細胞壊死活性を有する化合物
【課題】 細胞壊死活性、特に、腫瘍細胞に対する細胞壊死活性を必要とする医薬品の分
野において有用な化合物を提供することを目的とする。
【解決手段】
［１］魚類及び介類の肉、卵、及び体液からなる群から選ばれるいずれかを、疎水性の有
機溶媒で抽出することにより得られる、細胞壊死活性を有する化合物。
［２］前記細胞壊死活性は、肺癌患者由来の癌細胞を用いたハイブリドーマ、ヒト大腸癌
由来細胞、マウス大腸癌由来細胞及びヒト末梢血リンパ球に対するものであることを特徴
とする、上記［１］に記載の細胞壊死活性を有する化合物。
野において有用な化合物を提供することを目的とする。
【解決手段】
［１］魚類及び介類の肉、卵、及び体液からなる群から選ばれるいずれかを、疎水性の有
機溶媒で抽出することにより得られる、細胞壊死活性を有する化合物。
［２］前記細胞壊死活性は、肺癌患者由来の癌細胞を用いたハイブリドーマ、ヒト大腸癌
由来細胞、マウス大腸癌由来細胞及びヒト末梢血リンパ球に対するものであることを特徴
とする、上記［１］に記載の細胞壊死活性を有する化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞壊死活性を有する化合物に関し、より詳細には、魚類及び介類から得ら
れる、疎水性の細胞壊死活性を有する化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体においては、形態学的に分類される２種類の細胞死が知られている。一方は
プログラムされた細胞死といわれるアポトーシスであり、他方は細胞の壊死（ネクローシ
ス）である。こうした細胞の死は、ウイルス感染の場合を例に挙げれば、感染成立後に生
体防御機構が作動してＴ細胞とＢ細胞とが協同的に作用し、ウイルスに感染した細胞を非
自己と認識して死滅させるものである。
【０００３】
細胞の壊死は、ウイルス感染のみならず、近年、死亡原因の上位に位置する癌の場合に
も起こることが知られている。癌細胞が出現すると、腫瘍細胞の壊死作用を有するＴＮＦ
等の生体因子やＮＫ細胞等が作用し、生体の恒常性の維持が図られる（非特許文献１参照
）。
【０００４】
一方、動植物に含まれる種々の活性を有する化合物については、植物精油等の主要成分
等に関する報告も多く、研究も進んでいる（非特許文献２参照）。また、魚類や介類にお
いても、シガトキシン等を初めとする海産毒については研究が進み、いろいろな報告もな
されている（非特許文献３参照）が、腫瘍壊死活性を有する物質を含むかどうかについて
の報告は少ない。
【非特許文献１】BioScience用語ライブラリー 免疫 14〜15頁 1995年11月1日 第１刷発行
【非特許文献２】エッセンシャルオイルの化学 1990年１月30日 第１版発行 裳華房
【非特許文献３】http://www.jst.go.jp/pr/report/report193/
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生体の恒常性とのバランス上、細胞壊死活性を有する物質の生体内における産生量は限
られているため、腫瘍を有している生体そのものから、腫瘍細胞を選択的に壊死させるこ
とができる物質を大量に得ることは難しい。
【０００６】
しかし、こうした活性を有する化合物は、ウイルス感染や癌の治療においては有用性が
高いと考えられており、腫瘍壊死活性を有する化合物を、あるまとまった量で定常的に確
保することについては、強い要請がある。
【０００７】
本発明の発明者らは、上記のような事情の下で鋭意研究を進め、本発明を完成したもの
である。本発明は、魚類又は介類から得られる、細胞壊死活性を有する化合物を含む画分
を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、魚類及び介類の肉、卵、及び体液からなる群より選ばれる少なく
とも一つを、疎水性の有機溶媒で抽出して得られる細胞壊死活性を有する化合物である。
【０００９】
ここで、前記魚類の肉は、カツオ、マグロ、アジ、サバ及びイワシからなる群から選ば
れるものであることが好ましく、前記魚類の卵は、ニシン、タラ、トビウオ、ホキ及びシ
シャモからなる群から選ばれるものであることが好ましい。また、前記介類の体液は、イ
カスミ及びタコスミからなる群から選ばれるものであることが好ましい。
【００１０】
また、前記細胞壊死活性は、肺癌患者由来の癌細胞を用いたハイブリドーマ、ヒト大腸
癌由来細胞、マウス大腸癌由来細胞及びヒト末梢血リンパ球に対するものであることが好
ましい。
【００１１】
さらに、前記細胞壊死活性を有する化合物は、アルカリに親和性のあるものであること
が好ましく、１００℃、３０分の加熱処理によって失活するものであることが、さらに好
ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、魚類及び介類から疎水性の細胞壊死活性を有する化合物を得ることが
できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
まず、本発明の化合物の抽出に用いた、魚類及び介類について説明する。ここで使用し
た魚類としては、例えば、カツオ、マグロ、アジ、サバ及びイワシ等を挙げることができ
るが、これらに限定されるものではない。
中でもカツオ、マグロ、アジ、サバ及びイワシからなる群より選ばれる少なくとも一つを使用することが好ましく、カツオを使用することがさらに好ましい。
【００１４】
また、前記魚類の卵としては、ニシン、タラ、サケ、トビウオ、ホキ及びシシャモ等の
卵を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
中でもニシン、タラ、サケ、トビウオ、ホキ及びシシャモからなる群より選ばれる少な
くとも一つの卵を使用することが好ましく、ニシンの卵であるカズノコを使用することが
、一定の質の材料を容易に入手できることからさらに好ましい。
【００１５】
また、前記介類は、イカ及びタコ等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
中でもイカ及びタコからなる群から選ばれる少なくとも一つであることが好ましい。
【００１６】
また前記体液は、イカスミ、タコスミ等を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
中でもイカスミ及びタコスミからなる群から選ばれる少なくとも一つであることが好ましい。
特に、スルメイカのイカスミを使用すると、後述する細胞壊死活性の高い化合物を得ることができる。
【００１７】
上記の魚類の肉、卵および体液、並びに介類の肉、卵および体液から、後述する細胞壊死活性を有する化合物を抽出するにあたっては、疎水性の有機溶媒を使用することが好ましく、前記疎水性の有機溶媒としては、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素類、シクロペンタン、シクロヘキサン等の脂環式脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、メチルイソブチルケトン等のケトン類、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類等を挙げることができる。これらの中でも脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、ケトン類、及びエステル類が好ましく、ｎ−ヘキサン、トルエン、ベンゼン、及び酢酸エチルからなる群から選ばれるものを使用することが、溶媒自体の極性及び水との親和性という点から好ましく、とりわけ、ｎ−ヘキサンを使用すると抽出効率が高い。
【００１８】
上記疎水性の有機溶媒は一種もしくは二種以上を使用することができる。
【００１９】
上記疎水性の有機溶媒には、エチルアルコール、アセトン、ＤＭＳＯ等の水溶性の有機
溶媒の一種もしくは二種以上を併用することができる。
【００２０】
また、細胞壊死活性は、肺癌患者由来のリンパ球細胞とリンパ腫細胞であるＮＡＴ−３
０細胞とを融合して作製したハイブリドーマ、ヒト大腸癌由来細胞、マウス大腸癌由来細
胞及びヒト末梢血リンパ球に対するものであることが好ましい。ここで、肺癌患者由来の
リンパ球細胞とリンパ腫細胞であるＮＡＴ−３０細胞とを融合して作製したハイブリドー
マとしては、ＨＢ４Ｃ５、ＨＦ１０Ｂ４等を挙げることができる。ＨＢ４Ｃ５を使用する
ことが、培養及び細胞活性の測定が容易であるという理由から好ましい。
【００２１】
ヒト大腸癌由来細胞としては、Ｃｏｌｏ−２０１、ＬｏＶｏ、Ｃａｃｏ−２、ＬＳ１８
