組換えベクター、形質転換体、および、それを用いたホルモンの製造方法
【課題】抗生物質生産の調整に関与するホルモンの製造に使用できる組換えベクターの提供。
【解決手段】下記（Ａ）および（Ｂ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挿入された組換えベクターとする。
（Ａ） 特定の塩基配列からなるＤＮＡ（Ｂ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、下記式（１）で表される反応の触媒活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【解決手段】下記（Ａ）および（Ｂ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挿入された組換えベクターとする。
（Ａ） 特定の塩基配列からなるＤＮＡ（Ｂ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、下記式（１）で表される反応の触媒活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗生物質の生産を制御するホルモンの生合成遺伝子を含む組換えベクター、それを導入した形質転換体、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
Streptomyces等の放線菌は、様々な抗生物質を生産することが知られているが、これらの抗生物質の生産は、通常、自己調節因子（autoregulator）と呼ばれる低分子ホルモン（分子量１９０〜２６０程度）によって調節されている（非特許文献１参照）。
【０００３】
しかしながら、この低分子ホルモンの放線菌における生産量は、例えば、１トンあたり数ｍｇ程度であり、精製や合成が困難であることから、それ自体の研究が困難である。また、このように生産を制御する低分子ホルモンが入手し難いことから、どのような抗生物質がどのようなメカニズムで低分子ホルモンによりその生産が制御されているのかという、抗生物質の生合成に関する研究にも利用し難いという問題がある。さらに、低分子ホルモンの生合成系に関与する酵素をコードする遺伝子については、本発明者らにより、最終工程に関与するＮＡＤＰＨ特異性脱水酵素遺伝子（ＢａｒＳ１遺伝子）が報告されているのみであって（非特許文献２参照）、遺伝子側からのアプローチも困難な状況である。
【非特許文献１】Nihira, T. 2003. In Microbial Secondary Metabolites: Biosynthesis, Genetics and Regulation. 99-119. F. Fierro and J. F. Martin, ed. Research Signpost., Leon.
【非特許文献２】Shikura, N., Yamamura, J., Yamada, Y. & Nihira, T. 2002. 「barS1, the first identified gene for the biosynthesis of a (-butyrolactone autoregulator, a microbial hormone eliciting antibiotic production in Streptomyces species.」 J. Bacteriol. 184: 5151-5157.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、抗生物質生産の調整に関与するホルモンの製造に使用できる組換えベクター、形質転換体、およびこれを用いたホルモンの製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するため、本発明の組換えベクターは、下記（Ａ）および（Ｂ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挿入された組換えベクターである。
（Ａ） 配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、下記式（１）で表される反応の触媒活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【０００６】
また、本発明の形質転換体は、宿主に組換えベクターが導入された形質転換体であり、前記組換えベクターが、本発明の組換えベクターであることを特徴とする。
【０００７】
本発明は、形質転換体の培養工程を含むホルモンの製造方法であって、前記形質転換体が、本発明の形質転換体であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者らは、放線菌、特にStreptomycesにおける抗生物質の生産を制御するホルモンの生合成系について鋭意研究を行った。その結果、各種ホルモンの共通骨格の形成に関与すると推測される酵素のコード遺伝子（以下、「ｂａｒＳ２遺伝子」という）を、同定するに至った。
【０００９】
放線菌Streptomycesの抗生物質生産に関与するホルモン、いわゆる自己調節因子（autoregulator）としては、以下のような物質が報告されている。なお、ホルモンの化合物名は以下の通りである。
ＶＢ‐Ａ
(2R, 3R, 1'R)-2-(1'-α-ヒドロキシ-5'メチル-ヘキシル)-3-(ヒドロキシメチル)ブタノリド
ＶＢ‐Ｂ
(2R, 3R, 1'R)-2-(1'-α-ヒドロキシ-4'メチル-ヘキシル)-3-(ヒドロキシメチル)ブタノリド
ＶＢ‐Ｃ
(2R, 3R, 1'R)-2-(1'-α-ヒドロキシヘキシル)-3-(ヒドロキシメチル)ブタノリド
ＶＢ‐Ｄ
(2R, 3R, 1'R)-2-(1'-α-ヒドロキシヘプチル)-3-(ヒドロキシメチル)ブタノリド
ＶＢ‐Ｅ
(2R, 3R, 1'R)-2-(1'-α-ヒドロキシ-4'メチル-ペンチル)-3-(ヒドロキシメチル)ブタノリド
【００１０】
【化２】
【００１１】
これらのホルモンの生合成経路の一例として、ＶＢ-Ａの推定生合成系を以下に示す。生合成系の中でも、γ-ブチロラクトン骨格を有する中間体からブタノリド（butanolide）への脱水反応（前記式（１）で表される反応）は、列挙した各種ホルモンに共通の工程であり、且つ、ホルモンの生合成系における律速反応にあたると考えられる。このため、この脱水反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を単離し、これを放線菌において発現させれば、前記式（１）の反応が促進される。このような考えに基づいて、本発明者らは、前記式（１）で表される反応を触媒する酵素のコード遺伝子を同定し、この遺伝子を挿入した組換えベクターの構築に至ったのである。したがって、本発明の組換えベクターや形質転換体を用いれば、例えば、前記式（１）の反応を触媒する酵素を遺伝子工学的に発現させることができるため、形質転換体におけるホルモンの生産量を増加することが可能となる。そして、このようにホルモンの生産を増加できれば、ホルモン自体の研究や、これによって制御される抗生物質生合成系の研究の試薬としても使用できるため、極めて有用である。
