細胞内パラメータを改変することができる分子をスクリーニングするための発光タンパク質プローブを用いて、前記パラメータを検出するための方法
本発明は、標的細胞内のパラメータを改変することができる分子をスクリーニングするための発光組換えタンパク質プローブによって、前記細胞内パラメータを検出するための方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内パラメータを改変することができる分子をスクリーニングするための発光組換えタンパク質プローブによって、前記パラメータを検出するための方法に関する。
【０００２】
特に本発明は、細胞内パラメータ及び／又は活性を改変することができる薬理学的及び／又は化粧品的及び／又は環境的関心のある分子をスクリーニングするための発光タンパク質プローブによって、前記パラメータ及び／又は活性を検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体を形成する細胞は、他の細胞及び細胞外環境と連続的な情報交換があることが知られている。
【０００４】
細胞間の連絡は、細胞の原形質膜の上に存在する特定の受容体と相互作用する化学的性質のシグナルを受信及び送信する、細胞の能力によって保証される。大抵の場合、これらの受容体の活性化は、細胞外メッセンジャー（又はファーストメッセンジャー）によってもたらされる情報を細胞に伝達する、セカンドメッセンジャーと呼ばれる細胞内メッセンジャーの生成を引き起こす。非常に様々な細胞外伝達物質に関しては、知られているセカンドメッセンジャーの数は驚くほど限られている：カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、イノシトール１，４，５−３リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、アデノシンのヌクレオチド及び環状ヌクレオチド（ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ）。
【０００５】
これらのセカンドメッセンジャーは、細胞内パラメータを変えることによって、決定的な細胞応答が得られるまでの一連の事象を誘導することができる、細胞応答エフェクターと呼ばれる一連の細胞内の実行体を次いで活性化させる。
【０００６】
細胞のパラメータは、濃度、活性化状態、細胞局在などの値であり、これらの値によって我々は、細胞内に存在するそれぞれ個々の要素（イオン、タンパク質、ヌクレオチド、シグナル分子）によって行われる活動を理解し、したがってそれを記載することが可能である。
【０００７】
前記細胞パラメータの変動は、細胞外環境由来の（生理学的又は薬理学的な）何らかの刺激に応じた、通常の基本指数の修正（濃度の変動、原形質膜への移動、活性化又は不活性化）を指す。
【０００８】
環境的、化学的、物理的又は遺伝的要因は、細胞シグナルの変換経路の改変を引き起こす病的状態を生み出す可能性がある。
【０００９】
薬剤の機能を理解するために、薬剤及びそれらの変形が作用するはずである様々な細胞内パラメータの正確なモニタリングを可能にする方法を利用することが必要である。
【００１０】
現在、シグナルの変換経路と関係がある、わずか数個の細胞伝達物質を検出するためのいくつかの技法が存在し、大抵の場合これらの技法は、数千個の分子の大規模なスクリーニング法、他方では薬剤、化学又は化粧品産業の分野で強く感じられている要件に有効ではなく、且つ／或いはそれらに容易に適用することができない。
【００１１】
最も広く研究されている細胞伝達物質はカルシウムイオン（Ｃａ２＋）であったし、依然としてこれである。増殖因子から神経伝達物質までの範囲の広く様々な刺激が、サイトゾルのＣａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｃ）の変動によって細胞内で伝達することが分かってきている。
【００１２】
Ｃａ２＋は、あらゆる細胞区画中に通常存在する遍在イオンであり、その濃度の変動によって多数の細胞機能を制御することができる。
【００１３】
Ｃａ２＋の濃度を測定するための最初の技法の開発は６０年代にさかのぼり、［Ｃａ２＋］ｃ及び多数の生物学的機能を調節する際のその役割を制御する機構を詳細に理解する始まりとなった。
【００１４】
最初の［Ｃａ２＋］ｃ測定は、Ｃａ２＋感受性蛍光タンパク質、エクオリンのＢａｌａｎｕｓの巨大細胞へのマイクロインジェクションによって実施され（Ｒｉｄｇｗａｙ及びＡｓｈｌｅｙ、１９６７）、その後数年間は、金属クロムインジケーター及び特異的微小電極がしばしば使用された。いずれの場合も、インジケーターへのマイクロインジェクション、又は細胞への電極の挿入の必要性、及びしたがって数個の大きな寸法の細胞型を使用する可能性によって、これらの技法は制限された。
【００１５】
９０年代には、原形質膜を通過し細胞質レベルにおいて捕捉された状態で存在することができる、例えばｑｕｉｎ２及びｆｕｒｙ−２などの蛍光Ｃａ２＋インジケーターの使用によって（Ｔｓｉｅｎら、１９８２、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚら、１９８５）、多くの細胞型においてＣａ２＋の細胞における恒常性を試験し、このイオンの偏在的役割を実証することができた。しかしながら、蛍光インジケーター使用の容易さは、様々な細胞内オルガネラ中に選択的に蓄積する不適性によって反対される。
【００１６】
しかしながら前述の技法は、薬理学的スクリーニング試験に容易に適用することはできず、いずれの場合もＣａ２＋のみの測定に限られる。
【００１７】
９０年代、分子生物学的技法の出現は、トランスフェクション技法によって細胞内に導入されるタンパク質プローブの構築に基づいて、Ｃａ２＋イオンをモニターするための新たな方法の開発に貢献した。Ｃａ２＋用の２つのカテゴリーの組換えプローブが現在存在する。
【００１８】
その第１群は、蛍光タンパク質ＧＦＰに由来する分子の蛍光特性を利用する（緑色蛍光タンパク質、Ｚｈａｎｇら、２００２）。これらのプローブは薬理学的スクリーニングに使用するのは困難である、何故ならこれらのプローブは、時間の点で非常にコストがかかる手順を必要とし、スタンバイ状態下で得られる蛍光シグナルと活性化状態下で得られる蛍光シグナルの間の比は、自動化された方法に使用することができるほど十分広範囲ではないからである。
【００１９】
第２のカテゴリーのプローブは、Ｃａ２＋と結合することができ、したがって測定してＣａ２＋自体の濃度と関連付けることが可能な発光線を放射することができる生物発光タンパク質、特にエクオリンの使用に基づく。
【００２０】
１９６２年に発光クラゲの１種、Ａｅｑｕｏｒｅａ Ｖｉｃｔｏｒｉａから抽出及び精製された（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、１９６２）エクオリンは、アポタンパク質、及びペルオキシド型の共有結合によってアポタンパク質と結合した疎水性補欠分子団、セレンテラジンからなる約２２ｋＤａのタンパク質である。
【００２１】
「ＥＦ−ハンド」型の３箇所の特定の高親和性部位のレベルでの、エクオリンとのＣａ２＋の結合は、タンパク質自体の立体配坐の改変、及びその後の共有結合の切断、及び光子の放出、並びに酸化した補酵素の放出を誘導する。
【００２２】
最大発光率、即ち飽和条件下に対する分率として表される光子の放出率（Ｌ）の対数（Ｌ／Ｌｍａｘ）と［Ｃａ２＋］の対数の間に関係が存在するおかげで、［Ｃａ２＋］の変動を測定することが可能である。ｐＨ、イオン強度［Ｍｇ２＋］及び温度の知られている条件下でのｉｎ ｖｉｔｒｏ測定によって得られるこれらの値は、Ｓ字形状検量線の構築を可能にし、これに基づいて、０．１〜１０μＭのＣａ２＋濃度の範囲内で（及び突然変異エクオリンを使用して１００μＭを超えて（Ｍｏｎｔｅｒｏら、１９９５）、消費されたエクオリンの分率と蛍光タンパク質が曝される［Ｃａ２＋］値を各地点において関連付けることができる。細胞から得られる発光シグナルの変換は、この関係、［Ｃａ２＋］の値に基づく。
【００２３】
エクオリンは生物発光マーカーとして、蛍光インジケーターに関するいくつかの利点を有する、何故ならエクオリンは、Ｃａ２＋の濃度の変動を測定するための信頼性の高い道具である適切な制御要素又はシグナルペプチドを使用することによって、様々な細胞区画に容易に向けることができるからである（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９２）。特にこの刊行物は、ミトコンドリアレベルでのＣａ２＋濃度を対象とし測定するための技法を記載する。
【００２４】
例えば核（Ｂｒｉｎｉら、１９９３；Ｂｒｉｎｉら、１９９４）、小胞体（Ｍｏｎｔｅｒｏら、１９９５）、ゴルジ装置（Ｐｉｎｔｏｎら、１９９８）、ミトコンドリア内膜空間（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９８）、筋小胞体（Ｂｒｉｎｉら、１９９７）、膜下領域（Ｍａｒｓａｕｌｔら、１９９７）などの他の細胞要素を対象とするエクオリンの様々な組換えプローブが後に開発され、これらが様々な種類の刺激後の、様々な細胞部分のＣａ２＋の濃度の変動の測定を可能にした。
【００２５】
発光の他の利点は、それが蛍光に関して励起光を必要とせず、したがって自己蛍光及び光退色現象を回避することである。さらにエクオリンは毒性ではなく、エクオリンは他のカチオンと結合を形成せず、細胞内のＣａ２＋濃度に干渉することはない。
【００２６】
著者達は以前に、Ｃａ２＋イオンの濃度を測定するための代替法として、哺乳動物細胞中で発現されるエクオリンなどのＣａ２＋感受性組換え蛍光タンパク質の使用を試験した（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９３；Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９４；Ｂｒｉｎｉら、１９９４ｂ；Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９５；Ｂｒｉｎｉら、１９９５；Ｄｅ Ｇｉｏｒｇｉら、１９９６；Ｒｕｔｔｅｒら、１９９６；Ｂｒｉｎｉら、１９９９；Ｒｏｂｅｒｔら、２０００；Ｐｏｒｃｅｌｌｉら、２００１；Ｃｈｉｅｓａら、２００１）。
【００２７】
エクオリンの使用には、以下に記載する一連の技法の利点がある：
ａ）最適なシグナル／ノイズの関係、何故なら哺乳動物細胞は、内在性の発光タンパク質を有していないからである；
ｂ）エクオリンの使用はトランスフェクト群のデータを集約し、したがって細胞の変動性に応じたエラーを回避する；
ｃ）エクオリンプローブは細胞系において単独で安定的に発現させることができ（したがって「永続的」且つ反復可能なスクリーニング系を得る）、或いは当該の特異的受容体と共に安定的に同時発現させることができる（したがって特定のシグナル系の機能分析を簡潔にする）；
ｄ）非常に簡潔な検出系、何故ならそれは、放射されるすべての光の発光スペクトルを回収するのに十分であり、発光シグナルが強い（光の発光がＣａ２＋濃度の変動と共に対数的に増大する）とき、分析するサンプルの小型化及び自動化に適しているからである。
【００２８】
しかしながら、カルシウムイオンの変動は容易に検出することができるが、それらは薬剤的関心がある多数のシグナル変換経路の数個のみと関係があることが観察されることは興味深い。しかしながら、既に示されているように、直接検出するのは困難であるが、おそらく薬理学的又は毒物学的関心がある分子を同定するために非常に重要である、他の細胞要素（細胞エフェクター、酵素、イオンチャネル、セカンドメッセンジャー）と関係がある多くの他の変換経路が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
前に示したことに鑑みて、細胞内パラメータ及び／又は活性を検出するため、前記パラメータ及び／又は活性の特異的な改変を引き起こすのに適した分子をスクリーニングするための、有効で、感度が良く且つ迅速な方法を利用することに関する必要性が明らかに存在する。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明者らは現在、細胞内パラメータの変動を間接的に検出することができ、容易に検出することができる対応するＣａ２＋イオンの濃度の変動に前記変動を納めることができる、新しい方法を開発してきている。特に、何らかの生理学的及び／又は薬理学的刺激に応答する他の細胞内パラメータ又は酵素活性の変動を反映するＣａ２＋の濃度の変動に応答して発光シグナルを放出することができるエクオリン蛍光タンパク質の使用に基づく、生物発光検出系が設定されてきている。
【００３１】
細胞内パラメータ及び活性をカルシウム濃度の変動に変換することによって、例えばｃＡＭＰなどのセカンドメッセンジャーの生成、並びに例えばキナーゼタンパク質（ＰＫＣなどの制御タンパク質）、又はｓｈｃファミリーのタンパク質（ｐ４６ｓｈｃ、ｐ５２ｓｈｃ又はｐ６６ｓｈｃなどのタンパク質アダプター）などの、実行体タンパク質の活性化及び／又は移動を追跡することができる。
【００３２】
当該の実行体タンパク質の中で、本発明者らは例示目的で、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）及びタンパク質ｐ６６ｓｈｃを調べた。活性化の後、ＰＫＣ及びｐ６６ｓｈｃが細胞質から、カルシウムイオンの濃度が細胞質中での濃度に対して高い原形質膜に移動するので、異なるＣａ２＋濃度に対して非常に敏感なＰＫＣ／エクオリン及びｐ６６ｓｈｃ／エクオリンのキメラタンパク質を、本発明者らは作製した。このようにして、膜への移動及びＰＫＣ及びｐ６６ｓｈｃのその後の活性化は、２つの細胞領域（細胞質及び膜下領域）中の異なるＣａ２＋濃度などの間接的なパラメータと関連付けた。
【００３３】
本発明者らは、膜のレベルでのＰＫＣ−エクオリン及びｐ６６ｓｈｃ−エクオリンの発光シグナルは（［Ｃａ２＋］に関する発光関数の非線形性のために）、非活性状態の細胞質レベルでは、ＰＫＣ−エクオリン及びｐ６６ｓｈｃ−エクオリンプローブの発光シグナルに関してより少なくとも５０〜１００倍強いことを示す。考慮するキメラタンパク質の発光シグナルは、これらのキメラタンパク質の原型を用いて実施した実験に関する図１〜６中に示すように、知られている活性化物質を用いた移動の誘導後はより一層強い。
【００３４】
本発明者らにより確認された方法は、タンパク質の移動／活性化を簡潔に、経済的に且つ有効に定量化することを可能にし、光の発光が移動度と比例して増大すると、前記タンパク質に対して活性がある化合物のスクリーニングを実施する。
【００３５】
平行して本発明者らは、検出系としてエクオリンを再度使用する、セカンドメッセンジャーの濃度値をＣａ２＋濃度値に変換するため、即ち定量化するのが困難であるシグナルを容易に検出することができるシグナルに変換するための、同じ革新的な系を適用した。
【００３６】
セカンドメッセンジャーの中で、本発明者らはｃＡＭＰを調べた。この場合、元の受容体の細胞内部分を置換した、即ち、ｃＡＭＰの生成によって細胞応答を活性化させることができる部分を、細胞内のＣａ２＋の濃度の変動を誘導することができる（Ｇｑタンパク質と結合した）受容体の細胞内部分で置換した、キメラ受容体を開発した。このように、ひとたびキメラ受容体が刺激されると、それはｃＡＭＰの濃度よりもカルシウムの濃度の増大を誘導すると思われる。
【００３７】
凝縮エクオリンを、ミトコンドリアがサイトゾルのカルシウムの濃度の増大を「増幅させる」という事実によるその高い感受性の結果として、それをミトコンドリア（ｍｔ−ＡＥＱ）に向けるシグナル周波数で（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９２）、検出プローブとして使用した。図７及び８から推測することができるように、ｍｔ−ＡＥＱプローブの発光シグナルは、カルシウムの濃度の増大と通常関係がある刺激（ヒスタミン及びＡＴＰ）で処理した細胞中、或いはｃＡＭＰの濃度の増大と関係がある刺激（イソプロテレノール又は痛覚物質）で処理した細胞中で比較可能である。
【００３８】
本発明者らによって発見されたエクオリンに基づく、この型の発光プローブの他の適用例は、カルシウムのイオンチャネルに作用する細胞エフェクター（ＰＫＣなど）の触媒活性を分析する可能性、及び前記触媒活性に干渉する薬剤を同定する可能性によって表される。カルシウムチャネルは、重要な細胞区画の膜、例えば原形質膜、小胞体の膜又はミトコンドリア内膜などに局在する。これらはカルシウムの細胞内の恒常性の微調節に関与しており、それらの機能の改変は病的状態と関係がある。
【００３９】
この目的のために本発明者らは、適切なエクオリンプローブ（当該のチャネルが局在する細胞区画に関して変わる）、及び細胞エフェクターによって正又は負に制御された、特定の場合ＰＫＣによって負に制御された、カルシウムチャネルを（内因的或いは遺伝子工学処理後に）発現する細胞系を使用した。
【００４０】