０等を挙げることができる。Ｃｏｌｏ−２０１、及びＣａｃｏ−２からなる群より選ばれ
る少なくとも一つの株化細胞を使用することが、培養が容易であることから好ましく、Ｃ
ｏｌｏ−２０１を使用することがさらに好ましい。
【００２２】
マウス大腸癌由来細胞としては、ｃｏｌｏｎ−２６、ＲＫＯ−Ｅ６、ＣＴ２６、ＣＬ２
５等を挙げることができる。ｃｏｌｏｎ−２６を使用することが、ｉｎ ｖｉｖｏ（動物
実験）において効果を検討することが容易であることから好ましい。
【００２３】
また、上記のような株化細胞以外に、ヒト末梢血リンパ球細胞に対して、細胞壊死活性
を有するものであってもよい。
【００２４】
前記細胞壊死活性を有する化合物は、アルカリに親和性のあるものであることが好まし
く、１００℃、３０分の加熱処理によって失活するものであることがさらに好ましい。
【００２５】
こうしたアルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を挙げるこ
とができる。また、１００℃、３０分の加熱処理による細胞壊死活性の失活率（％）は、
加熱処理をしない場合の約５０〜８０％である。
【００２６】
以下に、本発明の細胞壊死活性を有する化合物を得るための手順を説明する。
【００２７】
上述したカツオの魚肉、イカスミ、及びカズノコを、それぞれ、所定量ずつ秤量し、所
定の大きさの遠心可能なチューブに個別にとり、所定量のｎ−ヘキサン等の疎水性の有機
溶媒を各チューブに加える。
【００２８】
これらのチューブを、１〜８℃、好ましくは３〜５℃、さらに好ましくは約４℃の温度
範囲で、６，０００〜１８，０００×ｇ、好ましくは７，０００〜１５，０００×ｇ、さ
らに好ましくは８,０００〜１５，０００×ｇの遠心力の範囲で所定の時間遠心分離する
。
各チューブのヘキサン相を他の容器に別個に移し、ｎ−ヘキサン等の疎水性の有機溶媒
相Ａとする。次いで、それぞれのチューブ内の沈殿物に所定量のｎ−ヘキサン等の疎水性
の有機溶媒を加えて再度溶解させ、その後、同様に所定の時間遠心分離し、ｎ−ヘキサン
等の疎水性の有機溶媒相Ｂを得る。上記のｎ−ヘキサン等の疎水性の有機溶媒相Ａ及びＢ
を合わせて、ｎ−ヘキサン等の疎水性の有機溶媒相抽出画分（１）とする。
【００２９】
ｎ−ヘキサン等の疎水性の有機溶媒相抽出画分（１）から所定量を遠心可能なチューブ
にとり、ここに等量の水を加えて激しく混和し、１〜８℃、好ましくは３〜５℃、さらに
好ましくは約４℃の温度範囲で、６，０００〜１８，０００×ｇ、好ましくは７，０００
〜１５，０００×ｇ、さらに好ましくは８,０００〜１５，０００×ｇの遠心力の範囲で
所定の時間遠心分離し、水相を除く。
【００３０】
再度等量の水をここに加えて上記と同様に混和した後に遠心し、得られたｎ−ヘキサン
等の疎水性の有機溶媒相をヘキサン抽出画分（２）とする。
【００３１】
上記のようにして得たｎ−ヘキサン等の疎水性の有機溶媒画分（１）及び（２）を、粗
精製標品として以下の手順に従い細胞壊死活性を測定する。
【００３２】
継代培養した上記のハイブリドーマ、ヒト大腸癌由来株化細胞、マウス大腸癌由来株化
細胞を、それぞれ２〜３日間前培養する。
【００３３】
ついで、所定の倍率に希釈した上述した粗標品を、所定量であらかじめ用意した大きさ
のシャーレに分注し、所定量のあらかじめ調製しておいた４×ＩＴＥＳをこのシャーレに
所定量ずつ分注する。
【００３４】
次に、あらかじめ調製した２×ＥＤＲＦ培地を用いて、上述の各細胞を約２×１０５
ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、これを上記のシャーレそれぞれに、所定量ずつ分注する。
【００３５】
細胞の分注を終えた後に、これらのシャーレを５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃に
て約２日〜３日間培養し、各シャーレ中の細胞数（全数）と、生細胞数とを測定し、生存
率を求めて細胞壊死活性とする。
【００３６】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に
何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
カツオその他の魚類の試料からのｎ−ヘキサン等による各画分の抽出
（１−１）材料等
カツオは鰹節製造工場より入手した２尾を用い、これらから得られた抽出用試料を、そ
れぞれ、カツオ−Ｉ及びカツオ−IIとした。
【００３８】
イカスミは市販品を購入した。また、カズノコは、オランダ産の市販品（−１８℃以下
にて冷凍保存されたもの）を購入した。
【００３９】
ｎ−ヘキサン、エチルアルコールルは、和光純薬工業（株）より、いずれも特級品を購
入した。また、水は、超純水を蒸留して使用した。
【００４０】
マイクロチューブは、容量１，５００μＬ、２，０００μＬ、及び５０００μＬのものをアシスト（株）社より購入した。
【００４１】
（１−２）ヘキサン抽出画分（１）、（２）、水抽出画分及びエタノール抽出画分の調製
上述したカツオ−Ｉ、カツオ−II、イカスミ、及びカズノコを、それぞれ、カツオ−Ｉ
とカツオ−IIとは０．５５１ｇ、イカスミは０．５４１ｇ、及びカズノコを０．５４９ｇ
秤量し、１．５ｍＬのマイクロチューブに個別にとり、それぞれ１ｍＬのへキサンを加え
て溶解させた。
【００４２】
これらのチューブを、４℃、１２，０００ｒｐｍ（１３，０００×ｇ）にて５分間遠心
し、それぞれヘキサン相を他の容器にそれぞれ移し、ヘキサン相Ａとした。次いで、それ
ぞれの沈殿に１ｍＬのヘキサンを加えて再度溶解させた後、４℃、１２，０００ｒｐｍ（
１３，０００×ｇ）にて５分間遠心分離し、ヘキサン相Ｂを得た。上記のヘキサン相Ａ及
びＢ合わせて、ヘキサン抽出画分（１）とした（図１参照）。
【００４３】
ヘキサン抽出画分（１）から６００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに移し、ここに
６００μＬの水を加えて激しく混和し、４℃、１２，０００ｒｐｍ（１３，０００×ｇ）
にて１５分間遠心分離し、水相を除いた。再度６００μＬの水をここに加えて上記と同様
に混和、遠心を行い、得られたヘキサン相をヘキサン抽出画分（２）とした（図１参照）
。
【００４４】
６００μLのヘキサン抽出画分（２）を５ｍＬのマイクロチューブにとり、ここに、ｎ-
ヘキサンと水とをそれぞれ１ｍＬずつ加えて上記と同様に混和し、遠心分離した。得られ
た沈殿に対して、６００μＬの水を加えて同様に混和し、４℃、１２，０００ｒｐｍ（１
３，０００×ｇ）にて１５分間遠心分離した。この遠心分離操作によって得られた上清を水抽出画分とした。また、得られた沈殿は、６００μＬのエタノールに溶解し、エタノール抽出画分とした（図１参照）。
【００４５】
（実施例２）上記各画分の細胞壊死活性測定
（２−１）試料、試薬等
上記の実施例1で得られた、カツオ−I、カツオ−II、イカスミ及びカズノコからそれぞ
れ得られた、ヘキサン抽出画分（１）、同（２）、水抽出画分、エタノール抽出画分につ
いて、細胞壊死活性を検討した。
【００４６】
細胞壊死活性は、ＨＢ４Ｃ５、Ｃｏｌｏ−２０１、Ｃｏｌｏｎ−２６及びヒト末梢血リ
ンパ球細胞を後述する条件にて培養し、総細胞数に対する生細胞数（生存率）を指標とし
て評価した。
【００４７】
ＨＢ４Ｃ５細胞は、肺癌患者のリンパ球と、リンパ腫細胞であるＮＡＴ−３０とを融合
させて作製されたヒト−ヒトハイブリドーマであり、ＩｇＭ型のヒトモノクローナル抗体
（Ｃ５抗体）を分泌する。この細胞の培養には、ＥＤＲＦ培地を、極東製薬工業（株）よ
り購入して使用した。添加物であるインスリン、トランスフェリン、エタノール及びセレ
ナイトは、シグマ社より購入して使用した。
【００４８】
ヒトの大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ−２０１はＡＴＣＣ（American Type Culture Collection
）より購入し、マウスの大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ−２６は、東北大学加齢医学研究所より
分与を受けた。Ｃｏｌｏ−２０１の培養には、５％ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳというこ
とがある）を添加した上記ＥＤＲＦ培地を使用した。ＦＢＳは５６℃で３０分間、非動化
処理を行っている。
【００４９】
ヒト末梢血リンパ球細胞は、健常成人より約３０ｍＬを真空採血管を用いて採血し、後
