肝再生促進剤
【課題】 肝細胞成長因子が有するような発癌性のリスクがなく安全で、医薬品化が容易な肝再生促進剤を提供すること。
【解決手段】 本発明の肝再生促進剤は、血小板を凍結融解することで得られる破壊物および／またはその構成成分を有効成分とすることを特徴とするものである。
【解決手段】 本発明の肝再生促進剤は、血小板を凍結融解することで得られる破壊物および／またはその構成成分を有効成分とすることを特徴とするものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝切除後の肝不全予防などに有効な肝再生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝切除後の肝不全予防のため、肝再生を促進する因子の研究は、今後の肝臓外科の発展のために非常に重要であり、肝不全の治療にも新たな展開をもたらすものと期待されている。既存の肝再生促進物質としては、肝細胞成長因子（HGF：hepatocyte growth factor）がよく知られているが、HGFは、肝細胞の増殖促進作用とともに、癌細胞の増殖促進作用を有しているので、HGFの投与によって潜在的な癌が急速に増大する恐れがある。従って、HGFが有するような発癌性のリスクがない安全で強力な肝再生促進物質の探索は非常に意義深いものであると言える。
【０００３】
上記の点に関連し、本発明者らは、ラット由来の初代培養肝細胞に対し、血小板を培養液に添加することにより、肝細胞DNA合成の促進、増殖に関連した転写因子活性の増強、蛋白質発現の誘導などの現象が見られることから、血小板と肝細胞の直接的接触が肝細胞増殖を誘導することを報告している（非特許文献1）。また、マウスの肝切除モデルを用いたin vivo実験で、脾臓を摘出することで血液中の血小板数が増加した状態で肝切除を行った場合、肝切除のみを行った場合に比較して、肝再生が促進されることを報告している（非特許文献2）。これらの知見に基づけば、血小板は、HGFが有するような発癌性のリスクがなく、安全な肝再生促進剤になりうると考えられる。しかしながら、血小板という血液細胞の寿命は非常に短く、輸血製剤として血小板減少症などに使用される濃厚血小板液の有効期限は、日本では採血後3日以内と定められており、非常に限られた期間のうちに使用しなければならないことから、血小板の医薬品化はその保存性などの点において必ずしも容易なことではない。
【非特許文献１】榎本好恭、大河内信弘、土井秀之、里見進，肝再生早期における血小板の役割の検討−血小板と肝細胞の接触の意義について−，肝臓 44巻 8号 383-394 (2003)
【非特許文献２】村田聡一郎、大河内信弘，血小板は肝再生を促進する，肝臓 45巻 suppl. (1) (2004) A42 WS-14
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、HGFが有するような発癌性のリスクがなく安全で、医薬品化が容易な肝再生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、血小板を凍結融解することで得られる破壊物およびその構成成分が優れた肝再生促進作用を有することを見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明の肝再生促進剤は、請求項1記載の通り、血小板を凍結融解することで得られる破壊物および／またはその構成成分を有効成分とすることを特徴とする。
また、請求項2記載の肝再生促進剤は、請求項1記載の肝再生促進剤において、有効成分が血小板破壊物を構成する液体成分であることを特徴とする。
また、本発明の肝再生促進組成物は、請求項3記載の通り、血小板を凍結融解することで得られる破壊物および／またはその構成成分を有効成分として含有してなることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、HGFが有するような発癌性のリスクがなく安全で、医薬品化が容易な肝再生促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明における肝再生促進剤は、血小板を凍結融解することで得られる破壊物および／またはその構成成分を有効成分とすることを特徴とするものである。血小板破壊物の構成成分としては、例えば、血小板の液体成分や膜成分が挙げられる。これらは、血小板に対して凍結と融解を繰り返すことで血小板破壊物を得た後、例えば、遠心操作を行って両者を分離することで調製することができる。血小板の凍結融解は、血小板の機械的強度を考慮して、例えば、-85〜-75℃での凍結と20〜30℃（室温）での融解を、3回以上繰り返すことが望ましい（上限回数は限定されるものではないが10回も行えば十分である）。血小板破壊物を得るための原料として使用する血小板は、例えば、血液成分採血で採取された直後のものであってもよいし、血液から分離されたものであってもよい。また、有効期限経過後の濃厚血小板液由来のものであってもよい。有効期限経過後の濃厚血小板液由来の血小板を原料として使用することにより、これまで有効期限経過により廃棄対象となっていた濃厚血小板液の有効利用を図ることができる。また、自己の血小板を原料として使用すれば、非自己蛋白質による免疫拒絶反応に対する不安を払拭することができる。
