細胞配列用マイクロチップ及び細胞配列方法
【課題】光ピンセットによる方法とマイクロ流路を利用した方法の長所を組み合わせ、細胞の移動・配列を正確に且つ迅速に行うことができる細胞配列用マイクロチップを提供すること。
【解決手段】送液機構と連結される細胞注入口を有し細胞注入口から注入された細胞が移動する細胞注入用流路と、排液機構と連結される細胞排出口を有し細胞排出口へと向かう細胞が移動する細胞排出用流路と、細胞注入用流路と細胞排出用流路との間に形成され、細胞注入用流路から細胞排出用流路へと流れる途中の細胞を貯留する貯留部と、貯留部に貯留された細胞が導入される細胞配列部と、細胞配列部と前記貯留部とを接続する分岐路とを１つの基板上に備え、細胞配列部は、互いに仕切られた複数の細胞収容用区画を有し、貯留部は、細胞注入用流路及び細胞排出用流路よりも広い幅に、分岐路は貯留部よりも狭い幅に形成されている細胞配列用マイクロチップとする。
【解決手段】送液機構と連結される細胞注入口を有し細胞注入口から注入された細胞が移動する細胞注入用流路と、排液機構と連結される細胞排出口を有し細胞排出口へと向かう細胞が移動する細胞排出用流路と、細胞注入用流路と細胞排出用流路との間に形成され、細胞注入用流路から細胞排出用流路へと流れる途中の細胞を貯留する貯留部と、貯留部に貯留された細胞が導入される細胞配列部と、細胞配列部と前記貯留部とを接続する分岐路とを１つの基板上に備え、細胞配列部は、互いに仕切られた複数の細胞収容用区画を有し、貯留部は、細胞注入用流路及び細胞排出用流路よりも広い幅に、分岐路は貯留部よりも狭い幅に形成されている細胞配列用マイクロチップとする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞配列用マイクロチップ及び細胞配列方法に関し、より詳しくは送液による細胞移動と光ピンセットによる細胞移動とを組み合わせて利用する細胞配列方法及びこの方法に用いられる細胞配列用マイクロチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞を非接触で移動させるための方法としては、レーザ光の放射圧を利用して細胞を捕捉（トラップ）し、レーザ光を走査することにより細胞を移動させる光ピンセットと呼ばれる方法が知られている（例えば、下記特許文献１等参照）。
光ピンセットによる方法は、細胞を正確に且つ自在に移動させることができる点において優れた方法であるが、移動速度が遅いために、多数の細胞を移動させる場合や長い距離を移動させる場合には時間がかかり作業効率が悪いという問題があった。
【０００３】
細胞を非接触で移動させるための他の方法として、マイクロポンプ等を用いてマイクロ流路に送液して細胞を移動させる方法が知られている（例えば、下記特許文献２等参照）。
マイクロ流路を利用した方法は、多数の細胞を一度に速く移動させることができる点においては優れているが、移動させる細胞数の制御や細胞の選択を行うことが困難であり、しかも微小且つ正確な移動には不向きであるという問題があった。
【０００４】
一方、細胞を規則的に配列するために多数の細胞培養セルを基板上に設けたマイクロチップが知られている（例えば、下記特許文献３参照）。
このようなマイクロチップは、２種類以上の細胞を任意のパターンで配列及び培養して創薬における毒性検査や再生医療に利用することができる擬似組織を作るための細胞チップの作製に使用することができる。また、異なる細胞を隣接させて培養し、細胞間の相互作用を検出することにより、細胞の移動・接着・分化・増殖などの研究にも利用できる。
【０００５】
従来、このようなマイクロチップを利用して細胞の配列を行う場合、マイクロチップ上から細胞を播種した後、光ピンセットにより細胞をセルに移動させて行われていた。
しかしながら、マイクロチップ上から細胞を播種すると、不要な細胞がセルの周りに残ってしまい、再現性のある細胞チップを得ることができなかった。また、光ピンセットによる移動では多くの細胞を並べるのに時間がかかり、細胞が移動・配列させられる前にマイクロチップに接着してしまうこともあった。
更に、マイクロチップ上で細胞を分別・抽出する場合においても、光ピンセットでは正確な分別が可能である反面、細胞の移動速度が遅いために、細胞の数が多い場合には、分別・抽出作業に時間がかかってしまい、作業効率が悪かった。
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−６２７９２号公報
【特許文献２】特開２００３−２７４９２４号公報
【特許文献３】特開２００５−２７５９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記したような従来技術の問題点を解決すべくなされたものであって、光ピンセットによる方法と、マイクロ流路を利用した方法の長所を組み合わせることにより、細胞の移動・配列を正確に且つ迅速に行うことができ、細胞チップの作製を作業効率良く行うことを可能とし得る細胞配列方法及びこの方法に用いられる細胞配列用マイクロチップを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１に係る発明は、送液機構と連結される細胞注入口を有し、該細胞注入口から注入された細胞が移動する細胞注入用流路と、排液機構と連結される細胞排出口を有し、該細胞排出口へと向かう細胞が移動する細胞排出用流路と、これら細胞注入用流路と細胞排出用流路との間に形成され、細胞注入用流路から細胞排出用流路へと流れる途中の細胞を一旦貯留する貯留部と、該貯留部に貯留された細胞が導入される細胞配列部と、該細胞配列部と前記貯留部とを接続する分岐路とを１つの基板上に備えており、前記細胞配列部は、壁により互いに仕切られた複数の細胞収容用区画を有し、前記貯留部は、前記細胞注入用流路及び細胞排出用流路よりも広い幅に形成され、前記分岐路は、該貯留部よりも狭い幅に形成されていることを特徴とする細胞配列用マイクロチップに関する。
【０００９】
請求項２に係る発明は、前記貯留部の細胞注入用流路側から前記分岐路へと入る経路の内角が直角又は鋭角に形成されていることを特徴とする請求項１記載の細胞配列用マイクロチップに関する。
【００１０】
請求項３に係る発明は、前記貯留部を介して接続された細胞注入用流路と細胞排出用流路とが同一直線上にないことを特徴とする請求項１又は２記載の細胞配列用マイクロチップに関する。
【００１１】
請求項４に係る発明は、夫々異なる細胞注入用流路及び細胞排出用流路と接続された複数の貯留部を有しており、該複数の貯留部が、１つの細胞配列部に対して夫々異なる分岐路を介して接続されていることを特徴とする請求項１乃至３いずれかに記載の細胞配列用マイクロチップに関する。
【００１２】
請求項５に係る発明は、前記細胞配列部が、六角形の細胞収容用区画がハニカム状に配列された構造を有し、該細胞収容用区画は、その底面に前記六角形よりも小さい円形穴が形成されていることを特徴とする請求項１乃至４いずれかに記載の細胞配列用マイクロチップに関する。
【００１３】
請求項６に係る発明は、請求項１乃至５いずれかに記載の細胞配列用マイクロチップを用いた細胞配列方法であって、前記送液機構からの送液により細胞を含む液を前記細胞注入用流路に供給して前記貯留部へと送り込む第一の段階と、該貯留部に送り込まれた細胞の中から所望の細胞を、前記送液機構と排液機構の制御により若しくは光ピンセットにより、前記分岐路を介して前記細胞配列部に移動させる第二の段階と、該細胞配列部に移動された細胞を光ピンセットにより移動させて所望の細胞収容用区画に収容する第三の段階とを備えており、前記第一乃至第三の段階を所要回数繰り返すことにより、複数の細胞を細胞配列部において所望配列に配列することを特徴とする細胞配列方法に関する。
【００１４】