述する処理を行って得た。この処理には、リン酸緩衝生理食塩水（以下、PBSということ
がある）及びＬＳＭ（Lymphocyte Separation Medium）を使用した。PBSは生理食塩水と
リン酸バッファーとを用いて調製し、ＬＳＭはオルガノンテクニカ社より購入した。
【００５０】
上述した実施例１で調製した各試料の希釈には、ＤＭＳＯ（特級）を和光純薬工業（株
）より、購入して使用した。
【００５１】
（２−２）ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５に対するヘキサン抽出画分（１）及び（２）の細胞
壊死活性の測定
継代培養したハイブリドーマＨＢ４Ｃ５を、５８ｃｍ２のシャーレ４枚に２×１０５ｃ
ｅｌｌｓ／ｍＬでまき、２日間培養して、８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。
【００５２】
上述した実施例１で調製した各試料を、５倍及び２５倍にＤＭＳＯを用いて希釈した。
ＤＭＳＯには細胞毒性があることから、細胞壊死活性測定においては、培地中における濃
度が０．５％以下となるようにした。すなわち、段階希釈した各試料３０μＬを滅菌水１
．４７ｍＬに溶解し、この溶解液５００μＬを、あらかじめ用意した２ｍＬのシャーレに
それぞれ分注した。
【００５３】
ついで、以下のようにして４×ＩＴＥＳを調製した。すなわち、２００μＬのインスリ
ン（２００μｇ）、２００μＬのトランスフェリン（８００μｇ）、２００μＬのエタノ
ールアミン（４．８４μｇ）、及び２００μＬのセレナイト（０．１９２μｇ）を合わせ
、ここに蒸留水９．２ｍＬを加えて１０ｍＬとし、４×ＩＴＥＳを調製した。こうして調
製した４×ＩＴＥＳを、５００μＬずつ、上記の２ｍＬの各シャーレに分注した。
【００５４】
次に、ＥＤＲＦ粉末１７．７ｇを、５００ｍＬの蒸留水に溶解して調製した２×ＥＤＲ
Ｆ培地１０ｍＬ以上を用いて、ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
に調製した。このハイブリドーマＨＢ４Ｃ５を含む２×ＥＤＲＦ培地を、上記の各シャー
レに１ｍＬずつ分注した。
【００５５】
これらのシャーレを５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃にて２日間培養し、各シャー
レ中の細胞数（全数）及び生細胞数とを測定し、生存率を求めた。生細胞数の測定には、
１％トリパンブルーを使用した。
【００５６】
カツオ−Ｉ、カツオ−II、イカスミ及びカズノコから実施例１の手順に従って得られた
、ヘキサン抽出画分（１）、同（２）について、細胞壊死活性を測定した。陽性対照には
、ヘキサンをＤＭＳＯで５倍希釈した試料を使用した（表１〜３中、番号１で示す）。ま
た、各画分の活性は、５倍希釈及び２５倍希釈の試料を用いて測定した（表１〜３中、２
及び４は５倍希釈を、また、３及び５は２５倍希釈の試料をそれぞれ活性測定に使用して
いる）。結果を表１〜３、図２に示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【表２】
【００５９】
【表３】
以上より、カツオ、イカスミ及びカズノコのヘキサン抽出画分（１）及び（２）には、
高い細胞壊死活性があることが示された。
【００６０】
（２−３）ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５に対するエタノール抽出画分及び水抽出画分の細胞壊死活性の測定
上記（２−２）と同様に調製したハイブリドーマＨＢ４Ｃ５に対して、ヘキサン抽出画
分（１）及び（２）と同量のエタノール抽出画分及び水抽出画分の細胞壊死活性を測定し
た。
【００６１】
カツオ−Ｉ、カツオ−II、イカスミ及びのエタノール抽出画分、及びカツオ−IIの水抽
出画分を用い、上記実施例（２−２）と同様にして、細胞壊死活性を測定した。結果を表
４〜６及び図３に示す。なお、表４〜６及び図３中、１はエタノールをＤＭＳＯで５倍希
釈したものを表す。
【００６２】
【表４】
【００６３】
【表５】
【００６４】
【表６】
以上より、いずれの試料においても、エタノール抽出画分及び水抽出各分においては、
ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞壊死活性は低下しており、細胞壊死活性はヘキサン抽出画
分（１）又は（２）にあることが示された。
【００６５】
（実施例３）細胞壊死活性を有する化合物の物性の検討
（３−１）酸又はアルカリに対する親和性の検討
カツオ−IIから０．５７５７ｇを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、ここにヘキサン
１ｍＬを加えて溶解させ、４℃、１２，０００ｒｐｍ（１３，０００×ｇ）にて５分間遠心分離し、ヘキサン相Ｃを得た。
【００６６】
ヘキサン相Ｃを、５００μＬずつ２つのマイクロチューブに分け、一方には５００μＬ
の６Ｎ塩酸を加え、他方には５００μＬの２Ｎ水酸化ナトリウムを加えた。転倒混和した
後に、４℃、１２，０００ｒｐｍ（１３，０００×ｇ）にて１５分間遠心分離し、ヘキサン相Ｄ（塩酸存在下で抽出された画分）及びヘキサン相Ｅ（水酸化ナトリウム存在下で抽出された画分）を得た。
【００６７】
ヘキサン相Ｄ及びＥについて、上述した実施例２と同様にして、ＨＢ４Ｃ５細胞に対す
る細胞壊死活性を測定した。結果を表７及び図４に示す。
【００６８】
【表７】
以上より、水酸化ナトリウム存在下においてヘキサン抽出した画分よりも、塩酸存在下
でヘキサン抽出した画分の方が高い細胞壊死活性を有することが示された。
【００６９】
これによって、細胞壊死活性を有する化合物は、アルカリに対して親和性を有するもの
であろうと考えられた。
【００７０】
（３−２）極性物質又は非極性物質の検討
実施例１で得た各ヘキサン抽出画分（２）５００μＬをドラフト内に１日静置し、ヘキ
サンが十分揮発した後、酢酸エチル５００μＬを加えて溶解した。この後、４℃、１２，
０００ｒｐｍ（１３，０００×ｇ）にて５分間遠心分離して上清をとり、それぞれを、カ
ツオ−Ｉ（２）Ａ、カツオ−II（２）Ａ、イカスミ（２）Ａ、カズノコ（２）Ａとした。
【００７１】
これらの試料について、上述した実施例２と同様にしてハイブリドーマＨＢ４Ｃ５に対
する細胞壊死活性を測定した。結果を表８及び９、並びに図５に示す。陽性対照には、酢
酸エチルをＤＭＳＯで５倍希釈したものを使用した。
【００７２】
【表８】
【００７３】
【表９】
以上より、カツオ−Ｉ、カツオ−II、及びイカスミでは、５倍希釈、２５倍希釈のいず
れの試料を使用した場合でも、細胞壊死活性が確認された。一方、カズノコは、２５倍希
釈の試料では細胞壊死活性が著しく低下していた。このため、細胞壊死活性は、概ねヘキ
サン抽出物を酢酸エチルで抽出した画分に含まれており、極性物質ではないと考えられた
。
【００７４】
（３−３）熱安定性の検討
上述した実施例（３−２）と同様にして得たカツオ−Ｉ（２）Ａ及びカツオ−II（２）
Ａを、１．５ｍＬのマイクロチューブに１ｍＬずつ分注し、１００℃の湯浴で３０分間、
加熱処理を行い、その後、氷中に漬けて急冷した。
【００７５】
２ｍＬのシャーレに、熱処理したカツオ−Ｉ（２）Ａ及びカツオ−II（２）Ａと、熱処
理していないカツオ−Ｉ（２）Ａ及びカツオ−II（２）Ａとをそれぞれ５００μＬずつ分
注した。
【００７６】
次いで、ＦＢＳ８００μＬに滅菌水９．２ｍＬを加え、８％ＦＢＳを調製した。この８
％ＦＢＳを上記のシャーレに５００μＬずつ分注した。ここで、上述したように前培養し
たＣｏｌｏ−２０１細胞を上記と同様に調製して、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２×Ｅ
ＤＲＦ培地）とし、上記の加熱試料又は非加熱試料、及びＦＢＳを含む各シャーレにそれ
ぞれ１ｍLずつ分注した。
【００７７】
このシャーレを５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて２日間培養し、細胞数と生
細胞数とを計測して生存率（％）を求めた。
【００７８】
結果を表１０及び図６に示す。陽性対照には、加熱処理した酢酸エチルをＤＭＳＯで５
倍希釈したものと、加熱処理していない酢酸エチルをＤＭＳＯで５倍希釈したものとを使
用した。
【００７９】
【表１０】
以上より、カツオ−I（２）Ａ及びカツオ−II（２）Ａのいずれの試料においても、非
加熱処理した試料では細胞壊死活性が見られたが、１００℃、３０分の加熱処理によって
この活性は失われることが示された。
