肺ガンの治療
被験者の肺ガンを治療し、予防し、抑制し、または減少させるために、免疫調節化合物が投与される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本願は、２００７年８月２３日に出願された米国仮出願連続番号第６０／９５７，５３０号の利益を主張する。当該仮出願の開示はその全体がここに引用により援用される。
【０００２】
発明の分野
この発明は、肺ガンの治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術の説明
肺ガンは肺組織の悪性転換および拡大であり、世界中で年間１３０万人の死亡に関与している。それは、男性ではガンに関する死亡の最大の原因であり、女性では２番目に多い原因である。
【０００４】
肺ガンのリスクに対して最大の影響を有する要因は、吸入された発ガン物質、特に煙草の煙に長期間さらされることであることを、現在の研究は示唆している。他の場合の肺ガンの発生（１０分の１未満）は、遺伝的要因の組合せによるものと思われる。ラドンガスおよび空気汚染も肺ガンの進行に寄与する場合がある。
【０００５】
治療および予後は、ガンの組織型、段階（広がり具合）、および患者の一般状態に依存する。現在の治療は外科手術、化学療法、および放射線治療を含む。全体的に、５年生存率は約１４％である。
【０００６】
肺ガンには、顕微鏡で組織病理学者が見る悪性細胞の大きさおよび外観によって分類される２つの主な種類がある。すなわち、非小細胞肺ガン（８０％）および小細胞（ほぼ２０％）肺ガンである。この分類は、単純な組織学的基準に基づいているものの、この病気の臨床管理および予後にとって非常に重要な意味合いを有する。
【０００７】
非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）は、それらの予後および管理がほぼ同じであるため、一緒にグループ化されている。肺扁平上皮ガン、腺ガン、および大細胞肺ガンという３つの主なサブタイプがある。
【０００８】
肺ガンの２９％を占める扁平上皮ガンもより大きい気管支で始まるが、よりゆっくりと成長する。これらの腫瘍の大きさは診断によって異なる。
【０００９】
腺ガンは、ＮＳＣＬＣのうち最も多いサブタイプであり、肺ガンの３２％を占める。それは、肺のガス交換表面近傍で始まる形態である。腺ガンの大抵の場合は喫煙に関連している。しかしながら、喫煙したことがない人々（喫煙未経験者）の中で、腺ガンは肺ガンの最も多い形態である。腺ガンのサブタイプである細気管支肺胞上皮ガンは、女性の喫煙未経験者により多く見られ、治療に対して異なる反応を有する場合がある。
【００１０】
大細胞ガンは、肺ガンの９％を占める、肺の表面近傍で成長する、成長が急な形態である。
【００１１】
小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ、「燕麦細胞ガン」とも呼ばれる）は、肺ガンのあまり一般的でない形態である。それはより大きい呼吸管で始まる傾向があり、急速にかなり大きく成長する。最もよく関与しているガン遺伝子はＬ−ｍｙｃである。「燕麦」細胞は密な神経分泌顆粒を含み、それらはこれに内分泌腫瘍随伴症候群関連を与える。それは当初、化学療法により敏感だが、最終的には予後が悪く、発現時には転移性であることが多い。この種類の肺ガンは、喫煙に強く関連している。
【００１２】
他の種類の肺ガンは、カルチノイド、腺様嚢胞ガン（円柱腫）、および粘膜上皮ガンを含む。
【００１３】
転移ガン
肺は、身体の他の部分におけるガンからの転移がよくある場所である。副腎、肝臓、脳、および骨は、原発性肺ガン自体からの転移が最もよくある部位である。
【００１４】
当該技術分野において、肺ガンを治療し、予防し、抑制し、または減少させるための治療の方法に対する要望が依然としてある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
この発明によれば、被験者における、肺ガン、その転移、または肺における肺外部のガンからの転移を治療し、抑制し、減少させ、または少なくとも部分的に予防するための、もしくは、肺ガン細胞の成長、その転移、または肺における肺外部のガン細胞からのガン細胞の転移を治療し、抑制し、減少させ、または少なくとも部分的に予防するための治療の方法は、治療に有効な量の式Ａの免疫調節剤化合物を被験者に投与するステップを含み、
【００１６】
【数１】
【００１７】
式中、ｎは１または２であり、Ｒは水素、アシル、アルキル、またはペプチド断片であり、Ｘは芳香族または複素環アミノ酸もしくはその誘導体であり、被験者における、前記肺ガン、その転移、または肺における肺外部のガンからの転移を治療し、抑制し、減少させ、または少なくとも部分的に予防するようにし、もしくは、被験者における、前記肺ガン細胞の成長、その転移、または肺における肺外部のガン細胞からのガン細胞の転移を治療し、抑制し、減少させ、または少なくとも部分的に予防するようにする。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】一実施の形態の一研究における異なる投与量での腫瘍成長をグラフで示す図である。
【図２】一実施の形態の研究における異なる投与量での腫瘍重量をグラフで示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
好ましい実施の形態の説明
一実施の形態によれば、この発明は、哺乳類の被験者、好ましくは人間の患者に免疫調節剤化合物を投与することによって、肺ガンを治療し、少なくとも部分的に予防し、抑制し、または減少させるための治療の方法に関する。
【００２０】
いくつかの実施の形態では、病気は、肺ガン、その転移、または肺における肺外部のガンからの転移である。この発明は、被験者における、肺ガン細胞の成長、その転移、または肺における肺外部のガン細胞からのガン細胞の転移を治療し、少なくとも部分的に予防し、抑制し、または減少させるために利用可能である。いくつかの実施の形態では、この発明の化合物での治療の前、最中、または後に、原発性肺ガン腫瘍、またはその主な部分が、外科手術により除去される。
【００２１】
この発明に従った免疫調節剤化合物は、式Ａの免疫調節剤を含む。
【００２２】
【数２】
【００２３】
式Ａにおいて、ｎは１または２であり、Ｒは水素、アシル、アルキル、またはペプチド断片であり、Ｘは芳香族または複素環アミノ酸もしくはその誘導体である。好ましくは、ＸはＬ−トリプトファンまたはＤ−トリプトファンであり、最も好ましくはＬ−トリプトファンである。
【００２４】
「Ｘ」についての芳香族または複素環アミノ酸の適切な誘導体は、アミド、モノ−またはジ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル置換アミド、アリルアミド、および（Ｃ1−Ｃ6）アルキルまたはアリルエステルである。「Ｒ」についての適切なアシルまたはアルキル部分は、炭素が１〜約６個の分岐または非分岐アルキル基、炭素原子が２〜約１０個のアシル基、ならびに、カルボベンジルオキシおよびｔ−ブチルオキシカルボニルなどの保護基である。好ましくは、式Ａに示すＣＨ基の炭素は、ｎが２の場合、Ｘの立体構造とは異なる立体構造を有する。
【００２５】
好ましい実施の形態は、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｎin−ホルミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−メチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファン、β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン、およびβ−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファンなどの化合物を利用している。特に好ましい実施の形態は、ＳＣＶ−０７とも呼ばれるγ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンを利用している。これらの化合物、ならびに、これらの化合物、これらの化合物の医薬的に受容可能な塩、およびそれらの医薬製剤を調製するための方法は、ここに引用により援用される米国特許第５，９１６，８７８号に開示されている。
【００２６】
ＳＣＶ−０７、すなわちγ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンは、ロシアの科学者により発見され、いくつかの徴候における有効性について米国でサイクローン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド（SciClone Pharmaceuticals, Inc.）により調査されているγ−グルタミルまたはβ−アスパルチル部分を有する免疫調節薬物の部類の１つである。ＳＣＶ−０７は、多くの体内および体外免疫調節活性を有する。ＳＣＶ−０７は、Ｃｏｎ−Ａ誘導胸腺細胞およびリンパ球の増殖を増加させ、Ｃｏｎ−Ａ誘導インターロイキン−２（ＩＬ−２）産生、および脾臓リンパ球によるＩＬ−２受容体発現を増加させ、骨髄細胞におけるＴｈｙ−１．２の発現を刺激する。体内で、ＳＣＶ−０７は、５−ＦＵ−免疫抑制動物に対し、およびヒツジ赤血球を用いた免疫付与のモデルにおいて、強力な免疫調節効果を有する。
【００２７】
式Ａの化合物は、任意の効果的な投与量、たとえば約０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは約０．１〜１００ｍｇの範囲、最も好ましくは約１０ｍｇの投与量で投与されてもよい。投与量は１週間に１回以上、たとえば毎日投与されてもよく、１日に１回以上投与されてもよい。投与は、経口、経鼻、経皮、舌下、注射、周期的注入、持続注入などを含む好適な方法によって行なわれ得る。投与量は筋肉注射によって投与されてもよいが、他の形態の注射および注入が利用されてもよく、経口または経鼻吸入もしくは経口摂取といった他の形態の投与が採用されてもよい。エアゾール、溶液、懸濁液、分散液、錠剤、カプセル、シロップなどが利用されてもよい。
【００２８】
投与量はまた、ミリグラム／キログラム単位で測定されてもよく、約０．００００１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲、より好ましくは約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内、さらにより好ましくは約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、およびさらにより好ましくは約１〜２０ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【００２９】
ＳＣＶ−０７と実質的に類似した生物活性を有する、置換、削除、伸張、代替、または他の態様で改質された部分を有する生物活性類似物、たとえば、ＳＣＶ−０７と実質的に同じ活性で実質的に同様に機能するような、ＳＣＶ−０７との十分な相同性を有するＳＣＶ−０７由来ペプチドが含まれる。
【００３０】
一実施の形態によれば、治療または予防期間中、被験者の循環系において有効量の式Ａの化合物を実質的に連続して保つように、式Ａの化合物が被験者に投与されてもよい。この発明によればはるかにより長い治療期間が考えられるが、この発明の実施の形態は、少なくとも約６時間、１０時間、１２時間、またはそれ以上の治療期間中、患者の循環系において有効量の式Ａの化合物を実質的に連続して保つことを含む。他の実施の形態では、治療期間は、少なくとも約１日、さらには数日、たとえば１週間、またはそれ以上である。しかしながら、被験者の循環系において有効量の式Ａの化合物が実質的に連続して保たれる、上に定義されたような治療は、同様のまたは異なる長さの非治療期間によって隔てられ得ることが考えられる。
【００３１】
一実施の形態によれば、式Ａの化合物は、被験者の循環系において有効量の式Ａの化合物を実質的に連続して保つように、治療期間中、たとえば静脈内注入によって被験者へと連続して注入される。注入は、ミニポンプなどのような好適な手段によって行なわれてもよい。また、これに代えて、被験者の循環系において有効量の式Ａの化合物を実質的に連続して保つように、式Ａの化合物の注射計画を維持することが可能である。好適な注射計画は、治療期間中、被験者の循環系において有効量の免疫調節剤化合物ペプチドを実質的に連続して保つよう、１時間、２時間、４時間、６時間ごとなどに注射することを含んでいてもよい。
【００３２】
式Ａの化合物の連続注入中、投与が実質的により長い期間にわたることが考えられるが、一実施の形態によれば、式Ａの化合物の連続注入は、少なくとも約１時間の治療期間にわたる。より好ましくは、連続注入は、より長い期間、たとえば少なくとも約６時間、８時間、１０時間、１２時間、またはそれ以上の期間、行なわれる。他の実施の形態では、連続注入は、少なくとも約１日、さらには数日間、たとえば１週間またはそれ以上の期間にわたる。
【００３３】
いくつかの実施例では、式Ａの化合物は、注射用の水、生理食塩水といった医薬的に受容可能な液状担体内に、約０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１〜１００μｇ／ｍｌの範囲内の濃度で存在する。
【００３４】
有効量の式Ａの化合物は、慣例的な用量漸増実験によって決定され得る。
式Ａの化合物はまた、他の薬剤を用いて投与され得る。たとえば、ガンの治療では、そのような薬剤は、化学療法薬剤および／または放射線を含む。
【００３５】
放射線は、好適な方法により、当該技術分野において投与される好適な投与量および投与量計画で投与されてもよい。たとえば、放射線は約１Ｇｙ／分の線量率で投与可能であり、放射線は、たとえば、放射線を投与しない日を挟んだ別々の投与日に、たとえば約４Ｇｙ／１回分の投与を、１日に２回投与可能である。
【００３６】
治療計画において式Ａの化合物とともに投与され得る化学療法薬剤は、シスプラチン、５−フルオロウラシル（５−Ｆｕ）、ＤＴＩＣなどを一例として含む好適な化学療法薬剤を含む。そのような化学療法薬剤は、ここの実施例で示すものを含む、好適な投与量および／または投与量計画で投与されてもよい。
【実施例】
【００３７】
実施例１
略語
ＣＴＸ シクロホフォスファミド
Ｆ 女性
ｇ グラム
ＩＲ 抑制率
Ｉｐ 腹腔内
Ｋｇ キログラム
Ｌ 長さ
Ｍ 男性
ｍＬ ミリリットル
ｓｃ 皮下
ｓｄ 標準偏差
Ｗ 幅
概要
この研究では、ＳＣＶ−０７が、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおけるマウス肺腫瘍の成長に対するその抑制効果について試験した。全部で７０匹のマウスにマウスルイス肺ガン（ＬＬＣ）細胞を皮下移植し、次に、ＳＣＶ−０７またはシクロフォスファミド（ＣＴＸ）を単独で用いて、もしくは併用して、連続１４日間治療した。ＳＣＶ−０７を毎日、ｓｃ注射により投与し、一方、ＣＴＸを１日おきにｉｐ注射により投与した。群１：媒体、群２：ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ、群３：ＣＴＸ ４０ｍｇ／ｋｇ、群４：ＳＣＶ−０７ ５ｍｇ／ｋｇ、群５：ＳＣＶ−０７ １０ｍｇ／ｋｇ、群６：ＳＣＶ−０７ ５ｍｇ／ｋｇプラスＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ、群７：ＳＣＶ−０７ １０ｍｇ／ｋｇプラスＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇという、全部で７つの群を用いた。腫瘍体積および体重を３日ごとに測定し、腫瘍重量を研究終了時の第１６日目（解剖日）に測定した。
【００３８】
研究期間全体を通して、どの群でも動物の死亡は見られなかった。さらに、体重の統計結果は、ＳＣＶ−０７のみの群と媒体対照群との有意差を示さず、動物の成長に対してＳＣＶ−０７が影響を及ぼさないことを表わしている。これに対し、第６日目以降、ＣＴＸ治療群は、特に高投与量のＣＴＸを投与された群において、体重の著しい減少を示した。
【００３９】
腫瘍の成長については、第３日目に、群４を除くすべての群が、群１（媒体対照）と比べ、腫瘍体積の統計学的に有意な抑制を示した。第６日目に、群２および群３のみが抑制を示した。第９日目に、群２、群３、および群７が抑制を示した。第１２日目に、群４を除くすべての群が抑制を示した。第１５日目に、すべての群の平均腫瘍サイズが、群１よりも統計学的に有意に小さくなった。第１６日目に、すべての治療群の平均腫瘍重量が、媒体対照群よりも低くなった。群２、群３、群４、群５、群６、および群７の腫瘍重量抑制率は、それぞれ、４５．５４％（ｐ＜０．０１）、９０．２５％（ｐ＜０．０１）、１８．０８％（ｐ＝０．０７）、３０．６０％（ｐ＜０．０１）、４８．５７％（ｐ＜０．０１）、および６２．６３％（ｐ＜０．０１）であった。
【００４０】
結論として、媒体群が顕著な腫瘍成長を示し、一方、陽性対照薬物ＣＴＸが腫瘍成長を効果的に減少させたので、この研究で使用された腫瘍モデルは有効である。ＳＣＶ−０７（１０ｍｇ／ｋｇ）を毎日、１４日間投与することは、腫瘍成長を著しく抑制した。治療された動物における腫瘍重量は、媒体対照群のものと比べて著しく減少した。さらに、次善の投与量（２０ｍｇ／ｋｇ）のＣＴＸと高投与量（１０ｍｇ／ｋｇ）のＳＣＶ−０７との併用治療は、抗腫瘍効果の増加を示した。
【００４１】
前書き
この研究は、ＳＣＶ−０７の抗腫瘍効果を、肺ガンにおける抗腫瘍薬物としてのその可能性を探求するために、マウス肺ガンモデルを用いて試験する。陽性対照としてＣＴＸを使用する。ＳＣＶ−０７とＣＴＸとの併用効果も、相加効果または相乗効果があるかどうかを判断するために試験する。
【００４２】
材料および方法
試験および対照物質
陰性対照物質（媒体）としてＰＢＳを使用し、陽性対照としてＣＴＸを使用した。ＣＴＸをシグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）社から購入し、１０ｍｇ／バイアルに等分した。ＰＢＳを、研究設計表に示されたような適正な投与量レベルを達成するよう添加した。製剤を冷蔵し、光から保護し、すぐに使用した。試験物質（ＳＣＶ−０７）を、研究設計表に示されたような適正な投与量レベルを達成するようＰＢＳに溶解させ、冷蔵し、光から保護し、１週間以内に使用する。
【００４３】
試験システムおよび動物の飼育管理
マウス肺ガン細胞（ＬＬＣ）
マウスルイス肺ガン細胞を、中国医学科学院（Chinese Academy of Medical Sciences（ＣＡＭＳ）、北京、中華人民共和国）の細胞培養センター（Cell Culture Center）から入手した。このガン細胞を、実験に使用する前に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに適応させた。細胞適応の詳細については第４．３．１号を参照されたい。
【００４４】
試験システム
中華人民共和国、北京、ＣＡＭＳの実験動物協会（Institute of Laboratory Animal Science）から、実験に未使用の健康なＣ５７ＢＬ／６マウスを、雄３５匹、雌３５匹受取った。研究開始時、これらの動物は、生後６週間で体重が１８〜２２グラムであった。
【００４５】
動物の飼育管理
動物を、寝床材料として加圧滅菌した木片が入った加圧滅菌した靴箱型ケージに、群別に収容した。飼育室の温度を２２〜２５℃に保ち、相対湿度を４０〜６０％に保った。研究に関連する事象によって中断される場合を除き、１２時間ずつの明暗サイクルが保たれた。動物には、滅菌水および北京KeAoXieLiげっ歯類用餌（認定済）を自由に給餌した。動物をすべて、腫瘍接種前に３日間順応させた。
【００４６】
実験手順
腫瘍細胞適応