請求項７に係る発明は、請求項４又は５に記載された細胞配列用マイクロチップを用い、前記第一の段階において、前記複数の細胞注入用流路に対して夫々異なる種類の細胞を供給して夫々異なる貯留部へと送り込み、前記第二の段階において、夫々異なる貯留部に送り込まれた複数の細胞の中から所望の細胞を、前記送液機構と排液機構の制御により若しくは光ピンセットにより夫々異なる分岐路を介して前記細胞配列部に移動させることを特徴とする請求項６記載の細胞配列方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
請求項１に係る発明によれば、細胞注入口に送液機構を接続して細胞注入用流路から貯留部へと多数の細胞を迅速に送り込むことができる。また、貯留部の幅が広く分岐路の幅が狭くなっていることにより、細胞を貯留部において一旦貯留させることができ、貯留部に貯留した細胞から所望の細胞を光ピンセット等を用いて細胞配列部へと移動させて、細胞配列部において細胞収容用区画内に細胞を正確に所望配列に配列することができる。
これにより、細胞配列作業を迅速且つ正確に行うことが可能となる。
また、送液機構により細胞を送液することができるため、チップの望まない位置での細胞接着を防ぐことができる。
更に、貯留部に貯留した複数の細胞のうち不必要な細胞（例えば、死んだ細胞や大きさが異なる細胞など）は、細胞排出口に排液機構を接続して細胞排出用流路へと排出することができる。
【００１６】
請求項２に係る発明によれば、貯留部の細胞注入用流路側から分岐路へと入る経路の内角が直角又は鋭角に形成されていることにより、送液機構からの送液によって多数の細胞が貯留部から分岐路を通って細胞配列部へと流れることが防がれ、不必要な細胞が細胞配列部へと入り込むことがない。
【００１７】
請求項３に係る発明によれば、貯留部を介して接続された細胞注入用流路と細胞排出用流路とが同一直線上にないことにより、貯留部において細胞を確実に一旦貯留させることができ、貯留部から細胞配列部への細胞の移動操作を容易に行うことが可能となる。
【００１８】
請求項４に係る発明によれば、夫々異なる細胞注入用流路及び細胞排出用流路と接続された複数の貯留部を有しており、該複数の貯留部が１つの細胞配列部に対して夫々異なる分岐路を介して接続されていることにより、異種細胞を流路内で混ぜることなく細胞配列部へと移動させることが可能となる。従って、同じような形状、大きさの異種細胞であっても区別ができ、細胞を蛍光等で標識する必要がない。
【００１９】
請求項５に係る発明によれば、細胞配列部が六角形の細胞収容用区画がハニカム状に配列された構造を有することにより、多数の細胞を規則的に配列させるのに好適であるとともに、細胞収容用区画の底面に六角形よりも小さい円形穴が形成されていることにより、円形穴内に細胞を安定した状態で固定することができる。
【００２０】
請求項６に係る発明によれば、送液機構からの送液により複数の細胞を含む液を細胞注入用流路に供給して前記貯留部へと送り込み、該貯留部に送り込まれた複数の細胞の中から所望の細胞を送液機構と排液機構の制御により若しくは光ピンセットにより分岐路を介して細胞配列部に移動させ、該細胞配列部に移動された細胞を光ピンセットにより移動させて細胞収容用区画に収容することにより、細胞の移動・配列を正確に且つ迅速に行うことができ、細胞チップの作製を効率良く且つ正確に行うことが可能となる。
【００２１】
請求項７に係る発明によれば、複数の細胞注入用流路に対して夫々異なる種類の細胞を供給して夫々異なる貯留部へと送り込み、夫々異なる貯留部に送り込まれた複数の細胞の中から所望の細胞を夫々異なる分岐路を介して細胞配列部に移動させることにより、異種細胞を流路内で混ぜることなく細胞配列部へと移動させることができ、細胞を蛍光等で標識することなく、異種細胞が配列された細胞チップの作製を効率良く且つ正確に行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明に係る細胞配列用マイクロチップ及び細胞配列方法の好適な実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
図１は本発明に係る細胞配列用マイクロチップ（以下、単にマイクロチップと称す）を示す図であって、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線断面図、（ｃ）は（ｂ）の中心付近の拡大図である。また、図２は、図１（ａ）の中心付近の拡大図であり、図３は、図１（ｃ）のＢ−Ｂ線断面図である。
【００２３】
本発明に係るマイクロチップは、光硬化性樹脂等の光透過性の合成樹脂から形成された略平板状の基板からなり、この基板上に、細胞注入用流路（１）と、細胞排出用流路（２）と、貯留部（３）と、細胞配列部（４）と、分岐路（５）とを備えている。
【００２４】
細胞注入用流路（１）は、送液機構からの送液により細胞を注入して貯留部（３）に向けて移動させるための流路であって、基板の表面下（表面に露出しない深さ位置を指す）に形成された内径１００μｍ程度の中空流路からなる。
細胞注入用流路（１）は、その始端部にマイクロポンプやマイクロシリンジ等の送液機構（図示せず）と連結される細胞注入口（６）が形成されており、その終端部は貯留部（３）を介して細胞排出用流路（２）と接続されている。
【００２５】
細胞排出用流路（２）は、貯留部（３）に貯留されている細胞を排液機構による吸引により移動させて排出するための流路であって、細胞注入用流路（１）と同様に、基板の表面下に形成された内径１００μｍ程度の中空流路からなる。
細胞排出用流路（２）は、その終端部にマイクロポンプやマイクロシリンジ等の排液機構（図示せず）と連結される細胞排出口（７）が形成されており、その始端部が貯留部（３）を介して細胞注入用流路（１）と接続されている。
【００２６】
貯留部（３）は、基板の表面下において、細胞注入用流路（１）と細胞排出用流路（２）との中間位置に両流路間を繋ぐように形成されており、細胞注入用流路（１）から細胞排出用流路（２）へと流れる途中の細胞を一旦貯留する役割を果たす。
貯留部（３）の幅は、細胞注入用流路（１）及び細胞排出用流路（２）よりも広い幅（例えば２倍以上）に形成されている。これにより、細胞注入用流路（１）を通って流れてきた細胞を含む液体は、その流速が貯留部（３）内において低下し、そのまま細胞排出用流路（２）へと排出されることが防がれる。
【００２７】
細胞配列部（４）は、貯留部（３）に貯留された細胞が導入されて配列操作がなされる部分であって、分岐路（５）を介して貯留部（３）と接続されている。
細胞配列部（４）は、四角柱状の空間であって、その上部は上方に向けて拡がる逆四角錐台状に形成されて基板表面において開口している。この開口部は必要に応じて蓋（図示せず）を被せて塞ぐことができる。このように開口部を開閉できることにより、細胞を長時間培養する場合に、溶液の蒸発防止と通気性の確保を図ることができる。但し、短時間の培養を目的とする場合には、細胞配列部（４）を、細胞注入用流路（１）、細胞排出用流路（２）、貯留部（３）と同様に、基板表面下に形成する構成を採用することができる。
【００２８】
細胞配列部（４）は、壁により互いに仕切られた複数の細胞収容用区画を有している。
図４は、細胞配列部（４）の細胞収容用区画を構成する微小基板（１０）を示す図であって、（ａ）は平面図、（ｂ）は斜視図、（ｃ）は１つの区画を拡大抽出した図である。
微小基板（１０）は、図１（ｃ）に示す如く、マイクロチップを構成する基板に対して底部から嵌合されて一体化されるものであって、その上面が細胞配列部（４）の底面を構成する。
【００２９】
微小基板（１０）の上面には、多数の細胞収容用区画（８）が形成されている。
細胞収容用区画（８）は平面視において六角形であって、多数の六角形の区画がハニカム状に配列されている。このようなハニカム状の配列は、多数の細胞を規則的に配列させるのに非常に適している。
細胞収容用区画（８）の底面には、外形の六角形よりも小さい、より具体的には六角形の内接円よりも小さい円形穴（９）が形成されている。