以上より、細胞壊死活性は熱に不安定な物資であることが示された。
【００８０】
（実施例４）腫瘍細胞に対する細胞壊死活性の検討
（４−１）ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ−２０１に対する細胞壊死活性
細胞をハイブリドーマＨＢ４Ｃ５からヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ−２０１に代えた以外
は、実施例２と同様にして細胞壊死活性を検討した。なお、Ｃｏｌｏ−２０１は接着細胞
であるため、活性測定にあたっては、常法に従って前培養した付着細胞を剥がすという操
作が必要となる。
【００８１】
上述したカツオ−Ｉ、カツオ−II、イカスミ及びカズノコの酢酸エチル抽出画分を試料
として、細胞壊死活性を測定した。すなわち、上記の各試料を添加した培養上清を15ｍL
の遠心管に移し、次いで、２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ ２ｍＬを付着細胞に当て
て、細胞を剥がした。剥がした細胞を、上清を移した１５ｍＬの遠心管に移し、この遠心管を４℃、２，０００ｒｐｍ（１３，０００×ｇ）で５分間遠心して上清を除いた。次いで、ここに２ｍＬのＥＤＲＦ培地を加えて懸濁した。生細胞数は、トリパンブルーと血球計算板とを用いて計測した。結果を、表１１、１２及び図７に示す。
【００８２】
【表１１】
【００８３】
【表１２】
以上より、上記の各抽出画分のうちカツオのヘキサン抽出画分をさらに酢酸エチルで抽
出した画分は、ヒトの癌細胞由来細胞株に対しても細胞壊死作用を有することが確認され
た。一方、イカスミとカズノコの抽出画分では、これらの活性は示されなかった。
【００８４】
（４−２）マウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ−２６に対する細胞壊死活性
細胞をハイブリドーマＨＢ４Ｃ５からマウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ−２６に代えた以
外は、実施例２と同様にして細胞壊死活性を検討した。なお、Ｃｏｌｏｎ−２６は付着細
胞であるため、活性測定にあたっては、常法に従って前培養した付着細胞を剥がすという
操作が必要となる。
【００８５】
上述したカツオ−Ｉ及びカツオ−IIの酢酸エチル抽出画分を試料として、細胞壊死活性
を測定した。すなわち、上記の各試料を添加した培養上清を１５ｍＬの遠心管に移し、次
いで、２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ ２ｍＬを付着細胞に当てて、細胞を剥がした
。剥がした細胞を、上清を移した１５ｍＬの遠心管に移し、この遠心管を室温にて、１，
０００ｒｐｍ（５００×ｇ）で５分間遠心して上清を除いた。次いで、ここに２ｍＬのＥ
ＤＲＦ培地を加えて懸濁した。生細胞数は、トリパンブルーと血球計算板とを用いて計測
した。結果を、表１３及び図８に示す。
【００８６】
【表１３】
【００８７】
（４−３）ヒト末梢リンパ球（ＰＢＬ）に対する細胞壊死活性の検討
細胞をハイブリドーマＨＢ４Ｃ５からＰＢＬに代えた以外は、実施例２と同様にして細
胞壊死活性を検討した。
【００８８】
健常人（男性）より約３０ｍＬを５０ｍＬの注射器により採血し、全血を５０ｍＬの遠
心管に移してＰＢＳを２０ｍＬ加えて、そっと転倒混和して懸濁した。
【００８９】
１５ｍＬの遠心間１２本にＬＳＭ（Lymphocyte Separation Medium）を３ｍLずつ加え
、数秒間遠心した。この後、ＬＳＭの上に、上記の懸濁した全血を、ＬＳＭの界面を乱さ
ないように静かに重層した。
【００９０】
室温にて、２，０００ｒｐｍ（８００×ｇ）にて、２０分間遠心し、４層に別れた全血
のうち、白血球を含む層を、別の１５ｍＬの遠心間に回収した。この遠心管に、全体が１
４ｍＬとなるまで、上記の２×ＥＤＲＦ培地を加えて、転倒混和し十分に懸濁した。
【００９１】
ついで、室温、１，５００ｒｐｍ（６００×ｇ）にて、５分間遠心し、上清をアスピレ
ータで除き、再度、１４ｍＬの２×ＥＤＲＦ培地を加えて、室温にて、１，５００ｒｐｍ
（６００×ｇ）にて、５分間遠心した。上清をアスピレータで除き、１０ｍＬの２×ＥＤ
ＲＦ培地を加えて懸濁した。
【００９２】
ついで、このＰＢＬ懸濁液を、２×ＥＤＲＦ培地を用いて５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
に調製した。
【００９３】
上述した実施例１で得たカツオ−Ｉ（１）Ａとカツオ−II（２）Ａとを試料として使用
し、陽性対照には、酢酸エチルをＤＭＳＯで５倍希釈したものを使用した。30μLのカツ
オ−Ｉ（２）Ａ又はカツオ−II（２）Ａを１．４７ｍＬの滅菌水で希釈し、この希釈後の
各試料を２４穴プレートの各ウェルに２５０μＬずつ分注した。
【００９４】
６００μＬのＦＢＳを２．４ｍＬの滅菌水で希釈し、２０％ＦＢＳを調製し、上記の各
ウェルに２５０μＬずつ分注した。ついで、上記のように調製したＰＢＬの懸濁液を、各
ウェルに１ｍＬずつ分注した。この２４穴プレートを、５％ＣＯ２インキュベータ中、３
７℃にて、２日間培養し、細胞数と生細胞数とを測定し、生存率を求めた。
【００９５】
結果を、表１４及び図９に示す。
【００９６】
【表１４】
以上より、上記の各抽出画分のうちカツオのヘキサン抽出画分をさらに酢酸エチルで抽
出した画分は、癌細胞のみならずヒトの末梢リンパ球細胞に対しても細胞壊死作用を有す
ることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明は、細胞壊死活性、特に、腫瘍細胞に対する細胞壊死活性を必要とする医薬品の
分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】魚類及び介類からのヘキサン抽出画分に含まれる化合物の抽出手順を示す図である。
【図２】図２Ａ〜Ｃは、魚類及び介類からの各ヘキサン抽出画分の細胞壊死活性を示す図である。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、魚類及び介類からの各ヘキサン抽出画分をさらに水で抽出した画分の細胞壊死活性を示す図である。
【図４】本発明の細胞壊死活性を有する化合物の酸又はアルカリへの親和性を示す図である。
【図５】図５Ａ及びＢは、本発明の細胞壊死活性を有する化合物の極性を測定した結果を示す図である。
【図６】本発明の細胞壊死活性を有する化合物の熱安定性を測定した結果を示す図である。
【図７】図７Ａ及びＢは、本発明の細胞壊死活性を有する化合物のヒト大腸癌由来株化細胞Colo201に対する腫瘍壊死活性を測定した結果を示す図である。
【図８】本発明の細胞壊死活性を有する化合物のマウス大腸癌由来株化細胞Colon-26に対する腫瘍壊死活性を測定した結果を示す図である。
【図９】本発明の細胞壊死活性を有する化合物のヒト末梢血リンパ球に対する腫瘍壊死活性を測定した結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞壊死活性を有する化合物に関し、より詳細には、魚類及び介類から得ら
れる、疎水性の細胞壊死活性を有する化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体においては、形態学的に分類される２種類の細胞死が知られている。一方は
プログラムされた細胞死といわれるアポトーシスであり、他方は細胞の壊死（ネクローシ
ス）である。こうした細胞の死は、ウイルス感染の場合を例に挙げれば、感染成立後に生
体防御機構が作動してＴ細胞とＢ細胞とが協同的に作用し、ウイルスに感染した細胞を非
自己と認識して死滅させるものである。
【０００３】
細胞の壊死は、ウイルス感染のみならず、近年、死亡原因の上位に位置する癌の場合に
も起こることが知られている。癌細胞が出現すると、腫瘍細胞の壊死作用を有するＴＮＦ
等の生体因子やＮＫ細胞等が作用し、生体の恒常性の維持が図られる（非特許文献１参照
）。
【０００４】
一方、動植物に含まれる種々の活性を有する化合物については、植物精油等の主要成分
等に関する報告も多く、研究も進んでいる（非特許文献２参照）。また、魚類や介類にお
いても、シガトキシン等を初めとする海産毒については研究が進み、いろいろな報告もな
されている（非特許文献３参照）が、腫瘍壊死活性を有する物質を含むかどうかについて
の報告は少ない。
【非特許文献１】BioScience用語ライブラリー 免疫 14〜15頁 1995年11月1日 第１刷発行
