結晶１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの製造法
【課題】１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの結晶の製造方法を提供すること。
【解決手段】１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの水溶液から結晶１，５−Ｄ−アンヒドログルシトール結晶を析出させる、結晶１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの製造方法。
【解決手段】１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの水溶液から結晶１，５−Ｄ−アンヒドログルシトール結晶を析出させる、結晶１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は結晶１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，５−Ｄ−アンヒドログルシトール（以下１，５−ＡＧ）は、グルコースの１位の水酸基が還元された構造をもつポリオールであり、多くの動植物により生合成されていることから、多くの食品中に含まれる物質である。１，５−ＡＧは動物体内で代謝的に安定であり、経口摂取した１，５−ＡＧのうち、４８時間内に二酸化炭素として呼気中に排出される量は全体の１％以下であるとの報告があり（非特許文献１参照）、低カロリーあるいはノンカロリー甘味料として利用できる。更に 産業上、研究試薬や臨床検査試薬として利用されている。
１，５−ＡＧの調製法としてはβ−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテートからの化学合成法が報告されている（非特許文献２参照）。その合成法はβ−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテートをエーテルに溶解後、臭化水素による臭素化、水素化アルミニウムリチウムによる脱アセチル化を行った後にエタノール中で結晶化されている。
【０００３】
その他の調製法としてプロテア種の葉から１，５−ＡＧをエタノール、ヘキサン等の有機溶媒で抽出、単離、晶析して１，５−ＡＧを調製する方法も報告されている（非特許文献３参照）。
これらの化学合成法や植物からの抽出法は、プロセスが多段的で煩雑であることや、更に晶析にエタノールやヘキサン等の有機溶媒を用いており、食品の製造方法としては安全性の点からも疑問が残る。
これらの問題点を解決する手段として、製造プロセスが簡略で、かつエーテル等の有機溶媒を用いない製造法が求められている。
１，５−ＡＧは大腸菌（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ ）により生合成されることが報告されている（非特許文献１参照）。しかし、大腸菌（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ ）による生合成量は工業生産を目的としておらず、大腸菌の培地中での１，５−ＡＧ生成量は大腸菌培養の培地１Ｌあたりに数マイクログラム程度であり、工業生産に利用できるものではない。
【０００４】
１，５−ＡＧのその他の調製法として、パラディウム触媒存在下での１，５−ＡＦへの水素添加法が報告されているが（非特許文献４参照）、１，５−ＡＧのみならずその他の反応生成物が生じ、１，５−ＡＧは反応生成物の２割程度であり効率的に調製することが困難である。また、１，５−ＡＧの晶出に関しての記載はない。
１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース（以下１，５−ＡＦ）は、澱粉などのα−１，４−グルカンをα−１，４−グルカンリアーゼで分解することによって調製できる糖質であり、近年、安価に大量に生産できる技術が考案された（特許文献１参照）。この１，５−ＡＦを出発物質とし、製造プロセスが簡便で、更にエーテル等の有機溶媒を用いずに１，５−ＡＧを製造する方法の開発と食品産業での利用を考えて、液状の製品形態とは別に取り扱いのし易い粉末状製品の製造方法の開発も望まれる。しかし、これらに関する技術情報は、知られていない。そこでエタノールやヘキサンなどの有機溶媒を用いない、１，５−ＡＧの結晶化方法について検討した。
【非特許文献１】生化学 第６９巻 第１２号， ｐｐ．１３６１−１３７２，（１９９７）
【非特許文献２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７２，４５４７−４５５３（１９５０）
【非特許文献３】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ９，１９５９−１９６０ （１９８３）
【非特許文献４】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３７ （２００２） ８７３−８９０
【特許文献１】特開２００５−１６８４５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、結晶１，５−ＡＧの製造方法を提供することにある。
【０００６】
本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、１，５−ＡＧについて鋭意研究を重ねた結果、１，５−ＡＧを含む水溶液から、１，５−ＡＧの結晶を析出させる方法を見出し、その究明事実に基づいて本発明に到達した。
従来の１，５−ＡＧの結晶化方法では、エタノールやヘキサンなどの有機溶媒を使用して１，５−ＡＧを析出させていたのに対し、本発明の結晶化方法は水溶液から析出させることを特徴としており、これまでの報告とは全く異なった製法である。
１，５−ＡＧは、多くの穀物や食品に含まれている物質であるが、１，５−ＡＦからの微生物による変換により簡単なプロセスで大量に製造でき、さらに１，５−ＡＧ水溶液から１，５−ＡＧの結晶を容易に且つ大量に析出させる技術を見出した。
すなわち、本発明の上記目的および利点は、１，５−ＡＧおよび水を含む混合物から結晶１，５−ＡＧを析出させることを特徴とする、結晶１，５−ＡＧの製造方法によって達成される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法によれば、１，５−ＡＧおよび水を含む混合物から容易に結晶１，５−ＡＧを製造することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の結晶化方法では結晶化の原液として、１，５−ＡＧおよび水を含んで成る混合物を使用する。１，５−ＡＧおよび水以外に含まれるものとしては糖類などの有機物、塩類、水可溶の有機溶媒などであるが特に制限されない。当該結晶原液は、１，５−ＡＧの過飽和溶液であって、結晶１，５−ＡＧが析出すればよい。ちなみに、１，５−ＡＧが９９.７重量％の１，５−ＡＧ結晶粉末の水１００ｇに対する溶解度は、１５℃のとき８１．９ｇ、３５℃のとき１５１．５ｇ、４７℃のとき１８５．２ｇであった。