本発明者らによって設定された系では、キナーゼの酵素作用によって閉じることができないチャネルを介したカルシウムの流れを示すエクオリンの発光シグナルの増大を検出することにより、ＰＫＣの触媒活性を阻害することによって作用する物質を同定することができる。
【００４１】
本発明者らにより生成された発光プローブの様々な適用例は、試験する分子の差別化スクリーニングを実施するのを可能にし、そのスクリーニングは容易に自動化できるので、スクリーニングはＨＴＳ（高スループットスクリーニング）分析とＭＴＳ（中スループットスクリーニング）の両方、或いはＬＴＳ（低スループットスクリーニング）測定用に使用することができる。
【００４２】
したがって本発明の目的は、添付の特許請求の範囲に従ったスクリーニング法に関する。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、標的の細胞内パラメータの改変を引き起こすことができる分子のスクリーニング法であって、前記改変がＣａ２＋感受性組換えタンパク質プローブによって検出されるＣａ２＋イオンの細胞内濃度の比例変数に変換され、以下の段階：
ａ）前記プローブをコードする配列を含む発現ベクターであって、前記配列が１つに凝縮されたＣａ２＋感受性蛍光タンパク質、好ましくはエクオリン、及び少なくとも１つの細胞エフェクター又はシグナル配列をコードする配列を含むことを特徴とする発現ベクターの構築、
ｂ）Ｃａ２＋感受性組換えタンパク質プローブを含む前記ベクターを用いた少なくとも１つの哺乳動物の細胞系のトランスフェクション、
ｃ）前記組換えタンパク質プローブを発現する細胞系に補欠分子団、好ましくはセレンテラジンを加えることによる、エクオリンの活性化、
ｄ）前記組換えタンパク質プローブを発現する細胞系への試験分子の投与、
ｅ）細胞系において発現されたＣａ２＋感受性蛍光タンパク質、好ましくはエクオリンの一部分における光子の放出の検出を含むスクリーニング法を提供する。
【００４４】
さらに明確にするために、用語「Ｃａ２＋感受性蛍光タンパク質」は、カルシウムイオンとの結合後に光子を放出することができる任意のアミノ酸配列を指し；エクオリン及びオベリンタンパク質が実用的観点から特に重要である。
【００４５】
「実行体又はエフェクタータンパク質」は、制御タンパク質、膜受容体と連結するタンパク質、膜チャネルと連結するタンパク質、膜脂質と連結するタンパク質を指す。
【００４６】
「制御タンパク質」は、それが他のシグナル分子と相互作用した後に他の細胞要素の活性及び／又は構造を改変することができる、任意のアミノ酸配列を指す。
【００４７】
「膜受容体と連結するタンパク質」は、細胞膜のレベルで位置する受容体と相互作用することができるアミノ酸配列を指す。これらの中では、活性化受容体と第３のタンパク質、及び受容体の活性に直接干渉する調節物質間の相互作用を可能にする、アダプターを識別することができる。
【００４８】
用語「膜チャネルと連結するタンパク質」は、細胞膜のレベルで位置するチャネルと相互作用することができるアミノ酸配列を示す。
【００４９】
さらに、用語「膜脂質と連結するタンパク質」は、細胞膜のレベルで位置する脂質と相互作用することができるアミノ酸配列として認められる。
【００５０】
最後に、用語細胞区画は、好ましくは細胞膜によって境界が定められた細胞内の任意の領域：例えば細胞質、原形質膜の下の領域、核、ミトコンドリア、内質小胞体、ゴルジ装置、小胞、溶解性エンドソームなどを指す。
【００５１】
添付の図面の図を個々に参照しながら、その好ましい実施形態に従い、非制限的な目的ではなく例示目的で本発明を以下に記載する：
【実施例】
【００５２】
（実施例１）
当該の細胞エフェクター、キナーゼタンパク質Ｃ（ＰＫＣ）の原形質膜への移動の分析
材料及び方法
ＰＫＣ−エクオリンキメラプローブの構築
我々の手順を確認するために、それぞれ異なるＰＫＣイソ型を含む、様々な型の一連のＰＫＣ−エクオリンキメラプローブを設計した：
１）ＰＫＣベータ−エクオリン（ベータＰＫＣ：ｒｅｆ．Ｍ１３９７５）
２）ＰＫＣデルタ−エクオリン（デルタＰＫＣ：ｒｅｆ．Ｍ１８３３０）；
３）ＰＫＣイプシロン−エクオリン（イプシロンＰＫＣ：ｒｅｆ．ＡＦ０２８００９）；
４）ＰＫＣゼータ−エクオリン（ゼータＰＫＣ：ｒｅｆ．Ｍ１８３３２）；
５）ＰＫＣガンマ−エクオリン；
６）ＰＫＣアルファ−エクオリン（アルファＰＫＣ：ｒｅｆ．Ｍ１３９７３）；
７）ＰＫＣ−ラムダ−エクオリン；
８）ＰＫＣシータ−エクオリン（シータＰＫＣ：ｒｅｆ．Ｌ０７０３２）；
９）ＰＫＣエータ−エクオリン。
【００５３】
特に、ＰＫＣ−エクオリンプローブを構築するために使用したエクオリンのヌクレオチド配列は以下の通りである：
【化１】
【００５４】
特定の実施例では、示された結果は、ＰＫＣベータ−エクオリン（ＰＣＫβ−ＡＥＱ）、ＰＫＣデルタ−エクオリン（ＰＣＫδ−ＡＥＱ）、ＰＫＣイプシロン−エクオリン（ＰＣＫε−ＡＥＱ）、ＰＫＣゼータ−エクオリン（ＰＣＫζ−ＡＥＱ）プローブの使用と関係がある。
【００５５】
前に記載したエクオリンをコードする配列とインフレームで凝縮させた様々なＰＫＣイソ型をコードする配列を、真核生物の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３；５．４ｋｂ）中に挿入することによって、これらのプローブを得た。
【００５６】
キメラプローブの局在は、この具体例ＰＫＣにおいてその細胞内経路を追跡するタンパク質の元の配列内に含まれていたシグナルペプチドによって測定した。ＰＫＣをコードする配列のＣ末端にエクオリンのｃＤＮＡを加えることによって、調べるタンパク質の配向又は生理的挙動を変えることはない。
【００５７】
この時点で、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ７又はＨｅｋ２９３細胞などの異なる細胞系において、得られたキメラプローブのトランスフェクションを実施する。
【００５８】
細胞系の遺伝子工学処理
示した実施例中では、細胞応答を活性化させるために任意の他の要素を発現させることは、使用した細胞系には必要ではなかった。しかしながら試験要件に応じて、細胞が試験する分子／薬剤に特異的な受容体を発現するのを誘導して、有効な結合度を保証し、これによって形質導入系の機能分析を簡潔にすることは可能である。
【００５９】
細胞のトランスフェクション
細胞培養フラスコ（７５ｃｍ２）で培養した細胞を、問題の細胞系に最も適したトランスフェクション技法を使用して、生成したキメラプローブを含むベクターを用いてトランスフェクトした。ＨｅＬａ安定化細胞系を実験モデルとして使用したので、この細胞系に関して高い割合の陽性細胞を保証するリン酸カルシウム技法を、トランスフェクション法として採用した。
【００６０】
キメラプローブを発現する細胞の回収
トランスフェクション後３６時間で、フラスコ中に含まれていた細胞を、トリプシン処理によって底部から剥離させた。次いで細胞の懸濁液をファルコンチューブ（１５〜５０ｍｌ）に移し、２０℃で１２００ｒｐｍの遠心分離にかけ、最後に細胞の沈殿をＫＲＢ（クレブス−リンガーの改変バッファー：１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＮａ３ＰＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、５．５ｍＭのグルコース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３７℃）中に再懸濁させた。
【００６１】
活性形へのエクオリン蛍光タンパク質の再構築
補欠分子団セレンテラジンを、５μＭの最終濃度でＰＫＣ−エクオリンプローブを発現する細胞の懸濁液に加えた。
【００６２】
マルチウェルプレート上での接種
トランスフェクトした細胞（約１００，０００の細胞に相当）を含む５０μｌの懸濁液を、プレートのそれぞれのウェルに接種した。これらの細胞は１〜２時間の範囲の時間放置して付着させ、セレンテラジンの光不安定性のために細胞は暗所に保った。
【００６３】
応答の検出
インキュベーション時間の最後に、試験する様々な分子をそれぞれのウェルに加え、処理した細胞を含むプレートを、エクオリンの一部分における光子の放出を測定する光電子増倍管と次いで直接接触させた。
【００６４】
結果
生きている細胞中でのＰＫＣの移動を調節することができる化合物を試験するために、この簡潔な試験を使用することができる。
【００６５】
図１〜４は、前に記載した方法に従う、ＰＫＣベータ、デルタ、イプシロン及びデルタのｃｐｓの移動の測定を示すグラフを示す。
【００６６】
示した実施例は２つの平行した細胞群で行った：
ａ）ＰＫＣ−エクオリン（ＰＫＣ−ＡＥＱ）プローブを発現するＨｅＬａ細胞（暗線）。
これらの細胞は次いで：
− 薬剤の作用を模倣するためにＰＭＡ（１μＭ、ＳＩＧＭＡ）で処理したＨｅＬａＰＫＣ−エクオリン細胞（濃い暗線）；
− ＰＭＡで処理しなかった対照ＨｅＬａＰＫＣ−エクオリン細胞（薄い暗線）；
ｂ）サイトゾルエクオリンプローブ（ｃｙｔ−ＡＥＱ）（如何なるタンパク質にも凝縮されない）を発現するＨｅＬａ細胞（光線）にさらに分けた。
これらの細胞は次いで：
− 薬剤の作用を模倣するためにＰＭＡで処理したサイトゾルエクオリンを有するＨｅＬａ細胞（濃い光線）；
− ＰＭＡで処理しなかったサイトゾルエクオリンを有する対照ＨｅＬａ細胞（薄い光線）；にさらに分けた。
【００６７】
図１〜４に示すグラフの傾向から観察することができるように、外部からのカルシウムの不在下では、光子の放出（ｃｐｓ：秒当たりの計数値として表す）は、調べたすべての条件下において非常に低い強度（１００ｃｐｓ未満）を有する。実際このような条件下では、ｃｙｔ−ＡＥＱプローブ（ＰＭＡホルボールエステルの不在下及び存在下）及びＰＫＣ−ＡＥＱプローブ（ＰＭＡの不在下）が局在する細胞質中、原形質膜の下、即ちＰＭＡを用いた処理の後にＰＫＣ−ＡＥＱプローブが移動する場所のカルシウムの濃度は、非常に低い（０．１μＭ）。
【００６８】
外部からのカルシウムを加えることは、原形質膜下の領域中のカルシウム濃度の必然的な増大を伴う、原形質膜上に位置するチャネルを介したこのイオンの重要な流れを誘導する。これらの条件下では、ＰＭＡで処理したＰＫＣ−ＡＥＱプローブを発現する細胞中のみで、光子の放出の多大な増大が記録され（＞１００，０００ｃｐｓ）、キナーゼの完全な移動を示す。
【００６９】
すべての他の群の細胞において、エクオリンの一部分における光子の放出の有意な変動は存在しない（１０，０００ｃｐｓ未満）。
【００７０】
グラフから、最大活性化物質（ＰＭＡ）の不在下で観察したｃｐｓ値より高いすべてのｃｐｓ値が、キナーゼの完全な移動を示すであろうことは明らかである。この系に関しては、得られたｃｐｓ値と細胞系の最大刺激条件下で記録された最大ｃｐｓ値の間の比に基づいて、移動を誘導することができる分子を同定することだけでなく、試験分子によって行われた活性化又は阻害の量を評価することも、したがって可能である。
【００７１】
移動効率は、対照（０％）（ＰＭＡを含まない）条件下で得たｃｐｓ値と、（ＰＭＡを用いた処理後の）最大移動（１００％）後に得たｃｐｓ値の間の範囲に基づいて、それを表すことによって測定することができ、これらは以下のように記載することができる：
− 最大活性化物質に対して７０％〜１００％の範囲の値の優れた活性化物質；
− 最大活性化物質に対して４０％〜７０％の範囲の値の中程度の活性化物質；
− 最大活性化物質に対して１０％〜４０％の範囲の値の低度の活性化物質；
− 最大活性化物質に対して１０％未満の値の非活性化物質。
【００７２】
この結果は、外部刺激に応答したサイトゾル区画から原形質膜へのタンパク質の移動を測定するために提案した、系の有効性を明らかに示す。
【００７３】
（実施例２）
高血糖状態下でのベータＰＫＣの原形質膜への移動の分析
材料及び方法
キメラＰＫＣ−エクオリンプローブの構築
実施例１で既に記載したベータ−エクオリンＰＫＣプローブを使用し、それを用いてＨＵＶＥＣ内皮細胞をトランスフェクトした。
【００７４】
細胞系の遺伝子工学処理
与えた実施例中では、細胞応答を開始させるために任意の他の要素を事前に発現させることは、使用した細胞系には必要ではなかった。しかしながら試験要件に応じて、細胞が試験する分子／薬剤に特異的な受容体を発現するのを誘導して、十分な結合度を保証し、これによって形質導入系の機能分析を簡潔にすることは可能である。
【００７５】
細胞のトランスフェクション
細胞培養フラスコ（７５ｃｍ２）で培養した細胞を、問題の細胞系に最も適したトランスフェクション技法を使用して、生成したキメラプローブを含むベクターを用いてトランスフェクトした。ＨＵＶＥＣと呼ばれる安定状態の臍帯静脈の内皮細胞を実験モデルとして使用し、この細胞系に関して高い割合の陽性細胞を保証するリポフェクタミンを使用し、ＰＫＣベータ−エクオリンプローブを用いて、これらの細胞をトランスフェクトした。
【００７６】
キメラプローブを発現する細胞の回収
トランスフェクション後３６時間で、フラスコ中に含まれていた細胞を、トリプシン処理によって底部から剥離させた。次いで細胞の懸濁液をファルコンチューブ（１５又は５０ｍｌ）に移し、２０℃で１２００ｒｐｍの遠心分離にかけ、最後に細胞の沈殿をＫＲＢ（クレブス−リンガーの改変バッファー：１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＮａ３ＰＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、５．５ｍＭのグルコース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３７℃）中に再懸濁させた。
【００７７】
活性形へのエクオリン発光タンパク質の再構築
補欠分子団セレンテラジンを、５μＭの最終濃度でＰＫＣベータ−エクオリンプローブを発現する細胞の懸濁液に加えた。
【００７８】
マルチウェルプレート上での接種
トランスフェクトした細胞（約１００，０００の細胞に相当）を含む５０μｌの懸濁液を、プレートのそれぞれのウェルに接種した。これらの細胞は１〜２時間の範囲の時間放置して付着させ、セレンテラジンの光不安定性のために細胞は暗所に保った。
【００７９】
応答の検出
インキュベーション時間の最後に、試験する様々な分子をそれぞれのウェルに加え、処理した細胞を含むプレートを、エクオリンの一部分における光子の放出を測定する光電子増倍管と次いで直接接触させた。
【００８０】
結果
生きている細胞中でのＰＫＣの移動を調節することができる化合物を試験するために、この簡潔な試験をしたがって使用することができる。
【００８１】
図５は、前に記載した方法に従う、ＰＫＣベータの移動の測定を示すグラフを示す。
【００８２】
与えた実施例は３つの平行した細胞群で行った：
ａ）対照条件（グルコースの不在）下に保った、ＰＫＣベータ−エクオリン（ＰＫＣβ−ＡＥＱ）プローブを発現するＨＵＶＥＣ細胞（点線）。
ｂ）高血糖状態（１０ｍＭのグルコース）下に保った、ＰＫＣベータ−エクオリン（ＰＫＣβ−ＡＥＱ）プローブを発現するＨＵＶＥＣ細胞（黒、太線）。
ｃ）よく知られている抗糖尿病剤、メトホルミン（２０μＭ）で処理し高血糖状態（１０ｍＭのグルコース）下に保った、ＰＫＣベータ−エクオリン（ＰＫＣβ−ＡＥＱ）プローブを発現するＨＵＶＥＣ細胞（黒、細線）。
【００８３】
図５に示すグラフの傾向から見ることができるように、外部からのカルシウムの不在下では、光子の放出（ｃｐｓ：秒当たりの計数値として表す）は、調べたすべての条件下において非常に低い強度（１００ｃｐｓ未満）である。実際これらの条件下では、（グルコースの不在下で）ＰＫＣβ−ＡＥＱプローブが局在する細胞質中、及び原形質膜の下、即ちグルコースを用いた処理の後にＰＫＣβ−ＡＥＱプローブが移動する場所のカルシウムの濃度は、非常に低い（０．１μＭ）。
【００８４】
外部からのカルシウムを加えることは、原形質膜下の領域中のカルシウム濃度の必然的な増大を伴う、原形質膜上に位置するチャネルを介した前記イオンの持続的な流れを誘導する。これらの条件下では、高濃度のグルコースで処理したＰＫＣβ−ＡＥＱプローブを発現する細胞中のみで、光子の放出の多大な増大が記録され（＞１００，０００ｃｐｓ）、高血糖状態下でのキナーゼの完全な移動を示す。
【００８５】
抗糖尿病剤で処理し高血糖状態下に保った細胞は、光子の放出の点で応答の相当な低下を示し（４０，０００ｃｐｓ未満）、これはＰＫＣβ−ＡＥＱプローブの移動の十分な阻害を意味する。
【００８６】
対照細胞では、エクオリンの一部分における光子の放出の有意な変動は観察されない（１０，０００ｃｐｓ未満）。
【００８７】
グラフから、抗糖尿病剤メトホルミンにより、高濃度のグルコース状態下に保った細胞を処理することによって、高血糖状態下においてグルコースによって誘導される移動を阻害することは明らかとなる。
【００８８】
この系に関しては、移動を阻害することができる分子を同定することだけでなく、対照（０％）（グルコースを含まない）条件下で得たｃｐｓ値と、（高濃度のグルコースを用いた処理後の）最大移動（１００％）後に得たｃｐｓ値の間の範囲に基づいてそれを表すことによって、その効率を評価することも可能であり、これらは以下のように記載することができる：