【００１２】
【化３】
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の組換えベクターは、前述のように、下記（Ａ）および（Ｂ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挿入された組換えベクターである。なお、配列番号１のＤＮＡがコードするアミノ酸配列を配列番号２に示す。
（Ａ） 配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記式（１）で表される反応の触媒活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１４】
前記（Ｂ）において、欠失、置換または付加が可能な塩基数は、前記式（１）で表される反応の触媒活性を喪失しない範囲であれば特に制限されない。例えば、５０塩基に対して、１〜６個が好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個である。特に、欠失・付加の場合には、例えば、３の倍数個（例えば、３）であることが好ましい。また、配列番号１の３’末端にさらに終止コドン（例えば、tga）を有してもよい。なお、前記式（１）における反応生成物は、下記式の状態をとると考えられる。
【００１５】
【化４】
【００１６】
また、本発明の組換えベクターに挿入される遺伝子は、前記式（１）で表される反応の触媒活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば、例えば、前記（Ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよいし、前記（Ａ）との相同性が９０％以上のＤＮＡでもよい。
【００１７】
ハイブリダイズのストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、各配列番号で示された塩基配列のＴｍ値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例として、５×ＳＳＣ溶液、１０×Denhardt溶液、１００μｇ/ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、１０分の洗浄（２回）があげられる。また、相同性は、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上である。
【００１８】
なお、配列番号１で表される遺伝子は、Streptomyces virginiae MAFF 10-06014株より同定した。この遺伝子が、前述の各種ホルモンの生合成遺伝子であることは、表現系がホルモン生産型である野生株について、この遺伝子を不活性化させた破壊株を作製し、この破壊株の表現型がホルモン非生産型となったことにより証明されている。
【００１９】
本発明の組換えベクターは、前記遺伝子をベクターに挿入することによって構築できる。遺伝子のベクターへの挿入は、従来公知の方法によって行うことができる。
【００２０】
前記ベクターとしては、特に制限されないが、例えば、本発明の組換えベクターを導入する宿主の種類に応じて適宜決定できる。具体例としては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウィルスベクター等があげられる。宿主が放線菌の場合には、例えば、汎用ベクターであるｐＳＥＴ１５２等が使用できる。
【００２１】
つぎに、本発明の形質転換体は、前述のように、宿主に組換えベクターが導入された形質転換体であり、前記組換えベクターが、本発明の組換えベクターであることを特徴とする。
【００２２】
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターが宿主に導入されていればよく、前述のようなホルモンを生産するものであれば、宿主の種類は制限されない。宿主の具体例としては、例えば、Streptomyces等の放線菌等があげられ、Streptomycesとしては、例えば、S. virginiae、S. bikiniensis、S. cyaneofuscatus、S. griseus、S. coelicolor、S. lavendulae 等があげられる。また、宿主は、所望のホルモンの種類に応じて適宜決定してもよく、前述のＶＢ型の場合には、例えば、S. virginiae、S. bikiniensis、S. cyaneofuscatus、Ａ-ｆａｃｔｏｒ型の場合には、例えば、S. griseus、ＩＭ−２型の場合には、例えば、S. coelicolor、S. lavendulae等があげられる。
【００２３】
組換えベクターの宿主への導入方法は、特に制限されず、例えば、大腸菌を用いた接合伝達法等、従来公知の方法が採用できる。
【００２４】
つぎに、本発明のホルモンの製造方法は、前述のように、形質転換体の培養工程を含み、前記形質転換体が、本発明の形質転換体であることを特徴とする。
【００２５】
培養条件は、形質転換体の種類に応じて決定できるが、放線菌の場合、例えば、培養温度２５〜２８℃、培養時間２４〜７２時間である。使用する培地としては、例えば、ｆ-ｂｒｏｔｈ（７．５ｇ／Ｌ Bacto Casitone、７．５ｇ／Ｌ Yeast Extract、１５ｇ／Ｌ グリセロール、２．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）等があげられる。
【００２６】
形質転換体により生成されたホルモンは、通常、培地に含まれるため、遠心分離等によって菌体を除去し、上清を回収すればよい。ホルモンの精製方法の一例を以下に示す。回収した前記上清を濃塩酸等によりｐＨ５に調整し、等量以上の酢酸エチルを用いて、前記上清からホルモンの抽出を２回行う。回収した酢酸エチル層に無水硫酸ナトリウムを適量加えて数時間放置し、前記酢酸エチル層から水分を除去する。そして、ろ過により無水硫酸ナトリウムを除去して酢酸エチル層のみを回収し、これを減圧蒸留によって濃縮乾固し、エタノールに再溶解することによって、ホルモンサンプルを得ることができる。
【００２７】
以下に、本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらに制限されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
ｂａｒＳ２遺伝子破壊株の作製
