肝細胞癌の予防又は処置のための組成物
【課題】哺乳動物の免疫応答を生成することによって該哺乳動物の癌を予防又は処置するための新規組成物を提供する。
【解決手段】哺乳動物の免疫応答を生成することによって該哺乳動物の癌を予防または処置するための組成物であって、該組成物は、配列番号１の核酸配列からなるαフェトプロテインｃＤＮＡを発現する組換えベクターで形質導入された免疫系細胞を含み、ここで該免疫応答は、αフェトプロテインペプチド特異的Ｔリンパ球を活性化して、これらの表面マーカーを保有する癌細胞に対して該免疫応答を生成する、組成物とする。
【解決手段】哺乳動物の免疫応答を生成することによって該哺乳動物の癌を予防または処置するための組成物であって、該組成物は、配列番号１の核酸配列からなるαフェトプロテインｃＤＮＡを発現する組換えベクターで形質導入された免疫系細胞を含み、ここで該免疫応答は、αフェトプロテインペプチド特異的Ｔリンパ球を活性化して、これらの表面マーカーを保有する癌細胞に対して該免疫応答を生成する、組成物とする。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
原発性肝癌は、世界中の癌による死の主要な原因である。肝細胞癌（ＨＣＣ）は、一年あたり約１２０万の症例の発生数を有する、最も一般的な型の原発性肝癌である。世界のいくつかの地域（例えば、東南アジアおよび南アフリカ）では、肝細胞癌は、最も一般的な型の悪性疾患の１つである。この疾患の高い頻度は、これらの地域における肝炎の高い発生数に関連するようである。
肝細胞癌の治癒治療は、非転移性疾患を有する個体に現在制限されており、そして肝移植を伴うかまたは伴わない、腫瘍の外科的切除を伴う。しかし、外科的切除および移植でさえも、切除後の再発のために、大部分の腫瘍が治癒しない。治療に対する化学療法剤のアプローチは、今日まで、たいてい、無効であった。最近２０年間は、肝細胞癌の処置に重大な進歩はなかった。
それゆえ、肝細胞癌の有効な処置についての必要性が依然として残っている。処置は、理想的には、この疾患の最大の発生数を有する、非先進国における使用に適切であるべきである。さらに、処置は、切除可能でない腫瘍および転移性疾患を有する個体における使用に適切であるべきである。
【非特許文献１】MORINAGA, T., et al., Primary structures of human α-fetoprotein and its mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80(15), PP.4604-4608 (1983)
【非特許文献２】佐藤一夫ら、α-fetoproteinに関する研究（VII）、日大医誌、43(10)、pp.835-842 (1984)
【非特許文献３】平井秀松、α-フェトプロテインによる肝癌の診断と治療、生物物理化学、28(6)、pp.333-341 (1984)
【非特許文献４】TAGA, H., THE EFFECT OF ACTIVE IMMUNIZATION OF RATS WITH HETEROLOGOUS α-FETOPROTEIN UPON HEPATOCARCINOGENESIS INDUCED BY 3'-METHYL-4-DIMETHYLAMINOBENZENE. Gann, 74, pp.248-257 (1983)
【特許文献１】特開平２−２１８６９４号公報
【特許文献２】国際公開第９６／２２７８７号パンフレット
【発明の開示】
【０００２】
本発明の１つの実施態様によれば、ヒトを含む哺乳動物における、肝細胞癌のような癌を予防または処置するための方法が提供される。この方法は、哺乳動物において、少なくともαフェトプロテイン分子のアミノ酸配列の部分に対する免疫応答を生じる工程を含む。
免疫応答を生じる工程は、少なくともαフェトプロテインアミノ酸配列の部分を含むペプチドを含む少なくとも１つの組成物、または少なくとも１つのアミノ酸置換を有する少なくともαフェトプロテインアミノ酸配列の部分を含むペプチドを含む少なくとも１つの組成物を哺乳動物に投与する工程を含み得る。また、免疫応答を生じる工程は、少なくともαフェトプロテイン分子のｃＤＮＡ配列の部分を含む少なくとも１つの組成物を哺乳動物に投与する工程を含み得る。さらに、免疫応答を生じる工程は、αフェトプロテインｃＤＮＡを発現する組換えベクターで形質導入した免疫系の細胞を含む少なくとも１つの組成物を哺乳動物に投与する工程を含み得る。
本発明の別の実施態様によれば、癌を予防または処置するために、ヒトを免疫するための組成物が提供される。組成物は、ＡＦＰ５、ＡＦＰ７、ＡＦＰ１３、ＡＦＰ１４、ＡＦＰ１８、ＡＦＰ２２、ＡＦＰ２３、ＡＦＰ２８、ＡＦＰ３８、ＡＦＰ３９、ＡＦＰ４５、ＡＦＰ４９、配列番号３および配列番号４からなる群より選択されるペプチドを含み得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００３】
本発明の１つの実施態様によって、癌がその表面上に少なくともαフェトプロテイン分子の部分を保有する哺乳動物（例えば、ヒト）において、少なくともαフェトプロテイン分子の部分に対する哺乳動物における免疫応答を生じさせることによって、癌（肝細胞癌を含む）を予防または処置するための方法が提供される。本方法は、癌を有する哺乳動物を免疫操作または遺伝子操作し、癌細胞の表面上に存在する少なくともαフェトプロテインの部分に対する免疫応答を生じさせる工程を包含する。次いで、罹患した哺乳動物の免疫系は、表面マーカーを保有する癌細胞を破壊させられ、それによって臨床的に癌を予防するか、または確立した癌を処置する。
ヒト肝細胞癌細胞の大部分は、ヒトαフェトプロテイン（ｈＡＦＰ）（６０９アミノ酸残基のタンパク質、配列番号２）を合成し、これは、通常、およそ誕生の時期までに胎児肝細胞によって産生される。肝細胞癌細胞は、その表面上に、少なくともαフェトプロテイン分子の部分を提示する傾向がある。肝細胞癌におけるαフェトプロテインの存在は、スクリーニングおよび診断目的のためのマーカーが使用されている。
【０００４】
αフェトプロテインは、通常、免疫系の発達の間に存在するため、免疫系が、タンパク質に対して免疫学的に応答する能力を保持しないことが当然想定される。本発明の１つの局面は、哺乳動物の免疫系が、外来タンパク質としてのαフェトプロテインに応答するように、および外来細胞としての少なくともαフェトプロテイン分子の部分をその表面上に有する細胞に対して反応され得るという発見を含む。従って、この免疫応答を生じさせることは、哺乳動物免疫系を引き起こし、肝細胞癌細胞を破壊することによって、肝細胞癌を予防するため、および疾患を処置するために使用され得る。
本明細書中に開示されるように、αフェトプロテインに対する免疫は、以下を含む種々の手段によって達成され得る：少なくともαフェトプロテイン配列の部分に基づく合成ペプチドを含む、少なくともαフェトプロテイン配列の部分を含む合成ペプチド（しかし、置換または他の改変を含む）での免疫、少なくともαフェトプロテインのｃＤＮＡ配列の部分での免疫（それによって、適切な免疫系細胞に対する少なくともαフェトプロテイン分子の部分の産生および提示を引き起こす）、遺伝子操作された抗原提示細胞の哺乳動物への導入、および少なくともαフェトプロテイン分子の部分の発現を引き起こすための、遺伝子治療用ウイルスベクターの使用。この免疫の目的は、αフェトプロテインペプチドに特異的なＴリンパ球を活性化し、これらの表面マーカーを保有する細胞に対する免疫応答を引き起こすこと、および好ましくは、それによって細胞障害性Ｔリンパ球を活性化し、肝細胞癌細胞を破壊することである。
【０００５】
１）ヒトにおいて免疫応答を生じさせる、ヒトαフェトプロテインペプチドの決定および生成
ヒトαフェトプロテイン分子のどの部分が、ヒトにおいて免疫応答を生じさせ得るかを決定するために、全ヒトαフェトプロテイン（ｈＡＦＰ）分子（配列番号２）由来の一連のペプチドを試験し、クラスＩ拘束ペプチドとして、それらが抗腫瘍応答を生じさせ得るか否か、および細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）についての標的分子として作用し得るか否かを決定した。ｈＡＦＰ由来の潜在的な免疫原性ペプチドを、ＨＬＡ Ａ２．１クラスＩ結合グルーブ(groove)に対する潜在的な適合に基づいて選択した。ＨＬＡＡ２．１（世界保健機構（World Health Organization）特殊命名法における、ＨＬＡ Ａ＊０２０１）は、コーカサス人において最もありふれた対立遺伝子であり、そしてまた他の民族においてよく分布していることから、ＨＬＡ Ａ２．１を選択した。決定を、以下のように行った。
【０００６】
第１に、公開されたコンセンサス配列によって、ＨＬＡ Ａ２．１に潜在的に結合するｈＡＦＰ（配列番号２）由来のペプチド配列を同定した。ＨＬＡ Ａ２．１は、長さが８〜１０アミノ酸であるペプチド、しかし好ましくは９マー（ｍｅｒ）のペプチドに結合すると考えられている。アミノ酸のイソロイシン、ロイシン、およびメチオニンは、ペプチド２位における重要なアンカー残基であると考えられており、そしてアミノ酸のイソロイシン、ロイシン、およびバリンは、ペプチド長に依存して、ペプチド９位または１０位における重要なアンカー残基であると考えられている。
ＨＬＡ Ａ２．１クラスＩ結合モチーフに適合した適切なペプチド配列を、University of Wisconsin Genetics Computer Group Program「find patterns」を用いて同定し、ｈＡＦＰ配列（配列番号２）をスクリーニングし、そして２つの強(strong)結合「アンカー」残基（それぞれ、９および１０残基を有するペプチドについて、２位の残基および９位または１０位の残基）を含む、９および１０マーのペプチド（「強(strong)」ペプチドと命名する）；１つのみの強結合(strong binding)アンカー残基を含む、９および１０マーのペプチド（「中間(intermediate)」ペプチドと命名する）：または強結合アンカー残基を含まないが、他のポジティブな結合残基を含む、９および１０マーのペプチド（「弱(weak)」ペプチドと命名する）を同定した。結合を破壊すると考えられる残基を１つより多く含むペプチド配列を、除去した。
【０００７】
スクリーニング研究によって、ＨＬＡ Ａ２．１クラスＩ結合モチーフに潜在的に結合する、全部で７２のペプチド配列を同定したが、これらの配列のうちの６つをさらなる考慮から除外した。なぜなら、この６つの配列は、それらの高疎水性に起因して合成が困難であったからである。残りの６６個のペプチド配列を、当業者に公知の技術によるChiron Mimetopes(Victoria，Australia)によって試験するために合成した。これらは、１０個の「強」ペプチド配列、４３個の「中間」ペプチド配列、および１３個の「弱」ペプチド配列を含んだ。ここで表Ｉに言及するように、ペプチド命名番号、ｈＡＦＰ配列（配列番号２、ペプチド配列によって示される）の残基、および６６個のペプチド配列の各々についてペプチドが含むアミノ酸を示す。ペプチド命名番号は、Chironからのペプチドの受領書の順番に基づき、従ってｈＡＦＰ分子（配列番号２）のアミノ酸配列に関して非連続的である。
【０００８】
表Ｉ ヒトＡＦＰペプチド配列
【０００９】
次に、６６個のペプチドの各々を、濃度依存方法でＨＬＡ Ａ２．１に結合する能力、およびそれによって以下のようなＴ２細胞安定化アッセイにおいてＨＬＡ Ａ２．１を安定化する能力について試験した。各ペプチドを、ＴＡＰ１およびＴＡＰ２欠失Ｔ２細胞とともに一晩インキュベートした。このＴ２細胞は、前日の晩に室温でインキュベートし、細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子の発現を増加させていた。各ペプチドを、０．１μＭ〜１００μＭのペプチド濃度の範囲にわたって、ＨＬＡ Ａ２．１分子を結合する能力について試験した。Ｔ２細胞株において、８〜１０マーのペプチドで満たされるＭＨＣ分子のみが、細胞表面上で安定である。ＨＬＡ Ａ２．１の安定性を、抗ＨＬＡ Ａ２抗体ＢＢ７．２（ＡＴＣＣ）およびヤギ抗マウスＦＩＴＣで染色した後にフローサイトメトリーによってアッセイした。結合についてのポジティブコントロールとして、ＦＬＵマトリクスペプチド（ＦＬＵマトリクス１タンパク質の残基５８〜６６（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ））およびＭＡＲＴ−１ペプチド（全タンパク質についてＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ０６４５２の、ＭＡＲＴ−１の残基２７〜３５（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ））を使用した。ＦＬＵマトリクスペプチドは、０．５μＭの濃度にて、Ｔ２細胞上でＡ２．１分子を一貫して安定化していた。
