細胞輸送組成物およびこれらの使用
【課題】毒性をほとんどまたは全く伴わずに、そして、適切な投与経路（すなわち、肺、胃腸（ＧＩ）管）を通って標的化され、さらに免疫賦活をほとんどまたは全く伴わない、膜を横切って化合物を輸送するための組成物および方法の提供。
【解決手段】組成物は、他の方法では細胞に入らない化合物の細胞内送達を媒介し得、他の方法では非効率的に細胞に入る化合物の細胞内送達を増強し得る。この方法は、脂質二重層または膜の近位面（例えば、インタクトな細胞の表面）を化合物（例えば、治療剤）およびジケトピペラジン（ＤＫＰ）を含有する複合体に接触させることによって実行される。ＤＫＰおよび化合物は、互いに非共有結合しているか、または、互いに共有結合している。
【解決手段】組成物は、他の方法では細胞に入らない化合物の細胞内送達を媒介し得、他の方法では非効率的に細胞に入る化合物の細胞内送達を増強し得る。この方法は、脂質二重層または膜の近位面（例えば、インタクトな細胞の表面）を化合物（例えば、治療剤）およびジケトピペラジン（ＤＫＰ）を含有する複合体に接触させることによって実行される。ＤＫＰおよび化合物は、互いに非共有結合しているか、または、互いに共有結合している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達組成物およびこれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
多くの治療化合物は、臨床的に有用でない。なぜならば、これらは、商業的開発には適さなくする、溶解性の逆説の餌食となるためである。これらの化合物は、水性環境を通って移動して標的細胞に到達し得るが、次いで、細胞の非極性脂質二重層を横切ることが困難であるために、細胞内標的に達し得ない。薬物投与の標準的な手段は、標的の特定の組織に対するその効率とその能力とにおいて制限される。さらに、いくつかの薬物送達剤は、炎症および毒性のような望ましくない副作用を生じる。
【発明の概要】
【０００３】
従って、毒性をほとんどまたは全く伴わない膜を横切って化合物を輸送するための方法および組成物を提供することが、本発明の目的である。
【０００４】
（発明の要旨）
毒性をほとんどまたは全く伴わずに、そして、適切な投与経路（すなわち、肺、胃腸（ＧＩ）管）を通って標的化される場合、免疫賦活をほとんどまたは全く伴わない、膜を横切って化合物を輸送するための組成物および方法が開発されている。この組成物は、他の方法では細胞に入らない化合物の細胞内送達を媒介し得、他の方法では非効率的に細胞に入る化合物の細胞内送達を増強し得る。
【０００５】
脂質二重層を横切って組成物を輸送するための方法は、脂質二重層の近位面（例えば、インタクトな細胞の表面）を化合物（例えば、治療剤）およびジケトピペラジン（ＤＫＰ）を含有する複合体に接触させることによって実行される。ＤＫＰおよび化合物は、互いに非共有結合しているか、または、互いに共有結合している。ＤＫＰと複合体化しない化合物の輸送速度と比べて、ＤＫＰと複合体化する化合物を含有する組成物の、脂質二重層の近位面（例えば、細胞外膜面）から脂質二重層の遠位面（例えば、細胞内膜面または細胞の細胞質）への輸送速度は、ＤＫＰの存在に起因して、より大きい。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】図１ａは、ナイーブ脾臓細胞のフマル酸ＤＫＰ（ＦＤＫＰ）−ミクロスフェア（ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標））に対する分裂促進的応答を示す、ｍｃｇ／ｍｌまたは％ 対 刺激指数の線グラフである。
【図１Ｂ】図１ｂは、臨床グレードのＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）の存在下におけるナイーブ脾臓細胞のインビトロ分裂促進研究から得た上清のサイトカイン分析を示す棒である。
【図２Ａ】図２ａは、臨床グレードまたは粗製のＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）の異なるバッチの存在下における、ヒトＰＢＭＣのインビトロ分裂促進研究を示す、棒グラフである。
【図２Ｂ】図２ｂは、ナイーブ脾臓細胞のＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）バッチの存在下におけるＰＢＭＣのインビトロ分裂促進研究から得た上清のサイトカイン分析を示す棒グラフである。
【図３】図３ａは、３７℃にて、ＯＶＡ−ＦＩＴＣまたはＯＶＡ−ＦＩＴＣ−ＦＴＳ ＦＤＫＰ（「ＯＶＡ＊ＴＥＣＨ−ＦＩＴＣ」）のいずれかの調製物 ２０μｇ／ｍｌと共にインキュベートした後の、Ａ４５９ヒト肺細胞株へのオブアルブミン（ＯＶＡ）−ＦＩＴＣ輸送の動力学を示す、時間（分）対 平均蛍光強度（ＭＦＩ）（単位）の棒グラフである。図３ｂは、３７℃にて、ＯＶＡ−ＦＩＴＣまたはＯＶＡ−ＦＩＴＣ−ＦＤＫＰ（「ＯＶＡ＊ＴＥＣＨ−ＦＩＴＣ」）のいずれかの調製物 ２０μｇ／ｍｌと共にインキュベートした後の、Ａ４５９細胞へのＯＶＡ−ＦＩＴＣの輸送増加（％で表す）を示す、時間（分）対 ＭＦＩの棒グラフである。
【図４】図４は、３７℃、４℃および０℃にてＯＶＡ−ＦＩＴＣ−スクシニルまたはＯＶＡ−ＦＩＴＣ−ＦＤＫＰ（ＯＶＡ＊ＴＥＣＨ−ＦＩＴＣ）のいずれか ２０μｇ／ｍｌと共に３０分間インキュベートした後の、Ａ４５９ヒト肺細胞へのＦＤＫＰミクロスフェアによるオブアルブミンの輸送の増加を示す、インキュベーション温度（℃）対 ＭＦＩ（単位）の棒グラフである。
【図５】図５は、３７℃における、培養していない脾臓細胞での、オボアルブミンのＦＤＫＰ−ミクロスフェア促進性輸送を示す、時間（分）対 ＭＦＩ（単位）の棒グラフである。
【図６】図６は、完全培地の存在下におけるＡ４５９肺細胞へのオボアルブミンの輸送を示す棒グラフである。
【図７】図７は、フェニラジンオキシドの存在下での、Ａ４５９肺細胞へのオボアルブミンの輸送を示す棒グラフである。
【図８】図８は、スクロースの存在下での、Ａ４５９肺細胞へのオボアルブミンの輸送を示す棒グラフである。
【図９】図９は、３７℃および種々のｐＨ条件（３、４、５、７．４および９）にて、ＯＶＡ−ＦＩＴＣまたはＯＶＡ−ＦＩＴＣ−ＦＤＫＰ（「ＯＶＡ＊ＴＥＣＨ−ＦＩＴＣ」）のいずれかの調製物 ２０μｇ／ｍｌと共にインキュベートした後の、Ｋ５６２細胞へのＦＩＴＣ−ＯＶＡの輸送を示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、３７℃における、Ａ４５９肺細胞への、インシュリンの輸送とインシュリン／ＦＤＫＰの輸送とを比較した、時間（分）対 ＭＦＩ（単位）の線グラフである。
【図１１】図１１は、吸入治療によりインシュリン／ＦＤＫＰ−ミクロスフェア複合体が投与される前（「ベースライン」）および後（「終点」）の、ヒト被験体における、インシュリン特異的ＩｇＧ抗体力価を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（詳細な説明）
本明細書中に記載される組成物および方法は、化合物をＤＫＰと複合体化することによって、膜を通る化合物の輸送を改善する。ＤＫＰは、標的細胞および標的組織への効率的な送達によって分子の治療能率を改善し、従って、低用量での処置を可能にする。必要に応じて、ＤＫＰは、合成または天然のポリマーでコーティングされる。
【０００８】
本明細書中で一般的に使用される「実質的に免疫応答がない」は、ＤＫＰの不在下と比べて、ＤＫＰの存在下で、免疫応答が５０％未満増加することを意味する。好ましくは、免疫応答は、２０％未満、１０％未満、５％未満増加するか、または全く増加しない。免疫応答は、抗体産生、サイトカイン分泌（例えば、インターロイキン−２）、またはＴ細胞のような免疫細胞の増殖を検出することによって測定される。ＤＫＰまたは複合体は、先天性の免疫（例えば、病原性関連分子パターンを認識するもの）の誘導に関与するレセプターに結合する。例えば、ＤＫＰまたは化合物−ＤＫＰ複合体は、トール様レセプター２に結合しない。
【０００９】
（Ｉ．組成物）
（Ａ．化合物）
種々の異なる化合物が、標的細胞（例えば、肺の肺胞細胞）への送達のために、ＦＤＫＰと複合体化され得る。これらの化合物は、ペプチドまたはタンパク質、オリゴ糖または多糖、核酸分子、およびこれらの化合物の組み合わせであり得る。送達される化合物としては、合成分子、合成低分子、または金属のような分子が挙げられる。組成物は、ＤＫＰと結合体化されるか、または複合体化される。
【００１０】
輸送される化合物としては、生物学的に活性な因子が挙げられる。送達される化合物としては、大きなタンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物および低分子が挙げられる。好ましくは、化合物はポリペプチドである。免疫応答を最小にするために、ポリペプチドのアミノ酸配列は、組成物が送達される哺乳動物の種のメンバーにより発現される、天然に存在するポリペプチドと同一または相同である。例えば、化合物は、インシュリンもしくはその生物学的に活性なフラグメント、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、ヒト成長ホルモン（ＨｇＨ）、グルカゴン様ペプチド（ＧＰＬ）、またはこれらのフラグメントのようなペプチドであり得る。化合物はまた、抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、病原性感染因子、悪性細胞または病原性分子に結合する抗体）であり得る。抗体は、インタクトなモノクローナル抗体または免疫学的に活性な抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）２フラグメント）；遺伝子操作した単鎖Ｆｖ分子；またはキメラ分子（１つの抗体（例えば、マウス起源）の結合特異性を有し、残りの部分が別の抗体（例えば、ヒト起源）である抗体）であり得る。
【００１１】
化合物は、サイトカインまたはケモカインであり得る。ケモカインは、感染および炎症に応答して炎症性細胞を組織に集めるのに重要な役割を果たす、低分子のスーパーファミリーである。ケモカインは、白血球の遊走、位置付けならびに、脈管新生および白血球の脱顆粒のような他のプロセスを促進する。サイトカインは、免疫応答および炎症性応答を調節するのを補助するためのメッセンジャーとして機能する。最適以下の濃度である場合、適切な免疫応答が惹起し損なう。過剰である場合、サイトカインは、有害であり得、種々の疾患に関連し得る。治療目的に従って、ブロッキングサイトカインおよび増殖因子を添加することが、すでに認可されているかまたは臨床開発中の多数の薬物を用いる、証明された治療的アプローチである。
【００１２】
サイトカインスーパーファミリーは、エリスロポエチン、トロンボポエチン、顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）およびインターロイキン類（ＩＬ）のような因子を含む。専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）の機能を調節することが示されているサイトカインおよびケモカインの例としては、ＩＬ−４およびＩＬ−１３が挙げられ、これらは、クラスＩＩ ＭＨＣ（主要組織適合性抗原）の発現を誘導し、マクロファージおよびＢ細胞を活性化し、そして、ＩＧクラスの切り換え（Ｂ細胞の成熟の重要なプロセスであり、これは、高親和性の体液性応答の生成に不可避である）の頻度を増加させることが知られている。
【００１３】
インターロイキン４は、Ｂ細胞、Ｔ細胞および多くの非リンパ系細胞（単球、上皮細胞および線維芽細胞を含む）に複数の生物学的影響を有する、Ｔ細胞および肥満細胞由来の多面的なサイトカインである。インターロイキン４はまた、マウスＢ細胞によるＩｇＧ１およびＩｇＥの分泌、ならびに、ヒトＢ細胞によるＩｇＧ４およびＩｇＥの分泌を誘導する。ＩｇＥ、そして、おそらくＩｇＧ１およびＩｇＧ４のＩＬ４依存性の産生は、ＩＬ４誘導性のアイソタイプの切り換えに起因する。ヒトにおいて、ＩＬ４は、ＩＬ１３とこの機能を共有する。
【００１４】
インターロイキン１３は、活性化されたＴ細胞により分泌され、ＬＰＳ刺激単球により炎症性サイトカイン（ＩＬ１β、ＩＬ６、ＴＮＦαおよびＩＬ８）の産生を阻害する。ヒトおよびマウスのＩＬ１３は、ヒトＢ細胞上のＣＤ２３発現を誘導し、抗Ｉｇ抗体または抗ＣＤ４０抗体と組み合わせてＢ細胞の増殖を促進し、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＧ４の分泌を刺激する。ＩＬ１３はまた、ヒトの単球の生存を延長し、ＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ２３の表面発現を増加させることが示されている。ヒトおよびマウスのＩＬ１３は、
