細胞分取及び培養方法とその装置
【課題】多数の細胞を同時にインキュベーションあるいは培養することを可能とする細胞インキュベーションチップおよび細胞インキュベーションチップへの細胞分別方法及びそのための装置を実現する。
【解決手段】複数の細胞を含む溶液を挿入でき、所定の大きさの細胞ないし細胞塊が通過するにふさわしい先端開口径を持つピペットと、ピペット内部の細胞を観察する手段と、ピペット先端部に細胞を含む溶液をピペット内部から押し出して液滴を形成する手段と、液滴内の細胞の有無を検出し細胞を含む液滴と含まない液滴を判断する手段とを備えて、液滴を基板上の所定の位置に滴下し並べる。
【解決手段】複数の細胞を含む溶液を挿入でき、所定の大きさの細胞ないし細胞塊が通過するにふさわしい先端開口径を持つピペットと、ピペット内部の細胞を観察する手段と、ピペット先端部に細胞を含む溶液をピペット内部から押し出して液滴を形成する手段と、液滴内の細胞の有無を検出し細胞を含む液滴と含まない液滴を判断する手段とを備えて、液滴を基板上の所定の位置に滴下し並べる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多数の細胞を同時にインキュベーションあるいは培養することを可能とする細胞インキュベーションチップおよび細胞インキュベーションチップへの細胞分別方法及びそのための装置に関する。すなわち、細胞を所定の数ずつアレー状に並べ、多数の細胞を同時に培養できる細胞培養チップと細胞培養システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を研究する上での基本は、目的細胞の分離と分離した細胞の個別培養である。分離技術としては、大きく分けると、以下のように分類できる。
（１）比重の違いで細胞を分離する方法、
（２）蛍光標識抗体で染色した情報あるいは目視の情報による方法、
（３）セルソーターによる方法。
いずれの方法も細胞懸濁液から目的の細胞を分離することができ、目的に応じて使用されている。
【０００３】
（１）の方法は、たとえば、精子細胞はＸ染色体を持つものと、Ｙ染色体をもつ２種類があり、重篤な遺伝的疾病を持つ家系においては、男女産み分けのため、利用されることがある。精子細胞のわずかな比重の違いを用いて分離する場合には速度沈降法によって分離する。この技術は、汎用的ではあるが、比重をつける試薬に目的細胞が曝露されることと、遠心による高い加速度にさらされるため、通常の細胞内での遺伝子発現などの細胞の状態が変動してしまう可能性がある。さらに、分離に長時間を要するため、通常４℃程度の低温に長時間目的細胞をさらすことになる。
【０００４】
（２）の方法は、未感作の免疫提示細胞と感作した免疫細胞とを見分けるような、細胞の比重の違いがほとんど無い場合に利用されるが、目視により目的細胞を１つ１つ分離する必要があり、分離に要する作業者の負担が大きい。さらに、目的細胞は蛍光標識抗体で染色されるため、目的細胞の状態が変動してしまう可能性がある。
【０００５】
（３）の方法は、比重を用いずに細胞を分離する技術のひとつである。セルソーターは蛍光染色処理後の細胞を電荷を持たせた液滴中に１細胞単位で単離して滴下し、この液滴中における細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小を基に、液滴が落下する過程で、落下方向に対して法平面方向に高電界を任意の方向に印加することで、液滴の落下方向を制御して、下部に置かれた複数の容器に分画して回収する技術である。この技術について詳しくは、非特許文献１に報告されている。
【０００６】
このようにして分離した細胞を、培養、あるいは、所定時間インキュベーションするには、まず、所定の数の細胞をマイクロプレートやカルチャーディシュやカルチャーフラスコに培養液と細胞を入れ、ｐＨを一定に保つために適度の二酸化炭素存在下でインキュベーションするのが一般的である。所定の数の細胞を分注するにはあらかじめ細胞懸濁液中の細胞数を算定盤やセルカウンターで一定体積あたりの細胞数をカウントし、目的の細胞数に見合った体積分をマイクロプレートなどにピペットを用いて入れるのが一般的である。
【０００７】
培養容器としては、多数の細胞の培養に向いているのはマイクロプレートを使用する方法である。カルチャーディシュは比較的種類の少ない細胞の培養、カルチャーフラスコは多量培養に向いている。これらの容器に細胞を入れるのは、研究者や医療従事者が判断しながらピペットを操作して入れるのが一般的である。また、細胞には未知のコミュニティーエフェクトがあり孤立した細胞は増殖しづらく、培養系の中にある程度細胞が存在する必要がある。
【０００８】
【非特許文献１】Kamarck,M.E, Methods Enzymol., 第１５１巻第１５０頁から１６５頁（１９８７年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来技術は、分離した細胞を同時に培養する方法及び装置として、必ずしも研究者や医療従事者を満足させるものではない。一般的には、多数のカルチャーフラスコを並べて培養を行っているにすぎず、培養の労力やコストが膨大なものになってしまう。また、各培養に処する細胞の数はあらかじめ細胞懸濁液に含まれる細胞数をカウントし、それから逆算される体積を持って細胞数としている。このため、たとえば、細胞一個一個をスタートとして培養を行おうとすると、無限希釈した細胞懸濁液をマイクロプレートやディッシュに播いて増殖してきたもののみを選別するなどの方法をとる必要があった。
【００１０】
この方法は、大腸菌や酵母などの単細胞生物のクローニングには効力を発揮するが、多細胞生物由来の細胞では、効率が悪い問題がある。さらに前記したように、細胞同士のコミュニティーエフェクトが断ち切られると、集団での細胞と挙動が異なることが容易に推測できるので、たとえば、細胞１０個づつの集団ごとにマイクロプレートウェルやディッシュに分注することが必要となるが、実際上は、正確に分注できない問題がある。
【００１１】
本発明は、細胞を所定の数ずつアレー状に並べる方法と、多数の細胞を同時に培養できる細胞培養チップとを提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明では、所定の数の細胞または細胞塊を、細胞培養チップの所定の位置に配置できるように、細胞培養チップの表面に親水領域を所定の間隔で独立して形成する。この親水領域に対して、細胞の懸濁液を吸い上げたピペット先端から必要な細胞数を持つ適当な大きさの液滴として滴下させる。この際、ピペット先端を光学系でモニターして液滴の大きさおよび細胞数を監視して、制御する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、自動的に一定の微小体積に一定数の細胞が入った液滴を作成し、細胞培養チップの所定の位置に配置できる。よって、微小な体積スペースで所定の細胞をインキュベーションすることができる。さらに、微小であることは、限られた面積に多数の細胞をアレー状にインキュベーションすることができるスケールメリットがある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（実施例１）
図１（ａ）は、実施例１に好適な細胞培養チップ１００の平面図、（ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図である。１はシリコン基板であり、例えば、その厚さは１ｍｍ、大きさは２０ｍｍ×２０ｍｍである。２は壁であり、シリコン基板で製作され、その厚さは、例えば、１ｍｍ、高さは０．５ｍｍである。壁２で囲われた領域は疎水性領域３とされ、そのなかに、親水性領域４が周期的に配列される。親水性領域４の大きさは、この領域の一つに収容する細胞の大きさあるいは数によって決定されるが、４００μｍ×４００μｍ程度である。親水性領域４の間隔は、細胞を含む液滴が、お互いが接触して混ざらないだけの間隔とするが、取り扱いの便を考えると、２０００から４０００μｍ程度が良い。５は位置決め用のマーカーであり、シリコン基板１の一面に形成される。
【００１５】
親水性領域と疎水性領域の作成方法は、例えば、疎水性のシリコン基板１の上面を酸化して、一旦、全領域を親水性のＳｉＯ２薄膜とする。その後、疎水性とすべき領域のＳｉＯ２薄膜をフッ酸で溶解除去して疎水性領域を作成すれば良い。