ここで、表ＩＩに言及するように、６６個のｈＡＦＰペプチドのうちの２２個のリストを示す。第１欄はペプチド命名番号を列挙し、第２欄はｈＡＦＰ配列（配列番号２、ペプチド配列によって示される）の残基を同定し、そして第３欄は配列内のアンカー残基の数を同定する。
表ＩＩの第４列は、Ｔ２細胞へＨＬＡ２．１が結合することが要求されるペプチドの最小濃度を示す。見られ得るように、１０の「強い(strong)」ペプチド配列のうちの６つおよび４３の「中間(intermediate)」ペプチド配列のうちの７つはＨＬＡ２．１への結合能力を示した。さらに、１３の「弱い(weak)」ペプチド配列のうちの９つはＨＬＡ２．１への結合能力を示した。
【００１０】
さらに、各々の６６のペプチドもまた、EBVリンパ芽球腫細胞オフ(off)速度論アッセイにおいて、経時的に、クラスＩ分子からのそれらの解離速度について試験した。なぜなら、クラスＩ分子に結合したペプチドの解離速度であるオフ速度論が、このペプチドの免疫原性の重要な予測であることが見い出されているからである。例えば、ウイルスペプチドＨＰＶ １６ Ｅ７、ＥＢＶ ＬＭＰ２、ＦＬＵ Ｍ１、およびＨＩＶ ｐｏｌのような非自己結合ペプチドについて、最も遅いオフ速度論を示している最も強い結合ペプチドが最も免疫原性であることが見い出されている。さらに、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１のようなメラノーマ抗原由来の免疫原性エピトープである多くの公知の自己タンパク質は、１つのアンカー残基を有し、そして可溶性クラスＩ再構成アッセイによって安定性の少ない結合親和性を有するが、非常に遅いオフ速度論を有することが見い出されている。例えば、Bakker，A．B．ら、Analogues of CTL epitopes with improved MHC class binding capacity elicit anti-melanoma CTL recognizing the wild-type epitope．Int J Cancer，1977．70(3):p.302-9;およびvan der Burg，S．H.ら、Do epitopes derived from autoantigens display low affinity for MHC class I?(letter)．Immunol Today，1997．1892):p．97-98;（各々は、それらの全体において参考として本明細書中で援用される）を参照のこと。
【００１１】
表ＩＩ ヒトＡＦＰペプチド配列および結合特性
【００１２】
ＥＢＶリンパ芽球腫細胞オフ速度論アッセイを、van der Burg，S.H.ら、Immunogenicity of peptides bound to MHC class I molecules depends on the MHC-peptide complex stability．J．Immunology，1996．156(9):p.3308-3314（これはその全体において本明細書中で参考として援用される）中に開示されるように実施した。簡単に言うと、ＨＬＡ Ａ２．１ ＥＢＶリンパ芽球腫細胞を、ＭＨＣ分子を不安定にする穏やかなｐＨ３．２酸性緩衝液中で、表面クラスＩペプチドおよびβ２ミクログロブリンが剥離した。各々のペプチドを、β２ミクログロブリンの存在下で１時間、過剰な２００μＭで剥離された細胞上にて直接パルスした。次いで、過剰な非結合ペプチドを洗浄除去し、そして続けて細胞を３７℃で０、２、４、および６時間インキュベートした。細胞を各時点の終わりに洗浄し、そしてＢＢ７．２抗体でＨＬＡ Ａ２について染色した。平均蛍光強度は剥離されたが、ペプチドでパルスされなかった細胞から少なくとも１．５倍増加する場合、ペプチドクラスＩ複合体を安定であるとした。
Ｔ２細胞安定化アッセイおよびＥＢＶリンパ芽球腫細胞オフ速度論アッセイの両方を少なくとも２回、各々のペプチドについて実施した。表ＩＩを再度参照すると、第５列は、ＥＢＶリンパ芽球腫細胞におけるペプチド安定性の時間を示す。見られ得るように、わずか３つの強いペプチド（ＡＦＰ５、ＡＦＰ１４およびＡＦＰ２２）、４３の中間ペプチドのうちの１２（ＡＦＰ４９を含む）および弱いペプチドの１つが遅いオフ速度論のレベルを示した。Ｔ２細胞安定化アッセイおよびＥＢＶリンパ芽球腫細胞オフ速度論アッセイの両方を考慮すると、両方のアッセイにおいて最も良い結果を提供する７つのペプチド配列は、ＡＦＰ５、ＡＦＰ７、ＡＦＰ１３、ＡＦＰ１４、ＡＦＰ２８、ＡＦＰ３８、およびＡＦＰ４５であった。
【００１３】
次に、表ＩＩＩの第１列に記載されるペプチドを、次いで、Plebanski，M．ら、Induction of peptide-specific primary cytotoxic T lymphocyte responses from human peripheral blood．Eur J．Immunol．1995．25(6):p.1783-7で開示される方法によってインビトロにおいてペプチド特異的ＣＴＬを産生するために用いた。そしてＣＴＬをＡ２．１陽性、ＡＦＰ陽性肝細胞癌細胞を溶解するそれらの能力について試験した。溶解は、ペプチドがヒトＡＦＰの天然にプロセスされる免疫原性エピトープであり、そして強力な標的抗原であることを示唆する。ＨＬＡ Ａ２．１ドナーおよび細胞株をＢＢ７．２（ＨＬＡ Ａ２）抗体（ＡＴＣＣ）でスクリーニングし、そして当業者に公知の技術により、ＰＣＲ、およびUCLA Tissue Typing Laboratory（当業者に公知の技術に従って）による直接的配列分析によって、確認およびサブタイプ化した。
簡単にいうと、ペプチド特異的ＣＴＬは、以下のような表ＩＩＩ ＡＦＰペプチドに記載されるペプチドヘ生じた。正常なＡ２．１ドナー由来の２×１０７末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ勾配により精製した。これらのＰＢＭＣを、３７℃で９０分間、１ｍｌの無血清培地中で５０μｇ／ｍｌペプチドでパルスした。次いで細胞を一度リンスし、そしてＲＰＭＩ１０％自己血清中のＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＫＬＨ（４．５μｇ／ｍｌ）とともに、０日にウェルあたり１．５ｍｌの１０％自己血清ＲＰＭＩ培地中、３×１０６ＰＢＭＣで２４ウェルプレートに配置した。ＣＴＬを非接着細胞を除去することにより、ならびにそれを、新鮮な、ペプチドパルス、洗浄、および照射したＰＢＭＣに、１：１のＰＢＭＣ対ＣＴＬ比で加えることによって、毎週再剌激した。ＩＬ−２を１０ユニット／ｍｌで毎週２回、加えた。
【００１４】
表ＩＩＩ ヒトＡＦＰペプチド細胞障害性
【００１５】
培養の３週間後、推定のｈＡＦＰペプチド産生ＣＴＬを、標準の４時間５１Ｃｒ放出アッセイにおいて細胞障害性について試験した。ＣＴＬを、ＣＴＬを産生するために使用した特異的ｈＡＦＰペプチドでパルスしたＴ２細胞に対してペプチド特異的な殺傷について試験し、そしてＦＬＵマトリックスペプチドまたはコントロールであるＭＡＲＴ−１ペプチドでパルスしたＴ２細胞と比較した。非特異的ＮＫ殺傷を、ＮＫ感受性標的Ｋ５６２で評価した。ＣＴＬをまた、ＨＬＡ Ａ２．１陽性、ＡＦＰ陽性ヒト肝細胞癌細胞株であるＨｅｐＧ２に対して試験した。
ここで、表ＩＩＩを参照すると、陽性ペプチド細胞障害性結果を提供した正常ドナー由来のＣＴＬを産生するために使用された１２のＡＦＰペプチド配列についての試験の細胞障害性結果が示される。第２列は、大容量のリンパ球培養物のＣＤ４／ＣＤ８表現型を示す。第３列および第４列はそれぞれ、ペプチドパルスしたＴ２細胞およびＨｅｐＧ２標的に対して、エフェクター（ＣＴＬ）対標的の比（Ｅ：Ｔ）を有する細胞障害性のレベルを示す。
表ＩＩＩに見られ得るように、ペプチドＡＦＰ２２、ＡＦＰ３９、ＡＦＰ４５、ＡＦＰ４９は、高レベルのＡＦＰ＋ＨｅｐＧ２細胞、ＨＬＡ Ａ２．１＋ＨｅｐＧ２細胞の特異的殺傷を証明した。ＡＦＰ２２およびＡＦＰ４９は４つのアミノ酸の重複（ｈＡＦＰ配列番号２の残基５４７〜５５０）を有することが留意され得る。さらにＡＦＰ２２は、ＡＦＰ２３と２つのアミノ酸の重複（ＡＦＰ２３を有する配列番号２の残基５５５〜５５６）を有し、最低限のＨｅｐＧ２殺傷を示した。
ＡＦＰ４９を使用して生成したＣＴＬを試験して、そしてＨｅｐＧ２細胞障害性を維持した。さらに新しいＡＦＰ４９ペプチド産生ＣＴＬ培養物を、２つの異なる正常なＨＬＡ Ａ２．１ドナーを使用して作製した。さらなる標的を、ＡＦＰ４９を使用して観測された細胞障害性がＡＦＰ抗原特異的でありそしてクラスＩ制限化であることを確認するために使用した。
【００１６】
ここで図１を参照して、これらの試験の代表的なデータを示す。第１に、観測された細胞障害性がクラスＩ制限化であることを確認するために、抗β２ミクログロブリン抗体をＨｅｐＧ２細胞へのＣＴＬ−Ｔ細胞レセプターの相互作用をブロックするために使用した。これは、ＨｅｐＧ２溶解物において有意な減少を生じた。次に、非特異的ＮＫ／ＬＡＫ殺傷を除くために、４０倍過剰の非標識（コールド）Ｋ５６２細胞を加えた。これは、ＨｅｐＧ２溶解物において有意な減少を生じなかった。さらに、ＭＩＩＣクラスＩ発現が、γＩＦＮ（５０ユニット／ｍｌ）との一晩のインキュベーションによって、ＨｅｐＧ２細胞においてアップレギュレートされた。見られ得るように、ＭＨＣクラスＩ発現アップレギュレーションは、ＨｅｐＧ２溶解物を増加した。また、ＡＦＰ＋、ＨＬＡ Ａ２．１＋陰性肝細胞癌細胞株、Ｈｅｐ３Ｂ、つまりクラスＩミスマッチ化肝細胞癌細胞株もまた、標的として用いた。ＡＦＰ４９ ＣＴＬは、非常に低いレベルでこれらのＨｅｐ３Ｂ標的を溶解した。この少量の観測されたＨｅｐ３Ｂ溶解物を、コールドＫ５６２細胞を加えた場合のＨｅｐＧ２の特異的殺傷の保持とは対照的に、過剰のコールドＫ５６２細胞を加えることによって取り除いた。
【００１７】
ここで、図２に言及すると、ペプチド標的およびＡＦＰ標的の両方に対してアッセイされた正常ＨＬＡ Ａ２．１ドナー由来のぺプチドパルスされたＰＢＭＣから作成したＣＴＬの標準クロム放出アッセイについての標的に対する特異的溶解のパーセントの棒グラフが示される。ＣＴＬのペプチド特異性を確認するために、それぞれの培養物を、ＣＴＬ培養物が作製される特異的ペプチドでパルスされたＴ２細胞に対して試験し（最も左の棒）、そして異なるＨＬＡ Ａ２．１結合ペプチドでパルスされたＴ２細胞（コントロールとして）と比較した（左から２番目の群の棒）。理解され得るように、ＡＦＰ４９ペプチド培養物、ＡＦＰ４９Ｖ９ペプチド培養物、ＡＦＰ５ペプチド培養物およびコントロールのＦＬＵマトリックスペプチド培養物の全てが、特異的ペプチドでパルスされたＴ２細胞の溶解によるペプチド特異性を示したが、異なるペプチドでパルスされたＴ２細胞に対してはペプチド特異性を示さなかった。
再度、図２に言及すると、これらのペプチド特異的ＣＴＬ培養物のそれぞれをまた、ＡｄＶｈＡＦＰまたはコントロールのＡｄＶＲＲ５のどちらかで形質導入されたＭ２０２（ＨＬＡＡ２．１＋／ＡＦＰ−）メラノーマ細胞の死滅について試験した。ＡＦＰペプチドのＡＦＰ５およびＡＦＰ４９、ならびにＡＦＰ４９の９位に単一のアミノ酸置換を有するペプチドＡＦＰ４９Ｌ９（配列番号３（ＧＶＡＬＱＴＭＫＬ））およびペプチドＡＦＰ４９Ｖ９（配列番号４（ＧＶＡＬＱＴＭＫＶ））のペプチド特異的ＣＴＬ培養物のそれぞれは、コントロールのＲＲ５で形質導入されたＭ２０２細胞の死滅よりもＡｄＶｈＡＦＰで形質導入されたＭ２０２細胞に有意に多い死滅を示す。ＦＬＵペプチド特異的ＣＴＬ培養物は、Ｍ２０２／ＡｄＶｈＡＦＰおよぴ４２０２／ＲＲ５の両方を同様の細胞障害性バックグランドレベルで殺傷した。
【００１８】
Ｍ２０２細胞は正確にプロセッシングすることが公知であり、ＨＬＡ Ａ２．１制限免疫優性ＭＡＲＴ−１ペプチドを提示する。従って、これらは、ＡｄＶｈＡＦＰで形質導入され、そしてＡＦＰ由来の正確なＨＬＡ Ａ２．１制限エピトープがプロセッシングされ、表面に提示されることを期待するのに理想的な細胞株である。ゆえに、この実験は、ＡＦＰ５、ＡＦＰ４９、ＡＦＰ４９Ｌ９（配列番号３）およびＡＦＰ４９Ｖ９（配列番号４）が、天然にプロセッシングされ、そしてＡＦＰ＋腫瘍を殺傷するＣＴＬを標的化するために使用され得るペプチドを提示することを示す。さらに、ＡＦＰ４９Ｌ９（配列番号３）およびＡＦＰ４９Ｖ９（配列番号４）に見られるように、ペプチド特異的ＣＴＬ培養物は、ＡＦＰ４９ペプチド特異的ＣＴＬ培養物よりさらにより効果的にＭ２０２／ＡｄＶｈＡＦＰを殺傷し、従って、ＡＦＰ４９Ｌ９（配列番号３）およびＡＦＰ４９Ｖ９（配列番号４）は、ＡＦＰ＋細胞に対する免疫応答の標的化のための改善されたぺプチドである。
