線溶活性を有するミミズ乾燥粉末及びその製造方法
【課題】ミミズ乾燥物質中の熱に安定な物質による線溶活性を利用することにより、１００℃でも安定であるので、沸騰水中で加熱できるため温度制御に気を使う必要がないばかりでなく、十分に熱湯殺菌が行われているので、一般細菌は勿論のこと、大腸菌群やカビ類が増殖することがなく、その結果として健康食品の原料として好適なミミズ乾燥粉末及びその製造方法を提供する。
【解決手段】 ミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振とうした後エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲルろ過を行い有効画分を乾燥することからなる線溶活性を有する乾燥粉末及びその製造方法。前記乾燥工程が、凍結乾燥又はスプレードライヤーを使用する乾燥方法であることが好ましい。
【解決手段】 ミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振とうした後エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲルろ過を行い有効画分を乾燥することからなる線溶活性を有する乾燥粉末及びその製造方法。前記乾燥工程が、凍結乾燥又はスプレードライヤーを使用する乾燥方法であることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線溶活性を有するミミズ乾燥粉末及びその製造方法に関し、詳細には、血流改善作用を有する、熱に安定な物質を主体とする新規なミミズ乾燥粉末及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体中には、継続的に血栓が生成し、これが体内に存在する線溶活性酵素により逐次溶解されている。しかし、このバランスがくずれると、不必要な血栓が増加し、血栓に起因する様々な疾病をもたらす。近年、壮、老年層において、この種の疾病、たとえば一過性脳虚血発作、脳梗塞（脳血栓、脳塞栓）、虚血性狭心症、心筋梗塞、動脈血栓症、静脈血栓症、深部静脈血栓症、末梢動脈閉塞症、末梢静脈閉塞症、肺血栓症、肺塞栓症などの血栓に起因する種々の疾病患者が多発し、問題となっている。
【０００３】
このため、これらの疾病患者の治療剤として、種々の医療品が開発されているが、それらの中でウロキナーゼやストレプトキナーゼのような血栓溶解酵素製剤が効果的であり、薬理作用が優れているという点で、ウロキナーゼが特に注目されている。
【０００４】
しかしながら、このウロキナーゼは、プラスミノゲンを直接活性化させると同時にフィブリノゲンを減少させるため出血を起こしたり、トロンボプラスチン・凝固時間（Activated partial thromboplastin time）を短縮させる副作用を伴う。
一方、ストレプトキナーゼは、発熱、嘔気、頭痛、痙攣、蕁麻疹、出血などの副作用を伴う上に、抗原性があり、抗体産生症例では効果が低いという欠点がある。
更に、上記両者とも１〜１２時間掛けて点滴静注により投与しなければならないために、患者に多大な苦痛を与えるという欠点も有していた。
【０００５】
他方、ミミズやその乾燥物は、以前から漢方薬の一種として用いられており、解熱作用、鎮痛作用、利尿作用、解毒作用などの薬理作用を有することが知られている。
ミミズの機能性については、中国最古の医薬書といわれている「神農本草経」に、種々の疾患に有効な医薬品として記載されている。更に宋時代に編さんされ、既にこの世から失われてしまった「日華子」という医学書の中に、ミミズが中風に効果があったと書かれているといわれている。
【０００６】
ところで、従来の慣習的なミミズの乾燥物又は乾燥粉末の製法は大別すれば次のとおりである。
（１）ミミズの腹部を裂いて体内の内容物（内臓と泥土）を取り去って天日、日陰又は低温（通常５０℃以下）で乾燥する。
（２）ミミズを草木灰の中に入れて殺したのち、灰を取り去って天日、日陰又は低温（通常５０℃以下）で乾燥し、ミミズ体内に泥土が詰まったままのものを得る方法。
（３）ミミズ体内の泥土を取り去ったのち、草木灰又は火灰の中に入れて乾燥する方法。などである。これらの乾燥物は必要時又は使用時に粉砕して使用していた。これらの製法は簡易かつ経済的な方法で、家庭でも容易に実行できる長所がある。
【０００７】
然しながら、これらの製法で得たミミズの乾燥物又は乾燥粉末は０〜５℃の冷蔵庫内、又は５〜４５℃の室温に解放状態で貯蔵したとき約６ヶ月以内、密閉状態で貯蔵したときでも１年以内の短期間内にカビが発生し使用不可能となる欠点がある。
そこで、ミミズ乾燥物中の酵素が破壊又は失活することがなく、かつ密閉状態で少なくとも４年間貯蔵又は保管が可能な無菌ミミズの乾燥粉末を高い収率で得るために詳細な研究が行われた結果、特許文献１にはミミズ乾燥粉末を有効成分としてなる血圧調節剤、特許文献２にはミミズ乾燥粉末を有効成分として含有する抗高脂血症剤、そして特許文献３には優れた抗高脂血症活性と安全性を有するミミズ乾燥粉末の製造法が開示された。
【０００８】
上記の３種の特許文献に開示された技術は、いずれも−１０℃〜−６０℃での凍結を必須の製造条件とするものである。
