細胞膜破壊装置
【課題】細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ抽出する。
【解決手段】所定の濃度の電解質と、所定の濃度の細胞とを含む溶液中に、互いに対向して配置された、板電極２Ａと、板電極２Ａよりも表面積が小さい針状電極３Ａとを備え、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に存在する溶液中に、電解質が電離した電解質イオンの移動による電流を発生させて、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間を通電状態とする通電部６を備える。
【解決手段】所定の濃度の電解質と、所定の濃度の細胞とを含む溶液中に、互いに対向して配置された、板電極２Ａと、板電極２Ａよりも表面積が小さい針状電極３Ａとを備え、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に存在する溶液中に、電解質が電離した電解質イオンの移動による電流を発生させて、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間を通電状態とする通電部６を備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中に含まれる細胞の細胞膜を破壊する細胞膜破壊装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、薬品や超音波などを用いることなく電気的手法を用いて溶液中に含まれる細胞の細胞膜を破壊（殺菌）する技術として、高電圧パルス、水中放電、もしくは、水中に発生する衝撃波を利用するものがある。
【０００３】
また、電気的手法を用いて細胞膜を破壊し、細胞内の生体物質（内容物）を抽出する技術としては、特許文献１に開示された生体物質を抽出する方法がある。
【０００４】
この方法では、細胞内の生体物質を抽出するために、容積がμｌ（マイクロ・リットル）程度のチャンバの外側に電極を設けて１Ｖ（ボルト）〜１００Ｖ程度の交流電場を、比較的長時間、連続的に試料に印加している。
【０００５】
その他、電気的手法を用いて細胞の細胞膜を破壊する技術としては、特許文献２に開示された流路基板がある。
【０００６】
この流路基板では、流路の一部を局部的に１つの細胞のサイズよりも狭くした狭窄部とし、該狭窄部で細胞を補足して、細胞破砕電圧を印加している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開２００５／０８３０７８号明細書（２００５年０９月０９日国際公開）
【特許文献２】特開２００８−２５９４９１号公報（２００８年１０月３０日公開）
【特許文献３】特開２００７−１７４９０１（２００７年７月１２日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、前記高電圧パルス、水中放電、もしくは、水中に発生する衝撃波を利用する技術では、高電圧の印加、もしくは、放電や衝撃波による物理的衝撃のため、細胞内の内容物が損傷してしまうという問題点があった。
【０００９】
前記特許文献１に開示された方法では、１回の電圧印加処理では、容積がμｌ程度の小さなチャンバの容積に応じた溶液しか処理できないので、１つのチャンバでは、多量の溶液を迅速に処理できないという問題点があった。また、１Ｖ〜１００Ｖ程度の交流電場を、比較的長時間、連続的に試料に印加しているので、細胞内の内容物が損傷してしまう可能性もある。
【００１０】
さらに、前記特許文献２に開示された流路基板では、細胞の１つ１つを、１つの細胞のサイズよりも狭い狭窄部で補足して破壊しているので、細胞内の内容物を迅速に効率良く抽出できないという問題点があった。
【００１１】
本発明は、前記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ抽出することができる細胞膜破壊装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の細胞膜破壊装置は、前記課題を解決するために、所定の濃度の電解質と、所定の濃度の細胞とを含む溶液中に、互いに対向して配置された、陽極と、前記陽極よりも表面積が小さい針状電極である陰極とを備え、前記陽極および前記陰極間に存在する溶液中に、前記電解質が電離した電解質イオンの移動による電流を発生させて、前記陽極および前記陰極間を通電状態とする通電手段を備えることを特徴とする。
【００１３】
前記構成によれば、通電手段は、陽極および陰極間に存在する溶液中に、電解質が電離した電解質イオンの移動による電流（非ファラデー電流）を発生させて、陽極および前記陰極間を（瞬間的に）通電状態とする。
【００１４】
ここで、非ファラデー電流が流れる時間は、電解質イオンの移動が開始されてから陽極および陰極の周りに電気二重層が形成されるまでの時間であり、約１０ｍｓ（ミリ秒）程度であることが知られている。よって、このとき、陽極および陰極間に存在する溶液中のいたるところ（厳密には電解質イオンの流れが存在しているところ）で、瞬間的に局所的な電位差（電圧）が生じる。
【００１５】
また、陽極および陰極を同一の構成材料とすれば、陽極および陰極の溶出を抑制することができ、また、非ファラデー電流が流れた後は、陽極および陰極間の溶液中は、電気的に中性となって、電位差もほとんどない電解液バルクが形成される。
【００１６】
これにより、陽極および陰極間の存在する溶液中のいたるところに存在する細胞は、約１０ｍｓ程度の間のみ、前記瞬間的な電圧に晒されることになる。
【００１７】
また、前記瞬間的な電圧の大きさが、非ファラデー電流が流れる時間、常に約１Ｖ以上であれば、細胞の細胞膜は、非可逆的に破壊される。このため、単一若しくは複数の細胞からなる微生物、すなわち、単細胞微生物や多細胞微生物などを死滅させる（殺菌する）ことが可能となる。また、これにより、細胞内の内容物を抽出することも可能となる。
【００１８】
よって、以上の構成によれば、前記特許文献１の方法と比較して、細胞が長時間、電圧に晒されることがないので、細胞内の内容物の損傷を抑制しつつ、細胞膜を非可逆的に破壊し、細胞内の内容物を抽出することができる。
【００１９】
以上より、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ抽出することができる。
【００２０】
また、前記構成では、陰極は、陽極よりも表面積が小さい針状電極である。これにより、陽極および陰極間に印加される電圧の大きさが多少小さくても、広範囲に亘って溶液を通電させることができる。よって、細胞の細胞膜を、迅速かつ高効率に破壊することができる。これにより、単細胞微生物や多細胞微生物などを迅速かつ高効率に死滅させる（殺菌する）ことが可能となる。また、細胞内の内容物を、迅速かつ高効率に抽出することができる。
【００２１】
以上より、本発明の細胞膜破壊装置によれば、溶液中の細胞、または、単一若しくは複数の細胞からなる微生物を迅速かつ高効率に死滅させ、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ迅速かつ高効率に抽出することができる。
【００２２】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、前記課題を解決するために、所定の濃度の電解質と、所定の濃度の細胞とを含む溶液中に、互いに対向して配置された、陽極と、陰極とを備え、前記陽極および前記陰極間に存在する溶液中に、前記電解質が電離した電解質イオンの移動による電流を発生させて、前記陽極および前記陰極間を通電状態とする通電手段を備えることを特徴とする。
【００２３】
前記構成によれば、通電手段は、陽極および陰極間に存在する溶液中に、非ファラデー電流を発生させて、陽極および前記陰極間を（瞬間的に）通電状態とする。
【００２４】
ここで、上記のように、非ファラデー電流が流れる時間は、電解質イオンの移動が開始されてから陽極および陰極の周りに電気二重層が形成されるまでの時間であり、約１０ｍｓ程度である。よって、このとき、陽極および陰極間に存在する溶液中のいたるところで、瞬間的に局所的な電位差が生じる。
【００２５】
また、陽極および陰極を同一の構成材料とすれば、陽極および陰極の溶出を抑制することができ、また、非ファラデー電流が流れた後は、陽極および陰極間の溶液中は、電気的に中性となって、電位差もほとんどない電解液バルクが形成される。
【００２６】
これにより、陽極および陰極間の存在する溶液中のいたるところに存在する細胞は、約１０ｍｓ程度の間のみ、前記瞬間的な電圧に晒されることになる。
【００２７】
また、前記瞬間的な電圧の大きさが、非ファラデー電流が流れる時間、常に約１Ｖ以上であれば、細胞の細胞膜は、非可逆的に破壊される。このため、単一若しくは複数の細胞からなる微生物、すなわち、単細胞微生物や多細胞微生物などを死滅させる（殺菌する）ことが可能となる。また、これにより、細胞内の内容物を抽出することも可能となる。
【００２８】
よって、以上の構成によれば、前記特許文献１の方法と比較して、細胞が長時間、電圧に晒されることがないので、細胞内の内容物の損傷を抑制しつつ、細胞膜を非可逆的に破壊し、細胞内の内容物を抽出することができる。
【００２９】
以上より、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ抽出することができる。
【００３０】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、前記構成に加えて、前記陽極は、筒形状の筒状電極であり、前記筒状電極の一方の開口は、前記陰極が存在する方向に開放されていても良い。
【００３１】
前記構成によれば、筒状電極の一方の開口は、陰極が存在する方向に開放されている。これにより、筒状電極と、針状電極との間で、広範囲に亘って溶液を通電させることができる。
【００３２】
また、溶液が流れる方向を、筒状電極の中心軸の方向と一致させることで、溶液が、その流れを妨げられることなく、筒状電極を通過する。よって、溶液中の細胞、または、単一若しくは複数の細胞からなる微生物を迅速かつ高効率に死滅させ、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ迅速かつ高効率に抽出することができる。
【００３３】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、前記構成に加えて、前記陽極は、平板状の板電極であっても良い。
【００３４】
前記構成によれば、板電極と針状電極との配置を調整することで、板電極と、針状電極との間で、広範囲に亘って溶液を通電させることができる。よって、溶液中の細胞、または、単一若しくは複数の細胞からなる微生物を迅速かつ高効率に死滅させ、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ迅速かつ高効率に抽出することができる。
【００３５】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、前記構成に加えて、前記通電手段は、前記陽極および前記陰極間に放電が生じない程度の振幅を有するパルス電圧を少なくとも１回、印加することで、前記電解質イオンの移動による電流（非ファラデー電流）を溶液中に発生させても良い。
【００３６】
ここで、陽極および陰極間に、一定電圧を印加することなく、パルス電圧を印加するのは、溶液中に長時間、電流が流れないようにして、細胞内の内容物の損傷を抑制するためである。
【００３７】
また、パルス電圧の印加回数は、１回でも良いが、パルス電圧の印加回数を大きくする程、単細胞微生物や多細胞微生物などを高効率に死滅させ（殺菌し）、細胞内の内容物を、高効率に抽出することができる。
【００３８】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、前記構成に加えて、電荷を蓄積することが可能なコンデンサを備え、前記通電手段は、前記コンデンサに蓄えられた電荷を放電させることにより発生する、前記陽極および前記陰極間に放電が生じない程度の大きさで過渡的に減少する過渡電圧を、少なくとも１回、印加することで、前記電解質イオンの移動による電流（非ファラデー電流）を溶液中に発生させても良い。
【００３９】
ここで、陽極および陰極間に、一定電圧を印加することなく、過渡電圧を印加するのは、溶液中に長時間、電流が流れないようにして、細胞内の内容物の損傷を抑制するためである。
【００４０】
また、過渡電圧の印加回数は、１回でも良いが、過渡電圧の印加回数を大きくする程、単細胞微生物や多細胞微生物などを高効率に死滅させ（殺菌し）、細胞内の内容物を、高効率に抽出することができる。
【００４１】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、前記構成に加えて、流路幅が局部的に狭くなっている狭窄部を有し、該狭窄部における流路幅が複数の細胞が通過できる程度の幅となっている流路を備え、前記陽極および前記陰極が、前記狭窄部の近傍において、溶液の流れる方向に沿って、前記流路の内部に並列配置されていても良い。
【００４２】
前記構成によれば、通電状態とする領域を、狭窄部の近傍とすることができるので、電気抵抗が大きな溶液であっても陽極および陰極間を通電させることができる。
【００４３】
また、前記構成では、狭窄部における流路幅が複数の細胞が通過できる程度の幅なので、前記特許文献２に記載された流路基板と比較して、単細胞微生物や多細胞微生物などを迅速かつ高効率に死滅させ（殺菌し）、細胞内の内容物を、迅速かつ高効率に抽出することができる。