マウスＢ細胞における活性は知られていない。
【００１５】
クラスＩＩ ＭＨＣは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞（Ｂ細胞に支持を提供する（高親和性の免疫グロブリンを分泌する）ことに加え、エフェクター細胞として機能する）およびＣＤ８＋
Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球−ＣＴＬ）に対する、抗原由来ペプチドの提示に重要である。
【００１６】
（ｂ．ジケトピペラジン）
ジケトピペラジン（ＤＫＰ）は、会合した分子（例えば、薬物、治療剤またはワクチン）の細胞内および組織を横切る送達を促進する、細胞輸送体として機能する。
【００１７】
ＦＤＫＰ微粒子は、不溶性であり、かつ、１つのｐＨで安定であり、別のｐＨでは不安定かつ／または溶解性になる、自己集合複合体である。ＦＤＫＰ微粒子は、一般に、直径２ミクロンである。好ましい実施形態において、ＤＫＰは、中性または生理学的なｐＨにおいて可溶性である。ＦＤＫＰ微粒子およびＦＤＫＰ微粒子を作製する方法は、米国特第５，３５２，４６１号；同第５，５０３，８５２号；および同第６，０７１，４９７号
（本明細書中に参考として援用される）に記載される。米国特許第５，８７７，１７４号；同第６，１５３，６１３号；同第５，６９３，３３８号、同第５，９７６，５６９号；同第６，３３１，３１８号；および同第６，３９５，７７４号は、置換および誘導体化ＤＫＰを記載し、これらは、本明細書中に参考として援用される。ＦＤＫＰ（３，６−ビス［Ｎ−フマル酸−Ｎ−（ｎ−ブチル）アミノ］―２，５−ＤＫＰ、ＣＡＳ登録番号１７６７３８−９１−３）は、以下の構造を有する：
【００１８】
【化１】
【００１９】
ＦＤＫＰ微粒子は、溶液中へのＤＫＰ液滴の沈殿により形成される。治療剤（例えば、インシュリン）のような組成物は、フマル酸ＤＫＰと共に酸性溶液中で沈殿させることによって、安定な複合体に処方された。個体への投与に際して、ＤＫＰ微粒子は迅速に溶解し、ＤＫＰ微粒子の周りに沈殿した天然または合成のポリマーによって形成される、回旋状の高表面領域マトリクスを放出する。試験される因子を用いてＤＫＰを沈殿させることによって、マトリクス内の濃い濃度の因子が達成される。 ＤＫＰは、左右対称に官能化されており、２つの側鎖は、同一である。あるいは、ＤＫＰは、非対称に官能化され得る。左右対称に官能化されたＤＫＰおよび非対称に官能化されたＤＫＰの両方が、酸性基、塩基性基またはこれらの組み合わせを含む側鎖を有し得る。
【００２０】
２つの側鎖の各々に０、１および２の保護基を有するＤＫＰは、溶媒および溶液のｐＨに依存して異なる溶解性を有し、沈殿により溶液から単離される。従って、１つの保護された側鎖を有するＤＫＰを選択的に脱保護し、沈殿させて、非左右対称に置換されたＤＫＰが得られる。その単保護化ＤＫＰ誘導体自体は、酸性媒体中で可溶性であり、弱アルカリ性溶液中で不溶性である傾向がある。
【００２１】
ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）は、ＭａｎｎＫｉｎｄ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（以前は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎとして知られていた）により開発された、ＤＫＰからなる微粒子に与えられた名称である。頻繁な肺投与を含む、複数の臨床治験において、ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）は、Ｉ型およびＩＩ型の糖尿病患者におけるインシュリンの送達について、所望の安全プロフィールを示した。
【００２２】
ＦＫＤＰ微粒子（ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標））は、不活性であり（図１ａ〜２ｂを参照のこと）、実質的に副作用を伴わずに、細胞内取り込みを増強する。
【００２３】
ＦＤＫＰ粒子は、種々の分子（低分子、有機分子、生体高分子（例えば、タンパク質およびペプチド）、および核酸を含む）の、生物学的活性を保持したままでの細胞への取り込みを促進する。小さなタンパク質（例えば、インシュリン、約５〜６ｋＤａ）および大きなタンパク質（例えば、トリアルブミン；４５ｋＤａ）の両方が、細胞内に効率的に輸送される。
【００２４】
（ｃ．微粒子のサイズと重量）
深部の肺組織への優先的な送達を達成するために、組成物／ＤＫＰ複合体のサイズは、直径２０ミクロン未満であり、好ましくは、直径１０ミクロン未満であり、そして、より好ましくは、直径５ミクロン未満である。５ミクロンより大きい粒子は通常、大きすぎて、肺の深部組織（肺胞）にアクセスできない。肺胞送達のためには、例えば、サイズは直径２．５ミクロン未満であり、例えば、複合体の直径は、１．５ミクロン〜２．５ミクロンの範囲である。
【００２５】
複合体のサイズ／構造は、細胞膜を横切る効率的な輸送に有利に働き、免疫賦活を最小限にする。この組成物の分子量は、２００ｋＤａ未満（例えば、より好ましくは、１００ｋＤａ未満）である。好ましくは、分子量は５０ｋＤａ未満である。より好ましくは、組成物の分子量は、２０ｋＤａ未満または１０ｋＤａ未満（例えば、３〜６ｋＤａの範囲）である。例えば、ヒトインシュリン（５〜６ｋＤａの間の分子量）は、実質的に免疫賦活を伴わずに、効率的に送達される。
【００２６】
（ｄ．投薬量）
送達される組成物の用量は、高いゾーン耐性および／またはクローンアネルギーに有利に働き、それによって、投与される組成物に対して免疫非反応性を確実にする。例えば、組成物の用量は、単回投与あたり、０．５ｍｇ〜１００ｍｇの範囲である。好ましくは、吸入されるインシュリンの用量は、ヒトへの投与について、単回投与あたり５００μｇ〜１０００μｇの範囲（代表的には、単回投与あたり１ｍｇ〜４ｍｇの範囲、または、１日あたり４ｍｇ〜１６ｍｇの範囲）である。
【００２７】
（ｅ．ＤＫＰ上のコーティング）
ＤＫＰ微粒子は、天然および／または合成のポリマー（最も好ましくは、生分解性ポリマー）のような材料でコーティングされ得る。代表的な天然ポリマーとしては、タンパク質（例えば、アルブミン（好ましくは、ヒトアルブミン）、フィブリン、ゼラチンおよびコラーゲン）および多糖（例えば、アリギネート、セルロース、デキストランおよびキトサン）が挙げられる。代表的な合成ポリマーとしては、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、これらのコポリマー（例えば、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ））、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシアルカノエート、ならびに、好ましくはないが、非生分解性のポリマー（例えば、ポリアクリル酸、ポリスチレンおよびポリエチレンビニルアセテート）が挙げられる。
【００２８】
（ＩＩ．組成物の作製方法）
ＦＤＫＰ微粒子は、好ましくは、以下の工程によってカプセル化される所望の化合物の存在下で形成される：
（１）１つ以上の酸性基を含むＤＫＰ誘導体の弱アルカリ性溶液の酸性化、
（２）１つ以上の塩基性基を含むＤＫＰ誘導体の弱酸性溶液の塩基性化、または
（３）酸性基と塩基性基との両方を含むＤＫＰ誘導体の酸性または塩基性溶液の中性化。
【００２９】
必要に応じて、ＤＫＰ微粒子は、天然または合成のポリマーのマトリクス内でＤＫＰ粒子を沈殿させることによって、ポリマーでコーティングされ得る。
【００３０】
ＤＫＰの側鎖の改変、種々の反応物質の濃度、処方のために用いられる条件、および、形成に用いられるプロセスが、得られる微粒子のサイズを制御し得る。
【００３１】
（ＩＩＩ．組成物の使用）
標的細胞への輸送と、その後の、化合物会合ＤＫＰ調製物の投与の加速および拡大は、治療適用を改善するためのこの方法の使用についての一例である。
【００３２】
微粒子または懸濁物（ｐＨ７．４にて、リン酸緩衝化生理食塩水中で作製された）としてのＤＫＰ複合体調製物が、標的細胞（例えば、深部肺組織）に投与される。ＤＫＰ−化合物複合体は、免疫応答を最小限にする計画および用量を用いて、粘膜表面（肺、鼻、膣、直腸または口）に投与される。適切な濃度および免疫計画は、標準的な技術を用いて決定され、各化合物について最適化される。治療組成物（例えば、インシュリン）は、ｍｇ用量範囲で投与される（そして、それによって、高いゾーン耐性の発生による免疫賦活を避ける）。
【００３３】
ヒトまたは他の哺乳動物内の特定部位へと組成物を送達する方法は、化合物およびＤＫＰを含む複合体に細胞または組織を接触させることによって実施される。好ましい実施形態において、組成物は、肺の小気道（例えば、肺胞）へと送達される。必要に応じて、組成物は、経口投与されるが、代表的には、皮下または皮内、静脈内、腹腔内、または筋肉内に投与される。１つの実施形態において、組成物は吸入により投与される。
【００３４】
この方法は、好ましくは、所定の時間内に、複数の接触工程を包含する。例えば、接触工程間の間隔は、２４時間未満であり得る。複合体は、１日に数回送達され得る。従って、接触工程間の時間は、１２時間未満、６時間未満または３時間未満であり得る。複数の接触工程の後、組織内の免疫細胞は、その後の組成物との接触に非反応性である。
【００３５】
計画に関して、免疫細胞は、最初の刺激に応答した後、強力な抗原特異的免疫応答を達成するための第２の刺激を受け取る前に、数日〜数週間または数ヶ月の休息期間を必要とする。インシュリンが吸入される場合、組成物は、代表的には、１日に３〜４回患者に投与される。この計画は、刺激間の間隔が非常に短いことによって特徴付けられ、従って、免疫細胞を、その後のシグナルに対して静止状態でありかつ受容性にする。この計画は、耐性、アネルギーまたは、抗原特異的免疫細胞のアポトーシスを引き起こすべきであり、正の免疫応答を生じない。
【００３６】
（コーティングされたＤＫＰ微粒子の投与）
１つの実施形態において、コーティングされたジケトピペラジンが投与され、その結果、組成物が患者に投与された後に、貯蔵物（ｄｅｐｏｔ）を形成する。中性ｐＨへの暴露の際のジケトピペラジンの溶解の後に、抗原が放出され、残りのコーティングは、抗原の高い局所濃度を含む、多面迷宮様構造（ｍｕｌｔｉ−ｆａｃｅｔｅｄ ｌａｂｙｒｉｎｔｈ−ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）である。抗原は、末梢の免疫細胞を貯蔵物に引き付け、これにより、エフェクター細胞、サイトカインおよびケモカインの高濃度を生じる。貯蔵物は、種々の免疫応答を開始するか、または、抗原に対する免疫応答を調節するための必須の成分を提供する。
【００３７】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、さらに理解される。
【実施例】
【００３８】
（実施例１：フマル酸ＤＫＰは、先天性免疫を刺激しない）
ＤＫＰがその化学組成または病原性配列（例えば、殺傷型Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の模倣の可能性に起因する免疫賦活特性を保有するという可能性を排除するために、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウス由来の脾細胞を、微粒子として処方された「ブランク」のフマル酸ＤＫＰ（ＦＤＫＰ）の３つのバッチと共にインキュベートし、種々の濃度において、ＯＶＡと会合したＦＤＫＰ（「ＴＣＮＳＰ＊ＯＶＡ」）と比較した。このアッセイは、これらの細胞の励起および増殖を生じる、微量の夾雑物または分裂促進因子に対する静止期のＴ細胞の高い感受性により選択した。脾細胞の増殖性応答を、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイにより測定した。種々のバッチからのＦＤＫＰのブランク微粒子は、コントロール（培地のみ）に匹敵する増殖を誘導した。これらのデータは、ＦＤＫＰが免疫賦活性でないことを示した。
【００３９】
