組換え生鶏痘ウィルスベクター及びＣ型肝炎ウィルスに対する薬剤組成物中でのそれらの使用
本発明は、Ｃ型肝炎ウィルス抗原に基づく組合せタンパク質のための組換え鶏痘ウィルス、及び回数を低減した投与後にＣ型肝炎ウィルスに対して細胞性免疫反応を誘導できる薬剤組成物中でのその使用に関する。本発明によれば、前記薬剤組成物は、哺乳動物のＣ型肝炎ウィルスに関する感染を予防及び治療するのに使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）のタンパク質を発現する組換え鶏痘ウィルスを用いる免疫学及びウィルスワクチン、並びにＨＣＶに対して細胞性免疫反応を誘導できる薬剤組成物の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶは、１９８９年に初めて、分子生物学技術を用いて非Ａ非Ｂ型輸血後肝炎の主な病原と特定された（Ｃｈｏｏ Ｑ−Ｌ．，Ｋｕｏ Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９）血液由来非Ａ非Ｂ型ウィルス肝炎ゲノム由来のｃＤＮＡクローンの単離（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｂｌｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ ｎｏｎ Ａ，ｎｏｎ−Ｂ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｇｅｎｏｍｅ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４４：３５９〜６２；ＥＰ ０３１８２１６ Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ）。現在では、世界中で１億７千万を超える人々がこのウィルス因子に感染している。ＨＣＶ感染は、症例の８５％で持続性であり、しばしば硬変症及び肝細胞癌を引き起こす（Ｃａｓｅｌｍａｎｎ Ｗ．Ｈ．，Ａｌｔ Ｍ．（１９９６）肝細胞癌に関する主な危険因子としてのＣ型肝炎ウィルス感染（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｍａｊｏｒ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２４：６１〜６６）。実際に、感染から２５年後、ＨＣＶ慢性保菌者の２５％が硬変症を発症し、その１〜４％が毎年肝細胞癌を発症する（Ｐｒｉｎｃｅ Ａ．Ｍ．，Ｓｈａｔａ Ｍ．Ｔ．（２００１）Ｃ型肝炎ウィルス感染の免疫学的予防（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．）Ｃｌｉｎ．Ｌｉｖｅｒ．Ｄｉｓ．５：１０９１〜１０３）。
【０００３】
ＨＣＶ感染に特に好ましい治療は、集中療法で投与されるペグ化インターフェロンの併用に基づいている。しかし、この治療は攻撃的（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）で、高価であり、且つ症例の５０％未満に有効である。（Ｐｒｉｎｃｅ Ａ．Ｍ．，Ｓｈａｔａ Ｍ．Ｔ．（２００１）Ｃ型肝炎ウィルス感染の免疫学的予防（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．）Ｃｌｉｎ．Ｌｉｖｅｒ．Ｄｉｓ．５：１０９１〜１０３）。
【０００４】
ＨＣＶ抗原に基づく、タンパク質サブユニット、ウィルス様粒子、合成ペプチド、組換え生ベクター及びＤＮＡ免疫用ＤＮＡ構築体といった様々な変異体は、ワクチン接種手法として評価されてきた（ＵＳ６６３５２５７、ＵＳ６３８７６６２、ＵＳ６２３５８８８、ＵＳ６６８５９４４、ＵＳ２００３０２１８０５、Ｌｅｃｈｍａｎｎ Ｍ．，Ｌｉａｎｇ Ｔ．Ｊ．（２０００）Ｃ型肝炎のワクチン開発（Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．）Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ．Ｄｉｓ．２０：２１１〜２６）。これらの変異体の一部は、それらのＨＣＶエピトープに対する特異的な免疫反応を誘発する能力を実証しているが、この反応はまだ不十分のようである。現在、ＨＣＶ感染に対する予防と相関のある免疫パラメーターは、完全に定められていない。それにもかかわらず、いくつかの研究は、初期の、強い及び多重特異な細胞障害性Ｔ細胞応答が、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞と共に、ウィルスに対する免疫及び疾患の解消に有利であることを示唆する。反対に、後期のＴ細胞応答は、慢性肝臓免疫病の確立に関連している（Ｃｅｒｎｙ Ａ．，Ｃｈｉｓａｒｉ Ｆ．Ｖ．（１９９９）慢性Ｃ型肝炎の発病：肝傷害の免疫学的特徴及びウィルスの持続性（Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ： ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｅ．）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．３０：５９５〜６０１；Ｃｏｏｐｅｒ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃ型肝炎ウィルスに対して好結果の免疫反応の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ．）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：４３９〜４９；Ｌｅｃｈｎｅｒ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）細胞障害性Ｔリンパ球は何故Ｃ型肝炎ウィルスの除去に失敗するのか？ 主要組織適合性複合体クラスＩペプチド四量体を用いた研究からの教訓（Ｗｈｙ ｄｏ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆａｉｌ ｔｏ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ？ Ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｓｔｕｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ．）Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３５５：１０８５〜９２；Ｔａｋａｋｉ Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｃ型肝炎の単一源発生からの回復から２０年後に細胞性免疫反応は存続し、液性免疫反応は低減する（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｐｅｒｓｉｓｔ ａｎｄ ｈｕｍｏｒａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｗｏ ｄｅｃａｄｅｓ ａｆｔｅｒ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｏｕｒｃｅ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：５７８〜８２）。
【０００５】