− 最大活性化物質に対して１０％〜４０％の範囲の値の優れた阻害剤；
− 最大活性化物質に対して４０％〜７０％の範囲の値の中程度の阻害剤；
− 最大活性化物質に対して７０％〜１００％の範囲の値の低度の活性化物質；
【００８９】
この結果は、外部刺激に応答したサイトゾル区画から原形質膜へのタンパク質の移動を測定するために提案した、系の有効性を明らかに示す。
【００９０】
（実施例３）
ｓｈｃタンパク質のファミリーに属するタンパク質アダプターｐ６６の、原形質膜への移動の分析
材料及び方法
キメラｐ６６ｓｈｃ−エクオリンプローブの構築
キメラプローブｐ６６ｓｈｃ−エクオリンを設計して、我々の手順をさらに確認した。
【００９１】
ｐ６６ｓｈｃ−エクオリンプローブを構築するために使用したタンパク質ｐ６６ｓｈｃのヌクレオチド配列は、参照としてＰＵＢＭＥＤ９０４９３００を有する。
【００９２】
ｐ６６ｓｈｃ−エクオリンプローブを構築するために使用したエクオリンのヌクレオチド配列は、以下の通りである：
【化２】
【００９３】
エクオリンをコードする配列とインフレームで凝縮させたｐ６６ｓｈｃタンパク質をコードする配列を、真核生物の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３；５．４ｋｂ）中に挿入することによって、このプローブを得た。
【００９４】
キメラプローブの局在は、この具体例ｐ６６ｓｈｃにおいてその細胞内経路を追跡するタンパク質の元の配列内に含まれていたシグナルペプチドによって測定する。ｐ６６ｓｈｃをコードする配列のＣ末端にエクオリンのｃＤＮＡを加えることによって、調べるタンパク質の配向又は生理的挙動を変えることはない。
【００９５】
この時点で、Ａ４３１、ＤＭＳ７９などの異なる細胞系において、得られたキメラタンパク質プローブのトランスフェクションを実施する。
【００９６】
細胞系の遺伝子工学処理
示した実施例中では、細胞応答を活性化させるために任意の他の要素を発現させることは、使用した細胞系には必要ではなかった。しかしながら試験要件に応じて、細胞が試験する分子／薬剤に特異的な受容体を発現するのを誘導して、有効な結合度を保証し、これによって形質導入系の機能分析を簡潔にすることは可能である。
【００９７】
細胞のトランスフェクション
細胞培養フラスコ（７５ｃｍ２）で培養した細胞を、問題の細胞系に最も適したトランスフェクション技法を使用して、生成したキメラプローブを含むベクターを用いてトランスフェクトした。この細胞系に関して高い割合の陽性細胞を保証する「Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬」手順（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を使用して、安定状態のトランスフェクト細胞系Ａ４３１を実験モデルとして採用した。
【００９８】
トランスフェクション後２４時間、無血清ＤＭＥＭ培地中に細胞を保った。
【００９９】
キメラプローブを発現する細胞の回収
トランスフェクション後３６時間で、フラスコ中に含まれていた細胞を、トリプシン処理によって底部から剥離させた。次いで細胞の懸濁液をファルコンチューブ（１５〜５０ｍｌ）に移し、２０℃で１２００ｒｐｍの遠心分離にかけ、最後に細胞の沈殿をＫＲＢ（クレブス−リンガーの改変バッファー：１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＮａ３ＰＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、５．５ｍＭのグルコース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３７℃）中に再懸濁させた。
【０１００】
活性形へのエクオリン発光タンパク質の再構築
補欠分子団セレンテラジンを、５μＭの最終濃度でｐ６６ｓｈｃ−エクオリンプローブを発現する細胞の懸濁液に加えた。
【０１０１】
マルチウェルプレート上での接種
トランスフェクトした細胞（約１００，０００の細胞に相当）を含む５０μｌの懸濁液を、プレートのそれぞれのウェルに接種した。これらの細胞は１〜２時間の範囲の時間放置して付着させ、セレンテラジンの光不安定性のために細胞は暗所に保った。
【０１０２】
応答の検出
インキュベーション時間の最後に、試験する様々な分子をそれぞれのウェルに加え、処理した細胞を含むプレートを、エクオリンの一部分における光子の放出を測定する光電子増倍管と次いで直接接触させた。
【０１０３】
結果
生きている細胞中でのｓｈｃファミリーのタンパク質の移動を調節することができる化合物を試験するために、この簡潔な試験を使用することができる。
【０１０４】
図６は、前に記載した方法に従うｐ６６ｓｈｃの移動の測定を示すグラフを示す。
【０１０５】
示した実施例は２つの平行した細胞群で行った：
ａ）ｐ６６ｓｈｃ−エクオリン（ｐ６６ｓｈｃ−ＡＥＱ）プローブを発現するＡ４３１細胞（暗線）。
これらの細胞は次いで：
− ＥＧＦ（表皮成長因子）（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理した−Ａ４３１ｐ６６ｓｈｃ−エクオリン細胞（濃い暗線）；
− 対照Ａ４３１ｐ６６ｓｈｃ−エクオリン細胞、即ちＥＧＦで処理しなかった細胞（薄い暗線）；
ｂ）サイトゾルエクオリンプローブ（ｃｙｔ−ＡＥＱ）（如何なるタンパク質にも凝縮されない）を発現するＡ４３１細胞（光線）にさらに分けた。
これらの細胞は次いで：
− ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）で処理したサイトゾルエクオリンを有するＡ４３１細胞（濃い光線）；
− サイトゾルエクオリンを有する対照Ａ４３１細胞、即ちＥＧＦで処理しなかった細胞（薄い光線）にさらに分けた。
【０１０６】
図６に示すグラフの傾向から観察することができるように、外部からのカルシウムの不在下では、光子の放出（ｃｐｓ：秒当たりの計数値として表す）は、調べたすべての条件下において非常に低い強度（１００ｃｐｓ未満）を有する。実際このような条件下では、ｃｙｔ−ＡＥＱプローブ（ＥＧＦ成長因子の不在下及び存在下）及びｐ６６ｓｈｃ−ＡＥＱプローブ（ＥＧＦの不在下）が局在する細胞質中、及び原形質膜の下、即ちＥＧＦを用いた処理の後にｐ６６ｓｈｃ−ＡＥＱプローブが移動する場所のカルシウムの濃度は、非常に低い（０．１μＭ）。
【０１０７】
外部からのカルシウムを加えることは、原形質膜下の領域中のカルシウム濃度の必然的な増大を伴う、原形質膜上に位置するチャネルを介したこのイオンの重要な流れを誘導する。これらの条件下では、ＥＧＦで処理したｐ６６ｓｈｃ−ＡＥＱプローブを発現する細胞中のみで、光子の放出の多大な増大が記録され（＞１００，０００ｃｐｓ）、このタンパク質の完全な移動を示す。
【０１０８】
すべての他の群の細胞において、エクオリンの一部分における光子の放出の有意な変動は存在しない（１０，０００ｃｐｓ未満）。
【０１０９】
グラフから、最大活性化物質（ＥＧＦ）の不在下で観察したｃｐｓ値より高いすべてのｃｐｓ値が、キナーゼの完全な移動を示すであろうことは明らかである。この系に関しては、タンパク質の完全又は不完全な移動を確認することによって、一方ではＥＧＦ成長因子によって活性化させたものに対して他の経路を介したｓｈｃタンパク質の移動を誘導することができる分子、及び他方では、ＥＧＦ因子によって活性化される細胞内変換経路を遮断することができる分子を同定することが、したがって可能である。
【０１１０】
対照（０％）（ＥＧＦを含まない）条件下で得たｃｐｓ値と（ＥＧＦを用いた処理後の）最大移動（１００％）後に得たｃｐｓ値の間の範囲に基づいてそれを表すことによって、前記移動を分子が誘導（又は遮断）する効率を測定することもでき、これらは以下のように記載することができる：
− 最大活性化物質に対して７０％〜１００％の範囲の値の優れた活性化物質；
− 最大活性化物質に対して４０％〜７０％の範囲の値の中程度の活性化物質；
− 最大活性化物質に対して１０％〜４０％の範囲の値の低度の活性化物質；
− 最大活性化物質に対して１０％未満の値の非活性化物質。
【０１１１】
この結果は、外部刺激に応答したサイトゾル区画から原形質膜へのタンパク質の移動を測定するために提案した、系の有効性を明らかに示す。
【０１１２】
（実施例４）
当該の第２細胞メッセンジャー、ｃＡＭＰの濃度の変動の分析
材料及び方法
ｍｔ−ＡＥＱプローブの構築
ｍｔ−ＡＥＱプローブの記載は、論文（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９２）中に詳細に記載されている。
【０１１３】
ｍｔ−エクオリンプローブの細胞発現系の遺伝子工学処理
この適用例のために２つの細胞系を、ｃＡＭＰの機能を制御することができる異なる薬剤を試験することができると思われる２つの異なるキメラ受容体を、細胞系が発現することができるように遺伝子工学処理した。
【０１１４】
使用した第１のキメラ受容体は、（ｃＡＭＰの生成と関係がある）ベータアドレナリン作動性受容体の細胞外部分と（カルシウムの濃度の変動と関係がある）アルファアドレナリン作動性受容体の細胞内部分（Ｃｏｔｅｃｃｈｉａら、１９９２）を凝縮することによって構築し、ここでは以後ベータ／アルファアドレナリン作動性受容体と呼ぶ。
【０１１５】
前記受容体をＨｅＬａ細胞において発現させ、これによって当該の特定の薬剤を用いた刺激に応答することができる遺伝子工学処理した細胞系を得た。
【０１１６】
使用した第２のキメラ受容体は、（ｃＡＭＰの生成と関係がある）痛覚物質用のＯＲＬ１受容体の細胞外部分と（カルシウムの濃度の変動と関係がある）アルファアドレナリン作動性受容体の細胞内部分（Ｃｏｔｅｃｃｈｉａら、１９９２）を凝縮することによって構築し、ここでは以後ＯＲＬ１／アルファアドレナリン作動性受容体と呼ぶ。
【０１１７】
前記受容体をＣＨＯ細胞において発現させ、これによって当該の特定の薬剤を用いた刺激に応答することができる遺伝子工学処理した細胞系を得た。
【０１１８】
細胞のトランスフェクション
このようにして遺伝子工学処理した細胞系は、リン酸カルシウム技法により
ｍｔ−ＡＥＱプローブを含むベクターを用いて、次いでいずれもトランスフェクトした。
【０１１９】
キメラプローブを発現する細胞の回収
トランスフェクション後３６時間で、細胞培養用のフラスコ（７５ｃｍ２）で培養した細胞を、トリプシン処理によって底部から剥離させた。次いで細胞の懸濁液を（１５又は５０ｍｌの）ファルコンチューブに移し、２０℃において細胞遠心分離装置中で１２００ｒｐｍの遠心分離にかけ、最後に細胞の沈殿をＫＲＢ／Ｃａ２＋（クレブス−リンガーの改変バッファー：１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＮａ３ＰＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、５．５ｍＭのグルコース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３７℃）中に再懸濁させた。
【０１２０】
活性形へのエクオリン蛍光タンパク質の再構築
補欠分子団セレンテラジンを、５μＭの最終濃度でｍｔ−ＡＥＱプローブを発現する遺伝子工学処理した細胞の懸濁液に加えた。
【０１２１】
マルチウェルプレート上での接種
トランスフェクトした細胞（約１００，０００の細胞に相当）を含む５０μｌの懸濁液を、プレートのそれぞれのウェルに接種した。これらの細胞は１〜２時間の範囲の時間放置して付着させ、セレンテラジンの光不安定性のために細胞は暗所に保った。
【０１２２】
応答の検出
インキュベーション時間の最後に、試験する様々な分子をそれぞれのウェルに加え、処理した細胞を含むプレートを、エクオリンの一部分における光子の放出を測定する光電子増倍管と次いで直接接触させた。
【０１２３】
結果
特定の受容体の活性化によってｃＡＭＰの濃度の変動を誘導することができる化合物を試験するために、この簡潔な試験をしたがって使用することができる。
【０１２４】
それぞれｍｔ−ＡＥＱプローブ及びキメラ受容体（ベータ／アルファアドレナリン作動性）及びキメラ受容体（ＯＲＬ１／アルファアドレナリン作動性）
を発現する、ＨｅＬａ及びＣＨＯ細胞で実験を行った。
【０１２５】
ＨｅＬａ細胞（図７）は以下のもので処理した：
− ヒスタミンＨ１の内因性受容体の刺激により、カルシウムの正常な増大を誘導するためのヒスタミン（１００μＭ、ＳＩＧＭＡ）（暗線）。
− キメラ受容体の刺激により、カルシウムの増大を誘導するためのイソプロテレノール（１００μＭ、ＳＩＧＭＡ）（光線）。
【０１２６】
ベータアドレナリン作動性受容体を発現し、前記受容体の刺激を誘導するためにイソプロテレノールで刺激したＨｅＬａ細胞は、対照として使用した（点線）。
【０１２７】
ＣＨＯ細胞（図８）は以下のもので処理した：
− ＡＴＰ Ｐ２Ｙの内因性受容体の刺激により、カルシウムの正常な増大を誘導するためのＡＴＰ（１００μＭ、ＳＩＧＭＡ）（暗線）。
− キメラ受容体の刺激により、カルシウムの増大を誘導するための痛覚物質（１μＭ）（光線）。
【０１２８】
野生型ＯＲＬ１受容体を発現し、前記受容体の刺激を誘導するために痛覚物質で刺激したＣＨＯ細胞は、対照として使用した（点線）。
【０１２９】
図７及び８は、前に記載した方法を用いたｃＡＭＰの生成及びｃＡＭＰの濃度の変動の測定の、２つの例を示すグラフを示す。グラフの分析から観察することができるように、刺激の不在下では、光子の放出（ｃｐｓ：秒当たりの計数値）は非常に低く、ほぼゼロである（１００ｃｐｓ）。これらの基本条件下では、ｍｔ−ＡＥＱプローブが局在するミトコンドリアマトリクス中のカルシウムの濃度は、非常に低い（０．２μＭ）。
【０１３０】
文献（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９２；Ｐｉｎｔｏｎら、１９９８）中に広く記載されているように、ＨｅＬａ細胞の場合のヒスタミンを用いた刺激、及びＣＨＯ細胞の場合のＡＴＰを用いた刺激は、ミトコンドリアマトリクス中のカルシウムの濃度の相当且つ一時的な増大を誘導する。
【０１３１】
この増大は、エクオリンの一部分における桁外れの光子の放出で表される（１秒当たりに放出される２０未満の光子から８０，０００を超える光子まで）。
【０１３２】
提案した系の有効性を確認するために我々は、キメラ受容体の細胞外部分の特異的アゴニスト（イソプロテレノール及び痛覚物質）を用いて細胞を刺激した。この場合も光線は、エクオリンの一部分における光子の放出の有意な増大（１秒当たりに放出される２０未満の光子から８０，０００を超える光子まで）がどのような状態で存在するかを示し、イソプロテレノール及び痛覚物質（ｃＡＭＰの生成及びｃＡＭＰの濃度の増大と通常関係がある）を用いた刺激は、カルシウムの濃度の変動と関係があるシグナルに変換されることを示す。これとは反対に、ｃＡＭＰの生成としたがって関係がある、イソプロテレノールを用いたベータアドレナリン作動性受容体を発現する細胞の刺激、及び痛覚物質を用いたＯＲＬ１野生型受容体を発現する細胞の刺激は、ｃｐｓの如何なる増大も誘導せず、カルシウムの濃度の非増大を示す。カルシウムの濃度の変動と関係がある細胞内部分を有するキメラ受容体を発現する細胞において、ｃｐｓの増大を誘導する任意の物質が、ｃＡＭＰの濃度を変えることができるであろうことは明らかである。
【０１３３】
この結果は、ｃＡＭＰの生成と関係がある特定の受容体の活性化を測定するために提案した、系の有効性を明らかに実証する。
【０１３４】
（実施例５）
カルシウム用のチャネルの機能状態の制御における、当該の細胞エフェクター、ＰＫＣの触媒活性の活性化／阻害の分析
この方法を確認するために、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルと呼ばれる原形質膜のレベルに位置する特定のカルシウムチャネルにおける、ＰＫＣの触媒活性の分析実験を実施した。
【０１３５】
この具体例では、ＰＫＣ依存性リン酸化によって阻害されるＬ型のＣａ２＋チャネル、及び調べるチャネルと直接接触する原形質膜下に局在するエクオリンによって表されるプローブ（ＳＮＡＰ−ＡＥＱ）（Ｍａｒｓａｕｌｔら、１９９７）で、細胞をトランスフェクトした。
【０１３６】
材料及び方法
ＳＮＡＰ−ＡＥＱプローブの構築
ＳＮＡＰ−ＡＥＱプローブの記載は、論文（Ｍａｒｓａｕｌｔら、１９９７）中に詳細に記載されている。
【０１３７】
ＳＮＡＰ−ＡＥＱプローブの細胞発現系の遺伝子工学処理
この適用例のために、カルシウムチャネル（この場合Ｌ型）を有する細胞系を遺伝子工学処理することが必要である。
【０１３８】
当該の細胞エフェクター（ＰＫＣ）によってその活性が制御されるカルシウムチャネルを発現するように、ＨｅＬａ細胞を遺伝子工学処理した。
【０１３９】
細胞のトランスフェクション
遺伝子工学処理した細胞系は、リン酸カルシウム法によりＳＮＡＰ−ＡＥＱプローブを含むベクターを用いて、次いでトランスフェクトした。
【０１４０】