培養物から分泌されるサイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−２）の分析をまた実施した。このアッセイを、５日間培養したナイーブマウスの脾臓細胞を用いてＦＤＫＰミクロスフェアの分裂促進性を試験するための二次的な確認アッセイとして使用した。図１ａは、フマル酸ＤＫＰ（ＦＤＫＰ）−ミクロスフェア（ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標））に対するナイーブ脾臓細胞の分裂促進的な応答を示す線グラフである。ナイーブマウスから回収した脾細胞のプールを用いて、分裂促進的アッセイを実施した。ナイーブ細胞を９６ウェルｕ底組織培養処理プレート中、５×１０５細胞／ウェルにて播種した。細胞を、１００μｇ／ｍｌの種々のバッチのＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）（臨床グレードのブランクＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）バッチ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）を含まない臨床グレードのバッチおよび２つの粗製バッチを含む）と共にインキュベートした。ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（１００％）をまた試験に含めた。全てのサンプルを、０．７μｇ／ｍｌ ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）または０．７％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０の濃度に対して、２×で７回滴定した。分裂促進性のバックグラウンドレベルを評価するために、細胞を培地のみとインキュベートした。刺激の最大レベルを決定するために、細胞をコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）と共にインキュベートした。細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２にて、７２時間インキュベートした。この培養物を１００μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−チミジンでパルスし、さらに１６時間インキュベートした。培地コントロールと比較して、アッセイについて記録された３Ｈ−チミジン取り込みの値から、取り込み率を算出した。
【００４０】
ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ） Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｍｏｕｓｅ Ｔｈ１／Ｔｈ２ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎａｌｙｓｉｓを用いて、サイトカイン分析を行った。１００μｇ／ｍｌのＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）結合Ｏｖａ（バッチ番号２０２．２４．１、２０２．３３．１および２０２．０４０）の存在下、およびブランクのＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）（バッチ番号Ｄ−０３５Ｕ．０２．００２）の存在下でインキュベートした細胞から上清を回収した。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−４およびＩＬ−２のレベルを、各サイトカインの標準曲線を用いて定量した。
【００４１】
図１ｂに示すように、高いレベルのγＩＦＮ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２が、オボアルブミン（ポジティブコントロール）と共にインキュベートした培養物について示されたが、種々のバッチのＦＤＫＰミクロスフェアについては、わずかなレベルの任意のサイトカインを記録した。
【００４２】
さらに、ＦＤＫＰは、５日間の培養でヒト末梢血リンパ球（ｈｕＰＢＬ）を刺激し得る分裂促進因子を結合することを示した（図２ａ）。リンパ球プレップから単離したＰＢＭＣを用いて、分裂促進アッセイを実施した。ナイーブ細胞を、９６ウェルｕ底組織培養処理プレートに５×１０５細胞／ウェルにて播種した。この細胞を、１００μｇ／ｍｌおよび、連続２倍段階希釈の破傷風トキソイドまたはいくつかのブランクのＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）バッチ（ＴＷＥＥＮを含まない臨床グレードのバッチおよびいくつかの粗製（ＴＷＥＥＮなし）バッチを含む）と共にインキュベートした。分裂促進性のバックグラウンドレベルを評価するために、細胞を培地のみとインキュベートした。刺激の最大レベルを決定するために、細胞をフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）と共にインキュベートした。細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２にて、７２時間インキュベートした。この培養物を１００μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−チミジンでパルスし、さらに１６時間インキュベートした。培地と比較して、アッセイについて記録された３Ｈ−チミジン取り込みの値から、分裂促進率を算出した。
【００４３】
種々のバッチの処方されたブランク（すなわち、負荷なし）のＦＤＫＰ ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）（Ｄ０３５Ｕ．０２．００２、Ｄ０３５Ｕ．０２．００２またはＴＷＥＥＮを含まない）または粗製の処方されていないＦＤＫＰ ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）（００１．Ｅ．０２−０１１および００１．Ｅ．０２−０１２）は、ｈｕＰＢＬを刺激して、培地コントロールのベースラインを超えて増殖しなかった。強力な想起（ｒｅｃａｌｌ）抗原である破傷風トキソイドを、抗原特異的な増殖応答を示すポジティブコントロールとして使用した（図２ａを参照のこと）。
【００４４】
これらの培養物により分泌されるサイトカインの分析を、ＨｕＰＢＬを用いてＦＤＫＰミクロスフェアの分裂促進性を試験するための二次確認アッセイとして使用した。高いレベルのγＩＦＮ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２が、破傷風トキソイド（ポジティブコントロール）と共にインキュベートした培養物について示されたが、種々のバッチのＦＤＫＰミクロスフェアについては、わずかなレベルの任意のサイトカインを記録した（図２ｂを参照のこと）。従って、ＦＤＫＰは、先天性の免疫応答を刺激し損ない、これは、その作用機構が、伝統的な細菌アジュバント、またはトール様レセプター（例えば、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５またはＴＬＲ−９）に結合し得るＤＮＡの切れ端とは異なることを示した。
【００４５】
免疫原性を評価するための実験をまた、インビボで実施した。インシュリンＤＫＰ−ミクロスフェアを、吸入治療によりヒト被験体に投与した。ＦＤＫＰ（２ミクロンのメジアン直径を有する粒子および、１〜５ミクロンの範囲の直径を有する粒子）と共に処方された１２Ｕ、２４Ｕまたは４８Ｕのインシュリン用量（それぞれ４５０μｇ、９００μｇおよび１．８ｍｇのインシュリンに対応）を、処置の間に、一週間間隔で６回投与した。処置の前後に、血清サンプルを被験体から得た（６回の吸入の後）。図１１は、吸入治療によりインシュリン／ＦＤＫＰ−ミクロスフェア複合体が投与される前（「ベースライン」）および後（「終点」）の、ヒト被験体における、インシュリン特異的ＩｇＧ抗体力価を示す棒グラフである。図１１に示すように、インシュリン−ＦＤＫＰ−ミクロスフェア複合体の肺投与は、処置された患者の血清においてインシュリン特異的抗体の増加をもたらさなかった。
【００４６】
（実施例２：輸送反応速度論）
輸送化合物としてオボアルブミン（ＯＶＡ）を用いて、取り込み実験を行った。
【００４７】
一つの実験において、肺細胞を、種々のインキュベーション時間にて輸送化合物と共にインキュベートした。図３ａおよび３ｂに示すように、３７℃において、ＯＶＡについて約５０％の輸送が、最初の１０分で達成され、３０分以内に完全飽和（１００％）が生じた。これらのデータは、細胞による化合物の取り込みが、本発明のＦＤＫＰによって増加することを示す。
【００４８】
図４は、３７℃、４℃および０℃にてＯＶＡ−ＦＩＴＣ−スクシニルまたはＯＶＡ−ＦＩＴＣ−ＦＤＫＰ（ＯＶＡ＊ＴＥＣＨ−ＦＩＴＣ）の２０μｇ／ｍｌと共に３０分間インキュベートした後の、Ａ４５９ヒト肺細胞へのＯＶＡ−ＦＩＴＣの輸送を示す、棒グラフである。細胞を、ＯＶＡまたはＯＶＡ−ＦＤＫＰ−ミクロスフェア複合体またはＯＶＡ−スクシニルＦＤＫＰ−ミクロスフェア複合体と、３０分間接触させ、その後、（細胞内への化合物の輸送の指標として）蛍光を測定した。両方の複合体が、ＦＤＫＰを伴わないＯＶＡ−ＦＩＴＣについての輸送と比べて、全ての温度について大いに改善された輸送を有した。ＯＶＡ−ＦＩＴＣ−ＦＤＫＰは、輸送において最大の改善を有した。
【００４９】
インシュリンの肺細胞への輸送をまた評価した（図１０を参照のこと）。図１０は、インシュリンは肺細胞へと輸送されなかったが、インシュリン／ＦＤＫＰ複合体は肺細胞に輸送されたことを示す棒グラフである。このデータは、３０〜６０分で有意な細胞内取り込みを示し、ＤＫＰ−ミクロスフェアの非存在下におけるインシュリンと比較して、ＤＫＰ−ミクロスフェアと結合した場合、インシュリンの取り込みを２８〜４０倍増加したことを示す。
【００５０】
（実施例３：脾臓細胞における輸送増強）
未培養の初代細胞を用いて、化合物の標的細胞への輸送速度を研究した。単離されたマウス脾臓細胞を用いて、化合物の輸送速度との時間経過比較を行った。ＢＡＬＢ／Ｃマウスから脾臓を摘出し、細胞懸濁物を調製した。単離された細胞を、４×１０６細胞／ｍｌの密度にて、完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ ＦＢＳ、１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中でインキュベートした。オボアルブミン−ＦＩＴＣまたはオボアルブミン−ＦＩＴＣ／ＦＤＫＰを２０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、細胞を３７℃にて所定の時間インキュベートした。８容量のＰＢＳを各インキュベーション期間の終わりに添加し、そして、全ての時点が終わるまで、細胞を氷上に置いた。細胞を遠心分離し、再懸濁して、ＦＡＣＳによりＦＩＴＣ取り込みについて分析した。
【００５１】
図５は、３７℃における、培養していない脾臓細胞での、試験化合物、オボアルブミンのＦＤＫＰ−ミクロスフェア促進性輸送を示す棒グラフである。脾細胞によるオボアルブミンの取り込みの増強は、ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥの存在下で１０分以内に立証され、このことは、これまでに試験した細胞型における膜浸透の迅速かつ普遍的な増強を示した（図５を参照のこと）。ＯＶＡ−ＦＩＴＳ／ＦＤＫＰとの６０分間のインキュベーションの後、別の細胞集団の存在が明らかとなった。細胞の生存度は、悪影響を及ぼされていなかった。
【００５２】
（実施例４：血清含有培地における輸送）
オボアルブミン−ＦＩＴＣの輸送を、血清の存在下、インビボ臨床適用に関連する条件下で測定した。Ｋ５６２細胞を、培地単独または１０％ ＦＢＳを含む培地中で、４×１０６細胞／ｍＬの細胞密度にて、オボアルブミン−ＦＩＴＣまたはオボアルブミン−ＦＩＴＣ／ＦＤＫＰのいずれかと共に、インキュベートした（３０分間、３７℃、２０μｇ／ｍＬ）。洗浄後、細胞を、ＦＩＴＣ取り込みについてＦＡＣＳにて分析した。分析前に、細胞をＶＩＡＰＲＯＢＥ（細胞生存性染色）を用いて染色した。
【００５３】
図６は、完全培地の存在下におけるＡ４５９肺細胞へのオボアルブミンの輸送を示す棒グラフである。細胞内オボアルブミン含量の５倍以上の増強が、３７℃にて３０分後に、血清の存在下で示された（図６を参照のこと）。
【００５４】
（実施例５：広範囲のｐＨにわたる輸送の増強）
Ｋ５６２細胞を、ｐＨ３、４、５、７．４または９に調整したＢＤ細胞染色溶液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中で、４×１０６細胞／ｍＬの細胞密度にて、オボアルブミン−ＦＩＴＣまたはオボアルブミン−ＦＩＴＣ／ＦＤＫＰのいずれかと共にインキュベートした（３０分間、３７℃、２０μｇ／ｍＬ）。洗浄後、細胞をＶＩＡＰＲＯＢＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて氷上で５分間染色し、生存細胞のＦＩＴＣ含量をＦＡＣＳ分析により決定した。
【００５５】
ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥによる輸送増強を、ｐＨ４および５を除く研究された全てのｐＨにおいて検出した（図９を参照のこと）。図９に示すように、増強は、ｐＨ９において特に有意であった（５倍近い増加）。これらのデータは、ＦＤＫＰ−ミクロスフェアが、広範囲のｐＨにより特徴付けられる身体の種々の領域（アルカリ条件により特徴付けられる領域（例えば、腸管組織）を含む）における、細胞膜を横切る会合した化合物の増大した輸送に特に効果的であることを示す。
【００５６】
（実施例６：輸送の増強に対する架橋剤の効果）
ＤＫＰミクロスフェアが増強する輸送が、クラスリンで覆われた窩（これは、レセプター媒介性のエンドサイトーシスに関与し、特定の毒素、レクチン、ウイルス、血清輸送タンパク質、抗体、ホルモンおよび成長因子の細胞取り込みを担うことが述べられている）を介する、レセプター媒介性のエンドサイトーシスによって生じないことを確認するための研究を行った。これらの窩の形成は、高浸透性のスクロース溶液の存在下で阻害される。膜のチオール基の架橋は、エンドサイトーシスを防止する別の手段である。なぜならば、チオール基は、多数の分子（水、尿素およびアミノ酸を含む）の膜輸送において重要な役割を果たすためである。チオールの酸化還元状態はまた、膜障壁機能を維持する上で重要である。フェニラジンオキシドを用いて架橋した膜のチオール基を使用して、ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥがエンドサイトーシスに依存するかどうかを決定した。
【００５７】
Ｋ５６２細胞を、血清を含まないＲＰＭＩ培地中、８０μＭフェニラジンオキシド（ＳＩＧＭＡ）で前処理した（５分間、３７℃）。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、その後、１０％血清含有培地中で、オボアルブミン−ＦＩＴＣまたはオボアルブミン−ＦＩＴＣ／ＦＤＫＰのいずれかと共に細胞をインキュベートした（３０分間、３７℃、以前の輸送研究について示した細胞および標識の条件にて）。高浸透性のスクロース溶液の効果について、０．５Ｍスクロースを含有する培地の存在下でインキュベーションを行った。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳで分析した。処理後の細胞の生存度を、以前に示したように、ＶＩＡＰＲＯＢＥを用いて評価し、分析は、生存細胞のみを反映する。
【００５８】
図７は、フェニラジンオキシドの存在下での、Ａ４５９肺細胞へのオボアルブミンの輸送を示す棒グラフである。図８は、スクロースの存在下での、Ａ４５９肺細胞へのオボアルブミンの輸送を示す棒グラフである。両方の処理に関して、ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ媒介性の輸送の増強が、完全培地のみで見られる増強と比べて減少した。しかしながら、増強は依然として観察され、このことは、これらの処理による膜へのかなりの変更にも関わらず、ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥの輸送増強機構が、依然として有効であることを示した（図７および８）。
【００５９】
（実施例７：薬物送達を促進するための輸送体としてのＤＫＰアナログ）
ＤＫＰのスクシニルアナログを、化合物の細胞内輸送の促進因子として評価した。ＤＫＰのスクシニルアナログをＯＶＡと会合させ、ヒト肺細胞をこの複合体に接触させた。図４は、スクシニルＤＫＰと会合したＯＶＡおよびフマル酸ＤＫＰの、ＯＶＡ単独と比べて増強された輸送を示す。
【００６０】
（実施例８：ＤＫＰ複合体の組織標的化送達は、免疫応答を刺激しない）
組成物の用量、投与計画、組成物の大きさ／構造および投与部位を、免疫系の最小限の刺激を伴うか、または刺激を伴わずに、細胞への効果的な薬物送達を達成するために、最適化した。例えば、深部肺への堆積を達成するための、１日あたり１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量範囲における吸入によるインシュリンの送達（小さな（例えば、２ミクロン）のインシュリン／ＦＤＫＰ複合体（これは、肺の肺胞に堆積する）を用いる）は、免疫応答を刺激しなかった。深部肺（肺胞）は、免疫応答を生じない環境を提供し、それによって、吸入された小さな粒子に対する有害な応答の発生を回避する。ミクロンサイズの小さな粒子は、深部の呼吸器組織（例えば、肺胞）へのアクセス、および免疫抑制条件により特徴付けられる環境を獲得し得る。対照的に、より大きい粒子（＞５〜１０ミクロン）は、上部の呼吸器管に堆積する。このような大きい粒子は、肺胞組織の免疫抑制条件へのアクセスを獲得せず、従って、免疫応答を刺激し得る。
【００６１】
１回の処理で与えられるインシュリンの用量は、免疫応答を惹起するのに用いられるペプチドの量をはるかに上回る。免疫応答を誘導するよりはむしろ（ｒａｔｈｅｒ ｔｈｅｎ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、投与される用量は、免疫の非応答性（例えば、耐性、クローンアネルギー）を誘導する。例えば、μｇ用量範囲（例えば、５０μｇ）で投与されるペプチド（例えば、ｉ．ｍ．ワクチン）は、免疫応答を刺激するが、吸入により与えられる５ｍｇまたは１０ｍｇのインシュリン／ＦＤＫＰ複合体は、免疫応答の刺激をもたらさないことが予想される。
【００６２】
（実施例９：送達される化合物の大きさの影響）
送達される化合物の構造および大きさはまた、その免疫原性に影響を有する。低分子ペプチドは、あまり免疫原性でなく、一方で、より大きな異種分子または複合体分子は、より免疫原性である。試験されるヒトインシュリン組成物（５８０７．６ダルトンの分子量）は、肺組織に送達される場合に、免疫応答を刺激する可能性が低いことが予想される。免疫刺激をさらに最小にするために、免疫適合性組成物を用いる。例えば、インシュリンのヒト形態は、ヒトにおいて弱い免疫原性抗原である。
【００６３】
２４人の患者について、臨床試験を行い、免疫応答性を評価した。患者を、吸入によりインシュリン／ＤＫＰ複合体（インシュリン５８０６の分子量、約２ミクロンの複合体の大きさ）で４回処置した。処置後に検出された抗インシュリン抗体のレベルは、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡにより測定すると、処置前のレベルと異ならなかった（図１１）。これらのデータは、本明細書中に記載される薬物送達の組成物および方法が、臨床的に明らかな免疫応答を刺激しないことを示唆する。
１．膜または脂質二重層を横切って化合物を輸送するための方法であって、該方法は、該膜または二重層の近位面を該化合物とジケトピペラジン（ＤＫＰ）を含有する複合体に接触させる工程を包含し、該脂質二重層の近位面から該脂質二重層の遠位面への該化合物の輸送は、該ＤＫＰの不在下と比べて、該ＤＫＰの存在下で増加する、方法；
２．前記脂質二重層が、インタクトな細胞を含む、前記１に記載の方法；
３．前記細胞と前記複合体との接触の後に、免疫応答が実質的に誘導されない、前記２に記載の方法；
４．前記免疫応答が、前記ＤＫＰの存在下にて、該ＤＫＰの不在下と比べて、２０％未満増加する、前記３に記載の方法；
５．前記化合物が、生物学的に活性な因子である、前記１に記載の方法；
６．前記生物学的に活性な因子が、インシュリン、インシュリン前駆物質、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、ヒト成長ホルモン（ＨｇＨ）、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）、サイトカイン、ケモカインおよびこれらのフラグメントからなる群から選択される、前記５に記載の方法；
７．前記生物学的に活性な因子が、抗体またはそのフラグメントである、前記５に記載の方法；
８．前記複合体の直径が５ミクロン未満である、前記１に記載の方法；
９．前記複合体の直径が２．５ミクロン未満である、前記１に記載の方法；
１０．前記複合体の直径が、１．５ミクロンと２．５ミクロンとの間である、前記１に記載の方法；
１１．前記免疫応答が、抗体、Ｔ細胞増殖またはサイトカインの産生によって検出される、前記３に記載の方法；
１２．前記サイトカインがインターロイキン−２である、前記１１に記載の方法；
１３．前記ＤＫＰが、トール様レセプターと結合しない、前記１に記載の方法；
１４．肺の組織または細胞が接触される、前記１に記載の方法；
１５．前記肺の組織が、肺の小気道を含む、前記１４に記載の方法；
１６．前記組織が、肺胞を含む、前記１４に記載の方法；
１７．前記化合物の用量が、単回投与あたり、０．５ｍｇと１００ｍｇとの間である、前記１４に記載の方法；
１８．前記化合物の用量が、単回投与あたり、５００ｍｇと１０００ｍｇとの間である、前記１４に記載の方法；
１９．前記化合物の用量が、１日あたり２ｍｇと１６ｍｇとの間である、前記１４に記載の方法；
２０．前記化合物の分子量が２００ｋＤａ未満である、前記１４に記載の方法；
２１．前記化合物の分子量が１００ｋＤａ未満である、前記１４に記載の方法；
２２．前記化合物の分子量が１００ｋＤａ未満である、前記１４に記載の方法；
２３．前記化合物の分子量が、３ｋＤａと６ｋＤａとの間である、前記１４に記載の方法；
２４．前記組成物がポリペプチドである、前記１４に記載の方法；
２５．前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、哺乳動物の種のメンバーによって発現される、天然に存在するポリペプチドと同一である、前記２４に記載の方法；
２６．前記ポリペプチドが、インシュリン、インシュリン前駆物質、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、ヒト成長ホルモン（ＨｇＨ）、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）、またはこれらのフラグメントである、前記２４に記載の方法；
２７．前記ポリペプチドが、抗体またはこれらのフラグメントである、前記２４に記載の方法；
２８．前記方法が、複数の接触工程を包含する、前記１４に記載の方法；
２９．前記接触工程の間の時間間隔が、２４時間未満である、前記２８に記載の方法；
３０．前記間隔が、１２時間未満である、前記２９に記載の方法；
３１．前記間隔が、６時間未満である、前記２９に記載の方法；
３２．前記間隔が、３時間未満である、前記２９に記載の方法；
３３．前記複数の接触工程の後に、前記肺の組織における免疫細胞が、前記化合物との引き続く接触に対して非応答性である、前記２８に記載の方法；
３４．前記膜または脂質二重層が哺乳動物内に位置する、前記１に記載の方法；
３５．前記哺乳動物がヒトである、前記３４に記載の方法；
３６．前記複合体が経口投与される、前記３４に記載の方法；
３７．前記１〜３７のいずれか一つに記載の方法における使用のための組成物。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達組成物およびこれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
多くの治療化合物は、臨床的に有用でない。なぜならば、これらは、商業的開発には適さなくする、溶解性の逆説の餌食となるためである。これらの化合物は、水性環境を通って移動して標的細胞に到達し得るが、次いで、細胞の非極性脂質二重層を横切ることが困難であるために、細胞内標的に達し得ない。薬物投与の標準的な手段は、標的の特定の組織に対するその効率とその能力とにおいて制限される。さらに、いくつかの薬物送達剤は、炎症および毒性のような望ましくない副作用を生じる。
【発明の概要】
【０００３】
従って、毒性をほとんどまたは全く伴わない膜を横切って化合物を輸送するための方法および組成物を提供することが、本発明の目的である。
【０００４】
（発明の要旨）
毒性をほとんどまたは全く伴わずに、そして、適切な投与経路（すなわち、肺、胃腸（ＧＩ）管）を通って標的化される場合、免疫賦活をほとんどまたは全く伴わない、膜を横切って化合物を輸送するための組成物および方法が開発されている。この組成物は、他の方法では細胞に入らない化合物の細胞内送達を媒介し得、他の方法では非効率的に細胞に入る化合物の細胞内送達を増強し得る。
【０００５】