無菌組織培養手順により、１バイアルのマウス肺ガン細胞を解凍し、１０００ｒｐｍ、２０〜２５℃で５分間、遠心分離機にかけた。細胞ペレットを０．５ｍＬの生理食塩水（ＮＭ）に懸濁し、各マウスの右腋窩に皮下注射した（約１×１０6細胞／マウス）。腫瘍の直径が約１ｃｍに達すると、動物をＣＯ2窒息で安楽死させ、腫瘍を摘出した。腫瘍細胞を前述のような生理食塩水に懸濁し、細胞適応サイクルをもう１回繰返した。
【００４７】
腫瘍細胞接種
体積０．１ｍＬの生理食塩水内の１×１０6個のＬＬＣ細胞を、マウスの右腋窩領域に皮下注射した。腫瘍接種日を第０日目と定義した。
【００４８】
研究設計および治療計画
第１日目に、動物をそれらの体重に基づき、平均体重が群間で統計学的に有意に異ならないよう、７つの異なる群に無作為に分けた。投与を第１日目に開始した。ＳＣＶ−０７を、体重２０ｇにつき０．１ｍＬの投与体積で、１日１回、連続１４日間、皮下投与により投与し、同じ投与体積のＣＴＸを、１日おきに腹腔内注射により投与した。媒体も、１日１回、連続１４日間、同じ投与体積のＰＢＳのｓｃ投与により投与した。すべての群についての治療計画を、表１に概説する。
【００４９】
【表１】
【００５０】
抗腫瘍効果の評価
研究期間全体を通して、すべての動物の腫瘍サイズおよび体重を３日ごとに測定した。腫瘍サイズは測径器により、体重は実験室の天秤により測定した。動物の死亡率および罹患率を毎日監視し、記録した。第１６日目に、動物をＣＯ2窒息により安楽死させ、腫瘍を摘出し、分離し、重量を量った。
【００５１】
腫瘍体積を、以下の式を用いて計算した。
腫瘍体積＝長さ×幅×幅／２
腫瘍体積抑制率（ＩＲ）を、以下の式に従って計算した。
【００５２】
【数３】
【００５３】
式中、ＴＶは測定日の腫瘍体積であり、「媒体」はＰＢＳを受ける群を示し、「薬物で治療」はＳＣＶ−０７および／またはＣＴＸを受ける群を示す。
【００５４】
単独で使用された、またはＣＴＸと併用されたＳＣＶ−０７の抗腫瘍効果も、腫瘍重量によって評価した。各マウスの腫瘍重量を安楽死の後で記録し、腫瘍重量の抑制率を以下の式に従って計算した。
【００５５】
【数４】
【００５６】
平均偏差および標準偏差を、エクセルを用いて計算した。
統計的分析
スチューデントのｔ検定を用いて、腫瘍体積、腫瘍重量、および体重について、群内での比較を行なった。０．０５未満のＰ値は統計学的に有意であると考えた。
【００５７】
結果および論議
死亡率
この研究において、動物の死亡は観察されなかった。
【００５８】
腫瘍サイズ
腫瘍サイズの生測定データを付録１〜１０に列挙する。計算された腫瘍抑制率、および媒体群に対する各治療群の統計比較を表２〜６に列挙する。腫瘍成長曲線を図１に示す。腫瘍体積データに基づくと、第３日目に、群４を除くすべての群が腫瘍成長の著しい抑制を示した。第６日目に、群２および群３が抑制を示した。第９日目に、群２、群３、および群７の平均腫瘍サイズが、群１（媒体）よりも統計学的に有意に小さくなった。第１２日目に、群４を除くすべての治療群の平均腫瘍サイズが、群１よりも統計学的に有意に小さくなった。第１５日目に、すべての群の平均腫瘍サイズが、群１よりも統計学的に有意に小さくなった。併用治療群の中では、高投与量のＳＣＶ−０７がＣＴＸとの相加効果を示した。
【００５９】
腫瘍重量
腫瘍重量の生データを付録１１に示した。一方、各治療群と媒体対照群との統計比較結果を表７に示す。表７に示すように、第１６日目に測定されたすべての治療群の平均腫瘍重量は、媒体対照群よりも低かった。群２、群３、群４、群５，群６、および群７における腫瘍抑制率は、それぞれ、４５．５４％（ｐ＜０．０１）、９０．２５％（ｐ＜０．０１）、１８．０８％（ｐ＝０．０７）、３０．６０％（ｐ＜０．０１）、４８．５７％（ｐ＜０．０１）、および６２．６３％（ｐ＜０．０１）であった。群２（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ）と群６（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ＋ＳＣＶ−０７ ５ｍｇ／ｋｇ）とでは、腫瘍抑制において統計学的に有意な差はなかった。これに対し、群７（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ＋ＳＣＶ−０７ １０ｍｇ／ｋｇ）の抑制率は、群２（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ）よりも統計学的に有意に大きく、ＣＴＸをＳＣＶ−０７と併用した場合の相加効果を表わしている。
【００６０】
図２は、研究終了時（第１６日目）での全群についての腫瘍重量を示す。
体重
体重測定の生データを付録１２〜１７に列挙した。媒体群に対する各治療群の統計比較の結果を表８〜１３に列挙している。
【００６１】
表に示すように、第３日目では、各治療群と媒体対照群との有意差はない。第６日目に、群３（ＣＴＸ ４０ｍｇ／ｋｇ）は１０．８２％（Ｐ＜０．０５）の体重抑制率を呈した。他の群については体重の有意差はなかった。第９日目では、群２（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ）、群３（ＣＴＸ ４０ｍｇ／ｋｇ）、および群６（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ＋ＳＣＶ−０７ ５ｍｇ／ｋｇ）についての抑制率は、それぞれ、１２．３５％（ｐ＜０．０１）、１６．１２％（ｐ＜０．０１）、および７．２２％（ｐ＜０．０１）であった。群６にＳＣＶ−０７を添加すると、体重増加の抑制率が減少した。他の群については体重の有意差はなく、動物の体重増加にＳＣＶ−０７が影響を及ぼさないことを表わしている。第１２日目では、群２（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ）、群３（ＣＴＸ ４０ｍｇ／ｋｇ）、および群６（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ＋ＳＣＶ−０７ ５ｍｇ／ｋｇ）についての抑制率は、それぞれ、１４．８３％（ｐ＜０．０１）、２１．９７％（ｐ＜０．０１）、および１０．２８％（ｐ＜０．０１）であった。第１５日目に、群３（ＣＴＸ ４０ｍｇ／ｋｇ）の抑制率は２５％（ｐ＜０．０１）であった。他の群については体重の有意差はなかった。この結果は、ＣＴＸはおそらくその毒性により体重増加を抑制し、ＳＣＶ−０７はおそらくそのＣＴＸ毒性の緩和により、抑制を部分的に保留し得ることを表わしている。
【００６２】
結論および論議
結論として、陽性対照薬物ＣＴＸによって腫瘍成長が抑制可能なので、この研究で使用された腫瘍モデルは有効である。試験物質であるＳＣＶ−０７を毎日１０ｍｇ／ｋｇ、１４日間投与することも、腫瘍成長に対して効果的である。第１２日目以降、ＳＣＶ−０７で治療されたすべての群の動物の腫瘍サイズは、媒体対照群のものと比べて著しく減少した。第１６日目に測定された腫瘍重量も、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のみを受けた群、および併用治療を受けた群では著しく減少したが、５ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のみを受けた群ではそうでもなかった。さらに、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７と２０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７との併用は、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７または２０ｍｇ／ｋｇのＣＴＸを単独で使用した場合に得られる３０．６％および４５．５４％の抑制に比べ、合わせて６２．６３％の腫瘍成長の抑制を生み出した。これらの結果は、ＳＣＶ−０７とＣＴＸとの併用が腫瘍成長抑制に向けて相加効果を生み出すことを示唆している。
【００６３】
ＣＴＸ治療群における動物の平均体重は著しく減少し、毒性効果を表わしている。しかしながら、併用治療群におけるＳＣＶ−０７の添加により、ＣＴＸの毒性効果はＳＣＶ−０７によって少なくとも部分的に弱められ得るようである。この減少は、２０ｍｇ／ｋｇのＣＴＸの単独使用が体重増加の統計学的に有意な抑制を生み出すものの、併用治療群（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ＋ＳＣＶ−０７ １０ｍｇ／ｋｇ）では抑制がない第９日目において明らかである。体重増加のより顕著な抑制を生み出す、より高い投与量のＣＴＸ（すなわち４０ｍｇ／ｋｇ）と併用したＳＣＶ−０７の保護効果は、試験しなかった。さらなる研究によって検証されれば、ＳＣＶ−０７の保護効果は、ＳＣＶ−０７とＣＴＸとの併用治療を検討する際に非常に有用であろう。総合すれば、高投与量（１０ｍｇ／ｋｇ）のＳＣＶ−０７と次善の投与量（２０ｍｇ／ｋｇ）のＣＴＸとの併用は、抗腫瘍効果の増加および毒性の低下を示した。
【００６４】
【表２】
【００６５】
【表３】
【００６６】
【表４】
【００６７】
【表５】
【００６８】
【表６】
【００６９】
【表７】
【００７０】
【表８】
【００７１】
【表９】
【００７２】
【表１０】
【００７３】
【表１１】
【００７４】
【表１２】
【００７５】
【表１３】
【００７６】
【表１４】
【００７７】
【表１５】
【００７８】
【表１６】
【００７９】
実施例２
腫瘍成長の減少における効果に関する、放射線と併用したＳＣＶ−０７の評価
概要
この研究では、放射線治療を行なった場合または行なわなかった場合の腫瘍成長に対するＳＣＶ−０７の影響を、マウスのＨ１４６肺ガンモデルを用いて試験した。ガンを持ったマウスが１日１回、２０日間、生理食塩水またはＳＣＶ−０７を用いて、放射線治療を受けて、または受けずに治療された。生存および重量変化の観察に基づくと、ＳＣＶ−０７はこの研究では毒性の証拠を示さず、また、それは放射線に対するＨ１４６腫瘍の反応を変化させなかった。単独で投与された場合、ＳＣＶ−０７は投与量に依存して腫瘍成長の減少に効果的であり、１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を１日２回、２０日間受けた動物は９．１％の腫瘍成長抑制を示し、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を１日２回、２０日間受けた動物は３５．９％の腫瘍成長抑制を示した。１回投与の紫外線治療と併用すると、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を１日２回、２０日間投与した治療は、放射線のみで治療された動物に比べ、７８．３％の腫瘍成長抑制、すなわち４０．５％のＴＧＩをもたらした。これらの観察に基づくと、ＳＣＶ−０７は、単独で投与された場合、または放射線治療と併用した場合に、肺ガンモデルにおける腫瘍の成長を減少させるのに効果的であると思われる。
【００８０】
目的
マウスのＮＣＩ Ｈ１４６小細胞肺ガンモデルを用いて、腫瘍成長抑制におけるＳＣＶ−０７の効果を、単独治療として、および放射線治療と併用して評価する。
【００８１】
研究設計
９６匹の雌のヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）を、８つの治療群に無作為に割当てた。各マウスの左脇腹下方に、体積が０．１ｍＬの１×１０5個のＮＣＩ−Ｈ１４６（Ｈ１４６）肺ガン細胞をマトリゲルとともに接種した。腫瘍の体積が一旦７５〜１２５ｍｍ3に達すると、治療を開始した。表２．１に詳述するように、媒体、放射線、ＳＣＶ−０７、または放射線およびＳＣＶ−０７を用いて群を治療した。薬物治療の開始を第１日目と指定した。群１および群４のマウスは、媒体を皮下（ｓｃ）注射により２０日間受けた。群２〜４および６〜８のマウスは、媒体中のＳＣＶ−０７を１日１回、ｓｃ注射により、第１〜２０日目に受け、群６〜８のマウスは放射線を受けた（２回、第０日目および第２日目に４Ｇｙ／１回分）。放射は、これらの群のマウスをケタミン（１２０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（６ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、腫瘍を有する脇腹の領域が放射線にさらされるようにマウスを鉛遮蔽体の下に配置することによって行なわれた。放射線は、フィリップス（Philips）１６０ｋＶ源を用いて、約４０ｃｍの焦点距離、および約１．０Ｇｙ／分の線量率で送出された。研究期間全体を通して、腫瘍を１日おきに測定した。群１〜８のマウスは第２１日目に犠牲となり、残った腫瘍が摘出され、測定され、重量を量られ、写真を撮られて、後の分析用にホルマリンで固定された。
【００８２】
【表１７】
【００８３】
重量および生存
起こり得る毒性を評価するために、動物の重量を毎日測定し、それらの生存を記録した。研究期間中、開始重量の２０％を超える減少を呈した動物を安楽死させた。腫瘍が４０００ｍｍ3を超えて成長した動物も安楽死させた。
【００８４】
材料および方法
組織培養
Ｈ１４６ヒト肺ガン細胞をＡＴＣＣから入手した。これらの細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％のペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびに２ｍＭのＬ−グルタミンが補充されたＤＭＥＭにおいて成長させた。媒質を除去し、カルシウムおよびマグネシウムを含まない殺菌したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて２回すすぎ、０．２５％トリプシン／０．０３％ＥＤＴＡ溶液を１〜２ｍｌ添加することによって、細胞を二次培養した。細胞が分離するまで、フラスコを３７℃で培養した。細胞を次に、１：３の比率で二次培養した。
【００８５】
研究実行の場所
この研究は、マサチューセッツ州ウォータータウン（Watertown）のバイオモデルズ（Biomodels）ＡＡＡＬＡＣ公認施設で行なわれた。この研究に関する動物使用許可は、バイオモデルズＩＡＣＵＣから得た。
【００８６】
動物
ｎｕ遺伝子（ｎｕ＋／ｎｕ＋）についてホモであり（チャールズリバーラボ（Charles River Labs））、生後５〜６週間で、治療前の平均体重が２４グラムの雌のヌードマウスを使用した。動物に耳パンチを用いて個々に番号を付け、１つのケージにつき６匹ずつの群で収容し、研究開始前に順応させた。少なくとも２日間の順応期間中、不調を呈する動物を除外するために、動物を毎日観察した。
【００８７】
飼育室
この研究は、温度が７０°Ｆ＋／−５°Ｆ、相対湿度が５０％＋／−２０％の、ろ過空気が供給された飼育室で行なわれた。飼育室は、１時間につき最低で１２〜１５回の換気を保つように設定された。この飼育室には、薄明無しで１２時間オン、１２時間オフとなる明暗サイクル用の自動タイマが付いていた。
【００８８】
滅菌されたベッド・オ・コブズ（Bed-O-Cobs）（登録商標）寝床を使用した。寝床は少なくとも週に１回交換した。
【００８９】
ケージ、蓋、底などを市販の洗剤で洗い、空気乾燥させた。使用前、これらの物品を覆って加圧滅菌した。フードに入れられる面および材料を殺菌するために、市販の殺菌剤を使用した。床は毎日掃除され、少なくとも週に２回、市販の洗剤でモップがかけられた。壁およびケージラックは少なくとも１月に１回、薄めた漂白容器を用いてスポンジで擦られた。研究、投与量、動物番号、および治療群を識別するために必要な適切な情報を記載したケージカードまたはラベルを、すべてのケージに付けた。研究中、温度および相対湿度を記録し、これらの記録を保存した。
【００９０】
餌
動物には、無菌ラボダイエット（Labdiet）（登録商標）５０５３（滅菌前）げっ歯類用餌を給餌し、滅菌水を自由に与えた。
【００９１】
動物の無作為化および割当て
治療の開始前、マウスを、無作為にかつ先を見越して８つの群に分けた。各動物を、個々の番号に対応する耳パンチによって識別した。各ケージを識別するためにケージカードを使用し、研究番号（ＳＣＩ−０５）、治療群番号、および動物番号を記載した。
【００９２】
結果の評価
治療群間の統計学的差異を、スチューデントのｔ検定、マン・ホイットニーのＵ検定、およびカイ二乗分析を用いて、０．０５という臨界値で判断した。
【００９３】
実験手順
腫瘍を２日に１回、マイクロ測径器で測定し、腫瘍体積を４／３πｒ3として計算した。ここで、ｒは長さと幅との和を４で割ったものに等しい。式１００−（Ｖｃ*１００／Ｖｔ）を用いて腫瘍成長指標（ＴＧＩ）を計算した。式中、Ｖｃは対照群における腫瘍の平均体積であり、Ｖｔは試験群における腫瘍の平均体積である。
【００９４】
結果および論議
生存
この研究の期間中、治療の直接的な結果としての動物の死亡は起こらなかった。
【００９５】
動物の重量
媒体治療群とＳＣＶ−０７を単独治療として受けた動物（ｐ＝０．７）との間、または放射線のみを受けた動物および放射線とＳＣＶ−０７とを併用して受けた動物（ｐ＝０．６８）には、平均重量の日別変化に有意差はなかった。媒体のみを受けたマウスは、第２１日目までに、平均でそれらの開始重量の１３．２％増加した。１００μｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のいずれかで治療されたマウスは、第２１日目までに、それらの開始重量の１０．２％〜１２．３％増加した。媒体で治療され、かつ放射線にさらされたマウスは、第２１日目までに、平均でそれらの開始重量の３．２％増加した。１００μｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のいずれかで治療され、かつ放射線にさらされたマウスは、第２１日目までに、それらの開始重量の２．８％〜３．６％増加した。
【００９６】
各動物の重量変化百分率についての平均の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、一元配置分散分析検定を用いて群同士を比較することにより、これらの差異の有意性を評価した。
【００９７】
腫瘍体積
１日おきに測定した長さおよび幅の測定値から、長さと幅との和を４で割った平均半径（ｒ）を計算し、式４／３πｒ3を用いて体積を計算することにより、腫瘍体積を計算した。
【００９８】
１００μｇ／ｍｌで治療された動物からの腫瘍は、媒体対照動物よりも速い速度で成長した。放射線を受けなかった動物のうち、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療されたマウスが、腫瘍成長抑制において最良の改善を示した。媒体で治療された動物についての研究期間終了時の平均腫瘍体積は４４３６．６ｍｍ３であり、１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療された動物については４９２３ｍｍ３、１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療された動物については４０３３．４ｍｍ３、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療された動物については２８４２．４ｍｍ３であった。
【００９９】
放射線を受けた動物のうち、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療されたマウスが、腫瘍成長抑制において最良の改善を示した。媒体で治療された動物についての研究期間終了時の平均腫瘍体積は１６１８．５ｍｍ３であり、１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療された動物については１３２２．３ｍｍ３、１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療された動物については１９２３．９ｍｍ３、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療された動物については９６２．８ｍｍ３であった。
