩｇＧの高レベル発現
この実施例では、ＮＨＬおよび自己免疫疾患を持つ患者を処置するために開発されたヒト化抗ＣＤ２２ ＡｂであるｈＬＬ２を産生する細胞クローンを生成させるために、Ｓｐ−Ｅ２６を宿主として使用する。ｈＬＬ２産生クローン８７−２−Ｃ９は、Ｓｐ２／０細胞を宿主として使用することによって、以前に生成されており（Ｌｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ８０，２６６０−２６６６，１９９７）、その例では、トランスフェクション後に陽性クローンが一つだけ同定され（約２．５×１０-7の頻度）、増幅前のその唯一のｈＬＬ２産生クローンの最大生産性（Ｐmax）（Ｔフラスコにおける調整終末培養培地中の抗体濃度と定義される）は、１．４ｍｇ／Ｌだった。Ｌｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．が記述した手法（Ｃａｎｃｅｒ ８０，２６６０−２６６６，１９９７）と同様の手法を使って、同じｈＬＬ２ｐｄＨＬ２ベクターをＳｐ−Ｅ２６細胞にトランスフェクトしたところ、２００を超える安定なｈＬＬ２産生クローンが得られた（頻度＞１０-4）。ランダムに選択した１２個のクローンのＰmaxを評価したところ、１３〜１７０ｍｇ／Ｌ（平均５０ｍｇ／Ｌ）の範囲にあることが分かった。これらのクローンの生産性は、ＭＴＸを使った遺伝子増幅によって、さらに強化することができる。この実施例により、組換えタンパク質を産生する細胞クローンを開発するための宿主としてＳｐ−Ｅ２６を使用することの（その親Ｓｐ２／０細胞と比較した場合の）利点が実証された。
【実施例４】
【００６４】
ＨＰＶ１６ Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子の安定発現によるＡｂ産生細胞株の改良
６０７−３ｕ−８細胞は、もともと、ヒト化モノクローナルＡｂを生産するために、トランスフェクションによって、Ｓｐ２／０から生成された細胞である。このクローンは、遺伝子増幅（ＭＴＸを使用）およびサブクローニングによって開発されものであり、最大（Ａｂ）生産性は１５０ｍｇ／Ｌまで強化されたが、培養培地への血清添加を断つと約１００ｍｇ／Ｌに低下した。無血清条件下でより高い抗体生産性を得るために、ＨＰＶ−１６のＥ６／Ｅ７遺伝子を６０７−３ｕ−８細胞に導入し、Ａｂ生産性に対するＥ６／Ｅ７の作用を以下のように評価した。
【００６５】
１０％ＦＢＳおよび３μＭ ＭＴＸを添加したＨＳＦＭで維持した６０７−３ｕ−８細胞に、ＨＰＶ−１６ Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子の発現カセットを含有するＬＸＳＮレトロウイルスベクターを、１０：１のＭＯＩで形質導入した。２４時間回復させた後、安定にトランスフェクトされた細胞をＧ４１８（４００μｇ／ｍｌ）中で１０日間選択した。Ｇ４１８耐性細胞を、限界希釈法（０．５細胞／ウェル）により、９６ウェル細胞培養プレートでサブクローニングした。生き残ったクローン（６０７Ｅ１Ｃ１２と命名）を評価のために得た。Ｅ６／Ｅ７トランスフェクションを伴わない６０７−３ｕ−８−７Ｇ７および６０７−３ｕ−８−２Ｄ１０と名付けた６０７−３ｕ−８の二つのサブクローンも選択した。これら三つのクローンのＰmaxを決定したところ、有意差はなかった（表１）。
【００６６】
これらの結果は、この細胞にＥ６／Ｅ７遺伝子を導入しても、Ａｂを産生する細胞の能力は変化しないことを示唆している。次に、６０７Ｅ１Ｃ１２、６０７−３ｕ−８−７Ｇ７および６０７−３ｕ−８−２Ｄ１０を無血清培地中で成長するように適応させ、これらのクローンの生産性を決定した。全ての細胞が無血清培地でよく成長していた。クローン６０７Ｅ１Ｃ１２の最終抗体生産性は１５０ｍｇ／Ｌに維持されたが、Ｅ６／Ｅ７を持たない二つのクローンはかなり減少した。また、６０７Ｅ１Ｃ１２の生産性は、凍結（冷凍保存のため）と融解サイクルの後も、安定だった（表１）。
【００６７】
【表１】
【実施例５】
【００６８】
突然変異型Ｂｃｌ−２を構成的に発現させる遺伝子改変Ｓｐ２／０細胞株の生成および特徴付け
三つの点突然変異（Ｔ６９Ｅ、Ｓ７０ＥおよびＳ８７Ｅ）を有する突然変異型Ｂｃｌ−２は、野生型および単一点突然変異体と比較して、有意に高い抗アポトーシス活性を示すことを、証拠が示唆している（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０１：１５３−１５８，２００４）。そこで、この三重突然変異体（Ｂｃｌ−２−ＥＥＥと呼ぶ）の発現ベクターを構築し、それを使って、（特にバイオリアクターにおける）生存および生産性を増加させるために、Ｓｐ２／０細胞のトランスフェクションを行った。クローンを単離し、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ発現レベル、成長およびアポトーシス特性について評価した。Ｂｃｌ−２−ＥＥＥの核酸配列を配列番号３に示し、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥタンパク質の対応するアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００６９】
ヒトＢｃｌ−２のアミノ酸残基６４〜１０１のコード配列に基づいて、１１６ｂｐの合成ＤＮＡ二重鎖を設計した。残基６９、７０および８７のコドンを全て、グルタミン酸（Ｅ）のコドンに変えた。この配列全体は並外れてＧＣリッチであり、数多くのポリＧ区間およびポリＣ区間を持っていた。いくつかのコドンに保存的置換を施して、ＧおよびＣの連続を中断させ、全体のＧＣ含量を減少させた。
【００７０】
合わせると上記１１６ｂｐ配列をまたぎ、３’末端の２２ｂｐ分が重複している、二つの８０マーオリゴヌクレオチドを合成した（配列番号５および配列番号６を参照されたい）。これらのオリゴヌクレオチドをアニールさせ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いるプライマー伸長によって二重鎖ＤＮＡを生成させた。その二重鎖を、ＰＣＲプライマーＢｃｌ−２−ＥＥＥ ＰＣＲ Ｌｅｆｔ（ＴＡＴＡＴＧＧＡＣＣＣＧＧＴＣＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧ；配列番号１０）およびＢｃｌ−２−ＥＥＥ ＰＣＲ Ｒｉｇｈｔ（ＴＴＡＡＴＣＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣ；配列番号１１）を使って、増幅した。
【００７１】
次に、その１２６ｂｐアンプリマーをｐＧｅｍＴ ＰＣＲクローニングベクターにクローニングした。Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ−ｐＧｅｍＴをＴｔｈＩ制限エンドヌクレアーゼおよびＮｇｏＭＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、１０５ｂｐフラグメントをゲル単離し、ＴｔｈＩおよびＭｇｏＭＩで消化したｈＢｃｌ−２−ｐｕｃ１９ベクター（ＡＴＣＣ ７９８０４）と連結することにより、ｈＢｃｌ−２（ＥＥＥ）−ｐｕｃ１９を生成させた。この構築物の配列を確認した。
【００７２】
９４８ｂｐのインサートフラグメントをｈＢｃｌ−２（ＥＥＥ）−ｐｕｃ１９からＥｃｏＲＩで切り出し、ＥｃｏＲＩで消化しアルカリホスファターゼで処理したｐＺｅｏＳＶ２＋ベクターと連結した。その結果得られた構築物がｈＢｃｌ−２（ＥＥＥ）−ｐＺｅｏＳＶ２＋である。
【００７３】
次に、Ｓｐ２／０細胞（５．６×１０6）に６０μｇのｈＢｃｌ−２（ＥＥＥ）−ｐＺｅｏＳＶ２＋を、エレクトロポレーションにより、Ｓｐ２／０細胞用の標準的プロトコールに従ってトランスフェクトした。細胞を６枚の９６ウェルプレートにプレーティングし、それを選択なしで４８時間インキュベートした。２日後に、８００μｇ／ｍｌのゼオシンを培地に加えた。
【００７４】
４０ウェルからの細胞を２４ウェルプレートに拡大し、ウェスタンブロットにより、抗ｈＢｃｌ−２および抗βアクチンを使って分析した。４０ウェルのうち５ウェルを除く全てが、中〜高レベルのＢｃｌ−２−ＥＥＥ発現を示した。４枚のゲルのうち１枚について、結果を図７に示す。野生型Ｂｃｌ−２が前もってトランスフェクトされているＳｐ２／０由来のｈＭＮ１４細胞株（クローン６６４．Ｂ４）を、陽性対照（＋）として使用した。Ｄｅｎｇらによって実証されたように、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥはＳＤＳ−ＰＡＧＥで野生型Ｂｃｌ−２よりもわずかに遅く移動する。
【００７５】
三つの強く陽性なウェル（＃７、＃２５および＃８７）をさらなる評価とサブクローニングのために選択した。限界希釈プレーティングにより、１枚の９６ウェルプレートにつき２０未満の陽性ウェルを得たことから、個々のウェル中の細胞が実際にクローニングされている可能性は極めて高い（＞９９％）ことが示された。まず、もとの３ウェルから得た２３のサブクローンを、抗ｈＢｃｌ−２−ＰＥを使って、Ｇｕａｖａ Ｅｘｐｒｅｓｓで分析した（図８）。その結果、元のウェルは混合された細胞クローンを含有していることが確認された。ウェル＃７は最も強いシグナルを持つクローンをもたらし、ウェル＃２５は最も低いシグナルを持つクローンを含んでいた。クローン７−１２、７−１６、８７−２および８７−１０をさらなる分析のために拡大した。次に、初期の成長速度が遅いいくつかのサブクローンを同様に分析したところ、一つのクローン８７−２９が、他のどのクローンよりも２０％高いシグナルを与えたので、それを、さらなる分析のために拡大した。
【００７６】
二つの高発現ＳＰ−ＥＥＥクローン（８７−２９および７−１６）を非トランスフェクトＳｐ２／０、ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ細胞と比較した（図９）。Ｓｐ−ＥＥＥクローンは、Ｒａｊｉ細胞およびＤａｕｊｉ細胞（これらはどちらもおそらく正常細胞レベルのＢｃｌ−２を発現させることが知られている）より約２０倍高く発現させる。Ｓｐ２／０細胞は陰性だった。このことは、抗Ｂｃｌ−２イムノブロットによって、さらに実証された（図１０）。Ｂｃｌ−２は、ヒトＢｃｌ−２特異的抗体では、タンパク質負荷量を多くし（５０Ｋ細胞）、Ｘ線フィルムを長く露光しても、Ｓｐ２／０細胞中に検出されなかった。マウス、ラットおよびヒトＢｃｌ−２を認識する抗Ｂｃｌ−２ ＭＡｂ（Ｃ−２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によるイムノブロット分析では、タンパク質負荷量を多くし（１００Ｋ細胞）、Ｘ線フィルムを長く露光しても、非トランスフェクトＳｐ２／０細胞からＢｃｌ−２は検出されなかった（図１０Ｂ）。Ｓｐ２／０細胞中で発現されるＢｃｌ−２があるとすれば、それは、クローン８７−２９におけるＢｃｌ−２−ＥＥＥよりも２桁以上の低いレベルである。
【００７７】
五つのＳｐ−ＥＥＥサブクローンおよびＳｐ２／０細胞について成長曲線を比較した。三つのＳｐ−ＥＥＥサブクローンは、Ｓｐ２／０細胞に対して明確な優位性を示した。これらの三つ（７−１２、７−１６および８７−２９）は、最も高レベルのＢｃｌ−２−ＥＥＥも発現させる。７−１２および７−１６は、同じもとのウェルに由来し、ほぼ同一の性質（Ｂｃｌ−２−ＥＥＥレベルおよび成長曲線）を持つので、これらはおそらく同じ発端クローンから派生したのだろう。最もよい二つのＳＰ−ＥＥＥサブクローン７−１６および８７−２９をさらなる評価に使用した。
【００７８】
１０％、１％または０％血清を添加した培地にクローンをプレーティングし（前適応ステップなし）、細胞密度および生存率を監視した。１０％血清では、８７−２９は高密度まで成長し、Ｓｐ２／０細胞と比較して生存は４日以上増加した（図１１）。１％血清では、全ての細胞が１０％血清で達成された密度の約３５〜４０％まで成長し、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥトランスフェクタントはＳｐ２／０に対して生存面で類似の優位性を持っていた（図１２）。無血清培地に直接移すと、Ｓｐ２／０細胞は６００Ｋ細胞／ｍｌまでしか成長しなかったが、８７−２９細胞は２倍高い密度まで成長した（図１３）。各血清濃度において、８７−２９細胞はＳｐ２／０細胞より４〜６日間長く生存した。
【００７９】
メトトレキサート（ＭＴＸ）感受性を８７−２９について決定した（図１４）。このデータは、ＭＴＸ耐性クローンの初期選択には、０．０４μＭという最小ＭＴＸ濃度で十分であることを示唆している。したがって、Ｓｐ２／０細胞に用いられるものと同じ選択および増幅プロトコールを、Ｓｐ−ＥＥＥ細胞にも使用することができる。
【００８０】
Ｂｃｌ−２は生存促進／抗アポトーシスタンパク質である。フレキシブルループドメイン（ＦＬＤ）を欠くＢｃｌ−２欠失突然変異体が強化されたアポトーシス阻害能力を持つことは、数グループによって実証されている（Ｆｉｇｕｅｒｏａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７３，２１１−２２２；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ Ｊ．，１６，９６８−９７７）。さらに最近になって、Ｂｃｌ−２のＦＬＤ中の１〜３個のＳ／Ｔ残基がグルタミン酸に突然変異すると（これはリン酸化を模倣している）、その抗アポトーシス能力は著しく強化されることが、実証された（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，ＰＮＡＳ，１０１，１５３−１５８）。三重突然変異体（Ｔ６９Ｅ、Ｓ７０ＥおよびＳ８７Ｅ）は、最も著しい生存強化をもたらした。ここでは、類似のＢｃｌ−２三重突然変異体構築物（Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ）を使って、Ｓｐ２／０細胞を安定にトランスフェクトした。
【００８１】
上述の実験は全て、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥの発現がＳｐ２／０細胞におけるアポトーシス速度を低下させることを実証している。発現レベルが高いクローンは低レベルのクローンより長く生きたので、この作用はおおむね用量依存的だった。最も良いクローン８７−２９は、非トランスフェクトＳｐ２／０細胞と比較して、１５〜２０％高い細胞密度まで成長し、４〜６日間長く生存する。
【００８２】
クローン（８７−２９）中のＢｃｌ−２−ＥＥＥレベルは、Ｄａｕｄｉ細胞またはＲａｊｉ細胞における正常レベルより、約２０倍高い。非トランスフェクトＳｐ２／０細胞ではＢｃｌ−２発現は検出されなかった。実施例６で述べるように、ｈＭＮ−１４発現Ｓｐ２／０細胞に、野生型Ｂｃｌ−２を発現させるための類似の構築物をトランスフェクトし、並外れた成長特性と強化された生産性とを持つクローンを単離した。このクローン（６６４．Ｂ４）をＭＴＸでさらに増幅させたところ、Ｂｃｌ−２レベルは著しく増加した。最後に、増幅された（３μＭ ＭＴＸ）細胞株をサブクローニングしたところ、あるクローン（６６４．Ｂ４．１Ｃ１）のＢｃｌ−２レベルは、６６４．Ｂ４より２倍高かった。この特定サブクローンは、優れた生産性および成長特性を持つ。８７−２９におけるＢｃｌ−２−ＥＥＥレベルは、増幅された６６４．Ｂ４．１Ｃ１中のＢｃｌ−２レベルより、約２倍高い。８７−２９細胞は、Ｓｐ２／０細胞の成長速度に匹敵する成長速度を持ち、Ｓｐ２／０と比較して、見かけ上、一日は余分に成長を続けることができ、１５〜２０％高い最大密度に到達することができる。類似する性質が、Ｅ６／Ｅ７発現Ｓｐ−Ｅ２６細胞株でも見出された。親Ｓｐ２／０細胞よりも４〜６日長く生存するＢｃｌ−２−ＥＥＥ発現８７−２９クローンは、１日しか余分に生存しないＳｐ−Ｅ２６クローンより優れている。
【００８３】
８７−２９クローンに代表されるＳｐ−ＥＥＥ細胞株は、組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有する適切なベクターによるトランスフェクション時にその組換えタンパク質を発現させるためのアポトーシス耐性宿主として有用である。この細胞株が有用であるためには、それが、トランスフェクションおよび増幅後ならびに延長された培養中に、そのＢｃｌ−２−ＥＥＥ発現および生存面の優位性を維持しなければならない。安定にトランスフェクトされたＢｃｌ−２−ＥＥＥ遺伝子がその後のトランスフェクション中に失われることはなさそうであるから、生存特性は減少しないはずである。ＭＴＸ増幅は、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現を増加させることによって、産生クローンの生存をさらに改良し得ると考えられる。実際、野生型Ｂｃｌ−２をトランスフェクトしたｈＭＮ−１４ ６６４．Ｂ４細胞株の場合は、これが当てはまった。増幅およびサブクローニング後に、Ｂｃｌ−２レベルは数倍増加し、細胞生存は著しく改良された。
【００８４】
最終Ｓｐ／ＥＥＥクローン（＃８７−２９）は、親Ｓｐ２／０細胞に匹敵する成長速度を持つ。しかし、Ｓｐ／ＥＥＥ ８７−２９細胞は、Ｓｐ２／０と比較して、１日は余分に成長し続け、１５〜２０％高い最大密度に到達し、４〜６日は余分な生存を示す。さらに、Ｓｐ／ＥＥＥ細胞株は、血清欠乏に対して、Ｓｐ２／０細胞よりもかなり耐性が高かった。
【実施例６】
【００８５】
ヒトＢｃｌ−２遺伝子の安定発現による静置回分培養におけるＡｂ産生細胞生存の改良
Ｂｃｌ−２−トランスフェクト細胞クローンの生成
細胞クローン６６５．２Ｂ９は、もともと、ヒト化モノクローナル抗ＣＥＡ Ａｂを生産するために、トランスフェクションによって、Ｓｐ２／０から生成させた細胞である（Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，未公表の結果）。ｈＭＮ１４ｐｄＨＬ２と呼ばれるベクターを使ってＳｐ２／０細胞をトランスフェクトすることにより、細胞クローン６６５．２Ｂ９が得られた。ｐｄＨＬ２ベクターはＧｉｌｌｉｅｓらが初めて記述したベクターであり、メトトレキサート処理による後続の選択および増幅を可能にする増幅可能なマウスｄｈｆｒ遺伝子を持っていた（Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１（１９８９））。一般に、ｐｄＨＬ２ベクターは、二つのメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーターとＩｇＨエンハンサーとによって独立して制御されるＩｇＧ重鎖および軽鎖遺伝子の両方の発現をもたらす。ｈＭＮ１４ｐｄＨＬ２ベクターの図解を図１６に示す。配列番号１はこのベクターの配列を表し、配列番号２はエンハンサー配列と定義される７２ｂｐ配列を表す。プロモーター配列はｈＭＮ１４ｐｄＨＬ２のｎｔ２９０８〜２９７９に相当する。
【００８６】
一般に、Ｓｐ２／０細胞には、この例で使用するｈＭＮ１４ｐｄＨＬ２ベクターなどの線状化ｐｄＨＬ２ベクターを、エレクトロポレーションによってトランスフェクトすることができる。選択は、トランスフェクションの４８時間後に、０．０５〜０．１μＭ ＭＴＸを含有する培地と共に細胞をインキュベートすることによって開始することができる。挿入された抗体配列の増幅は、ＭＴＸ濃度を５μＭまで段階的に増加させることによって達成される。
【００８７】
クローンを、ＭＴＸを０．３μＭまで段階的に増加させる遺伝子増幅にかけたところ、この時点で、抗体の最大生産性（Ｐｍａｘ）は約１００ｍｇ／Ｌまで増加した。細胞成長特性を改良するために、６６５．２Ｂ９細胞に、ヒトＢｃｌ−２遺伝子を含有するプラスミド発現ベクター（図１７）を、エレクトロポレーションによってトランスフェクトした。ＡＴＣＣから購入したｐＢ４プラスミド（ｐＢ４、カタログ番号７９８０４）からＥｃｏＲＩ部位を使ってＢｃｌ−２遺伝子を切り出し、哺乳類発現ベクターｐＺｅｏＳＶ（＋）のＭＣＳに同じ制限酵素を使って挿入した。ゼオシン耐性遺伝子がこのベクターの一部であるため、５０〜３００μｇ／ｍＬの範囲のゼオシンを含有する培地に、トランスフェクト細胞を入れた。３００ｍｇ／ｍｌゼオシンを含有する培地から安定なクローンを選択し、０．５細胞／１００μＬ／ウェルの密度で９６ウェルプレートにプレーティングすることにより、ゼオシンを含まない培地でサブクローニングした。その後はゼオシンを含まない培地を使用した。
【００８８】
ウェルにおけるクローンの形成を、顕微鏡下の目視観察によって確認した。細胞クラスターを一つだけ含むウェルの細胞を拡大した。各９６ウェルプレートが約３０クローンをもたらし、そのうちの１４クローンをさらなる研究のためにランダムに選択した。これらのクローンの成長特徴を、ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＧｕａｖａ ＰＣＡを用いる毎日の細胞計数および生存率測定によって評価した。２４ウェルプレートで評価した１４クローン（図１８、１９）から、改良された成長特徴（より高い細胞密度および延長された細胞生存）を示すＢｃｌ−２−トランスフェクトクローンを一つ同定し、６６５．２Ｂ９＃４（またはクローン＃４）と名付けた。親６６５．２Ｂ９と比較すると、クローン＃４は、Ｔフラスコ中で、より高い細胞密度（約１．７倍）まで成長すると共に４〜６日間長く生存し（図２０、２１）、より良い成長の結果として、クローン＃４のＰmaxは、ＥＬＩＳＡタイトレーションおよびプロテインＡカラム精製による決定で約１７０ｍｇ／Ｌまで増加した。
【００８９】
６６５．２Ｂ９＃４におけるＢｃｌ−２発現
６６５．２Ｂ９＃４の改良された成長特性がＢｃｌ−２のトランスフェクションによってもたらされたことを確認するために、Ｇｕａｖａ Ｅｘｐｒｅｓｓ試薬およびＧｕａｖａ ＰＣＡ計測器を使って、ヒトＢｃｌ−２タンパク質の細胞内レベルを測定した。簡単に述べると、１．５ｍｌ遠心管に入れた４×１０5細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１×ＰＢＳで３回洗浄した。上清を注意深く吸引した。Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＳＣＢ），Ｉｎｃ．の固定溶液（１０×、６０μＬ）（カタログ番号ｓｃ−３６２２）を細胞ペレットに１５分間加え、氷上でインキュベートした。固定溶液を、４℃のＰＢＳ ４×１ｍＬで、毎回上述のように遠心することによって除去した。
【００９０】
−２０℃の透過処理バッファー（０．５ｍＬ）（ＳＣＢカタログ番号ｓｃ−３６２３）を、ボルテックスしながら滴下した後、１５分間氷上でインキュベートした。次に細胞を遠心し、０．５ｍＬのＦＣＭ洗浄バッファー（ＳＣＢカタログ番号ｓｃ−３６２４）で２回洗浄した。最終細胞ペレットを１００μＬのＦＣＭ洗浄バッファーに再懸濁し、Ｂｃｌ−２細胞内タンパク質について、ＰＥにコンジュゲートした抗Ｂｃｌ−２マウスモノクローナル抗体（ＳＣＢから入手）１０μＬで染色した。インキュベーションは暗所、室温で１時間行った。次に０．５ｍＬのＦＣＭ洗浄バッファーによる洗浄を２回行った。最終細胞ペレットを０．４ｍＬのＦＣＭ洗浄バッファーで再懸濁し、細胞をＧｕａｖａ ＰＣで分析した。各クローンの蛍光強度の平均値（ＭＦＩ）を、ＰＥとコンジュゲートした非特異的アイソタイプマウスＩｇＧＩによる対照染色と比較した。表２に要約する結果は、クローン６６５．２Ｂ９＃４が親細胞株より高レベルのＢｃｌ−２を発現させることを裏付けている。親６６５．２Ｂ９と類似する成長プロファイルを示すゼオシン耐性クローン（＃１３）は、Ｂｃｌ−２染色に関して陰性であったことから、この成長の改良にはＢｃｌ−２発現が必要であることが確認された。
【００９１】
【表２】
【００９２】
Ｇｕａｖａ Ｅｘｐｒｅｓｓ分析により、Ｂｃｌ−２レベルに対応する蛍光染色の強度は、クローン６６５．２Ｂ９＃４のＭＴＸ増幅と共に上昇することが分かったことから、Ｂｃｌ−２とｄｈｆｒ遺伝子との同時増幅が示唆された。増幅細胞の細胞内Ｂｃｌ−２レベルを比較するために、ウェスタンブロッティング分析を、クローン６６５．２Ｂ９＃４（Ｂｃｌ−２陽性）およびクローン＃１３（Ｂｃｌ−２陰性）の細胞溶解物に対して、抗ヒトＢｃｌ−２抗体を使って行った。デンシトメトリー評価により、１．０μＭ ＭＴＸ中で成長するクローン６６５．２Ｂ９＃４のＢｃｌ−２シグナルは、０．６μＭ ＭＴＸ中の細胞よりも２倍強いことがわかった。クローン＃１３の溶解物は、Ｂｃｌ−２タンパク質の存在を示さなかった（図２２）。
【実施例７】
【００９３】
回分培養条件下でのクローン６６５．２Ｂ９＃４の改良されたＡｂ生産
終末期近くの細胞培養物における栄養素消費を監視することにより、グルコースおよびＬ−グルタミンが消費される最初の構成要素であることがわかった。これらの制限栄養素の添加が最終抗体収量を改善するかどうかを決定するための実験を行った。２タイプの培養を開始した。すなわち、補給半回分法（この場合はこれらの制限構成要素が消費された時に栄養素を添加した）と、無供給回分法（栄養素の添加なし）である。試験したのは、０．６μＭおよび１μＭのＭＴＸを含有する培地で成長するＢｃｌ−２陽性クローン６６５．２Ｂ９＃４、ならびに０．３μＭ ＭＴＸ中で成長するＢｃｌ−２陰性クローン＃１３である。図２３および図２４に、終末段階に到達するまでの、両培養タイプにおける細胞生存率および細胞密度のプロファイルを示す。ｍｇ／Ｌで表したタンパク質収量を表３に示す。この実験の結果は、栄養素の補給により、生産される抗体の総収量が、全ての培養物で約２倍改良されることを示唆している。
【００９４】
【表３】
【実施例８】
【００９５】
低レベルの組換えタンパク質を産生する細胞株へのＢｃｌ−２遺伝子の導入
細胞クローン４８２．２Ｃ４Ａは、もともと、ＩｇＧ（抗ＣＥＡ）およびそれぞれがＩｇＧ重鎖のＣ末端に共有結合されている二つのｓｃＦｖ（抗ＤＴＰＡ）（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．４１：２７０Ｐ，２０００；Ｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．４３：９６９，２００２）という形態をした二重特異性Ａｂを生産するために、トランスフェクションによって、Ｓｐ２／０から生成させた細胞である。このクローンは遺伝子増幅にかけられ、約２０ｍｇ／Ｌの最終生産性を持っていた。成長特性を改良し、最終的にはＡｂ生産性を改良するために、４８２．２Ｃ４Ａ細胞に、ヒトＢｃｌ−２遺伝子を含有するプラスミド発現ベクターを、実施例６に記載するように、エレクトロポレーションによってトランスフェクトした。３週間後に、７５０μｇ／ｍｌのゼオシンを含有する培地で、トランスフェクタントを選択した。