【００１６】
（実施例２）
図２（ａ）は、細胞培養チップ１００に細胞を分配する実施例２のシステム構成を説明する概念図、図２（ｂ）は、細胞培養チップ１００の親水性領域４に細胞が分配された結果を示す断面図である。
【００１７】
実施例２では、細胞１２を分配するためのピペット１１の先端に形成される液滴を光学的にモニターしながら細胞培養チップ１００の親水性領域４に細胞１２を分配する。図２（ａ）において、１９はＸＹ方向に駆動されるステージであり、２７はステージ１９の駆動装置である。ステージ１９の上面には細胞培養チップ１００の温度を制御するためのヒーター２２が設けられ、この上面に細胞培養チップ１００が載置される。細胞培養チップ１００の上部には、分配すべき細胞１２を含む懸濁液１３があらかじめ吸い上げられて保持されているピペット１１が配置される。ピペット１１の根元部には、チューブ３０を介してシリンジポンプ３１が設けられ、シリンジポンプ３１には駆動装置３２が取り付けられている。シリンジポンプ３１が駆動装置３２により駆動されると、ピペット１１内の懸濁液１３が細胞１２とともに押し出される。なお、ピペット１１の根元部とチューブ３０との接続部が離れたように図示されているのは、ピペット１１を拡大して表示するためであり、分離されているわけではない。
【００１８】
一方、ピペット１１の先端部には、ピペット１１の先端部に培養液を供給するための他のピペット２０の先端が配置される。ピペット２０の根元部にはチューブ３４を介してシリンジポンプ３５が設けられ、シリンジポンプ３５には駆動装置３６が取り付けられている。シリンジポンプ３５が駆動装置３６により駆動されると、シリンジポンプ３５内の培養液がピペット２０から押し出される。
【００１９】
また、ピペット１１の先端部に形成された液滴を細胞培養チップ１００の親水性領域４に移すためのピペットの上下動駆動装置３７が設けられる。ここでは、上下動駆動装置３７はピペット１１に連係するものとする。上下動駆動装置３７に、使用者により、ピペット１１を下げる信号が与えられると、ピペット１１は下に動き、ピペット１１の先端部に形成された液滴を細胞培養チップ１００の親水性領域４に移す。上下動駆動装置３７に、使用者により、ピペット１１を復旧させる信号が与えられると、ピペット１１は図に示す位置に戻る。ピペット１１の図に示す位置への復旧は、下げ操作から、パソコン２６により、タイムシーケンシャルに行われるものとしても良い。一点差線３９は上下動駆動装置３７とピペット１１との連係を意味する。
【００２０】
さらに、ピペット１１の先端部の近傍の内部および先端部に形成される液滴の大きさをモニターするための光学系を構成する光源１６、集光レンズ１７が設けられ、これに対向する位置で細胞培養チップ１００の下部にコリメートレンズ１８およびモニター２５が設けられる。したがって、細胞培養チップ１００、温調器２２およびステージ１９は、光学的に透明である必要がある。２６は、いわゆる、パソコンであり、モニター２５からの入力信号に応じて、あらかじめ格納してある所定のプログラムから得られる制御信号、および、使用者がモニター２５の表示画面を見ながら与える操作入力信号２８に応じて駆動装置２７，３２，３６および３７に必要な信号を与える。なお、ここでは、図示しなかったが、モニター２５の検出している画面と同一の表示をパソコン２６のモニターに表示するのが便利である。そうすれば、モニター２５は、小型のＣＣＤカメラとすることができる。また、操作入力信号２８は、パソコン２６の入力装置を介して与えられるものである。
【００２１】
ここで、ピペット１１のサイズについて考えると以下のようである。ピペット１１は、その先端に、必要な細胞数を持つ適当な大きさの液滴を構成できるようにすることが必要である。一方、ピペット１１内には、細胞を含む懸濁液をピペットで吸い上げてから使用するが、液滴を構成するときに、ピペット１１の先端を通過する細胞がモニター２５で誤り無く検出できることが必要である。したがって、ピペット１１の先端部の直径は細胞１個あるいは所定の細胞数の塊が通過するのを許すが、計数できないほどの細胞が、一度に通過できないものとする。すなわち、現在、汎用的に使用されている培養用ピペットのように径が太いものではなく、透明で、先端部の直径が、一般的な動物細胞用として２０〜１００μｍ、バクテリアなどの微生物用では５μｍ程度とするのが良い。
【００２２】
細胞培養チップ１００の親水性領域４に細胞１２を分配する操作について以下説明する。まず、システムが起動されると、使用者は、図１（ａ）で説明したマーカー５に着目して細胞培養チップ１００が所定の起動位置にあるように位置決めする。次に、細胞１２の最初の分配位置をピペット１１および２０の先端部に対応する位置に移動させる操作入力信号２８に応じて、駆動装置２７によりステージ１９を操作する。細胞培養チップ１００が所定の位置まで来ると、ピペット１１内部の細胞懸濁液１３を細胞１２とともに排出する操作を行う。この際、ピペット１１の先端部の外側と先端部近傍の内部を光源１６とモニター２５からなる光学系で監視する。モニター２５の出力をパソコン２６に取り込み、パソコン２６の画像演算結果をもとに駆動装置３２を動作させて、シリンジポンプ３１の送液を制御することができる。
【００２３】
モニター２５でピペット１１の先端を監視しながら、駆動装置３２を動作させて、シリンジポンプ３１を動かし、細胞１２を含む懸濁液１３をピペット１１の先端から排出して、ピペット先端に液滴２１を形成する。このとき、液滴２１中に所定の細胞数が挿入されたことをモニター２５を通してパソコン２６が認識し、駆動装置３２に停止指令を出して、シリンジポンプ３１を停止させる。
【００２４】
以下、説明をシンプルにするため、液滴２１に挿入される細胞１２の数は1個として説明するが、細胞数は目的に応じて任意に使用者が決めればよい。たとえば、１０個でもよい。細胞１２の認識は、ピペット１１の先端部の液滴２１中に存在する細胞１２を直接検出するだけでも良いが、より効率的には、ピペット１１の内部を移動する細胞１２をモニター２５で監視し、パソコン２６で細胞のピペット内での位置と移動速度を計算し、ピペット１１の先端から液滴２１内に排出される時を予測してシリンジポンプ３１を制御してもよい。後者の認識方法を用いれば、たとえば短い間隔で複数の細胞がピペット内を移動している場合などに細胞を1個だけ液滴の中に入れる場合に有利となる。
【００２５】
ここで、細胞懸濁液１３の細胞濃度が低いときは、細胞がピペット１１の先端から出る直前に液滴２１を形成し始め、所定時間後に液滴形成を停止すれば、液滴２１の大きさを一定にすることができる。液滴を形成したくないときは、たとえばブロアーでピペット１１の先端から出てくる液を吹き飛ばせばよい。あるいは、基板１の外にドレインを設け、そこに排出してもよい。
【００２６】
一方、細胞懸濁液１３の細胞濃度が高いと、ピペット１１から排出される液量がまちまちとなる。すなわち、ピペット１１から排出される細胞１２の排出の頻度が上がるから、液を排出させる時間を所定の時間に固定していると、その時間内に次の細胞が液的２１の中に入ってしまう可能性がある。このようなケースでは、ピペット２０を用いる。ピペット２０とこれに連結されたシリンジポンプ３５には、培養液あるいは細胞希釈液のみが入れられている。すなわち、モニター２５を通して細胞１２が液滴２１に入るのをパソコン２６が確認したとき、駆動装置３２に停止指令を出して、シリンジポンプ３１を停止させるとともに、このときまでに液滴２１を形成するのに駆動されたシリンジポンプ３１の繰り出し量から、その時点の液滴２１の体積を割り出す。この体積と液滴２１の所望の体積との差をパソコン２６で計算する。この計算結果に応じて、その時点に出来ている液滴２１にピペット２０で培養液あるいは細胞希釈液を加えるように、パソコン２６から駆動装置３６に動作信号を送り、シリンジポンプ３５を駆動して、ピペット２０を用いて液滴２１の体積が所定の値になるまで液を加える。
【００２７】
このとき、ピペット２０に液滴中の細胞が逆流しないように、ピペット２０の先端は細胞が通らない大きさ、たとえば０．２μｍφとするのが良い。あるいは、先端が０．２μｍのフィルター構造を有するものとするのが良い。
【００２８】