【発明の効果】
【００４４】
本発明の細胞膜破壊装置は、以上のように、所定の濃度の電解質と、所定の濃度の細胞とを含む溶液中に、互いに対向して配置された、陽極と、前記陽極よりも表面積が小さい針状電極である陰極とを備え、前記陽極および前記陰極間に存在する溶液中に、前記電解質が電離した電解質イオンの移動による電流を発生させて、前記陽極および前記陰極間を通電状態とする通電手段を備える構成である。
【００４５】
本発明の細胞膜破壊装置は、以上のように、所定の濃度の電解質と、所定の濃度の細胞とを含む溶液中に、互いに対向して配置された、陽極と、陰極とを備え、前記陽極および前記陰極間に存在する溶液中に、前記電解質が電離した電解質イオンの移動による電流を発生させて、前記陽極および前記陰極間を通電状態とする通電手段を備える構成である。
【００４６】
それゆえ、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ抽出することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の一実施形態である細胞膜破壊装置の概要構成を示す模式図である。
【図２】（ａ）は、前記細胞膜破壊装置による処理前の溶液の様子を示す図であり、（ｂ）は、処理後の溶液の様子を示す図であり、（ｃ）は、処理回数と、溶液内の海水中微生物の生存率との関係を示すグラフである。
【図３】本発明の他の実施形態である細胞膜破壊装置の概要構成を示す模式図である。
【図４】前記細胞膜破壊装置に関し、筒状電極と針状電極の配置方法の一例を示す模式図である。
【図５】（ａ）は、前記細胞膜破壊装置の一実施例の構成を示す図であり、（ｂ）は、前記実施例に関し、プローブ電極間に局所的に生じた電位差の時間的変化を示すグラフである。
【図６】前記実施例による処理前（実験開始直後）の溶液中のプランクトンの観察結果を示す図である。
【図７】（ａ）は、前記実施例による処理前（実験開始直後）の溶液中のプランクトンの観察結果を示す図であり、（ｂ）は、対照実験のために別に用意した前記実施例による処理が行われていない溶液中のプランクトン（実験終了後）の観察結果を示す図である。
【図８】板電極および針状電極（針電極）間で、溶液中に電流が実際に流れている様子を実験的に示す図である。
【図９】パルス処理を行うための測定装置の構成を示す回路図と、板電極および針状電極（針電極）間に印加されるパルス電圧のパルス波形（５Ｈｚ，５Ｖ）を示すグラフである。
【図１０】処理用容器の概要構成を示す図である。
【図１１】パルス電圧を印加したとき（５Ｈｚ，５Ｖ，１０００回）、および、パルス電圧を印加していないとき、における波長とＯ．Ｄ．（Optical Density）との関係を示すグラフである。
【図１２】波長６１５ｎｍにおけるＯ．Ｄ．の周波数依存性を示すグラフである。
【図１３】波長６１５ｎｍにおけるＯ．Ｄ．の処理時間依存性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明の一実施形態について図１〜図１３に基づいて説明すれば、次の通りである。以下の特定の項目で説明すること以外の構成は、必要に応じて説明を省略する場合があるが、他の項目で説明する構成と同じである。また、説明の便宜上、各項目に示した部材と同一の機能を有する部材については、同一の符号を付し、適宜その説明を省略する。
【００４９】
〔１．細胞膜破壊装置１０について〕
まず、図１および図２（ａ）〜（ｃ）に基づき、本発明の一実施形態である細胞膜破壊装置１０について説明する。図１は、細胞膜破壊装置１０の概要構成を示す模式図である。
【００５０】
図１に示すように、細胞膜破壊装置１０は、水槽１、板電極（陽極）２Ａ、針状電極（陰極）３Ａ、セラミックチューブ４Ｌ、４Ｒ、接続配線５Ｌ、５Ｒ、通電部（通電手段）６、接続端子７Ｌ、Ｒを備える。
【００５１】
細胞膜破壊装置１０は、液体試料（溶液）中に含まれる細胞（または、微生物に含まれる複数の細胞）の細胞膜を破壊して、単一または複数の細胞からなる微生物、すなわち、単細胞微生物または多細胞微生物を死滅させ（殺菌し）、細胞内の内容物を抽出するものである。
【００５２】
ここで、抽出は、少なくとも１つ以上の細胞内の内容物を解放することであり、細胞の内容物が周囲の液体中に拡散されるように、細胞壁または細胞バリアを開放または破裂させることである。
【００５３】
水槽１には、本実施形態では、液体試料としてバラスト水（微生物を含む海水）が注入されるが、このような液体試料に限定されない。なお、海水中に含まれる食塩（電解質）の濃度は、通常、０．７Ｍ（Ｍは、ｍｏｌ／ｌ：モル／リットル）程度である。
【００５４】
上述のように、微生物は、単一の細胞からなる単細胞微生物であっても良いし、複数の細胞からなる多細胞微生物であっても良い。また、微生物は、古細菌微生物、真性細菌微生物、および真核細胞微生物などであれば良く、例えば、細菌、細菌胞子、ウィルス、真菌、および真菌胞子などである。
【００５５】
真核細胞は、例えば、植物細胞、植物胞子、動物細胞、および哺乳動物細胞などである。哺乳動物細胞は、例えば、ヒト細胞、白血球、および有核赤血球などである。
【００５６】
細胞内の内容物は、細胞小器官、遺伝物質、およびタンパク質などを含む。遺伝物質は、染色体、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、任意のタイプのリボ核酸（ＲＮＡ：例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ）などを含む。
【００５７】
タンパク質は、酵素、構造タンパク質、輸送タンパク質、イオンチャネル、毒素、ホルモン、および受容体などを含む。
【００５８】
また、液体試料は、綿棒で採取された皮膚試料、脳脊髄液、血液、唾液、気管支-肺胞洗浄物、気管支吸引物、肺組織および尿などの生体試料であっても良い。
【００５９】
また、液体試料は、核酸増幅を実施するのに必要とされる１種又は２種以上の試薬を含んでいても良い。
【００６０】
さらに、液体試料は、プライマー、核酸、デオキシヌクレオシド三リン酸、および核酸ポリメラーゼなどの試薬を含んでよい。
【００６１】
次に、板電極２Ａおよび針状電極３Ａは、図１に示すように、板電極２Ａの表面積が大きい方の表面に対して、針状電極３Ａの長手方向が垂直となるように、互いに対向して配置される。なお、板電極２Ａおよび針状電極３Ａの配置方法は、これに限られず、例えば、板電極２Ａの表面積が大きい方の表面に対して、針状電極３Ａの長手方向が平行となるように、互いに対向して配置されていても良い。
【００６２】
板電極２Ａは、陽極で、本実施形態では、表面積が大きい方の表面が、縦３ｃｍ、横３ｃｍの矩形である平板状の板電極であるが、その寸法、および、形状は、これに限られない。また、板電極２Ａの構成材料は、本実施形態では、タングステンであるが、これに限定されない。
【００６３】
一方、本実施形態の針状電極３Ａは、陰極で、板電極２Ａよりも表面積が小さい針状（または棒状）の電極であり、その構成材料は、本実施形態では、タングステンであるが、その寸法、形状および構成材料はこれらに限定されない。なお、板電極２Ａおよび針状電極３Ａの構成材料は、上述したタングステンの他、白金、金、炭素、銀、銅などを用いても良い。
【００６４】
また、以下で説明するように、板電極２Ａおよび針状電極３Ａの溶出を抑制するため、板電極２Ａおよび針状電極３Ａを同一の構成材料で構成することが好ましい。
【００６５】
また、針状電極３Ａの短手方向の断面の直径は、約１ｍｍである。このとき、針状電極３Ａと板電極２Ａとの対向表面積比は、１：１１４６である。
【００６６】
なお、通電状態となる範囲をできるだけ広くするためには、針状電極３Ａに対する板電極２Ａの対向表面積比は、できるだけ大きくなるように設計することが好ましい。
【００６７】
また、針状電極３Ａと板電極２Ａの電極間距離は、本実施形態では、約１１ｃｍであるが、これに限られない。
【００６８】
なお、板電極２Ａは、水槽１に設けられた嵌挿孔（不図示）に絶縁体であるセラミックチューブ４Ｌを介して嵌挿され、接続端子７Ｌと電気的に接続されている。一方、針状電極３Ａは、水槽１に設けられた嵌挿孔（不図示）に絶縁体であるセラミックチューブ４Ｒを介して嵌挿され、接続端子７Ｒと電気的に接続されている。
【００６９】
以上の構成によれば、板電極２Ａと針状電極３Ａとの配置を調整することで、後述する通電部６により、板電極２Ａと、針状電極３Ａとの間で、広範囲に亘って溶液を（瞬間的に）通電させることができる。
【００７０】
通電部６は、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に存在する溶液中に、電解質が電離した電解質イオン（海水の場合は、ナトリウムイオンと、塩素イオンなど）の移動による非ファラデー電流を発生させて、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間を（瞬間的に）通電状態とする。
【００７１】
また、通電部６は、静電容量が７５０μＦのコンデンサ（不図示）を備え、約５０Ｖの電圧をコンデンサに印加して蓄えられた電荷を放電させることにより発生する、過渡的に減少する過渡電圧を少なくとも１回、印加している。なお、この過渡電圧により、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間には、放電は生じない。
【００７２】
なお、本実施形態の細胞膜破壊装置１０における上記コンデンサの静電容量は、数μＦ程度〜数千μＦ程度であり、従来手法でのコンデンサの静電容量である数ｎＦ程度と比較して圧倒的に大きい。例えば、本実施形態の細胞膜破壊装置１０におけるコンデンサの静電容量は、１０μＦ以上、９０００μ以下とすることが好ましい。
【００７３】
ここで、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に、一定電圧を印加することなく、過渡電圧を印加するのは、溶液中に長時間、電流が流れないようにして、細胞内の内容物の損傷を抑制するためである。
【００７４】
次に、非ファラデー電流が流れる時間は、電解質イオンの移動が開始されてから板電極２Ａおよび針状電極３Ａの周りに電気二重層が形成されるまでの時間であり、約１０ｍｓ（ミリ秒）程度であることが知られている。よって、このとき、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に存在する溶液中のいたるところ（厳密には電解質イオンの流れが存在しているところ）で、瞬間的に局所的な電位差（電圧）が生じる。
【００７５】
また、本実施形態では、板電極２Ａおよび針状電極３Ａを同一の構成材料とすれば、板電極２Ａおよび針状電極３Ａの溶出を抑制することができ、また、非ファラデー電流が流れた後は、陽極および陰極間の溶液中は、電気的に中性となって、電位差もほとんどない電解液バルクが形成される。
【００７６】
これにより、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間の存在する溶液中のいたるところに存在する細胞は、約１０ｍｓ程度の間のみ、前記瞬間的な電圧に晒されることになる。
【００７７】
ここで、溶液中の細胞の細胞膜が、どの程度の時間、どの程度の大きさの電圧に晒されると非可逆的に破壊されるかについて検討する。
【００７８】
仮に、半径ａの細胞に一様な電界Ｅを時刻ｔ＝０においてステップ状に印加した時、細胞膜にかかる膜電圧Ｖ（θ）の時間変化は、
【００７９】
【数１】
【００８０】
【数２】
【００８１】
で与えられる（特許文献３参照）。
【００８２】
ただし、θは、電界Ｅの方向をθ＝０ととった時の、細胞中心を原点とする極座標の天頂角、τは、時定数、Ｃは、細胞膜の単位面積あたりの静電容量、ρｉｎ、ρｏｕｔは、それぞれ、細胞内液および外液の抵抗率である。
【００８３】
しかしながら、式（１）は、球形の完全な膜が存在する時の膜電圧を与えるもので、電圧の印加により膜の一点にポアが形成された場合は、膜電圧の分布がこの式から大きく異なることになる。
【００８４】
すなわち、式（１）は、細胞膜にかかる電圧の大きさは、電気力線の最上流側（北極：θ＝０）の位置および最下流側（南極：θ＝π）の位置で最大となることを示しているので、電圧を印加した場合、まず、このいずれかの位置にポアが形成されることが予想される。
【００８５】
すると、ここを通して電流が流れ、他方の極の充電がさらにすすみ、ここには、式（１）で与えられる以上の過大な電圧がかかることになり、この位置が非可逆的に破壊されると考えられる。このようにして、いわば将棋倒しのように細胞膜の別の位置に過電圧が伝搬する現象により、細胞が破壊される。
【００８６】
ここで、細胞膜の単位面積あたりの静電容量Ｃは、細胞種によらず１μＦ／ｃｍ２（マイクロ・ファラッド／平方センチメートル）程度であることが知られている。よって、式（２）の細胞膜の充電の時定数τは、例えば、半径ａ＝５μｍ（マイクロメートル）の細胞に対して、周囲の媒質が生理食塩水濃度１．５４ｍＭ程度の溶液である場合には、時定数τ＝４０ｎｓ（ナノ秒）程度、周囲の媒質が１ｍＭ程度の低濃度の食塩溶液である場合には、時定数τ＝２μｓ（マイクロ秒）程度である。
【００８７】
従って、細胞膜に不可逆的破壊を起こすためには、これより長い時間、約１Ｖ以上の電圧が細胞に印加されれば良いことになる。
【００８８】
上述した時定数τ＝４０ｎｓ程度、および時定数τ＝２μｓ程度の値のいずれも、非ファラデー電流が流れる時間である約１０ｍｓよりもかなり小さい。