【非特許文献２】エッセンシャルオイルの化学 1990年１月30日 第１版発行 裳華房
【非特許文献３】http://www.jst.go.jp/pr/report/report193/
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
生体の恒常性とのバランス上、細胞壊死活性を有する物質の生体内における産生量は限
られているため、腫瘍を有している生体そのものから、腫瘍細胞を選択的に壊死させるこ
とができる物質を大量に得ることは難しい。
【０００６】
しかし、こうした活性を有する化合物は、ウイルス感染や癌の治療においては有用性が
高いと考えられており、腫瘍壊死活性を有する化合物を、あるまとまった量で定常的に確
保することについては、強い要請がある。
【０００７】
本発明の発明者らは、上記のような事情の下で鋭意研究を進め、本発明を完成したもの
である。本発明は、魚類又は介類から得られる、細胞壊死活性を有する化合物を含む画分
を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、魚類及び介類の肉、卵、及び体液からなる群より選ばれる少なく
とも一つを、疎水性の有機溶媒で抽出して得られる細胞壊死活性を有する化合物である。
【０００９】
ここで、前記魚類の肉は、カツオ、マグロ、アジ、サバ及びイワシからなる群から選ば
れるものであることが好ましく、前記魚類の卵は、ニシン、タラ、トビウオ、ホキ及びシ
シャモからなる群から選ばれるものであることが好ましい。また、前記介類の体液は、イ
カスミ及びタコスミからなる群から選ばれるものであることが好ましい。
【００１０】
また、前記細胞壊死活性は、肺癌患者由来の癌細胞を用いたハイブリドーマ、ヒト大腸
癌由来細胞、マウス大腸癌由来細胞及びヒト末梢血リンパ球に対するものであることが好
ましい。
【００１１】
さらに、前記細胞壊死活性を有する化合物は、アルカリに親和性のあるものであること
が好ましく、１００℃、３０分の加熱処理によって失活するものであることが、さらに好
ましい。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、魚類及び介類から疎水性の細胞壊死活性を有する化合物を得ることが
できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
まず、本発明の化合物の抽出に用いた、魚類及び介類について説明する。ここで使用し
た魚類としては、例えば、カツオ、マグロ、アジ、サバ及びイワシ等を挙げることができ
るが、これらに限定されるものではない。
中でもカツオ、マグロ、アジ、サバ及びイワシからなる群より選ばれる少なくとも一つを使用することが好ましく、カツオを使用することがさらに好ましい。
【００１４】
また、前記魚類の卵としては、ニシン、タラ、サケ、トビウオ、ホキ及びシシャモ等の
卵を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
中でもニシン、タラ、サケ、トビウオ、ホキ及びシシャモからなる群より選ばれる少な
くとも一つの卵を使用することが好ましく、ニシンの卵であるカズノコを使用することが
、一定の質の材料を容易に入手できることからさらに好ましい。
【００１５】
また、前記介類は、イカ及びタコ等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
中でもイカ及びタコからなる群から選ばれる少なくとも一つであることが好ましい。
【００１６】
また前記体液は、イカスミ、タコスミ等を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
中でもイカスミ及びタコスミからなる群から選ばれる少なくとも一つであることが好ましい。
特に、スルメイカのイカスミを使用すると、後述する細胞壊死活性の高い化合物を得ることができる。
【００１７】
上記の魚類の肉、卵および体液、並びに介類の肉、卵および体液から、後述する細胞壊死活性を有する化合物を抽出するにあたっては、疎水性の有機溶媒を使用することが好ましく、前記疎水性の有機溶媒としては、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素類、シクロペンタン、シクロヘキサン等の脂環式脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、メチルイソブチルケトン等のケトン類、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類等を挙げることができる。これらの中でも脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、ケトン類、及びエステル類が好ましく、ｎ−ヘキサン、トルエン、ベンゼン、及び酢酸エチルからなる群から選ばれるものを使用することが、溶媒自体の極性及び水との親和性という点から好ましく、とりわけ、ｎ−ヘキサンを使用すると抽出効率が高い。
【００１８】
上記疎水性の有機溶媒は一種もしくは二種以上を使用することができる。
【００１９】
上記疎水性の有機溶媒には、エチルアルコール、アセトン、ＤＭＳＯ等の水溶性の有機
溶媒の一種もしくは二種以上を併用することができる。
【００２０】
また、細胞壊死活性は、肺癌患者由来のリンパ球細胞とリンパ腫細胞であるＮＡＴ−３
０細胞とを融合して作製したハイブリドーマ、ヒト大腸癌由来細胞、マウス大腸癌由来細
胞及びヒト末梢血リンパ球に対するものであることが好ましい。ここで、肺癌患者由来の
リンパ球細胞とリンパ腫細胞であるＮＡＴ−３０細胞とを融合して作製したハイブリドー
マとしては、ＨＢ４Ｃ５、ＨＦ１０Ｂ４等を挙げることができる。ＨＢ４Ｃ５を使用する
ことが、培養及び細胞活性の測定が容易であるという理由から好ましい。
【００２１】
ヒト大腸癌由来細胞としては、Ｃｏｌｏ−２０１、ＬｏＶｏ、Ｃａｃｏ−２、ＬＳ１８
０等を挙げることができる。Ｃｏｌｏ−２０１、及びＣａｃｏ−２からなる群より選ばれ
る少なくとも一つの株化細胞を使用することが、培養が容易であることから好ましく、Ｃ
ｏｌｏ−２０１を使用することがさらに好ましい。
【００２２】
マウス大腸癌由来細胞としては、ｃｏｌｏｎ−２６、ＲＫＯ−Ｅ６、ＣＴ２６、ＣＬ２
５等を挙げることができる。ｃｏｌｏｎ−２６を使用することが、ｉｎ ｖｉｖｏ（動物
実験）において効果を検討することが容易であることから好ましい。
【００２３】
また、上記のような株化細胞以外に、ヒト末梢血リンパ球細胞に対して、細胞壊死活性
を有するものであってもよい。
【００２４】
前記細胞壊死活性を有する化合物は、アルカリに親和性のあるものであることが好まし
く、１００℃、３０分の加熱処理によって失活するものであることがさらに好ましい。
【００２５】
こうしたアルカリとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を挙げるこ
とができる。また、１００℃、３０分の加熱処理による細胞壊死活性の失活率（％）は、
加熱処理をしない場合の約５０〜８０％である。
【００２６】
以下に、本発明の細胞壊死活性を有する化合物を得るための手順を説明する。
【００２７】
上述したカツオの魚肉、イカスミ、及びカズノコを、それぞれ、所定量ずつ秤量し、所
定の大きさの遠心可能なチューブに個別にとり、所定量のｎ−ヘキサン等の疎水性の有機
溶媒を各チューブに加える。
【００２８】
これらのチューブを、１〜８℃、好ましくは３〜５℃、さらに好ましくは約４℃の温度
範囲で、６，０００〜１８，０００×ｇ、好ましくは７，０００〜１５，０００×ｇ、さ
らに好ましくは８,０００〜１５，０００×ｇの遠心力の範囲で所定の時間遠心分離する
。
各チューブのヘキサン相を他の容器に別個に移し、ｎ−ヘキサン等の疎水性の有機溶媒
相Ａとする。次いで、それぞれのチューブ内の沈殿物に所定量のｎ−ヘキサン等の疎水性
の有機溶媒を加えて再度溶解させ、その後、同様に所定の時間遠心分離し、ｎ−ヘキサン
等の疎水性の有機溶媒相Ｂを得る。上記のｎ−ヘキサン等の疎水性の有機溶媒相Ａ及びＢ
を合わせて、ｎ−ヘキサン等の疎水性の有機溶媒相抽出画分（１）とする。
【００２９】
ｎ−ヘキサン等の疎水性の有機溶媒相抽出画分（１）から所定量を遠心可能なチューブ
にとり、ここに等量の水を加えて激しく混和し、１〜８℃、好ましくは３〜５℃、さらに
好ましくは約４℃の温度範囲で、６，０００〜１８，０００×ｇ、好ましくは７，０００
〜１５，０００×ｇ、さらに好ましくは８,０００〜１５，０００×ｇの遠心力の範囲で
所定の時間遠心分離し、水相を除く。