【００９６】
アポトーシス感受性細胞を排除するために、ゼオシン耐性細胞を２５μｇ／ｍｌのＣＨＸで５時間処理した。処理した細胞を新しい培養培地で２回洗浄してＣＨＸを除去し、新しい成長培地に再懸濁した。２４時間回復させた後、生存細胞を、限界希釈法（０．５細胞／ウェル）により、９６ウェル細胞培養プレートにクローニングした。クローンは２週間でウェルに出現し、それらをＡｂ産生、ＣＨＸ誘導アポトーシスに対する耐性、および成長プロファイルについてスクリーニングした。全ての面で親４８２．２Ｃ４Ａより成績の良いクローンを選択し、さらに特徴づける。最も成績の良いクローンは、親４８２．２Ｃ４Ａ細胞と比較して、ストレス条件下で成長させた時に、より頑強であり、老化培養条件誘導アポトーシスに抵抗し、より高い最大Ａｂ生産性（約１５０％以上）を持つと予想される。
【実施例９】
【００９７】
細胞成長特性をさらに改良するためのＳｐ−Ｅ２６へのＢｃｌ−２遺伝子の導入
Ｓｐ−Ｅ２６細胞に、実施例５で述べたヒトＢｃｌ−２−ＥＥＥ遺伝子を含有するプラスミド発現ベクターを、エレクトロポレーションによってトランスフェクトする。３週間後に、５００μｇ／ｍｌのゼオシンを含有する培地で、トランスフェクタントを選択する。
【００９８】
アポトーシス感受性細胞を排除するために、ゼオシン耐性細胞を２５μｇ／ｍｌのＣＨＸで５時間処理する。処理した細胞を新しい培養培地で２回洗浄してＣＨＸを除去し、新しい成長培地に再懸濁する。２４時間回復させた後、生存細胞を、限界希釈法（０．５細胞／ウェル）により、９６ウェル細胞培養プレートにクローニングする。クローンは２週間でウェルに出現し、それらをＣＨＸ誘導アポトーシスに対する耐性および成長プロファイルについてスクリーニングする。全ての面で親Ｓｐ−Ｅ２６およびＳｐ−ＥＥＥより成績の良いクローンを選択し、さらに特徴づける。ＨＰＶ−１６ Ｅ６／Ｅ７およびＢｃｌ−２−ＥＥＥを含有する最も成績の良いクローンは、親Ｓｐ−Ｅ２６およびＳｐ／ＥＥＥ細胞よりも、ストレス条件下で成長させた時に頑強であり、老化培養条件誘導アポトーシスに対して耐性であると予想され、それゆえに、組換えタンパク質生産にとって、より良い宿主細胞である。
【実施例１０】
【００９９】
Ｓｐ−ＥＥＥ細胞株による組換えタンパク質の改良された生産
組換えタンパク質を生産するために生存が強化されている細胞株を開発する場合にとり得る経路が二つある。実施例６で述べたように極めてうまく成し遂げられた一方法では、既に産生している細胞株に、Ｂｃｌ−２などの生存促進遺伝子を安定にトランスフェクトする。しかしこの方法には、追加のトランスフェクションステップ、選択ステップおよびクローニングステップが必要であり、これにより、細胞株開発プロセスが少なくとも２ヶ月は長くなり、もしかするとそれよりはるかに長くなるかもしれない。さらにまた、成長／生存、Ｂｃｌ−２発現レベルおよび生産性を含むいくつかのパラメータを決定する必要があるので、「最良」のクローンをスクリーニングする必要もある。したがって少数のクローンしか評価することができない。最も高い生産性を持つクローンが優れた生存性を持たないことは十分にあり得ることであり、その逆も同様である。ここで使用する代替方法は、優れた成長特性および生存特性を持つ親細胞株を開発し、その後に、その細胞株に、所望するタンパク質を生産するための発現ベクターをトランスフェクトすることである。
【０１００】
Ｓｐ２／０細胞と比較すると、Ｓｐ−ＥＥＥ細胞は一日長く成長し続け、１５〜２０％高い最大密度に到達し、培養下で４〜６日長く生存する。細胞は、組換えタンパク質、例えばＩｇＧ、抗体フラグメントおよび融合タンパク質、成長因子、例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＦＳ、ＥＰＯ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、サイトカイン、例えばインターロイキンフェミリーメンバー（ＩＬ−１〜ＩＬ−３１）、またはインターフェロンファミリーメンバー（例えばα、βまたはγインターフェロン）、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ホルモン、酵素、またはワクチン（例えばＡ型、Ｂ型またはＣ型肝炎、ならびに上述した他のワクチン）を生産するための遺伝子を、後からトランスフェクトしても、その強化された成長特性および生存特性を保つ。
【０１０１】
ＩｇＧなどの組換えタンパク質のための発現カセットを一つ以上含有するｐｄＨＬ２などのＤＮＡベクターを使って、エレクトロポレーションなどの標準的方法によって、Ｓｐ−ＥＥＥ細胞をトランスフェクトする。トランスフェクタントを９６ウェルプレートにプレーティングし、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅなどの確立された技法により、クローンをタンパク質産生について分析する。産生クローンを、培養培地中のＭＴＸに、その濃度を数ヶ月かけて増加させながら曝すことにより、遺伝子コピー数を増幅する。Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ発現クローンは、Ｂｃｌ−２陰性Ｓｐ２／０細胞で生成させたクローンと比較して、約２０％高い細胞密度まで成長し、少なくとも４日間は長く生存するので、前者は標準的フラスコまたはローラーボトル培養において少なくとも２０％多い組換えタンパク質を産生するだろう。懸濁培養、灌流培養または半回分式バイオリアクター培養では、さらに高い増加が実現される。
【実施例１１】
【０１０２】
バイオリアクターにおけるＢｃｌ−２トランスフェクトクローン６６５．Ｂ４．１Ｃ１の改良されたＡｂ生産
実施例６の６６５．２Ｂ９＃４と親クローン６６５．２Ｂ９をどちらも無血清培地に前適応させた。細胞を、Ｔフラスコで数ヶ月間、連続継代培養することにより、３μＭ ＭＴＸを含有するハイブリドーマ無血清培地（ＨＳＦＭ）の特別仕様の製剤（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ ＰＮ １００７０）に適応させた。適応した細胞を、バンキングのために、Ｔフラスコからローラーボトルにスケールアップした。４５％調整培地（指数増殖期にある培養物の遠心分離後に上清として集めた培地）、１０％ＤＭＳＯおよび４５％ＨＳＦＭから構成されるＦＢＳフリー冷凍保存溶液を使って、各１ｍＬバイアル中に１×１０7個の生存細胞を含むマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を、各細胞株について作製した。ＭＣＢ細胞株を、それぞれ６６５．２Ｂ９．１Ｅ４（Ｂｃｌ−２遺伝子なし）および６６５．Ｂ４．１Ｃ１（Ｂｃｌ−２遺伝子あり）と名付けた。これら二つのクローンの成長特性および抗体産生を回分培養条件で比較した。
【０１０３】
実験は、ＭＣＢから拡大した上記の細胞を使って、３Ｌベンチスケールバイオリアクターで行った。３Ｌバイオリアクターシステムは、２５００Ｌ ｃＧＭＰバイオリアクターシステムのスケールダウンモデルである。したがって、評価結果は、大規模商業生産へのこれらの細胞株の適合性を裏付けるだろう。
【０１０４】
ＭＣＢを作製する際に使用したものと同じ成長ＨＳＦＭ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ ＰＮ １００７０）を使って、細胞株を維持し、接種物を調製した。３Ｌ半回分式バイオリアクタープロセスには、特別仕様の変更を加えた成長ＨＳＦＭに基づく特別仕様の製剤である基礎ＨＳＦＭ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ ＰＮ １０１９４）を使用した。どちらの培地も唯一の微量タンパク質としてインスリンおよびトランスフェリンを含有する。撹拌および曝気によって起こる剪断から細胞を保護するために、さらに０．１％のプルロニックＦ６８を製剤に組み入れた。この培地は３μＭ ＭＴＸも含有した。
【０１０５】
連続供給溶液およびパルス供給溶液の具体的特徴を以下の表４および表５に示す。
【表４】
【表５】
【０１０６】
半回分実験は、３Ｌ Ｂｅｌｌｃｏスピナーフラスコバイオリアクターシステム（Ｂｅｌｌｃｏ ｇｌａｓｓｅｓ、ニュージーランド州バインランド）で、作業体積を２Ｌとして行った。バイオリアクターの温度、ｐＨおよび溶存酸素（ＤＯ）を監視し、シングルループコントローラで制御した。リアクター温度は加熱ブランケットで３７℃に制御した。培養ｐＨはＣＯ2または６％Ｎａ2ＣＯ3の添加によって７．３に制御した。曝気は、円柱状シンタードスパージャー（ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ ｓｉｎｔｅｒｅｄ ｓｐａｒｇｅｒ）により、１０ｍｌ／分で行った。ＤＯは、培地へのＯ2の間欠的散布により、４０％を上回る空気飽和度に制御した。培養中は常に約５０〜６０ｒｐｍの一定撹拌速度を使用した。
【０１０７】
ＭＣＢからの凍結バイアルを融解し、Ｔフラスコ中で約１〜２週間回復させた。次に、細胞をＴフラスコからローラーボトルに拡大した後、バイオリアクターに接種した。細胞を５％ＣＯ2雰囲気下に３７℃で培養し、拡大プロセス中は常に指数成長期に維持した。
【０１０８】
接種に先だって、１．２リットルの基礎ＨＳＦＭをバイオリアクターに無菌的にポンプ輸送した。溶存酸素（ＤＯ）計を較正するために、培地を空気飽和させた。ｐＨ計を較正するために、培地試料も採取した。ｐＨ計およびＤＯ計を較正し終えた後、両方のコントローラをＡＵＴＯモードに設定した。システムがｐＨ（７．３）および温度（３７℃）の設定ポイントに到達したら、計算された量の接種物をローラーボトルからバイオリアクターにポンプ輸送した。接種後の生存細胞密度（ＶＣＤ）は約２×１０5生存細胞／ｍｌだった。
【０１０９】
供給方法は以下のとおりである。培養中は、必要かつ過剰でない栄養素を細胞に与えるために、濃縮栄養素溶液をバイオリアクターに供給した。濃縮栄養素溶液は、連続供給およびパルス供給によって、培養物に送達した。連続供給溶液は、蠕動ポンプ（Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ １０１Ｕ／Ｒ）を使って、リアクターに連続的にポンプ輸送した。パルス供給溶液は、１日に１回、培養物にパルス供給した。
【０１１０】
二つの半回分式供給方法を開発し、両方の細胞株に適用した。プロセス＃１では、培養中に組換えインスリンを供給しない。プロセス＃２はプロセス＃１に基づき、リノール酸および脂質供給スケジュールの変更と、インスリンの追加供給を伴う。以下の表に、両プロセスの供給を、両細胞株について要約する。
【０１１１】
【表６】
【０１１２】
【表７】
【０１１３】
【表８】
【０１１４】
【表９】
【０１１５】
培養中は、オフライン分析のために、バイオリアクター試料を定期的に採取した。生存細胞密度（ＶＣＤ）および細胞生存率を、０．４％トリパンブルー色素による染色後に、血球計を使った顕微鏡計数によって測定した。グルコース、乳酸、グルタミン、アンモニア濃度を、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ ２００を使って測定した。抗体濃度をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーカラムを用いるＨＰＬＣによって決定した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐ／Ｎ ２−１００１−００）。
【０１１６】
抗体の累積生産量を培養物中の総生存細胞数の時間積分で割ることによって、比抗体生産性を算出した。すなわち
【数１】
式中、
【数２】
は、公式：
【数３】
によって近似される。
【０１１７】
プロセス＃１では、６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞が成長して、６日目に１×１０7生存細胞／ｍｌの最大ＶＣＤ、生存率８６％を達成した。６日目の後は、ＶＣＤおよびＶ％が急速に低下し、培養物を８日目に収集した。プロセス＃２は、培養物が、１．２×１０7生存細胞／ｍｌという、さらに高いＶＣＤに到達して、１日長く持続するのに役立った。
【０１１８】
６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞と比較すると、６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞は、どちらのプロセスでも、はるかに良好な成長を示した。プロセス＃１の場合、そのＶＣＤは７日目に２×１０7生存細胞／ｍｌに到達し、生存率は９７％だった。また、その培養物は、このＶＣＤおよびＶ％をさらに２日間維持してから、下降を始めた。培養物を１１日目に収集した。プロセス＃２では、６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞は、プロセス＃１と類似する成長プロファイルを示した。より具体的には、細胞は、２．３×１０7生存細胞／ｍｌの最高ＶＣＤに到達し、生存率は少し遅く下降し、収集は１１日目に行われた。この観察結果は、プロセス＃２において成長面での優位性を示した６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞株とは、多少異なった。
【０１１９】
プロセス＃１および＃２における二つの細胞株の抗体収量を比較した。６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞の最終収量は、プロセス＃１で０．４２ｇ／Ｌ、プロセス＃２で０．５５ｇ／Ｌだった。これに比して、６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞は、どちらのプロセスでも、１．５ｇ／Ｌという高い最終収率を達成した。
【０１２０】
一日あたりの比抗体生産性（細胞あたり）を算出したところ、６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞は、どちらのプロセスでも、培養の全過程を通して、約１５ｐｇ／細胞／日という平均一日Ｑ[MAb]を持っていた。プロセス＃２では最高ＶＣＤでの成長が１日追加されたことにより、最終抗体濃度が高くなった。
【０１２１】
６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞は、どちらのプロセスでも類似する一日あたりの比抗体生産性プロファイルを示したが、プロセス＃１の方がわずかに高い生産性をもたらした。一日Ｑ[MAb]は９日目まで約２０〜２５ｐｇ／細胞／日に保たれた。その後、生産性は下降した。
【０１２２】
６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞株と比較して、６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞株は、１５ｐｇ／細胞／日よりも高い約２５ｐｇ／細胞／日という比抗体生産性を示した。その良好な成長と相まって、６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞株では、最終抗体収量が、６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞株によって達成される０．５５ｇ／Ｌと比較して１．５ｇ／Ｌと、３倍になった。これらの結果は、組換えタンパク質（この例では臨床使用するための抗体）の大規模商業製造をモデル化したバイオリアクター中の無血清培地における宿主細胞の成長および抗体収量を強化するために、Ｂｃｌ−２遺伝子を宿主細胞に組み入れることの利益を実証している。
【実施例１２】
【０１２３】
Ｓｐ／ＥＳＦ無血清前適応細胞株の開発
細胞形質転換およびタンパク質生産の標準的プロトコールを以下に要約する。Ｓｐ２／０細胞またはＳｐ２／０由来の細胞株を１０％ＦＢＳ中で維持し、関心対象の遺伝子を含有する発現ベクターをエレクトロポレーションによってトランスフェクトする。１０％ＦＢＳを添加した培地中でトランスフェクタント細胞株を維持しながら、培養培地中のメトトレキサート（ＭＴＸ）を段階的に増加させることにより、発現を増幅させることを試みる。この増幅プロセスは通常、４〜８ヶ月を要するが、うまく機能するのは時折しかなく、典型的には初期生産性が低い細胞株においてうまく機能するだけのようである。ＭＴＸ増幅が完了したら、３〜６ヶ月かけてクローンを無血清培地での成長に徐々に適応させるが、これは、典型的には、生産性を最大５０％喪失させる。
【０１２４】
Ｓｐ／ＥＥＥ細胞株は、強化された成長および生存特性を示すと共に、血清欠乏に対して優れた耐性を示したので、無血清培地での成長に前適応させたＳｐ／ＥＥＥ細胞株を開発することの実現可能性を探究し、この細胞株をトランスフェクション、クローニングおよび増幅に使用することにした。以下に、Ｓｐ／ＥＳＦ（Ｓｐ／ＥＥＥ無血清）細胞株の開発を説明する。抗体またはフラグメントなどのクローン化タンパク質の生産に関する実行可能性は、Ｃ−ＡＤ２−Ｆａｂ−ｈ６７９−ｐｄＨＬ２発現ベクターのトランスフェクションによって実証した。
【０１２５】
無血清培地における成長への適応およびサブクローニング
Ｓｐ／ＥＥＥ細胞を、２ヶ月かけて、無血清培地（ＳＦＭ）での成長に適応させた。ＦＢＳを使わずにＳＦＭ中でトランスフェクションを行い得るかどうかを決定する目的で、無血清適応Ｓｐ／ＥＥＥ細胞を限界希釈法でプレーティングして、それらが低密度から回復するかどうかを決定した。細胞を９６ウェルプレートの第１列に５細胞／ウェルの濃度でプレーティングし、そのプレートの下方に向かって２倍ずつ希釈した。この限界希釈により、合計７個のクローンを得た。これらの結果は、細胞がトランスフェクションに必要な条件下で生存できることを実証している。それら７個のサブクローンのうち４個を使って成長曲線実験を行うことにより、最も好ましい成長特性を持つクローンを選択した。４個のクローン（＃１、３、４、および５）と親クローンを、Ｔ２５フラスコ中、６ｍｌの培養培地に、密度が３×１０5細胞／ｍｌになるように分割した。細胞生存率（図２５）および細胞密度（図２６）を、生存率が０に達するまで監視した。
【０１２６】
サブクローンのうち、＃３は、他のどのサブクローンまたは親細胞株よりも２４時間長く生存した。また、サブクローン＃３および＃１は、他のクローンより高い最大細胞密度（３２０万〜３３０万／ｍＬ、図２６）に到達した。これは、サブクローン＃３が、うまくトランスフェクションを起こすように、より良く適応し得ることを示唆している。そこで、サブクローン＃３を新たにＳｐ／ＥＳＦと名付け、以降のトランスフェクションに使用した。
【０１２７】
ｈ６７９−ＡＤ２によるＳｐ／ＥＳＦ細胞のトランスフェクション
上記のデータに基づき、Ｓｐ／ＥＳＦ細胞（サブクローン＃３）に、エレクトロポレーションにより、Ｓｐ２／０細胞に関する標準的プロトコールに従って、３０μｇのｈ６７９−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２をトランスフェクトした。４８時間後に、細胞を０．１μＭ ＭＴＸで選択した。対照として、１０％ＦＢＳ中のＳｐ／ＥＥＥ細胞にも、ｈ６７９−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２を、エレクトロポレーションにより、同じ条件下でトランスフェクトした。１０日後に、プレートは、ＢＳＡ−ＩＭＰ−２６０コートプレートを使ってＥＬＩＳＡでスクリーニングできる状態になっていた。どちらのトランスフェクションでも、４００ウェルのうち約１３０ウェルが陽性クローンを含んでいた。ＯＤ測定値が最も高い４０ウェルの陽性Ｓｐ／ＥＳＦ細胞を２４ウェルプレートに移し、ＭＴＸを０．２μＭ ＭＴＸに増加させた。２４ウェルプレート中の細胞が終末相に達してから、ＨＳＧセンサーチップを使ったＢＩＡＣＯＲＥ分析によるスクリーニングを、さらに行った。スクリーニングしたクローンのうち４個が＞５０ｍｇ／Ｌの生産性を持っていた。生産性が最も高いクローン（ｈ６７９−ＡＤ２−ＳＦ ＃Ｔ６）は、８２ｍｇ／Ｌの初期生産性を持っていた。これらの初期生産性結果は、１０％ＦＢＳ中のＳｐ／ＥＥＥ細胞を使ったこの構築物のトランスフェクションによって以前得られた結果と極めてよく似ていた。
【０１２８】
増幅
ＭＴＸ増幅用にｈ６７９−ＡＤ２−ＳＦ＃ Ｔ６クローンを選択した。２週間後に、ＭＴＸ濃度を０．２μＭから０．４μＭに増加させた。わずか２回のＭＴＸ増加後でも既に、生産性の多少の増幅を観察することができる。
【０１２９】
【表１０】
【０１３０】
結論
Ｓｐ／ＥＳＦについて上に示したデータは、トランスフェクション、限界希釈法によるクローニング、およびＭＴＸ増幅の全てを、無血清条件下に１ヶ月未満で達成できることを示している。これは、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２発現ベクターのトランスフェクションによって実証された。このトランスフェクションは、８２ｍｇ／Ｌという極めて高い初期生産をもたらし、これを２週間で１０３ｍｇ／Ｌまで増幅することができた。ＭＴＸばく露の時間を長くすれば、さらなる増幅が予想される。８２ｍｇ／Ｌという最良クローン（Ｔ６）の初期生産性は、１０％ＦＢＳ中で行われた親Ｓｐ／ＥＥＥ細胞株の元のトランスフェクションによる最良のｈ６７９−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２クローン（５Ｄ８）の初期生産性（これは約５０ｍｇ／Ｌだった）を上回っている。Ｓｐ／ＥＳＦ細胞には、エリスロポエチンを生産するためのＥＰＯ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２もトランスフェクトした。
【０１３１】
Ｓｐ／ＥＳＦの主要パラメータを既存のＰＥＲ．Ｃ６細胞株（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００３，１９：１６３−１６８）のパラメータと比較した表１１に示すように、Ｓｐ／ＥＳＰは多くのカテゴリでＰＥＲ．Ｃ６を凌ぐ。
【０１３２】
【表１１】
【０１３３】
本願が開示しクレームする組成物および／または方法および／または装置は全て、この開示に照らして、過度の実験を行わなくても作製し、実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して説明したが、組成物および／または方法および／または装置ならびに本明細書に記載の方法のステップまたはステップの順序に、本発明の概念、要旨および範囲から逸脱することなく改変を加え得ることは、当業者には明らかだろう。より具体的には、本明細書に記載する薬剤の代りに、化学的にも生理学的にも関係する一定の薬剤を使用することができ、それでもなお同じ結果または類似する結果が達成されるであろうことは、明らかだろう。当業者にとって自明なそれらの類似する置換態様および変更態様は、本願請求項によって定義される本発明の要旨、範囲および概念に含まれるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】シクロヘキシミドで処理した（＋ＣＨＸ）または無処理の（−ＣＨＸ）Ｓｐ２／０細胞およびＳｐ−Ｅ２６細胞の視覚像を表す。
【図２】ＣＨＸ処理に対してより耐性なＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７形質導入細胞をスクリーニングした結果を示す。合計５５クローンをスクリーニングした。最初の実験では３１クローンをスクリーニングし（上段のパネル）、２番目の実験では２４クローンをスクリーニングした（下段のパネル）。各クローンの健常細胞を二つに等分した。一方をＣＨＸで２時間処理し、他方を無処理のままにしておいた。次に、これら二つの培養物中の生存細胞をＭＴＴアッセイで測定し、処理した生存細胞集団（ＣＨＸ+）と無処理の生存細胞集団（ＣＨＸ-）との比をプロットとした。上段のパネルに示すように、Ｓｐ２／０細胞ではＣＨＸ処理が生存率を３０％低下させたのに対し、Ｓｐ−Ｅ２６細胞では６％しか低下しなかった。スクリーニングした３１クローンのうち７クローン（＊で示すもの）は、Ｓｐ２／０よりも有意に成績が良かったが（生存率の低下は＜２０％）、Ｓｐ−Ｅ２６ほど良くはなかった。２番目の実験でスクリーニングした２４クローンの場合（下段のパネル）、ＣＨＸ処理は、Ｓｐ２／０細胞の生存率を約５０％低下させ、Ｓｐ−Ｅ２６の生存率を＜２０％低下させた。２４クローンのうち１０クローン（＊または＊＊で示すもの）は、Ｓｐ２／０よりも有意に成績が良く（＜３０％の低下）、そのうちの６クローン（＊＊で示すもの）はＳｐ−Ｅ２６に匹敵するか、Ｓｐ−Ｅ２６より優秀だった（＜２０％）。Ｅ２８およびＥ３６は、Ｓｐ２／０よりは良い成績だがＳｐ−Ｅ２６ほど良くはない二つの追加対照クローンである。
【図３】ＧｕａｖａネキシンＶアッセイのドットプロットを表す。初期アポトーシス細胞（ネキシンＶ陽性および７−ＡＡＤ陰性）のパーセンテージを右下の象限に示す。
【図４】ＣＨＸで処理したＳｐ２／０におけるＤＮＡ断片化を表す。これに対し、Ｓｐ−Ｅ２６細胞はこの処理に対して耐性だった。
【図５】ＴフラスコにおけるＳｐ２／０細胞およびＳｐ−Ｅ２６細胞の成長プロファイルを表す。健常細胞（＞９５％の生存率）を、２００，０００／ｍｌの初期細胞密度で、Ｔフラスコに播種した。Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬（Ｇｕａｖａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）およびＰＣＡ計測器（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使って生存細胞および死細胞を毎日計数した。ＮＨ4+および乳酸の蓄積も監視した。
【図６】３Ｌバイオリアクターでの回分培養物について決定したＳｐ２／０細胞とＳｐ−Ｅ２６細胞の成長プロファイルの比較。健常細胞（＞９５％の生存率）を２５０，０００／ｍｌの初期細胞密度でバイオリアクターに播種した。トリパンブルーと顕微鏡とによって細胞を毎日計数した。
【図７】Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ発現についてクローンをスクリーニングするために、Ｂｃｌ−２（１００）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）で染色し、増感化学発光法で発色させた代表的イムノブロットを表す。