まず、野生株S. virginiae MAFF 10-06014株（National Food Research Institute, Ministry of Agriculture, Forestry, and Fisheries, Tsukuba, Japan）のゲノムＤＮＡから、ｂａｒＳ２遺伝子の一部（４６８ｂｐ）を欠失させた遺伝子破壊株（disruptant）を、以下に示す方法によって作製した。
【００２９】
図１（Ａ）に、S. virginiaeのｂａｒＳ２遺伝子周辺の制限酵素地図ならびに遺伝子座を示し、図１（Ｂ）および図２に、ｂａｒＳ２遺伝子破壊株ならびに補完株（complemented strain）を作製するための相同組換えの概略を示す。同図において各略称は以下の通りである。ａｍｐ，アンピシリン耐性遺伝子；ａｐｒ，アプラマイシン耐性遺伝子；Ａ，Ａｏｒ５１ＨＩ；Ｂ，ＢａｍＨＩ；Ｅ，ＥｃｏＲＩ；Ｈ，ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｎ，ＮａｅＩ；Ｎｏ，ＮｏｔＩ；Ｎｒ，ＮｒｕＩ；Ｐ１，ＰｖｕＩ；Ｐ２，ＰｖｕＩＩ；Ｓ，ＳｐｈＩ；Ｓｍ，ＳｍａＩ；Ｘ，ＸｂａＩ；ＷＴ，野生株。
【００３０】
S. virginiae MAFF 10-06014株のゲノムＤＮＡから、ｂａｒＳ２遺伝子が中心に位置するＥｃｏＲＩ-ＥｃｏＲＩ断片（１０ｋｂ）を切り出し、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位に挿入して、組換えプラスミドｐＳＶＢ１００を作製した。そして、このｐＳＶＢ１００のＡｏｒ５１ＨＩ-ＮｏｔＩ断片（４ｋｂ）をｐＵＣ１９のＰｓｔＩ部位に挿入し、組換えプラスミドｐＳＶＢ１０１を作製した。さらに、ｐＳＶＢ１０１のＮｒｕＩ-ＸｂａＩ断片を除去し、そのＮｒｕＩおよびＸｂａ部位に、ＮａｅＩ断片（２.２５ｋｂ）を挿入して、ｂａｒＳ２遺伝子の部分的な欠損によりｂａｒＳ２遺伝子が破壊されたプラスミドｐＳＶＢ１０２を構築した。なお、ＤＮＡシークエンシングにより、ｐＳＶＢ１０２において、部分的に欠損しているｂａｒＳ遺伝子（ΔｂａｒＳ２）は、４６８ｂｐのｉｎ−ｆｒａｍｅ欠損を起こしていることを確認した。
【００３１】
ｐＳＶＢ１０２から、完全なΔｂａｒＳ２遺伝子（４.７５ｋｂ）をＨｉｎｄIII-ＥｃｏＲＩ断片として切り出し、E. coliからStreptomycesへの伝達を行う接合伝達性プラスミドｐＫＣ１１３２のＨｉｎｄIII-ＥｃｏＲＩ部位に連結させて、組換えプラスミドｐＳＶＢ１０３を作製した。このｐＳＶＢ１０３を、ｐＵＺ８００２を有するE. coli ET12567株に導入し、さらに、この形質転換体とS. virginiae MAFF 10-06014株とを接合伝達させた。そして、S. virginiaeの染色体上においてｐＳＶＢ１０３がsingle crossoverにより連結した接合伝達体を、アプラマイシンにより選択した（single crossover株）。そして、ｐＳＶＢ１０３導入株を、アプラマイシン無添加のＩＳＰ２寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で培養した後（２８℃、３ラウンド）、second crossoverにより形成された、ｂａｒＳ２遺伝子が欠損した破壊株（ＳＶＢＤ１株）を、アプラマイシン感受性によって選択した。
【００３２】
復帰株(revertant)の作製
前述のsecond crossoverの際に、前記遺伝子破壊株と同時に生じる、遺伝子型が野生株と同等の復帰株(revertant)を取得した。
【００３３】
ｂａｒＳ２遺伝子補完株（complemented strain）の作製
また、ｂａｒＳ２遺伝子破壊株（ＳＶＢＤ１株）を補完するために、完全なｂａｒＳ遺伝子を含むＰｖｕＩ-ＰｖｕII断片（１．４５ｋｂ）を、その推定プロモーター領域（ｐｂａｒＳ２）とともに、ｐＳＶＢ１０１から単離し、ＳｍａＩ処理したｐＵＣ１９に挿入して、組換えプラスミドｐＳＶＢ１０４を作製した。そして、ｐＳＶＢ１０４のＸｂａＩ-ＥｃｏＲＩ断片を、ＸｂａＩ-ＥｃｏＲＩ処理した接合伝達性プラスミドｐＳＥＴ１５２に連結させてｐＳＶＢ１０５を作製した。ｐＵＺ８００２を有するE. coli ET12567株からＳＶＢＤ１株に、ｐＳＶＢ１０５を接合伝達させ、アプラマイシン耐性接合完了体（ｂａｒＳ２遺伝子補完株）を得た。
【００３４】
S. virginiae MAFF 10-06014株（野生株：ＷＴ）、single crossover株、ｂａｒＳ２遺伝子破壊株（ＳＶＢＤ１株）、復帰株および補完株からそれぞれＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとして、以下の配列番号で表されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物についてのアガロースゲル電気泳動写真を図３（Ａ）に示す。なお、同図において、レーンＷは野生株、レーンＳはsingle crossover株、レーンＤはｂａｒＳ２遺伝子破壊株（ＳＶＢＤ１株）、レーンＲは復帰株、レーンＣは補完株の結果を示す。
Forward primer(SV5-F:配列番号３)
5'- ACCCTGGTGGTCGACGGCGGGTTCACCAT -3'
Reverse primer(SV5-R:配列番号４)
5'- TGGTCACCGGATCGACCGGTTTCAT -3'
【００３５】
前述のように抽出した各ＤＮＡをＳｐｈＩで処理し、この切断物について、プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。なお、野生株、single crossover株、破壊株（ＳＶＢＤ１株）および復帰株のプローブとしては、ｐＳＶＢ１０１のＳｐｈＩ-ＮａｅＩ断片（１ｋｂ）を、補完株のプローブとしては、ｐＳＶＢ１０４のＮａｅＩ-ＢａｍＨＩ断片（４３６ｂｐ）を使用した。
【００３６】
まず、図３（Ａ）に示すように、野生株のＰＣＲ産物が約１ｋｂであるのに対して、ｐＳＶＢ１０３導入株およびｂａｒＳ２遺伝子破壊株（ＳＶＢＤ１株）のＰＣＲ産物は約０．５４ｋｂであることから、ｂａｒＳ２遺伝子の一部（約０．４６ｋｂ）が欠失していることを確認できた。また、復帰株のＰＣＲ産物が野生株と同様に約１ｋｂであることから、完全なｂａｒＳ２遺伝子が復帰していることを確認できた。また、図３（Ｂ）に示すように、野生株のＳｐｈＩ断片は、１．５ｋｂであるのに対して、ｐＳＶＢ１０３導入株およびｂａｒＳ２遺伝子破壊株（ＳＶＢＤ１株）のＳｐｈＩ断片は１．５ｋｂおよび０．９ｋｂであることから、ｂａｒＳ２遺伝子の一部が欠失していることを確認できた。また、復帰株は、野生株と同様の結果を示したことから、完全なｂａｒＳ２遺伝子が復帰していることが確認できた。
【実施例２】
【００３７】
ｂａｒＳ２遺伝子の形態への影響を確認した。
【００３８】