【００１９】
従って、この開示から理解され得るように、本発明はヒトを含む哺乳動物における癌の予防または処置を包含する。ここで、癌細胞は、表面マーカーとして少なくともαフェトプロテイン分子の部分を保有する。予防または処置は、少なくともαフェトプロテイン分子の部分を含むペプチドまたは少なくともαフェトプロテイン分子の部分の置換もしくは他の変化により生成されるペプチドを含む組成物を哺乳動物に投与することにより達成される。これらのペプチドには、ＡＦＰ５、ＡＦＰ７、ＡＦＰ１３、ＡＦＰｌ４、ＡＦＰ１８、ＡＦＰ２２、ＡＦＰ２３、ＡＦＰ２８、ＡＦＰ３８、ＡＦＰ３９、ＡＦＰ４５、ＡＦＰ４９、ＡＦＰ４９Ｌ９（配列番号３）、およびＡＦＰ４９Ｖ９（配列番号４）が挙げられる。
【００２０】
２）その表面にαフェトプロテインを保有する細胞（肝細胞性癌細胞を含む）に対する免疫応答の生成のためのαフェトプロテインｃＤＮＡを用いる哺乳動物の免疫
αフェトプロテインｃＤＮＡを用いる哺乳動物の免疫は、その表面にαフェトプロテインを保有する腫瘍細胞（肝細胞性癌細胞を含む）を用いる試行に対して部分的または完全に保護的である免疫応答を生成する。この効果を以下のように実証した：
ヒトαフェトプロテインｃＤＮＡは以下のように作製した。最初に、ヒトαフェトプロテインｃＤＮＡを、Trlzol法(LlfeTechnologles,Galthersburg,MD、製造者らの指示に従う）により、そしてRNAzolB法(TelTest,Frlendswood,TX)によって、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣから入手可能）から作製された総ＲＮＡからＰＣＲ技術により生成した。およそ１μｇの総ＲＮＡを、Perkin Elmer ＲＴ−ＰＣＲキットおよび公開された配列に基づいたＡＦＰ特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ反応において使用した。５’プライマーは、５’ＧＣＡ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＧＧ ＧＴであった。３’プライマーは、５’ＡＡＣ ＴＣＣ ＣＡＡ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＣＧ ＡＧＴであった。プライマーは、プライマーに取り込まれた制限エンドヌクレアーゼ部位ＸｂａＩを有するコード領域全体（ＡＴＧ〜停止コドン）、およびＰＣＲ後の酵素切断を容易にする６塩基（ＣＴＣ ＴＣＴ）を有する終末を含んだ。プライマー配列は、Operon Technologiesにより合成された（５０ｎＭスケール、未精製）。
【００２１】
上記で作製されたヒトαフェトプロテインのＰＣＲ ｃＤＮＡ産物を、アガロースゲル上で分析し、そのサイズをチェックした。正確なサイズの産物を、Qiagen PCR-quick clean-upカラムで精製し、ＸｂａＩ酵素で消化してその部位をプライマー中に設計し、そして当業者に公知の技術に従って、ｐＲｃＣＭＶ（ヒト用）またはｐＣＲ３．１（マウス用）哺乳動物発現ベクター（Invitorogen,Carlsbad,CA）のいずれかでクローニング反応において使用した。陽性プラスミドを、ミニプレップ分析により同定した。これらの陽性プラスミドを、マキシプレップし、そしてアリコートをＵＣＬＡでＤＮＡ配列決定の中心の施設（DNA sequencing core facility）により配列決定して、挿入物の配列同一性を確認した。配列データは１つの鎖についてのみであり、ＡＦＰ挿入物の同一性が確認された。従って、クローニングされたヒトＡＦＰ ｃＤＮＡは、公開されたヒトＡＦＰ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０００７７、Ｊ０００７６、Ｖ０１５１４、塩基４８〜１８７７（配列番号１））に対して同一であった。
マウスＡＦＰ ｃＤＮＡ（ｍＡＦＰ ｃＤＮＡ）を、ヒトＡＦＰ ｃＤＮＡをクローニングするために使用される上記に開示の方法に対応する方法（ただしマウス特異的プライマーを使用）を用いて、クローニングした。５’マウス特異的プライマーは、５’ＧＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＧＧ ＡＴＣ ＡＣＡであった。３’マウス特異的プライマーは、ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＣＣ ＣＡＡ ＡＧＣ ＡＴＣ Ａであった。総ＲＮＡ単離のために使用されたマウスＡＦＰ陽性細胞株は、Ｈｅｐａ１６であった。本明細書中に開示される安定なトランスフェクタントおよび筋肉内注射実験の全てを、シグナル配列を含むｃＤＮＡクローンを用いて行った。
【００２２】
次いで、ｍＡＦＰ ｃＤＮＡを、真核細胞発現ベクターＶＲ１０１２（Vical,Inc.,San Diego,CA）に配置した。ＶＲ１０１２発現ベクターは、増強された発現のためのイントロンを含む強い構成性のＣＭＶ最初期のプロモーター／エンハンサー、ＢＧＨ終結およびインビボ発現のためのポリＡ配列を含む。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにｍＡＦＰ ｃＤＮＡを含むＶＲ１００２またはコントロールとして生理食塩水１００μｇの注射を１週間に１回、３週間与えた。最後の注射の１週間後、ＶＲ１００２ｍＡＦＰ ｃＤＮＡ免疫化マウスおよび非免疫化のコントロールマウス群の両方を、同系のマウスにおいて次第に増殖する腫瘍の単一の細胞懸濁液から得られた４×１０６個のＢＷＩＣ３肝細胞性癌細胞（生細胞）で試行した。ＢＷＩＣ３は、ｍＡＦＰ陽性マウス細胞株である。
図３を参照すると、免疫した動物（白四角）は、コントロール動物（黒四角）に比べ、遅延した腫瘍の増殖あるいは完全な保護を示すことが理解され得る。これらの知見は、数度繰り返された。対応する実験において、ＭＡＲＴ−１メラノーマ抗原を発現するプラスミドベクターの筋肉内注入は、ＢＷＩＣ３肝細胞の癌細胞試行から動物を保護しなかった（データは示さず）。
【００２３】
別の１群の実験において、代用物としてのマウス肝細胞癌株は、ｍＡＦＰ ｃＤＮＡによるＥＬ４（Ｈ−２ｂ）リンパ種の安定なトランスフェクションにより構築された。腫瘍株ＥＬ４（ｍＡＦＰ）は、親ＥＬ４細胞株と同様のインビボ増殖速度論を有していた。ＲＴ−ＰＣＲを用いたところ、ＥＬ４（ｍＡＦＰ）腫瘍細胞株は、ＢＷＩＣ３肝細胞の癌細胞株の１％以下のレベルのＡＦＰを産生するように思われた。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ｍＡＦＰ ｃＤＮＡまたはコントロールとしての生理食塩水を含む１００μｇ ＶＲ１０２ｌを、週１回、３週間の間、筋肉内注入した。最後の注入の１週間後、ＶＲ１０１２ ｍＡＦＰ ｃＤＮＡにより免疫化マウスおよび非免疫化コントロールの群の両方を、７．５×１０５の生存可能なＥＬ４（親）あるいはＥＬ４（ｍＡＦＰ）細胞で試行（challenge）した。
図４を参照すると、免疫した動物細胞（白四角）およびコントロール動物（黒丸）は、ＥＬ４（親）細胞による試行の場合、差異を示さない（ｐ＝０．０７，スチューデントのＴ検定）ことが理解され得る。しかし、図５に見られるように、免疫した動物（白四角）は、ＥＬ４（ｍＡＦＰ）細胞による試行の場合、コントロール動物（黒丸）と比較して、部分的な保護を示した（ｐ＝０．０７，スチューデントのＴ検定）。これらの知見はまた、数度繰り返された。
【００２４】
さらなる一連の実験において、αフェトプロテインを表面に有する細胞での試行に対する保護は、安定にトランスフェクトされたマウス線維肉腫細胞株を代用物として用いることにより示された。第一に、安定にトランスフェクトされたマウス線維肉腫細胞株は、ＤＯＴＡＰリポフェクション法（Boehringer Mannheim、製造者の指示に従う）またはＣａＰＯ４沈殿法（当業者に周知である技法に従う）のいずれかにより産生された。要約すると、DOTAPリポフェクション法は、前日の夜にオーバーナイトで接着させた、６ウェルプレートでウェルあたり１×１０５の細胞を用いる。２．５μｇのプラスミド（マウスのＡＦＰ ｐＣＲ３．１）を２５μｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび５０μｌのＨｅｐｅｓ中の１５μｌの脂質を室温で１５分間混合する。この溶液を、１ｍｌの培養培地（１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０）中に希釈し、そしてウェル中の細胞に加える。４〜６時間後、溶液を２ｍｌの新たな培養培地で交換する。４８〜７２時間後、５００μｇ／ｍｌ（総濃度、７５％活性）のＧ４１８（ジェネティシン(geneticin)）により、選択を始めた。２〜３週間の選択の後、任意の潜在的なトランスフェクタントを、ＲＴ−ＰＣＲによりマウスＡＦＰ ＲＮＡおよびｎｅｏ−ＲＮＡの発現について試験し、マウスＡＰＲＴ遺伝子発現で半定量した。
哺乳動物におけるＡＦＰ免疫の腫瘍産生を防止する効果を以下のように示した。マウスＡＦＰ−ｐＣＲ３．１プラスミドおよびマウスＡＦＰ−ＡｄＶシャトルベクタープラスミド（ｐＡＣ ＣＭＶｐＬｐＡ）は、当業者に公知である技法に従い調製し、そしてマウスＡＦＰ−ＶｉｃａｌベクターＶＲ１０２ｌを構築した。マウス線維肉腫細胞株ＦＳＡ，ＮＦＳＡ，ＭＣＡＫおよびＳＶＥＣを、上記ｍＡＦＰ ＰＣＲ３．１により安定にトランスフェクトした。
【００２５】
Qiagenプラスミドプレップキット（５０μｌ ＰＢＳ中に５０μｇのプラスミド）によりエンドトキシンを含まずに調製した、ｎｅｏ−含有発現プラスミドであるマウスＡＦＰ−ＡｄＶシャトルベクターを用い、Ｃ３Ｈマウスを、プラスミドＤＮＡで３週間、毎週筋肉内注射することにより免疫した。次に、Ｃ３Ｈマウスを、ＡＦＰ発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＦＳＡ Ｃ３Ｈバックグラウンド（background）の線維肉肺細胞で、あるいはｎｅｏ発現ベクターのみで安定にトランスフェクトされたＦＳＡ Ｃ３Ｈバックグラウンドの線維肉肺細胞で試行し、ＡＦＰ抗自己抗原反応が発生するか、あるいはネオマイシンを発現する安定なトランスフェクタントを用いることにより、ＡＦＰ応答を遮蔽する抗ｎｅｏ（非自己抗原）反応を引き起こすか否か判定した。肺瘍細胞はインビボで継代され、そして単一の細胞懸濁液を腫瘍試行に用いた。
図６を参照すると、腫瘍後１８日目の試行までに、ＡＦＰ発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＦＳＡ Ｃ３Ｈバックグラウンドの線維肉腫細胞で試行した免疫したＣＨ３マウス（下部の黒四角）のうち、１つのみが何らかの腫瘍の増殖（３ｍｍ×３ｍｍの腫瘍）を示し、その一方で、ＡＦＰ発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＦＳＡ Ｃ３Ｈバックグラウンドの線維肉腫細胞で試行した残り４匹の免疫したＣＨ３マウス（黒丸）は、全く腫瘍の増殖の徴候を示さなかったことが理解され得る。対照的に、５匹中２匹のＡＦＰ発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＦＳＡ Ｃ３Ｈバックグラウンドの線維肉腫細胞で試行（challenge）した非免疫化Ｃ３Ｈマウス（上部の黒四角）は、何らかの腫瘍の増殖を示した（平均６．８ｍｍ２）。ＦＳＡ親腫瘍細胞およびｎｅｏ−ベクター−ＦＳＡ（neo-vector-FSA）細胞は、免疫化（黒ダイヤ）および非免疫化（黒逆三角）ＣＨ３マウスの両方で、同様に増殖する。このプロトコールは繰り返され、同様の結果が得られた（データは示さず）。
【００２６】
第２の実験は、Jackson Labs(Bar Harbor Marine)からのＣ５７Ｌ／Ｊ（「リーデン（leaden）」）マウスを用い行われた。これらのマウスは、ネオマイシンを含有しないＶｉｃａｌ（ＶＲ１０２１）由来のプラスミドベクターで免疫し、従って、マウスＡＦＰ遺伝子のみを合成する。Ｃ５７Ｌ／Ｊマウスは、同系のマウス腫瘍細胞株（ＡＴＣＣからのＢＷＩＣ３）で試行した。これらＢＷＩＣ３細胞は、上記のように産生された安定にトランスフェクションしたマウス線維肉腫細胞よりも、かなり高いレベルでマウスＡＦＰを合成した。