【０１００】
各動物の腫瘍体積についての平均の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、一元配置分散分析検定を用いて群同士を比較することにより、データのさらなる分析を行なった。この分析は、いずれの治療群と生理食塩水対照群との有意差も明らかにはしなかった（放射線を受けていない動物についてはｐ＝０．１３、放射線を受けた動物についてはｐ＝０．１４）。しかしながら、マン・ホイットニー順位和分析を用いて媒体治療と１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７とを直接比較すると、有意差がある（ｐ＝０．０２６）。
【０１０１】
式１００−（Ｖｃ*１００／Ｖｔ）を用いて腫瘍成長抑制（ＴＧＩ）を計算した。式中、Ｖｃは対照群における腫瘍の平均体積であり、Ｖｔは試験群における腫瘍の平均体積である。表２．２は、１００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を単独で用いて、または放射線と併用して治療された動物についての腫瘍成長抑制を示す。放射線を受けなかった対照と比較すると、１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のみで治療された動物は、９．１％の腫瘍成長抑制を有し、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のみで治療された動物は、３５．９％の腫瘍成長抑制を有した。放射線のみで治療された動物は、放射線を受けなかった対照と比較すると、６３．５％のＴＧＩを有し、一方、ＳＣＶ−０７プラス放射線で治療された動物は、７０．２％（１００μｇ／ｋｇ）、５０．３％（１ｍｇ／ｋｇ）、およびの７８．３％（１０ｍｇ／ｋｇ）ＴＧＩ値を有した。放射線プラス媒体を受けた群と比較すると、放射線プラスＳＣＶ−０７で治療された群は、１００μｇ／ｋｇで１８．３％、１０ｍｇ／ｋｇで４０．５％のＴＧＩを有した。
【０１０２】
【表１８】
【０１０３】
表２．２． 腫瘍成長抑制（ＴＧＩ）。ＴＧＩは、最新の腫瘍測定値から、式１００−（Ｖｃ*１００／Ｖｔ）を用いて計算された。式中、Ｖｃは対照群における腫瘍の平均体積であり、Ｖｔは試験群における腫瘍の平均体積である。**群２および群７の平均腫瘍体積は、媒体対照動物を上回った（それぞれ、９．８％および１５．８７％）。
【０１０４】
結論
生存および重量変化の観察に基づくと、ＳＣＶ−０７はこの研究では毒性の証拠を示さなかった。
【０１０５】
１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のみで治療された動物は、媒体対照動物と比較すると、腫瘍成長抑制（ＴＧＩ＝６８％）の著しい減少を示した（Ｐ＝０．０２６）。
【０１０６】
統計学的に有意ではないものの、１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のみで、または１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のみで治療された動物は、媒体のみを受けた動物に比べ、腫瘍成長の減少を示した。
【０１０７】
統計学的に有意ではないものの、１００μｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療され、放射線を受けた動物は、放射線を受けた動物に比べ、腫瘍成長の減少を示した。
【０１０８】
【表１９】
【０１０９】
【表２０】
【０１１０】
【表２１】
【０１１１】
【表２２】
【０１１２】
【表２３】
【０１１３】
実施例３
皮下ＬＬＣ腫瘍を有するマウスにおけるＳＣＶ−０７およびシスプラチンの併用治療の抗腫瘍効果研究
略語
ＢＷ 体重
ＣＯ2 二酸化炭素
ＣＤＤＰ シス−ジアミン ジクロロプラチナム（シスプラチン）
ｇ グラム
ｋｇ キログラム
Ｌ 長さ
ＬＬＣ ルイス肺ガン
ｍｇ ミリグラム
ｍＬ ミリリットル
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＰＩ パーセント抑制
ＳＤ 標準偏差
ＴＶ 腫瘍体積
ＴＷ 腫瘍重量
ＶＢＩ バイタル・ブリッジ社（中国）（Vital Bridge (China), Inc.）
Ｗ 幅
概要
この研究では、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに接種されたマウスルイス肺ガン（ＬＬＣ）細胞から成長した皮下ガンの成長に対するＳＣＶ−０７およびシスプラチン（ＣＤＤＰ）の抑制効果を評価した。全部で７０匹のマウスにマウスＬＬＣ細胞を皮下移植し、次にＳＣＶ−０７またはＣＤＤＰを単独で用いて、もしくは併用して、連続１４日間治療した。ＳＣＶ−０７を毎日、ｓｃ注射により投与し、一方、ＣＤＤＰを第１日目、第６日目、および第１２日目にｉｐ注射により投与した。群１：媒体、群２：ＣＤＤＰ ２ｍｇ／ｋｇ、群３：ＣＤＤＰ ６ｍｇ／ｋｇ、群４：ＳＣＶ−０７ １０ｍｇ／ｋｇ、群５：ＳＣＶ−０７ ２０ｍｇ／ｋｇ、群６：ＳＣＶ−０７ １０ｍｇ／ｋｇプラスＣＤＤＰ ２ｍｇ／ｋｇ、群７：ＳＣＶ−０７ ２０ｍｇ／ｋｇプラスＣＤＤＰ ２ｍｇ／ｋｇという、全部で７つの群が使用された。体重を３日ごとに記録し、腫瘍サイズを１日おきに測定し、腫瘍重量を研究終了時の第１６日目（解剖日）に測定した。
【０１１４】
研究期間全体を通して、死んだ動物はいなかった。体重の統計結果は、ＳＣＶ−０７単独治療群（群４および５）のいずれかと媒体対照群（群１）との有意差を示さず、動物の成長に対してＳＣＶ−０７が影響を及ぼさないことを表わしている。これに対し、第３日目以降、６ｍｇ／ｋｇのＣＤＤＰ治療を受けた群（群３）は、体重の統計学的に有意な減少を一貫して示した。２ｍｇ／ｋｇのＣＤＤＰ治療を受けた群である群２は、第１５日目のみ体重の統計学的に有意な減少を示し、一方、２ｍｇ／ｋｇのＣＤＤＰを２０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７と併用して受けた群７は、第３日目以降、群１と比較して、体重の統計学的に有意な減少を一貫して呈した。
【０１１５】
腫瘍測定データは、第６日目に、群２および群３の平均腫瘍体積が群１のものよりも統計学的に有意に小さいことを示した。第８日目、第１０日目、第１２日目、および第１４日目において、すべての群の平均腫瘍体積が群１よりも統計学的に有意に小さかった。第１６日目に、すべての治療群の平均腫瘍重量が群１よりも低くなった。腫瘍重量に基づいて計算された腫瘍抑制は、群２、群３、群４、群５、群６、および群７について、それぞれ、５８．９０％（ｐ＜０．０１）、７７．３５％（ｐ＜０．０１）、１６．８４％（ｐ＜０．０５）、３７．４５％（ｐ＜０．０１）、４０．８１％（ｐ＜０．０１）、および５６．１３％（ｐ＜０．０１）であった。
【０１１６】
要約すると、陽性対照薬物ＣＤＤＰが腫瘍成長を効果的に減少させたので、この研究で使用された腫瘍モデルは、有効であった。ＳＣＶ−０７（１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ）を用いた治療は、媒体対照群のものと比べてこれらの群で腫瘍体積がより小さく、腫瘍重量がより低かったことに反映されるように、腫瘍成長を抑制した。ＣＤＤＰ（２ｍｇ／ｋｇ）と併用したＳＣＶ−０７（１０または２０ｍｇ／ｋｇ）の治療計画は、ＳＣＶ−０７単独治療よりも腫瘍成長のより高い抑制をもたらすものの、ＣＤＤＰ単独の場合と比べると、抗腫瘍効果の増加はない（相加効果なし）。
【０１１７】
前書き
この研究は、マウスルイス肺ガン（ＬＬＣ）モデルにおいて単独で使用される、またはＣＤＤＰと併用されるＳＣＶ−０７の抗腫瘍効果を、肺ガンの治療に対するその治療可能性を探索する目的で評価するために設計された。ＣＤＤＰを、このガンモデルを検証する陽性対照薬物としても使用した。
【０１１８】
材料および方法
試験および対照物質
陰性対照物質（媒体）としてＰＢＳを使用し、陽性対照としてＣＤＤＰを使用した。ＣＤＤＰをＰＵＭＣ病院から購入した。この薬剤は、Qilu製薬会社（Qilu Pharmaceutical Co., Ltd.）により製造され、各バイアルは１０ｍｇのＣＤＤＰ粉末を含有している。使用前、投与量製剤表（表３．１）に示されたような適正な投与量レベルを達成するよう、ＰＢＳを１バイアルのＣＤＤＰに添加した。製剤を冷蔵し、光から保護し、すぐに使用した。試験物質（ＳＣＶ−０７）を、表１に示されたような適正な投与量レベルを達成するようＰＢＳに溶解させ、冷蔵し、光から保護し、１週間以内に使用した。
【０１１９】
【表２４】
【０１２０】
試験システムおよび動物の飼育管理
マウス肺ガン細胞（ＬＬＣ）
マウスルイス肺ガン細胞を、中国医学科学院（ＣＡＭＳ、北京、中華人民共和国）の細胞培養センターから入手した。このガン細胞を、実験に使用する前に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに適応させた。細胞適応の詳細については第４．３．１号を参照されたい。
【０１２１】
試験システム
中華人民共和国、北京、ＣＡＭＳの実験動物協会から、実験に未使用の健康なＣ５７ＢＬ／６マウスを、雄３５匹、雌３５匹受取った。研究開始時、これらの動物は、生後６週間で体重が１８〜２２グラムであった。
【０１２２】
動物の飼育管理
動物を、寝床材料として加圧滅菌した木片が入った加圧滅菌した靴箱型ケージに、群別に収容した。飼育室の温度を２２〜２５℃に保ち、相対湿度を４０〜６０％に保った。研究に関連する事象によって中断される場合を除き、１２時間ずつの明暗サイクルが保たれた。動物には、滅菌水および北京KeAoXieLiげっ歯類用餌（認定済）を自由に給餌した。動物をすべて、腫瘍接種前に３日間順応させた。
【０１２３】
実験手順
腫瘍細胞適応
１バイアルのＬＬＣ細胞を液体窒素ストックから取り出し、３７℃の水槽に配置した。バイアルの中身が解凍されるまで、緩やかな旋回を行なった。無菌組織培養手法を用いて、細胞をすぐに１０００ｒｐｍ、２０〜２５℃で５分間、ＴＤ５Ａ−ＷＳ遠心分離機にかけた。遠心分離後、細胞を０．１〜０．５ｍＬの生理食塩水（ＮＭ）に懸濁し、次に１０匹のマウスに皮下注射した（０．１ｍＬ／マウス、約１×１０6個の細胞）。１〜２週間後、腫瘍の直径が約１ｃｍになると、動物をＣＯ2過剰投与で安楽死させ、腫瘍を摘出した。この手順を別の２０匹に繰返して、適正な移植可能性を有する十分な数のＬＬＣ細胞を生成した。
【０１２４】
腫瘍細胞接種
腫瘍移植日、０．１ｍＬの１×１０6個の細胞を、各マウスの右腋窩領域に皮下注射した。腫瘍移植日を第０日目と定義した。
【０１２５】
研究設計および治療計画
第１日目に、動物を体重が適合する異なる群に無作為に割当て、表３．２に下方計画を用いて投与を開始した。簡潔には、ＳＣＶ−０７を、腫瘍細胞移植部位とは異なる部位に、１日１回、連続１４日間、皮下投与により投与し、一方、ＣＤＤＰを、第１日目、第６日目、および第１２日目に腹腔内投与した。
【０１２６】
抗腫瘍効果の評価
第１日目〜第１４日目に、死亡率および罹患率を一日２回チェックし、体重を３日ごとに記録し、腫瘍を測径器を用いて２日ごとに測定した。研究終了時（第１６日目）、動物をＣＯ2窒息により安楽死させ、腫瘍を摘出して重量を量った。
【０１２７】
腫瘍体積を、以下の式を用いて計算した。
腫瘍体積＝長さ×幅×幅／２
腫瘍体積抑制（ＰＩ）を、以下の式に従って計算した。
【０１２８】
【数５】
【０１２９】
式中、ＴＶは測定日の腫瘍体積であり、「媒体」はＰＢＳを受ける群を示し、「薬物で治療」はＳＣＶ−０７および／またはＣＤＤＰを受ける群を示す。
【０１３０】
単独で使用された、またはＣＤＤＰと併用されたＳＣＶ−０７の抗腫瘍効果も、腫瘍重量によって評価した。各マウスの腫瘍重量を安楽死の後で記録し、腫瘍重量のパーセント抑制を以下の式に従って計算した。
【０１３１】
【数６】
【０１３２】
平均偏差および標準偏差を、エクセルを用いて計算した。
【０１３３】
【表２５】
【０１３４】
統計的分析
スチューデントのｔ検定を用いて、腫瘍体積、腫瘍重量、および体重について、群内での比較を行なった。０．０５未満のＰ値は統計学的に有意であると考えた。
【０１３５】
結果および論議
死亡率
研究期間全体を通して、死んだ動物はいなかった。
【０１３６】
腫瘍サイズ
腫瘍サイズの生測定データを付録３．１〜３．１４に示す。計算された平均腫瘍体積、および媒体群に対する各治療群の統計試験結果を表３〜９に示す。第２日目では、どの群でも腫瘍は測定できなかった。第４日目に、群４を除くすべての群の平均腫瘍体積が、群１（媒体対照）のものよりも統計学的に有意に小さくなった。第６日目に、群２および群３のみが、より小さい平均腫瘍体積を示した。第８日目、第１０日目、第１２日目、および第１４日目に、すべての群の平均腫瘍体積が、群１よりも統計学的に有意に小さくなった。
【０１３７】
腫瘍重量
第１６日目に測定した腫瘍重量の生データを付録３．１５に示した。腫瘍重量に基づいた計算されたパーセント抑制（ＰＩ）値、および各治療群と媒体群との統計比較結果を、表３．１０に示す。表３．１０に示すように、すべての治療群の平均腫瘍重量は、媒体群のものよりも低かった。群２、群３、群４、群５，群６、および群７のＰＩ値は、それぞれ、５８．９０％（ｐ＜０．０１）、７７．３５％（ｐ＜０．０１）、１６．８４％（ｐ＜０．０５）、３７．４５％（ｐ＜０．０１）、４０．８１％（ｐ＜０．０１）、および５６．１３％（ｐ＜０．０１）であった。併用治療群（すなわち群６および７）は、ＳＣＶ−０７単独治療を受けた対応する群（すなわち群４および５）よりも高いＰＩ値を有するものの、これらのＰＩ値は、ＣＤＤＰ単独治療を受けた群２のものほど高くはなかった。併用治療群のいずれかとＣＤＤＰ単独治療群（群２）とでは、ＰＩにおいて統計学的に有意な差はなく、ＣＤＤＰをＳＣＶ−０７と併用した場合、相加効果がないことを表わしている。
【０１３８】
体重
体重測定の生データを付録３．１６〜３．２１に列挙した。媒体群に対する各治療群の統計比較の結果を表３．１１〜３．１６に示した。
【０１３９】
表３．１１〜３．１６に示すように、第０日目では、各治療群と媒体対照群との間に統計学的に有意な差はなかった。第３日目に、群３（ＣＤＤＰ ６ｍｇ／ｋｇ）および群７（ＣＤＤＰ ２ｍｇ／ｋｇ＋ＳＣＶ−０７ ２０ｍｇ／ｋｇ）は、媒体群に対し、それぞれ９．３３％（Ｐ＜０．０１）および８．３１％（Ｐ＜０．０１）の体重減少を呈した。他の群については、媒体群と比較して体重の有意差はなかった。第６日目では、群３および群７の体重は、媒体群よりも１０．４５％（ｐ＜０．０１）および６．５８％（ｐ＜０．０１）低かった。第９日目では、群３、群６、および群７の体重は、媒体群よりもそれぞれ１４．５１％（ｐ＜０．０１）、８．７０％（ｐ＜０．０５）、および１１．４１％（ｐ＜０．０１）低かった。第１２日目では、群３および群７の体重は、媒体群よりもそれぞれ１３．６２％（Ｐ＜０．０１）および６．６５％（Ｐ＜０．０５）低かった。第１５日目では、群２、群３、群６、および群７の体重は、媒体群よりもそれぞれ１２．５１％（ｐ＜０．０１）、２４．３７％（Ｐ＜０．０１）、１０．４２％（Ｐ＜０．０５）、および１４．５６％（Ｐ＜０．０１）低かった。研究期間全体を通して、ＳＣＶ−０７単独治療を受けた群４および群５の体重には統計学的に有意な差はなく、ＳＣＶ−０７は単独で使用された場合、動物の体重増加に有意な影響を及ぼさなかったことを表わしている。これに対し、ＣＤＤＰ治療は体重の減少に関連し、この所見は特に、高投与量（６ｍｇ／ｋｇ）のＣＤＤＰを受けた群である群３で顕著であった。ＣＤＤＰとＳＣＶ−０７との併用は、重量減少を緩和しなかったが、実際には、ＣＤＤＰに関連する重量減少をより顕著にするであろう。ＣＤＤＰのみを受けた群２よりも、高投与量のＳＣＶ−０７と併用してＣＤＤＰを受けた群である群７において、より多い重量減少が見られた。
【０１４０】
結論および論議
結論として、陽性対照薬物ＣＤＤＰによって腫瘍成長が抑制されたので、この研究で使用された腫瘍モデルは有効であった。試験物質であるＳＣＶ−０７を毎日１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ投与することは、腫瘍成長に対して効果的であった。第８日目以降、ＳＣＶ−０７で治療されたすべての群の動物の平均腫瘍体積は、媒体対照群のものと比べて著しく減少した。第１６日目に測定された腫瘍重量も、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のみを受けた群、および併用治療を受けた群では著しく減少した。１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を単独で使用した場合に得られる１６．８４％および３７．４５％の抑制、ならびに２ｍｇ／ｋｇまたは６ｍｇ／ｋｇのＣＤＤＰを単独で使用した場合に得られる５８．９０％および７７．３５％の抑制に比べて、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇののＳＣＶ−０７と２ｍｇ／ｋｇのＣＤＤＰとの併用は、４０．８１％および５６．１３％の腫瘍成長の抑制を生み出した。これらの結果は、ＳＣＶ−０７とＣＤＤＰとの併用が腫瘍成長抑制に向けて相加効果を生み出さないことを示唆した。
【０１４１】
ＣＤＤＰ治療群における平均体重は著しく減少し、毒性効果を表わしている。単独で使用された場合、ＳＣＶ−０７は、ＳＣＶ−０７で治療されたすべての群において体重の統計学的に有意な減少をもたらさず、動物の体重にＳＣＶ−０７影響を及ぼさないことを表わしている。しかしながら、ＳＣＶ−０７がＣＤＤＰと併用された場合、それはＣＤＤＰに関連する重量減少を悪化させるであろう。なぜなら、研究期間全体を通して、高投与量のＳＣＶ−０７と併用してＣＤＤＰを受けた群である群７において、より多い重量減少が見られたためである。
【０１４２】
【表２６】
【０１４３】
【表２７】
【０１４４】
【表２８】
【０１４５】
【表２９】
【０１４６】
【表３０】
【０１４７】
【表３１】
【０１４８】
【表３２】
【０１４９】
【表３３】
【０１５０】
【表３４】
【０１５１】
【表３５】
【０１５２】
【表３６】
【０１５３】
【表３７】
【０１５４】
【表３８】
【０１５５】
【表３９】
【０１５６】
【表４０】
【０１５７】
【表４１】
【０１５８】
【表４２】
【０１５９】
【表４３】
【０１６０】
【表４４】
【０１６１】
実施例４
Ｂ１６、ＬＬＣ、およびＲｅｎＣａ細胞株の増殖に対するＳＣＶ−０７の体外効果
略語
５−Ｆｕ ５−フルオロウラシル
ＣＶ 変動係数
ＤＭＥＭ ダルベッコ変法イーグル培地
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＴＩＣ ５−（３，３−ジメチル−１−トリアゼノ）イミダゾール−４−カルボキサミド
ＦＢＳ ウシ胎児血清
ＬＬＣ ルイス肺ガン
ＭＴＴ メチルチアゾリルジフェニル−テトラゾリウムブロミド
ＮＡ 適用不可
ＯＤ 光学密度
ＰＰＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＲＰＭＩ ロズウェルパーク記念研究所（Roswell Park Memorial Institute）
ＳＤ 標準偏差
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＯＰ 標準作業手順
ＶＢＩ バイタル・ブリッジ社（中国）
Ｖｓ 対
概要
この研究は、Ｂ１６、ＬＬＣ、およびＲｅｎＣａ細胞に対するＳＣＶ−０７の体外細胞毒性効果を評価するために行なわれた。
【０１６２】