このようにして作成した細胞が1個含まれる液滴２１は、ピペット１１の上下動駆動装置３７により、ステージ１９の上に置かれた基板１の上の親水性領域４に接触させられ、液滴２１は基板１の親水性領域４に移動する。細胞１２を含む液滴２１が基板１の親水性領域４、すなわち、細胞培養チップ１００の親水性領域４に移動したことが確認されると、使用者は操作信号２８を与えて、ステージ駆動装置１０を動かし、次の液滴を置く位置にピペット先端が位置するように、細胞培養チップ１００を移動させる。この移動は、親水性領域４の配置の情報をパソコン２６に与えておけば、パソコン２６によって自動的に行うことができる。そして、この新しい位置で、上述のようにしてピペット１１の先端に新たな液滴を形成し、細胞培養チップ１００の親水性領域４に移動させる。これを繰り返して、細胞培養チップ１００の親水性領域４の必要な部位に液滴を置く。これらの、すべての操作を、乾燥を防ぐため湿潤雰囲気の中で行う。液滴１５の配置が終わると、壁２で囲われた領域内全てにシリコンオイル３８を張る。
【００２９】
図２（ｂ）は、図２（ａ）を参照して説明した、細胞培養チップ１００に細胞を分配する実施例２のシステムによって、細胞培養チップ１００の親水性領域４に細胞が分配された結果を示す断面図である。シリコン基板１上の壁２で囲われた領域内の親水性領域４に細胞１２と、これを包み込む形の液滴１５が配置されている。壁２で囲われた領域内全てにシリコンオイル３８が張られている。液滴１５は０．２から２μｌ程度なので、０．５ｍｍの高さの壁２の内側に、シリコンオイル３８を入れると、液滴１５は乾燥から保護される。
【００３０】
ここで、シリコンオイルを使用する理由は、シリコンオイルがガス透過性に優れる点にある。これにより、常に液滴１５中の細胞１２に酸素を供給でき、極微量の培養液の中で細胞１２を飼い続けることができる。シリコンオイルの厚みは薄いほうが良く、液滴１５がシリコンオイルに埋まる程度が良く、たとえば深さ０．５ｍｍになるようにシリコンオイルを静かに流し込む。これにより、細胞の種類と状態にもよるが、たとえば上皮細胞であれば通常は数時間観察できる。細胞観察はモニター２５を用いても良いし、別の観察用の装置に移しても良い。
【００３１】
（実施例３）
より長時間、細胞をインキュベーションして観察できるようにするには、酸素透過性を確保するだけでは不十分で、細胞１２を包み込んでいる液滴１５を新しい培養液に交換する必要がある。
【００３２】
図３は、実施例２のシステム構成の内、細胞１２を包み込んでいる液滴１５を新しい培養液に交換する機能に着目した実施例３のシステム構成を説明する概念図である。実体としては、実施例２のシステム構成のピペット２０とこれに連係したチューブ３４、シリンジポンプ３５および駆動装置３６が利用できるので、図２を利用して、関連の無いものを削除した構成で説明する。もちろん、コンタミ等の防止の観点でピペット２０とこれに連係したチューブ３４、シリンジポンプ３５を新しいものに置換しても良いことは言うまでも無い。
【００３３】
ピペット２０の先端が新しい培養液に交換する液滴１５の位置になるように、ステージ１９を移動させて、着目している液滴１５をモニター２５で監視する。モニター２５で液滴１５とピペット２０の先端とを監視しながら、液滴１５の中にピペット２０を挿入する。ここでは、上下動駆動装置３７はピペット２０に連係するものとする。上下動駆動装置３７に、使用者により、ピペット２０を下げる信号が与えられるとピペット２０は下に動き、ピペット２０の先端部が液滴１５の中に挿入される。
【００３４】
ピペット２０の先端部が液滴１５の中に入ったことがモニター２５を通して確認できたら、使用者は、培養液を交換する旨の信号２８をパソコン２６に与える。パソコン２６は、液滴１５の大きさおよびこれに包含されている細胞の数、大きさの情報を与えられていれば、培養液を交換する旨の信号２８に応じて、シリンジポンプ３６を駆動して、所定量の古い培養液を一定量排出(吸引して外部に捨てる)し、基質や成長因子などを含む新しい培養液を供給する操作を自動的に、タイムシーケンシャルに実行することができる。この際、重要なのは、液滴１５に包含されている細胞１２が古い培養液とともに排出されてはならないし、不要なバクテリアが新しい培養液とともに混入することも許されない。
【００３５】
このため、ピペット２０の先端は、細胞が吸引されない内径、たとえば０．２μｍとするのが良い。あるいは、先端が０．２μｍのフィルター構造を有しているものとしても良い。また、ピペット２０およびこれに連係するチューブ３４、シリンジポンプ３５の衛生管理は十分に行う。
【００３６】
（実施例４）
所定時間、細胞をインキュベーションし、モニター２５による観察が終了し、所定の細胞のみを回収する操作について説明する。
【００３７】
図４は、実施例２のシステム構成の内、所定の細胞１２を包み込んでいる液滴１５の中から細胞を回収する機能に着目した実施例４のシステム構成を説明する概念図である。実体としては、実施例２のシステム構成のピペット１１とこれに連係したチューブ３０、シリンジポンプ３１および駆動装置３２が利用できるので、図２を利用して、関連の無いものを削除した構成で説明する。もちろん、コンタミ等の防止の観点でピペット１１とこれに連係したチューブ３０、シリンジポンプ３１を新しいものに置換しても良いことは言うまでも無い。さらに、細胞回収のことを考慮して、より太いサイズのピペット１１とするのも良い。
【００３８】
回収したい細胞を包含している液滴１５の位置になるように、ステージ１９を移動させて、着目している液滴１５をモニター２５で監視する。モニター２５で液滴１５とピペット１１の先端とを監視しながら、液滴１５の中にピペット１１を挿入する。ここでは、上下動駆動装置３７はピペット１１に連係するものとする。上下動駆動装置３７に、使用者により、ピペット１１を下げる信号が与えられるとピペット１１は下に動き、ピペット１１の先端部が液滴１５の中に挿入され、液滴１５の中の細胞１２をピペット１１内に吸い上げて回収する。
【００３９】
ピペット１１の先端部が液滴１５の中に入ったことがモニター２５を通して確認できたら、使用者は、液滴１５の中の細胞１２を吸引する旨の信号２８をパソコン２６に与える。パソコン２６は、液滴１５の大きさおよびこれに包含されている細胞の数、大きさの情報が与えられていれば、細胞１２を吸引する旨の信号２８に応じて、シリンジポンプ３１を駆動して培養液と一緒に細胞１２をピペット１１に吸引する操作を自動的に、タイムシーケンシャルに実行することができる。ここで、シリコンオイル３８を突き抜けてピペット１１を細胞１２を含む液滴１５内に挿入して吸い上げるので、多少のシリコンオイル３８が一緒に吸い上げられることになるが、無視しても、支障が無い程度の量でしかない。
【００４０】
ピペット１１に吸引された細胞１２は、所定の回収容器に排出し、目的細胞を回収する。
【００４１】
目的細胞を回収した後、別の液滴１５から細胞１２を回収するときは、新たに回収したい細胞を包含している液滴１５の位置がモニター２５で監視できる位置になるように、ステージ１９を移動させ、新たに着目している液滴１５をモニター２５で監視しながら、上述の手順で細胞１２をピペット１１に吸引し、所定の回収容器に排出し、新たな目的細胞を回収する。
【００４２】
ここで、実施例４に適するピペット１１のサイズについて検討すると以下のようである。実施例２の液滴の作成のときは、ピペット１１のサイズの先端部の直径は、一般的な動物細胞用として２０〜１００μｍ、バクテリアなどの微生物用では５μｍ程度とするのが良いとしたが、実施例４では、所定時間インキュベーションした後細胞を取り出すことを考慮すると、細胞が分裂して細胞塊になったものを吸いあげるに十分な径が必要である。具体的には１００〜４００μｍ程度である。
【００４３】
（実施例５）
図５（ａ）は、本発明の実施に好適な実施例５の細胞培養チップ１００の他の構成例を示す平面図、図５（ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図、図５（ｃ）は、液滴の形成法を説明する図である。図５（ａ）と図１（ａ）とを対比して明らかなように、実施例５の細胞培養チップ１００は、実施例１のそれと同じ平面構造である。また、材料、サイズ、製法も同様である。実施例５の細胞培養チップ１００の断面構造は、実施例１のそれとは異なる。すなわち、壁２で囲われた領域は疎水性領域３とされ、そのなかに、親水性領域４が周期的に配列される点では変わらないが、親水性領域４がウェルとして形成されている。この大きさは、直径４００μｍ（あるいは４００μｍ×４００μｍ）で深さ１００μｍとする。
