組換えＭＶＡおよびその生産方法
本発明はＭＶＡ変異体に関し、これは組換えＭＶＡウィルスの生産に使用でき、同様に、これらの変異ＭＶＡウィルスで感染させた宿主細胞に関する。本発明は、さらにＤＮＡ−ベクター構築物、変異ＭＶＡウィルスおよびＤＮＡ-ベクター構築物の使用による組換えＭＶＡの生産方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＭＶＡウィルスの生産に使用できるＭＶＡ変異体に関し、同様に、これらの変異ＭＶＡウィルスで感染させた宿主細胞に関する。本発明は、さらに、ＤＮＡベクター構築物、前記変異ＭＶＡウィルスおよびＤＮＡ-ベクター構築物の使用によって組換えＭＶＡを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクシニアウィルス（ＶＶ）は、ポックスウィルスファミリーのオルソポックスウィルス属に属している。ワクチニアウィルスのある株は、長い間、天然痘に対する免疫のための生菌ワクチンとして使用されており、例えば、Lister Institute （英国）のElstree株があげられる。ワクチン接種に由来する合併症のため(Schar, Zeitschr. fur Praventivmedizin 18, 4144 [1973])、天然痘は根絶されたというＷＨＯによる１９８０年の宣言以来、今日ではハイリスクの人々にのみ天然痘に対する予防接種がなされている。
【０００３】
ワクシニアウィルスは、外来抗原の生産やデリバリーのためのベクターとして使用されている (Smith et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383407 [1984])。これは、ワクシニアウィルスのゲノムに、ＤＮＡ組換え技術によって導入された外来抗原をコードするＤＮＡ配列（遺伝子）を内含する。ウィルスのライフサイクルに必須ではないウィルスＤＮＡ内の部位で前記遺伝子が結合されている場合、新たに生産された組換えワクシニアウィルスは、感染、すなわち外来細胞に感染でき、このため結合したＤＮＡ配列を発現することも可能となる(EP Patent Applications No. 83,286 およびNo. 110,385)。このようにして調製された組換えワクシニアウィルスは、一方では感染予防のための生菌ワクチンとして使用でき、他方、真核細胞における異種タンパク質の調製のための生菌ワクチンとして使用できる。
【０００４】
ワクシニアウィルスは、中でも最も広範囲にわたって評価されている生菌ベクターであり、組換えワクチンとしての使用をサポートする特有の特徴を有している。すなわち、極めて安定、安価に製造でき、処理が容易であり、多数の外来ＤＮＡに適用できるという点である。また、抗体応答と細胞毒応答の両方を誘発するという利点を有し、より自然な方法において免疫システムへの抗原の提示を可能とし、また、広い様々な種類の動物モデルにおける感染疾患を防御するベクターワクチンとしての使用も成功している。加えて、ワクシニアベクターは、組換えタンパク質の構造−機能の相関性を分析し、体液性および細胞媒介免疫応答のターゲットを決定し、また、特定の疾患の防御に必要な免疫防御のタイプを調べるための、極めて価値のあるリサーチツールである。
【０００５】
しかしながら、ワクシニアウィルスは、ヒトへの感染性を示し、試験室において発現ベクターとして使用することは、安全性の問題や規制に影響する。さらに、例えば、ヒトに対する新規治療や予防への取組みのために、組換えタンパク質または組換えウィルス粒子を生産するというような、組換えワクシニアウィルスの将来的な適用可能性は、組換えワクシニアベクターの増殖複製により妨げられる。文献に記載された組換えワクシニアウィルスの多くは、ワクシニアウィルスの Western Reserve（ＷＲ）株に基づいている。他方、この株は、高神経毒性であり、ヒトや動物での使用にあまり適していないことが知られている (Morita et al., Vaccine 5, 6570 [1987])。
【０００６】
ＶＶ標準株の安全性の問題は、in vitroでの制限された複製能力やin vivoでの無毒性を特徴とする非常に弱毒化されたウィルス株からのワクシニアベクターの開発により対処されている。望ましくない副作用を避けるために特別に培養されたウィルス株が長年知られている。そして、トリ線維芽細胞におけるワクシニアウィルス（ＣＶＡ）Ａｎｋａｒａ株の長期連続的な継代により、改変されたワクシニアウィルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）の培養が可能となっている（Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. and Stickl, H. (1975) Infection 3, 6-14; Swiss Patent No. 568 392）。ＭＶＡウィルスは、ブタペスト条約の要求を遵守して、ＣＮＣＭ（Institut Pasteur, Collectione Nationale de Cultures de Microorganisms, 25, rue de Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15）に、１９８７年１２月５日、寄託番号Ｉ−７２１で寄託された。
【０００７】
ＭＶＡウィルスは、ゲノムにおける変化を決定するために、野生株ＣＶＡ株と比較して分析されている。６個の主な欠失（欠失Ｉ、II、III、IV、ＶおよびVI）が同定されている(Meyer, H., Sutter, G. and Mayr A. (1991) J. Gen. Virol. 72, 10311038)。この改変されたワクシニアウィルスＡｎｋａｒａは、ワクチン接種に使用した際、結果として副作用を起こさないという極めて低い毒性を示す。このため、免疫無防備状態の患者の初回接種に特に適している。ＭＶＡ株の優れた特性は、多くの臨床試験において証明されている(Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 23862392 [1974])。
【０００８】
改変されたワクシニアウィルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）は、組換え遺伝子の発現のために安全なウィルスベクターとして有用なツールであり、タンパク質機能のin vitro研究または抗原特異性細胞応答もしくは体液性免疫応答のin vivo誘導のような異なる目的にも使用できる。ＭＶＡの主な利点は、ヒトや多くの哺乳類細胞における複製欠陥にかかわらず、高レベルの遺伝子発現が可能であることである。優れた安全性の実績を有するワクチンであるＭＶＡは、生物学的安全性レベル１での取扱いが可能であり、動物に異種抗原を導入した際の、免疫原性および安全性が立証されており（１−８）、さらに、第１のヒト候補ワクチンについての臨床試験が進められている(９−１１)。
【０００９】
新たな構築物の評価についての要求が増加しているが、ウィルスの増殖欠損や発生する細胞障害効果の減少のため、複製コンピテント組換えワクシニアウィルスと比較した場合、ＭＶＡベクターの生産は異なっている。組換えＭＶＡの迅速且つ簡便な製造方法が、多数候補構築物の相対評価を可能とするために必要である。
【００１０】
親株と比較して、ＭＶＡは、Ｋ１Ｌ遺伝子のほとんどを含む親株のゲノムの約１５％（３０，０００塩基対）の構成を欠失している。長さ２６３ｂｐの断片のみが、ＭＶＡゲノムにまだ存在する。ＭＶＡのＫ１Ｌ遺伝子配列は、文献（Antoine, G., F. Scheiflinger, F. Dorner, and F. G. Falkner. 1998）に開示されるように、２０６８５−２０９８１の部位で、ＭＶＡゲノムにおけるＯＲＦ ０２２Ｌのはじめの２６３ｂｐを示す。改変されたワクチニアＡｎｋａｒａ株の完全なゲノム配列および他のオルソポックスウィルス属との比較は、文献（Virology 244:365-396）に開示されている。
【００１１】
以前より、ワクシニアウィルス宿主域遺伝子Ｋ１Ｌのトランジェント発現の選択に基づく、組換えＭＶＡの容易且つ高効率な製造方法が開発されている。この方法は、ウサギ腎臓ＲＫ-１３細胞におけるＭＶＡ生育を助けるためのストリンジェントマーカーとなるワクシニアウィルスＫ１Ｌ遺伝子機能を用いて、トランジェンント宿主域遺伝子発現による組換えＭＶＡの選択に基づいている（１２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
新たなＭＶＡベクタープラスミドの構築物とその使用は、トランジェント選択可能マーカーとしてワクシニアウィルス宿主域遺伝子Ｋ１Ｌの発現カセットを備えることが開示されている。これらのプラスミドは、ＭＶＡゲノムに、付加的な組換え遺伝子を安定に挿入すること、ＭＶＡゲノム配列の正確なターゲット変異のいずれも可能とする。Ｋ１Ｌ遺伝子をフランキングする反復ＤＮＡ配列は、非選択生育条件下、相同組換えによりウィルスゲノムからマーカー遺伝子を除去するようにデザインされた。
【００１３】
クラゲAequorea victoria由来の緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）遺伝子を含む異種遺伝子配列を有する多重組換えＭＶＡの構築のために、この簡単な選択プロトコールを使用する際、発明者らは、単離した組換えＭＶＡの一部は、ＲＫ１３細胞で生育できるが、目的のターゲット遺伝子を発現しないことを観察した。多重単離ＭＶＡの分子分析において、二つの異なる失敗が明らかとなった。すなわち、(ｉ)組換え遺伝子の挿入ではなく、Ｋ１Ｌマーカー遺伝子のみが存在する組換え遺伝子の挿入部位で、（ii）ＭＶＡゲノム内の天然欠失II領域が、影響／トランケートされているということである（図１Ａ）。第１の考察は、ＭＶＡゲノムにおけるｆｌａｎｋ Ｉ遺伝子配列と、従来のトランスファープラスミドのｆｌａｎｋ Ｉ反復配列との間における、第１の単交雑（single cross）の事象が原因であり、残りのｆｌａｎｋ Ｉ配列間での相同組換えという第２の事象が続き、結果として、ＭＶＡゲノムへのＫ１Ｌマーカー配列のみの安定した挿入となる。第２の考察は、相同組換え事象がＭＶＡにおけるＫ１Ｌ遺伝子配列とトランスファープラスミドとの間で起きる場合に生じる。後者の組換え事象の可能性は、Tscharke & Smith(１３)により示唆されている。
【００１４】
そこで、本発明の目的は、前述の問題を回避した、組換えＭＶＡの改良された生産方法の提供である。さらに、本発明の目的は、このような組換え方法に使用できる、ＭＶＡ変異体およびＤＮＡベクター構築物の提供である。これは、従属クレームの主題により実行される。本発明の好ましい形態は、従属クレームに示す。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によれば、ＭＶＡ Ｋ１Ｌ遺伝子配列（以下に示す断片のみからなる）、好ましくはそのプロモーター配列またはその機能性部分が、変異、欠失またはその両方によってＭＶＡゲノムにおいて不活性化されていることを特徴とする、新規ＭＶＡ変異体が提供される。
【００１６】
上述のように、Ｋ１Ｌ遺伝子の長さ２６４ｂｐの断片のみがＭＶＡゲノム（コード配列）に存在する。さらに、個々の制御配列は、約１００ｂｐの付加塩基を含む。ＭＶＡ Ｋ１遺伝子配列は、文献（Antoine, G., F. Scheiflinger, F. Dorner, and F. G. Falkner. 1998）に記載されているように、ＭＶＡゲノムのｎｔ２０６８５−２０９８１位のＯＲＦ ０２２Ｌの部分である。このように、ＭＶＡ Ｋ１Ｌ遺伝子配列および制御配列の機能性部分の不活性化は、本発明の目的を実行するために十分であることがわかる。「不活性化」とは、ＭＶＡゲノム内の天然欠失II領域（region of natural deletion II）における影響（affection）／トランケーション（truncation）（および、目的の遺伝子の発現を欠くという結果）の原因となる、ＭＶＡにおけるＫ１Ｌ遺伝子とトランスファープラスミド（ＤＮＡベクター構築物）との間での相同組換えを避けるための配列における改変を意味する。
【００１７】
好ましい形態において、ＭＶＡ Ｋ１Ｌ遺伝子は、好ましくは、そのプロモーター配列もしくはその機能性部分と共に、ウィルスゲノムからの欠失により不活性化されている。また、Ｋ１Ｌ配列機能における組換えＭＶＡの欠陥は、例えば、Ｋ１Ｌ遺伝子に特異的な組換えの阻害を通じてＫ１Ｌ配列の不活性化を導く挿入突然変異等の配列突然変異により発生してもよい。この組換えＭＶＡは、外来遺伝子の導入方法、および、例えば、組換えＭＶＡを生産する方法等、その後の形質転換株の選択方法に有益に使用できる。
【００１８】
上述のように、ＭＶＡゲノムの不活性は、不活性程度を意味し、この結果、一般的に、ＭＶＡにおけるＫ１Ｌ遺伝子配列とトランスファープラスミド（ベクター構築物）との間の相同組換えを妨げることとなる。変異の場合、本発明の不活性化Ｋ１Ｌ配列とＶＶ Ｋ１Ｌ遺伝子との間の相同性は、５０％以下であり、好ましくは１０〜５０％の範囲、より好ましくは１５〜４０％、特に好ましくは２０〜３０％の範囲である。相同性０％であってもよい。
【００１９】
欠失による不活性の場合、欠失断片は、ＭＶＡ Ｋ１Ｌ遺伝子の少なくとも１００ｂｐを含み、より好ましくは１５０または２００ｂｐを含む。上述のように、全２６４ｂｐを欠失することも可能である。さらに、制御配列は、相同組換えの事象を避けるために、広い範囲で欠失することが望ましい。コード配列および制御配列の両方からなる全Ｋ１Ｌ配列を欠失してもよい（例えば、約３６０ｂｐの欠失）。
【００２０】
近年確立されたプラスミドＤＮＡのトランスフェクション方法を使用して一次トリ線維芽細胞（ＣＥＦ）をＭＶＡに感染させ、引き続き、ミコフェノール酸存在下で、β-ガラクトシダーゼを生産するウィルスの選択を行い(Sutter, G. and B. Moss. 1992, PNAS USA 89:10847-10851.)、ウィルスゲノムから欠失したＫ１Ｌコード配列を有する変異ＭＶＡを生産した。
【００２１】
本発明の基本原理は、ＭＶＡが、誘導された適当なＤＮＡ配列（Ｋ１Ｌコード配列、および、さらに任意で、異種タンパク質をコードするようなＤＮＡ配列）なしにＲＫ-１３細胞に存在する間は、複製は起こらないという点である。このため、本発明の方法／ＭＶＡ変異体／ＤＮＡ構築物は、組換えＭＶＡの選択に適しており、組換えＭＶＡの効率良い生産のツールとして使用できる。
【００２２】