一般的に、細胞は内周壁に付着しようとする性質があるため、六角形の区画に収容した場合には特定の辺に付着して偏ってしまうが、六角形の細胞収容用区画（８）の底部に円形穴（９）が形成されていることにより、細胞は円形穴（９）内に偏ることなく安定して収容固定される。
【００３０】
但し、本発明において、細胞配列部（４）の構造は、図４に示す如く六角形の細胞収容用区画をハニカム状に配置した構造に限定されるものではない。
他の構造としては、例えば、図５（ａ）に示すような四角形の細胞収容用区画（８）を格子状に配置した構造や、図５（ｂ）に示すような直線溝状の細胞収容用区画（８）を平行に配置した構造を例示することができる。尚、図５において、（Ｓ）は細胞を示しており、図３（ｂ）の場合には、溝の幅を変化させることで異なる大きさの細胞（Ｓ）を収容することができ、細胞間相互作用の検出に好適に利用できる。
【００３１】
分岐路（５）は、貯留部（３）と細胞配列部（４）を接続する流路であって、その幅は貯留部（３）よりも狭い幅（好ましくは１／２〜１／３程度）に形成されている。
また、貯留部（３）の細胞注入用流路側から分岐路（５）へと入る経路の内角（θ）は、直角又は鋭角に形成されている。図６（ａ）は直角に形成した例を示しており、図６（ｂ）は鋭角に形成した例を示している。
このように分岐路（５）の幅及び角度を設定することにより、送液機構からの送液によって多数の細胞が貯留部（３）から分岐路（５）を通って細胞配列部（４）へと流れ込むことが防がれ、不必要な細胞が細胞配列部へと入り込むことがない。
【００３２】
また、貯留部（３）を介して接続されている細胞注入用流路（１）と細胞排出用流路（２）とは同一直線上にないように形成されている。
これにより、細胞注入用流路（１）から移動してきた細胞を、貯留部（３）において確実に一旦貯留させることができる。そのため、貯留部（３）から細胞配列部（４）への細胞の移動操作を容易に行うことが可能となる。
【００３３】
また、本発明に係るマイクロチップは、１つの細胞配列部（４）に対して複数の貯留部（３）が夫々異なる分岐路（５）を介して接続されている。図示例では、２つの貯留部（３）が細胞配列部（４）を挟んで対称位置に配置されているが、３つ以上の貯留部を設ける構成としてもよい。
複数の貯留部（３）は、夫々異なる細胞注入用流路（１）及び細胞排出用流路（２）と接続されている。つまり、細胞注入用流路（１）と貯留部（３）と細胞排出用流路（２）を繋ぐ経路が複数設けられているということであり、これら複数の経路が細胞配列部（４）を挟んで対称位置に形成されている。
この構成により、異種細胞を細胞注入用流路（１）内で混ぜることなく細胞配列部（４）へと移動させることができ、細胞を蛍光等で標識する必要がない。
【００３４】
次に、本発明に係る細胞配列方法について説明する。
図７は、本発明に係る細胞配列方法において用いられる装置の一例を示す概略図であり、この装置は、倒立型の顕微鏡にレーザ光源等の各種機器が組み合わされた構成を有している。
先ず、この装置の構成について説明する。
【００３５】
装置に設けられた顕微鏡は、ＸＹ方向への移動が可能であって本発明に係るマイクロチップ（１１）を載置するための電動ステージ（１２）と、該電動ステージ（１２）の直下部に配置されて後述するレーザ光源から出力されたレーザ光を集光してマイクロチップ（１１）へと導く対物レンズ（１３）と、該対物レンズ（１３）の鉛直上方に配置されてマイクロチップ（１１）に光を照射するハロゲンランプからなる光源ランプ（１４）と、該光源ランプ（１４）とマイクロチップ（１１）の間に配置されて光源ランプ（１４）からマイクロチップ（１１）へと照射される光量を調節する電動シャッター（１５）と、光源ランプ（１４）から照射されてマイクロチップ（１１）を通過した可視光の透過像を撮像するＣＣＤカメラやＣＭＯＳカメラ等からなる撮像装置（１６）を備えている。
【００３６】
電動ステージ（１２）の移動及び電動シャッター（１５）の開閉は、コンピュータ（２７）に組み込まれた制御ソフトウェアからの制御信号に基づいて制御されるように構成されている。
【００３７】
顕微鏡の対物レンズ（１３）の鉛直下方には、ダイクロイックミラー（１７１）と吸収フィルター（１７２）を備えたミラーユニット（１７）が配置されている。
ダイクロイックミラー（１７１）は、レーザ光源から出力されたレーザ光の向きを変えて対物レンズ（１３）へと導くとともに、光源ランプ（１４）から照射された光を通過させて撮像装置（１６）へと導くものである。
吸収フィルター（１７２）は、光源ランプ（１４）から照射されてダイクロイックミラー（１７１）を通過した光の波長成分のうち可視光成分のみを通過させて撮像装置（１６）へと導くものである。
【００３８】
レーザ光源は、ＩＲレーザを出力する第１レーザ光源（１８）と、ＵＶレーザを出力する第２レーザ光源（１９）とからなる。
第１レーザ光源（１８）から出力されるＩＲレーザは、細胞を捕捉して操作するためのトラッピング用レーザ、即ち光ピンセットとして用いられる。ＩＲレーザとしては、例えばＹＡＧレーザ（波長1060nm）、Ｎｄ：ＹＬＦレーザ（波長1047nm）、ＤＰＳＳレーザ（波長1064nm）等を用いることができるが、細胞にダメージを与えずに移動等の操作を行うことができるものであれば、特にこれらに限定はされない。
第２レーザ光源（９）から出力されるＵＶレーザは、細胞をレーザ融合するための細胞融合用レーザとして用いられる。但し、本発明に係る方法においては、この第２レーザ光源は必ずしも必要ではない。
【００３９】
第１レーザ光源（１８）及び第２レーザ光源（１９）から出力されたレーザ光を、上記したミラーユニット（１７）のダイクロイックミラー（１７１）へと導く導光路には、電動シャッター（２０）（２１）、ダイクロイックミラー（２２）（２３）（２５）（２６）、電動ミラーユニット（２４）が配置されている。
【００４０】
電動シャッター（２０）（２１）は、第１レーザ光源（１８）及び第２レーザ光源（１９）の出射孔の前方に夫々配置されている。
これら電動シャッター（２０）（２１）は、コンピュータ（２７）から送られる制御信号に基づいて独立して開閉操作が可能となっており、これによって第１レーザ光源（１８）及び第２レーザ光源（１９）から出力されたレーザ光を選択的に、電動ミラーユニット（２４）等を介してミラーユニット（１７）へと導くことができる。
【００４１】
電動シャッター（２０）の前方にはダイクロイックミラー（２３）が配置され、電動シャッター（２１）の前方にはダイクロイックミラー（２２）が配置されている。
ダイクロイックミラー（２２）は、第２レーザ光源（１９）から出力されたレーザ光の向きを変えてダイクロイックミラー（２３）へと導く。
ダイクロイックミラー（２３）は、第１レーザ光源（１８）から出力されたレーザ光を通過させて電動ミラーユニット（２４）へと導くとともに、ダイクロイックミラー（２２）により導かれた第２レーザ光源（１９）からのレーザ光を反射させて電動ミラーユニット（２４）へと導く。
上記したダイクロイックミラー（２２）（２３）により、第１レーザ光源（１８）と第２レーザ光源（１９）から出力されたレーザ光は、同一経路を通って電動ミラーユニット（２４）へと導かれる。
【００４２】
電動ミラーユニット（２４）は、コンピュータ（２７）から送られる制御信号に基づいて独立して制御可能な２つの電子制御ミラーを有しており、これら２つの電子制御ミラーは、電動ステージ（１２）上のマイクロチップ（１１）内におけるレーザ光の走査方向において、一方のミラーがＸ方向、他方のミラーがＹ方向の走査を夫々担当する。
電子制御ミラーとしては、ガルバノミラー、ピエゾ駆動によるミラー、アクチュエータ駆動によるミラー等が好適に用いられる。
【００４３】
ダイクロイックミラー（２５）は、電動ミラーユニット（２４）を通過したレーザ光の向きを変えてダイクロイックミラー（２６）へと導く。
ダイクロイックミラー（２６）は、この導かれたレーザ光の向きを変えて、ミラーユニット（１７）のダイクロイックミラー（１７１）へと導く。