【図８】Ｇｕａｖａ Ｅｘｐｒｅｓｓを使ったフローサイトメトリー結果のグラフを表す。細胞を固定し、透過処理してから、フィコエリトリン結合抗Ｂｃｌ−２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で染色した。数個のサブクローンを比較している。
【図９】Ｇｕａｖａ Ｅｘｐｒｅｓｓを使ったフローサイトメトリー結果のグラフを表す。細胞を固定し、透過処理してから、フィコエリトリン結合抗Ｂｃｌ−２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で染色した。Ｓｐ２／０細胞、Ｒａｊｉ細胞およびＤａｕｄｉ細胞をＢｃｌ−２−ＥＥＥクローンと比較した。
【図１０】６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞、Ｓｐ２／０細胞、Ｒａｊｉ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｓｐ−ＥＥＥ（８７−２９クローン）細胞およびＳｐ−ＥＥＥ（７−１６クローン）細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を表す。（Ａ）ヒトＢｃｌ−２特異的抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）で染色したブロット。（Ｂ）マウスおよびヒトＢｃｌ−２を認識する抗Ｂｃｌ−２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）で染色したブロット。
【図１１】１０％ウシ胎仔血清を添加した培地中で成長させたＳｐ−ＥＥＥクローンの成長曲線（Ａ）および生存率（Ｂ）をＳｐ２／０細胞と比較したものを表す。
【図１２】１％ウシ胎仔血清を添加した培地中で成長させたＳｐ−ＥＥＥクローンの成長曲線（Ａ）および生存率（Ｂ）をＳｐ２／０細胞と比較したものを表す。
【図１３】無血清培地中で成長させたＳｐ−ＥＥＥクローンの成長曲線（Ａ）および生存率（Ｂ）をＳｐ２／０細胞と比較したものを表す。
【図１４】Ｓｐ−ＥＥＥ（８７−２９クローン）細胞のメトトレキサート死滅曲線を表す。
【図１５】１ｍｇ／ｍｌのゼオシンの存在下または非存在下で成長させたＳｐ−ＥＥＥクローンを比較した、Ｇｕａｖａ Ｅｘｐｒｅｓｓを使ったフローサイトメトリー結果のグラフを表す。細胞を固定し、透過処理してから、フィコエリトリン結合抗Ｂｃｌ−２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）で染色した。
【図１６】ヒト化抗体配列ならびにＳＶ４０のプロモーター配列およびエンハンサー配列を持つ６６５．２Ｂ９クローンを得るために、Ｓｐ２／０細胞のトランスフェクションに使用した、ｐｄＨＬ２ベクターの地図を表す。
【図１７】クローン６６５．２Ｂ９のトランスフェクションに使用した、Ｂｃｌ−２遺伝子が組み入れられているＤＮＡプラスミドの地図を表す。
【図１８】Ｂｃｌ−２トランスフェクトクローン６６５．２Ｂ９＃４、Ｂｃｌ−２陰性クローンおよび非トランスフェクト対照の成長プロファイルを表す。健常細胞（＞９５％の生存率）を２４ウェルプレートに４００，０００／ｍｌの初期細胞密度で播種した。Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ計測器を使って生存細胞および死細胞を毎日計数した。
【図１９】Ｂｃｌ−２トランスフェクトクローン６６５．２Ｂ９＃４、Ｂｃｌ−２陰性クローンおよび非トランスフェクト対照の成長プロファイル。健常細胞（＞９５％の生存率）を２４ウェルプレートに４００，０００／ｍｌの初期細胞密度で播種した。Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ計測器を使って生存細胞および死細胞を毎日計数した。
【図２０】異なるＭＴＸ濃度におけるＢｃｌ−２トランスフェクトクローン６６５．２５９＃４およびＢｃｌ−２陰性クローンの成長プロファイルを示す。健常細胞（＞９５％の生存率）をＴフラスコに１００，０００／ｍｌの初期細胞密度で播種した。Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ計測器を使って生存細胞密度および生存率を毎日計数した。
【図２１】異なるＭＴＸ濃度におけるＢｃｌ−２トランスフェクトクローン６６５．２５９＃４およびＢｃｌ−２陰性クローンの成長プロファイルを示す。健常細胞（＞９５％の生存率）をＴフラスコに１００，０００／ｍｌの初期細胞密度で播種した。Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ計測器を使って生存細胞密度および生存率を毎日計数した。
【図２２】クローン６６５．２Ｂ９＃４（ＭＴＸ濃度を増加させたもの）およびクローン＃１３によって発現されるヒトＢｃｌ−２のレベル（ウェスタンブロット法で検出したもの）を表す。
【図２３】Ｌ−グルタミンおよびグルコースを補給して、またはＬ−グルタミンおよびグルコースを補給せずに、０．６μＭおよび１μＭのＭＴＸ中で培養したクローン６６５．２Ｂ９＃４ならびに０．３μＭ ＭＴＸ中で培養したクローン＃１３の細胞生存率のプロファイルを表す。健常細胞（＞９５％の生存率）をローラーボトルに２００，０００／ｍｌの初期細胞密度で播種した。「補給」培養物には、２日目および４日目（矢印で示した時点）に、グルコースおよびＬ−グルタミンを含有する栄養添加溶液を加えた。Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ計測器を使って生存細胞および死細胞を毎日計数した。
【図２４】Ｌ−グルタミンおよびグルコースを補給して、またはＬ−グルタミンおよびグルコースを補給せずに、０．６μＭおよび１μＭのＭＴＸ中で培養したクローン６６５．２Ｂ９＃４ならびに０．３μＭ ＭＴＸ中で培養したクローン＃１３の生存細胞密度のプロファイルを表す。健常細胞（＞９５％の生存率）をローラーボトルに２００，０００／ｍｌの初期細胞密度で播種した。「補給」培養物には、２日目および４日目（矢印で示した時点）に、グルコースおよびＬ−グルタミンを含有する栄養添加溶液を加えた。Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ計測器を使って生存細胞および死細胞を毎日計数した。
【図２５】培養５日間にわたるＳｐ／ＥＥＥサブクローンの無血清培地における生存率を表す。
【図２６】培養５日間にわたる無血清Ｓｐ／ＥＥＥサブクローンの生存細胞密度を図示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明のさまざまな実施形態は、細胞株の寿命延長および／または細胞株からのタンパク質収量を増加させるための方法および組成物に関する。具体的な実施形態において、細胞株は、抗体または抗体フラグメントを産生するハイブリドーマ細胞株であってもよい。さらに具体的な実施形態において、本方法は、一つ以上の遺伝子（例えばＥ６、Ｅ７および／もしくはＢｃｌ−２または関連タンパク質をコードする遺伝子）を細胞株にトランスフェクトすることを含み得る。そのようなタンパク質はそのネイティブ配列に限定されるわけではなく、例えばＴ６９Ｅ、Ｓ７０ＥおよびＳ８７Ｅに点突然変異を持つＢｃｌ−２などのように、置換されたアミノ酸を一つ以上含んでいてもよい。別の実施形態は、無血清培地中で成長しタンパク質を産生する能力を持つ哺乳動物細胞株に関する。そのような細胞株は、抗体、二重特異性抗体、多価抗体もしくは多重特異性抗体またはそのフラグメントなどの異種タンパク質を発現させる発現ベクターを、その細胞株にトランスフェクトすることによる、タンパク質生産の方法に使用することができる。好ましい実施形態では、その細胞株を無血清培地中でトランスフェクトすることにより、トランスフェクト細胞株を無血清増殖成長および無血清タンパク質生産に適応させる必要を回避して、かなりの時間を節約することができる。
【背景技術】
【０００２】
細胞をインビトロで（特に大きなバイオリアクターで）培養することは、数多くのバイオテクノロジー製品を生産する基礎を成している。これは、細胞による培地中へのタンパク質産物の産出を伴い、これらの産物はその培地から単離され、さらに加工された後、臨床的に使用される。培養下で増殖成長する細胞から生産されるタンパク質の量は、例えば細胞密度、細胞周期の位相、そのタンパク質の細胞生合成速度、細胞の生存および成長を支えるために用いられる培地の条件、ならびにその細胞の培養下での寿命（すなわち、それらの細胞がプログラム細胞死またはアポトーシスで死ぬまでの時間）などといった、いくつかの因子に依存する。培養細胞の生存率および寿命を改善する方法は、例えば栄養素、細胞密度、酸素含量および二酸化炭素含量、乳酸デヒドロゲナーゼ、ｐＨ、容量オスモル濃度、異化産物などを制御することによって所望するタンパク質の生産性を増加させる方法と共に、種々開発されてきた。例えば、細胞密度を増加させることで、生産性を高めることはできるが、それは培養細胞の寿命を縮めることにもなり得る。そこで、細胞集団ができるだけ長く最も生産的な状態に維持されるように、最大密度に到達した時には培養細胞の増殖速度を低下させることが望まれるだろう。これにより、バイオリアクター周期をその生産ピークにおいて増加または延長させて、所望するタンパク質産物をより長期間産出させることができ、そしてそれは、バイオリアクター周期からの収量を高めることになる。
【０００３】
バイオリアクター周期の時間を増加させるために、例えば細胞増殖のための培地を調節すること、一定の成長促進因子を添加すること、ならびにタンパク質合成に影響を及ぼさずに細胞増殖を阻害することなど、多種多様なアプローチが探究されてきた。ある具体的アプローチでは、細胞周期因子に影響を及ぼすための遺伝子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを使って細胞周期を制御することにより、培養細胞の寿命を増加させることを目指す。この方法では、細胞周期進行を妨げて、いわゆる擬似老化状態（これは、さらなる細胞分裂を遮断し培養細胞のタンパク質合成能力を拡大する）を誘導するベクターをトランスフェクトし、または形質転換し、または感染させることにより、細胞を擬似老化段階へと誘導する。言い換えると、細胞周期阻害剤を発現させるベクターを細胞にトランスフェクトすることにより、擬似老化状態を誘導することができる（Ｂｕｃｃｉａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許出願公開第２００２／０１６０４５０号Ａ１；ＷＯ ０２／１６５９０ Ａ２）。後者の方法は、細胞増殖を阻害することにより、ＧｏｌｄｓｔｅｉｎとＳｉｎｇａｌが記述しているように延長された細胞培養寿命を持ち（Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ８８，３５９−６４，１９７４；Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７：１９９−２０５，１９９８）、アポトーシスに対して耐性を持つ（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７，４２９１−６，２０００；Ｊａｖｅｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９，６１−８，２０００）ことができる状態に、細胞を強制的に陥らせようとするものである。
【０００４】
さらにもう一つのアプローチでは、アデノウイルスＥ１遺伝子のトランスフェクション後に無限増殖性を持つ初代二倍体ヒト細胞またはその誘導体を樹立する。機能的なＡｄ５ Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子産物を発現させる新しい細胞株（その一つがＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ受託番号９６０２２９４０）である）は、遺伝子治療およびワクチン用ならびに組換え治療タンパク質（例えばヒト成長因子およびヒト抗体）の生産用に設計された組換えアデノウイルスならびに他のウイルス（例えばインフルエンザ、単純ヘルペス、ロタウイルス、麻疹）を産生することができる（Ｖｏｇｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ０２／４０６６５ Ａ２）。
【０００５】
別のアプローチでは、細胞におけるアポトーシスを防止または遅延させるためのカスパーゼ阻害剤の使用に、焦点が当てられた。例えば米国特許第６，５８６，２０６号を参照されたい。さらに別のアプローチでは、細胞におけるアポトーシスを防止または遅延させるために、Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバーなどといったアポトーシス阻害剤を使用することが試みられた。Ａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ，３：２３−２８（２００４）を参照されたい。これらのアプローチは予測不可能な結果をもたらした。例えばある研究では、Ｂｃｌ−２の発現によって細胞の生存率は増加したが、タンパク質生産は増加しなかった（Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６８：３１−４３，２０００参照）。もう一つの例では、ＣＨＯ細胞におけるアポトーシスを遅延させることを目的とするＢｃｌ−２タンパク質の過剰発現が開示されたが、Ｂｃｌ−ｘＬはタンパク質生産を増加させたものの、Ｂｃｌ−２はタンパク質生産を減少させた（ＷＯ０３／０８３０９３参照）。さらにもう一つの例では、培養Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５８１、以下Ｓｐ２／０という）の生存を延長するためにＢｃｌ−２タンパク質の発現を使用する実験が開示された。しかし、Ｂｃｌ−２発現クローンの細胞密度は、その親培養物の細胞密度よりも２０〜５０％低く、生物医薬産業での実用化には懸念が生じた（ＷＯ０３／０４０３７４；Ｕ．Ｓ．６，９６４，１９９参照）。
【０００６】
したがって、組換えタンパク質を高レベルに発現させるための改良された宿主細胞および組換えタンパク質生産（特に、宿主細胞における抗体および抗体フラグメント、多重特異性抗体、フラグメントおよび単鎖構築物、ペプチド、酵素、成長因子、ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、ならびにワクチンの生産）を確実に増加させるための方法が、当分野において必要とされていることは、明らかである。また、無血清成長および無血清タンパク質生産の前に非常に長い適応期間を経ることなく、無血清条件下で発現ベクターをトランスフェクトし、タンパク質生産に使用することができる、無血清培地または血清枯渇培地中で成長するように前適応させた細胞株も必要とされている。
【発明の開示】
【０００７】
したがって、老化を阻害する薬剤または細胞生存を促進する薬剤（例えば抗アポトーシス剤）を細胞中に導入することにより、細胞培養の寿命および／または組換えタンパク質収量を増加させるための改良された宿主細胞および方法を提供することが、本発明の目的である。そのような薬剤の使用は、所望する組換えタンパク質の生産に用いられる培養細胞の寿命および生存率を優先的に増加させると同時に、培養細胞の生産性を増加させ、それによって所望するタンパク質の最適収量を増加させる。好ましくは、本発明の方法で使用されるアポトーシス阻害因子には、Ｂｃｌ−２およびそのファミリーメンバーが含まれるが、これらに限るわけではない。あるいは、細胞内アポトーシス促進性タンパク質のレベルをダウンレギュレートする因子（例えばｐ５３およびＲｂ）または細胞内抗アポトーシスタンパク質（例えばＢｃｌ−２）をアップレギュレートする因子を細胞中に導入することによって、細胞クローンの寿命および組換えタンパク質収量を改良することもできる。
【０００８】
好ましくは、本発明の方法で使用される調節剤には、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ−１６）がんタンパク質Ｅ６およびＥ７、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２、ならびにその組合わせが含まれるが、これらに限るわけではない。また、本明細書に記載するカスパーゼ阻害剤も、アポトーシスを遮断または減少させ、よって細胞生存を増加させ、前記培養細胞による組換えタンパク質の生産を増加させる一因となり得る。組換えタンパク質の生産を強化するためにこれらの培養物に使用することができる抗アポトーシス剤のさらにもう一つのクラスには、Ｉ型サイトカインスーパーファミリーの一定のメンバー、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）などが含まれる。ＥＰＯは、このクラスのプロトタイプ分子として、赤血球だけでなく、複数の細胞タイプのアポトーシスの主要調整因子であり、それゆえに、例えば内皮細胞、心筋細胞、腎臓の尿細管上皮細胞、皮膚、およびニューロンなどにおいて、より普遍的な細胞保護機能を持つ［Ｐ．ＧｈｅｚｚｉおよびＭ．Ｂｒｉｎｅｓによる総説、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｅｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １１（ｓｕｐｐｌ．１），ｓ３７−ｓ４４，Ｊｕｌｙ ２００４を参照のこと］。
【０００９】
さまざまな実施形態で、ＨＰＶ−１６のＥ６、Ｅ７および／またはＢｃｌ−２などの一つ以上の調節因子をトランスフェクトした細胞株を、無血清培地での成長に前適応させることができる。そのような前適応細胞株、例えばＳｐ／ＥＳＦ細胞株（下記実施例参照、ただしこれに限るわけではない）は、一つ以上の発現ベクターにより、無血清条件下で、さらなる形質転換を起こすことができ、したがって無血清成長への適応に長い時間を必要とせずに、無血清条件下での発現およびタンパク質生産を可能にすることができる。この驚くべき結果は、無血清条件下または低血清条件下でのタンパク質生産を可能にし、培地コストの著しい節約をもたらす。同時に、標準的な哺乳動物細胞株（これは、血清リッチな条件下でしかトランスフェクション可能でなく、無血清タンパク質生産への適応には、さらに６〜１２ヶ月を必要とする）を使った場合に要求される、無血清適応に必要なかなりの時間が、無血清条件下でのトランスフェクションおよびタンパク質生産によって不要になる。
【００１０】
本発明は、細胞培養物の寿命を延長し、かつ／または最適化され、所望する組換えタンパク質の収量が増加するような細胞培養条件を作り出すために、例えばトランスフェクションベクター、望ましい性質を持つ細胞クローンのスクリーニングおよび選択、細胞培養培地、成長条件、バイオリアクター構成、ならびに細胞タイプなどといった因子（ただしこれらに限るわけではない）の新規な組合わせを取り入れた細胞培養方法も教示する。これらの細胞培養方法には、懸濁培養法、潅流培養法および半回分培養法が含まれる。Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７９：１４７−１５９（２０００）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７９：１７１−１８１（２００４）；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５５：７８３−７９２（１９９７）を参照されたい。
【００１１】
別段の定義をしない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は全て、その平易な通常の意味を持つ。また、本明細書で言及する特許および他の参考文献の内容は、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において、「ある（ａまたはａｎ）」は、ある項目について、一つまたはそれ以上を意味し得る。
【００１３】
本明細書で使用する用語「および（ａｎｄ）」および「または（ｏｒ）」は、接続詞または離接的接続詞を意味するために使用され得る。すなわち、どちらの用語も、別段の表示がない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」に等価であると理解すべきである。
【００１４】
本明細書で使用する用語「約」は±１０％を意味する。すなわち「約１００」は９０〜１１０の数字を意味する。
【００１５】
本明細書にいう抗体とは、完全長の（すなわち天然の、または通常の免疫グロブリン遺伝子フラグメント組換えプロセスによって形成された）免疫グロブリン分子（例えばＩｇＧ抗体）または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な（すなわち、特異的に結合する）部分もしくは類似物、例えば抗体フラグメントを指す。
【００１６】
抗体フラグメントは、例えばＦ（ａｂ）2、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどといった抗体の一部分である。構造がどうであれ、抗体フラグメントは、完全な抗体によって認識される抗原と同じ抗原に結合する。「抗体フラグメント」という用語は、特異的抗原に結合して複合体を形成することによって抗体のように作用する任意の合成タンパク質または遺伝子操作タンパク質も包含する。例えば抗体フラグメントには、可変領域からなる単離されたフラグメント、例えば重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とがペプチドリンカーによってつながれている組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）、および超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識ユニット（ＣＤＲ）が含まれる。
【００１７】
本明細書で使用する抗体融合タンパク質という用語は、同じまたは異なる特異性を持つ二つ以上の同じまたは異なるｓｃＦｖまたは抗体フラグメントが連結されるように組み換えられて生産された抗原結合分子を指す。融合タンパク質の結合価は、その融合タンパク質が単一の抗原またはエピトープに対して持つ結合アームまたは結合部位の数、すなわち一価、二価、三価または多価を示す。抗体融合タンパク質の多価結合性は、抗原への結合に複数の相互作用を利用することができ、したがってその抗原への結合のアビディティを増加させ得ることを意味する。特異性は、抗体融合タンパク質が結合することのできる抗原またはエピトープの数、すなわち単一特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性を示す。これらの定義を使った場合、天然の抗体、例えばＩｇＧは、二つの結合アームを持つので二価であるが、一つのエピトープに結合するので単一特異性である。単一特異性多価融合タンパク質は、例えば同じ抗原と反応する二つの結合部位を持つダイアボディなど、あるエピトープに対して二つ以上の結合部位を持つが、単一のエピトープにしか結合しない。融合タンパク質は、単一の抗体構成要素を含むか、異なる抗体構成要素の多価的または多重特異性的組合わせを含むか、または同じ抗体構成要素の複数コピーを含み得る。融合タンパク質はさらに、抗体または抗体フラグメントおよび治療剤を含み得る。そのような融合タンパク質に適した治療剤の例には、免疫調整剤（「抗体−免疫調整剤融合タンパク質」）および毒素（「抗体−毒素融合タンパク質」）が含まれる。好ましい毒素の一つは、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、好ましくは組換えＲＮアーゼを含む。
【００１８】
細胞株
本発明のさまざまな実施形態は、宿主細胞株を含む改良された組成物、およびそのような細胞株で組換えタンパク質の強化された生産を行うための方法に関する。一つ以上の抗アポトーシス遺伝子を構成的に発現させ、関心対象のタンパク質またはペプチドをコードする発現構築物をトランスフェクトすることができる細胞株であって、抗アポトーシス遺伝子の発現が培養下でのトランスフェクト細胞の生存を延長し、関心対象のタンパク質またはペプチドの収量を高め得るような細胞株を作出した。
【００１９】
特定の実施形態は、回分培養下で強化された生存を示すＳｐ−Ｅ２６、Ｓｐ−ＥＥＥおよびＳｐ−ＥＳＦと呼ばれる新規細胞株をもたらすＳｐ２／０骨髄腫細胞株の派生細胞株に関する。Ｓｐ−Ｅ２６は、ＨＰＶ−１６のＥ６タンパク質およびＥ７タンパク質を構成的に発現させる。Ｓｐ−ＥＥＥおよびＳｐ−ＥＳＦは、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥと呼ばれるＢｃｌ−２突然変異体を構成的に発現する。さらにまた、Ｓｐ−Ｅ２６、Ｓｐ−ＥＥＥまたはＳｐ−ＥＳＦに関心対象の組換えタンパク質の発現ベクターをトランスフェクトすれば、組換えタンパク質生産、特に組換え抗体および抗体フラグメントの生産を改良することもできる。Ｅ６／Ｅ７タンパク質またはＢｃｌ−２−ＥＥＥタンパク質は、宿主細胞におけるアポトーシスの誘導を遅延させ、宿主細胞における強化された組換えタンパク質生産を可能にする。タンパク質生産は、その細胞の成長培地に、一つ以上のカスパーゼ阻害剤（例えばカスパーゼ１および／または３阻害剤）を添加することによって（Ｂｉｎ Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｐｈｒｏｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ ２００４；９６：ｅ３９−ｅ５１）、そして／またはＩ型サイトカインスーパーファミリーの一つ以上のメンバー、例えばエリスロポエチン（ＥＰＯ）を添加することによって、さらに増強することができる。これに関して、汎カスパーゼ阻害剤は特に有効である。
【００２０】
さらに、Ｓｐ−ＥＥＥ細胞株を、無血清条件下または低血清条件下での成長およびタンパク質生産に前適応させて、Ｓｐ−ＥＳＦなどの無血清前適応細胞株を生じさせることもできる。Ｓｐ−ＥＳＦおよび類似の細胞株には、関心対象のタンパク質、例えば抗体、抗体フラグメント、二重特異性抗体などをコードする一つ以上の発現ベクターをトランスフェクトすることができる。トランスフェクションへの無血清条件の使用は、トランスフェクションおよびタンパク質生産に利用することができる哺乳動物細胞株では類を見ないものであり、無血清成長への適応に要するかなりの時間を不要にする。