実施例１における野生株、ｂａｒＳ２遺伝子破壊株（ＳＶＢＤ１株）、ｂａｒＳ２遺伝子補完株を、それぞれＩＳＰ２寒天培地にまき、２８℃で１４日間培養した。この結果を、図４に示す。図４は、寒天培地での生育状態を示す写真であり、Ａは野生株、ＢはｂａｒＳ２遺伝子破壊株（ＳＶＢＤ１株）、ＣはｂａｒＳ２遺伝子補完株をそれぞれ示す。
【００３９】
また、各種株について液体培養を行い、その経時的な生育状態をＯＤ600として測定した。液体培地の組成は、７．５ｇ／Ｌ Bacto Casitone（Difco Laboratories社製）、７．５ｇ／Ｌ Yeast Extract（Difco Laboratories社製）、１５ｇ／Ｌグリセロール、２．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌとした（ｐＨ６．５、以下同じ）。この液体培地７０ｍｌに胞子１×１０8個となるように前述の株をそれぞれ接種し、２８℃で所定時間（０〜４８時間）攪拌培養した（１４０strokes／分）。培養後の菌体を回収して同量の前記液体培地に懸濁し、使用時まで−８０℃で凍結させた。そして、凍結菌体を室温に放置してから、三角フラスコ中の液体培地７０ｍｌに懸濁し、そのＯＤ600を測定した。その結果を図５に示す。
【００４０】
図４および図５に示すように、いずれの株についても生育に差は見られていない。このことから、ｂａｒＳ２遺伝子は、形態分化や一次代謝には関与しておらず、二次代謝に関与していると推測される。
【実施例３】
【００４１】
ＶＢ生成の確認
次に、実施例２と同様の野生株、破壊株および補完株を培養し、ＶＢ生成の有無を確認した。
【００４２】
まず、前培養として、前述の各株（胞子１×１０8）を７０ｍｌのｆ-ｂｒｏｔｈで振とう培養した。培養条件は、２４時間、１４０strokes／分とした。前培養後、回収した菌体をｆ-ｂｒｏｔｈで２回洗浄し、等量の新たなｆ-ｂｒｏｔｈに懸濁して、使用時まで−８０℃で保存した。凍結させた前培養の菌体を室温に放置した後、ｆｉｎａｌ ＯＤ600が０.０７５になるように７０ｍｌのｆ-ｂｒｏｔｈに前記菌体を添加した。そして、これを前述の前培養と同様の条件でインキュベートし本培養を行った。所定時間（１２時間、１８時間、２４時間）培養した後、培養液から菌体を除去し、得られた上清を０.４５μｍのフィルターに通し、ろ液を以下の条件でＨＰＬＣに供してＶＭの生成を確認した。そして、抗生物質バージニアマイシン（ＶＭ）生産の誘導に必要なＶＢ-Ａの最小量（０．６ｎｇ／ｍｌ（２．６ｎＭ））を１ユニットとして、ＶＢ活性を求めた。ＶＢ活性の結果を下記表１に示す。また、ＶＭの経時的な生産量の変化を図６に示す。
【００４３】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム ：逆相カラム
（商品名Cosmosil 5C18 カラム：ナカライテスク社製）
サイズ ：直径４.６ｍｍ×１５０ｍｍ
溶出条件 ：（５分間）
２０％*1アセトニトリル-０.１％ ＴＦＡ*2
（３０分間）
２０-８０％アセトニトリルリニアグラジェント
（洗浄）
１００％アセトニトリル
流速 ：０.７５ｍｌ／分
検出波長 ：ＵＶ３０５ｎｍ
＊１：％＝体積％
＊２：ＴＦＡ＝トリフルフルオロ酢酸
【００４４】
（表１）
ＶＢ活性（Ｕ／ｍｌ）
培養時間 野生株 破壊株 補完株
１２時間 ０．２ ０．２ ０．２
１８時間 ２２８．５ ０．２ ２２８．５
【００４５】
前記表１および図６に示すように、ｂａｒＳ２遺伝子を部分的に欠失させることによって、破壊株ではＶＢを生成できなくなり、その結果、ＶＭ生産の誘導が抑制された。また、ｂａｒＳ２遺伝子を補完することによって、復帰株では再度ＶＢが生成され、ＶＭ生産の誘導が可能となった。以上の結果から、ｂａｒＳ２がＶＢの生成に関与していることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
以上のように、本発明によれば、従来少量しか生産されなかった、抗生物質生産を制御するホルモンを効率良く生産できる。このため、例えば、試薬としての提供が容易になるため、ホルモン自体の研究はもちろんのこと、これによって制御される抗生物質の生合成経路の研究を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】（Ａ）は、本発明の一実施例における、ｂａｒＳ２遺伝子周辺の制限酵素地図ならびに遺伝子座を示す図であり、（Ｂ）は、相同組換えの概略を示す図である。
【図２】本発明の前記実施例における相同組換えの概略を示す図である。
【図３】（Ａ）は、本発明の一実施例におけるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の写真であり、（Ｂ）は、サザンハイブルダイゼーションのラジオグラムである。
【図４】本発明のその他の実施例における生育状態を示す写真であり、（Ａ）は野生株、（Ｂ）は遺伝子破壊株、（Ｃ）は補完株の結果を示す。
【図５】本発明のその他の実施例における、野生株、遺伝子破壊株および補完株の生育曲線を示すグラフである。
【図６】本発明のその他の実施例における経時的なＶＭ生産量を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗生物質の生産を制御するホルモンの生合成遺伝子を含む組換えベクター、それを導入した形質転換体、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
Streptomyces等の放線菌は、様々な抗生物質を生産することが知られているが、これらの抗生物質の生産は、通常、自己調節因子（autoregulator）と呼ばれる低分子ホルモン（分子量１９０〜２６０程度）によって調節されている（非特許文献１参照）。
【０００３】
しかしながら、この低分子ホルモンの放線菌における生産量は、例えば、１トンあたり数ｍｇ程度であり、精製や合成が困難であることから、それ自体の研究が困難である。また、このように生産を制御する低分子ホルモンが入手し難いことから、どのような抗生物質がどのようなメカニズムで低分子ホルモンによりその生産が制御されているのかという、抗生物質の生合成に関する研究にも利用し難いという問題がある。さらに、低分子ホルモンの生合成系に関与する酵素をコードする遺伝子については、本発明者らにより、最終工程に関与するＮＡＤＰＨ特異性脱水酵素遺伝子（ＢａｒＳ１遺伝子）が報告されているのみであって（非特許文献２参照）、遺伝子側からのアプローチも困難な状況である。
【非特許文献１】Nihira, T. 2003. In Microbial Secondary Metabolites: Biosynthesis, Genetics and Regulation. 99-119. F. Fierro and J. F. Martin, ed. Research Signpost., Leon.