Ｃ５７Ｌ／Ｊマウスを、上記のとおり、ｍＡＦＰ−Ｖｉｃａｌベクターを用いて免疫し、そしてマウスあたり１×１０６のＢＷＩＣ３細胞による腫瘍試行は、皮下に行われた。図７を参照すると、１４日後の腫瘍試行で、非免疫化Ｃ５７Ｌ／Ｊマウス（黒四角）は、免疫化Ｃ５７Ｌ／Ｊマウス（黒丸）の腫瘍よりも、平均２倍の大きさの腫瘍を有することが理解され得る。
【００２７】
第３の実験で、さらなるＣ５７Ｌ／Ｊマウスを、マウスＡＦＰ遺伝子のみを合成するプラスミドベクター（ＶＲ１０２１）で免疫し、上記のとおりｌ×１０６のＢＷＩＣ３細胞で試行した。図８を参照すると、試行後１７日までに、全ての５匹の非免疫化（黒丸および黒四角）マウスは、平均の直径１１．４ｍｍ２の腫瘍を有することが埋解され得る。対照的に、ｍＡＦＰ−Ｖｉｃａｌで免疫したマウス５匹中３匹（黒三角）は、平均９ｍｍ２の腫瘍を有し、免疫したマウス１匹（黒ダイヤ）は小さい３ｍｍ２の腫瘍を有し、１匹のマウス（黒逆三角）は、全く腫瘍を示さなかった。
従って、本開示により評価され得るように、本発明は、癌細胞が表面のマーカーとしての少なくともαフェトプロテイン分子の部分を有する場合、ヒトを含む哺乳動物における癌の予防および処置を包含する。予防および処置は、少なくともαフェトプロテイン分子の部分に対する免疫反応を引き起こすために、少なくともαフェトプロテインｃＤＮＡの部分を含む組成物を哺乳動物へ投与することにより達成される。
【００２８】
３）細胞表面にαフェトプロテインを有する細胞へと遺伝子操作された樹状細胞（肝細胞癌細胞を含む）を用いる哺乳動物の免疫
マウスＡＦＰαフェトプロテインｃＤＮＡを発現する、組換えアデノウイルスベクター（ＡｄＶｍＡＦＰ）を用いて形質導入した樹状細胞を用いる哺乳動物の免疫によって、肝細胞癌細胞での試行に対して部分的または完全に保護的である免疫応答がもたらされる。この効果を以下に示す。
第一に、マウスＡＦＰを発現する組換えアデノウイルスベクター（ＡｄＶｍＡＦＰ）を、当業者に公知の技術に従って構築した。例えば、Ribas、A.、L.H.Butterfield、W.H.McBride、S.M.Jilani,L.A.Bui、C.M.Vollmer、R.Lau、V.B.Dissette、B.Hu、A.Y.Chen、J.A.Glaspy、およびJ.S.Economou、1997、Genetic immunization for the melanoma antigen MART-1/Melan-A using recombinant adenovirus-transduced murine dendritic cells．Cancer Res 57:2865；ならびにToloza,E.M.、K.Hunt、S.Swisher、W.McBride,．R.Lau、S.Pang、K.Rhoades、T.Drake．A.Belldegrun、J.Glaspy、およびJ.S.Economou．1996、In vivo cancer gene therapy with a recombinant interleukin-2 adenovirus vector，Cancer Gene Ther 3:11（これらは、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。次いで、樹状細胞を、当業者に公知の技術に従って、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４中で７日間分化させたＣ５７ＢＬ／６骨髄から作製した。例えば、Ribas、A.、L.H.Butterfield、W.H.McBride、S.M.Jilani,L.A.Bui、C.M.Vollmer、R.Lau、V.B.Dissette、B.Hu、A.Y.Chen、J.A.Glaspy、およびJ.S.Economou、1997、Genetic immunization for the melanoma antigen MART-1/Melan-A using recombinant adenovirus-transduced murine dendritic cells．Cancer Res 57:2865;ならびにInaba,K、M.Inaba、N.Romani、H.Aya、M.Deguchi．S.Ikehara、S.Muramatsu、およびR.M.Steinman、1992、Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophagecolony-stimulating factor．J Exp Med 176:1693（これらは、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００２９】
ここで図９を参照すると、種々の感染多重度（ＭＯＩ）でＡｄＶｍＡＦＰを用いて形質導入したマウスＤＣから単離されたｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析が示されている。左から右へと読むと、レーン１はゲルサイズ標準を示す；レーン２は、ネガティブコントロールとして使用されたｍＡＦＰネガティブ細胞についての結果を示す；レーン３はネガティブコントロールとして使用されたマウス樹状細胞についての結果を示す；レーン４〜７は、それぞれ、１０、１００、１０００、および５０００のＭＯＩのＡｄＶｍＡＦＰを用いて形質導入したマウス樹状細胞についての結果を示す；レーン８は、ポジティブコントロールとして使用されたＢＷＩＣ３細胞についての結果を示す（およそ１．９ｋｂにおける上の最も目立つ線）；ならびにレーン９は、ＰＣＲ夾雑物についてのテンプレートなしコントロールとしての、二重蒸留水（ＤＤＷ）についての結果を示す。理解され得るように、マウスＡＦＰを発現する組換えアデノウイルスベクター（ＡｄＶｍＡＦＰ）は、樹状細胞に首尾よく形質導入された。
【００３０】
次に、５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの３つのグループを、２週間にわたって、ＡｄＶｍＡＦＰ、ＲＲ５（空のＥ１欠損アデノウイルス）を用いて１００のＭＯＩで形質導入した樹状細胞、または非処理樹状細胞のいずれかを５×１０５で１週間あたり１回の静注を与えることによって調製した。マウスのこれらの３つのグループおよびコントロールとして供される注射していないマウスの１グループを、最後の注射後１週間で、７×１０５のＥＬ４（ＡＦＰ）で試行した。結果を図１０に示す。理解され得るように、ＲＲＳ（黒三角形）、または非処理樹状細胞（黒逆三角形）を注射したマウスのいずれも、コントロールマウス（黒丸）も腫瘍試行に対する保護を示さなかった。対照的に、ＡｄＶｍＡＦＰを１００のＭＯＩで形質導入した５×１０５樹状細胞を注射したマウス（黒四角）は、腫瘍試行に対して部分的な保護を示した。
さらに、５匹のマウスの別のグループを、２週間にわたって、ＡｄＶｍＡＦＰで１００のＭＯＩで形質導入した５×１０５樹状細胞の、１週間当たり１回の静注を与えることによって調製した。形質導入樹状細胞の最後の注射後１週間での４×１０６ＢＷＩＣ３腫瘍細胞での試行に対する、このグループの応答を、同様であるが注射していないコントロールマウスの１グループの応答と比較した。この試験の結果を図１１に示す。理解され得るように、免疫したマウス（黒四角）は、コントロールマウス（黒丸）と比較して、腫瘍試行に対して有意な保護を示し、これは、形質導入した樹状細胞での処置の有効性を実証する。
【００３１】
従って、本開示から理解され得るように、本発明は、哺乳動物（ヒトを含む）における癌を予防または処置する工程（ここで、癌細胞は、少なくとも、表面マーカーとしてαフェトプロテイン分子の部分を有する）を包含する。この予防または処置は、αフェトプロテインｃＤＮＡを発現する組換えベクターで形質導入した免疫系細胞（例えば、樹状細胞）を含有する組成物を哺乳動物に投与することによって達成される。
【実施例】
【００３２】
実施例Ｉ 哺乳動物における肝細胞癌の処置
本発明の１つの実施態様によれば、ヒトにおいて少なくともαフェトプロテイン分子の部分に対する免疫応答を生成することによってヒトにおいて肝細胞癌を処置するための方法が提供される。本方法は、本明細書中に開示された方法の一つと同様の方法、または対応する方法においてヒトを免疫する工程、あるいはヒトを遺伝子操作してαフェトプロテインに対する免疫応答を生成する工程を包含する。好ましい実施態様において、肝細胞癌を有するヒトを、少なくともヒトαフェトプロテイン分子（例えば、ＡＦＰ５、ＡＦＰ７、ＡＦＰ１３、ＡＦＰ１４、ＡＦＰ１８、ＡＦＰ２２、ＡＦＰ２３、ＡＦＰ２８、ＡＦＰ３８、ＡＦＰ３９、ＡＦＰ４５、またはＡＦＰ４９）の部分に対する免疫応答を生成するように免疫する。この免疫によって、ヒトの免疫系が、細胞表面にαフェトプロテイン分子のその部分を有する肝細胞癌細胞を攻撃することを引き起こす。
本発明は特定の好ましい実施態様を参照してかなり詳細に議論したが、他の実施態様も可能である。従って、添付の請求の範囲の精神および範囲は、本明細書中に含まれる好ましい実施態様の記載に制限されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒトＡＦＰ４９ペプチドを用いて生成されたＣＴＬの相対的細胞障害性を示す、棒グラフである。
【図２】ペプチド標的およびＡＦＰ標的の両方に対してアッセイした、正常なＨＬＡＡ２．１ドナーからのペプチドパルスＰＢＭＣから生成されたＣＴＬの標準的なクロム放出アッセイの標的に対する％特異的溶解を示す、棒グラフである。
【図３】マウスＡＦＰ ｃＤＮＡで免疫したマウス（白四角）および免疫しなかったマウス（黒丸）について、ＢＷＩＣ３（ｍＡＦＰ陽性マウス腫瘍細胞株）の腫瘍試行後の日数に対する平均腫瘍容積のプロットである。
【図４】マウスＡＦＰ ｃＤＮＡで免疫したマウス（白四角）および免疫しなかったマウス（黒丸）について、ＥＬ４（親）（非ｍＡＦＰ産生性マウス腫瘍細胞株）の腫瘍試行後の日数に対する平均腫瘍容積のプロットである。
【図５】マウスＡＦＰ ｃＤＮＡで免疫したマウス（白四角）および免疫しなかったマウス（黒丸）について、ＥＬ４（ＡＦＰ）（ｍＡＦＰ産生性マウス腫瘍細胞株）の腫瘍試行後の日数に対する平均腫瘍容積のプロットである。
【図６】マウスＡＦＰ−Ａｄｖシャトルベクターｎｅｏ含有発現プラスミドを用いてプラスミドＤＮＡで免疫したマウス（黒丸、下の黒四角、黒菱形）および免疫しなかったマウス（上の黒四角、逆向きの黒三角）について、ＡＦＰ発現ベクターで安定にトランスフェクトしたＦＳＡ Ｃ３Ｈバックグラウンド線維肉腫細胞またはｎｅｏ発現ベクターのみで安定にトランスフェクトしたＦＳＡ Ｃ３Ｈバックグラウンド線維肉腫細胞の腫瘍試行後の日数に対する平均腫瘍直径のプロットである。
【図７】マウスＡＦＰ遺伝子を合成したプラスミドベクターで免疫したマウス（黒丸）および免疫しなかったマウス（黒四角）について、ＢＷＩＣ３の腫瘍試行後の日数に対する平均腫瘍直径のプロットである。
【図８】マウスＡＦＰ遺伝子を合成したプラスミドベクターで免疫したマウス（黒三角、黒菱形、逆向き黒三角）および免疫しなかったマウス（黒丸および黒四角）について、ＢＷＩＣ３の腫瘍試行後の日数に対する平均肺腫直径のプロットである。
【図９】種々のコントロール（レーン２、３、８、および９）と比較した、種々の感染多重度（ＭＯＩ）でＡｄＶｍＡＦＰで形質導入されたマウスＤＣから単離されたｍＲＮＡ（レーン４〜７）のＲＴ−ＰＣＲ分析である。
【図１０】ＡｄＶｍＡＦＰ形質導入樹状細胞で免疫したマウス（黒四角）、種々のコントロール物質で免疫したマウス（黒三角および逆向き黒三角）、および免疫しなかったマウス（黒丸）について、ＥＬ４（ＡＦＰ）（ｍＡＦＰ産生性マウス腫瘍細胞株）の腫瘍試行後の日数に対する平均肺腫容積のプロットである。
【図１１】ＡｄＶｍＡＦＰ形質導入樹状細胞で免疫したマウス（黒四角）および免疫しなかったマウス（黒丸）について、ＢＷＩＣ３（ｍＡＦＰ産生性マウス腫瘍細胞株）の腫瘍試行後の日数に対する平均腫瘍容積のプロットである。
【背景技術】
【０００１】
原発性肝癌は、世界中の癌による死の主要な原因である。肝細胞癌（ＨＣＣ）は、一年あたり約１２０万の症例の発生数を有する、最も一般的な型の原発性肝癌である。世界のいくつかの地域（例えば、東南アジアおよび南アフリカ）では、肝細胞癌は、最も一般的な型の悪性疾患の１つである。この疾患の高い頻度は、これらの地域における肝炎の高い発生数に関連するようである。
肝細胞癌の治癒治療は、非転移性疾患を有する個体に現在制限されており、そして肝移植を伴うかまたは伴わない、腫瘍の外科的切除を伴う。しかし、外科的切除および移植でさえも、切除後の再発のために、大部分の腫瘍が治癒しない。治療に対する化学療法剤のアプローチは、今日まで、たいてい、無効であった。最近２０年間は、肝細胞癌の処置に重大な進歩はなかった。