一方、上記の方法を製造が容易とは言い難いとして、低温を維持することなく室温で製造することができ、しかも微生物の増殖を抑えて、血栓を生じにくくする能力を有し、血流の改善作用を大幅に向上させることのできるミミズ乾燥粉末の製造法方が特許文献４に開示された。
【０００９】
しかし、特許文献４に開示された製造法方は、２０℃〜５５℃で５時間〜１７０時間放置した後に粉末化処理するものであるから、３０℃で７日間経過後にカビのコロニー数が０であるという結果になっている。
【特許文献１】特公平７−３９３４９号公報
【特許文献２】特公平７−８０７７７号公報
【特許文献３】特公平７−８８３０８号公報
【特許文献４】特開２００４−２９２４０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ところで、前記の特公平７−３９３４９号公報、特公平７−８０７７７号公報及び特公平７−８８３０８号公報に開示されたミミズ乾燥粉末は、どれもミミズ乾燥物中の酵素が破壊又は失活することがないようにするために、最終工程の真空乾燥温度を７０℃〜８０℃に制限する必要があり、温度制御に注力する必要があり、加えて密閉状態では少なくとも４年間はカビを生じることなく貯蔵が可能であるものの、開放状態では、特に高温多湿時期にはそれほど長期間カビのコロニーを生じることなく貯蔵又は保管することは困難であった。
【００１１】
一方、特開２００４−２９２４０２号公報に開示されたミミズ乾燥粉末は、ミミズの血栓溶解作用物質の前駆体にするために、乾燥温度を２０〜５５℃に保持することが必要であり、そのため温度制御に注力する必要があることに加えて、開放状態で３０℃に放置した場合、せいぜい１週間程度カビのコロニーの生成を抑制することができるだけであった。
【００１２】
本発明は、このような従来の情況に鑑みてなされたものであり、ミミズ乾燥物質中の熱に安定な物質による線溶活性を利用することにより、１００℃でも安定であるので、沸騰水中で加熱できるため温度制御に気を使う必要がないばかりでなく、十分に熱湯殺菌が行われているので、一般細菌は勿論のこと、大腸菌群やカビ類が増殖することがなく、その結果として健康食品の原料として好適なミミズ乾燥粉末及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
宮崎医科大学の美原 恒博士らは、ミミズの線溶活性物質について検討しミミズの中に３７℃でｐＨ３〜１０まで３０分間放置しても安定なセリンプロテアーゼが存在することを発見した。更にミミズの凍結乾燥粉末をヒトに経口投与したところ、フィブリン平板（プラスミノーゲンが入っている）の溶解面積が大きくなることを認めた。そこで、ミミズの経口投与後のプラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）を測定したところ、これが上昇することを明らかにしたのである（Ｍｉｈａｒａ，Ｈ：Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｏｃ．Ｊａｐ．Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．７（１９９１）参照。
【００１４】
ミミズの凍結乾燥粉末をヒトに経口投与して血液中のプラスミンが活性化されたことは事実であるが、この活性化は、粉末中のセリンプロテアーゼではないと思われる。その理由は、経口投与されるとセリンプロテアーゼは、アミノ酸やペプチドにまで分解され、線溶活性を失ってしまうからである。しかし、経口投与後の血液中にｔ−ＰＡが増加したのは明らかであるので、ミミズの凍結乾燥物中に血管内皮細胞からｔ−ＰＡの分泌をうながす物質が存在すると考えざるを得ない。
【００１５】
そこで本発明者は、この物質を明らかにする実験を進めたのである。
上記の機構は、下記の如く考えられる。
プラスミノーゲン→（＋ｔ−ＰＡ）→プラスミン→フィブリン溶解
【００１６】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を続け、常識的に酵素が活性を失う８０℃という高温での乾燥処理によって得たものでもミミズの乾燥粉末が線溶活性を維持しているのは、酵素の外に高温でも安定な物質が線溶活性に寄与していると想定し、ミミズ粉末の１００℃処理後の溶出物のゲルろ過による操作により、線溶活性を有する特定の有効画分が取得できることを見出し、かかる知見に基づいて本発明を達成することができた。
【００１７】
すなわち、本発明は、上記の目的を達成するために下記の構成よりなるものである。
（１）水にミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振とうした後、エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲルろ過を行い、得られた画分のうちの有効画分を乾燥して製造したことを特徴とする線溶活性を有するミミズ乾燥粉末を得るにある。
（２）水にミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加
熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振
とうした後、エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲ
ルろ過を行い、得られた画分１、２、３のうちの最初の有効画分１を乾燥して製
造したことを特徴とする線溶活性を有するミミズ乾燥粉末を得るにある。
（３）水にミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振とうした後、エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲルろ過を行い、得られた画分のうちの有効画分を乾燥することを特徴とする線溶活性を有する乾燥粉末の製造方法を得るにある。
（４）水にミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振とうした後、エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲルろ過を行い、得られた画分１、２、３のうちの最初の有効画分１を乾燥することを特徴とする線溶活性を有する乾燥粉末の製造方法を得るにある。
（５）前記乾燥工程が、凍結乾燥またはスプレードライヤーを使用する乾燥であることを特徴とするミミズ乾燥粉末の製造方法を得るにある。
【００１８】
本発明によれば、ミミズの凍結乾燥粉末の中に、肺の毛細血管からプラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）の分泌をうながす熱に安定な物質が存在することが判った。したがって、ミミズの凍結乾燥粉末を経口で摂取すると、血液のプラスミン活性が上昇するのは、この熱安定性の物質が吸収され、血管内皮細胞からｔ−ＰＡの分泌をうながすためだと思われる。
しかも、本発明の乾燥粉末及びその製造方法によれば、沸騰水中で加熱を行っても失活しない熱安定性の物質を線溶活性成分として製造できるので、温度制御に格別の配慮を必要とせず、しかも従来の酵素活性を維持する製造方法等と違って沸騰水中で十分に煮沸殺菌されているので、高湿度条件下においてもカビのコロニーが生成しにくいという利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の線溶活性を有するミミズ乾燥粉末の出発原料としてのミミズ乾燥粉末としては、前記の特公平７−３９３４９号公報、特公平７−８０７７７号公報、特公平７−８０７７７号公報及び特開２００４−２９２４０２号公報に記載されているミミズ乾燥粉末をはじめ、同等の薬理効果を有する如何なるミミズ乾燥粉末も何等制限されることなく使用できる。
【００２０】
本発明において、水の量はミミズ乾燥粉末添加の添加量の約１０倍で、ミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌し、その後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し凍結乾燥する。その後得られた粉末に約５倍の水を再び添加して振とうし、その後にエタノールを水と等量添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを取り、約１／７〜1／２５に濃縮する。これをゲルろ過するためセファデックスカラム等で溶離し、得られた画分１〜３のうちの有効画分を選択しこれを乾燥して製造する。水を加熱する温度は、前記したように温度制御に注意する必要がなくなるため、水の常圧での沸騰温度である１００℃とする。また、１００℃での加熱は、ミミズの乾燥粉末に付着または含まれる細菌類やカビがあれば十分に殺菌、死滅させるため望ましく、本発明の特徴となる。
【００２１】
１００℃での加熱、煮沸時間は少なくとも３〜３０分であることが必要である。３分以内の短時間では、十分な加熱が行われず、十分な熱湯殺菌が行われないからである。一方、３０分を超えて加熱しても殺菌効果がそれ以上に上がらないばかりでなく、熱経済的にも、また熱エネルギー的にもこれ以上の加熱は無駄になることが予測される。
【００２２】
また、上澄み濃縮物の乾燥及び有効画分の乾燥の両方とも、上記の特許公報に記載されている凍結乾燥をはじめ、公知の凍結乾燥あるいはスプレードライヤーを使用して定法にしたがって行う如何なる乾燥も使用することができる。
【００２３】
ゲルろ過は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０、Ｇ−７５、トヨパールＨＷ５５、ＡＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、バイオゲル、セルロファイン等を好適に使用できる。
【実施例】
【００２４】
以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等制限を受けるものではない。
【００２５】
実施例１
有効画分の調製