キメラプローブを発現する細胞の回収
トランスフェクション後３６時間で、細胞培養用のフラスコ（７５ｃｍ２）で培養した細胞を、トリプシン処理によって底部から剥離させた。次いで細胞の懸濁液を（１５又は５０ｍｌの）ファルコンチューブに移し、２０℃において細胞遠心分離装置中で１２００ｒｐｍの遠心分離にかけ、最後に細胞の沈殿をＫＲＢ（クレブス−リンガーの改変バッファー：１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＮａ３ＰＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、５．５ｍＭのグルコース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３７℃）中に再懸濁させた。
【０１４１】
活性形へのエクオリン蛍光タンパク質の再構築
補欠分子団セレンテラジンを、５μＭの最終濃度でＳＮＡＰ−ＡＥＱプローブを発現する遺伝子工学処理した細胞の懸濁液に加えた。
【０１４２】
マルチウェルプレート上での接種
トランスフェクト及び再構築した細胞（約１００，０００の細胞に相当）を含む５０μｌの懸濁液を、プレートのそれぞれのウェルに接種した。これらの細胞は１〜２時間の範囲の時間放置して付着させ、セレンテラジンの光不安定性のために細胞は暗所に保った。
【０１４３】
応答の検出
インキュベーション時間の最後に、試験する様々な分子をそれぞれのウェルに加え、処理した細胞を含むプレートを、エクオリンの一部分における光子の放出を測定する光電子増倍管と次いで直接接触させた。
【０１４４】
この試験によって、当該の細胞エフェクターの触媒活性、及びその結果カルシウムチャネルの機能状態を改変することができる分子を同定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】ＰＭＡ刺激の存在下又は不在下でのイソ型ＰＫＣβ−エクオリンを有するプローブの移動単位（ｃｐｓ）、及びエクオリンサイトゾルｃｙｔ−ＡＥＱプローブに関する違いの測定を示すグラフの図である。
【図２】ＰＭＡ刺激の存在下又は不在下でのイソ型ＰＫＣδ−エクオリンを有するプローブの移動単位（ｃｐｓ）、及びエクオリンサイトゾルｃｙｔ−ＡＥＱプローブに関する違いの測定を示すグラフの図である。
【図３】ＰＭＡ刺激の存在下又は不在下でのＰＫＣε−エクオリンイソ型を有するプローブの移動単位（ｃｐｓ）、及びエクオリンサイトゾルｃｙｔ−ＡＥＱプローブに関する違いの測定を示すグラフの図である。
【図４】ＰＭＡ刺激の存在下又は不在下でのＰＫＣζ−エクオリンイソ型を有するプローブの移動単位（ｃｐｓ）、及びエクオリンサイトゾルｃｙｔ−ＡＥＱプローブに関する違いの測定を示すグラフの図である。
【図５】薬剤の存在下又は不在下での高血糖状態下における、ＰＫＣβ−ＡＥＱプローブの移動単位（ｃｐｓ）の測定を示すグラフの図である。
【図６】ＥＧＦ刺激の存在下又は不在下でのｐ６６ｓｈｃ−ＡＥＱプローブの移動単位（ｃｐｓ）、及びエクオリンサイトゾルｃｙｔ−ＡＥＱプローブに関する違いの測定を示すグラフの図である。
【図７】ベータアドレナリン作動性受容体とイソプロテノール、或いはベータ／アルファアドレナリン作動性キメラ受容体とイソプロテノール又はヒスタミンの存在下での、ｃＡＭＰ濃度の増大の単位（ｃｐｓ）の測定を示すグラフの図である。
【図８】痛覚物質の野生型ＯＲＬ１受容体、及び痛覚物質、或いはアドレナリン作動性ＯＲＬ１／アルファアキメラ受容体、及びＡＴＰ又は痛覚物質の存在下での、ｃＡＭＰ濃度の増大の単位（ｃｐｓ）の測定を示すグラフの図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内パラメータを改変することができる分子をスクリーニングするための発光組換えタンパク質プローブによって、前記パラメータを検出するための方法に関する。
【０００２】
特に本発明は、細胞内パラメータ及び／又は活性を改変することができる薬理学的及び／又は化粧品的及び／又は環境的関心のある分子をスクリーニングするための発光タンパク質プローブによって、前記パラメータ及び／又は活性を検出するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
生体を形成する細胞は、他の細胞及び細胞外環境と連続的な情報交換があることが知られている。
【０００４】
細胞間の連絡は、細胞の原形質膜の上に存在する特定の受容体と相互作用する化学的性質のシグナルを受信及び送信する、細胞の能力によって保証される。大抵の場合、これらの受容体の活性化は、細胞外メッセンジャー（又はファーストメッセンジャー）によってもたらされる情報を細胞に伝達する、セカンドメッセンジャーと呼ばれる細胞内メッセンジャーの生成を引き起こす。非常に様々な細胞外伝達物質に関しては、知られているセカンドメッセンジャーの数は驚くほど限られている：カルシウムイオン（Ｃａ２＋）、イノシトール１，４，５−３リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、アデノシンのヌクレオチド及び環状ヌクレオチド（ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ）。
【０００５】
これらのセカンドメッセンジャーは、細胞内パラメータを変えることによって、決定的な細胞応答が得られるまでの一連の事象を誘導することができる、細胞応答エフェクターと呼ばれる一連の細胞内の実行体を次いで活性化させる。
【０００６】
細胞のパラメータは、濃度、活性化状態、細胞局在などの値であり、これらの値によって我々は、細胞内に存在するそれぞれ個々の要素（イオン、タンパク質、ヌクレオチド、シグナル分子）によって行われる活動を理解し、したがってそれを記載することが可能である。
【０００７】
前記細胞パラメータの変動は、細胞外環境由来の（生理学的又は薬理学的な）何らかの刺激に応じた、通常の基本指数の修正（濃度の変動、原形質膜への移動、活性化又は不活性化）を指す。
【０００８】
環境的、化学的、物理的又は遺伝的要因は、細胞シグナルの変換経路の改変を引き起こす病的状態を生み出す可能性がある。
【０００９】
薬剤の機能を理解するために、薬剤及びそれらの変形が作用するはずである様々な細胞内パラメータの正確なモニタリングを可能にする方法を利用することが必要である。
【００１０】
現在、シグナルの変換経路と関係がある、わずか数個の細胞伝達物質を検出するためのいくつかの技法が存在し、大抵の場合これらの技法は、数千個の分子の大規模なスクリーニング法、他方では薬剤、化学又は化粧品産業の分野で強く感じられている要件に有効ではなく、且つ／或いはそれらに容易に適用することができない。
【００１１】
最も広く研究されている細胞伝達物質はカルシウムイオン（Ｃａ２＋）であったし、依然としてこれである。増殖因子から神経伝達物質までの範囲の広く様々な刺激が、サイトゾルのＣａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｃ）の変動によって細胞内で伝達することが分かってきている。
【００１２】
Ｃａ２＋は、あらゆる細胞区画中に通常存在する遍在イオンであり、その濃度の変動によって多数の細胞機能を制御することができる。
【００１３】
Ｃａ２＋の濃度を測定するための最初の技法の開発は６０年代にさかのぼり、［Ｃａ２＋］ｃ及び多数の生物学的機能を調節する際のその役割を制御する機構を詳細に理解する始まりとなった。
【００１４】
最初の［Ｃａ２＋］ｃ測定は、Ｃａ２＋感受性蛍光タンパク質、エクオリンのＢａｌａｎｕｓの巨大細胞へのマイクロインジェクションによって実施され（Ｒｉｄｇｗａｙ及びＡｓｈｌｅｙ、１９６７）、その後数年間は、金属クロムインジケーター及び特異的微小電極がしばしば使用された。いずれの場合も、インジケーターへのマイクロインジェクション、又は細胞への電極の挿入の必要性、及びしたがって数個の大きな寸法の細胞型を使用する可能性によって、これらの技法は制限された。
【００１５】
９０年代には、原形質膜を通過し細胞質レベルにおいて捕捉された状態で存在することができる、例えばｑｕｉｎ２及びｆｕｒｙ−２などの蛍光Ｃａ２＋インジケーターの使用によって（Ｔｓｉｅｎら、１９８２、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚら、１９８５）、多くの細胞型においてＣａ２＋の細胞における恒常性を試験し、このイオンの偏在的役割を実証することができた。しかしながら、蛍光インジケーター使用の容易さは、様々な細胞内オルガネラ中に選択的に蓄積する不適性によって反対される。
【００１６】
しかしながら前述の技法は、薬理学的スクリーニング試験に容易に適用することはできず、いずれの場合もＣａ２＋のみの測定に限られる。
【００１７】
９０年代、分子生物学的技法の出現は、トランスフェクション技法によって細胞内に導入されるタンパク質プローブの構築に基づいて、Ｃａ２＋イオンをモニターするための新たな方法の開発に貢献した。Ｃａ２＋用の２つのカテゴリーの組換えプローブが現在存在する。
【００１８】
その第１群は、蛍光タンパク質ＧＦＰに由来する分子の蛍光特性を利用する（緑色蛍光タンパク質、Ｚｈａｎｇら、２００２）。これらのプローブは薬理学的スクリーニングに使用するのは困難である、何故ならこれらのプローブは、時間の点で非常にコストがかかる手順を必要とし、スタンバイ状態下で得られる蛍光シグナルと活性化状態下で得られる蛍光シグナルの間の比は、自動化された方法に使用することができるほど十分広範囲ではないからである。
【００１９】
第２のカテゴリーのプローブは、Ｃａ２＋と結合することができ、したがって測定してＣａ２＋自体の濃度と関連付けることが可能な発光線を放射することができる生物発光タンパク質、特にエクオリンの使用に基づく。
【００２０】
１９６２年に発光クラゲの１種、Ａｅｑｕｏｒｅａ Ｖｉｃｔｏｒｉａから抽出及び精製された（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら、１９６２）エクオリンは、アポタンパク質、及びペルオキシド型の共有結合によってアポタンパク質と結合した疎水性補欠分子団、セレンテラジンからなる約２２ｋＤａのタンパク質である。
【００２１】
「ＥＦ−ハンド」型の３箇所の特定の高親和性部位のレベルでの、エクオリンとのＣａ２＋の結合は、タンパク質自体の立体配坐の改変、及びその後の共有結合の切断、及び光子の放出、並びに酸化した補酵素の放出を誘導する。
【００２２】
最大発光率、即ち飽和条件下に対する分率として表される光子の放出率（Ｌ）の対数（Ｌ／Ｌｍａｘ）と［Ｃａ２＋］の対数の間に関係が存在するおかげで、［Ｃａ２＋］の変動を測定することが可能である。ｐＨ、イオン強度［Ｍｇ２＋］及び温度の知られている条件下でのｉｎ ｖｉｔｒｏ測定によって得られるこれらの値は、Ｓ字形状検量線の構築を可能にし、これに基づいて、０．１〜１０μＭのＣａ２＋濃度の範囲内で（及び突然変異エクオリンを使用して１００μＭを超えて（Ｍｏｎｔｅｒｏら、１９９５）、消費されたエクオリンの分率と蛍光タンパク質が曝される［Ｃａ２＋］値を各地点において関連付けることができる。細胞から得られる発光シグナルの変換は、この関係、［Ｃａ２＋］の値に基づく。
【００２３】
エクオリンは生物発光マーカーとして、蛍光インジケーターに関するいくつかの利点を有する、何故ならエクオリンは、Ｃａ２＋の濃度の変動を測定するための信頼性の高い道具である適切な制御要素又はシグナルペプチドを使用することによって、様々な細胞区画に容易に向けることができるからである（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９２）。特にこの刊行物は、ミトコンドリアレベルでのＣａ２＋濃度を対象とし測定するための技法を記載する。
【００２４】
例えば核（Ｂｒｉｎｉら、１９９３；Ｂｒｉｎｉら、１９９４）、小胞体（Ｍｏｎｔｅｒｏら、１９９５）、ゴルジ装置（Ｐｉｎｔｏｎら、１９９８）、ミトコンドリア内膜空間（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９８）、筋小胞体（Ｂｒｉｎｉら、１９９７）、膜下領域（Ｍａｒｓａｕｌｔら、１９９７）などの他の細胞要素を対象とするエクオリンの様々な組換えプローブが後に開発され、これらが様々な種類の刺激後の、様々な細胞部分のＣａ２＋の濃度の変動の測定を可能にした。
【００２５】
発光の他の利点は、それが蛍光に関して励起光を必要とせず、したがって自己蛍光及び光退色現象を回避することである。さらにエクオリンは毒性ではなく、エクオリンは他のカチオンと結合を形成せず、細胞内のＣａ２＋濃度に干渉することはない。
【００２６】
著者達は以前に、Ｃａ２＋イオンの濃度を測定するための代替法として、哺乳動物細胞中で発現されるエクオリンなどのＣａ２＋感受性組換え蛍光タンパク質の使用を試験した（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９３；Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９４；Ｂｒｉｎｉら、１９９４ｂ；Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９５；Ｂｒｉｎｉら、１９９５；Ｄｅ Ｇｉｏｒｇｉら、１９９６；Ｒｕｔｔｅｒら、１９９６；Ｂｒｉｎｉら、１９９９；Ｒｏｂｅｒｔら、２０００；Ｐｏｒｃｅｌｌｉら、２００１；Ｃｈｉｅｓａら、２００１）。
【００２７】
エクオリンの使用には、以下に記載する一連の技法の利点がある：
ａ）最適なシグナル／ノイズの関係、何故なら哺乳動物細胞は、内在性の発光タンパク質を有していないからである；
ｂ）エクオリンの使用はトランスフェクト群のデータを集約し、したがって細胞の変動性に応じたエラーを回避する；
ｃ）エクオリンプローブは細胞系において単独で安定的に発現させることができ（したがって「永続的」且つ反復可能なスクリーニング系を得る）、或いは当該の特異的受容体と共に安定的に同時発現させることができる（したがって特定のシグナル系の機能分析を簡潔にする）；
ｄ）非常に簡潔な検出系、何故ならそれは、放射されるすべての光の発光スペクトルを回収するのに十分であり、発光シグナルが強い（光の発光がＣａ２＋濃度の変動と共に対数的に増大する）とき、分析するサンプルの小型化及び自動化に適しているからである。
【００２８】
しかしながら、カルシウムイオンの変動は容易に検出することができるが、それらは薬剤的関心がある多数のシグナル変換経路の数個のみと関係があることが観察されることは興味深い。しかしながら、既に示されているように、直接検出するのは困難であるが、おそらく薬理学的又は毒物学的関心がある分子を同定するために非常に重要である、他の細胞要素（細胞エフェクター、酵素、イオンチャネル、セカンドメッセンジャー）と関係がある多くの他の変換経路が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
前に示したことに鑑みて、細胞内パラメータ及び／又は活性を検出するため、前記パラメータ及び／又は活性の特異的な改変を引き起こすのに適した分子をスクリーニングするための、有効で、感度が良く且つ迅速な方法を利用することに関する必要性が明らかに存在する。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
本発明者らは現在、細胞内パラメータの変動を間接的に検出することができ、容易に検出することができる対応するＣａ２＋イオンの濃度の変動に前記変動を納めることができる、新しい方法を開発してきている。特に、何らかの生理学的及び／又は薬理学的刺激に応答する他の細胞内パラメータ又は酵素活性の変動を反映するＣａ２＋の濃度の変動に応答して発光シグナルを放出することができるエクオリン蛍光タンパク質の使用に基づく、生物発光検出系が設定されてきている。
【００３１】
細胞内パラメータ及び活性をカルシウム濃度の変動に変換することによって、例えばｃＡＭＰなどのセカンドメッセンジャーの生成、並びに例えばキナーゼタンパク質（ＰＫＣなどの制御タンパク質）、又はｓｈｃファミリーのタンパク質（ｐ４６ｓｈｃ、ｐ５２ｓｈｃ又はｐ６６ｓｈｃなどのタンパク質アダプター）などの、実行体タンパク質の活性化及び／又は移動を追跡することができる。
【００３２】
当該の実行体タンパク質の中で、本発明者らは例示目的で、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）及びタンパク質ｐ６６ｓｈｃを調べた。活性化の後、ＰＫＣ及びｐ６６ｓｈｃが細胞質から、カルシウムイオンの濃度が細胞質中での濃度に対して高い原形質膜に移動するので、異なるＣａ２＋濃度に対して非常に敏感なＰＫＣ／エクオリン及びｐ６６ｓｈｃ／エクオリンのキメラタンパク質を、本発明者らは作製した。このようにして、膜への移動及びＰＫＣ及びｐ６６ｓｈｃのその後の活性化は、２つの細胞領域（細胞質及び膜下領域）中の異なるＣａ２＋濃度などの間接的なパラメータと関連付けた。
【００３３】