組換え生ベクターは、ＨＣＶに対する細胞性免疫反応を生じるのに魅力的な候補である。ＨＣＶコア及びＥ１を組換えたアデノウィルスによるマウス中での免疫は、これらの抗原に対して特異的細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発した（Ｂｒｕｎａ−Ｒｏｍｅｒｏ Ｏ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）欠陥組換えアデノウィルスを用いたＣ型肝炎ウィルス構造抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応答の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｔｉｘｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２５：４７０〜７）。これらの結果には期待が持たれているが、遺伝子療法のための組換えアデノウィルスの使用に関連する最近の問題により、それらのヒトでの使用に関して疑いが生じている。ＤＮＡ構築体に基づくワクチン候補と併用した場合、異なるＨＣＶ遺伝子を含有する組換えワクシニア及びカナリア痘ウィルスを使用すると、評価した抗原に従ってマウス中の細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導した（Ｐａｎｃｈｏｌｉ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）多シストロン性Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）遺伝子によるＤＮＡプライム−カナリア痘ブーストはＨＣＶ構造及び非構造タンパク質に対する強力な免疫反応を生じる（ＤＮＡ ｐｒｉｍｅ−ｃａｎａｒｙｐｏｘ ｂｏｏｓｔ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ （ＨＣＶ）ｇｅｎｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＨＣＶ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８２：１８〜２７；Ｐａｎｃｈｏｌｉ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）多シストロン性遺伝子によるＤＮＡ免疫又はＨＣＶ ＤＮＡプライム−組換えカナリア痘ウィルスブーストによる免疫は、ＨＬＡ−Ａ２．１−トランスジェニックマウスにおいて、免疫反応及び組換えＨＣＶ−ワクシニアウィルス感染からの予防を誘導する（ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ （ＨＣＶ）ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｇｅｎｅｓ ｏｒ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ＨＣＶ ＤＮＡ ｐｒｉｍｉｎｇ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃａｎａｒｙｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｂｏｏｓｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＣＶ−ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ＨＬＡ−Ａ２．１−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：３８２〜９０）。実際には、ＨＣＶ構造抗原のカナリア痘ウィルス組換え体の個々の投与後における細胞性免疫であって、例えば、組換えワクシニアウィルスによる抗原投与モデル中で効果を示し得る該免疫のｉｎ ｖｉｖｏでの誘導に関しては、証拠がない。この群のウィルスには、ＨＣＶ抗原に対する免疫反応の誘導に関してこれまで使用されていない鶏痘ウィルスも属する。鶏痘ウィルスは、哺乳動物細胞中では複製されないが、宿主細胞の細胞質中に感染し、そのゲノムがコードするタンパク質を効果的に発現することができる。これらの特徴により、ヒトでの組換え鶏痘の使用に付随する規制的リスクは、他の生ウィルスベクターと比較して減少する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在では、入手可能なＨＣＶ感染に対するワクチンが市場にない。実際、ほとんどの研究は、まだ前臨床段階である。したがって、ＨＣＶ感染に対して有効な予防及び／又は治療薬の開発は、未解決の問題であり、且つ急務である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、制限及び技術水準を飛び越えて、鶏痘ゲノムの非必須領域に、ＨＣＶに対する特異的細胞性免疫反応を誘導可能で、鶏痘ウィルスによって発現されるＨＣＶ抗原に対応するａａ領域に従うＨＣＶ由来のＤＮＡ断片を含有する、組換え鶏痘ウィルスを提供することで上述の問題を解決する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明によれば、ウィルスＦＰＣｏＥ１は、コアタンパク質及びＥ１の一部分を含めたａａ ７９−３３８（配列番号１）を含むタンパク質を発現し、一方、ウィルスＦＰＢＳは、異なるＨＣＶ抗原に対応するＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔリンパ球に特異的なエピトープを含めたキメラタンパク質（配列番号２）を含む。これらのウィルスにおいて、ＨＣＶ抗原をコードする配列は、ＨＣＶキューバ分離株のｃＤＮＡ由来である（Ｍｏｒａｌｅｓ ＪらのＷＯ ９８／２５９６０）。
【０００９】
本発明の別の態様は、有効量の組換え鶏痘ウィルス及び薬剤として許容される賦形剤を含む、ＨＣＶに対する特異的細胞性免疫応答を誘導するための医薬組成物に関する。
【００１０】
本発明に含まれる組換え鶏痘ウィルスは、ヒト細胞に侵入し、細胞質中でＨＣＶ抗原を発現する能力がある。ヒト細胞中での発現は、鶏痘ウィルスの初期／後期合成プロモーターに基づく転写単位によって制御される。これらのウィルスは、ワクシニアウィルスに由来する７．５Ｋプロモーターの制御下にあるキサンチングアノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子も含有する。これらのウィルスは、ヒトの体内では複製することができない。
【００１１】
この組成物は、筋肉内、腹膜内又は皮下経路によって投与することができる。投与方法は、注射器、遺伝子銃、噴霧器又は他の免疫デバイスを用いることによって行うことができる。各個体は、所定容量で２．５×１０７〜１×１０８ＰＦＵ／用量の範囲で投与を受ける。本発明では、ＤＮＡ構築体を用いたプライム／ブースト戦略における組換え鶏痘ウィルスの投与手順も説明している。組換え鶏痘ウィルスは、プライム／ブースト戦略において、他のＨＣＶ抗原についてのタンパク質又は組換えたウィルスと一緒に、或いはサイトカイン及び他の免疫刺激分子と同時に投与することもできる。これらの組合せにより、新しいエピトープ特異性の発生又は特異的に派生した免疫反応の強化が可能になる。
【００１２】
ＨＣＶ抗原の組換え鶏痘ウィルスに基づく薬剤組成物は、以下の利点を有することができる：
−強力な特異的細胞性免疫を誘導することが可能である。
−低減された免疫回数によって所望の効果が得られる。
−混合ワクチンのコアとしてこれらの組成物の使用が可能である。
−アジュバントを必要としない。
−これらは抗ウィルス因子と併用することができる。
【００１３】
状況によって、薬剤組成物は、別の療法若しくはワクチンの前、同時又は後に、ＨＣＶに対する免疫を誘導するために投与することができる。これらの薬剤組成物は、ＨＣＶ感染に対する予防免疫を誘導するため、並びに慢性Ｃ型肝炎、硬変症及び肝臓癌の患者の免疫を誘導するためにも投与することができる。
【実施例】
【００１４】
実現例
本発明で理解されているように、Ｃ型肝炎ウィルス又はＨＣＶという用語は、一般的な状態におけるウィルスを表しており、したがってこの用語は、特定のウィルス配列又はＨＣＶ分離株に限定するものではない。
【００１５】
同様に、コード配列は、正しい調節配列の制御下に置かれたとき、通常ｍＲＮＡを介して、ポリペプチドに翻訳される核酸分子として理解される。この場合、コード配列には、ｃＤＮＡ及び組換えヌクレオチド配列を含むことができるが、それだけには限定されない。
【００１６】