【００４４】
図５（ｃ）に示すように、この実施例５では、壁２で囲われた領域に、あらかじめ、シリコンオイル３８を塗布しておく。シリコンオイル３８の層を突き抜けて、図２を参照して説明した実施例２のピペット１１とピペット２０を挿入し、ウェル５１内で、細胞懸濁液１３をピペット１１から、希釈液をピペット２０から供給し、液滴２１を直接、親水性領域４のウェルの中に形成する。ピペット１１，２０の先端を基板１のウェルの壁に接触させておくことで、形成された液滴２１をウェル内に、自動的に形成し、実施例２における液滴１５とすることができる。
【００４５】
実施例５においても、液滴２１を形成するウェルの領域とピペット１１，２０の先端は、モニター２５により監視しながら制御することが必要であるが、実施例２の説明から容易に分かることなので、図と説明を簡略化した。
【００４６】
（実施例６）
上述の実施例では、いずれも、一つのピペットは、一つの機能を持つものとして説明されているが、実施例６では、一つのピペットに、二つの機能を持たせた例について説明する。
【００４７】
図６（ａ）は、ピペット８１の先端が仕切り板８２により二つの流路とされた例を示す図、図６（ｂ）は、ピペット８７の内側にピペット８９を有する構造として二つの流路とされた例を示す図である。
【００４８】
図６（ａ）に示す構造では、第一の流路８３を第２の流路８４に比して十分に大きくし、第一の流路８３から細胞懸濁液、第２の流路８４から希釈液を供給できる構造とすることで、実施例２記載のピペット１１とピペット２０とを一体型としたものとすることができる。それぞれの流路の制御は独立したフリンジポンプで行うことは言うまでも無い。
【００４９】
図６（ｂ）に示す構造では、内側のピペット８９は内径が５０μｍとし、外側のピペット８７との内壁までの間隔は最大で８μｍとしている。これにより、内側のピペット８７から細胞懸濁液、外側のピペット８９から希釈液を供給することとして、実施例２記載のピペット１１とピペット２０とを一体型としたものとすることができる。それぞれの流路の制御は独立したフリンジポンプで行うことは言うまでも無い。
【００５０】
いずれの場合でも、希釈液を供給する側のサイズを、細胞懸濁液を供給する側から細胞が回り込まないものとすることで、実施例２記載のピペット１１とピペット２０とを一体型としたものとすることができる。
【００５１】
（その他）
上述したいずれの実施例でも、基板１の下面には細胞をインキュベーションする場合の基板温度をコントロールする手段２２が存在する。基本的に細胞を顕微鏡で観察しながらのインキュベーションとなるので、基板１そのものは透明である必要がある。温度をコントロールするヒーター２２も透明である必要があり、ＩＴＯ素子を用いるのが良い。ＩＴＯ素子としない場合は、例えば、透明な循環液が内部を温調した溶液が流れている構造のものを使用しても良い。この場合は、モニター２５の光学系に制約が生ずることがあるが長焦点対物レンズを用いれば解決する。
【００５２】
ピペット先端部を移動する細胞の計数については、例えば、ピペット先端部に対となる電極を設置し、細胞がピペットから出るときの電気的な変化を捕らえ、あるいは、先端部にレーザーなどを照射し、細胞が通過するときの光散乱を検出し、ピペットから細胞が排出されることを確認して計数することもできる。
【００５３】
図３を参照しながら、細胞１２を包み込んでいる液滴１５を新しい培養液に交換する機能について説明したが、この機能を利用すれば、細胞に影響のある種々物質、たとえば、細胞培養用の基質、増殖因子、サイトカインや内分泌かく乱物質をはじめとする化学物質などを液滴内に注入して、細胞への影響を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】（ａ）は、実施例１に好適な細胞培養チップ１００の平面図、（ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図である。
【図２】（ａ）は、細胞培養チップ１００に細胞を分配する実施例２のシステム構成を説明する概念図、（ｂ）は、細胞培養チップ１００の親水性領域４に細胞が分配された結果を示す断面図である。
【図３】実施例２のシステム構成の内、細胞１２を包み込んでいる液滴１５を新しい培養液に交換する機能に着目した実施例３のシステム構成を説明する概念図である。
【図４】実施例２のシステム構成の内、所定の細胞１２を包み込んでいる液滴１５の中から細胞を回収する機能に着目した実施例４のシステム構成を説明する概念図である。
【図５】（ａ）は、本発明の実施に好適な実施例５の細胞培養チップ１００の他の構成例を示す平面図、（ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図、（ｃ）は、液滴の形成法を説明する図である。
【図６】（ａ）は、ピペット１００の先端が仕切り板１０１により二つの流路とされた例を示す図、（ｂ）は、ピペット１１０の内側にピペット１１１を有する構造として二つの流路とされた例を示す図である。
【符号の説明】
【００５５】
１…シリコン基板、２…壁、３…疎水性領域、４…親水性領域、５…配置決め用のマーカー、１２…細胞、１１，２０…ピペット、１３…細胞１２を含む懸濁液、１６…光源、１７…集光レンズ、１８…コリメートレンズ、１９…ステージ、２２…ヒーター、２５…モニター、２６…パソコン、２７，３２，３６，３７…駆動装置、２８…操作入力信号、３０，３４…チューブ、３１，３５…シリンジポンプ、３８…シリコンオイル、３９…駆動装置とピペットとの連係を示す線、１００…細胞培養チップ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多数の細胞を同時にインキュベーションあるいは培養することを可能とする細胞インキュベーションチップおよび細胞インキュベーションチップへの細胞分別方法及びそのための装置に関する。すなわち、細胞を所定の数ずつアレー状に並べ、多数の細胞を同時に培養できる細胞培養チップと細胞培養システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を研究する上での基本は、目的細胞の分離と分離した細胞の個別培養である。分離技術としては、大きく分けると、以下のように分類できる。
（１）比重の違いで細胞を分離する方法、
（２）蛍光標識抗体で染色した情報あるいは目視の情報による方法、
（３）セルソーターによる方法。
いずれの方法も細胞懸濁液から目的の細胞を分離することができ、目的に応じて使用されている。
【０００３】
（１）の方法は、たとえば、精子細胞はＸ染色体を持つものと、Ｙ染色体をもつ２種類があり、重篤な遺伝的疾病を持つ家系においては、男女産み分けのため、利用されることがある。精子細胞のわずかな比重の違いを用いて分離する場合には速度沈降法によって分離する。この技術は、汎用的ではあるが、比重をつける試薬に目的細胞が曝露されることと、遠心による高い加速度にさらされるため、通常の細胞内での遺伝子発現などの細胞の状態が変動してしまう可能性がある。さらに、分離に長時間を要するため、通常４℃程度の低温に長時間目的細胞をさらすことになる。
【０００４】
（２）の方法は、未感作の免疫提示細胞と感作した免疫細胞とを見分けるような、細胞の比重の違いがほとんど無い場合に利用されるが、目視により目的細胞を１つ１つ分離する必要があり、分離に要する作業者の負担が大きい。さらに、目的細胞は蛍光標識抗体で染色されるため、目的細胞の状態が変動してしまう可能性がある。
【０００５】
（３）の方法は、比重を用いずに細胞を分離する技術のひとつである。セルソーターは蛍光染色処理後の細胞を電荷を持たせた液滴中に１細胞単位で単離して滴下し、この液滴中における細胞の蛍光の有無、光散乱量の大小を基に、液滴が落下する過程で、落下方向に対して法平面方向に高電界を任意の方向に印加することで、液滴の落下方向を制御して、下部に置かれた複数の容器に分画して回収する技術である。この技術について詳しくは、非特許文献１に報告されている。
【０００６】
