細胞培養方法及び細胞培養装置
【課題】培養細胞を安価に、かつ、大量に製造することができる細胞培養方法及び細胞培養装置を提供する。
【解決手段】表面に凹凸を有する基材１２を搬送するとともに、該基材の表面に細胞を供給し、細胞が供給された基材を培養液３０中に浸漬させた状態で搬送しながら前記細胞を増殖させて、細胞３２を前記基材の表面から回収する。基材の表面が多孔質フィルムにより形成されていることが好ましく、孔がハニカム状に配置されていることが特に好ましい。
【解決手段】表面に凹凸を有する基材１２を搬送するとともに、該基材の表面に細胞を供給し、細胞が供給された基材を培養液３０中に浸漬させた状態で搬送しながら前記細胞を増殖させて、細胞３２を前記基材の表面から回収する。基材の表面が多孔質フィルムにより形成されていることが好ましく、孔がハニカム状に配置されていることが特に好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養方法及び細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、従来から行われてきた臓器移植や人工臓器を用いる治療法にとって代わる方法として、再生医療に大きな期待が寄せられている。再生医療の研究は、骨髄移植のような幹細胞の補充による細胞・組織の再生、創傷治癒、手術時の皮膚、臓器の損傷修復を目指した研究と、狭義の組織工学（Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）という概念で捉えられる一連の研究という２つの方向性で発展してきた。狭義の組織工学とは、細胞が生体内で生着する際に必要な足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）と細胞の両方を用いて修復しようとする研究である。再生医学には「細胞」、「細胞の増殖・分化のための足場」、及び「細胞増殖因子」が必要である。再生医療においては、より長期間生存し、生体内における本来の機能をより高いレベルで発現する手段が重要である。
培養細胞については、三次元的に集合した組織体（スフェロイド）を形成した場合には、二次元的に形成した場合に比べて、より長期間生存し、生体内における本来の機能をより高いレベルで発現することが報告されている。このため、培養細胞から三次元組織体を形成する技術は、例えば、生体の挙動を再現するシミュレータ、薬品開発における動物実験の代替技術、細胞移植による再生医療技術等への応用が期待されている。
【０００３】
このような培養細胞の三次元体（スフェロイド）を形成する技術として、例えば、流動性の培地中で回転させながら培養する方法（特許文献１参照）、所定の粘度以上の細胞培養液を用いる方法（特許文献２参照）、ゾル状態の培養液にスフェロイド前駆体を浮遊させた後、培養液をゲル化して培養を行う方法（特許文献３参照）、細胞は透過せず培養液は透過し得る網目状構造物を設けた培養容器（特許文献４参照）などが提案されている。
【０００４】
また、細胞増殖に良好な足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）となり得る材料として、非水溶性ポリマーから形成され、ハニカム構造、即ち、基底フィルムの表面に基底フィルムに垂直な隔壁で区画された複数の小空間が互いにヘキサゴナルに位置するように形成された構造を有するハニカム多孔質体の使用が提案されている（例えば特許文献５参照）。
【特許文献１】特開２００４−５２００２３号公報
【特許文献２】特開平７−７９７７２号公報
【特許文献３】特開平８−１４０６７３号公報
【特許文献４】特開平８−７０８４７号公報
【特許文献５】特開２００１−１５７５７４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞培養において、上記のような種々の培養方法、培養液、培養容器等が提案されているが、今後、培養細胞を薬品開発における動物実験の代替技術や細胞移植による再生医療技術等に益々適用するには、培養細胞を安価に、かつ、大量に製造することが望まれる。
【０００６】
本発明は、培養細胞を安価に、かつ、大量に製造することができる細胞培養方法及び細胞培養装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明によれば以下の細胞培養方法及び細胞培養装置が提供される。
【０００８】
＜１＞ 表面に凹凸を有する基材を搬送するとともに、該基材の表面に細胞を供給する工程と、前記細胞が供給された基材を培養液中に浸漬させた状態で前記細胞を培養する工程と、前記培養した細胞を前記基材の表面から回収する工程を含むことを特徴とする細胞培養方法。
＜２＞ 前記細胞が供給された基材を培養液中に浸漬させた状態で前記細胞をスフェロイド化することを特徴とする＜１＞の細胞培養方法。
＜３＞ 前記基材の搬送速度を０．００１〜１００ｍ／分とすることを特徴とする＜１＞又は＜２＞に記載の細胞培養方法。
＜４＞ 前記基材として連続したシート状基材をロールから繰り出して供給する工程と、前記培養した細胞を回収した後の前記シート状基材を巻き取る工程とをさらに有することを特徴とする＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の細胞培養方法。
＜５＞ 前記基材が連続した無端のシート状基材であり、前記培養した細胞を回収した後のシート状基材を洗浄する工程をさらに有することを特徴とする＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の細胞培養方法。
＜６＞ 前記基材の表面が、多孔質フィルムにより形成されていることを特徴とする＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の細胞培養方法。
＜７＞ 前記基材が、前記多孔質フィルムを支持する支持体を含むことを特徴とする＜６＞に記載の細胞培養方法。
＜８＞ 前記多孔質フィルムが、疎水性の高分子多孔質フィルムであることを特徴とする＜６＞又は＜７＞に記載の細胞培養方法。
＜９＞ 前記多孔質フィルムの支持体が金属製であることを特徴とする＜７＞又は＜８＞に記載の細胞培養方法。
＜１０＞ 前記多孔質フィルムが、三次元網目構造を有し、表面に孔がハニカム状に配置していることを特徴とする＜６＞〜＜９＞のいずれかに記載の細胞培養方法。
＜１１＞ 前記基材の表面に、細胞を保持しうる細胞接着性領域と、該細胞接着性領域の周りを囲む細胞非接着性領域とが配置されていることを特徴とする＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の細胞培養方法。
＜１２＞ 前記基材の表面に、前記細胞をインクジェットヘッドにより供給することを特徴とする＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の細胞培養方法。
【０００９】
＜１３＞ 表面に凹凸を有する基材を所定の方向に搬送する手段と、
前記搬送される基材の表面に細胞を供給する手段と、
前記細胞を培養する培養液を収容し、前記細胞が供給された基材を前記培養液に浸漬させる培養液槽と、
前記培養した細胞を前記基材の表面から回収する手段と、
を含むことを特徴とする細胞培養装置。
＜１４＞ 前記細胞が供給された基材を培養液中に浸漬させた状態で前記細胞をスフェロイド化することを特徴とする＜１３＞に記載の細胞培養装置。
＜１５＞ 前記基材を搬送する手段が、前記基材を０．００１〜１００ｍ／分の搬送速度で搬送する手段であることを特徴とする＜１３＞又は＜１４＞に記載の細胞培養装置。
＜１６＞ 前記基材として連続したシート状基材をロールから繰り出して供給する手段と、前記培養した細胞を回収した後の前記シート状基材を巻き取る手段とを有することを特徴とする＜１３＞〜＜１５＞のいずれかに記載の細胞培養装置。
＜１７＞ 前記基材が連続した無端のシート状基材であり、前記培養した細胞を回収した後のシート状基材を洗浄する手段をさらに有することを特徴とする＜１３＞〜＜１５＞のいずれかに記載の細胞培養装置。
＜１８＞ 前記基材の表面が、多孔質フィルムにより形成されていることを特徴とする＜１３＞〜＜１７＞のいずれかに記載の細胞培養装置。
＜１９＞ 前記基材が、前記多孔質フィルムを支持する支持体を含むことを特徴とする＜１８＞に記載の細胞培養装置。
＜２０＞ 前記多孔質フィルムが、疎水性の高分子多孔質フィルムであることを特徴とする＜１８＞又は＜１９＞に記載の細胞培養装置。
＜２１＞ 前記多孔質フィルムの支持体が金属製であることを特徴とする＜１９＞又は＜２０＞に記載の細胞培養装置。
＜２２＞ 前記多孔質フィルムが、三次元網目構造を有し、表面に孔がハニカム状に配置していることを特徴とする＜１８＞〜＜２１＞のいずれかに記載の細胞培養装置。
＜２３＞ 前記基材の表面に、細胞を保持しうる細胞接着性領域と、該細胞接着性領域の周りを囲む細胞非接着性領域とが配置されていることを特徴とする＜１３＞〜＜２２＞のいずれかに記載の細胞培養装置。
＜２４＞ 前記細胞を、インクジェットヘッドにより前記基材に供給することを特徴とする＜１３＞〜＜２３＞のいずれかに記載の細胞培養装置。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、培養細胞を安価に、かつ、大量に製造することができる細胞培養方法及び細胞培養装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明に係る細胞培養方法及び細胞培養装置について、主にスフェロイドの製造方法及びスフェロイド製造装置を例に、図面を参照しつつ説明する。
本発明に係る細胞培養方法は、表面に凹凸を有する基材を搬送するとともに、該基材の表面に細胞を供給する工程と、前記細胞が供給された基材を培養液中に浸漬させた状態で前記細胞を培養する工程と、前記培養した細胞を前記基材の表面から回収する工程を含む。
【００１２】
−第１の実施形態−
本発明に係るスフェロイドの製造方法は、例えば図１に示すような構成の装置を用いて好適に行うことができる。
本実施形態のスフェロイド製造装置１０は、表面に凹凸を有する連続したシート状基材１２を所定の方向に連続的に搬送する手段（基材搬送手段）１４，１６，１８ａ，１８ｂと、前記連続的に搬送される基材１２の表面に細胞を断続的又は連続的に供給する手段（細胞供給手段）２０，２２，２４と、前記細胞をスフェロイド化する培養液３０を収容し、前記細胞が供給された基材１２を前記培養液３０に浸漬させる培養液槽（細胞培養手段）２８と、前記スフェロイド化した細胞３２を前記基材１２の表面から回収する手段（細胞回収手段）３４，４４とを含んでいる。
このような装置構成により、表面に凹凸を有する連続したシート状基材１２を連続的に搬送させるとともに、基材１２に細胞を断続的又は連続的に供給した後、一定期間培養液３０中に浸漬させながら搬送させて細胞を培養し、スフェロイド化した細胞３２を基材１２から回収することができる。
【００１３】
＜基材＞
基材１２は、表面に凹凸が形成されており、供給された細胞を保持し、搬送中、細胞が脱落しないように、培養する細胞の種類、サイズ等に応じて選択すればよい。例えば、多孔質有機樹脂製フィルム、メッシュフィルム、任意の方法による微細加工フィルムなどが挙げられる。微細加工フィルムの例としては、微小な孔がハニカム状に配置された、いわゆるハニカムフィルム、ナノインプリントにより表面にμｍ又はｎｍオーダーの凹凸を施した樹脂フィルム、光リソグラフィー技術を用いた、任意のサイズ・形・分布・パターンの孔（例えば１０μｍ径の均一六角柱状孔）をハニカムパターンに配置したフィルム、平均直径が１μｍ〜１０μｍのランダムなサイズの円筒孔がランダムに配置したフィルム、マイクロ打ち抜き加工や射出成形加工で同様に作製した多孔質フィルムなどが挙げられる。本発明の基材１２としてはハニカムフィルムが好ましい。
【００１４】
例えば、多孔質フィルムを用いる場合は、フィルムの厚さ方向に貫通し、または貫通しない孔を有するフィルムであって、かつ、細胞などの組織体を表面に保持できるものであれば、材質、構造、孔の形態および孔径、孔径分布、孔の位置の分布、開孔率（フィルム面積に対する表面開孔部総面積の割合）は特に限定されず、細胞の種類に応じて選択すればよい。より具体的な例として、下記のような方法により製造したものが挙げられる。
例えば、ワイヤー状、フィラメント状の素材を高密度で編成或いは織成してシート状の織編体とする方法、繊維集合体を繊維の絡み合いや融着、バインダーなどにより成形して不織布とする方法、樹脂材料などに発泡、或いは加圧発泡等により連通孔構造を形成して多孔質フィルム（多孔質シート）とする方法、有機溶媒と高分子化合物を含む液を支持体上にキャストするキャスト法により連通孔、貫通孔を形成したフィルムを形成する方法、パンチング等の方法で穿孔して多孔質フィルムを得る方法などが挙げられる。
【００１５】
多孔質フィルムにおける孔の形態および孔径については、例えば、細胞の平均径の８０％以下の円柱状や四角柱状の貫通孔、細胞の平均径よりも狭い孔径であって、表裏面を連通してなる孔を有する多孔構造などが挙げられる。
孔径分布や孔の位置の分布については例えば、精密メッシュフィルターのような単分散なもの、一般的な多孔質フィルムのような多分散なものが挙げられる。
開孔率については、精密メッシュフィルターのように８０％を超えるもの、一般的な多孔質フィルムのように５０％以下のものなど、いずれも目的に応じて使用することができる。
【００１６】
本発明に使用しうる多孔質フィルムにおける孔径としては、前記の如く細胞の平均径の８０％以下の孔径、細胞の平均径よりも狭い孔径であることが三次元組織体の形成には好ましいが、より具体的には、孔径は０．０１μｍ〜１００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは０．１μｍ〜５０μｍ、さらに好ましくは１μｍ〜２０μｍの範囲である。なお、本発明における多孔質フィルムの孔径の大きさは、その形状に拘わらず特に断らない限り、最大径を表すものとし、例えば、円形であれば直径を、矩形であれば対角線の長さを意味するものとする。この多孔質フィルムにおける空孔の孔径は、市販の高倍率顕微鏡やＳＥＭ表面観察によって測定することができる。
【００１７】
また、培養する細胞の平均径とこの空孔径との関係を制御することで、例えば、フィルムの厚さ方向に貫通した孔を有する多孔質フィルムを使用する場合、フィルムの表面のみならず、播種側の裏面にも組織体を形成することが可能となる。即ち、多孔質フィルムとして孔径が細胞径よりも小さいものを使用すれば、細胞播種側の多孔質フィルムの表面および細胞播種反対側の多孔質フィルム表面（裏面）の両面にスフェロイドを形成することができる。一方、多孔質フィルムの孔径が細胞径よりも大きいものを用いて同様の培養を行った場合は、細胞播種した多孔質フィルム表面ではなく、その反対側の多孔質フィルム裏面上にスフェロイドが形成される。従って、多孔質フィルムの孔径を制御することで組織体の形成方向を制御することができる。
ただし、搬送中における基材１２の破損を防ぐため、表面の多孔質フィルムと、該多孔質フィルムを支持する支持体とを含む基材１２を用いることが好ましい。例えば、ポリエチレンテレフタレート等の樹脂フィルムを支持体とし、この樹脂フィルム上に多孔質フィルムを一体的に形成した基材１２を用いることができる。このような基材１２であれば、細胞は表面となる多孔質フィルム側のみで増殖してスフェロイドを形成することとなる。
【００１８】
また、表面に、細胞を保持しうる細胞接着性領域と、該細胞接着性領域の周りを囲む細胞非接着性領域とが配置されている基材を用いてもよい。例えば、多孔質フィルムの表面に上記細胞接着性領域と、細胞非接着性領域のパターニングを行えばよい。
【００１９】
この細胞非接着性物質としては、例えば、細胞接着性領域で培養する細胞の細胞膜に存する細胞表面分子に対して結合しない物質を用いることができる。具体的に、生体から取得された細胞非接着性物質としては、例えば、アルブミン等の高い親水性を示すたんぱく質等を好ましく用いることができる。また、合成された細胞非接着性物質としては、例えば、ポリエチレングリコール等の極めて高い親水性を示す高分子鎖を含む化合物や、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ（ポリヒドロキシエチルメタクリレート）、ＳＰＣ（セグメント化ポリウレタン）等を好ましく用いることができる。また、これら細胞非接着性物質の誘導体としては、例えば、当該細胞非接着性物質に任意の官能基や高分子鎖を、所定の化学反応等によって結合したものを好ましく用いることができる。上記の中で、特に好ましい細胞非接着性物質は、ポリエチレングリコールである。
【００２０】
細胞非接着性物質またはその誘導体は、例えば、当該細胞非接着性物質またはその誘導体を含む水溶液中において、当該細胞非接着性物質またはその誘導体が有する官能基と、表面に露出している官能基とを所定の化学反応等によって結合させることにより、当該細胞接着性領域の周辺領域表面に固定できる。
基材の具体的な製造方法等については後述する。
【００２１】
＜基材搬送手段＞
基材１２を搬送する手段は、２つの搬送ローラ（供給ローラ１４及び回収ローラ１６）と、補助ローラ１８ａ，１８ｂにより構成されている。供給ローラ１４には、表面に凹凸を有する連続したシート状基材１２がロール状に巻かれており、基材１２を連続的に繰り出して供給することができる。一方、回収ローラ１６には、スフェロイド化した細胞３２が基材１２から回収された後、使用後の基材１２が巻き取られる。供給ローラ１４による基材１２の供給速度と回収ローラ１６による基材１２の回収速度とが同じとなるように各搬送ローラ１４，１６の回転速度を制御することで、基材１２を供給ローラ１４から回収ローラ１６に向けて一定の速度で搬送することができる。なお、基材１２の強度等に問題がなければ、回収ローラ１６を駆動ローラとし、供給ローラ１４を従動ローラとすることにより基材１２を搬送するようにしてもよい。