【００８９】
すなわち、前記瞬間的な電圧の大きさが、非ファラデー電流が流れる時間、常に約１Ｖ以上であれば、細胞の細胞膜は、非可逆的に破壊されると考えられる。
【００９０】
よって、以上の構成によれば、前記特許文献１の方法と比較して、細胞が長時間、電圧に晒されることがないので、細胞内の内容物の損傷を抑制しつつ、細胞膜を非可逆的に破壊することができる。すなわち、単細胞微生物や多細胞微生物などを死滅させる（殺菌する）ことができる。また、これにより、細胞内の内容物を抽出することも可能となる。
【００９１】
例えば、図２（ａ）は、細胞膜破壊装置１０による処理前に、水槽１内の溶液の一部を取り出して観察したときの様子である。一方、図２（ｂ）は、細胞膜破壊装置１０による処理後に、水槽１内の溶液の一部を取り出して観察したときの様子である。
【００９２】
図２（ｂ）に示すように、細胞膜破壊装置１０により処理の後は、溶液中の細胞の細胞膜が非可逆的に破壊されていることが分かる。
【００９３】
また、前記構成では、針状電極３Ａは、板電極２Ａよりも表面積が小さい針状電極である。これにより、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に印加される電圧の大きさが多少小さくても、広範囲に亘って溶液を通電させることができる。よって、溶液中の細胞、または、単一若しくは複数の細胞からなる微生物を高効率に死滅させ、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ高効率に抽出することができる。
【００９４】
以上より、細胞膜破壊装置１０によれば、溶液中の細胞、または、単一若しくは複数の細胞からなる微生物を迅速かつ高効率に死滅させ、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ迅速かつ高効率に抽出することができる。
【００９５】
また、細胞膜破壊装置１０は、非常に簡単な構成なので、バラスト水処理装置として使用すれば、大型、小型のいずれの船舶への搭載も可能である。また、処理用の薬剤などを添加することなく微生物の処理が可能であり、排水時に二次処理を行う必要がない。また、バラスト水処理装置として小規模な装置の実現が可能であり、配管系に設置することも可能である。
【００９６】
次に、上述した通電部６が、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に印加する過渡電圧の印加回数は、１回でも良いが、過渡電圧の印加回数を大きくする程、細胞内の内容物を、高効率に抽出することができる。
【００９７】
例えば、図２（ｃ）のグラフに示すように、実際に、細胞膜破壊装置１０による処理回数が少ないときは、細胞の生存率は、３８％程度であったものが、処理回数を多くすることにより、生存率は、０％となった。
【００９８】
なお、本実施形態では、通電部６は、コンデンサの放電現象を利用したものを採用したが、通電部６の構成は、これに限定されない。
【００９９】
例えば、通電部６としてパルス電圧発生器（不図示）を用い、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に放電が生じない程度の振幅を有するパルス電圧を少なくとも１回、印加することで、前記非ファラデー電流を溶液中に発生させても良い。
【０１００】
なお、パルス電圧のパルス幅（時間）は、時定数τよりも大きいことが好ましいが、細胞の内容物の損傷を抑制するには、できるだけ短い方が好ましい。
【０１０１】
また、パルス電圧の大きさは、上述したコンデンサによる放電を参考に約５０Ｖとすることが考えられるが、これに限られない（以下の４．パルス処理の実験結果について参照）。
【０１０２】
また、パルス電流は、極性反転を起こさない、いわゆる、単極性のパルスであることが好ましいが、必要に応じて両極性のパルスとしても良い。
【０１０３】
ここで、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に、一定電圧を印加することなく、パルス電圧を印加するのは、溶液中に長時間、電流が流れないようにして、細胞内の内容物の損傷を抑制するためである。
【０１０４】
また、パルス電圧の印加回数は、１回でも良いが、パルス電圧の印加回数を大きくする程、単細胞微生物や多細胞微生物などを高効率に死滅させ（殺菌し）、細胞内の内容物を、高効率に抽出することができる。
【０１０５】
〔２．細胞膜破壊装置２０について〕
次に、図３および図４に基づき、本発明の他の実施形態である細胞膜破壊装置２０の構成について説明する。図３は、細胞膜破壊装置２０の概要構成を示す模式図である。
【０１０６】
図３に示すように、細胞膜破壊装置２０が、上述した細胞膜破壊装置１０と異なっている点は、以下のとおりである。
【０１０７】
（１）水槽１に替えて、サンプル流入路（流路）１Ｌ、狭窄部（流路）１Ｃ、サンプル流出路（流路）１Ｒからなる流路を用いている点。
【０１０８】
（２）板電極２Ａおよび針状電極３Ａの組合せに替えて、筒状電極２Ｂ（陽極）および針状電極（陰極）３Ｂの組合せを用いている点。
【０１０９】
なお、上記（１）および（２）以外の構成については、以上で説明したことと同じなので、ここでは、説明を省略する。
【０１１０】
まず、図３に示すように、本実施形態の細胞膜破壊装置２０は、流路幅が局部的に狭くなっている狭窄部１Ｃを有し、狭窄部１Ｃにおける流路幅が複数の細胞が通過できる程度の幅となっている流路（サンプル流入路１Ｌ、狭窄部１Ｃおよびサンプル流出路１Ｒ）を備える。
【０１１１】
サンプル流入路１Ｌは、液体試料（サンプル）を流入させる流入路である。一方、サンプル流出路１Ｒは、液体試料を流出させる流出路である。
【０１１２】
すなわち、本実施形態の細胞膜破壊装置２０は、所定の流速でサンプルを流路に流しつつ、単細胞微生物や多細胞微生物などを迅速かつ高効率に死滅させ（殺菌し）、また、迅速かつ高効率に細胞内の内容物を抽出できる構成となっている。
【０１１３】
なお、狭窄部１Ｃの幅は、１つの細胞の直径が約１０μｍなので、少なくとも、２つの細胞が通過できる２０μｍ以上であれば良い。
【０１１４】
また、筒状電極２Ｂおよび針状電極３Ｂは、狭窄部１Ｃの近傍において、溶液の流れる方向に沿って、前記流路の内部に並列配置されている。
【０１１５】
これにより、非ファラデー電流により通電状態とする領域を、狭窄部１Ｃの近傍とすることができるので、電気抵抗が大きな溶液であっても筒状電極２Ｂおよび針状電極３Ｂ間を通電させることができる。
【０１１６】
また、前記構成では、狭窄部１Ｃにおける流路幅が複数の細胞が通過できる程度の幅なので、前記特許文献２に記載された流路基板と比較して、細胞内の内容物を、迅速かつ高効率に抽出することができる。
【０１１７】
次に、図４に基づき、筒状電極２Ｂおよび針状電極３Ｂの配置方法の一例について説明する。
【０１１８】
図４に示すように、筒状電極２Ｂ（本実施形態では、円筒形であるが、これに限定されない）には、円形の左開口ＯＬ、円形の右開口（一方の開口）ＯＲが存在しており、筒状電極２Ｂの右開口ＯＲは、針状電極３Ｂが存在する方向に開放されていることが好ましい。
【０１１９】
これにより、筒状電極２Ｂと、針状電極３Ｂとの間で、広範囲に亘って溶液を通電させることができる。
【０１２０】
例えば、筒状電極２Ｂの左開口ＯＬおよび右開口ＯＲ間の距離ｄ１が、３ｃｍであり、右開口ＯＲ又は左開口ＯＬの半径を１．５ｃｍとし、筒状電極２Ｂの内側面のすべてが、針状電極３Ｂ（ほぼ、円柱とし、円の直径を１ｍｍとする）と対向（半円柱の表面が対向）しているとすると、針状電極３Ｂと筒状電極２Ｂの対向表面積比は、１：６０となる。
【０１２１】
なお、筒状電極２Ｂおよび針状電極３Ｂの配置方法は、これに限られず、例えば、筒状電極２Ｂの中心軸の方向と、針状電極３Ｂの長手方向とが一致するように配置しても良い。
【０１２２】
なお、筒状電極２Ｂおよび針状電極３Ｂ間の距離ｄ２（左開口ＯＬの開口中心Ｃと、針状電極３Ｂ間の距離）は、板電極２Ａおよび針状電極３Ａの組合せと同様に約１１ｃｍとしても良いが、これに限定されない。
【０１２３】
また、図４に示すように、溶液が流れる方向を、筒状電極２Ｂの中心軸（右開口ＯＲおよび左開口ＯＬの開口中心Ｃを通る軸）の方向と一致させることで、溶液が、その流れを妨げられることなく、筒状電極２Ｂを通過する。よって、単細胞微生物や多細胞微生物などを迅速かつ高効率に死滅させ（殺菌し）、細胞内の内容物を、迅速かつ高効率に抽出することができる。
【０１２４】
なお、以上の説明では、細胞膜破壊装置２０の筒状電極２Ｂおよび針状電極３Ｂの寸法や、電極間の距離を、細胞膜破壊装置１０の板電極２Ａおよび針状電極３Ａの寸法と同程度とした。
【０１２５】
しかしながら、前記寸法は、本実施形態と比較して非常に小さくても良く、サンプル流入路１Ｌ、狭窄部１Ｃおよびサンプル流出路１Ｒを、マイクロメートルオーダのマイクロ流路とする場合には、前記寸法もマイクロメートルオーダとなり得る。
【０１２６】
以上の構成によれば、単細胞微生物や多細胞微生物などを迅速かつ高効率に死滅させ（殺菌し）、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ迅速かつ高効率に抽出することができる。また、食品衛生や環境衛生等の検査において、検査対象となる有害菌類の細胞内の内容物を後の検査に影響を与えず、迅速かつ効率的に取り出すことができる。
【０１２７】
また、通電部６が印加する電圧の振幅を調節することにより、細胞内の内容物の変性を抑えることができる。さらに、細胞膜を破砕する際に薬品等を添加せず処理が可能で、薬品による細胞内の内容物の変性や、薬品による後の検査への影響を抑えることができる。
【０１２８】
〔３．細胞膜破壊装置１０の効果試験について〕
次に、図５（ａ）〜図７（ｂ）に基づき、上述した細胞膜破壊装置１０を試作し（以下、単に「実施例」という）効果試験を行った結果について説明する。
【０１２９】
図５（ａ）は、試作した実施例の構成を示す図である。また、図５（ａ）に示す実施例では、水槽１の中央付近に生じる局所的な電位差を観測するためのプローブ電極を設置した。次に、上記効果試験の実施手順（１〜４）について説明する。
【０１３０】
（実施手順１：使用プランクトンの調整）
まず、海水１Ｌ（またはｌ：リットル）に植物性プランクトン（以下プランクトン）培養液１０ｍｌ（１０ｍｌに含まれるプランクトン数は、約８．７×１０５個）入れて入念に撹拌したものを実験に使用した。溶液中の微生物は、アカシオヒゲムシ（Heterosigma akashiwo）＜プランクトン＞である。
【０１３１】
（実施手順２：染色液の調整）
プランクトンの観察を容易に行うため、Neutral Red（C15H17ClN4）を染色液として使用した。この染色液の特徴は、生きているプランクトンが赤く染まり、死んだプランクトンは染まらない点にある。Neutral Redはあらかじめ純水に溶かし、１％（重量％）溶液を調製した。
【０１３２】
（実施手順３：過渡電圧の印加処理）
電極は、上述した板電極２Ａおよび針状電極３Ａを使用した。また、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間には、上述した過渡電圧を印加した。水槽１にプランクトンを含む海水を約５００ｍｌ入れて処理を行った。処理回数は複数回行う。今回は４０回処理を行い、その処理に必要な時間は約４０秒であった。
【０１３３】
（実施手順４：プランクトンの染色操作および観察）
染色処理は、プランクトンを含む海水１０ｍｌに対し、Neutral Red、１％（重量％）溶液を５μｌ添加した。また、染色後、３０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、上澄みを９ｍｌ捨てた。
【０１３４】
以上のような染色処理を行った後、プランクトンの観察を顕微鏡で行った。
【０１３５】
次に、図５（ｂ）〜図７（ｂ）に基づき、上記効果試験の結果について説明する。
【０１３６】
まず、図５（ｂ）は、実施例に関し、プローブ電極間に局所的に生じた電位差の時間的変化を示すグラフである。
【０１３７】
図５（ｂ）に示すように、プローブ電極間は、ステップ関数的に約３０Ｖの電位差が瞬間的に生じ、その後、指数関数的（過渡的）にその電位差が減少している。
【０１３８】
また、図５（ｂ）では、ステップ関数的に約３０Ｖの電位差が生じてから、９ｍｓ（ミリ秒）までの経過が示されている。
【０１３９】
以上より、約１０ｍｓの間、１Ｖ以上の電位差を局所的に生じさせることが可能であることが分かった。
【０１４０】
次に、図６は、前記実施例による処理前（実験開始直後）の溶液中のプランクトンの観察結果を示す図である。
【０１４１】
図６に示すように、実施例による処理前では、プランクトンの形状がはっきりしており、染色液により赤く染まっていることから生きていることがわかる。
【０１４２】
次に、図７（ａ）は、前記実施例による処理前（実験開始直後）の溶液中のプランクトンの観察結果を示す図である。
【０１４３】
図７（ａ）に示すように、プランクトンの形状はわからなくなっており、プランクトンの残骸状のものが観察された。このことからプランクトンの膜が破壊され、内容物が出ていると考えられる。
【０１４４】
次に、図７（ｂ）は、対照実験のために別に用意した前記実施例による処理が行われていない溶液中のプランクトン（実験終了後）の観察結果を示す図である。
【０１４５】