このようにして分離した細胞を、培養、あるいは、所定時間インキュベーションするには、まず、所定の数の細胞をマイクロプレートやカルチャーディシュやカルチャーフラスコに培養液と細胞を入れ、ｐＨを一定に保つために適度の二酸化炭素存在下でインキュベーションするのが一般的である。所定の数の細胞を分注するにはあらかじめ細胞懸濁液中の細胞数を算定盤やセルカウンターで一定体積あたりの細胞数をカウントし、目的の細胞数に見合った体積分をマイクロプレートなどにピペットを用いて入れるのが一般的である。
【０００７】
培養容器としては、多数の細胞の培養に向いているのはマイクロプレートを使用する方法である。カルチャーディシュは比較的種類の少ない細胞の培養、カルチャーフラスコは多量培養に向いている。これらの容器に細胞を入れるのは、研究者や医療従事者が判断しながらピペットを操作して入れるのが一般的である。また、細胞には未知のコミュニティーエフェクトがあり孤立した細胞は増殖しづらく、培養系の中にある程度細胞が存在する必要がある。
【０００８】
【非特許文献１】Kamarck,M.E, Methods Enzymol., 第１５１巻第１５０頁から１６５頁（１９８７年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来技術は、分離した細胞を同時に培養する方法及び装置として、必ずしも研究者や医療従事者を満足させるものではない。一般的には、多数のカルチャーフラスコを並べて培養を行っているにすぎず、培養の労力やコストが膨大なものになってしまう。また、各培養に処する細胞の数はあらかじめ細胞懸濁液に含まれる細胞数をカウントし、それから逆算される体積を持って細胞数としている。このため、たとえば、細胞一個一個をスタートとして培養を行おうとすると、無限希釈した細胞懸濁液をマイクロプレートやディッシュに播いて増殖してきたもののみを選別するなどの方法をとる必要があった。
【００１０】
この方法は、大腸菌や酵母などの単細胞生物のクローニングには効力を発揮するが、多細胞生物由来の細胞では、効率が悪い問題がある。さらに前記したように、細胞同士のコミュニティーエフェクトが断ち切られると、集団での細胞と挙動が異なることが容易に推測できるので、たとえば、細胞１０個づつの集団ごとにマイクロプレートウェルやディッシュに分注することが必要となるが、実際上は、正確に分注できない問題がある。
【００１１】
本発明は、細胞を所定の数ずつアレー状に並べる方法と、多数の細胞を同時に培養できる細胞培養チップとを提案することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明では、所定の数の細胞または細胞塊を、細胞培養チップの所定の位置に配置できるように、細胞培養チップの表面に親水領域を所定の間隔で独立して形成する。この親水領域に対して、細胞の懸濁液を吸い上げたピペット先端から必要な細胞数を持つ適当な大きさの液滴として滴下させる。この際、ピペット先端を光学系でモニターして液滴の大きさおよび細胞数を監視して、制御する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、自動的に一定の微小体積に一定数の細胞が入った液滴を作成し、細胞培養チップの所定の位置に配置できる。よって、微小な体積スペースで所定の細胞をインキュベーションすることができる。さらに、微小であることは、限られた面積に多数の細胞をアレー状にインキュベーションすることができるスケールメリットがある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（実施例１）
図１（ａ）は、実施例１に好適な細胞培養チップ１００の平面図、（ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図である。１はシリコン基板であり、例えば、その厚さは１ｍｍ、大きさは２０ｍｍ×２０ｍｍである。２は壁であり、シリコン基板で製作され、その厚さは、例えば、１ｍｍ、高さは０．５ｍｍである。壁２で囲われた領域は疎水性領域３とされ、そのなかに、親水性領域４が周期的に配列される。親水性領域４の大きさは、この領域の一つに収容する細胞の大きさあるいは数によって決定されるが、４００μｍ×４００μｍ程度である。親水性領域４の間隔は、細胞を含む液滴が、お互いが接触して混ざらないだけの間隔とするが、取り扱いの便を考えると、２０００から４０００μｍ程度が良い。５は位置決め用のマーカーであり、シリコン基板１の一面に形成される。
【００１５】
親水性領域と疎水性領域の作成方法は、例えば、疎水性のシリコン基板１の上面を酸化して、一旦、全領域を親水性のＳｉＯ２薄膜とする。その後、疎水性とすべき領域のＳｉＯ２薄膜をフッ酸で溶解除去して疎水性領域を作成すれば良い。
【００１６】
（実施例２）
図２（ａ）は、細胞培養チップ１００に細胞を分配する実施例２のシステム構成を説明する概念図、図２（ｂ）は、細胞培養チップ１００の親水性領域４に細胞が分配された結果を示す断面図である。
【００１７】
実施例２では、細胞１２を分配するためのピペット１１の先端に形成される液滴を光学的にモニターしながら細胞培養チップ１００の親水性領域４に細胞１２を分配する。図２（ａ）において、１９はＸＹ方向に駆動されるステージであり、２７はステージ１９の駆動装置である。ステージ１９の上面には細胞培養チップ１００の温度を制御するためのヒーター２２が設けられ、この上面に細胞培養チップ１００が載置される。細胞培養チップ１００の上部には、分配すべき細胞１２を含む懸濁液１３があらかじめ吸い上げられて保持されているピペット１１が配置される。ピペット１１の根元部には、チューブ３０を介してシリンジポンプ３１が設けられ、シリンジポンプ３１には駆動装置３２が取り付けられている。シリンジポンプ３１が駆動装置３２により駆動されると、ピペット１１内の懸濁液１３が細胞１２とともに押し出される。なお、ピペット１１の根元部とチューブ３０との接続部が離れたように図示されているのは、ピペット１１を拡大して表示するためであり、分離されているわけではない。
【００１８】
一方、ピペット１１の先端部には、ピペット１１の先端部に培養液を供給するための他のピペット２０の先端が配置される。ピペット２０の根元部にはチューブ３４を介してシリンジポンプ３５が設けられ、シリンジポンプ３５には駆動装置３６が取り付けられている。シリンジポンプ３５が駆動装置３６により駆動されると、シリンジポンプ３５内の培養液がピペット２０から押し出される。
【００１９】
また、ピペット１１の先端部に形成された液滴を細胞培養チップ１００の親水性領域４に移すためのピペットの上下動駆動装置３７が設けられる。ここでは、上下動駆動装置３７はピペット１１に連係するものとする。上下動駆動装置３７に、使用者により、ピペット１１を下げる信号が与えられると、ピペット１１は下に動き、ピペット１１の先端部に形成された液滴を細胞培養チップ１００の親水性領域４に移す。上下動駆動装置３７に、使用者により、ピペット１１を復旧させる信号が与えられると、ピペット１１は図に示す位置に戻る。ピペット１１の図に示す位置への復旧は、下げ操作から、パソコン２６により、タイムシーケンシャルに行われるものとしても良い。一点差線３９は上下動駆動装置３７とピペット１１との連係を意味する。
【００２０】
さらに、ピペット１１の先端部の近傍の内部および先端部に形成される液滴の大きさをモニターするための光学系を構成する光源１６、集光レンズ１７が設けられ、これに対向する位置で細胞培養チップ１００の下部にコリメートレンズ１８およびモニター２５が設けられる。したがって、細胞培養チップ１００、温調器２２およびステージ１９は、光学的に透明である必要がある。２６は、いわゆる、パソコンであり、モニター２５からの入力信号に応じて、あらかじめ格納してある所定のプログラムから得られる制御信号、および、使用者がモニター２５の表示画面を見ながら与える操作入力信号２８に応じて駆動装置２７，３２，３６および３７に必要な信号を与える。なお、ここでは、図示しなかったが、モニター２５の検出している画面と同一の表示をパソコン２６のモニターに表示するのが便利である。そうすれば、モニター２５は、小型のＣＣＤカメラとすることができる。また、操作入力信号２８は、パソコン２６の入力装置を介して与えられるものである。
【００２１】