【００２１】
Ｂｃｌ−２などのアポトーシス阻害因子の同時発現により、宿主細胞における組換えタンパク質、例えば抗体または抗体フラグメントの生産を著しく強化することができる。特に、抗体または抗体フラグメントをコードする発現ベクターを安定にトランスフェクトすると共に、Ｂｃｌ−２などのアポトーシス阻害因子をコードする発現ベクターをコトランスフェクトしたＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株では、タンパク質生産が著しく強化される。増加した抗体生産は、Ｅ６／Ｅ７遺伝子をトランスフェクトした宿主細胞からも得ることができる。組換えタンパク質生産は、細胞の成長培地に一つ以上のカスパーゼ阻害剤を添加することによって、さらに増強することができる。これに関して、汎カスパーゼ阻害剤は特に有効である。また、組換えタンパク質生産は、細胞培養物の培地にＥＰＯまたは他の抗アポトーシス性サイトカインを供給することによって強化することもできる。
【００２２】
アポトーシスと呼ばれる生理的細胞死またはプログラム細胞死（Ｋｅｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．，２６：２３９−２５７，１９７２）は、適正な組織の発生および維持にとって不可欠であり、進化の過程で保存されてきた固有の遺伝的プログラムによって制御される（Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，７，６６３−６９８，１９９１）。そのため、エクスビボ培養物などの人工的環境で細胞が成長する場合は、この遺伝的資質が有限の寿命をもたらす。したがって、医学および産業ならびに研究で用いられるタンパク質の生産にとって、そのような細胞培養物の有用性は、そのような培養物がアポトーシス機構によって死ぬまで、より長い寿命またはサイクルにわたって、そのような培養物を維持することに依存する。
【００２３】
細胞周期をアポトーシス作用と区別することにより、細胞増殖イベントおよび細胞死イベントに独立して作用する方法および薬剤が発見されている。アポトーシスの周知の細胞内調節因子であるＢｃｌ−２（Ｖａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３５，４４０−２，１９８８）は、細胞周期進入に対するその阻害的影響とは遺伝的に異なる抗アポトーシス作用を持つことがわかっているがん原遺伝子である（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ １６，４６２８−３８，１９９７）。Ｂｃｌ−２の二つのホモログＢｃｌ−ｘLおよびＢｃｌ−ｗも細胞生存を延長させるが、Ｂｃｌ−２ファミリーの他のメンバー、例えばＢａｘおよびＢａｋは、アポトーシス促進性である（Ｏｌｔｖａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ７４，６０９−１９，１９９３；Ｃｈｉｔｔｅｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７４，７３３−６，１９９５；Ｆａｒｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７４，７３１−３，１９９５；Ｋｉｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７４，７３６−９，１９９５）。他の抗アポトーシス遺伝子にはＢｃｌ−６およびＭｃｌ−１が含まれる。
【００２４】
このように、Ｂｃｌ−２とそのファミリーの一定のメンバーはアポトーシスに対する防御作用を持ち、これを、タンパク質の生産に使用される一定の培養宿主細胞の寿命を増加させ、それによって生産、単離されるタンパク質の量を高めるための方法に使用することができる。抗アポトーシス性のＢｃｌ−２ファミリーメンバー、例えばＢｃｌ−２、ＢＣｌ−ｘL、Ｂｃｌ−ｗ、またはこれらのタンパク質の突然変異体種の過剰発現は、アポトーシスを阻害し、その結果として細胞密度を増加させ、培養物の生存を延長する。そのため、抗アポトーシス性のＢｃｌ−２ファミリー遺伝子をトランスフェクトすれば、他の研究者ら（前掲書）が提案しているように細胞周期そのものを妨害することによって細胞培養物を延命する必要は回避される。同様に、Ｂｃｌ−２遺伝子の線維芽細胞へのトランスフェクションは、これらの細胞におけるＢｃｌ−２の過剰発現をもたらし、その結果として、アポトーシスの拮抗作用と細胞の寿命の増加が起こり、それに付随して組換えタンパク質の生産および単離が増加する。インターロイキン−６（ＩＬ−６）依存性マウス骨髄腫細胞は、サイトカイン離脱時に、あたかもアポトーシスを起こすかのように死ぬことも観察されている。そのような細胞中のＩＬ−６受容体は、アポトーシスの延期に関して、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ｘLによって調節され得ることも、見出されている（Ｓｃｈｗａｒｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５：２２６２−５，１９９５）。
【００２５】
三つの点突然変異（Ｔ６９Ｅ、Ｓ７０ＥおよびＳ８７Ｅ）を有する突然変異型Ｂｃｌ−２は、野生型または単一点突然変異体と比較して有意に高い抗アポトーシス活性を示すことが、報告されている（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１０１）１５３−１５８，２００４）。したがって、さまざまな実施形態が、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ三重突然変異体の発現ベクターの構築に関するものであり、その発現ベクターは、改良された寿命および組換えタンパク質生産を示すＳｐ−ＥＥＥクローンおよびサブクローンを作出するために、Ｓｐ２／０細胞のトランスフェクションに使用された。
【００２６】
発がんウイルスなどの他の因子も、例えば高リスク型ＨＰＶがんタンパク質Ｅ６およびＥ７など、それらが誘発する細胞不死化および最終的には完全な悪性トランスフォーメーションの一部として、アポトーシスに対抗することができる（Ｆｉｎｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ １８８，１５−２４，２００２）。例えば、ウイルスＥ６タンパク質は、紫外線に対する表皮のアポトーシス応答を効果的に遮断する（Ｓｔｏｒｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ ＭｏＩ Ｍｅｄ ８，４１７−２１，２００２）。間接的な証拠から、ヒトパピローマウイルスが扁平上皮癌におけるアポトーシスの減少を引き起こし得る（ただし基底細胞癌におけるアポトーシスは減少させない）ことも示唆されている（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８７，３１９−２３，２００２）。しかし、パピローマウイルスがんタンパク質の全てが、抗アポトーシス作用を持つわけではない。例えば別の研究では、ウシ種のパピローマウイルスＥ６タンパク質はアポトーシスに対する細胞の感受性を高めることが報告されており（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２９５，２３０−７，２００２）、これは、ＨＰＶ−１６ Ｅ７遺伝子が一定の刺激によって誘導されるアポトーシスからアストロサイトを保護することを示す別の研究とは対照的である（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｙｏｎｓｅｉ Ｍｅｄ Ｊ ４２，４７１−９，２００１）。Ｅ６結合性ペプチドアプタマーの使用により、ＨＰＶ Ｅ６がんタンパク質がＨＰＶ陽性腫瘍細胞において抗アポトーシス活性を持つことを示す直接的な実験的証拠が得られた（Ｂｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７，６６９３−７，２０００）。しかし他のＨＰＶがんタンパク質は反対の作用を持ち得る。Ｅ２タンパク質は、他のＨＰＶタンパク質の不在下で、アポトーシスを誘導する（Ｗｅｂｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７５，８７−９４，２０００）。
【００２７】
Ｅ６タンパク質とＥ７タンパク質の両方の持続的発現が、子宮頸がん細胞の最適な増殖には必要であることが知られており、これら二つのウイルスタンパク質は、細胞生存に対して異なる作用を発揮する（ＤｅＦｉｌｉｐｐｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７，１５５１−６３，２００３）。ＨＰＶ−１６ Ｅ６による主要細胞内ターゲットはｐ５３である。Ｅ６は、ｐ５３および細胞ユビキチンリガーゼＥ６ＡＰと三元複合体を形成して、ｐ５３のユビキチン化およびプロテアソーム経路による分解ならびにｐ５３の不活化をもたらす。これに対し、ＨＰＶ−１６ Ｅ７タンパク質は、腫瘍抑制タンパク質Ｒｂと相互作用し、それを不安定化する。さらにまた、例えばＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘL、ｐ７３、ＭＤＭ２、ｐ２１、サイクリンおよびｃｄｃ、ｃｄｋタンパク質など、アポトーシス経路および細胞周期経路に関与するさまざまな他の細胞内タンパク質のレベルが、Ｅ６およびＥ７トランスフォーメーションによって調節されると報告された。これらのタンパク質の発現の変化は、細胞の生理学的性質に著しい影響を与えるだろう。そこで本発明者らは、老化培養条件により誘導されるアポトーシスに対して耐性である遺伝子改変クローンを生成させるためにＨＰＶ−１６ Ｅ６およびＥ７による培養細胞のトランスフェクションは有効であり、その結果として細胞培養物の寿命を延長させることができるだろうという仮説を立てた。ＨＰＶ−１６がんタンパク質Ｅ７またはＥ６の単独での細胞への導入が、老化培養条件により誘導されるアポトーシスに対して改良された耐性を持つ遺伝子改変クローンを生成させるのに十分であるかもしれないとも推測した。細胞が組換えタンパク質産生クローンである場合、生理学的性質の改良は、結果的に、総合的なタンパク質生産性の強化につながるだろう。
【００２８】
ウイルス抗アポトーシス遺伝子を発現させる新しい宿主細胞の生成
ＨＰＶ−１６ Ｅ６タンパク質およびＥ７タンパク質などのウイルス抗アポトーシス遺伝子を構成的に発現させる骨髄腫宿主細胞などの宿主細胞を生成させることができる。これらの宿主細胞には、関心対象の組換えタンパク質をコードする発現ベクターをトランスフェクトすることができ、抗アポトーシス遺伝子の同時発現は、著しく増加した組換えタンパク質の生産をもたらす。
【００２９】
宿主細胞は、基本的に、ウイルス抗アポトーシス遺伝子で安定に形質転換することができる組換えタンパク質生産に適した任意の宿主細胞であることができる。多くの組換えタンパク質にとっては、ＣＨＯ細胞およびＣＯＳ細胞などの宿主細胞が好都合であり、一方、抗体などの他のタンパク質には、骨髄腫細胞およびＣＨＯ細胞などの宿主細胞が一般に好んで選択される。有用な宿主細胞株の他の例は、ＶＥＲＯ細胞およびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＮＳＯ、ＮＳ１、ＲＩＮおよびＭＤＣＫ細胞株である。有用な細胞株は、ＣＯＳ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１０）、Ｐ３Ｘ３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８０）、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１０）およびＢＳＣ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６）細胞株など、商業的供給源から入手することができる。ウイルス遺伝子（例えばＥ６／Ｅ７８）および／または真核生物遺伝子は、それらの遺伝子の構成的発現または誘導性発現をもたらす任意の適切な方法によって、すなわち宿主細胞染色体へのそれらの遺伝子の安定な組込みを可能にすると同時にそれらの遺伝子の発現も可能にする任意の方法によって、宿主細胞中に導入することができる。宿主細胞を関心対象の遺伝子で安定に形質転換するための方法は、当分野では周知である。とりわけ好都合な方法は、ウイルス抗アポトーシス遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを使用することである。適切なベクターとして、ＬＳＸＮベクター（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７，９８０−９０，１９８９）が挙げられる。しかし、エレクトロポレーションまたは細胞融合など、当分野で知られる任意の代替方法を利用することができる。
【００３０】
宿主細胞のトランスフェクションに使用するベクターは、そのベクターを含有する細胞の選択を可能にする選択可能マーカーを含有すると好都合である。トランスフェクト細胞に抗生物質耐性を付与する酵素など、適切な選択マーカーは、当分野では周知である。トランスフェクション後は、抗生物質などの選択剤を含有する培地で細胞を維持し、マーカーに対する耐性についてスクリーニングする。通常の方法を使って、細胞を選択し、限界希釈法でクローニングすることができる。
【００３１】
細胞生存率を増加させるウイルス抗アポトーシス遺伝子の能力は、アポトーシスを誘導する薬剤、例えばシクロヘキシミド（ＣＨＸ）などで、細胞を攻撃することによって、試験することができる。ウイルス抗アポトーシス遺伝子を発現させない細胞がアポトーシスの著しい発生を示しがちであるのに対し、それらの遺伝子を発現させる細胞は、激しく低下したアポトーシス活性を示す。アポトーシスを検出する方法は当分野で周知であり、例えば細胞表面ＦＩＴＣ−アネキシンＶ結合アッセイ、ＤＮＡラダーリングアッセイおよびＴＵＮＥＬアッセイなどがある。
【００３２】
ウイルス抗アポトーシス遺伝子を発現させる適切な細胞を選択したら、その細胞に、選択した組換えタンパク質をコードする発現ベクターをトランスフェクトすることができる。発現ベクターは、一過性発現に適したベクターであるか、好都合には、真核生物複製起点を含有するエピソームベクター、または発現カセットの安定な組込みとそれに続く遺伝子増幅とを可能にする増幅可能ベクターであることができる。適切なベクターは当分野では周知であり、例えば、抗体および抗体フラグメントの生産にとりわけ適しているｐｄＨＬ２ベクターなどがある。増幅可能な発現カセットを使用する場合、それは、トランスフェクト細胞の選択が可能なように、レトロウイルスベクターに使用する選択可能マーカーとは異なる選択可能マーカーを含有すると好都合である。ここでもまた、適切にトランスフェクトされた細胞を選択し、次に限界希釈法によってクローニングすることができる。
【００３３】
適切なクローンを選択したら、所望する関心対象のタンパク質を生産するために、細胞を適切な培地に入れて培養することができる。培地は、血清を含有するか、好ましくは無血清であることができる。また、培養培地に一つ以上のカスパーゼ阻害剤（例えばカスパーゼ１または３）を添加することにより、細胞の寿命およびタンパク質生産を増加させることもできる。好ましくは、カスパーゼ阻害剤は、カスパーゼ３、カスパーゼ９および／またはカスパーゼ１２の一つ以上を阻害するように作用する。細胞透過性カスパーゼ阻害剤を使用すると好都合であり、汎カスパーゼ阻害剤はとりわけ好都合である。Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋおよびＡｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏ（配列番号７）などの適切な阻害剤は、当分野では周知である。あるいは、アポトーシスに影響を与えることによってその成長特性を強化するために、その細胞株をさらにトランスフェクトして、ＡｖｅｎまたはＸＩＡＰなどのカスパーゼ阻害剤を発現させることもできる。これに関して、ＥＰＯなど、Ｉ型サイトカインスーパーファミリーの一定のメンバーも、抗アポトーシス作用および細胞保護作用を持つことにより、細胞生存を増加させることができる。
【００３４】
上述の方法により、基本的に任意の所望する遺伝子によるトランスフェクションに使用することができる細胞株が生成する。しかし、所望するタンパク質（特に組換えタンパク質）を構成的に発現させる樹立細胞株に、後から、ウイルスまたはＢｃｌ−２ファミリー抗アポトーシス遺伝子をコードする適切なベクターをトランスフェクトしてもよいことは、当業者には理解されるだろう。下記実施例２を参照されたい。
【００３５】
関心対象のタンパク質は、宿主細胞において検出可能な量で生産され得る基本的に任意のタンパク質であることができる。例として、従来のＩｇＧ型抗体、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2もしくはＦ（ａｂ）2フラグメント、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖもしくはＦａｂ−ｓｃＦｖ融合抗体、ＩｇＧ−もしくはＦａｂ−ペプチド毒素融合タンパク質、またはワクチン［例えば、限定するわけではないが、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎；ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、ハンターンウイルス、エボラウイルス、ロタウイルス、サイトメガロウイルス、リーシュマニアＲＮＡウイルス、ＳＡＲＳ、マラリア、結核（マイコバクテリア）、炭疽、痘瘡、野兎病、その他、参照によりそのまま本明細書に組み入れられるｗｗｗ．ｖａｃｃｉｎｅｓ．ｏｒｇに列挙されているもの］が挙げられる。本明細書に記載する宿主細胞は、実施例１および実施例２で述べる骨髄腫細胞における抗体および抗体フラグメント、ならびに組換え成長因子（例えばＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、トロンボポエチン）、ホルモン、インターロイキン（例えばＩＬ−１〜ＩＬ−３１）、インターフェロン（例えばα、β、γ、およびコンセンサス）、ならびに酵素の高効率生産には、とりわけ適している。これらの方法は、他の骨髄腫細胞株、例えばマウスＮＳＯまたはラットＹＢ２／０；上皮株、例えばＣＨＯおよびＨＥＫ２９３；間葉系細胞株、例えば線維芽細胞株ＣＯＳ−１またはＣＯＳ−７；およびニューロン細胞、例えば網膜細胞、ならびにグリア細胞およびグリア腫細胞など、組換えタンパク質の生産に用いられるいくつもの細胞株に適用することができるだろう。
【００３６】
アポトーシス阻害剤を発現させる細胞における組換え抗体発現
先行の研究では、キメラ抗体を産生する組換えＣＨＯ細胞中で天然のアポトーシス阻害剤であるＢｃｌ−２を同時発現させることの効果が述べられている（Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６８：３１−４３（２０００）参照）。細胞培養寿命の増加は観察されたが、抗体生産は、Ｂｃｌ−２発現を欠く等価な細胞と比較して増加しなかった。しかし本発明者らは、骨髄腫細胞からの組換え抗体の生産が、その細胞がＢｃｌ−２も発現させる場合には、著しく増加することを見出した。
【００３７】
骨髄腫細胞株に、抗体または抗体フラグメントをコードする発現カセットを安定にトランスフェクトすると、好都合である。適切な発現カセットは、抗体重鎖および軽鎖（ｓｃＦｖの場合は単鎖）の発現を制御する一つ以上のプロモーターを、上述の選択可能マーカーと共に含有する。とりわけ有用なベクターはｐｄＨＬ２であり、これは、選択可能マーカー酵素をコードするＤＮＡ配列に作動的に連結されたプロモーターを含む選択可能マーカー遺伝子；関心対象のタンパク質をコードするＤＮＡ配列に作動的に連結されたプロモーターを持つ転写単位；選択可能マーカー遺伝子と転写単位との間にあって、選択可能マーカー遺伝子と第１転写単位の両方の転写を、第１エンハンサーの非存在下における選択可能マーカー遺伝子と第１転写単位の両方の転写と比較して刺激する、エンハンサーエレメントを含有する。
【００３８】
ベクターは、第１エンハンサーと選択可能マーカー遺伝子との間に置かれたプロモーターから構成されるブロッキングエレメントも含有し、これは、選択可能マーカー遺伝子の転写の刺激を選択的に弱めるのに潜在的に役立つ。ＶH配列およびＶL配列は、ヒト軽鎖定常領域、重鎖定常領域、および増幅可能なｄｈｆｒ遺伝子の配列（それぞれが別々のプロモーターによって制御されるもの）を含有する増幅可能ベクターであるｐｄＨＬ２に、連結することができる。Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ２：１８４，（１９９６）およびＬｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ８０：２６６０−２６６７，（１９９７）を参照されたい。このベクターは、例えばエレクトロポレーションによって、細胞にトランスフェクトすることができる。選択は、０．１μＭまたは適切な濃度のメトトレキサート（ＭＴＸ）を培養培地に添加することによって行うことができる。増幅は、ＭＴＸの濃度を３μＭまたはそれ以上まで増加させることで、段階的に行うことができる。したがって、発現カセットを安定にトランスフェクトされると共に、関心対象の抗体を構成的に発現させる細胞を、当分野では周知である方法を使って取得し、特徴づけることができる。下記実施例４も参照されたい。選択およびクローニングの後、次に、抗体発現細胞株には、Ｂｃｌ−２などの抗アポトーシス遺伝子をコードする発現ベクターを、トランスフェクトすることができる。例えば、ＳＶ４０プロモーターに融合されたＢｃｌ−２遺伝子を含有するベクターｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州カールズバッド）を、エレクトロポレーションなどの適切な方法を使って、細胞にトランスフェクトし、必要に応じて、選択および遺伝子増幅を行うことができる。
【００３９】
あるいは、適切な宿主細胞に、突然変異型Ｂｃｌ−２遺伝子などのアポトーシス阻害剤をトランスフェクトし、次に無血清培地での成長に適応させてから、所望する関心対象のタンパク質をコードする発現ベクターを、好ましくは無血清培地中で、さらにトランスフェクトすることもできる。その結果生じた細胞株を用いる抗体生産を上述のように行い、アポトーシス阻害剤を発現させない細胞における生産と比較することができる。
【００４０】
本発明を例証するために代表的な例を以下に示す。実施例１では、ＨＰＶ−１６ Ｅ６／Ｅ７をＳｐ２／０細胞に組み入れることにより、アポトーシスが減少／遅延するという特徴を示す改良型細胞クローンＳｐ−Ｅ２６がもたされることを説明する。実施例２では、ＨＰＶ−１６ Ｅ７エレメントのみの過剰発現によって宿主細胞株を改良するための方法を説明する。実施例３では、組換えＡｂを産生するトランスフェクタントを開発するための宿主としてＳｐ−Ｅ２６を使用することを説明する。実施例４では、Ｅ６／Ｅ７エレメントを同時発現させる抗体産生細胞株で観察される、強化されたＭａｂ生産を説明する。実施例５では、寿命の改良をもたらす三つの点突然変異を有する突然変異型Ｂｃｌ−２（Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ）を構成的に発現させる改変Ｓｐ２／０細胞株（Ｓｐ−ＥＥＥと呼ぶ）の生成および特徴付けを説明する。実施例６では、Ｂｃｌ−２を発現させる抗体産生細胞株の改良された成長特性を説明する。実施例７では、実施例６のＢｃｌ−２発現細胞株に観察される、強化されたＭＡｂ生産を説明する。実施例８では、低レベルの組換えタンパク質を産生する細胞クローンを、その細胞にＢｃｌ−２発現を導入することによって改良する方法を説明する。実施例９では、Ｓｐ−Ｅ２６を、その細胞にＢｃｌ−２発現を導入することによって改良するための方法を説明する。実施例１０では、組換えＡｂを産生するトランスフェクタントを開発するための宿主としてのＳｐ−ＥＥＥの使用を説明する。実施例１１では、収量を最適化するための半回分式リアクタープロファイルおよび供給スケジュールの使用を説明する。実施例１２では、無血清培地における成長およびトランスフェクションが可能なＳｐ−ＥＥＥのサブクローンの生成を説明する。
【００４１】
本明細書では、当分野で知られるアポトーシス阻害剤をコードする一つ以上の遺伝子をトランスフェクトした細胞株を使って、好ましい実施形態を例示するが、代替実施形態として、コードされるタンパク質がネイティブタンパク質と同じ生理学的機能（抗アポトーシス）を示す限り、そのような遺伝子のコード配列および／または非コード配列に、本願に係る方法および組成物の範囲内で、さまざまな置換、欠失または挿入を加え得ることは、当業者には理解されるだろう。一定の実施形態では、コードされるタンパク質が天然（野生型）タンパク質と８０％以上の配列一致度、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、最も好ましくは９９．５％以上の配列一致度を示し得る。
【００４２】
抗体