ミミズ凍結乾燥粉末７０ｇに水７７０ｍｌを加え、１００℃、３０分加熱し溶出後、上澄みを約１０ｍｌまで濃縮し、凍結乾燥する。この画分をＡとする。次に、Ａの粉末７ｇに水３５ｍｌを加え、５分間振とうしエタノール３５ｍｌを加える。よく撹拌し、上澄みを取り、３〜１０ｍｌに濃縮した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０のカラムでゲルろ過する。尚、本実施例では溶出液を３つに画分し、Ｂ−１（有効画分）、Ｂ−２、Ｂ−３とした。
【００２６】
フィブリン溶解実験
ラットの肺０．５ｇに上記の画分Ａの各種濃度溶液及びゲルろ過した各溶液おのおの３ｍｌを加え、３７℃で６０分反応させた後、上澄み３００μｌにプラスミノーゲン１５０μｌを加え、３７℃３０分反応した後、フィブリン平板上に５０μｌずつ滴下し、常温で１８時間放置しフィブリンの溶けた直径を測定した。直径は８個のフィブリン平板の平均値で表した。
【００２７】
実験結果
まずミミズ凍結乾燥粉末から熱処理（１００℃、３０分）して抽出したＡの画分に、毛細血管内皮細胞からプラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）の分泌をうながす作用があるか否かを検討した。０．５ｇのラットの肺に、生理食塩水を作用させたものを対照にして実験を行った。表１に示すように、生理食塩水を肺に作用させたとき、フィブリン平板の溶けた直径は０．９ｃｍであるのに対し、ミミズＡ（６５ｍｇ／ｍｌ）では１．６ｃｍと０．７ｃｍの拡大が見られた。これは、ｔ−ＰＡを分泌させる熱に安定な物質がミミズの中に存在していることを示している。更にミミズＡ（６５ｍｇ／ｍｌ）の４倍希釈でも有効なこと、及びミミズＡ（１３０ｍｇ／ｍｌ）では２．０ｃｍの直径であり、対照より１．１ｃｍ拡大していることも判った。
【００２８】
【表１】
【００２９】
そこで、前記の有効画分の調製の手順に記載したところのＡをＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０のカラムにかけ、最初に溶出されたものからＢ−１、Ｂ−２、Ｂ−３の３画分に分けたものを、ｔ−ＰＡの分泌について検討することにした。表２に示すように、生理食塩水よりもフィブリン平板の溶解が拡大しているのはＢ−１（有効画分）のみであった。
【００３０】
【表２】
【００３１】
実施例２
前記の実施例1におけるミミズ凍結乾燥粉末の水添加物の１００℃での加熱時間を３分に変更したこと以外は、実施例1と同一の手順を繰り返した。
【００３２】
実施例３
前記の実施例1におけるミミズ凍結乾燥粉末の水添加物の１００℃での加熱時間を１５分に変更したこと以外は、実施例1と同一の手順を繰り返した。
実施例２及び３とも、表１及び２に示す実施例1と殆ど同一のフィブリン平板の溶解結果を得た。
【００３３】
上記の結果からミミズの凍結乾燥粉末の中に、肺の毛細血管からプラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）の分泌をうながす熱に安定な物質が存在することが分かった。したがって、ミミズの凍結乾燥粉末を経口で摂取すると、血液のプラスミン活性が上昇するのは、この熱安定物質が吸収され、血管内皮細胞からｔ−ＰＡの分泌をうながすためだと思われる。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の線溶活性を有するミミズ乾燥粉末及びその製造方法は、温度制御に気を使う必要なしに、十分に熱湯殺菌が行われたミミズ乾燥粉末を提供できるので、従来のミミズ乾燥粉末の使用可能分野である抗高脂血症剤、血圧調節剤、血栓症治療剤などの健康食品として広い用途が期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線溶活性を有するミミズ乾燥粉末及びその製造方法に関し、詳細には、血流改善作用を有する、熱に安定な物質を主体とする新規なミミズ乾燥粉末及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体中には、継続的に血栓が生成し、これが体内に存在する線溶活性酵素により逐次溶解されている。しかし、このバランスがくずれると、不必要な血栓が増加し、血栓に起因する様々な疾病をもたらす。近年、壮、老年層において、この種の疾病、たとえば一過性脳虚血発作、脳梗塞（脳血栓、脳塞栓）、虚血性狭心症、心筋梗塞、動脈血栓症、静脈血栓症、深部静脈血栓症、末梢動脈閉塞症、末梢静脈閉塞症、肺血栓症、肺塞栓症などの血栓に起因する種々の疾病患者が多発し、問題となっている。
【０００３】
このため、これらの疾病患者の治療剤として、種々の医療品が開発されているが、それらの中でウロキナーゼやストレプトキナーゼのような血栓溶解酵素製剤が効果的であり、薬理作用が優れているという点で、ウロキナーゼが特に注目されている。
【０００４】
しかしながら、このウロキナーゼは、プラスミノゲンを直接活性化させると同時にフィブリノゲンを減少させるため出血を起こしたり、トロンボプラスチン・凝固時間（Activated partial thromboplastin time）を短縮させる副作用を伴う。
一方、ストレプトキナーゼは、発熱、嘔気、頭痛、痙攣、蕁麻疹、出血などの副作用を伴う上に、抗原性があり、抗体産生症例では効果が低いという欠点がある。