ここで、ピペット１１のサイズについて考えると以下のようである。ピペット１１は、その先端に、必要な細胞数を持つ適当な大きさの液滴を構成できるようにすることが必要である。一方、ピペット１１内には、細胞を含む懸濁液をピペットで吸い上げてから使用するが、液滴を構成するときに、ピペット１１の先端を通過する細胞がモニター２５で誤り無く検出できることが必要である。したがって、ピペット１１の先端部の直径は細胞１個あるいは所定の細胞数の塊が通過するのを許すが、計数できないほどの細胞が、一度に通過できないものとする。すなわち、現在、汎用的に使用されている培養用ピペットのように径が太いものではなく、透明で、先端部の直径が、一般的な動物細胞用として２０〜１００μｍ、バクテリアなどの微生物用では５μｍ程度とするのが良い。
【００２２】
細胞培養チップ１００の親水性領域４に細胞１２を分配する操作について以下説明する。まず、システムが起動されると、使用者は、図１（ａ）で説明したマーカー５に着目して細胞培養チップ１００が所定の起動位置にあるように位置決めする。次に、細胞１２の最初の分配位置をピペット１１および２０の先端部に対応する位置に移動させる操作入力信号２８に応じて、駆動装置２７によりステージ１９を操作する。細胞培養チップ１００が所定の位置まで来ると、ピペット１１内部の細胞懸濁液１３を細胞１２とともに排出する操作を行う。この際、ピペット１１の先端部の外側と先端部近傍の内部を光源１６とモニター２５からなる光学系で監視する。モニター２５の出力をパソコン２６に取り込み、パソコン２６の画像演算結果をもとに駆動装置３２を動作させて、シリンジポンプ３１の送液を制御することができる。
【００２３】
モニター２５でピペット１１の先端を監視しながら、駆動装置３２を動作させて、シリンジポンプ３１を動かし、細胞１２を含む懸濁液１３をピペット１１の先端から排出して、ピペット先端に液滴２１を形成する。このとき、液滴２１中に所定の細胞数が挿入されたことをモニター２５を通してパソコン２６が認識し、駆動装置３２に停止指令を出して、シリンジポンプ３１を停止させる。
【００２４】
以下、説明をシンプルにするため、液滴２１に挿入される細胞１２の数は1個として説明するが、細胞数は目的に応じて任意に使用者が決めればよい。たとえば、１０個でもよい。細胞１２の認識は、ピペット１１の先端部の液滴２１中に存在する細胞１２を直接検出するだけでも良いが、より効率的には、ピペット１１の内部を移動する細胞１２をモニター２５で監視し、パソコン２６で細胞のピペット内での位置と移動速度を計算し、ピペット１１の先端から液滴２１内に排出される時を予測してシリンジポンプ３１を制御してもよい。後者の認識方法を用いれば、たとえば短い間隔で複数の細胞がピペット内を移動している場合などに細胞を1個だけ液滴の中に入れる場合に有利となる。
【００２５】
ここで、細胞懸濁液１３の細胞濃度が低いときは、細胞がピペット１１の先端から出る直前に液滴２１を形成し始め、所定時間後に液滴形成を停止すれば、液滴２１の大きさを一定にすることができる。液滴を形成したくないときは、たとえばブロアーでピペット１１の先端から出てくる液を吹き飛ばせばよい。あるいは、基板１の外にドレインを設け、そこに排出してもよい。
【００２６】
一方、細胞懸濁液１３の細胞濃度が高いと、ピペット１１から排出される液量がまちまちとなる。すなわち、ピペット１１から排出される細胞１２の排出の頻度が上がるから、液を排出させる時間を所定の時間に固定していると、その時間内に次の細胞が液的２１の中に入ってしまう可能性がある。このようなケースでは、ピペット２０を用いる。ピペット２０とこれに連結されたシリンジポンプ３５には、培養液あるいは細胞希釈液のみが入れられている。すなわち、モニター２５を通して細胞１２が液滴２１に入るのをパソコン２６が確認したとき、駆動装置３２に停止指令を出して、シリンジポンプ３１を停止させるとともに、このときまでに液滴２１を形成するのに駆動されたシリンジポンプ３１の繰り出し量から、その時点の液滴２１の体積を割り出す。この体積と液滴２１の所望の体積との差をパソコン２６で計算する。この計算結果に応じて、その時点に出来ている液滴２１にピペット２０で培養液あるいは細胞希釈液を加えるように、パソコン２６から駆動装置３６に動作信号を送り、シリンジポンプ３５を駆動して、ピペット２０を用いて液滴２１の体積が所定の値になるまで液を加える。
【００２７】
このとき、ピペット２０に液滴中の細胞が逆流しないように、ピペット２０の先端は細胞が通らない大きさ、たとえば０．２μｍφとするのが良い。あるいは、先端が０．２μｍのフィルター構造を有するものとするのが良い。
【００２８】
このようにして作成した細胞が1個含まれる液滴２１は、ピペット１１の上下動駆動装置３７により、ステージ１９の上に置かれた基板１の上の親水性領域４に接触させられ、液滴２１は基板１の親水性領域４に移動する。細胞１２を含む液滴２１が基板１の親水性領域４、すなわち、細胞培養チップ１００の親水性領域４に移動したことが確認されると、使用者は操作信号２８を与えて、ステージ駆動装置１０を動かし、次の液滴を置く位置にピペット先端が位置するように、細胞培養チップ１００を移動させる。この移動は、親水性領域４の配置の情報をパソコン２６に与えておけば、パソコン２６によって自動的に行うことができる。そして、この新しい位置で、上述のようにしてピペット１１の先端に新たな液滴を形成し、細胞培養チップ１００の親水性領域４に移動させる。これを繰り返して、細胞培養チップ１００の親水性領域４の必要な部位に液滴を置く。これらの、すべての操作を、乾燥を防ぐため湿潤雰囲気の中で行う。液滴１５の配置が終わると、壁２で囲われた領域内全てにシリコンオイル３８を張る。
【００２９】
図２（ｂ）は、図２（ａ）を参照して説明した、細胞培養チップ１００に細胞を分配する実施例２のシステムによって、細胞培養チップ１００の親水性領域４に細胞が分配された結果を示す断面図である。シリコン基板１上の壁２で囲われた領域内の親水性領域４に細胞１２と、これを包み込む形の液滴１５が配置されている。壁２で囲われた領域内全てにシリコンオイル３８が張られている。液滴１５は０．２から２μｌ程度なので、０．５ｍｍの高さの壁２の内側に、シリコンオイル３８を入れると、液滴１５は乾燥から保護される。
【００３０】
ここで、シリコンオイルを使用する理由は、シリコンオイルがガス透過性に優れる点にある。これにより、常に液滴１５中の細胞１２に酸素を供給でき、極微量の培養液の中で細胞１２を飼い続けることができる。シリコンオイルの厚みは薄いほうが良く、液滴１５がシリコンオイルに埋まる程度が良く、たとえば深さ０．５ｍｍになるようにシリコンオイルを静かに流し込む。これにより、細胞の種類と状態にもよるが、たとえば上皮細胞であれば通常は数時間観察できる。細胞観察はモニター２５を用いても良いし、別の観察用の装置に移しても良い。
【００３１】
（実施例３）
より長時間、細胞をインキュベーションして観察できるようにするには、酸素透過性を確保するだけでは不十分で、細胞１２を包み込んでいる液滴１５を新しい培養液に交換する必要がある。
【００３２】
図３は、実施例２のシステム構成の内、細胞１２を包み込んでいる液滴１５を新しい培養液に交換する機能に着目した実施例３のシステム構成を説明する概念図である。実体としては、実施例２のシステム構成のピペット２０とこれに連係したチューブ３４、シリンジポンプ３５および駆動装置３６が利用できるので、図２を利用して、関連の無いものを削除した構成で説明する。もちろん、コンタミ等の防止の観点でピペット２０とこれに連係したチューブ３４、シリンジポンプ３５を新しいものに置換しても良いことは言うまでも無い。
【００３３】
ピペット２０の先端が新しい培養液に交換する液滴１５の位置になるように、ステージ１９を移動させて、着目している液滴１５をモニター２５で監視する。モニター２５で液滴１５とピペット２０の先端とを監視しながら、液滴１５の中にピペット２０を挿入する。ここでは、上下動駆動装置３７はピペット２０に連係するものとする。上下動駆動装置３７に、使用者により、ピペット２０を下げる信号が与えられるとピペット２０は下に動き、ピペット２０の先端部が液滴１５の中に挿入される。
【００３４】
ピペット２０の先端部が液滴１５の中に入ったことがモニター２５を通して確認できたら、使用者は、培養液を交換する旨の信号２８をパソコン２６に与える。パソコン２６は、液滴１５の大きさおよびこれに包含されている細胞の数、大きさの情報を与えられていれば、培養液を交換する旨の信号２８に応じて、シリンジポンプ３６を駆動して、所定量の古い培養液を一定量排出(吸引して外部に捨てる)し、基質や成長因子などを含む新しい培養液を供給する操作を自動的に、タイムシーケンシャルに実行することができる。この際、重要なのは、液滴１５に包含されている細胞１２が古い培養液とともに排出されてはならないし、不要なバクテリアが新しい培養液とともに混入することも許されない。