さまざまな実施形態が、関心対象のトランスフェクト細胞株から発現される抗体および／または抗体フラグメントに関し得る。「抗体」という用語は、本明細書では、抗原結合領域を持つ任意の抗体様分子を指すために使用され、これには、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）などの抗体フラグメントが包含される。抗体に基づく種々の構築物およびフラグメントを製造し使用するための技法は、当分野では周知である。抗体を製造し特徴づけるための手段も、当分野では周知である（例えばＨａｒｌｏｗｅおよびＬａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照）。有用な抗体には、数多くのさまざまな公知供給源から市販されているものもある。例えば、さまざまな抗体分泌ハイブリドーマ株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、バージニア州マナッサス）から入手することができる。例えば腫瘍関連抗原など（ただしこれに限らない）のさまざまな疾患ターゲットに対する数多くの抗体がＡＴＣＣに寄託されており、本願に係る方法および組成物で使用するために入手することができる（例えば以下の米国特許番号を参照されたい：７，０６０，８０２；７，０５６，５０９；７，０４９，０６０；７，０４５，１３２；７，０４１，８０３；７，０４１，８０２；７，０４１，２９３；７，０３８，０１８；７，０３７，４９８；７，０１２，１３３；７，００１，５９８；６，９９８，４６８；６，９９４，９７６；６，９９４，８５２；６，９８９，２４１；６，９７４，８６３；６，９６５，０１８；６，９６４，８５４；６，９６２，９８１；６，９６２，８１３；６，９５６，１０７；６，９５１，９２４；６，９４９，２４４；６，９４６，１２９；６，９４３，０２０；６，９３９，５４７；６，９２１，６４５；６，９２１，６４５；６，９２１，５３３；６，９１９，４３３；６，９１９，０７８；６，９１６，４７５；６，９０５，６８１；６，８９９，８７９；６，８９３，６２５；６，８８７，４６８；６，８８７，４６６；６，８８４，５９４；６，８８１，４０５；６，８７８，８１２；６，８７５，５８０；６，８７２，５６８；６，８６７，００６；６，８６４，０６２；６，８６１，５１１；６，８６１，２２７；６，８６１，２２６；６，８３８，２８２；６，８３５，５４９；６，８３５，３７０；６，８２４，７８０；６，８２４，７７８；６，８１２，２０６；６，７９３，９２４；８，７８３，７５８；６，７７０，４５０；６，７６７，７１１；６，７６４，６８１；６，７６４，６７９；６，７４３，８９８；６，７３３，９８１；６，７３０，３０７；６，７２０，１５；６，７１６，９６６；６，７０９，６５３；６，６９３，１７６；６，６９２，９０８；６，６８９，６０７；６，６８９，３６２；６，６８９，３５５；６，６８２，７３７；６，６８２，７３６；６，６８２，７３４；６，６７３，３４４；６，６５２，８５２；６，６３５，４８２；６，６３０，１４４；６，６１０，８３３；６，６１０，２９４；６，６０５，４４１；６，６０５，２７９；６，５９６，８５２；６，５９２，８６８；６，５７６，７４５；６，５７２；８５６；６，５６６，０７６；６，５６２，６１８；６，５４５，１３０；６，５４４，７４９；６，５３４，０５８；６，５２８，６２５；６，５２８，２６９；６，５２１，２２７；６，５１８，４０４；６，５１１，６６５；６，４９１，９１５；６，４８８，９３０；６，４８２，５９８；６，４８２，４０８；６，４７９，２４７；６，４６８，５３１；６，４６８，５２９；６，４６５，１７３；６，４６１，８２３；６，４５８，３５６；６，４５５，０４４；６，４５５，０４０；６，４５１，３１０；６，４４４，２０６；６，４４１，１４３；６，４３２，４０４；６，４３２，４０２；６，４１９，９２８；６，４１３，７２６；６，４０６，６９４；６，４０３，７７０；６，４０３，０９１；６，３９５，２７４；６，３８３，７５９；６，３８３，４８４；６，３７６，６５４；６，３７２，２１５；６，３５９，１２６；６，３５５，４８１；６，３５５，４４４；６，３５５，２４５；６，３５５，２４４；６，３４６，２４６；６，３４４，１９８；６，３４０，５７１；６，３４０，４５９（これらの米国特許はそれぞれ、抗体分泌ハイブリドーマ細胞株のＡＴＣＣ受託番号および当該抗体もしくはそのフラグメントの関連ターゲット抗原に関して、参照により本明細書に組み入れられる））。これらは典型例に過ぎず、当分野では他にも多種多様な抗体分泌ハイブリドーマが知られている。選択した関心対象の疾患関連ターゲットに対する抗体についてＡＴＣＣ、ＰｕｂＭｅｄおよび／またはＵＳＰＴＯデータベースを簡単に検索するだけで、ほとんどどの疾患関連抗原に対する抗体分泌ハイブリドーマでも入手し得ることは、当業者には理解されるだろう。当分野で周知の標準的技法を使って、クローン化抗体の抗原結合ドメインを増幅し、切り出し、発現ベクターに連結し、適応宿主細胞中に形質転換し、タンパク質生産に使用することができる。
【００４３】
抗体フラグメントの生産
本願に係る方法および／または組成物のいくつかの実施形態は、抗体フラグメントに関し得る。抗体フラグメントを生産するための典型的な方法は、米国特許第４，０３６，９４５号；米国特許第４，３３１，６４７号；Ｎｉｓｏｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ，１９６０，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，８９：２３０；Ｐｏｒｔｅｒ，１９５９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，７３：１１９；Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６７，ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ｐａｇｅ ４２２（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、およびＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９１，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）に開示されている。
【００４４】
抗体フラグメントを形成させる他の方法、例えば、一価軽鎖−重鎖フラグメントを形成させるための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、または他の酵素的、化学的もしくは遺伝子技法も、そのフラグメントが完全な抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用することができる。例えばＦｖフラグメントはＶH鎖とＶL鎖の会合体を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．，１９７２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２６５９に記述されているように、非共有結合的であることができる。あるいは、可変鎖を分子間ジスルフィド結合によって連結するか、グルタルアルデヒドなどの化学薬品によって架橋してもよい。Ｓａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照されたい。
【００４５】
好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによってつながれたＶH鎖およびＶL鎖を含む。これらの単鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドリンカー配列でつながれたＶHおよびＶLドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって製造される。構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、次にその発現ベクターを宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は、上記二つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを持つ一本のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生産するための方法は当分野では周知である。Ｗｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：９７；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３；米国特許第４，９４６，７７８号；Ｐａｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１２７１、およびＳａｎｄｈｕ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：４３７を参照されたい。
【００４６】
抗体フラグメントのもう一つの形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、関心対象の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使って抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することなどによって製造される。Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｍｅｔｈｏｄｓ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６；Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ，ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，ｐａｇｅｓ １６６−１７９（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９５，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ｐａｇｅｓ １３７−１８５（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照されたい。抗体分泌ハイブリドーマ細胞株が公開されている場合は、抗原結合特異性をコードするＣＤＲ配列を入手し、それをキメラ抗体またはヒト化抗体に組み入れて、使用することができる。
【００４７】
キメラ抗体およびヒト化抗体
キメラ抗体は、ヒト抗体の可変領域が、例えば、マウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むマウス抗体の可変領域で置き換えられている組換えタンパク質である。キメラ抗体は、対象に投与された場合に、低下した免疫原性と、増加した安定性とを示す。キメラ抗体を構築するための方法は当分野では周知である（例えばＬｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １３：４６９）。
【００４８】
マウス免疫グロブリンの可変重鎖および可変軽鎖に由来するマウスＣＤＲを、ヒト抗体の対応する可変ドメイン中に移すことにより、キメラモノクローナル抗体をヒト化することができる。キメラモノクローナル抗体中のマウスフレームワーク領域（ＦＲ）もヒトＦＲ配列で置き換えられる。ヒト化モノクローナルの安定性および抗原特異性を保存するために、一つ以上のヒトＦＲ残基をマウスの対応する残基で置き換えてもよい。ヒト化モノクローナル抗体は対象の治療的処置に使用することができる。ＣＤＲ配列の選ばれた修飾によって、ターゲットに対するヒト化抗体のアフィニティを増加させることもできる（ＷＯ００２９５８４Ａ１）。ヒト化モノクローナル抗体を生産するための技法は当分野では周知である（例えばＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｓａｎｄｈｕ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１９９２，１２：４３７；Ｔｅｍｐｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：２６６；Ｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９３，１５０：２８４４を参照されたい）。
【００４９】
別の実施形態は非ヒト霊長類抗体に関し得る。治療的に有用な抗体をヒヒで生じさせるための一般技法は、例えばＧｏｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ９１／１１４６５（１９９１）、およびＬｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４６：３１０（１９９０）に見出すことができる。
【００５０】
ヒト抗体
コンビナトリアルアプローチまたはヒト免疫グロブリン遺伝子座で形質転換されたトランスジェニック動物を使って完全ヒト抗体を生産するための方法は、当分野では知られている（例えばＭａｎｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎｅｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７：３１５−２８；ＣｏｎｒａｄおよびＳｃｈｅｌｌｅｒ，２００５，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ．８：１１７−２６；ＢｒｅｋｋｅおよびＬｏｓｅｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．３：５４４−５０；それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）。そのような完全ヒト抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体よりもさらに少ない副作用を示し、インビボでは基本的に内在性ヒト抗体のように機能すると予想される。一定の実施形態において、本願に係る方法および手法は、そのような技法によって生産されるヒト抗体を利用し得る。
【００５１】
代替方法の一つでは、ファージディスプレイ技法を使って、ヒト抗体を生成させることができる（例えばＤａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．４：１２６−４０、これは参照により本明細書に組み入れられる）。ヒト抗体は、正常なヒトから、またはがんなどの特定疾患状態を示すヒトから、生成させることができる（Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。罹患個体からヒト抗体を構築することの利点は、循環抗体レパートリーが疾患関連抗原に対する抗体に偏っている可能性があることである。
【００５２】
この方法論に限定されない一例として、Ｄａｎｔａｓ−Ｂａｒｂｏｓａ ｅｔ ａｌ．（２００５）は、骨肉腫患者からヒトＦａｂ抗体フラグメントのファージディスプレイライブラリーを構築した。概説すると、循環血リンパ球から全ＲＮＡが得られた（前掲書）。組換えＦａｂがμ鎖、γ鎖およびκ鎖抗体レパートリーからクローニングされ、ファージディスプレイライブラリーに挿入された（前掲書）。重鎖および軽鎖免疫グロブリン配列に対する特異的プライマーを使って、ＲＮＡがｃＤＮＡに変換され、Ｆａｂ ｃＤＮＡライブラリーの作製に使用された（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−９７、これは参照により本明細書に組み入れられる）。ライブラリーの構築は、Ａｎｄｒｉｓ−Ｗｉｄｈｏｐｆ ｅｔ ａｌ．（２０００、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）の９．１〜９．２２頁、これは参照により本明細書に組み入れられる）に従って行われた。最終Ｆａｂフラグメントを制限エンドヌクレアーゼで消化し、バクテリオファージゲノムに挿入することによって、ファージディスプレイライブラリーが作製された。そのようなライブラリーは、当分野で知られる標準的なファージディスプレイ法によってスクリーニングすることができる。この技法は典型例に過ぎず、ファージディスプレイによってヒト抗体または抗体フラグメントを作製しスクリーニングするための既知の方法をどれでも利用し得ることは、当業者には理解されるだろう。
【００５３】
もう一つの代替方法として、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたトランスジェニック動物を使用することにより、基本的に任意の免疫原ターゲットに対する抗体を、標準的な免疫化プロトコールを使って生成させることができる。そのようなシステムの限定でない一例は、Ａｂｇｅｎｉｘ（カリフォルニア州フリーモント）のＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（例えば、Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１：１１−２３、これは参照により本明細書に組み入れられる）である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）および類似の動物では、マウス抗体遺伝子が不活化されて、機能的なヒト抗体遺伝子で置き換えられているが、マウス免疫系の残りの部分は完全なまま保たれている。
【００５４】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、可変領域配列の大部分を補助遺伝子および調節配列に沿って含んでいるヒトＩｇＨ遺伝子座およびＩｇκ遺伝子座の一部を含有する生殖細胞系列構成のＹＡＣ（酵母人工染色体）で、形質転換された。そのヒト可変領域レパートリーを使って抗体産生Ｂ細胞を生成させることができ、それを既知の技術によってハイブリドーマに加工することができる。ターゲット抗原で免疫されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、通常の免疫応答によってヒト抗体を産生し、それは、上述の標準的技法によって収集および／または生産することができる。さまざまなＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株を利用することができ、それらはそれぞれが、異なる抗体クラスを産生する能力を持つ。そのようなヒト抗体は、化学的架橋または他の既知の方法論によって、他の分子にカップリングすることができる。トランスジェニックに生産されたヒト抗体は、通常のヒト抗体の薬物動態特性を保ちつつ、治療薬としての可能性を持つことが示されている（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。本願に係る組成物および方法がＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）システムの使用に限定されることはなく、ヒト抗体を産生するように遺伝子操作されている任意のトランスジェニック動物を利用し得ることは、当業者には理解されるだろう。
【実施例１】
【００５５】
ＨＰＶ−１６ Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子の安定発現によるアポトーシス耐性細胞クローンの生成
ＣＨＸ処理に耐性な細胞クローンの選択
ＨＰＶ−１６ Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子の発現カセットを含有するＬＸＳＮレトロウイルスベクターを、１０：１のＭＯＩ（多重感染度）で、Ｓｐ２／０細胞に形質導入した。２４時間の回復後に、感染細胞をＧ４１８（１０００μｇ／ｍｌ）中で１０日間選択した。Ｇ４１８耐性細胞を限界希釈法（０．５細胞／ウェル）により９６ウェル細胞培養プレートでクローニングした。安定な感染物を、強力なアポトーシス誘導剤シクロヘキシミド（ＣＨＸ）による処理に対する耐性についてスクリーニングした。簡単に述べると、健常細胞（生存率＞９５％、図１ＣおよびＤ）を、２５μｇ／ｍｌのＣＨＸを含有する培地中でインキュベートし、細胞形態を顕微鏡で調べた。２〜３時間のインキュベーション後に５０％を超える親Ｓｐ２／０細胞が形態変化を起こし、断片化したが（図１Ａ）、いくつかのＥ６／Ｅ７トランスフェクトクローンは形態変化の程度が小さく、アポトーシスに対する耐性を示した。Ｓｐ−Ｅ２６と呼ぶ最良のクローンは、４時間処理しても、明白な形態変化を示さなかった（図１Ｂ）。
【００５６】
冗長な目視検査を避けるために、ＭＴＴアッセイを使って、生存細胞集団における変化にアクセスした。健常細胞を通常の培養条件下にＣＨＸありまたはＣＨＸなしで２〜３時間インキュベートした後、ＭＴＴ色素をウェルに加えた。さらに２時間インキュベートした後、ＳＤＳおよびＨＣｌを含有する溶解バッファーを加えることによって、細胞を可溶化した。プレートを３７℃で終夜インキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使って、ＯＤの読み取りを５９０ｎｍで行った。図２に示すように、Ｓｐ２／０細胞をＣＸＨで処理した場合、生存細胞集団は有意に減少した。これに対し、同じ処理条件（ＣＨＸの濃度および時間）下で、Ｓｐ−Ｅ２６細胞は、ＣＨＸ処理に対して、より良く耐えた。この方法により、多数のクローンをスクリーニングし、さらなる分析のために選択することができる（図２）。
【００５７】
Ｓｐ−Ｅ２６の抗アポトーシス特性
Ｓｐ−Ｅ２６細胞および親Ｓｐ２／０細胞におけるＣＨＸ誘導アポトーシスを、アネキシンＶ染色およびＤＮＡ断片化アッセイによって評価した。２５μｇ／ｍｌのＣＨＸを含有する培地中でインキュベートした後、細胞を収集し、Ｇｕａｖａネキシン試薬で染色し（アネキシンＶ染色と等価）、Ｇｕａｖａ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓシステム（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分析した。図３は、ＣＨＸ処理に約１．５時間ばく露した場合、３０％を上回るＳｐ２／０細胞がアネキシンＶ陽性になってアポトーシスを示すのに対して、Ｓｐ−Ｅ２６は健常なままで、初期アポトーシス細胞の増加を示さなかったことを表している。
【００５８】
ＣＨＸによるアポトーシスの誘導は、アポトーシスの特徴である細胞内オリゴヌクレオソームＤＮＡフラグメントの形成を分析することによって明らかにすることができる。ＣＨＸ処理したおよび無処理のＳｐ−Ｅ２６細胞およびＳｐ２／０細胞から細胞ＤＮＡを抽出し、ＤＮＡラダーリングアッセイを行った。ＣＨＸで処理したＳｐ２／０細胞では、大規模なＤＮＡ断片化が検出された（図４）。これに対し、同一の処理条件で、Ｓｐ−Ｅ２６のゲノムＤＮＡは完全なままであり、ＤＮＡ断片化の外観を示さなかった（図４）。
【００５９】
Ｓｐ−Ｅ２６細胞におけるＨＰＶ Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子の存在
Ｓｐ−Ｅ２６細胞のゲノム中にＥ６遺伝子およびＥ７遺伝子が安定に存在することを確認するために、Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、Ｓｐ−Ｅ２６から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとするＰＣＲ反応に使用したところ、約７００ｂｐのＤＮＡフラグメントが生じた。そのＰＣＲ産物をクローニングし、ＤＮＡ配列決定により、Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子であることを確認した。Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子は、親Ｓｐ２／０細胞には検出されなかった。
【００６０】
Ｓｐ−Ｅ２６の改良された成長特性
Ｓｐ−Ｅ２６の成長特性をＴフラスコ（図５）および３Ｌ回分式バイオリアクター（図６）で評価した。Ｓｐ−Ｅ２６は、回分培養において親Ｓｐ２／０に比べて改良された成長特性を示し、より高い最大細胞密度と、より長い生存期間を達成した。
【実施例２】
【００６１】
ＨＰＶ１６ Ｅ７遺伝子の安定過剰発現によるアポトーシス耐性細胞クローンの生成
クローンＳｐ−Ｅ２６のゲノムに組み込まれたポリシストロン性のＨＰＶ１６ Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子の構造を、プライマーペアＥ６−Ｎ８+（ＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＡＣＣＣＡＣＡＧＧＡＧＣＧＡ；配列番号８）およびＥ７−Ｃ８-（ＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡ ＡＣＡＧＡＴＧＧＧ；配列番号９）を用いるＰＣＲならびにＤＮＡ配列決定によって分析した。プライマーＥ６−Ｎ８+およびＥ７−Ｃ８-の配列は、それぞれＥ６のＮ末端の８アミノ酸残のコード配列およびＥ７のＣ末端の８コドンの相補配列と合致するので、完全長Ｅ６およびＥ７のアンプリコンは、約８５０ｂｐであると予想される。しかし、Ｅ６−Ｎ８+およびＥ７−Ｃ８-を使ってＳｐ−Ｅ２６細胞から調製されたゲノムＤＮＡを増幅したところ、約７００ｂｐしかないＰＣＲフラグメントが得られた。この７００ｂｐ ＰＣＲ産物をＤＮＡ配列決定したところ、１８２ポリヌクレオチドフラグメントがＥ６遺伝子から欠失していることが明らかになった。この欠損Ｅ６遺伝子は、おそらくスプライシングによって生じたものと思われ、Ｎ末端の４３アミノ酸残基を持つ切断型Ｅ６ペプチドをコードする。Ｅ６に起因すると考えられる主な生理学的活性が、ｐ５３発現をダウンレギュートするその能力であることを考慮すると、この切断型Ｅ６タンパク質はおそらく完全には機能しないだろう。なぜなら、Ｓｐ−Ｅ２６におけるｐ５３の発現レベルは、Ｓｐ２／０における発現レベルよりも安定していることがわかったからである。
【００６２】
そこで、抗アポトーシス作用を持ち、Ｓｐ２／０細胞の成長特性を改良するには、ＨＰＶ−１６ Ｅ７遺伝子だけで十分であるかどうかを調べるために、ＨＰＶ−１６ Ｅ７によるＳｐ２／０細胞のトランスフェクションを、以下のように行う：
（ｉ）Ｅ７をコードするＤＮＡ配列をＳｐ−Ｅ２６細胞からＲＴ−ＰＣＲによってクローニングする。哺乳類発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）への遺伝子の連結が容易になるように、適切な制限部位を導入する。Ｅ７ｐＲｃと名付けたベクター内のウイルス遺伝子の転写は、ＣＭＶプロモーター−エンハンサー配列から指示される。このベクターはネオマイシン耐性を付与する遺伝子も含有し、その遺伝子はＳＶ４０プロモーターから転写される。
（ｉｉ）ＨＰＶ−１６ Ｅ７遺伝子の発現カセットを含有する発現ベクターをＳｐ２／０細胞にトランスフェクトする。簡単に述べると、５μｇのＥ７ｐＲｃをＳｃａＩで線状化し、エレクトロポレーションによって細胞にトランスフェクトする。
（ｉｉｉ）２４時間の回復後に、トランスフェクト細胞をＧ４１８（１０００μｇ／ｍｌ）中で１０日間選択する。