更に、上記両者とも１〜１２時間掛けて点滴静注により投与しなければならないために、患者に多大な苦痛を与えるという欠点も有していた。
【０００５】
他方、ミミズやその乾燥物は、以前から漢方薬の一種として用いられており、解熱作用、鎮痛作用、利尿作用、解毒作用などの薬理作用を有することが知られている。
ミミズの機能性については、中国最古の医薬書といわれている「神農本草経」に、種々の疾患に有効な医薬品として記載されている。更に宋時代に編さんされ、既にこの世から失われてしまった「日華子」という医学書の中に、ミミズが中風に効果があったと書かれているといわれている。
【０００６】
ところで、従来の慣習的なミミズの乾燥物又は乾燥粉末の製法は大別すれば次のとおりである。
（１）ミミズの腹部を裂いて体内の内容物（内臓と泥土）を取り去って天日、日陰又は低温（通常５０℃以下）で乾燥する。
（２）ミミズを草木灰の中に入れて殺したのち、灰を取り去って天日、日陰又は低温（通常５０℃以下）で乾燥し、ミミズ体内に泥土が詰まったままのものを得る方法。
（３）ミミズ体内の泥土を取り去ったのち、草木灰又は火灰の中に入れて乾燥する方法。などである。これらの乾燥物は必要時又は使用時に粉砕して使用していた。これらの製法は簡易かつ経済的な方法で、家庭でも容易に実行できる長所がある。
【０００７】
然しながら、これらの製法で得たミミズの乾燥物又は乾燥粉末は０〜５℃の冷蔵庫内、又は５〜４５℃の室温に解放状態で貯蔵したとき約６ヶ月以内、密閉状態で貯蔵したときでも１年以内の短期間内にカビが発生し使用不可能となる欠点がある。
そこで、ミミズ乾燥物中の酵素が破壊又は失活することがなく、かつ密閉状態で少なくとも４年間貯蔵又は保管が可能な無菌ミミズの乾燥粉末を高い収率で得るために詳細な研究が行われた結果、特許文献１にはミミズ乾燥粉末を有効成分としてなる血圧調節剤、特許文献２にはミミズ乾燥粉末を有効成分として含有する抗高脂血症剤、そして特許文献３には優れた抗高脂血症活性と安全性を有するミミズ乾燥粉末の製造法が開示された。
【０００８】
上記の３種の特許文献に開示された技術は、いずれも−１０℃〜−６０℃での凍結を必須の製造条件とするものである。
一方、上記の方法を製造が容易とは言い難いとして、低温を維持することなく室温で製造することができ、しかも微生物の増殖を抑えて、血栓を生じにくくする能力を有し、血流の改善作用を大幅に向上させることのできるミミズ乾燥粉末の製造法方が特許文献４に開示された。
【０００９】
しかし、特許文献４に開示された製造法方は、２０℃〜５５℃で５時間〜１７０時間放置した後に粉末化処理するものであるから、３０℃で７日間経過後にカビのコロニー数が０であるという結果になっている。
【特許文献１】特公平７−３９３４９号公報
【特許文献２】特公平７−８０７７７号公報
【特許文献３】特公平７−８８３０８号公報
【特許文献４】特開２００４−２９２４０２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ところで、前記の特公平７−３９３４９号公報、特公平７−８０７７７号公報及び特公平７−８８３０８号公報に開示されたミミズ乾燥粉末は、どれもミミズ乾燥物中の酵素が破壊又は失活することがないようにするために、最終工程の真空乾燥温度を７０℃〜８０℃に制限する必要があり、温度制御に注力する必要があり、加えて密閉状態では少なくとも４年間はカビを生じることなく貯蔵が可能であるものの、開放状態では、特に高温多湿時期にはそれほど長期間カビのコロニーを生じることなく貯蔵又は保管することは困難であった。
【００１１】
一方、特開２００４−２９２４０２号公報に開示されたミミズ乾燥粉末は、ミミズの血栓溶解作用物質の前駆体にするために、乾燥温度を２０〜５５℃に保持することが必要であり、そのため温度制御に注力する必要があることに加えて、開放状態で３０℃に放置した場合、せいぜい１週間程度カビのコロニーの生成を抑制することができるだけであった。
【００１２】
本発明は、このような従来の情況に鑑みてなされたものであり、ミミズ乾燥物質中の熱に安定な物質による線溶活性を利用することにより、１００℃でも安定であるので、沸騰水中で加熱できるため温度制御に気を使う必要がないばかりでなく、十分に熱湯殺菌が行われているので、一般細菌は勿論のこと、大腸菌群やカビ類が増殖することがなく、その結果として健康食品の原料として好適なミミズ乾燥粉末及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
宮崎医科大学の美原 恒博士らは、ミミズの線溶活性物質について検討しミミズの中に３７℃でｐＨ３〜１０まで３０分間放置しても安定なセリンプロテアーゼが存在することを発見した。更にミミズの凍結乾燥粉末をヒトに経口投与したところ、フィブリン平板（プラスミノーゲンが入っている）の溶解面積が大きくなることを認めた。そこで、ミミズの経口投与後のプラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）を測定したところ、これが上昇することを明らかにしたのである（Ｍｉｈａｒａ，Ｈ：Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｏｃ．Ｊａｐ．Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．７（１９９１）参照。