脂質二重層を横切って組成物を輸送するための方法は、脂質二重層の近位面（例えば、インタクトな細胞の表面）を化合物（例えば、治療剤）およびジケトピペラジン（ＤＫＰ）を含有する複合体に接触させることによって実行される。ＤＫＰおよび化合物は、互いに非共有結合しているか、または、互いに共有結合している。ＤＫＰと複合体化しない化合物の輸送速度と比べて、ＤＫＰと複合体化する化合物を含有する組成物の、脂質二重層の近位面（例えば、細胞外膜面）から脂質二重層の遠位面（例えば、細胞内膜面または細胞の細胞質）への輸送速度は、ＤＫＰの存在に起因して、より大きい。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】図１ａは、ナイーブ脾臓細胞のフマル酸ＤＫＰ（ＦＤＫＰ）−ミクロスフェア（ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標））に対する分裂促進的応答を示す、ｍｃｇ／ｍｌまたは％ 対 刺激指数の線グラフである。
【図１Ｂ】図１ｂは、臨床グレードのＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）の存在下におけるナイーブ脾臓細胞のインビトロ分裂促進研究から得た上清のサイトカイン分析を示す棒である。
【図２Ａ】図２ａは、臨床グレードまたは粗製のＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）の異なるバッチの存在下における、ヒトＰＢＭＣのインビトロ分裂促進研究を示す、棒グラフである。
【図２Ｂ】図２ｂは、ナイーブ脾臓細胞のＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）バッチの存在下におけるＰＢＭＣのインビトロ分裂促進研究から得た上清のサイトカイン分析を示す棒グラフである。
【図３】図３ａは、３７℃にて、ＯＶＡ−ＦＩＴＣまたはＯＶＡ−ＦＩＴＣ−ＦＴＳ ＦＤＫＰ（「ＯＶＡ＊ＴＥＣＨ−ＦＩＴＣ」）のいずれかの調製物 ２０μｇ／ｍｌと共にインキュベートした後の、Ａ４５９ヒト肺細胞株へのオブアルブミン（ＯＶＡ）−ＦＩＴＣ輸送の動力学を示す、時間（分）対 平均蛍光強度（ＭＦＩ）（単位）の棒グラフである。図３ｂは、３７℃にて、ＯＶＡ−ＦＩＴＣまたはＯＶＡ−ＦＩＴＣ−ＦＤＫＰ（「ＯＶＡ＊ＴＥＣＨ−ＦＩＴＣ」）のいずれかの調製物 ２０μｇ／ｍｌと共にインキュベートした後の、Ａ４５９細胞へのＯＶＡ−ＦＩＴＣの輸送増加（％で表す）を示す、時間（分）対 ＭＦＩの棒グラフである。
【図４】図４は、３７℃、４℃および０℃にてＯＶＡ−ＦＩＴＣ−スクシニルまたはＯＶＡ−ＦＩＴＣ−ＦＤＫＰ（ＯＶＡ＊ＴＥＣＨ−ＦＩＴＣ）のいずれか ２０μｇ／ｍｌと共に３０分間インキュベートした後の、Ａ４５９ヒト肺細胞へのＦＤＫＰミクロスフェアによるオブアルブミンの輸送の増加を示す、インキュベーション温度（℃）対 ＭＦＩ（単位）の棒グラフである。
【図５】図５は、３７℃における、培養していない脾臓細胞での、オボアルブミンのＦＤＫＰ−ミクロスフェア促進性輸送を示す、時間（分）対 ＭＦＩ（単位）の棒グラフである。
【図６】図６は、完全培地の存在下におけるＡ４５９肺細胞へのオボアルブミンの輸送を示す棒グラフである。
【図７】図７は、フェニラジンオキシドの存在下での、Ａ４５９肺細胞へのオボアルブミンの輸送を示す棒グラフである。
【図８】図８は、スクロースの存在下での、Ａ４５９肺細胞へのオボアルブミンの輸送を示す棒グラフである。
【図９】図９は、３７℃および種々のｐＨ条件（３、４、５、７．４および９）にて、ＯＶＡ−ＦＩＴＣまたはＯＶＡ−ＦＩＴＣ−ＦＤＫＰ（「ＯＶＡ＊ＴＥＣＨ−ＦＩＴＣ」）のいずれかの調製物 ２０μｇ／ｍｌと共にインキュベートした後の、Ｋ５６２細胞へのＦＩＴＣ−ＯＶＡの輸送を示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、３７℃における、Ａ４５９肺細胞への、インシュリンの輸送とインシュリン／ＦＤＫＰの輸送とを比較した、時間（分）対 ＭＦＩ（単位）の線グラフである。
【図１１】図１１は、吸入治療によりインシュリン／ＦＤＫＰ−ミクロスフェア複合体が投与される前（「ベースライン」）および後（「終点」）の、ヒト被験体における、インシュリン特異的ＩｇＧ抗体力価を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（詳細な説明）
本明細書中に記載される組成物および方法は、化合物をＤＫＰと複合体化することによって、膜を通る化合物の輸送を改善する。ＤＫＰは、標的細胞および標的組織への効率的な送達によって分子の治療能率を改善し、従って、低用量での処置を可能にする。必要に応じて、ＤＫＰは、合成または天然のポリマーでコーティングされる。
【０００８】
本明細書中で一般的に使用される「実質的に免疫応答がない」は、ＤＫＰの不在下と比べて、ＤＫＰの存在下で、免疫応答が５０％未満増加することを意味する。好ましくは、免疫応答は、２０％未満、１０％未満、５％未満増加するか、または全く増加しない。免疫応答は、抗体産生、サイトカイン分泌（例えば、インターロイキン−２）、またはＴ細胞のような免疫細胞の増殖を検出することによって測定される。ＤＫＰまたは複合体は、先天性の免疫（例えば、病原性関連分子パターンを認識するもの）の誘導に関与するレセプターに結合する。例えば、ＤＫＰまたは化合物−ＤＫＰ複合体は、トール様レセプター２に結合しない。
【０００９】
（Ｉ．組成物）
（Ａ．化合物）
種々の異なる化合物が、標的細胞（例えば、肺の肺胞細胞）への送達のために、ＦＤＫＰと複合体化され得る。これらの化合物は、ペプチドまたはタンパク質、オリゴ糖または多糖、核酸分子、およびこれらの化合物の組み合わせであり得る。送達される化合物としては、合成分子、合成低分子、または金属のような分子が挙げられる。組成物は、ＤＫＰと結合体化されるか、または複合体化される。
【００１０】
輸送される化合物としては、生物学的に活性な因子が挙げられる。送達される化合物としては、大きなタンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物および低分子が挙げられる。好ましくは、化合物はポリペプチドである。免疫応答を最小にするために、ポリペプチドのアミノ酸配列は、組成物が送達される哺乳動物の種のメンバーにより発現される、天然に存在するポリペプチドと同一または相同である。例えば、化合物は、インシュリンもしくはその生物学的に活性なフラグメント、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、ヒト成長ホルモン（ＨｇＨ）、グルカゴン様ペプチド（ＧＰＬ）、またはこれらのフラグメントのようなペプチドであり得る。化合物はまた、抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、病原性感染因子、悪性細胞または病原性分子に結合する抗体）であり得る。抗体は、インタクトなモノクローナル抗体または免疫学的に活性な抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ）２フラグメント）；遺伝子操作した単鎖Ｆｖ分子；またはキメラ分子（１つの抗体（例えば、マウス起源）の結合特異性を有し、残りの部分が別の抗体（例えば、ヒト起源）である抗体）であり得る。
【００１１】
化合物は、サイトカインまたはケモカインであり得る。ケモカインは、感染および炎症に応答して炎症性細胞を組織に集めるのに重要な役割を果たす、低分子のスーパーファミリーである。ケモカインは、白血球の遊走、位置付けならびに、脈管新生および白血球の脱顆粒のような他のプロセスを促進する。サイトカインは、免疫応答および炎症性応答を調節するのを補助するためのメッセンジャーとして機能する。最適以下の濃度である場合、適切な免疫応答が惹起し損なう。過剰である場合、サイトカインは、有害であり得、種々の疾患に関連し得る。治療目的に従って、ブロッキングサイトカインおよび増殖因子を添加することが、すでに認可されているかまたは臨床開発中の多数の薬物を用いる、証明された治療的アプローチである。
【００１２】
サイトカインスーパーファミリーは、エリスロポエチン、トロンボポエチン、顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）およびインターロイキン類（ＩＬ）のような因子を含む。専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）の機能を調節することが示されているサイトカインおよびケモカインの例としては、ＩＬ−４およびＩＬ−１３が挙げられ、これらは、クラスＩＩ ＭＨＣ（主要組織適合性抗原）の発現を誘導し、マクロファージおよびＢ細胞を活性化し、そして、ＩＧクラスの切り換え（Ｂ細胞の成熟の重要なプロセスであり、これは、高親和性の体液性応答の生成に不可避である）の頻度を増加させることが知られている。
【００１３】
インターロイキン４は、Ｂ細胞、Ｔ細胞および多くの非リンパ系細胞（単球、上皮細胞および線維芽細胞を含む）に複数の生物学的影響を有する、Ｔ細胞および肥満細胞由来の多面的なサイトカインである。インターロイキン４はまた、マウスＢ細胞によるＩｇＧ１およびＩｇＥの分泌、ならびに、ヒトＢ細胞によるＩｇＧ４およびＩｇＥの分泌を誘導する。ＩｇＥ、そして、おそらくＩｇＧ１およびＩｇＧ４のＩＬ４依存性の産生は、ＩＬ４誘導性のアイソタイプの切り換えに起因する。ヒトにおいて、ＩＬ４は、ＩＬ１３とこの機能を共有する。
【００１４】
インターロイキン１３は、活性化されたＴ細胞により分泌され、ＬＰＳ刺激単球により炎症性サイトカイン（ＩＬ１β、ＩＬ６、ＴＮＦαおよびＩＬ８）の産生を阻害する。ヒトおよびマウスのＩＬ１３は、ヒトＢ細胞上のＣＤ２３発現を誘導し、抗Ｉｇ抗体または抗ＣＤ４０抗体と組み合わせてＢ細胞の増殖を促進し、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＧ４の分泌を刺激する。ＩＬ１３はまた、ヒトの単球の生存を延長し、ＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ２３の表面発現を増加させることが示されている。ヒトおよびマウスのＩＬ１３は、
マウスＢ細胞における活性は知られていない。
【００１５】
クラスＩＩ ＭＨＣは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞（Ｂ細胞に支持を提供する（高親和性の免疫グロブリンを分泌する）ことに加え、エフェクター細胞として機能する）およびＣＤ８＋
Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球−ＣＴＬ）に対する、抗原由来ペプチドの提示に重要である。
【００１６】
（ｂ．ジケトピペラジン）
ジケトピペラジン（ＤＫＰ）は、会合した分子（例えば、薬物、治療剤またはワクチン）の細胞内および組織を横切る送達を促進する、細胞輸送体として機能する。
【００１７】
ＦＤＫＰ微粒子は、不溶性であり、かつ、１つのｐＨで安定であり、別のｐＨでは不安定かつ／または溶解性になる、自己集合複合体である。ＦＤＫＰ微粒子は、一般に、直径２ミクロンである。好ましい実施形態において、ＤＫＰは、中性または生理学的なｐＨにおいて可溶性である。ＦＤＫＰ微粒子およびＦＤＫＰ微粒子を作製する方法は、米国特第５，３５２，４６１号；同第５，５０３，８５２号；および同第６，０７１，４９７号
（本明細書中に参考として援用される）に記載される。米国特許第５，８７７，１７４号；同第６，１５３，６１３号；同第５，６９３，３３８号、同第５，９７６，５６９号；同第６，３３１，３１８号；および同第６，３９５，７７４号は、置換および誘導体化ＤＫＰを記載し、これらは、本明細書中に参考として援用される。ＦＤＫＰ（３，６−ビス［Ｎ−フマル酸−Ｎ−（ｎ−ブチル）アミノ］―２，５−ＤＫＰ、ＣＡＳ登録番号１７６７３８−９１−３）は、以下の構造を有する：
【００１８】
【化１】
【００１９】
ＦＤＫＰ微粒子は、溶液中へのＤＫＰ液滴の沈殿により形成される。治療剤（例えば、インシュリン）のような組成物は、フマル酸ＤＫＰと共に酸性溶液中で沈殿させることによって、安定な複合体に処方された。個体への投与に際して、ＤＫＰ微粒子は迅速に溶解し、ＤＫＰ微粒子の周りに沈殿した天然または合成のポリマーによって形成される、回旋状の高表面領域マトリクスを放出する。試験される因子を用いてＤＫＰを沈殿させることによって、マトリクス内の濃い濃度の因子が達成される。 ＤＫＰは、左右対称に官能化されており、２つの側鎖は、同一である。あるいは、ＤＫＰは、非対称に官能化され得る。左右対称に官能化されたＤＫＰおよび非対称に官能化されたＤＫＰの両方が、酸性基、塩基性基またはこれらの組み合わせを含む側鎖を有し得る。
【００２０】
２つの側鎖の各々に０、１および２の保護基を有するＤＫＰは、溶媒および溶液のｐＨに依存して異なる溶解性を有し、沈殿により溶液から単離される。従って、１つの保護された側鎖を有するＤＫＰを選択的に脱保護し、沈殿させて、非左右対称に置換されたＤＫＰが得られる。その単保護化ＤＫＰ誘導体自体は、酸性媒体中で可溶性であり、弱アルカリ性溶液中で不溶性である傾向がある。
【００２１】
ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）は、ＭａｎｎＫｉｎｄ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（以前は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎとして知られていた）により開発された、ＤＫＰからなる微粒子に与えられた名称である。頻繁な肺投与を含む、複数の臨床治験において、ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）は、Ｉ型およびＩＩ型の糖尿病患者におけるインシュリンの送達について、所望の安全プロフィールを示した。
【００２２】
ＦＫＤＰ微粒子（ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標））は、不活性であり（図１ａ〜２ｂを参照のこと）、実質的に副作用を伴わずに、細胞内取り込みを増強する。
【００２３】
ＦＤＫＰ粒子は、種々の分子（低分子、有機分子、生体高分子（例えば、タンパク質およびペプチド）、および核酸を含む）の、生物学的活性を保持したままでの細胞への取り込みを促進する。小さなタンパク質（例えば、インシュリン、約５〜６ｋＤａ）および大きなタンパク質（例えば、トリアルブミン；４５ｋＤａ）の両方が、細胞内に効率的に輸送される。
【００２４】
（ｃ．微粒子のサイズと重量）
深部の肺組織への優先的な送達を達成するために、組成物／ＤＫＰ複合体のサイズは、直径２０ミクロン未満であり、好ましくは、直径１０ミクロン未満であり、そして、より好ましくは、直径５ミクロン未満である。５ミクロンより大きい粒子は通常、大きすぎて、肺の深部組織（肺胞）にアクセスできない。肺胞送達のためには、例えば、サイズは直径２．５ミクロン未満であり、例えば、複合体の直径は、１．５ミクロン〜２．５ミクロンの範囲である。
【００２５】
複合体のサイズ／構造は、細胞膜を横切る効率的な輸送に有利に働き、免疫賦活を最小限にする。この組成物の分子量は、２００ｋＤａ未満（例えば、より好ましくは、１００ｋＤａ未満）である。好ましくは、分子量は５０ｋＤａ未満である。より好ましくは、組成物の分子量は、２０ｋＤａ未満または１０ｋＤａ未満（例えば、３〜６ｋＤａの範囲）である。例えば、ヒトインシュリン（５〜６ｋＤａの間の分子量）は、実質的に免疫賦活を伴わずに、効率的に送達される。
【００２６】
（ｄ．投薬量）
送達される組成物の用量は、高いゾーン耐性および／またはクローンアネルギーに有利に働き、それによって、投与される組成物に対して免疫非反応性を確実にする。例えば、組成物の用量は、単回投与あたり、０．５ｍｇ〜１００ｍｇの範囲である。好ましくは、吸入されるインシュリンの用量は、ヒトへの投与について、単回投与あたり５００μｇ〜１０００μｇの範囲（代表的には、単回投与あたり１ｍｇ〜４ｍｇの範囲、または、１日あたり４ｍｇ〜１６ｍｇの範囲）である。
【００２７】
（ｅ．ＤＫＰ上のコーティング）
ＤＫＰ微粒子は、天然および／または合成のポリマー（最も好ましくは、生分解性ポリマー）のような材料でコーティングされ得る。代表的な天然ポリマーとしては、タンパク質（例えば、アルブミン（好ましくは、ヒトアルブミン）、フィブリン、ゼラチンおよびコラーゲン）および多糖（例えば、アリギネート、セルロース、デキストランおよびキトサン）が挙げられる。代表的な合成ポリマーとしては、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、これらのコポリマー（例えば、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ））、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシアルカノエート、ならびに、好ましくはないが、非生分解性のポリマー（例えば、ポリアクリル酸、ポリスチレンおよびポリエチレンビニルアセテート）が挙げられる。
【００２８】
（ＩＩ．組成物の作製方法）
ＦＤＫＰ微粒子は、好ましくは、以下の工程によってカプセル化される所望の化合物の存在下で形成される：
（１）１つ以上の酸性基を含むＤＫＰ誘導体の弱アルカリ性溶液の酸性化、
（２）１つ以上の塩基性基を含むＤＫＰ誘導体の弱酸性溶液の塩基性化、または
（３）酸性基と塩基性基との両方を含むＤＫＰ誘導体の酸性または塩基性溶液の中性化。
【００２９】
必要に応じて、ＤＫＰ微粒子は、天然または合成のポリマーのマトリクス内でＤＫＰ粒子を沈殿させることによって、ポリマーでコーティングされ得る。
【００３０】
ＤＫＰの側鎖の改変、種々の反応物質の濃度、処方のために用いられる条件、および、形成に用いられるプロセスが、得られる微粒子のサイズを制御し得る。
【００３１】
（ＩＩＩ．組成物の使用）
標的細胞への輸送と、その後の、化合物会合ＤＫＰ調製物の投与の加速および拡大は、治療適用を改善するためのこの方法の使用についての一例である。
【００３２】
微粒子または懸濁物（ｐＨ７．４にて、リン酸緩衝化生理食塩水中で作製された）としてのＤＫＰ複合体調製物が、標的細胞（例えば、深部肺組織）に投与される。ＤＫＰ−化合物複合体は、免疫応答を最小限にする計画および用量を用いて、粘膜表面（肺、鼻、膣、直腸または口）に投与される。適切な濃度および免疫計画は、標準的な技術を用いて決定され、各化合物について最適化される。治療組成物（例えば、インシュリン）は、ｍｇ用量範囲で投与される（そして、それによって、高いゾーン耐性の発生による免疫賦活を避ける）。
【００３３】
ヒトまたは他の哺乳動物内の特定部位へと組成物を送達する方法は、化合物およびＤＫＰを含む複合体に細胞または組織を接触させることによって実施される。好ましい実施形態において、組成物は、肺の小気道（例えば、肺胞）へと送達される。必要に応じて、組成物は、経口投与されるが、代表的には、皮下または皮内、静脈内、腹腔内、または筋肉内に投与される。１つの実施形態において、組成物は吸入により投与される。
【００３４】
この方法は、好ましくは、所定の時間内に、複数の接触工程を包含する。例えば、接触工程間の間隔は、２４時間未満であり得る。複合体は、１日に数回送達され得る。従って、接触工程間の時間は、１２時間未満、６時間未満または３時間未満であり得る。複数の接触工程の後、組織内の免疫細胞は、その後の組成物との接触に非反応性である。
【００３５】
計画に関して、免疫細胞は、最初の刺激に応答した後、強力な抗原特異的免疫応答を達成するための第２の刺激を受け取る前に、数日〜数週間または数ヶ月の休息期間を必要とする。インシュリンが吸入される場合、組成物は、代表的には、１日に３〜４回患者に投与される。この計画は、刺激間の間隔が非常に短いことによって特徴付けられ、従って、免疫細胞を、その後のシグナルに対して静止状態でありかつ受容性にする。この計画は、耐性、アネルギーまたは、抗原特異的免疫細胞のアポトーシスを引き起こすべきであり、正の免疫応答を生じない。
【００３６】
（コーティングされたＤＫＰ微粒子の投与）
１つの実施形態において、コーティングされたジケトピペラジンが投与され、その結果、組成物が患者に投与された後に、貯蔵物（ｄｅｐｏｔ）を形成する。中性ｐＨへの暴露の際のジケトピペラジンの溶解の後に、抗原が放出され、残りのコーティングは、抗原の高い局所濃度を含む、多面迷宮様構造（ｍｕｌｔｉ−ｆａｃｅｔｅｄ ｌａｂｙｒｉｎｔｈ−ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）である。抗原は、末梢の免疫細胞を貯蔵物に引き付け、これにより、エフェクター細胞、サイトカインおよびケモカインの高濃度を生じる。貯蔵物は、種々の免疫応答を開始するか、または、抗原に対する免疫応答を調節するための必須の成分を提供する。
【００３７】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、さらに理解される。
【実施例】
【００３８】
（実施例１：フマル酸ＤＫＰは、先天性免疫を刺激しない）
ＤＫＰがその化学組成または病原性配列（例えば、殺傷型Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の模倣の可能性に起因する免疫賦活特性を保有するという可能性を排除するために、ナイーブＢａｌｂ／ｃマウス由来の脾細胞を、微粒子として処方された「ブランク」のフマル酸ＤＫＰ（ＦＤＫＰ）の３つのバッチと共にインキュベートし、種々の濃度において、ＯＶＡと会合したＦＤＫＰ（「ＴＣＮＳＰ＊ＯＶＡ」）と比較した。このアッセイは、これらの細胞の励起および増殖を生じる、微量の夾雑物または分裂促進因子に対する静止期のＴ細胞の高い感受性により選択した。脾細胞の増殖性応答を、３Ｈ−チミジン取り込みアッセイにより測定した。種々のバッチからのＦＤＫＰのブランク微粒子は、コントロール（培地のみ）に匹敵する増殖を誘導した。これらのデータは、ＦＤＫＰが免疫賦活性でないことを示した。
【００３９】
培養物から分泌されるサイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−２）の分析をまた実施した。このアッセイを、５日間培養したナイーブマウスの脾臓細胞を用いてＦＤＫＰミクロスフェアの分裂促進性を試験するための二次的な確認アッセイとして使用した。図１ａは、フマル酸ＤＫＰ（ＦＤＫＰ）−ミクロスフェア（ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標））に対するナイーブ脾臓細胞の分裂促進的な応答を示す線グラフである。ナイーブマウスから回収した脾細胞のプールを用いて、分裂促進的アッセイを実施した。ナイーブ細胞を９６ウェルｕ底組織培養処理プレート中、５×１０５細胞／ウェルにて播種した。細胞を、１００μｇ／ｍｌの種々のバッチのＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）（臨床グレードのブランクＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）バッチ、ＴＷＥＥＮ（登録商標）を含まない臨床グレードのバッチおよび２つの粗製バッチを含む）と共にインキュベートした。ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（１００％）をまた試験に含めた。全てのサンプルを、０．７μｇ／ｍｌ ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）または０．７％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０の濃度に対して、２×で７回滴定した。分裂促進性のバックグラウンドレベルを評価するために、細胞を培地のみとインキュベートした。刺激の最大レベルを決定するために、細胞をコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）と共にインキュベートした。細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２にて、７２時間インキュベートした。この培養物を１００μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−チミジンでパルスし、さらに１６時間インキュベートした。培地コントロールと比較して、アッセイについて記録された３Ｈ−チミジン取り込みの値から、取り込み率を算出した。
【００４０】
ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ） Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｍｏｕｓｅ Ｔｈ１／Ｔｈ２ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｎａｌｙｓｉｓを用いて、サイトカイン分析を行った。１００μｇ／ｍｌのＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）結合Ｏｖａ（バッチ番号２０２．２４．１、２０２．３３．１および２０２．０４０）の存在下、およびブランクのＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）（バッチ番号Ｄ−０３５Ｕ．０２．００２）の存在下でインキュベートした細胞から上清を回収した。ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−５、ＩＬ−４およびＩＬ−２のレベルを、各サイトカインの標準曲線を用いて定量した。
【００４１】