【００３５】
このため、ピペット２０の先端は、細胞が吸引されない内径、たとえば０．２μｍとするのが良い。あるいは、先端が０．２μｍのフィルター構造を有しているものとしても良い。また、ピペット２０およびこれに連係するチューブ３４、シリンジポンプ３５の衛生管理は十分に行う。
【００３６】
（実施例４）
所定時間、細胞をインキュベーションし、モニター２５による観察が終了し、所定の細胞のみを回収する操作について説明する。
【００３７】
図４は、実施例２のシステム構成の内、所定の細胞１２を包み込んでいる液滴１５の中から細胞を回収する機能に着目した実施例４のシステム構成を説明する概念図である。実体としては、実施例２のシステム構成のピペット１１とこれに連係したチューブ３０、シリンジポンプ３１および駆動装置３２が利用できるので、図２を利用して、関連の無いものを削除した構成で説明する。もちろん、コンタミ等の防止の観点でピペット１１とこれに連係したチューブ３０、シリンジポンプ３１を新しいものに置換しても良いことは言うまでも無い。さらに、細胞回収のことを考慮して、より太いサイズのピペット１１とするのも良い。
【００３８】
回収したい細胞を包含している液滴１５の位置になるように、ステージ１９を移動させて、着目している液滴１５をモニター２５で監視する。モニター２５で液滴１５とピペット１１の先端とを監視しながら、液滴１５の中にピペット１１を挿入する。ここでは、上下動駆動装置３７はピペット１１に連係するものとする。上下動駆動装置３７に、使用者により、ピペット１１を下げる信号が与えられるとピペット１１は下に動き、ピペット１１の先端部が液滴１５の中に挿入され、液滴１５の中の細胞１２をピペット１１内に吸い上げて回収する。
【００３９】
ピペット１１の先端部が液滴１５の中に入ったことがモニター２５を通して確認できたら、使用者は、液滴１５の中の細胞１２を吸引する旨の信号２８をパソコン２６に与える。パソコン２６は、液滴１５の大きさおよびこれに包含されている細胞の数、大きさの情報が与えられていれば、細胞１２を吸引する旨の信号２８に応じて、シリンジポンプ３１を駆動して培養液と一緒に細胞１２をピペット１１に吸引する操作を自動的に、タイムシーケンシャルに実行することができる。ここで、シリコンオイル３８を突き抜けてピペット１１を細胞１２を含む液滴１５内に挿入して吸い上げるので、多少のシリコンオイル３８が一緒に吸い上げられることになるが、無視しても、支障が無い程度の量でしかない。
【００４０】
ピペット１１に吸引された細胞１２は、所定の回収容器に排出し、目的細胞を回収する。
【００４１】
目的細胞を回収した後、別の液滴１５から細胞１２を回収するときは、新たに回収したい細胞を包含している液滴１５の位置がモニター２５で監視できる位置になるように、ステージ１９を移動させ、新たに着目している液滴１５をモニター２５で監視しながら、上述の手順で細胞１２をピペット１１に吸引し、所定の回収容器に排出し、新たな目的細胞を回収する。
【００４２】
ここで、実施例４に適するピペット１１のサイズについて検討すると以下のようである。実施例２の液滴の作成のときは、ピペット１１のサイズの先端部の直径は、一般的な動物細胞用として２０〜１００μｍ、バクテリアなどの微生物用では５μｍ程度とするのが良いとしたが、実施例４では、所定時間インキュベーションした後細胞を取り出すことを考慮すると、細胞が分裂して細胞塊になったものを吸いあげるに十分な径が必要である。具体的には１００〜４００μｍ程度である。
【００４３】
（実施例５）
図５（ａ）は、本発明の実施に好適な実施例５の細胞培養チップ１００の他の構成例を示す平面図、図５（ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図、図５（ｃ）は、液滴の形成法を説明する図である。図５（ａ）と図１（ａ）とを対比して明らかなように、実施例５の細胞培養チップ１００は、実施例１のそれと同じ平面構造である。また、材料、サイズ、製法も同様である。実施例５の細胞培養チップ１００の断面構造は、実施例１のそれとは異なる。すなわち、壁２で囲われた領域は疎水性領域３とされ、そのなかに、親水性領域４が周期的に配列される点では変わらないが、親水性領域４がウェルとして形成されている。この大きさは、直径４００μｍ（あるいは４００μｍ×４００μｍ）で深さ１００μｍとする。
【００４４】
図５（ｃ）に示すように、この実施例５では、壁２で囲われた領域に、あらかじめ、シリコンオイル３８を塗布しておく。シリコンオイル３８の層を突き抜けて、図２を参照して説明した実施例２のピペット１１とピペット２０を挿入し、ウェル５１内で、細胞懸濁液１３をピペット１１から、希釈液をピペット２０から供給し、液滴２１を直接、親水性領域４のウェルの中に形成する。ピペット１１，２０の先端を基板１のウェルの壁に接触させておくことで、形成された液滴２１をウェル内に、自動的に形成し、実施例２における液滴１５とすることができる。
【００４５】
実施例５においても、液滴２１を形成するウェルの領域とピペット１１，２０の先端は、モニター２５により監視しながら制御することが必要であるが、実施例２の説明から容易に分かることなので、図と説明を簡略化した。
【００４６】
（実施例６）
上述の実施例では、いずれも、一つのピペットは、一つの機能を持つものとして説明されているが、実施例６では、一つのピペットに、二つの機能を持たせた例について説明する。
【００４７】
図６（ａ）は、ピペット８１の先端が仕切り板８２により二つの流路とされた例を示す図、図６（ｂ）は、ピペット８７の内側にピペット８９を有する構造として二つの流路とされた例を示す図である。
【００４８】
図６（ａ）に示す構造では、第一の流路８３を第２の流路８４に比して十分に大きくし、第一の流路８３から細胞懸濁液、第２の流路８４から希釈液を供給できる構造とすることで、実施例２記載のピペット１１とピペット２０とを一体型としたものとすることができる。それぞれの流路の制御は独立したフリンジポンプで行うことは言うまでも無い。
【００４９】
図６（ｂ）に示す構造では、内側のピペット８９は内径が５０μｍとし、外側のピペット８７との内壁までの間隔は最大で８μｍとしている。これにより、内側のピペット８７から細胞懸濁液、外側のピペット８９から希釈液を供給することとして、実施例２記載のピペット１１とピペット２０とを一体型としたものとすることができる。それぞれの流路の制御は独立したフリンジポンプで行うことは言うまでも無い。
【００５０】
いずれの場合でも、希釈液を供給する側のサイズを、細胞懸濁液を供給する側から細胞が回り込まないものとすることで、実施例２記載のピペット１１とピペット２０とを一体型としたものとすることができる。
【００５１】
（その他）
上述したいずれの実施例でも、基板１の下面には細胞をインキュベーションする場合の基板温度をコントロールする手段２２が存在する。基本的に細胞を顕微鏡で観察しながらのインキュベーションとなるので、基板１そのものは透明である必要がある。温度をコントロールするヒーター２２も透明である必要があり、ＩＴＯ素子を用いるのが良い。ＩＴＯ素子としない場合は、例えば、透明な循環液が内部を温調した溶液が流れている構造のものを使用しても良い。この場合は、モニター２５の光学系に制約が生ずることがあるが長焦点対物レンズを用いれば解決する。
【００５２】
ピペット先端部を移動する細胞の計数については、例えば、ピペット先端部に対となる電極を設置し、細胞がピペットから出るときの電気的な変化を捕らえ、あるいは、先端部にレーザーなどを照射し、細胞が通過するときの光散乱を検出し、ピペットから細胞が排出されることを確認して計数することもできる。
【００５３】
図３を参照しながら、細胞１２を包み込んでいる液滴１５を新しい培養液に交換する機能について説明したが、この機能を利用すれば、細胞に影響のある種々物質、たとえば、細胞培養用の基質、増殖因子、サイトカインや内分泌かく乱物質をはじめとする化学物質などを液滴内に注入して、細胞への影響を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】（ａ）は、実施例１に好適な細胞培養チップ１００の平面図、（ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図である。