【０００９】
血小板破壊物やその構成成分は、例えば、注射剤の形態に製剤化し、肝切除の前および／または後に門脈や静脈から投与すれば、その優れた肝再生促進作用に基づいて、肝切除後の速やかな肝機能の回復を期待することができる。また、血小板破壊物やその構成成分をそのまま凍結保存製剤とし、必要時に融解して門脈や静脈から投与してもよい。また、血小板破壊物やその構成成分をペースト化し、これを肝切除後の切除断端に塗布するといった使用方法も考えられる（血小板の液体成分のみは除く）。本発明の肝再生促進剤を使用すれば、旧来、残肝機能温存のために外科的治療を行わなかった場合や、肝機能低下により外科的治療の対象にならないような肝硬変症例に対しても、肝切除が可能となる。なお、本発明の肝再生促進剤の投与量は、肝再生促進作用を発現する範囲内で、患者の年齢や体重や性別や症状などに応じて適宜決定されるものであるが、静脈から投与する場合を考えると、通常、成人あたり0.01〜10mg/日程度である。
【実施例】
【００１０】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。
【００１１】
実施例1：血小板破壊物およびその液体成分の肝再生促進作用の3H-methyl thymidineによる評価
（実験方法）
マウスより採血した血液に、血液保存液であるACD液を血液:ACD液=4:1になるように加えて軽く攪拌した後、200xgで10分間遠心操作して上清（PRP：platelet rich plasma）を採取した。得られたPRPに対して1000xgで15分間遠心操作して沈殿（ペレット）を得た。次に、得られたペレットに対して血小板洗浄バッファー（NaCl 120mM，NaH2PO4 4.26mM，glucose 5.5mM，sodium citrate 4.77mM，citric acid 2.35mM，pH6.5，4℃）を使用して1000xgで15分間遠心操作してペレットを得、得られたペレットに対して血小板洗浄バッファーを使用した遠心操作をさらにもう1回繰り返して合計3回の遠心操作を行うことでPRPから濃厚血小板液を調製した。
上記のようにして調製された濃厚血小板液を-80℃で凍結させてから室温で融解させた。この凍結融解サイクルを5回繰り返すことで血小板の凍結融解による黄褐色不透明の破壊物を得た。さらに、得られた血小板破壊物に対して10000xgで1時間遠心操作して上清を採取し、これを0.22μmのフィルタで濾過して黄色透明の血小板破壊物の液体成分を得た。
2 step perfusion methodにより単離したマウスの肝細胞2×104個をコラーゲンコートした培養ディッシュに播種した。培地は、900mlのウィリアムズE培地に、fetal bovine serum（FBS）100ml，l-glutamine（200mM）1ml，2-mercaptethanol（50mM）1ml，Nicotinamide 1.2g，dexamethazone（10-4M）1ml，insulin（10mg/ml）100μl，penicillin/streptomycin 10mlを添加したものを使用した。肝細胞を播種してから3時間後に肝細胞が培養ディッシュに接着するので、そこにウィリアムズE培地に溶解した血小板破壊物またはその液体成分を、肝細胞の個数に対して500倍の個数の血小板から調製した分量だけ添加した。さらに、肝細胞を播種してから27時間後に3H-methyl thymidineを培養ディッシュに添加し、75時間後にシンチレーションカウンターにより肝細胞の3H-methyl thymidineの取り込み量を測定することで、血小板破壊物およびその液体成分の肝細胞に対するDNA合成促進作用を調べた。また、対照として血小板破壊物やその液体成分を含まないウィルアムズE培地のみを同じ容量だけ添加した場合の肝細胞に対するDNA合成促進作用も調べた。結果を図1に示す（症例数は6）。
【００１２】
（実験結果）
図1から明らかなように、血小板破壊物およびその液体成分には、肝細胞に対する優れたDNA合成促進作用が認められ、その肝再生促進作用が確認できた。
【００１３】
実施例2：血小板破壊物およびその液体成分の肝再生促進作用のBrdUによる評価
（実験方法）