ここで、「組換えＭＶＡ」とは、例えば、ＤＮＡ組換え技術により遺伝的に変化したＭＶＡを意味し、これは、例えば、ワクチンとして、または、発現ベクターとしての使用に適用できる。
【００２３】
本発明によれば、組換えＭＶＡワクシニアウィルスは、以下のように調製できる。しかしながら、当業者は、本発明の範囲内で技術常識に基づいて変更できると理解できる。さらに、ここで述べる文献は引用により取り入れる。
【００２４】
ワクシニアウィルス（ＶＶ）Ｋ１Ｌタンパク質またはＫ１Ｌ由来ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および、例えば、ＭＶＡゲノム内の欠失III等の天然に発生する欠失のような非本質的な部位をフランキングするＤＮＡ配列によって両側がフランキングされた外来ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物は、細胞に導入され、好ましくは、真核細胞に導入される。好ましくは、鳥類、哺乳類およびヒト細胞が使用できる。好ましい真核細胞は、相同組換えが起きるように、本発明の変異ＭＶＡで感染させたＢＨＫ-２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ-１０）、ＢＳＣ-１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ-２６）、ＣＶ-１(ＥＣＡＣＣ ８７０３２６０５)またはＭＡ１４(ＥＣＡＣＣ ８５１０２９１８)細胞である。さらに好ましい宿主細胞は、トリ線維芽細胞、ウズラ線維芽細胞、ＱＴ-９細胞、ベロ細胞、ＭＲＣ-５細胞、Ｂ-細胞またはヒト一次細胞（例えば、一次線維芽細胞、樹状細胞である。
【００２５】
上述のように、ＤＮＡ構築物は、ＶＶ Ｋ１Ｌ遺伝子または機能的に等しい遺伝子をコードする配列を含む。本発明において機能的に等しいとは、機能を変化することなく、ＶＶ Ｋ１Ｌ遺伝子の核酸と比較した場合に、１以上の置換、挿入および／または欠失を含むような核酸を意味する。これらは好ましくは１であり、２、３、４またはそれ以上のヌクレオチド、５’末端、３’末端または核酸配列内において欠失し、これらのヌクレオチドは、他により置換されてもよい。本発明によれば、ＶＶ Ｋ１Ｌと同等のタンパク質をコードする核酸は、例えば、オリジナルのＶＶ Ｋ１Ｌ遺伝子（上記）の核酸との相同性が、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％または９５％である。
【００２６】
このような関係において、特に、例えば、“サイレント”チェンジと呼ばれる配列内での欠失、挿入および／または置換がなされた、ＶＶ Ｋ１Ｌタンパク質と同等なタンパク質をコードするＶＶ Ｋ１Ｌ遺伝子の変異体は、本発明の部分とみなされる。
【００２７】
例えば、核酸配列におけるこのような変化は、同等のアミノ酸で置換することが考えられる。例えば、保存アミノ酸置換のように、類似する構造および／または化学特性である類似アミノ酸で１つのアミノ酸を置換するアミノ酸置換が好ましい。
【００２８】
アミノ酸置換は、関連する残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性（親媒性）の特性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、疎水性アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンである。極性、中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む。正電荷（塩基性）は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンを含む。負電荷アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。
【００２９】
「挿入」または「欠失」は、通常、１〜５アミノ酸の範囲である。許される変異の程度は、組換えＤＮＡ法を用いたポリペプチド分子におけるアミノ酸の挿入、欠失または置換の順序的な適用を通じて経験的に決定できる。結果として得られる変異体は、生物活性で試験できる。
【００３０】
タンパクのＮ末端およびＣ末端に影響するヌクレオチド変化は、通常、タンパク質活性を変化しない。これらの部分は、通常、生物活性に関与しないからである。示唆された修飾は、それぞれ、技術分野の範囲であり、コードされる産物の生物活性の維持に基づく範囲である。
【００３１】
ＤＮＡ構築物が、真核細胞に導入され、Ｋ１ＬコードＤＮＡおよび外来ＤＮＡが、ウィルスＤＮＡと結合すると、例えば、ＲＫ-１３細胞のようなウィルス成育をサポートするＫ１Ｌ機能を必要とする細胞内での継代を通じて、所望の組換えワクシニアウィルスＭＶＡを単離できる。組換えウィルスのクローニングは、プラーク精製のような公知技術で可能である（Nakano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 15931596 [1982], Franke et al., Mol. Cell. Biol. 19181924 [1985], Chakrabarti et al., Mol. Cell. Biol. 34033409 [1985], Fathi et al., Virology 97105 [1986]）。
【００３２】
挿入されるＤＮＡ構築物は、鎖状でも環状でもよい。環状ＤＮＡが好ましく使用される。特に好ましくはプラスミドの使用である。
【００３３】
ＤＮＡ構築物は、例えば、ＭＶＡゲノム(Sutter, G. and Moss, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1084710851)内の欠失III部位、ＭＶＡゲノム内のＫ１Ｌを遺伝子工学で欠失させた部位、または、本発明の変異ＭＶＡゲノム内の非必須部位であるような、非必須部位の左右をフランキングする配列を含んでもよい。
【００３４】
外来ＤＮＡ配列は、例えば、自然に欠損が生じるような、非必須部位をフランキングする配列の間に挿入されてもよい。
【００３５】
外来ＤＮＡ配列は、治療用ポリペプチドをコードする遺伝子でもよい。前記治療用ポリペプチドは、ワクチン接種の目的または治療もしくは科学的に価値のあるポリペプチドの生産に好ましく使用できる、例えば、抗体ポリペプチド、ケモカイン、サイトカインもしくはインターフェロン等の分泌タンパク質、または、病原性物質由来のポリペプチドである。病原性物質は、生物における多種多様な非限定的な腫瘍細胞や、疾患の原因となり、これにより病理学的発達を導く、ウィルス、細菌および寄生虫があげられる。このような病原性物質の例は、Davis, B.D. ら(Microbiology, 3rd ed., Harper International Edition)により報告されている。病原性物質の好ましい遺伝子は、インフルエンザウィルス、はしか呼吸性シンシチウムウィルス（measles and respiratory syncytial viruses）、デング熱ウィルス、例えば、ＨＩＶ ＩおよびＨＩＶ IIのようなヒト免疫不全ウィルス、例えば、ＨＣＶやＨＢＶ等のヒト肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、パピローマウィルス、プラスモジウムマラリア原虫、および、結核を引き起こすマイコバクテリアの遺伝子等である。
【００３６】
腫瘍関連抗原をコードする好ましい遺伝子は、例えば、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１および２等のメラノーマ関連分化抗原、例えば、ＭＡＧＥ-１、-２、-３およびＢＡＧＥのような腫瘍精巣（cancer testes）抗原、および、Ｈｅｒ-２／ｎｅｕ、ＭＵＣ-１ならびにｐ５３のような、ガンにおいて過剰発現する非変異共用（non-mutated shared）抗原の遺伝子である。
【００３７】
外来ＤＮＡ配列または遺伝子を発現するために、ＤＮＡに存在する遺伝子の翻訳に必要とされる制御配列が必要である。このような制御配列（プロモーターと呼ばれる）は、当該技術分野において公知である。例えば、ＥＰ-Ａ-１９８，３２８に開示されるワクシニア１１ｋＤａ遺伝子、ＥＰ-Ａ-１１０，３８５に開示されるプロモーターのような、ワクシニアウィルスに特異的なプロモーター、もしくは、ワクシニアウィルスに特異的な転写を可能にする異種ポックスウィルスプロモーター、またはワクシニアウィルスに特異的な転写を可能にする合成プロモーター等があげられる。
【００３８】
好ましい対応において、本発明のＤＮＡ−ベクター構築物は、以下の
・ ＶＶのＫ１Ｌコード配列を含むＫ１Ｌマーカー遺伝子および転写ユニット、好ましくは、その真正プロモーターの転写制御配列を含む、
・ 相同組換えによって組換えＭＶＡから前記マーカーを後に除去するための、Ｋ１Ｌマーカー遺伝子をフランキングする２つのＤＮＡ配列、好ましくは、２つの同一挿入ＤＮＡ断片（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬａｃＺ由来）、
・ クローニングサイト、好ましくは、任意に異種遺伝子が挿入されるマルチプルクローニングサイト、
・ ワクシニアウィルスに特異的な転写のためのプロモーター、好ましくはワクシニアウィルス誘導プロモーター、またはワクシニアウィルスに特異的な転写を可能にする異種ポックスウィルスプロモーター、または、ワクシニアウィルスに特異的な転写を可能とする合成プロモーター、
という機能性関連組成（functionally linked components）を含み、
前記組成が、上述の本発明の変異ＭＶＡゲノム内の非必須部位、ＭＶＡゲノム内の欠失III部位、または、ＭＶＡゲノム内のＫ１Ｌを遺伝子工学で欠失させた部位への、外来遺伝子の標的挿入に必須である２つのＭＶＡ-ＤＮＡ配列によりフランキングされている。
【００３９】
ＤＮＡ構築物は、例えば、カルシウムリン酸沈殿法 (Graham et al., Virol. 52, 456467 [1973]; Wigler et al., Cell 777785 [1979])、エレクトロポレーション法 (Neumann et al., EMBO J. 1, 841845 [1982])、マイクロインジェクション法（Graessmann et al., Meth. Enzymology 101, 482492 (1983)）、リポソーム法 (Straubinger et al., Methods in Enzymology 101, 512527 (1983))、スフェロプラスト法 (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 21632167 (1980))、または、当該技術分野の公知の方法であるトランスフェクションによって細胞に導入できる。カルシウムリン酸沈殿法によるトランスフェクションが好ましく使用できる。
【００４０】
ワクチンの調製のため、本発明により生産されるＭＶＡワクシニアウィルスは、生理学的に許容できる形状に変化してもよい。これは、天然痘に対するワクチン接種に使用するワクチン調製における長年の経験に基づいて行うことができる（Kaplan, Br. Med. Bull. 25, 131135 [1969]）。一般的に、組換えＭＶＡ約１０6〜１０8粒子が、アンプル（好ましくはガラスアンプル）において、２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００ｍｌ中で凍結乾燥される。凍結乾燥は、非経口投与に適した希釈剤（マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、またはポリビニルピロリドン）または他の助剤（抗酸化剤、安定化剤等）を含んでもよい。そして、ガラスアンプルは密封し保存できる。好ましくは−２０℃で数ヶ月である。
【００４１】
ワクチン接種のため、凍結乾燥物は、０．１〜０．２ｍｌの水溶液（好ましくは生理食塩水）に溶解でき、例えば、皮内接種により非経口的に投与できる。本発明のワクチンは、好ましくは皮内注射される。わずかな腫れ物および赤味、時々痛みが、注射部位に見られる（Stickl et al., supra)。投与方法、投与量や投与数は、当業者により最適化できる。外来抗原に対する高いレベルの免疫応答を得るためには、長期間に渡り数回ワクチンを投与することが適切な手法である。
【００４２】
要約として、組換えＭＶＡの生産に関する本発明の方法は、変異ＭＶＡで上述のように宿主細胞を感染させる工程、本発明のＤＮＡベクター構築物で前記宿主細胞をトランスフェクトする工程、および、ウサギ腎臓ＲＫ-１３細胞、または、ＭＶＡもしくは請求項１記載の変異ＭＶＡの増殖生育を可能とするＫ１Ｌ遺伝子機能を本質的に必要とする他の細胞の生育により、回復したＭＶＡを選択する工程を含む。
【００４３】
図面の簡単な説明
図１：Ｋ１Ｌに基づく宿主範囲の選択の可能なpit-fallおよびそれらの除去に関する図。
（Ａ）ＭＶＡゲノム（ＨｉｎｄIII制限地図）およびベクタープラスミドｐIIIｄＨＲのマップ図。欠失II部位：Ｋ１Ｌ遺伝子の断片（斜線のボックス）を含むＯＲＦｓの表示。欠失III部位：ｆｌａｎｋ-Ｉおよびｆｌａｎｋ-IIは、ＭＶＡゲノム内の欠失III部位への外来遺伝子のターゲット挿入に必須であるＭＶＡ-ＤＮＡ配列である。ｆｌａｎｋ-１-ｒｅｐは、相同組換えによりＫ１Ｌ発現カセットの欠失を可能とするｆｌａｎｋ-Ｉの右末端に相同の２８３ｂｐ反復ＭＶＡ-ＤＮＡ断片の部分を示す。Ｋ１Ｌマーカー：真正のプロモーターを含むＫ１Ｌ遺伝子配列、Ｐvv：ワクシニアウィルス特異的プロモーター、ＭＣＳ：マルチプルクローニングサイト。１および２：通常のＫ１Ｌ選択を用いた潜在的に不必要な相同組換え事象（点線で示す）。（Ｂ）ＭＶＡゲノムからのＫ１Ｌ配列の除去。上は、ＭＶＡゲノムのＨｉｎｄIII制限地図、下は、Ｋ１Ｌ遺伝子の断片（斜線のボックス）を含む、ＭＶＡゲノム内の欠損II部位でのＯＲＦｓを表す。ｐIInewＬＺ-ｇｐｔ-ｄｅｌ：Ｋ１Ｌ欠失プラスミド、２６１ｂｐＫ１Ｌ断片をフランキングするＭＶＡ配列（Ｎ２ＬおよびＫ２Ｌ遺伝子配列）を有する、Ｎ２Ｌ-ｒｅｐ：Ｎ２Ｌ ＯＲＦの５’領域の３１５ｂｐ反復、Ｐ１１：ワクシニアウィルス後期プロモーター、Ｐ７．５：ワクシニアウィルス早期／後期プロモーター、ＬａｃＺ：β-ガラクトシダーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉ ＬａｃＺ遺伝子、ｇｐｔ：キサンチン-グアニン-ホスホリボシル-トランスフェラーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉ ｇｐｔ 遺伝子。下は、ＭＶＡ−IInewの欠損II領域を示す。（Ｃ）新規ＭＶＡトランスファープラスミドｐIIIΔＨＲ。ｆｌａｎｋ-Ｉおよびｆｌａｎｋ-IIは、ＭＶＡゲノム内の欠損II部位への外来遺伝子のターゲット挿入に必須のＭＶＡ-ＤＮＡ配列である。Ｋ１Ｌ-マーカー：真正のプロモーターを含むＫ１Ｌ遺伝子配列、Ｐvv:ワクシニアウィルス特異性のプロモーター、ＭＣＳ：マルチプルクローニングサイト。同一のｌａｃＺ-誘導ＤＮＡ断片（ｄｅｌ）の２つのコピーは、相同組換えにより組換えＭＶＡから選択性マーカーを後に除去するために、Ｋ１Ｌマーカー遺伝子のそれぞれの末端に位置している。