結晶原液とする１，５−ＡＧの製造方法自体は特に限定されないが、１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する能力を持つ微生物と接触せしめて１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換して製造する方法などを挙げることができる。
１，５−ＡＧの原料となる１，５−ＡＦはオゴノリなどの紅藻から抽出・精製したα−１，４−グルカンリアーゼを澱粉あるいは澱粉分解物に作用させることにより得ることができる。
【００１０】
かくして調製された１，５−ＡＦは、本発明の製造法で使用する場合は、未分解の原料を含むもの（例えば、１，５−ＡＦ純度４０％標品など）であってもよい。ここでいう純度とは固形分中の１，５−ＡＦの重量百分率を示す。また、さらにカラムクロマトグラフィーにより、デキストリンやブドウ糖などの他の成分を除去して得られる標品、例えば、１，５−ＡＦ純度９０％以上の高純度品であってもよい。
１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する能力をもつ微生物としては、具体的にはサッカロマイセス属、サッカロマイコデス属、ウィリオプシス属、ブレタノマイセス属、カンディダ属、ガラクトマイセス属、ピティア属、チゴサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ティレティオプシス属、ステリマトマイセス属、クルツマノセス属、リューコスポリディウム属、エリスロバシディウム属、フィロバシディウム属、トリコスポロン属、ココヴァエラ属、フェロマイセス属、ブレロマイセス属、クリプロコッカス属、ツチヤエヤ属及びオーレオバシディウム属などが挙げられる。
【００１１】
さらに具体的にはサッカロマイセス・セレビジエ、サッカロマイコデス・ルディジー、ウィリオプシス・プラテンシス、ブレタノマイセス・ブラキシレンシス、カンディダ・ヴァリダ、カンディダ・ケフィア、ガラクトマイセス・チトリ−アウランティ−、ピティア・アノマラ、チゴサッカロマイセス・ルキシ−、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ティレティオプシス・ワシントネンシス、ステリマトマイセス・ハロフィラス、クルツマノマイセス・ネクタイレイ、リューコスポリディウム・スコッティ、エリスロバシディウム・ハセガワヌラン、フィロバシディウム・フロリフォルメ、トリコスポロン・キュータネウム、ココヴァエラ・タイランディカ、フェロマイセス・ポリボーラス、ブレロマイセス・アルブス、クリプロコッカス・アルビダス、ツチヤエヤ・ウィングフィールディ及びオーレオバシディウム・ミクロスティクタムなどが挙げられる。
さらに、本発明に用いられる微生物は具体的には、以下のような菌株が挙げられる。
【００１２】
サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０、サッカロマイコデス・ルディジー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉ）ＮＢＲＣ １０４３、ウィリオプシス・プランテンシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ １１０１５、ブレタノマイセス・ブルキシレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ） ＮＢＲＣ ０６２８、カンディダ・ヴァリダ（Ｃａｎｄｉｄａ ｖａｌｉｄａ） ＮＢＲＣ ０１５９、ＮＢＲＣ １１０１５、カンディダ・ケフィア（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ） ＮＢＲＣ ０４３２、ガラクトマイセス・チトリ−アウランティー（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｔｒｉ−ａｕｒａｎｔｉｉ） ＮＢＲＣ １０８２１ 、ピティア・アノマラ （Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ） ＮＢＲＣ ０７０７、チゴサッカロマイセス・ルキシ−（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）ＮＢＲＣ １９１４、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＢＲＣ １６０８、ティレティオプシス・ワシントネンシス（Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ ｗａｓｈｉｇｔｏｎｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ ６８３１、ステリマトマイセス・ハロフィラス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＢＲＣ １８４４ 、クルツマノマイセス・ネクタイレイ（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ ｎｅｃｔａｉｒｅｉ） ＮＢＲＣ １０１１８、リューコスポリディウム・スコッティ（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｃｏｔｔｉｉ）ＮＢＲＣ １２１１、エリスロバシディウム・ハセガワヌラン（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｈａｓｅｇａｗａｎｕｒｎ） ＮＢＲＣ １０５８ 、フィロバシディウム・フロリフォルメ（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｆｌｏｒｉｆｏｒｍｅ）ＮＢＲＣ １６０３、トリコスポロン・キュータネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）ＮＢＲＣ １１９８、ココヴァエラ・タイランディカ（Ｋｏｃｋｏｖａｅｌｌａ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃａ）ＮＢＲＣ １０５２１、フェロマイセス・ポリボーラス（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｂｏｒｕｓ） ＮＢＲＣ １０１２０、ブレロマイセス・アルブス（Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ）ＮＢＲＣ １１９２、クリプロコッカス・アルビダス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ） ＮＢＲＣ ０４３４、ツチヤエヤ・ウィングフィールディ（Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ ｗｉｎｇｆｉｅｌｄｉｉ） ＮＢＲＣ １０２０４及びオーレオバシディウム・ミクロスティクタム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｍｉｃｒｏｓｔｉｃｔｕｍ） ＮＢＲＣ ３２０７０等である。これら菌株は、デパートメント・オブ・バイオテクノロジー ナショナル・インシュティテュ−ト・オブ・テクノロジー・アンド・エバーリュエント（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ） 住所 Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ａｇｅｎｃｙ ５−８，Ｋａｚｕｓａ−ｋａｍａｔａｒｉ ２−ｃｈｏｍｅ，Ｋｉｓａｒａｚｕ−ｓｈｉ，Ｃｈｉｂａ，２９２−０８１８ Ｊａｐａｎ） から入手可能である。但し、１，５−ＡＧの製法に用いられる微生物は、１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する能力を有する微生物であれば全てが使用可能であり、上記微生物に限定されるものではない。