ＳＣＶ−０７または陽性対照薬物（すなわちＤＴＩＣ、５−Ｆｕ、およびシスプラチン）の存在下で、Ｂ１６、ＬＬＣ、またはＲｅｎＣａ細胞を、ブランク対照を含む１２種の異なる濃度で、９６ウェルのプレートで培養した。ＳＣＶ−０７の濃度は、以前の体内研究の有効投与量から近似された血漿濃度に基づいて選択した。５−Ｆｕおよびシスプラチンの濃度は、文献で報告されたそれらのそれぞれのＩＣ50値によって選択した。ＳＣＶ−０７および陽性対照薬物の培養時間は、２４〜７２時間までさまざまであった。細胞増殖に対する薬物の抑制効果は、ＭＴＴ法によって判断した。
【０１６３】
５−Ｆｕおよびシスプラチンの治療は、対応する細胞株において著しい細胞毒性効果をもたらした。Ｂ１６細胞の増殖を抑制する５−ＦｕについてのＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて０．２６、０．３８、および０．２６μｇ／ｍＬであると概算された。ＲｅｎＣａ細胞では、５−ＦｕについてのＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて０．０３、０．０４、および０．０４μｇ／ｍＬであると概算された。ＬＬＣ細胞の増殖を抑制するシスプラチンについてのＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて３．２６、３．０７、および３．１０μｇ／ｍＬであると概算された。ＳＣＶ−０７は、すべての試験濃度（０．０５〜１００μｇ／ｍＬ）で、培養されたＢ１６、ＬＬＣ、およびＲｅｎＣａ細胞において培養増殖を抑制しなかった。ＳＣＶ−０７についてのＩＣ50値は、その濃度−抑制曲線の不適合度のため、得られなかった。
【０１６４】
結論として、この研究は、ＳＣＶ−０７が、培養されたＢ１６、ＬＬＣ、およびＲｅｎＣａ腫瘍細胞に対する体外細胞毒性効果を有してないことを実証した。
【０１６５】
前書き
この発明の目的は、Ｂ１６、ＬＬＣ、およびＲｅｎＣａ細胞に対するＳＣＶ−０７の体外細胞毒性効果を評価することであった。
【０１６６】
ＳＣＶ−０７は免疫調節剤である。マウスの皮下に移植された腫瘍細胞（Ｂ１６、ＬＬＣ、またはＲｅｎＣａ）の成長を抑制することが、以前の体内研究において既に実証されている(1-3)。この研究では、これらの腫瘍細胞株に対するＳＣＶ−０７の体外細胞毒性効果を評価した。
【０１６７】
ＳＣＶ−０７または陽性対照薬物（すなわちＤＴＩＣ、５−Ｆｕ、もしくはシスプラチン）の存在下で、Ｂ１６、ＬＬＣ、およびＲｅｎＣａ細胞を、９６ウェルのプレートで培養した。異なる細胞株の薬物の培養時間は、２４〜７２時間までさまざまであった。細胞増殖の抑制の評価には、ＭＴＴアッセイを使用した。
【０１６８】
材料および方法
材料
ＳＣＶ−０７
ＳＣＶ−０７（ロット番号ＲＲ００２１０１）がスポンサーによって提供された。８．４ｍＬの滅菌ダルベッコのＰＢＳ（インビトロゲン（Invitrogen）、カタログ番号１４１９０−１４４）に４．２ｍｇのＳＣＶ−０７を溶解することによって、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＣＶ−０７の貯蔵液を調製した。次に貯蔵液を滅菌ろ過し、２〜８℃で貯蔵し、錫箔を用いて光から保護した。使用前、貯蔵液を、培地を用いてさまざまな濃度にさらに希釈した。
【０１６９】
ＤＴＩＣ
ＤＴＩＣをシグマ社（Sigma）から購入した（カタログ番号Ｄ２３９０、ロット番号０２６Ｋ１３６３）。５００μＬの０．１Ｎ ＨＣＬに８．８ｍｇのＤＴＩＣを溶解することによって、１０ｍｇ／ｍＬの貯蔵液を調製し、次に３８０μＬのミリＱ水を添加した。貯蔵液を一旦調製すると、滅菌ろ過し、２〜８℃で貯蔵し、錫箔を用いて光から保護した。使用前、貯蔵液を、培地を用いてさまざまな濃度にさらに希釈した。
【０１７０】
５−Ｆｕ
５−Ｆｕをシグマ社から購入した（カタログ番号Ｆ６６２７、ロット番号１２５Ｋ１４９９）。９．６ｍＬの滅菌ダルベッコのＰＢＳ（インビトロゲン、カタログ番号１４１９０−１４４）に４．８ｍｇの５−Ｆｕを溶解することによって、０．５ｍｇ／ｍＬの貯蔵液を調製した。貯蔵液を一旦調製すると、滅菌ろ過し、２〜８℃で貯蔵し、錫箔を用いて光から保護した。使用前、貯蔵液を、培地を用いてさまざまな濃度にさらに希釈した。
【０１７１】
シスプラチン
シスプラチンをQilu製薬会社から購入した。１０ｍＬの滅菌ダルベッコのＰＢＳ（インビトロゲン、カタログ番号１４１９０−１４４）に１０ｍｇのシスプラチンを溶解することによって、１ｍｇ／ｍＬの貯蔵液を調製した。貯蔵液を一旦調製すると、滅菌ろ過し、２〜８℃で貯蔵した。使用前、貯蔵液を、培地を用いてさまざまな濃度にさらに希釈した。
【０１７２】
他の材料
ＭＴＴをシグマ社から購入した（カタログ番号Ｍ２１２８）。ＦＢＳ，ペニシリン−ストレプトマイシンＤＭＥＭ、およびＲＰＭＩ−１６４０媒質を、インビトロゲン社から購入した。ファルコン（Falcon）（登録商標）９６ウェル平底プレート（ＢＤ、カタログ番号３５３０７２）は、フィッシャー・サイエンティフィック（Fisher Scientific）社から購入した。
試験システム
Ｂ１６細胞株
Ｂ１６メラトーマ細胞株を、中国医学科学院、上海細胞バンク（Shanghai Cell Bank）から入手した。これらの細胞を、１０％のＦＢＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ−１６４０媒質において培養した。
【０１７３】
ＬＬＣ細胞株
ＬＬＣ細胞株を、中国医学科学院、上海細胞バンクから入手した。これらの細胞を、１０％のＦＢＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭにおいて培養した。
【０１７４】
ＲｅｎＣａ細胞株
ＲｅｎＣａ細胞株を、中国軍事医学科学院（Chinese Military Academy of Sciences）から入手した。これらの細胞を、１０％のＦＢＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ−１６４０媒質において培養した。
【０１７５】
ＭＴＴアッセイ
ＶＢＩ ＳＯＰ ６５．０２６に従って、ＭＴＴアッセイを行なった。簡潔に、上述の対応する培地を用いて、Ｂ１６、ＬＬＣ、またはＲｅｎＣａ細胞の懸濁液を調製した。ファルコン（登録商標）９６ウェル平底プレートの各ウェルに、１００μＬの細胞懸濁液を播種した。播種密度は、１００００細胞／ウェル（Ｂ１６およびＬＬＣ細胞株）、または７０００細胞／ウェル（ＲｅｎＣａ細胞株）であった。プレートに２５μＬの薬物を添加し、次に３７℃で５％のＣＯ2を用いて、予め規定された時間、プレートを培養することにより、薬物処理を行なった（薬物処理の詳細については、表４．１を参照されたい）。薬物を、ブランク対照を含む１２種の濃度で処理し、各濃度を４通りに試験した。ＳＣＶ−０７の濃度は、以前の体内研究の有効投与量から近似された血漿濃度に基づいて選択した。５−Ｆｕおよびシスプラチンの濃度は、対応する細胞株について文献で報告されたそれらのそれぞれのＩＣ50値によって選択した。薬物処理後、ＭＴＴを１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で各ウェルに添加し、細胞培養を４時間続けた。ＭＴＴ培養の終了時、ＳＤＳおよびＤＭＦからなる抽出緩衝液をプレートに添加して、生存細胞によってＭＴＴから変換されたホルマザンを可溶化した。次に、各ウェルのＯＤを、テカンインフィニット（Tecan Infinite）Ｍ２００プレートリーダを用いて５７０ｎｍで測定した。
【０１７６】
【表４５】
【０１７７】
データ分析
平均およびＳＤの計算
平均およびＳＤの計算のために、生のＯＤデータをマイクロソフトエクセルにインポートした。
【０１７８】
ＩＣ50の計算
細胞増殖を抑制するためのＩＣ50を、プリズム５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社（GraphPad Software, Inc.））を用いて計算した。細胞の死滅をもたらした薬物の濃度を、ＩＣ50の決定から除外した。以下の式を用いることにより、ＩＣ50を概算した。
【０１７９】
【数７】
【０１８０】
ここで、Ｘは薬物の濃度を表わし、Ｙは対応するＯＤを表わす。Ｂｏｔｔｏｍは（細胞成長の最大抑制に対応する）理論的に最も低いＯＤを表わし、一方、Ｔｏｐは理論的に最も高いＯＤを表わす。ＩＣ50は、５０％の反応を生み出す薬剤の濃度を表わす。Ｘ値およびＹ値をすべて入力すると、Ｂｏｔｔｏｍ、Ｔｏｐ、およびＩＣ50の値が、そのプログラムを介し、内蔵の抑制モデル（すなわちＬｏｇ［抑制因子］対反応モデル）に適合させることによって自動的に求められた。
【０１８１】
結果
Ｂ１６細胞に対するＳＣＶ−０７の効果
Ｂ１６細胞の増殖に対するＳＣＶ−０７および陽性対照薬物の効果を測定した。計算されたＩＣ50値を表４．２に列挙する。生データならびに計算された平均およびＳＤを付録４．１〜４．４に示す。ＳＣＶ−０７の濃度−抑制曲線は本質的に平坦であり、Ｂ１６細胞に対するＳＣＶ−０７の細胞毒性効果（すなわち細胞増殖の抑制）がないことを表わしている。ＤＴＩＣは当初、陽性対照として使用された。しかしながら、細胞毒性効果はより高い濃度（すなわち２５０および５００μｇ／ｍＬ）でのみ顕著であり、ＩＣ50は、曲線が収束していないため、定められなかった。これはおそらく、肝細胞に依存した活性化がＤＴＩＣにないことによるものである。５−Ｆｕについては、０．２〜２０μｇ／ｍＬの濃度範囲で、細胞成長の抑制が観察された。５０および１００μｇ／ｍＬで細胞死滅が引起された。それにより、これら２つの濃度はＩＣ50分析から除外された。５−Ｆｕについて、ＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて０．２６、０．３８、および０．２６μｇ／ｍＬであると判断された。これに対し、ＳＣＶ−０７については、ＩＣ50値は、その濃度−抑制曲線の不適合度のため、得られなかった。
【０１８２】
【表４６】
【０１８３】
ＬＬＣ細胞に対するＳＣＶ−０７の効果
ＬＬＣ細胞の増殖に対するＳＣＶ−０７およびシスプラチン（陽性対照薬物）の効果を測定した。計算されたＩＣ50値を表４．３に列挙する。生データならびに計算された平均およびＳＤを付録４．５〜４．７に示す。ＳＣＶ−０７の濃度−抑制曲線は本質的に平坦であり、ＬＬＣ細胞における細胞毒性がないことを表わしている。これに対し、シスプラチンについては、１．０μｇ／ｍＬ以上の濃度で細胞毒性効果が観察された。シスプラチンについてのＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて３．２６、３．０７、および３．１０μｇ／ｍＬであった。一方、ＳＣＶ−０７については、ＩＣ50値は、その濃度−抑制曲線の不適合度のため、得られなかった。
【０１８４】
【表４７】
【０１８５】
ＲｅｎＣａ細胞に対するＳＣＶ−０７の効果
ＲｅｎＣａ細胞の増殖に対するＳＣＶ−０７および５−Ｆｕ（陽性対照薬物）の効果を測定した。計算されたＩＣ50値を表４．４に列挙する。生データならびに計算された平均およびＳＤを付録４．８〜４．１０に示す。ＳＣＶ−０７の濃度−抑制曲線は本質的に平坦であり、ＲｅｎＣａ細胞におけるＳＣＶ−０７の細胞毒性がないことを表わしている。一方、５−Ｆｕについては、０．０５〜１０μｇ／ｍＬの濃度範囲で細胞毒性効果が観察された。２０．５０、および１００μｇ／ｍＬで細胞死滅が引起された。それにより、これら３つの濃度はＩＣ50分析から除外された。５−ＦｕについてのＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて０．０３、０．０４、および０．０４μｇ／ｍＬであった。これに対し、ＳＣＶ−０７については、ＩＣ50値は、その濃度−抑制曲線の不適合度のため、得られなかった。
【０１８６】
【表４８】
【０１８７】
結果および論議
５−Ｆｕおよびシスプラチンの治療は、対応する細胞株において細胞増殖の著しい抑制をもたらし、試験化合物の潜在的な細胞毒性を判断するのにこのアッセイを使用する正当性を認めている。Ｂ１６細胞の増殖を抑制する５−ＦｕについてのＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて０．２６、０．３８、および０．２６μｇ／ｍＬであると概算された。ＲｅｎＣａ細胞では、５−ＦｕについてのＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて０．０３、０．０４、および０．０４μｇ／ｍＬであると概算された。ＬＬＣ細胞の増殖を抑制するシスプラチンについてのＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて３．２６、３．０７、および３．１０μｇ／ｍＬであると概算された。ＤＴＩＣについては、より高い濃度（すなわち２５０および５００μｇ／ｍＬ）で細胞毒性効果は顕著であった。より低い濃度でははっきり認められるほどの細胞毒性がＤＴＩＣにはないことは、アッセイには含まれていなかった肝細胞によって、ＤＴＩＣのより有毒な代謝物への代謝的変換が要求されていることと一致する。
【０１８８】
陽性対照薬物による顕著な細胞毒性とはまったく対照的に、ＳＣＶ−０７は、培養されたＢ１６、ＬＬＣ、またはＲｅｎＣａ細胞において培養増殖の抑制をもたらさなかった。ＳＣＶ−０７についてのＩＣ50値は、その濃度−抑制曲線の不適合度のため、得られなかった。
【０１８９】
ＳＣＶ−０７に細胞毒性効果がないことは、免疫系の活性化を通して効果を発揮する典型的な免疫調節剤についての作用のメカニズムと一致する。しかしながら、ＳＣＶ−０７から由来する代謝物の細胞毒性効果はまだ突き止められていないことに留意すべきである。ＤＴＩＣと同様に、ＳＣＶ−０７の肝細胞によって中和される代謝活性化は、細胞毒性効果の必要条件かもしれない。ＳＣＶ−０７代謝物を用いた、または肝細胞および腫瘍細胞からなる細胞培養系を用いた研究は、腫瘍治療に対するＳＣＶ−０７の作用のメカニズムにおける細胞毒性の役割をさらに定義するのに役立つかもしれない。
【０１９０】
結論として、この研究は、現在の実験条件下では、ＳＣＶ−０７が、培養されたＢ１６、ＬＬＣ、およびＲｅｎＣａ腫瘍細胞に対して体外細胞毒性効果を有していないことを実証した。
【０１９１】
【表４９】
【０１９２】
【表５０】
【０１９３】
【表５１】
【０１９４】
【表５２】
【０１９５】
【表５３】
【０１９６】
【表５４】
【０１９７】
【表５５】
【０１９８】
【表５６】
【０１９９】
【表５７】
【０２００】
【表５８】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本願は、２００７年８月２３日に出願された米国仮出願連続番号第６０／９５７，５３０号の利益を主張する。当該仮出願の開示はその全体がここに引用により援用される。
【０００２】
発明の分野
この発明は、肺ガンの治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景技術の説明
肺ガンは肺組織の悪性転換および拡大であり、世界中で年間１３０万人の死亡に関与している。それは、男性ではガンに関する死亡の最大の原因であり、女性では２番目に多い原因である。
【０００４】
肺ガンのリスクに対して最大の影響を有する要因は、吸入された発ガン物質、特に煙草の煙に長期間さらされることであることを、現在の研究は示唆している。他の場合の肺ガンの発生（１０分の１未満）は、遺伝的要因の組合せによるものと思われる。ラドンガスおよび空気汚染も肺ガンの進行に寄与する場合がある。
【０００５】
治療および予後は、ガンの組織型、段階（広がり具合）、および患者の一般状態に依存する。現在の治療は外科手術、化学療法、および放射線治療を含む。全体的に、５年生存率は約１４％である。
【０００６】
肺ガンには、顕微鏡で組織病理学者が見る悪性細胞の大きさおよび外観によって分類される２つの主な種類がある。すなわち、非小細胞肺ガン（８０％）および小細胞（ほぼ２０％）肺ガンである。この分類は、単純な組織学的基準に基づいているものの、この病気の臨床管理および予後にとって非常に重要な意味合いを有する。
【０００７】
非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）は、それらの予後および管理がほぼ同じであるため、一緒にグループ化されている。肺扁平上皮ガン、腺ガン、および大細胞肺ガンという３つの主なサブタイプがある。
【０００８】
肺ガンの２９％を占める扁平上皮ガンもより大きい気管支で始まるが、よりゆっくりと成長する。これらの腫瘍の大きさは診断によって異なる。
【０００９】
腺ガンは、ＮＳＣＬＣのうち最も多いサブタイプであり、肺ガンの３２％を占める。それは、肺のガス交換表面近傍で始まる形態である。腺ガンの大抵の場合は喫煙に関連している。しかしながら、喫煙したことがない人々（喫煙未経験者）の中で、腺ガンは肺ガンの最も多い形態である。腺ガンのサブタイプである細気管支肺胞上皮ガンは、女性の喫煙未経験者により多く見られ、治療に対して異なる反応を有する場合がある。
【００１０】
大細胞ガンは、肺ガンの９％を占める、肺の表面近傍で成長する、成長が急な形態である。
【００１１】
小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ、「燕麦細胞ガン」とも呼ばれる）は、肺ガンのあまり一般的でない形態である。それはより大きい呼吸管で始まる傾向があり、急速にかなり大きく成長する。最もよく関与しているガン遺伝子はＬ−ｍｙｃである。「燕麦」細胞は密な神経分泌顆粒を含み、それらはこれに内分泌腫瘍随伴症候群関連を与える。それは当初、化学療法により敏感だが、最終的には予後が悪く、発現時には転移性であることが多い。この種類の肺ガンは、喫煙に強く関連している。
【００１２】
他の種類の肺ガンは、カルチノイド、腺様嚢胞ガン（円柱腫）、および粘膜上皮ガンを含む。
【００１３】
転移ガン
肺は、身体の他の部分におけるガンからの転移がよくある場所である。副腎、肝臓、脳、および骨は、原発性肺ガン自体からの転移が最もよくある部位である。
【００１４】
当該技術分野において、肺ガンを治療し、予防し、抑制し、または減少させるための治療の方法に対する要望が依然としてある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
この発明によれば、被験者における、肺ガン、その転移、または肺における肺外部のガンからの転移を治療し、抑制し、減少させ、または少なくとも部分的に予防するための、もしくは、肺ガン細胞の成長、その転移、または肺における肺外部のガン細胞からのガン細胞の転移を治療し、抑制し、減少させ、または少なくとも部分的に予防するための治療の方法は、治療に有効な量の式Ａの免疫調節剤化合物を被験者に投与するステップを含み、
【００１６】
【数１】
【００１７】
式中、ｎは１または２であり、Ｒは水素、アシル、アルキル、またはペプチド断片であり、Ｘは芳香族または複素環アミノ酸もしくはその誘導体であり、被験者における、前記肺ガン、その転移、または肺における肺外部のガンからの転移を治療し、抑制し、減少させ、または少なくとも部分的に予防するようにし、もしくは、被験者における、前記肺ガン細胞の成長、その転移、または肺における肺外部のガン細胞からのガン細胞の転移を治療し、抑制し、減少させ、または少なくとも部分的に予防するようにする。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】一実施の形態の一研究における異なる投与量での腫瘍成長をグラフで示す図である。
【図２】一実施の形態の研究における異なる投与量での腫瘍重量をグラフで示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
好ましい実施の形態の説明