図１ｂに示すように、高いレベルのγＩＦＮ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２が、オボアルブミン（ポジティブコントロール）と共にインキュベートした培養物について示されたが、種々のバッチのＦＤＫＰミクロスフェアについては、わずかなレベルの任意のサイトカインを記録した。
【００４２】
さらに、ＦＤＫＰは、５日間の培養でヒト末梢血リンパ球（ｈｕＰＢＬ）を刺激し得る分裂促進因子を結合することを示した（図２ａ）。リンパ球プレップから単離したＰＢＭＣを用いて、分裂促進アッセイを実施した。ナイーブ細胞を、９６ウェルｕ底組織培養処理プレートに５×１０５細胞／ウェルにて播種した。この細胞を、１００μｇ／ｍｌおよび、連続２倍段階希釈の破傷風トキソイドまたはいくつかのブランクのＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）バッチ（ＴＷＥＥＮを含まない臨床グレードのバッチおよびいくつかの粗製（ＴＷＥＥＮなし）バッチを含む）と共にインキュベートした。分裂促進性のバックグラウンドレベルを評価するために、細胞を培地のみとインキュベートした。刺激の最大レベルを決定するために、細胞をフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）と共にインキュベートした。細胞を、３７℃、５％ ＣＯ２にて、７２時間インキュベートした。この培養物を１００μＣｉ／ｍｌの３Ｈ−チミジンでパルスし、さらに１６時間インキュベートした。培地と比較して、アッセイについて記録された３Ｈ−チミジン取り込みの値から、分裂促進率を算出した。
【００４３】
種々のバッチの処方されたブランク（すなわち、負荷なし）のＦＤＫＰ ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）（Ｄ０３５Ｕ．０２．００２、Ｄ０３５Ｕ．０２．００２またはＴＷＥＥＮを含まない）または粗製の処方されていないＦＤＫＰ ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ（登録商標）（００１．Ｅ．０２−０１１および００１．Ｅ．０２−０１２）は、ｈｕＰＢＬを刺激して、培地コントロールのベースラインを超えて増殖しなかった。強力な想起（ｒｅｃａｌｌ）抗原である破傷風トキソイドを、抗原特異的な増殖応答を示すポジティブコントロールとして使用した（図２ａを参照のこと）。
【００４４】
これらの培養物により分泌されるサイトカインの分析を、ＨｕＰＢＬを用いてＦＤＫＰミクロスフェアの分裂促進性を試験するための二次確認アッセイとして使用した。高いレベルのγＩＦＮ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２が、破傷風トキソイド（ポジティブコントロール）と共にインキュベートした培養物について示されたが、種々のバッチのＦＤＫＰミクロスフェアについては、わずかなレベルの任意のサイトカインを記録した（図２ｂを参照のこと）。従って、ＦＤＫＰは、先天性の免疫応答を刺激し損ない、これは、その作用機構が、伝統的な細菌アジュバント、またはトール様レセプター（例えば、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５またはＴＬＲ−９）に結合し得るＤＮＡの切れ端とは異なることを示した。
【００４５】
免疫原性を評価するための実験をまた、インビボで実施した。インシュリンＤＫＰ−ミクロスフェアを、吸入治療によりヒト被験体に投与した。ＦＤＫＰ（２ミクロンのメジアン直径を有する粒子および、１〜５ミクロンの範囲の直径を有する粒子）と共に処方された１２Ｕ、２４Ｕまたは４８Ｕのインシュリン用量（それぞれ４５０μｇ、９００μｇおよび１．８ｍｇのインシュリンに対応）を、処置の間に、一週間間隔で６回投与した。処置の前後に、血清サンプルを被験体から得た（６回の吸入の後）。図１１は、吸入治療によりインシュリン／ＦＤＫＰ−ミクロスフェア複合体が投与される前（「ベースライン」）および後（「終点」）の、ヒト被験体における、インシュリン特異的ＩｇＧ抗体力価を示す棒グラフである。図１１に示すように、インシュリン−ＦＤＫＰ−ミクロスフェア複合体の肺投与は、処置された患者の血清においてインシュリン特異的抗体の増加をもたらさなかった。
【００４６】
（実施例２：輸送反応速度論）
輸送化合物としてオボアルブミン（ＯＶＡ）を用いて、取り込み実験を行った。
【００４７】
一つの実験において、肺細胞を、種々のインキュベーション時間にて輸送化合物と共にインキュベートした。図３ａおよび３ｂに示すように、３７℃において、ＯＶＡについて約５０％の輸送が、最初の１０分で達成され、３０分以内に完全飽和（１００％）が生じた。これらのデータは、細胞による化合物の取り込みが、本発明のＦＤＫＰによって増加することを示す。
【００４８】
図４は、３７℃、４℃および０℃にてＯＶＡ−ＦＩＴＣ−スクシニルまたはＯＶＡ−ＦＩＴＣ−ＦＤＫＰ（ＯＶＡ＊ＴＥＣＨ−ＦＩＴＣ）の２０μｇ／ｍｌと共に３０分間インキュベートした後の、Ａ４５９ヒト肺細胞へのＯＶＡ−ＦＩＴＣの輸送を示す、棒グラフである。細胞を、ＯＶＡまたはＯＶＡ−ＦＤＫＰ−ミクロスフェア複合体またはＯＶＡ−スクシニルＦＤＫＰ−ミクロスフェア複合体と、３０分間接触させ、その後、（細胞内への化合物の輸送の指標として）蛍光を測定した。両方の複合体が、ＦＤＫＰを伴わないＯＶＡ−ＦＩＴＣについての輸送と比べて、全ての温度について大いに改善された輸送を有した。ＯＶＡ−ＦＩＴＣ−ＦＤＫＰは、輸送において最大の改善を有した。
【００４９】
インシュリンの肺細胞への輸送をまた評価した（図１０を参照のこと）。図１０は、インシュリンは肺細胞へと輸送されなかったが、インシュリン／ＦＤＫＰ複合体は肺細胞に輸送されたことを示す棒グラフである。このデータは、３０〜６０分で有意な細胞内取り込みを示し、ＤＫＰ−ミクロスフェアの非存在下におけるインシュリンと比較して、ＤＫＰ−ミクロスフェアと結合した場合、インシュリンの取り込みを２８〜４０倍増加したことを示す。
【００５０】
（実施例３：脾臓細胞における輸送増強）
未培養の初代細胞を用いて、化合物の標的細胞への輸送速度を研究した。単離されたマウス脾臓細胞を用いて、化合物の輸送速度との時間経過比較を行った。ＢＡＬＢ／Ｃマウスから脾臓を摘出し、細胞懸濁物を調製した。単離された細胞を、４×１０６細胞／ｍｌの密度にて、完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ ＦＢＳ、１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中でインキュベートした。オボアルブミン−ＦＩＴＣまたはオボアルブミン−ＦＩＴＣ／ＦＤＫＰを２０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、細胞を３７℃にて所定の時間インキュベートした。８容量のＰＢＳを各インキュベーション期間の終わりに添加し、そして、全ての時点が終わるまで、細胞を氷上に置いた。細胞を遠心分離し、再懸濁して、ＦＡＣＳによりＦＩＴＣ取り込みについて分析した。
【００５１】
図５は、３７℃における、培養していない脾臓細胞での、試験化合物、オボアルブミンのＦＤＫＰ−ミクロスフェア促進性輸送を示す棒グラフである。脾細胞によるオボアルブミンの取り込みの増強は、ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥの存在下で１０分以内に立証され、このことは、これまでに試験した細胞型における膜浸透の迅速かつ普遍的な増強を示した（図５を参照のこと）。ＯＶＡ−ＦＩＴＳ／ＦＤＫＰとの６０分間のインキュベーションの後、別の細胞集団の存在が明らかとなった。細胞の生存度は、悪影響を及ぼされていなかった。
【００５２】
（実施例４：血清含有培地における輸送）
オボアルブミン−ＦＩＴＣの輸送を、血清の存在下、インビボ臨床適用に関連する条件下で測定した。Ｋ５６２細胞を、培地単独または１０％ ＦＢＳを含む培地中で、４×１０６細胞／ｍＬの細胞密度にて、オボアルブミン−ＦＩＴＣまたはオボアルブミン−ＦＩＴＣ／ＦＤＫＰのいずれかと共に、インキュベートした（３０分間、３７℃、２０μｇ／ｍＬ）。洗浄後、細胞を、ＦＩＴＣ取り込みについてＦＡＣＳにて分析した。分析前に、細胞をＶＩＡＰＲＯＢＥ（細胞生存性染色）を用いて染色した。
【００５３】
図６は、完全培地の存在下におけるＡ４５９肺細胞へのオボアルブミンの輸送を示す棒グラフである。細胞内オボアルブミン含量の５倍以上の増強が、３７℃にて３０分後に、血清の存在下で示された（図６を参照のこと）。
【００５４】
（実施例５：広範囲のｐＨにわたる輸送の増強）
Ｋ５６２細胞を、ｐＨ３、４、５、７．４または９に調整したＢＤ細胞染色溶液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）中で、４×１０６細胞／ｍＬの細胞密度にて、オボアルブミン−ＦＩＴＣまたはオボアルブミン−ＦＩＴＣ／ＦＤＫＰのいずれかと共にインキュベートした（３０分間、３７℃、２０μｇ／ｍＬ）。洗浄後、細胞をＶＩＡＰＲＯＢＥ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて氷上で５分間染色し、生存細胞のＦＩＴＣ含量をＦＡＣＳ分析により決定した。
【００５５】
ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥによる輸送増強を、ｐＨ４および５を除く研究された全てのｐＨにおいて検出した（図９を参照のこと）。図９に示すように、増強は、ｐＨ９において特に有意であった（５倍近い増加）。これらのデータは、ＦＤＫＰ−ミクロスフェアが、広範囲のｐＨにより特徴付けられる身体の種々の領域（アルカリ条件により特徴付けられる領域（例えば、腸管組織）を含む）における、細胞膜を横切る会合した化合物の増大した輸送に特に効果的であることを示す。
【００５６】
（実施例６：輸送の増強に対する架橋剤の効果）
ＤＫＰミクロスフェアが増強する輸送が、クラスリンで覆われた窩（これは、レセプター媒介性のエンドサイトーシスに関与し、特定の毒素、レクチン、ウイルス、血清輸送タンパク質、抗体、ホルモンおよび成長因子の細胞取り込みを担うことが述べられている）を介する、レセプター媒介性のエンドサイトーシスによって生じないことを確認するための研究を行った。これらの窩の形成は、高浸透性のスクロース溶液の存在下で阻害される。膜のチオール基の架橋は、エンドサイトーシスを防止する別の手段である。なぜならば、チオール基は、多数の分子（水、尿素およびアミノ酸を含む）の膜輸送において重要な役割を果たすためである。チオールの酸化還元状態はまた、膜障壁機能を維持する上で重要である。フェニラジンオキシドを用いて架橋した膜のチオール基を使用して、ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥがエンドサイトーシスに依存するかどうかを決定した。
【００５７】
Ｋ５６２細胞を、血清を含まないＲＰＭＩ培地中、８０μＭフェニラジンオキシド（ＳＩＧＭＡ）で前処理した（５分間、３７℃）。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、その後、１０％血清含有培地中で、オボアルブミン−ＦＩＴＣまたはオボアルブミン−ＦＩＴＣ／ＦＤＫＰのいずれかと共に細胞をインキュベートした（３０分間、３７℃、以前の輸送研究について示した細胞および標識の条件にて）。高浸透性のスクロース溶液の効果について、０．５Ｍスクロースを含有する培地の存在下でインキュベーションを行った。細胞を洗浄し、ＦＡＣＳで分析した。処理後の細胞の生存度を、以前に示したように、ＶＩＡＰＲＯＢＥを用いて評価し、分析は、生存細胞のみを反映する。
【００５８】
図７は、フェニラジンオキシドの存在下での、Ａ４５９肺細胞へのオボアルブミンの輸送を示す棒グラフである。図８は、スクロースの存在下での、Ａ４５９肺細胞へのオボアルブミンの輸送を示す棒グラフである。両方の処理に関して、ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥ媒介性の輸送の増強が、完全培地のみで見られる増強と比べて減少した。しかしながら、増強は依然として観察され、このことは、これらの処理による膜へのかなりの変更にも関わらず、ＴＥＣＨＮＯＳＰＨＥＲＥの輸送増強機構が、依然として有効であることを示した（図７および８）。
【００５９】
（実施例７：薬物送達を促進するための輸送体としてのＤＫＰアナログ）
ＤＫＰのスクシニルアナログを、化合物の細胞内輸送の促進因子として評価した。ＤＫＰのスクシニルアナログをＯＶＡと会合させ、ヒト肺細胞をこの複合体に接触させた。図４は、スクシニルＤＫＰと会合したＯＶＡおよびフマル酸ＤＫＰの、ＯＶＡ単独と比べて増強された輸送を示す。
【００６０】
（実施例８：ＤＫＰ複合体の組織標的化送達は、免疫応答を刺激しない）