【００１３】
１，５−ＡＧの製法に用いられる微生物は、前記の微生物より紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等による変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組み換え法などの遺伝学的手法により誘導される遺伝子組み換え株などいずれの株であっても良い。
【００１４】
微生物培養のための１，５−ＡＦを含む培養液は、通常の炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じて有機栄養源を含む培地を用いることができる。炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グリセロール等のアルコール類、有機酸、その他が適宜使用される。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸等を含有する酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他などが適宜使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カルシウムイオン、その他などが適宜使用される。その培地に、別にフィルター滅菌した１，５−ＡＦ水溶液を添加して１，５−ＡＧ調製用の培地を調製することができる。
培養条件は特別な制限もなく、例えば好気条件下でｐＨ３〜７及び温度２０〜４０℃の範囲で、適当なｐＨと温度を保ちながら２〜７日程度培養を行うことができる。
【００１５】
このようにして培養液中に生成した１，５−ＡＧを通常実施される周知の手段で培養物より分離、精製する。具体的には、遠心分離、珪藻土ろ過で菌体及び固形物を除去した後、活性炭で脱色、イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮してシロップ状とする。この際、微生物の培養条件によって１，５−ＡＧの生成率も異なる。したがって、イオン交換や吸着、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分離などの操作を適宜組み合わせ、ある程度の他の成分を除去して１，５−ＡＧの純度を高めておくことが望ましい。
【００１６】
本発明の結晶化方法において使用される水溶液の１，５−ＡＧ濃度（％）は１，５−ＡＧ純度によっても異なるが、例えば、濃度が２５〜９５％、好ましくは３５〜９０％、より好ましくは４５〜８５％であればよい。
１，５−ＡＧ純度の分析方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を用いて行う。詳細条件については以下に示す。
分離カラム：ＳｈｏｄｅｘＳＰ８１０−ＭＣＩＧＥＬＣＫ０８Ｓ（昭和電工（株）製、三菱化学（株）製）、移動相：蒸留水、流速：１．０ｍＬ／分、カラム温度：４０℃、検出：示差屈折率検出器、サンプル供与量：２０μＬ。以上の分析条件で得られたクロマトグラムを単純面積百分率で解析し得られた１，５−ＡＧのピーク面積の割合を１，５−ＡＧ純度とした。
【００１７】
具体例として上記の方法で分析した市販標準試薬の１，５−ＡＧと１，５−ＡＦを含む培地でサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０を５日間培養した培養液の測定結果を（図１）に示す。また、Ｂｘの値は、市販の屈折計を用いて測定することができ、具体的には、アタゴ（株）製のデジタル屈折計を使用して測定した。
ここでいう１，５−ＡＧ濃度は、ＨＰＬＣで測定した１，５−ＡＧ純度にＢｘの測定値の１００分の１を乗じた値である。
【００１８】
本発明の結晶化方法において、結晶原液から結晶１，５−ＡＧを析出させる際の温度条件は、当該溶液の濃度や１，５−ＡＧ純度により異なるが、例えば−１０〜９０℃、好ましくは０〜８０℃、より好ましくは１０〜７０℃である。結晶化後の分蜜時の作業効率などを考慮すると、２０〜６０℃であることがより好ましい。この際、より多くの１，５−ＡＧ結晶を得るために、結晶原液の温度を下降させながら結晶原液の過飽和状態を保ち、結晶化を行うこともできる。
本発明の方法において、水溶液を濃縮しながら１，５−ＡＧ濃度を、好ましくは５０〜９０％、さらに好ましくは５５〜８５％、より好ましくは６５〜７５％に保持して結晶化原液の過飽和状態を保ちつづけて結晶化させる方法を行うこともできる。
【００１９】
また、より効率的に結晶化を行うために、結晶化原液に種結晶を共存させることもできる。
【００２０】
本発明における種結晶としては、例えば、１，５−ＡＧ結晶自体、あるいは１，５−ＡＧの結晶が混合したマスキットを用いることができる。また、種結晶を共存させる方法としては特に制限されないが、例えば、結晶原液に該種結晶を添加する工程をとることもできあるいは、予め結晶が混合しているマスキットの状態のものを結晶原液として使用することであってもよい。
さらに、結晶をマスキットより分蜜して得られた母液を使用して再度上述の種結晶を共存させて結晶１，５−ＡＧを製造することも可能である。
結晶化に用いる装置としては温度調整および減圧操作が可能な回分式の結晶化装置や連続的に温度制御するなどの装置が利用できるがこの装置に限定されるものではない。
【００２１】
本発明の方法により析出した１，５−ＡＧの結晶は、マスキットより分蜜後、乾燥工程を経て粉末品として得ることができる。
分蜜方法は、１，５−ＡＧ結晶を採取できればよく、通常用いられる方法をとることができ特に制限されない。例えば、マスキットをバスケット型遠心脱水機に供し、結晶１，５−ＡＧと蜜（母液）とを分離し、必要に応じて冷水を噴霧して洗浄することも可能である。
本発明の製造方法により得られた結晶１，５−ＡＧは、粉末とすることができるので、食品として１，５−ＡＧを含むシロップとは異なった使用方法で利用可能である。
【実施例】
【００２２】
実施例１
以下、実施例にて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