本発明者らは、膜のレベルでのＰＫＣ−エクオリン及びｐ６６ｓｈｃ−エクオリンの発光シグナルは（［Ｃａ２＋］に関する発光関数の非線形性のために）、非活性状態の細胞質レベルでは、ＰＫＣ−エクオリン及びｐ６６ｓｈｃ−エクオリンプローブの発光シグナルに関してより少なくとも５０〜１００倍強いことを示す。考慮するキメラタンパク質の発光シグナルは、これらのキメラタンパク質の原型を用いて実施した実験に関する図１〜６中に示すように、知られている活性化物質を用いた移動の誘導後はより一層強い。
【００３４】
本発明者らにより確認された方法は、タンパク質の移動／活性化を簡潔に、経済的に且つ有効に定量化することを可能にし、光の発光が移動度と比例して増大すると、前記タンパク質に対して活性がある化合物のスクリーニングを実施する。
【００３５】
平行して本発明者らは、検出系としてエクオリンを再度使用する、セカンドメッセンジャーの濃度値をＣａ２＋濃度値に変換するため、即ち定量化するのが困難であるシグナルを容易に検出することができるシグナルに変換するための、同じ革新的な系を適用した。
【００３６】
セカンドメッセンジャーの中で、本発明者らはｃＡＭＰを調べた。この場合、元の受容体の細胞内部分を置換した、即ち、ｃＡＭＰの生成によって細胞応答を活性化させることができる部分を、細胞内のＣａ２＋の濃度の変動を誘導することができる（Ｇｑタンパク質と結合した）受容体の細胞内部分で置換した、キメラ受容体を開発した。このように、ひとたびキメラ受容体が刺激されると、それはｃＡＭＰの濃度よりもカルシウムの濃度の増大を誘導すると思われる。
【００３７】
凝縮エクオリンを、ミトコンドリアがサイトゾルのカルシウムの濃度の増大を「増幅させる」という事実によるその高い感受性の結果として、それをミトコンドリア（ｍｔ−ＡＥＱ）に向けるシグナル周波数で（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９２）、検出プローブとして使用した。図７及び８から推測することができるように、ｍｔ−ＡＥＱプローブの発光シグナルは、カルシウムの濃度の増大と通常関係がある刺激（ヒスタミン及びＡＴＰ）で処理した細胞中、或いはｃＡＭＰの濃度の増大と関係がある刺激（イソプロテレノール又は痛覚物質）で処理した細胞中で比較可能である。
【００３８】
本発明者らによって発見されたエクオリンに基づく、この型の発光プローブの他の適用例は、カルシウムのイオンチャネルに作用する細胞エフェクター（ＰＫＣなど）の触媒活性を分析する可能性、及び前記触媒活性に干渉する薬剤を同定する可能性によって表される。カルシウムチャネルは、重要な細胞区画の膜、例えば原形質膜、小胞体の膜又はミトコンドリア内膜などに局在する。これらはカルシウムの細胞内の恒常性の微調節に関与しており、それらの機能の改変は病的状態と関係がある。
【００３９】
この目的のために本発明者らは、適切なエクオリンプローブ（当該のチャネルが局在する細胞区画に関して変わる）、及び細胞エフェクターによって正又は負に制御された、特定の場合ＰＫＣによって負に制御された、カルシウムチャネルを（内因的或いは遺伝子工学処理後に）発現する細胞系を使用した。
【００４０】
本発明者らによって設定された系では、キナーゼの酵素作用によって閉じることができないチャネルを介したカルシウムの流れを示すエクオリンの発光シグナルの増大を検出することにより、ＰＫＣの触媒活性を阻害することによって作用する物質を同定することができる。
【００４１】
本発明者らにより生成された発光プローブの様々な適用例は、試験する分子の差別化スクリーニングを実施するのを可能にし、そのスクリーニングは容易に自動化できるので、スクリーニングはＨＴＳ（高スループットスクリーニング）分析とＭＴＳ（中スループットスクリーニング）の両方、或いはＬＴＳ（低スループットスクリーニング）測定用に使用することができる。
【００４２】
したがって本発明の目的は、添付の特許請求の範囲に従ったスクリーニング法に関する。
【００４３】
本発明の好ましい実施形態では、標的の細胞内パラメータの改変を引き起こすことができる分子のスクリーニング法であって、前記改変がＣａ２＋感受性組換えタンパク質プローブによって検出されるＣａ２＋イオンの細胞内濃度の比例変数に変換され、以下の段階：
ａ）前記プローブをコードする配列を含む発現ベクターであって、前記配列が１つに凝縮されたＣａ２＋感受性蛍光タンパク質、好ましくはエクオリン、及び少なくとも１つの細胞エフェクター又はシグナル配列をコードする配列を含むことを特徴とする発現ベクターの構築、
ｂ）Ｃａ２＋感受性組換えタンパク質プローブを含む前記ベクターを用いた少なくとも１つの哺乳動物の細胞系のトランスフェクション、
ｃ）前記組換えタンパク質プローブを発現する細胞系に補欠分子団、好ましくはセレンテラジンを加えることによる、エクオリンの活性化、
ｄ）前記組換えタンパク質プローブを発現する細胞系への試験分子の投与、
ｅ）細胞系において発現されたＣａ２＋感受性蛍光タンパク質、好ましくはエクオリンの一部分における光子の放出の検出を含むスクリーニング法を提供する。
【００４４】
さらに明確にするために、用語「Ｃａ２＋感受性蛍光タンパク質」は、カルシウムイオンとの結合後に光子を放出することができる任意のアミノ酸配列を指し；エクオリン及びオベリンタンパク質が実用的観点から特に重要である。
【００４５】
「実行体又はエフェクタータンパク質」は、制御タンパク質、膜受容体と連結するタンパク質、膜チャネルと連結するタンパク質、膜脂質と連結するタンパク質を指す。
【００４６】
「制御タンパク質」は、それが他のシグナル分子と相互作用した後に他の細胞要素の活性及び／又は構造を改変することができる、任意のアミノ酸配列を指す。
【００４７】
「膜受容体と連結するタンパク質」は、細胞膜のレベルで位置する受容体と相互作用することができるアミノ酸配列を指す。これらの中では、活性化受容体と第３のタンパク質、及び受容体の活性に直接干渉する調節物質間の相互作用を可能にする、アダプターを識別することができる。
【００４８】
用語「膜チャネルと連結するタンパク質」は、細胞膜のレベルで位置するチャネルと相互作用することができるアミノ酸配列を示す。
【００４９】
さらに、用語「膜脂質と連結するタンパク質」は、細胞膜のレベルで位置する脂質と相互作用することができるアミノ酸配列として認められる。
【００５０】
最後に、用語細胞区画は、好ましくは細胞膜によって境界が定められた細胞内の任意の領域：例えば細胞質、原形質膜の下の領域、核、ミトコンドリア、内質小胞体、ゴルジ装置、小胞、溶解性エンドソームなどを指す。
【００５１】
添付の図面の図を個々に参照しながら、その好ましい実施形態に従い、非制限的な目的ではなく例示目的で本発明を以下に記載する：
【実施例】
【００５２】
（実施例１）
当該の細胞エフェクター、キナーゼタンパク質Ｃ（ＰＫＣ）の原形質膜への移動の分析
材料及び方法
ＰＫＣ−エクオリンキメラプローブの構築
我々の手順を確認するために、それぞれ異なるＰＫＣイソ型を含む、様々な型の一連のＰＫＣ−エクオリンキメラプローブを設計した：
１）ＰＫＣベータ−エクオリン（ベータＰＫＣ：ｒｅｆ．Ｍ１３９７５）
２）ＰＫＣデルタ−エクオリン（デルタＰＫＣ：ｒｅｆ．Ｍ１８３３０）；
３）ＰＫＣイプシロン−エクオリン（イプシロンＰＫＣ：ｒｅｆ．ＡＦ０２８００９）；
４）ＰＫＣゼータ−エクオリン（ゼータＰＫＣ：ｒｅｆ．Ｍ１８３３２）；
５）ＰＫＣガンマ−エクオリン；
６）ＰＫＣアルファ−エクオリン（アルファＰＫＣ：ｒｅｆ．Ｍ１３９７３）；
７）ＰＫＣ−ラムダ−エクオリン；
８）ＰＫＣシータ−エクオリン（シータＰＫＣ：ｒｅｆ．Ｌ０７０３２）；
９）ＰＫＣエータ−エクオリン。
【００５３】
特に、ＰＫＣ−エクオリンプローブを構築するために使用したエクオリンのヌクレオチド配列は以下の通りである：
【化１】
【００５４】
特定の実施例では、示された結果は、ＰＫＣベータ−エクオリン（ＰＣＫβ−ＡＥＱ）、ＰＫＣデルタ−エクオリン（ＰＣＫδ−ＡＥＱ）、ＰＫＣイプシロン−エクオリン（ＰＣＫε−ＡＥＱ）、ＰＫＣゼータ−エクオリン（ＰＣＫζ−ＡＥＱ）プローブの使用と関係がある。
【００５５】
前に記載したエクオリンをコードする配列とインフレームで凝縮させた様々なＰＫＣイソ型をコードする配列を、真核生物の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３；５．４ｋｂ）中に挿入することによって、これらのプローブを得た。
【００５６】
キメラプローブの局在は、この具体例ＰＫＣにおいてその細胞内経路を追跡するタンパク質の元の配列内に含まれていたシグナルペプチドによって測定した。ＰＫＣをコードする配列のＣ末端にエクオリンのｃＤＮＡを加えることによって、調べるタンパク質の配向又は生理的挙動を変えることはない。
【００５７】
この時点で、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ７又はＨｅｋ２９３細胞などの異なる細胞系において、得られたキメラプローブのトランスフェクションを実施する。
【００５８】
細胞系の遺伝子工学処理
示した実施例中では、細胞応答を活性化させるために任意の他の要素を発現させることは、使用した細胞系には必要ではなかった。しかしながら試験要件に応じて、細胞が試験する分子／薬剤に特異的な受容体を発現するのを誘導して、有効な結合度を保証し、これによって形質導入系の機能分析を簡潔にすることは可能である。
【００５９】
細胞のトランスフェクション
細胞培養フラスコ（７５ｃｍ２）で培養した細胞を、問題の細胞系に最も適したトランスフェクション技法を使用して、生成したキメラプローブを含むベクターを用いてトランスフェクトした。ＨｅＬａ安定化細胞系を実験モデルとして使用したので、この細胞系に関して高い割合の陽性細胞を保証するリン酸カルシウム技法を、トランスフェクション法として採用した。
【００６０】
キメラプローブを発現する細胞の回収
トランスフェクション後３６時間で、フラスコ中に含まれていた細胞を、トリプシン処理によって底部から剥離させた。次いで細胞の懸濁液をファルコンチューブ（１５〜５０ｍｌ）に移し、２０℃で１２００ｒｐｍの遠心分離にかけ、最後に細胞の沈殿をＫＲＢ（クレブス−リンガーの改変バッファー：１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＮａ３ＰＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、５．５ｍＭのグルコース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３７℃）中に再懸濁させた。
【００６１】
活性形へのエクオリン蛍光タンパク質の再構築
補欠分子団セレンテラジンを、５μＭの最終濃度でＰＫＣ−エクオリンプローブを発現する細胞の懸濁液に加えた。
【００６２】
マルチウェルプレート上での接種
トランスフェクトした細胞（約１００，０００の細胞に相当）を含む５０μｌの懸濁液を、プレートのそれぞれのウェルに接種した。これらの細胞は１〜２時間の範囲の時間放置して付着させ、セレンテラジンの光不安定性のために細胞は暗所に保った。
【００６３】
応答の検出
インキュベーション時間の最後に、試験する様々な分子をそれぞれのウェルに加え、処理した細胞を含むプレートを、エクオリンの一部分における光子の放出を測定する光電子増倍管と次いで直接接触させた。
【００６４】
結果
生きている細胞中でのＰＫＣの移動を調節することができる化合物を試験するために、この簡潔な試験を使用することができる。
【００６５】
図１〜４は、前に記載した方法に従う、ＰＫＣベータ、デルタ、イプシロン及びデルタのｃｐｓの移動の測定を示すグラフを示す。
【００６６】
示した実施例は２つの平行した細胞群で行った：
ａ）ＰＫＣ−エクオリン（ＰＫＣ−ＡＥＱ）プローブを発現するＨｅＬａ細胞（暗線）。
これらの細胞は次いで：
− 薬剤の作用を模倣するためにＰＭＡ（１μＭ、ＳＩＧＭＡ）で処理したＨｅＬａＰＫＣ−エクオリン細胞（濃い暗線）；
− ＰＭＡで処理しなかった対照ＨｅＬａＰＫＣ−エクオリン細胞（薄い暗線）；
ｂ）サイトゾルエクオリンプローブ（ｃｙｔ−ＡＥＱ）（如何なるタンパク質にも凝縮されない）を発現するＨｅＬａ細胞（光線）にさらに分けた。
これらの細胞は次いで：
− 薬剤の作用を模倣するためにＰＭＡで処理したサイトゾルエクオリンを有するＨｅＬａ細胞（濃い光線）；
− ＰＭＡで処理しなかったサイトゾルエクオリンを有する対照ＨｅＬａ細胞（薄い光線）；にさらに分けた。
【００６７】
図１〜４に示すグラフの傾向から観察することができるように、外部からのカルシウムの不在下では、光子の放出（ｃｐｓ：秒当たりの計数値として表す）は、調べたすべての条件下において非常に低い強度（１００ｃｐｓ未満）を有する。実際このような条件下では、ｃｙｔ−ＡＥＱプローブ（ＰＭＡホルボールエステルの不在下及び存在下）及びＰＫＣ−ＡＥＱプローブ（ＰＭＡの不在下）が局在する細胞質中、原形質膜の下、即ちＰＭＡを用いた処理の後にＰＫＣ−ＡＥＱプローブが移動する場所のカルシウムの濃度は、非常に低い（０．１μＭ）。
【００６８】
外部からのカルシウムを加えることは、原形質膜下の領域中のカルシウム濃度の必然的な増大を伴う、原形質膜上に位置するチャネルを介したこのイオンの重要な流れを誘導する。これらの条件下では、ＰＭＡで処理したＰＫＣ−ＡＥＱプローブを発現する細胞中のみで、光子の放出の多大な増大が記録され（＞１００，０００ｃｐｓ）、キナーゼの完全な移動を示す。
【００６９】
すべての他の群の細胞において、エクオリンの一部分における光子の放出の有意な変動は存在しない（１０，０００ｃｐｓ未満）。
【００７０】
グラフから、最大活性化物質（ＰＭＡ）の不在下で観察したｃｐｓ値より高いすべてのｃｐｓ値が、キナーゼの完全な移動を示すであろうことは明らかである。この系に関しては、得られたｃｐｓ値と細胞系の最大刺激条件下で記録された最大ｃｐｓ値の間の比に基づいて、移動を誘導することができる分子を同定することだけでなく、試験分子によって行われた活性化又は阻害の量を評価することも、したがって可能である。
【００７１】
移動効率は、対照（０％）（ＰＭＡを含まない）条件下で得たｃｐｓ値と、（ＰＭＡを用いた処理後の）最大移動（１００％）後に得たｃｐｓ値の間の範囲に基づいて、それを表すことによって測定することができ、これらは以下のように記載することができる：
− 最大活性化物質に対して７０％〜１００％の範囲の値の優れた活性化物質；
− 最大活性化物質に対して４０％〜７０％の範囲の値の中程度の活性化物質；
− 最大活性化物質に対して１０％〜４０％の範囲の値の低度の活性化物質；
− 最大活性化物質に対して１０％未満の値の非活性化物質。
【００７２】
この結果は、外部刺激に応答したサイトゾル区画から原形質膜へのタンパク質の移動を測定するために提案した、系の有効性を明らかに示す。
【００７３】
（実施例２）
高血糖状態下でのベータＰＫＣの原形質膜への移動の分析
材料及び方法
キメラＰＫＣ−エクオリンプローブの構築
実施例１で既に記載したベータ−エクオリンＰＫＣプローブを使用し、それを用いてＨＵＶＥＣ内皮細胞をトランスフェクトした。
【００７４】
細胞系の遺伝子工学処理
与えた実施例中では、細胞応答を開始させるために任意の他の要素を事前に発現させることは、使用した細胞系には必要ではなかった。しかしながら試験要件に応じて、細胞が試験する分子／薬剤に特異的な受容体を発現するのを誘導して、十分な結合度を保証し、これによって形質導入系の機能分析を簡潔にすることは可能である。
【００７５】
細胞のトランスフェクション
細胞培養フラスコ（７５ｃｍ２）で培養した細胞を、問題の細胞系に最も適したトランスフェクション技法を使用して、生成したキメラプローブを含むベクターを用いてトランスフェクトした。ＨＵＶＥＣと呼ばれる安定状態の臍帯静脈の内皮細胞を実験モデルとして使用し、この細胞系に関して高い割合の陽性細胞を保証するリポフェクタミンを使用し、ＰＫＣベータ−エクオリンプローブを用いて、これらの細胞をトランスフェクトした。
【００７６】
キメラプローブを発現する細胞の回収
トランスフェクション後３６時間で、フラスコ中に含まれていた細胞を、トリプシン処理によって底部から剥離させた。次いで細胞の懸濁液をファルコンチューブ（１５又は５０ｍｌ）に移し、２０℃で１２００ｒｐｍの遠心分離にかけ、最後に細胞の沈殿をＫＲＢ（クレブス−リンガーの改変バッファー：１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＮａ３ＰＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、５．５ｍＭのグルコース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３７℃）中に再懸濁させた。
【００７７】
活性形へのエクオリン発光タンパク質の再構築
補欠分子団セレンテラジンを、５μＭの最終濃度でＰＫＣベータ−エクオリンプローブを発現する細胞の懸濁液に加えた。
【００７８】
マルチウェルプレート上での接種