【非特許文献２】Shikura, N., Yamamura, J., Yamada, Y. & Nihira, T. 2002. 「barS1, the first identified gene for the biosynthesis of a (-butyrolactone autoregulator, a microbial hormone eliciting antibiotic production in Streptomyces species.」 J. Bacteriol. 184: 5151-5157.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、抗生物質生産の調整に関与するホルモンの製造に使用できる組換えベクター、形質転換体、およびこれを用いたホルモンの製造方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するため、本発明の組換えベクターは、下記（Ａ）および（Ｂ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挿入された組換えベクターである。
（Ａ） 配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、下記式（１）で表される反応の触媒活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【０００６】
また、本発明の形質転換体は、宿主に組換えベクターが導入された形質転換体であり、前記組換えベクターが、本発明の組換えベクターであることを特徴とする。
【０００７】
本発明は、形質転換体の培養工程を含むホルモンの製造方法であって、前記形質転換体が、本発明の形質転換体であることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者らは、放線菌、特にStreptomycesにおける抗生物質の生産を制御するホルモンの生合成系について鋭意研究を行った。その結果、各種ホルモンの共通骨格の形成に関与すると推測される酵素のコード遺伝子（以下、「ｂａｒＳ２遺伝子」という）を、同定するに至った。
【０００９】
放線菌Streptomycesの抗生物質生産に関与するホルモン、いわゆる自己調節因子（autoregulator）としては、以下のような物質が報告されている。なお、ホルモンの化合物名は以下の通りである。
ＶＢ‐Ａ
(2R, 3R, 1'R)-2-(1'-α-ヒドロキシ-5'メチル-ヘキシル)-3-(ヒドロキシメチル)ブタノリド
ＶＢ‐Ｂ
(2R, 3R, 1'R)-2-(1'-α-ヒドロキシ-4'メチル-ヘキシル)-3-(ヒドロキシメチル)ブタノリド
ＶＢ‐Ｃ
(2R, 3R, 1'R)-2-(1'-α-ヒドロキシヘキシル)-3-(ヒドロキシメチル)ブタノリド
ＶＢ‐Ｄ
(2R, 3R, 1'R)-2-(1'-α-ヒドロキシヘプチル)-3-(ヒドロキシメチル)ブタノリド
ＶＢ‐Ｅ
(2R, 3R, 1'R)-2-(1'-α-ヒドロキシ-4'メチル-ペンチル)-3-(ヒドロキシメチル)ブタノリド
【００１０】
【化２】
【００１１】
これらのホルモンの生合成経路の一例として、ＶＢ-Ａの推定生合成系を以下に示す。生合成系の中でも、γ-ブチロラクトン骨格を有する中間体からブタノリド（butanolide）への脱水反応（前記式（１）で表される反応）は、列挙した各種ホルモンに共通の工程であり、且つ、ホルモンの生合成系における律速反応にあたると考えられる。このため、この脱水反応を触媒する酵素をコードする遺伝子を単離し、これを放線菌において発現させれば、前記式（１）の反応が促進される。このような考えに基づいて、本発明者らは、前記式（１）で表される反応を触媒する酵素のコード遺伝子を同定し、この遺伝子を挿入した組換えベクターの構築に至ったのである。したがって、本発明の組換えベクターや形質転換体を用いれば、例えば、前記式（１）の反応を触媒する酵素を遺伝子工学的に発現させることができるため、形質転換体におけるホルモンの生産量を増加することが可能となる。そして、このようにホルモンの生産を増加できれば、ホルモン自体の研究や、これによって制御される抗生物質生合成系の研究の試薬としても使用できるため、極めて有用である。
【００１２】
【化３】
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の組換えベクターは、前述のように、下記（Ａ）および（Ｂ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挿入された組換えベクターである。なお、配列番号１のＤＮＡがコードするアミノ酸配列を配列番号２に示す。
（Ａ） 配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、前記式（１）で表される反応の触媒活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１４】
前記（Ｂ）において、欠失、置換または付加が可能な塩基数は、前記式（１）で表される反応の触媒活性を喪失しない範囲であれば特に制限されない。例えば、５０塩基に対して、１〜６個が好ましく、より好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個である。特に、欠失・付加の場合には、例えば、３の倍数個（例えば、３）であることが好ましい。また、配列番号１の３’末端にさらに終止コドン（例えば、tga）を有してもよい。なお、前記式（１）における反応生成物は、下記式の状態をとると考えられる。
【００１５】
【化４】
【００１６】
また、本発明の組換えベクターに挿入される遺伝子は、前記式（１）で表される反応の触媒活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば、例えば、前記（Ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであってもよいし、前記（Ａ）との相同性が９０％以上のＤＮＡでもよい。
【００１７】
ハイブリダイズのストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、各配列番号で示された塩基配列のＴｍ値の±５℃、好ましくは±２℃、より好ましくは±１℃である。条件の具体例として、５×ＳＳＣ溶液、１０×Denhardt溶液、１００μｇ/ｍｌサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、１０分の洗浄（２回）があげられる。また、相同性は、例えば、９０％以上であり、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上である。