【００４４】
本発明に係る細胞配列方法は、上記構成からなる装置を用いて行うことが可能であり、以下その具体的方法について説明する。
先ず、準備段階として、上記説明した本発明に係るマイクロチップ（１１）を倒立顕微鏡の電動ステージ（１２）上に載置固定する。
そして、マイクロポンプやマイクロシリンジ等からなる送液機構及び排液機構を用意し、送液機構をマイクロチップ（１１）の細胞注入口（６）と、排液機構を細胞排出口（７）と、夫々チューブを介して接続する。
【００４５】
次いで、第一段階として、送液機構からの送液により、細胞（Ｓ）を含む液を細胞注入用流路（１）に供給して貯留部（３）へと送り込む（図８参照）。この貯留部（３）への細胞の供給は、送液機構からの送液により行われるため迅速に行うことができる。
そして、第二段階として、貯留部（３）に送り込まれた細胞の中から所望の細胞（Ｓ１）を、送液機構と排液機構の制御により若しくは光ピンセットにより、分岐路（５）を介して細胞配列部（４）に移動させる（図９参照）。
【００４６】
送液機構と排液機構の制御による方法では、送液機構による送液圧に比べて排液機構による吸引圧が低くなる（吸引を停止する場合も含む）ように行う。
送液圧と吸引圧とが略等しい場合、細胞注入口（６）から細胞注入用流路（１）へと供給された液は、貯留部（３）において層状の流れとなってそのまま細胞排出用流路（２）へと流れていく。しかし、上記のように制御すると、細胞注入口（６）から細胞注入用流路（１）へと供給された液は、細胞排出用流路（２）への流通が妨げられて貯留部（３）内において拡散し、分岐路（５）を通って細胞配列部（４）へと流入する。
この制御方法では、細胞注入用流路（１）への細胞の供給を少量ずつ行うことによって、より確実に所望の細胞（Ｓ１）のみを分岐路（５）を介して細胞配列部（４）へと移動させることができる。
【００４７】
光ピンセットによる方法では、上記した装置において、第１レーザ光源（８）から出力されたＩＲレーザを貯留部（３）へと導いて液中の細胞を捕捉し、電動ミラーユニット（２４）の駆動によってレーザ光を走査することにより、所望の細胞（Ｓ１）を分岐路（５）を介して細胞配列部（４）へと移動させることができる。
【００４８】
最後に、第三段階として、細胞配列部（４）に移動された所望の細胞（Ｓ１）を、上記した光ピンセットにより移動して、所望の細胞収容用区画（８）の円形穴（９）内に収容する（図１０参照）。
細胞注入用流路（１）から貯留部（３）へと供給された液中に含まれる細胞のうち、不必要な細胞については、送液機構による送液圧に比べて排液機構による吸引圧が高くなる（送液を停止する場合も含む）ように制御することにより、細胞排出用流路（２）へと導いて細胞排出口（７）から外部に排出する（図１１参照）。
【００４９】
上記第一乃至第三段階を所要回数繰り返すことにより、複数の細胞を細胞配列部（４）において所望配列に配列することができる。
【００５０】
異種細胞を配列させる場合には、上記第一段階において、複数の細胞注入用流路（１）に対して夫々異なる種類の細胞を供給して夫々異なる貯留部（３）へと送り込む。
そして、上記第二段階において、夫々異なる貯留部（３）に送り込まれた複数の細胞の中から所望の細胞を、上記した送液機構と排液機構の制御により若しくは光ピンセットにより、夫々異なる分岐路（５）を介して細胞配列部（４）に移動させる。
最後に、第三段階として、細胞配列部（４）に移動された細胞を、上記した光ピンセットにより移動して、所望の細胞収容用区画内に収容する。
この第一乃至第三段階を所要回数繰り返すことにより、異種細胞を細胞配列部（４）において所望配列に配列することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、創薬における毒性検査や再生医療に利用できる擬似組織を作るための細胞チップの作製等に使用することができ、細胞の移動・接着・分化・増殖などの研究にも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明に係る細胞配列用マイクロチップを示す図であって、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線断面図、（ｃ）は（ｂ）の中心付近の拡大図である。
【図２】図１（ａ）の中心付近の拡大図である。
【図３】図１（ｃ）のＢ−Ｂ線断面図である。
【図４】細胞配列部において細胞収容用区画を構成する微小基板を示す図であって、（ａ）は平面図、（ｂ）は斜視図、（ｃ）は１つの区画を拡大抽出した図である。
【図５】細胞配列部の構造の別の例を示す平面図である。
【図６】貯留部の細胞注入用流路側から分岐路へと入る経路の内角を説明する図であって、（ａ）は直角に形成した例、（ｂ）は鋭角に形成した例を示す図である。
【図７】本発明に係る細胞配列方法において用いられる装置の一例を示す概略図である。
【図８】本発明に係る細胞配列方法の第一段階を示す図である。
【図９】本発明に係る細胞配列方法の第二段階を示す図である。
【図１０】本発明に係る細胞配列方法の第三段階を示す図である。
【図１１】本発明に係る細胞配列方法において不要な細胞を排出する様子を示す図である。
【符号の説明】
【００５３】
１ 細胞注入用流路
２ 細胞排出用流路
３ 貯留部
４ 細胞配列部
５ 分岐路
６ 細胞注入口
７ 細胞排出口
８ 細胞収容用区画
９ 円形穴
１１ マイクロチップ
Ｓ 細胞
Ｓ１ 所望の細胞
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞配列用マイクロチップ及び細胞配列方法に関し、より詳しくは送液による細胞移動と光ピンセットによる細胞移動とを組み合わせて利用する細胞配列方法及びこの方法に用いられる細胞配列用マイクロチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞を非接触で移動させるための方法としては、レーザ光の放射圧を利用して細胞を捕捉（トラップ）し、レーザ光を走査することにより細胞を移動させる光ピンセットと呼ばれる方法が知られている（例えば、下記特許文献１等参照）。
光ピンセットによる方法は、細胞を正確に且つ自在に移動させることができる点において優れた方法であるが、移動速度が遅いために、多数の細胞を移動させる場合や長い距離を移動させる場合には時間がかかり作業効率が悪いという問題があった。
【０００３】
細胞を非接触で移動させるための他の方法として、マイクロポンプ等を用いてマイクロ流路に送液して細胞を移動させる方法が知られている（例えば、下記特許文献２等参照）。
マイクロ流路を利用した方法は、多数の細胞を一度に速く移動させることができる点においては優れているが、移動させる細胞数の制御や細胞の選択を行うことが困難であり、しかも微小且つ正確な移動には不向きであるという問題があった。
【０００４】
一方、細胞を規則的に配列するために多数の細胞培養セルを基板上に設けたマイクロチップが知られている（例えば、下記特許文献３参照）。
このようなマイクロチップは、２種類以上の細胞を任意のパターンで配列及び培養して創薬における毒性検査や再生医療に利用することができる擬似組織を作るための細胞チップの作製に使用することができる。また、異なる細胞を隣接させて培養し、細胞間の相互作用を検出することにより、細胞の移動・接着・分化・増殖などの研究にも利用できる。
【０００５】
従来、このようなマイクロチップを利用して細胞の配列を行う場合、マイクロチップ上から細胞を播種した後、光ピンセットにより細胞をセルに移動させて行われていた。
しかしながら、マイクロチップ上から細胞を播種すると、不要な細胞がセルの周りに残ってしまい、再現性のある細胞チップを得ることができなかった。また、光ピンセットによる移動では多くの細胞を並べるのに時間がかかり、細胞が移動・配列させられる前にマイクロチップに接着してしまうこともあった。