本発明は、例示するものであって本発明の目的を限定するものではない、以下の実施例によってより詳細に説明する。
【００１７】
（実施例１：ＦＰＣｏＥ１ｃ、ＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳの評価）
ＨＣＶ抗原の組換え鶏痘ウィルスにおける特異的細胞性免疫反応を誘導する能力を評価するために、ウィルスＦＰＣｏＥ１ｃ、ＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳを作成した。図１は、ＨＣＶ抗原に対応する配列の概略図を示す。ウィルスは、以下のように得た：ニワトリ胚線維芽細胞を鶏痘に感染させ、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いてプラスミドｐＦＰＣｏＥ１ｃ、ｐＦＰＣｏＥ１又はｐＦＰＢＳでトランスフェクトさせた。これらのプラスミドは、プラスミドｐＦＰ６７ｘｇｐｔ（Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔ Ｄ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｓ．，Ｄｕａｒｔｅ Ｃ．Ａ．（２００２）ＨＩＶ−１由来のマルチエピトープポリペプチドを発現している組換え鶏痘ウィルスによって誘導された細胞性免疫反応に対するプロモーターの効果（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｏｗｌｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉ−ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ＨＩＶ−１．）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：１７１〜９）由来であり、ａａ １−３３８、ａａ ７９−３３８を含む領域をコードする配列（配列番号１）、又はＴリンパ球に特異的なエピトープに基づくキメラタンパク質をコードする配列（配列番号２）（それぞれプラスミドｐＦＰＣｏＥ１ｃ、ｐＦＰＣｏＥ１及びｐＦＰＢＳ）を含んでいた。キサンチン、ヒポキサンチン及びミコフェノール酸を含有する選択培地中でウィルス精製を数サイクル行った後、感染プレートからのウィルス産物を増幅し、ＨＣＶ配列に対応する挿入の存在をポリメラーゼ連鎖反応法によって確認した。
【００１８】
ウィルスＦＰＣｏＥ１ｃ、ＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳの免疫原性を、８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスで２．５×１０７ＰＦＵで２回腹膜内投与後（３週間空けて）調べた。各免疫群には、動物１０匹が含まれていた。図２Ａは、ＦＰＣｏＥ１による免疫だけがコア及びＥ１に対して検出可能なレベルの抗体を誘導できたことを示す。しかし、図２Ｂは、陰性ウィルス、ＦＰ９で免疫した動物で検出された反応に対して統計的に有意である（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）、ＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳで免疫した動物に対応するリンパ球からのＩＦＮ−γ分泌陽性反応を示す。ＦＰＣｏＥ１ｃによる免疫では、ＩＦＮ−γ分泌リンパ球の陽性反応が誘導されなかった。さらに、図２Ｃで示すように、ウィルスＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳで免疫した群からの動物は、ＨＣＶ抗原について組換えていないワクシニアウィルス対照（ＷＲ）を抗原投与した後に観察されたものに比較して、ＨＣＶ構造抗原（ＨＣＶポリタンパク質のａａ １−６５０）の組換えワクシニアウィルス（ｖｖＲＥ）を１０６ＰＦＵで抗原投与した後の卵巣へのウィルス負荷量（ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ）を有意に低減させることが可能であった（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）。さらに、ＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳで免疫した動物のｖｖＲＥウィルス負荷量は、陰性鶏痘ウィルスＦＰ９で免疫した動物で検出されたものに関して統計的により低かった（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）。ＦＰＣｏＥ１ｃによる免疫は、卵巣へのウィルス負荷量を有意に低減させなかった。ワクシニアウィルスによる抗原投与は、鶏痘ウィルスによる最後の免疫から２週間後に腹膜内接種によって実施した。卵巣の抽出は、ワクシニアウィルスの接種から５日後に行った。組換えワクシニアウィルスによる抗原投与は、ワクチン候補のｉｎ ｖｉｖｏにおける強力な細胞性免疫反応を誘発する能力を実証するのに広く使用されてきた。特に、卵巣中のウィルス力価の低減は、強力なＣＤ８＋ Ｔリンパ球応答の誘導に主に関連している。
【００１９】
（実施例２：鶏痘ウィルスの投与経路（腹膜内、皮下及び筋肉内））
組換え鶏痘ウィルスによって生じる免疫反応に対する接種経路の影響を評価するために、８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。各免疫群には、動物１０匹が含まれていた。ウィルス（２．５×１０７ＰＦＵ）を、２回免疫で３週間空けて腹膜内、筋肉内又は皮下経路によって投与した。図３は、ワクシニアウィルスｖｖＲＥによる抗原投与後の卵巣でのウィルス負荷量を低減させる組換え鶏痘ウィルスＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳの能力に関し免疫経路間で有意な差がないことを示す。これら２種類の組換えウィルスは、鶏痘陰性対照ＦＰ９に比較して、ウィルス負荷量の低減に基づいて陽性反応を誘導した（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）。ワクシニアウィルスによる抗原投与は、鶏痘ウィルスによる最後の免疫から２週間後に１０６ＰＦＵのワクシニアウィルスｖｖＲＥの腹膜内接種によって実施した。卵巣の抽出は、ワクシニアウィルスの接種から５日後に行った。
【００２０】
（実施例３：用量比較（０．９×１０７、２．５×１０７、５×１０７及び１×１０８ＰＦＵ）
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを０及び３週目に筋肉内経路によって異なる量の組換え鶏痘ウィルスで免疫した。各免疫群には、動物１０匹が含まれていた。図４は、０．９×１０７ＰＦＵで免疫したマウスでは、鶏痘ウィルスによる最後の免疫から２週間後に１０６ＰＦＵのｖｖＲＥによって抗原投与した後の卵巣で検出されたウィルス負荷量に関して有意な差がなかったことを示す。対照的に、２．５×１０７、５×１０７及び１×１０８ＰＦＵのＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳの投与は、同様の量の鶏痘陰性対照ＦＰ９を接種した動物で検出されたものに対して、卵巣へのｖｖＲＥウィルス負荷量を著しく低減させた（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）。すべての場合において、卵巣の抽出は、ｖｖＲＥの接種から５日後に行った。
【００２１】
（実施例４：ＤＮＡ及び鶏痘ウィルスによるプライム／ブースト免疫）