（ｉｖ）次にＧ４１８耐性細胞を、限界希釈法（０．５細胞／ウェル）により、９６ウェル細胞培養プレートでクローニングする。安定なトランスフェクタントを選択し、強力なアポトーシス誘導剤であるシクロヘキシミド（ＣＨＸ）による処理に対する耐性についてスクリーニングする。
（ｖ）健常細胞（生存率＞９５％）を、２５μｇ／ｍｌのＣＨＸを含有する培地中、またはＣＨＸの非存在下に、通常の培養条件で３〜４時間インキュベートした後、ウェルにＭＴＴ色素を添加する。さらに２時間インキュベートしてから、ＳＤＳおよびＨＣｌを含有する溶解バッファーを加えることにより、細胞を可溶化する。プレートを３７℃で終夜インキュベートし、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使ってＯＤの読み取りを５９０ｎｍで行う。ＣＨＸ処理に対して耐性を示す細胞クローンを選択し、さらなる分析のために拡大する。
（ｖｉ）Ｅ７−トランスフェクト細胞の抗アポトーシス特性を、アネキシンＶ染色およびＤＮＡ断片化アッセイによって評価する。アネキシンＶアッセイでは、２５μｇ／ｍｌのＣＨＸを含有する培地中でインキュベートしてから、細胞を収集し、Ｇｕａｖａネキシン試薬で染色し（アネキシンＶ染色と等価）、Ｇｕａｖａ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓシステム（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）で分析する。ＤＮＡ断片化アッセイでは、ＣＨＸ処理したおよび無処理のＥ７−トランスフェクタントおよびＳｐ２／０細胞から細胞ＤＮＡを抽出し、それをアガロースゲル電気泳動で分析する。
（ｖｉｉ）Ｅ７−トランスフェクタントにおけるウイルスがん遺伝子の発現を、サザンブロット（ゲノムレベル）分析、ノーザンブロット（ｍＲＮＡレベル）分析、およびイムノブロット（タンパク質レベル）分析によって評価する。アポトーシス過程に関与しＥ７タンパク質による影響を受ける細胞内タンパク質の発現を、イムノブロッティング分析によって調べる。
（ｖｉｉｉ）選択したＥ７−トランスフェクタントの成長特性を、Ｔフラスコおよび３Ｌ回分式バイオリアクターで評価する。トランスフェクタントは、回分培養した親Ｓｐ２／０と比較して、改良された成長特性を示す。すなわち、より高い最大細胞密度と、より長い生存期間とを達成する。
【実施例３】
【００６３】
Ｓｐ−Ｅ２６におけるｈＬＬ２ ＩｇＧの高レベル発現
この実施例では、ＮＨＬおよび自己免疫疾患を持つ患者を処置するために開発されたヒト化抗ＣＤ２２ ＡｂであるｈＬＬ２を産生する細胞クローンを生成させるために、Ｓｐ−Ｅ２６を宿主として使用する。ｈＬＬ２産生クローン８７−２−Ｃ９は、Ｓｐ２／０細胞を宿主として使用することによって、以前に生成されており（Ｌｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ ８０，２６６０−２６６６，１９９７）、その例では、トランスフェクション後に陽性クローンが一つだけ同定され（約２．５×１０-7の頻度）、増幅前のその唯一のｈＬＬ２産生クローンの最大生産性（Ｐmax）（Ｔフラスコにおける調整終末培養培地中の抗体濃度と定義される）は、１．４ｍｇ／Ｌだった。Ｌｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．が記述した手法（Ｃａｎｃｅｒ ８０，２６６０−２６６６，１９９７）と同様の手法を使って、同じｈＬＬ２ｐｄＨＬ２ベクターをＳｐ−Ｅ２６細胞にトランスフェクトしたところ、２００を超える安定なｈＬＬ２産生クローンが得られた（頻度＞１０-4）。ランダムに選択した１２個のクローンのＰmaxを評価したところ、１３〜１７０ｍｇ／Ｌ（平均５０ｍｇ／Ｌ）の範囲にあることが分かった。これらのクローンの生産性は、ＭＴＸを使った遺伝子増幅によって、さらに強化することができる。この実施例により、組換えタンパク質を産生する細胞クローンを開発するための宿主としてＳｐ−Ｅ２６を使用することの（その親Ｓｐ２／０細胞と比較した場合の）利点が実証された。
【実施例４】
【００６４】
ＨＰＶ１６ Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子の安定発現によるＡｂ産生細胞株の改良
６０７−３ｕ−８細胞は、もともと、ヒト化モノクローナルＡｂを生産するために、トランスフェクションによって、Ｓｐ２／０から生成された細胞である。このクローンは、遺伝子増幅（ＭＴＸを使用）およびサブクローニングによって開発されものであり、最大（Ａｂ）生産性は１５０ｍｇ／Ｌまで強化されたが、培養培地への血清添加を断つと約１００ｍｇ／Ｌに低下した。無血清条件下でより高い抗体生産性を得るために、ＨＰＶ−１６のＥ６／Ｅ７遺伝子を６０７−３ｕ−８細胞に導入し、Ａｂ生産性に対するＥ６／Ｅ７の作用を以下のように評価した。
【００６５】
１０％ＦＢＳおよび３μＭ ＭＴＸを添加したＨＳＦＭで維持した６０７−３ｕ−８細胞に、ＨＰＶ−１６ Ｅ６遺伝子およびＥ７遺伝子の発現カセットを含有するＬＸＳＮレトロウイルスベクターを、１０：１のＭＯＩで形質導入した。２４時間回復させた後、安定にトランスフェクトされた細胞をＧ４１８（４００μｇ／ｍｌ）中で１０日間選択した。Ｇ４１８耐性細胞を、限界希釈法（０．５細胞／ウェル）により、９６ウェル細胞培養プレートでサブクローニングした。生き残ったクローン（６０７Ｅ１Ｃ１２と命名）を評価のために得た。Ｅ６／Ｅ７トランスフェクションを伴わない６０７−３ｕ−８−７Ｇ７および６０７−３ｕ−８−２Ｄ１０と名付けた６０７−３ｕ−８の二つのサブクローンも選択した。これら三つのクローンのＰmaxを決定したところ、有意差はなかった（表１）。
【００６６】
これらの結果は、この細胞にＥ６／Ｅ７遺伝子を導入しても、Ａｂを産生する細胞の能力は変化しないことを示唆している。次に、６０７Ｅ１Ｃ１２、６０７−３ｕ−８−７Ｇ７および６０７−３ｕ−８−２Ｄ１０を無血清培地中で成長するように適応させ、これらのクローンの生産性を決定した。全ての細胞が無血清培地でよく成長していた。クローン６０７Ｅ１Ｃ１２の最終抗体生産性は１５０ｍｇ／Ｌに維持されたが、Ｅ６／Ｅ７を持たない二つのクローンはかなり減少した。また、６０７Ｅ１Ｃ１２の生産性は、凍結（冷凍保存のため）と融解サイクルの後も、安定だった（表１）。
【００６７】
【表１】
【実施例５】
【００６８】
突然変異型Ｂｃｌ−２を構成的に発現させる遺伝子改変Ｓｐ２／０細胞株の生成および特徴付け
三つの点突然変異（Ｔ６９Ｅ、Ｓ７０ＥおよびＳ８７Ｅ）を有する突然変異型Ｂｃｌ−２は、野生型および単一点突然変異体と比較して、有意に高い抗アポトーシス活性を示すことを、証拠が示唆している（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０１：１５３−１５８，２００４）。そこで、この三重突然変異体（Ｂｃｌ−２−ＥＥＥと呼ぶ）の発現ベクターを構築し、それを使って、（特にバイオリアクターにおける）生存および生産性を増加させるために、Ｓｐ２／０細胞のトランスフェクションを行った。クローンを単離し、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ発現レベル、成長およびアポトーシス特性について評価した。Ｂｃｌ−２−ＥＥＥの核酸配列を配列番号３に示し、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥタンパク質の対応するアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００６９】
ヒトＢｃｌ−２のアミノ酸残基６４〜１０１のコード配列に基づいて、１１６ｂｐの合成ＤＮＡ二重鎖を設計した。残基６９、７０および８７のコドンを全て、グルタミン酸（Ｅ）のコドンに変えた。この配列全体は並外れてＧＣリッチであり、数多くのポリＧ区間およびポリＣ区間を持っていた。いくつかのコドンに保存的置換を施して、ＧおよびＣの連続を中断させ、全体のＧＣ含量を減少させた。
【００７０】
合わせると上記１１６ｂｐ配列をまたぎ、３’末端の２２ｂｐ分が重複している、二つの８０マーオリゴヌクレオチドを合成した（配列番号５および配列番号６を参照されたい）。これらのオリゴヌクレオチドをアニールさせ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いるプライマー伸長によって二重鎖ＤＮＡを生成させた。その二重鎖を、ＰＣＲプライマーＢｃｌ−２−ＥＥＥ ＰＣＲ Ｌｅｆｔ（ＴＡＴＡＴＧＧＡＣＣＣＧＧＴＣＧＣＣＡＧＡＧＡＡＧ；配列番号１０）およびＢｃｌ−２−ＥＥＥ ＰＣＲ Ｒｉｇｈｔ（ＴＴＡＡＴＣＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＧＴＣ；配列番号１１）を使って、増幅した。
【００７１】
次に、その１２６ｂｐアンプリマーをｐＧｅｍＴ ＰＣＲクローニングベクターにクローニングした。Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ−ｐＧｅｍＴをＴｔｈＩ制限エンドヌクレアーゼおよびＮｇｏＭＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、１０５ｂｐフラグメントをゲル単離し、ＴｔｈＩおよびＭｇｏＭＩで消化したｈＢｃｌ−２−ｐｕｃ１９ベクター（ＡＴＣＣ ７９８０４）と連結することにより、ｈＢｃｌ−２（ＥＥＥ）−ｐｕｃ１９を生成させた。この構築物の配列を確認した。
【００７２】
９４８ｂｐのインサートフラグメントをｈＢｃｌ−２（ＥＥＥ）−ｐｕｃ１９からＥｃｏＲＩで切り出し、ＥｃｏＲＩで消化しアルカリホスファターゼで処理したｐＺｅｏＳＶ２＋ベクターと連結した。その結果得られた構築物がｈＢｃｌ−２（ＥＥＥ）−ｐＺｅｏＳＶ２＋である。
【００７３】
次に、Ｓｐ２／０細胞（５．６×１０6）に６０μｇのｈＢｃｌ−２（ＥＥＥ）−ｐＺｅｏＳＶ２＋を、エレクトロポレーションにより、Ｓｐ２／０細胞用の標準的プロトコールに従ってトランスフェクトした。細胞を６枚の９６ウェルプレートにプレーティングし、それを選択なしで４８時間インキュベートした。２日後に、８００μｇ／ｍｌのゼオシンを培地に加えた。
【００７４】
４０ウェルからの細胞を２４ウェルプレートに拡大し、ウェスタンブロットにより、抗ｈＢｃｌ−２および抗βアクチンを使って分析した。４０ウェルのうち５ウェルを除く全てが、中〜高レベルのＢｃｌ−２−ＥＥＥ発現を示した。４枚のゲルのうち１枚について、結果を図７に示す。野生型Ｂｃｌ−２が前もってトランスフェクトされているＳｐ２／０由来のｈＭＮ１４細胞株（クローン６６４．Ｂ４）を、陽性対照（＋）として使用した。Ｄｅｎｇらによって実証されたように、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥはＳＤＳ−ＰＡＧＥで野生型Ｂｃｌ−２よりもわずかに遅く移動する。
【００７５】
三つの強く陽性なウェル（＃７、＃２５および＃８７）をさらなる評価とサブクローニングのために選択した。限界希釈プレーティングにより、１枚の９６ウェルプレートにつき２０未満の陽性ウェルを得たことから、個々のウェル中の細胞が実際にクローニングされている可能性は極めて高い（＞９９％）ことが示された。まず、もとの３ウェルから得た２３のサブクローンを、抗ｈＢｃｌ−２−ＰＥを使って、Ｇｕａｖａ Ｅｘｐｒｅｓｓで分析した（図８）。その結果、元のウェルは混合された細胞クローンを含有していることが確認された。ウェル＃７は最も強いシグナルを持つクローンをもたらし、ウェル＃２５は最も低いシグナルを持つクローンを含んでいた。クローン７−１２、７−１６、８７−２および８７−１０をさらなる分析のために拡大した。次に、初期の成長速度が遅いいくつかのサブクローンを同様に分析したところ、一つのクローン８７−２９が、他のどのクローンよりも２０％高いシグナルを与えたので、それを、さらなる分析のために拡大した。
【００７６】
二つの高発現ＳＰ−ＥＥＥクローン（８７−２９および７−１６）を非トランスフェクトＳｐ２／０、ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ細胞と比較した（図９）。Ｓｐ−ＥＥＥクローンは、Ｒａｊｉ細胞およびＤａｕｊｉ細胞（これらはどちらもおそらく正常細胞レベルのＢｃｌ−２を発現させることが知られている）より約２０倍高く発現させる。Ｓｐ２／０細胞は陰性だった。このことは、抗Ｂｃｌ−２イムノブロットによって、さらに実証された（図１０）。Ｂｃｌ−２は、ヒトＢｃｌ−２特異的抗体では、タンパク質負荷量を多くし（５０Ｋ細胞）、Ｘ線フィルムを長く露光しても、Ｓｐ２／０細胞中に検出されなかった。マウス、ラットおよびヒトＢｃｌ−２を認識する抗Ｂｃｌ−２ ＭＡｂ（Ｃ−２、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によるイムノブロット分析では、タンパク質負荷量を多くし（１００Ｋ細胞）、Ｘ線フィルムを長く露光しても、非トランスフェクトＳｐ２／０細胞からＢｃｌ−２は検出されなかった（図１０Ｂ）。Ｓｐ２／０細胞中で発現されるＢｃｌ−２があるとすれば、それは、クローン８７−２９におけるＢｃｌ−２−ＥＥＥよりも２桁以上の低いレベルである。
【００７７】
五つのＳｐ−ＥＥＥサブクローンおよびＳｐ２／０細胞について成長曲線を比較した。三つのＳｐ−ＥＥＥサブクローンは、Ｓｐ２／０細胞に対して明確な優位性を示した。これらの三つ（７−１２、７−１６および８７−２９）は、最も高レベルのＢｃｌ−２−ＥＥＥも発現させる。７−１２および７−１６は、同じもとのウェルに由来し、ほぼ同一の性質（Ｂｃｌ−２−ＥＥＥレベルおよび成長曲線）を持つので、これらはおそらく同じ発端クローンから派生したのだろう。最もよい二つのＳＰ−ＥＥＥサブクローン７−１６および８７−２９をさらなる評価に使用した。
【００７８】
１０％、１％または０％血清を添加した培地にクローンをプレーティングし（前適応ステップなし）、細胞密度および生存率を監視した。１０％血清では、８７−２９は高密度まで成長し、Ｓｐ２／０細胞と比較して生存は４日以上増加した（図１１）。１％血清では、全ての細胞が１０％血清で達成された密度の約３５〜４０％まで成長し、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥトランスフェクタントはＳｐ２／０に対して生存面で類似の優位性を持っていた（図１２）。無血清培地に直接移すと、Ｓｐ２／０細胞は６００Ｋ細胞／ｍｌまでしか成長しなかったが、８７−２９細胞は２倍高い密度まで成長した（図１３）。各血清濃度において、８７−２９細胞はＳｐ２／０細胞より４〜６日間長く生存した。
【００７９】
メトトレキサート（ＭＴＸ）感受性を８７−２９について決定した（図１４）。このデータは、ＭＴＸ耐性クローンの初期選択には、０．０４μＭという最小ＭＴＸ濃度で十分であることを示唆している。したがって、Ｓｐ２／０細胞に用いられるものと同じ選択および増幅プロトコールを、Ｓｐ−ＥＥＥ細胞にも使用することができる。
【００８０】
Ｂｃｌ−２は生存促進／抗アポトーシスタンパク質である。フレキシブルループドメイン（ＦＬＤ）を欠くＢｃｌ−２欠失突然変異体が強化されたアポトーシス阻害能力を持つことは、数グループによって実証されている（Ｆｉｇｕｅｒｏａ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７３，２１１−２２２；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＥＭＢＯ Ｊ．，１６，９６８−９７７）。さらに最近になって、Ｂｃｌ−２のＦＬＤ中の１〜３個のＳ／Ｔ残基がグルタミン酸に突然変異すると（これはリン酸化を模倣している）、その抗アポトーシス能力は著しく強化されることが、実証された（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，ＰＮＡＳ，１０１，１５３−１５８）。三重突然変異体（Ｔ６９Ｅ、Ｓ７０ＥおよびＳ８７Ｅ）は、最も著しい生存強化をもたらした。ここでは、類似のＢｃｌ−２三重突然変異体構築物（Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ）を使って、Ｓｐ２／０細胞を安定にトランスフェクトした。
【００８１】
上述の実験は全て、Ｂｃｌ−２−ＥＥＥの発現がＳｐ２／０細胞におけるアポトーシス速度を低下させることを実証している。発現レベルが高いクローンは低レベルのクローンより長く生きたので、この作用はおおむね用量依存的だった。最も良いクローン８７−２９は、非トランスフェクトＳｐ２／０細胞と比較して、１５〜２０％高い細胞密度まで成長し、４〜６日間長く生存する。
【００８２】
クローン（８７−２９）中のＢｃｌ−２−ＥＥＥレベルは、Ｄａｕｄｉ細胞またはＲａｊｉ細胞における正常レベルより、約２０倍高い。非トランスフェクトＳｐ２／０細胞ではＢｃｌ−２発現は検出されなかった。実施例６で述べるように、ｈＭＮ−１４発現Ｓｐ２／０細胞に、野生型Ｂｃｌ−２を発現させるための類似の構築物をトランスフェクトし、並外れた成長特性と強化された生産性とを持つクローンを単離した。このクローン（６６４．Ｂ４）をＭＴＸでさらに増幅させたところ、Ｂｃｌ−２レベルは著しく増加した。最後に、増幅された（３μＭ ＭＴＸ）細胞株をサブクローニングしたところ、あるクローン（６６４．Ｂ４．１Ｃ１）のＢｃｌ−２レベルは、６６４．Ｂ４より２倍高かった。この特定サブクローンは、優れた生産性および成長特性を持つ。８７−２９におけるＢｃｌ−２−ＥＥＥレベルは、増幅された６６４．Ｂ４．１Ｃ１中のＢｃｌ−２レベルより、約２倍高い。８７−２９細胞は、Ｓｐ２／０細胞の成長速度に匹敵する成長速度を持ち、Ｓｐ２／０と比較して、見かけ上、一日は余分に成長を続けることができ、１５〜２０％高い最大密度に到達することができる。類似する性質が、Ｅ６／Ｅ７発現Ｓｐ−Ｅ２６細胞株でも見出された。親Ｓｐ２／０細胞よりも４〜６日長く生存するＢｃｌ−２−ＥＥＥ発現８７−２９クローンは、１日しか余分に生存しないＳｐ−Ｅ２６クローンより優れている。
【００８３】
８７−２９クローンに代表されるＳｐ−ＥＥＥ細胞株は、組換えタンパク質をコードする遺伝子を含有する適切なベクターによるトランスフェクション時にその組換えタンパク質を発現させるためのアポトーシス耐性宿主として有用である。この細胞株が有用であるためには、それが、トランスフェクションおよび増幅後ならびに延長された培養中に、そのＢｃｌ−２−ＥＥＥ発現および生存面の優位性を維持しなければならない。安定にトランスフェクトされたＢｃｌ−２−ＥＥＥ遺伝子がその後のトランスフェクション中に失われることはなさそうであるから、生存特性は減少しないはずである。ＭＴＸ増幅は、Ｂｃｌ−２タンパク質の発現を増加させることによって、産生クローンの生存をさらに改良し得ると考えられる。実際、野生型Ｂｃｌ−２をトランスフェクトしたｈＭＮ−１４ ６６４．Ｂ４細胞株の場合は、これが当てはまった。増幅およびサブクローニング後に、Ｂｃｌ−２レベルは数倍増加し、細胞生存は著しく改良された。
【００８４】
最終Ｓｐ／ＥＥＥクローン（＃８７−２９）は、親Ｓｐ２／０細胞に匹敵する成長速度を持つ。しかし、Ｓｐ／ＥＥＥ ８７−２９細胞は、Ｓｐ２／０と比較して、１日は余分に成長し続け、１５〜２０％高い最大密度に到達し、４〜６日は余分な生存を示す。さらに、Ｓｐ／ＥＥＥ細胞株は、血清欠乏に対して、Ｓｐ２／０細胞よりもかなり耐性が高かった。
【実施例６】
【００８５】
ヒトＢｃｌ−２遺伝子の安定発現による静置回分培養におけるＡｂ産生細胞生存の改良
Ｂｃｌ−２−トランスフェクト細胞クローンの生成
細胞クローン６６５．２Ｂ９は、もともと、ヒト化モノクローナル抗ＣＥＡ Ａｂを生産するために、トランスフェクションによって、Ｓｐ２／０から生成させた細胞である（Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，未公表の結果）。ｈＭＮ１４ｐｄＨＬ２と呼ばれるベクターを使ってＳｐ２／０細胞をトランスフェクトすることにより、細胞クローン６６５．２Ｂ９が得られた。ｐｄＨＬ２ベクターはＧｉｌｌｉｅｓらが初めて記述したベクターであり、メトトレキサート処理による後続の選択および増幅を可能にする増幅可能なマウスｄｈｆｒ遺伝子を持っていた（Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１（１９８９））。一般に、ｐｄＨＬ２ベクターは、二つのメタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーターとＩｇＨエンハンサーとによって独立して制御されるＩｇＧ重鎖および軽鎖遺伝子の両方の発現をもたらす。ｈＭＮ１４ｐｄＨＬ２ベクターの図解を図１６に示す。配列番号１はこのベクターの配列を表し、配列番号２はエンハンサー配列と定義される７２ｂｐ配列を表す。プロモーター配列はｈＭＮ１４ｐｄＨＬ２のｎｔ２９０８〜２９７９に相当する。
【００８６】
一般に、Ｓｐ２／０細胞には、この例で使用するｈＭＮ１４ｐｄＨＬ２ベクターなどの線状化ｐｄＨＬ２ベクターを、エレクトロポレーションによってトランスフェクトすることができる。選択は、トランスフェクションの４８時間後に、０．０５〜０．１μＭ ＭＴＸを含有する培地と共に細胞をインキュベートすることによって開始することができる。挿入された抗体配列の増幅は、ＭＴＸ濃度を５μＭまで段階的に増加させることによって達成される。
【００８７】
クローンを、ＭＴＸを０．３μＭまで段階的に増加させる遺伝子増幅にかけたところ、この時点で、抗体の最大生産性（Ｐｍａｘ）は約１００ｍｇ／Ｌまで増加した。細胞成長特性を改良するために、６６５．２Ｂ９細胞に、ヒトＢｃｌ−２遺伝子を含有するプラスミド発現ベクター（図１７）を、エレクトロポレーションによってトランスフェクトした。ＡＴＣＣから購入したｐＢ４プラスミド（ｐＢ４、カタログ番号７９８０４）からＥｃｏＲＩ部位を使ってＢｃｌ−２遺伝子を切り出し、哺乳類発現ベクターｐＺｅｏＳＶ（＋）のＭＣＳに同じ制限酵素を使って挿入した。ゼオシン耐性遺伝子がこのベクターの一部であるため、５０〜３００μｇ／ｍＬの範囲のゼオシンを含有する培地に、トランスフェクト細胞を入れた。３００ｍｇ／ｍｌゼオシンを含有する培地から安定なクローンを選択し、０．５細胞／１００μＬ／ウェルの密度で９６ウェルプレートにプレーティングすることにより、ゼオシンを含まない培地でサブクローニングした。その後はゼオシンを含まない培地を使用した。
【００８８】
ウェルにおけるクローンの形成を、顕微鏡下の目視観察によって確認した。細胞クラスターを一つだけ含むウェルの細胞を拡大した。各９６ウェルプレートが約３０クローンをもたらし、そのうちの１４クローンをさらなる研究のためにランダムに選択した。これらのクローンの成長特徴を、ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＧｕａｖａ ＰＣＡを用いる毎日の細胞計数および生存率測定によって評価した。２４ウェルプレートで評価した１４クローン（図１８、１９）から、改良された成長特徴（より高い細胞密度および延長された細胞生存）を示すＢｃｌ−２−トランスフェクトクローンを一つ同定し、６６５．２Ｂ９＃４（またはクローン＃４）と名付けた。親６６５．２Ｂ９と比較すると、クローン＃４は、Ｔフラスコ中で、より高い細胞密度（約１．７倍）まで成長すると共に４〜６日間長く生存し（図２０、２１）、より良い成長の結果として、クローン＃４のＰmaxは、ＥＬＩＳＡタイトレーションおよびプロテインＡカラム精製による決定で約１７０ｍｇ／Ｌまで増加した。
【００８９】
６６５．２Ｂ９＃４におけるＢｃｌ−２発現
６６５．２Ｂ９＃４の改良された成長特性がＢｃｌ−２のトランスフェクションによってもたらされたことを確認するために、Ｇｕａｖａ Ｅｘｐｒｅｓｓ試薬およびＧｕａｖａ ＰＣＡ計測器を使って、ヒトＢｃｌ−２タンパク質の細胞内レベルを測定した。簡単に述べると、１．５ｍｌ遠心管に入れた４×１０5細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、１×ＰＢＳで３回洗浄した。上清を注意深く吸引した。Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＳＣＢ），Ｉｎｃ．の固定溶液（１０×、６０μＬ）（カタログ番号ｓｃ−３６２２）を細胞ペレットに１５分間加え、氷上でインキュベートした。固定溶液を、４℃のＰＢＳ ４×１ｍＬで、毎回上述のように遠心することによって除去した。
【００９０】
−２０℃の透過処理バッファー（０．５ｍＬ）（ＳＣＢカタログ番号ｓｃ−３６２３）を、ボルテックスしながら滴下した後、１５分間氷上でインキュベートした。次に細胞を遠心し、０．５ｍＬのＦＣＭ洗浄バッファー（ＳＣＢカタログ番号ｓｃ−３６２４）で２回洗浄した。最終細胞ペレットを１００μＬのＦＣＭ洗浄バッファーに再懸濁し、Ｂｃｌ−２細胞内タンパク質について、ＰＥにコンジュゲートした抗Ｂｃｌ−２マウスモノクローナル抗体（ＳＣＢから入手）１０μＬで染色した。インキュベーションは暗所、室温で１時間行った。次に０．５ｍＬのＦＣＭ洗浄バッファーによる洗浄を２回行った。最終細胞ペレットを０．４ｍＬのＦＣＭ洗浄バッファーで再懸濁し、細胞をＧｕａｖａ ＰＣで分析した。各クローンの蛍光強度の平均値（ＭＦＩ）を、ＰＥとコンジュゲートした非特異的アイソタイプマウスＩｇＧＩによる対照染色と比較した。表２に要約する結果は、クローン６６５．２Ｂ９＃４が親細胞株より高レベルのＢｃｌ−２を発現させることを裏付けている。親６６５．２Ｂ９と類似する成長プロファイルを示すゼオシン耐性クローン（＃１３）は、Ｂｃｌ−２染色に関して陰性であったことから、この成長の改良にはＢｃｌ−２発現が必要であることが確認された。
【００９１】
【表２】
【００９２】
Ｇｕａｖａ Ｅｘｐｒｅｓｓ分析により、Ｂｃｌ−２レベルに対応する蛍光染色の強度は、クローン６６５．２Ｂ９＃４のＭＴＸ増幅と共に上昇することが分かったことから、Ｂｃｌ−２とｄｈｆｒ遺伝子との同時増幅が示唆された。増幅細胞の細胞内Ｂｃｌ−２レベルを比較するために、ウェスタンブロッティング分析を、クローン６６５．２Ｂ９＃４（Ｂｃｌ−２陽性）およびクローン＃１３（Ｂｃｌ−２陰性）の細胞溶解物に対して、抗ヒトＢｃｌ−２抗体を使って行った。デンシトメトリー評価により、１．０μＭ ＭＴＸ中で成長するクローン６６５．２Ｂ９＃４のＢｃｌ−２シグナルは、０．６μＭ ＭＴＸ中の細胞よりも２倍強いことがわかった。クローン＃１３の溶解物は、Ｂｃｌ−２タンパク質の存在を示さなかった（図２２）。
【実施例７】
【００９３】