また、補助ローラ１８ａ，１８ｂの位置や数は任意であり、供給ローラ１４から供給された基材１２を培養液３０中に導いて浸漬させ、培養液３０中でスフェロイド化した細胞３２を回収ローラ１６の手前で基材１２から回収できるように適宜設ければよい。
このように供給ローラ１４、回収ローラ１６、及び補助ローラ１８ａ，１８ｂを設けることで、ロール・ツー・ロールにより基材１２を供給ローラ１４から回収ローラ１６の方向に向けて所定の速度で搬送することができる。
【００２２】
＜細胞供給手段＞
供給ローラ１４から送り出された基材１２を介して補助ローラ１８ａにほぼ対向する位置にインクジェットヘッド２０が設けられている。インクジェットヘッド２０は、細胞が蓄えられた容器２２にパイプ２４を介して繋がれており、連続的に搬送される基材１２の表面に対して細胞を含む液２６を供給する。このようなインクジェットヘッド２０を備えることで、連続的に搬送される基材１２の表面に、細胞を含む液を一定の量で断続的に供給することができる。なお、細胞供給手段はインクジェットヘッド２０に限定されず、細胞に損傷を与えずに基材１２上に断続的に供給することができればディスペンサー等の他の供給手段を用いてもよい。
【００２３】
＜細胞培養手段＞
細胞が供給された基材１２は、培養液３０が収容された培養液槽２８に導かれ、基材１２及び基材１２の表面に保持された細胞は培養液３０に浸漬された状態で搬送される。培養液３０は細胞の種類に応じて選択すればよく、培養液３０の温度も細胞の種類に応じて設定すればよい。培養液槽２８には、培養液３０を一定の温度に保つためのヒータのほか、浄化を行うための循環システム等を設けてもよい。
基材１２に保持された細胞は、回収ローラ１６に到達する前にスフェロイド化させる必要がある。そのため、培養液槽２８の長さは、細胞の種類、基材１２の搬送速度等に応じて選択すればよい。例えば、培養する細胞、使用する基材、培養液を用い、細胞がスフェロイド化するまでの時間を測定し、培養液槽２８の長さと搬送速度を選択することができる。なお、基材１２の搬送速度は、細胞が基材から離脱しない速度とし、通常は、基材の搬送速度を０．００１〜１００ｍ／分とすることが好ましく、より好ましくは０．００２〜８０ｍ／分、さらに好ましくは０．００３〜６０ｍ／分である。
【００２４】
＜スフェロイド回収手段＞
培養液３０中でスフェロイド化した細胞３２は、基材１２に保持された状態で培養液槽２８から出た後、基材１２の表面から回収される。スフェロイド３２を回収する手段は特に限定されず、例えば、吸引、ブレードによるかき取り等を採用することができる。例えば、図３に示すようなＶ字状のブレード３６と吸引口３４を組み合わせた回収手段を採用することができる。基材１２に保持されているスフェロイド３２は、基材１２の移動に伴ってＶ字ブレード３６と接触して基材１２から離脱し、それぞれブレード３６に沿って両サイドの各吸引口３４に導かれて吸い込まれる。このような回収手段を用いればスフェロイド３２をより確実にかつ効率的に回収することができる。
なお、本実施形態に係るスフェロイド製造装置１０は、雰囲気中の雑菌による汚染を防ぐため、クリーンルーム、クローズドシステムに収容して稼動させることが好ましい。
【００２５】
＜多孔質フィルムの製造方法＞
基材１２を構成する多孔質フィルムのうち、最も好ましいのは、有機溶媒と高分子化合物を含む液を支持体上にキャストして膜を形成し、前記膜中に空隙が形成されたハニカム状或いは任意の形状の連通孔が形成されてなる多孔質フィルムである。
図４（Ａ）〜（Ｃ）は、多数の空孔がハニカム状に配置された構造（ハニカム構造）を有する多孔質フィルム（以下、ハニカムフィルムと略称する場合がある。）５０の一例を概略的に示している。本発明でいうハニカム構造とは、具体的には、図４（Ａ）に示すようにほぼ一定の形状とサイズを有する空孔５２が膜本体５４に連続的にかつ規則的に配列している構造を意味する。このような規則的な孔５２の配列は、単層の場合には二次元的であり、複層の場合は三次元的にも規則性を有するものでもよい。この規則性は、二次元的には１つの空孔の周囲を複数（例えば、６つ）の空孔が取り囲むように配置され、三次元的には結晶構造の面心立方や六方晶のような構造を取って、空孔が最密充填のように配置ことが多いが、製造条件によってはこれら以外の規則性を示すこともある。例えば、図２のＳＥＭ写真に見られるように、厚さ方向に貫通せず、隣接する空孔同士が連通するハニカムフィルムを得ることもできる。
【００２６】
ハニカム構造の多孔質フィルム５０の表面には、ほぼ所定の間隔Ｌで各孔５２の開口部が現れ、本発明では、その開口部の径Ｄを開口径と呼ぶこととする。ハニカム構造の規則性は、このような空孔５２の開口径の変動係数で比較的簡便に評価することができる。通常は、変動係数が小さいほど多孔質フィルムの力学強度を高くすることができ、本発明に係るハニカムフィルム５０における変動係数は２０％以下であることが好ましく、１０％以下であることがより好ましく、５％以下であることがさらに好ましい。
【００２７】
図４に示されるように孔５０が規則的に配列された多孔質フィルム（多孔質基材）５０を作製する方法としては、まず、支持体上に原料溶液をキャストして液膜（高分子膜）を形成する。次いで、結露乾燥工程により、雰囲気中の水分を結露させて高分子膜中に液滴を形成させる。その後、液滴を蒸発させることで、例えば図２のＳＥＭ写真に見られるような孔が規則的に配列された多孔質フィルムを得ることができる。
【００２８】
このようなキャスト法によれば、高分子溶液に含まれる樹脂、溶剤、添加剤などの原料や、成膜雰囲気における湿度、湿潤空気の供給条件などの諸条件を調整することにより、孔の形状や配列を制御することができ、例えばハニカム状或いは任意の形状の連通孔が形成されてなる多孔質フィルム５０を得ることができる。また、例えば、貫通孔としてのみならず、隣接する周囲の孔と連通して、所謂三次元網目構造の空隙５２を有する多孔質フィルム５０を複雑な工程を必要とせずに製造することができる。
【００２９】
ハニカム状多孔質フィルム（ハニカムフィルム）の具体的な製造方法としては、例えば、特願２００７−０３９９９２、特願２００７−０８１８３２に記載されている方法を好ましく適用することができる。
図５は、本発明に係るハニカム状多孔質フイルムの製造方法の一例を概略的に示すである。まず、液調製工程において高分子化合物と溶媒と両親溶性化合物などの添加剤とから高分子溶液（以下、液と称する）を調製する。
また、支持体形成工程において支持体６６を製造する。次いで、キャスト工程により液を支持体６６上にキャスト（塗布）して高分子膜６０を形成する。
支持体６６上に高分子膜６０を形成した後、結露工程（図５（Ａ）参照）を行い高分子膜６０中に水を主成分とする液滴６４を形成する。次いで、乾燥工程を行い、高分子膜６０中の有機溶媒６８を揮発させ（図５（Ｂ））、さらに高分子膜６０の液滴６４を水蒸気７０として蒸発させる（図５（Ｃ））。これにより図４に示したようなハニカム状多孔質フイルム５０が得られる。なお、ハニカム状多孔質フイルム５０に機能性物質を含有させるなどして機能性構造体（機能性フィルム）を得ることもできる。
【００３０】
多孔質フィルム及び支持体は、合成樹脂、ＥＰＤＭ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｄｉｅｎｅ Ｍｏｎｏｍｅｒ）等の合成ゴム、天然ゴム等から成形される。合成樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート等）、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニル、シリコーン等を好ましく用いることができる。
【００３１】
多孔質フィルムの形成に用いる材料は、目的に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、疎水性ポリマー及び両親媒性化合物から選択される少なくとも１種が好適である。
【００３２】
多孔質フィルムを構成する疎水性ポリマーは、公知のもののなかから、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビニル重合ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリヘキサフルオロプロペン、ポリビニルエーテル、ポリビニルカルバゾール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルカルバゾール、ポリテトラフルオロエチレンなど）、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリ乳酸など）、ポリラクトン（例えばポリカプロラクトンなど）、ポリアミド又はポリイミド（例えば、ナイロンやポリアミド酸など）、ポリウレタン、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリアロマティックス、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリシロキサン誘導体、などが挙げられる。これらは、溶解性、光学的物性、電気的物性、膜強度、弾性等の観点から、必要に応じてホモポリマーとしてもよいし、２種以上の構造単位を共重合させてなるコポリマーや２種以上のポリマーの混合物であるポリマーブレンドの形態をとってもよい。
【００３３】
多孔質フィルムの形成に用いられる両親媒性化合物には特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、両親媒性ポリマーが挙げられる。
両親媒性ポリマーは、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリアクリルアミドを主鎖骨格とし、疎水性側鎖としてドデシル基、親水性側鎖としてカルボキシル基を併せ持つ両親媒性ポリマー、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールブロックコポリマー、などが挙げられる。
前記疎水性側鎖は、アルキレン基、フェニレン基等の非極性直鎖状基であり、エステル基、アミド基等の連結基を除いて、末端まで極性基やイオン性解離基などの親水性基を分岐しない構造であることが好ましい。該疎水性側鎖としては、例えば、アルキレン基を用いる場合には５つ以上のメチレンユニットからなることが好ましい。
前記親水性側鎖は、アルキレン基等の連結部分を介して末端に極性基やイオン性解離基、又はオキシエチレン基などの親水性部分を有する構造であることが好ましい。
【００３４】
両親媒性化合物としては、両親媒性ポリマー以外のものも挙げられる。両親媒性ポリマー以外の両親媒性化合物としては、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、界面活性剤などが好ましい。
両親媒性化合物として用いられる界面活性剤としては、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される化合物などが挙げられる。
【００３５】
【化１】
【００３６】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ１は脂肪族基、脂環式化合物基、芳香族基、又は、ヘテロ環を表し、Ｒ２は脂肪族基、脂環式化合物基、芳香族基、ヘテロ環、又は、−Ｌ−Ｚを表す。Ｑ１、Ｑ２、及びＱ３はそれぞれ単結合、酸素原子、硫黄原子、又は、−Ｎ（Ｒ３）−を表し、Ｒ３は水素原子、脂肪族基、脂環式化合物基、芳香族基、ヘテロ環、又は、−Ｌ−Ｚを表す。ここで、Ｌは２価の連結基を表し、Ｚはイオン性の基を表す。なお、単結合とは、元素が存在しないことを表し、例えば、Ｑ１が単結合を表すとは、ＰとＲ１とが直接連結されていることを意味する。
【００３７】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ１で表される脂肪族基としては、例えば、直鎖又は分枝の炭素数１〜４０の無置換アルキル基、直鎖又は分枝の炭素数１〜４０の置換アルキル基、直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の無置換アルケニル基、直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の置換アルケニル基、直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の無置換アルキニル基、直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の置換アルキニル基等が好ましい。
直鎖又は分枝の炭素数１〜４０の無置換アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−アミル基、ｔｅｒｔ−アミル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｔｅｒｔ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、１，１，３−トリメチルヘキシル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、セチル基、ヘキサデシル基、２−ヘキシルデシル基、オクタデシル基、エイコシル基、２−オクチルドデシル基、ドコシル基、テトラコシル基、２−デシルテトラデシル基、トリコシル基等が挙げられる。
直鎖又は分枝の炭素数１〜４０の置換アルキル基における置換基としては、例えば、アルコキシル基、アリール基、ハロゲン原子、カルボンエステル基、カルボンアミド基、カルバモイル基、オキシカルボニル基、燐酸エステル基等が挙げられる。具体的には、例えば、ベンジル基、β−フェネチル基、２−メトキシエチル基、４−フェニルブチル基、４−アセトキシエチル基、６−フェノキシヘキシル基、１２−フェニルドデシル基、１８−フェニルオクタデシル基、ヘプタデシルフルオロオクチル基、１２−（ｐ−クロロフェニル）ドデシル基、２−（燐酸ジフェニル）エチル基等が挙げられる。
【００３８】
前記直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の無置換アルケニル基としては、例えば、ビニル基、アリル基、３−ブテニル基、２−メチル−２−ブテニル基、４−ペンテニル基、３−ペンテニル基、３−メチル−３−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、４−ヘキセニル基、３−ヘキセニル基、２−ヘキセニル基、７−オクテニル基、９−デセニル基、オレイル基、リノレイル基、リノレニル基等が挙げられる。
前記直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の置換アルケニル基としては、例えば、２−フェニルビニル基、４−アセチル−２−ブテニル基、１３−メトキシ−９−オクタデセニル基、９，１０−ジブロモ−１２−オクタデセニル基等が挙げられる。
前記直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の無置換アルキニル基としては、例えば、アセチレン基、プロパルギル基、３−ブチニル基、４−ペンチニル基、５−ヘキシニル基、４−ヘキシニル基、３−ヘキシニル基、２−ヘキシニル基等が挙げられる。
前記直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の置換アルキニル基における置換基としては、例えば、アルコキシル基、アリール基等が挙げられる。具体的には、例えば、２−フェニルアセチレン基、３−フェニルプロパルギル基等が挙げられる。
【００３９】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ１で表される脂環式化合物基としては、例えば、置換又は無置換の炭素数３〜４０のシクロアルキル基、置換又は無置換の炭素数４〜４０のシクロアルケニル基等が好ましい。
前記芳香族基としては、例えば、置換又は無置換の炭素数６〜５０のアリール基等が好ましい。
前記脂環式化合物基における、置換又は無置換の炭素数３〜４０のシクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロヘキシル基、２，６−ジメチルシクロヘキシル基、４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシル基、４−フェニルシクロヘキシル基、３−メトキシシクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。
前記脂環式化合物基における、置換又は無置換の炭素数４〜４０のシクロアルケニル基としては、例えば、１−シクロヘキセニル基、２−シクロヘキセニル基、３−シクロヘキセニル基、２，６−ジメチル−３−シクロヘキセニル基、４−ｔｅｒｔ−ブチル−２−シクロヘキセニル基、２−シクロヘプテニル基、３−メチル−３−シクロヘプテニル基等が挙げられる。
【００４０】