【００４４】
図２：ＨＣＶ nonstructuralタンパク質３の遺伝子配列を含む組換えＭＶＡの構築およびゲノム構造
制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIに対するＭＶＡゲノムの概略地図を上に示す。ＨＣＶコード配列は、ワクシニアウィルス早期／後期プロモーターＰ７．５の転写制御下に置かれており、ＭＶＡゲノム内の欠失III部位で相同組換えにより挿入されている。ｆｌａｎｋ１およびｆｌａｎｋ２は、欠失III部位に隣接するＭＶＡ-ＤＮＡ配列であり、ＭＶＡゲノムへの組換えをターゲットとするために働く。Ｒｅｃ２は、ｆｌａｎｋ１の末端に対応し、相同組換えにより最終的な組換えウィルスのゲノムからＫ１Ｌ選択性マーカーを除去するための、２８３ｂｐ反復ＭＶＡ-ＤＮＡ配列の部分を示す。組換えＭＶＡ-ＨＣＶ-ＮＳ３のゲノム構造の説明は以下に示す。
【００４５】
図３：ＭＶＡ-Ｐ７．５-ＮＳ３のin vitro特性
左図：欠失III部位に挿入された遺伝子配列およびＮＳ-３特異的配列をモニターする、ウィルスＤＮＡのＰＣＲ分析。野生型ＭＶＡのゲノムＤＮＡ、ＭＶＡ-ＨＣＶ-ＮＳ３およびトランスファープラスミドｐIII-ｄＨＲ-Ｐ７．５-ＮＳ３を、アガロースゲル電気泳動により分離した特有のＤＮＡ断片の増幅のため、鋳型ＤＮＡとして使用した。１-ｋＢ-Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ）をマーカーとして使用した（レーン１）。右図：ＣＥＦ細胞に１０ ＩＵ／細胞のＭＶＡまたはＭＶＡ−Ｐ７．５-ＮＳ３を感染させ、２４時間宿主感染を行った。溶解細胞からのタンパク質は、ＳＤＳ-１０％ＰＡＧＥで分離し、ポリクローナルＨＣＶ特異的抗血清を用いたウェスタンブロットにより分析した。部位およびタンパク質標準の分子量（ｋＤａ）は、レーンＭＷに示す。
【００４６】
以下に示す実施例は、本発明のさらなる理解に貢献するものであるが、本発明を実施例の主題に限定するためのものではない。
【実施例１】
【００４７】
実施例
トランジェントＫ１Ｌ選択技術を改良するため、発明者らは、Ｋ１Ｌを有さないＭＶＡの構築（例：ＭＶＡ（IInew）、図１Ｂ）および新規ＤＮＡベクター構築物（トランスファープラスミド）（例：pIIIΔHR、図１Ｃ）のデザインという２つの手段を採用した。
【００４８】
１．ウィルスの生育および精製
１．１ ＭＶＡおよびＭＶＡ変異ウィルスの生育
ＭＶＡウィルスは、トリ胚線維芽（ＣＥＦ）培養において原株であるＣＶＡ株の連続継代により生産される、非常に弱毒化されたワクチンウィルスである。ワクシニアのＭＶＡ株の生産、特性および使用に関する沿革の一般的なレビューとして、Mayrら（Mayr et al. in Infection 3, 614 [1975].）により開示された要約を参照することができる。ＣＥＦへの適合のため、他の細胞システムにおけるＭＶＡウィルスの生育は、非常に制限される。容易にセルラインを維持できるという特徴を示す乳児ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）は、高効率ＣＥＦのように、ＭＶＡ生育、組換え遺伝子の優れた発現をサポートし、発現ベクターおよび生菌組換えワクチンの発展において、標準化されたＭＶＡの生育のために推奨される（Drexler et al. 1998, J. Gen. Virol., 79, 347-352）。
【００４９】
ＭＶＡウィルスは、一般にＣＥＦ細胞で生育され、その宿主細胞に適応する。ＣＥＦ細胞の調製のため、インキュベートした鶏卵から１１日胚を単離し、四肢を除去し、胚を小さな断片にカットして、室温で２時間、２５％トリプシン含有溶液内でゆっくり解離させた。得られた細胞懸濁を、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）および２ｍＭグルタミンを含む等量の培地Ｉ(ＭＥＭイーグル：例えば、Gibco（Basle, Switzerland；Order No. 0721500）より入手可能)に希釈し、セルスクリーン（例えば、Technomara AG（Zurich, Switzerland；Order No. Bellco 1985；150 mesh）より入手可能）を通してろ過した。そして、ベンチ遠心機(Hermle KG, D7209 Gosheim, FRG)において、室温で５分、２０００ｒｐｍの遠心により、細胞を沈殿させた。細胞沈殿物を１／４量の培地Ｉにより回収し、この方法により得られたＣＥＦ細胞を細胞培養皿に撒いた。これらを、所望の細胞密度に応じて、１〜２日、３７℃で、ＣＯ2インキュベーターにより培地中で生育させ、直接、または、さらに１〜２細胞継代の後、感染に使用した。初代培養の調製の明確な記載は、R.I. Freshneyによる「“Culture of animal cell", Alan R. Liss Verlag, New York [1983] Chapter 11, page 99 et seq.」に見出すことができる。
【００５０】
本発明のＭＶＡ変異は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加した最小必須培地（ＭＥＭ）で生育させたＣＥＦ細胞または乳児ハムスター腎臓ＢＨＫ−２１細胞(American Type Culture Collection ATCC CCL-10)で定法により増殖させる。ＢＨＫ−２１細胞は、３７℃、５％ＣＯ2の湿雰囲気下に維持させた。
【００５１】
ウィルスは、以下に示すようにして感染に使用した。細胞を１７５ｃｍ2細胞培養ボトルで培養した。８０〜９０％気密で、培地を除去し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ；例えば、Animed AG（Muttenz, Switzerland, Order No. 23.100.10）のＭＶＡ懸濁液（細胞あたり０．０１感染粒子、０．０１ｍｌ／ｃｍ2）とともに、細胞を１時間インキュベートした。それから、培地を添加し（０．２ｍｌ／ｃｍ2）、細胞の約８０％が丸くなるまで、約２〜３日間、３７℃で前記ボトルをインキュベートした。更なるプロセス（精製等）の前、溶解したウィルスは、細胞および培地とともに、処理することなく前記細胞培養ボトル中で−３０℃に保存した。
【００５２】
１．２ ウィルスの精製
出来るだけ精製され、宿主細胞に特異的な成分を含まないウィルス調製物を得るために行われる精製工程は、ＭＶＡおよびＷＲウィルスで同一とした(Joklik, Virology 18, 918 [1962], Zwartouw et al., J. gen. Microbiol. 29, 523529 [1962])。感染させて−３０℃で保存した細胞培養を解凍し、残存細胞を振り落とすか、プラスチック基板でかき取り、細胞およびウィルスを遠心分離によって培地から除去した(Sorvall centrigue、ＧＳＡローター、１時間、５００ｒｐｍ、１０℃)。ウィルスおよび細胞粒子からなる沈殿物を、１回ＰＢＳ（沈殿量の１０〜２０倍）に懸濁し、懸濁液を上述のように遠心分離した。新たな沈殿物を１０倍量のＲＳＢ緩衝液（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2）に懸濁し、残存している無傷細胞を分裂させ、細胞膜からウィルス粒子を遊離させるために、懸濁液を超音波（４mm直径チップを備えたLabsonic 1510、Bender and Hobein（Zurich, Switzerland）；２×１０秒、６０ワット、室温）で簡単に処理した。細胞核および大きな細胞デブリスを、後の簡単な懸濁液の遠心分離において除去した（Sorvall GSAローター、DuPont Co., D6353 Bad Nauheim, FRG；３分、３０００ｒｐｍ、１０℃）。沈殿物は、上述のように、再度ＲＳＢ緩衝液に懸濁し、超音波処理、遠心分離処理を行った。遊離ウィルス粒子を含む回収した上清をあわせて、３５％スクロース含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍｌからなるパッドに層状に広げ、そして、Kontron TST 28.38/17 ローターで遠心分離した(Kontron Instrumente, Zurich, Switzerland; Beckman SW 27 rotorに相当；９０分、１４，０００ｒｐｍ、１０℃)。上清をデカンタし、ウィルス粒子を含む沈殿を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍｌで回収し、超音波(２×１０秒、室温、上述の機器)による簡単な処理でホモジネートし、さらなる精製のためにステップグラジェントに供した。このグラジェントステップは、それぞれ、スクロースの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液５ｍｌ（スクロース濃度ステップ：２０％、２５％、３０％、３５％および４０％）の組成とした。グラジェントは、Kontron TST 28.38/17ローターを用いて、１４，０００ｒｐｍ、１０℃、３５分で遠心した。この遠心後、ウィルス粒子を含むいくつかの分離ゾーンが、３０％〜４０％スクロースの間におけるグラジェント領域でみられた。この領域をグラジェント（１０ｍｌ）から吸い上げ、スクロース溶液をＰＢＳ（２０ｍｌ）で希釈し、ウィルス粒子を遠心分離によってそこから沈殿させた(Kontron TST 28.38/17 ローター、９０分、１４，０００ｒｐｍ、１０℃)。純粋なウィルス粒子でほぼ構成されている沈殿を、ウィルス濃度が平均１〜５×１０9ｐｆｕ／ｍｌに相当するようにＰＢＳで回収した。精製されたウィルス原液は、後続の実験のため、直接またはＰＢＳで希釈して使用した。
【００５３】
２．変異ＭＶＡウィルスの構築および特性
２．１ Ｋ１Ｌ欠失プラスミド
ＭＶＡゲノムから、ＭＶＡ ＯＲＦ ０２２Ｌ（Antoine, G., F. Scheiflinger, F. Dorner, and F. G. Falkner. 1998. Virology 244:365-396に開示されているように、全欠失配列は、ＭＶＡゲノムのｎｔ２０７１９〜２１１６９から構成される）のプロモーター配列とともに、残りの２６３ｂｐのＫ１Ｌ配列を除去するために、発明者らは、欠失プラスミドｐIInewＬＺ-ｇｐｔ-ｄｅｌ（ｐＵＣII−ＬＺのｆｌａｎｋ １）(14)を構築した。このプラスミドは、ＭＶＡゲノム内の欠失II部位（the site of deletion II）への相同組換えに予め使用されるものであり、Ｋ１Ｌ遺伝子を含まず、以下のＰＣＲによって単離された新たなｆｌａｎｋ（Ｋ２Ｌ）により置換されている。前記ＰＣＲは、ＭＶＡゲノム遺伝子から、プライマーIIf1newAおよびIIf1newBを用いて行われる。
IIf1newA：5' CAG CTG CAG CGG CCG CCT TAC ACC GTA CCC 3' (SEQ ID NO: 1)
IIf1newB：5' CAG GCA TGC GTA GAA CGT AGA TCC GG 3' (SEQ ID NO: 2)
さらに、Ｎ２Ｌオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’領域３１５ｂｐ反復（以下のプライマーdelIIAおよびdelIIBを用いたＰＣＲにより単離）は、ＬａｃＺ-ｇｐｔ-カセットの下流に挿入され、これによってｐIInewＬＺ-ｇｐｔ-ｄｅｌが作製され、Ｎ２Ｌ遺伝子配列の相同組換えによりマーカーカセットを欠失できる。
delIIA：5' CAG CTG CAG CCA TAA TGG TCA ATC GCC 3'
(SEQ ID NO: 3)
delIIB：5' CAG GCG GCC GCG GTA TTC GAT GAT TAT TTT TAA CAA AAT AAC 3'
(SEQ ID NO: 4)
【００５４】
２．２ ＭＶＡ変異の生成
ＭＶＡ（IInew）は、ＭＶＡ(クローン分離株Ｆ６（clonal isolate F6）)を感染させた初代トリ線維芽（ＣＥＦ）へのｐIInewＬＺ-ｇｐｔ-ｄｅｌ ＤＮＡのトランスフェクションによって生産され、続いて、上述のような（７）ミコフェノール酸存在下でβ−ガラクトシダーゼを生産するウィルスの選択が行われた。組換えＭＶＡの選択後、選択プレッシャーを除去し（selective pressure was removed）、マーカーフリーのウィルスを単離した（図１Ｂ）。
【００５５】
３． 組換えＭＶＡウィルスの生産
３．１ ベクタープラスミドの構築
さらに、ＭＶＡトランスファープラスミドにおけるＭＶＡゲノム配列とＭＶＡ反復配列との間での相同組換えの可能性を排除するために、我々は、ｌａｃＺ遺伝子由来の２つの短い２１６ｂｐ反復配列により挟まれた、Ｋ１Ｌマーカーカセットを含む新たなプラスミドｐIIIΔＨＲをデザインした。
【００５６】
Ｋ１Ｌマーカーカセット、その真正プロモーターの転写制御下における完全なＫ１Ｌコード配列は、ワクシニアウィルスWestern Reserve株(Dr. B. Moss（LVD-NIH, Bethesda MD, USA）より提供)のゲノムＤＮＡ由来１１００ｂｐＤＮＡ断片として、オリゴヌクレオチドK1L-5'-3 CAG CAG CCC GGG TGC GAT AGC CAT GTA TCT ACT AAT CAG (SEQ ID NO: 5)およびK1L-3'-1 CAG CAG CCC GGG GGA AAT CTA TCT TAT ATA CAC (SEQ ID NO: 6)を用いたＰＣＲにより増幅した（制限酵素ＳｍａＩの部位を下線で示す）。
【００５７】