更に、マイクロチップ上で細胞を分別・抽出する場合においても、光ピンセットでは正確な分別が可能である反面、細胞の移動速度が遅いために、細胞の数が多い場合には、分別・抽出作業に時間がかかってしまい、作業効率が悪かった。
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−６２７９２号公報
【特許文献２】特開２００３−２７４９２４号公報
【特許文献３】特開２００５−２７５９８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記したような従来技術の問題点を解決すべくなされたものであって、光ピンセットによる方法と、マイクロ流路を利用した方法の長所を組み合わせることにより、細胞の移動・配列を正確に且つ迅速に行うことができ、細胞チップの作製を作業効率良く行うことを可能とし得る細胞配列方法及びこの方法に用いられる細胞配列用マイクロチップを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
請求項１に係る発明は、送液機構と連結される細胞注入口を有し、該細胞注入口から注入された細胞が移動する細胞注入用流路と、排液機構と連結される細胞排出口を有し、該細胞排出口へと向かう細胞が移動する細胞排出用流路と、これら細胞注入用流路と細胞排出用流路との間に形成され、細胞注入用流路から細胞排出用流路へと流れる途中の細胞を一旦貯留する貯留部と、該貯留部に貯留された細胞が導入される細胞配列部と、該細胞配列部と前記貯留部とを接続する分岐路とを１つの基板上に備えており、前記細胞配列部は、壁により互いに仕切られた複数の細胞収容用区画を有し、前記貯留部は、前記細胞注入用流路及び細胞排出用流路よりも広い幅に形成され、前記分岐路は、該貯留部よりも狭い幅に形成されていることを特徴とする細胞配列用マイクロチップに関する。
【０００９】
請求項２に係る発明は、前記貯留部の細胞注入用流路側から前記分岐路へと入る経路の内角が直角又は鋭角に形成されていることを特徴とする請求項１記載の細胞配列用マイクロチップに関する。
【００１０】
請求項３に係る発明は、前記貯留部を介して接続された細胞注入用流路と細胞排出用流路とが同一直線上にないことを特徴とする請求項１又は２記載の細胞配列用マイクロチップに関する。
【００１１】
請求項４に係る発明は、夫々異なる細胞注入用流路及び細胞排出用流路と接続された複数の貯留部を有しており、該複数の貯留部が、１つの細胞配列部に対して夫々異なる分岐路を介して接続されていることを特徴とする請求項１乃至３いずれかに記載の細胞配列用マイクロチップに関する。
【００１２】
請求項５に係る発明は、前記細胞配列部が、六角形の細胞収容用区画がハニカム状に配列された構造を有し、該細胞収容用区画は、その底面に前記六角形よりも小さい円形穴が形成されていることを特徴とする請求項１乃至４いずれかに記載の細胞配列用マイクロチップに関する。
【００１３】
請求項６に係る発明は、請求項１乃至５いずれかに記載の細胞配列用マイクロチップを用いた細胞配列方法であって、前記送液機構からの送液により細胞を含む液を前記細胞注入用流路に供給して前記貯留部へと送り込む第一の段階と、該貯留部に送り込まれた細胞の中から所望の細胞を、前記送液機構と排液機構の制御により若しくは光ピンセットにより、前記分岐路を介して前記細胞配列部に移動させる第二の段階と、該細胞配列部に移動された細胞を光ピンセットにより移動させて所望の細胞収容用区画に収容する第三の段階とを備えており、前記第一乃至第三の段階を所要回数繰り返すことにより、複数の細胞を細胞配列部において所望配列に配列することを特徴とする細胞配列方法に関する。
【００１４】
請求項７に係る発明は、請求項４又は５に記載された細胞配列用マイクロチップを用い、前記第一の段階において、前記複数の細胞注入用流路に対して夫々異なる種類の細胞を供給して夫々異なる貯留部へと送り込み、前記第二の段階において、夫々異なる貯留部に送り込まれた複数の細胞の中から所望の細胞を、前記送液機構と排液機構の制御により若しくは光ピンセットにより夫々異なる分岐路を介して前記細胞配列部に移動させることを特徴とする請求項６記載の細胞配列方法に関する。
【発明の効果】
【００１５】
請求項１に係る発明によれば、細胞注入口に送液機構を接続して細胞注入用流路から貯留部へと多数の細胞を迅速に送り込むことができる。また、貯留部の幅が広く分岐路の幅が狭くなっていることにより、細胞を貯留部において一旦貯留させることができ、貯留部に貯留した細胞から所望の細胞を光ピンセット等を用いて細胞配列部へと移動させて、細胞配列部において細胞収容用区画内に細胞を正確に所望配列に配列することができる。
これにより、細胞配列作業を迅速且つ正確に行うことが可能となる。
また、送液機構により細胞を送液することができるため、チップの望まない位置での細胞接着を防ぐことができる。
更に、貯留部に貯留した複数の細胞のうち不必要な細胞（例えば、死んだ細胞や大きさが異なる細胞など）は、細胞排出口に排液機構を接続して細胞排出用流路へと排出することができる。
【００１６】
請求項２に係る発明によれば、貯留部の細胞注入用流路側から分岐路へと入る経路の内角が直角又は鋭角に形成されていることにより、送液機構からの送液によって多数の細胞が貯留部から分岐路を通って細胞配列部へと流れることが防がれ、不必要な細胞が細胞配列部へと入り込むことがない。
【００１７】
請求項３に係る発明によれば、貯留部を介して接続された細胞注入用流路と細胞排出用流路とが同一直線上にないことにより、貯留部において細胞を確実に一旦貯留させることができ、貯留部から細胞配列部への細胞の移動操作を容易に行うことが可能となる。
【００１８】
請求項４に係る発明によれば、夫々異なる細胞注入用流路及び細胞排出用流路と接続された複数の貯留部を有しており、該複数の貯留部が１つの細胞配列部に対して夫々異なる分岐路を介して接続されていることにより、異種細胞を流路内で混ぜることなく細胞配列部へと移動させることが可能となる。従って、同じような形状、大きさの異種細胞であっても区別ができ、細胞を蛍光等で標識する必要がない。
【００１９】
請求項５に係る発明によれば、細胞配列部が六角形の細胞収容用区画がハニカム状に配列された構造を有することにより、多数の細胞を規則的に配列させるのに好適であるとともに、細胞収容用区画の底面に六角形よりも小さい円形穴が形成されていることにより、円形穴内に細胞を安定した状態で固定することができる。
【００２０】
請求項６に係る発明によれば、送液機構からの送液により複数の細胞を含む液を細胞注入用流路に供給して前記貯留部へと送り込み、該貯留部に送り込まれた複数の細胞の中から所望の細胞を送液機構と排液機構の制御により若しくは光ピンセットにより分岐路を介して細胞配列部に移動させ、該細胞配列部に移動された細胞を光ピンセットにより移動させて細胞収容用区画に収容することにより、細胞の移動・配列を正確に且つ迅速に行うことができ、細胞チップの作製を効率良く且つ正確に行うことが可能となる。
【００２１】
請求項７に係る発明によれば、複数の細胞注入用流路に対して夫々異なる種類の細胞を供給して夫々異なる貯留部へと送り込み、夫々異なる貯留部に送り込まれた複数の細胞の中から所望の細胞を夫々異なる分岐路を介して細胞配列部に移動させることにより、異種細胞を流路内で混ぜることなく細胞配列部へと移動させることができ、細胞を蛍光等で標識することなく、異種細胞が配列された細胞チップの作製を効率良く且つ正確に行うことが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下、本発明に係る細胞配列用マイクロチップ及び細胞配列方法の好適な実施形態について、図面を参照しつつ説明する。
図１は本発明に係る細胞配列用マイクロチップ（以下、単にマイクロチップと称す）を示す図であって、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線断面図、（ｃ）は（ｂ）の中心付近の拡大図である。また、図２は、図１（ａ）の中心付近の拡大図であり、図３は、図１（ｃ）のＢ−Ｂ線断面図である。