トランスフェクトした細胞（約１００，０００の細胞に相当）を含む５０μｌの懸濁液を、プレートのそれぞれのウェルに接種した。これらの細胞は１〜２時間の範囲の時間放置して付着させ、セレンテラジンの光不安定性のために細胞は暗所に保った。
【００７９】
応答の検出
インキュベーション時間の最後に、試験する様々な分子をそれぞれのウェルに加え、処理した細胞を含むプレートを、エクオリンの一部分における光子の放出を測定する光電子増倍管と次いで直接接触させた。
【００８０】
結果
生きている細胞中でのＰＫＣの移動を調節することができる化合物を試験するために、この簡潔な試験をしたがって使用することができる。
【００８１】
図５は、前に記載した方法に従う、ＰＫＣベータの移動の測定を示すグラフを示す。
【００８２】
与えた実施例は３つの平行した細胞群で行った：
ａ）対照条件（グルコースの不在）下に保った、ＰＫＣベータ−エクオリン（ＰＫＣβ−ＡＥＱ）プローブを発現するＨＵＶＥＣ細胞（点線）。
ｂ）高血糖状態（１０ｍＭのグルコース）下に保った、ＰＫＣベータ−エクオリン（ＰＫＣβ−ＡＥＱ）プローブを発現するＨＵＶＥＣ細胞（黒、太線）。
ｃ）よく知られている抗糖尿病剤、メトホルミン（２０μＭ）で処理し高血糖状態（１０ｍＭのグルコース）下に保った、ＰＫＣベータ−エクオリン（ＰＫＣβ−ＡＥＱ）プローブを発現するＨＵＶＥＣ細胞（黒、細線）。
【００８３】
図５に示すグラフの傾向から見ることができるように、外部からのカルシウムの不在下では、光子の放出（ｃｐｓ：秒当たりの計数値として表す）は、調べたすべての条件下において非常に低い強度（１００ｃｐｓ未満）である。実際これらの条件下では、（グルコースの不在下で）ＰＫＣβ−ＡＥＱプローブが局在する細胞質中、及び原形質膜の下、即ちグルコースを用いた処理の後にＰＫＣβ−ＡＥＱプローブが移動する場所のカルシウムの濃度は、非常に低い（０．１μＭ）。
【００８４】
外部からのカルシウムを加えることは、原形質膜下の領域中のカルシウム濃度の必然的な増大を伴う、原形質膜上に位置するチャネルを介した前記イオンの持続的な流れを誘導する。これらの条件下では、高濃度のグルコースで処理したＰＫＣβ−ＡＥＱプローブを発現する細胞中のみで、光子の放出の多大な増大が記録され（＞１００，０００ｃｐｓ）、高血糖状態下でのキナーゼの完全な移動を示す。
【００８５】
抗糖尿病剤で処理し高血糖状態下に保った細胞は、光子の放出の点で応答の相当な低下を示し（４０，０００ｃｐｓ未満）、これはＰＫＣβ−ＡＥＱプローブの移動の十分な阻害を意味する。
【００８６】
対照細胞では、エクオリンの一部分における光子の放出の有意な変動は観察されない（１０，０００ｃｐｓ未満）。
【００８７】
グラフから、抗糖尿病剤メトホルミンにより、高濃度のグルコース状態下に保った細胞を処理することによって、高血糖状態下においてグルコースによって誘導される移動を阻害することは明らかとなる。
【００８８】
この系に関しては、移動を阻害することができる分子を同定することだけでなく、対照（０％）（グルコースを含まない）条件下で得たｃｐｓ値と、（高濃度のグルコースを用いた処理後の）最大移動（１００％）後に得たｃｐｓ値の間の範囲に基づいてそれを表すことによって、その効率を評価することも可能であり、これらは以下のように記載することができる：
− 最大活性化物質に対して１０％〜４０％の範囲の値の優れた阻害剤；
− 最大活性化物質に対して４０％〜７０％の範囲の値の中程度の阻害剤；
− 最大活性化物質に対して７０％〜１００％の範囲の値の低度の活性化物質；
【００８９】
この結果は、外部刺激に応答したサイトゾル区画から原形質膜へのタンパク質の移動を測定するために提案した、系の有効性を明らかに示す。
【００９０】
（実施例３）
ｓｈｃタンパク質のファミリーに属するタンパク質アダプターｐ６６の、原形質膜への移動の分析
材料及び方法
キメラｐ６６ｓｈｃ−エクオリンプローブの構築
キメラプローブｐ６６ｓｈｃ−エクオリンを設計して、我々の手順をさらに確認した。
【００９１】
ｐ６６ｓｈｃ−エクオリンプローブを構築するために使用したタンパク質ｐ６６ｓｈｃのヌクレオチド配列は、参照としてＰＵＢＭＥＤ９０４９３００を有する。
【００９２】
ｐ６６ｓｈｃ−エクオリンプローブを構築するために使用したエクオリンのヌクレオチド配列は、以下の通りである：
【化２】
【００９３】
エクオリンをコードする配列とインフレームで凝縮させたｐ６６ｓｈｃタンパク質をコードする配列を、真核生物の発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３；５．４ｋｂ）中に挿入することによって、このプローブを得た。
【００９４】
キメラプローブの局在は、この具体例ｐ６６ｓｈｃにおいてその細胞内経路を追跡するタンパク質の元の配列内に含まれていたシグナルペプチドによって測定する。ｐ６６ｓｈｃをコードする配列のＣ末端にエクオリンのｃＤＮＡを加えることによって、調べるタンパク質の配向又は生理的挙動を変えることはない。
【００９５】
この時点で、Ａ４３１、ＤＭＳ７９などの異なる細胞系において、得られたキメラタンパク質プローブのトランスフェクションを実施する。
【００９６】
細胞系の遺伝子工学処理
示した実施例中では、細胞応答を活性化させるために任意の他の要素を発現させることは、使用した細胞系には必要ではなかった。しかしながら試験要件に応じて、細胞が試験する分子／薬剤に特異的な受容体を発現するのを誘導して、有効な結合度を保証し、これによって形質導入系の機能分析を簡潔にすることは可能である。
【００９７】
細胞のトランスフェクション
細胞培養フラスコ（７５ｃｍ２）で培養した細胞を、問題の細胞系に最も適したトランスフェクション技法を使用して、生成したキメラプローブを含むベクターを用いてトランスフェクトした。この細胞系に関して高い割合の陽性細胞を保証する「Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬」手順（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を使用して、安定状態のトランスフェクト細胞系Ａ４３１を実験モデルとして採用した。
【００９８】
トランスフェクション後２４時間、無血清ＤＭＥＭ培地中に細胞を保った。
【００９９】
キメラプローブを発現する細胞の回収
トランスフェクション後３６時間で、フラスコ中に含まれていた細胞を、トリプシン処理によって底部から剥離させた。次いで細胞の懸濁液をファルコンチューブ（１５〜５０ｍｌ）に移し、２０℃で１２００ｒｐｍの遠心分離にかけ、最後に細胞の沈殿をＫＲＢ（クレブス−リンガーの改変バッファー：１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＮａ３ＰＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、５．５ｍＭのグルコース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３７℃）中に再懸濁させた。
【０１００】
活性形へのエクオリン発光タンパク質の再構築
補欠分子団セレンテラジンを、５μＭの最終濃度でｐ６６ｓｈｃ−エクオリンプローブを発現する細胞の懸濁液に加えた。
【０１０１】
マルチウェルプレート上での接種
トランスフェクトした細胞（約１００，０００の細胞に相当）を含む５０μｌの懸濁液を、プレートのそれぞれのウェルに接種した。これらの細胞は１〜２時間の範囲の時間放置して付着させ、セレンテラジンの光不安定性のために細胞は暗所に保った。
【０１０２】
応答の検出
インキュベーション時間の最後に、試験する様々な分子をそれぞれのウェルに加え、処理した細胞を含むプレートを、エクオリンの一部分における光子の放出を測定する光電子増倍管と次いで直接接触させた。
【０１０３】
結果
生きている細胞中でのｓｈｃファミリーのタンパク質の移動を調節することができる化合物を試験するために、この簡潔な試験を使用することができる。
【０１０４】
図６は、前に記載した方法に従うｐ６６ｓｈｃの移動の測定を示すグラフを示す。
【０１０５】
示した実施例は２つの平行した細胞群で行った：
ａ）ｐ６６ｓｈｃ−エクオリン（ｐ６６ｓｈｃ−ＡＥＱ）プローブを発現するＡ４３１細胞（暗線）。
これらの細胞は次いで：
− ＥＧＦ（表皮成長因子）（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理した−Ａ４３１ｐ６６ｓｈｃ−エクオリン細胞（濃い暗線）；
− 対照Ａ４３１ｐ６６ｓｈｃ−エクオリン細胞、即ちＥＧＦで処理しなかった細胞（薄い暗線）；
ｂ）サイトゾルエクオリンプローブ（ｃｙｔ−ＡＥＱ）（如何なるタンパク質にも凝縮されない）を発現するＡ４３１細胞（光線）にさらに分けた。
これらの細胞は次いで：
− ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）で処理したサイトゾルエクオリンを有するＡ４３１細胞（濃い光線）；
− サイトゾルエクオリンを有する対照Ａ４３１細胞、即ちＥＧＦで処理しなかった細胞（薄い光線）にさらに分けた。
【０１０６】
図６に示すグラフの傾向から観察することができるように、外部からのカルシウムの不在下では、光子の放出（ｃｐｓ：秒当たりの計数値として表す）は、調べたすべての条件下において非常に低い強度（１００ｃｐｓ未満）を有する。実際このような条件下では、ｃｙｔ−ＡＥＱプローブ（ＥＧＦ成長因子の不在下及び存在下）及びｐ６６ｓｈｃ−ＡＥＱプローブ（ＥＧＦの不在下）が局在する細胞質中、及び原形質膜の下、即ちＥＧＦを用いた処理の後にｐ６６ｓｈｃ−ＡＥＱプローブが移動する場所のカルシウムの濃度は、非常に低い（０．１μＭ）。
【０１０７】
外部からのカルシウムを加えることは、原形質膜下の領域中のカルシウム濃度の必然的な増大を伴う、原形質膜上に位置するチャネルを介したこのイオンの重要な流れを誘導する。これらの条件下では、ＥＧＦで処理したｐ６６ｓｈｃ−ＡＥＱプローブを発現する細胞中のみで、光子の放出の多大な増大が記録され（＞１００，０００ｃｐｓ）、このタンパク質の完全な移動を示す。
【０１０８】
すべての他の群の細胞において、エクオリンの一部分における光子の放出の有意な変動は存在しない（１０，０００ｃｐｓ未満）。
【０１０９】
グラフから、最大活性化物質（ＥＧＦ）の不在下で観察したｃｐｓ値より高いすべてのｃｐｓ値が、キナーゼの完全な移動を示すであろうことは明らかである。この系に関しては、タンパク質の完全又は不完全な移動を確認することによって、一方ではＥＧＦ成長因子によって活性化させたものに対して他の経路を介したｓｈｃタンパク質の移動を誘導することができる分子、及び他方では、ＥＧＦ因子によって活性化される細胞内変換経路を遮断することができる分子を同定することが、したがって可能である。
【０１１０】
対照（０％）（ＥＧＦを含まない）条件下で得たｃｐｓ値と（ＥＧＦを用いた処理後の）最大移動（１００％）後に得たｃｐｓ値の間の範囲に基づいてそれを表すことによって、前記移動を分子が誘導（又は遮断）する効率を測定することもでき、これらは以下のように記載することができる：
− 最大活性化物質に対して７０％〜１００％の範囲の値の優れた活性化物質；
− 最大活性化物質に対して４０％〜７０％の範囲の値の中程度の活性化物質；
− 最大活性化物質に対して１０％〜４０％の範囲の値の低度の活性化物質；
− 最大活性化物質に対して１０％未満の値の非活性化物質。
【０１１１】
この結果は、外部刺激に応答したサイトゾル区画から原形質膜へのタンパク質の移動を測定するために提案した、系の有効性を明らかに示す。
【０１１２】
（実施例４）
当該の第２細胞メッセンジャー、ｃＡＭＰの濃度の変動の分析
材料及び方法
ｍｔ−ＡＥＱプローブの構築
ｍｔ−ＡＥＱプローブの記載は、論文（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９２）中に詳細に記載されている。
【０１１３】
ｍｔ−エクオリンプローブの細胞発現系の遺伝子工学処理
この適用例のために２つの細胞系を、ｃＡＭＰの機能を制御することができる異なる薬剤を試験することができると思われる２つの異なるキメラ受容体を、細胞系が発現することができるように遺伝子工学処理した。
【０１１４】
使用した第１のキメラ受容体は、（ｃＡＭＰの生成と関係がある）ベータアドレナリン作動性受容体の細胞外部分と（カルシウムの濃度の変動と関係がある）アルファアドレナリン作動性受容体の細胞内部分（Ｃｏｔｅｃｃｈｉａら、１９９２）を凝縮することによって構築し、ここでは以後ベータ／アルファアドレナリン作動性受容体と呼ぶ。
【０１１５】
前記受容体をＨｅＬａ細胞において発現させ、これによって当該の特定の薬剤を用いた刺激に応答することができる遺伝子工学処理した細胞系を得た。
【０１１６】
使用した第２のキメラ受容体は、（ｃＡＭＰの生成と関係がある）痛覚物質用のＯＲＬ１受容体の細胞外部分と（カルシウムの濃度の変動と関係がある）アルファアドレナリン作動性受容体の細胞内部分（Ｃｏｔｅｃｃｈｉａら、１９９２）を凝縮することによって構築し、ここでは以後ＯＲＬ１／アルファアドレナリン作動性受容体と呼ぶ。
【０１１７】
前記受容体をＣＨＯ細胞において発現させ、これによって当該の特定の薬剤を用いた刺激に応答することができる遺伝子工学処理した細胞系を得た。
【０１１８】
細胞のトランスフェクション
このようにして遺伝子工学処理した細胞系は、リン酸カルシウム技法により
ｍｔ−ＡＥＱプローブを含むベクターを用いて、次いでいずれもトランスフェクトした。
【０１１９】
キメラプローブを発現する細胞の回収
トランスフェクション後３６時間で、細胞培養用のフラスコ（７５ｃｍ２）で培養した細胞を、トリプシン処理によって底部から剥離させた。次いで細胞の懸濁液を（１５又は５０ｍｌの）ファルコンチューブに移し、２０℃において細胞遠心分離装置中で１２００ｒｐｍの遠心分離にかけ、最後に細胞の沈殿をＫＲＢ／Ｃａ２＋（クレブス−リンガーの改変バッファー：１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＮａ３ＰＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、５．５ｍＭのグルコース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３７℃）中に再懸濁させた。
【０１２０】
活性形へのエクオリン蛍光タンパク質の再構築
補欠分子団セレンテラジンを、５μＭの最終濃度でｍｔ−ＡＥＱプローブを発現する遺伝子工学処理した細胞の懸濁液に加えた。
【０１２１】
マルチウェルプレート上での接種
トランスフェクトした細胞（約１００，０００の細胞に相当）を含む５０μｌの懸濁液を、プレートのそれぞれのウェルに接種した。これらの細胞は１〜２時間の範囲の時間放置して付着させ、セレンテラジンの光不安定性のために細胞は暗所に保った。
【０１２２】
応答の検出
インキュベーション時間の最後に、試験する様々な分子をそれぞれのウェルに加え、処理した細胞を含むプレートを、エクオリンの一部分における光子の放出を測定する光電子増倍管と次いで直接接触させた。
【０１２３】
結果
特定の受容体の活性化によってｃＡＭＰの濃度の変動を誘導することができる化合物を試験するために、この簡潔な試験をしたがって使用することができる。
【０１２４】
それぞれｍｔ−ＡＥＱプローブ及びキメラ受容体（ベータ／アルファアドレナリン作動性）及びキメラ受容体（ＯＲＬ１／アルファアドレナリン作動性）
を発現する、ＨｅＬａ及びＣＨＯ細胞で実験を行った。
【０１２５】
ＨｅＬａ細胞（図７）は以下のもので処理した：
− ヒスタミンＨ１の内因性受容体の刺激により、カルシウムの正常な増大を誘導するためのヒスタミン（１００μＭ、ＳＩＧＭＡ）（暗線）。
− キメラ受容体の刺激により、カルシウムの増大を誘導するためのイソプロテレノール（１００μＭ、ＳＩＧＭＡ）（光線）。
【０１２６】
ベータアドレナリン作動性受容体を発現し、前記受容体の刺激を誘導するためにイソプロテレノールで刺激したＨｅＬａ細胞は、対照として使用した（点線）。
【０１２７】
ＣＨＯ細胞（図８）は以下のもので処理した：
− ＡＴＰ Ｐ２Ｙの内因性受容体の刺激により、カルシウムの正常な増大を誘導するためのＡＴＰ（１００μＭ、ＳＩＧＭＡ）（暗線）。
− キメラ受容体の刺激により、カルシウムの増大を誘導するための痛覚物質（１μＭ）（光線）。
【０１２８】
野生型ＯＲＬ１受容体を発現し、前記受容体の刺激を誘導するために痛覚物質で刺激したＣＨＯ細胞は、対照として使用した（点線）。
【０１２９】
図７及び８は、前に記載した方法を用いたｃＡＭＰの生成及びｃＡＭＰの濃度の変動の測定の、２つの例を示すグラフを示す。グラフの分析から観察することができるように、刺激の不在下では、光子の放出（ｃｐｓ：秒当たりの計数値）は非常に低く、ほぼゼロである（１００ｃｐｓ）。これらの基本条件下では、ｍｔ−ＡＥＱプローブが局在するミトコンドリアマトリクス中のカルシウムの濃度は、非常に低い（０．２μＭ）。
【０１３０】
文献（Ｒｉｚｚｕｔｏら、１９９２；Ｐｉｎｔｏｎら、１９９８）中に広く記載されているように、ＨｅＬａ細胞の場合のヒスタミンを用いた刺激、及びＣＨＯ細胞の場合のＡＴＰを用いた刺激は、ミトコンドリアマトリクス中のカルシウムの濃度の相当且つ一時的な増大を誘導する。