この両末端に同方向繰り返しを有するＫ１Ｌマーカーカセットは、先に開示（１２）されたｐΔＫ１Ｌより切り離し、ｐIIIΔＨＲ（図１Ｃ）を生産するために、ｐIIIｄＨＲにＫ１Ｌマーカーおよびｆｌａｎｋ Ｉ反復に代えて挿入した。最終のＭＶＡ組換えウィルスのゲノムは、ターゲット遺伝子配列および１つのＬａｃＺ遺伝子断片を含む。付加する外来ＤＮＡの挿入は、結果として「無害（clean）」ではないベクターウィルス生じ、さらに、この挿入配列は、組換えＭＶＡの簡便な同定のために、一般的な遺伝子マーカーとして働くこともできる。
【００５８】
３．２ 組換えＭＶＡの構成および単離
感染／トランスフェクション実験における組換え効率についてのこれらの変化の効果を測定した。ＣＥＦ細胞を、ＭＶＡ（Ｆ６）またはＭＶＡ（IInew）で感染し、ｐIIIｄＨＲ-ｇｆｐまたはｐIIIΔＨＲ-ｇｆｐでトランスフェクトした。サンプルは、４８時間で回収され、一部分がＲＫ１３モノレイヤーの感染に使用された。３日後、感染させたモノレイヤーを完全に回収し、ＲＫ１３細胞への第２継代を行った。３日のポスト感染で、多数の可視／ｇｆｐ蛍光細胞凝集体が、光／ＵＶ光顕微鏡観察により測定された。それから、発明者らは、例えば、Ｋ１Ｌマーカーカセットやｇｆｐ遺伝子のＭＶＡへの挿入のような、正しい組換え事象のパーセンテージを算出するためにこのデータを使用した（表１）。発明者により作成された通常の選択システム（ＭＶＡ（Ｆ６）およびｐIIIｄＨＲ-ｇｆｐ）を使用したところ、第２ＲＫ１３継代後におけるＫ１Ｌおよびｇｆｐに対するて全てのフォーカス組換えの３０．５％であることがわかった。ＭＶＡゲノムからの残りのＫ１Ｌ配列の除去は、適切な組換え事象をわずかに促進した（４５％、ＭＶＡ（IInew）およびpIIIｄＨＲ-ｇｆｐ）。これに対して、ＭＶＡトランスファープラスミドからのｆｌａｎｋ１反復配列の除去は、残りのＫ１Ｌ配列を持つＭＶＡを使用した場合でさえ、所望の組換え事象（７１％）という明らかな増加結果となった。発明者らは、新規ＭＶＡおよびｇｆｐトランスファープラスミド（ＭＶＡ（IInew）およびpIIIΔＨＲ-ｇｆｐ）を使用した場合に、事実上１００％効率を得た。ＲＫ１３細胞におけるはじめのブラインド継代は、希釈液のプレーティングおよびフォーカス量の測定前に行われた。これは、第１ＲＫ１３継代におけるＧＦＰポジティブ細胞凝集体の測定をする際、結果が適切な組換え事象の高い数値を示唆し、さらに、次の継代に入る時、約半分のウィルス単離体が、ＧＦＰポジティブウィルスフォーカスを誘導できないことが観察されたためである。この観察は、おそらく不安定な単一組換え事象および／またはキャリーオーバープラスミドＤＮＡ由来のとランジェントｇｆｐ発現に基づく。
【００５９】
発明者らは、さらに、（ｉ）ＭＶＡゲノム内の残存Ｋ１Ｌ配列の除去、（ii）トランジェントマーカー遺伝子を欠失するための相同性非ＭＶＡ配列を有する新規ＭＶＡトランスファープラスミドのデザインによって、Ｋ１Ｌに基づく選択技術を改良した。各方法は、異なる程度であっても、すでに所望の組換えウィルスの生産を改善した。修飾されたＭＶＡベクタープラスミドと、Ｋ１Ｌ配列を有さないＭＶＡバックボーンウィルスとの組み合わせは、効率的な選択およびターゲットゲノム部位への遺伝子の正確な移動を可能とし、事実上、ＭＶＡ組換えウィルスのみを単離することを可能とする。
【００６０】
４．ｒＭＶＡの生産／選択の方法
ＨＣＶ-Ｊ株（遺伝子型１ｂ）のnonstructural ３（ＮＳ３）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現する組換えＭＶＡ（ｒＭＶＡ）の構築は、内因性Ｋ１Ｌ配列を欠くＭＶＡ親ウィルス（ＭＶＡ-IInew）を基礎としてｒＭＶＡを生産し、異種、非ＭＶＡ反復要素（ＬａｃＺ）を有するプラスミドを使用する、我々の新規技術の有益な使用の実施例として供給できる。はじめから、我々は、Staib C.,ら（Staib C., et al. 2000, Biotechniques 28:1137-1148）に開示されているような我々の通常の宿主範囲選択プロトコールを使用する、ＨＣＶ-Ｊ株（遺伝型１ｂ）のＨＣＶ ＮＳ３遺伝子（ＭＶＡ-ＨＣＶ／ＮＳ３）の発現のためのｒＭＶＡの生産を試みていた。
【００６１】
ＨＣＶ ｃＤＮＡを含むプラスミドは、慢性肝炎の日本人患者由来であり、京都大学（Dr. Kunitada Shimotohno）より入手した。これを、ＰＣＲ増幅を用いたＮＳ３遺伝子 (ＨＣＶ ポリプロテインアミノ酸１０２８−１６５８)の調製に使用し、また、対応するＰＣＲ産物をＭＶＡトランスファーベクターｐIII-ｄＨＲ-Ｐ７．５（図２）へのクローニングのために使用した。ＭＶＡ（clonal isolate F6）でのＣＥＦモノレイヤーの感染ならびにｐIII-ｄＨＲ-Ｐ７．５-ＮＳ３でのトランスフェクションの後、選択マーカーとしてＫ１Ｌを使用して、ＲＫ１３細胞におけるいくつかのプラーク精製工程を行った。我々は、真の（bona fide）組換えウィルスを得ることができなかった。我々は、ｒＭＶＡゲノムの欠失３（ｄｅｌ３）部位内に安定に結合したＫ１Ｌ配列のみを有するＭＶＡを単離したが、安定に生育するウィルス継代は得られなかった。改善策として、我々は、改良した新規Ｋ１Ｌ選択技術の使用を決定し、ＮＳ３遺伝子配列を新規ＭＶＡプラスミドｐIII-ΔＨＲ-Ｐ７．５にクローニングし、相同組換えによる発現カセットの結合のために、レセプターウィルスとしてＫ１Ｌフリーの改善された単離ＭＶＡ-IInewを使用した。戦略の変更により、数回のプラーク精製ステップのみで所望の組換えウィルスＭＶＡ-ＨＣＶ／ＮＳ３を生産し単離することができた。図３は、ちょうどＭＶＡゲノムｄｅｌ３部位でのＮＳ３ ＯＲＦの適切な挿入および完全なＫ１Ｌ選択マーカーカセットの除去をモニターするＰＣＲ分析（左図）によるｒＭＶＡのin vitro特性を示す。さらに、新たに生産された組換えＭＶＡ-ＨＣＶ／ＮＳ３は、ウェスタンブロット分析（図３、右図）に示すように、ＣＥＦ細胞の感染において、適切なＮＳ３ポリペプチドを生産できる。ＭＶＡ-ＨＣＶ／ＮＳ３は、現在、ヒトのＨＣＶ感染に対する予防および／または治療の改善のための、有望な候補ベクターウィルスとして評価できる。重要な新規のｒＭＶＡ構築物は、標準方法によって作製することは不可能でないとしても非常に困難であると推測されるが、本特許出願に開示された我々の改善した方法論により、実際に重要な新規のｒＭＶＡ構築物を得ることが今や可能となった。
【００６２】
参考文献
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【００６３】
【表１】
【００６４】
表１：通常、新規ＭＶＡおよびトランスファープラスミドを使用した組換え効率
パーセンテージは、ｇｆｐ発現フォーカスと光顕微鏡下で可視のフォーカスとの非として算出した。かっこ内の数値は、各サンプルの２つの異なる１０倍希釈についてのカウントしたフォーカスの絶対値を示し、３回の試験の表示である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１Ａ】ＭＶＡゲノム（ＨｉｎｄIII制限地図）およびベクタープラスミドｐIIIｄＨＲのマップ図
【図１Ｂ】ＭＶＡゲノムからのＫ１Ｌ配列の除去を示すであって、上図は、ＭＶＡゲノムのＨｉｎｄIII制限地図、下図は、Ｋ１Ｌ遺伝子の断片を含む、ＭＶＡゲノム内の欠損II部位でのＯＲＦｓを示す。
【図１Ｃ】新規ＭＶＡトランスファープラスミドｐIIIΔＨＲを示す図。
【図２】ＨＣＶ nonstructuralタンパク質３の遺伝子配列を含む組換えＭＶＡの構築およびゲノム構造を示す図。
【図３】ＭＶＡ-Ｐ７．５-ＮＳ３のin vitro特性を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えＭＶＡウィルスの生産に使用できるＭＶＡ変異体に関し、同様に、これらの変異ＭＶＡウィルスで感染させた宿主細胞に関する。本発明は、さらに、ＤＮＡベクター構築物、前記変異ＭＶＡウィルスおよびＤＮＡ-ベクター構築物の使用によって組換えＭＶＡを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ワクシニアウィルス（ＶＶ）は、ポックスウィルスファミリーのオルソポックスウィルス属に属している。ワクチニアウィルスのある株は、長い間、天然痘に対する免疫のための生菌ワクチンとして使用されており、例えば、Lister Institute （英国）のElstree株があげられる。ワクチン接種に由来する合併症のため(Schar, Zeitschr. fur Praventivmedizin 18, 4144 [1973])、天然痘は根絶されたというＷＨＯによる１９８０年の宣言以来、今日ではハイリスクの人々にのみ天然痘に対する予防接種がなされている。
【０００３】
ワクシニアウィルスは、外来抗原の生産やデリバリーのためのベクターとして使用されている (Smith et al., Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383407 [1984])。これは、ワクシニアウィルスのゲノムに、ＤＮＡ組換え技術によって導入された外来抗原をコードするＤＮＡ配列（遺伝子）を内含する。ウィルスのライフサイクルに必須ではないウィルスＤＮＡ内の部位で前記遺伝子が結合されている場合、新たに生産された組換えワクシニアウィルスは、感染、すなわち外来細胞に感染でき、このため結合したＤＮＡ配列を発現することも可能となる(EP Patent Applications No. 83,286 およびNo. 110,385)。このようにして調製された組換えワクシニアウィルスは、一方では感染予防のための生菌ワクチンとして使用でき、他方、真核細胞における異種タンパク質の調製のための生菌ワクチンとして使用できる。
【０００４】
ワクシニアウィルスは、中でも最も広範囲にわたって評価されている生菌ベクターであり、組換えワクチンとしての使用をサポートする特有の特徴を有している。すなわち、極めて安定、安価に製造でき、処理が容易であり、多数の外来ＤＮＡに適用できるという点である。また、抗体応答と細胞毒応答の両方を誘発するという利点を有し、より自然な方法において免疫システムへの抗原の提示を可能とし、また、広い様々な種類の動物モデルにおける感染疾患を防御するベクターワクチンとしての使用も成功している。加えて、ワクシニアベクターは、組換えタンパク質の構造−機能の相関性を分析し、体液性および細胞媒介免疫応答のターゲットを決定し、また、特定の疾患の防御に必要な免疫防御のタイプを調べるための、極めて価値のあるリサーチツールである。
【０００５】
しかしながら、ワクシニアウィルスは、ヒトへの感染性を示し、試験室において発現ベクターとして使用することは、安全性の問題や規制に影響する。さらに、例えば、ヒトに対する新規治療や予防への取組みのために、組換えタンパク質または組換えウィルス粒子を生産するというような、組換えワクシニアウィルスの将来的な適用可能性は、組換えワクシニアベクターの増殖複製により妨げられる。文献に記載された組換えワクシニアウィルスの多くは、ワクシニアウィルスの Western Reserve（ＷＲ）株に基づいている。他方、この株は、高神経毒性であり、ヒトや動物での使用にあまり適していないことが知られている (Morita et al., Vaccine 5, 6570 [1987])。
【０００６】
ＶＶ標準株の安全性の問題は、in vitroでの制限された複製能力やin vivoでの無毒性を特徴とする非常に弱毒化されたウィルス株からのワクシニアベクターの開発により対処されている。望ましくない副作用を避けるために特別に培養されたウィルス株が長年知られている。そして、トリ線維芽細胞におけるワクシニアウィルス（ＣＶＡ）Ａｎｋａｒａ株の長期連続的な継代により、改変されたワクシニアウィルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）の培養が可能となっている（Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V. and Stickl, H. (1975) Infection 3, 6-14; Swiss Patent No. 568 392）。ＭＶＡウィルスは、ブタペスト条約の要求を遵守して、ＣＮＣＭ（Institut Pasteur, Collectione Nationale de Cultures de Microorganisms, 25, rue de Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15）に、１９８７年１２月５日、寄託番号Ｉ−７２１で寄託された。
【０００７】
ＭＶＡウィルスは、ゲノムにおける変化を決定するために、野生株ＣＶＡ株と比較して分析されている。６個の主な欠失（欠失Ｉ、II、III、IV、ＶおよびVI）が同定されている(Meyer, H., Sutter, G. and Mayr A. (1991) J. Gen. Virol. 72, 10311038)。この改変されたワクシニアウィルスＡｎｋａｒａは、ワクチン接種に使用した際、結果として副作用を起こさないという極めて低い毒性を示す。このため、免疫無防備状態の患者の初回接種に特に適している。ＭＶＡ株の優れた特性は、多くの臨床試験において証明されている(Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 23862392 [1974])。
【０００８】
改変されたワクシニアウィルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）は、組換え遺伝子の発現のために安全なウィルスベクターとして有用なツールであり、タンパク質機能のin vitro研究または抗原特異性細胞応答もしくは体液性免疫応答のin vivo誘導のような異なる目的にも使用できる。ＭＶＡの主な利点は、ヒトや多くの哺乳類細胞における複製欠陥にかかわらず、高レベルの遺伝子発現が可能であることである。優れた安全性の実績を有するワクチンであるＭＶＡは、生物学的安全性レベル１での取扱いが可能であり、動物に異種抗原を導入した際の、免疫原性および安全性が立証されており（１−８）、さらに、第１のヒト候補ワクチンについての臨床試験が進められている(９−１１)。
【０００９】
新たな構築物の評価についての要求が増加しているが、ウィルスの増殖欠損や発生する細胞障害効果の減少のため、複製コンピテント組換えワクシニアウィルスと比較した場合、ＭＶＡベクターの生産は異なっている。組換えＭＶＡの迅速且つ簡便な製造方法が、多数候補構築物の相対評価を可能とするために必要である。
【００１０】