【００２３】
本発明に係るマイクロチップは、光硬化性樹脂等の光透過性の合成樹脂から形成された略平板状の基板からなり、この基板上に、細胞注入用流路（１）と、細胞排出用流路（２）と、貯留部（３）と、細胞配列部（４）と、分岐路（５）とを備えている。
【００２４】
細胞注入用流路（１）は、送液機構からの送液により細胞を注入して貯留部（３）に向けて移動させるための流路であって、基板の表面下（表面に露出しない深さ位置を指す）に形成された内径１００μｍ程度の中空流路からなる。
細胞注入用流路（１）は、その始端部にマイクロポンプやマイクロシリンジ等の送液機構（図示せず）と連結される細胞注入口（６）が形成されており、その終端部は貯留部（３）を介して細胞排出用流路（２）と接続されている。
【００２５】
細胞排出用流路（２）は、貯留部（３）に貯留されている細胞を排液機構による吸引により移動させて排出するための流路であって、細胞注入用流路（１）と同様に、基板の表面下に形成された内径１００μｍ程度の中空流路からなる。
細胞排出用流路（２）は、その終端部にマイクロポンプやマイクロシリンジ等の排液機構（図示せず）と連結される細胞排出口（７）が形成されており、その始端部が貯留部（３）を介して細胞注入用流路（１）と接続されている。
【００２６】
貯留部（３）は、基板の表面下において、細胞注入用流路（１）と細胞排出用流路（２）との中間位置に両流路間を繋ぐように形成されており、細胞注入用流路（１）から細胞排出用流路（２）へと流れる途中の細胞を一旦貯留する役割を果たす。
貯留部（３）の幅は、細胞注入用流路（１）及び細胞排出用流路（２）よりも広い幅（例えば２倍以上）に形成されている。これにより、細胞注入用流路（１）を通って流れてきた細胞を含む液体は、その流速が貯留部（３）内において低下し、そのまま細胞排出用流路（２）へと排出されることが防がれる。
【００２７】
細胞配列部（４）は、貯留部（３）に貯留された細胞が導入されて配列操作がなされる部分であって、分岐路（５）を介して貯留部（３）と接続されている。
細胞配列部（４）は、四角柱状の空間であって、その上部は上方に向けて拡がる逆四角錐台状に形成されて基板表面において開口している。この開口部は必要に応じて蓋（図示せず）を被せて塞ぐことができる。このように開口部を開閉できることにより、細胞を長時間培養する場合に、溶液の蒸発防止と通気性の確保を図ることができる。但し、短時間の培養を目的とする場合には、細胞配列部（４）を、細胞注入用流路（１）、細胞排出用流路（２）、貯留部（３）と同様に、基板表面下に形成する構成を採用することができる。
【００２８】
細胞配列部（４）は、壁により互いに仕切られた複数の細胞収容用区画を有している。
図４は、細胞配列部（４）の細胞収容用区画を構成する微小基板（１０）を示す図であって、（ａ）は平面図、（ｂ）は斜視図、（ｃ）は１つの区画を拡大抽出した図である。
微小基板（１０）は、図１（ｃ）に示す如く、マイクロチップを構成する基板に対して底部から嵌合されて一体化されるものであって、その上面が細胞配列部（４）の底面を構成する。
【００２９】
微小基板（１０）の上面には、多数の細胞収容用区画（８）が形成されている。
細胞収容用区画（８）は平面視において六角形であって、多数の六角形の区画がハニカム状に配列されている。このようなハニカム状の配列は、多数の細胞を規則的に配列させるのに非常に適している。
細胞収容用区画（８）の底面には、外形の六角形よりも小さい、より具体的には六角形の内接円よりも小さい円形穴（９）が形成されている。
一般的に、細胞は内周壁に付着しようとする性質があるため、六角形の区画に収容した場合には特定の辺に付着して偏ってしまうが、六角形の細胞収容用区画（８）の底部に円形穴（９）が形成されていることにより、細胞は円形穴（９）内に偏ることなく安定して収容固定される。
【００３０】
但し、本発明において、細胞配列部（４）の構造は、図４に示す如く六角形の細胞収容用区画をハニカム状に配置した構造に限定されるものではない。
他の構造としては、例えば、図５（ａ）に示すような四角形の細胞収容用区画（８）を格子状に配置した構造や、図５（ｂ）に示すような直線溝状の細胞収容用区画（８）を平行に配置した構造を例示することができる。尚、図５において、（Ｓ）は細胞を示しており、図３（ｂ）の場合には、溝の幅を変化させることで異なる大きさの細胞（Ｓ）を収容することができ、細胞間相互作用の検出に好適に利用できる。
【００３１】
分岐路（５）は、貯留部（３）と細胞配列部（４）を接続する流路であって、その幅は貯留部（３）よりも狭い幅（好ましくは１／２〜１／３程度）に形成されている。
また、貯留部（３）の細胞注入用流路側から分岐路（５）へと入る経路の内角（θ）は、直角又は鋭角に形成されている。図６（ａ）は直角に形成した例を示しており、図６（ｂ）は鋭角に形成した例を示している。
このように分岐路（５）の幅及び角度を設定することにより、送液機構からの送液によって多数の細胞が貯留部（３）から分岐路（５）を通って細胞配列部（４）へと流れ込むことが防がれ、不必要な細胞が細胞配列部へと入り込むことがない。
【００３２】
また、貯留部（３）を介して接続されている細胞注入用流路（１）と細胞排出用流路（２）とは同一直線上にないように形成されている。
これにより、細胞注入用流路（１）から移動してきた細胞を、貯留部（３）において確実に一旦貯留させることができる。そのため、貯留部（３）から細胞配列部（４）への細胞の移動操作を容易に行うことが可能となる。
【００３３】
また、本発明に係るマイクロチップは、１つの細胞配列部（４）に対して複数の貯留部（３）が夫々異なる分岐路（５）を介して接続されている。図示例では、２つの貯留部（３）が細胞配列部（４）を挟んで対称位置に配置されているが、３つ以上の貯留部を設ける構成としてもよい。
複数の貯留部（３）は、夫々異なる細胞注入用流路（１）及び細胞排出用流路（２）と接続されている。つまり、細胞注入用流路（１）と貯留部（３）と細胞排出用流路（２）を繋ぐ経路が複数設けられているということであり、これら複数の経路が細胞配列部（４）を挟んで対称位置に形成されている。
この構成により、異種細胞を細胞注入用流路（１）内で混ぜることなく細胞配列部（４）へと移動させることができ、細胞を蛍光等で標識する必要がない。
【００３４】
次に、本発明に係る細胞配列方法について説明する。
図７は、本発明に係る細胞配列方法において用いられる装置の一例を示す概略図であり、この装置は、倒立型の顕微鏡にレーザ光源等の各種機器が組み合わされた構成を有している。
先ず、この装置の構成について説明する。
【００３５】
装置に設けられた顕微鏡は、ＸＹ方向への移動が可能であって本発明に係るマイクロチップ（１１）を載置するための電動ステージ（１２）と、該電動ステージ（１２）の直下部に配置されて後述するレーザ光源から出力されたレーザ光を集光してマイクロチップ（１１）へと導く対物レンズ（１３）と、該対物レンズ（１３）の鉛直上方に配置されてマイクロチップ（１１）に光を照射するハロゲンランプからなる光源ランプ（１４）と、該光源ランプ（１４）とマイクロチップ（１１）の間に配置されて光源ランプ（１４）からマイクロチップ（１１）へと照射される光量を調節する電動シャッター（１５）と、光源ランプ（１４）から照射されてマイクロチップ（１１）を通過した可視光の透過像を撮像するＣＣＤカメラやＣＭＯＳカメラ等からなる撮像装置（１６）を備えている。
【００３６】
電動ステージ（１２）の移動及び電動シャッター（１５）の開閉は、コンピュータ（２７）に組み込まれた制御ソフトウェアからの制御信号に基づいて制御されるように構成されている。
【００３７】
顕微鏡の対物レンズ（１３）の鉛直下方には、ダイクロイックミラー（１７１）と吸収フィルター（１７２）を備えたミラーユニット（１７）が配置されている。