一実施の形態によれば、この発明は、哺乳類の被験者、好ましくは人間の患者に免疫調節剤化合物を投与することによって、肺ガンを治療し、少なくとも部分的に予防し、抑制し、または減少させるための治療の方法に関する。
【００２０】
いくつかの実施の形態では、病気は、肺ガン、その転移、または肺における肺外部のガンからの転移である。この発明は、被験者における、肺ガン細胞の成長、その転移、または肺における肺外部のガン細胞からのガン細胞の転移を治療し、少なくとも部分的に予防し、抑制し、または減少させるために利用可能である。いくつかの実施の形態では、この発明の化合物での治療の前、最中、または後に、原発性肺ガン腫瘍、またはその主な部分が、外科手術により除去される。
【００２１】
この発明に従った免疫調節剤化合物は、式Ａの免疫調節剤を含む。
【００２２】
【数２】
【００２３】
式Ａにおいて、ｎは１または２であり、Ｒは水素、アシル、アルキル、またはペプチド断片であり、Ｘは芳香族または複素環アミノ酸もしくはその誘導体である。好ましくは、ＸはＬ−トリプトファンまたはＤ−トリプトファンであり、最も好ましくはＬ−トリプトファンである。
【００２４】
「Ｘ」についての芳香族または複素環アミノ酸の適切な誘導体は、アミド、モノ−またはジ−（Ｃ1−Ｃ6）アルキル置換アミド、アリルアミド、および（Ｃ1−Ｃ6）アルキルまたはアリルエステルである。「Ｒ」についての適切なアシルまたはアルキル部分は、炭素が１〜約６個の分岐または非分岐アルキル基、炭素原子が２〜約１０個のアシル基、ならびに、カルボベンジルオキシおよびｔ−ブチルオキシカルボニルなどの保護基である。好ましくは、式Ａに示すＣＨ基の炭素は、ｎが２の場合、Ｘの立体構造とは異なる立体構造を有する。
【００２５】
好ましい実施の形態は、γ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｎin−ホルミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−メチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−トリプトファン、γ−Ｌ−グルタミル−Ｄ−トリプトファン、β−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファン、およびβ−Ｄ−アスパルチル−Ｌ−トリプトファンなどの化合物を利用している。特に好ましい実施の形態は、ＳＣＶ−０７とも呼ばれるγ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンを利用している。これらの化合物、ならびに、これらの化合物、これらの化合物の医薬的に受容可能な塩、およびそれらの医薬製剤を調製するための方法は、ここに引用により援用される米国特許第５，９１６，８７８号に開示されている。
【００２６】
ＳＣＶ−０７、すなわちγ−Ｄ−グルタミル−Ｌ−トリプトファンは、ロシアの科学者により発見され、いくつかの徴候における有効性について米国でサイクローン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド（SciClone Pharmaceuticals, Inc.）により調査されているγ−グルタミルまたはβ−アスパルチル部分を有する免疫調節薬物の部類の１つである。ＳＣＶ−０７は、多くの体内および体外免疫調節活性を有する。ＳＣＶ−０７は、Ｃｏｎ−Ａ誘導胸腺細胞およびリンパ球の増殖を増加させ、Ｃｏｎ−Ａ誘導インターロイキン−２（ＩＬ−２）産生、および脾臓リンパ球によるＩＬ−２受容体発現を増加させ、骨髄細胞におけるＴｈｙ−１．２の発現を刺激する。体内で、ＳＣＶ−０７は、５−ＦＵ−免疫抑制動物に対し、およびヒツジ赤血球を用いた免疫付与のモデルにおいて、強力な免疫調節効果を有する。
【００２７】
式Ａの化合物は、任意の効果的な投与量、たとえば約０．００１〜１０００ｍｇ、好ましくは約０．１〜１００ｍｇの範囲、最も好ましくは約１０ｍｇの投与量で投与されてもよい。投与量は１週間に１回以上、たとえば毎日投与されてもよく、１日に１回以上投与されてもよい。投与は、経口、経鼻、経皮、舌下、注射、周期的注入、持続注入などを含む好適な方法によって行なわれ得る。投与量は筋肉注射によって投与されてもよいが、他の形態の注射および注入が利用されてもよく、経口または経鼻吸入もしくは経口摂取といった他の形態の投与が採用されてもよい。エアゾール、溶液、懸濁液、分散液、錠剤、カプセル、シロップなどが利用されてもよい。
【００２８】
投与量はまた、ミリグラム／キログラム単位で測定されてもよく、約０．００００１〜１０００ｍｇ／ｋｇの範囲、より好ましくは約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内、さらにより好ましくは約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、およびさらにより好ましくは約１〜２０ｍｇ／ｋｇであってもよい。
【００２９】
ＳＣＶ−０７と実質的に類似した生物活性を有する、置換、削除、伸張、代替、または他の態様で改質された部分を有する生物活性類似物、たとえば、ＳＣＶ−０７と実質的に同じ活性で実質的に同様に機能するような、ＳＣＶ−０７との十分な相同性を有するＳＣＶ−０７由来ペプチドが含まれる。
【００３０】
一実施の形態によれば、治療または予防期間中、被験者の循環系において有効量の式Ａの化合物を実質的に連続して保つように、式Ａの化合物が被験者に投与されてもよい。この発明によればはるかにより長い治療期間が考えられるが、この発明の実施の形態は、少なくとも約６時間、１０時間、１２時間、またはそれ以上の治療期間中、患者の循環系において有効量の式Ａの化合物を実質的に連続して保つことを含む。他の実施の形態では、治療期間は、少なくとも約１日、さらには数日、たとえば１週間、またはそれ以上である。しかしながら、被験者の循環系において有効量の式Ａの化合物が実質的に連続して保たれる、上に定義されたような治療は、同様のまたは異なる長さの非治療期間によって隔てられ得ることが考えられる。
【００３１】
一実施の形態によれば、式Ａの化合物は、被験者の循環系において有効量の式Ａの化合物を実質的に連続して保つように、治療期間中、たとえば静脈内注入によって被験者へと連続して注入される。注入は、ミニポンプなどのような好適な手段によって行なわれてもよい。また、これに代えて、被験者の循環系において有効量の式Ａの化合物を実質的に連続して保つように、式Ａの化合物の注射計画を維持することが可能である。好適な注射計画は、治療期間中、被験者の循環系において有効量の免疫調節剤化合物ペプチドを実質的に連続して保つよう、１時間、２時間、４時間、６時間ごとなどに注射することを含んでいてもよい。
【００３２】
式Ａの化合物の連続注入中、投与が実質的により長い期間にわたることが考えられるが、一実施の形態によれば、式Ａの化合物の連続注入は、少なくとも約１時間の治療期間にわたる。より好ましくは、連続注入は、より長い期間、たとえば少なくとも約６時間、８時間、１０時間、１２時間、またはそれ以上の期間、行なわれる。他の実施の形態では、連続注入は、少なくとも約１日、さらには数日間、たとえば１週間またはそれ以上の期間にわたる。
【００３３】
いくつかの実施例では、式Ａの化合物は、注射用の水、生理食塩水といった医薬的に受容可能な液状担体内に、約０．００１〜１０００μｇ／ｍｌ、より好ましくは約０．１〜１００μｇ／ｍｌの範囲内の濃度で存在する。
【００３４】
有効量の式Ａの化合物は、慣例的な用量漸増実験によって決定され得る。
式Ａの化合物はまた、他の薬剤を用いて投与され得る。たとえば、ガンの治療では、そのような薬剤は、化学療法薬剤および／または放射線を含む。
【００３５】
放射線は、好適な方法により、当該技術分野において投与される好適な投与量および投与量計画で投与されてもよい。たとえば、放射線は約１Ｇｙ／分の線量率で投与可能であり、放射線は、たとえば、放射線を投与しない日を挟んだ別々の投与日に、たとえば約４Ｇｙ／１回分の投与を、１日に２回投与可能である。
【００３６】
治療計画において式Ａの化合物とともに投与され得る化学療法薬剤は、シスプラチン、５−フルオロウラシル（５−Ｆｕ）、ＤＴＩＣなどを一例として含む好適な化学療法薬剤を含む。そのような化学療法薬剤は、ここの実施例で示すものを含む、好適な投与量および／または投与量計画で投与されてもよい。
【実施例】
【００３７】
実施例１
略語
ＣＴＸ シクロホフォスファミド
Ｆ 女性
ｇ グラム
ＩＲ 抑制率
Ｉｐ 腹腔内
Ｋｇ キログラム
Ｌ 長さ
Ｍ 男性
ｍＬ ミリリットル
ｓｃ 皮下
ｓｄ 標準偏差
Ｗ 幅
概要
この研究では、ＳＣＶ−０７が、Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおけるマウス肺腫瘍の成長に対するその抑制効果について試験した。全部で７０匹のマウスにマウスルイス肺ガン（ＬＬＣ）細胞を皮下移植し、次に、ＳＣＶ−０７またはシクロフォスファミド（ＣＴＸ）を単独で用いて、もしくは併用して、連続１４日間治療した。ＳＣＶ−０７を毎日、ｓｃ注射により投与し、一方、ＣＴＸを１日おきにｉｐ注射により投与した。群１：媒体、群２：ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ、群３：ＣＴＸ ４０ｍｇ／ｋｇ、群４：ＳＣＶ−０７ ５ｍｇ／ｋｇ、群５：ＳＣＶ−０７ １０ｍｇ／ｋｇ、群６：ＳＣＶ−０７ ５ｍｇ／ｋｇプラスＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ、群７：ＳＣＶ−０７ １０ｍｇ／ｋｇプラスＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇという、全部で７つの群を用いた。腫瘍体積および体重を３日ごとに測定し、腫瘍重量を研究終了時の第１６日目（解剖日）に測定した。
【００３８】
研究期間全体を通して、どの群でも動物の死亡は見られなかった。さらに、体重の統計結果は、ＳＣＶ−０７のみの群と媒体対照群との有意差を示さず、動物の成長に対してＳＣＶ−０７が影響を及ぼさないことを表わしている。これに対し、第６日目以降、ＣＴＸ治療群は、特に高投与量のＣＴＸを投与された群において、体重の著しい減少を示した。
【００３９】
腫瘍の成長については、第３日目に、群４を除くすべての群が、群１（媒体対照）と比べ、腫瘍体積の統計学的に有意な抑制を示した。第６日目に、群２および群３のみが抑制を示した。第９日目に、群２、群３、および群７が抑制を示した。第１２日目に、群４を除くすべての群が抑制を示した。第１５日目に、すべての群の平均腫瘍サイズが、群１よりも統計学的に有意に小さくなった。第１６日目に、すべての治療群の平均腫瘍重量が、媒体対照群よりも低くなった。群２、群３、群４、群５、群６、および群７の腫瘍重量抑制率は、それぞれ、４５．５４％（ｐ＜０．０１）、９０．２５％（ｐ＜０．０１）、１８．０８％（ｐ＝０．０７）、３０．６０％（ｐ＜０．０１）、４８．５７％（ｐ＜０．０１）、および６２．６３％（ｐ＜０．０１）であった。
【００４０】
結論として、媒体群が顕著な腫瘍成長を示し、一方、陽性対照薬物ＣＴＸが腫瘍成長を効果的に減少させたので、この研究で使用された腫瘍モデルは有効である。ＳＣＶ−０７（１０ｍｇ／ｋｇ）を毎日、１４日間投与することは、腫瘍成長を著しく抑制した。治療された動物における腫瘍重量は、媒体対照群のものと比べて著しく減少した。さらに、次善の投与量（２０ｍｇ／ｋｇ）のＣＴＸと高投与量（１０ｍｇ／ｋｇ）のＳＣＶ−０７との併用治療は、抗腫瘍効果の増加を示した。
【００４１】
前書き
この研究は、ＳＣＶ−０７の抗腫瘍効果を、肺ガンにおける抗腫瘍薬物としてのその可能性を探求するために、マウス肺ガンモデルを用いて試験する。陽性対照としてＣＴＸを使用する。ＳＣＶ−０７とＣＴＸとの併用効果も、相加効果または相乗効果があるかどうかを判断するために試験する。
【００４２】
材料および方法
試験および対照物質
陰性対照物質（媒体）としてＰＢＳを使用し、陽性対照としてＣＴＸを使用した。ＣＴＸをシグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）社から購入し、１０ｍｇ／バイアルに等分した。ＰＢＳを、研究設計表に示されたような適正な投与量レベルを達成するよう添加した。製剤を冷蔵し、光から保護し、すぐに使用した。試験物質（ＳＣＶ−０７）を、研究設計表に示されたような適正な投与量レベルを達成するようＰＢＳに溶解させ、冷蔵し、光から保護し、１週間以内に使用する。
【００４３】
試験システムおよび動物の飼育管理
マウス肺ガン細胞（ＬＬＣ）
マウスルイス肺ガン細胞を、中国医学科学院（Chinese Academy of Medical Sciences（ＣＡＭＳ）、北京、中華人民共和国）の細胞培養センター（Cell Culture Center）から入手した。このガン細胞を、実験に使用する前に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに適応させた。細胞適応の詳細については第４．３．１号を参照されたい。
【００４４】
試験システム
中華人民共和国、北京、ＣＡＭＳの実験動物協会（Institute of Laboratory Animal Science）から、実験に未使用の健康なＣ５７ＢＬ／６マウスを、雄３５匹、雌３５匹受取った。研究開始時、これらの動物は、生後６週間で体重が１８〜２２グラムであった。
【００４５】
動物の飼育管理
動物を、寝床材料として加圧滅菌した木片が入った加圧滅菌した靴箱型ケージに、群別に収容した。飼育室の温度を２２〜２５℃に保ち、相対湿度を４０〜６０％に保った。研究に関連する事象によって中断される場合を除き、１２時間ずつの明暗サイクルが保たれた。動物には、滅菌水および北京KeAoXieLiげっ歯類用餌（認定済）を自由に給餌した。動物をすべて、腫瘍接種前に３日間順応させた。
【００４６】
実験手順
腫瘍細胞適応
無菌組織培養手順により、１バイアルのマウス肺ガン細胞を解凍し、１０００ｒｐｍ、２０〜２５℃で５分間、遠心分離機にかけた。細胞ペレットを０．５ｍＬの生理食塩水（ＮＭ）に懸濁し、各マウスの右腋窩に皮下注射した（約１×１０6細胞／マウス）。腫瘍の直径が約１ｃｍに達すると、動物をＣＯ2窒息で安楽死させ、腫瘍を摘出した。腫瘍細胞を前述のような生理食塩水に懸濁し、細胞適応サイクルをもう１回繰返した。
【００４７】
腫瘍細胞接種
体積０．１ｍＬの生理食塩水内の１×１０6個のＬＬＣ細胞を、マウスの右腋窩領域に皮下注射した。腫瘍接種日を第０日目と定義した。
【００４８】
研究設計および治療計画
第１日目に、動物をそれらの体重に基づき、平均体重が群間で統計学的に有意に異ならないよう、７つの異なる群に無作為に分けた。投与を第１日目に開始した。ＳＣＶ−０７を、体重２０ｇにつき０．１ｍＬの投与体積で、１日１回、連続１４日間、皮下投与により投与し、同じ投与体積のＣＴＸを、１日おきに腹腔内注射により投与した。媒体も、１日１回、連続１４日間、同じ投与体積のＰＢＳのｓｃ投与により投与した。すべての群についての治療計画を、表１に概説する。
【００４９】
【表１】
【００５０】
抗腫瘍効果の評価
研究期間全体を通して、すべての動物の腫瘍サイズおよび体重を３日ごとに測定した。腫瘍サイズは測径器により、体重は実験室の天秤により測定した。動物の死亡率および罹患率を毎日監視し、記録した。第１６日目に、動物をＣＯ2窒息により安楽死させ、腫瘍を摘出し、分離し、重量を量った。
【００５１】
腫瘍体積を、以下の式を用いて計算した。
腫瘍体積＝長さ×幅×幅／２
腫瘍体積抑制率（ＩＲ）を、以下の式に従って計算した。
【００５２】
【数３】
【００５３】
式中、ＴＶは測定日の腫瘍体積であり、「媒体」はＰＢＳを受ける群を示し、「薬物で治療」はＳＣＶ−０７および／またはＣＴＸを受ける群を示す。
【００５４】
単独で使用された、またはＣＴＸと併用されたＳＣＶ−０７の抗腫瘍効果も、腫瘍重量によって評価した。各マウスの腫瘍重量を安楽死の後で記録し、腫瘍重量の抑制率を以下の式に従って計算した。
【００５５】
【数４】
【００５６】
平均偏差および標準偏差を、エクセルを用いて計算した。
統計的分析
スチューデントのｔ検定を用いて、腫瘍体積、腫瘍重量、および体重について、群内での比較を行なった。０．０５未満のＰ値は統計学的に有意であると考えた。
【００５７】
結果および論議
死亡率
この研究において、動物の死亡は観察されなかった。
【００５８】
腫瘍サイズ
腫瘍サイズの生測定データを付録１〜１０に列挙する。計算された腫瘍抑制率、および媒体群に対する各治療群の統計比較を表２〜６に列挙する。腫瘍成長曲線を図１に示す。腫瘍体積データに基づくと、第３日目に、群４を除くすべての群が腫瘍成長の著しい抑制を示した。第６日目に、群２および群３が抑制を示した。第９日目に、群２、群３、および群７の平均腫瘍サイズが、群１（媒体）よりも統計学的に有意に小さくなった。第１２日目に、群４を除くすべての治療群の平均腫瘍サイズが、群１よりも統計学的に有意に小さくなった。第１５日目に、すべての群の平均腫瘍サイズが、群１よりも統計学的に有意に小さくなった。併用治療群の中では、高投与量のＳＣＶ−０７がＣＴＸとの相加効果を示した。
【００５９】
腫瘍重量
腫瘍重量の生データを付録１１に示した。一方、各治療群と媒体対照群との統計比較結果を表７に示す。表７に示すように、第１６日目に測定されたすべての治療群の平均腫瘍重量は、媒体対照群よりも低かった。群２、群３、群４、群５，群６、および群７における腫瘍抑制率は、それぞれ、４５．５４％（ｐ＜０．０１）、９０．２５％（ｐ＜０．０１）、１８．０８％（ｐ＝０．０７）、３０．６０％（ｐ＜０．０１）、４８．５７％（ｐ＜０．０１）、および６２．６３％（ｐ＜０．０１）であった。群２（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ）と群６（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ＋ＳＣＶ−０７ ５ｍｇ／ｋｇ）とでは、腫瘍抑制において統計学的に有意な差はなかった。これに対し、群７（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ＋ＳＣＶ−０７ １０ｍｇ／ｋｇ）の抑制率は、群２（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ）よりも統計学的に有意に大きく、ＣＴＸをＳＣＶ−０７と併用した場合の相加効果を表わしている。
【００６０】
図２は、研究終了時（第１６日目）での全群についての腫瘍重量を示す。
体重
体重測定の生データを付録１２〜１７に列挙した。媒体群に対する各治療群の統計比較の結果を表８〜１３に列挙している。
【００６１】
表に示すように、第３日目では、各治療群と媒体対照群との有意差はない。第６日目に、群３（ＣＴＸ ４０ｍｇ／ｋｇ）は１０．８２％（Ｐ＜０．０５）の体重抑制率を呈した。他の群については体重の有意差はなかった。第９日目では、群２（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ）、群３（ＣＴＸ ４０ｍｇ／ｋｇ）、および群６（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ＋ＳＣＶ−０７ ５ｍｇ／ｋｇ）についての抑制率は、それぞれ、１２．３５％（ｐ＜０．０１）、１６．１２％（ｐ＜０．０１）、および７．２２％（ｐ＜０．０１）であった。群６にＳＣＶ−０７を添加すると、体重増加の抑制率が減少した。他の群については体重の有意差はなく、動物の体重増加にＳＣＶ−０７が影響を及ぼさないことを表わしている。第１２日目では、群２（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ）、群３（ＣＴＸ ４０ｍｇ／ｋｇ）、および群６（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ＋ＳＣＶ−０７ ５ｍｇ／ｋｇ）についての抑制率は、それぞれ、１４．８３％（ｐ＜０．０１）、２１．９７％（ｐ＜０．０１）、および１０．２８％（ｐ＜０．０１）であった。第１５日目に、群３（ＣＴＸ ４０ｍｇ／ｋｇ）の抑制率は２５％（ｐ＜０．０１）であった。他の群については体重の有意差はなかった。この結果は、ＣＴＸはおそらくその毒性により体重増加を抑制し、ＳＣＶ−０７はおそらくそのＣＴＸ毒性の緩和により、抑制を部分的に保留し得ることを表わしている。