それゆえ、肝細胞癌の有効な処置についての必要性が依然として残っている。処置は、理想的には、この疾患の最大の発生数を有する、非先進国における使用に適切であるべきである。さらに、処置は、切除可能でない腫瘍および転移性疾患を有する個体における使用に適切であるべきである。
【非特許文献１】MORINAGA, T., et al., Primary structures of human α-fetoprotein and its mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80(15), PP.4604-4608 (1983)
【非特許文献２】佐藤一夫ら、α-fetoproteinに関する研究（VII）、日大医誌、43(10)、pp.835-842 (1984)
【非特許文献３】平井秀松、α-フェトプロテインによる肝癌の診断と治療、生物物理化学、28(6)、pp.333-341 (1984)
【非特許文献４】TAGA, H., THE EFFECT OF ACTIVE IMMUNIZATION OF RATS WITH HETEROLOGOUS α-FETOPROTEIN UPON HEPATOCARCINOGENESIS INDUCED BY 3'-METHYL-4-DIMETHYLAMINOBENZENE. Gann, 74, pp.248-257 (1983)
【特許文献１】特開平２−２１８６９４号公報
【特許文献２】国際公開第９６／２２７８７号パンフレット
【発明の開示】
【０００２】
本発明の１つの実施態様によれば、ヒトを含む哺乳動物における、肝細胞癌のような癌を予防または処置するための方法が提供される。この方法は、哺乳動物において、少なくともαフェトプロテイン分子のアミノ酸配列の部分に対する免疫応答を生じる工程を含む。
免疫応答を生じる工程は、少なくともαフェトプロテインアミノ酸配列の部分を含むペプチドを含む少なくとも１つの組成物、または少なくとも１つのアミノ酸置換を有する少なくともαフェトプロテインアミノ酸配列の部分を含むペプチドを含む少なくとも１つの組成物を哺乳動物に投与する工程を含み得る。また、免疫応答を生じる工程は、少なくともαフェトプロテイン分子のｃＤＮＡ配列の部分を含む少なくとも１つの組成物を哺乳動物に投与する工程を含み得る。さらに、免疫応答を生じる工程は、αフェトプロテインｃＤＮＡを発現する組換えベクターで形質導入した免疫系の細胞を含む少なくとも１つの組成物を哺乳動物に投与する工程を含み得る。
本発明の別の実施態様によれば、癌を予防または処置するために、ヒトを免疫するための組成物が提供される。組成物は、ＡＦＰ５、ＡＦＰ７、ＡＦＰ１３、ＡＦＰ１４、ＡＦＰ１８、ＡＦＰ２２、ＡＦＰ２３、ＡＦＰ２８、ＡＦＰ３８、ＡＦＰ３９、ＡＦＰ４５、ＡＦＰ４９、配列番号３および配列番号４からなる群より選択されるペプチドを含み得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００３】
本発明の１つの実施態様によって、癌がその表面上に少なくともαフェトプロテイン分子の部分を保有する哺乳動物（例えば、ヒト）において、少なくともαフェトプロテイン分子の部分に対する哺乳動物における免疫応答を生じさせることによって、癌（肝細胞癌を含む）を予防または処置するための方法が提供される。本方法は、癌を有する哺乳動物を免疫操作または遺伝子操作し、癌細胞の表面上に存在する少なくともαフェトプロテインの部分に対する免疫応答を生じさせる工程を包含する。次いで、罹患した哺乳動物の免疫系は、表面マーカーを保有する癌細胞を破壊させられ、それによって臨床的に癌を予防するか、または確立した癌を処置する。
ヒト肝細胞癌細胞の大部分は、ヒトαフェトプロテイン（ｈＡＦＰ）（６０９アミノ酸残基のタンパク質、配列番号２）を合成し、これは、通常、およそ誕生の時期までに胎児肝細胞によって産生される。肝細胞癌細胞は、その表面上に、少なくともαフェトプロテイン分子の部分を提示する傾向がある。肝細胞癌におけるαフェトプロテインの存在は、スクリーニングおよび診断目的のためのマーカーが使用されている。
【０００４】
αフェトプロテインは、通常、免疫系の発達の間に存在するため、免疫系が、タンパク質に対して免疫学的に応答する能力を保持しないことが当然想定される。本発明の１つの局面は、哺乳動物の免疫系が、外来タンパク質としてのαフェトプロテインに応答するように、および外来細胞としての少なくともαフェトプロテイン分子の部分をその表面上に有する細胞に対して反応され得るという発見を含む。従って、この免疫応答を生じさせることは、哺乳動物免疫系を引き起こし、肝細胞癌細胞を破壊することによって、肝細胞癌を予防するため、および疾患を処置するために使用され得る。
本明細書中に開示されるように、αフェトプロテインに対する免疫は、以下を含む種々の手段によって達成され得る：少なくともαフェトプロテイン配列の部分に基づく合成ペプチドを含む、少なくともαフェトプロテイン配列の部分を含む合成ペプチド（しかし、置換または他の改変を含む）での免疫、少なくともαフェトプロテインのｃＤＮＡ配列の部分での免疫（それによって、適切な免疫系細胞に対する少なくともαフェトプロテイン分子の部分の産生および提示を引き起こす）、遺伝子操作された抗原提示細胞の哺乳動物への導入、および少なくともαフェトプロテイン分子の部分の発現を引き起こすための、遺伝子治療用ウイルスベクターの使用。この免疫の目的は、αフェトプロテインペプチドに特異的なＴリンパ球を活性化し、これらの表面マーカーを保有する細胞に対する免疫応答を引き起こすこと、および好ましくは、それによって細胞障害性Ｔリンパ球を活性化し、肝細胞癌細胞を破壊することである。
【０００５】
１）ヒトにおいて免疫応答を生じさせる、ヒトαフェトプロテインペプチドの決定および生成
ヒトαフェトプロテイン分子のどの部分が、ヒトにおいて免疫応答を生じさせ得るかを決定するために、全ヒトαフェトプロテイン（ｈＡＦＰ）分子（配列番号２）由来の一連のペプチドを試験し、クラスＩ拘束ペプチドとして、それらが抗腫瘍応答を生じさせ得るか否か、および細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）についての標的分子として作用し得るか否かを決定した。ｈＡＦＰ由来の潜在的な免疫原性ペプチドを、ＨＬＡ Ａ２．１クラスＩ結合グルーブ(groove)に対する潜在的な適合に基づいて選択した。ＨＬＡＡ２．１（世界保健機構（World Health Organization）特殊命名法における、ＨＬＡ Ａ＊０２０１）は、コーカサス人において最もありふれた対立遺伝子であり、そしてまた他の民族においてよく分布していることから、ＨＬＡ Ａ２．１を選択した。決定を、以下のように行った。
【０００６】
第１に、公開されたコンセンサス配列によって、ＨＬＡ Ａ２．１に潜在的に結合するｈＡＦＰ（配列番号２）由来のペプチド配列を同定した。ＨＬＡ Ａ２．１は、長さが８〜１０アミノ酸であるペプチド、しかし好ましくは９マー（ｍｅｒ）のペプチドに結合すると考えられている。アミノ酸のイソロイシン、ロイシン、およびメチオニンは、ペプチド２位における重要なアンカー残基であると考えられており、そしてアミノ酸のイソロイシン、ロイシン、およびバリンは、ペプチド長に依存して、ペプチド９位または１０位における重要なアンカー残基であると考えられている。
ＨＬＡ Ａ２．１クラスＩ結合モチーフに適合した適切なペプチド配列を、University of Wisconsin Genetics Computer Group Program「find patterns」を用いて同定し、ｈＡＦＰ配列（配列番号２）をスクリーニングし、そして２つの強(strong)結合「アンカー」残基（それぞれ、９および１０残基を有するペプチドについて、２位の残基および９位または１０位の残基）を含む、９および１０マーのペプチド（「強(strong)」ペプチドと命名する）；１つのみの強結合(strong binding)アンカー残基を含む、９および１０マーのペプチド（「中間(intermediate)」ペプチドと命名する）：または強結合アンカー残基を含まないが、他のポジティブな結合残基を含む、９および１０マーのペプチド（「弱(weak)」ペプチドと命名する）を同定した。結合を破壊すると考えられる残基を１つより多く含むペプチド配列を、除去した。
【０００７】
スクリーニング研究によって、ＨＬＡ Ａ２．１クラスＩ結合モチーフに潜在的に結合する、全部で７２のペプチド配列を同定したが、これらの配列のうちの６つをさらなる考慮から除外した。なぜなら、この６つの配列は、それらの高疎水性に起因して合成が困難であったからである。残りの６６個のペプチド配列を、当業者に公知の技術によるChiron Mimetopes(Victoria，Australia)によって試験するために合成した。これらは、１０個の「強」ペプチド配列、４３個の「中間」ペプチド配列、および１３個の「弱」ペプチド配列を含んだ。ここで表Ｉに言及するように、ペプチド命名番号、ｈＡＦＰ配列（配列番号２、ペプチド配列によって示される）の残基、および６６個のペプチド配列の各々についてペプチドが含むアミノ酸を示す。ペプチド命名番号は、Chironからのペプチドの受領書の順番に基づき、従ってｈＡＦＰ分子（配列番号２）のアミノ酸配列に関して非連続的である。
【０００８】
表Ｉ ヒトＡＦＰペプチド配列
【０００９】
次に、６６個のペプチドの各々を、濃度依存方法でＨＬＡ Ａ２．１に結合する能力、およびそれによって以下のようなＴ２細胞安定化アッセイにおいてＨＬＡ Ａ２．１を安定化する能力について試験した。各ペプチドを、ＴＡＰ１およびＴＡＰ２欠失Ｔ２細胞とともに一晩インキュベートした。このＴ２細胞は、前日の晩に室温でインキュベートし、細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子の発現を増加させていた。各ペプチドを、０．１μＭ〜１００μＭのペプチド濃度の範囲にわたって、ＨＬＡ Ａ２．１分子を結合する能力について試験した。Ｔ２細胞株において、８〜１０マーのペプチドで満たされるＭＨＣ分子のみが、細胞表面上で安定である。ＨＬＡ Ａ２．１の安定性を、抗ＨＬＡ Ａ２抗体ＢＢ７．２（ＡＴＣＣ）およびヤギ抗マウスＦＩＴＣで染色した後にフローサイトメトリーによってアッセイした。結合についてのポジティブコントロールとして、ＦＬＵマトリクスペプチド（ＦＬＵマトリクス１タンパク質の残基５８〜６６（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ））およびＭＡＲＴ−１ペプチド（全タンパク質についてＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ０６４５２の、ＭＡＲＴ−１の残基２７〜３５（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ））を使用した。ＦＬＵマトリクスペプチドは、０．５μＭの濃度にて、Ｔ２細胞上でＡ２．１分子を一貫して安定化していた。
ここで、表ＩＩに言及するように、６６個のｈＡＦＰペプチドのうちの２２個のリストを示す。第１欄はペプチド命名番号を列挙し、第２欄はｈＡＦＰ配列（配列番号２、ペプチド配列によって示される）の残基を同定し、そして第３欄は配列内のアンカー残基の数を同定する。
表ＩＩの第４列は、Ｔ２細胞へＨＬＡ２．１が結合することが要求されるペプチドの最小濃度を示す。見られ得るように、１０の「強い(strong)」ペプチド配列のうちの６つおよび４３の「中間(intermediate)」ペプチド配列のうちの７つはＨＬＡ２．１への結合能力を示した。さらに、１３の「弱い(weak)」ペプチド配列のうちの９つはＨＬＡ２．１への結合能力を示した。
【００１０】
さらに、各々の６６のペプチドもまた、EBVリンパ芽球腫細胞オフ(off)速度論アッセイにおいて、経時的に、クラスＩ分子からのそれらの解離速度について試験した。なぜなら、クラスＩ分子に結合したペプチドの解離速度であるオフ速度論が、このペプチドの免疫原性の重要な予測であることが見い出されているからである。例えば、ウイルスペプチドＨＰＶ １６ Ｅ７、ＥＢＶ ＬＭＰ２、ＦＬＵ Ｍ１、およびＨＩＶ ｐｏｌのような非自己結合ペプチドについて、最も遅いオフ速度論を示している最も強い結合ペプチドが最も免疫原性であることが見い出されている。さらに、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１のようなメラノーマ抗原由来の免疫原性エピトープである多くの公知の自己タンパク質は、１つのアンカー残基を有し、そして可溶性クラスＩ再構成アッセイによって安定性の少ない結合親和性を有するが、非常に遅いオフ速度論を有することが見い出されている。例えば、Bakker，A．B．ら、Analogues of CTL epitopes with improved MHC class binding capacity elicit anti-melanoma CTL recognizing the wild-type epitope．Int J Cancer，1977．70(3):p.302-9;およびvan der Burg，S．H.ら、Do epitopes derived from autoantigens display low affinity for MHC class I?(letter)．Immunol Today，1997．1892):p．97-98;（各々は、それらの全体において参考として本明細書中で援用される）を参照のこと。