ＤＮＡワクチン候補とＨＣＶ抗原の組換え鶏痘ウィルスを組み合わせたプライム／ブースト免疫で誘導された免疫反応を評価することを目的として、８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。各免疫群には、動物１０匹が含まれていた。１群（Ｃｏ−ｐＩＤＫＥ２）を、０、３、７及び１２週目に筋肉内経路によって、ＨＣＶポリタンパク質の最初の６５０ ａａを発現しているプラスミド、ｐＩＤＫＥ２（Ｄｕｅｎａｓ−Ｃａｒｒｅｒａ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｃ型肝炎ウィルス構造抗原をコードしているＤＮＡワクチンによる免疫はウサギ及びＭａｃａｃａ ｉｒｕｓ（カニクイマカクザル）中のカプシド及び外被タンパク質に対して特異的な免疫反応を誘発する（Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ−Ｃ−ｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｅｌｉｃｉｔｓ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｃａｐｓｉｄ ａｎｄ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ ａｎｄ Ｍａｃａｃａ ｉｒｕｓ （ｃｒａｂ−ｅａｔｉｎｇ ｍａｃａｑｕｅ ｍｏｎｋｅｙｓ）．）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：２４９〜５５）１００μｇと組換えＨＣＶコアタンパク質、Ｃｏ．１２０（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｏｂｒｅｇｏｎ Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）．切断されたＨＣＶコアタンパク質はマウス中で細胞性免疫成分の強い関与による強力な免疫反応を誘発する（Ａ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ＨＣＶ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｌｉｃｉｔｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｗｉｔｈ ａ ｓｔｒｏｎｇ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：３９４０〜４６）１０μｇの混合物で免疫した。動物の１群（ｐＡＥＣ−Ｋ６）を、陰性対照プラスミドｐＡＥＣ−Ｋ６（Ｈｅｒｒｅｒａ Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）．ヒトにおけるＤＮＡ免疫のための小型プラスミドベクターのファミリー（Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｃｏｍｐａｃｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７９：５４８〜５１）で同様の条件で免疫した。別の群を、０及び３週目に筋肉内経路によって２．５×１０７ＰＦＵのＦＰＣｏＥ１で免疫した。さらに、動物のある群を同じ条件で、陰性鶏痘ウィルス、ＦＰ９で免疫した。さらに、１群（Ｃｏ−ｐＩＤＫＥ２／ＦＰＣｏＥ１）を、０及び３週目に混合物Ｃｏ−ｐＩＤＫＥ２で、９及び１２週目にＦＰＣｏＥ１で筋肉内経路によって免疫した。別の群（Ｃｏ−ｐＩＤＫＥ２／ＦＰ９）を同じ方法で免疫したが、６及び９週目の投与はＦＰ９で投与した。図５は、最も高レベルの抗体がＣｏ−ｐＩＤＫＥ２群で誘導されたことを示す（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）。さらに、Ｃｏ−ｐＩＤＫＥ２とＦＰＣｏＥ１を組み合わせたプライム／ブースト投与は、ＦＰＣｏＥ１単独で免疫した群で検出されたものに対してより高レベルの抗体を誘導した（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）。図５Ｂでは、ＦＰＣｏＥ１、又はＣｏ−ｐＩＤＫＥ２で免疫した両方の群、並びに最初の２投与をＣｏ−ｐＩＤＫＥ２及び他の２投与をＦＰＣｏＥ１で免疫した群が、陰性対照で免疫した動物に対して抗原投与後のｖｖＲＥウィルス負荷量を有意に低減させた（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）ことを観察することができる。最も少ないウィルス負荷量は、最初の２投与をＣｏ−ｐＩＤＫＥ２及び他の２投与をＦＰＣｏＥ１で免疫した動物で検出された。ワクシニアウィルスによる抗原投与は、最後の免疫から２週間後に１０６ＰＦＵのワクシニアウィルスｖｖＲＥの腹膜内接種によって実施した。卵巣の抽出は、ワクシニアウィルスｖｖＲＥの接種から５日後に行った。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】組換え鶏痘ウィルス中のＨＣＶ抗原に対応する領域の概略図である。
【図２】異なる組換え鶏痘ウィルスによる免疫スケジュールを示す図である。抗体反応（Ａ）。インターフェロンγ分泌反応（Ｂ）。ＨＣＶ構造抗原を組換えたワクシニアウィルスによる抗原投与に対する反応（Ｃ）。
【図３】異なる経路の接種によるＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳによる免疫スケジュールを示す図である。ＨＣＶ構造抗原を組換えたワクシニアウィルスによる抗原投与に対する反応。
【図４】異なる量のＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳによる免疫スケジュールを示す図である。ＨＣＶ構造抗原を組換えたワクシニアウィルスによる抗原投与に対する反応。
【図５】ＦＰＣｏＥ１とＤＮＡワクチンの製剤の併用に基づいた免疫スケジュールを示す図である。コア、Ｅ１及びＥ２に対する抗体反応（Ａ）。ＨＣＶ構造抗原を組換えたワクシニアウィルスによる抗原投与に対する反応（Ｂ）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特にＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）のタンパク質を発現する組換え鶏痘ウィルスを用いる免疫学及びウィルスワクチン、並びにＨＣＶに対して細胞性免疫反応を誘導できる薬剤組成物の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶは、１９８９年に初めて、分子生物学技術を用いて非Ａ非Ｂ型輸血後肝炎の主な病原と特定された（Ｃｈｏｏ Ｑ−Ｌ．，Ｋｕｏ Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９８９）血液由来非Ａ非Ｂ型ウィルス肝炎ゲノム由来のｃＤＮＡクローンの単離（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｂｌｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ ｎｏｎ Ａ，ｎｏｎ−Ｂ ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｇｅｎｏｍｅ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２４４：３５９〜６２；ＥＰ ０３１８２１６ Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐ）。現在では、世界中で１億７千万を超える人々がこのウィルス因子に感染している。ＨＣＶ感染は、症例の８５％で持続性であり、しばしば硬変症及び肝細胞癌を引き起こす（Ｃａｓｅｌｍａｎｎ Ｗ．Ｈ．，Ａｌｔ Ｍ．（１９９６）肝細胞癌に関する主な危険因子としてのＣ型肝炎ウィルス感染（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｍａｊｏｒ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．）Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２４：６１〜６６）。実際に、感染から２５年後、ＨＣＶ慢性保菌者の２５％が硬変症を発症し、その１〜４％が毎年肝細胞癌を発症する（Ｐｒｉｎｃｅ Ａ．Ｍ．，Ｓｈａｔａ Ｍ．Ｔ．（２００１）Ｃ型肝炎ウィルス感染の免疫学的予防（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．）Ｃｌｉｎ．Ｌｉｖｅｒ．Ｄｉｓ．５：１０９１〜１０３）。