親株と比較して、ＭＶＡは、Ｋ１Ｌ遺伝子のほとんどを含む親株のゲノムの約１５％（３０，０００塩基対）の構成を欠失している。長さ２６３ｂｐの断片のみが、ＭＶＡゲノムにまだ存在する。ＭＶＡのＫ１Ｌ遺伝子配列は、文献（Antoine, G., F. Scheiflinger, F. Dorner, and F. G. Falkner. 1998）に開示されるように、２０６８５−２０９８１の部位で、ＭＶＡゲノムにおけるＯＲＦ ０２２Ｌのはじめの２６３ｂｐを示す。改変されたワクチニアＡｎｋａｒａ株の完全なゲノム配列および他のオルソポックスウィルス属との比較は、文献（Virology 244:365-396）に開示されている。
【００１１】
以前より、ワクシニアウィルス宿主域遺伝子Ｋ１Ｌのトランジェント発現の選択に基づく、組換えＭＶＡの容易且つ高効率な製造方法が開発されている。この方法は、ウサギ腎臓ＲＫ-１３細胞におけるＭＶＡ生育を助けるためのストリンジェントマーカーとなるワクシニアウィルスＫ１Ｌ遺伝子機能を用いて、トランジェンント宿主域遺伝子発現による組換えＭＶＡの選択に基づいている（１２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
新たなＭＶＡベクタープラスミドの構築物とその使用は、トランジェント選択可能マーカーとしてワクシニアウィルス宿主域遺伝子Ｋ１Ｌの発現カセットを備えることが開示されている。これらのプラスミドは、ＭＶＡゲノムに、付加的な組換え遺伝子を安定に挿入すること、ＭＶＡゲノム配列の正確なターゲット変異のいずれも可能とする。Ｋ１Ｌ遺伝子をフランキングする反復ＤＮＡ配列は、非選択生育条件下、相同組換えによりウィルスゲノムからマーカー遺伝子を除去するようにデザインされた。
【００１３】
クラゲAequorea victoria由来の緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）遺伝子を含む異種遺伝子配列を有する多重組換えＭＶＡの構築のために、この簡単な選択プロトコールを使用する際、発明者らは、単離した組換えＭＶＡの一部は、ＲＫ１３細胞で生育できるが、目的のターゲット遺伝子を発現しないことを観察した。多重単離ＭＶＡの分子分析において、二つの異なる失敗が明らかとなった。すなわち、(ｉ)組換え遺伝子の挿入ではなく、Ｋ１Ｌマーカー遺伝子のみが存在する組換え遺伝子の挿入部位で、（ii）ＭＶＡゲノム内の天然欠失II領域が、影響／トランケートされているということである（図１Ａ）。第１の考察は、ＭＶＡゲノムにおけるｆｌａｎｋ Ｉ遺伝子配列と、従来のトランスファープラスミドのｆｌａｎｋ Ｉ反復配列との間における、第１の単交雑（single cross）の事象が原因であり、残りのｆｌａｎｋ Ｉ配列間での相同組換えという第２の事象が続き、結果として、ＭＶＡゲノムへのＫ１Ｌマーカー配列のみの安定した挿入となる。第２の考察は、相同組換え事象がＭＶＡにおけるＫ１Ｌ遺伝子配列とトランスファープラスミドとの間で起きる場合に生じる。後者の組換え事象の可能性は、Tscharke & Smith(１３)により示唆されている。
【００１４】
そこで、本発明の目的は、前述の問題を回避した、組換えＭＶＡの改良された生産方法の提供である。さらに、本発明の目的は、このような組換え方法に使用できる、ＭＶＡ変異体およびＤＮＡベクター構築物の提供である。これは、従属クレームの主題により実行される。本発明の好ましい形態は、従属クレームに示す。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明によれば、ＭＶＡ Ｋ１Ｌ遺伝子配列（以下に示す断片のみからなる）、好ましくはそのプロモーター配列またはその機能性部分が、変異、欠失またはその両方によってＭＶＡゲノムにおいて不活性化されていることを特徴とする、新規ＭＶＡ変異体が提供される。
【００１６】
上述のように、Ｋ１Ｌ遺伝子の長さ２６４ｂｐの断片のみがＭＶＡゲノム（コード配列）に存在する。さらに、個々の制御配列は、約１００ｂｐの付加塩基を含む。ＭＶＡ Ｋ１遺伝子配列は、文献（Antoine, G., F. Scheiflinger, F. Dorner, and F. G. Falkner. 1998）に記載されているように、ＭＶＡゲノムのｎｔ２０６８５−２０９８１位のＯＲＦ ０２２Ｌの部分である。このように、ＭＶＡ Ｋ１Ｌ遺伝子配列および制御配列の機能性部分の不活性化は、本発明の目的を実行するために十分であることがわかる。「不活性化」とは、ＭＶＡゲノム内の天然欠失II領域（region of natural deletion II）における影響（affection）／トランケーション（truncation）（および、目的の遺伝子の発現を欠くという結果）の原因となる、ＭＶＡにおけるＫ１Ｌ遺伝子とトランスファープラスミド（ＤＮＡベクター構築物）との間での相同組換えを避けるための配列における改変を意味する。
【００１７】
好ましい形態において、ＭＶＡ Ｋ１Ｌ遺伝子は、好ましくは、そのプロモーター配列もしくはその機能性部分と共に、ウィルスゲノムからの欠失により不活性化されている。また、Ｋ１Ｌ配列機能における組換えＭＶＡの欠陥は、例えば、Ｋ１Ｌ遺伝子に特異的な組換えの阻害を通じてＫ１Ｌ配列の不活性化を導く挿入突然変異等の配列突然変異により発生してもよい。この組換えＭＶＡは、外来遺伝子の導入方法、および、例えば、組換えＭＶＡを生産する方法等、その後の形質転換株の選択方法に有益に使用できる。
【００１８】
上述のように、ＭＶＡゲノムの不活性は、不活性程度を意味し、この結果、一般的に、ＭＶＡにおけるＫ１Ｌ遺伝子配列とトランスファープラスミド（ベクター構築物）との間の相同組換えを妨げることとなる。変異の場合、本発明の不活性化Ｋ１Ｌ配列とＶＶ Ｋ１Ｌ遺伝子との間の相同性は、５０％以下であり、好ましくは１０〜５０％の範囲、より好ましくは１５〜４０％、特に好ましくは２０〜３０％の範囲である。相同性０％であってもよい。
【００１９】
欠失による不活性の場合、欠失断片は、ＭＶＡ Ｋ１Ｌ遺伝子の少なくとも１００ｂｐを含み、より好ましくは１５０または２００ｂｐを含む。上述のように、全２６４ｂｐを欠失することも可能である。さらに、制御配列は、相同組換えの事象を避けるために、広い範囲で欠失することが望ましい。コード配列および制御配列の両方からなる全Ｋ１Ｌ配列を欠失してもよい（例えば、約３６０ｂｐの欠失）。
【００２０】
近年確立されたプラスミドＤＮＡのトランスフェクション方法を使用して一次トリ線維芽細胞（ＣＥＦ）をＭＶＡに感染させ、引き続き、ミコフェノール酸存在下で、β-ガラクトシダーゼを生産するウィルスの選択を行い(Sutter, G. and B. Moss. 1992, PNAS USA 89:10847-10851.)、ウィルスゲノムから欠失したＫ１Ｌコード配列を有する変異ＭＶＡを生産した。
【００２１】
本発明の基本原理は、ＭＶＡが、誘導された適当なＤＮＡ配列（Ｋ１Ｌコード配列、および、さらに任意で、異種タンパク質をコードするようなＤＮＡ配列）なしにＲＫ-１３細胞に存在する間は、複製は起こらないという点である。このため、本発明の方法／ＭＶＡ変異体／ＤＮＡ構築物は、組換えＭＶＡの選択に適しており、組換えＭＶＡの効率良い生産のツールとして使用できる。
【００２２】
ここで、「組換えＭＶＡ」とは、例えば、ＤＮＡ組換え技術により遺伝的に変化したＭＶＡを意味し、これは、例えば、ワクチンとして、または、発現ベクターとしての使用に適用できる。
【００２３】
本発明によれば、組換えＭＶＡワクシニアウィルスは、以下のように調製できる。しかしながら、当業者は、本発明の範囲内で技術常識に基づいて変更できると理解できる。さらに、ここで述べる文献は引用により取り入れる。
【００２４】
ワクシニアウィルス（ＶＶ）Ｋ１Ｌタンパク質またはＫ１Ｌ由来ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、および、例えば、ＭＶＡゲノム内の欠失III等の天然に発生する欠失のような非本質的な部位をフランキングするＤＮＡ配列によって両側がフランキングされた外来ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物は、細胞に導入され、好ましくは、真核細胞に導入される。好ましくは、鳥類、哺乳類およびヒト細胞が使用できる。好ましい真核細胞は、相同組換えが起きるように、本発明の変異ＭＶＡで感染させたＢＨＫ-２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ-１０）、ＢＳＣ-１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ-２６）、ＣＶ-１(ＥＣＡＣＣ ８７０３２６０５)またはＭＡ１４(ＥＣＡＣＣ ８５１０２９１８)細胞である。さらに好ましい宿主細胞は、トリ線維芽細胞、ウズラ線維芽細胞、ＱＴ-９細胞、ベロ細胞、ＭＲＣ-５細胞、Ｂ-細胞またはヒト一次細胞（例えば、一次線維芽細胞、樹状細胞である。
【００２５】
上述のように、ＤＮＡ構築物は、ＶＶ Ｋ１Ｌ遺伝子または機能的に等しい遺伝子をコードする配列を含む。本発明において機能的に等しいとは、機能を変化することなく、ＶＶ Ｋ１Ｌ遺伝子の核酸と比較した場合に、１以上の置換、挿入および／または欠失を含むような核酸を意味する。これらは好ましくは１であり、２、３、４またはそれ以上のヌクレオチド、５’末端、３’末端または核酸配列内において欠失し、これらのヌクレオチドは、他により置換されてもよい。本発明によれば、ＶＶ Ｋ１Ｌと同等のタンパク質をコードする核酸は、例えば、オリジナルのＶＶ Ｋ１Ｌ遺伝子（上記）の核酸との相同性が、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％または９５％である。
【００２６】
このような関係において、特に、例えば、“サイレント”チェンジと呼ばれる配列内での欠失、挿入および／または置換がなされた、ＶＶ Ｋ１Ｌタンパク質と同等なタンパク質をコードするＶＶ Ｋ１Ｌ遺伝子の変異体は、本発明の部分とみなされる。
【００２７】
例えば、核酸配列におけるこのような変化は、同等のアミノ酸で置換することが考えられる。例えば、保存アミノ酸置換のように、類似する構造および／または化学特性である類似アミノ酸で１つのアミノ酸を置換するアミノ酸置換が好ましい。
【００２８】
アミノ酸置換は、関連する残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性（親媒性）の特性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、疎水性アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンである。極性、中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む。正電荷（塩基性）は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンを含む。負電荷アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。
【００２９】
「挿入」または「欠失」は、通常、１〜５アミノ酸の範囲である。許される変異の程度は、組換えＤＮＡ法を用いたポリペプチド分子におけるアミノ酸の挿入、欠失または置換の順序的な適用を通じて経験的に決定できる。結果として得られる変異体は、生物活性で試験できる。
【００３０】
タンパクのＮ末端およびＣ末端に影響するヌクレオチド変化は、通常、タンパク質活性を変化しない。これらの部分は、通常、生物活性に関与しないからである。示唆された修飾は、それぞれ、技術分野の範囲であり、コードされる産物の生物活性の維持に基づく範囲である。
【００３１】
ＤＮＡ構築物が、真核細胞に導入され、Ｋ１ＬコードＤＮＡおよび外来ＤＮＡが、ウィルスＤＮＡと結合すると、例えば、ＲＫ-１３細胞のようなウィルス成育をサポートするＫ１Ｌ機能を必要とする細胞内での継代を通じて、所望の組換えワクシニアウィルスＭＶＡを単離できる。組換えウィルスのクローニングは、プラーク精製のような公知技術で可能である（Nakano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 15931596 [1982], Franke et al., Mol. Cell. Biol. 19181924 [1985], Chakrabarti et al., Mol. Cell. Biol. 34033409 [1985], Fathi et al., Virology 97105 [1986]）。
【００３２】
挿入されるＤＮＡ構築物は、鎖状でも環状でもよい。環状ＤＮＡが好ましく使用される。特に好ましくはプラスミドの使用である。
【００３３】
ＤＮＡ構築物は、例えば、ＭＶＡゲノム(Sutter, G. and Moss, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1084710851)内の欠失III部位、ＭＶＡゲノム内のＫ１Ｌを遺伝子工学で欠失させた部位、または、本発明の変異ＭＶＡゲノム内の非必須部位であるような、非必須部位の左右をフランキングする配列を含んでもよい。
【００３４】
外来ＤＮＡ配列は、例えば、自然に欠損が生じるような、非必須部位をフランキングする配列の間に挿入されてもよい。
【００３５】
外来ＤＮＡ配列は、治療用ポリペプチドをコードする遺伝子でもよい。前記治療用ポリペプチドは、ワクチン接種の目的または治療もしくは科学的に価値のあるポリペプチドの生産に好ましく使用できる、例えば、抗体ポリペプチド、ケモカイン、サイトカインもしくはインターフェロン等の分泌タンパク質、または、病原性物質由来のポリペプチドである。病原性物質は、生物における多種多様な非限定的な腫瘍細胞や、疾患の原因となり、これにより病理学的発達を導く、ウィルス、細菌および寄生虫があげられる。このような病原性物質の例は、Davis, B.D. ら(Microbiology, 3rd ed., Harper International Edition)により報告されている。病原性物質の好ましい遺伝子は、インフルエンザウィルス、はしか呼吸性シンシチウムウィルス（measles and respiratory syncytial viruses）、デング熱ウィルス、例えば、ＨＩＶ ＩおよびＨＩＶ IIのようなヒト免疫不全ウィルス、例えば、ＨＣＶやＨＢＶ等のヒト肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、パピローマウィルス、プラスモジウムマラリア原虫、および、結核を引き起こすマイコバクテリアの遺伝子等である。
【００３６】