図７（ｂ）に示すように、プランクトンの形状がはっきりしており、染色液により赤く染まっていることから、プランクトンが生きていることがわかる。また、細胞膜破壊装置１０の処理後のプランクトンと比較すると、図７（ａ）では、プランクトンが経時変化により膜が壊れたのではないことが分かる。
【０１４６】
次に、図８に基づき、細胞膜破壊装置１０の板電極２Ａおよび針状電極（針電極）３Ａ間で、溶液中に電流が実際に流れるか否かについて実験した結果を説明する。
【０１４７】
図８は、細胞膜破壊装置１０で、ＬＥＤ（light emitting diode）の電極の両端を海水の中に沈め、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に５０Ｖの過渡電圧を印加したときの様子を示している。
【０１４８】
ＬＥＤの電極の向きによって、ＬＥＤは一瞬点灯した。なお、以上より、海水中にプラズマ放電や物理的衝撃を生まないほどの電流を流すことができることが分かる。
【０１４９】
〔４．パルス処理の実験結果について〕
ところで、細胞を用いた抗体医薬製造が行われ、細胞から機能を保持したまま、簡便、かつ、効率的に生体分子を抽出する前処理方法が従来から求められている。このような前処理方法としては、界面活性剤の利用、超音波細胞破砕法やパルス電界法などが考えられるが、特にパルス電界法は、時間や印加電圧等の制御できるパラメータが多い。
【０１５０】
しかしながら、パルス電界法では外部電圧に〜１０ｋＶ程度（数ｋＶ〜数十ｋＶ）の高電圧印加がなされ、安全性の確保や高価な装置を必要とする点からも改善の余地がある。
【０１５１】
一方、上述したように、大腸菌などの原核細胞において、細胞膜自体に約１Ｖを越える電圧を印加すると、電気穿孔の修復ができず膜の破壊に至る。
【０１５２】
そこで、本願発明者らは、大腸菌内部からの酵素抽出を目的に、数Ｖ程度の極めて低電圧の電圧パルス印加により細胞膜を破砕する本実施形態の前処理方法について実験を行った。また、大腸菌内部に存在するβ-glucuronidaseと5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronideの活性を利用した高感度な検出手段である発色酵素基質法を用いて、その吸光度から酵素活性を評価し、本実施形態の前処理方法と上記検出法の一連のプロセスの有効性を確認した。
【０１５３】
実験では、使用菌株として大腸菌（Escherichia coli : ＤＨ５α, 東洋紡）を用い、ＬＢ液体培地（Difco: Tryptone １０ｇ／Ｌ, Yeast extract ５ｇ／Ｌ, ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ）で３７℃、１２時間以上振とう培養した（ＴＡＩＴＥＣ，ＢＲ−４０ＬＦ）。
【０１５４】
培養液用比色計（ＷＰＡ，ＣＯ８０００ Ｂｉｏｗａｖｅ）で培養液のＯ．Ｄ．を測定し、ＬＢ液体培地を加えＯ．Ｄ．＝０．４±０．０５に調整した後、試料溶液とした（約１０８ ｃｆｕ／ｍＬ）。なお、「Ｏ．Ｄ．」は、Optical Density（光学濃度または光学密度）の略であり、以降、単にＯ．Ｄ．という。また、「ｃｆｕ」は、Colony Forming Unit（コロニーフォーミングユニット）の略である。
【０１５５】
次にコンデンサ容量３０００μＦ（マイクロ・ファラッド）、信号発生器（ＮＦ， １９１５）、多出力直流安定化電源（ＴＥＸＩＣＯ， ＰＷ３６−１．５ＡＤ）を用いて、パルス電源を構築し、出力パルスはデジタルオシロスコープ（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ， ＴＤＳ１００１Ｂ）で観察した。
【０１５６】
図９に実験で使用したパルス出力系の概略図（回路図）とパルス形状の一例を示す。処理槽（円筒形、内径２０ｍｍ）にはタングステン電極を用い、針電極を負、平板電極を正とし、電極間は２ｍｍに固定した。試料溶液を処理槽に４ｍＬ分注し、平板電極下に設置したスタラーで攪拌しつつパルス電圧で処理した。
【０１５７】
また、検査試薬の調整のため、5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide Cyclohexylammonium Saltを、N,N-dimethylformamide（ＤＭＦ）溶媒で１９．２ｍＭに調整し（共に和光純薬工業）、２００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４水溶液と２００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４水溶液を３．３：６．７（体積：体積）で混合したリン酸緩衝液を用いて９倍量で希釈し、基質溶液とした。パルス電圧印加後の各サンプルを分注し、基質溶液と１：１で混合した後、３７℃、１６時間以上酵素反応させ、紫外可視分光光度計（日本分光， Ｖ−５５０）でＯ．Ｄ．の波長分布を計測した。
【０１５８】
従来から、大腸菌や大腸菌群の確認は、簡便・迅速さを目的に、蛍光や発色により判断できる酵素基質法や抗原抗体法が提案されている。特に大腸菌や大腸菌群に特異的に存在する酵素β-glucuronidaseまたはβ-galactosidaseに着目し、5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide（Ｘ‐ｇｌｕｃ）や5-Bromo-４-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside（Ｘ‐ｇａｌ）を用いている。
【０１５９】
また、菌の濃度が低い場合においても、分光光度計を用いたＯ．Ｄ．から評価できる。本明細書では、低電圧による電圧パルス処理後の、内容物をより効率的に取り出す指針（パルス条件）を得るため、寒天培地上ではなく感度が高い分光光度計を用いて評価した。
【０１６０】
図１１に大腸菌培養液とパルス処理後（５Ｈｚ，５Ｖ，パルス回数１０００回）のＯ．Ｄ．を示す。５００〜７５０ｎｍの範囲でＯ．Ｄ．の上昇が、パルス処理の有無に関係なく共に観測されたが、パルス処理を施した際、Ｏ．Ｄ．より大きく増加する結果が得られた。
【０１６１】
次に、パルス形状（周波数と電圧）に対する、波長６１５ｎｍにおけるＯ．Ｄ．依存性を確認した。図１２に、１Ｈｚ，５Ｈｚ，１０Ｈｚ各々の周波数で、パルス処理回数を１０００回に固定し、１Ｖ，５Ｖ，１０Ｖの電圧を印加した結果を示す。
【０１６２】
この時、波長６１５ｎｍに対して波長７５０ｎｍのＯ．Ｄ．をバックグラウンドとして実測値から補正した（Ａｂｓ６１５−Ａｂｓ７５０）。
【０１６３】
５Ｖと１０Ｖのパルス処理時には、未処理に比べてＯ．Ｄ．の変化が観測されたが、１Ｖ時は、パルス処理を行わない場合に比べて有意な差は認められなかった。さらに、５Ｈｚを測定条件として固定し、処理時間に対するＯ．Ｄ．を測定した結果を図１３に示す（パルス処理時間５００，１０００，１５００ｓｅｃ）。
【０１６４】
定性的には処理時間に伴うＯ．Ｄ．の増加がみられ、処理時間が増加するに従ってＯ．Ｄ．が飽和した後、減少する傾向が５Ｖで観測された。一方、１０Ｖの場合は処理時間（５００，１０００，１５００ｓｅｃ）に関わらず同程度のＯ．Ｄ．を示し、この条件ではパルス処理によるβ-glucuronidaseの検出は困難であった。
【０１６５】
以上より、数Ｖ程度の極めて低電圧の電圧パルスによって細胞内に含まれる酵素を高効率に細胞外へ取り出せることが示された。よって、本実施形態の前処理方法（細胞膜破壊装置１０および２０）によれば、低電圧で、かつ細胞膜破壊の効率が高い細胞膜破壊装置１０を提供することが可能となる。例えば、本実施形態のパルス電圧の振幅は、１Ｖ以上、１００Ｖ以下であることが好ましい。
【０１６６】
なお、本発明は、以下のように表現することもできる。
【０１６７】
すなわち、本発明の細胞膜破壊装置は、放電による衝撃を生まない程度の低電圧によるパルス電流を海水中に効率よく広範囲に流しても良い。
【０１６８】
これにより、海水中微生物から細胞内の内容物を、その損傷を回避しつつ、効率良く抽出することができる。
【０１６９】
また、簡単な構成でも、抽出処理の処理速度が速く、小規模の装置を構成できるので、船舶への搭載も可能な細胞膜破壊装置を提供できる。
【０１７０】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、放電による衝撃を生まない程度の低電圧によるパルス電流をサンプルに流しても良い。これにより、細胞膜を迅速かつ高効率に破壊できる。
【０１７１】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、パルス電流を細胞膜破砕処理用の流路に流し、流路を流れるサンプルに複数回パルス電流を流しても良い。これにより、サンプル中に含まれる有害細菌類の細胞膜を破壊することができる。
【０１７２】
さらに、以上の構成によれば、食品衛生や環境衛生等の検査において、検査対象となる有害菌類の細胞内の内容物を後の検査に影響を与えず、迅速かつ効率的に取り出す手法を提供することができる。
【０１７３】
また、本発明は、以下のように表現することもできる。
【０１７４】
すなわち、本発明の細胞膜破壊装置は、プラズマ放電や物理的衝撃を生まない程度の低電圧によるパルス電流を複数回流しても良い。これにより、効率よく海水中微生物を処理することができる。
【０１７５】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、正電極に比べ、表面積の小さな負電極の構造を持たせても良い。これにより、低電圧であっても広範囲かつ高速に処理できる。
【０１７６】
以上の構成によれば、処理用の薬剤などを添加することなく微生物処理が可能であり、排水時に二次処理を行う必要がない。また、小規模な装置が見込まれ、配管系に設置することも可能である。
【０１７７】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、プラズマ放電や物理的衝撃を生まない程度の低電圧によるパルス電流を複数回流しても良い。これにより、細胞膜を破砕し、高効率に細胞内の内容物を取り出すことができる。
【０１７８】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、細胞膜破砕用の流路はパルス電流を流す構造を複数個有しても良い。
【０１７９】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、パルス電流が流れる部分は局部的に流路が絞られていても良い。これにより、電気抵抗が大きなサンプルであってもパルス電流を通電させることができる。
【０１８０】
〔付記事項〕
なお、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組合せて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１８１】
本発明は、大腸菌、レジオネラ菌、Ｏ‐１５７、サルモネラ菌などの有害細菌を効率的に死滅させる殺菌装置、細胞内の内容物を効率的に抽出する抽出装置、細胞内の内容物を効率的に抽出すると共に、抽出した内容物の分析を行う分析装置などに広く適用することができる。
【符号の説明】
【０１８２】
１ 水槽
１Ｌ サンプル流入路（流路）
１Ｒ サンプル流出路（流路）
１Ｃ 狭窄部（流路）
２Ａ 板電極（陽極）
２Ｂ 筒状電極（陽極）
３Ａ、３Ｂ 針状電極（陰極）
４Ｌ、４Ｒ セラミックチューブ
５Ｌ、５Ｒ 接続配線
６ 通電部（通電手段）
７Ｌ、７Ｒ 接続端子
１０ 細胞膜破壊装置
２０ 細胞膜破壊装置
Ｃ 開口中心
ＯＬ 左開口
ＯＲ 右開口（一方の開口）
ｄ１、ｄ２ 距離
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中に含まれる細胞の細胞膜を破壊する細胞膜破壊装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、薬品や超音波などを用いることなく電気的手法を用いて溶液中に含まれる細胞の細胞膜を破壊（殺菌）する技術として、高電圧パルス、水中放電、もしくは、水中に発生する衝撃波を利用するものがある。
【０００３】
また、電気的手法を用いて細胞膜を破壊し、細胞内の生体物質（内容物）を抽出する技術としては、特許文献１に開示された生体物質を抽出する方法がある。
【０００４】
この方法では、細胞内の生体物質を抽出するために、容積がμｌ（マイクロ・リットル）程度のチャンバの外側に電極を設けて１Ｖ（ボルト）〜１００Ｖ程度の交流電場を、比較的長時間、連続的に試料に印加している。
【０００５】
その他、電気的手法を用いて細胞の細胞膜を破壊する技術としては、特許文献２に開示された流路基板がある。
【０００６】
この流路基板では、流路の一部を局部的に１つの細胞のサイズよりも狭くした狭窄部とし、該狭窄部で細胞を補足して、細胞破砕電圧を印加している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開２００５／０８３０７８号明細書（２００５年０９月０９日国際公開）
【特許文献２】特開２００８−２５９４９１号公報（２００８年１０月３０日公開）
【特許文献３】特開２００７−１７４９０１（２００７年７月１２日公開）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、前記高電圧パルス、水中放電、もしくは、水中に発生する衝撃波を利用する技術では、高電圧の印加、もしくは、放電や衝撃波による物理的衝撃のため、細胞内の内容物が損傷してしまうという問題点があった。
【０００９】