以後の説明中に用いる％は、特に断りがない限り容量（ｗ／ｖ）％である。グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ｐＨ６．０の培地を１Ｌの培養フラスコに５００ｍＬずつ分注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。
【００２３】
上記培地に、斜面培地（グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、寒天粉末１．５％、ｐＨ６．０）で培養した：サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０を１白金耳採取し、２５℃、３日間振盪培養した。これを種培養液とした。上記と同じ組成を有する培地５Ｌを容量１０Ｌのミニジャーファーメンターに入れ、孔径０．４５μｍフィルターを通し除菌処理した１，５−ＡＦ水溶液を最終濃度２．５％となるように添加した。その１，５−ＡＦを含む培地に、前記種培養液５００ｍＬを加え、攪拌速度２００ｒｐｍ、通気量１Ｌ／分、２５℃で５日間振盪培養して１，５−ＡＧを含む培養液を得た（図１）。その培養液から遠心分離（３０００ｒｐｍ−１０分）と珪藻土ろ過で菌体及び固形物を除去した後、活性炭（蒸気炭）とイオン交換樹脂（ＳＫ−１Ｂ：ＳＡ１０ＡＰ＝２：１ 三菱化学（株）製）で脱色、脱塩を行った。この精製した溶液を濃縮後、Ｎａ＋型イオン交換樹脂（ＵＢＫ５３０ 三菱化学（株）製）を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーで１，５−ＡＧを分離し、純度９６．５％の１，５−ＡＧ水溶液が得られた。
【００２４】
この水溶液をナス型フラスコに移して、エバポレータでＢｘ４５％まで濃縮した。４℃で２４時間冷却し、結晶を析出させその結晶を更に蒸留水に溶解し、先の操作と同様に再結晶化させて、多面体様の白色結晶を４．５ｇ得た。この結晶をミリ−Ｑ水に溶解しＨＰＬＣで分析した結果、単一なシンメトリーピークとなり、この結晶が純度９９．９％の１，５−ＡＧ単一成分であることが確認できた。更に１Ｈ−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳで以下の条件で分析し物質同定を行った。
【００２５】
１Ｈ−ＮＭＲ：市販標準試薬の１，５−ＡＧと先の白色結晶を、観測周波数：４９９．８ＭＨｚ、溶媒Ｄ２Ｏ、濃度１０ｍｇ／７００μＬ、基準ＴＳＰ−ｄ４ （（ＣＨ３）３ＣＤ２ＣＤ２ＣＯＯＮａ）、温度：２５℃、観測幅：５ＫＨｚ、データ点：６４Ｋ（１２８Ｋでフーリエ変換）、パルス幅：３０°、パルス繰り返し時間：１０ｓｅｃ、積算回数：８回で測定した結果、市販標準試薬の１，５−ＡＧと先の白色結晶は同一スペクトルを示した。（図２）
ＥＳＩ−ＭＳ：先の白色結晶をミリ−Ｑ水に５０ｎｍｏｌ／ｍｌとなるように溶解し、最終濃度３０％（Ｖ／Ｖ）となるようにメタノールを添加した。その後、０．１％（Ｖ／Ｖ）ギ酸を添加してイオン化電圧：８５０Ｖで質量分析を実施した結果、イオン質量電荷比：１６５（ｍ／ｚ）のスペクトルを得た。（図３）これは、ｍ＝１６４（１，５−ＡＧの質量）＋１（プロトン１個分の質量）、ｚ＝１（電荷数）である。 ｍ／ｚ ＝ （１６４ ＋ １）／１ ＝ １６５となり、先のＨＰＬＣ（図１）、１Ｈ−ＮＭＲ（図２）、ＥＳＩ−ＭＳ（図３）の結果から、白色結晶が１，５−ＡＧであると同定された。
【００２６】
実施例２
実施例１で得られた１，５−ＡＧ濃度が６５．０％の水溶液５．２６ｇナス型フラスコに入れ、５５℃の恒温槽で温度が一定になるまで保温した。次に、種結晶として１，５−ＡＧ結晶０．０５ｇを３回に分けて添加した。
この種結晶を含む水溶液を５５℃から２７℃まで４８時間かけて冷却し、１，５−ＡＧを結晶化させた。この結晶を濾紙で回収して冷水で洗浄後、減圧乾燥機にて２４時間乾燥させ、０．６０６ｇの白色結晶を得た。得られた結晶のＸ線構造解析を行った。結晶をグラスファイバー先端に取り付け表１の条件でＸ線回折の測定を行った。
【００２７】
【表１】
【００２８】
測定した結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
実施例３
クロマト分離で得られた、１，５−ＡＧ水溶液をナス型フラスコに入れ濃縮し１，５−ＡＧ濃度５５．８％の水溶液を１６．０ｇを得た。６０℃の恒温槽で温度が一定になるまで保温し、実施例１で得られた１，５−ＡＧ結晶を種結晶として０．０１５ｇ添加した。６０℃から４５℃まで１時間かけて冷却して１，５−ＡＧを結晶化させた。この結晶を濾紙で回収して冷水で洗浄後、減圧乾燥機にて２４時間乾燥させ、０．６０８ｇの白色結晶を得た。
【００３１】
実施例４
１，５−ＡＧ濃度６５％水溶液２８５ｇを１，０００ｍｌのナス型フラスコに入れ、４５℃の恒温槽で温度が一定になるまで保温した。実施例１で得られた１，５−ＡＧ結晶を種結晶として０．３３ｇ添加し、エバポレータで減圧濃縮することで１，５−ＡＧを結晶化させた。この結晶を濾紙で回収して冷水で洗浄後、減圧乾燥機にて２４時間乾燥させ、４７．４ｇの白色結晶を得た。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例１で得られた１，５−ＡＧを含む培養液の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）図。
【図２】実施例１で得られた１，５−ＡＧ結晶の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図。
【図３】実施例１で得られた１，５−ＡＧ結晶のＥＭＩ−ＭＳ図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は結晶１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，５−Ｄ−アンヒドログルシトール（以下１，５−ＡＧ）は、グルコースの１位の水酸基が還元された構造をもつポリオールであり、多くの動植物により生合成されていることから、多くの食品中に含まれる物質である。１，５−ＡＧは動物体内で代謝的に安定であり、経口摂取した１，５−ＡＧのうち、４８時間内に二酸化炭素として呼気中に排出される量は全体の１％以下であるとの報告があり（非特許文献１参照）、低カロリーあるいはノンカロリー甘味料として利用できる。更に 産業上、研究試薬や臨床検査試薬として利用されている。
１，５−ＡＧの調製法としてはβ−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテートからの化学合成法が報告されている（非特許文献２参照）。その合成法はβ−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテートをエーテルに溶解後、臭化水素による臭素化、水素化アルミニウムリチウムによる脱アセチル化を行った後にエタノール中で結晶化されている。
【０００３】