腫瘍関連抗原をコードする好ましい遺伝子は、例えば、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１および２等のメラノーマ関連分化抗原、例えば、ＭＡＧＥ-１、-２、-３およびＢＡＧＥのような腫瘍精巣（cancer testes）抗原、および、Ｈｅｒ-２／ｎｅｕ、ＭＵＣ-１ならびにｐ５３のような、ガンにおいて過剰発現する非変異共用（non-mutated shared）抗原の遺伝子である。
【００３７】
外来ＤＮＡ配列または遺伝子を発現するために、ＤＮＡに存在する遺伝子の翻訳に必要とされる制御配列が必要である。このような制御配列（プロモーターと呼ばれる）は、当該技術分野において公知である。例えば、ＥＰ-Ａ-１９８，３２８に開示されるワクシニア１１ｋＤａ遺伝子、ＥＰ-Ａ-１１０，３８５に開示されるプロモーターのような、ワクシニアウィルスに特異的なプロモーター、もしくは、ワクシニアウィルスに特異的な転写を可能にする異種ポックスウィルスプロモーター、またはワクシニアウィルスに特異的な転写を可能にする合成プロモーター等があげられる。
【００３８】
好ましい対応において、本発明のＤＮＡ−ベクター構築物は、以下の
・ ＶＶのＫ１Ｌコード配列を含むＫ１Ｌマーカー遺伝子および転写ユニット、好ましくは、その真正プロモーターの転写制御配列を含む、
・ 相同組換えによって組換えＭＶＡから前記マーカーを後に除去するための、Ｋ１Ｌマーカー遺伝子をフランキングする２つのＤＮＡ配列、好ましくは、２つの同一挿入ＤＮＡ断片（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬａｃＺ由来）、
・ クローニングサイト、好ましくは、任意に異種遺伝子が挿入されるマルチプルクローニングサイト、
・ ワクシニアウィルスに特異的な転写のためのプロモーター、好ましくはワクシニアウィルス誘導プロモーター、またはワクシニアウィルスに特異的な転写を可能にする異種ポックスウィルスプロモーター、または、ワクシニアウィルスに特異的な転写を可能とする合成プロモーター、
という機能性関連組成（functionally linked components）を含み、
前記組成が、上述の本発明の変異ＭＶＡゲノム内の非必須部位、ＭＶＡゲノム内の欠失III部位、または、ＭＶＡゲノム内のＫ１Ｌを遺伝子工学で欠失させた部位への、外来遺伝子の標的挿入に必須である２つのＭＶＡ-ＤＮＡ配列によりフランキングされている。
【００３９】
ＤＮＡ構築物は、例えば、カルシウムリン酸沈殿法 (Graham et al., Virol. 52, 456467 [1973]; Wigler et al., Cell 777785 [1979])、エレクトロポレーション法 (Neumann et al., EMBO J. 1, 841845 [1982])、マイクロインジェクション法（Graessmann et al., Meth. Enzymology 101, 482492 (1983)）、リポソーム法 (Straubinger et al., Methods in Enzymology 101, 512527 (1983))、スフェロプラスト法 (Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 21632167 (1980))、または、当該技術分野の公知の方法であるトランスフェクションによって細胞に導入できる。カルシウムリン酸沈殿法によるトランスフェクションが好ましく使用できる。
【００４０】
ワクチンの調製のため、本発明により生産されるＭＶＡワクシニアウィルスは、生理学的に許容できる形状に変化してもよい。これは、天然痘に対するワクチン接種に使用するワクチン調製における長年の経験に基づいて行うことができる（Kaplan, Br. Med. Bull. 25, 131135 [1969]）。一般的に、組換えＭＶＡ約１０6〜１０8粒子が、アンプル（好ましくはガラスアンプル）において、２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００ｍｌ中で凍結乾燥される。凍結乾燥は、非経口投与に適した希釈剤（マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトース、またはポリビニルピロリドン）または他の助剤（抗酸化剤、安定化剤等）を含んでもよい。そして、ガラスアンプルは密封し保存できる。好ましくは−２０℃で数ヶ月である。
【００４１】
ワクチン接種のため、凍結乾燥物は、０．１〜０．２ｍｌの水溶液（好ましくは生理食塩水）に溶解でき、例えば、皮内接種により非経口的に投与できる。本発明のワクチンは、好ましくは皮内注射される。わずかな腫れ物および赤味、時々痛みが、注射部位に見られる（Stickl et al., supra)。投与方法、投与量や投与数は、当業者により最適化できる。外来抗原に対する高いレベルの免疫応答を得るためには、長期間に渡り数回ワクチンを投与することが適切な手法である。
【００４２】
要約として、組換えＭＶＡの生産に関する本発明の方法は、変異ＭＶＡで上述のように宿主細胞を感染させる工程、本発明のＤＮＡベクター構築物で前記宿主細胞をトランスフェクトする工程、および、ウサギ腎臓ＲＫ-１３細胞、または、ＭＶＡもしくは請求項１記載の変異ＭＶＡの増殖生育を可能とするＫ１Ｌ遺伝子機能を本質的に必要とする他の細胞の生育により、回復したＭＶＡを選択する工程を含む。
【００４３】
図面の簡単な説明
図１：Ｋ１Ｌに基づく宿主範囲の選択の可能なpit-fallおよびそれらの除去に関する図。
（Ａ）ＭＶＡゲノム（ＨｉｎｄIII制限地図）およびベクタープラスミドｐIIIｄＨＲのマップ図。欠失II部位：Ｋ１Ｌ遺伝子の断片（斜線のボックス）を含むＯＲＦｓの表示。欠失III部位：ｆｌａｎｋ-Ｉおよびｆｌａｎｋ-IIは、ＭＶＡゲノム内の欠失III部位への外来遺伝子のターゲット挿入に必須であるＭＶＡ-ＤＮＡ配列である。ｆｌａｎｋ-１-ｒｅｐは、相同組換えによりＫ１Ｌ発現カセットの欠失を可能とするｆｌａｎｋ-Ｉの右末端に相同の２８３ｂｐ反復ＭＶＡ-ＤＮＡ断片の部分を示す。Ｋ１Ｌマーカー：真正のプロモーターを含むＫ１Ｌ遺伝子配列、Ｐvv：ワクシニアウィルス特異的プロモーター、ＭＣＳ：マルチプルクローニングサイト。１および２：通常のＫ１Ｌ選択を用いた潜在的に不必要な相同組換え事象（点線で示す）。（Ｂ）ＭＶＡゲノムからのＫ１Ｌ配列の除去。上は、ＭＶＡゲノムのＨｉｎｄIII制限地図、下は、Ｋ１Ｌ遺伝子の断片（斜線のボックス）を含む、ＭＶＡゲノム内の欠損II部位でのＯＲＦｓを表す。ｐIInewＬＺ-ｇｐｔ-ｄｅｌ：Ｋ１Ｌ欠失プラスミド、２６１ｂｐＫ１Ｌ断片をフランキングするＭＶＡ配列（Ｎ２ＬおよびＫ２Ｌ遺伝子配列）を有する、Ｎ２Ｌ-ｒｅｐ：Ｎ２Ｌ ＯＲＦの５’領域の３１５ｂｐ反復、Ｐ１１：ワクシニアウィルス後期プロモーター、Ｐ７．５：ワクシニアウィルス早期／後期プロモーター、ＬａｃＺ：β-ガラクトシダーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉ ＬａｃＺ遺伝子、ｇｐｔ：キサンチン-グアニン-ホスホリボシル-トランスフェラーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉ ｇｐｔ 遺伝子。下は、ＭＶＡ−IInewの欠損II領域を示す。（Ｃ）新規ＭＶＡトランスファープラスミドｐIIIΔＨＲ。ｆｌａｎｋ-Ｉおよびｆｌａｎｋ-IIは、ＭＶＡゲノム内の欠損II部位への外来遺伝子のターゲット挿入に必須のＭＶＡ-ＤＮＡ配列である。Ｋ１Ｌ-マーカー：真正のプロモーターを含むＫ１Ｌ遺伝子配列、Ｐvv:ワクシニアウィルス特異性のプロモーター、ＭＣＳ：マルチプルクローニングサイト。同一のｌａｃＺ-誘導ＤＮＡ断片（ｄｅｌ）の２つのコピーは、相同組換えにより組換えＭＶＡから選択性マーカーを後に除去するために、Ｋ１Ｌマーカー遺伝子のそれぞれの末端に位置している。
【００４４】
図２：ＨＣＶ nonstructuralタンパク質３の遺伝子配列を含む組換えＭＶＡの構築およびゲノム構造
制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIに対するＭＶＡゲノムの概略地図を上に示す。ＨＣＶコード配列は、ワクシニアウィルス早期／後期プロモーターＰ７．５の転写制御下に置かれており、ＭＶＡゲノム内の欠失III部位で相同組換えにより挿入されている。ｆｌａｎｋ１およびｆｌａｎｋ２は、欠失III部位に隣接するＭＶＡ-ＤＮＡ配列であり、ＭＶＡゲノムへの組換えをターゲットとするために働く。Ｒｅｃ２は、ｆｌａｎｋ１の末端に対応し、相同組換えにより最終的な組換えウィルスのゲノムからＫ１Ｌ選択性マーカーを除去するための、２８３ｂｐ反復ＭＶＡ-ＤＮＡ配列の部分を示す。組換えＭＶＡ-ＨＣＶ-ＮＳ３のゲノム構造の説明は以下に示す。
【００４５】
図３：ＭＶＡ-Ｐ７．５-ＮＳ３のin vitro特性
左図：欠失III部位に挿入された遺伝子配列およびＮＳ-３特異的配列をモニターする、ウィルスＤＮＡのＰＣＲ分析。野生型ＭＶＡのゲノムＤＮＡ、ＭＶＡ-ＨＣＶ-ＮＳ３およびトランスファープラスミドｐIII-ｄＨＲ-Ｐ７．５-ＮＳ３を、アガロースゲル電気泳動により分離した特有のＤＮＡ断片の増幅のため、鋳型ＤＮＡとして使用した。１-ｋＢ-Ｌａｄｄｅｒ（Ｇｉｂｃｏ）をマーカーとして使用した（レーン１）。右図：ＣＥＦ細胞に１０ ＩＵ／細胞のＭＶＡまたはＭＶＡ−Ｐ７．５-ＮＳ３を感染させ、２４時間宿主感染を行った。溶解細胞からのタンパク質は、ＳＤＳ-１０％ＰＡＧＥで分離し、ポリクローナルＨＣＶ特異的抗血清を用いたウェスタンブロットにより分析した。部位およびタンパク質標準の分子量（ｋＤａ）は、レーンＭＷに示す。
【００４６】
以下に示す実施例は、本発明のさらなる理解に貢献するものであるが、本発明を実施例の主題に限定するためのものではない。
【実施例１】
【００４７】
実施例
トランジェントＫ１Ｌ選択技術を改良するため、発明者らは、Ｋ１Ｌを有さないＭＶＡの構築（例：ＭＶＡ（IInew）、図１Ｂ）および新規ＤＮＡベクター構築物（トランスファープラスミド）（例：pIIIΔHR、図１Ｃ）のデザインという２つの手段を採用した。
【００４８】
１．ウィルスの生育および精製
１．１ ＭＶＡおよびＭＶＡ変異ウィルスの生育
ＭＶＡウィルスは、トリ胚線維芽（ＣＥＦ）培養において原株であるＣＶＡ株の連続継代により生産される、非常に弱毒化されたワクチンウィルスである。ワクシニアのＭＶＡ株の生産、特性および使用に関する沿革の一般的なレビューとして、Mayrら（Mayr et al. in Infection 3, 614 [1975].）により開示された要約を参照することができる。ＣＥＦへの適合のため、他の細胞システムにおけるＭＶＡウィルスの生育は、非常に制限される。容易にセルラインを維持できるという特徴を示す乳児ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ−２１）は、高効率ＣＥＦのように、ＭＶＡ生育、組換え遺伝子の優れた発現をサポートし、発現ベクターおよび生菌組換えワクチンの発展において、標準化されたＭＶＡの生育のために推奨される（Drexler et al. 1998, J. Gen. Virol., 79, 347-352）。
【００４９】
ＭＶＡウィルスは、一般にＣＥＦ細胞で生育され、その宿主細胞に適応する。ＣＥＦ細胞の調製のため、インキュベートした鶏卵から１１日胚を単離し、四肢を除去し、胚を小さな断片にカットして、室温で２時間、２５％トリプシン含有溶液内でゆっくり解離させた。得られた細胞懸濁を、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）および２ｍＭグルタミンを含む等量の培地Ｉ(ＭＥＭイーグル：例えば、Gibco（Basle, Switzerland；Order No. 0721500）より入手可能)に希釈し、セルスクリーン（例えば、Technomara AG（Zurich, Switzerland；Order No. Bellco 1985；150 mesh）より入手可能）を通してろ過した。そして、ベンチ遠心機(Hermle KG, D7209 Gosheim, FRG)において、室温で５分、２０００ｒｐｍの遠心により、細胞を沈殿させた。細胞沈殿物を１／４量の培地Ｉにより回収し、この方法により得られたＣＥＦ細胞を細胞培養皿に撒いた。これらを、所望の細胞密度に応じて、１〜２日、３７℃で、ＣＯ2インキュベーターにより培地中で生育させ、直接、または、さらに１〜２細胞継代の後、感染に使用した。初代培養の調製の明確な記載は、R.I. Freshneyによる「“Culture of animal cell", Alan R. Liss Verlag, New York [1983] Chapter 11, page 99 et seq.」に見出すことができる。
【００５０】
本発明のＭＶＡ変異は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加した最小必須培地（ＭＥＭ）で生育させたＣＥＦ細胞または乳児ハムスター腎臓ＢＨＫ−２１細胞(American Type Culture Collection ATCC CCL-10)で定法により増殖させる。ＢＨＫ−２１細胞は、３７℃、５％ＣＯ2の湿雰囲気下に維持させた。
【００５１】
ウィルスは、以下に示すようにして感染に使用した。細胞を１７５ｃｍ2細胞培養ボトルで培養した。８０〜９０％気密で、培地を除去し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ；例えば、Animed AG（Muttenz, Switzerland, Order No. 23.100.10）のＭＶＡ懸濁液（細胞あたり０．０１感染粒子、０．０１ｍｌ／ｃｍ2）とともに、細胞を１時間インキュベートした。それから、培地を添加し（０．２ｍｌ／ｃｍ2）、細胞の約８０％が丸くなるまで、約２〜３日間、３７℃で前記ボトルをインキュベートした。更なるプロセス（精製等）の前、溶解したウィルスは、細胞および培地とともに、処理することなく前記細胞培養ボトル中で−３０℃に保存した。
【００５２】
１．２ ウィルスの精製