前記特許文献１に開示された方法では、１回の電圧印加処理では、容積がμｌ程度の小さなチャンバの容積に応じた溶液しか処理できないので、１つのチャンバでは、多量の溶液を迅速に処理できないという問題点があった。また、１Ｖ〜１００Ｖ程度の交流電場を、比較的長時間、連続的に試料に印加しているので、細胞内の内容物が損傷してしまう可能性もある。
【００１０】
さらに、前記特許文献２に開示された流路基板では、細胞の１つ１つを、１つの細胞のサイズよりも狭い狭窄部で補足して破壊しているので、細胞内の内容物を迅速に効率良く抽出できないという問題点があった。
【００１１】
本発明は、前記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ抽出することができる細胞膜破壊装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の細胞膜破壊装置は、前記課題を解決するために、所定の濃度の電解質と、所定の濃度の細胞とを含む溶液中に、互いに対向して配置された、陽極と、前記陽極よりも表面積が小さい針状電極である陰極とを備え、前記陽極および前記陰極間に存在する溶液中に、前記電解質が電離した電解質イオンの移動による電流を発生させて、前記陽極および前記陰極間を通電状態とする通電手段を備えることを特徴とする。
【００１３】
前記構成によれば、通電手段は、陽極および陰極間に存在する溶液中に、電解質が電離した電解質イオンの移動による電流（非ファラデー電流）を発生させて、陽極および前記陰極間を（瞬間的に）通電状態とする。
【００１４】
ここで、非ファラデー電流が流れる時間は、電解質イオンの移動が開始されてから陽極および陰極の周りに電気二重層が形成されるまでの時間であり、約１０ｍｓ（ミリ秒）程度であることが知られている。よって、このとき、陽極および陰極間に存在する溶液中のいたるところ（厳密には電解質イオンの流れが存在しているところ）で、瞬間的に局所的な電位差（電圧）が生じる。
【００１５】
また、陽極および陰極を同一の構成材料とすれば、陽極および陰極の溶出を抑制することができ、また、非ファラデー電流が流れた後は、陽極および陰極間の溶液中は、電気的に中性となって、電位差もほとんどない電解液バルクが形成される。
【００１６】
これにより、陽極および陰極間の存在する溶液中のいたるところに存在する細胞は、約１０ｍｓ程度の間のみ、前記瞬間的な電圧に晒されることになる。
【００１７】
また、前記瞬間的な電圧の大きさが、非ファラデー電流が流れる時間、常に約１Ｖ以上であれば、細胞の細胞膜は、非可逆的に破壊される。このため、単一若しくは複数の細胞からなる微生物、すなわち、単細胞微生物や多細胞微生物などを死滅させる（殺菌する）ことが可能となる。また、これにより、細胞内の内容物を抽出することも可能となる。
【００１８】
よって、以上の構成によれば、前記特許文献１の方法と比較して、細胞が長時間、電圧に晒されることがないので、細胞内の内容物の損傷を抑制しつつ、細胞膜を非可逆的に破壊し、細胞内の内容物を抽出することができる。
【００１９】
以上より、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ抽出することができる。
【００２０】
また、前記構成では、陰極は、陽極よりも表面積が小さい針状電極である。これにより、陽極および陰極間に印加される電圧の大きさが多少小さくても、広範囲に亘って溶液を通電させることができる。よって、細胞の細胞膜を、迅速かつ高効率に破壊することができる。これにより、単細胞微生物や多細胞微生物などを迅速かつ高効率に死滅させる（殺菌する）ことが可能となる。また、細胞内の内容物を、迅速かつ高効率に抽出することができる。
【００２１】
以上より、本発明の細胞膜破壊装置によれば、溶液中の細胞、または、単一若しくは複数の細胞からなる微生物を迅速かつ高効率に死滅させ、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ迅速かつ高効率に抽出することができる。
【００２２】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、前記課題を解決するために、所定の濃度の電解質と、所定の濃度の細胞とを含む溶液中に、互いに対向して配置された、陽極と、陰極とを備え、前記陽極および前記陰極間に存在する溶液中に、前記電解質が電離した電解質イオンの移動による電流を発生させて、前記陽極および前記陰極間を通電状態とする通電手段を備えることを特徴とする。
【００２３】
前記構成によれば、通電手段は、陽極および陰極間に存在する溶液中に、非ファラデー電流を発生させて、陽極および前記陰極間を（瞬間的に）通電状態とする。
【００２４】
ここで、上記のように、非ファラデー電流が流れる時間は、電解質イオンの移動が開始されてから陽極および陰極の周りに電気二重層が形成されるまでの時間であり、約１０ｍｓ程度である。よって、このとき、陽極および陰極間に存在する溶液中のいたるところで、瞬間的に局所的な電位差が生じる。
【００２５】
また、陽極および陰極を同一の構成材料とすれば、陽極および陰極の溶出を抑制することができ、また、非ファラデー電流が流れた後は、陽極および陰極間の溶液中は、電気的に中性となって、電位差もほとんどない電解液バルクが形成される。
【００２６】
これにより、陽極および陰極間の存在する溶液中のいたるところに存在する細胞は、約１０ｍｓ程度の間のみ、前記瞬間的な電圧に晒されることになる。
【００２７】
また、前記瞬間的な電圧の大きさが、非ファラデー電流が流れる時間、常に約１Ｖ以上であれば、細胞の細胞膜は、非可逆的に破壊される。このため、単一若しくは複数の細胞からなる微生物、すなわち、単細胞微生物や多細胞微生物などを死滅させる（殺菌する）ことが可能となる。また、これにより、細胞内の内容物を抽出することも可能となる。
【００２８】
よって、以上の構成によれば、前記特許文献１の方法と比較して、細胞が長時間、電圧に晒されることがないので、細胞内の内容物の損傷を抑制しつつ、細胞膜を非可逆的に破壊し、細胞内の内容物を抽出することができる。
【００２９】
以上より、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ抽出することができる。
【００３０】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、前記構成に加えて、前記陽極は、筒形状の筒状電極であり、前記筒状電極の一方の開口は、前記陰極が存在する方向に開放されていても良い。
【００３１】
前記構成によれば、筒状電極の一方の開口は、陰極が存在する方向に開放されている。これにより、筒状電極と、針状電極との間で、広範囲に亘って溶液を通電させることができる。
【００３２】
また、溶液が流れる方向を、筒状電極の中心軸の方向と一致させることで、溶液が、その流れを妨げられることなく、筒状電極を通過する。よって、溶液中の細胞、または、単一若しくは複数の細胞からなる微生物を迅速かつ高効率に死滅させ、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ迅速かつ高効率に抽出することができる。
【００３３】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、前記構成に加えて、前記陽極は、平板状の板電極であっても良い。
【００３４】
前記構成によれば、板電極と針状電極との配置を調整することで、板電極と、針状電極との間で、広範囲に亘って溶液を通電させることができる。よって、溶液中の細胞、または、単一若しくは複数の細胞からなる微生物を迅速かつ高効率に死滅させ、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ迅速かつ高効率に抽出することができる。
【００３５】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、前記構成に加えて、前記通電手段は、前記陽極および前記陰極間に放電が生じない程度の振幅を有するパルス電圧を少なくとも１回、印加することで、前記電解質イオンの移動による電流（非ファラデー電流）を溶液中に発生させても良い。
【００３６】
ここで、陽極および陰極間に、一定電圧を印加することなく、パルス電圧を印加するのは、溶液中に長時間、電流が流れないようにして、細胞内の内容物の損傷を抑制するためである。
【００３７】
また、パルス電圧の印加回数は、１回でも良いが、パルス電圧の印加回数を大きくする程、単細胞微生物や多細胞微生物などを高効率に死滅させ（殺菌し）、細胞内の内容物を、高効率に抽出することができる。
【００３８】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、前記構成に加えて、電荷を蓄積することが可能なコンデンサを備え、前記通電手段は、前記コンデンサに蓄えられた電荷を放電させることにより発生する、前記陽極および前記陰極間に放電が生じない程度の大きさで過渡的に減少する過渡電圧を、少なくとも１回、印加することで、前記電解質イオンの移動による電流（非ファラデー電流）を溶液中に発生させても良い。
【００３９】
ここで、陽極および陰極間に、一定電圧を印加することなく、過渡電圧を印加するのは、溶液中に長時間、電流が流れないようにして、細胞内の内容物の損傷を抑制するためである。
【００４０】
また、過渡電圧の印加回数は、１回でも良いが、過渡電圧の印加回数を大きくする程、単細胞微生物や多細胞微生物などを高効率に死滅させ（殺菌し）、細胞内の内容物を、高効率に抽出することができる。
【００４１】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、前記構成に加えて、流路幅が局部的に狭くなっている狭窄部を有し、該狭窄部における流路幅が複数の細胞が通過できる程度の幅となっている流路を備え、前記陽極および前記陰極が、前記狭窄部の近傍において、溶液の流れる方向に沿って、前記流路の内部に並列配置されていても良い。
【００４２】
前記構成によれば、通電状態とする領域を、狭窄部の近傍とすることができるので、電気抵抗が大きな溶液であっても陽極および陰極間を通電させることができる。
【００４３】
また、前記構成では、狭窄部における流路幅が複数の細胞が通過できる程度の幅なので、前記特許文献２に記載された流路基板と比較して、単細胞微生物や多細胞微生物などを迅速かつ高効率に死滅させ（殺菌し）、細胞内の内容物を、迅速かつ高効率に抽出することができる。
【発明の効果】
【００４４】
本発明の細胞膜破壊装置は、以上のように、所定の濃度の電解質と、所定の濃度の細胞とを含む溶液中に、互いに対向して配置された、陽極と、前記陽極よりも表面積が小さい針状電極である陰極とを備え、前記陽極および前記陰極間に存在する溶液中に、前記電解質が電離した電解質イオンの移動による電流を発生させて、前記陽極および前記陰極間を通電状態とする通電手段を備える構成である。
【００４５】
本発明の細胞膜破壊装置は、以上のように、所定の濃度の電解質と、所定の濃度の細胞とを含む溶液中に、互いに対向して配置された、陽極と、陰極とを備え、前記陽極および前記陰極間に存在する溶液中に、前記電解質が電離した電解質イオンの移動による電流を発生させて、前記陽極および前記陰極間を通電状態とする通電手段を備える構成である。
【００４６】
それゆえ、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ抽出することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の一実施形態である細胞膜破壊装置の概要構成を示す模式図である。
【図２】（ａ）は、前記細胞膜破壊装置による処理前の溶液の様子を示す図であり、（ｂ）は、処理後の溶液の様子を示す図であり、（ｃ）は、処理回数と、溶液内の海水中微生物の生存率との関係を示すグラフである。
【図３】本発明の他の実施形態である細胞膜破壊装置の概要構成を示す模式図である。
【図４】前記細胞膜破壊装置に関し、筒状電極と針状電極の配置方法の一例を示す模式図である。
【図５】（ａ）は、前記細胞膜破壊装置の一実施例の構成を示す図であり、（ｂ）は、前記実施例に関し、プローブ電極間に局所的に生じた電位差の時間的変化を示すグラフである。
【図６】前記実施例による処理前（実験開始直後）の溶液中のプランクトンの観察結果を示す図である。
【図７】（ａ）は、前記実施例による処理前（実験開始直後）の溶液中のプランクトンの観察結果を示す図であり、（ｂ）は、対照実験のために別に用意した前記実施例による処理が行われていない溶液中のプランクトン（実験終了後）の観察結果を示す図である。
【図８】板電極および針状電極（針電極）間で、溶液中に電流が実際に流れている様子を実験的に示す図である。
【図９】パルス処理を行うための測定装置の構成を示す回路図と、板電極および針状電極（針電極）間に印加されるパルス電圧のパルス波形（５Ｈｚ，５Ｖ）を示すグラフである。
【図１０】処理用容器の概要構成を示す図である。
【図１１】パルス電圧を印加したとき（５Ｈｚ，５Ｖ，１０００回）、および、パルス電圧を印加していないとき、における波長とＯ．Ｄ．（Optical Density）との関係を示すグラフである。
【図１２】波長６１５ｎｍにおけるＯ．Ｄ．の周波数依存性を示すグラフである。
【図１３】波長６１５ｎｍにおけるＯ．Ｄ．の処理時間依存性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本発明の一実施形態について図１〜図１３に基づいて説明すれば、次の通りである。以下の特定の項目で説明すること以外の構成は、必要に応じて説明を省略する場合があるが、他の項目で説明する構成と同じである。また、説明の便宜上、各項目に示した部材と同一の機能を有する部材については、同一の符号を付し、適宜その説明を省略する。