【００３０】
再度等量の水をここに加えて上記と同様に混和した後に遠心し、得られたｎ−ヘキサン
等の疎水性の有機溶媒相をヘキサン抽出画分（２）とする。
【００３１】
上記のようにして得たｎ−ヘキサン等の疎水性の有機溶媒画分（１）及び（２）を、粗
精製標品として以下の手順に従い細胞壊死活性を測定する。
【００３２】
継代培養した上記のハイブリドーマ、ヒト大腸癌由来株化細胞、マウス大腸癌由来株化
細胞を、それぞれ２〜３日間前培養する。
【００３３】
ついで、所定の倍率に希釈した上述した粗標品を、所定量であらかじめ用意した大きさ
のシャーレに分注し、所定量のあらかじめ調製しておいた４×ＩＴＥＳをこのシャーレに
所定量ずつ分注する。
【００３４】
次に、あらかじめ調製した２×ＥＤＲＦ培地を用いて、上述の各細胞を約２×１０５
ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、これを上記のシャーレそれぞれに、所定量ずつ分注する。
【００３５】
細胞の分注を終えた後に、これらのシャーレを５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃に
て約２日〜３日間培養し、各シャーレ中の細胞数（全数）と、生細胞数とを測定し、生存
率を求めて細胞壊死活性とする。
【００３６】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に
何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３７】
カツオその他の魚類の試料からのｎ−ヘキサン等による各画分の抽出
（１−１）材料等
カツオは鰹節製造工場より入手した２尾を用い、これらから得られた抽出用試料を、そ
れぞれ、カツオ−Ｉ及びカツオ−IIとした。
【００３８】
イカスミは市販品を購入した。また、カズノコは、オランダ産の市販品（−１８℃以下
にて冷凍保存されたもの）を購入した。
【００３９】
ｎ−ヘキサン、エチルアルコールルは、和光純薬工業（株）より、いずれも特級品を購
入した。また、水は、超純水を蒸留して使用した。
【００４０】
マイクロチューブは、容量１，５００μＬ、２，０００μＬ、及び５０００μＬのものをアシスト（株）社より購入した。
【００４１】
（１−２）ヘキサン抽出画分（１）、（２）、水抽出画分及びエタノール抽出画分の調製
上述したカツオ−Ｉ、カツオ−II、イカスミ、及びカズノコを、それぞれ、カツオ−Ｉ
とカツオ−IIとは０．５５１ｇ、イカスミは０．５４１ｇ、及びカズノコを０．５４９ｇ
秤量し、１．５ｍＬのマイクロチューブに個別にとり、それぞれ１ｍＬのへキサンを加え
て溶解させた。
【００４２】
これらのチューブを、４℃、１２，０００ｒｐｍ（１３，０００×ｇ）にて５分間遠心
し、それぞれヘキサン相を他の容器にそれぞれ移し、ヘキサン相Ａとした。次いで、それ
ぞれの沈殿に１ｍＬのヘキサンを加えて再度溶解させた後、４℃、１２，０００ｒｐｍ（
１３，０００×ｇ）にて５分間遠心分離し、ヘキサン相Ｂを得た。上記のヘキサン相Ａ及
びＢ合わせて、ヘキサン抽出画分（１）とした（図１参照）。
【００４３】
ヘキサン抽出画分（１）から６００μＬを１．５ｍＬマイクロチューブに移し、ここに
６００μＬの水を加えて激しく混和し、４℃、１２，０００ｒｐｍ（１３，０００×ｇ）
にて１５分間遠心分離し、水相を除いた。再度６００μＬの水をここに加えて上記と同様
に混和、遠心を行い、得られたヘキサン相をヘキサン抽出画分（２）とした（図１参照）
。
【００４４】
６００μLのヘキサン抽出画分（２）を５ｍＬのマイクロチューブにとり、ここに、ｎ-
ヘキサンと水とをそれぞれ１ｍＬずつ加えて上記と同様に混和し、遠心分離した。得られ
た沈殿に対して、６００μＬの水を加えて同様に混和し、４℃、１２，０００ｒｐｍ（１
３，０００×ｇ）にて１５分間遠心分離した。この遠心分離操作によって得られた上清を水抽出画分とした。また、得られた沈殿は、６００μＬのエタノールに溶解し、エタノール抽出画分とした（図１参照）。
【００４５】
（実施例２）上記各画分の細胞壊死活性測定
（２−１）試料、試薬等
上記の実施例1で得られた、カツオ−I、カツオ−II、イカスミ及びカズノコからそれぞ
れ得られた、ヘキサン抽出画分（１）、同（２）、水抽出画分、エタノール抽出画分につ
いて、細胞壊死活性を検討した。
【００４６】
細胞壊死活性は、ＨＢ４Ｃ５、Ｃｏｌｏ−２０１、Ｃｏｌｏｎ−２６及びヒト末梢血リ
ンパ球細胞を後述する条件にて培養し、総細胞数に対する生細胞数（生存率）を指標とし
て評価した。
【００４７】
ＨＢ４Ｃ５細胞は、肺癌患者のリンパ球と、リンパ腫細胞であるＮＡＴ−３０とを融合
させて作製されたヒト−ヒトハイブリドーマであり、ＩｇＭ型のヒトモノクローナル抗体
（Ｃ５抗体）を分泌する。この細胞の培養には、ＥＤＲＦ培地を、極東製薬工業（株）よ
り購入して使用した。添加物であるインスリン、トランスフェリン、エタノール及びセレ
ナイトは、シグマ社より購入して使用した。
【００４８】
ヒトの大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ−２０１はＡＴＣＣ（American Type Culture Collection
）より購入し、マウスの大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ−２６は、東北大学加齢医学研究所より
分与を受けた。Ｃｏｌｏ−２０１の培養には、５％ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳというこ
とがある）を添加した上記ＥＤＲＦ培地を使用した。ＦＢＳは５６℃で３０分間、非動化
処理を行っている。
【００４９】
ヒト末梢血リンパ球細胞は、健常成人より約３０ｍＬを真空採血管を用いて採血し、後
述する処理を行って得た。この処理には、リン酸緩衝生理食塩水（以下、PBSということ
がある）及びＬＳＭ（Lymphocyte Separation Medium）を使用した。PBSは生理食塩水と
リン酸バッファーとを用いて調製し、ＬＳＭはオルガノンテクニカ社より購入した。
【００５０】
上述した実施例１で調製した各試料の希釈には、ＤＭＳＯ（特級）を和光純薬工業（株
）より、購入して使用した。
【００５１】
（２−２）ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５に対するヘキサン抽出画分（１）及び（２）の細胞
壊死活性の測定
継代培養したハイブリドーマＨＢ４Ｃ５を、５８ｃｍ２のシャーレ４枚に２×１０５ｃ
ｅｌｌｓ／ｍＬでまき、２日間培養して、８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製した。
【００５２】
上述した実施例１で調製した各試料を、５倍及び２５倍にＤＭＳＯを用いて希釈した。
ＤＭＳＯには細胞毒性があることから、細胞壊死活性測定においては、培地中における濃
度が０．５％以下となるようにした。すなわち、段階希釈した各試料３０μＬを滅菌水１
．４７ｍＬに溶解し、この溶解液５００μＬを、あらかじめ用意した２ｍＬのシャーレに
それぞれ分注した。
【００５３】
ついで、以下のようにして４×ＩＴＥＳを調製した。すなわち、２００μＬのインスリ
ン（２００μｇ）、２００μＬのトランスフェリン（８００μｇ）、２００μＬのエタノ
ールアミン（４．８４μｇ）、及び２００μＬのセレナイト（０．１９２μｇ）を合わせ
、ここに蒸留水９．２ｍＬを加えて１０ｍＬとし、４×ＩＴＥＳを調製した。こうして調
製した４×ＩＴＥＳを、５００μＬずつ、上記の２ｍＬの各シャーレに分注した。
【００５４】
次に、ＥＤＲＦ粉末１７．７ｇを、５００ｍＬの蒸留水に溶解して調製した２×ＥＤＲ
Ｆ培地１０ｍＬ以上を用いて、ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
に調製した。このハイブリドーマＨＢ４Ｃ５を含む２×ＥＤＲＦ培地を、上記の各シャー
レに１ｍＬずつ分注した。
【００５５】
これらのシャーレを５％ＣＯ２インキュベータ中、３７℃にて２日間培養し、各シャー
レ中の細胞数（全数）及び生細胞数とを測定し、生存率を求めた。生細胞数の測定には、
１％トリパンブルーを使用した。
【００５６】
カツオ−Ｉ、カツオ−II、イカスミ及びカズノコから実施例１の手順に従って得られた
、ヘキサン抽出画分（１）、同（２）について、細胞壊死活性を測定した。陽性対照には
、ヘキサンをＤＭＳＯで５倍希釈した試料を使用した（表１〜３中、番号１で示す）。ま