【０００３】
ＨＣＶ感染に特に好ましい治療は、集中療法で投与されるペグ化インターフェロンの併用に基づいている。しかし、この治療は攻撃的（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）で、高価であり、且つ症例の５０％未満に有効である。（Ｐｒｉｎｃｅ Ａ．Ｍ．，Ｓｈａｔａ Ｍ．Ｔ．（２００１）Ｃ型肝炎ウィルス感染の免疫学的予防（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．）Ｃｌｉｎ．Ｌｉｖｅｒ．Ｄｉｓ．５：１０９１〜１０３）。
【０００４】
ＨＣＶ抗原に基づく、タンパク質サブユニット、ウィルス様粒子、合成ペプチド、組換え生ベクター及びＤＮＡ免疫用ＤＮＡ構築体といった様々な変異体は、ワクチン接種手法として評価されてきた（ＵＳ６６３５２５７、ＵＳ６３８７６６２、ＵＳ６２３５８８８、ＵＳ６６８５９４４、ＵＳ２００３０２１８０５、Ｌｅｃｈｍａｎｎ Ｍ．，Ｌｉａｎｇ Ｔ．Ｊ．（２０００）Ｃ型肝炎のワクチン開発（Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．）Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ．Ｄｉｓ．２０：２１１〜２６）。これらの変異体の一部は、それらのＨＣＶエピトープに対する特異的な免疫反応を誘発する能力を実証しているが、この反応はまだ不十分のようである。現在、ＨＣＶ感染に対する予防と相関のある免疫パラメーターは、完全に定められていない。それにもかかわらず、いくつかの研究は、初期の、強い及び多重特異な細胞障害性Ｔ細胞応答が、ＣＤ４＋Ｔｈ１細胞と共に、ウィルスに対する免疫及び疾患の解消に有利であることを示唆する。反対に、後期のＴ細胞応答は、慢性肝臓免疫病の確立に関連している（Ｃｅｒｎｙ Ａ．，Ｃｈｉｓａｒｉ Ｆ．Ｖ．（１９９９）慢性Ｃ型肝炎の発病：肝傷害の免疫学的特徴及びウィルスの持続性（Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ： ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ｉｎｊｕｒｙ ａｎｄ ｖｉｒａｌ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｅ．）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．３０：５９５〜６０１；Ｃｏｏｐｅｒ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃ型肝炎ウィルスに対して好結果の免疫反応の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ．）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：４３９〜４９；Ｌｅｃｈｎｅｒ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）細胞障害性Ｔリンパ球は何故Ｃ型肝炎ウィルスの除去に失敗するのか？ 主要組織適合性複合体クラスＩペプチド四量体を用いた研究からの教訓（Ｗｈｙ ｄｏ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆａｉｌ ｔｏ ｅｌｉｍｉｎａｔｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ？ Ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｒｏｍ ｓｔｕｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｅｔｒａｍｅｒｓ．）Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．３５５：１０８５〜９２；Ｔａｋａｋｉ Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｃ型肝炎の単一源発生からの回復から２０年後に細胞性免疫反応は存続し、液性免疫反応は低減する（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｐｅｒｓｉｓｔ ａｎｄ ｈｕｍｏｒａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｔｗｏ ｄｅｃａｄｅｓ ａｆｔｅｒ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｏｕｒｃｅ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ．）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６：５７８〜８２）。
【０００５】
組換え生ベクターは、ＨＣＶに対する細胞性免疫反応を生じるのに魅力的な候補である。ＨＣＶコア及びＥ１を組換えたアデノウィルスによるマウス中での免疫は、これらの抗原に対して特異的細胞障害性Ｔ細胞応答を誘発した（Ｂｒｕｎａ−Ｒｏｍｅｒｏ Ｏ．，ｅｔ ａｌ．（１９９７）欠陥組換えアデノウィルスを用いたＣ型肝炎ウィルス構造抗原に対する細胞障害性Ｔ細胞応答の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｔｉｘｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ．）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２５：４７０〜７）。これらの結果には期待が持たれているが、遺伝子療法のための組換えアデノウィルスの使用に関連する最近の問題により、それらのヒトでの使用に関して疑いが生じている。ＤＮＡ構築体に基づくワクチン候補と併用した場合、異なるＨＣＶ遺伝子を含有する組換えワクシニア及びカナリア痘ウィルスを使用すると、評価した抗原に従ってマウス中の細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導した（Ｐａｎｃｈｏｌｉ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）多シストロン性Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）遺伝子によるＤＮＡプライム−カナリア痘ブーストはＨＣＶ構造及び非構造タンパク質に対する強力な免疫反応を生じる（ＤＮＡ ｐｒｉｍｅ−ｃａｎａｒｙｐｏｘ ｂｏｏｓｔ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ （ＨＣＶ）ｇｅｎｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＨＣＶ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８２：１８〜２７；Ｐａｎｃｈｏｌｉ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）多シストロン性遺伝子によるＤＮＡ免疫又はＨＣＶ ＤＮＡプライム−組換えカナリア痘ウィルスブーストによる免疫は、ＨＬＡ−Ａ２．