【００６２】
結論および論議
結論として、陽性対照薬物ＣＴＸによって腫瘍成長が抑制可能なので、この研究で使用された腫瘍モデルは有効である。試験物質であるＳＣＶ−０７を毎日１０ｍｇ／ｋｇ、１４日間投与することも、腫瘍成長に対して効果的である。第１２日目以降、ＳＣＶ−０７で治療されたすべての群の動物の腫瘍サイズは、媒体対照群のものと比べて著しく減少した。第１６日目に測定された腫瘍重量も、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のみを受けた群、および併用治療を受けた群では著しく減少したが、５ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のみを受けた群ではそうでもなかった。さらに、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７と２０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７との併用は、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７または２０ｍｇ／ｋｇのＣＴＸを単独で使用した場合に得られる３０．６％および４５．５４％の抑制に比べ、合わせて６２．６３％の腫瘍成長の抑制を生み出した。これらの結果は、ＳＣＶ−０７とＣＴＸとの併用が腫瘍成長抑制に向けて相加効果を生み出すことを示唆している。
【００６３】
ＣＴＸ治療群における動物の平均体重は著しく減少し、毒性効果を表わしている。しかしながら、併用治療群におけるＳＣＶ−０７の添加により、ＣＴＸの毒性効果はＳＣＶ−０７によって少なくとも部分的に弱められ得るようである。この減少は、２０ｍｇ／ｋｇのＣＴＸの単独使用が体重増加の統計学的に有意な抑制を生み出すものの、併用治療群（ＣＴＸ ２０ｍｇ／ｋｇ＋ＳＣＶ−０７ １０ｍｇ／ｋｇ）では抑制がない第９日目において明らかである。体重増加のより顕著な抑制を生み出す、より高い投与量のＣＴＸ（すなわち４０ｍｇ／ｋｇ）と併用したＳＣＶ−０７の保護効果は、試験しなかった。さらなる研究によって検証されれば、ＳＣＶ−０７の保護効果は、ＳＣＶ−０７とＣＴＸとの併用治療を検討する際に非常に有用であろう。総合すれば、高投与量（１０ｍｇ／ｋｇ）のＳＣＶ−０７と次善の投与量（２０ｍｇ／ｋｇ）のＣＴＸとの併用は、抗腫瘍効果の増加および毒性の低下を示した。
【００６４】
【表２】
【００６５】
【表３】
【００６６】
【表４】
【００６７】
【表５】
【００６８】
【表６】
【００６９】
【表７】
【００７０】
【表８】
【００７１】
【表９】
【００７２】
【表１０】
【００７３】
【表１１】
【００７４】
【表１２】
【００７５】
【表１３】
【００７６】
【表１４】
【００７７】
【表１５】
【００７８】
【表１６】
【００７９】
実施例２
腫瘍成長の減少における効果に関する、放射線と併用したＳＣＶ−０７の評価
概要
この研究では、放射線治療を行なった場合または行なわなかった場合の腫瘍成長に対するＳＣＶ−０７の影響を、マウスのＨ１４６肺ガンモデルを用いて試験した。ガンを持ったマウスが１日１回、２０日間、生理食塩水またはＳＣＶ−０７を用いて、放射線治療を受けて、または受けずに治療された。生存および重量変化の観察に基づくと、ＳＣＶ−０７はこの研究では毒性の証拠を示さず、また、それは放射線に対するＨ１４６腫瘍の反応を変化させなかった。単独で投与された場合、ＳＣＶ−０７は投与量に依存して腫瘍成長の減少に効果的であり、１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を１日２回、２０日間受けた動物は９．１％の腫瘍成長抑制を示し、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を１日２回、２０日間受けた動物は３５．９％の腫瘍成長抑制を示した。１回投与の紫外線治療と併用すると、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を１日２回、２０日間投与した治療は、放射線のみで治療された動物に比べ、７８．３％の腫瘍成長抑制、すなわち４０．５％のＴＧＩをもたらした。これらの観察に基づくと、ＳＣＶ−０７は、単独で投与された場合、または放射線治療と併用した場合に、肺ガンモデルにおける腫瘍の成長を減少させるのに効果的であると思われる。
【００８０】
目的
マウスのＮＣＩ Ｈ１４６小細胞肺ガンモデルを用いて、腫瘍成長抑制におけるＳＣＶ−０７の効果を、単独治療として、および放射線治療と併用して評価する。
【００８１】
研究設計
９６匹の雌のヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）を、８つの治療群に無作為に割当てた。各マウスの左脇腹下方に、体積が０．１ｍＬの１×１０5個のＮＣＩ−Ｈ１４６（Ｈ１４６）肺ガン細胞をマトリゲルとともに接種した。腫瘍の体積が一旦７５〜１２５ｍｍ3に達すると、治療を開始した。表２．１に詳述するように、媒体、放射線、ＳＣＶ−０７、または放射線およびＳＣＶ−０７を用いて群を治療した。薬物治療の開始を第１日目と指定した。群１および群４のマウスは、媒体を皮下（ｓｃ）注射により２０日間受けた。群２〜４および６〜８のマウスは、媒体中のＳＣＶ−０７を１日１回、ｓｃ注射により、第１〜２０日目に受け、群６〜８のマウスは放射線を受けた（２回、第０日目および第２日目に４Ｇｙ／１回分）。放射は、これらの群のマウスをケタミン（１２０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（６ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、腫瘍を有する脇腹の領域が放射線にさらされるようにマウスを鉛遮蔽体の下に配置することによって行なわれた。放射線は、フィリップス（Philips）１６０ｋＶ源を用いて、約４０ｃｍの焦点距離、および約１．０Ｇｙ／分の線量率で送出された。研究期間全体を通して、腫瘍を１日おきに測定した。群１〜８のマウスは第２１日目に犠牲となり、残った腫瘍が摘出され、測定され、重量を量られ、写真を撮られて、後の分析用にホルマリンで固定された。
【００８２】
【表１７】
【００８３】
重量および生存
起こり得る毒性を評価するために、動物の重量を毎日測定し、それらの生存を記録した。研究期間中、開始重量の２０％を超える減少を呈した動物を安楽死させた。腫瘍が４０００ｍｍ3を超えて成長した動物も安楽死させた。
【００８４】
材料および方法
組織培養
Ｈ１４６ヒト肺ガン細胞をＡＴＣＣから入手した。これらの細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１％のペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびに２ｍＭのＬ−グルタミンが補充されたＤＭＥＭにおいて成長させた。媒質を除去し、カルシウムおよびマグネシウムを含まない殺菌したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて２回すすぎ、０．２５％トリプシン／０．０３％ＥＤＴＡ溶液を１〜２ｍｌ添加することによって、細胞を二次培養した。細胞が分離するまで、フラスコを３７℃で培養した。細胞を次に、１：３の比率で二次培養した。
【００８５】
研究実行の場所
この研究は、マサチューセッツ州ウォータータウン（Watertown）のバイオモデルズ（Biomodels）ＡＡＡＬＡＣ公認施設で行なわれた。この研究に関する動物使用許可は、バイオモデルズＩＡＣＵＣから得た。
【００８６】
動物
ｎｕ遺伝子（ｎｕ＋／ｎｕ＋）についてホモであり（チャールズリバーラボ（Charles River Labs））、生後５〜６週間で、治療前の平均体重が２４グラムの雌のヌードマウスを使用した。動物に耳パンチを用いて個々に番号を付け、１つのケージにつき６匹ずつの群で収容し、研究開始前に順応させた。少なくとも２日間の順応期間中、不調を呈する動物を除外するために、動物を毎日観察した。
【００８７】
飼育室
この研究は、温度が７０°Ｆ＋／−５°Ｆ、相対湿度が５０％＋／−２０％の、ろ過空気が供給された飼育室で行なわれた。飼育室は、１時間につき最低で１２〜１５回の換気を保つように設定された。この飼育室には、薄明無しで１２時間オン、１２時間オフとなる明暗サイクル用の自動タイマが付いていた。
【００８８】
滅菌されたベッド・オ・コブズ（Bed-O-Cobs）（登録商標）寝床を使用した。寝床は少なくとも週に１回交換した。
【００８９】
ケージ、蓋、底などを市販の洗剤で洗い、空気乾燥させた。使用前、これらの物品を覆って加圧滅菌した。フードに入れられる面および材料を殺菌するために、市販の殺菌剤を使用した。床は毎日掃除され、少なくとも週に２回、市販の洗剤でモップがかけられた。壁およびケージラックは少なくとも１月に１回、薄めた漂白容器を用いてスポンジで擦られた。研究、投与量、動物番号、および治療群を識別するために必要な適切な情報を記載したケージカードまたはラベルを、すべてのケージに付けた。研究中、温度および相対湿度を記録し、これらの記録を保存した。
【００９０】
餌
動物には、無菌ラボダイエット（Labdiet）（登録商標）５０５３（滅菌前）げっ歯類用餌を給餌し、滅菌水を自由に与えた。
【００９１】
動物の無作為化および割当て
治療の開始前、マウスを、無作為にかつ先を見越して８つの群に分けた。各動物を、個々の番号に対応する耳パンチによって識別した。各ケージを識別するためにケージカードを使用し、研究番号（ＳＣＩ−０５）、治療群番号、および動物番号を記載した。
【００９２】
結果の評価
治療群間の統計学的差異を、スチューデントのｔ検定、マン・ホイットニーのＵ検定、およびカイ二乗分析を用いて、０．０５という臨界値で判断した。
【００９３】
実験手順
腫瘍を２日に１回、マイクロ測径器で測定し、腫瘍体積を４／３πｒ3として計算した。ここで、ｒは長さと幅との和を４で割ったものに等しい。式１００−（Ｖｃ*１００／Ｖｔ）を用いて腫瘍成長指標（ＴＧＩ）を計算した。式中、Ｖｃは対照群における腫瘍の平均体積であり、Ｖｔは試験群における腫瘍の平均体積である。
【００９４】
結果および論議
生存
この研究の期間中、治療の直接的な結果としての動物の死亡は起こらなかった。
【００９５】
動物の重量
媒体治療群とＳＣＶ−０７を単独治療として受けた動物（ｐ＝０．７）との間、または放射線のみを受けた動物および放射線とＳＣＶ−０７とを併用して受けた動物（ｐ＝０．６８）には、平均重量の日別変化に有意差はなかった。媒体のみを受けたマウスは、第２１日目までに、平均でそれらの開始重量の１３．２％増加した。１００μｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のいずれかで治療されたマウスは、第２１日目までに、それらの開始重量の１０．２％〜１２．３％増加した。媒体で治療され、かつ放射線にさらされたマウスは、第２１日目までに、平均でそれらの開始重量の３．２％増加した。１００μｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のいずれかで治療され、かつ放射線にさらされたマウスは、第２１日目までに、それらの開始重量の２．８％〜３．６％増加した。
【００９６】
各動物の重量変化百分率についての平均の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、一元配置分散分析検定を用いて群同士を比較することにより、これらの差異の有意性を評価した。
【００９７】
腫瘍体積
１日おきに測定した長さおよび幅の測定値から、長さと幅との和を４で割った平均半径（ｒ）を計算し、式４／３πｒ3を用いて体積を計算することにより、腫瘍体積を計算した。
【００９８】
１００μｇ／ｍｌで治療された動物からの腫瘍は、媒体対照動物よりも速い速度で成長した。放射線を受けなかった動物のうち、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療されたマウスが、腫瘍成長抑制において最良の改善を示した。媒体で治療された動物についての研究期間終了時の平均腫瘍体積は４４３６．６ｍｍ３であり、１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療された動物については４９２３ｍｍ３、１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療された動物については４０３３．４ｍｍ３、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療された動物については２８４２．４ｍｍ３であった。
【００９９】
放射線を受けた動物のうち、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療されたマウスが、腫瘍成長抑制において最良の改善を示した。媒体で治療された動物についての研究期間終了時の平均腫瘍体積は１６１８．５ｍｍ３であり、１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療された動物については１３２２．３ｍｍ３、１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療された動物については１９２３．９ｍｍ３、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療された動物については９６２．８ｍｍ３であった。
【０１００】
各動物の腫瘍体積についての平均の曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、一元配置分散分析検定を用いて群同士を比較することにより、データのさらなる分析を行なった。この分析は、いずれの治療群と生理食塩水対照群との有意差も明らかにはしなかった（放射線を受けていない動物についてはｐ＝０．１３、放射線を受けた動物についてはｐ＝０．１４）。しかしながら、マン・ホイットニー順位和分析を用いて媒体治療と１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７とを直接比較すると、有意差がある（ｐ＝０．０２６）。
【０１０１】
式１００−（Ｖｃ*１００／Ｖｔ）を用いて腫瘍成長抑制（ＴＧＩ）を計算した。式中、Ｖｃは対照群における腫瘍の平均体積であり、Ｖｔは試験群における腫瘍の平均体積である。表２．２は、１００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を単独で用いて、または放射線と併用して治療された動物についての腫瘍成長抑制を示す。放射線を受けなかった対照と比較すると、１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のみで治療された動物は、９．１％の腫瘍成長抑制を有し、１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のみで治療された動物は、３５．９％の腫瘍成長抑制を有した。放射線のみで治療された動物は、放射線を受けなかった対照と比較すると、６３．５％のＴＧＩを有し、一方、ＳＣＶ−０７プラス放射線で治療された動物は、７０．２％（１００μｇ／ｋｇ）、５０．３％（１ｍｇ／ｋｇ）、およびの７８．３％（１０ｍｇ／ｋｇ）ＴＧＩ値を有した。放射線プラス媒体を受けた群と比較すると、放射線プラスＳＣＶ−０７で治療された群は、１００μｇ／ｋｇで１８．３％、１０ｍｇ／ｋｇで４０．５％のＴＧＩを有した。
【０１０２】
【表１８】
【０１０３】
表２．２． 腫瘍成長抑制（ＴＧＩ）。ＴＧＩは、最新の腫瘍測定値から、式１００−（Ｖｃ*１００／Ｖｔ）を用いて計算された。式中、Ｖｃは対照群における腫瘍の平均体積であり、Ｖｔは試験群における腫瘍の平均体積である。**群２および群７の平均腫瘍体積は、媒体対照動物を上回った（それぞれ、９．８％および１５．８７％）。
【０１０４】
結論
生存および重量変化の観察に基づくと、ＳＣＶ−０７はこの研究では毒性の証拠を示さなかった。
【０１０５】
１０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のみで治療された動物は、媒体対照動物と比較すると、腫瘍成長抑制（ＴＧＩ＝６８％）の著しい減少を示した（Ｐ＝０．０２６）。
【０１０６】
統計学的に有意ではないものの、１００μｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のみで、または１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のみで治療された動物は、媒体のみを受けた動物に比べ、腫瘍成長の減少を示した。
【０１０７】
統計学的に有意ではないものの、１００μｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７で治療され、放射線を受けた動物は、放射線を受けた動物に比べ、腫瘍成長の減少を示した。
【０１０８】
【表１９】
【０１０９】
【表２０】
【０１１０】
【表２１】
【０１１１】
【表２２】
【０１１２】
【表２３】
【０１１３】
実施例３
皮下ＬＬＣ腫瘍を有するマウスにおけるＳＣＶ−０７およびシスプラチンの併用治療の抗腫瘍効果研究
略語
ＢＷ 体重
ＣＯ2 二酸化炭素
ＣＤＤＰ シス−ジアミン ジクロロプラチナム（シスプラチン）
ｇ グラム
ｋｇ キログラム
Ｌ 長さ
ＬＬＣ ルイス肺ガン
ｍｇ ミリグラム
ｍＬ ミリリットル
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＰＩ パーセント抑制
ＳＤ 標準偏差
ＴＶ 腫瘍体積
ＴＷ 腫瘍重量
ＶＢＩ バイタル・ブリッジ社（中国）（Vital Bridge (China), Inc.）
Ｗ 幅
概要
この研究では、Ｃ５７／ＢＬ６マウスに接種されたマウスルイス肺ガン（ＬＬＣ）細胞から成長した皮下ガンの成長に対するＳＣＶ−０７およびシスプラチン（ＣＤＤＰ）の抑制効果を評価した。全部で７０匹のマウスにマウスＬＬＣ細胞を皮下移植し、次にＳＣＶ−０７またはＣＤＤＰを単独で用いて、もしくは併用して、連続１４日間治療した。ＳＣＶ−０７を毎日、ｓｃ注射により投与し、一方、ＣＤＤＰを第１日目、第６日目、および第１２日目にｉｐ注射により投与した。群１：媒体、群２：ＣＤＤＰ ２ｍｇ／ｋｇ、群３：ＣＤＤＰ ６ｍｇ／ｋｇ、群４：ＳＣＶ−０７ １０ｍｇ／ｋｇ、群５：ＳＣＶ−０７ ２０ｍｇ／ｋｇ、群６：ＳＣＶ−０７ １０ｍｇ／ｋｇプラスＣＤＤＰ ２ｍｇ／ｋｇ、群７：ＳＣＶ−０７ ２０ｍｇ／ｋｇプラスＣＤＤＰ ２ｍｇ／ｋｇという、全部で７つの群が使用された。体重を３日ごとに記録し、腫瘍サイズを１日おきに測定し、腫瘍重量を研究終了時の第１６日目（解剖日）に測定した。
【０１１４】
研究期間全体を通して、死んだ動物はいなかった。体重の統計結果は、ＳＣＶ−０７単独治療群（群４および５）のいずれかと媒体対照群（群１）との有意差を示さず、動物の成長に対してＳＣＶ−０７が影響を及ぼさないことを表わしている。これに対し、第３日目以降、６ｍｇ／ｋｇのＣＤＤＰ治療を受けた群（群３）は、体重の統計学的に有意な減少を一貫して示した。２ｍｇ／ｋｇのＣＤＤＰ治療を受けた群である群２は、第１５日目のみ体重の統計学的に有意な減少を示し、一方、２ｍｇ／ｋｇのＣＤＤＰを２０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７と併用して受けた群７は、第３日目以降、群１と比較して、体重の統計学的に有意な減少を一貫して呈した。