【００４９】
〔１．細胞膜破壊装置１０について〕
まず、図１および図２（ａ）〜（ｃ）に基づき、本発明の一実施形態である細胞膜破壊装置１０について説明する。図１は、細胞膜破壊装置１０の概要構成を示す模式図である。
【００５０】
図１に示すように、細胞膜破壊装置１０は、水槽１、板電極（陽極）２Ａ、針状電極（陰極）３Ａ、セラミックチューブ４Ｌ、４Ｒ、接続配線５Ｌ、５Ｒ、通電部（通電手段）６、接続端子７Ｌ、Ｒを備える。
【００５１】
細胞膜破壊装置１０は、液体試料（溶液）中に含まれる細胞（または、微生物に含まれる複数の細胞）の細胞膜を破壊して、単一または複数の細胞からなる微生物、すなわち、単細胞微生物または多細胞微生物を死滅させ（殺菌し）、細胞内の内容物を抽出するものである。
【００５２】
ここで、抽出は、少なくとも１つ以上の細胞内の内容物を解放することであり、細胞の内容物が周囲の液体中に拡散されるように、細胞壁または細胞バリアを開放または破裂させることである。
【００５３】
水槽１には、本実施形態では、液体試料としてバラスト水（微生物を含む海水）が注入されるが、このような液体試料に限定されない。なお、海水中に含まれる食塩（電解質）の濃度は、通常、０．７Ｍ（Ｍは、ｍｏｌ／ｌ：モル／リットル）程度である。
【００５４】
上述のように、微生物は、単一の細胞からなる単細胞微生物であっても良いし、複数の細胞からなる多細胞微生物であっても良い。また、微生物は、古細菌微生物、真性細菌微生物、および真核細胞微生物などであれば良く、例えば、細菌、細菌胞子、ウィルス、真菌、および真菌胞子などである。
【００５５】
真核細胞は、例えば、植物細胞、植物胞子、動物細胞、および哺乳動物細胞などである。哺乳動物細胞は、例えば、ヒト細胞、白血球、および有核赤血球などである。
【００５６】
細胞内の内容物は、細胞小器官、遺伝物質、およびタンパク質などを含む。遺伝物質は、染色体、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、任意のタイプのリボ核酸（ＲＮＡ：例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ）などを含む。
【００５７】
タンパク質は、酵素、構造タンパク質、輸送タンパク質、イオンチャネル、毒素、ホルモン、および受容体などを含む。
【００５８】
また、液体試料は、綿棒で採取された皮膚試料、脳脊髄液、血液、唾液、気管支-肺胞洗浄物、気管支吸引物、肺組織および尿などの生体試料であっても良い。
【００５９】
また、液体試料は、核酸増幅を実施するのに必要とされる１種又は２種以上の試薬を含んでいても良い。
【００６０】
さらに、液体試料は、プライマー、核酸、デオキシヌクレオシド三リン酸、および核酸ポリメラーゼなどの試薬を含んでよい。
【００６１】
次に、板電極２Ａおよび針状電極３Ａは、図１に示すように、板電極２Ａの表面積が大きい方の表面に対して、針状電極３Ａの長手方向が垂直となるように、互いに対向して配置される。なお、板電極２Ａおよび針状電極３Ａの配置方法は、これに限られず、例えば、板電極２Ａの表面積が大きい方の表面に対して、針状電極３Ａの長手方向が平行となるように、互いに対向して配置されていても良い。
【００６２】
板電極２Ａは、陽極で、本実施形態では、表面積が大きい方の表面が、縦３ｃｍ、横３ｃｍの矩形である平板状の板電極であるが、その寸法、および、形状は、これに限られない。また、板電極２Ａの構成材料は、本実施形態では、タングステンであるが、これに限定されない。
【００６３】
一方、本実施形態の針状電極３Ａは、陰極で、板電極２Ａよりも表面積が小さい針状（または棒状）の電極であり、その構成材料は、本実施形態では、タングステンであるが、その寸法、形状および構成材料はこれらに限定されない。なお、板電極２Ａおよび針状電極３Ａの構成材料は、上述したタングステンの他、白金、金、炭素、銀、銅などを用いても良い。
【００６４】
また、以下で説明するように、板電極２Ａおよび針状電極３Ａの溶出を抑制するため、板電極２Ａおよび針状電極３Ａを同一の構成材料で構成することが好ましい。
【００６５】
また、針状電極３Ａの短手方向の断面の直径は、約１ｍｍである。このとき、針状電極３Ａと板電極２Ａとの対向表面積比は、１：１１４６である。
【００６６】
なお、通電状態となる範囲をできるだけ広くするためには、針状電極３Ａに対する板電極２Ａの対向表面積比は、できるだけ大きくなるように設計することが好ましい。
【００６７】
また、針状電極３Ａと板電極２Ａの電極間距離は、本実施形態では、約１１ｃｍであるが、これに限られない。
【００６８】
なお、板電極２Ａは、水槽１に設けられた嵌挿孔（不図示）に絶縁体であるセラミックチューブ４Ｌを介して嵌挿され、接続端子７Ｌと電気的に接続されている。一方、針状電極３Ａは、水槽１に設けられた嵌挿孔（不図示）に絶縁体であるセラミックチューブ４Ｒを介して嵌挿され、接続端子７Ｒと電気的に接続されている。
【００６９】
以上の構成によれば、板電極２Ａと針状電極３Ａとの配置を調整することで、後述する通電部６により、板電極２Ａと、針状電極３Ａとの間で、広範囲に亘って溶液を（瞬間的に）通電させることができる。
【００７０】
通電部６は、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に存在する溶液中に、電解質が電離した電解質イオン（海水の場合は、ナトリウムイオンと、塩素イオンなど）の移動による非ファラデー電流を発生させて、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間を（瞬間的に）通電状態とする。
【００７１】
また、通電部６は、静電容量が７５０μＦのコンデンサ（不図示）を備え、約５０Ｖの電圧をコンデンサに印加して蓄えられた電荷を放電させることにより発生する、過渡的に減少する過渡電圧を少なくとも１回、印加している。なお、この過渡電圧により、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間には、放電は生じない。
【００７２】
なお、本実施形態の細胞膜破壊装置１０における上記コンデンサの静電容量は、数μＦ程度〜数千μＦ程度であり、従来手法でのコンデンサの静電容量である数ｎＦ程度と比較して圧倒的に大きい。例えば、本実施形態の細胞膜破壊装置１０におけるコンデンサの静電容量は、１０μＦ以上、９０００μ以下とすることが好ましい。
【００７３】
ここで、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に、一定電圧を印加することなく、過渡電圧を印加するのは、溶液中に長時間、電流が流れないようにして、細胞内の内容物の損傷を抑制するためである。
【００７４】
次に、非ファラデー電流が流れる時間は、電解質イオンの移動が開始されてから板電極２Ａおよび針状電極３Ａの周りに電気二重層が形成されるまでの時間であり、約１０ｍｓ（ミリ秒）程度であることが知られている。よって、このとき、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に存在する溶液中のいたるところ（厳密には電解質イオンの流れが存在しているところ）で、瞬間的に局所的な電位差（電圧）が生じる。
【００７５】
また、本実施形態では、板電極２Ａおよび針状電極３Ａを同一の構成材料とすれば、板電極２Ａおよび針状電極３Ａの溶出を抑制することができ、また、非ファラデー電流が流れた後は、陽極および陰極間の溶液中は、電気的に中性となって、電位差もほとんどない電解液バルクが形成される。
【００７６】
これにより、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間の存在する溶液中のいたるところに存在する細胞は、約１０ｍｓ程度の間のみ、前記瞬間的な電圧に晒されることになる。
【００７７】
ここで、溶液中の細胞の細胞膜が、どの程度の時間、どの程度の大きさの電圧に晒されると非可逆的に破壊されるかについて検討する。
【００７８】
仮に、半径ａの細胞に一様な電界Ｅを時刻ｔ＝０においてステップ状に印加した時、細胞膜にかかる膜電圧Ｖ（θ）の時間変化は、
【００７９】
【数１】
【００８０】
【数２】
【００８１】
で与えられる（特許文献３参照）。
【００８２】
ただし、θは、電界Ｅの方向をθ＝０ととった時の、細胞中心を原点とする極座標の天頂角、τは、時定数、Ｃは、細胞膜の単位面積あたりの静電容量、ρｉｎ、ρｏｕｔは、それぞれ、細胞内液および外液の抵抗率である。
【００８３】
しかしながら、式（１）は、球形の完全な膜が存在する時の膜電圧を与えるもので、電圧の印加により膜の一点にポアが形成された場合は、膜電圧の分布がこの式から大きく異なることになる。
【００８４】
すなわち、式（１）は、細胞膜にかかる電圧の大きさは、電気力線の最上流側（北極：θ＝０）の位置および最下流側（南極：θ＝π）の位置で最大となることを示しているので、電圧を印加した場合、まず、このいずれかの位置にポアが形成されることが予想される。
【００８５】
すると、ここを通して電流が流れ、他方の極の充電がさらにすすみ、ここには、式（１）で与えられる以上の過大な電圧がかかることになり、この位置が非可逆的に破壊されると考えられる。このようにして、いわば将棋倒しのように細胞膜の別の位置に過電圧が伝搬する現象により、細胞が破壊される。
【００８６】
ここで、細胞膜の単位面積あたりの静電容量Ｃは、細胞種によらず１μＦ／ｃｍ２（マイクロ・ファラッド／平方センチメートル）程度であることが知られている。よって、式（２）の細胞膜の充電の時定数τは、例えば、半径ａ＝５μｍ（マイクロメートル）の細胞に対して、周囲の媒質が生理食塩水濃度１．５４ｍＭ程度の溶液である場合には、時定数τ＝４０ｎｓ（ナノ秒）程度、周囲の媒質が１ｍＭ程度の低濃度の食塩溶液である場合には、時定数τ＝２μｓ（マイクロ秒）程度である。
【００８７】
従って、細胞膜に不可逆的破壊を起こすためには、これより長い時間、約１Ｖ以上の電圧が細胞に印加されれば良いことになる。
【００８８】
上述した時定数τ＝４０ｎｓ程度、および時定数τ＝２μｓ程度の値のいずれも、非ファラデー電流が流れる時間である約１０ｍｓよりもかなり小さい。
【００８９】
すなわち、前記瞬間的な電圧の大きさが、非ファラデー電流が流れる時間、常に約１Ｖ以上であれば、細胞の細胞膜は、非可逆的に破壊されると考えられる。
【００９０】
よって、以上の構成によれば、前記特許文献１の方法と比較して、細胞が長時間、電圧に晒されることがないので、細胞内の内容物の損傷を抑制しつつ、細胞膜を非可逆的に破壊することができる。すなわち、単細胞微生物や多細胞微生物などを死滅させる（殺菌する）ことができる。また、これにより、細胞内の内容物を抽出することも可能となる。
【００９１】
例えば、図２（ａ）は、細胞膜破壊装置１０による処理前に、水槽１内の溶液の一部を取り出して観察したときの様子である。一方、図２（ｂ）は、細胞膜破壊装置１０による処理後に、水槽１内の溶液の一部を取り出して観察したときの様子である。
【００９２】
図２（ｂ）に示すように、細胞膜破壊装置１０により処理の後は、溶液中の細胞の細胞膜が非可逆的に破壊されていることが分かる。
【００９３】
また、前記構成では、針状電極３Ａは、板電極２Ａよりも表面積が小さい針状電極である。これにより、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に印加される電圧の大きさが多少小さくても、広範囲に亘って溶液を通電させることができる。よって、溶液中の細胞、または、単一若しくは複数の細胞からなる微生物を高効率に死滅させ、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ高効率に抽出することができる。
【００９４】
以上より、細胞膜破壊装置１０によれば、溶液中の細胞、または、単一若しくは複数の細胞からなる微生物を迅速かつ高効率に死滅させ、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ迅速かつ高効率に抽出することができる。
【００９５】
また、細胞膜破壊装置１０は、非常に簡単な構成なので、バラスト水処理装置として使用すれば、大型、小型のいずれの船舶への搭載も可能である。また、処理用の薬剤などを添加することなく微生物の処理が可能であり、排水時に二次処理を行う必要がない。また、バラスト水処理装置として小規模な装置の実現が可能であり、配管系に設置することも可能である。
【００９６】
次に、上述した通電部６が、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に印加する過渡電圧の印加回数は、１回でも良いが、過渡電圧の印加回数を大きくする程、細胞内の内容物を、高効率に抽出することができる。
【００９７】
例えば、図２（ｃ）のグラフに示すように、実際に、細胞膜破壊装置１０による処理回数が少ないときは、細胞の生存率は、３８％程度であったものが、処理回数を多くすることにより、生存率は、０％となった。
【００９８】
なお、本実施形態では、通電部６は、コンデンサの放電現象を利用したものを採用したが、通電部６の構成は、これに限定されない。
【００９９】
例えば、通電部６としてパルス電圧発生器（不図示）を用い、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に放電が生じない程度の振幅を有するパルス電圧を少なくとも１回、印加することで、前記非ファラデー電流を溶液中に発生させても良い。