た、各画分の活性は、５倍希釈及び２５倍希釈の試料を用いて測定した（表１〜３中、２
及び４は５倍希釈を、また、３及び５は２５倍希釈の試料をそれぞれ活性測定に使用して
いる）。結果を表１〜３、図２に示す。
【００５７】
【表１】
【００５８】
【表２】
【００５９】
【表３】
以上より、カツオ、イカスミ及びカズノコのヘキサン抽出画分（１）及び（２）には、
高い細胞壊死活性があることが示された。
【００６０】
（２−３）ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５に対するエタノール抽出画分及び水抽出画分の細胞壊死活性の測定
上記（２−２）と同様に調製したハイブリドーマＨＢ４Ｃ５に対して、ヘキサン抽出画
分（１）及び（２）と同量のエタノール抽出画分及び水抽出画分の細胞壊死活性を測定し
た。
【００６１】
カツオ−Ｉ、カツオ−II、イカスミ及びのエタノール抽出画分、及びカツオ−IIの水抽
出画分を用い、上記実施例（２−２）と同様にして、細胞壊死活性を測定した。結果を表
４〜６及び図３に示す。なお、表４〜６及び図３中、１はエタノールをＤＭＳＯで５倍希
釈したものを表す。
【００６２】
【表４】
【００６３】
【表５】
【００６４】
【表６】
以上より、いずれの試料においても、エタノール抽出画分及び水抽出各分においては、
ハイブリドーマＨＢ４Ｃ５細胞壊死活性は低下しており、細胞壊死活性はヘキサン抽出画
分（１）又は（２）にあることが示された。
【００６５】
（実施例３）細胞壊死活性を有する化合物の物性の検討
（３−１）酸又はアルカリに対する親和性の検討
カツオ−IIから０．５７５７ｇを１．５ｍＬマイクロチューブにとり、ここにヘキサン
１ｍＬを加えて溶解させ、４℃、１２，０００ｒｐｍ（１３，０００×ｇ）にて５分間遠心分離し、ヘキサン相Ｃを得た。
【００６６】
ヘキサン相Ｃを、５００μＬずつ２つのマイクロチューブに分け、一方には５００μＬ
の６Ｎ塩酸を加え、他方には５００μＬの２Ｎ水酸化ナトリウムを加えた。転倒混和した
後に、４℃、１２，０００ｒｐｍ（１３，０００×ｇ）にて１５分間遠心分離し、ヘキサン相Ｄ（塩酸存在下で抽出された画分）及びヘキサン相Ｅ（水酸化ナトリウム存在下で抽出された画分）を得た。
【００６７】
ヘキサン相Ｄ及びＥについて、上述した実施例２と同様にして、ＨＢ４Ｃ５細胞に対す
る細胞壊死活性を測定した。結果を表７及び図４に示す。
【００６８】
【表７】
以上より、水酸化ナトリウム存在下においてヘキサン抽出した画分よりも、塩酸存在下
でヘキサン抽出した画分の方が高い細胞壊死活性を有することが示された。
【００６９】
これによって、細胞壊死活性を有する化合物は、アルカリに対して親和性を有するもの
であろうと考えられた。
【００７０】
（３−２）極性物質又は非極性物質の検討
実施例１で得た各ヘキサン抽出画分（２）５００μＬをドラフト内に１日静置し、ヘキ
サンが十分揮発した後、酢酸エチル５００μＬを加えて溶解した。この後、４℃、１２，
０００ｒｐｍ（１３，０００×ｇ）にて５分間遠心分離して上清をとり、それぞれを、カ
ツオ−Ｉ（２）Ａ、カツオ−II（２）Ａ、イカスミ（２）Ａ、カズノコ（２）Ａとした。
【００７１】
これらの試料について、上述した実施例２と同様にしてハイブリドーマＨＢ４Ｃ５に対
する細胞壊死活性を測定した。結果を表８及び９、並びに図５に示す。陽性対照には、酢
酸エチルをＤＭＳＯで５倍希釈したものを使用した。
【００７２】
【表８】
【００７３】
【表９】
以上より、カツオ−Ｉ、カツオ−II、及びイカスミでは、５倍希釈、２５倍希釈のいず
れの試料を使用した場合でも、細胞壊死活性が確認された。一方、カズノコは、２５倍希
釈の試料では細胞壊死活性が著しく低下していた。このため、細胞壊死活性は、概ねヘキ
サン抽出物を酢酸エチルで抽出した画分に含まれており、極性物質ではないと考えられた
。
【００７４】
（３−３）熱安定性の検討
上述した実施例（３−２）と同様にして得たカツオ−Ｉ（２）Ａ及びカツオ−II（２）
Ａを、１．５ｍＬのマイクロチューブに１ｍＬずつ分注し、１００℃の湯浴で３０分間、
加熱処理を行い、その後、氷中に漬けて急冷した。
【００７５】
２ｍＬのシャーレに、熱処理したカツオ−Ｉ（２）Ａ及びカツオ−II（２）Ａと、熱処
理していないカツオ−Ｉ（２）Ａ及びカツオ−II（２）Ａとをそれぞれ５００μＬずつ分
注した。
【００７６】
次いで、ＦＢＳ８００μＬに滅菌水９．２ｍＬを加え、８％ＦＢＳを調製した。この８
％ＦＢＳを上記のシャーレに５００μＬずつ分注した。ここで、上述したように前培養し
たＣｏｌｏ−２０１細胞を上記と同様に調製して、２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（２×Ｅ
ＤＲＦ培地）とし、上記の加熱試料又は非加熱試料、及びＦＢＳを含む各シャーレにそれ
ぞれ１ｍLずつ分注した。
【００７７】
このシャーレを５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃にて２日間培養し、細胞数と生
細胞数とを計測して生存率（％）を求めた。
【００７８】
結果を表１０及び図６に示す。陽性対照には、加熱処理した酢酸エチルをＤＭＳＯで５
倍希釈したものと、加熱処理していない酢酸エチルをＤＭＳＯで５倍希釈したものとを使
用した。
【００７９】
【表１０】
以上より、カツオ−I（２）Ａ及びカツオ−II（２）Ａのいずれの試料においても、非
加熱処理した試料では細胞壊死活性が見られたが、１００℃、３０分の加熱処理によって
この活性は失われることが示された。
以上より、細胞壊死活性は熱に不安定な物資であることが示された。
【００８０】
（実施例４）腫瘍細胞に対する細胞壊死活性の検討
（４−１）ヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ−２０１に対する細胞壊死活性
細胞をハイブリドーマＨＢ４Ｃ５からヒト大腸癌細胞株Ｃｏｌｏ−２０１に代えた以外
は、実施例２と同様にして細胞壊死活性を検討した。なお、Ｃｏｌｏ−２０１は接着細胞
であるため、活性測定にあたっては、常法に従って前培養した付着細胞を剥がすという操
作が必要となる。
【００８１】
上述したカツオ−Ｉ、カツオ−II、イカスミ及びカズノコの酢酸エチル抽出画分を試料
として、細胞壊死活性を測定した。すなわち、上記の各試料を添加した培養上清を15ｍL
の遠心管に移し、次いで、２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ ２ｍＬを付着細胞に当て
て、細胞を剥がした。剥がした細胞を、上清を移した１５ｍＬの遠心管に移し、この遠心管を４℃、２，０００ｒｐｍ（１３，０００×ｇ）で５分間遠心して上清を除いた。次いで、ここに２ｍＬのＥＤＲＦ培地を加えて懸濁した。生細胞数は、トリパンブルーと血球計算板とを用いて計測した。結果を、表１１、１２及び図７に示す。
【００８２】
【表１１】
【００８３】
【表１２】
以上より、上記の各抽出画分のうちカツオのヘキサン抽出画分をさらに酢酸エチルで抽
出した画分は、ヒトの癌細胞由来細胞株に対しても細胞壊死作用を有することが確認され
た。一方、イカスミとカズノコの抽出画分では、これらの活性は示されなかった。
【００８４】
（４−２）マウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ−２６に対する細胞壊死活性
細胞をハイブリドーマＨＢ４Ｃ５からマウス大腸癌細胞株Ｃｏｌｏｎ−２６に代えた以
外は、実施例２と同様にして細胞壊死活性を検討した。なお、Ｃｏｌｏｎ−２６は付着細
胞であるため、活性測定にあたっては、常法に従って前培養した付着細胞を剥がすという
操作が必要となる。
【００８５】
上述したカツオ−Ｉ及びカツオ−IIの酢酸エチル抽出画分を試料として、細胞壊死活性
を測定した。すなわち、上記の各試料を添加した培養上清を１５ｍＬの遠心管に移し、次
いで、２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ ２ｍＬを付着細胞に当てて、細胞を剥がした
。剥がした細胞を、上清を移した１５ｍＬの遠心管に移し、この遠心管を室温にて、１，
０００ｒｐｍ（５００×ｇ）で５分間遠心して上清を除いた。次いで、ここに２ｍＬのＥ
ＤＲＦ培地を加えて懸濁した。生細胞数は、トリパンブルーと血球計算板とを用いて計測
した。結果を、表１３及び図８に示す。
【００８６】
【表１３】
【００８７】
（４−３）ヒト末梢リンパ球（ＰＢＬ）に対する細胞壊死活性の検討
細胞をハイブリドーマＨＢ４Ｃ５からＰＢＬに代えた以外は、実施例２と同様にして細
胞壊死活性を検討した。