１−トランスジェニックマウスにおいて、免疫反応及び組換えＨＣＶ−ワクシニアウィルス感染からの予防を誘導する（ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ （ＨＣＶ）ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｇｅｎｅｓ ｏｒ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ＨＣＶ ＤＮＡ ｐｒｉｍｉｎｇ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｃａｎａｒｙｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｂｏｏｓｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＣＶ−ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ＨＬＡ−Ａ２．１−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ．）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：３８２〜９０）。実際には、ＨＣＶ構造抗原のカナリア痘ウィルス組換え体の個々の投与後における細胞性免疫であって、例えば、組換えワクシニアウィルスによる抗原投与モデル中で効果を示し得る該免疫のｉｎ ｖｉｖｏでの誘導に関しては、証拠がない。この群のウィルスには、ＨＣＶ抗原に対する免疫反応の誘導に関してこれまで使用されていない鶏痘ウィルスも属する。鶏痘ウィルスは、哺乳動物細胞中では複製されないが、宿主細胞の細胞質中に感染し、そのゲノムがコードするタンパク質を効果的に発現することができる。これらの特徴により、ヒトでの組換え鶏痘の使用に付随する規制的リスクは、他の生ウィルスベクターと比較して減少する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在では、入手可能なＨＣＶ感染に対するワクチンが市場にない。実際、ほとんどの研究は、まだ前臨床段階である。したがって、ＨＣＶ感染に対して有効な予防及び／又は治療薬の開発は、未解決の問題であり、且つ急務である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、制限及び技術水準を飛び越えて、鶏痘ゲノムの非必須領域に、ＨＣＶに対する特異的細胞性免疫反応を誘導可能で、鶏痘ウィルスによって発現されるＨＣＶ抗原に対応するａａ領域に従うＨＣＶ由来のＤＮＡ断片を含有する、組換え鶏痘ウィルスを提供することで上述の問題を解決する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明によれば、ウィルスＦＰＣｏＥ１は、コアタンパク質及びＥ１の一部分を含めたａａ ７９−３３８（配列番号１）を含むタンパク質を発現し、一方、ウィルスＦＰＢＳは、異なるＨＣＶ抗原に対応するＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔリンパ球に特異的なエピトープを含めたキメラタンパク質（配列番号２）を含む。これらのウィルスにおいて、ＨＣＶ抗原をコードする配列は、ＨＣＶキューバ分離株のｃＤＮＡ由来である（Ｍｏｒａｌｅｓ ＪらのＷＯ ９８／２５９６０）。
【０００９】
本発明の別の態様は、有効量の組換え鶏痘ウィルス及び薬剤として許容される賦形剤を含む、ＨＣＶに対する特異的細胞性免疫応答を誘導するための医薬組成物に関する。
【００１０】
本発明に含まれる組換え鶏痘ウィルスは、ヒト細胞に侵入し、細胞質中でＨＣＶ抗原を発現する能力がある。ヒト細胞中での発現は、鶏痘ウィルスの初期／後期合成プロモーターに基づく転写単位によって制御される。これらのウィルスは、ワクシニアウィルスに由来する７．５Ｋプロモーターの制御下にあるキサンチングアノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子も含有する。これらのウィルスは、ヒトの体内では複製することができない。
【００１１】
この組成物は、筋肉内、腹膜内又は皮下経路によって投与することができる。投与方法は、注射器、遺伝子銃、噴霧器又は他の免疫デバイスを用いることによって行うことができる。各個体は、所定容量で２．５×１０７〜１×１０８ＰＦＵ／用量の範囲で投与を受ける。本発明では、ＤＮＡ構築体を用いたプライム／ブースト戦略における組換え鶏痘ウィルスの投与手順も説明している。組換え鶏痘ウィルスは、プライム／ブースト戦略において、他のＨＣＶ抗原についてのタンパク質又は組換えたウィルスと一緒に、或いはサイトカイン及び他の免疫刺激分子と同時に投与することもできる。これらの組合せにより、新しいエピトープ特異性の発生又は特異的に派生した免疫反応の強化が可能になる。
【００１２】
ＨＣＶ抗原の組換え鶏痘ウィルスに基づく薬剤組成物は、以下の利点を有することができる：
−強力な特異的細胞性免疫を誘導することが可能である。
−低減された免疫回数によって所望の効果が得られる。
−混合ワクチンのコアとしてこれらの組成物の使用が可能である。
−アジュバントを必要としない。
−これらは抗ウィルス因子と併用することができる。
【００１３】
状況によって、薬剤組成物は、別の療法若しくはワクチンの前、同時又は後に、ＨＣＶに対する免疫を誘導するために投与することができる。これらの薬剤組成物は、ＨＣＶ感染に対する予防免疫を誘導するため、並びに慢性Ｃ型肝炎、硬変症及び肝臓癌の患者の免疫を誘導するためにも投与することができる。
【実施例】
【００１４】
実現例
本発明で理解されているように、Ｃ型肝炎ウィルス又はＨＣＶという用語は、一般的な状態におけるウィルスを表しており、したがってこの用語は、特定のウィルス配列又はＨＣＶ分離株に限定するものではない。
【００１５】
同様に、コード配列は、正しい調節配列の制御下に置かれたとき、通常ｍＲＮＡを介して、ポリペプチドに翻訳される核酸分子として理解される。この場合、コード配列には、ｃＤＮＡ及び組換えヌクレオチド配列を含むことができるが、それだけには限定されない。
【００１６】
本発明は、例示するものであって本発明の目的を限定するものではない、以下の実施例によってより詳細に説明する。
【００１７】
（実施例１：ＦＰＣｏＥ１ｃ、ＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳの評価）
ＨＣＶ抗原の組換え鶏痘ウィルスにおける特異的細胞性免疫反応を誘導する能力を評価するために、ウィルスＦＰＣｏＥ１ｃ、ＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳを作成した。図１は、ＨＣＶ抗原に対応する配列の概略図を示す。ウィルスは、以下のように得た：ニワトリ胚線維芽細胞を鶏痘に感染させ、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いてプラスミドｐＦＰＣｏＥ１ｃ、ｐＦＰＣｏＥ１又はｐＦＰＢＳでトランスフェクトさせた。これらのプラスミドは、プラスミドｐＦＰ６７ｘｇｐｔ（Ｖａｚｑｕｅｚ−Ｂｌｏｍｑｕｉｓｔ Ｄ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ Ｓ．，Ｄｕａｒｔｅ Ｃ．Ａ．（２００２）ＨＩＶ−１由来のマルチエピトープポリペプチドを発現している組換え鶏痘ウィルスによって誘導された細胞性免疫反応に対するプロモーターの効果（Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｏｗｌｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉ−ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ＨＩＶ−１．）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：１７１〜９）由来であり、ａａ １−３３８、ａａ ７９−３３８を含む領域をコードする配列（配列番号１）、又はＴリンパ球に特異的なエピトープに基づくキメラタンパク質をコードする配列（配列番号２）（それぞれプラスミドｐＦＰＣｏＥ１ｃ、ｐＦＰＣｏＥ１及びｐＦＰＢＳ）を含んでいた。キサンチン、ヒポキサンチン及びミコフェノール酸を含有する選択培地中でウィルス精製を数サイクル行った後、感染プレートからのウィルス産物を増幅し、ＨＣＶ配列に対応する挿入の存在をポリメラーゼ連鎖反応法によって確認した。