回分培養条件下でのクローン６６５．２Ｂ９＃４の改良されたＡｂ生産
終末期近くの細胞培養物における栄養素消費を監視することにより、グルコースおよびＬ−グルタミンが消費される最初の構成要素であることがわかった。これらの制限栄養素の添加が最終抗体収量を改善するかどうかを決定するための実験を行った。２タイプの培養を開始した。すなわち、補給半回分法（この場合はこれらの制限構成要素が消費された時に栄養素を添加した）と、無供給回分法（栄養素の添加なし）である。試験したのは、０．６μＭおよび１μＭのＭＴＸを含有する培地で成長するＢｃｌ−２陽性クローン６６５．２Ｂ９＃４、ならびに０．３μＭ ＭＴＸ中で成長するＢｃｌ−２陰性クローン＃１３である。図２３および図２４に、終末段階に到達するまでの、両培養タイプにおける細胞生存率および細胞密度のプロファイルを示す。ｍｇ／Ｌで表したタンパク質収量を表３に示す。この実験の結果は、栄養素の補給により、生産される抗体の総収量が、全ての培養物で約２倍改良されることを示唆している。
【００９４】
【表３】
【実施例８】
【００９５】
低レベルの組換えタンパク質を産生する細胞株へのＢｃｌ−２遺伝子の導入
細胞クローン４８２．２Ｃ４Ａは、もともと、ＩｇＧ（抗ＣＥＡ）およびそれぞれがＩｇＧ重鎖のＣ末端に共有結合されている二つのｓｃＦｖ（抗ＤＴＰＡ）（Ｌｅｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ．４１：２７０Ｐ，２０００；Ｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．４３：９６９，２００２）という形態をした二重特異性Ａｂを生産するために、トランスフェクションによって、Ｓｐ２／０から生成させた細胞である。このクローンは遺伝子増幅にかけられ、約２０ｍｇ／Ｌの最終生産性を持っていた。成長特性を改良し、最終的にはＡｂ生産性を改良するために、４８２．２Ｃ４Ａ細胞に、ヒトＢｃｌ−２遺伝子を含有するプラスミド発現ベクターを、実施例６に記載するように、エレクトロポレーションによってトランスフェクトした。３週間後に、７５０μｇ／ｍｌのゼオシンを含有する培地で、トランスフェクタントを選択した。
【００９６】
アポトーシス感受性細胞を排除するために、ゼオシン耐性細胞を２５μｇ／ｍｌのＣＨＸで５時間処理した。処理した細胞を新しい培養培地で２回洗浄してＣＨＸを除去し、新しい成長培地に再懸濁した。２４時間回復させた後、生存細胞を、限界希釈法（０．５細胞／ウェル）により、９６ウェル細胞培養プレートにクローニングした。クローンは２週間でウェルに出現し、それらをＡｂ産生、ＣＨＸ誘導アポトーシスに対する耐性、および成長プロファイルについてスクリーニングした。全ての面で親４８２．２Ｃ４Ａより成績の良いクローンを選択し、さらに特徴づける。最も成績の良いクローンは、親４８２．２Ｃ４Ａ細胞と比較して、ストレス条件下で成長させた時に、より頑強であり、老化培養条件誘導アポトーシスに抵抗し、より高い最大Ａｂ生産性（約１５０％以上）を持つと予想される。
【実施例９】
【００９７】
細胞成長特性をさらに改良するためのＳｐ−Ｅ２６へのＢｃｌ−２遺伝子の導入
Ｓｐ−Ｅ２６細胞に、実施例５で述べたヒトＢｃｌ−２−ＥＥＥ遺伝子を含有するプラスミド発現ベクターを、エレクトロポレーションによってトランスフェクトする。３週間後に、５００μｇ／ｍｌのゼオシンを含有する培地で、トランスフェクタントを選択する。
【００９８】
アポトーシス感受性細胞を排除するために、ゼオシン耐性細胞を２５μｇ／ｍｌのＣＨＸで５時間処理する。処理した細胞を新しい培養培地で２回洗浄してＣＨＸを除去し、新しい成長培地に再懸濁する。２４時間回復させた後、生存細胞を、限界希釈法（０．５細胞／ウェル）により、９６ウェル細胞培養プレートにクローニングする。クローンは２週間でウェルに出現し、それらをＣＨＸ誘導アポトーシスに対する耐性および成長プロファイルについてスクリーニングする。全ての面で親Ｓｐ−Ｅ２６およびＳｐ−ＥＥＥより成績の良いクローンを選択し、さらに特徴づける。ＨＰＶ−１６ Ｅ６／Ｅ７およびＢｃｌ−２−ＥＥＥを含有する最も成績の良いクローンは、親Ｓｐ−Ｅ２６およびＳｐ／ＥＥＥ細胞よりも、ストレス条件下で成長させた時に頑強であり、老化培養条件誘導アポトーシスに対して耐性であると予想され、それゆえに、組換えタンパク質生産にとって、より良い宿主細胞である。
【実施例１０】
【００９９】
Ｓｐ−ＥＥＥ細胞株による組換えタンパク質の改良された生産
組換えタンパク質を生産するために生存が強化されている細胞株を開発する場合にとり得る経路が二つある。実施例６で述べたように極めてうまく成し遂げられた一方法では、既に産生している細胞株に、Ｂｃｌ−２などの生存促進遺伝子を安定にトランスフェクトする。しかしこの方法には、追加のトランスフェクションステップ、選択ステップおよびクローニングステップが必要であり、これにより、細胞株開発プロセスが少なくとも２ヶ月は長くなり、もしかするとそれよりはるかに長くなるかもしれない。さらにまた、成長／生存、Ｂｃｌ−２発現レベルおよび生産性を含むいくつかのパラメータを決定する必要があるので、「最良」のクローンをスクリーニングする必要もある。したがって少数のクローンしか評価することができない。最も高い生産性を持つクローンが優れた生存性を持たないことは十分にあり得ることであり、その逆も同様である。ここで使用する代替方法は、優れた成長特性および生存特性を持つ親細胞株を開発し、その後に、その細胞株に、所望するタンパク質を生産するための発現ベクターをトランスフェクトすることである。
【０１００】
Ｓｐ２／０細胞と比較すると、Ｓｐ−ＥＥＥ細胞は一日長く成長し続け、１５〜２０％高い最大密度に到達し、培養下で４〜６日長く生存する。細胞は、組換えタンパク質、例えばＩｇＧ、抗体フラグメントおよび融合タンパク質、成長因子、例えばＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＦＳ、ＥＰＯ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、サイトカイン、例えばインターロイキンフェミリーメンバー（ＩＬ−１〜ＩＬ−３１）、またはインターフェロンファミリーメンバー（例えばα、βまたはγインターフェロン）、オリゴヌクレオチド、ペプチド、ホルモン、酵素、またはワクチン（例えばＡ型、Ｂ型またはＣ型肝炎、ならびに上述した他のワクチン）を生産するための遺伝子を、後からトランスフェクトしても、その強化された成長特性および生存特性を保つ。
【０１０１】
ＩｇＧなどの組換えタンパク質のための発現カセットを一つ以上含有するｐｄＨＬ２などのＤＮＡベクターを使って、エレクトロポレーションなどの標準的方法によって、Ｓｐ−ＥＥＥ細胞をトランスフェクトする。トランスフェクタントを９６ウェルプレートにプレーティングし、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅなどの確立された技法により、クローンをタンパク質産生について分析する。産生クローンを、培養培地中のＭＴＸに、その濃度を数ヶ月かけて増加させながら曝すことにより、遺伝子コピー数を増幅する。Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ発現クローンは、Ｂｃｌ−２陰性Ｓｐ２／０細胞で生成させたクローンと比較して、約２０％高い細胞密度まで成長し、少なくとも４日間は長く生存するので、前者は標準的フラスコまたはローラーボトル培養において少なくとも２０％多い組換えタンパク質を産生するだろう。懸濁培養、灌流培養または半回分式バイオリアクター培養では、さらに高い増加が実現される。
【実施例１１】
【０１０２】
バイオリアクターにおけるＢｃｌ−２トランスフェクトクローン６６５．Ｂ４．１Ｃ１の改良されたＡｂ生産
実施例６の６６５．２Ｂ９＃４と親クローン６６５．２Ｂ９をどちらも無血清培地に前適応させた。細胞を、Ｔフラスコで数ヶ月間、連続継代培養することにより、３μＭ ＭＴＸを含有するハイブリドーマ無血清培地（ＨＳＦＭ）の特別仕様の製剤（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ ＰＮ １００７０）に適応させた。適応した細胞を、バンキングのために、Ｔフラスコからローラーボトルにスケールアップした。４５％調整培地（指数増殖期にある培養物の遠心分離後に上清として集めた培地）、１０％ＤＭＳＯおよび４５％ＨＳＦＭから構成されるＦＢＳフリー冷凍保存溶液を使って、各１ｍＬバイアル中に１×１０7個の生存細胞を含むマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を、各細胞株について作製した。ＭＣＢ細胞株を、それぞれ６６５．２Ｂ９．１Ｅ４（Ｂｃｌ−２遺伝子なし）および６６５．Ｂ４．１Ｃ１（Ｂｃｌ−２遺伝子あり）と名付けた。これら二つのクローンの成長特性および抗体産生を回分培養条件で比較した。
【０１０３】
実験は、ＭＣＢから拡大した上記の細胞を使って、３Ｌベンチスケールバイオリアクターで行った。３Ｌバイオリアクターシステムは、２５００Ｌ ｃＧＭＰバイオリアクターシステムのスケールダウンモデルである。したがって、評価結果は、大規模商業生産へのこれらの細胞株の適合性を裏付けるだろう。
【０１０４】
ＭＣＢを作製する際に使用したものと同じ成長ＨＳＦＭ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ ＰＮ １００７０）を使って、細胞株を維持し、接種物を調製した。３Ｌ半回分式バイオリアクタープロセスには、特別仕様の変更を加えた成長ＨＳＦＭに基づく特別仕様の製剤である基礎ＨＳＦＭ（Ｉｍｍｕｎｏｍｅｄｉｃｓ ＰＮ １０１９４）を使用した。どちらの培地も唯一の微量タンパク質としてインスリンおよびトランスフェリンを含有する。撹拌および曝気によって起こる剪断から細胞を保護するために、さらに０．１％のプルロニックＦ６８を製剤に組み入れた。この培地は３μＭ ＭＴＸも含有した。
【０１０５】
連続供給溶液およびパルス供給溶液の具体的特徴を以下の表４および表５に示す。
【表４】
【表５】
【０１０６】
半回分実験は、３Ｌ Ｂｅｌｌｃｏスピナーフラスコバイオリアクターシステム（Ｂｅｌｌｃｏ ｇｌａｓｓｅｓ、ニュージーランド州バインランド）で、作業体積を２Ｌとして行った。バイオリアクターの温度、ｐＨおよび溶存酸素（ＤＯ）を監視し、シングルループコントローラで制御した。リアクター温度は加熱ブランケットで３７℃に制御した。培養ｐＨはＣＯ2または６％Ｎａ2ＣＯ3の添加によって７．３に制御した。曝気は、円柱状シンタードスパージャー（ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ ｓｉｎｔｅｒｅｄ ｓｐａｒｇｅｒ）により、１０ｍｌ／分で行った。ＤＯは、培地へのＯ2の間欠的散布により、４０％を上回る空気飽和度に制御した。培養中は常に約５０〜６０ｒｐｍの一定撹拌速度を使用した。
【０１０７】
ＭＣＢからの凍結バイアルを融解し、Ｔフラスコ中で約１〜２週間回復させた。次に、細胞をＴフラスコからローラーボトルに拡大した後、バイオリアクターに接種した。細胞を５％ＣＯ2雰囲気下に３７℃で培養し、拡大プロセス中は常に指数成長期に維持した。
【０１０８】
接種に先だって、１．２リットルの基礎ＨＳＦＭをバイオリアクターに無菌的にポンプ輸送した。溶存酸素（ＤＯ）計を較正するために、培地を空気飽和させた。ｐＨ計を較正するために、培地試料も採取した。ｐＨ計およびＤＯ計を較正し終えた後、両方のコントローラをＡＵＴＯモードに設定した。システムがｐＨ（７．３）および温度（３７℃）の設定ポイントに到達したら、計算された量の接種物をローラーボトルからバイオリアクターにポンプ輸送した。接種後の生存細胞密度（ＶＣＤ）は約２×１０5生存細胞／ｍｌだった。
【０１０９】
供給方法は以下のとおりである。培養中は、必要かつ過剰でない栄養素を細胞に与えるために、濃縮栄養素溶液をバイオリアクターに供給した。濃縮栄養素溶液は、連続供給およびパルス供給によって、培養物に送達した。連続供給溶液は、蠕動ポンプ（Ｗａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ １０１Ｕ／Ｒ）を使って、リアクターに連続的にポンプ輸送した。パルス供給溶液は、１日に１回、培養物にパルス供給した。
【０１１０】
二つの半回分式供給方法を開発し、両方の細胞株に適用した。プロセス＃１では、培養中に組換えインスリンを供給しない。プロセス＃２はプロセス＃１に基づき、リノール酸および脂質供給スケジュールの変更と、インスリンの追加供給を伴う。以下の表に、両プロセスの供給を、両細胞株について要約する。
【０１１１】
【表６】
【０１１２】
【表７】
【０１１３】
【表８】
【０１１４】
【表９】
【０１１５】
培養中は、オフライン分析のために、バイオリアクター試料を定期的に採取した。生存細胞密度（ＶＣＤ）および細胞生存率を、０．４％トリパンブルー色素による染色後に、血球計を使った顕微鏡計数によって測定した。グルコース、乳酸、グルタミン、アンモニア濃度を、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ ２００を使って測定した。抗体濃度をプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーカラムを用いるＨＰＬＣによって決定した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐ／Ｎ ２−１００１−００）。
【０１１６】
抗体の累積生産量を培養物中の総生存細胞数の時間積分で割ることによって、比抗体生産性を算出した。すなわち
【数１】
式中、
【数２】
は、公式：
【数３】
によって近似される。
【０１１７】
プロセス＃１では、６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞が成長して、６日目に１×１０7生存細胞／ｍｌの最大ＶＣＤ、生存率８６％を達成した。６日目の後は、ＶＣＤおよびＶ％が急速に低下し、培養物を８日目に収集した。プロセス＃２は、培養物が、１．２×１０7生存細胞／ｍｌという、さらに高いＶＣＤに到達して、１日長く持続するのに役立った。
【０１１８】
６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞と比較すると、６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞は、どちらのプロセスでも、はるかに良好な成長を示した。プロセス＃１の場合、そのＶＣＤは７日目に２×１０7生存細胞／ｍｌに到達し、生存率は９７％だった。また、その培養物は、このＶＣＤおよびＶ％をさらに２日間維持してから、下降を始めた。培養物を１１日目に収集した。プロセス＃２では、６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞は、プロセス＃１と類似する成長プロファイルを示した。より具体的には、細胞は、２．３×１０7生存細胞／ｍｌの最高ＶＣＤに到達し、生存率は少し遅く下降し、収集は１１日目に行われた。この観察結果は、プロセス＃２において成長面での優位性を示した６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞株とは、多少異なった。
【０１１９】
プロセス＃１および＃２における二つの細胞株の抗体収量を比較した。６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞の最終収量は、プロセス＃１で０．４２ｇ／Ｌ、プロセス＃２で０．５５ｇ／Ｌだった。これに比して、６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞は、どちらのプロセスでも、１．５ｇ／Ｌという高い最終収率を達成した。
【０１２０】
一日あたりの比抗体生産性（細胞あたり）を算出したところ、６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞は、どちらのプロセスでも、培養の全過程を通して、約１５ｐｇ／細胞／日という平均一日Ｑ[MAb]を持っていた。プロセス＃２では最高ＶＣＤでの成長が１日追加されたことにより、最終抗体濃度が高くなった。
【０１２１】
６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞は、どちらのプロセスでも類似する一日あたりの比抗体生産性プロファイルを示したが、プロセス＃１の方がわずかに高い生産性をもたらした。一日Ｑ[MAb]は９日目まで約２０〜２５ｐｇ／細胞／日に保たれた。その後、生産性は下降した。
【０１２２】
６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞株と比較して、６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞株は、１５ｐｇ／細胞／日よりも高い約２５ｐｇ／細胞／日という比抗体生産性を示した。その良好な成長と相まって、６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞株では、最終抗体収量が、６６５．２Ｂ９．１Ｅ４細胞株によって達成される０．５５ｇ／Ｌと比較して１．５ｇ／Ｌと、３倍になった。これらの結果は、組換えタンパク質（この例では臨床使用するための抗体）の大規模商業製造をモデル化したバイオリアクター中の無血清培地における宿主細胞の成長および抗体収量を強化するために、Ｂｃｌ−２遺伝子を宿主細胞に組み入れることの利益を実証している。
【実施例１２】
【０１２３】
Ｓｐ／ＥＳＦ無血清前適応細胞株の開発
細胞形質転換およびタンパク質生産の標準的プロトコールを以下に要約する。Ｓｐ２／０細胞またはＳｐ２／０由来の細胞株を１０％ＦＢＳ中で維持し、関心対象の遺伝子を含有する発現ベクターをエレクトロポレーションによってトランスフェクトする。１０％ＦＢＳを添加した培地中でトランスフェクタント細胞株を維持しながら、培養培地中のメトトレキサート（ＭＴＸ）を段階的に増加させることにより、発現を増幅させることを試みる。この増幅プロセスは通常、４〜８ヶ月を要するが、うまく機能するのは時折しかなく、典型的には初期生産性が低い細胞株においてうまく機能するだけのようである。ＭＴＸ増幅が完了したら、３〜６ヶ月かけてクローンを無血清培地での成長に徐々に適応させるが、これは、典型的には、生産性を最大５０％喪失させる。
【０１２４】
Ｓｐ／ＥＥＥ細胞株は、強化された成長および生存特性を示すと共に、血清欠乏に対して優れた耐性を示したので、無血清培地での成長に前適応させたＳｐ／ＥＥＥ細胞株を開発することの実現可能性を探究し、この細胞株をトランスフェクション、クローニングおよび増幅に使用することにした。以下に、Ｓｐ／ＥＳＦ（Ｓｐ／ＥＥＥ無血清）細胞株の開発を説明する。抗体またはフラグメントなどのクローン化タンパク質の生産に関する実行可能性は、Ｃ−ＡＤ２−Ｆａｂ−ｈ６７９−ｐｄＨＬ２発現ベクターのトランスフェクションによって実証した。
【０１２５】
無血清培地における成長への適応およびサブクローニング
Ｓｐ／ＥＥＥ細胞を、２ヶ月かけて、無血清培地（ＳＦＭ）での成長に適応させた。ＦＢＳを使わずにＳＦＭ中でトランスフェクションを行い得るかどうかを決定する目的で、無血清適応Ｓｐ／ＥＥＥ細胞を限界希釈法でプレーティングして、それらが低密度から回復するかどうかを決定した。細胞を９６ウェルプレートの第１列に５細胞／ウェルの濃度でプレーティングし、そのプレートの下方に向かって２倍ずつ希釈した。この限界希釈により、合計７個のクローンを得た。これらの結果は、細胞がトランスフェクションに必要な条件下で生存できることを実証している。それら７個のサブクローンのうち４個を使って成長曲線実験を行うことにより、最も好ましい成長特性を持つクローンを選択した。４個のクローン（＃１、３、４、および５）と親クローンを、Ｔ２５フラスコ中、６ｍｌの培養培地に、密度が３×１０5細胞／ｍｌになるように分割した。細胞生存率（図２５）および細胞密度（図２６）を、生存率が０に達するまで監視した。
【０１２６】
サブクローンのうち、＃３は、他のどのサブクローンまたは親細胞株よりも２４時間長く生存した。また、サブクローン＃３および＃１は、他のクローンより高い最大細胞密度（３２０万〜３３０万／ｍＬ、図２６）に到達した。これは、サブクローン＃３が、うまくトランスフェクションを起こすように、より良く適応し得ることを示唆している。そこで、サブクローン＃３を新たにＳｐ／ＥＳＦと名付け、以降のトランスフェクションに使用した。
【０１２７】
ｈ６７９−ＡＤ２によるＳｐ／ＥＳＦ細胞のトランスフェクション
上記のデータに基づき、Ｓｐ／ＥＳＦ細胞（サブクローン＃３）に、エレクトロポレーションにより、Ｓｐ２／０細胞に関する標準的プロトコールに従って、３０μｇのｈ６７９−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２をトランスフェクトした。４８時間後に、細胞を０．１μＭ ＭＴＸで選択した。対照として、１０％ＦＢＳ中のＳｐ／ＥＥＥ細胞にも、ｈ６７９−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２を、エレクトロポレーションにより、同じ条件下でトランスフェクトした。１０日後に、プレートは、ＢＳＡ−ＩＭＰ−２６０コートプレートを使ってＥＬＩＳＡでスクリーニングできる状態になっていた。どちらのトランスフェクションでも、４００ウェルのうち約１３０ウェルが陽性クローンを含んでいた。ＯＤ測定値が最も高い４０ウェルの陽性Ｓｐ／ＥＳＦ細胞を２４ウェルプレートに移し、ＭＴＸを０．２μＭ ＭＴＸに増加させた。２４ウェルプレート中の細胞が終末相に達してから、ＨＳＧセンサーチップを使ったＢＩＡＣＯＲＥ分析によるスクリーニングを、さらに行った。スクリーニングしたクローンのうち４個が＞５０ｍｇ／Ｌの生産性を持っていた。生産性が最も高いクローン（ｈ６７９−ＡＤ２−ＳＦ ＃Ｔ６）は、８２ｍｇ／Ｌの初期生産性を持っていた。これらの初期生産性結果は、１０％ＦＢＳ中のＳｐ／ＥＥＥ細胞を使ったこの構築物のトランスフェクションによって以前得られた結果と極めてよく似ていた。
【０１２８】
増幅
ＭＴＸ増幅用にｈ６７９−ＡＤ２−ＳＦ＃ Ｔ６クローンを選択した。２週間後に、ＭＴＸ濃度を０．２μＭから０．４μＭに増加させた。わずか２回のＭＴＸ増加後でも既に、生産性の多少の増幅を観察することができる。
【０１２９】
【表１０】
【０１３０】
結論
Ｓｐ／ＥＳＦについて上に示したデータは、トランスフェクション、限界希釈法によるクローニング、およびＭＴＸ増幅の全てを、無血清条件下に１ヶ月未満で達成できることを示している。これは、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２発現ベクターのトランスフェクションによって実証された。このトランスフェクションは、８２ｍｇ／Ｌという極めて高い初期生産をもたらし、これを２週間で１０３ｍｇ／Ｌまで増幅することができた。ＭＴＸばく露の時間を長くすれば、さらなる増幅が予想される。８２ｍｇ／Ｌという最良クローン（Ｔ６）の初期生産性は、１０％ＦＢＳ中で行われた親Ｓｐ／ＥＥＥ細胞株の元のトランスフェクションによる最良のｈ６７９−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２クローン（５Ｄ８）の初期生産性（これは約５０ｍｇ／Ｌだった）を上回っている。Ｓｐ／ＥＳＦ細胞には、エリスロポエチンを生産するためのＥＰＯ−ＤＤＤ２−ｐｄＨＬ２もトランスフェクトした。
【０１３１】
Ｓｐ／ＥＳＦの主要パラメータを既存のＰＥＲ．Ｃ６細胞株（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００３，１９：１６３−１６８）のパラメータと比較した表１１に示すように、Ｓｐ／ＥＳＰは多くのカテゴリでＰＥＲ．Ｃ６を凌ぐ。
【０１３２】
【表１１】
【０１３３】
本願が開示しクレームする組成物および／または方法および／または装置は全て、この開示に照らして、過度の実験を行わなくても作製し、実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して説明したが、組成物および／または方法および／または装置ならびに本明細書に記載の方法のステップまたはステップの順序に、本発明の概念、要旨および範囲から逸脱することなく改変を加え得ることは、当業者には明らかだろう。より具体的には、本明細書に記載する薬剤の代りに、化学的にも生理学的にも関係する一定の薬剤を使用することができ、それでもなお同じ結果または類似する結果が達成されるであろうことは、明らかだろう。当業者にとって自明なそれらの類似する置換態様および変更態様は、本願請求項によって定義される本発明の要旨、範囲および概念に含まれるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】シクロヘキシミドで処理した（＋ＣＨＸ）または無処理の（−ＣＨＸ）Ｓｐ２／０細胞およびＳｐ−Ｅ２６細胞の視覚像を表す。
【図２】ＣＨＸ処理に対してより耐性なＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７形質導入細胞をスクリーニングした結果を示す。合計５５クローンをスクリーニングした。最初の実験では３１クローンをスクリーニングし（上段のパネル）、２番目の実験では２４クローンをスクリーニングした（下段のパネル）。各クローンの健常細胞を二つに等分した。一方をＣＨＸで２時間処理し、他方を無処理のままにしておいた。次に、これら二つの培養物中の生存細胞をＭＴＴアッセイで測定し、処理した生存細胞集団（ＣＨＸ+）と無処理の生存細胞集団（ＣＨＸ-）との比をプロットとした。上段のパネルに示すように、Ｓｐ２／０細胞ではＣＨＸ処理が生存率を３０％低下させたのに対し、Ｓｐ−Ｅ２６細胞では６％しか低下しなかった。スクリーニングした３１クローンのうち７クローン（＊で示すもの）は、Ｓｐ２／０よりも有意に成績が良かったが（生存率の低下は＜２０％）、Ｓｐ−Ｅ２６ほど良くはなかった。２番目の実験でスクリーニングした２４クローンの場合（下段のパネル）、ＣＨＸ処理は、Ｓｐ２／０細胞の生存率を約５０％低下させ、Ｓｐ−Ｅ２６の生存率を＜２０％低下させた。２４クローンのうち１０クローン（＊または＊＊で示すもの）は、Ｓｐ２／０よりも有意に成績が良く（＜３０％の低下）、そのうちの６クローン（＊＊で示すもの）はＳｐ−Ｅ２６に匹敵するか、Ｓｐ−Ｅ２６より優秀だった（＜２０％）。Ｅ２８およびＥ３６は、Ｓｐ２／０よりは良い成績だがＳｐ−Ｅ２６ほど良くはない二つの追加対照クローンである。