ダイクロイックミラー（１７１）は、レーザ光源から出力されたレーザ光の向きを変えて対物レンズ（１３）へと導くとともに、光源ランプ（１４）から照射された光を通過させて撮像装置（１６）へと導くものである。
吸収フィルター（１７２）は、光源ランプ（１４）から照射されてダイクロイックミラー（１７１）を通過した光の波長成分のうち可視光成分のみを通過させて撮像装置（１６）へと導くものである。
【００３８】
レーザ光源は、ＩＲレーザを出力する第１レーザ光源（１８）と、ＵＶレーザを出力する第２レーザ光源（１９）とからなる。
第１レーザ光源（１８）から出力されるＩＲレーザは、細胞を捕捉して操作するためのトラッピング用レーザ、即ち光ピンセットとして用いられる。ＩＲレーザとしては、例えばＹＡＧレーザ（波長1060nm）、Ｎｄ：ＹＬＦレーザ（波長1047nm）、ＤＰＳＳレーザ（波長1064nm）等を用いることができるが、細胞にダメージを与えずに移動等の操作を行うことができるものであれば、特にこれらに限定はされない。
第２レーザ光源（９）から出力されるＵＶレーザは、細胞をレーザ融合するための細胞融合用レーザとして用いられる。但し、本発明に係る方法においては、この第２レーザ光源は必ずしも必要ではない。
【００３９】
第１レーザ光源（１８）及び第２レーザ光源（１９）から出力されたレーザ光を、上記したミラーユニット（１７）のダイクロイックミラー（１７１）へと導く導光路には、電動シャッター（２０）（２１）、ダイクロイックミラー（２２）（２３）（２５）（２６）、電動ミラーユニット（２４）が配置されている。
【００４０】
電動シャッター（２０）（２１）は、第１レーザ光源（１８）及び第２レーザ光源（１９）の出射孔の前方に夫々配置されている。
これら電動シャッター（２０）（２１）は、コンピュータ（２７）から送られる制御信号に基づいて独立して開閉操作が可能となっており、これによって第１レーザ光源（１８）及び第２レーザ光源（１９）から出力されたレーザ光を選択的に、電動ミラーユニット（２４）等を介してミラーユニット（１７）へと導くことができる。
【００４１】
電動シャッター（２０）の前方にはダイクロイックミラー（２３）が配置され、電動シャッター（２１）の前方にはダイクロイックミラー（２２）が配置されている。
ダイクロイックミラー（２２）は、第２レーザ光源（１９）から出力されたレーザ光の向きを変えてダイクロイックミラー（２３）へと導く。
ダイクロイックミラー（２３）は、第１レーザ光源（１８）から出力されたレーザ光を通過させて電動ミラーユニット（２４）へと導くとともに、ダイクロイックミラー（２２）により導かれた第２レーザ光源（１９）からのレーザ光を反射させて電動ミラーユニット（２４）へと導く。
上記したダイクロイックミラー（２２）（２３）により、第１レーザ光源（１８）と第２レーザ光源（１９）から出力されたレーザ光は、同一経路を通って電動ミラーユニット（２４）へと導かれる。
【００４２】
電動ミラーユニット（２４）は、コンピュータ（２７）から送られる制御信号に基づいて独立して制御可能な２つの電子制御ミラーを有しており、これら２つの電子制御ミラーは、電動ステージ（１２）上のマイクロチップ（１１）内におけるレーザ光の走査方向において、一方のミラーがＸ方向、他方のミラーがＹ方向の走査を夫々担当する。
電子制御ミラーとしては、ガルバノミラー、ピエゾ駆動によるミラー、アクチュエータ駆動によるミラー等が好適に用いられる。
【００４３】
ダイクロイックミラー（２５）は、電動ミラーユニット（２４）を通過したレーザ光の向きを変えてダイクロイックミラー（２６）へと導く。
ダイクロイックミラー（２６）は、この導かれたレーザ光の向きを変えて、ミラーユニット（１７）のダイクロイックミラー（１７１）へと導く。
【００４４】
本発明に係る細胞配列方法は、上記構成からなる装置を用いて行うことが可能であり、以下その具体的方法について説明する。
先ず、準備段階として、上記説明した本発明に係るマイクロチップ（１１）を倒立顕微鏡の電動ステージ（１２）上に載置固定する。
そして、マイクロポンプやマイクロシリンジ等からなる送液機構及び排液機構を用意し、送液機構をマイクロチップ（１１）の細胞注入口（６）と、排液機構を細胞排出口（７）と、夫々チューブを介して接続する。
【００４５】
次いで、第一段階として、送液機構からの送液により、細胞（Ｓ）を含む液を細胞注入用流路（１）に供給して貯留部（３）へと送り込む（図８参照）。この貯留部（３）への細胞の供給は、送液機構からの送液により行われるため迅速に行うことができる。
そして、第二段階として、貯留部（３）に送り込まれた細胞の中から所望の細胞（Ｓ１）を、送液機構と排液機構の制御により若しくは光ピンセットにより、分岐路（５）を介して細胞配列部（４）に移動させる（図９参照）。
【００４６】
送液機構と排液機構の制御による方法では、送液機構による送液圧に比べて排液機構による吸引圧が低くなる（吸引を停止する場合も含む）ように行う。
送液圧と吸引圧とが略等しい場合、細胞注入口（６）から細胞注入用流路（１）へと供給された液は、貯留部（３）において層状の流れとなってそのまま細胞排出用流路（２）へと流れていく。しかし、上記のように制御すると、細胞注入口（６）から細胞注入用流路（１）へと供給された液は、細胞排出用流路（２）への流通が妨げられて貯留部（３）内において拡散し、分岐路（５）を通って細胞配列部（４）へと流入する。
この制御方法では、細胞注入用流路（１）への細胞の供給を少量ずつ行うことによって、より確実に所望の細胞（Ｓ１）のみを分岐路（５）を介して細胞配列部（４）へと移動させることができる。
【００４７】
光ピンセットによる方法では、上記した装置において、第１レーザ光源（８）から出力されたＩＲレーザを貯留部（３）へと導いて液中の細胞を捕捉し、電動ミラーユニット（２４）の駆動によってレーザ光を走査することにより、所望の細胞（Ｓ１）を分岐路（５）を介して細胞配列部（４）へと移動させることができる。
【００４８】
最後に、第三段階として、細胞配列部（４）に移動された所望の細胞（Ｓ１）を、上記した光ピンセットにより移動して、所望の細胞収容用区画（８）の円形穴（９）内に収容する（図１０参照）。
細胞注入用流路（１）から貯留部（３）へと供給された液中に含まれる細胞のうち、不必要な細胞については、送液機構による送液圧に比べて排液機構による吸引圧が高くなる（送液を停止する場合も含む）ように制御することにより、細胞排出用流路（２）へと導いて細胞排出口（７）から外部に排出する（図１１参照）。
【００４９】
上記第一乃至第三段階を所要回数繰り返すことにより、複数の細胞を細胞配列部（４）において所望配列に配列することができる。
【００５０】
異種細胞を配列させる場合には、上記第一段階において、複数の細胞注入用流路（１）に対して夫々異なる種類の細胞を供給して夫々異なる貯留部（３）へと送り込む。
そして、上記第二段階において、夫々異なる貯留部（３）に送り込まれた複数の細胞の中から所望の細胞を、上記した送液機構と排液機構の制御により若しくは光ピンセットにより、夫々異なる分岐路（５）を介して細胞配列部（４）に移動させる。
最後に、第三段階として、細胞配列部（４）に移動された細胞を、上記した光ピンセットにより移動して、所望の細胞収容用区画内に収容する。
この第一乃至第三段階を所要回数繰り返すことにより、異種細胞を細胞配列部（４）において所望配列に配列することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、創薬における毒性検査や再生医療に利用できる擬似組織を作るための細胞チップの作製等に使用することができ、細胞の移動・接着・分化・増殖などの研究にも利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】本発明に係る細胞配列用マイクロチップを示す図であって、（ａ）は平面図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ａ線断面図、（ｃ）は（ｂ）の中心付近の拡大図である。