【００８８】
健常人（男性）より約３０ｍＬを５０ｍＬの注射器により採血し、全血を５０ｍＬの遠
心管に移してＰＢＳを２０ｍＬ加えて、そっと転倒混和して懸濁した。
【００８９】
１５ｍＬの遠心間１２本にＬＳＭ（Lymphocyte Separation Medium）を３ｍLずつ加え
、数秒間遠心した。この後、ＬＳＭの上に、上記の懸濁した全血を、ＬＳＭの界面を乱さ
ないように静かに重層した。
【００９０】
室温にて、２，０００ｒｐｍ（８００×ｇ）にて、２０分間遠心し、４層に別れた全血
のうち、白血球を含む層を、別の１５ｍＬの遠心間に回収した。この遠心管に、全体が１
４ｍＬとなるまで、上記の２×ＥＤＲＦ培地を加えて、転倒混和し十分に懸濁した。
【００９１】
ついで、室温、１，５００ｒｐｍ（６００×ｇ）にて、５分間遠心し、上清をアスピレ
ータで除き、再度、１４ｍＬの２×ＥＤＲＦ培地を加えて、室温にて、１，５００ｒｐｍ
（６００×ｇ）にて、５分間遠心した。上清をアスピレータで除き、１０ｍＬの２×ＥＤ
ＲＦ培地を加えて懸濁した。
【００９２】
ついで、このＰＢＬ懸濁液を、２×ＥＤＲＦ培地を用いて５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
に調製した。
【００９３】
上述した実施例１で得たカツオ−Ｉ（１）Ａとカツオ−II（２）Ａとを試料として使用
し、陽性対照には、酢酸エチルをＤＭＳＯで５倍希釈したものを使用した。30μLのカツ
オ−Ｉ（２）Ａ又はカツオ−II（２）Ａを１．４７ｍＬの滅菌水で希釈し、この希釈後の
各試料を２４穴プレートの各ウェルに２５０μＬずつ分注した。
【００９４】
６００μＬのＦＢＳを２．４ｍＬの滅菌水で希釈し、２０％ＦＢＳを調製し、上記の各
ウェルに２５０μＬずつ分注した。ついで、上記のように調製したＰＢＬの懸濁液を、各
ウェルに１ｍＬずつ分注した。この２４穴プレートを、５％ＣＯ２インキュベータ中、３
７℃にて、２日間培養し、細胞数と生細胞数とを測定し、生存率を求めた。
【００９５】
結果を、表１４及び図９に示す。
【００９６】
【表１４】
以上より、上記の各抽出画分のうちカツオのヘキサン抽出画分をさらに酢酸エチルで抽
出した画分は、癌細胞のみならずヒトの末梢リンパ球細胞に対しても細胞壊死作用を有す
ることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明は、細胞壊死活性、特に、腫瘍細胞に対する細胞壊死活性を必要とする医薬品の
分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】魚類及び介類からのヘキサン抽出画分に含まれる化合物の抽出手順を示す図である。
【図２】図２Ａ〜Ｃは、魚類及び介類からの各ヘキサン抽出画分の細胞壊死活性を示す図である。
【図３】図３Ａ〜Ｃは、魚類及び介類からの各ヘキサン抽出画分をさらに水で抽出した画分の細胞壊死活性を示す図である。
【図４】本発明の細胞壊死活性を有する化合物の酸又はアルカリへの親和性を示す図である。
【図５】図５Ａ及びＢは、本発明の細胞壊死活性を有する化合物の極性を測定した結果を示す図である。
【図６】本発明の細胞壊死活性を有する化合物の熱安定性を測定した結果を示す図である。
【図７】図７Ａ及びＢは、本発明の細胞壊死活性を有する化合物のヒト大腸癌由来株化細胞Colo201に対する腫瘍壊死活性を測定した結果を示す図である。
【図８】本発明の細胞壊死活性を有する化合物のマウス大腸癌由来株化細胞Colon-26に対する腫瘍壊死活性を測定した結果を示す図である。
【図９】本発明の細胞壊死活性を有する化合物のヒト末梢血リンパ球に対する腫瘍壊死活性を測定した結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
魚類及び介類の肉、卵、及び体液からなる群より選ばれる少なくとも一つを、疎水性の有機溶媒で抽出して得られる細胞壊死活性を有する化合物。
【請求項２】
前記疎水性の有機溶媒が、ｎ−ヘキサン、トルエン、キシレン及びベンゼンからなる群より選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞壊死活性を有する化合物。
【請求項３】
前記魚類の肉が、カツオ、マグロ、アジ、サバ及びイワシからなる群より選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１又は２のいずれかに記載の細胞壊死活性を有する化合物。
【請求項４】
前記魚類の卵が、ニシン、タラ、サケ、トビウオ、ホキ及びシシャモからなる群より選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１又は２のいずれかに記載の細胞壊死活性を有する化合物。
【請求項５】
前記介類の体液が、イカスミ及びタコスミからなる群より選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１又は２のいずれかに記載の細胞壊死活性を有する化合物。
【請求項６】
前記細胞壊死活性は、肺癌患者由来の癌細胞を用いたハイブリドーマ、ヒト大腸癌由来細胞、マウス大腸癌由来細胞及びヒト末梢血リンパ球に対するものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞壊死活性を有する化合物。
【請求項７】
前記細胞壊死活性を有する化合物は、アルカリに親和性のあるものであることを特徴とする、請求項６に記載の細胞壊死活性を有する化合物。
【請求項８】
前記細胞壊死活性を有する化合物は、１００℃、３０分の加熱処理によって失活するものであることを特徴とする、請求項６又は７に記載の細胞壊死活性を有する化合物。
【請求項１】
魚類及び介類の肉、卵、及び体液からなる群より選ばれる少なくとも一つを、疎水性の有機溶媒で抽出して得られる細胞壊死活性を有する化合物。
【請求項２】
前記疎水性の有機溶媒が、ｎ−ヘキサン、トルエン、キシレン及びベンゼンからなる群より選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１に記載の細胞壊死活性を有する化合物。
【請求項３】
前記魚類の肉が、カツオ、マグロ、アジ、サバ及びイワシからなる群より選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１又は２のいずれかに記載の細胞壊死活性を有する化合物。
【請求項４】
前記魚類の卵が、ニシン、タラ、サケ、トビウオ、ホキ及びシシャモからなる群より選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１又は２のいずれかに記載の細胞壊死活性を有する化合物。
【請求項５】
前記介類の体液が、イカスミ及びタコスミからなる群より選ばれる少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１又は２のいずれかに記載の細胞壊死活性を有する化合物。
【請求項６】
前記細胞壊死活性は、肺癌患者由来の癌細胞を用いたハイブリドーマ、ヒト大腸癌由来細胞、マウス大腸癌由来細胞及びヒト末梢血リンパ球に対するものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞壊死活性を有する化合物。
【請求項７】
前記細胞壊死活性を有する化合物は、アルカリに親和性のあるものであることを特徴とする、請求項６に記載の細胞壊死活性を有する化合物。
【請求項８】
前記細胞壊死活性を有する化合物は、１００℃、３０分の加熱処理によって失活するものであることを特徴とする、請求項６又は７に記載の細胞壊死活性を有する化合物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００７−９１６５５（Ｐ２００７−９１６５５Ａ）
【公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２８４３０２（Ｐ２００５−２８４３０２）
【出願日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【出願人】（５９０００６３９８）マルトモ株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月２９日（２００５．９．２９）
【出願人】（５０４１４７２５４）国立大学法人愛媛大学 (214)
【出願人】（５９０００６３９８）マルトモ株式会社 (23)
【Ｆターム（参考）】
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