【０１００】
なお、パルス電圧のパルス幅（時間）は、時定数τよりも大きいことが好ましいが、細胞の内容物の損傷を抑制するには、できるだけ短い方が好ましい。
【０１０１】
また、パルス電圧の大きさは、上述したコンデンサによる放電を参考に約５０Ｖとすることが考えられるが、これに限られない（以下の４．パルス処理の実験結果について参照）。
【０１０２】
また、パルス電流は、極性反転を起こさない、いわゆる、単極性のパルスであることが好ましいが、必要に応じて両極性のパルスとしても良い。
【０１０３】
ここで、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に、一定電圧を印加することなく、パルス電圧を印加するのは、溶液中に長時間、電流が流れないようにして、細胞内の内容物の損傷を抑制するためである。
【０１０４】
また、パルス電圧の印加回数は、１回でも良いが、パルス電圧の印加回数を大きくする程、単細胞微生物や多細胞微生物などを高効率に死滅させ（殺菌し）、細胞内の内容物を、高効率に抽出することができる。
【０１０５】
〔２．細胞膜破壊装置２０について〕
次に、図３および図４に基づき、本発明の他の実施形態である細胞膜破壊装置２０の構成について説明する。図３は、細胞膜破壊装置２０の概要構成を示す模式図である。
【０１０６】
図３に示すように、細胞膜破壊装置２０が、上述した細胞膜破壊装置１０と異なっている点は、以下のとおりである。
【０１０７】
（１）水槽１に替えて、サンプル流入路（流路）１Ｌ、狭窄部（流路）１Ｃ、サンプル流出路（流路）１Ｒからなる流路を用いている点。
【０１０８】
（２）板電極２Ａおよび針状電極３Ａの組合せに替えて、筒状電極２Ｂ（陽極）および針状電極（陰極）３Ｂの組合せを用いている点。
【０１０９】
なお、上記（１）および（２）以外の構成については、以上で説明したことと同じなので、ここでは、説明を省略する。
【０１１０】
まず、図３に示すように、本実施形態の細胞膜破壊装置２０は、流路幅が局部的に狭くなっている狭窄部１Ｃを有し、狭窄部１Ｃにおける流路幅が複数の細胞が通過できる程度の幅となっている流路（サンプル流入路１Ｌ、狭窄部１Ｃおよびサンプル流出路１Ｒ）を備える。
【０１１１】
サンプル流入路１Ｌは、液体試料（サンプル）を流入させる流入路である。一方、サンプル流出路１Ｒは、液体試料を流出させる流出路である。
【０１１２】
すなわち、本実施形態の細胞膜破壊装置２０は、所定の流速でサンプルを流路に流しつつ、単細胞微生物や多細胞微生物などを迅速かつ高効率に死滅させ（殺菌し）、また、迅速かつ高効率に細胞内の内容物を抽出できる構成となっている。
【０１１３】
なお、狭窄部１Ｃの幅は、１つの細胞の直径が約１０μｍなので、少なくとも、２つの細胞が通過できる２０μｍ以上であれば良い。
【０１１４】
また、筒状電極２Ｂおよび針状電極３Ｂは、狭窄部１Ｃの近傍において、溶液の流れる方向に沿って、前記流路の内部に並列配置されている。
【０１１５】
これにより、非ファラデー電流により通電状態とする領域を、狭窄部１Ｃの近傍とすることができるので、電気抵抗が大きな溶液であっても筒状電極２Ｂおよび針状電極３Ｂ間を通電させることができる。
【０１１６】
また、前記構成では、狭窄部１Ｃにおける流路幅が複数の細胞が通過できる程度の幅なので、前記特許文献２に記載された流路基板と比較して、細胞内の内容物を、迅速かつ高効率に抽出することができる。
【０１１７】
次に、図４に基づき、筒状電極２Ｂおよび針状電極３Ｂの配置方法の一例について説明する。
【０１１８】
図４に示すように、筒状電極２Ｂ（本実施形態では、円筒形であるが、これに限定されない）には、円形の左開口ＯＬ、円形の右開口（一方の開口）ＯＲが存在しており、筒状電極２Ｂの右開口ＯＲは、針状電極３Ｂが存在する方向に開放されていることが好ましい。
【０１１９】
これにより、筒状電極２Ｂと、針状電極３Ｂとの間で、広範囲に亘って溶液を通電させることができる。
【０１２０】
例えば、筒状電極２Ｂの左開口ＯＬおよび右開口ＯＲ間の距離ｄ１が、３ｃｍであり、右開口ＯＲ又は左開口ＯＬの半径を１．５ｃｍとし、筒状電極２Ｂの内側面のすべてが、針状電極３Ｂ（ほぼ、円柱とし、円の直径を１ｍｍとする）と対向（半円柱の表面が対向）しているとすると、針状電極３Ｂと筒状電極２Ｂの対向表面積比は、１：６０となる。
【０１２１】
なお、筒状電極２Ｂおよび針状電極３Ｂの配置方法は、これに限られず、例えば、筒状電極２Ｂの中心軸の方向と、針状電極３Ｂの長手方向とが一致するように配置しても良い。
【０１２２】
なお、筒状電極２Ｂおよび針状電極３Ｂ間の距離ｄ２（左開口ＯＬの開口中心Ｃと、針状電極３Ｂ間の距離）は、板電極２Ａおよび針状電極３Ａの組合せと同様に約１１ｃｍとしても良いが、これに限定されない。
【０１２３】
また、図４に示すように、溶液が流れる方向を、筒状電極２Ｂの中心軸（右開口ＯＲおよび左開口ＯＬの開口中心Ｃを通る軸）の方向と一致させることで、溶液が、その流れを妨げられることなく、筒状電極２Ｂを通過する。よって、単細胞微生物や多細胞微生物などを迅速かつ高効率に死滅させ（殺菌し）、細胞内の内容物を、迅速かつ高効率に抽出することができる。
【０１２４】
なお、以上の説明では、細胞膜破壊装置２０の筒状電極２Ｂおよび針状電極３Ｂの寸法や、電極間の距離を、細胞膜破壊装置１０の板電極２Ａおよび針状電極３Ａの寸法と同程度とした。
【０１２５】
しかしながら、前記寸法は、本実施形態と比較して非常に小さくても良く、サンプル流入路１Ｌ、狭窄部１Ｃおよびサンプル流出路１Ｒを、マイクロメートルオーダのマイクロ流路とする場合には、前記寸法もマイクロメートルオーダとなり得る。
【０１２６】
以上の構成によれば、単細胞微生物や多細胞微生物などを迅速かつ高効率に死滅させ（殺菌し）、細胞内の内容物を、その損傷を抑制しつつ迅速かつ高効率に抽出することができる。また、食品衛生や環境衛生等の検査において、検査対象となる有害菌類の細胞内の内容物を後の検査に影響を与えず、迅速かつ効率的に取り出すことができる。
【０１２７】
また、通電部６が印加する電圧の振幅を調節することにより、細胞内の内容物の変性を抑えることができる。さらに、細胞膜を破砕する際に薬品等を添加せず処理が可能で、薬品による細胞内の内容物の変性や、薬品による後の検査への影響を抑えることができる。
【０１２８】
〔３．細胞膜破壊装置１０の効果試験について〕
次に、図５（ａ）〜図７（ｂ）に基づき、上述した細胞膜破壊装置１０を試作し（以下、単に「実施例」という）効果試験を行った結果について説明する。
【０１２９】
図５（ａ）は、試作した実施例の構成を示す図である。また、図５（ａ）に示す実施例では、水槽１の中央付近に生じる局所的な電位差を観測するためのプローブ電極を設置した。次に、上記効果試験の実施手順（１〜４）について説明する。
【０１３０】
（実施手順１：使用プランクトンの調整）
まず、海水１Ｌ（またはｌ：リットル）に植物性プランクトン（以下プランクトン）培養液１０ｍｌ（１０ｍｌに含まれるプランクトン数は、約８．７×１０５個）入れて入念に撹拌したものを実験に使用した。溶液中の微生物は、アカシオヒゲムシ（Heterosigma akashiwo）＜プランクトン＞である。
【０１３１】
（実施手順２：染色液の調整）
プランクトンの観察を容易に行うため、Neutral Red（C15H17ClN4）を染色液として使用した。この染色液の特徴は、生きているプランクトンが赤く染まり、死んだプランクトンは染まらない点にある。Neutral Redはあらかじめ純水に溶かし、１％（重量％）溶液を調製した。
【０１３２】
（実施手順３：過渡電圧の印加処理）
電極は、上述した板電極２Ａおよび針状電極３Ａを使用した。また、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間には、上述した過渡電圧を印加した。水槽１にプランクトンを含む海水を約５００ｍｌ入れて処理を行った。処理回数は複数回行う。今回は４０回処理を行い、その処理に必要な時間は約４０秒であった。
【０１３３】
（実施手順４：プランクトンの染色操作および観察）
染色処理は、プランクトンを含む海水１０ｍｌに対し、Neutral Red、１％（重量％）溶液を５μｌ添加した。また、染色後、３０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、上澄みを９ｍｌ捨てた。
【０１３４】
以上のような染色処理を行った後、プランクトンの観察を顕微鏡で行った。
【０１３５】
次に、図５（ｂ）〜図７（ｂ）に基づき、上記効果試験の結果について説明する。
【０１３６】
まず、図５（ｂ）は、実施例に関し、プローブ電極間に局所的に生じた電位差の時間的変化を示すグラフである。
【０１３７】
図５（ｂ）に示すように、プローブ電極間は、ステップ関数的に約３０Ｖの電位差が瞬間的に生じ、その後、指数関数的（過渡的）にその電位差が減少している。
【０１３８】
また、図５（ｂ）では、ステップ関数的に約３０Ｖの電位差が生じてから、９ｍｓ（ミリ秒）までの経過が示されている。
【０１３９】
以上より、約１０ｍｓの間、１Ｖ以上の電位差を局所的に生じさせることが可能であることが分かった。
【０１４０】
次に、図６は、前記実施例による処理前（実験開始直後）の溶液中のプランクトンの観察結果を示す図である。
【０１４１】
図６に示すように、実施例による処理前では、プランクトンの形状がはっきりしており、染色液により赤く染まっていることから生きていることがわかる。
【０１４２】
次に、図７（ａ）は、前記実施例による処理前（実験開始直後）の溶液中のプランクトンの観察結果を示す図である。
【０１４３】
図７（ａ）に示すように、プランクトンの形状はわからなくなっており、プランクトンの残骸状のものが観察された。このことからプランクトンの膜が破壊され、内容物が出ていると考えられる。
【０１４４】
次に、図７（ｂ）は、対照実験のために別に用意した前記実施例による処理が行われていない溶液中のプランクトン（実験終了後）の観察結果を示す図である。
【０１４５】
図７（ｂ）に示すように、プランクトンの形状がはっきりしており、染色液により赤く染まっていることから、プランクトンが生きていることがわかる。また、細胞膜破壊装置１０の処理後のプランクトンと比較すると、図７（ａ）では、プランクトンが経時変化により膜が壊れたのではないことが分かる。
【０１４６】
次に、図８に基づき、細胞膜破壊装置１０の板電極２Ａおよび針状電極（針電極）３Ａ間で、溶液中に電流が実際に流れるか否かについて実験した結果を説明する。
【０１４７】
図８は、細胞膜破壊装置１０で、ＬＥＤ（light emitting diode）の電極の両端を海水の中に沈め、板電極２Ａおよび針状電極３Ａ間に５０Ｖの過渡電圧を印加したときの様子を示している。
【０１４８】
ＬＥＤの電極の向きによって、ＬＥＤは一瞬点灯した。なお、以上より、海水中にプラズマ放電や物理的衝撃を生まないほどの電流を流すことができることが分かる。
【０１４９】
〔４．パルス処理の実験結果について〕
ところで、細胞を用いた抗体医薬製造が行われ、細胞から機能を保持したまま、簡便、かつ、効率的に生体分子を抽出する前処理方法が従来から求められている。このような前処理方法としては、界面活性剤の利用、超音波細胞破砕法やパルス電界法などが考えられるが、特にパルス電界法は、時間や印加電圧等の制御できるパラメータが多い。
【０１５０】
しかしながら、パルス電界法では外部電圧に〜１０ｋＶ程度（数ｋＶ〜数十ｋＶ）の高電圧印加がなされ、安全性の確保や高価な装置を必要とする点からも改善の余地がある。
【０１５１】
一方、上述したように、大腸菌などの原核細胞において、細胞膜自体に約１Ｖを越える電圧を印加すると、電気穿孔の修復ができず膜の破壊に至る。
【０１５２】
そこで、本願発明者らは、大腸菌内部からの酵素抽出を目的に、数Ｖ程度の極めて低電圧の電圧パルス印加により細胞膜を破砕する本実施形態の前処理方法について実験を行った。また、大腸菌内部に存在するβ-glucuronidaseと5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronideの活性を利用した高感度な検出手段である発色酵素基質法を用いて、その吸光度から酵素活性を評価し、本実施形態の前処理方法と上記検出法の一連のプロセスの有効性を確認した。
【０１５３】
実験では、使用菌株として大腸菌（Escherichia coli : ＤＨ５α, 東洋紡）を用い、ＬＢ液体培地（Difco: Tryptone １０ｇ／Ｌ, Yeast extract ５ｇ／Ｌ, ＮａＣｌ １０ｇ／Ｌ）で３７℃、１２時間以上振とう培養した（ＴＡＩＴＥＣ，ＢＲ−４０ＬＦ）。
【０１５４】
培養液用比色計（ＷＰＡ，ＣＯ８０００ Ｂｉｏｗａｖｅ）で培養液のＯ．Ｄ．を測定し、ＬＢ液体培地を加えＯ．Ｄ．＝０．４±０．０５に調整した後、試料溶液とした（約１０８ ｃｆｕ／ｍＬ）。なお、「Ｏ．Ｄ．」は、Optical Density（光学濃度または光学密度）の略であり、以降、単にＯ．Ｄ．という。また、「ｃｆｕ」は、Colony Forming Unit（コロニーフォーミングユニット）の略である。
【０１５５】
次にコンデンサ容量３０００μＦ（マイクロ・ファラッド）、信号発生器（ＮＦ， １９１５）、多出力直流安定化電源（ＴＥＸＩＣＯ， ＰＷ３６−１．５ＡＤ）を用いて、パルス電源を構築し、出力パルスはデジタルオシロスコープ（Ｔｅｋｔｒｏｎｉｘ， ＴＤＳ１００１Ｂ）で観察した。
【０１５６】