【図２】図１（ａ）の中心付近の拡大図である。
【図３】図１（ｃ）のＢ−Ｂ線断面図である。
【図４】細胞配列部において細胞収容用区画を構成する微小基板を示す図であって、（ａ）は平面図、（ｂ）は斜視図、（ｃ）は１つの区画を拡大抽出した図である。
【図５】細胞配列部の構造の別の例を示す平面図である。
【図６】貯留部の細胞注入用流路側から分岐路へと入る経路の内角を説明する図であって、（ａ）は直角に形成した例、（ｂ）は鋭角に形成した例を示す図である。
【図７】本発明に係る細胞配列方法において用いられる装置の一例を示す概略図である。
【図８】本発明に係る細胞配列方法の第一段階を示す図である。
【図９】本発明に係る細胞配列方法の第二段階を示す図である。
【図１０】本発明に係る細胞配列方法の第三段階を示す図である。
【図１１】本発明に係る細胞配列方法において不要な細胞を排出する様子を示す図である。
【符号の説明】
【００５３】
１ 細胞注入用流路
２ 細胞排出用流路
３ 貯留部
４ 細胞配列部
５ 分岐路
６ 細胞注入口
７ 細胞排出口
８ 細胞収容用区画
９ 円形穴
１１ マイクロチップ
Ｓ 細胞
Ｓ１ 所望の細胞
【特許請求の範囲】
【請求項１】
送液機構と連結される細胞注入口を有し、該細胞注入口から注入された細胞が移動する細胞注入用流路と、
排液機構と連結される細胞排出口を有し、該細胞排出口へと向かう細胞が移動する細胞排出用流路と、
これら細胞注入用流路と細胞排出用流路との間に形成され、細胞注入用流路から細胞排出用流路へと流れる途中の細胞を一旦貯留する貯留部と、
該貯留部に貯留された細胞が導入される細胞配列部と、
該細胞配列部と前記貯留部とを接続する分岐路と、
を１つの基板上に備えており、
前記細胞配列部は、壁により互いに仕切られた複数の細胞収容用区画を有し、
前記貯留部は、前記細胞注入用流路及び細胞排出用流路よりも広い幅に形成され、
前記分岐路は、該貯留部よりも狭い幅に形成されている
ことを特徴とする細胞配列用マイクロチップ。
【請求項２】
前記貯留部の細胞注入用流路側から前記分岐路へと入る経路の内角が直角又は鋭角に形成されていることを特徴とする請求項１記載の細胞配列用マイクロチップ。
【請求項３】
前記貯留部を介して接続された細胞注入用流路と細胞排出用流路とが同一直線上にないことを特徴とする請求項１又は２記載の細胞配列用マイクロチップ。
【請求項４】
夫々異なる細胞注入用流路及び細胞排出用流路と接続された複数の貯留部を有しており、
該複数の貯留部が、１つの細胞配列部に対して夫々異なる分岐路を介して接続されていることを特徴とする請求項１乃至３いずれかに記載の細胞配列用マイクロチップ。
【請求項５】
前記細胞配列部が、六角形の細胞収容用区画がハニカム状に配列された構造を有し、
該細胞収容用区画は、その底面に前記六角形よりも小さい円形穴が形成されていることを特徴とする請求項１乃至４いずれかに記載の細胞配列用マイクロチップ。
【請求項６】
請求項１乃至５いずれかに記載の細胞配列用マイクロチップを用いた細胞配列方法であって、
前記送液機構からの送液により細胞を含む液を前記細胞注入用流路に供給して前記貯留部へと送り込む第一の段階と、
該貯留部に送り込まれた細胞の中から所望の細胞を、前記送液機構と排液機構の制御により若しくは光ピンセットにより、前記分岐路を介して前記細胞配列部に移動させる第二の段階と、
該細胞配列部に移動された細胞を光ピンセットにより移動させて所望の細胞収容用区画に収容する第三の段階とを備えており、
前記第一乃至第三の段階を所要回数繰り返すことにより、複数の細胞を細胞配列部において所望配列に配列することを特徴とする細胞配列方法。
【請求項７】
請求項４又は５に記載された細胞配列用マイクロチップを用い、
前記第一の段階において、前記複数の細胞注入用流路に対して夫々異なる種類の細胞を供給して夫々異なる貯留部へと送り込み、
前記第二の段階において、夫々異なる貯留部に送り込まれた複数の細胞の中から所望の細胞を、前記送液機構と排液機構の制御により若しくは光ピンセットにより夫々異なる分岐路を介して前記細胞配列部に移動させることを特徴とする請求項６記載の細胞配列方法。
【請求項１】
送液機構と連結される細胞注入口を有し、該細胞注入口から注入された細胞が移動する細胞注入用流路と、
排液機構と連結される細胞排出口を有し、該細胞排出口へと向かう細胞が移動する細胞排出用流路と、
これら細胞注入用流路と細胞排出用流路との間に形成され、細胞注入用流路から細胞排出用流路へと流れる途中の細胞を一旦貯留する貯留部と、
該貯留部に貯留された細胞が導入される細胞配列部と、
該細胞配列部と前記貯留部とを接続する分岐路と、
を１つの基板上に備えており、
前記細胞配列部は、壁により互いに仕切られた複数の細胞収容用区画を有し、
前記貯留部は、前記細胞注入用流路及び細胞排出用流路よりも広い幅に形成され、
前記分岐路は、該貯留部よりも狭い幅に形成されている
ことを特徴とする細胞配列用マイクロチップ。
【請求項２】
前記貯留部の細胞注入用流路側から前記分岐路へと入る経路の内角が直角又は鋭角に形成されていることを特徴とする請求項１記載の細胞配列用マイクロチップ。
【請求項３】
前記貯留部を介して接続された細胞注入用流路と細胞排出用流路とが同一直線上にないことを特徴とする請求項１又は２記載の細胞配列用マイクロチップ。
【請求項４】
夫々異なる細胞注入用流路及び細胞排出用流路と接続された複数の貯留部を有しており、
該複数の貯留部が、１つの細胞配列部に対して夫々異なる分岐路を介して接続されていることを特徴とする請求項１乃至３いずれかに記載の細胞配列用マイクロチップ。
【請求項５】
前記細胞配列部が、六角形の細胞収容用区画がハニカム状に配列された構造を有し、
該細胞収容用区画は、その底面に前記六角形よりも小さい円形穴が形成されていることを特徴とする請求項１乃至４いずれかに記載の細胞配列用マイクロチップ。
【請求項６】
請求項１乃至５いずれかに記載の細胞配列用マイクロチップを用いた細胞配列方法であって、
前記送液機構からの送液により細胞を含む液を前記細胞注入用流路に供給して前記貯留部へと送り込む第一の段階と、
該貯留部に送り込まれた細胞の中から所望の細胞を、前記送液機構と排液機構の制御により若しくは光ピンセットにより、前記分岐路を介して前記細胞配列部に移動させる第二の段階と、
該細胞配列部に移動された細胞を光ピンセットにより移動させて所望の細胞収容用区画に収容する第三の段階とを備えており、
前記第一乃至第三の段階を所要回数繰り返すことにより、複数の細胞を細胞配列部において所望配列に配列することを特徴とする細胞配列方法。
【請求項７】
請求項４又は５に記載された細胞配列用マイクロチップを用い、
前記第一の段階において、前記複数の細胞注入用流路に対して夫々異なる種類の細胞を供給して夫々異なる貯留部へと送り込み、
前記第二の段階において、夫々異なる貯留部に送り込まれた複数の細胞の中から所望の細胞を、前記送液機構と排液機構の制御により若しくは光ピンセットにより夫々異なる分岐路を介して前記細胞配列部に移動させることを特徴とする請求項６記載の細胞配列方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００７−３３０２０２（Ｐ２００７−３３０２０２Ａ）
【公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１６８０１３（Ｐ２００６−１６８０１３）
【出願日】平成１８年６月１６日（２００６．６．１６）
【出願人】（５０７０４４０２２）株式会社ＡＢｓｉｚｅ (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月１６日（２００６．６．１６）
【出願人】（５０７０４４０２２）株式会社ＡＢｓｉｚｅ (8)
【Ｆターム（参考）】
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