前記芳香族基における、置換又は無置換の炭素数６〜５０のアリール基の置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシル基、アリール基、ハロゲン原子等が挙げられる。具体的には、例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、アントラニル基、ｏ−クレジル基、ｍ−クレジル基、ｐ−クレジル基、ｐ−エチルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、ｐ−ｎ−アミルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−アミルフェニル基、２，６−ジメチル−４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、ｐ−シクロヘキシルフェニル基、オクチルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフェニル基、ノニルフェニル基、ｐ−ｎ−ドデシルフェニル基、ｍ−メトキシフェニル基、ｐ−ブトキシフェニル基、ｍ−オクチルオキシフェニル基、ビフェニル基、ｍ−クロロフェニル基、ペンタクロロフェニル基、２−（５−メチルナフチル基）等が挙げられる。
【００４１】
前記一般式（Ｉ）中、ヘテロ環としては、例えば、置換又は無置換の炭素数４〜４０の環状エーテル、置換又は無置換の炭素数４〜４０の含窒素環等が好ましい。
前記置換又は無置換の炭素数４〜４０の環状エーテルとしては、例えば、フリル基、４−ブチル−３−フリル基、ピラニル基、５−オクチル−２Ｈ−ピラン−３−イル基、イソベンゾフラニル基、クロメニル基等が挙げられる。
前記置換又は無置換の炭素数４〜４０の含窒素環としては、例えば、２Ｈ−ピロリル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、インドリジニル基、モルホリル基等が挙げられる。
【００４２】
これらの中でも、炭素数１〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の無置換アルキル基、置換基の炭素数を除いた炭素数が１〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の置換アルキル基、炭素数２〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の無置換アルケニル基、炭素数２〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の置換アルケニル基、炭素数６〜３０の置換又は無置換のアリール基が特に好ましい。
前記炭素数１〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の無置換アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−アミル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、１，１，３−トリメチルヘキシル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、セチル基、ヘキサデシル基、２−ヘキシルデシル基、オクタデシル基、エイコシル基、２−オクチルドデシル基、ドコシル基、テトラコシル基、２−デシルテトラデシル基等が挙げられる。
【００４３】
前記置換基の炭素数を除いた炭素数が１〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の置換アルキル基としては、例えば、６−フェノキシヘキシル基、１２−フェニルドデシル基、１８−フェニルオクタデシル基、ヘプタデシルフルオロオクチル基、１２−（ｐ−クロロフェニル）ドデシル基、４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシル基等が挙げられる。
前記炭素数２〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の無置換アルケニル基としては、例えば、ビニル基、アリル基、２−メチル−２−ブテニル基、４−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、３−ヘキセニル基、３−シクロヘキセニル基、７−オクテニル基、９−デセニル基、オレイル基、リノレイル基、リノレニル基等が挙げられる。
前記炭素数２〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の置換アルケニル基としては、例えば、２−フェニルビニル基、９，１０−ジブロモ−１２−オクタデセニル基等が挙げられる。
前記炭素数６〜３０の置換又は無置換のアリール基としては、例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、ｐ−クレジル基、ｐ−エチルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−アミルフェニル基、オクチルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフェニル基、ノニルフェニル基、ｐ−ｎ−ドデシルフェニル基、ｍ−オクチルオキシフェニル基、ビフェニル基、等が挙げられる。
【００４４】
前記一般式（Ｉ）中、Ｑ１、Ｑ２、及びＱ３としては、単結合、酸素原子、又は−Ｎ（Ｒ３）−が好ましく、Ｑ１、Ｑ２、及びＱ３の内の少なくとも２つ以上が酸素原子であることが特に好ましい。
【００４５】
前記一般式（Ｉ）中、Ｌとしては、下記一般式（ＩＩ）で表される基が好ましい。
【００４６】
【化２】
【００４７】
ただし、前記一般式（ＩＩ）中、Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、それぞれ同じであっても異なっていてもよく、炭素数１〜４０の置換又は無置換のアルキレン基、或いは、炭素数６〜４０の置換又は無置換のアリーレン基のいずれかを表す。Ｊ１、Ｊ２、及びＪ３は、それぞれ同じであっても異なっていてもく、２価の結合ユニットを表す。ｐ、ｑ、及びｒは、それぞれ独立に、０〜５の整数を表す。ｓは、１〜１０の整数を表す。ａ及びｂは、それぞれ独立に、０〜５０の整数を表す。
【００４８】
前記Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３における置換基としては、例えば、前記一般式（Ｉ）におけるＲ１で例示した基が挙げられる。具体的には、例えば、アルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、１，４−シクロヘキシレン基、オクタメチレン基、デカメチレン基、２−メトキシ−１，３−プロピレン基等が好ましく、アリーレン基としては、ｏ−フェニレン基、ｍ−フェニレン基、ｐ−フェニレン基、３−クロロ−１，４−フェニレン基、１，４−ナフチレン基、１，５−ナフチレン基等が好ましい。これらの中でも、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、１，４−シクロヘキシレン基、オクタメチレン基、デカメチレン基、ｍ−フェニレン基、ｐ−フェニレン基が特に好ましい。
【００４９】
前記Ｊ１、Ｊ２、及びＪ３における２価の結合ユニットとしては、例えば、単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）ＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ４）ＣＯ−、−Ｎ（Ｒ４）ＣＯＮ（Ｒ５）−、−ＯＣＯＮ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）ＣＯＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）ＳＯ２−、−Ｎ（ＣＯＲ４）−、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ１）Ｏ−等が好ましい。なお、これらにおいて、Ｒ１は前記一般式（Ｉ）におけるのと同じ意を表し、Ｒ４は水素原子、炭素数１〜６の無置換アルキル基、及び置換基の炭素数を除いた炭素数が１〜６の置換アルキル基のいずれかを表し、Ｒ５はＲ４と同じ意を表すがそれぞれ同じであっても異なっていてもよい。
前記Ｒ４及びＲ５における置換基としては、アリール基、アルコキシル基、ハロゲン原子等が挙げられる。
これらの中では、単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ３）−（Ｒ３は水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基を表す。）、−Ｎ（Ｒ４）ＣＯ−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）ＳＯ２−等が特に好ましい。
【００５０】
前記ｐ、ｑ、及びｒとしては、それぞれ独立に、０〜３の整数が好ましく、０又は１の整数が特に好ましい。
前記ｓとしては、１〜５の整数が好ましく、１〜３の整数が特に好ましい。前記ａ及びｂとしては、それぞれ独立に、０〜２０の整数が好ましく、０〜１０の整数が特に好ましい。
【００５１】
前記一般式（Ｉ）中、Ｚとしては、親水性のアニオン性又はカチオン性のイオン性基が好ましく、アニオン性基が特に好ましい。
前記アニオン性基としては、−ＣＯＯＭ、−ＳＯ３Ｍ、−ＯＳＯ３Ｍ、−ＰＯ（ＯＭ）２−ＯＰＯ（ＯＭ）２が特に好ましい。なお、前記Ｍは、対カチオンを表し、アルカリ金属イオン（例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン等）、アルカリ土類金属イオン（例えば、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等）、及びアンモニウムイオンのいずれかが好ましい。これらの中でも、ナトリウムイオン、カリウムイオンが特に好ましい。
前記カチオン性基としては、例えば、−ＮＨ３＋・Ｘ−、−ＮＨ２（Ｒ６）＋・Ｘ−、−ＮＨ（Ｒ６）２＋・Ｘ−、−Ｎ（Ｒ６）３＋・Ｘ−が挙げられる。
前記Ｒ６は、炭素数１〜３のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、２−ヒドロキシエチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基等）を表し、メチル基、２−ヒドロキシエチル基が好ましい。
前記Ｘ−としては、対アニオンを表し、例えば、ハロゲンイオン（例えば、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン等）、複合無機アニオン（例えば、水酸化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、燐酸イオン等）、及び有機化合物アニオン（例えば、シュウ酸イオン、蟻酸イオン、酢酸イオン、プロピオン酸イオン、メタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン等）が好ましく、塩素イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、酢酸イオンが特に好ましい。
【００５２】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ２としては、例えば、上記Ｒ１で例示した基、上記−Ｌ−Ｚで例示した基の中から選ばれる一価の基が挙げられる。Ｒ１で例示した基から選択される場合は、同一分子内に存在するＲ１と同一構造であっても異なった構造であってもよい。また、−Ｌ−Ｚで例示した基から選択される場合も、同一分子内に存在する−Ｌ−Ｚと同一構造であっても異なった構造であってもよい。これらの中でも、Ｒ１で例示した基から選択される場合が特に好ましい。更に、Ｒ１とＲ２との炭素数の合計が６以上８０以下になることが好ましく、８以上５０以下になる場合が特に好ましい。
【００５３】
前記界面活性剤の具体例〔例示化合物（ＰＷ−１）〜（ＰＷ−５２）〕を以下に例示するが、これら具体例に限定されるものではない。
【００５４】
【化３】
【００５５】
【化４】
【００５６】
【化５】
【００５７】
【化６】
【００５８】
【化７】
【００５９】
【化８】
【００６０】
【化９】
【００６１】
【化１０】
【００６２】
【化１１】
【００６３】
【化１２】
【００６４】
前記疎水性側鎖と前記親水性側鎖との比率は、分子の大きさや非極性、極性の強さ、疎水性有機溶媒の疎水性の強さなどに応じて異なり一概には規定できないが、ユニット比（疎水性側鎖／親水性側鎖）は９．９／０．１〜５．５／４．５が好ましい。また、コポリマーの場合、疎水性側鎖の親水性側鎖の交互重合体よりも、疎水性溶媒への溶解性に影響しない範囲で疎水性側鎖と親水性側鎖がブロックを形成するブロックコポリマーであることが好ましい。
【００６５】
多孔質フィルムの原料となる疎水性ポリマー及び両親媒性ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は、１０，０００〜１０，０００，０００が好ましく、５０，０００〜１，０００，０００がより好ましい。なお、この重量平均分子量は、ＧＰＣ法により測定した値を採用している。
また、両親媒性化合物が界面活性剤の如き低分子量の化合物である場合の分子量としては、３００〜６００の範囲であることが好ましい。
【００６６】
本発明の特定多孔質フィルムを形成するに際しては、疎水性ポリマーのみを原料とすることもできるが、疎水性ポリマーと両親媒性化合物とを、共に用いることが好ましい。
疎水性ポリマーと両親媒性化合物との組成比率（質量比率）は、前記両親媒性化合物が両親媒性ポリマーである場合は、９９．９：０．１〜５０：５０が好ましく、９５：５〜７５：２５がより好ましい。前記両親媒性化合物の比率が上記範囲において、均一な連通多孔質構造体が得られ、且つ、膜の安定性、特に力学的な安定性を十分に得ることができる。
また、前記両親媒性化合物が両親媒性ポリマーでない場合は、前記疎水性ポリマーと前記両親媒性化合物との組成比率（質量比率）は、９９．９：０．１〜８０：２０が好ましい。前記両親媒性化合物が両親媒性の低分子量化合物である場合、この組成比率において、均一な連通多孔質構造体が得られ、フィルム強度を適切に維持することができる。
なお、両親媒性化合物として、両親媒性ポリマーと両親媒性の低分子化合物を任意の比率で混合して用いてもよい。
【００６７】
多孔質フィルムの原料として用いる疎水性ポリマー及び両親媒性ポリマーは、分子内に重合性基を有する重合性（架橋性）ポリマーであることも好ましい態様である。また、疎水性ポリマー及び／又は両親媒性ポリマーとともに、重合性の多官能モノマーを配合し、この配合物により連通孔を有する多孔質構造体を形成した後、熱硬化法、紫外線硬化法、電子線硬化法等の公知の方法によって硬化処理を施すことも、多孔質フィルム強度向上の観点から好ましい。
【００６８】
疎水性ポリマー及び／又は両親媒性ポリマーと併用しうる多官能モノマーとしては、反応性の点から多官能（メタ）アクリレートが好ましい。前記多官能（メタ）アクリレートの例としては、ジペンタエリスリトールペンタアクリレ−ト、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールカプロラクトン付加物へキサアクリレート又はこれらの変性物、エポキシアクリレートオリゴマー、ポリエステルアクリレートオリゴマー、ウレタンアクリレートオリゴマ−、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、トリプロピレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレート、又はこれらの変性物などが使用できる。
これらの多官能モノマーは耐擦傷性と柔軟性のバランスから、単独で又は２種以上を組み合わせて用いられる。
疎水性ポリマー及び両親媒性ポリマーは、分子内に重合性基を有する重合性（架橋性）ポリマーである場合には、疎水性ポリマー及び両親媒性ポリマーの重合性基と反応しうる重合性の多官能モノマーを併用することも好ましい。
【００６９】
［有機溶媒］
前記高分子化合物を溶解させて液を調製する有機溶媒としては、クロロホルム、 ジクロロメタン、四塩化炭素、シクロヘキサン、酢酸メチルなどが挙げられる。但し、前記高分子化合物を溶解させることができれば特に限定されるものではない。また、キャストするときのポリマー濃度は、高分子膜６０を形成できる濃度であれば良く、具体的には、０．１重量％以上３０重量％以下の範囲であることが好ましい。０．１重量％未満であると、ハニカム状多孔質フイルム５０の生産性に劣り工業的大量生産に適さないおそれがある。また、３０重量％を超える濃度であると、結露工程（図５（Ａ））において液滴の成長が十分に行われないうちに、乾燥工程（図５（Ｂ）（Ｃ））が行われてハニカム状多孔質フイルムとなるため、好ましい構造、例えばハニカム構造を形成することが困難となる場合がある。
【００７０】
［微粒子］
本発明において、微粒子を液中に含有させることで高分子膜６０の高分子化合物の凝縮を容易とすることができる。微粒子は特に限定されず、また、微粒子のサイズ（平均粒子径）も特に限定されるものではない。
【００７１】
［その他の添加剤］
ハニカム状多孔質フイルム５０に機能性を付与するため、液中に機能性を発現する添加剤を予め含有させておくこともできる。添加剤についてもその種類、添加量などは所望の物、範囲であれば特に限定されるものではない。
【００７２】
キャスト法により製造された多孔質フィルムが、平面方向（面内方向）に連通する空孔を有することは、培養細胞の酸素や培養液の供給、老廃物等の排出などの物質交換にとって有利な構造であるといえる。すなわち、図７に示すように、多孔質フィルム５０の連通孔５２を通じて細胞３２ａに栄養素（グルコース、ビタミン、必須アミノ酸など）を供給し易く、また、細胞３２ａからの排泄物（乳酸など）を排出し易い。