播種した肝細胞の個数が5×105個であり、3H-methyl thymidineのかわりにBrdUを培養ディッシュに添加すること以外は実施例1と同様にして行った。実施例2においては、血小板破壊物は、肝細胞の個数に対して500倍の個数の血小板から調製した分量だけ添加した。その液体成分は、肝細胞の個数に対して2500倍の個数の血小板から調製した分量だけ添加した。また、対照として血小板破壊物やその液体成分を含まないウィルアムズE培地のみを同じ容量だけ添加した場合の肝細胞に対するDNA合成促進作用も調べた。さらに、比較として、肝細胞の個数に対して1倍，10倍，100倍，200倍，500倍の個数の血小板を添加した場合の肝細胞に対するDNA合成促進作用も調べた。結果を図2に示す（症例数は6）。
【００１４】
図2から明らかなように、実施例2においても、血小板破壊物およびその液体成分には、肝細胞に対する優れたDNA合成促進作用が認められ、その肝再生促進作用が確認できた。
【００１５】
製剤例1：血小板破壊物を含む注射剤
実施例1に記載の方法で調製した血小板破壊物を生理食塩水に懸濁させた後、これをアンプルに封入し、滅菌処理を行って注射剤とした。
【００１６】
製剤例2：血小板破壊物の液体成分を含む注射剤
実施例1に記載の方法で調製した血小板破壊物の液体成分をアンプルに封入し、滅菌処理を行って注射剤とした。
【産業上の利用可能性】
【００１７】
本発明は、HGFが有するような発癌性のリスクがなく安全で、医薬品化が容易な肝再生促進剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例における血小板破壊物およびその液体成分の3H-methyl thymidineによる評価に基づく肝細胞に対するDNA合成促進作用を示すグラフである。
【図２】同、BrdUによる評価に基づく肝細胞に対するDNA合成促進作用を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝切除後の肝不全予防などに有効な肝再生促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝切除後の肝不全予防のため、肝再生を促進する因子の研究は、今後の肝臓外科の発展のために非常に重要であり、肝不全の治療にも新たな展開をもたらすものと期待されている。既存の肝再生促進物質としては、肝細胞成長因子（HGF：hepatocyte growth factor）がよく知られているが、HGFは、肝細胞の増殖促進作用とともに、癌細胞の増殖促進作用を有しているので、HGFの投与によって潜在的な癌が急速に増大する恐れがある。従って、HGFが有するような発癌性のリスクがない安全で強力な肝再生促進物質の探索は非常に意義深いものであると言える。
【０００３】
上記の点に関連し、本発明者らは、ラット由来の初代培養肝細胞に対し、血小板を培養液に添加することにより、肝細胞DNA合成の促進、増殖に関連した転写因子活性の増強、蛋白質発現の誘導などの現象が見られることから、血小板と肝細胞の直接的接触が肝細胞増殖を誘導することを報告している（非特許文献1）。また、マウスの肝切除モデルを用いたin vivo実験で、脾臓を摘出することで血液中の血小板数が増加した状態で肝切除を行った場合、肝切除のみを行った場合に比較して、肝再生が促進されることを報告している（非特許文献2）。これらの知見に基づけば、血小板は、HGFが有するような発癌性のリスクがなく、安全な肝再生促進剤になりうると考えられる。しかしながら、血小板という血液細胞の寿命は非常に短く、輸血製剤として血小板減少症などに使用される濃厚血小板液の有効期限は、日本では採血後3日以内と定められており、非常に限られた期間のうちに使用しなければならないことから、血小板の医薬品化はその保存性などの点において必ずしも容易なことではない。
【非特許文献１】榎本好恭、大河内信弘、土井秀之、里見進，肝再生早期における血小板の役割の検討−血小板と肝細胞の接触の意義について−，肝臓 44巻 8号 383-394 (2003)
【非特許文献２】村田聡一郎、大河内信弘，血小板は肝再生を促進する，肝臓 45巻 suppl. (1) (2004) A42 WS-14
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、HGFが有するような発癌性のリスクがなく安全で、医薬品化が容易な肝再生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、血小板を凍結融解することで得られる破壊物およびその構成成分が優れた肝再生促進作用を有することを見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明の肝再生促進剤は、請求項1記載の通り、血小板を凍結融解することで得られる破壊物および／またはその構成成分を有効成分とすることを特徴とする。
また、請求項2記載の肝再生促進剤は、請求項1記載の肝再生促進剤において、有効成分が血小板破壊物を構成する液体成分であることを特徴とする。