組成物の用量、投与計画、組成物の大きさ／構造および投与部位を、免疫系の最小限の刺激を伴うか、または刺激を伴わずに、細胞への効果的な薬物送達を達成するために、最適化した。例えば、深部肺への堆積を達成するための、１日あたり１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量範囲における吸入によるインシュリンの送達（小さな（例えば、２ミクロン）のインシュリン／ＦＤＫＰ複合体（これは、肺の肺胞に堆積する）を用いる）は、免疫応答を刺激しなかった。深部肺（肺胞）は、免疫応答を生じない環境を提供し、それによって、吸入された小さな粒子に対する有害な応答の発生を回避する。ミクロンサイズの小さな粒子は、深部の呼吸器組織（例えば、肺胞）へのアクセス、および免疫抑制条件により特徴付けられる環境を獲得し得る。対照的に、より大きい粒子（＞５〜１０ミクロン）は、上部の呼吸器管に堆積する。このような大きい粒子は、肺胞組織の免疫抑制条件へのアクセスを獲得せず、従って、免疫応答を刺激し得る。
【００６１】
１回の処理で与えられるインシュリンの用量は、免疫応答を惹起するのに用いられるペプチドの量をはるかに上回る。免疫応答を誘導するよりはむしろ（ｒａｔｈｅｒ ｔｈｅｎ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、投与される用量は、免疫の非応答性（例えば、耐性、クローンアネルギー）を誘導する。例えば、μｇ用量範囲（例えば、５０μｇ）で投与されるペプチド（例えば、ｉ．ｍ．ワクチン）は、免疫応答を刺激するが、吸入により与えられる５ｍｇまたは１０ｍｇのインシュリン／ＦＤＫＰ複合体は、免疫応答の刺激をもたらさないことが予想される。
【００６２】
（実施例９：送達される化合物の大きさの影響）
送達される化合物の構造および大きさはまた、その免疫原性に影響を有する。低分子ペプチドは、あまり免疫原性でなく、一方で、より大きな異種分子または複合体分子は、より免疫原性である。試験されるヒトインシュリン組成物（５８０７．６ダルトンの分子量）は、肺組織に送達される場合に、免疫応答を刺激する可能性が低いことが予想される。免疫刺激をさらに最小にするために、免疫適合性組成物を用いる。例えば、インシュリンのヒト形態は、ヒトにおいて弱い免疫原性抗原である。
【００６３】
２４人の患者について、臨床試験を行い、免疫応答性を評価した。患者を、吸入によりインシュリン／ＤＫＰ複合体（インシュリン５８０６の分子量、約２ミクロンの複合体の大きさ）で４回処置した。処置後に検出された抗インシュリン抗体のレベルは、ＩｇＧ ＥＬＩＳＡにより測定すると、処置前のレベルと異ならなかった（図１１）。これらのデータは、本明細書中に記載される薬物送達の組成物および方法が、臨床的に明らかな免疫応答を刺激しないことを示唆する。
１．膜または脂質二重層を横切って化合物を輸送するための方法であって、該方法は、該膜または二重層の近位面を該化合物とジケトピペラジン（ＤＫＰ）を含有する複合体に接触させる工程を包含し、該脂質二重層の近位面から該脂質二重層の遠位面への該化合物の輸送は、該ＤＫＰの不在下と比べて、該ＤＫＰの存在下で増加する、方法；
２．前記脂質二重層が、インタクトな細胞を含む、前記１に記載の方法；
３．前記細胞と前記複合体との接触の後に、免疫応答が実質的に誘導されない、前記２に記載の方法；
４．前記免疫応答が、前記ＤＫＰの存在下にて、該ＤＫＰの不在下と比べて、２０％未満増加する、前記３に記載の方法；
５．前記化合物が、生物学的に活性な因子である、前記１に記載の方法；
６．前記生物学的に活性な因子が、インシュリン、インシュリン前駆物質、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、ヒト成長ホルモン（ＨｇＨ）、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）、サイトカイン、ケモカインおよびこれらのフラグメントからなる群から選択される、前記５に記載の方法；
７．前記生物学的に活性な因子が、抗体またはそのフラグメントである、前記５に記載の方法；
８．前記複合体の直径が５ミクロン未満である、前記１に記載の方法；
９．前記複合体の直径が２．５ミクロン未満である、前記１に記載の方法；
１０．前記複合体の直径が、１．５ミクロンと２．５ミクロンとの間である、前記１に記載の方法；
１１．前記免疫応答が、抗体、Ｔ細胞増殖またはサイトカインの産生によって検出される、前記３に記載の方法；
１２．前記サイトカインがインターロイキン−２である、前記１１に記載の方法；
１３．前記ＤＫＰが、トール様レセプターと結合しない、前記１に記載の方法；
１４．肺の組織または細胞が接触される、前記１に記載の方法；
１５．前記肺の組織が、肺の小気道を含む、前記１４に記載の方法；
１６．前記組織が、肺胞を含む、前記１４に記載の方法；
１７．前記化合物の用量が、単回投与あたり、０．５ｍｇと１００ｍｇとの間である、前記１４に記載の方法；
１８．前記化合物の用量が、単回投与あたり、５００ｍｇと１０００ｍｇとの間である、前記１４に記載の方法；
１９．前記化合物の用量が、１日あたり２ｍｇと１６ｍｇとの間である、前記１４に記載の方法；
２０．前記化合物の分子量が２００ｋＤａ未満である、前記１４に記載の方法；
２１．前記化合物の分子量が１００ｋＤａ未満である、前記１４に記載の方法；
２２．前記化合物の分子量が１００ｋＤａ未満である、前記１４に記載の方法；
２３．前記化合物の分子量が、３ｋＤａと６ｋＤａとの間である、前記１４に記載の方法；
２４．前記組成物がポリペプチドである、前記１４に記載の方法；
２５．前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、哺乳動物の種のメンバーによって発現される、天然に存在するポリペプチドと同一である、前記２４に記載の方法；
２６．前記ポリペプチドが、インシュリン、インシュリン前駆物質、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、ヒト成長ホルモン（ＨｇＨ）、グルカゴン様ペプチド（ＧＬＰ）、またはこれらのフラグメントである、前記２４に記載の方法；
２７．前記ポリペプチドが、抗体またはこれらのフラグメントである、前記２４に記載の方法；
２８．前記方法が、複数の接触工程を包含する、前記１４に記載の方法；
２９．前記接触工程の間の時間間隔が、２４時間未満である、前記２８に記載の方法；
３０．前記間隔が、１２時間未満である、前記２９に記載の方法；
３１．前記間隔が、６時間未満である、前記２９に記載の方法；
３２．前記間隔が、３時間未満である、前記２９に記載の方法；
３３．前記複数の接触工程の後に、前記肺の組織における免疫細胞が、前記化合物との引き続く接触に対して非応答性である、前記２８に記載の方法；
３４．前記膜または脂質二重層が哺乳動物内に位置する、前記１に記載の方法；
３５．前記哺乳動物がヒトである、前記３４に記載の方法；
３６．前記複合体が経口投与される、前記３４に記載の方法；
３７．前記１〜３７のいずれか一つに記載の方法における使用のための組成物。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジケトピペラジンとグルカゴン様ペプチド１（ＧＰＬ−１）を含む微粒子を含む組成物。
【請求項２】
前記ジケトピペラジンがフマリルジケトピペラジンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ジケトピペラジン微粒子の直径が約１．５ミクロン〜約２０ミクロンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ジケトピペラジン微粒子の直径が１０ミクロン未満、または５ミクロン未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ジケトピペラジン微粒子の直径が１．５ミクロン〜２．５ミクロンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
哺乳動物に化合物を送達するための組成物であって、ジケトピペラジン微粒子を含み、該化合物がＧＰＬ−１である、組成物。
【請求項７】
皮下に、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、または吸入により投与される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
肺、鼻、膣、直腸または口の粘膜表面に投与される、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記ジケトピペラジンがフマリルジケトピペラジンである、請求項６に記載の組成物
【請求項１０】
前記ジケトピペラジン微粒子の直径が約１．５ミクロン〜約２０ミクロンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ジケトピペラジン微粒子の直径が１０ミクロン未満、または５ミクロン未満である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ジケトピペラジン微粒子の直径が１．５ミクロン〜２．５ミクロンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項１】
ジケトピペラジンとグルカゴン様ペプチド１（ＧＰＬ−１）を含む微粒子を含む組成物。
【請求項２】
前記ジケトピペラジンがフマリルジケトピペラジンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ジケトピペラジン微粒子の直径が約１．５ミクロン〜約２０ミクロンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ジケトピペラジン微粒子の直径が１０ミクロン未満、または５ミクロン未満である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ジケトピペラジン微粒子の直径が１．５ミクロン〜２．５ミクロンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
哺乳動物に化合物を送達するための組成物であって、ジケトピペラジン微粒子を含み、該化合物がＧＰＬ−１である、組成物。
【請求項７】
皮下に、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、または吸入により投与される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
肺、鼻、膣、直腸または口の粘膜表面に投与される、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記ジケトピペラジンがフマリルジケトピペラジンである、請求項６に記載の組成物
【請求項１０】
前記ジケトピペラジン微粒子の直径が約１．５ミクロン〜約２０ミクロンである、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ジケトピペラジン微粒子の直径が１０ミクロン未満、または５ミクロン未満である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ジケトピペラジン微粒子の直径が１．５ミクロン〜２．５ミクロンである、請求項６に記載の組成物。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１１−１０５７３０（Ｐ２０１１−１０５７３０Ａ）
【公開日】平成２３年６月２日（２０１１．６．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２８７４７９（Ｐ２０１０−２８７４７９）
【出願日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【分割の表示】特願２００５−５０６０９４（Ｐ２００５−５０６０９４）の分割
【原出願日】平成１５年８月１日（２００３．８．１）
【出願人】（５０３２０８５５２）マンカインド コーポレイション (50)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月２日（２０１１．６．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月２４日（２０１０．１２．２４）
【分割の表示】特願２００５−５０６０９４（Ｐ２００５−５０６０９４）の分割
【原出願日】平成１５年８月１日（２００３．８．１）
【出願人】（５０３２０８５５２）マンカインド コーポレイション (50)
【Ｆターム（参考）】
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