【００７３】
また、支持体と多孔質フィルムを同種の材料で形成するか、互いに接着する材料で形成することで、多数の孔がハニカム状に配置された多孔質フィルムと、該多孔質フィルムを支持する支持体とが一体化したフィルムを得ることができる。このように多孔質フィルムと支持体とが一体化していれば、多孔質フィルムだけの場合に比べて強度が高くなり、基材として好適である。
【００７４】
＜スフェロイドの製造方法＞
次に、スフェロイドの製造方法について具体的に説明する。
供給ローラ１４及び回収ローラ１６の回転により、供給ローラ１４にロール状に巻かれているシート状基材１２が連続的に所定の速度で繰り出され、インクジェットヘッド２０の下に供給される。そして、供給ローラ１４から回収ローラ１６の方向に搬送される基材１２に対して、インクジェットヘッド２０から一定の間隔で断続的に細胞を含む液（単細胞溶液）２６が供給される。
【００７５】
基材に供給する細胞としては、所定の培養条件下で、増殖するものであれば、由来する動物種や臓器・組織の種類を問わず任意の細胞を用いることができる。具体的な例としては、ヒトまたはヒト以外の動物（例えば、サル、ブタ、イヌ、ラット、マウス等）由来の肝臓、膵臓、腎臓、神経、皮膚、脂肪等から採取される初代細胞、Ｏｃｔ−４・Ｓｏｘ２・Ｋｌｆ４・ｃ−Ｍｙｃの４因子を導入して初期化したマウスｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、人工多能性幹細胞）、Ｏｃｔ−４・Ｓｏｘ２・Ｋｌｆ４の３因子で初期化したマウスｉＰＳ細胞、ＯＣＴ−４・ＳＯＸ２・ＮＡＮＯＧ・ＬＩＮ２８の４遺伝子を胎児肺由来の線維芽細胞や新生児包皮由来の線維芽細胞へ導入し初期化したヒトｉＰＳ細胞、ＯＣＴ−４・ＳＯＸ２・ＮＡＮＯＧ・ＬＩＮ２８の４遺伝子を胎児肺由来の線維芽細胞や新生児包皮由来の線維芽細胞へ導入し初期化したヒトｉＰＳ細胞、未分化な幹細胞、胚由来のＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）、血管内皮細胞、樹立されている株化細胞、またはこれらに遺伝子操作等を施した細胞等であって、増殖可能な細胞を好ましく用いることができる。
なお、スフェロイド化させる細胞によっては、基材１２の表面にエタノールを噴射して濡れ性を向上させた後、細胞を供給してもよい。エタノールで基材１２の表面を濡らした後、細胞を供給すれば、細胞が基材表面に接触したときに細胞が損傷することを抑制することができる。
【００７６】
基材１２上に供給された細胞は、基材１２の表面の凹凸によって保持され、基材１２の搬送により培養液槽２８内の培養液３０中に浸漬される。培養液３０としては、当該細胞の生存状態や機能等を維持することができるよう、必要な塩類や栄養成分等を適切な濃度で含む水溶液であれば任意の組成のものを用いることができる。例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）等の基礎培地に、増殖因子や抗生物質等を添加した培養培地や、いわゆる生理的食塩水等を好ましく用いることができる。培養液３０の温度も細胞の温度に応じて設定すればよいが、通常は３７℃程度で細胞が最も活性化するため３７℃±２℃程度に保温することが好ましい。
また、本発明では、スフェロイド３２を連続的に生産するため、細胞培養を長時間行うことになる。培養液３０の鮮度を保つため、培養液３０を循環させて浄化を図ってもよい。
【００７７】
基材１２が培養液中で一定の速度で連続的に移動する間、培養時間の経過に伴って増殖し、次第に重なり合い、三次元的に集合して、立体的な組織体（スフェロイド）が形成される。培養液３０中でスフェロイド化した細胞３２は、基材１２とともに培養液槽２８から出た後、吸引等の回収手段３４により回収される。ここで、スフェロイド３２は基材１２に密着している面積が小さいため、スフェロイド３２を基材１２から離脱させるためのトリプシンなどの薬剤を使用せずにブレードや吸引等の物理的手段によって離脱させ、回収することができる。従って、薬剤によるスフェロイド３２のダメージを効果的に防ぐことができる。吸引されたスフェロイド３２は、吸引パイプ４０，４２を経て専用の回収容器４４内に回収される。
なお、スフェロイド３２の回収は培養液３０中で行ってもよく、例えば、ブレードによって基材１２から離脱させた後、培養液３０に浮遊したところを吸引して回収してもよい。
以上のような方法によれば、スフェロイドを連造的に生産して回収することができるため、スフェロイドを安価に、かつ、大量に得ることができる。
【００７８】
−第２の実施形態−
図６は、本発明に係るスフェロイドの製造装置の他の形態を示している。この装置８０は基材を繰り返し使用するタイプであり、対向配置された２つの搬送ローラ８４，８６に、表面に凹凸を有し、無端のシート状基材８２が懸架されている。基材８２としては、金属製の支持体に支持された多孔質フィルム（多孔質無端ベルト）を好ましく用いることができる。また、スフェロイド３２を回収する側の搬送ローラ８６の上方には、基材８２を洗浄するための洗浄手段８８が設けられている。
【００７９】
このような構成の装置でスフェロイドを製造するには、一方の搬送ローラ８４から繰り出された基材８２の表面にインクジェットヘッド２０から細胞を含む液２６を断続的に供給する。基材８２上に供給された細胞は、基材８２の搬送に伴い、培養液３０中に浸漬された状態で他方の搬送ローラ８６の方向に移動する。基材８２が培養液３０中で搬送される間、基材８２に保持されている細胞が増殖し、培養液３０を出る前にスフェロイド化する。培養液３０を出たスフェロイド３２は、ブレード、吸引等の回収手段３４によって基材８２の表面から回収される。
【００８０】
基材８２からスフェロイド３２が回収された後、基材８２は搬送ローラ８６に巻かれるとともに洗浄手段８８により洗浄される。洗浄手段８８及び洗浄液は、基材８２の材質、培養液、細胞などに応じて適宜決めればよく、洗浄槽を別途設けてもよい。
洗浄後、基材８２は、細胞供給側の搬送ローラに戻され、再び細胞の供給、培養、回収、洗浄の工程を経る。このように連続したシート状基材８２として無端基材を用い、スフェロイド３２を回収した後のシート状基材８２を洗浄する工程を設けることで、基材８２を繰り返し用いてスフェロイドを連続生産することができるため、製造コストの低下、生産性の向上を一層図ることができる。
なお、本実施形態に係るスフェロイド製造装置８０も、雰囲気中の雑菌による汚染を防ぐため、クリーンルーム、クローズドシステムに収容して稼動させることが好ましい。
【実施例】
【００８１】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明は下記実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１
＜基材の作製＞
厚さ１７５μｍの２軸延伸ポリエステルフィルム（３０ｃｍ幅）の片面に、ポリ（ε―カプロラクトン）（ＰＣＬ、Ｗａｋｏ製 重量平均分子量 ７０，０００から１００，０００）と両親媒性ポリアクリルアミドポリマー（下記構造、重量平均分子量 ４９，０００）を重量比１０：１で０．５ｍｇ／ｍＬとなるように塩化メチレンに溶解した。この溶液をガラスシャーレ（Φ９０）上にキャストし、相対湿度８０％の雰囲気下で塩化メチレンを蒸発させた。これにより、ポリエステルフィルム上に、開孔径７〜１５μｍの孔がハニカム状に配置されたハニカム状多孔質フィルムが形成され、これをロール状に巻いて細胞培養用基材Ａを得た。
【００８２】
【化１３】
【００８３】
＜肝細胞の調製＞
次に初代ラット肝細胞の調製、および培養を以下のように行った。
まず、初代ラット肝細胞を調製するために０．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ（和光純薬工業社製）溶液１５０ｍＬを用意した。７週齢の雄ウィスター系ラット（体重２５０ｇ）の門脈（肝臓に入る血管）にカニューレを導入し、脱血液を３０ｍＬ／ｍｉｎで５分間流した後、３７℃に加温したコラゲナーゼ溶液を１５ｍＬ／ｍｉｎで１０分間流した。コラゲナーゼによって処理された肝臓を培養液に入れ、メスとピペットを使って肝細胞を分散させた。得られた肝細胞懸濁液を３回洗浄し、肝細胞以外の細胞を取り除いた（９５％以上の純度）。このようにして単離した肝細胞を以下の培養実験の種細胞として使用した。
【００８４】
＜培養液＞
肝細胞の培養には、ダルベッコ改変イーグル培地（ギブコ社製：ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）１３．５ｇ／Ｌに、６０ｍｇ／Ｌプロリン、５０ｍｇ／ｍＬ上皮細胞成長因子（フナコシ社製：ＥＧＦ）、１０ｍｇ／Ｌインシュリン（シグマ社製）、７．５ｍｇ／Ｌヒドロコルチゾン（和光純薬工業社製）、０．１μＭ硫酸銅・５水和物（和光純薬工業社製）、３μｇ／Ｌセレン酸（和光純薬工業社製）、５０ｐＭ硫酸亜鉛・７水和物（和光純薬工業社製）、５０μｇ／Ｌリノール酸（シグマ社製）、５８．８ｍｇ／Ｌペニシリン（明治製菓社製）、１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン（明治製菓社製）、１．０５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業社製）、１．１９ｇ／Ｌの２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（同人堂社製：ＨＥＰＥＳ、２−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を加えた無血清培地を用いた。
【００８５】
＜培養工程＞
ロール状に巻いた基材Ａを繰り出すとともに、上述のラット肝細胞を１．４×１０８個／ｍ２となるように基材上にフィードした。フィード後の培養は、５％炭酸ガス、９５％大気の雰囲気で行い、長さ１５ｍ、幅１５０ｃｍ、高さ３０ｃｍの培養液槽（液温３７℃）に基材を浸漬し、速度０．００５ｍ／分で培養液槽中を搬送させた。培養時間は５０時間とした。
培養後のスフェロイドは、ポンプによって吸引回収した。７２時間後に回収したスフェロイドは１４２，２９６個であった。
【００８６】
＜スフェロイドの評価＞
得られた肝細胞の培養状態を評価するために、培養の各期間において、位相差顕微鏡による細胞形態を観察した。また、スフェロイドが形成された条件においてはその粒径を測定し、スフェロイド粒径分布を評価した。ここで、スフェロイド粒径の測定は、画像解析ソフトＷｉｎＲＯＯＦ（三谷商事社製）を用い、１条件当たり１００個のスフェロイド粒径を測定し、粒径分布を求めた。培養初期に分散状態であった細胞が徐々に集合化し、細胞同士が結合、凝集化して三次元的な細胞集合体であるスフェロイドを形成することを確認した。
【００８７】
比較例１
ディッシュを用いて以下のようにバッチ式培養を行った。
市販のφ６０ｍｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ ＃３００２，日本ベクトン製）を３０個用意し、実施例１と同様の培養液及び肝細胞を用いて細胞培養を行った。培養雰囲気、培養温度などは実施例１と同様である。
３日間培養を行ったところ、１ディッシュ当たり２４個のスフェロイドが形成され、全てのディッシュを合わせて７２０個のスフェロイドが得られた。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明に係るスフェロイドの製造装置の一例を示す概略構成図である。
【図２】基材を構成する多孔質フィルムの一例を示すＳＥＭ画像である。
【図３】スフェロイドの回収手段の一例を示す概略図である。
【図４】基材を構成する多孔質フィルムの一例を示す概略図である。（Ａ）概略平面図 （Ｂ）ａ−ａ線概略断面図 （Ｃ）ｂ−ｂ線概略断面図
【図５】基材を製造する方法の一例を示す図である。（Ａ）支持体上に高分子膜が形成された状態 （Ｂ）高分子膜中の有機溶媒が揮発する状態 （Ｃ）高分子膜中の液滴から水分が揮発する状態
【図６】本発明に係るスフェロイドの製造装置の他の例を示す概略構成図である。
【図７】多孔質フィルムの孔を通じて細胞の栄養素と排泄物の出入りを概略的に示す図である。
【符号の説明】
【００８９】
１０ スフェロイド製造装置
１２ シート状基材
１４ 供給ローラ
１６ 回収ローラ
１８ａ，１８ｂ 補助ローラ
２０ インクジェットヘッド
２２ 細胞供給用容器
２４ パイプ
２６ 細胞を含む液
２８ 培養液槽
３０ 培養液
３２ スフェロイド
３４ 吸引口
４４ スフェロイド回収容器
８２ シート状基材（無端）
８８ 洗浄手段
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養方法及び細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、従来から行われてきた臓器移植や人工臓器を用いる治療法にとって代わる方法として、再生医療に大きな期待が寄せられている。再生医療の研究は、骨髄移植のような幹細胞の補充による細胞・組織の再生、創傷治癒、手術時の皮膚、臓器の損傷修復を目指した研究と、狭義の組織工学（Ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）という概念で捉えられる一連の研究という２つの方向性で発展してきた。狭義の組織工学とは、細胞が生体内で生着する際に必要な足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）と細胞の両方を用いて修復しようとする研究である。再生医学には「細胞」、「細胞の増殖・分化のための足場」、及び「細胞増殖因子」が必要である。再生医療においては、より長期間生存し、生体内における本来の機能をより高いレベルで発現する手段が重要である。
培養細胞については、三次元的に集合した組織体（スフェロイド）を形成した場合には、二次元的に形成した場合に比べて、より長期間生存し、生体内における本来の機能をより高いレベルで発現することが報告されている。このため、培養細胞から三次元組織体を形成する技術は、例えば、生体の挙動を再現するシミュレータ、薬品開発における動物実験の代替技術、細胞移植による再生医療技術等への応用が期待されている。
【０００３】
このような培養細胞の三次元体（スフェロイド）を形成する技術として、例えば、流動性の培地中で回転させながら培養する方法（特許文献１参照）、所定の粘度以上の細胞培養液を用いる方法（特許文献２参照）、ゾル状態の培養液にスフェロイド前駆体を浮遊させた後、培養液をゲル化して培養を行う方法（特許文献３参照）、細胞は透過せず培養液は透過し得る網目状構造物を設けた培養容器（特許文献４参照）などが提案されている。
【０００４】
また、細胞増殖に良好な足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）となり得る材料として、非水溶性ポリマーから形成され、ハニカム構造、即ち、基底フィルムの表面に基底フィルムに垂直な隔壁で区画された複数の小空間が互いにヘキサゴナルに位置するように形成された構造を有するハニカム多孔質体の使用が提案されている（例えば特許文献５参照）。
【特許文献１】特開２００４−５２００２３号公報
【特許文献２】特開平７−７９７７２号公報
【特許文献３】特開平８−１４０６７３号公報
【特許文献４】特開平８−７０８４７号公報
【特許文献５】特開２００１−１５７５７４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞培養において、上記のような種々の培養方法、培養液、培養容器等が提案されているが、今後、培養細胞を薬品開発における動物実験の代替技術や細胞移植による再生医療技術等に益々適用するには、培養細胞を安価に、かつ、大量に製造することが望まれる。
【０００６】
本発明は、培養細胞を安価に、かつ、大量に製造することができる細胞培養方法及び細胞培養装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するため、本発明によれば以下の細胞培養方法及び細胞培養装置が提供される。
【０００８】
＜１＞ 表面に凹凸を有する基材を搬送するとともに、該基材の表面に細胞を供給する工程と、前記細胞が供給された基材を培養液中に浸漬させた状態で前記細胞を培養する工程と、前記培養した細胞を前記基材の表面から回収する工程を含むことを特徴とする細胞培養方法。
＜２＞ 前記細胞が供給された基材を培養液中に浸漬させた状態で前記細胞をスフェロイド化することを特徴とする＜１＞の細胞培養方法。
＜３＞ 前記基材の搬送速度を０．００１〜１００ｍ／分とすることを特徴とする＜１＞又は＜２＞に記載の細胞培養方法。
＜４＞ 前記基材として連続したシート状基材をロールから繰り出して供給する工程と、前記培養した細胞を回収した後の前記シート状基材を巻き取る工程とをさらに有することを特徴とする＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の細胞培養方法。
＜５＞ 前記基材が連続した無端のシート状基材であり、前記培養した細胞を回収した後のシート状基材を洗浄する工程をさらに有することを特徴とする＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の細胞培養方法。
＜６＞ 前記基材の表面が、多孔質フィルムにより形成されていることを特徴とする＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の細胞培養方法。