【００１８】
なお、配列番号１で表される遺伝子は、Streptomyces virginiae MAFF 10-06014株より同定した。この遺伝子が、前述の各種ホルモンの生合成遺伝子であることは、表現系がホルモン生産型である野生株について、この遺伝子を不活性化させた破壊株を作製し、この破壊株の表現型がホルモン非生産型となったことにより証明されている。
【００１９】
本発明の組換えベクターは、前記遺伝子をベクターに挿入することによって構築できる。遺伝子のベクターへの挿入は、従来公知の方法によって行うことができる。
【００２０】
前記ベクターとしては、特に制限されないが、例えば、本発明の組換えベクターを導入する宿主の種類に応じて適宜決定できる。具体例としては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウィルスベクター等があげられる。宿主が放線菌の場合には、例えば、汎用ベクターであるｐＳＥＴ１５２等が使用できる。
【００２１】
つぎに、本発明の形質転換体は、前述のように、宿主に組換えベクターが導入された形質転換体であり、前記組換えベクターが、本発明の組換えベクターであることを特徴とする。
【００２２】
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターが宿主に導入されていればよく、前述のようなホルモンを生産するものであれば、宿主の種類は制限されない。宿主の具体例としては、例えば、Streptomyces等の放線菌等があげられ、Streptomycesとしては、例えば、S. virginiae、S. bikiniensis、S. cyaneofuscatus、S. griseus、S. coelicolor、S. lavendulae 等があげられる。また、宿主は、所望のホルモンの種類に応じて適宜決定してもよく、前述のＶＢ型の場合には、例えば、S. virginiae、S. bikiniensis、S. cyaneofuscatus、Ａ-ｆａｃｔｏｒ型の場合には、例えば、S. griseus、ＩＭ−２型の場合には、例えば、S. coelicolor、S. lavendulae等があげられる。
【００２３】
組換えベクターの宿主への導入方法は、特に制限されず、例えば、大腸菌を用いた接合伝達法等、従来公知の方法が採用できる。
【００２４】
つぎに、本発明のホルモンの製造方法は、前述のように、形質転換体の培養工程を含み、前記形質転換体が、本発明の形質転換体であることを特徴とする。
【００２５】
培養条件は、形質転換体の種類に応じて決定できるが、放線菌の場合、例えば、培養温度２５〜２８℃、培養時間２４〜７２時間である。使用する培地としては、例えば、ｆ-ｂｒｏｔｈ（７．５ｇ／Ｌ Bacto Casitone、７．５ｇ／Ｌ Yeast Extract、１５ｇ／Ｌ グリセロール、２．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）等があげられる。
【００２６】
形質転換体により生成されたホルモンは、通常、培地に含まれるため、遠心分離等によって菌体を除去し、上清を回収すればよい。ホルモンの精製方法の一例を以下に示す。回収した前記上清を濃塩酸等によりｐＨ５に調整し、等量以上の酢酸エチルを用いて、前記上清からホルモンの抽出を２回行う。回収した酢酸エチル層に無水硫酸ナトリウムを適量加えて数時間放置し、前記酢酸エチル層から水分を除去する。そして、ろ過により無水硫酸ナトリウムを除去して酢酸エチル層のみを回収し、これを減圧蒸留によって濃縮乾固し、エタノールに再溶解することによって、ホルモンサンプルを得ることができる。
【００２７】
以下に、本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらに制限されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
ｂａｒＳ２遺伝子破壊株の作製
まず、野生株S. virginiae MAFF 10-06014株（National Food Research Institute, Ministry of Agriculture, Forestry, and Fisheries, Tsukuba, Japan）のゲノムＤＮＡから、ｂａｒＳ２遺伝子の一部（４６８ｂｐ）を欠失させた遺伝子破壊株（disruptant）を、以下に示す方法によって作製した。
【００２９】
図１（Ａ）に、S. virginiaeのｂａｒＳ２遺伝子周辺の制限酵素地図ならびに遺伝子座を示し、図１（Ｂ）および図２に、ｂａｒＳ２遺伝子破壊株ならびに補完株（complemented strain）を作製するための相同組換えの概略を示す。同図において各略称は以下の通りである。ａｍｐ，アンピシリン耐性遺伝子；ａｐｒ，アプラマイシン耐性遺伝子；Ａ，Ａｏｒ５１ＨＩ；Ｂ，ＢａｍＨＩ；Ｅ，ＥｃｏＲＩ；Ｈ，ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｎ，ＮａｅＩ；Ｎｏ，ＮｏｔＩ；Ｎｒ，ＮｒｕＩ；Ｐ１，ＰｖｕＩ；Ｐ２，ＰｖｕＩＩ；Ｓ，ＳｐｈＩ；Ｓｍ，ＳｍａＩ；Ｘ，ＸｂａＩ；ＷＴ，野生株。
【００３０】
S. virginiae MAFF 10-06014株のゲノムＤＮＡから、ｂａｒＳ２遺伝子が中心に位置するＥｃｏＲＩ-ＥｃｏＲＩ断片（１０ｋｂ）を切り出し、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位に挿入して、組換えプラスミドｐＳＶＢ１００を作製した。そして、このｐＳＶＢ１００のＡｏｒ５１ＨＩ-ＮｏｔＩ断片（４ｋｂ）をｐＵＣ１９のＰｓｔＩ部位に挿入し、組換えプラスミドｐＳＶＢ１０１を作製した。さらに、ｐＳＶＢ１０１のＮｒｕＩ-ＸｂａＩ断片を除去し、そのＮｒｕＩおよびＸｂａ部位に、ＮａｅＩ断片（２.２５ｋｂ）を挿入して、ｂａｒＳ２遺伝子の部分的な欠損によりｂａｒＳ２遺伝子が破壊されたプラスミドｐＳＶＢ１０２を構築した。なお、ＤＮＡシークエンシングにより、ｐＳＶＢ１０２において、部分的に欠損しているｂａｒＳ遺伝子（ΔｂａｒＳ２）は、４６８ｂｐのｉｎ−ｆｒａｍｅ欠損を起こしていることを確認した。
【００３１】
ｐＳＶＢ１０２から、完全なΔｂａｒＳ２遺伝子（４.７５ｋｂ）をＨｉｎｄIII-ＥｃｏＲＩ断片として切り出し、E. coliからStreptomycesへの伝達を行う接合伝達性プラスミドｐＫＣ１１３２のＨｉｎｄIII-ＥｃｏＲＩ部位に連結させて、組換えプラスミドｐＳＶＢ１０３を作製した。このｐＳＶＢ１０３を、ｐＵＺ８００２を有するE. coli ET12567株に導入し、さらに、この形質転換体とS. virginiae MAFF 10-06014株とを接合伝達させた。そして、S. virginiaeの染色体上においてｐＳＶＢ１０３がsingle crossoverにより連結した接合伝達体を、アプラマイシンにより選択した（single crossover株）。そして、ｐＳＶＢ１０３導入株を、アプラマイシン無添加のＩＳＰ２寒天培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で培養した後（２８℃、３ラウンド）、second crossoverにより形成された、ｂａｒＳ２遺伝子が欠損した破壊株（ＳＶＢＤ１株）を、アプラマイシン感受性によって選択した。