その他の調製法としてプロテア種の葉から１，５−ＡＧをエタノール、ヘキサン等の有機溶媒で抽出、単離、晶析して１，５−ＡＧを調製する方法も報告されている（非特許文献３参照）。
これらの化学合成法や植物からの抽出法は、プロセスが多段的で煩雑であることや、更に晶析にエタノールやヘキサン等の有機溶媒を用いており、食品の製造方法としては安全性の点からも疑問が残る。
これらの問題点を解決する手段として、製造プロセスが簡略で、かつエーテル等の有機溶媒を用いない製造法が求められている。
１，５−ＡＧは大腸菌（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ ）により生合成されることが報告されている（非特許文献１参照）。しかし、大腸菌（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ ）による生合成量は工業生産を目的としておらず、大腸菌の培地中での１，５−ＡＧ生成量は大腸菌培養の培地１Ｌあたりに数マイクログラム程度であり、工業生産に利用できるものではない。
【０００４】
１，５−ＡＧのその他の調製法として、パラディウム触媒存在下での１，５−ＡＦへの水素添加法が報告されているが（非特許文献４参照）、１，５−ＡＧのみならずその他の反応生成物が生じ、１，５−ＡＧは反応生成物の２割程度であり効率的に調製することが困難である。また、１，５−ＡＧの晶出に関しての記載はない。
１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース（以下１，５−ＡＦ）は、澱粉などのα−１，４−グルカンをα−１，４−グルカンリアーゼで分解することによって調製できる糖質であり、近年、安価に大量に生産できる技術が考案された（特許文献１参照）。この１，５−ＡＦを出発物質とし、製造プロセスが簡便で、更にエーテル等の有機溶媒を用いずに１，５−ＡＧを製造する方法の開発と食品産業での利用を考えて、液状の製品形態とは別に取り扱いのし易い粉末状製品の製造方法の開発も望まれる。しかし、これらに関する技術情報は、知られていない。そこでエタノールやヘキサンなどの有機溶媒を用いない、１，５−ＡＧの結晶化方法について検討した。
【非特許文献１】生化学 第６９巻 第１２号， ｐｐ．１３６１−１３７２，（１９９７）
【非特許文献２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７２，４５４７−４５５３（１９５０）
【非特許文献３】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ９，１９５９−１９６０ （１９８３）
【非特許文献４】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３７ （２００２） ８７３−８９０
【特許文献１】特開２００５−１６８４５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、結晶１，５−ＡＧの製造方法を提供することにある。
【０００６】
本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、１，５−ＡＧについて鋭意研究を重ねた結果、１，５−ＡＧを含む水溶液から、１，５−ＡＧの結晶を析出させる方法を見出し、その究明事実に基づいて本発明に到達した。
従来の１，５−ＡＧの結晶化方法では、エタノールやヘキサンなどの有機溶媒を使用して１，５−ＡＧを析出させていたのに対し、本発明の結晶化方法は水溶液から析出させることを特徴としており、これまでの報告とは全く異なった製法である。
１，５−ＡＧは、多くの穀物や食品に含まれている物質であるが、１，５−ＡＦからの微生物による変換により簡単なプロセスで大量に製造でき、さらに１，５−ＡＧ水溶液から１，５−ＡＧの結晶を容易に且つ大量に析出させる技術を見出した。
すなわち、本発明の上記目的および利点は、１，５−ＡＧおよび水を含む混合物から結晶１，５−ＡＧを析出させることを特徴とする、結晶１，５−ＡＧの製造方法によって達成される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法によれば、１，５−ＡＧおよび水を含む混合物から容易に結晶１，５−ＡＧを製造することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の結晶化方法では結晶化の原液として、１，５−ＡＧおよび水を含んで成る混合物を使用する。１，５−ＡＧおよび水以外に含まれるものとしては糖類などの有機物、塩類、水可溶の有機溶媒などであるが特に制限されない。当該結晶原液は、１，５−ＡＧの過飽和溶液であって、結晶１，５−ＡＧが析出すればよい。ちなみに、１，５−ＡＧが９９.７重量％の１，５−ＡＧ結晶粉末の水１００ｇに対する溶解度は、１５℃のとき８１．９ｇ、３５℃のとき１５１．５ｇ、４７℃のとき１８５．２ｇであった。
結晶原液とする１，５−ＡＧの製造方法自体は特に限定されないが、１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する能力を持つ微生物と接触せしめて１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換して製造する方法などを挙げることができる。
１，５−ＡＧの原料となる１，５−ＡＦはオゴノリなどの紅藻から抽出・精製したα−１，４−グルカンリアーゼを澱粉あるいは澱粉分解物に作用させることにより得ることができる。
【００１０】
かくして調製された１，５−ＡＦは、本発明の製造法で使用する場合は、未分解の原料を含むもの（例えば、１，５−ＡＦ純度４０％標品など）であってもよい。ここでいう純度とは固形分中の１，５−ＡＦの重量百分率を示す。また、さらにカラムクロマトグラフィーにより、デキストリンやブドウ糖などの他の成分を除去して得られる標品、例えば、１，５−ＡＦ純度９０％以上の高純度品であってもよい。
１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する能力をもつ微生物としては、具体的にはサッカロマイセス属、サッカロマイコデス属、ウィリオプシス属、ブレタノマイセス属、カンディダ属、ガラクトマイセス属、ピティア属、チゴサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ティレティオプシス属、ステリマトマイセス属、クルツマノセス属、リューコスポリディウム属、エリスロバシディウム属、フィロバシディウム属、トリコスポロン属、ココヴァエラ属、フェロマイセス属、ブレロマイセス属、クリプロコッカス属、ツチヤエヤ属及びオーレオバシディウム属などが挙げられる。
【００１１】