＜７＞ 前記基材が、前記多孔質フィルムを支持する支持体を含むことを特徴とする＜６＞に記載の細胞培養方法。
＜８＞ 前記多孔質フィルムが、疎水性の高分子多孔質フィルムであることを特徴とする＜６＞又は＜７＞に記載の細胞培養方法。
＜９＞ 前記多孔質フィルムの支持体が金属製であることを特徴とする＜７＞又は＜８＞に記載の細胞培養方法。
＜１０＞ 前記多孔質フィルムが、三次元網目構造を有し、表面に孔がハニカム状に配置していることを特徴とする＜６＞〜＜９＞のいずれかに記載の細胞培養方法。
＜１１＞ 前記基材の表面に、細胞を保持しうる細胞接着性領域と、該細胞接着性領域の周りを囲む細胞非接着性領域とが配置されていることを特徴とする＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の細胞培養方法。
＜１２＞ 前記基材の表面に、前記細胞をインクジェットヘッドにより供給することを特徴とする＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の細胞培養方法。
【０００９】
＜１３＞ 表面に凹凸を有する基材を所定の方向に搬送する手段と、
前記搬送される基材の表面に細胞を供給する手段と、
前記細胞を培養する培養液を収容し、前記細胞が供給された基材を前記培養液に浸漬させる培養液槽と、
前記培養した細胞を前記基材の表面から回収する手段と、
を含むことを特徴とする細胞培養装置。
＜１４＞ 前記細胞が供給された基材を培養液中に浸漬させた状態で前記細胞をスフェロイド化することを特徴とする＜１３＞に記載の細胞培養装置。
＜１５＞ 前記基材を搬送する手段が、前記基材を０．００１〜１００ｍ／分の搬送速度で搬送する手段であることを特徴とする＜１３＞又は＜１４＞に記載の細胞培養装置。
＜１６＞ 前記基材として連続したシート状基材をロールから繰り出して供給する手段と、前記培養した細胞を回収した後の前記シート状基材を巻き取る手段とを有することを特徴とする＜１３＞〜＜１５＞のいずれかに記載の細胞培養装置。
＜１７＞ 前記基材が連続した無端のシート状基材であり、前記培養した細胞を回収した後のシート状基材を洗浄する手段をさらに有することを特徴とする＜１３＞〜＜１５＞のいずれかに記載の細胞培養装置。
＜１８＞ 前記基材の表面が、多孔質フィルムにより形成されていることを特徴とする＜１３＞〜＜１７＞のいずれかに記載の細胞培養装置。
＜１９＞ 前記基材が、前記多孔質フィルムを支持する支持体を含むことを特徴とする＜１８＞に記載の細胞培養装置。
＜２０＞ 前記多孔質フィルムが、疎水性の高分子多孔質フィルムであることを特徴とする＜１８＞又は＜１９＞に記載の細胞培養装置。
＜２１＞ 前記多孔質フィルムの支持体が金属製であることを特徴とする＜１９＞又は＜２０＞に記載の細胞培養装置。
＜２２＞ 前記多孔質フィルムが、三次元網目構造を有し、表面に孔がハニカム状に配置していることを特徴とする＜１８＞〜＜２１＞のいずれかに記載の細胞培養装置。
＜２３＞ 前記基材の表面に、細胞を保持しうる細胞接着性領域と、該細胞接着性領域の周りを囲む細胞非接着性領域とが配置されていることを特徴とする＜１３＞〜＜２２＞のいずれかに記載の細胞培養装置。
＜２４＞ 前記細胞を、インクジェットヘッドにより前記基材に供給することを特徴とする＜１３＞〜＜２３＞のいずれかに記載の細胞培養装置。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、培養細胞を安価に、かつ、大量に製造することができる細胞培養方法及び細胞培養装置が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下に、本発明に係る細胞培養方法及び細胞培養装置について、主にスフェロイドの製造方法及びスフェロイド製造装置を例に、図面を参照しつつ説明する。
本発明に係る細胞培養方法は、表面に凹凸を有する基材を搬送するとともに、該基材の表面に細胞を供給する工程と、前記細胞が供給された基材を培養液中に浸漬させた状態で前記細胞を培養する工程と、前記培養した細胞を前記基材の表面から回収する工程を含む。
【００１２】
−第１の実施形態−
本発明に係るスフェロイドの製造方法は、例えば図１に示すような構成の装置を用いて好適に行うことができる。
本実施形態のスフェロイド製造装置１０は、表面に凹凸を有する連続したシート状基材１２を所定の方向に連続的に搬送する手段（基材搬送手段）１４，１６，１８ａ，１８ｂと、前記連続的に搬送される基材１２の表面に細胞を断続的又は連続的に供給する手段（細胞供給手段）２０，２２，２４と、前記細胞をスフェロイド化する培養液３０を収容し、前記細胞が供給された基材１２を前記培養液３０に浸漬させる培養液槽（細胞培養手段）２８と、前記スフェロイド化した細胞３２を前記基材１２の表面から回収する手段（細胞回収手段）３４，４４とを含んでいる。
このような装置構成により、表面に凹凸を有する連続したシート状基材１２を連続的に搬送させるとともに、基材１２に細胞を断続的又は連続的に供給した後、一定期間培養液３０中に浸漬させながら搬送させて細胞を培養し、スフェロイド化した細胞３２を基材１２から回収することができる。
【００１３】
＜基材＞
基材１２は、表面に凹凸が形成されており、供給された細胞を保持し、搬送中、細胞が脱落しないように、培養する細胞の種類、サイズ等に応じて選択すればよい。例えば、多孔質有機樹脂製フィルム、メッシュフィルム、任意の方法による微細加工フィルムなどが挙げられる。微細加工フィルムの例としては、微小な孔がハニカム状に配置された、いわゆるハニカムフィルム、ナノインプリントにより表面にμｍ又はｎｍオーダーの凹凸を施した樹脂フィルム、光リソグラフィー技術を用いた、任意のサイズ・形・分布・パターンの孔（例えば１０μｍ径の均一六角柱状孔）をハニカムパターンに配置したフィルム、平均直径が１μｍ〜１０μｍのランダムなサイズの円筒孔がランダムに配置したフィルム、マイクロ打ち抜き加工や射出成形加工で同様に作製した多孔質フィルムなどが挙げられる。本発明の基材１２としてはハニカムフィルムが好ましい。
【００１４】
例えば、多孔質フィルムを用いる場合は、フィルムの厚さ方向に貫通し、または貫通しない孔を有するフィルムであって、かつ、細胞などの組織体を表面に保持できるものであれば、材質、構造、孔の形態および孔径、孔径分布、孔の位置の分布、開孔率（フィルム面積に対する表面開孔部総面積の割合）は特に限定されず、細胞の種類に応じて選択すればよい。より具体的な例として、下記のような方法により製造したものが挙げられる。
例えば、ワイヤー状、フィラメント状の素材を高密度で編成或いは織成してシート状の織編体とする方法、繊維集合体を繊維の絡み合いや融着、バインダーなどにより成形して不織布とする方法、樹脂材料などに発泡、或いは加圧発泡等により連通孔構造を形成して多孔質フィルム（多孔質シート）とする方法、有機溶媒と高分子化合物を含む液を支持体上にキャストするキャスト法により連通孔、貫通孔を形成したフィルムを形成する方法、パンチング等の方法で穿孔して多孔質フィルムを得る方法などが挙げられる。
【００１５】
多孔質フィルムにおける孔の形態および孔径については、例えば、細胞の平均径の８０％以下の円柱状や四角柱状の貫通孔、細胞の平均径よりも狭い孔径であって、表裏面を連通してなる孔を有する多孔構造などが挙げられる。
孔径分布や孔の位置の分布については例えば、精密メッシュフィルターのような単分散なもの、一般的な多孔質フィルムのような多分散なものが挙げられる。
開孔率については、精密メッシュフィルターのように８０％を超えるもの、一般的な多孔質フィルムのように５０％以下のものなど、いずれも目的に応じて使用することができる。
【００１６】
本発明に使用しうる多孔質フィルムにおける孔径としては、前記の如く細胞の平均径の８０％以下の孔径、細胞の平均径よりも狭い孔径であることが三次元組織体の形成には好ましいが、より具体的には、孔径は０．０１μｍ〜１００μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは０．１μｍ〜５０μｍ、さらに好ましくは１μｍ〜２０μｍの範囲である。なお、本発明における多孔質フィルムの孔径の大きさは、その形状に拘わらず特に断らない限り、最大径を表すものとし、例えば、円形であれば直径を、矩形であれば対角線の長さを意味するものとする。この多孔質フィルムにおける空孔の孔径は、市販の高倍率顕微鏡やＳＥＭ表面観察によって測定することができる。
【００１７】
また、培養する細胞の平均径とこの空孔径との関係を制御することで、例えば、フィルムの厚さ方向に貫通した孔を有する多孔質フィルムを使用する場合、フィルムの表面のみならず、播種側の裏面にも組織体を形成することが可能となる。即ち、多孔質フィルムとして孔径が細胞径よりも小さいものを使用すれば、細胞播種側の多孔質フィルムの表面および細胞播種反対側の多孔質フィルム表面（裏面）の両面にスフェロイドを形成することができる。一方、多孔質フィルムの孔径が細胞径よりも大きいものを用いて同様の培養を行った場合は、細胞播種した多孔質フィルム表面ではなく、その反対側の多孔質フィルム裏面上にスフェロイドが形成される。従って、多孔質フィルムの孔径を制御することで組織体の形成方向を制御することができる。
ただし、搬送中における基材１２の破損を防ぐため、表面の多孔質フィルムと、該多孔質フィルムを支持する支持体とを含む基材１２を用いることが好ましい。例えば、ポリエチレンテレフタレート等の樹脂フィルムを支持体とし、この樹脂フィルム上に多孔質フィルムを一体的に形成した基材１２を用いることができる。このような基材１２であれば、細胞は表面となる多孔質フィルム側のみで増殖してスフェロイドを形成することとなる。
【００１８】
また、表面に、細胞を保持しうる細胞接着性領域と、該細胞接着性領域の周りを囲む細胞非接着性領域とが配置されている基材を用いてもよい。例えば、多孔質フィルムの表面に上記細胞接着性領域と、細胞非接着性領域のパターニングを行えばよい。
【００１９】
この細胞非接着性物質としては、例えば、細胞接着性領域で培養する細胞の細胞膜に存する細胞表面分子に対して結合しない物質を用いることができる。具体的に、生体から取得された細胞非接着性物質としては、例えば、アルブミン等の高い親水性を示すたんぱく質等を好ましく用いることができる。また、合成された細胞非接着性物質としては、例えば、ポリエチレングリコール等の極めて高い親水性を示す高分子鎖を含む化合物や、ＭＰＣ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ（ポリヒドロキシエチルメタクリレート）、ＳＰＣ（セグメント化ポリウレタン）等を好ましく用いることができる。また、これら細胞非接着性物質の誘導体としては、例えば、当該細胞非接着性物質に任意の官能基や高分子鎖を、所定の化学反応等によって結合したものを好ましく用いることができる。上記の中で、特に好ましい細胞非接着性物質は、ポリエチレングリコールである。
【００２０】
細胞非接着性物質またはその誘導体は、例えば、当該細胞非接着性物質またはその誘導体を含む水溶液中において、当該細胞非接着性物質またはその誘導体が有する官能基と、表面に露出している官能基とを所定の化学反応等によって結合させることにより、当該細胞接着性領域の周辺領域表面に固定できる。
基材の具体的な製造方法等については後述する。
【００２１】
＜基材搬送手段＞
基材１２を搬送する手段は、２つの搬送ローラ（供給ローラ１４及び回収ローラ１６）と、補助ローラ１８ａ，１８ｂにより構成されている。供給ローラ１４には、表面に凹凸を有する連続したシート状基材１２がロール状に巻かれており、基材１２を連続的に繰り出して供給することができる。一方、回収ローラ１６には、スフェロイド化した細胞３２が基材１２から回収された後、使用後の基材１２が巻き取られる。供給ローラ１４による基材１２の供給速度と回収ローラ１６による基材１２の回収速度とが同じとなるように各搬送ローラ１４，１６の回転速度を制御することで、基材１２を供給ローラ１４から回収ローラ１６に向けて一定の速度で搬送することができる。なお、基材１２の強度等に問題がなければ、回収ローラ１６を駆動ローラとし、供給ローラ１４を従動ローラとすることにより基材１２を搬送するようにしてもよい。
また、補助ローラ１８ａ，１８ｂの位置や数は任意であり、供給ローラ１４から供給された基材１２を培養液３０中に導いて浸漬させ、培養液３０中でスフェロイド化した細胞３２を回収ローラ１６の手前で基材１２から回収できるように適宜設ければよい。
このように供給ローラ１４、回収ローラ１６、及び補助ローラ１８ａ，１８ｂを設けることで、ロール・ツー・ロールにより基材１２を供給ローラ１４から回収ローラ１６の方向に向けて所定の速度で搬送することができる。
【００２２】
＜細胞供給手段＞
供給ローラ１４から送り出された基材１２を介して補助ローラ１８ａにほぼ対向する位置にインクジェットヘッド２０が設けられている。インクジェットヘッド２０は、細胞が蓄えられた容器２２にパイプ２４を介して繋がれており、連続的に搬送される基材１２の表面に対して細胞を含む液２６を供給する。このようなインクジェットヘッド２０を備えることで、連続的に搬送される基材１２の表面に、細胞を含む液を一定の量で断続的に供給することができる。なお、細胞供給手段はインクジェットヘッド２０に限定されず、細胞に損傷を与えずに基材１２上に断続的に供給することができればディスペンサー等の他の供給手段を用いてもよい。
【００２３】
＜細胞培養手段＞
細胞が供給された基材１２は、培養液３０が収容された培養液槽２８に導かれ、基材１２及び基材１２の表面に保持された細胞は培養液３０に浸漬された状態で搬送される。培養液３０は細胞の種類に応じて選択すればよく、培養液３０の温度も細胞の種類に応じて設定すればよい。培養液槽２８には、培養液３０を一定の温度に保つためのヒータのほか、浄化を行うための循環システム等を設けてもよい。
基材１２に保持された細胞は、回収ローラ１６に到達する前にスフェロイド化させる必要がある。そのため、培養液槽２８の長さは、細胞の種類、基材１２の搬送速度等に応じて選択すればよい。例えば、培養する細胞、使用する基材、培養液を用い、細胞がスフェロイド化するまでの時間を測定し、培養液槽２８の長さと搬送速度を選択することができる。なお、基材１２の搬送速度は、細胞が基材から離脱しない速度とし、通常は、基材の搬送速度を０．００１〜１００ｍ／分とすることが好ましく、より好ましくは０．００２〜８０ｍ／分、さらに好ましくは０．００３〜６０ｍ／分である。
【００２４】
＜スフェロイド回収手段＞
培養液３０中でスフェロイド化した細胞３２は、基材１２に保持された状態で培養液槽２８から出た後、基材１２の表面から回収される。スフェロイド３２を回収する手段は特に限定されず、例えば、吸引、ブレードによるかき取り等を採用することができる。例えば、図３に示すようなＶ字状のブレード３６と吸引口３４を組み合わせた回収手段を採用することができる。基材１２に保持されているスフェロイド３２は、基材１２の移動に伴ってＶ字ブレード３６と接触して基材１２から離脱し、それぞれブレード３６に沿って両サイドの各吸引口３４に導かれて吸い込まれる。このような回収手段を用いればスフェロイド３２をより確実にかつ効率的に回収することができる。
なお、本実施形態に係るスフェロイド製造装置１０は、雰囲気中の雑菌による汚染を防ぐため、クリーンルーム、クローズドシステムに収容して稼動させることが好ましい。
【００２５】
＜多孔質フィルムの製造方法＞
基材１２を構成する多孔質フィルムのうち、最も好ましいのは、有機溶媒と高分子化合物を含む液を支持体上にキャストして膜を形成し、前記膜中に空隙が形成されたハニカム状或いは任意の形状の連通孔が形成されてなる多孔質フィルムである。
図４（Ａ）〜（Ｃ）は、多数の空孔がハニカム状に配置された構造（ハニカム構造）を有する多孔質フィルム（以下、ハニカムフィルムと略称する場合がある。）５０の一例を概略的に示している。本発明でいうハニカム構造とは、具体的には、図４（Ａ）に示すようにほぼ一定の形状とサイズを有する空孔５２が膜本体５４に連続的にかつ規則的に配列している構造を意味する。このような規則的な孔５２の配列は、単層の場合には二次元的であり、複層の場合は三次元的にも規則性を有するものでもよい。この規則性は、二次元的には１つの空孔の周囲を複数（例えば、６つ）の空孔が取り囲むように配置され、三次元的には結晶構造の面心立方や六方晶のような構造を取って、空孔が最密充填のように配置ことが多いが、製造条件によってはこれら以外の規則性を示すこともある。例えば、図２のＳＥＭ写真に見られるように、厚さ方向に貫通せず、隣接する空孔同士が連通するハニカムフィルムを得ることもできる。
【００２６】
ハニカム構造の多孔質フィルム５０の表面には、ほぼ所定の間隔Ｌで各孔５２の開口部が現れ、本発明では、その開口部の径Ｄを開口径と呼ぶこととする。ハニカム構造の規則性は、このような空孔５２の開口径の変動係数で比較的簡便に評価することができる。通常は、変動係数が小さいほど多孔質フィルムの力学強度を高くすることができ、本発明に係るハニカムフィルム５０における変動係数は２０％以下であることが好ましく、１０％以下であることがより好ましく、５％以下であることがさらに好ましい。
【００２７】
図４に示されるように孔５０が規則的に配列された多孔質フィルム（多孔質基材）５０を作製する方法としては、まず、支持体上に原料溶液をキャストして液膜（高分子膜）を形成する。次いで、結露乾燥工程により、雰囲気中の水分を結露させて高分子膜中に液滴を形成させる。その後、液滴を蒸発させることで、例えば図２のＳＥＭ写真に見られるような孔が規則的に配列された多孔質フィルムを得ることができる。
【００２８】