【００３２】
復帰株(revertant)の作製
前述のsecond crossoverの際に、前記遺伝子破壊株と同時に生じる、遺伝子型が野生株と同等の復帰株(revertant)を取得した。
【００３３】
ｂａｒＳ２遺伝子補完株（complemented strain）の作製
また、ｂａｒＳ２遺伝子破壊株（ＳＶＢＤ１株）を補完するために、完全なｂａｒＳ遺伝子を含むＰｖｕＩ-ＰｖｕII断片（１．４５ｋｂ）を、その推定プロモーター領域（ｐｂａｒＳ２）とともに、ｐＳＶＢ１０１から単離し、ＳｍａＩ処理したｐＵＣ１９に挿入して、組換えプラスミドｐＳＶＢ１０４を作製した。そして、ｐＳＶＢ１０４のＸｂａＩ-ＥｃｏＲＩ断片を、ＸｂａＩ-ＥｃｏＲＩ処理した接合伝達性プラスミドｐＳＥＴ１５２に連結させてｐＳＶＢ１０５を作製した。ｐＵＺ８００２を有するE. coli ET12567株からＳＶＢＤ１株に、ｐＳＶＢ１０５を接合伝達させ、アプラマイシン耐性接合完了体（ｂａｒＳ２遺伝子補完株）を得た。
【００３４】
S. virginiae MAFF 10-06014株（野生株：ＷＴ）、single crossover株、ｂａｒＳ２遺伝子破壊株（ＳＶＢＤ１株）、復帰株および補完株からそれぞれＤＮＡを抽出し、これを鋳型ＤＮＡとして、以下の配列番号で表されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物についてのアガロースゲル電気泳動写真を図３（Ａ）に示す。なお、同図において、レーンＷは野生株、レーンＳはsingle crossover株、レーンＤはｂａｒＳ２遺伝子破壊株（ＳＶＢＤ１株）、レーンＲは復帰株、レーンＣは補完株の結果を示す。
Forward primer(SV5-F:配列番号３)
5'- ACCCTGGTGGTCGACGGCGGGTTCACCAT -3'
Reverse primer(SV5-R:配列番号４)
5'- TGGTCACCGGATCGACCGGTTTCAT -3'
【００３５】
前述のように抽出した各ＤＮＡをＳｐｈＩで処理し、この切断物について、プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。なお、野生株、single crossover株、破壊株（ＳＶＢＤ１株）および復帰株のプローブとしては、ｐＳＶＢ１０１のＳｐｈＩ-ＮａｅＩ断片（１ｋｂ）を、補完株のプローブとしては、ｐＳＶＢ１０４のＮａｅＩ-ＢａｍＨＩ断片（４３６ｂｐ）を使用した。
【００３６】
まず、図３（Ａ）に示すように、野生株のＰＣＲ産物が約１ｋｂであるのに対して、ｐＳＶＢ１０３導入株およびｂａｒＳ２遺伝子破壊株（ＳＶＢＤ１株）のＰＣＲ産物は約０．５４ｋｂであることから、ｂａｒＳ２遺伝子の一部（約０．４６ｋｂ）が欠失していることを確認できた。また、復帰株のＰＣＲ産物が野生株と同様に約１ｋｂであることから、完全なｂａｒＳ２遺伝子が復帰していることを確認できた。また、図３（Ｂ）に示すように、野生株のＳｐｈＩ断片は、１．５ｋｂであるのに対して、ｐＳＶＢ１０３導入株およびｂａｒＳ２遺伝子破壊株（ＳＶＢＤ１株）のＳｐｈＩ断片は１．５ｋｂおよび０．９ｋｂであることから、ｂａｒＳ２遺伝子の一部が欠失していることを確認できた。また、復帰株は、野生株と同様の結果を示したことから、完全なｂａｒＳ２遺伝子が復帰していることが確認できた。
【実施例２】
【００３７】
ｂａｒＳ２遺伝子の形態への影響を確認した。
【００３８】
実施例１における野生株、ｂａｒＳ２遺伝子破壊株（ＳＶＢＤ１株）、ｂａｒＳ２遺伝子補完株を、それぞれＩＳＰ２寒天培地にまき、２８℃で１４日間培養した。この結果を、図４に示す。図４は、寒天培地での生育状態を示す写真であり、Ａは野生株、ＢはｂａｒＳ２遺伝子破壊株（ＳＶＢＤ１株）、ＣはｂａｒＳ２遺伝子補完株をそれぞれ示す。
【００３９】
また、各種株について液体培養を行い、その経時的な生育状態をＯＤ600として測定した。液体培地の組成は、７．５ｇ／Ｌ Bacto Casitone（Difco Laboratories社製）、７．５ｇ／Ｌ Yeast Extract（Difco Laboratories社製）、１５ｇ／Ｌグリセロール、２．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌとした（ｐＨ６．５、以下同じ）。この液体培地７０ｍｌに胞子１×１０8個となるように前述の株をそれぞれ接種し、２８℃で所定時間（０〜４８時間）攪拌培養した（１４０strokes／分）。培養後の菌体を回収して同量の前記液体培地に懸濁し、使用時まで−８０℃で凍結させた。そして、凍結菌体を室温に放置してから、三角フラスコ中の液体培地７０ｍｌに懸濁し、そのＯＤ600を測定した。その結果を図５に示す。
【００４０】
図４および図５に示すように、いずれの株についても生育に差は見られていない。このことから、ｂａｒＳ２遺伝子は、形態分化や一次代謝には関与しておらず、二次代謝に関与していると推測される。
【実施例３】
【００４１】
ＶＢ生成の確認
次に、実施例２と同様の野生株、破壊株および補完株を培養し、ＶＢ生成の有無を確認した。
【００４２】
まず、前培養として、前述の各株（胞子１×１０8）を７０ｍｌのｆ-ｂｒｏｔｈで振とう培養した。培養条件は、２４時間、１４０strokes／分とした。前培養後、回収した菌体をｆ-ｂｒｏｔｈで２回洗浄し、等量の新たなｆ-ｂｒｏｔｈに懸濁して、使用時まで−８０℃で保存した。凍結させた前培養の菌体を室温に放置した後、ｆｉｎａｌ ＯＤ600が０.０７５になるように７０ｍｌのｆ-ｂｒｏｔｈに前記菌体を添加した。そして、これを前述の前培養と同様の条件でインキュベートし本培養を行った。所定時間（１２時間、１８時間、２４時間）培養した後、培養液から菌体を除去し、得られた上清を０.４５μｍのフィルターに通し、ろ液を以下の条件でＨＰＬＣに供してＶＭの生成を確認した。そして、抗生物質バージニアマイシン（ＶＭ）生産の誘導に必要なＶＢ-Ａの最小量（０．６ｎｇ／ｍｌ（２．６ｎＭ））を１ユニットとして、ＶＢ活性を求めた。ＶＢ活性の結果を下記表１に示す。また、ＶＭの経時的な生産量の変化を図６に示す。
【００４３】
（ＨＰＬＣ条件）
カラム ：逆相カラム
（商品名Cosmosil 5C18 カラム：ナカライテスク社製）
サイズ ：直径４.６ｍｍ×１５０ｍｍ
溶出条件 ：（５分間）