出来るだけ精製され、宿主細胞に特異的な成分を含まないウィルス調製物を得るために行われる精製工程は、ＭＶＡおよびＷＲウィルスで同一とした(Joklik, Virology 18, 918 [1962], Zwartouw et al., J. gen. Microbiol. 29, 523529 [1962])。感染させて−３０℃で保存した細胞培養を解凍し、残存細胞を振り落とすか、プラスチック基板でかき取り、細胞およびウィルスを遠心分離によって培地から除去した(Sorvall centrigue、ＧＳＡローター、１時間、５００ｒｐｍ、１０℃)。ウィルスおよび細胞粒子からなる沈殿物を、１回ＰＢＳ（沈殿量の１０〜２０倍）に懸濁し、懸濁液を上述のように遠心分離した。新たな沈殿物を１０倍量のＲＳＢ緩衝液（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ2）に懸濁し、残存している無傷細胞を分裂させ、細胞膜からウィルス粒子を遊離させるために、懸濁液を超音波（４mm直径チップを備えたLabsonic 1510、Bender and Hobein（Zurich, Switzerland）；２×１０秒、６０ワット、室温）で簡単に処理した。細胞核および大きな細胞デブリスを、後の簡単な懸濁液の遠心分離において除去した（Sorvall GSAローター、DuPont Co., D6353 Bad Nauheim, FRG；３分、３０００ｒｐｍ、１０℃）。沈殿物は、上述のように、再度ＲＳＢ緩衝液に懸濁し、超音波処理、遠心分離処理を行った。遊離ウィルス粒子を含む回収した上清をあわせて、３５％スクロース含有１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍｌからなるパッドに層状に広げ、そして、Kontron TST 28.38/17 ローターで遠心分離した(Kontron Instrumente, Zurich, Switzerland; Beckman SW 27 rotorに相当；９０分、１４，０００ｒｐｍ、１０℃)。上清をデカンタし、ウィルス粒子を含む沈殿を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍｌで回収し、超音波(２×１０秒、室温、上述の機器)による簡単な処理でホモジネートし、さらなる精製のためにステップグラジェントに供した。このグラジェントステップは、それぞれ、スクロースの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）溶液５ｍｌ（スクロース濃度ステップ：２０％、２５％、３０％、３５％および４０％）の組成とした。グラジェントは、Kontron TST 28.38/17ローターを用いて、１４，０００ｒｐｍ、１０℃、３５分で遠心した。この遠心後、ウィルス粒子を含むいくつかの分離ゾーンが、３０％〜４０％スクロースの間におけるグラジェント領域でみられた。この領域をグラジェント（１０ｍｌ）から吸い上げ、スクロース溶液をＰＢＳ（２０ｍｌ）で希釈し、ウィルス粒子を遠心分離によってそこから沈殿させた(Kontron TST 28.38/17 ローター、９０分、１４，０００ｒｐｍ、１０℃)。純粋なウィルス粒子でほぼ構成されている沈殿を、ウィルス濃度が平均１〜５×１０9ｐｆｕ／ｍｌに相当するようにＰＢＳで回収した。精製されたウィルス原液は、後続の実験のため、直接またはＰＢＳで希釈して使用した。
【００５３】
２．変異ＭＶＡウィルスの構築および特性
２．１ Ｋ１Ｌ欠失プラスミド
ＭＶＡゲノムから、ＭＶＡ ＯＲＦ ０２２Ｌ（Antoine, G., F. Scheiflinger, F. Dorner, and F. G. Falkner. 1998. Virology 244:365-396に開示されているように、全欠失配列は、ＭＶＡゲノムのｎｔ２０７１９〜２１１６９から構成される）のプロモーター配列とともに、残りの２６３ｂｐのＫ１Ｌ配列を除去するために、発明者らは、欠失プラスミドｐIInewＬＺ-ｇｐｔ-ｄｅｌ（ｐＵＣII−ＬＺのｆｌａｎｋ １）(14)を構築した。このプラスミドは、ＭＶＡゲノム内の欠失II部位（the site of deletion II）への相同組換えに予め使用されるものであり、Ｋ１Ｌ遺伝子を含まず、以下のＰＣＲによって単離された新たなｆｌａｎｋ（Ｋ２Ｌ）により置換されている。前記ＰＣＲは、ＭＶＡゲノム遺伝子から、プライマーIIf1newAおよびIIf1newBを用いて行われる。
IIf1newA：5' CAG CTG CAG CGG CCG CCT TAC ACC GTA CCC 3' (SEQ ID NO: 1)
IIf1newB：5' CAG GCA TGC GTA GAA CGT AGA TCC GG 3' (SEQ ID NO: 2)
さらに、Ｎ２Ｌオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’領域３１５ｂｐ反復（以下のプライマーdelIIAおよびdelIIBを用いたＰＣＲにより単離）は、ＬａｃＺ-ｇｐｔ-カセットの下流に挿入され、これによってｐIInewＬＺ-ｇｐｔ-ｄｅｌが作製され、Ｎ２Ｌ遺伝子配列の相同組換えによりマーカーカセットを欠失できる。
delIIA：5' CAG CTG CAG CCA TAA TGG TCA ATC GCC 3'
(SEQ ID NO: 3)
delIIB：5' CAG GCG GCC GCG GTA TTC GAT GAT TAT TTT TAA CAA AAT AAC 3'
(SEQ ID NO: 4)
【００５４】
２．２ ＭＶＡ変異の生成
ＭＶＡ（IInew）は、ＭＶＡ(クローン分離株Ｆ６（clonal isolate F6）)を感染させた初代トリ線維芽（ＣＥＦ）へのｐIInewＬＺ-ｇｐｔ-ｄｅｌ ＤＮＡのトランスフェクションによって生産され、続いて、上述のような（７）ミコフェノール酸存在下でβ−ガラクトシダーゼを生産するウィルスの選択が行われた。組換えＭＶＡの選択後、選択プレッシャーを除去し（selective pressure was removed）、マーカーフリーのウィルスを単離した（図１Ｂ）。
【００５５】
３． 組換えＭＶＡウィルスの生産
３．１ ベクタープラスミドの構築
さらに、ＭＶＡトランスファープラスミドにおけるＭＶＡゲノム配列とＭＶＡ反復配列との間での相同組換えの可能性を排除するために、我々は、ｌａｃＺ遺伝子由来の２つの短い２１６ｂｐ反復配列により挟まれた、Ｋ１Ｌマーカーカセットを含む新たなプラスミドｐIIIΔＨＲをデザインした。
【００５６】
Ｋ１Ｌマーカーカセット、その真正プロモーターの転写制御下における完全なＫ１Ｌコード配列は、ワクシニアウィルスWestern Reserve株(Dr. B. Moss（LVD-NIH, Bethesda MD, USA）より提供)のゲノムＤＮＡ由来１１００ｂｐＤＮＡ断片として、オリゴヌクレオチドK1L-5'-3 CAG CAG CCC GGG TGC GAT AGC CAT GTA TCT ACT AAT CAG (SEQ ID NO: 5)およびK1L-3'-1 CAG CAG CCC GGG GGA AAT CTA TCT TAT ATA CAC (SEQ ID NO: 6)を用いたＰＣＲにより増幅した（制限酵素ＳｍａＩの部位を下線で示す）。
【００５７】
この両末端に同方向繰り返しを有するＫ１Ｌマーカーカセットは、先に開示（１２）されたｐΔＫ１Ｌより切り離し、ｐIIIΔＨＲ（図１Ｃ）を生産するために、ｐIIIｄＨＲにＫ１Ｌマーカーおよびｆｌａｎｋ Ｉ反復に代えて挿入した。最終のＭＶＡ組換えウィルスのゲノムは、ターゲット遺伝子配列および１つのＬａｃＺ遺伝子断片を含む。付加する外来ＤＮＡの挿入は、結果として「無害（clean）」ではないベクターウィルス生じ、さらに、この挿入配列は、組換えＭＶＡの簡便な同定のために、一般的な遺伝子マーカーとして働くこともできる。
【００５８】
３．２ 組換えＭＶＡの構成および単離
感染／トランスフェクション実験における組換え効率についてのこれらの変化の効果を測定した。ＣＥＦ細胞を、ＭＶＡ（Ｆ６）またはＭＶＡ（IInew）で感染し、ｐIIIｄＨＲ-ｇｆｐまたはｐIIIΔＨＲ-ｇｆｐでトランスフェクトした。サンプルは、４８時間で回収され、一部分がＲＫ１３モノレイヤーの感染に使用された。３日後、感染させたモノレイヤーを完全に回収し、ＲＫ１３細胞への第２継代を行った。３日のポスト感染で、多数の可視／ｇｆｐ蛍光細胞凝集体が、光／ＵＶ光顕微鏡観察により測定された。それから、発明者らは、例えば、Ｋ１Ｌマーカーカセットやｇｆｐ遺伝子のＭＶＡへの挿入のような、正しい組換え事象のパーセンテージを算出するためにこのデータを使用した（表１）。発明者により作成された通常の選択システム（ＭＶＡ（Ｆ６）およびｐIIIｄＨＲ-ｇｆｐ）を使用したところ、第２ＲＫ１３継代後におけるＫ１Ｌおよびｇｆｐに対するて全てのフォーカス組換えの３０．５％であることがわかった。ＭＶＡゲノムからの残りのＫ１Ｌ配列の除去は、適切な組換え事象をわずかに促進した（４５％、ＭＶＡ（IInew）およびpIIIｄＨＲ-ｇｆｐ）。これに対して、ＭＶＡトランスファープラスミドからのｆｌａｎｋ１反復配列の除去は、残りのＫ１Ｌ配列を持つＭＶＡを使用した場合でさえ、所望の組換え事象（７１％）という明らかな増加結果となった。発明者らは、新規ＭＶＡおよびｇｆｐトランスファープラスミド（ＭＶＡ（IInew）およびpIIIΔＨＲ-ｇｆｐ）を使用した場合に、事実上１００％効率を得た。ＲＫ１３細胞におけるはじめのブラインド継代は、希釈液のプレーティングおよびフォーカス量の測定前に行われた。これは、第１ＲＫ１３継代におけるＧＦＰポジティブ細胞凝集体の測定をする際、結果が適切な組換え事象の高い数値を示唆し、さらに、次の継代に入る時、約半分のウィルス単離体が、ＧＦＰポジティブウィルスフォーカスを誘導できないことが観察されたためである。この観察は、おそらく不安定な単一組換え事象および／またはキャリーオーバープラスミドＤＮＡ由来のとランジェントｇｆｐ発現に基づく。
【００５９】
発明者らは、さらに、（ｉ）ＭＶＡゲノム内の残存Ｋ１Ｌ配列の除去、（ii）トランジェントマーカー遺伝子を欠失するための相同性非ＭＶＡ配列を有する新規ＭＶＡトランスファープラスミドのデザインによって、Ｋ１Ｌに基づく選択技術を改良した。各方法は、異なる程度であっても、すでに所望の組換えウィルスの生産を改善した。修飾されたＭＶＡベクタープラスミドと、Ｋ１Ｌ配列を有さないＭＶＡバックボーンウィルスとの組み合わせは、効率的な選択およびターゲットゲノム部位への遺伝子の正確な移動を可能とし、事実上、ＭＶＡ組換えウィルスのみを単離することを可能とする。
【００６０】
４．ｒＭＶＡの生産／選択の方法
ＨＣＶ-Ｊ株（遺伝子型１ｂ）のnonstructural ３（ＮＳ３）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を発現する組換えＭＶＡ（ｒＭＶＡ）の構築は、内因性Ｋ１Ｌ配列を欠くＭＶＡ親ウィルス（ＭＶＡ-IInew）を基礎としてｒＭＶＡを生産し、異種、非ＭＶＡ反復要素（ＬａｃＺ）を有するプラスミドを使用する、我々の新規技術の有益な使用の実施例として供給できる。はじめから、我々は、Staib C.,ら（Staib C., et al. 2000, Biotechniques 28:1137-1148）に開示されているような我々の通常の宿主範囲選択プロトコールを使用する、ＨＣＶ-Ｊ株（遺伝型１ｂ）のＨＣＶ ＮＳ３遺伝子（ＭＶＡ-ＨＣＶ／ＮＳ３）の発現のためのｒＭＶＡの生産を試みていた。
【００６１】
ＨＣＶ ｃＤＮＡを含むプラスミドは、慢性肝炎の日本人患者由来であり、京都大学（Dr. Kunitada Shimotohno）より入手した。これを、ＰＣＲ増幅を用いたＮＳ３遺伝子 (ＨＣＶ ポリプロテインアミノ酸１０２８−１６５８)の調製に使用し、また、対応するＰＣＲ産物をＭＶＡトランスファーベクターｐIII-ｄＨＲ-Ｐ７．５（図２）へのクローニングのために使用した。ＭＶＡ（clonal isolate F6）でのＣＥＦモノレイヤーの感染ならびにｐIII-ｄＨＲ-Ｐ７．５-ＮＳ３でのトランスフェクションの後、選択マーカーとしてＫ１Ｌを使用して、ＲＫ１３細胞におけるいくつかのプラーク精製工程を行った。我々は、真の（bona fide）組換えウィルスを得ることができなかった。我々は、ｒＭＶＡゲノムの欠失３（ｄｅｌ３）部位内に安定に結合したＫ１Ｌ配列のみを有するＭＶＡを単離したが、安定に生育するウィルス継代は得られなかった。改善策として、我々は、改良した新規Ｋ１Ｌ選択技術の使用を決定し、ＮＳ３遺伝子配列を新規ＭＶＡプラスミドｐIII-ΔＨＲ-Ｐ７．５にクローニングし、相同組換えによる発現カセットの結合のために、レセプターウィルスとしてＫ１Ｌフリーの改善された単離ＭＶＡ-IInewを使用した。戦略の変更により、数回のプラーク精製ステップのみで所望の組換えウィルスＭＶＡ-ＨＣＶ／ＮＳ３を生産し単離することができた。図３は、ちょうどＭＶＡゲノムｄｅｌ３部位でのＮＳ３ ＯＲＦの適切な挿入および完全なＫ１Ｌ選択マーカーカセットの除去をモニターするＰＣＲ分析（左図）によるｒＭＶＡのin vitro特性を示す。さらに、新たに生産された組換えＭＶＡ-ＨＣＶ／ＮＳ３は、ウェスタンブロット分析（図３、右図）に示すように、ＣＥＦ細胞の感染において、適切なＮＳ３ポリペプチドを生産できる。ＭＶＡ-ＨＣＶ／ＮＳ３は、現在、ヒトのＨＣＶ感染に対する予防および／または治療の改善のための、有望な候補ベクターウィルスとして評価できる。重要な新規のｒＭＶＡ構築物は、標準方法によって作製することは不可能でないとしても非常に困難であると推測されるが、本特許出願に開示された我々の改善した方法論により、実際に重要な新規のｒＭＶＡ構築物を得ることが今や可能となった。
【００６２】
参考文献
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【００６３】
【表１】
【００６４】
表１：通常、新規ＭＶＡおよびトランスファープラスミドを使用した組換え効率
パーセンテージは、ｇｆｐ発現フォーカスと光顕微鏡下で可視のフォーカスとの非として算出した。かっこ内の数値は、各サンプルの２つの異なる１０倍希釈についてのカウントしたフォーカスの絶対値を示し、３回の試験の表示である。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１Ａ】ＭＶＡゲノム（ＨｉｎｄIII制限地図）およびベクタープラスミドｐIIIｄＨＲのマップ図
【図１Ｂ】ＭＶＡゲノムからのＫ１Ｌ配列の除去を示すであって、上図は、ＭＶＡゲノムのＨｉｎｄIII制限地図、下図は、Ｋ１Ｌ遺伝子の断片を含む、ＭＶＡゲノム内の欠損II部位でのＯＲＦｓを示す。
【図１Ｃ】新規ＭＶＡトランスファープラスミドｐIIIΔＨＲを示す図。
【図２】ＨＣＶ nonstructuralタンパク質３の遺伝子配列を含む組換えＭＶＡの構築およびゲノム構造を示す図。