【０１１５】
腫瘍測定データは、第６日目に、群２および群３の平均腫瘍体積が群１のものよりも統計学的に有意に小さいことを示した。第８日目、第１０日目、第１２日目、および第１４日目において、すべての群の平均腫瘍体積が群１よりも統計学的に有意に小さかった。第１６日目に、すべての治療群の平均腫瘍重量が群１よりも低くなった。腫瘍重量に基づいて計算された腫瘍抑制は、群２、群３、群４、群５、群６、および群７について、それぞれ、５８．９０％（ｐ＜０．０１）、７７．３５％（ｐ＜０．０１）、１６．８４％（ｐ＜０．０５）、３７．４５％（ｐ＜０．０１）、４０．８１％（ｐ＜０．０１）、および５６．１３％（ｐ＜０．０１）であった。
【０１１６】
要約すると、陽性対照薬物ＣＤＤＰが腫瘍成長を効果的に減少させたので、この研究で使用された腫瘍モデルは、有効であった。ＳＣＶ−０７（１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ）を用いた治療は、媒体対照群のものと比べてこれらの群で腫瘍体積がより小さく、腫瘍重量がより低かったことに反映されるように、腫瘍成長を抑制した。ＣＤＤＰ（２ｍｇ／ｋｇ）と併用したＳＣＶ−０７（１０または２０ｍｇ／ｋｇ）の治療計画は、ＳＣＶ−０７単独治療よりも腫瘍成長のより高い抑制をもたらすものの、ＣＤＤＰ単独の場合と比べると、抗腫瘍効果の増加はない（相加効果なし）。
【０１１７】
前書き
この研究は、マウスルイス肺ガン（ＬＬＣ）モデルにおいて単独で使用される、またはＣＤＤＰと併用されるＳＣＶ−０７の抗腫瘍効果を、肺ガンの治療に対するその治療可能性を探索する目的で評価するために設計された。ＣＤＤＰを、このガンモデルを検証する陽性対照薬物としても使用した。
【０１１８】
材料および方法
試験および対照物質
陰性対照物質（媒体）としてＰＢＳを使用し、陽性対照としてＣＤＤＰを使用した。ＣＤＤＰをＰＵＭＣ病院から購入した。この薬剤は、Qilu製薬会社（Qilu Pharmaceutical Co., Ltd.）により製造され、各バイアルは１０ｍｇのＣＤＤＰ粉末を含有している。使用前、投与量製剤表（表３．１）に示されたような適正な投与量レベルを達成するよう、ＰＢＳを１バイアルのＣＤＤＰに添加した。製剤を冷蔵し、光から保護し、すぐに使用した。試験物質（ＳＣＶ−０７）を、表１に示されたような適正な投与量レベルを達成するようＰＢＳに溶解させ、冷蔵し、光から保護し、１週間以内に使用した。
【０１１９】
【表２４】
【０１２０】
試験システムおよび動物の飼育管理
マウス肺ガン細胞（ＬＬＣ）
マウスルイス肺ガン細胞を、中国医学科学院（ＣＡＭＳ、北京、中華人民共和国）の細胞培養センターから入手した。このガン細胞を、実験に使用する前に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに適応させた。細胞適応の詳細については第４．３．１号を参照されたい。
【０１２１】
試験システム
中華人民共和国、北京、ＣＡＭＳの実験動物協会から、実験に未使用の健康なＣ５７ＢＬ／６マウスを、雄３５匹、雌３５匹受取った。研究開始時、これらの動物は、生後６週間で体重が１８〜２２グラムであった。
【０１２２】
動物の飼育管理
動物を、寝床材料として加圧滅菌した木片が入った加圧滅菌した靴箱型ケージに、群別に収容した。飼育室の温度を２２〜２５℃に保ち、相対湿度を４０〜６０％に保った。研究に関連する事象によって中断される場合を除き、１２時間ずつの明暗サイクルが保たれた。動物には、滅菌水および北京KeAoXieLiげっ歯類用餌（認定済）を自由に給餌した。動物をすべて、腫瘍接種前に３日間順応させた。
【０１２３】
実験手順
腫瘍細胞適応
１バイアルのＬＬＣ細胞を液体窒素ストックから取り出し、３７℃の水槽に配置した。バイアルの中身が解凍されるまで、緩やかな旋回を行なった。無菌組織培養手法を用いて、細胞をすぐに１０００ｒｐｍ、２０〜２５℃で５分間、ＴＤ５Ａ−ＷＳ遠心分離機にかけた。遠心分離後、細胞を０．１〜０．５ｍＬの生理食塩水（ＮＭ）に懸濁し、次に１０匹のマウスに皮下注射した（０．１ｍＬ／マウス、約１×１０6個の細胞）。１〜２週間後、腫瘍の直径が約１ｃｍになると、動物をＣＯ2過剰投与で安楽死させ、腫瘍を摘出した。この手順を別の２０匹に繰返して、適正な移植可能性を有する十分な数のＬＬＣ細胞を生成した。
【０１２４】
腫瘍細胞接種
腫瘍移植日、０．１ｍＬの１×１０6個の細胞を、各マウスの右腋窩領域に皮下注射した。腫瘍移植日を第０日目と定義した。
【０１２５】
研究設計および治療計画
第１日目に、動物を体重が適合する異なる群に無作為に割当て、表３．２に下方計画を用いて投与を開始した。簡潔には、ＳＣＶ−０７を、腫瘍細胞移植部位とは異なる部位に、１日１回、連続１４日間、皮下投与により投与し、一方、ＣＤＤＰを、第１日目、第６日目、および第１２日目に腹腔内投与した。
【０１２６】
抗腫瘍効果の評価
第１日目〜第１４日目に、死亡率および罹患率を一日２回チェックし、体重を３日ごとに記録し、腫瘍を測径器を用いて２日ごとに測定した。研究終了時（第１６日目）、動物をＣＯ2窒息により安楽死させ、腫瘍を摘出して重量を量った。
【０１２７】
腫瘍体積を、以下の式を用いて計算した。
腫瘍体積＝長さ×幅×幅／２
腫瘍体積抑制（ＰＩ）を、以下の式に従って計算した。
【０１２８】
【数５】
【０１２９】
式中、ＴＶは測定日の腫瘍体積であり、「媒体」はＰＢＳを受ける群を示し、「薬物で治療」はＳＣＶ−０７および／またはＣＤＤＰを受ける群を示す。
【０１３０】
単独で使用された、またはＣＤＤＰと併用されたＳＣＶ−０７の抗腫瘍効果も、腫瘍重量によって評価した。各マウスの腫瘍重量を安楽死の後で記録し、腫瘍重量のパーセント抑制を以下の式に従って計算した。
【０１３１】
【数６】
【０１３２】
平均偏差および標準偏差を、エクセルを用いて計算した。
【０１３３】
【表２５】
【０１３４】
統計的分析
スチューデントのｔ検定を用いて、腫瘍体積、腫瘍重量、および体重について、群内での比較を行なった。０．０５未満のＰ値は統計学的に有意であると考えた。
【０１３５】
結果および論議
死亡率
研究期間全体を通して、死んだ動物はいなかった。
【０１３６】
腫瘍サイズ
腫瘍サイズの生測定データを付録３．１〜３．１４に示す。計算された平均腫瘍体積、および媒体群に対する各治療群の統計試験結果を表３〜９に示す。第２日目では、どの群でも腫瘍は測定できなかった。第４日目に、群４を除くすべての群の平均腫瘍体積が、群１（媒体対照）のものよりも統計学的に有意に小さくなった。第６日目に、群２および群３のみが、より小さい平均腫瘍体積を示した。第８日目、第１０日目、第１２日目、および第１４日目に、すべての群の平均腫瘍体積が、群１よりも統計学的に有意に小さくなった。
【０１３７】
腫瘍重量
第１６日目に測定した腫瘍重量の生データを付録３．１５に示した。腫瘍重量に基づいた計算されたパーセント抑制（ＰＩ）値、および各治療群と媒体群との統計比較結果を、表３．１０に示す。表３．１０に示すように、すべての治療群の平均腫瘍重量は、媒体群のものよりも低かった。群２、群３、群４、群５，群６、および群７のＰＩ値は、それぞれ、５８．９０％（ｐ＜０．０１）、７７．３５％（ｐ＜０．０１）、１６．８４％（ｐ＜０．０５）、３７．４５％（ｐ＜０．０１）、４０．８１％（ｐ＜０．０１）、および５６．１３％（ｐ＜０．０１）であった。併用治療群（すなわち群６および７）は、ＳＣＶ−０７単独治療を受けた対応する群（すなわち群４および５）よりも高いＰＩ値を有するものの、これらのＰＩ値は、ＣＤＤＰ単独治療を受けた群２のものほど高くはなかった。併用治療群のいずれかとＣＤＤＰ単独治療群（群２）とでは、ＰＩにおいて統計学的に有意な差はなく、ＣＤＤＰをＳＣＶ−０７と併用した場合、相加効果がないことを表わしている。
【０１３８】
体重
体重測定の生データを付録３．１６〜３．２１に列挙した。媒体群に対する各治療群の統計比較の結果を表３．１１〜３．１６に示した。
【０１３９】
表３．１１〜３．１６に示すように、第０日目では、各治療群と媒体対照群との間に統計学的に有意な差はなかった。第３日目に、群３（ＣＤＤＰ ６ｍｇ／ｋｇ）および群７（ＣＤＤＰ ２ｍｇ／ｋｇ＋ＳＣＶ−０７ ２０ｍｇ／ｋｇ）は、媒体群に対し、それぞれ９．３３％（Ｐ＜０．０１）および８．３１％（Ｐ＜０．０１）の体重減少を呈した。他の群については、媒体群と比較して体重の有意差はなかった。第６日目では、群３および群７の体重は、媒体群よりも１０．４５％（ｐ＜０．０１）および６．５８％（ｐ＜０．０１）低かった。第９日目では、群３、群６、および群７の体重は、媒体群よりもそれぞれ１４．５１％（ｐ＜０．０１）、８．７０％（ｐ＜０．０５）、および１１．４１％（ｐ＜０．０１）低かった。第１２日目では、群３および群７の体重は、媒体群よりもそれぞれ１３．６２％（Ｐ＜０．０１）および６．６５％（Ｐ＜０．０５）低かった。第１５日目では、群２、群３、群６、および群７の体重は、媒体群よりもそれぞれ１２．５１％（ｐ＜０．０１）、２４．３７％（Ｐ＜０．０１）、１０．４２％（Ｐ＜０．０５）、および１４．５６％（Ｐ＜０．０１）低かった。研究期間全体を通して、ＳＣＶ−０７単独治療を受けた群４および群５の体重には統計学的に有意な差はなく、ＳＣＶ−０７は単独で使用された場合、動物の体重増加に有意な影響を及ぼさなかったことを表わしている。これに対し、ＣＤＤＰ治療は体重の減少に関連し、この所見は特に、高投与量（６ｍｇ／ｋｇ）のＣＤＤＰを受けた群である群３で顕著であった。ＣＤＤＰとＳＣＶ−０７との併用は、重量減少を緩和しなかったが、実際には、ＣＤＤＰに関連する重量減少をより顕著にするであろう。ＣＤＤＰのみを受けた群２よりも、高投与量のＳＣＶ−０７と併用してＣＤＤＰを受けた群である群７において、より多い重量減少が見られた。
【０１４０】
結論および論議
結論として、陽性対照薬物ＣＤＤＰによって腫瘍成長が抑制されたので、この研究で使用された腫瘍モデルは有効であった。試験物質であるＳＣＶ−０７を毎日１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ投与することは、腫瘍成長に対して効果的であった。第８日目以降、ＳＣＶ−０７で治療されたすべての群の動物の平均腫瘍体積は、媒体対照群のものと比べて著しく減少した。第１６日目に測定された腫瘍重量も、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７のみを受けた群、および併用治療を受けた群では著しく減少した。１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇのＳＣＶ−０７を単独で使用した場合に得られる１６．８４％および３７．４５％の抑制、ならびに２ｍｇ／ｋｇまたは６ｍｇ／ｋｇのＣＤＤＰを単独で使用した場合に得られる５８．９０％および７７．３５％の抑制に比べて、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇののＳＣＶ−０７と２ｍｇ／ｋｇのＣＤＤＰとの併用は、４０．８１％および５６．１３％の腫瘍成長の抑制を生み出した。これらの結果は、ＳＣＶ−０７とＣＤＤＰとの併用が腫瘍成長抑制に向けて相加効果を生み出さないことを示唆した。
【０１４１】
ＣＤＤＰ治療群における平均体重は著しく減少し、毒性効果を表わしている。単独で使用された場合、ＳＣＶ−０７は、ＳＣＶ−０７で治療されたすべての群において体重の統計学的に有意な減少をもたらさず、動物の体重にＳＣＶ−０７影響を及ぼさないことを表わしている。しかしながら、ＳＣＶ−０７がＣＤＤＰと併用された場合、それはＣＤＤＰに関連する重量減少を悪化させるであろう。なぜなら、研究期間全体を通して、高投与量のＳＣＶ−０７と併用してＣＤＤＰを受けた群である群７において、より多い重量減少が見られたためである。
【０１４２】
【表２６】
【０１４３】
【表２７】
【０１４４】
【表２８】
【０１４５】
【表２９】
【０１４６】
【表３０】
【０１４７】
【表３１】
【０１４８】
【表３２】
【０１４９】
【表３３】
【０１５０】
【表３４】
【０１５１】
【表３５】
【０１５２】
【表３６】
【０１５３】
【表３７】
【０１５４】
【表３８】
【０１５５】
【表３９】
【０１５６】
【表４０】
【０１５７】
【表４１】
【０１５８】
【表４２】
【０１５９】
【表４３】
【０１６０】
【表４４】
【０１６１】
実施例４
Ｂ１６、ＬＬＣ、およびＲｅｎＣａ細胞株の増殖に対するＳＣＶ−０７の体外効果
略語
５−Ｆｕ ５−フルオロウラシル
ＣＶ 変動係数
ＤＭＥＭ ダルベッコ変法イーグル培地
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＴＩＣ ５−（３，３−ジメチル−１−トリアゼノ）イミダゾール−４−カルボキサミド
ＦＢＳ ウシ胎児血清
ＬＬＣ ルイス肺ガン
ＭＴＴ メチルチアゾリルジフェニル−テトラゾリウムブロミド
ＮＡ 適用不可
ＯＤ 光学密度
ＰＰＳ リン酸緩衝生理食塩水
ＲＰＭＩ ロズウェルパーク記念研究所（Roswell Park Memorial Institute）
ＳＤ 標準偏差
ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＯＰ 標準作業手順
ＶＢＩ バイタル・ブリッジ社（中国）
Ｖｓ 対
概要
この研究は、Ｂ１６、ＬＬＣ、およびＲｅｎＣａ細胞に対するＳＣＶ−０７の体外細胞毒性効果を評価するために行なわれた。
【０１６２】
ＳＣＶ−０７または陽性対照薬物（すなわちＤＴＩＣ、５−Ｆｕ、およびシスプラチン）の存在下で、Ｂ１６、ＬＬＣ、またはＲｅｎＣａ細胞を、ブランク対照を含む１２種の異なる濃度で、９６ウェルのプレートで培養した。ＳＣＶ−０７の濃度は、以前の体内研究の有効投与量から近似された血漿濃度に基づいて選択した。５−Ｆｕおよびシスプラチンの濃度は、文献で報告されたそれらのそれぞれのＩＣ50値によって選択した。ＳＣＶ−０７および陽性対照薬物の培養時間は、２４〜７２時間までさまざまであった。細胞増殖に対する薬物の抑制効果は、ＭＴＴ法によって判断した。
【０１６３】
５−Ｆｕおよびシスプラチンの治療は、対応する細胞株において著しい細胞毒性効果をもたらした。Ｂ１６細胞の増殖を抑制する５−ＦｕについてのＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて０．２６、０．３８、および０．２６μｇ／ｍＬであると概算された。ＲｅｎＣａ細胞では、５−ＦｕについてのＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて０．０３、０．０４、および０．０４μｇ／ｍＬであると概算された。ＬＬＣ細胞の増殖を抑制するシスプラチンについてのＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて３．２６、３．０７、および３．１０μｇ／ｍＬであると概算された。ＳＣＶ−０７は、すべての試験濃度（０．０５〜１００μｇ／ｍＬ）で、培養されたＢ１６、ＬＬＣ、およびＲｅｎＣａ細胞において培養増殖を抑制しなかった。ＳＣＶ−０７についてのＩＣ50値は、その濃度−抑制曲線の不適合度のため、得られなかった。
【０１６４】
結論として、この研究は、ＳＣＶ−０７が、培養されたＢ１６、ＬＬＣ、およびＲｅｎＣａ腫瘍細胞に対する体外細胞毒性効果を有してないことを実証した。
【０１６５】
前書き
この発明の目的は、Ｂ１６、ＬＬＣ、およびＲｅｎＣａ細胞に対するＳＣＶ−０７の体外細胞毒性効果を評価することであった。
【０１６６】
ＳＣＶ−０７は免疫調節剤である。マウスの皮下に移植された腫瘍細胞（Ｂ１６、ＬＬＣ、またはＲｅｎＣａ）の成長を抑制することが、以前の体内研究において既に実証されている(1-3)。この研究では、これらの腫瘍細胞株に対するＳＣＶ−０７の体外細胞毒性効果を評価した。
【０１６７】
ＳＣＶ−０７または陽性対照薬物（すなわちＤＴＩＣ、５−Ｆｕ、もしくはシスプラチン）の存在下で、Ｂ１６、ＬＬＣ、およびＲｅｎＣａ細胞を、９６ウェルのプレートで培養した。異なる細胞株の薬物の培養時間は、２４〜７２時間までさまざまであった。細胞増殖の抑制の評価には、ＭＴＴアッセイを使用した。
【０１６８】
材料および方法
材料
ＳＣＶ−０７
ＳＣＶ−０７（ロット番号ＲＲ００２１０１）がスポンサーによって提供された。８．４ｍＬの滅菌ダルベッコのＰＢＳ（インビトロゲン（Invitrogen）、カタログ番号１４１９０−１４４）に４．２ｍｇのＳＣＶ−０７を溶解することによって、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＣＶ−０７の貯蔵液を調製した。次に貯蔵液を滅菌ろ過し、２〜８℃で貯蔵し、錫箔を用いて光から保護した。使用前、貯蔵液を、培地を用いてさまざまな濃度にさらに希釈した。
【０１６９】
ＤＴＩＣ
ＤＴＩＣをシグマ社（Sigma）から購入した（カタログ番号Ｄ２３９０、ロット番号０２６Ｋ１３６３）。５００μＬの０．１Ｎ ＨＣＬに８．８ｍｇのＤＴＩＣを溶解することによって、１０ｍｇ／ｍＬの貯蔵液を調製し、次に３８０μＬのミリＱ水を添加した。貯蔵液を一旦調製すると、滅菌ろ過し、２〜８℃で貯蔵し、錫箔を用いて光から保護した。使用前、貯蔵液を、培地を用いてさまざまな濃度にさらに希釈した。
【０１７０】
５−Ｆｕ
５−Ｆｕをシグマ社から購入した（カタログ番号Ｆ６６２７、ロット番号１２５Ｋ１４９９）。９．６ｍＬの滅菌ダルベッコのＰＢＳ（インビトロゲン、カタログ番号１４１９０−１４４）に４．８ｍｇの５−Ｆｕを溶解することによって、０．５ｍｇ／ｍＬの貯蔵液を調製した。貯蔵液を一旦調製すると、滅菌ろ過し、２〜８℃で貯蔵し、錫箔を用いて光から保護した。使用前、貯蔵液を、培地を用いてさまざまな濃度にさらに希釈した。
【０１７１】
シスプラチン
シスプラチンをQilu製薬会社から購入した。１０ｍＬの滅菌ダルベッコのＰＢＳ（インビトロゲン、カタログ番号１４１９０−１４４）に１０ｍｇのシスプラチンを溶解することによって、１ｍｇ／ｍＬの貯蔵液を調製した。貯蔵液を一旦調製すると、滅菌ろ過し、２〜８℃で貯蔵した。使用前、貯蔵液を、培地を用いてさまざまな濃度にさらに希釈した。
【０１７２】
他の材料
ＭＴＴをシグマ社から購入した（カタログ番号Ｍ２１２８）。ＦＢＳ，ペニシリン−ストレプトマイシンＤＭＥＭ、およびＲＰＭＩ−１６４０媒質を、インビトロゲン社から購入した。ファルコン（Falcon）（登録商標）９６ウェル平底プレート（ＢＤ、カタログ番号３５３０７２）は、フィッシャー・サイエンティフィック（Fisher Scientific）社から購入した。
試験システム
Ｂ１６細胞株
Ｂ１６メラトーマ細胞株を、中国医学科学院、上海細胞バンク（Shanghai Cell Bank）から入手した。これらの細胞を、１０％のＦＢＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ−１６４０媒質において培養した。
【０１７３】
ＬＬＣ細胞株
ＬＬＣ細胞株を、中国医学科学院、上海細胞バンクから入手した。これらの細胞を、１０％のＦＢＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭにおいて培養した。
【０１７４】
ＲｅｎＣａ細胞株
ＲｅｎＣａ細胞株を、中国軍事医学科学院（Chinese Military Academy of Sciences）から入手した。これらの細胞を、１０％のＦＢＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補充されたＲＰＭＩ−１６４０媒質において培養した。
【０１７５】
ＭＴＴアッセイ