さらに具体的にはサッカロマイセス・セレビジエ、サッカロマイコデス・ルディジー、ウィリオプシス・プラテンシス、ブレタノマイセス・ブラキシレンシス、カンディダ・ヴァリダ、カンディダ・ケフィア、ガラクトマイセス・チトリ−アウランティ−、ピティア・アノマラ、チゴサッカロマイセス・ルキシ−、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ティレティオプシス・ワシントネンシス、ステリマトマイセス・ハロフィラス、クルツマノマイセス・ネクタイレイ、リューコスポリディウム・スコッティ、エリスロバシディウム・ハセガワヌラン、フィロバシディウム・フロリフォルメ、トリコスポロン・キュータネウム、ココヴァエラ・タイランディカ、フェロマイセス・ポリボーラス、ブレロマイセス・アルブス、クリプロコッカス・アルビダス、ツチヤエヤ・ウィングフィールディ及びオーレオバシディウム・ミクロスティクタムなどが挙げられる。
さらに、本発明に用いられる微生物は具体的には、以下のような菌株が挙げられる。
【００１２】
サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０、サッカロマイコデス・ルディジー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉ）ＮＢＲＣ １０４３、ウィリオプシス・プランテンシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ １１０１５、ブレタノマイセス・ブルキシレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ） ＮＢＲＣ ０６２８、カンディダ・ヴァリダ（Ｃａｎｄｉｄａ ｖａｌｉｄａ） ＮＢＲＣ ０１５９、ＮＢＲＣ １１０１５、カンディダ・ケフィア（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ） ＮＢＲＣ ０４３２、ガラクトマイセス・チトリ−アウランティー（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｔｒｉ−ａｕｒａｎｔｉｉ） ＮＢＲＣ １０８２１ 、ピティア・アノマラ （Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ） ＮＢＲＣ ０７０７、チゴサッカロマイセス・ルキシ−（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）ＮＢＲＣ １９１４、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＢＲＣ １６０８、ティレティオプシス・ワシントネンシス（Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ ｗａｓｈｉｇｔｏｎｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ ６８３１、ステリマトマイセス・ハロフィラス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＢＲＣ １８４４ 、クルツマノマイセス・ネクタイレイ（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ ｎｅｃｔａｉｒｅｉ） ＮＢＲＣ １０１１８、リューコスポリディウム・スコッティ（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｃｏｔｔｉｉ）ＮＢＲＣ １２１１、エリスロバシディウム・ハセガワヌラン（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｈａｓｅｇａｗａｎｕｒｎ） ＮＢＲＣ １０５８ 、フィロバシディウム・フロリフォルメ（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｆｌｏｒｉｆｏｒｍｅ）ＮＢＲＣ １６０３、トリコスポロン・キュータネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）ＮＢＲＣ １１９８、ココヴァエラ・タイランディカ（Ｋｏｃｋｏｖａｅｌｌａ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃａ）ＮＢＲＣ １０５２１、フェロマイセス・ポリボーラス（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｂｏｒｕｓ） ＮＢＲＣ １０１２０、ブレロマイセス・アルブス（Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ）ＮＢＲＣ １１９２、クリプロコッカス・アルビダス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ） ＮＢＲＣ ０４３４、ツチヤエヤ・ウィングフィールディ（Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ ｗｉｎｇｆｉｅｌｄｉｉ） ＮＢＲＣ １０２０４及びオーレオバシディウム・ミクロスティクタム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｍｉｃｒｏｓｔｉｃｔｕｍ） ＮＢＲＣ ３２０７０等である。これら菌株は、デパートメント・オブ・バイオテクノロジー ナショナル・インシュティテュ−ト・オブ・テクノロジー・アンド・エバーリュエント（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ） 住所 Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ａｇｅｎｃｙ ５−８，Ｋａｚｕｓａ−ｋａｍａｔａｒｉ ２−ｃｈｏｍｅ，Ｋｉｓａｒａｚｕ−ｓｈｉ，Ｃｈｉｂａ，２９２−０８１８ Ｊａｐａｎ） から入手可能である。但し、１，５−ＡＧの製法に用いられる微生物は、１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する能力を有する微生物であれば全てが使用可能であり、上記微生物に限定されるものではない。
【００１３】
１，５−ＡＧの製法に用いられる微生物は、前記の微生物より紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等による変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組み換え法などの遺伝学的手法により誘導される遺伝子組み換え株などいずれの株であっても良い。
【００１４】
微生物培養のための１，５−ＡＦを含む培養液は、通常の炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じて有機栄養源を含む培地を用いることができる。炭素源としては、グルコース等の炭水化物、グリセロール等のアルコール類、有機酸、その他が適宜使用される。有機栄養源としては、ビタミン、アミノ酸等を含有する酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他などが適宜使用される。無機イオンとしては、マグネシウムイオン、リン酸イオン、カルシウムイオン、その他などが適宜使用される。その培地に、別にフィルター滅菌した１，５−ＡＦ水溶液を添加して１，５−ＡＧ調製用の培地を調製することができる。