【図２】（ａ）は、細胞培養チップ１００に細胞を分配する実施例２のシステム構成を説明する概念図、（ｂ）は、細胞培養チップ１００の親水性領域４に細胞が分配された結果を示す断面図である。
【図３】実施例２のシステム構成の内、細胞１２を包み込んでいる液滴１５を新しい培養液に交換する機能に着目した実施例３のシステム構成を説明する概念図である。
【図４】実施例２のシステム構成の内、所定の細胞１２を包み込んでいる液滴１５の中から細胞を回収する機能に着目した実施例４のシステム構成を説明する概念図である。
【図５】（ａ）は、本発明の実施に好適な実施例５の細胞培養チップ１００の他の構成例を示す平面図、（ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図、（ｃ）は、液滴の形成法を説明する図である。
【図６】（ａ）は、ピペット１００の先端が仕切り板１０１により二つの流路とされた例を示す図、（ｂ）は、ピペット１１０の内側にピペット１１１を有する構造として二つの流路とされた例を示す図である。
【符号の説明】
【００５５】
１…シリコン基板、２…壁、３…疎水性領域、４…親水性領域、５…配置決め用のマーカー、１２…細胞、１１，２０…ピペット、１３…細胞１２を含む懸濁液、１６…光源、１７…集光レンズ、１８…コリメートレンズ、１９…ステージ、２２…ヒーター、２５…モニター、２６…パソコン、２７，３２，３６，３７…駆動装置、２８…操作入力信号、３０，３４…チューブ、３１，３５…シリンジポンプ、３８…シリコンオイル、３９…駆動装置とピペットとの連係を示す線、１００…細胞培養チップ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細胞を含む溶液を保持でき、所定の大きさの細胞ないし細胞塊が通過するにふさわしい先端開口径を持つピペットと、
前記ピペット先端の細胞を観察する手段と、
前記ピペット先端部に細胞を含む溶液をピペット内部から押し出して液滴を形成する手段と、
前記液滴内に所定の細胞が包含され、所定の大きさの液滴となったことを判断する手段と、
を備え、前記ピペット先端部に形成された前記液滴を基板上の所定の位置に滴下し並べることを特徴とする細胞分取装置。
【請求項２】
所定の数の細胞を含む液滴を形成する手段と、前記液滴のサイズをコントロールする手段、前記液滴を基板上にアレー状に配列するための基板と、前記基板上に形成されて前記液滴の溶媒より比重が小さくかつ実質的に液滴と混ざらない溶媒層からなることを特徴とする細胞培養システム。
【請求項３】
所定の数の細胞を含む液滴を形成する手段、前記液滴のサイズをコントロールする手段、前記液滴を基板上にアレー状に配列する基板、前記基板上に形成されて前記液滴の溶媒より比重が小さくかつ実質的に液滴の溶媒と混ざらない溶媒層、前記基板上の液滴の溶媒を交換する手段、前記細胞の培養中に前記液滴の温度をコントロールする手段、前記基板上にアレー状に配した液滴中の細胞を観察する手段、所定時間培養した後前記細胞を回収する手段からなることを特徴とする細胞培養システム。
【請求項４】
所定の大きさを持つ基板の一面を疎水性の領域にするとともに該疎水性の領域に所定の間隔で独立した複数の親水性の領域を形成した基板、前記複数の親水性の領域を囲う基板上に形成された壁とよりなるとともに、前記親水性の領域に所定の液滴に包含された細胞を配列し、かつ、前記液滴の溶媒より比重が小さくかつ実質的に液滴の溶媒と混ざらない溶媒層で覆ったことを特徴とする細胞培養チップ。
【請求項５】
前記溶媒層を先に設けた後、前記基板の複数の親水性の領域に所定の液滴に包含された細胞を配列した請求項４記載の細胞培養チップ。
【請求項６】
前記所定の数の細胞を含む液滴を形成する手段が、細胞を含む懸濁液を供給するピペットの先端部と培養液を供給するピペットの先端部とがつき合わせた形で配置され、それぞれの液量を制御して、液滴のサイズを制御する請求項１記載の細胞分取装置。
【請求項７】
前記所定の数の細胞を含む液滴を形成する手段が、細胞を含む懸濁液を供給するピペットの先端部と培養液を供給するピペットの先端部とがつき合わせた形で配置され、それぞれの液量を制御して、液滴のサイズを制御する請求項２または３記載の細胞培養システム。
【請求項８】
前記二つのピペットに対応する流路が一つのピペット内に形成された請求項６記載の細胞分取装置。
【請求項９】
前記二つのピペットに対応する流路が一つのピペット内に形成された請求項７記載の細胞培養システム。
【請求項１】
複数の細胞を含む溶液を保持でき、所定の大きさの細胞ないし細胞塊が通過するにふさわしい先端開口径を持つピペットと、
前記ピペット先端の細胞を観察する手段と、
前記ピペット先端部に細胞を含む溶液をピペット内部から押し出して液滴を形成する手段と、
前記液滴内に所定の細胞が包含され、所定の大きさの液滴となったことを判断する手段と、
を備え、前記ピペット先端部に形成された前記液滴を基板上の所定の位置に滴下し並べることを特徴とする細胞分取装置。
【請求項２】
所定の数の細胞を含む液滴を形成する手段と、前記液滴のサイズをコントロールする手段、前記液滴を基板上にアレー状に配列するための基板と、前記基板上に形成されて前記液滴の溶媒より比重が小さくかつ実質的に液滴と混ざらない溶媒層からなることを特徴とする細胞培養システム。
【請求項３】
所定の数の細胞を含む液滴を形成する手段、前記液滴のサイズをコントロールする手段、前記液滴を基板上にアレー状に配列する基板、前記基板上に形成されて前記液滴の溶媒より比重が小さくかつ実質的に液滴の溶媒と混ざらない溶媒層、前記基板上の液滴の溶媒を交換する手段、前記細胞の培養中に前記液滴の温度をコントロールする手段、前記基板上にアレー状に配した液滴中の細胞を観察する手段、所定時間培養した後前記細胞を回収する手段からなることを特徴とする細胞培養システム。
【請求項４】
所定の大きさを持つ基板の一面を疎水性の領域にするとともに該疎水性の領域に所定の間隔で独立した複数の親水性の領域を形成した基板、前記複数の親水性の領域を囲う基板上に形成された壁とよりなるとともに、前記親水性の領域に所定の液滴に包含された細胞を配列し、かつ、前記液滴の溶媒より比重が小さくかつ実質的に液滴の溶媒と混ざらない溶媒層で覆ったことを特徴とする細胞培養チップ。
【請求項５】
前記溶媒層を先に設けた後、前記基板の複数の親水性の領域に所定の液滴に包含された細胞を配列した請求項４記載の細胞培養チップ。
【請求項６】
前記所定の数の細胞を含む液滴を形成する手段が、細胞を含む懸濁液を供給するピペットの先端部と培養液を供給するピペットの先端部とがつき合わせた形で配置され、それぞれの液量を制御して、液滴のサイズを制御する請求項１記載の細胞分取装置。
【請求項７】
前記所定の数の細胞を含む液滴を形成する手段が、細胞を含む懸濁液を供給するピペットの先端部と培養液を供給するピペットの先端部とがつき合わせた形で配置され、それぞれの液量を制御して、液滴のサイズを制御する請求項２または３記載の細胞培養システム。
【請求項８】
前記二つのピペットに対応する流路が一つのピペット内に形成された請求項６記載の細胞分取装置。
【請求項９】
前記二つのピペットに対応する流路が一つのピペット内に形成された請求項７記載の細胞培養システム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−８１４８２（Ｐ２００６−８１４８２Ａ）
【公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２７０７６８（Ｐ２００４−２７０７６８）
【出願日】平成１６年９月１７日（２００４．９．１７）
【出願人】（５０４２９６０２４）有限責任中間法人 オンチップ・セロミクス・コンソーシアム (39)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月１７日（２００４．９．１７）
【出願人】（５０４２９６０２４）有限責任中間法人 オンチップ・セロミクス・コンソーシアム (39)
【Ｆターム（参考）】
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