図９に実験で使用したパルス出力系の概略図（回路図）とパルス形状の一例を示す。処理槽（円筒形、内径２０ｍｍ）にはタングステン電極を用い、針電極を負、平板電極を正とし、電極間は２ｍｍに固定した。試料溶液を処理槽に４ｍＬ分注し、平板電極下に設置したスタラーで攪拌しつつパルス電圧で処理した。
【０１５７】
また、検査試薬の調整のため、5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide Cyclohexylammonium Saltを、N,N-dimethylformamide（ＤＭＦ）溶媒で１９．２ｍＭに調整し（共に和光純薬工業）、２００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４水溶液と２００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４水溶液を３．３：６．７（体積：体積）で混合したリン酸緩衝液を用いて９倍量で希釈し、基質溶液とした。パルス電圧印加後の各サンプルを分注し、基質溶液と１：１で混合した後、３７℃、１６時間以上酵素反応させ、紫外可視分光光度計（日本分光， Ｖ−５５０）でＯ．Ｄ．の波長分布を計測した。
【０１５８】
従来から、大腸菌や大腸菌群の確認は、簡便・迅速さを目的に、蛍光や発色により判断できる酵素基質法や抗原抗体法が提案されている。特に大腸菌や大腸菌群に特異的に存在する酵素β-glucuronidaseまたはβ-galactosidaseに着目し、5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide（Ｘ‐ｇｌｕｃ）や5-Bromo-４-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside（Ｘ‐ｇａｌ）を用いている。
【０１５９】
また、菌の濃度が低い場合においても、分光光度計を用いたＯ．Ｄ．から評価できる。本明細書では、低電圧による電圧パルス処理後の、内容物をより効率的に取り出す指針（パルス条件）を得るため、寒天培地上ではなく感度が高い分光光度計を用いて評価した。
【０１６０】
図１１に大腸菌培養液とパルス処理後（５Ｈｚ，５Ｖ，パルス回数１０００回）のＯ．Ｄ．を示す。５００〜７５０ｎｍの範囲でＯ．Ｄ．の上昇が、パルス処理の有無に関係なく共に観測されたが、パルス処理を施した際、Ｏ．Ｄ．より大きく増加する結果が得られた。
【０１６１】
次に、パルス形状（周波数と電圧）に対する、波長６１５ｎｍにおけるＯ．Ｄ．依存性を確認した。図１２に、１Ｈｚ，５Ｈｚ，１０Ｈｚ各々の周波数で、パルス処理回数を１０００回に固定し、１Ｖ，５Ｖ，１０Ｖの電圧を印加した結果を示す。
【０１６２】
この時、波長６１５ｎｍに対して波長７５０ｎｍのＯ．Ｄ．をバックグラウンドとして実測値から補正した（Ａｂｓ６１５−Ａｂｓ７５０）。
【０１６３】
５Ｖと１０Ｖのパルス処理時には、未処理に比べてＯ．Ｄ．の変化が観測されたが、１Ｖ時は、パルス処理を行わない場合に比べて有意な差は認められなかった。さらに、５Ｈｚを測定条件として固定し、処理時間に対するＯ．Ｄ．を測定した結果を図１３に示す（パルス処理時間５００，１０００，１５００ｓｅｃ）。
【０１６４】
定性的には処理時間に伴うＯ．Ｄ．の増加がみられ、処理時間が増加するに従ってＯ．Ｄ．が飽和した後、減少する傾向が５Ｖで観測された。一方、１０Ｖの場合は処理時間（５００，１０００，１５００ｓｅｃ）に関わらず同程度のＯ．Ｄ．を示し、この条件ではパルス処理によるβ-glucuronidaseの検出は困難であった。
【０１６５】
以上より、数Ｖ程度の極めて低電圧の電圧パルスによって細胞内に含まれる酵素を高効率に細胞外へ取り出せることが示された。よって、本実施形態の前処理方法（細胞膜破壊装置１０および２０）によれば、低電圧で、かつ細胞膜破壊の効率が高い細胞膜破壊装置１０を提供することが可能となる。例えば、本実施形態のパルス電圧の振幅は、１Ｖ以上、１００Ｖ以下であることが好ましい。
【０１６６】
なお、本発明は、以下のように表現することもできる。
【０１６７】
すなわち、本発明の細胞膜破壊装置は、放電による衝撃を生まない程度の低電圧によるパルス電流を海水中に効率よく広範囲に流しても良い。
【０１６８】
これにより、海水中微生物から細胞内の内容物を、その損傷を回避しつつ、効率良く抽出することができる。
【０１６９】
また、簡単な構成でも、抽出処理の処理速度が速く、小規模の装置を構成できるので、船舶への搭載も可能な細胞膜破壊装置を提供できる。
【０１７０】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、放電による衝撃を生まない程度の低電圧によるパルス電流をサンプルに流しても良い。これにより、細胞膜を迅速かつ高効率に破壊できる。
【０１７１】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、パルス電流を細胞膜破砕処理用の流路に流し、流路を流れるサンプルに複数回パルス電流を流しても良い。これにより、サンプル中に含まれる有害細菌類の細胞膜を破壊することができる。
【０１７２】
さらに、以上の構成によれば、食品衛生や環境衛生等の検査において、検査対象となる有害菌類の細胞内の内容物を後の検査に影響を与えず、迅速かつ効率的に取り出す手法を提供することができる。
【０１７３】
また、本発明は、以下のように表現することもできる。
【０１７４】
すなわち、本発明の細胞膜破壊装置は、プラズマ放電や物理的衝撃を生まない程度の低電圧によるパルス電流を複数回流しても良い。これにより、効率よく海水中微生物を処理することができる。
【０１７５】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、正電極に比べ、表面積の小さな負電極の構造を持たせても良い。これにより、低電圧であっても広範囲かつ高速に処理できる。
【０１７６】
以上の構成によれば、処理用の薬剤などを添加することなく微生物処理が可能であり、排水時に二次処理を行う必要がない。また、小規模な装置が見込まれ、配管系に設置することも可能である。
【０１７７】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、プラズマ放電や物理的衝撃を生まない程度の低電圧によるパルス電流を複数回流しても良い。これにより、細胞膜を破砕し、高効率に細胞内の内容物を取り出すことができる。
【０１７８】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、細胞膜破砕用の流路はパルス電流を流す構造を複数個有しても良い。
【０１７９】
また、本発明の細胞膜破壊装置は、パルス電流が流れる部分は局部的に流路が絞られていても良い。これにより、電気抵抗が大きなサンプルであってもパルス電流を通電させることができる。
【０１８０】
〔付記事項〕
なお、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組合せて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１８１】
本発明は、大腸菌、レジオネラ菌、Ｏ‐１５７、サルモネラ菌などの有害細菌を効率的に死滅させる殺菌装置、細胞内の内容物を効率的に抽出する抽出装置、細胞内の内容物を効率的に抽出すると共に、抽出した内容物の分析を行う分析装置などに広く適用することができる。
【符号の説明】
【０１８２】
１ 水槽
１Ｌ サンプル流入路（流路）
１Ｒ サンプル流出路（流路）
１Ｃ 狭窄部（流路）
２Ａ 板電極（陽極）
２Ｂ 筒状電極（陽極）
３Ａ、３Ｂ 針状電極（陰極）
４Ｌ、４Ｒ セラミックチューブ
５Ｌ、５Ｒ 接続配線
６ 通電部（通電手段）
７Ｌ、７Ｒ 接続端子
１０ 細胞膜破壊装置
２０ 細胞膜破壊装置
Ｃ 開口中心
ＯＬ 左開口
ＯＲ 右開口（一方の開口）
ｄ１、ｄ２ 距離
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の濃度の電解質と、所定の濃度の細胞とを含む溶液中に、互いに対向して配置された、陽極と、前記陽極よりも表面積が小さい針状電極である陰極とを備え、
前記陽極および前記陰極間に存在する溶液中に、前記電解質が電離した電解質イオンの移動による電流を発生させて、前記陽極および前記陰極間を通電状態とする通電手段を備えることを特徴とする細胞膜破壊装置。
【請求項２】
前記陽極は、筒形状の筒状電極であり、
前記筒状電極の一方の開口は、前記陰極が存在する方向に開放されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞膜破壊装置。
【請求項３】
前記陽極は、平板状の板電極であることを特徴とする請求項１に記載の細胞膜破壊装置。
【請求項４】
前記通電手段は、前記陽極および前記陰極間に放電が生じない程度の振幅を有するパルス電圧を少なくとも１回、印加することで、前記電解質イオンの移動による電流を溶液中に発生させることを特徴とする請求項１から３までのいずれか１項に記載の細胞膜破壊装置。
【請求項５】
電荷を蓄積することが可能なコンデンサを備え、
前記通電手段は、前記コンデンサに蓄えられた電荷を放電させることにより発生する、前記陽極および前記陰極間に放電が生じない程度の大きさで過渡的に減少する過渡電圧を少なくとも１回、印加することで、前記電解質イオンの移動による電流を溶液中に発生させることを特徴とする請求項１から３までのいずれか１項に記載の細胞膜破壊装置。
【請求項６】
流路幅が局部的に狭くなっている狭窄部を有し、該狭窄部における流路幅が複数の細胞が通過できる程度の幅となっている流路を備え、
前記陽極および前記陰極が、前記狭窄部の近傍において、溶液の流れる方向に沿って、前記流路の内部に並列配置されていることを特徴とする請求項１から５までのいずれか１項に記載の細胞膜破壊装置。
【請求項７】
所定の濃度の電解質と、所定の濃度の細胞とを含む溶液中に、互いに対向して配置された、陽極と、陰極とを備え、
前記陽極および前記陰極間に存在する溶液中に、前記電解質が電離した電解質イオンの移動による電流を発生させて、前記陽極および前記陰極間を通電状態とする通電手段を備えることを特徴とする細胞膜破壊装置。
【請求項１】
所定の濃度の電解質と、所定の濃度の細胞とを含む溶液中に、互いに対向して配置された、陽極と、前記陽極よりも表面積が小さい針状電極である陰極とを備え、
前記陽極および前記陰極間に存在する溶液中に、前記電解質が電離した電解質イオンの移動による電流を発生させて、前記陽極および前記陰極間を通電状態とする通電手段を備えることを特徴とする細胞膜破壊装置。
【請求項２】
前記陽極は、筒形状の筒状電極であり、
前記筒状電極の一方の開口は、前記陰極が存在する方向に開放されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞膜破壊装置。
【請求項３】
前記陽極は、平板状の板電極であることを特徴とする請求項１に記載の細胞膜破壊装置。
【請求項４】
前記通電手段は、前記陽極および前記陰極間に放電が生じない程度の振幅を有するパルス電圧を少なくとも１回、印加することで、前記電解質イオンの移動による電流を溶液中に発生させることを特徴とする請求項１から３までのいずれか１項に記載の細胞膜破壊装置。
【請求項５】
電荷を蓄積することが可能なコンデンサを備え、
前記通電手段は、前記コンデンサに蓄えられた電荷を放電させることにより発生する、前記陽極および前記陰極間に放電が生じない程度の大きさで過渡的に減少する過渡電圧を少なくとも１回、印加することで、前記電解質イオンの移動による電流を溶液中に発生させることを特徴とする請求項１から３までのいずれか１項に記載の細胞膜破壊装置。
【請求項６】
流路幅が局部的に狭くなっている狭窄部を有し、該狭窄部における流路幅が複数の細胞が通過できる程度の幅となっている流路を備え、
前記陽極および前記陰極が、前記狭窄部の近傍において、溶液の流れる方向に沿って、前記流路の内部に並列配置されていることを特徴とする請求項１から５までのいずれか１項に記載の細胞膜破壊装置。
【請求項７】
所定の濃度の電解質と、所定の濃度の細胞とを含む溶液中に、互いに対向して配置された、陽極と、陰極とを備え、
前記陽極および前記陰極間に存在する溶液中に、前記電解質が電離した電解質イオンの移動による電流を発生させて、前記陽極および前記陰極間を通電状態とする通電手段を備えることを特徴とする細胞膜破壊装置。
【図１】
【図３】
【図４】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図３】
【図４】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−１００６５２（Ｐ２０１２−１００６５２Ａ）
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２２４９３４（Ｐ２０１１−２２４９３４）
【出願日】平成２３年１０月１２日（２０１１．１０．１２）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年５月３１日（２０１２．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月１２日（２０１１．１０．１２）
【出願人】（３０１０２１５３３）独立行政法人産業技術総合研究所 (6,529)
【Ｆターム（参考）】
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