２０％*1アセトニトリル-０.１％ ＴＦＡ*2
（３０分間）
２０-８０％アセトニトリルリニアグラジェント
（洗浄）
１００％アセトニトリル
流速 ：０.７５ｍｌ／分
検出波長 ：ＵＶ３０５ｎｍ
＊１：％＝体積％
＊２：ＴＦＡ＝トリフルフルオロ酢酸
【００４４】
（表１）
ＶＢ活性（Ｕ／ｍｌ）
培養時間 野生株 破壊株 補完株
１２時間 ０．２ ０．２ ０．２
１８時間 ２２８．５ ０．２ ２２８．５
【００４５】
前記表１および図６に示すように、ｂａｒＳ２遺伝子を部分的に欠失させることによって、破壊株ではＶＢを生成できなくなり、その結果、ＶＭ生産の誘導が抑制された。また、ｂａｒＳ２遺伝子を補完することによって、復帰株では再度ＶＢが生成され、ＶＭ生産の誘導が可能となった。以上の結果から、ｂａｒＳ２がＶＢの生成に関与していることが証明された。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
以上のように、本発明によれば、従来少量しか生産されなかった、抗生物質生産を制御するホルモンを効率良く生産できる。このため、例えば、試薬としての提供が容易になるため、ホルモン自体の研究はもちろんのこと、これによって制御される抗生物質の生合成経路の研究を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】（Ａ）は、本発明の一実施例における、ｂａｒＳ２遺伝子周辺の制限酵素地図ならびに遺伝子座を示す図であり、（Ｂ）は、相同組換えの概略を示す図である。
【図２】本発明の前記実施例における相同組換えの概略を示す図である。
【図３】（Ａ）は、本発明の一実施例におけるＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の写真であり、（Ｂ）は、サザンハイブルダイゼーションのラジオグラムである。
【図４】本発明のその他の実施例における生育状態を示す写真であり、（Ａ）は野生株、（Ｂ）は遺伝子破壊株、（Ｃ）は補完株の結果を示す。
【図５】本発明のその他の実施例における、野生株、遺伝子破壊株および補完株の生育曲線を示すグラフである。
【図６】本発明のその他の実施例における経時的なＶＭ生産量を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）および（Ｂ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挿入された組換えベクター。
（Ａ） 配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、下記式（１）で表される反応の触媒活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【化１】
【請求項２】
宿主に組換えベクターが導入された形質転換体であり、
前記組換えベクターが、請求項１の組換えベクターであることを特徴とする形質転換体。
【請求項３】
前記宿主が放線菌である、請求項２記載の形質転換体。
【請求項４】
前記放線菌が、Streptomycesである、請求項３記載の形質転換体。
【請求項５】
形質転換体の培養工程を含むホルモンの製造方法であって、
前記形質転換体が、請求項２〜４のいずれか一項に記載の形質転換体であることを特徴とする製造方法。
【請求項６】
前記ホルモンが、放線菌の抗生物質生産を調整するホルモンである、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
前記ホルモンが、γ-ブチロラクトン骨格を有する化合物である、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
前記ホルモンが、ＶＢ型、ＩＭ−２型およびＡ-ｆａｃｔｏｒ型からなる群から選択された少なくとも一つのγ-ブチロラクトン骨格を有する化合物である、請求項６記載の製造方法。
【請求項１】
下記（Ａ）および（Ｂ）のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子が挿入された組換えベクター。
（Ａ） 配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ
（Ｂ） 前記（Ａ）の塩基配列において１個もしくは数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列からなり、且つ、下記式（１）で表される反応の触媒活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【化１】
【請求項２】
宿主に組換えベクターが導入された形質転換体であり、
前記組換えベクターが、請求項１の組換えベクターであることを特徴とする形質転換体。
【請求項３】
前記宿主が放線菌である、請求項２記載の形質転換体。
【請求項４】
前記放線菌が、Streptomycesである、請求項３記載の形質転換体。
【請求項５】
形質転換体の培養工程を含むホルモンの製造方法であって、
前記形質転換体が、請求項２〜４のいずれか一項に記載の形質転換体であることを特徴とする製造方法。
【請求項６】
前記ホルモンが、放線菌の抗生物質生産を調整するホルモンである、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
前記ホルモンが、γ-ブチロラクトン骨格を有する化合物である、請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
前記ホルモンが、ＶＢ型、ＩＭ−２型およびＡ-ｆａｃｔｏｒ型からなる群から選択された少なくとも一つのγ-ブチロラクトン骨格を有する化合物である、請求項６記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００７−１２９９４０（Ｐ２００７−１２９９４０Ａ）
【公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３２５３０４（Ｐ２００５−３２５３０４）
【出願日】平成１７年１１月９日（２００５．１１．９）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（８０１００００６１）財団法人大阪産業振興機構 (168)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月９日（２００５．１１．９）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【出願人】（８０１００００６１）財団法人大阪産業振興機構 (168)
【Ｆターム（参考）】
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