【００１１】
表ＩＩ ヒトＡＦＰペプチド配列および結合特性
【００１２】
ＥＢＶリンパ芽球腫細胞オフ速度論アッセイを、van der Burg，S.H.ら、Immunogenicity of peptides bound to MHC class I molecules depends on the MHC-peptide complex stability．J．Immunology，1996．156(9):p.3308-3314（これはその全体において本明細書中で参考として援用される）中に開示されるように実施した。簡単に言うと、ＨＬＡ Ａ２．１ ＥＢＶリンパ芽球腫細胞を、ＭＨＣ分子を不安定にする穏やかなｐＨ３．２酸性緩衝液中で、表面クラスＩペプチドおよびβ２ミクログロブリンが剥離した。各々のペプチドを、β２ミクログロブリンの存在下で１時間、過剰な２００μＭで剥離された細胞上にて直接パルスした。次いで、過剰な非結合ペプチドを洗浄除去し、そして続けて細胞を３７℃で０、２、４、および６時間インキュベートした。細胞を各時点の終わりに洗浄し、そしてＢＢ７．２抗体でＨＬＡ Ａ２について染色した。平均蛍光強度は剥離されたが、ペプチドでパルスされなかった細胞から少なくとも１．５倍増加する場合、ペプチドクラスＩ複合体を安定であるとした。
Ｔ２細胞安定化アッセイおよびＥＢＶリンパ芽球腫細胞オフ速度論アッセイの両方を少なくとも２回、各々のペプチドについて実施した。表ＩＩを再度参照すると、第５列は、ＥＢＶリンパ芽球腫細胞におけるペプチド安定性の時間を示す。見られ得るように、わずか３つの強いペプチド（ＡＦＰ５、ＡＦＰ１４およびＡＦＰ２２）、４３の中間ペプチドのうちの１２（ＡＦＰ４９を含む）および弱いペプチドの１つが遅いオフ速度論のレベルを示した。Ｔ２細胞安定化アッセイおよびＥＢＶリンパ芽球腫細胞オフ速度論アッセイの両方を考慮すると、両方のアッセイにおいて最も良い結果を提供する７つのペプチド配列は、ＡＦＰ５、ＡＦＰ７、ＡＦＰ１３、ＡＦＰ１４、ＡＦＰ２８、ＡＦＰ３８、およびＡＦＰ４５であった。
【００１３】
次に、表ＩＩＩの第１列に記載されるペプチドを、次いで、Plebanski，M．ら、Induction of peptide-specific primary cytotoxic T lymphocyte responses from human peripheral blood．Eur J．Immunol．1995．25(6):p.1783-7で開示される方法によってインビトロにおいてペプチド特異的ＣＴＬを産生するために用いた。そしてＣＴＬをＡ２．１陽性、ＡＦＰ陽性肝細胞癌細胞を溶解するそれらの能力について試験した。溶解は、ペプチドがヒトＡＦＰの天然にプロセスされる免疫原性エピトープであり、そして強力な標的抗原であることを示唆する。ＨＬＡ Ａ２．１ドナーおよび細胞株をＢＢ７．２（ＨＬＡ Ａ２）抗体（ＡＴＣＣ）でスクリーニングし、そして当業者に公知の技術により、ＰＣＲ、およびUCLA Tissue Typing Laboratory（当業者に公知の技術に従って）による直接的配列分析によって、確認およびサブタイプ化した。
簡単にいうと、ペプチド特異的ＣＴＬは、以下のような表ＩＩＩ ＡＦＰペプチドに記載されるペプチドヘ生じた。正常なＡ２．１ドナー由来の２×１０７末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ勾配により精製した。これらのＰＢＭＣを、３７℃で９０分間、１ｍｌの無血清培地中で５０μｇ／ｍｌペプチドでパルスした。次いで細胞を一度リンスし、そしてＲＰＭＩ１０％自己血清中のＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＫＬＨ（４．５μｇ／ｍｌ）とともに、０日にウェルあたり１．５ｍｌの１０％自己血清ＲＰＭＩ培地中、３×１０６ＰＢＭＣで２４ウェルプレートに配置した。ＣＴＬを非接着細胞を除去することにより、ならびにそれを、新鮮な、ペプチドパルス、洗浄、および照射したＰＢＭＣに、１：１のＰＢＭＣ対ＣＴＬ比で加えることによって、毎週再剌激した。ＩＬ−２を１０ユニット／ｍｌで毎週２回、加えた。
【００１４】
表ＩＩＩ ヒトＡＦＰペプチド細胞障害性
【００１５】
培養の３週間後、推定のｈＡＦＰペプチド産生ＣＴＬを、標準の４時間５１Ｃｒ放出アッセイにおいて細胞障害性について試験した。ＣＴＬを、ＣＴＬを産生するために使用した特異的ｈＡＦＰペプチドでパルスしたＴ２細胞に対してペプチド特異的な殺傷について試験し、そしてＦＬＵマトリックスペプチドまたはコントロールであるＭＡＲＴ−１ペプチドでパルスしたＴ２細胞と比較した。非特異的ＮＫ殺傷を、ＮＫ感受性標的Ｋ５６２で評価した。ＣＴＬをまた、ＨＬＡ Ａ２．１陽性、ＡＦＰ陽性ヒト肝細胞癌細胞株であるＨｅｐＧ２に対して試験した。
ここで、表ＩＩＩを参照すると、陽性ペプチド細胞障害性結果を提供した正常ドナー由来のＣＴＬを産生するために使用された１２のＡＦＰペプチド配列についての試験の細胞障害性結果が示される。第２列は、大容量のリンパ球培養物のＣＤ４／ＣＤ８表現型を示す。第３列および第４列はそれぞれ、ペプチドパルスしたＴ２細胞およびＨｅｐＧ２標的に対して、エフェクター（ＣＴＬ）対標的の比（Ｅ：Ｔ）を有する細胞障害性のレベルを示す。
表ＩＩＩに見られ得るように、ペプチドＡＦＰ２２、ＡＦＰ３９、ＡＦＰ４５、ＡＦＰ４９は、高レベルのＡＦＰ＋ＨｅｐＧ２細胞、ＨＬＡ Ａ２．１＋ＨｅｐＧ２細胞の特異的殺傷を証明した。ＡＦＰ２２およびＡＦＰ４９は４つのアミノ酸の重複（ｈＡＦＰ配列番号２の残基５４７〜５５０）を有することが留意され得る。さらにＡＦＰ２２は、ＡＦＰ２３と２つのアミノ酸の重複（ＡＦＰ２３を有する配列番号２の残基５５５〜５５６）を有し、最低限のＨｅｐＧ２殺傷を示した。
ＡＦＰ４９を使用して生成したＣＴＬを試験して、そしてＨｅｐＧ２細胞障害性を維持した。さらに新しいＡＦＰ４９ペプチド産生ＣＴＬ培養物を、２つの異なる正常なＨＬＡ Ａ２．１ドナーを使用して作製した。さらなる標的を、ＡＦＰ４９を使用して観測された細胞障害性がＡＦＰ抗原特異的でありそしてクラスＩ制限化であることを確認するために使用した。
【００１６】
ここで図１を参照して、これらの試験の代表的なデータを示す。第１に、観測された細胞障害性がクラスＩ制限化であることを確認するために、抗β２ミクログロブリン抗体をＨｅｐＧ２細胞へのＣＴＬ−Ｔ細胞レセプターの相互作用をブロックするために使用した。これは、ＨｅｐＧ２溶解物において有意な減少を生じた。次に、非特異的ＮＫ／ＬＡＫ殺傷を除くために、４０倍過剰の非標識（コールド）Ｋ５６２細胞を加えた。これは、ＨｅｐＧ２溶解物において有意な減少を生じなかった。さらに、ＭＩＩＣクラスＩ発現が、γＩＦＮ（５０ユニット／ｍｌ）との一晩のインキュベーションによって、ＨｅｐＧ２細胞においてアップレギュレートされた。見られ得るように、ＭＨＣクラスＩ発現アップレギュレーションは、ＨｅｐＧ２溶解物を増加した。また、ＡＦＰ＋、ＨＬＡ Ａ２．１＋陰性肝細胞癌細胞株、Ｈｅｐ３Ｂ、つまりクラスＩミスマッチ化肝細胞癌細胞株もまた、標的として用いた。ＡＦＰ４９ ＣＴＬは、非常に低いレベルでこれらのＨｅｐ３Ｂ標的を溶解した。この少量の観測されたＨｅｐ３Ｂ溶解物を、コールドＫ５６２細胞を加えた場合のＨｅｐＧ２の特異的殺傷の保持とは対照的に、過剰のコールドＫ５６２細胞を加えることによって取り除いた。
【００１７】
ここで、図２に言及すると、ペプチド標的およびＡＦＰ標的の両方に対してアッセイされた正常ＨＬＡ Ａ２．１ドナー由来のぺプチドパルスされたＰＢＭＣから作成したＣＴＬの標準クロム放出アッセイについての標的に対する特異的溶解のパーセントの棒グラフが示される。ＣＴＬのペプチド特異性を確認するために、それぞれの培養物を、ＣＴＬ培養物が作製される特異的ペプチドでパルスされたＴ２細胞に対して試験し（最も左の棒）、そして異なるＨＬＡ Ａ２．１結合ペプチドでパルスされたＴ２細胞（コントロールとして）と比較した（左から２番目の群の棒）。理解され得るように、ＡＦＰ４９ペプチド培養物、ＡＦＰ４９Ｖ９ペプチド培養物、ＡＦＰ５ペプチド培養物およびコントロールのＦＬＵマトリックスペプチド培養物の全てが、特異的ペプチドでパルスされたＴ２細胞の溶解によるペプチド特異性を示したが、異なるペプチドでパルスされたＴ２細胞に対してはペプチド特異性を示さなかった。
再度、図２に言及すると、これらのペプチド特異的ＣＴＬ培養物のそれぞれをまた、ＡｄＶｈＡＦＰまたはコントロールのＡｄＶＲＲ５のどちらかで形質導入されたＭ２０２（ＨＬＡＡ２．１＋／ＡＦＰ−）メラノーマ細胞の死滅について試験した。ＡＦＰペプチドのＡＦＰ５およびＡＦＰ４９、ならびにＡＦＰ４９の９位に単一のアミノ酸置換を有するペプチドＡＦＰ４９Ｌ９（配列番号３（ＧＶＡＬＱＴＭＫＬ））およびペプチドＡＦＰ４９Ｖ９（配列番号４（ＧＶＡＬＱＴＭＫＶ））のペプチド特異的ＣＴＬ培養物のそれぞれは、コントロールのＲＲ５で形質導入されたＭ２０２細胞の死滅よりもＡｄＶｈＡＦＰで形質導入されたＭ２０２細胞に有意に多い死滅を示す。ＦＬＵペプチド特異的ＣＴＬ培養物は、Ｍ２０２／ＡｄＶｈＡＦＰおよぴ４２０２／ＲＲ５の両方を同様の細胞障害性バックグランドレベルで殺傷した。
【００１８】
Ｍ２０２細胞は正確にプロセッシングすることが公知であり、ＨＬＡ Ａ２．１制限免疫優性ＭＡＲＴ−１ペプチドを提示する。従って、これらは、ＡｄＶｈＡＦＰで形質導入され、そしてＡＦＰ由来の正確なＨＬＡ Ａ２．１制限エピトープがプロセッシングされ、表面に提示されることを期待するのに理想的な細胞株である。ゆえに、この実験は、ＡＦＰ５、ＡＦＰ４９、ＡＦＰ４９Ｌ９（配列番号３）およびＡＦＰ４９Ｖ９（配列番号４）が、天然にプロセッシングされ、そしてＡＦＰ＋腫瘍を殺傷するＣＴＬを標的化するために使用され得るペプチドを提示することを示す。さらに、ＡＦＰ４９Ｌ９（配列番号３）およびＡＦＰ４９Ｖ９（配列番号４）に見られるように、ペプチド特異的ＣＴＬ培養物は、ＡＦＰ４９ペプチド特異的ＣＴＬ培養物よりさらにより効果的にＭ２０２／ＡｄＶｈＡＦＰを殺傷し、従って、ＡＦＰ４９Ｌ９（配列番号３）およびＡＦＰ４９Ｖ９（配列番号４）は、ＡＦＰ＋細胞に対する免疫応答の標的化のための改善されたぺプチドである。
【００１９】
従って、この開示から理解され得るように、本発明はヒトを含む哺乳動物における癌の予防または処置を包含する。ここで、癌細胞は、表面マーカーとして少なくともαフェトプロテイン分子の部分を保有する。予防または処置は、少なくともαフェトプロテイン分子の部分を含むペプチドまたは少なくともαフェトプロテイン分子の部分の置換もしくは他の変化により生成されるペプチドを含む組成物を哺乳動物に投与することにより達成される。これらのペプチドには、ＡＦＰ５、ＡＦＰ７、ＡＦＰ１３、ＡＦＰｌ４、ＡＦＰ１８、ＡＦＰ２２、ＡＦＰ２３、ＡＦＰ２８、ＡＦＰ３８、ＡＦＰ３９、ＡＦＰ４５、ＡＦＰ４９、ＡＦＰ４９Ｌ９（配列番号３）、およびＡＦＰ４９Ｖ９（配列番号４）が挙げられる。
【００２０】
２）その表面にαフェトプロテインを保有する細胞（肝細胞性癌細胞を含む）に対する免疫応答の生成のためのαフェトプロテインｃＤＮＡを用いる哺乳動物の免疫
αフェトプロテインｃＤＮＡを用いる哺乳動物の免疫は、その表面にαフェトプロテインを保有する腫瘍細胞（肝細胞性癌細胞を含む）を用いる試行に対して部分的または完全に保護的である免疫応答を生成する。この効果を以下のように実証した：