また、本発明の肝再生促進組成物は、請求項3記載の通り、血小板を凍結融解することで得られる破壊物および／またはその構成成分を有効成分として含有してなることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、HGFが有するような発癌性のリスクがなく安全で、医薬品化が容易な肝再生促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明における肝再生促進剤は、血小板を凍結融解することで得られる破壊物および／またはその構成成分を有効成分とすることを特徴とするものである。血小板破壊物の構成成分としては、例えば、血小板の液体成分や膜成分が挙げられる。これらは、血小板に対して凍結と融解を繰り返すことで血小板破壊物を得た後、例えば、遠心操作を行って両者を分離することで調製することができる。血小板の凍結融解は、血小板の機械的強度を考慮して、例えば、-85〜-75℃での凍結と20〜30℃（室温）での融解を、3回以上繰り返すことが望ましい（上限回数は限定されるものではないが10回も行えば十分である）。血小板破壊物を得るための原料として使用する血小板は、例えば、血液成分採血で採取された直後のものであってもよいし、血液から分離されたものであってもよい。また、有効期限経過後の濃厚血小板液由来のものであってもよい。有効期限経過後の濃厚血小板液由来の血小板を原料として使用することにより、これまで有効期限経過により廃棄対象となっていた濃厚血小板液の有効利用を図ることができる。また、自己の血小板を原料として使用すれば、非自己蛋白質による免疫拒絶反応に対する不安を払拭することができる。
【０００９】
血小板破壊物やその構成成分は、例えば、注射剤の形態に製剤化し、肝切除の前および／または後に門脈や静脈から投与すれば、その優れた肝再生促進作用に基づいて、肝切除後の速やかな肝機能の回復を期待することができる。また、血小板破壊物やその構成成分をそのまま凍結保存製剤とし、必要時に融解して門脈や静脈から投与してもよい。また、血小板破壊物やその構成成分をペースト化し、これを肝切除後の切除断端に塗布するといった使用方法も考えられる（血小板の液体成分のみは除く）。本発明の肝再生促進剤を使用すれば、旧来、残肝機能温存のために外科的治療を行わなかった場合や、肝機能低下により外科的治療の対象にならないような肝硬変症例に対しても、肝切除が可能となる。なお、本発明の肝再生促進剤の投与量は、肝再生促進作用を発現する範囲内で、患者の年齢や体重や性別や症状などに応じて適宜決定されるものであるが、静脈から投与する場合を考えると、通常、成人あたり0.01〜10mg/日程度である。
【実施例】
【００１０】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。
【００１１】
実施例1：血小板破壊物およびその液体成分の肝再生促進作用の3H-methyl thymidineによる評価
（実験方法）
マウスより採血した血液に、血液保存液であるACD液を血液:ACD液=4:1になるように加えて軽く攪拌した後、200xgで10分間遠心操作して上清（PRP：platelet rich plasma）を採取した。得られたPRPに対して1000xgで15分間遠心操作して沈殿（ペレット）を得た。次に、得られたペレットに対して血小板洗浄バッファー（NaCl 120mM，NaH2PO4 4.26mM，glucose 5.5mM，sodium citrate 4.77mM，citric acid 2.35mM，pH6.5，4℃）を使用して1000xgで15分間遠心操作してペレットを得、得られたペレットに対して血小板洗浄バッファーを使用した遠心操作をさらにもう1回繰り返して合計3回の遠心操作を行うことでPRPから濃厚血小板液を調製した。
上記のようにして調製された濃厚血小板液を-80℃で凍結させてから室温で融解させた。この凍結融解サイクルを5回繰り返すことで血小板の凍結融解による黄褐色不透明の破壊物を得た。さらに、得られた血小板破壊物に対して10000xgで1時間遠心操作して上清を採取し、これを0.22μmのフィルタで濾過して黄色透明の血小板破壊物の液体成分を得た。