このようなキャスト法によれば、高分子溶液に含まれる樹脂、溶剤、添加剤などの原料や、成膜雰囲気における湿度、湿潤空気の供給条件などの諸条件を調整することにより、孔の形状や配列を制御することができ、例えばハニカム状或いは任意の形状の連通孔が形成されてなる多孔質フィルム５０を得ることができる。また、例えば、貫通孔としてのみならず、隣接する周囲の孔と連通して、所謂三次元網目構造の空隙５２を有する多孔質フィルム５０を複雑な工程を必要とせずに製造することができる。
【００２９】
ハニカム状多孔質フィルム（ハニカムフィルム）の具体的な製造方法としては、例えば、特願２００７−０３９９９２、特願２００７−０８１８３２に記載されている方法を好ましく適用することができる。
図５は、本発明に係るハニカム状多孔質フイルムの製造方法の一例を概略的に示すである。まず、液調製工程において高分子化合物と溶媒と両親溶性化合物などの添加剤とから高分子溶液（以下、液と称する）を調製する。
また、支持体形成工程において支持体６６を製造する。次いで、キャスト工程により液を支持体６６上にキャスト（塗布）して高分子膜６０を形成する。
支持体６６上に高分子膜６０を形成した後、結露工程（図５（Ａ）参照）を行い高分子膜６０中に水を主成分とする液滴６４を形成する。次いで、乾燥工程を行い、高分子膜６０中の有機溶媒６８を揮発させ（図５（Ｂ））、さらに高分子膜６０の液滴６４を水蒸気７０として蒸発させる（図５（Ｃ））。これにより図４に示したようなハニカム状多孔質フイルム５０が得られる。なお、ハニカム状多孔質フイルム５０に機能性物質を含有させるなどして機能性構造体（機能性フィルム）を得ることもできる。
【００３０】
多孔質フィルム及び支持体は、合成樹脂、ＥＰＤＭ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ Ｄｉｅｎｅ Ｍｏｎｏｍｅｒ）等の合成ゴム、天然ゴム等から成形される。合成樹脂としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート等）、ポリウレタン、ポリスルホン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリビニル、シリコーン等を好ましく用いることができる。
【００３１】
多孔質フィルムの形成に用いる材料は、目的に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、疎水性ポリマー及び両親媒性化合物から選択される少なくとも１種が好適である。
【００３２】
多孔質フィルムを構成する疎水性ポリマーは、公知のもののなかから、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビニル重合ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリヘキサフルオロプロペン、ポリビニルエーテル、ポリビニルカルバゾール、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルカルバゾール、ポリテトラフルオロエチレンなど）、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリ乳酸など）、ポリラクトン（例えばポリカプロラクトンなど）、ポリアミド又はポリイミド（例えば、ナイロンやポリアミド酸など）、ポリウレタン、ポリウレア、ポリカーボネート、ポリアロマティックス、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリシロキサン誘導体、などが挙げられる。これらは、溶解性、光学的物性、電気的物性、膜強度、弾性等の観点から、必要に応じてホモポリマーとしてもよいし、２種以上の構造単位を共重合させてなるコポリマーや２種以上のポリマーの混合物であるポリマーブレンドの形態をとってもよい。
【００３３】
多孔質フィルムの形成に用いられる両親媒性化合物には特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、両親媒性ポリマーが挙げられる。
両親媒性ポリマーは、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリアクリルアミドを主鎖骨格とし、疎水性側鎖としてドデシル基、親水性側鎖としてカルボキシル基を併せ持つ両親媒性ポリマー、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールブロックコポリマー、などが挙げられる。
前記疎水性側鎖は、アルキレン基、フェニレン基等の非極性直鎖状基であり、エステル基、アミド基等の連結基を除いて、末端まで極性基やイオン性解離基などの親水性基を分岐しない構造であることが好ましい。該疎水性側鎖としては、例えば、アルキレン基を用いる場合には５つ以上のメチレンユニットからなることが好ましい。
前記親水性側鎖は、アルキレン基等の連結部分を介して末端に極性基やイオン性解離基、又はオキシエチレン基などの親水性部分を有する構造であることが好ましい。
【００３４】
両親媒性化合物としては、両親媒性ポリマー以外のものも挙げられる。両親媒性ポリマー以外の両親媒性化合物としては、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、界面活性剤などが好ましい。
両親媒性化合物として用いられる界面活性剤としては、例えば、下記一般式（Ｉ）で表される化合物などが挙げられる。
【００３５】
【化１】
【００３６】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ１は脂肪族基、脂環式化合物基、芳香族基、又は、ヘテロ環を表し、Ｒ２は脂肪族基、脂環式化合物基、芳香族基、ヘテロ環、又は、−Ｌ−Ｚを表す。Ｑ１、Ｑ２、及びＱ３はそれぞれ単結合、酸素原子、硫黄原子、又は、−Ｎ（Ｒ３）−を表し、Ｒ３は水素原子、脂肪族基、脂環式化合物基、芳香族基、ヘテロ環、又は、−Ｌ−Ｚを表す。ここで、Ｌは２価の連結基を表し、Ｚはイオン性の基を表す。なお、単結合とは、元素が存在しないことを表し、例えば、Ｑ１が単結合を表すとは、ＰとＲ１とが直接連結されていることを意味する。
【００３７】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ１で表される脂肪族基としては、例えば、直鎖又は分枝の炭素数１〜４０の無置換アルキル基、直鎖又は分枝の炭素数１〜４０の置換アルキル基、直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の無置換アルケニル基、直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の置換アルケニル基、直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の無置換アルキニル基、直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の置換アルキニル基等が好ましい。
直鎖又は分枝の炭素数１〜４０の無置換アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−アミル基、ｔｅｒｔ−アミル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｔｅｒｔ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、１，１，３−トリメチルヘキシル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、セチル基、ヘキサデシル基、２−ヘキシルデシル基、オクタデシル基、エイコシル基、２−オクチルドデシル基、ドコシル基、テトラコシル基、２−デシルテトラデシル基、トリコシル基等が挙げられる。
直鎖又は分枝の炭素数１〜４０の置換アルキル基における置換基としては、例えば、アルコキシル基、アリール基、ハロゲン原子、カルボンエステル基、カルボンアミド基、カルバモイル基、オキシカルボニル基、燐酸エステル基等が挙げられる。具体的には、例えば、ベンジル基、β−フェネチル基、２−メトキシエチル基、４−フェニルブチル基、４−アセトキシエチル基、６−フェノキシヘキシル基、１２−フェニルドデシル基、１８−フェニルオクタデシル基、ヘプタデシルフルオロオクチル基、１２−（ｐ−クロロフェニル）ドデシル基、２−（燐酸ジフェニル）エチル基等が挙げられる。
【００３８】
前記直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の無置換アルケニル基としては、例えば、ビニル基、アリル基、３−ブテニル基、２−メチル−２−ブテニル基、４−ペンテニル基、３−ペンテニル基、３−メチル−３−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、４−ヘキセニル基、３−ヘキセニル基、２−ヘキセニル基、７−オクテニル基、９−デセニル基、オレイル基、リノレイル基、リノレニル基等が挙げられる。
前記直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の置換アルケニル基としては、例えば、２−フェニルビニル基、４−アセチル−２−ブテニル基、１３−メトキシ−９−オクタデセニル基、９，１０−ジブロモ−１２−オクタデセニル基等が挙げられる。
前記直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の無置換アルキニル基としては、例えば、アセチレン基、プロパルギル基、３−ブチニル基、４−ペンチニル基、５−ヘキシニル基、４−ヘキシニル基、３−ヘキシニル基、２−ヘキシニル基等が挙げられる。
前記直鎖又は分枝の炭素数２〜４０の置換アルキニル基における置換基としては、例えば、アルコキシル基、アリール基等が挙げられる。具体的には、例えば、２−フェニルアセチレン基、３−フェニルプロパルギル基等が挙げられる。
【００３９】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ１で表される脂環式化合物基としては、例えば、置換又は無置換の炭素数３〜４０のシクロアルキル基、置換又は無置換の炭素数４〜４０のシクロアルケニル基等が好ましい。
前記芳香族基としては、例えば、置換又は無置換の炭素数６〜５０のアリール基等が好ましい。
前記脂環式化合物基における、置換又は無置換の炭素数３〜４０のシクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル基、シクロヘキシル基、２，６−ジメチルシクロヘキシル基、４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシル基、４−フェニルシクロヘキシル基、３−メトキシシクロヘキシル基、シクロヘプチル基等が挙げられる。
前記脂環式化合物基における、置換又は無置換の炭素数４〜４０のシクロアルケニル基としては、例えば、１−シクロヘキセニル基、２−シクロヘキセニル基、３−シクロヘキセニル基、２，６−ジメチル−３−シクロヘキセニル基、４−ｔｅｒｔ−ブチル−２−シクロヘキセニル基、２−シクロヘプテニル基、３−メチル−３−シクロヘプテニル基等が挙げられる。
【００４０】
前記芳香族基における、置換又は無置換の炭素数６〜５０のアリール基の置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシル基、アリール基、ハロゲン原子等が挙げられる。具体的には、例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、アントラニル基、ｏ−クレジル基、ｍ−クレジル基、ｐ−クレジル基、ｐ−エチルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、ｐ−ｎ−アミルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−アミルフェニル基、２，６−ジメチル−４−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、ｐ−シクロヘキシルフェニル基、オクチルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフェニル基、ノニルフェニル基、ｐ−ｎ−ドデシルフェニル基、ｍ−メトキシフェニル基、ｐ−ブトキシフェニル基、ｍ−オクチルオキシフェニル基、ビフェニル基、ｍ−クロロフェニル基、ペンタクロロフェニル基、２−（５−メチルナフチル基）等が挙げられる。
【００４１】
前記一般式（Ｉ）中、ヘテロ環としては、例えば、置換又は無置換の炭素数４〜４０の環状エーテル、置換又は無置換の炭素数４〜４０の含窒素環等が好ましい。
前記置換又は無置換の炭素数４〜４０の環状エーテルとしては、例えば、フリル基、４−ブチル−３−フリル基、ピラニル基、５−オクチル−２Ｈ−ピラン−３−イル基、イソベンゾフラニル基、クロメニル基等が挙げられる。
前記置換又は無置換の炭素数４〜４０の含窒素環としては、例えば、２Ｈ−ピロリル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、インドリジニル基、モルホリル基等が挙げられる。
【００４２】
これらの中でも、炭素数１〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の無置換アルキル基、置換基の炭素数を除いた炭素数が１〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の置換アルキル基、炭素数２〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の無置換アルケニル基、炭素数２〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の置換アルケニル基、炭素数６〜３０の置換又は無置換のアリール基が特に好ましい。
前記炭素数１〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の無置換アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−アミル基、ｎ−ヘキシル基、シクロヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ノニル基、１，１，３−トリメチルヘキシル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、セチル基、ヘキサデシル基、２−ヘキシルデシル基、オクタデシル基、エイコシル基、２−オクチルドデシル基、ドコシル基、テトラコシル基、２−デシルテトラデシル基等が挙げられる。
【００４３】
前記置換基の炭素数を除いた炭素数が１〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の置換アルキル基としては、例えば、６−フェノキシヘキシル基、１２−フェニルドデシル基、１８−フェニルオクタデシル基、ヘプタデシルフルオロオクチル基、１２−（ｐ−クロロフェニル）ドデシル基、４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキシル基等が挙げられる。
前記炭素数２〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の無置換アルケニル基としては、例えば、ビニル基、アリル基、２−メチル−２−ブテニル基、４−ペンテニル基、５−ヘキセニル基、３−ヘキセニル基、３−シクロヘキセニル基、７−オクテニル基、９−デセニル基、オレイル基、リノレイル基、リノレニル基等が挙げられる。
前記炭素数２〜２４の、直鎖、環状、又は分枝の置換アルケニル基としては、例えば、２−フェニルビニル基、９，１０−ジブロモ−１２−オクタデセニル基等が挙げられる。
前記炭素数６〜３０の置換又は無置換のアリール基としては、例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、ｐ−クレジル基、ｐ−エチルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−アミルフェニル基、オクチルフェニル基、ｐ−ｔｅｒｔ−オクチルフェニル基、ノニルフェニル基、ｐ−ｎ−ドデシルフェニル基、ｍ−オクチルオキシフェニル基、ビフェニル基、等が挙げられる。
【００４４】
前記一般式（Ｉ）中、Ｑ１、Ｑ２、及びＱ３としては、単結合、酸素原子、又は−Ｎ（Ｒ３）−が好ましく、Ｑ１、Ｑ２、及びＱ３の内の少なくとも２つ以上が酸素原子であることが特に好ましい。
【００４５】
前記一般式（Ｉ）中、Ｌとしては、下記一般式（ＩＩ）で表される基が好ましい。
【００４６】
【化２】
【００４７】
ただし、前記一般式（ＩＩ）中、Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３は、それぞれ同じであっても異なっていてもよく、炭素数１〜４０の置換又は無置換のアルキレン基、或いは、炭素数６〜４０の置換又は無置換のアリーレン基のいずれかを表す。Ｊ１、Ｊ２、及びＪ３は、それぞれ同じであっても異なっていてもく、２価の結合ユニットを表す。ｐ、ｑ、及びｒは、それぞれ独立に、０〜５の整数を表す。ｓは、１〜１０の整数を表す。ａ及びｂは、それぞれ独立に、０〜５０の整数を表す。
【００４８】