【００１８】
ウィルスＦＰＣｏＥ１ｃ、ＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳの免疫原性を、８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスで２．５×１０７ＰＦＵで２回腹膜内投与後（３週間空けて）調べた。各免疫群には、動物１０匹が含まれていた。図２Ａは、ＦＰＣｏＥ１による免疫だけがコア及びＥ１に対して検出可能なレベルの抗体を誘導できたことを示す。しかし、図２Ｂは、陰性ウィルス、ＦＰ９で免疫した動物で検出された反応に対して統計的に有意である（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）、ＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳで免疫した動物に対応するリンパ球からのＩＦＮ−γ分泌陽性反応を示す。ＦＰＣｏＥ１ｃによる免疫では、ＩＦＮ−γ分泌リンパ球の陽性反応が誘導されなかった。さらに、図２Ｃで示すように、ウィルスＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳで免疫した群からの動物は、ＨＣＶ抗原について組換えていないワクシニアウィルス対照（ＷＲ）を抗原投与した後に観察されたものに比較して、ＨＣＶ構造抗原（ＨＣＶポリタンパク質のａａ １−６５０）の組換えワクシニアウィルス（ｖｖＲＥ）を１０６ＰＦＵで抗原投与した後の卵巣へのウィルス負荷量（ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｌｏａｄ）を有意に低減させることが可能であった（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）。さらに、ＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳで免疫した動物のｖｖＲＥウィルス負荷量は、陰性鶏痘ウィルスＦＰ９で免疫した動物で検出されたものに関して統計的により低かった（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）。ＦＰＣｏＥ１ｃによる免疫は、卵巣へのウィルス負荷量を有意に低減させなかった。ワクシニアウィルスによる抗原投与は、鶏痘ウィルスによる最後の免疫から２週間後に腹膜内接種によって実施した。卵巣の抽出は、ワクシニアウィルスの接種から５日後に行った。組換えワクシニアウィルスによる抗原投与は、ワクチン候補のｉｎ ｖｉｖｏにおける強力な細胞性免疫反応を誘発する能力を実証するのに広く使用されてきた。特に、卵巣中のウィルス力価の低減は、強力なＣＤ８＋ Ｔリンパ球応答の誘導に主に関連している。
【００１９】
（実施例２：鶏痘ウィルスの投与経路（腹膜内、皮下及び筋肉内））
組換え鶏痘ウィルスによって生じる免疫反応に対する接種経路の影響を評価するために、８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。各免疫群には、動物１０匹が含まれていた。ウィルス（２．５×１０７ＰＦＵ）を、２回免疫で３週間空けて腹膜内、筋肉内又は皮下経路によって投与した。図３は、ワクシニアウィルスｖｖＲＥによる抗原投与後の卵巣でのウィルス負荷量を低減させる組換え鶏痘ウィルスＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳの能力に関し免疫経路間で有意な差がないことを示す。これら２種類の組換えウィルスは、鶏痘陰性対照ＦＰ９に比較して、ウィルス負荷量の低減に基づいて陽性反応を誘導した（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）。ワクシニアウィルスによる抗原投与は、鶏痘ウィルスによる最後の免疫から２週間後に１０６ＰＦＵのワクシニアウィルスｖｖＲＥの腹膜内接種によって実施した。卵巣の抽出は、ワクシニアウィルスの接種から５日後に行った。
【００２０】
（実施例３：用量比較（０．９×１０７、２．５×１０７、５×１０７及び１×１０８ＰＦＵ）
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを０及び３週目に筋肉内経路によって異なる量の組換え鶏痘ウィルスで免疫した。各免疫群には、動物１０匹が含まれていた。図４は、０．９×１０７ＰＦＵで免疫したマウスでは、鶏痘ウィルスによる最後の免疫から２週間後に１０６ＰＦＵのｖｖＲＥによって抗原投与した後の卵巣で検出されたウィルス負荷量に関して有意な差がなかったことを示す。対照的に、２．５×１０７、５×１０７及び１×１０８ＰＦＵのＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳの投与は、同様の量の鶏痘陰性対照ＦＰ９を接種した動物で検出されたものに対して、卵巣へのｖｖＲＥウィルス負荷量を著しく低減させた（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）。すべての場合において、卵巣の抽出は、ｖｖＲＥの接種から５日後に行った。
【００２１】
（実施例４：ＤＮＡ及び鶏痘ウィルスによるプライム／ブースト免疫）
ＤＮＡワクチン候補とＨＣＶ抗原の組換え鶏痘ウィルスを組み合わせたプライム／ブースト免疫で誘導された免疫反応を評価することを目的として、８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。各免疫群には、動物１０匹が含まれていた。１群（Ｃｏ−ｐＩＤＫＥ２）を、０、３、７及び１２週目に筋肉内経路によって、ＨＣＶポリタンパク質の最初の６５０ ａａを発現しているプラスミド、ｐＩＤＫＥ２（Ｄｕｅｎａｓ−Ｃａｒｒｅｒａ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｃ型肝炎ウィルス構造抗原をコードしているＤＮＡワクチンによる免疫はウサギ及びＭａｃａｃａ ｉｒｕｓ（カニクイマカクザル）中のカプシド及び外被タンパク質に対して特異的な免疫反応を誘発する（Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ−Ｃ−ｖｉｒｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｅｌｉｃｉｔｓ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｃａｐｓｉｄ ａｎｄ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ ａｎｄ Ｍａｃａｃａ ｉｒｕｓ （ｃｒａｂ−ｅａｔｉｎｇ ｍａｃａｑｕｅ ｍｏｎｋｅｙｓ）．）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：２４９〜５５）１００μｇと組換えＨＣＶコアタンパク質、Ｃｏ．１２０（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｏｂｒｅｇｏｎ Ｊ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）．切断されたＨＣＶコアタンパク質はマウス中で細胞性免疫成分の強い関与による強力な免疫反応を誘発する（Ａ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ＨＣＶ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｌｉｃｉｔｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｗｉｔｈ ａ ｓｔｒｏｎｇ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．）Ｖａｃｃｉｎｅ １９：３９４０〜４６）１０μｇの混合物で免疫した。動物の１群（ｐＡＥＣ−Ｋ６）を、陰性対照プラスミドｐＡＥＣ−Ｋ６（Ｈｅｒｒｅｒａ Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）．