ヒトαフェトプロテインｃＤＮＡは以下のように作製した。最初に、ヒトαフェトプロテインｃＤＮＡを、Trlzol法(LlfeTechnologles,Galthersburg,MD、製造者らの指示に従う）により、そしてRNAzolB法(TelTest,Frlendswood,TX)によって、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣから入手可能）から作製された総ＲＮＡからＰＣＲ技術により生成した。およそ１μｇの総ＲＮＡを、Perkin Elmer ＲＴ−ＰＣＲキットおよび公開された配列に基づいたＡＦＰ特異的プライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲ反応において使用した。５’プライマーは、５’ＧＣＡ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＧＧ ＧＴであった。３’プライマーは、５’ＡＡＣ ＴＣＣ ＣＡＡ ＡＧＣ ＡＧＣ ＡＣＧ ＡＧＴであった。プライマーは、プライマーに取り込まれた制限エンドヌクレアーゼ部位ＸｂａＩを有するコード領域全体（ＡＴＧ〜停止コドン）、およびＰＣＲ後の酵素切断を容易にする６塩基（ＣＴＣ ＴＣＴ）を有する終末を含んだ。プライマー配列は、Operon Technologiesにより合成された（５０ｎＭスケール、未精製）。
【００２１】
上記で作製されたヒトαフェトプロテインのＰＣＲ ｃＤＮＡ産物を、アガロースゲル上で分析し、そのサイズをチェックした。正確なサイズの産物を、Qiagen PCR-quick clean-upカラムで精製し、ＸｂａＩ酵素で消化してその部位をプライマー中に設計し、そして当業者に公知の技術に従って、ｐＲｃＣＭＶ（ヒト用）またはｐＣＲ３．１（マウス用）哺乳動物発現ベクター（Invitorogen,Carlsbad,CA）のいずれかでクローニング反応において使用した。陽性プラスミドを、ミニプレップ分析により同定した。これらの陽性プラスミドを、マキシプレップし、そしてアリコートをＵＣＬＡでＤＮＡ配列決定の中心の施設（DNA sequencing core facility）により配列決定して、挿入物の配列同一性を確認した。配列データは１つの鎖についてのみであり、ＡＦＰ挿入物の同一性が確認された。従って、クローニングされたヒトＡＦＰ ｃＤＮＡは、公開されたヒトＡＦＰ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０００７７、Ｊ０００７６、Ｖ０１５１４、塩基４８〜１８７７（配列番号１））に対して同一であった。
マウスＡＦＰ ｃＤＮＡ（ｍＡＦＰ ｃＤＮＡ）を、ヒトＡＦＰ ｃＤＮＡをクローニングするために使用される上記に開示の方法に対応する方法（ただしマウス特異的プライマーを使用）を用いて、クローニングした。５’マウス特異的プライマーは、５’ＧＣＣ ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＧＧ ＡＴＣ ＡＣＡであった。３’マウス特異的プライマーは、ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＣＣ ＣＡＡ ＡＧＣ ＡＴＣ Ａであった。総ＲＮＡ単離のために使用されたマウスＡＦＰ陽性細胞株は、Ｈｅｐａ１６であった。本明細書中に開示される安定なトランスフェクタントおよび筋肉内注射実験の全てを、シグナル配列を含むｃＤＮＡクローンを用いて行った。
【００２２】
次いで、ｍＡＦＰ ｃＤＮＡを、真核細胞発現ベクターＶＲ１０１２（Vical,Inc.,San Diego,CA）に配置した。ＶＲ１０１２発現ベクターは、増強された発現のためのイントロンを含む強い構成性のＣＭＶ最初期のプロモーター／エンハンサー、ＢＧＨ終結およびインビボ発現のためのポリＡ配列を含む。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにｍＡＦＰ ｃＤＮＡを含むＶＲ１００２またはコントロールとして生理食塩水１００μｇの注射を１週間に１回、３週間与えた。最後の注射の１週間後、ＶＲ１００２ｍＡＦＰ ｃＤＮＡ免疫化マウスおよび非免疫化のコントロールマウス群の両方を、同系のマウスにおいて次第に増殖する腫瘍の単一の細胞懸濁液から得られた４×１０６個のＢＷＩＣ３肝細胞性癌細胞（生細胞）で試行した。ＢＷＩＣ３は、ｍＡＦＰ陽性マウス細胞株である。
図３を参照すると、免疫した動物（白四角）は、コントロール動物（黒四角）に比べ、遅延した腫瘍の増殖あるいは完全な保護を示すことが理解され得る。これらの知見は、数度繰り返された。対応する実験において、ＭＡＲＴ−１メラノーマ抗原を発現するプラスミドベクターの筋肉内注入は、ＢＷＩＣ３肝細胞の癌細胞試行から動物を保護しなかった（データは示さず）。
【００２３】
別の１群の実験において、代用物としてのマウス肝細胞癌株は、ｍＡＦＰ ｃＤＮＡによるＥＬ４（Ｈ−２ｂ）リンパ種の安定なトランスフェクションにより構築された。腫瘍株ＥＬ４（ｍＡＦＰ）は、親ＥＬ４細胞株と同様のインビボ増殖速度論を有していた。ＲＴ−ＰＣＲを用いたところ、ＥＬ４（ｍＡＦＰ）腫瘍細胞株は、ＢＷＩＣ３肝細胞の癌細胞株の１％以下のレベルのＡＦＰを産生するように思われた。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ｍＡＦＰ ｃＤＮＡまたはコントロールとしての生理食塩水を含む１００μｇ ＶＲ１０２ｌを、週１回、３週間の間、筋肉内注入した。最後の注入の１週間後、ＶＲ１０１２ ｍＡＦＰ ｃＤＮＡにより免疫化マウスおよび非免疫化コントロールの群の両方を、７．５×１０５の生存可能なＥＬ４（親）あるいはＥＬ４（ｍＡＦＰ）細胞で試行（challenge）した。
図４を参照すると、免疫した動物細胞（白四角）およびコントロール動物（黒丸）は、ＥＬ４（親）細胞による試行の場合、差異を示さない（ｐ＝０．０７，スチューデントのＴ検定）ことが理解され得る。しかし、図５に見られるように、免疫した動物（白四角）は、ＥＬ４（ｍＡＦＰ）細胞による試行の場合、コントロール動物（黒丸）と比較して、部分的な保護を示した（ｐ＝０．０７，スチューデントのＴ検定）。これらの知見はまた、数度繰り返された。
【００２４】
さらなる一連の実験において、αフェトプロテインを表面に有する細胞での試行に対する保護は、安定にトランスフェクトされたマウス線維肉腫細胞株を代用物として用いることにより示された。第一に、安定にトランスフェクトされたマウス線維肉腫細胞株は、ＤＯＴＡＰリポフェクション法（Boehringer Mannheim、製造者の指示に従う）またはＣａＰＯ４沈殿法（当業者に周知である技法に従う）のいずれかにより産生された。要約すると、DOTAPリポフェクション法は、前日の夜にオーバーナイトで接着させた、６ウェルプレートでウェルあたり１×１０５の細胞を用いる。２．５μｇのプラスミド（マウスのＡＦＰ ｐＣＲ３．１）を２５μｌの２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび５０μｌのＨｅｐｅｓ中の１５μｌの脂質を室温で１５分間混合する。この溶液を、１ｍｌの培養培地（１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０）中に希釈し、そしてウェル中の細胞に加える。４〜６時間後、溶液を２ｍｌの新たな培養培地で交換する。４８〜７２時間後、５００μｇ／ｍｌ（総濃度、７５％活性）のＧ４１８（ジェネティシン(geneticin)）により、選択を始めた。２〜３週間の選択の後、任意の潜在的なトランスフェクタントを、ＲＴ−ＰＣＲによりマウスＡＦＰ ＲＮＡおよびｎｅｏ−ＲＮＡの発現について試験し、マウスＡＰＲＴ遺伝子発現で半定量した。
哺乳動物におけるＡＦＰ免疫の腫瘍産生を防止する効果を以下のように示した。マウスＡＦＰ−ｐＣＲ３．１プラスミドおよびマウスＡＦＰ−ＡｄＶシャトルベクタープラスミド（ｐＡＣ ＣＭＶｐＬｐＡ）は、当業者に公知である技法に従い調製し、そしてマウスＡＦＰ−ＶｉｃａｌベクターＶＲ１０２ｌを構築した。マウス線維肉腫細胞株ＦＳＡ，ＮＦＳＡ，ＭＣＡＫおよびＳＶＥＣを、上記ｍＡＦＰ ＰＣＲ３．１により安定にトランスフェクトした。
【００２５】
Qiagenプラスミドプレップキット（５０μｌ ＰＢＳ中に５０μｇのプラスミド）によりエンドトキシンを含まずに調製した、ｎｅｏ−含有発現プラスミドであるマウスＡＦＰ−ＡｄＶシャトルベクターを用い、Ｃ３Ｈマウスを、プラスミドＤＮＡで３週間、毎週筋肉内注射することにより免疫した。次に、Ｃ３Ｈマウスを、ＡＦＰ発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＦＳＡ Ｃ３Ｈバックグラウンド（background）の線維肉肺細胞で、あるいはｎｅｏ発現ベクターのみで安定にトランスフェクトされたＦＳＡ Ｃ３Ｈバックグラウンドの線維肉肺細胞で試行し、ＡＦＰ抗自己抗原反応が発生するか、あるいはネオマイシンを発現する安定なトランスフェクタントを用いることにより、ＡＦＰ応答を遮蔽する抗ｎｅｏ（非自己抗原）反応を引き起こすか否か判定した。肺瘍細胞はインビボで継代され、そして単一の細胞懸濁液を腫瘍試行に用いた。
図６を参照すると、腫瘍後１８日目の試行までに、ＡＦＰ発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＦＳＡ Ｃ３Ｈバックグラウンドの線維肉腫細胞で試行した免疫したＣＨ３マウス（下部の黒四角）のうち、１つのみが何らかの腫瘍の増殖（３ｍｍ×３ｍｍの腫瘍）を示し、その一方で、ＡＦＰ発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＦＳＡ Ｃ３Ｈバックグラウンドの線維肉腫細胞で試行した残り４匹の免疫したＣＨ３マウス（黒丸）は、全く腫瘍の増殖の徴候を示さなかったことが理解され得る。対照的に、５匹中２匹のＡＦＰ発現ベクターで安定にトランスフェクトされたＦＳＡ Ｃ３Ｈバックグラウンドの線維肉腫細胞で試行（challenge）した非免疫化Ｃ３Ｈマウス（上部の黒四角）は、何らかの腫瘍の増殖を示した（平均６．８ｍｍ２）。ＦＳＡ親腫瘍細胞およびｎｅｏ−ベクター−ＦＳＡ（neo-vector-FSA）細胞は、免疫化（黒ダイヤ）および非免疫化（黒逆三角）ＣＨ３マウスの両方で、同様に増殖する。このプロトコールは繰り返され、同様の結果が得られた（データは示さず）。
【００２６】
第２の実験は、Jackson Labs(Bar Harbor Marine)からのＣ５７Ｌ／Ｊ（「リーデン（leaden）」）マウスを用い行われた。これらのマウスは、ネオマイシンを含有しないＶｉｃａｌ（ＶＲ１０２１）由来のプラスミドベクターで免疫し、従って、マウスＡＦＰ遺伝子のみを合成する。Ｃ５７Ｌ／Ｊマウスは、同系のマウス腫瘍細胞株（ＡＴＣＣからのＢＷＩＣ３）で試行した。これらＢＷＩＣ３細胞は、上記のように産生された安定にトランスフェクションしたマウス線維肉腫細胞よりも、かなり高いレベルでマウスＡＦＰを合成した。
Ｃ５７Ｌ／Ｊマウスを、上記のとおり、ｍＡＦＰ−Ｖｉｃａｌベクターを用いて免疫し、そしてマウスあたり１×１０６のＢＷＩＣ３細胞による腫瘍試行は、皮下に行われた。図７を参照すると、１４日後の腫瘍試行で、非免疫化Ｃ５７Ｌ／Ｊマウス（黒四角）は、免疫化Ｃ５７Ｌ／Ｊマウス（黒丸）の腫瘍よりも、平均２倍の大きさの腫瘍を有することが理解され得る。
【００２７】
第３の実験で、さらなるＣ５７Ｌ／Ｊマウスを、マウスＡＦＰ遺伝子のみを合成するプラスミドベクター（ＶＲ１０２１）で免疫し、上記のとおりｌ×１０６のＢＷＩＣ３細胞で試行した。図８を参照すると、試行後１７日までに、全ての５匹の非免疫化（黒丸および黒四角）マウスは、平均の直径１１．４ｍｍ２の腫瘍を有することが埋解され得る。対照的に、ｍＡＦＰ−Ｖｉｃａｌで免疫したマウス５匹中３匹（黒三角）は、平均９ｍｍ２の腫瘍を有し、免疫したマウス１匹（黒ダイヤ）は小さい３ｍｍ２の腫瘍を有し、１匹のマウス（黒逆三角）は、全く腫瘍を示さなかった。
従って、本開示により評価され得るように、本発明は、癌細胞が表面のマーカーとしての少なくともαフェトプロテイン分子の部分を有する場合、ヒトを含む哺乳動物における癌の予防および処置を包含する。予防および処置は、少なくともαフェトプロテイン分子の部分に対する免疫反応を引き起こすために、少なくともαフェトプロテインｃＤＮＡの部分を含む組成物を哺乳動物へ投与することにより達成される。
【００２８】
３）細胞表面にαフェトプロテインを有する細胞へと遺伝子操作された樹状細胞（肝細胞癌細胞を含む）を用いる哺乳動物の免疫
マウスＡＦＰαフェトプロテインｃＤＮＡを発現する、組換えアデノウイルスベクター（ＡｄＶｍＡＦＰ）を用いて形質導入した樹状細胞を用いる哺乳動物の免疫によって、肝細胞癌細胞での試行に対して部分的または完全に保護的である免疫応答がもたらされる。この効果を以下に示す。