前記Ｙ１、Ｙ２、及びＹ３における置換基としては、例えば、前記一般式（Ｉ）におけるＲ１で例示した基が挙げられる。具体的には、例えば、アルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、１，４−シクロヘキシレン基、オクタメチレン基、デカメチレン基、２−メトキシ−１，３−プロピレン基等が好ましく、アリーレン基としては、ｏ−フェニレン基、ｍ−フェニレン基、ｐ−フェニレン基、３−クロロ−１，４−フェニレン基、１，４−ナフチレン基、１，５−ナフチレン基等が好ましい。これらの中でも、エチレン基、プロピレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基、１，４−シクロヘキシレン基、オクタメチレン基、デカメチレン基、ｍ−フェニレン基、ｐ−フェニレン基が特に好ましい。
【００４９】
前記Ｊ１、Ｊ２、及びＪ３における２価の結合ユニットとしては、例えば、単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）ＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ４）ＣＯ−、−Ｎ（Ｒ４）ＣＯＮ（Ｒ５）−、−ＯＣＯＮ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）ＣＯＯ−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）ＳＯ２−、−Ｎ（ＣＯＲ４）−、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ１）Ｏ−等が好ましい。なお、これらにおいて、Ｒ１は前記一般式（Ｉ）におけるのと同じ意を表し、Ｒ４は水素原子、炭素数１〜６の無置換アルキル基、及び置換基の炭素数を除いた炭素数が１〜６の置換アルキル基のいずれかを表し、Ｒ５はＲ４と同じ意を表すがそれぞれ同じであっても異なっていてもよい。
前記Ｒ４及びＲ５における置換基としては、アリール基、アルコキシル基、ハロゲン原子等が挙げられる。
これらの中では、単結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ３）−（Ｒ３は水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基を表す。）、−Ｎ（Ｒ４）ＣＯ−、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）ＳＯ２−等が特に好ましい。
【００５０】
前記ｐ、ｑ、及びｒとしては、それぞれ独立に、０〜３の整数が好ましく、０又は１の整数が特に好ましい。
前記ｓとしては、１〜５の整数が好ましく、１〜３の整数が特に好ましい。前記ａ及びｂとしては、それぞれ独立に、０〜２０の整数が好ましく、０〜１０の整数が特に好ましい。
【００５１】
前記一般式（Ｉ）中、Ｚとしては、親水性のアニオン性又はカチオン性のイオン性基が好ましく、アニオン性基が特に好ましい。
前記アニオン性基としては、−ＣＯＯＭ、−ＳＯ３Ｍ、−ＯＳＯ３Ｍ、−ＰＯ（ＯＭ）２−ＯＰＯ（ＯＭ）２が特に好ましい。なお、前記Ｍは、対カチオンを表し、アルカリ金属イオン（例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン等）、アルカリ土類金属イオン（例えば、マグネシウムイオン、カルシウムイオン等）、及びアンモニウムイオンのいずれかが好ましい。これらの中でも、ナトリウムイオン、カリウムイオンが特に好ましい。
前記カチオン性基としては、例えば、−ＮＨ３＋・Ｘ−、−ＮＨ２（Ｒ６）＋・Ｘ−、−ＮＨ（Ｒ６）２＋・Ｘ−、−Ｎ（Ｒ６）３＋・Ｘ−が挙げられる。
前記Ｒ６は、炭素数１〜３のアルキル基（例えば、メチル基、エチル基、２−ヒドロキシエチル基、ｎ−プロピル基、ｉｓｏ−プロピル基等）を表し、メチル基、２−ヒドロキシエチル基が好ましい。
前記Ｘ−としては、対アニオンを表し、例えば、ハロゲンイオン（例えば、フッ素イオン、塩素イオン、臭素イオン等）、複合無機アニオン（例えば、水酸化物イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、燐酸イオン等）、及び有機化合物アニオン（例えば、シュウ酸イオン、蟻酸イオン、酢酸イオン、プロピオン酸イオン、メタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン等）が好ましく、塩素イオン、硫酸イオン、硝酸イオン、酢酸イオンが特に好ましい。
【００５２】
前記一般式（Ｉ）中、Ｒ２としては、例えば、上記Ｒ１で例示した基、上記−Ｌ−Ｚで例示した基の中から選ばれる一価の基が挙げられる。Ｒ１で例示した基から選択される場合は、同一分子内に存在するＲ１と同一構造であっても異なった構造であってもよい。また、−Ｌ−Ｚで例示した基から選択される場合も、同一分子内に存在する−Ｌ−Ｚと同一構造であっても異なった構造であってもよい。これらの中でも、Ｒ１で例示した基から選択される場合が特に好ましい。更に、Ｒ１とＲ２との炭素数の合計が６以上８０以下になることが好ましく、８以上５０以下になる場合が特に好ましい。
【００５３】
前記界面活性剤の具体例〔例示化合物（ＰＷ−１）〜（ＰＷ−５２）〕を以下に例示するが、これら具体例に限定されるものではない。
【００５４】
【化３】
【００５５】
【化４】
【００５６】
【化５】
【００５７】
【化６】
【００５８】
【化７】
【００５９】
【化８】
【００６０】
【化９】
【００６１】
【化１０】
【００６２】
【化１１】
【００６３】
【化１２】
【００６４】
前記疎水性側鎖と前記親水性側鎖との比率は、分子の大きさや非極性、極性の強さ、疎水性有機溶媒の疎水性の強さなどに応じて異なり一概には規定できないが、ユニット比（疎水性側鎖／親水性側鎖）は９．９／０．１〜５．５／４．５が好ましい。また、コポリマーの場合、疎水性側鎖の親水性側鎖の交互重合体よりも、疎水性溶媒への溶解性に影響しない範囲で疎水性側鎖と親水性側鎖がブロックを形成するブロックコポリマーであることが好ましい。
【００６５】
多孔質フィルムの原料となる疎水性ポリマー及び両親媒性ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）は、１０，０００〜１０，０００，０００が好ましく、５０，０００〜１，０００，０００がより好ましい。なお、この重量平均分子量は、ＧＰＣ法により測定した値を採用している。
また、両親媒性化合物が界面活性剤の如き低分子量の化合物である場合の分子量としては、３００〜６００の範囲であることが好ましい。
【００６６】
本発明の特定多孔質フィルムを形成するに際しては、疎水性ポリマーのみを原料とすることもできるが、疎水性ポリマーと両親媒性化合物とを、共に用いることが好ましい。
疎水性ポリマーと両親媒性化合物との組成比率（質量比率）は、前記両親媒性化合物が両親媒性ポリマーである場合は、９９．９：０．１〜５０：５０が好ましく、９５：５〜７５：２５がより好ましい。前記両親媒性化合物の比率が上記範囲において、均一な連通多孔質構造体が得られ、且つ、膜の安定性、特に力学的な安定性を十分に得ることができる。
また、前記両親媒性化合物が両親媒性ポリマーでない場合は、前記疎水性ポリマーと前記両親媒性化合物との組成比率（質量比率）は、９９．９：０．１〜８０：２０が好ましい。前記両親媒性化合物が両親媒性の低分子量化合物である場合、この組成比率において、均一な連通多孔質構造体が得られ、フィルム強度を適切に維持することができる。
なお、両親媒性化合物として、両親媒性ポリマーと両親媒性の低分子化合物を任意の比率で混合して用いてもよい。
【００６７】
多孔質フィルムの原料として用いる疎水性ポリマー及び両親媒性ポリマーは、分子内に重合性基を有する重合性（架橋性）ポリマーであることも好ましい態様である。また、疎水性ポリマー及び／又は両親媒性ポリマーとともに、重合性の多官能モノマーを配合し、この配合物により連通孔を有する多孔質構造体を形成した後、熱硬化法、紫外線硬化法、電子線硬化法等の公知の方法によって硬化処理を施すことも、多孔質フィルム強度向上の観点から好ましい。
【００６８】
疎水性ポリマー及び／又は両親媒性ポリマーと併用しうる多官能モノマーとしては、反応性の点から多官能（メタ）アクリレートが好ましい。前記多官能（メタ）アクリレートの例としては、ジペンタエリスリトールペンタアクリレ−ト、ジペンタエリスリトールヘキサアクリレート、ジペンタエリスリトールカプロラクトン付加物へキサアクリレート又はこれらの変性物、エポキシアクリレートオリゴマー、ポリエステルアクリレートオリゴマー、ウレタンアクリレートオリゴマ−、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、トリプロピレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、ペンタエリスリトールトリアクリレート、ペンタエリスリトールテトラアクリレート、又はこれらの変性物などが使用できる。
これらの多官能モノマーは耐擦傷性と柔軟性のバランスから、単独で又は２種以上を組み合わせて用いられる。
疎水性ポリマー及び両親媒性ポリマーは、分子内に重合性基を有する重合性（架橋性）ポリマーである場合には、疎水性ポリマー及び両親媒性ポリマーの重合性基と反応しうる重合性の多官能モノマーを併用することも好ましい。
【００６９】
［有機溶媒］
前記高分子化合物を溶解させて液を調製する有機溶媒としては、クロロホルム、 ジクロロメタン、四塩化炭素、シクロヘキサン、酢酸メチルなどが挙げられる。但し、前記高分子化合物を溶解させることができれば特に限定されるものではない。また、キャストするときのポリマー濃度は、高分子膜６０を形成できる濃度であれば良く、具体的には、０．１重量％以上３０重量％以下の範囲であることが好ましい。０．１重量％未満であると、ハニカム状多孔質フイルム５０の生産性に劣り工業的大量生産に適さないおそれがある。また、３０重量％を超える濃度であると、結露工程（図５（Ａ））において液滴の成長が十分に行われないうちに、乾燥工程（図５（Ｂ）（Ｃ））が行われてハニカム状多孔質フイルムとなるため、好ましい構造、例えばハニカム構造を形成することが困難となる場合がある。
【００７０】
［微粒子］
本発明において、微粒子を液中に含有させることで高分子膜６０の高分子化合物の凝縮を容易とすることができる。微粒子は特に限定されず、また、微粒子のサイズ（平均粒子径）も特に限定されるものではない。
【００７１】
［その他の添加剤］
ハニカム状多孔質フイルム５０に機能性を付与するため、液中に機能性を発現する添加剤を予め含有させておくこともできる。添加剤についてもその種類、添加量などは所望の物、範囲であれば特に限定されるものではない。
【００７２】
キャスト法により製造された多孔質フィルムが、平面方向（面内方向）に連通する空孔を有することは、培養細胞の酸素や培養液の供給、老廃物等の排出などの物質交換にとって有利な構造であるといえる。すなわち、図７に示すように、多孔質フィルム５０の連通孔５２を通じて細胞３２ａに栄養素（グルコース、ビタミン、必須アミノ酸など）を供給し易く、また、細胞３２ａからの排泄物（乳酸など）を排出し易い。
【００７３】
また、支持体と多孔質フィルムを同種の材料で形成するか、互いに接着する材料で形成することで、多数の孔がハニカム状に配置された多孔質フィルムと、該多孔質フィルムを支持する支持体とが一体化したフィルムを得ることができる。このように多孔質フィルムと支持体とが一体化していれば、多孔質フィルムだけの場合に比べて強度が高くなり、基材として好適である。
【００７４】
＜スフェロイドの製造方法＞
次に、スフェロイドの製造方法について具体的に説明する。
供給ローラ１４及び回収ローラ１６の回転により、供給ローラ１４にロール状に巻かれているシート状基材１２が連続的に所定の速度で繰り出され、インクジェットヘッド２０の下に供給される。そして、供給ローラ１４から回収ローラ１６の方向に搬送される基材１２に対して、インクジェットヘッド２０から一定の間隔で断続的に細胞を含む液（単細胞溶液）２６が供給される。
【００７５】
基材に供給する細胞としては、所定の培養条件下で、増殖するものであれば、由来する動物種や臓器・組織の種類を問わず任意の細胞を用いることができる。具体的な例としては、ヒトまたはヒト以外の動物（例えば、サル、ブタ、イヌ、ラット、マウス等）由来の肝臓、膵臓、腎臓、神経、皮膚、脂肪等から採取される初代細胞、Ｏｃｔ−４・Ｓｏｘ２・Ｋｌｆ４・ｃ−Ｍｙｃの４因子を導入して初期化したマウスｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、人工多能性幹細胞）、Ｏｃｔ−４・Ｓｏｘ２・Ｋｌｆ４の３因子で初期化したマウスｉＰＳ細胞、ＯＣＴ−４・ＳＯＸ２・ＮＡＮＯＧ・ＬＩＮ２８の４遺伝子を胎児肺由来の線維芽細胞や新生児包皮由来の線維芽細胞へ導入し初期化したヒトｉＰＳ細胞、ＯＣＴ−４・ＳＯＸ２・ＮＡＮＯＧ・ＬＩＮ２８の４遺伝子を胎児肺由来の線維芽細胞や新生児包皮由来の線維芽細胞へ導入し初期化したヒトｉＰＳ細胞、未分化な幹細胞、胚由来のＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）、血管内皮細胞、樹立されている株化細胞、またはこれらに遺伝子操作等を施した細胞等であって、増殖可能な細胞を好ましく用いることができる。
なお、スフェロイド化させる細胞によっては、基材１２の表面にエタノールを噴射して濡れ性を向上させた後、細胞を供給してもよい。エタノールで基材１２の表面を濡らした後、細胞を供給すれば、細胞が基材表面に接触したときに細胞が損傷することを抑制することができる。
【００７６】
基材１２上に供給された細胞は、基材１２の表面の凹凸によって保持され、基材１２の搬送により培養液槽２８内の培養液３０中に浸漬される。培養液３０としては、当該細胞の生存状態や機能等を維持することができるよう、必要な塩類や栄養成分等を適切な濃度で含む水溶液であれば任意の組成のものを用いることができる。例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）等の基礎培地に、増殖因子や抗生物質等を添加した培養培地や、いわゆる生理的食塩水等を好ましく用いることができる。培養液３０の温度も細胞の温度に応じて設定すればよいが、通常は３７℃程度で細胞が最も活性化するため３７℃±２℃程度に保温することが好ましい。
また、本発明では、スフェロイド３２を連続的に生産するため、細胞培養を長時間行うことになる。培養液３０の鮮度を保つため、培養液３０を循環させて浄化を図ってもよい。
【００７７】
基材１２が培養液中で一定の速度で連続的に移動する間、培養時間の経過に伴って増殖し、次第に重なり合い、三次元的に集合して、立体的な組織体（スフェロイド）が形成される。培養液３０中でスフェロイド化した細胞３２は、基材１２とともに培養液槽２８から出た後、吸引等の回収手段３４により回収される。ここで、スフェロイド３２は基材１２に密着している面積が小さいため、スフェロイド３２を基材１２から離脱させるためのトリプシンなどの薬剤を使用せずにブレードや吸引等の物理的手段によって離脱させ、回収することができる。従って、薬剤によるスフェロイド３２のダメージを効果的に防ぐことができる。吸引されたスフェロイド３２は、吸引パイプ４０，４２を経て専用の回収容器４４内に回収される。
なお、スフェロイド３２の回収は培養液３０中で行ってもよく、例えば、ブレードによって基材１２から離脱させた後、培養液３０に浮遊したところを吸引して回収してもよい。
以上のような方法によれば、スフェロイドを連造的に生産して回収することができるため、スフェロイドを安価に、かつ、大量に得ることができる。
【００７８】
−第２の実施形態−
図６は、本発明に係るスフェロイドの製造装置の他の形態を示している。この装置８０は基材を繰り返し使用するタイプであり、対向配置された２つの搬送ローラ８４，８６に、表面に凹凸を有し、無端のシート状基材８２が懸架されている。基材８２としては、金属製の支持体に支持された多孔質フィルム（多孔質無端ベルト）を好ましく用いることができる。また、スフェロイド３２を回収する側の搬送ローラ８６の上方には、基材８２を洗浄するための洗浄手段８８が設けられている。
【００７９】
このような構成の装置でスフェロイドを製造するには、一方の搬送ローラ８４から繰り出された基材８２の表面にインクジェットヘッド２０から細胞を含む液２６を断続的に供給する。基材８２上に供給された細胞は、基材８２の搬送に伴い、培養液３０中に浸漬された状態で他方の搬送ローラ８６の方向に移動する。基材８２が培養液３０中で搬送される間、基材８２に保持されている細胞が増殖し、培養液３０を出る前にスフェロイド化する。培養液３０を出たスフェロイド３２は、ブレード、吸引等の回収手段３４によって基材８２の表面から回収される。
【００８０】
基材８２からスフェロイド３２が回収された後、基材８２は搬送ローラ８６に巻かれるとともに洗浄手段８８により洗浄される。洗浄手段８８及び洗浄液は、基材８２の材質、培養液、細胞などに応じて適宜決めればよく、洗浄槽を別途設けてもよい。
洗浄後、基材８２は、細胞供給側の搬送ローラに戻され、再び細胞の供給、培養、回収、洗浄の工程を経る。このように連続したシート状基材８２として無端基材を用い、スフェロイド３２を回収した後のシート状基材８２を洗浄する工程を設けることで、基材８２を繰り返し用いてスフェロイドを連続生産することができるため、製造コストの低下、生産性の向上を一層図ることができる。
なお、本実施形態に係るスフェロイド製造装置８０も、雰囲気中の雑菌による汚染を防ぐため、クリーンルーム、クローズドシステムに収容して稼動させることが好ましい。
【実施例】
【００８１】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明は下記実施例に何ら限定されるものではない。