2 step perfusion methodにより単離したマウスの肝細胞2×104個をコラーゲンコートした培養ディッシュに播種した。培地は、900mlのウィリアムズE培地に、fetal bovine serum（FBS）100ml，l-glutamine（200mM）1ml，2-mercaptethanol（50mM）1ml，Nicotinamide 1.2g，dexamethazone（10-4M）1ml，insulin（10mg/ml）100μl，penicillin/streptomycin 10mlを添加したものを使用した。肝細胞を播種してから3時間後に肝細胞が培養ディッシュに接着するので、そこにウィリアムズE培地に溶解した血小板破壊物またはその液体成分を、肝細胞の個数に対して500倍の個数の血小板から調製した分量だけ添加した。さらに、肝細胞を播種してから27時間後に3H-methyl thymidineを培養ディッシュに添加し、75時間後にシンチレーションカウンターにより肝細胞の3H-methyl thymidineの取り込み量を測定することで、血小板破壊物およびその液体成分の肝細胞に対するDNA合成促進作用を調べた。また、対照として血小板破壊物やその液体成分を含まないウィルアムズE培地のみを同じ容量だけ添加した場合の肝細胞に対するDNA合成促進作用も調べた。結果を図1に示す（症例数は6）。
【００１２】
（実験結果）
図1から明らかなように、血小板破壊物およびその液体成分には、肝細胞に対する優れたDNA合成促進作用が認められ、その肝再生促進作用が確認できた。
【００１３】
実施例2：血小板破壊物およびその液体成分の肝再生促進作用のBrdUによる評価
（実験方法）
播種した肝細胞の個数が5×105個であり、3H-methyl thymidineのかわりにBrdUを培養ディッシュに添加すること以外は実施例1と同様にして行った。実施例2においては、血小板破壊物は、肝細胞の個数に対して500倍の個数の血小板から調製した分量だけ添加した。その液体成分は、肝細胞の個数に対して2500倍の個数の血小板から調製した分量だけ添加した。また、対照として血小板破壊物やその液体成分を含まないウィルアムズE培地のみを同じ容量だけ添加した場合の肝細胞に対するDNA合成促進作用も調べた。さらに、比較として、肝細胞の個数に対して1倍，10倍，100倍，200倍，500倍の個数の血小板を添加した場合の肝細胞に対するDNA合成促進作用も調べた。結果を図2に示す（症例数は6）。
【００１４】
図2から明らかなように、実施例2においても、血小板破壊物およびその液体成分には、肝細胞に対する優れたDNA合成促進作用が認められ、その肝再生促進作用が確認できた。
【００１５】
製剤例1：血小板破壊物を含む注射剤
実施例1に記載の方法で調製した血小板破壊物を生理食塩水に懸濁させた後、これをアンプルに封入し、滅菌処理を行って注射剤とした。
【００１６】
製剤例2：血小板破壊物の液体成分を含む注射剤
実施例1に記載の方法で調製した血小板破壊物の液体成分をアンプルに封入し、滅菌処理を行って注射剤とした。
【産業上の利用可能性】
【００１７】
本発明は、HGFが有するような発癌性のリスクがなく安全で、医薬品化が容易な肝再生促進剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例における血小板破壊物およびその液体成分の3H-methyl thymidineによる評価に基づく肝細胞に対するDNA合成促進作用を示すグラフである。
【図２】同、BrdUによる評価に基づく肝細胞に対するDNA合成促進作用を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板を凍結融解することで得られる破壊物および／またはその構成成分を有効成分とすることを特徴とする肝再生促進剤。
【請求項２】
有効成分が血小板破壊物を構成する液体成分であることを特徴とする請求項1記載の肝再生促進剤。
【請求項３】
血小板を凍結融解することで得られる破壊物および／またはその構成成分を有効成分として含有してなることを特徴とする肝再生促進組成物。
【請求項１】
血小板を凍結融解することで得られる破壊物および／またはその構成成分を有効成分とすることを特徴とする肝再生促進剤。
【請求項２】
有効成分が血小板破壊物を構成する液体成分であることを特徴とする請求項1記載の肝再生促進剤。
【請求項３】
血小板を凍結融解することで得られる破壊物および／またはその構成成分を有効成分として含有してなることを特徴とする肝再生促進組成物。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−４５７２１（Ｐ２００７−４５７２１Ａ）
【公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２２９４９５（Ｐ２００５−２２９４９５）
【出願日】平成１７年８月８日（２００５．８．８）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月２２日（２００７．２．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年８月８日（２００５．８．８）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
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