培養条件は特別な制限もなく、例えば好気条件下でｐＨ３〜７及び温度２０〜４０℃の範囲で、適当なｐＨと温度を保ちながら２〜７日程度培養を行うことができる。
【００１５】
このようにして培養液中に生成した１，５−ＡＧを通常実施される周知の手段で培養物より分離、精製する。具体的には、遠心分離、珪藻土ろ過で菌体及び固形物を除去した後、活性炭で脱色、イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮してシロップ状とする。この際、微生物の培養条件によって１，５−ＡＧの生成率も異なる。したがって、イオン交換や吸着、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分離などの操作を適宜組み合わせ、ある程度の他の成分を除去して１，５−ＡＧの純度を高めておくことが望ましい。
【００１６】
本発明の結晶化方法において使用される水溶液の１，５−ＡＧ濃度（％）は１，５−ＡＧ純度によっても異なるが、例えば、濃度が２５〜９５％、好ましくは３５〜９０％、より好ましくは４５〜８５％であればよい。
１，５−ＡＧ純度の分析方法としては、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を用いて行う。詳細条件については以下に示す。
分離カラム：ＳｈｏｄｅｘＳＰ８１０−ＭＣＩＧＥＬＣＫ０８Ｓ（昭和電工（株）製、三菱化学（株）製）、移動相：蒸留水、流速：１．０ｍＬ／分、カラム温度：４０℃、検出：示差屈折率検出器、サンプル供与量：２０μＬ。以上の分析条件で得られたクロマトグラムを単純面積百分率で解析し得られた１，５−ＡＧのピーク面積の割合を１，５−ＡＧ純度とした。
【００１７】
具体例として上記の方法で分析した市販標準試薬の１，５−ＡＧと１，５−ＡＦを含む培地でサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０を５日間培養した培養液の測定結果を（図１）に示す。また、Ｂｘの値は、市販の屈折計を用いて測定することができ、具体的には、アタゴ（株）製のデジタル屈折計を使用して測定した。
ここでいう１，５−ＡＧ濃度は、ＨＰＬＣで測定した１，５−ＡＧ純度にＢｘの測定値の１００分の１を乗じた値である。
【００１８】
本発明の結晶化方法において、結晶原液から結晶１，５−ＡＧを析出させる際の温度条件は、当該溶液の濃度や１，５−ＡＧ純度により異なるが、例えば−１０〜９０℃、好ましくは０〜８０℃、より好ましくは１０〜７０℃である。結晶化後の分蜜時の作業効率などを考慮すると、２０〜６０℃であることがより好ましい。この際、より多くの１，５−ＡＧ結晶を得るために、結晶原液の温度を下降させながら結晶原液の過飽和状態を保ち、結晶化を行うこともできる。
本発明の方法において、水溶液を濃縮しながら１，５−ＡＧ濃度を、好ましくは５０〜９０％、さらに好ましくは５５〜８５％、より好ましくは６５〜７５％に保持して結晶化原液の過飽和状態を保ちつづけて結晶化させる方法を行うこともできる。
【００１９】
また、より効率的に結晶化を行うために、結晶化原液に種結晶を共存させることもできる。
【００２０】
本発明における種結晶としては、例えば、１，５−ＡＧ結晶自体、あるいは１，５−ＡＧの結晶が混合したマスキットを用いることができる。また、種結晶を共存させる方法としては特に制限されないが、例えば、結晶原液に該種結晶を添加する工程をとることもできあるいは、予め結晶が混合しているマスキットの状態のものを結晶原液として使用することであってもよい。
さらに、結晶をマスキットより分蜜して得られた母液を使用して再度上述の種結晶を共存させて結晶１，５−ＡＧを製造することも可能である。
結晶化に用いる装置としては温度調整および減圧操作が可能な回分式の結晶化装置や連続的に温度制御するなどの装置が利用できるがこの装置に限定されるものではない。
【００２１】
本発明の方法により析出した１，５−ＡＧの結晶は、マスキットより分蜜後、乾燥工程を経て粉末品として得ることができる。
分蜜方法は、１，５−ＡＧ結晶を採取できればよく、通常用いられる方法をとることができ特に制限されない。例えば、マスキットをバスケット型遠心脱水機に供し、結晶１，５−ＡＧと蜜（母液）とを分離し、必要に応じて冷水を噴霧して洗浄することも可能である。
本発明の製造方法により得られた結晶１，５−ＡＧは、粉末とすることができるので、食品として１，５−ＡＧを含むシロップとは異なった使用方法で利用可能である。
【実施例】
【００２２】
実施例１
以下、実施例にて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
以後の説明中に用いる％は、特に断りがない限り容量（ｗ／ｖ）％である。グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ｐＨ６．０の培地を１Ｌの培養フラスコに５００ｍＬずつ分注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。
【００２３】
上記培地に、斜面培地（グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、寒天粉末１．５％、ｐＨ６．０）で培養した：サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０を１白金耳採取し、２５℃、３日間振盪培養した。これを種培養液とした。上記と同じ組成を有する培地５Ｌを容量１０Ｌのミニジャーファーメンターに入れ、孔径０．４５μｍフィルターを通し除菌処理した１，５−ＡＦ水溶液を最終濃度２．５％となるように添加した。その１，５−ＡＦを含む培地に、前記種培養液５００ｍＬを加え、攪拌速度２００ｒｐｍ、通気量１Ｌ／分、２５℃で５日間振盪培養して１，５−ＡＧを含む培養液を得た（図１）。その培養液から遠心分離（３０００ｒｐｍ−１０分）と珪藻土ろ過で菌体及び固形物を除去した後、活性炭（蒸気炭）とイオン交換樹脂（ＳＫ−１Ｂ：ＳＡ１０ＡＰ＝２：１ 三菱化学（株）製）で脱色、脱塩を行った。この精製した溶液を濃縮後、Ｎａ＋型イオン交換樹脂（ＵＢＫ５３０ 三菱化学（株）製）を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーで１，５−ＡＧを分離し、純度９６．５％の１，５−ＡＧ水溶液が得られた。
【００２４】
この水溶液をナス型フラスコに移して、エバポレータでＢｘ４５％まで濃縮した。４℃で２４時間冷却し、結晶を析出させその結晶を更に蒸留水に溶解し、先の操作と同様に再結晶化させて、多面体様の白色結晶を４．５ｇ得た。この結晶をミリ−Ｑ水に溶解しＨＰＬＣで分析した結果、単一なシンメトリーピークとなり、この結晶が純度９９．９％の１，５−ＡＧ単一成分であることが確認できた。更に１Ｈ−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳで以下の条件で分析し物質同定を行った。
【００２５】