【００１４】
ミミズの凍結乾燥粉末をヒトに経口投与して血液中のプラスミンが活性化されたことは事実であるが、この活性化は、粉末中のセリンプロテアーゼではないと思われる。その理由は、経口投与されるとセリンプロテアーゼは、アミノ酸やペプチドにまで分解され、線溶活性を失ってしまうからである。しかし、経口投与後の血液中にｔ−ＰＡが増加したのは明らかであるので、ミミズの凍結乾燥物中に血管内皮細胞からｔ−ＰＡの分泌をうながす物質が存在すると考えざるを得ない。
【００１５】
そこで本発明者は、この物質を明らかにする実験を進めたのである。
上記の機構は、下記の如く考えられる。
プラスミノーゲン→（＋ｔ−ＰＡ）→プラスミン→フィブリン溶解
【００１６】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意研究を続け、常識的に酵素が活性を失う８０℃という高温での乾燥処理によって得たものでもミミズの乾燥粉末が線溶活性を維持しているのは、酵素の外に高温でも安定な物質が線溶活性に寄与していると想定し、ミミズ粉末の１００℃処理後の溶出物のゲルろ過による操作により、線溶活性を有する特定の有効画分が取得できることを見出し、かかる知見に基づいて本発明を達成することができた。
【００１７】
すなわち、本発明は、上記の目的を達成するために下記の構成よりなるものである。
（１）水にミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振とうした後、エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲルろ過を行い、得られた画分のうちの有効画分を乾燥して製造したことを特徴とする線溶活性を有するミミズ乾燥粉末を得るにある。
（２）水にミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加
熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振
とうした後、エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲ
ルろ過を行い、得られた画分１、２、３のうちの最初の有効画分１を乾燥して製
造したことを特徴とする線溶活性を有するミミズ乾燥粉末を得るにある。
（３）水にミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振とうした後、エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲルろ過を行い、得られた画分のうちの有効画分を乾燥することを特徴とする線溶活性を有する乾燥粉末の製造方法を得るにある。
（４）水にミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振とうした後、エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲルろ過を行い、得られた画分１、２、３のうちの最初の有効画分１を乾燥することを特徴とする線溶活性を有する乾燥粉末の製造方法を得るにある。
（５）前記乾燥工程が、凍結乾燥またはスプレードライヤーを使用する乾燥であることを特徴とするミミズ乾燥粉末の製造方法を得るにある。
【００１８】
本発明によれば、ミミズの凍結乾燥粉末の中に、肺の毛細血管からプラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）の分泌をうながす熱に安定な物質が存在することが判った。したがって、ミミズの凍結乾燥粉末を経口で摂取すると、血液のプラスミン活性が上昇するのは、この熱安定性の物質が吸収され、血管内皮細胞からｔ−ＰＡの分泌をうながすためだと思われる。
しかも、本発明の乾燥粉末及びその製造方法によれば、沸騰水中で加熱を行っても失活しない熱安定性の物質を線溶活性成分として製造できるので、温度制御に格別の配慮を必要とせず、しかも従来の酵素活性を維持する製造方法等と違って沸騰水中で十分に煮沸殺菌されているので、高湿度条件下においてもカビのコロニーが生成しにくいという利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の線溶活性を有するミミズ乾燥粉末の出発原料としてのミミズ乾燥粉末としては、前記の特公平７−３９３４９号公報、特公平７−８０７７７号公報、特公平７−８０７７７号公報及び特開２００４−２９２４０２号公報に記載されているミミズ乾燥粉末をはじめ、同等の薬理効果を有する如何なるミミズ乾燥粉末も何等制限されることなく使用できる。
【００２０】