ヒトにおけるＤＮＡ免疫のための小型プラスミドベクターのファミリー（Ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｃｏｍｐａｃｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ．）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７９：５４８〜５１）で同様の条件で免疫した。別の群を、０及び３週目に筋肉内経路によって２．５×１０７ＰＦＵのＦＰＣｏＥ１で免疫した。さらに、動物のある群を同じ条件で、陰性鶏痘ウィルス、ＦＰ９で免疫した。さらに、１群（Ｃｏ−ｐＩＤＫＥ２／ＦＰＣｏＥ１）を、０及び３週目に混合物Ｃｏ−ｐＩＤＫＥ２で、９及び１２週目にＦＰＣｏＥ１で筋肉内経路によって免疫した。別の群（Ｃｏ−ｐＩＤＫＥ２／ＦＰ９）を同じ方法で免疫したが、６及び９週目の投与はＦＰ９で投与した。図５は、最も高レベルの抗体がＣｏ−ｐＩＤＫＥ２群で誘導されたことを示す（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）。さらに、Ｃｏ−ｐＩＤＫＥ２とＦＰＣｏＥ１を組み合わせたプライム／ブースト投与は、ＦＰＣｏＥ１単独で免疫した群で検出されたものに対してより高レベルの抗体を誘導した（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）。図５Ｂでは、ＦＰＣｏＥ１、又はＣｏ−ｐＩＤＫＥ２で免疫した両方の群、並びに最初の２投与をＣｏ−ｐＩＤＫＥ２及び他の２投与をＦＰＣｏＥ１で免疫した群が、陰性対照で免疫した動物に対して抗原投与後のｖｖＲＥウィルス負荷量を有意に低減させた（スチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５）ことを観察することができる。最も少ないウィルス負荷量は、最初の２投与をＣｏ−ｐＩＤＫＥ２及び他の２投与をＦＰＣｏＥ１で免疫した動物で検出された。ワクシニアウィルスによる抗原投与は、最後の免疫から２週間後に１０６ＰＦＵのワクシニアウィルスｖｖＲＥの腹膜内接種によって実施した。卵巣の抽出は、ワクシニアウィルスｖｖＲＥの接種から５日後に行った。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】組換え鶏痘ウィルス中のＨＣＶ抗原に対応する領域の概略図である。
【図２】異なる組換え鶏痘ウィルスによる免疫スケジュールを示す図である。抗体反応（Ａ）。インターフェロンγ分泌反応（Ｂ）。ＨＣＶ構造抗原を組換えたワクシニアウィルスによる抗原投与に対する反応（Ｃ）。
【図３】異なる経路の接種によるＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳによる免疫スケジュールを示す図である。ＨＣＶ構造抗原を組換えたワクシニアウィルスによる抗原投与に対する反応。
【図４】異なる量のＦＰＣｏＥ１及びＦＰＢＳによる免疫スケジュールを示す図である。ＨＣＶ構造抗原を組換えたワクシニアウィルスによる抗原投与に対する反応。
【図５】ＦＰＣｏＥ１とＤＮＡワクチンの製剤の併用に基づいた免疫スケジュールを示す図である。コア、Ｅ１及びＥ２に対する抗体反応（Ａ）。ＨＣＶ構造抗原を組換えたワクシニアウィルスによる抗原投与に対する反応（Ｂ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鶏痘ウィルスゲノムの非必須領域に、ＨＣＶに由来し、ＨＣＶ抗原に対して特異的細胞性免疫反応を誘導できるＤＮＡ断片を含有する、組換え鶏痘ウィルス。
【請求項２】
前記ＨＣＶ由来のＤＮＡ断片が、ａａ ７９−３３８を含むポリタンパク質コア−Ｅ１をコードする配列（配列番号１）である、請求項１に記載の鶏痘ウィルス。
【請求項３】
前記ＨＣＶ由来のＤＮＡ断片が、Ｔリンパ球に特異的なエピトープに基づくキメラタンパク質をコードする配列（配列番号２）である、請求項１に記載の鶏痘ウィルス。
【請求項４】
ＦＰＣｏＥ１である、請求項１及び２に記載の鶏痘ウィルス。
【請求項５】
ＦＰＢＳである、請求項１及び３に記載の鶏痘ウィルス。
【請求項６】
有効免疫量の請求項１から５までに記載の組換え鶏痘ウィルスと、薬剤として許容される賦形剤とを含む、ＨＣＶに対して特異的細胞性免疫を誘導するための医薬組成物。
【請求項７】
前記有効免疫量が、２．５×１０７〜１×１０８ＰＦＵ／用量の範囲である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＨＣＶ感染に対して予防免疫を誘導するための請求項６及び７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
慢性Ｃ型肝炎、硬変症及び肝臓癌の患者において、ＨＣＶに対する免疫を誘導するための請求項６及び７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
他の療法若しくはワクチンの前、同時又は後に、ＨＣＶに対する免疫を誘導するための請求項６及び７に記載の医薬組成物。
【請求項１】
鶏痘ウィルスゲノムの非必須領域に、ＨＣＶに由来し、ＨＣＶ抗原に対して特異的細胞性免疫反応を誘導できるＤＮＡ断片を含有する、組換え鶏痘ウィルス。
【請求項２】
前記ＨＣＶ由来のＤＮＡ断片が、ａａ ７９−３３８を含むポリタンパク質コア−Ｅ１をコードする配列（配列番号１）である、請求項１に記載の鶏痘ウィルス。
【請求項３】
前記ＨＣＶ由来のＤＮＡ断片が、Ｔリンパ球に特異的なエピトープに基づくキメラタンパク質をコードする配列（配列番号２）である、請求項１に記載の鶏痘ウィルス。
【請求項４】
ＦＰＣｏＥ１である、請求項１及び２に記載の鶏痘ウィルス。
【請求項５】
ＦＰＢＳである、請求項１及び３に記載の鶏痘ウィルス。
【請求項６】
有効免疫量の請求項１から５までに記載の組換え鶏痘ウィルスと、薬剤として許容される賦形剤とを含む、ＨＣＶに対して特異的細胞性免疫を誘導するための医薬組成物。
【請求項７】
前記有効免疫量が、２．５×１０７〜１×１０８ＰＦＵ／用量の範囲である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＨＣＶ感染に対して予防免疫を誘導するための請求項６及び７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
慢性Ｃ型肝炎、硬変症及び肝臓癌の患者において、ＨＣＶに対する免疫を誘導するための請求項６及び７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
他の療法若しくはワクチンの前、同時又は後に、ＨＣＶに対する免疫を誘導するための請求項６及び７に記載の医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００８−５０８８９０（Ｐ２００８−５０８８９０Ａ）
【公表日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２５１５３（Ｐ２００７−５２５１５３）
【出願日】平成１７年８月１０日（２００５．８．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００５／０００００４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１５５５７
【国際公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月１０日（２００５．８．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００５／０００００４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１５５５７
【国際公開日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
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