実施例１
＜基材の作製＞
厚さ１７５μｍの２軸延伸ポリエステルフィルム（３０ｃｍ幅）の片面に、ポリ（ε―カプロラクトン）（ＰＣＬ、Ｗａｋｏ製 重量平均分子量 ７０，０００から１００，０００）と両親媒性ポリアクリルアミドポリマー（下記構造、重量平均分子量 ４９，０００）を重量比１０：１で０．５ｍｇ／ｍＬとなるように塩化メチレンに溶解した。この溶液をガラスシャーレ（Φ９０）上にキャストし、相対湿度８０％の雰囲気下で塩化メチレンを蒸発させた。これにより、ポリエステルフィルム上に、開孔径７〜１５μｍの孔がハニカム状に配置されたハニカム状多孔質フィルムが形成され、これをロール状に巻いて細胞培養用基材Ａを得た。
【００８２】
【化１３】
【００８３】
＜肝細胞の調製＞
次に初代ラット肝細胞の調製、および培養を以下のように行った。
まず、初代ラット肝細胞を調製するために０．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ（和光純薬工業社製）溶液１５０ｍＬを用意した。７週齢の雄ウィスター系ラット（体重２５０ｇ）の門脈（肝臓に入る血管）にカニューレを導入し、脱血液を３０ｍＬ／ｍｉｎで５分間流した後、３７℃に加温したコラゲナーゼ溶液を１５ｍＬ／ｍｉｎで１０分間流した。コラゲナーゼによって処理された肝臓を培養液に入れ、メスとピペットを使って肝細胞を分散させた。得られた肝細胞懸濁液を３回洗浄し、肝細胞以外の細胞を取り除いた（９５％以上の純度）。このようにして単離した肝細胞を以下の培養実験の種細胞として使用した。
【００８４】
＜培養液＞
肝細胞の培養には、ダルベッコ改変イーグル培地（ギブコ社製：ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）１３．５ｇ／Ｌに、６０ｍｇ／Ｌプロリン、５０ｍｇ／ｍＬ上皮細胞成長因子（フナコシ社製：ＥＧＦ）、１０ｍｇ／Ｌインシュリン（シグマ社製）、７．５ｍｇ／Ｌヒドロコルチゾン（和光純薬工業社製）、０．１μＭ硫酸銅・５水和物（和光純薬工業社製）、３μｇ／Ｌセレン酸（和光純薬工業社製）、５０ｐＭ硫酸亜鉛・７水和物（和光純薬工業社製）、５０μｇ／Ｌリノール酸（シグマ社製）、５８．８ｍｇ／Ｌペニシリン（明治製菓社製）、１００ｍｇ／Ｌストレプトマイシン（明治製菓社製）、１．０５ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム（和光純薬工業社製）、１．１９ｇ／Ｌの２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸（同人堂社製：ＨＥＰＥＳ、２−［４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ］ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を加えた無血清培地を用いた。
【００８５】
＜培養工程＞
ロール状に巻いた基材Ａを繰り出すとともに、上述のラット肝細胞を１．４×１０８個／ｍ２となるように基材上にフィードした。フィード後の培養は、５％炭酸ガス、９５％大気の雰囲気で行い、長さ１５ｍ、幅１５０ｃｍ、高さ３０ｃｍの培養液槽（液温３７℃）に基材を浸漬し、速度０．００５ｍ／分で培養液槽中を搬送させた。培養時間は５０時間とした。
培養後のスフェロイドは、ポンプによって吸引回収した。７２時間後に回収したスフェロイドは１４２，２９６個であった。
【００８６】
＜スフェロイドの評価＞
得られた肝細胞の培養状態を評価するために、培養の各期間において、位相差顕微鏡による細胞形態を観察した。また、スフェロイドが形成された条件においてはその粒径を測定し、スフェロイド粒径分布を評価した。ここで、スフェロイド粒径の測定は、画像解析ソフトＷｉｎＲＯＯＦ（三谷商事社製）を用い、１条件当たり１００個のスフェロイド粒径を測定し、粒径分布を求めた。培養初期に分散状態であった細胞が徐々に集合化し、細胞同士が結合、凝集化して三次元的な細胞集合体であるスフェロイドを形成することを確認した。
【００８７】
比較例１
ディッシュを用いて以下のようにバッチ式培養を行った。
市販のφ６０ｍｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ ＃３００２，日本ベクトン製）を３０個用意し、実施例１と同様の培養液及び肝細胞を用いて細胞培養を行った。培養雰囲気、培養温度などは実施例１と同様である。
３日間培養を行ったところ、１ディッシュ当たり２４個のスフェロイドが形成され、全てのディッシュを合わせて７２０個のスフェロイドが得られた。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】本発明に係るスフェロイドの製造装置の一例を示す概略構成図である。
【図２】基材を構成する多孔質フィルムの一例を示すＳＥＭ画像である。
【図３】スフェロイドの回収手段の一例を示す概略図である。
【図４】基材を構成する多孔質フィルムの一例を示す概略図である。（Ａ）概略平面図 （Ｂ）ａ−ａ線概略断面図 （Ｃ）ｂ−ｂ線概略断面図
【図５】基材を製造する方法の一例を示す図である。（Ａ）支持体上に高分子膜が形成された状態 （Ｂ）高分子膜中の有機溶媒が揮発する状態 （Ｃ）高分子膜中の液滴から水分が揮発する状態
【図６】本発明に係るスフェロイドの製造装置の他の例を示す概略構成図である。
【図７】多孔質フィルムの孔を通じて細胞の栄養素と排泄物の出入りを概略的に示す図である。
【符号の説明】
【００８９】
１０ スフェロイド製造装置
１２ シート状基材
１４ 供給ローラ
１６ 回収ローラ
１８ａ，１８ｂ 補助ローラ
２０ インクジェットヘッド
２２ 細胞供給用容器
２４ パイプ
２６ 細胞を含む液
２８ 培養液槽
３０ 培養液
３２ スフェロイド
３４ 吸引口
４４ スフェロイド回収容器
８２ シート状基材（無端）
８８ 洗浄手段
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面に凹凸を有する基材を搬送するとともに、該基材の表面に細胞を供給する工程と、前記細胞が供給された基材を培養液中に浸漬させた状態で前記細胞を培養する工程と、前記培養した細胞を前記基材の表面から回収する工程を含むことを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２】
前記細胞が供給された基材を培養液中に浸漬させた状態で前記細胞をスフェロイド化することを特徴とする請求項１の細胞培養方法。
【請求項３】
前記基材の搬送速度を０．００１〜１００ｍ／分とすることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
前記基材として連続したシート状基材をロールから繰り出して供給する工程と、前記培養した細胞を回収した後の前記シート状基材を巻き取る工程とをさらに有することを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項５】
前記基材が連続した無端のシート状基材であり、前記培養した細胞を回収した後のシート状基材を洗浄する工程をさらに有することを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項６】
前記基材の表面が、多孔質フィルムにより形成されていることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項７】
前記基材が、前記多孔質フィルムを支持する支持体を含むことを特徴とする請求項６に記載の細胞培養方法。
【請求項８】
前記多孔質フィルムが、疎水性の高分子多孔質フィルムであることを特徴とする請求項６又は請求項７に記載の細胞培養方法。
【請求項９】
前記多孔質フィルムの支持体が金属製であることを特徴とする請求項７又は請求項８に記載の細胞培養方法。
【請求項１０】
前記多孔質フィルムが、三次元網目構造を有し、表面に孔がハニカム状に配置していることを特徴とする請求項６〜請求項９のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項１１】
前記基材の表面に、細胞を保持しうる細胞接着性領域と、該細胞接着性領域の周りを囲む細胞非接着性領域とが配置されていることを特徴とする請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項１２】
前記基材の表面に、前記細胞をインクジェットヘッドにより供給することを特徴とする請求項１〜請求項１１のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項１３】
表面に凹凸を有する基材を所定の方向に搬送する手段と、
前記搬送される基材の表面に細胞を供給する手段と、
前記細胞を培養する培養液を収容し、前記細胞が供給された基材を前記培養液に浸漬させる培養液槽と、
前記培養した細胞を前記基材の表面から回収する手段と、
を含むことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１４】
前記細胞が供給された基材を培養液中に浸漬させた状態で前記細胞をスフェロイド化することを特徴とする請求項１３に記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
前記基材を搬送する手段が、前記基材を０．００１〜１００ｍ／分の搬送速度で搬送する手段であることを特徴とする請求項１３又は請求項１４に記載の細胞培養装置。
【請求項１６】
前記基材として連続したシート状基材をロールから繰り出して供給する手段と、前記培養した細胞を回収した後の前記シート状基材を巻き取る手段とを有することを特徴とする請求項１３〜請求項１５のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１７】
前記基材が連続した無端のシート状基材であり、前記培養した細胞を回収した後のシート状基材を洗浄する手段をさらに有することを特徴とする請求項１３〜請求項１５のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１８】
前記基材の表面が、多孔質フィルムにより形成されていることを特徴とする請求項１３〜請求項１７のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１９】
前記基材が、前記多孔質フィルムを支持する支持体を含むことを特徴とする請求項１８に記載の細胞培養装置。
【請求項２０】
前記多孔質フィルムが、疎水性の高分子多孔質フィルムであることを特徴とする請求項１８又は請求項１９に記載の細胞培養装置。
【請求項２１】
前記多孔質フィルムの支持体が金属製であることを特徴とする請求項１９又は請求項２０に記載の細胞培養装置。
【請求項２２】
前記多孔質フィルムが、三次元網目構造を有し、表面に孔がハニカム状に配置していることを特徴とする請求項１８〜請求項２１のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項２３】
前記基材の表面に、細胞を保持しうる細胞接着性領域と、該細胞接着性領域の周りを囲む細胞非接着性領域とが配置されていることを特徴とする請求項１３〜請求項２２のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項２４】
前記細胞を、インクジェットヘッドにより前記基材に供給することを特徴とする請求項１３〜請求項２３のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１】
表面に凹凸を有する基材を搬送するとともに、該基材の表面に細胞を供給する工程と、前記細胞が供給された基材を培養液中に浸漬させた状態で前記細胞を培養する工程と、前記培養した細胞を前記基材の表面から回収する工程を含むことを特徴とする細胞培養方法。
【請求項２】
前記細胞が供給された基材を培養液中に浸漬させた状態で前記細胞をスフェロイド化することを特徴とする請求項１の細胞培養方法。
【請求項３】
前記基材の搬送速度を０．００１〜１００ｍ／分とすることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
前記基材として連続したシート状基材をロールから繰り出して供給する工程と、前記培養した細胞を回収した後の前記シート状基材を巻き取る工程とをさらに有することを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項５】
前記基材が連続した無端のシート状基材であり、前記培養した細胞を回収した後のシート状基材を洗浄する工程をさらに有することを特徴とする請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項６】
前記基材の表面が、多孔質フィルムにより形成されていることを特徴とする請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項７】
前記基材が、前記多孔質フィルムを支持する支持体を含むことを特徴とする請求項６に記載の細胞培養方法。
【請求項８】
前記多孔質フィルムが、疎水性の高分子多孔質フィルムであることを特徴とする請求項６又は請求項７に記載の細胞培養方法。
【請求項９】
前記多孔質フィルムの支持体が金属製であることを特徴とする請求項７又は請求項８に記載の細胞培養方法。
【請求項１０】
前記多孔質フィルムが、三次元網目構造を有し、表面に孔がハニカム状に配置していることを特徴とする請求項６〜請求項９のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項１１】
前記基材の表面に、細胞を保持しうる細胞接着性領域と、該細胞接着性領域の周りを囲む細胞非接着性領域とが配置されていることを特徴とする請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項１２】
前記基材の表面に、前記細胞をインクジェットヘッドにより供給することを特徴とする請求項１〜請求項１１のいずれか一項に記載の細胞培養方法。
【請求項１３】
表面に凹凸を有する基材を所定の方向に搬送する手段と、
前記搬送される基材の表面に細胞を供給する手段と、
前記細胞を培養する培養液を収容し、前記細胞が供給された基材を前記培養液に浸漬させる培養液槽と、
前記培養した細胞を前記基材の表面から回収する手段と、
を含むことを特徴とする細胞培養装置。
【請求項１４】
前記細胞が供給された基材を培養液中に浸漬させた状態で前記細胞をスフェロイド化することを特徴とする請求項１３に記載の細胞培養装置。
【請求項１５】
前記基材を搬送する手段が、前記基材を０．００１〜１００ｍ／分の搬送速度で搬送する手段であることを特徴とする請求項１３又は請求項１４に記載の細胞培養装置。
【請求項１６】
前記基材として連続したシート状基材をロールから繰り出して供給する手段と、前記培養した細胞を回収した後の前記シート状基材を巻き取る手段とを有することを特徴とする請求項１３〜請求項１５のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１７】
前記基材が連続した無端のシート状基材であり、前記培養した細胞を回収した後のシート状基材を洗浄する手段をさらに有することを特徴とする請求項１３〜請求項１５のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１８】
前記基材の表面が、多孔質フィルムにより形成されていることを特徴とする請求項１３〜請求項１７のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項１９】
前記基材が、前記多孔質フィルムを支持する支持体を含むことを特徴とする請求項１８に記載の細胞培養装置。
【請求項２０】
前記多孔質フィルムが、疎水性の高分子多孔質フィルムであることを特徴とする請求項１８又は請求項１９に記載の細胞培養装置。
【請求項２１】
前記多孔質フィルムの支持体が金属製であることを特徴とする請求項１９又は請求項２０に記載の細胞培養装置。
【請求項２２】
前記多孔質フィルムが、三次元網目構造を有し、表面に孔がハニカム状に配置していることを特徴とする請求項１８〜請求項２１のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項２３】
前記基材の表面に、細胞を保持しうる細胞接着性領域と、該細胞接着性領域の周りを囲む細胞非接着性領域とが配置されていることを特徴とする請求項１３〜請求項２２のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【請求項２４】
前記細胞を、インクジェットヘッドにより前記基材に供給することを特徴とする請求項１３〜請求項２３のいずれか一項に記載の細胞培養装置。
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【公開番号】特開２００９−２１３４２１（Ｐ２００９−２１３４２１Ａ）
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−６１６０５（Ｐ２００８−６１６０５）
【出願日】平成２０年３月１１日（２００８．３．１１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１１日（２００８．３．１１）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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