第一に、マウスＡＦＰを発現する組換えアデノウイルスベクター（ＡｄＶｍＡＦＰ）を、当業者に公知の技術に従って構築した。例えば、Ribas、A.、L.H.Butterfield、W.H.McBride、S.M.Jilani,L.A.Bui、C.M.Vollmer、R.Lau、V.B.Dissette、B.Hu、A.Y.Chen、J.A.Glaspy、およびJ.S.Economou、1997、Genetic immunization for the melanoma antigen MART-1/Melan-A using recombinant adenovirus-transduced murine dendritic cells．Cancer Res 57:2865；ならびにToloza,E.M.、K.Hunt、S.Swisher、W.McBride,．R.Lau、S.Pang、K.Rhoades、T.Drake．A.Belldegrun、J.Glaspy、およびJ.S.Economou．1996、In vivo cancer gene therapy with a recombinant interleukin-2 adenovirus vector，Cancer Gene Ther 3:11（これらは、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。次いで、樹状細胞を、当業者に公知の技術に従って、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４中で７日間分化させたＣ５７ＢＬ／６骨髄から作製した。例えば、Ribas、A.、L.H.Butterfield、W.H.McBride、S.M.Jilani,L.A.Bui、C.M.Vollmer、R.Lau、V.B.Dissette、B.Hu、A.Y.Chen、J.A.Glaspy、およびJ.S.Economou、1997、Genetic immunization for the melanoma antigen MART-1/Melan-A using recombinant adenovirus-transduced murine dendritic cells．Cancer Res 57:2865;ならびにInaba,K、M.Inaba、N.Romani、H.Aya、M.Deguchi．S.Ikehara、S.Muramatsu、およびR.M.Steinman、1992、Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophagecolony-stimulating factor．J Exp Med 176:1693（これらは、その全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００２９】
ここで図９を参照すると、種々の感染多重度（ＭＯＩ）でＡｄＶｍＡＦＰを用いて形質導入したマウスＤＣから単離されたｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析が示されている。左から右へと読むと、レーン１はゲルサイズ標準を示す；レーン２は、ネガティブコントロールとして使用されたｍＡＦＰネガティブ細胞についての結果を示す；レーン３はネガティブコントロールとして使用されたマウス樹状細胞についての結果を示す；レーン４〜７は、それぞれ、１０、１００、１０００、および５０００のＭＯＩのＡｄＶｍＡＦＰを用いて形質導入したマウス樹状細胞についての結果を示す；レーン８は、ポジティブコントロールとして使用されたＢＷＩＣ３細胞についての結果を示す（およそ１．９ｋｂにおける上の最も目立つ線）；ならびにレーン９は、ＰＣＲ夾雑物についてのテンプレートなしコントロールとしての、二重蒸留水（ＤＤＷ）についての結果を示す。理解され得るように、マウスＡＦＰを発現する組換えアデノウイルスベクター（ＡｄＶｍＡＦＰ）は、樹状細胞に首尾よく形質導入された。
【００３０】
次に、５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの３つのグループを、２週間にわたって、ＡｄＶｍＡＦＰ、ＲＲ５（空のＥ１欠損アデノウイルス）を用いて１００のＭＯＩで形質導入した樹状細胞、または非処理樹状細胞のいずれかを５×１０５で１週間あたり１回の静注を与えることによって調製した。マウスのこれらの３つのグループおよびコントロールとして供される注射していないマウスの１グループを、最後の注射後１週間で、７×１０５のＥＬ４（ＡＦＰ）で試行した。結果を図１０に示す。理解され得るように、ＲＲＳ（黒三角形）、または非処理樹状細胞（黒逆三角形）を注射したマウスのいずれも、コントロールマウス（黒丸）も腫瘍試行に対する保護を示さなかった。対照的に、ＡｄＶｍＡＦＰを１００のＭＯＩで形質導入した５×１０５樹状細胞を注射したマウス（黒四角）は、腫瘍試行に対して部分的な保護を示した。
さらに、５匹のマウスの別のグループを、２週間にわたって、ＡｄＶｍＡＦＰで１００のＭＯＩで形質導入した５×１０５樹状細胞の、１週間当たり１回の静注を与えることによって調製した。形質導入樹状細胞の最後の注射後１週間での４×１０６ＢＷＩＣ３腫瘍細胞での試行に対する、このグループの応答を、同様であるが注射していないコントロールマウスの１グループの応答と比較した。この試験の結果を図１１に示す。理解され得るように、免疫したマウス（黒四角）は、コントロールマウス（黒丸）と比較して、腫瘍試行に対して有意な保護を示し、これは、形質導入した樹状細胞での処置の有効性を実証する。
【００３１】
従って、本開示から理解され得るように、本発明は、哺乳動物（ヒトを含む）における癌を予防または処置する工程（ここで、癌細胞は、少なくとも、表面マーカーとしてαフェトプロテイン分子の部分を有する）を包含する。この予防または処置は、αフェトプロテインｃＤＮＡを発現する組換えベクターで形質導入した免疫系細胞（例えば、樹状細胞）を含有する組成物を哺乳動物に投与することによって達成される。
【実施例】
【００３２】
実施例Ｉ 哺乳動物における肝細胞癌の処置
本発明の１つの実施態様によれば、ヒトにおいて少なくともαフェトプロテイン分子の部分に対する免疫応答を生成することによってヒトにおいて肝細胞癌を処置するための方法が提供される。本方法は、本明細書中に開示された方法の一つと同様の方法、または対応する方法においてヒトを免疫する工程、あるいはヒトを遺伝子操作してαフェトプロテインに対する免疫応答を生成する工程を包含する。好ましい実施態様において、肝細胞癌を有するヒトを、少なくともヒトαフェトプロテイン分子（例えば、ＡＦＰ５、ＡＦＰ７、ＡＦＰ１３、ＡＦＰ１４、ＡＦＰ１８、ＡＦＰ２２、ＡＦＰ２３、ＡＦＰ２８、ＡＦＰ３８、ＡＦＰ３９、ＡＦＰ４５、またはＡＦＰ４９）の部分に対する免疫応答を生成するように免疫する。この免疫によって、ヒトの免疫系が、細胞表面にαフェトプロテイン分子のその部分を有する肝細胞癌細胞を攻撃することを引き起こす。
本発明は特定の好ましい実施態様を参照してかなり詳細に議論したが、他の実施態様も可能である。従って、添付の請求の範囲の精神および範囲は、本明細書中に含まれる好ましい実施態様の記載に制限されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ヒトＡＦＰ４９ペプチドを用いて生成されたＣＴＬの相対的細胞障害性を示す、棒グラフである。
【図２】ペプチド標的およびＡＦＰ標的の両方に対してアッセイした、正常なＨＬＡＡ２．１ドナーからのペプチドパルスＰＢＭＣから生成されたＣＴＬの標準的なクロム放出アッセイの標的に対する％特異的溶解を示す、棒グラフである。
【図３】マウスＡＦＰ ｃＤＮＡで免疫したマウス（白四角）および免疫しなかったマウス（黒丸）について、ＢＷＩＣ３（ｍＡＦＰ陽性マウス腫瘍細胞株）の腫瘍試行後の日数に対する平均腫瘍容積のプロットである。
【図４】マウスＡＦＰ ｃＤＮＡで免疫したマウス（白四角）および免疫しなかったマウス（黒丸）について、ＥＬ４（親）（非ｍＡＦＰ産生性マウス腫瘍細胞株）の腫瘍試行後の日数に対する平均腫瘍容積のプロットである。
【図５】マウスＡＦＰ ｃＤＮＡで免疫したマウス（白四角）および免疫しなかったマウス（黒丸）について、ＥＬ４（ＡＦＰ）（ｍＡＦＰ産生性マウス腫瘍細胞株）の腫瘍試行後の日数に対する平均腫瘍容積のプロットである。
【図６】マウスＡＦＰ−Ａｄｖシャトルベクターｎｅｏ含有発現プラスミドを用いてプラスミドＤＮＡで免疫したマウス（黒丸、下の黒四角、黒菱形）および免疫しなかったマウス（上の黒四角、逆向きの黒三角）について、ＡＦＰ発現ベクターで安定にトランスフェクトしたＦＳＡ Ｃ３Ｈバックグラウンド線維肉腫細胞またはｎｅｏ発現ベクターのみで安定にトランスフェクトしたＦＳＡ Ｃ３Ｈバックグラウンド線維肉腫細胞の腫瘍試行後の日数に対する平均腫瘍直径のプロットである。
【図７】マウスＡＦＰ遺伝子を合成したプラスミドベクターで免疫したマウス（黒丸）および免疫しなかったマウス（黒四角）について、ＢＷＩＣ３の腫瘍試行後の日数に対する平均腫瘍直径のプロットである。
【図８】マウスＡＦＰ遺伝子を合成したプラスミドベクターで免疫したマウス（黒三角、黒菱形、逆向き黒三角）および免疫しなかったマウス（黒丸および黒四角）について、ＢＷＩＣ３の腫瘍試行後の日数に対する平均肺腫直径のプロットである。
【図９】種々のコントロール（レーン２、３、８、および９）と比較した、種々の感染多重度（ＭＯＩ）でＡｄＶｍＡＦＰで形質導入されたマウスＤＣから単離されたｍＲＮＡ（レーン４〜７）のＲＴ−ＰＣＲ分析である。
【図１０】ＡｄＶｍＡＦＰ形質導入樹状細胞で免疫したマウス（黒四角）、種々のコントロール物質で免疫したマウス（黒三角および逆向き黒三角）、および免疫しなかったマウス（黒丸）について、ＥＬ４（ＡＦＰ）（ｍＡＦＰ産生性マウス腫瘍細胞株）の腫瘍試行後の日数に対する平均肺腫容積のプロットである。
【図１１】ＡｄＶｍＡＦＰ形質導入樹状細胞で免疫したマウス（黒四角）および免疫しなかったマウス（黒丸）について、ＢＷＩＣ３（ｍＡＦＰ産生性マウス腫瘍細胞株）の腫瘍試行後の日数に対する平均腫瘍容積のプロットである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において免疫応答を生成することによって該哺乳動物における癌を予防または処置するための組成物であって、該組成物は、配列番号１の核酸配列からなるαフェトプロテインｃＤＮＡを発現する組換えベクターで形質導入された免疫系細胞を含み、ここで該免疫応答は、αフェトプロテインペプチド特異的Ｔリンパ球を活性化して、これらの表面マーカーを保有する癌細胞に対して該免疫応答を生成する、組成物。
【請求項２】
前記免疫系細胞が樹状細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記癌が肝細胞癌である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１ないし３のいずれか一に記載の組成物。
【請求項１】
哺乳動物において免疫応答を生成することによって該哺乳動物における癌を予防または処置するための組成物であって、該組成物は、配列番号１の核酸配列からなるαフェトプロテインｃＤＮＡを発現する組換えベクターで形質導入された免疫系細胞を含み、ここで該免疫応答は、αフェトプロテインペプチド特異的Ｔリンパ球を活性化して、これらの表面マーカーを保有する癌細胞に対して該免疫応答を生成する、組成物。
【請求項２】
前記免疫系細胞が樹状細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記癌が肝細胞癌である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１ないし３のいずれか一に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１０−２２２３７９（Ｐ２０１０−２２２３７９Ａ）
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５０６２７（Ｐ２０１０−１５０６２７）
【出願日】平成２２年６月３０日（２０１０．６．３０）
【分割の表示】特願２００６−３８６２６（Ｐ２００６−３８６２６）の分割
【原出願日】平成１０年２月１３日（１９９８．２．１３）
【出願人】（５９２１３０６９９）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (364)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月３０日（２０１０．６．３０）
【分割の表示】特願２００６−３８６２６（Ｐ２００６−３８６２６）の分割
【原出願日】平成１０年２月１３日（１９９８．２．１３）
【出願人】（５９２１３０６９９）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (364)
【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
【Ｆターム（参考）】
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