【０１３１】
この増大は、エクオリンの一部分における桁外れの光子の放出で表される（１秒当たりに放出される２０未満の光子から８０，０００を超える光子まで）。
【０１３２】
提案した系の有効性を確認するために我々は、キメラ受容体の細胞外部分の特異的アゴニスト（イソプロテレノール及び痛覚物質）を用いて細胞を刺激した。この場合も光線は、エクオリンの一部分における光子の放出の有意な増大（１秒当たりに放出される２０未満の光子から８０，０００を超える光子まで）がどのような状態で存在するかを示し、イソプロテレノール及び痛覚物質（ｃＡＭＰの生成及びｃＡＭＰの濃度の増大と通常関係がある）を用いた刺激は、カルシウムの濃度の変動と関係があるシグナルに変換されることを示す。これとは反対に、ｃＡＭＰの生成としたがって関係がある、イソプロテレノールを用いたベータアドレナリン作動性受容体を発現する細胞の刺激、及び痛覚物質を用いたＯＲＬ１野生型受容体を発現する細胞の刺激は、ｃｐｓの如何なる増大も誘導せず、カルシウムの濃度の非増大を示す。カルシウムの濃度の変動と関係がある細胞内部分を有するキメラ受容体を発現する細胞において、ｃｐｓの増大を誘導する任意の物質が、ｃＡＭＰの濃度を変えることができるであろうことは明らかである。
【０１３３】
この結果は、ｃＡＭＰの生成と関係がある特定の受容体の活性化を測定するために提案した、系の有効性を明らかに実証する。
【０１３４】
（実施例５）
カルシウム用のチャネルの機能状態の制御における、当該の細胞エフェクター、ＰＫＣの触媒活性の活性化／阻害の分析
この方法を確認するために、Ｌ型Ｃａ２＋チャネルと呼ばれる原形質膜のレベルに位置する特定のカルシウムチャネルにおける、ＰＫＣの触媒活性の分析実験を実施した。
【０１３５】
この具体例では、ＰＫＣ依存性リン酸化によって阻害されるＬ型のＣａ２＋チャネル、及び調べるチャネルと直接接触する原形質膜下に局在するエクオリンによって表されるプローブ（ＳＮＡＰ−ＡＥＱ）（Ｍａｒｓａｕｌｔら、１９９７）で、細胞をトランスフェクトした。
【０１３６】
材料及び方法
ＳＮＡＰ−ＡＥＱプローブの構築
ＳＮＡＰ−ＡＥＱプローブの記載は、論文（Ｍａｒｓａｕｌｔら、１９９７）中に詳細に記載されている。
【０１３７】
ＳＮＡＰ−ＡＥＱプローブの細胞発現系の遺伝子工学処理
この適用例のために、カルシウムチャネル（この場合Ｌ型）を有する細胞系を遺伝子工学処理することが必要である。
【０１３８】
当該の細胞エフェクター（ＰＫＣ）によってその活性が制御されるカルシウムチャネルを発現するように、ＨｅＬａ細胞を遺伝子工学処理した。
【０１３９】
細胞のトランスフェクション
遺伝子工学処理した細胞系は、リン酸カルシウム法によりＳＮＡＰ−ＡＥＱプローブを含むベクターを用いて、次いでトランスフェクトした。
【０１４０】
キメラプローブを発現する細胞の回収
トランスフェクション後３６時間で、細胞培養用のフラスコ（７５ｃｍ２）で培養した細胞を、トリプシン処理によって底部から剥離させた。次いで細胞の懸濁液を（１５又は５０ｍｌの）ファルコンチューブに移し、２０℃において細胞遠心分離装置中で１２００ｒｐｍの遠心分離にかけ、最後に細胞の沈殿をＫＲＢ（クレブス−リンガーの改変バッファー：１２５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＮａ３ＰＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、５．５ｍＭのグルコース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、３７℃）中に再懸濁させた。
【０１４１】
活性形へのエクオリン蛍光タンパク質の再構築
補欠分子団セレンテラジンを、５μＭの最終濃度でＳＮＡＰ−ＡＥＱプローブを発現する遺伝子工学処理した細胞の懸濁液に加えた。
【０１４２】
マルチウェルプレート上での接種
トランスフェクト及び再構築した細胞（約１００，０００の細胞に相当）を含む５０μｌの懸濁液を、プレートのそれぞれのウェルに接種した。これらの細胞は１〜２時間の範囲の時間放置して付着させ、セレンテラジンの光不安定性のために細胞は暗所に保った。
【０１４３】
応答の検出
インキュベーション時間の最後に、試験する様々な分子をそれぞれのウェルに加え、処理した細胞を含むプレートを、エクオリンの一部分における光子の放出を測定する光電子増倍管と次いで直接接触させた。
【０１４４】
この試験によって、当該の細胞エフェクターの触媒活性、及びその結果カルシウムチャネルの機能状態を改変することができる分子を同定することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】ＰＭＡ刺激の存在下又は不在下でのイソ型ＰＫＣβ−エクオリンを有するプローブの移動単位（ｃｐｓ）、及びエクオリンサイトゾルｃｙｔ−ＡＥＱプローブに関する違いの測定を示すグラフの図である。
【図２】ＰＭＡ刺激の存在下又は不在下でのイソ型ＰＫＣδ−エクオリンを有するプローブの移動単位（ｃｐｓ）、及びエクオリンサイトゾルｃｙｔ−ＡＥＱプローブに関する違いの測定を示すグラフの図である。
【図３】ＰＭＡ刺激の存在下又は不在下でのＰＫＣε−エクオリンイソ型を有するプローブの移動単位（ｃｐｓ）、及びエクオリンサイトゾルｃｙｔ−ＡＥＱプローブに関する違いの測定を示すグラフの図である。
【図４】ＰＭＡ刺激の存在下又は不在下でのＰＫＣζ−エクオリンイソ型を有するプローブの移動単位（ｃｐｓ）、及びエクオリンサイトゾルｃｙｔ−ＡＥＱプローブに関する違いの測定を示すグラフの図である。
【図５】薬剤の存在下又は不在下での高血糖状態下における、ＰＫＣβ−ＡＥＱプローブの移動単位（ｃｐｓ）の測定を示すグラフの図である。
【図６】ＥＧＦ刺激の存在下又は不在下でのｐ６６ｓｈｃ−ＡＥＱプローブの移動単位（ｃｐｓ）、及びエクオリンサイトゾルｃｙｔ−ＡＥＱプローブに関する違いの測定を示すグラフの図である。
【図７】ベータアドレナリン作動性受容体とイソプロテノール、或いはベータ／アルファアドレナリン作動性キメラ受容体とイソプロテノール又はヒスタミンの存在下での、ｃＡＭＰ濃度の増大の単位（ｃｐｓ）の測定を示すグラフの図である。
【図８】痛覚物質の野生型ＯＲＬ１受容体、及び痛覚物質、或いはアドレナリン作動性ＯＲＬ１／アルファアキメラ受容体、及びＡＴＰ又は痛覚物質の存在下での、ｃＡＭＰ濃度の増大の単位（ｃｐｓ）の測定を示すグラフの図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的の細胞内パラメータの改変を引き起こすことができる分子のスクリーニング法であって、前記改変がＣａ２＋感受性組換えタンパク質プローブによって検出されるＣａ２＋イオンの細胞内濃度の比例変数に変換され、以下の段階：
ａ）前記プローブをコードする配列を含む発現ベクターであって、前記配列が１つに凝縮された少なくとも１つのＣａ２＋感受性蛍光タンパク質、及び少なくとも１つの細胞エフェクター又はシグナル配列をコードする配列を含むことを特徴とする発現ベクターの構築、
ｂ）Ｃａ２＋感受性組換えタンパク質プローブを含む前記ベクターを用いた少なくとも１つの哺乳動物の細胞系のトランスフェクション、
ｃ）前記組換えタンパク質プローブを発現する細胞系に補欠分子団を加えることによる、前記Ｃａ２＋感受性蛍光タンパク質の活性化、
ｄ）前記組換えタンパク質プローブを発現する細胞系への試験分子の投与、
ｅ）得られたｃｐｓ値と細胞系の最大刺激条件下で記録されたｃｐｓの最大値の間の比に基づく、細胞系において発現されたＣａ２＋感受性蛍光タンパク質の一部分における光子の放出の検出、及び試験分子によって行われた活性化又は阻害の量の評価を含むスクリーニング法。
【請求項２】
前記Ｃａ２＋感受性蛍光タンパク質がエクオリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記補欠分子団がセレンテラジンである、請求項１及び２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞内パラメータの改変が、セカンドメッセンジャーの濃度の変動、膜又は活性／不活性状態の細胞エフェクターへの移動を含む群から選択される、請求項１から３までに記載の方法。
【請求項５】
前記セカンドメッセンジャーが、環状ヌクレオチド、アデノシンヌクレオチド、ジアシルグリセロール、Ｃａ２＋及びイノシトール１，４，５−３リン酸を含む群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞エフェクターが、イオンチャネル、制御タンパク質、細胞膜受容体からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記イオンチャネルが、電圧依存性Ｃａ２＋チャネル及びＣａ２＋チャネル受容体を含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記制御タンパク質が、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、アデニル酸シクラーゼ、原形質膜受容体と連結するタンパク質、原形質膜チャネルと相互作用するタンパク質、原形質膜脂質と相互作用するタンパク質を含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞膜受容体が、Ｇタンパク質と結合した受容体、酵素活性を有する受容体、チャネル受容体を含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃａ２＋感受性組換えタンパク質プローブが、少なくとも１つのＣａ２＋感受性蛍光タンパク質、又はその一部分のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質プローブが、細胞エフェクターのシグナル配列及び／又はアミノ酸配列をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞エフェクターが、イオンチャネル、制御タンパク質、細胞膜受容体からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記イオンチャネルが、電圧依存性Ｃａ２＋チャネル及びＣａ２＋チャネル受容体を含む群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記制御タンパク質が、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、アデニル酸シクラーゼ、原形質膜受容体と連結するタンパク質、原形質膜チャネルと相互作用するタンパク質、原形質膜脂質と相互作用するタンパク質を含む群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロテインキナーゼがプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞膜受容体が、Ｇタンパク質と結合した受容体、酵素活性を有する受容体、チャネル受容体を含む群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記シグナル配列がＣａ２＋感受性蛍光タンパク質、好ましくはエクオリンを細胞区画に誘導する、請求項１０及び１１に記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質プローブが、ＰＫＣ−エクオリン（ＰＫＣ−ＡＥＱ）、ｓｈｃ−エクオリン（ｓｈｃ−ＡＥＱ）、ＳＮＡＰ−エクオリン（ＳＮＡＰ−ＡＥＱ）、ｍｔ−エクオリン（ｍｔ−ＡＥＱ）、サイトゾルエクオリン（ｃｙｔ−ＡＥＱ）からなる群から選択される凝縮タンパク質である、請求項１０から１７までのいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＰＫＣ−エクオリンが、ＰＫＣベータ−エクオリン、ＰＫＣデルタ−エクオリン、ＰＫＣイプシロン−エクオリン、ＰＫＣゼータ−エクオリン、ＰＫＣガンマ−エクオリン、ＰＫＣアルファ−エクオリン、ＰＫＣ−ラムダ−エクオリン、ＰＫＣシータ−エクオリン、ＰＫＣエータ−エクオリンを含む群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｓｈｃ−エクオリンが、ｐ６６ｓｈｃ−エクオリン、ｐ４６ｓｈｃ−エクオリン、ｐ５２ｓｈｃ−エクオリンからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
段階ａ）の発現ベクターが真核生物のベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの哺乳動物の細胞系を、異種原型又はキメラタンパク質を発現するように事前に遺伝子工学処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記異種タンパク質が受容体、酵素、イオンチャネル又は細胞エフェクターからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記受容体がキメラ受容体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記キメラ受容体が、カルシウムの濃度の変動と関係がある受容体の細胞内部分、及びｃＡＭＰの生成と関係がある受容体の細胞外部分を有することを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記イオンチャネルが、電圧依存性Ｃａ２＋チャネル及びＣａ２＋チャネル受容体を含む群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞エフェクターが、イオンチャネル、制御タンパク質、細胞膜受容体からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記イオンチャネルが、電圧依存性Ｃａ２＋チャネル及びＣａ２＋チャネル受容体を含む群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記制御タンパク質が、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、アデニル酸シクラーゼ、原形質膜受容体と連結するタンパク質、原形質膜チャネルと相互作用するタンパク質、原形質膜脂質と相互作用するタンパク質を含む群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞膜受容体が、Ｇタンパク質と結合した受容体、酵素活性を有する受容体、チャネル受容体を含む群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
１つに凝縮された少なくとも１つのＣａ２＋感受性蛍光タンパク質、又はその一部分のアミノ酸配列、及び細胞エフェクター又はシグナル配列を含むことを特徴とする、Ｃａ２＋感受性組換えタンパク質プローブ。
【請求項３２】
前記Ｃａ２＋感受性蛍光タンパク質がエクオリンである、請求項３１に記載のプローブ。
【請求項３３】
前記タンパク質プローブが、細胞エフェクターのシグナル配列及び／又はアミノ酸配列をさらに含む、請求項３１及び３２に記載のプローブ。
【請求項３４】
前記細胞エフェクターが、イオンチャネル、制御タンパク質、細胞膜受容体からなる群から選択される、請求項３１から３３までに記載のプローブ。
【請求項３５】
前記イオンチャネルが、電圧依存性Ｃａ２＋チャネル及びＣａ２＋チャネル受容体を含む群から選択される、請求項３４に記載のプローブ。
【請求項３６】
前記制御タンパク質が、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、アデニル酸シクラーゼ、原形質膜受容体と連結するタンパク質、原形質膜チャネルと相互作用するタンパク質、原形質膜脂質と相互作用するタンパク質を含む群から選択される、請求項３４に記載のプローブ。
【請求項３７】
前記プロテインキナーゼがプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）である、請求項３６に記載のプローブ。
【請求項３８】
前記プローブがＰＫＣ−エクオリン（ＰＫＣ−ＡＥＱ）からなる凝縮タンパク質である、請求項３１から３７までのいずれかに記載のプローブ。
【請求項３９】
ＰＫＣ−エクオリンが、ＰＫＣベータ−エクオリン（ＰＣＫベータ：ｒｉｆ．Ｍ１３９７５）、ＰＫＣデルタ−エクオリン（ＰＣＫデルタ：ｒｉｆ．Ｍ１８３３０）、ＰＫＣイプシロン−エクオリン（ＰＣＫイプシロン：ｒｉｆ．ＡＦ０２８００９）、ＰＫＣゼータ−エクオリン（ＰＣＫゼータ：ｒｉｆ．Ｍ１８３３２）、ＰＫＣガンマ−エクオリン、ＰＫＣアルファ−エクオリン（ＰＣＫアルファ：ｒｉｆ．Ｍ１３９７３）、ＰＫＣ−ラムダ−エクオリン、ＰＫＣシータ−エクオリン（ＰＣＫシータ：ｒｉｆ．Ｌ０７０３２）、ＰＫＣエータ−エクオリンを含む群から選択される、請求項３８に記載のプローブ。