本発明において、水の量はミミズ乾燥粉末添加の添加量の約１０倍で、ミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌し、その後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し凍結乾燥する。その後得られた粉末に約５倍の水を再び添加して振とうし、その後にエタノールを水と等量添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを取り、約１／７〜1／２５に濃縮する。これをゲルろ過するためセファデックスカラム等で溶離し、得られた画分１〜３のうちの有効画分を選択しこれを乾燥して製造する。水を加熱する温度は、前記したように温度制御に注意する必要がなくなるため、水の常圧での沸騰温度である１００℃とする。また、１００℃での加熱は、ミミズの乾燥粉末に付着または含まれる細菌類やカビがあれば十分に殺菌、死滅させるため望ましく、本発明の特徴となる。
【００２１】
１００℃での加熱、煮沸時間は少なくとも３〜３０分であることが必要である。３分以内の短時間では、十分な加熱が行われず、十分な熱湯殺菌が行われないからである。一方、３０分を超えて加熱しても殺菌効果がそれ以上に上がらないばかりでなく、熱経済的にも、また熱エネルギー的にもこれ以上の加熱は無駄になることが予測される。
【００２２】
また、上澄み濃縮物の乾燥及び有効画分の乾燥の両方とも、上記の特許公報に記載されている凍結乾燥をはじめ、公知の凍結乾燥あるいはスプレードライヤーを使用して定法にしたがって行う如何なる乾燥も使用することができる。
【００２３】
ゲルろ過は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０、Ｇ−７５、トヨパールＨＷ５５、ＡＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、バイオゲル、セルロファイン等を好適に使用できる。
【実施例】
【００２４】
以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何等制限を受けるものではない。
【００２５】
実施例１
有効画分の調製
ミミズ凍結乾燥粉末７０ｇに水７７０ｍｌを加え、１００℃、３０分加熱し溶出後、上澄みを約１０ｍｌまで濃縮し、凍結乾燥する。この画分をＡとする。次に、Ａの粉末７ｇに水３５ｍｌを加え、５分間振とうしエタノール３５ｍｌを加える。よく撹拌し、上澄みを取り、３〜１０ｍｌに濃縮した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０のカラムでゲルろ過する。尚、本実施例では溶出液を３つに画分し、Ｂ−１（有効画分）、Ｂ−２、Ｂ−３とした。
【００２６】
フィブリン溶解実験
ラットの肺０．５ｇに上記の画分Ａの各種濃度溶液及びゲルろ過した各溶液おのおの３ｍｌを加え、３７℃で６０分反応させた後、上澄み３００μｌにプラスミノーゲン１５０μｌを加え、３７℃３０分反応した後、フィブリン平板上に５０μｌずつ滴下し、常温で１８時間放置しフィブリンの溶けた直径を測定した。直径は８個のフィブリン平板の平均値で表した。
【００２７】
実験結果
まずミミズ凍結乾燥粉末から熱処理（１００℃、３０分）して抽出したＡの画分に、毛細血管内皮細胞からプラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）の分泌をうながす作用があるか否かを検討した。０．５ｇのラットの肺に、生理食塩水を作用させたものを対照にして実験を行った。表１に示すように、生理食塩水を肺に作用させたとき、フィブリン平板の溶けた直径は０．９ｃｍであるのに対し、ミミズＡ（６５ｍｇ／ｍｌ）では１．６ｃｍと０．７ｃｍの拡大が見られた。これは、ｔ−ＰＡを分泌させる熱に安定な物質がミミズの中に存在していることを示している。更にミミズＡ（６５ｍｇ／ｍｌ）の４倍希釈でも有効なこと、及びミミズＡ（１３０ｍｇ／ｍｌ）では２．０ｃｍの直径であり、対照より１．１ｃｍ拡大していることも判った。
【００２８】
【表１】
【００２９】
そこで、前記の有効画分の調製の手順に記載したところのＡをＳｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ−２０のカラムにかけ、最初に溶出されたものからＢ−１、Ｂ−２、Ｂ−３の３画分に分けたものを、ｔ−ＰＡの分泌について検討することにした。表２に示すように、生理食塩水よりもフィブリン平板の溶解が拡大しているのはＢ−１（有効画分）のみであった。
【００３０】
【表２】
【００３１】
実施例２
前記の実施例1におけるミミズ凍結乾燥粉末の水添加物の１００℃での加熱時間を３分に変更したこと以外は、実施例1と同一の手順を繰り返した。
【００３２】
実施例３
前記の実施例1におけるミミズ凍結乾燥粉末の水添加物の１００℃での加熱時間を１５分に変更したこと以外は、実施例1と同一の手順を繰り返した。
実施例２及び３とも、表１及び２に示す実施例1と殆ど同一のフィブリン平板の溶解結果を得た。
【００３３】