【図３】ＧｕａｖａネキシンＶアッセイのドットプロットを表す。初期アポトーシス細胞（ネキシンＶ陽性および７−ＡＡＤ陰性）のパーセンテージを右下の象限に示す。
【図４】ＣＨＸで処理したＳｐ２／０におけるＤＮＡ断片化を表す。これに対し、Ｓｐ−Ｅ２６細胞はこの処理に対して耐性だった。
【図５】ＴフラスコにおけるＳｐ２／０細胞およびＳｐ−Ｅ２６細胞の成長プロファイルを表す。健常細胞（＞９５％の生存率）を、２００，０００／ｍｌの初期細胞密度で、Ｔフラスコに播種した。Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬（Ｇｕａｖａ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）およびＰＣＡ計測器（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使って生存細胞および死細胞を毎日計数した。ＮＨ4+および乳酸の蓄積も監視した。
【図６】３Ｌバイオリアクターでの回分培養物について決定したＳｐ２／０細胞とＳｐ−Ｅ２６細胞の成長プロファイルの比較。健常細胞（＞９５％の生存率）を２５０，０００／ｍｌの初期細胞密度でバイオリアクターに播種した。トリパンブルーと顕微鏡とによって細胞を毎日計数した。
【図７】Ｂｃｌ−２−ＥＥＥ発現についてクローンをスクリーニングするために、Ｂｃｌ−２（１００）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ．）で染色し、増感化学発光法で発色させた代表的イムノブロットを表す。
【図８】Ｇｕａｖａ Ｅｘｐｒｅｓｓを使ったフローサイトメトリー結果のグラフを表す。細胞を固定し、透過処理してから、フィコエリトリン結合抗Ｂｃｌ−２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で染色した。数個のサブクローンを比較している。
【図９】Ｇｕａｖａ Ｅｘｐｒｅｓｓを使ったフローサイトメトリー結果のグラフを表す。細胞を固定し、透過処理してから、フィコエリトリン結合抗Ｂｃｌ−２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）で染色した。Ｓｐ２／０細胞、Ｒａｊｉ細胞およびＤａｕｄｉ細胞をＢｃｌ−２−ＥＥＥクローンと比較した。
【図１０】６６５．Ｂ４．１Ｃ１細胞、Ｓｐ２／０細胞、Ｒａｊｉ細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｓｐ−ＥＥＥ（８７−２９クローン）細胞およびＳｐ−ＥＥＥ（７−１６クローン）細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を表す。（Ａ）ヒトＢｃｌ−２特異的抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）で染色したブロット。（Ｂ）マウスおよびヒトＢｃｌ−２を認識する抗Ｂｃｌ−２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）で染色したブロット。
【図１１】１０％ウシ胎仔血清を添加した培地中で成長させたＳｐ−ＥＥＥクローンの成長曲線（Ａ）および生存率（Ｂ）をＳｐ２／０細胞と比較したものを表す。
【図１２】１％ウシ胎仔血清を添加した培地中で成長させたＳｐ−ＥＥＥクローンの成長曲線（Ａ）および生存率（Ｂ）をＳｐ２／０細胞と比較したものを表す。
【図１３】無血清培地中で成長させたＳｐ−ＥＥＥクローンの成長曲線（Ａ）および生存率（Ｂ）をＳｐ２／０細胞と比較したものを表す。
【図１４】Ｓｐ−ＥＥＥ（８７−２９クローン）細胞のメトトレキサート死滅曲線を表す。
【図１５】１ｍｇ／ｍｌのゼオシンの存在下または非存在下で成長させたＳｐ−ＥＥＥクローンを比較した、Ｇｕａｖａ Ｅｘｐｒｅｓｓを使ったフローサイトメトリー結果のグラフを表す。細胞を固定し、透過処理してから、フィコエリトリン結合抗Ｂｃｌ−２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）で染色した。
【図１６】ヒト化抗体配列ならびにＳＶ４０のプロモーター配列およびエンハンサー配列を持つ６６５．２Ｂ９クローンを得るために、Ｓｐ２／０細胞のトランスフェクションに使用した、ｐｄＨＬ２ベクターの地図を表す。
【図１７】クローン６６５．２Ｂ９のトランスフェクションに使用した、Ｂｃｌ−２遺伝子が組み入れられているＤＮＡプラスミドの地図を表す。
【図１８】Ｂｃｌ−２トランスフェクトクローン６６５．２Ｂ９＃４、Ｂｃｌ−２陰性クローンおよび非トランスフェクト対照の成長プロファイルを表す。健常細胞（＞９５％の生存率）を２４ウェルプレートに４００，０００／ｍｌの初期細胞密度で播種した。Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ計測器を使って生存細胞および死細胞を毎日計数した。
【図１９】Ｂｃｌ−２トランスフェクトクローン６６５．２Ｂ９＃４、Ｂｃｌ−２陰性クローンおよび非トランスフェクト対照の成長プロファイル。健常細胞（＞９５％の生存率）を２４ウェルプレートに４００，０００／ｍｌの初期細胞密度で播種した。Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ計測器を使って生存細胞および死細胞を毎日計数した。
【図２０】異なるＭＴＸ濃度におけるＢｃｌ−２トランスフェクトクローン６６５．２５９＃４およびＢｃｌ−２陰性クローンの成長プロファイルを示す。健常細胞（＞９５％の生存率）をＴフラスコに１００，０００／ｍｌの初期細胞密度で播種した。Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ計測器を使って生存細胞密度および生存率を毎日計数した。
【図２１】異なるＭＴＸ濃度におけるＢｃｌ−２トランスフェクトクローン６６５．２５９＃４およびＢｃｌ−２陰性クローンの成長プロファイルを示す。健常細胞（＞９５％の生存率）をＴフラスコに１００，０００／ｍｌの初期細胞密度で播種した。Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ計測器を使って生存細胞密度および生存率を毎日計数した。
【図２２】クローン６６５．２Ｂ９＃４（ＭＴＸ濃度を増加させたもの）およびクローン＃１３によって発現されるヒトＢｃｌ−２のレベル（ウェスタンブロット法で検出したもの）を表す。
【図２３】Ｌ−グルタミンおよびグルコースを補給して、またはＬ−グルタミンおよびグルコースを補給せずに、０．６μＭおよび１μＭのＭＴＸ中で培養したクローン６６５．２Ｂ９＃４ならびに０．３μＭ ＭＴＸ中で培養したクローン＃１３の細胞生存率のプロファイルを表す。健常細胞（＞９５％の生存率）をローラーボトルに２００，０００／ｍｌの初期細胞密度で播種した。「補給」培養物には、２日目および４日目（矢印で示した時点）に、グルコースおよびＬ−グルタミンを含有する栄養添加溶液を加えた。Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ計測器を使って生存細胞および死細胞を毎日計数した。
【図２４】Ｌ−グルタミンおよびグルコースを補給して、またはＬ−グルタミンおよびグルコースを補給せずに、０．６μＭおよび１μＭのＭＴＸ中で培養したクローン６６５．２Ｂ９＃４ならびに０．３μＭ ＭＴＸ中で培養したクローン＃１３の生存細胞密度のプロファイルを表す。健常細胞（＞９５％の生存率）をローラーボトルに２００，０００／ｍｌの初期細胞密度で播種した。「補給」培養物には、２日目および４日目（矢印で示した時点）に、グルコースおよびＬ−グルタミンを含有する栄養添加溶液を加えた。Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ試薬およびＰＣＡ計測器を使って生存細胞および死細胞を毎日計数した。
【図２５】培養５日間にわたるＳｐ／ＥＥＥサブクローンの無血清培地における生存率を表す。
【図２６】培養５日間にわたる無血清Ｓｐ／ＥＥＥサブクローンの生存細胞密度を図示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトし、無血清培地中で増殖成長するように適応させた哺乳動物細胞株。
【請求項２】
関心対象のタンパク質および選択可能なマーカータンパク質をコードするプラスミドを無血清培地中でさらにトランスフェクトした、請求項１の細胞株。
【請求項３】
アポトーシス阻害剤が、Ｔ６９Ｅ、Ｓ７０ＥおよびＳ８７Ｅ突然変異を持つＢｃｌ−２をコードする遺伝子を含む、請求項１の細胞株。
【請求項４】
プラスミドが抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、多価抗体またはそのフラグメントをコードする、請求項２の細胞株。
【請求項５】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株が、非トランスフェクト細胞株が示す密度に等しいかそれを上回る密度までの増殖成長を示す、請求項２の細胞株。
【請求項６】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株が、非トランスフェクト細胞株が示す密度より少なくとも１０％高い密度までの増殖成長を示す、請求項４の細胞株。
【請求項７】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株が、非トランスフェクト細胞株が示す密度より少なくとも２０％高い密度までの増殖成長を示す、請求項４の細胞株。
【請求項８】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株からのタンパク質生産量が、親細胞株からのタンパク質生産量よりも大きい、請求項２の細胞株。
【請求項９】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株からのタンパク質生産量が、親細胞株で観察される量の２倍である、請求項８の細胞株。
【請求項１０】
一つ以上の発現ベクターをさらにトランスフェクトした、請求項２の細胞株。
【請求項１１】
一つ以上の発現ベクターが染色体に組み込まれる、請求項１０の細胞株。
【請求項１２】
細胞株が、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０派生細胞株、ＮＳＯまたはＹＢ２／０からなる群より選択される骨髄腫細胞株である、請求項２の細胞株。
【請求項１３】
細胞株が、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨｅｐＧ２、ＢＨＫ２１、Ｐ３Ｘ３Ａｇ８．６５３およびＢＳＣ−１からなる群より選択される、請求項２の細胞株。
【請求項１４】
アポトーシス阻害剤が、Ｅ６、Ｅ７、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−ＥＥＥ、Ｂｈｒｆ１、ＫＳ−Ｂｃｌ−２、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、Ｂｃｌ−６およびＭｃｌ−１からなる群より選択される、請求項１の細胞株。
【請求項１５】
請求項２または請求項９に記載の細胞株によって生産されるタンパク質。
【請求項１６】
タンパク質が、抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、多価抗体またはそのフラグメントである、請求項１５のタンパク質。
【請求項１７】
タンパク質が成長因子、ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカインまたは酵素である、請求項１５のタンパク質。
【請求項１８】
タンパク質が、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、トロンボポエチン、ＩＬ−１〜ＩＬ−３１、インターフェロン−α、インターフェロン−βおよびインターフェロン−γからなる群より選択される、請求項１７のタンパク質。
【請求項１９】
ａ）アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株であって、無血清培地中で増殖成長するように適応させた細胞株を取得すること、
ｂ）アポトーシス阻害剤をトランスフェクトした前記細胞株を貯蔵のために凍結すること、
ｃ）生産されるべき一つ以上のタンパク質をコードする一つ以上の発現ベクターをトランスフェクトする前に、前記凍結細胞株を融解すること、
ｄ）前記細胞株に一つ以上の発現ベクターを無血清条件下でトランスフェクトすること、および
ｅ）前記細胞株を無血清培地中で培養することにより、前記一つ以上の発現ベクターから一つ以上のタンパク質を生産すること、
を含む、タンパク質生産の方法。
【請求項２０】
アポトーシス阻害剤が、Ｔ６９Ｅ、Ｓ７０ＥおよびＳ８７Ｅ突然変異を持つＢｃｌ−２をコードする遺伝子を含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
発現ベクターが抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、多価抗体またはそのフラグメントをコードする、請求項１９の方法。
【請求項２２】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株が、非トランスフェクト細胞株が示す密度に等しいかそれを上回る密度までの増殖成長を示す、請求項１９の方法。
【請求項２３】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株が、非トランスフェクト細胞株が示す密度より少なくとも１０％高い密度までの増殖成長を示す、請求項２２の方法。
【請求項２４】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株が、非トランスフェクト細胞株が示す密度よりも少なくとも２０％高い密度までの増殖成長を示す、請求項２３の方法。
【請求項２５】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株からのタンパク質生産量が、親細胞株からのタンパク質生産量よりも大きい、請求項１９の方法。
【請求項２６】
前記細胞株が骨髄腫細胞株である、請求項１９の方法。
【請求項２７】
骨髄腫細胞株がＳｐ２／０もしくはその派生細胞株、マウスＮＳＯまたはラットＹＢ２／０細胞株である、請求項２６の方法。
【請求項２８】
細胞株が、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨｅｐＧ２、ＢＨＫ２１、Ｐ３Ｘ３Ａｇ８．６５３およびＢＳＣ−１からなる群より選択される、請求項１９の方法。
【請求項２９】
前記アポトーシス阻害剤が、Ｅ６、Ｅ７、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−ＥＥＥ、Ｂｈｒｆ１、ＫＳ−Ｂｃｌ−２、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、Ｂｃｌ−６およびＭｃｌ−１からなる群より選択される、請求項１９の方法。
【請求項３０】
少なくとも一つのカスパーゼ阻害剤を含む培地中で細胞株を増殖成長させることをさらに含む、請求項１９の方法。
【請求項３１】
前記カスパーゼ阻害剤が、カスパーゼ−１、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１２および汎カスパーゼ阻害剤からなる群より選択される、請求項３０の方法。
【請求項３２】
エリスロポエチンを含む培地中で細胞株を成長させることをさらに含む、請求項１９の方法。
【請求項３３】
カスパーゼ阻害剤が、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏ（配列番号７）、ＡｖｅｎおよびＸＩＡＰからなる群より選択される、請求項３１の方法。
【請求項３４】
細胞培養寿命を少なくとも４日は延長させることになる、請求項１９の方法。
【請求項３５】
細胞培養寿命を少なくとも６日は延長させることになる、請求項１９の方法。
【請求項３６】
非トランスフェクト細胞がＳｐ２／０であり、アポトーシス阻害剤がＢｃｌ−ＥＥＥであり、発現ベクターがプラスミドｐｄＨＬ２を含み、Ｂｃｌ−ＥＥＥおよび発現ベクターをトランスフェクトした細胞株が、バイオリアクター中でタンパク質を生産するために選択され、増幅される、請求項１９の方法。
【請求項１】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトし、無血清培地中で増殖成長するように適応させた哺乳動物細胞株。
【請求項２】
関心対象のタンパク質および選択可能なマーカータンパク質をコードするプラスミドを無血清培地中でさらにトランスフェクトした、請求項１の細胞株。
【請求項３】
アポトーシス阻害剤が、Ｔ６９Ｅ、Ｓ７０ＥおよびＳ８７Ｅ突然変異を持つＢｃｌ−２をコードする遺伝子を含む、請求項１の細胞株。
【請求項４】
プラスミドが抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、多価抗体またはそのフラグメントをコードする、請求項２の細胞株。
【請求項５】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株が、非トランスフェクト細胞株が示す密度に等しいかそれを上回る密度までの増殖成長を示す、請求項２の細胞株。
【請求項６】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株が、非トランスフェクト細胞株が示す密度より少なくとも１０％高い密度までの増殖成長を示す、請求項４の細胞株。
【請求項７】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株が、非トランスフェクト細胞株が示す密度より少なくとも２０％高い密度までの増殖成長を示す、請求項４の細胞株。
【請求項８】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株からのタンパク質生産量が、親細胞株からのタンパク質生産量よりも大きい、請求項２の細胞株。
【請求項９】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株からのタンパク質生産量が、親細胞株で観察される量の２倍である、請求項８の細胞株。
【請求項１０】
一つ以上の発現ベクターをさらにトランスフェクトした、請求項２の細胞株。
【請求項１１】
一つ以上の発現ベクターが染色体に組み込まれる、請求項１０の細胞株。
【請求項１２】
細胞株が、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０派生細胞株、ＮＳＯまたはＹＢ２／０からなる群より選択される骨髄腫細胞株である、請求項２の細胞株。
【請求項１３】
細胞株が、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨｅｐＧ２、ＢＨＫ２１、Ｐ３Ｘ３Ａｇ８．６５３およびＢＳＣ−１からなる群より選択される、請求項２の細胞株。
【請求項１４】
アポトーシス阻害剤が、Ｅ６、Ｅ７、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−ＥＥＥ、Ｂｈｒｆ１、ＫＳ−Ｂｃｌ−２、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、Ｂｃｌ−６およびＭｃｌ−１からなる群より選択される、請求項１の細胞株。
【請求項１５】
請求項２または請求項９に記載の細胞株によって生産されるタンパク質。
【請求項１６】
タンパク質が、抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、多価抗体またはそのフラグメントである、請求項１５のタンパク質。
【請求項１７】
タンパク質が成長因子、ホルモン、インターロイキン、インターフェロン、サイトカインまたは酵素である、請求項１５のタンパク質。
【請求項１８】
タンパク質が、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、トロンボポエチン、ＩＬ−１〜ＩＬ−３１、インターフェロン−α、インターフェロン−βおよびインターフェロン−γからなる群より選択される、請求項１７のタンパク質。
【請求項１９】
ａ）アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株であって、無血清培地中で増殖成長するように適応させた細胞株を取得すること、
ｂ）アポトーシス阻害剤をトランスフェクトした前記細胞株を貯蔵のために凍結すること、
ｃ）生産されるべき一つ以上のタンパク質をコードする一つ以上の発現ベクターをトランスフェクトする前に、前記凍結細胞株を融解すること、
ｄ）前記細胞株に一つ以上の発現ベクターを無血清条件下でトランスフェクトすること、および
ｅ）前記細胞株を無血清培地中で培養することにより、前記一つ以上の発現ベクターから一つ以上のタンパク質を生産すること、
を含む、タンパク質生産の方法。
【請求項２０】
アポトーシス阻害剤が、Ｔ６９Ｅ、Ｓ７０ＥおよびＳ８７Ｅ突然変異を持つＢｃｌ−２をコードする遺伝子を含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
発現ベクターが抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、多価抗体またはそのフラグメントをコードする、請求項１９の方法。
【請求項２２】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株が、非トランスフェクト細胞株が示す密度に等しいかそれを上回る密度までの増殖成長を示す、請求項１９の方法。
【請求項２３】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株が、非トランスフェクト細胞株が示す密度より少なくとも１０％高い密度までの増殖成長を示す、請求項２２の方法。
【請求項２４】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株が、非トランスフェクト細胞株が示す密度よりも少なくとも２０％高い密度までの増殖成長を示す、請求項２３の方法。
【請求項２５】
アポトーシスの阻害剤をトランスフェクトした細胞株からのタンパク質生産量が、親細胞株からのタンパク質生産量よりも大きい、請求項１９の方法。
【請求項２６】
前記細胞株が骨髄腫細胞株である、請求項１９の方法。
【請求項２７】
骨髄腫細胞株がＳｐ２／０もしくはその派生細胞株、マウスＮＳＯまたはラットＹＢ２／０細胞株である、請求項２６の方法。
【請求項２８】
細胞株が、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨｅｐＧ２、ＢＨＫ２１、Ｐ３Ｘ３Ａｇ８．６５３およびＢＳＣ−１からなる群より選択される、請求項１９の方法。
【請求項２９】
前記アポトーシス阻害剤が、Ｅ６、Ｅ７、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂｃｌ−ｗ、Ｂｃｌ−ＥＥＥ、Ｂｈｒｆ１、ＫＳ−Ｂｃｌ−２、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ、Ｂｃｌ−６およびＭｃｌ−１からなる群より選択される、請求項１９の方法。
【請求項３０】
少なくとも一つのカスパーゼ阻害剤を含む培地中で細胞株を増殖成長させることをさらに含む、請求項１９の方法。
【請求項３１】
前記カスパーゼ阻害剤が、カスパーゼ−１、カスパーゼ−３、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１２および汎カスパーゼ阻害剤からなる群より選択される、請求項３０の方法。
【請求項３２】
エリスロポエチンを含む培地中で細胞株を成長させることをさらに含む、請求項１９の方法。
【請求項３３】
カスパーゼ阻害剤が、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ｃｈｏ（配列番号７）、ＡｖｅｎおよびＸＩＡＰからなる群より選択される、請求項３１の方法。
【請求項３４】
細胞培養寿命を少なくとも４日は延長させることになる、請求項１９の方法。
【請求項３５】
細胞培養寿命を少なくとも６日は延長させることになる、請求項１９の方法。
【請求項３６】
非トランスフェクト細胞がＳｐ２／０であり、アポトーシス阻害剤がＢｃｌ−ＥＥＥであり、発現ベクターがプラスミドｐｄＨＬ２を含み、Ｂｃｌ−ＥＥＥおよび発現ベクターをトランスフェクトした細胞株が、バイオリアクター中でタンパク質を生産するために選択され、増幅される、請求項１９の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【公表番号】特表２００９−５０２１６７（Ｐ２００９−５０２１６７Ａ）
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２３９５１（Ｐ２００８−５２３９５１）
【出願日】平成１８年７月１４日（２００６．７．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２７８２０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１５８４８
【国際公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（５９９１７６２６３）イムノメディクス， インコーポレイテッド (16)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月１４日（２００６．７．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２７８２０
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１５８４８
【国際公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（５９９１７６２６３）イムノメディクス， インコーポレイテッド (16)
【Ｆターム（参考）】
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