【請求項４０】
前記原形質膜受容体と連結するタンパク質がｓｈｃファミリーに属する、請求項３６に記載のプローブ。
【請求項４１】
タンパク質がｐ４６ｓｈｃ、ｐ５２ｓｈｃ及びｐ６６ｓｈｃを含む群から選択される、請求項４０に記載のプローブ。
【請求項４２】
前記細胞膜受容体が、Ｇタンパク質と結合した受容体、酵素活性を有する受容体、チャネル受容体を含む群から選択される、請求項３４に記載のプローブ。
【請求項４３】
前記シグナル配列がＣａ２＋感受性蛍光タンパク質、好ましくはエクオリンを細胞区画に誘導する、請求項３１から４２までに記載のプローブ。
【請求項４４】
細胞内パラメータの改変を引き起こすことができる分子のスクリーニングであって、前記改変がＣａ２＋イオンの細胞内濃度の比例変数に変換されるスクリーニング用の、請求項３１から４２までに定義したＣａ２＋感受性組換えプローブの使用。
【請求項４５】
前記細胞内パラメータの改変が、セカンドメッセンジャーの濃度の変動、膜又は活性／不活性状態の細胞エフェクターへの移動を含む群から選択される、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記セカンドメッセンジャーが、環状ヌクレオチド、アデノシンのヌクレオチド、ジアシルグリセロール、Ｃａ２＋及びイノシトール１，４，５−３リン酸を含む群から選択される、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
前記細胞エフェクターが、イオンチャネル、制御タンパク質、細胞膜受容体からなる群から選択される、請求項４５に記載の使用。
【請求項４８】
前記イオンチャネルが、電圧依存性Ｃａ２＋チャネル及びＣａ２＋チャネル受容体を含む群から選択される、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
前記制御タンパク質が、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、アデニル酸シクラーゼ、原形質膜受容体と連結するタンパク質、原形質膜チャネルと相互作用するタンパク質、原形質膜脂質と相互作用するタンパク質を含む群から選択される、請求項４７に記載の使用。
【請求項５０】
前記細胞膜受容体が、Ｇタンパク質と結合した受容体、酵素活性を有する受容体、チャネル受容体を含む群から選択される、請求項４７に記載の使用。
【請求項１】
標的の細胞内パラメータの改変を引き起こすことができる分子のスクリーニング法であって、前記改変がＣａ２＋感受性組換えタンパク質プローブによって検出されるＣａ２＋イオンの細胞内濃度の比例変数に変換され、以下の段階：
ａ）前記プローブをコードする配列を含む発現ベクターであって、前記配列が１つに凝縮された少なくとも１つのＣａ２＋感受性蛍光タンパク質、及び少なくとも１つの細胞エフェクター又はシグナル配列をコードする配列を含むことを特徴とする発現ベクターの構築、
ｂ）Ｃａ２＋感受性組換えタンパク質プローブを含む前記ベクターを用いた少なくとも１つの哺乳動物の細胞系のトランスフェクション、
ｃ）前記組換えタンパク質プローブを発現する細胞系に補欠分子団を加えることによる、前記Ｃａ２＋感受性蛍光タンパク質の活性化、
ｄ）前記組換えタンパク質プローブを発現する細胞系への試験分子の投与、
ｅ）得られたｃｐｓ値と細胞系の最大刺激条件下で記録されたｃｐｓの最大値の間の比に基づく、細胞系において発現されたＣａ２＋感受性蛍光タンパク質の一部分における光子の放出の検出、及び試験分子によって行われた活性化又は阻害の量の評価を含むスクリーニング法。
【請求項２】
前記Ｃａ２＋感受性蛍光タンパク質がエクオリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記補欠分子団がセレンテラジンである、請求項１及び２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞内パラメータの改変が、セカンドメッセンジャーの濃度の変動、膜又は活性／不活性状態の細胞エフェクターへの移動を含む群から選択される、請求項１から３までに記載の方法。
【請求項５】
前記セカンドメッセンジャーが、環状ヌクレオチド、アデノシンヌクレオチド、ジアシルグリセロール、Ｃａ２＋及びイノシトール１，４，５−３リン酸を含む群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞エフェクターが、イオンチャネル、制御タンパク質、細胞膜受容体からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記イオンチャネルが、電圧依存性Ｃａ２＋チャネル及びＣａ２＋チャネル受容体を含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記制御タンパク質が、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、アデニル酸シクラーゼ、原形質膜受容体と連結するタンパク質、原形質膜チャネルと相互作用するタンパク質、原形質膜脂質と相互作用するタンパク質を含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞膜受容体が、Ｇタンパク質と結合した受容体、酵素活性を有する受容体、チャネル受容体を含む群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃａ２＋感受性組換えタンパク質プローブが、少なくとも１つのＣａ２＋感受性蛍光タンパク質、又はその一部分のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質プローブが、細胞エフェクターのシグナル配列及び／又はアミノ酸配列をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞エフェクターが、イオンチャネル、制御タンパク質、細胞膜受容体からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記イオンチャネルが、電圧依存性Ｃａ２＋チャネル及びＣａ２＋チャネル受容体を含む群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記制御タンパク質が、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、アデニル酸シクラーゼ、原形質膜受容体と連結するタンパク質、原形質膜チャネルと相互作用するタンパク質、原形質膜脂質と相互作用するタンパク質を含む群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロテインキナーゼがプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞膜受容体が、Ｇタンパク質と結合した受容体、酵素活性を有する受容体、チャネル受容体を含む群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記シグナル配列がＣａ２＋感受性蛍光タンパク質、好ましくはエクオリンを細胞区画に誘導する、請求項１０及び１１に記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質プローブが、ＰＫＣ−エクオリン（ＰＫＣ−ＡＥＱ）、ｓｈｃ−エクオリン（ｓｈｃ−ＡＥＱ）、ＳＮＡＰ−エクオリン（ＳＮＡＰ−ＡＥＱ）、ｍｔ−エクオリン（ｍｔ−ＡＥＱ）、サイトゾルエクオリン（ｃｙｔ−ＡＥＱ）からなる群から選択される凝縮タンパク質である、請求項１０から１７までのいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ＰＫＣ−エクオリンが、ＰＫＣベータ−エクオリン、ＰＫＣデルタ−エクオリン、ＰＫＣイプシロン−エクオリン、ＰＫＣゼータ−エクオリン、ＰＫＣガンマ−エクオリン、ＰＫＣアルファ−エクオリン、ＰＫＣ−ラムダ−エクオリン、ＰＫＣシータ−エクオリン、ＰＫＣエータ−エクオリンを含む群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｓｈｃ−エクオリンが、ｐ６６ｓｈｃ−エクオリン、ｐ４６ｓｈｃ−エクオリン、ｐ５２ｓｈｃ−エクオリンからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
段階ａ）の発現ベクターが真核生物のベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの哺乳動物の細胞系を、異種原型又はキメラタンパク質を発現するように事前に遺伝子工学処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記異種タンパク質が受容体、酵素、イオンチャネル又は細胞エフェクターからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記受容体がキメラ受容体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記キメラ受容体が、カルシウムの濃度の変動と関係がある受容体の細胞内部分、及びｃＡＭＰの生成と関係がある受容体の細胞外部分を有することを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記イオンチャネルが、電圧依存性Ｃａ２＋チャネル及びＣａ２＋チャネル受容体を含む群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞エフェクターが、イオンチャネル、制御タンパク質、細胞膜受容体からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記イオンチャネルが、電圧依存性Ｃａ２＋チャネル及びＣａ２＋チャネル受容体を含む群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記制御タンパク質が、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、アデニル酸シクラーゼ、原形質膜受容体と連結するタンパク質、原形質膜チャネルと相互作用するタンパク質、原形質膜脂質と相互作用するタンパク質を含む群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞膜受容体が、Ｇタンパク質と結合した受容体、酵素活性を有する受容体、チャネル受容体を含む群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
１つに凝縮された少なくとも１つのＣａ２＋感受性蛍光タンパク質、又はその一部分のアミノ酸配列、及び細胞エフェクター又はシグナル配列を含むことを特徴とする、Ｃａ２＋感受性組換えタンパク質プローブ。
【請求項３２】
前記Ｃａ２＋感受性蛍光タンパク質がエクオリンである、請求項３１に記載のプローブ。
【請求項３３】
前記タンパク質プローブが、細胞エフェクターのシグナル配列及び／又はアミノ酸配列をさらに含む、請求項３１及び３２に記載のプローブ。
【請求項３４】
前記細胞エフェクターが、イオンチャネル、制御タンパク質、細胞膜受容体からなる群から選択される、請求項３１から３３までに記載のプローブ。
【請求項３５】
前記イオンチャネルが、電圧依存性Ｃａ２＋チャネル及びＣａ２＋チャネル受容体を含む群から選択される、請求項３４に記載のプローブ。
【請求項３６】
前記制御タンパク質が、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、アデニル酸シクラーゼ、原形質膜受容体と連結するタンパク質、原形質膜チャネルと相互作用するタンパク質、原形質膜脂質と相互作用するタンパク質を含む群から選択される、請求項３４に記載のプローブ。
【請求項３７】
前記プロテインキナーゼがプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）である、請求項３６に記載のプローブ。
【請求項３８】
前記プローブがＰＫＣ−エクオリン（ＰＫＣ−ＡＥＱ）からなる凝縮タンパク質である、請求項３１から３７までのいずれかに記載のプローブ。
【請求項３９】
ＰＫＣ−エクオリンが、ＰＫＣベータ−エクオリン（ＰＣＫベータ：ｒｉｆ．Ｍ１３９７５）、ＰＫＣデルタ−エクオリン（ＰＣＫデルタ：ｒｉｆ．Ｍ１８３３０）、ＰＫＣイプシロン−エクオリン（ＰＣＫイプシロン：ｒｉｆ．ＡＦ０２８００９）、ＰＫＣゼータ−エクオリン（ＰＣＫゼータ：ｒｉｆ．Ｍ１８３３２）、ＰＫＣガンマ−エクオリン、ＰＫＣアルファ−エクオリン（ＰＣＫアルファ：ｒｉｆ．Ｍ１３９７３）、ＰＫＣ−ラムダ−エクオリン、ＰＫＣシータ−エクオリン（ＰＣＫシータ：ｒｉｆ．Ｌ０７０３２）、ＰＫＣエータ−エクオリンを含む群から選択される、請求項３８に記載のプローブ。
【請求項４０】
前記原形質膜受容体と連結するタンパク質がｓｈｃファミリーに属する、請求項３６に記載のプローブ。
【請求項４１】
タンパク質がｐ４６ｓｈｃ、ｐ５２ｓｈｃ及びｐ６６ｓｈｃを含む群から選択される、請求項４０に記載のプローブ。
【請求項４２】
前記細胞膜受容体が、Ｇタンパク質と結合した受容体、酵素活性を有する受容体、チャネル受容体を含む群から選択される、請求項３４に記載のプローブ。
【請求項４３】
前記シグナル配列がＣａ２＋感受性蛍光タンパク質、好ましくはエクオリンを細胞区画に誘導する、請求項３１から４２までに記載のプローブ。
【請求項４４】
細胞内パラメータの改変を引き起こすことができる分子のスクリーニングであって、前記改変がＣａ２＋イオンの細胞内濃度の比例変数に変換されるスクリーニング用の、請求項３１から４２までに定義したＣａ２＋感受性組換えプローブの使用。
【請求項４５】
前記細胞内パラメータの改変が、セカンドメッセンジャーの濃度の変動、膜又は活性／不活性状態の細胞エフェクターへの移動を含む群から選択される、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記セカンドメッセンジャーが、環状ヌクレオチド、アデノシンのヌクレオチド、ジアシルグリセロール、Ｃａ２＋及びイノシトール１，４，５−３リン酸を含む群から選択される、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
前記細胞エフェクターが、イオンチャネル、制御タンパク質、細胞膜受容体からなる群から選択される、請求項４５に記載の使用。
【請求項４８】
前記イオンチャネルが、電圧依存性Ｃａ２＋チャネル及びＣａ２＋チャネル受容体を含む群から選択される、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
前記制御タンパク質が、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、アデニル酸シクラーゼ、原形質膜受容体と連結するタンパク質、原形質膜チャネルと相互作用するタンパク質、原形質膜脂質と相互作用するタンパク質を含む群から選択される、請求項４７に記載の使用。
【請求項５０】
前記細胞膜受容体が、Ｇタンパク質と結合した受容体、酵素活性を有する受容体、チャネル受容体を含む群から選択される、請求項４７に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００７−５３００２７（Ｐ２００７−５３００２７Ａ）
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０４５１０（Ｐ２００７−５０４５１０）
【出願日】平成１７年３月２３日（２００５．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／０００７９５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９３４２９
【国際公開日】平成１７年１０月６日（２００５．１０．６）
【出願人】（５０６３２４６１１）
【出願人】（５０６３２４６２２）
【出願人】（５０６３２４６３３）
【出願人】（５０６３２４６４４）
【出願人】（５０６３２４６５５）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年３月２３日（２００５．３．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／０００７９５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０９３４２９
【国際公開日】平成１７年１０月６日（２００５．１０．６）
【出願人】（５０６３２４６１１）
【出願人】（５０６３２４６２２）
【出願人】（５０６３２４６３３）
【出願人】（５０６３２４６４４）
【出願人】（５０６３２４６５５）
【Ｆターム（参考）】
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