１Ｈ−ＮＭＲ：市販標準試薬の１，５−ＡＧと先の白色結晶を、観測周波数：４９９．８ＭＨｚ、溶媒Ｄ２Ｏ、濃度１０ｍｇ／７００μＬ、基準ＴＳＰ−ｄ４ （（ＣＨ３）３ＣＤ２ＣＤ２ＣＯＯＮａ）、温度：２５℃、観測幅：５ＫＨｚ、データ点：６４Ｋ（１２８Ｋでフーリエ変換）、パルス幅：３０°、パルス繰り返し時間：１０ｓｅｃ、積算回数：８回で測定した結果、市販標準試薬の１，５−ＡＧと先の白色結晶は同一スペクトルを示した。（図２）
ＥＳＩ−ＭＳ：先の白色結晶をミリ−Ｑ水に５０ｎｍｏｌ／ｍｌとなるように溶解し、最終濃度３０％（Ｖ／Ｖ）となるようにメタノールを添加した。その後、０．１％（Ｖ／Ｖ）ギ酸を添加してイオン化電圧：８５０Ｖで質量分析を実施した結果、イオン質量電荷比：１６５（ｍ／ｚ）のスペクトルを得た。（図３）これは、ｍ＝１６４（１，５−ＡＧの質量）＋１（プロトン１個分の質量）、ｚ＝１（電荷数）である。 ｍ／ｚ ＝ （１６４ ＋ １）／１ ＝ １６５となり、先のＨＰＬＣ（図１）、１Ｈ−ＮＭＲ（図２）、ＥＳＩ−ＭＳ（図３）の結果から、白色結晶が１，５−ＡＧであると同定された。
【００２６】
実施例２
実施例１で得られた１，５−ＡＧ濃度が６５．０％の水溶液５．２６ｇナス型フラスコに入れ、５５℃の恒温槽で温度が一定になるまで保温した。次に、種結晶として１，５−ＡＧ結晶０．０５ｇを３回に分けて添加した。
この種結晶を含む水溶液を５５℃から２７℃まで４８時間かけて冷却し、１，５−ＡＧを結晶化させた。この結晶を濾紙で回収して冷水で洗浄後、減圧乾燥機にて２４時間乾燥させ、０．６０６ｇの白色結晶を得た。得られた結晶のＸ線構造解析を行った。結晶をグラスファイバー先端に取り付け表１の条件でＸ線回折の測定を行った。
【００２７】
【表１】
【００２８】
測定した結果を表２に示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】
実施例３
クロマト分離で得られた、１，５−ＡＧ水溶液をナス型フラスコに入れ濃縮し１，５−ＡＧ濃度５５．８％の水溶液を１６．０ｇを得た。６０℃の恒温槽で温度が一定になるまで保温し、実施例１で得られた１，５−ＡＧ結晶を種結晶として０．０１５ｇ添加した。６０℃から４５℃まで１時間かけて冷却して１，５−ＡＧを結晶化させた。この結晶を濾紙で回収して冷水で洗浄後、減圧乾燥機にて２４時間乾燥させ、０．６０８ｇの白色結晶を得た。
【００３１】
実施例４
１，５−ＡＧ濃度６５％水溶液２８５ｇを１，０００ｍｌのナス型フラスコに入れ、４５℃の恒温槽で温度が一定になるまで保温した。実施例１で得られた１，５−ＡＧ結晶を種結晶として０．３３ｇ添加し、エバポレータで減圧濃縮することで１，５−ＡＧを結晶化させた。この結晶を濾紙で回収して冷水で洗浄後、減圧乾燥機にて２４時間乾燥させ、４７．４ｇの白色結晶を得た。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】実施例１で得られた１，５−ＡＧを含む培養液の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）図。
【図２】実施例１で得られた１，５−ＡＧ結晶の１Ｈ−ＮＭＲスペクトル図。
【図３】実施例１で得られた１，５−ＡＧ結晶のＥＭＩ−ＭＳ図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを含む水溶液から１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの結晶を析出せしめることを特徴とする、結晶１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの製造方法。
【請求項２】
１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを含む水溶液中の１，５−Ｄ−アンヒドログルシトール濃度が２５〜９５重量％である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
析出を−１０〜９０℃の温度で行う請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを含む水溶液を濃縮しながら１，５−Ｄ−アンヒドログルシトール濃度を５０〜９０重量％の過飽和状態に保ちつつ、１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの結晶を析出せしめる請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを含む水溶液に種結晶を共存させて１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを析出せしめる請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１】
１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを含む水溶液から１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの結晶を析出せしめることを特徴とする、結晶１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの製造方法。
【請求項２】
１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを含む水溶液中の１，５−Ｄ−アンヒドログルシトール濃度が２５〜９５重量％である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
析出を−１０〜９０℃の温度で行う請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを含む水溶液を濃縮しながら１，５−Ｄ−アンヒドログルシトール濃度を５０〜９０重量％の過飽和状態に保ちつつ、１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの結晶を析出せしめる請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを含む水溶液に種結晶を共存させて１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを析出せしめる請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−２１５２３１（Ｐ２００９−２１５２３１Ａ）
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−６０８２１（Ｐ２００８−６０８２１）
【出願日】平成２０年３月１１日（２００８．３．１１）
【出願人】（３９００１５００４）日本澱粉工業株式会社 (15)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１１日（２００８．３．１１）
【出願人】（３９００１５００４）日本澱粉工業株式会社 (15)
【Ｆターム（参考）】
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