上記の結果からミミズの凍結乾燥粉末の中に、肺の毛細血管からプラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）の分泌をうながす熱に安定な物質が存在することが分かった。したがって、ミミズの凍結乾燥粉末を経口で摂取すると、血液のプラスミン活性が上昇するのは、この熱安定物質が吸収され、血管内皮細胞からｔ−ＰＡの分泌をうながすためだと思われる。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明の線溶活性を有するミミズ乾燥粉末及びその製造方法は、温度制御に気を使う必要なしに、十分に熱湯殺菌が行われたミミズ乾燥粉末を提供できるので、従来のミミズ乾燥粉末の使用可能分野である抗高脂血症剤、血圧調節剤、血栓症治療剤などの健康食品として広い用途が期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水にミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振とうした後、エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲルろ過を行い、得られた画分のうちの有効画分を乾燥して製造したことを特徴とする線溶活性を有するミミズ乾燥粉末。
【請求項２】
水にミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振とうした後、エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲルろ過を行い、得られた画分１、２、３のうちの最初の有効画分１を乾燥して製造したことを特徴とする線溶活性を有するミミズ乾燥粉末。
【請求項３】
水にミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振とうした後、エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲルろ過を行い、得られた画分のうちの有効画分を乾燥することを特徴とする線溶活性を有する乾燥粉末の製造方法。
【請求項４】
水にミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振とうした後、エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲルろ過を行い、得られた画分１、２、３のうちの最初の有効画分１を乾燥することを特
徴とする線溶活性を有する乾燥粉末の製造方法。
【請求項５】
前記乾燥工程が、凍結乾燥またはスプレードライヤーを使用する乾燥であることを特徴とする請求項又は４記載のミミズ乾燥粉末の製造方法。
【請求項１】
水にミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振とうした後、エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲルろ過を行い、得られた画分のうちの有効画分を乾燥して製造したことを特徴とする線溶活性を有するミミズ乾燥粉末。
【請求項２】
水にミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振とうした後、エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲルろ過を行い、得られた画分１、２、３のうちの最初の有効画分１を乾燥して製造したことを特徴とする線溶活性を有するミミズ乾燥粉末。
【請求項３】
水にミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振とうした後、エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲルろ過を行い、得られた画分のうちの有効画分を乾燥することを特徴とする線溶活性を有する乾燥粉末の製造方法。
【請求項４】
水にミミズ乾燥粉末を添加し、混合、撹拌後１００℃にて３〜３０分間加熱し溶出後、得られた上澄みを濃縮し、乾燥して得た粉末に再び水を添加して振とうした後、エタノールを添加し、十分に撹拌後に得られた上澄みを濃縮し、ゲルろ過を行い、得られた画分１、２、３のうちの最初の有効画分１を乾燥することを特
徴とする線溶活性を有する乾燥粉末の製造方法。
【請求項５】
前記乾燥工程が、凍結乾燥またはスプレードライヤーを使用する乾燥であることを特徴とする請求項又は４記載のミミズ乾燥粉末の製造方法。
【公開番号】特開２００７−１５３８０２（Ｐ２００７−１５３８０２Ａ）
【公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３５０８９５（Ｐ２００５−３５０８９５）
【出願日】平成１７年１２月５日（２００５．１２．５）
【出願人】（５９９１００５０１）富士バイオ株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月２１日（２００７．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月５日（２００５．１２．５）
【出願人】（５９９１００５０１）富士バイオ株式会社 (1)
【Ｆターム（参考）】
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