ＶＢＩ ＳＯＰ ６５．０２６に従って、ＭＴＴアッセイを行なった。簡潔に、上述の対応する培地を用いて、Ｂ１６、ＬＬＣ、またはＲｅｎＣａ細胞の懸濁液を調製した。ファルコン（登録商標）９６ウェル平底プレートの各ウェルに、１００μＬの細胞懸濁液を播種した。播種密度は、１００００細胞／ウェル（Ｂ１６およびＬＬＣ細胞株）、または７０００細胞／ウェル（ＲｅｎＣａ細胞株）であった。プレートに２５μＬの薬物を添加し、次に３７℃で５％のＣＯ2を用いて、予め規定された時間、プレートを培養することにより、薬物処理を行なった（薬物処理の詳細については、表４．１を参照されたい）。薬物を、ブランク対照を含む１２種の濃度で処理し、各濃度を４通りに試験した。ＳＣＶ−０７の濃度は、以前の体内研究の有効投与量から近似された血漿濃度に基づいて選択した。５−Ｆｕおよびシスプラチンの濃度は、対応する細胞株について文献で報告されたそれらのそれぞれのＩＣ50値によって選択した。薬物処理後、ＭＴＴを１ｍｇ／ｍＬの最終濃度で各ウェルに添加し、細胞培養を４時間続けた。ＭＴＴ培養の終了時、ＳＤＳおよびＤＭＦからなる抽出緩衝液をプレートに添加して、生存細胞によってＭＴＴから変換されたホルマザンを可溶化した。次に、各ウェルのＯＤを、テカンインフィニット（Tecan Infinite）Ｍ２００プレートリーダを用いて５７０ｎｍで測定した。
【０１７６】
【表４５】
【０１７７】
データ分析
平均およびＳＤの計算
平均およびＳＤの計算のために、生のＯＤデータをマイクロソフトエクセルにインポートした。
【０１７８】
ＩＣ50の計算
細胞増殖を抑制するためのＩＣ50を、プリズム５．０１（グラフパッド・ソフトウェア社（GraphPad Software, Inc.））を用いて計算した。細胞の死滅をもたらした薬物の濃度を、ＩＣ50の決定から除外した。以下の式を用いることにより、ＩＣ50を概算した。
【０１７９】
【数７】
【０１８０】
ここで、Ｘは薬物の濃度を表わし、Ｙは対応するＯＤを表わす。Ｂｏｔｔｏｍは（細胞成長の最大抑制に対応する）理論的に最も低いＯＤを表わし、一方、Ｔｏｐは理論的に最も高いＯＤを表わす。ＩＣ50は、５０％の反応を生み出す薬剤の濃度を表わす。Ｘ値およびＹ値をすべて入力すると、Ｂｏｔｔｏｍ、Ｔｏｐ、およびＩＣ50の値が、そのプログラムを介し、内蔵の抑制モデル（すなわちＬｏｇ［抑制因子］対反応モデル）に適合させることによって自動的に求められた。
【０１８１】
結果
Ｂ１６細胞に対するＳＣＶ−０７の効果
Ｂ１６細胞の増殖に対するＳＣＶ−０７および陽性対照薬物の効果を測定した。計算されたＩＣ50値を表４．２に列挙する。生データならびに計算された平均およびＳＤを付録４．１〜４．４に示す。ＳＣＶ−０７の濃度−抑制曲線は本質的に平坦であり、Ｂ１６細胞に対するＳＣＶ−０７の細胞毒性効果（すなわち細胞増殖の抑制）がないことを表わしている。ＤＴＩＣは当初、陽性対照として使用された。しかしながら、細胞毒性効果はより高い濃度（すなわち２５０および５００μｇ／ｍＬ）でのみ顕著であり、ＩＣ50は、曲線が収束していないため、定められなかった。これはおそらく、肝細胞に依存した活性化がＤＴＩＣにないことによるものである。５−Ｆｕについては、０．２〜２０μｇ／ｍＬの濃度範囲で、細胞成長の抑制が観察された。５０および１００μｇ／ｍＬで細胞死滅が引起された。それにより、これら２つの濃度はＩＣ50分析から除外された。５−Ｆｕについて、ＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて０．２６、０．３８、および０．２６μｇ／ｍＬであると判断された。これに対し、ＳＣＶ−０７については、ＩＣ50値は、その濃度−抑制曲線の不適合度のため、得られなかった。
【０１８２】
【表４６】
【０１８３】
ＬＬＣ細胞に対するＳＣＶ−０７の効果
ＬＬＣ細胞の増殖に対するＳＣＶ−０７およびシスプラチン（陽性対照薬物）の効果を測定した。計算されたＩＣ50値を表４．３に列挙する。生データならびに計算された平均およびＳＤを付録４．５〜４．７に示す。ＳＣＶ−０７の濃度−抑制曲線は本質的に平坦であり、ＬＬＣ細胞における細胞毒性がないことを表わしている。これに対し、シスプラチンについては、１．０μｇ／ｍＬ以上の濃度で細胞毒性効果が観察された。シスプラチンについてのＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて３．２６、３．０７、および３．１０μｇ／ｍＬであった。一方、ＳＣＶ−０７については、ＩＣ50値は、その濃度−抑制曲線の不適合度のため、得られなかった。
【０１８４】
【表４７】
【０１８５】
ＲｅｎＣａ細胞に対するＳＣＶ−０７の効果
ＲｅｎＣａ細胞の増殖に対するＳＣＶ−０７および５−Ｆｕ（陽性対照薬物）の効果を測定した。計算されたＩＣ50値を表４．４に列挙する。生データならびに計算された平均およびＳＤを付録４．８〜４．１０に示す。ＳＣＶ−０７の濃度−抑制曲線は本質的に平坦であり、ＲｅｎＣａ細胞におけるＳＣＶ−０７の細胞毒性がないことを表わしている。一方、５−Ｆｕについては、０．０５〜１０μｇ／ｍＬの濃度範囲で細胞毒性効果が観察された。２０．５０、および１００μｇ／ｍＬで細胞死滅が引起された。それにより、これら３つの濃度はＩＣ50分析から除外された。５−ＦｕについてのＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて０．０３、０．０４、および０．０４μｇ／ｍＬであった。これに対し、ＳＣＶ−０７については、ＩＣ50値は、その濃度−抑制曲線の不適合度のため、得られなかった。
【０１８６】
【表４８】
【０１８７】
結果および論議
５−Ｆｕおよびシスプラチンの治療は、対応する細胞株において細胞増殖の著しい抑制をもたらし、試験化合物の潜在的な細胞毒性を判断するのにこのアッセイを使用する正当性を認めている。Ｂ１６細胞の増殖を抑制する５−ＦｕについてのＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて０．２６、０．３８、および０．２６μｇ／ｍＬであると概算された。ＲｅｎＣａ細胞では、５−ＦｕについてのＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて０．０３、０．０４、および０．０４μｇ／ｍＬであると概算された。ＬＬＣ細胞の増殖を抑制するシスプラチンについてのＩＣ50値は、３つのアッセイにおいて３．２６、３．０７、および３．１０μｇ／ｍＬであると概算された。ＤＴＩＣについては、より高い濃度（すなわち２５０および５００μｇ／ｍＬ）で細胞毒性効果は顕著であった。より低い濃度でははっきり認められるほどの細胞毒性がＤＴＩＣにはないことは、アッセイには含まれていなかった肝細胞によって、ＤＴＩＣのより有毒な代謝物への代謝的変換が要求されていることと一致する。
【０１８８】
陽性対照薬物による顕著な細胞毒性とはまったく対照的に、ＳＣＶ−０７は、培養されたＢ１６、ＬＬＣ、またはＲｅｎＣａ細胞において培養増殖の抑制をもたらさなかった。ＳＣＶ−０７についてのＩＣ50値は、その濃度−抑制曲線の不適合度のため、得られなかった。
【０１８９】
ＳＣＶ−０７に細胞毒性効果がないことは、免疫系の活性化を通して効果を発揮する典型的な免疫調節剤についての作用のメカニズムと一致する。しかしながら、ＳＣＶ−０７から由来する代謝物の細胞毒性効果はまだ突き止められていないことに留意すべきである。ＤＴＩＣと同様に、ＳＣＶ−０７の肝細胞によって中和される代謝活性化は、細胞毒性効果の必要条件かもしれない。ＳＣＶ−０７代謝物を用いた、または肝細胞および腫瘍細胞からなる細胞培養系を用いた研究は、腫瘍治療に対するＳＣＶ−０７の作用のメカニズムにおける細胞毒性の役割をさらに定義するのに役立つかもしれない。
【０１９０】
結論として、この研究は、現在の実験条件下では、ＳＣＶ−０７が、培養されたＢ１６、ＬＬＣ、およびＲｅｎＣａ腫瘍細胞に対して体外細胞毒性効果を有していないことを実証した。
【０１９１】
【表４９】
【０１９２】
【表５０】
【０１９３】
【表５１】
【０１９４】
【表５２】
【０１９５】
【表５３】
【０１９６】
【表５４】
【０１９７】
【表５５】
【０１９８】
【表５６】
【０１９９】
【表５７】
【０２００】
【表５８】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における、肺ガン、その転移、または肺における肺外部のガンからの転移を治療し、少なくとも部分的に予防し、抑制し、または減少させるための、もしくは、肺ガン細胞の成長、その転移、または肺における肺外部のガン細胞からのガン細胞の転移を治療し、少なくとも部分的に予防し、抑制し、または減少させるための治療の方法であって、有効量の式Ａの免疫調節剤化合物を被験者に投与するステップを含み、
【数１】
式中、ｎは１または２であり、Ｒは水素、アシル、アルキル、またはペプチド断片であり、Ｘは芳香族または複素環アミノ酸もしくはその誘導体であり、被験者における、前記肺ガン、その前記転移、または肺における肺外部のガンからの前記転移を治療し、少なくとも部分的に予防し、抑制し、または減少させるようにし、もしくは、前記肺ガン細胞の成長、その前記転移、または前記肺における肺外部のガン細胞からのガン細胞の前記転移を治療し、少なくとも部分的に予防し、抑制し、または減少させるようにする、方法。
【請求項２】
ＸはＬ−トリプトファンまたはＤ−トリプトファンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物はＳＣＶ−０７である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物は、約０．００１〜１０００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物は、約０．０１〜１００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物は、被験者の体重１ｋｇにつき約０．００００１〜１０００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物は、被験者の体重１ｋｇにつき約０．０１〜１００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物はＳＣＶ−０７であり、約０．００１〜１０００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物はＳＣＶ−０７であり、被験者の体重１ｋｇにつき約０．００００１〜１０００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療は原発性肺ガン用である、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物は、約０．００１〜１０００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物は、約０．１〜１００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物は、被験者の体重１ｋｇにつき約０．００００１〜１０００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物は、被験者の体重１ｋｇにつき約０．０１〜１００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療は肺ガン転移用である、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物は、約０．００１〜１０００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物は、約０．１〜１００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物は、被験者の体重１ｋｇにつき約０．００００１〜１０００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物は、被験者の体重１ｋｇにつき約０．０１〜１００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記投与量は約１０ｍｇである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与量は約１０ｍｇである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
式Ａの前記化合物は、放射線および化学療法製剤のうち、少なくとも１つの投与を追加的に含む治療計画において投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記化学療法製剤は、シスプラチン、５−ＦｕおよびＤＴＩＣのうち、少なくとも１つを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項１】
被験者における、肺ガン、その転移、または肺における肺外部のガンからの転移を治療し、少なくとも部分的に予防し、抑制し、または減少させるための、もしくは、肺ガン細胞の成長、その転移、または肺における肺外部のガン細胞からのガン細胞の転移を治療し、少なくとも部分的に予防し、抑制し、または減少させるための治療の方法であって、有効量の式Ａの免疫調節剤化合物を被験者に投与するステップを含み、
【数１】
式中、ｎは１または２であり、Ｒは水素、アシル、アルキル、またはペプチド断片であり、Ｘは芳香族または複素環アミノ酸もしくはその誘導体であり、被験者における、前記肺ガン、その前記転移、または肺における肺外部のガンからの前記転移を治療し、少なくとも部分的に予防し、抑制し、または減少させるようにし、もしくは、前記肺ガン細胞の成長、その前記転移、または前記肺における肺外部のガン細胞からのガン細胞の前記転移を治療し、少なくとも部分的に予防し、抑制し、または減少させるようにする、方法。
【請求項２】
ＸはＬ−トリプトファンまたはＤ−トリプトファンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物はＳＣＶ−０７である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物は、約０．００１〜１０００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物は、約０．０１〜１００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物は、被験者の体重１ｋｇにつき約０．００００１〜１０００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物は、被験者の体重１ｋｇにつき約０．０１〜１００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物はＳＣＶ−０７であり、約０．００１〜１０００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物はＳＣＶ−０７であり、被験者の体重１ｋｇにつき約０．００００１〜１０００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療は原発性肺ガン用である、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物は、約０．００１〜１０００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物は、約０．１〜１００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物は、被験者の体重１ｋｇにつき約０．００００１〜１０００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物は、被験者の体重１ｋｇにつき約０．０１〜１００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療は肺ガン転移用である、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物は、約０．００１〜１０００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物は、約０．１〜１００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物は、被験者の体重１ｋｇにつき約０．００００１〜１０００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物は、被験者の体重１ｋｇにつき約０．０１〜１００ｍｇの範囲内の投与量で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記投与量は約１０ｍｇである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与量は約１０ｍｇである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
式Ａの前記化合物は、放射線および化学療法製剤のうち、少なくとも１つの投与を追加的に含む治療計画において投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記化学療法製剤は、シスプラチン、５−ＦｕおよびＤＴＩＣのうち、少なくとも１つを含む、請求項２２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１０−５３６８５４（Ｐ２０１０−５３６８５４Ａ）
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５２１８７６（Ｐ２０１０−５２１８７６）
【出願日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００９９３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２５８３０
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（５９３１９９５６３）サイクローン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (17)
【氏名又は名称原語表記】ＳｃｉＣｌｏｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】９５０ Ｔｏｗｅｒ Ｌａｎｅ， Ｓｕｉｔｅ ９００， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４４０４， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００９９３２
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０２５８３０
【国際公開日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【出願人】（５９３１９９５６３）サイクローン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド (17)
【氏名又は名称原語表記】ＳｃｉＣｌｏｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】９５０ Ｔｏｗｅｒ Ｌａｎｅ， Ｓｕｉｔｅ ９００， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９４４０４， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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