【図３】ＭＶＡ-Ｐ７．５-ＮＳ３のin vitro特性を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＶＡ変異体であって、ＭＶＡゲノムにおけるＫ１Ｌ遺伝子配列およびそのプロモーター配列、または、前記これらの配列の機能性部分が、不活性であり、好ましくは欠失または変異により不活性である、ＭＶＡ変異体。
【請求項２】
宿主細胞であって、請求項１記載のＭＶＡで感染された宿主細胞。
【請求項３】
宿主細胞が、真核細胞である、請求項２記載の宿主細胞。
【請求項４】
請求項３記載の真核細胞であって、トリ線維芽細胞、ウズラ線維芽細胞、ＱＴ-９細胞、ＢＨＫ-２１細胞、ＢＳ-Ｃ-１細胞、ＭＡ１０４細胞、ＣＶ-１細胞、ベロ細胞、ＭＲＣ-５細胞、Ｂ-細胞またはヒト一次細胞(例えば、一次線維芽細胞、樹状細胞)である細胞。
【請求項５】
ＤＮＡベクター構築物であって、ワクシニアウィルス(ＶＶ)Ｋ１Ｌ遺伝子をコードする配列、または、機能的に同等な遺伝子をコードする配列を含むＤＮＡベクター構築物。
【請求項６】
さらに外来タンパク質またはその機能性部分をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項５記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項７】
外来タンパク質が、治療ポリペプチドおよび病原性物質ならびにそれらの機能性部分からなる群由来の異種タンパク質である、請求項６記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項８】
治療ペプチドが、例えば、抗体のポリペプチド、ケモカイン、サイトカインまたはインターフェロンのような分泌タンパク質からなる群由来のペプチドである、請求項７記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項９】
病原性物質が、腫瘍細胞、腫瘍細胞関連抗原ならびにこれらの機能性部分、および、ウィルス、細菌、原虫および寄生虫からなる群由来である請求項８記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１０】
ウィルスが、インフルエンザウィルス、はしか（measles）ならびに呼吸シンシチウム（respiratory syncytial）ウィルス、デング熱ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、ヒト肝炎ウィルス、ヘルペスウィルスおよびパピローマウィルスからなる群から選択される、請求項８記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１１】
原虫がPlasmodium falciparumである、請求項９記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１２】
細菌が、結核の原因であるMycobacteriaである、請求項９記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１３】
腫瘍関連抗原、例えば、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク１ならびに２のようなメラノーマ関連分化抗原、ＭＡＧＥ−１、−２、−３ならびにＢＡＧＥのような腫瘍精巣抗原、および、Ｈｅｒ-２／ｎｅｕ、ＭＵＣ-１ならびにｐ５３のような、ガンにおいて過剰発現する非変異共用（non-mutated shared）抗原からなる群から選択される、請求項９記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１４】
ＶＶ Ｋ１Ｌおよび外来タンパク質コード領域が、それぞれ、ＭＶＡゲノム内の非必須部位をフランキングするＤＮＡ配列によってフランキングされている、請求項６〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１５】
非必須部位が、ＭＶＡゲノムにおける欠失III部位、ＭＶＡゲノム内でＫ１Ｌを遺伝子工学で欠失させた部位、または、請求項１記載の変異ＭＶＡゲノム内の非必須部位である、請求項１４記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１６】
ベクターが、
・ ＶＶのＫ１Ｌコード配列を含むＫ１Ｌマーカー遺伝子および転写ユニット、好ましくは、その真正プロモーターの転写制御配列を含む、
・ 相同組換えによって組換えＭＶＡから前記マーカーを後に除去するための、Ｋ１Ｌマーカー遺伝子をフランキングする２つのＤＮＡ配列、好ましくは、２つの同一挿入ＤＮＡ断片（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬａｃＺ由来）、
・ クローニングサイト、好ましくは、任意に異種遺伝子が挿入されるマルチプルクローニングサイト、
・ ワクシニアウィルスに特異的な転写のためのプロモーター、好ましくはワクシニアウィルス誘導プロモーター、またはワクシニアウィルスに特異的な転写を可能にする異種ポックスウィルスプロモーター、または、ワクシニアウィルスに特異的な転写を可能とする合成プロモーター、
という機能性関連組成（functionally linked components）を含み、
前記組成が、請求項１記載の変異ＭＶＡゲノム内の非必須部位、ＭＶＡゲノム内の欠失III部位、または、ＭＶＡゲノム内のＫ１Ｌを遺伝子工学で欠失させた部位への、外来遺伝子の標的挿入に必須である２つのＭＶＡ-ＤＮＡ配列によりフランキングされている、請求項５〜１５のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１７】
構築物がプラスミドである、請求項５〜１６のいずれか一項に記載のDNAベクター構築物。
【請求項１８】
組換えＭＶＡの生産方法であって、
請求項１記載のＭＶＡ変異体または野生型ＭＶＡにより、ＭＶＡ宿主細胞を感染させる工程、
請求項５〜１７のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター構築物で、前記宿主細胞をトランスフェクトする工程、および、
ウサギ腎臓ＲＫ-１３細胞、または、ＭＶＡもしくは請求項１記載の変異ＭＶＡの増殖生育を可能とするＫ１Ｌ遺伝子機能を本質的に必要とする他の細胞の生育により、回復したＭＶＡを選択する工程を含む組換えＭＶＡの生産方法。
【請求項１】
ＭＶＡ変異体であって、ＭＶＡゲノムにおけるＫ１Ｌ遺伝子配列およびそのプロモーター配列、または、前記これらの配列の機能性部分が、不活性であり、好ましくは欠失または変異により不活性である、ＭＶＡ変異体。
【請求項２】
宿主細胞であって、請求項１記載のＭＶＡで感染された宿主細胞。
【請求項３】
宿主細胞が、真核細胞である、請求項２記載の宿主細胞。
【請求項４】
請求項３記載の真核細胞であって、トリ線維芽細胞、ウズラ線維芽細胞、ＱＴ-９細胞、ＢＨＫ-２１細胞、ＢＳ-Ｃ-１細胞、ＭＡ１０４細胞、ＣＶ-１細胞、ベロ細胞、ＭＲＣ-５細胞、Ｂ-細胞またはヒト一次細胞(例えば、一次線維芽細胞、樹状細胞)である細胞。
【請求項５】
ＤＮＡベクター構築物であって、ワクシニアウィルス(ＶＶ)Ｋ１Ｌ遺伝子をコードする配列、または、機能的に同等な遺伝子をコードする配列を含むＤＮＡベクター構築物。
【請求項６】
さらに外来タンパク質またはその機能性部分をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項５記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項７】
外来タンパク質が、治療ポリペプチドおよび病原性物質ならびにそれらの機能性部分からなる群由来の異種タンパク質である、請求項６記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項８】
治療ペプチドが、例えば、抗体のポリペプチド、ケモカイン、サイトカインまたはインターフェロンのような分泌タンパク質からなる群由来のペプチドである、請求項７記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項９】
病原性物質が、腫瘍細胞、腫瘍細胞関連抗原ならびにこれらの機能性部分、および、ウィルス、細菌、原虫および寄生虫からなる群由来である請求項８記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１０】
ウィルスが、インフルエンザウィルス、はしか（measles）ならびに呼吸シンシチウム（respiratory syncytial）ウィルス、デング熱ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、ヒト肝炎ウィルス、ヘルペスウィルスおよびパピローマウィルスからなる群から選択される、請求項８記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１１】
原虫がPlasmodium falciparumである、請求項９記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１２】
細菌が、結核の原因であるMycobacteriaである、請求項９記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１３】
腫瘍関連抗原、例えば、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク１ならびに２のようなメラノーマ関連分化抗原、ＭＡＧＥ−１、−２、−３ならびにＢＡＧＥのような腫瘍精巣抗原、および、Ｈｅｒ-２／ｎｅｕ、ＭＵＣ-１ならびにｐ５３のような、ガンにおいて過剰発現する非変異共用（non-mutated shared）抗原からなる群から選択される、請求項９記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１４】
ＶＶ Ｋ１Ｌおよび外来タンパク質コード領域が、それぞれ、ＭＶＡゲノム内の非必須部位をフランキングするＤＮＡ配列によってフランキングされている、請求項６〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１５】
非必須部位が、ＭＶＡゲノムにおける欠失III部位、ＭＶＡゲノム内でＫ１Ｌを遺伝子工学で欠失させた部位、または、請求項１記載の変異ＭＶＡゲノム内の非必須部位である、請求項１４記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１６】
ベクターが、
・ ＶＶのＫ１Ｌコード配列を含むＫ１Ｌマーカー遺伝子および転写ユニット、好ましくは、その真正プロモーターの転写制御配列を含む、
・ 相同組換えによって組換えＭＶＡから前記マーカーを後に除去するための、Ｋ１Ｌマーカー遺伝子をフランキングする２つのＤＮＡ配列、好ましくは、２つの同一挿入ＤＮＡ断片（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬａｃＺ由来）、
・ クローニングサイト、好ましくは、任意に異種遺伝子が挿入されるマルチプルクローニングサイト、
・ ワクシニアウィルスに特異的な転写のためのプロモーター、好ましくはワクシニアウィルス誘導プロモーター、またはワクシニアウィルスに特異的な転写を可能にする異種ポックスウィルスプロモーター、または、ワクシニアウィルスに特異的な転写を可能とする合成プロモーター、
という機能性関連組成（functionally linked components）を含み、
前記組成が、請求項１記載の変異ＭＶＡゲノム内の非必須部位、ＭＶＡゲノム内の欠失III部位、または、ＭＶＡゲノム内のＫ１Ｌを遺伝子工学で欠失させた部位への、外来遺伝子の標的挿入に必須である２つのＭＶＡ-ＤＮＡ配列によりフランキングされている、請求項５〜１５のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター構築物。
【請求項１７】
構築物がプラスミドである、請求項５〜１６のいずれか一項に記載のDNAベクター構築物。
【請求項１８】
組換えＭＶＡの生産方法であって、
請求項１記載のＭＶＡ変異体または野生型ＭＶＡにより、ＭＶＡ宿主細胞を感染させる工程、
請求項５〜１７のいずれか一項に記載のＤＮＡベクター構築物で、前記宿主細胞をトランスフェクトする工程、および、
ウサギ腎臓ＲＫ-１３細胞、または、ＭＶＡもしくは請求項１記載の変異ＭＶＡの増殖生育を可能とするＫ１Ｌ遺伝子機能を本質的に必要とする他の細胞の生育により、回復したＭＶＡを選択する工程を含む組換えＭＶＡの生産方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００６−５１７７９５（Ｐ２００６−５１７７９５Ａ）
【公表日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０１８７９（Ｐ２００６−５０１８７９）
【出願日】平成１６年２月１８日（２００４．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００１５５４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７４４９３
【国際公開日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【出願人】（５９７１２１３８２）ゲーエスエフ フォーシュングスツェントラム フュール ウンヴェルト ウント ゲズントハイト ゲーエムベーハー (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年８月３日（２００６．８．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年２月１８日（２００４．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００１５５４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７４４９３
【国際公開日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【出願人】（５９７１２１３８２）ゲーエスエフ フォーシュングスツェントラム フュール ウンヴェルト ウント ゲズントハイト ゲーエムベーハー (4)
【Ｆターム（参考）】
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