本出願には、患者における肺疾患を特徴づけるための血清バイオマーカーまたは血漿バイオマーカーとして使用することができるｍｉＲＮＡが記載されている。これらのｍｉＲＮＡバイオマーカーは、肺がんなどの疾患を診断、予後判定、またはモニターするために、単独で、または、他のマーカーと組み合わせて使用することができる。一実施形態では、肺腫瘍または肺病変を有する患者において肺がんを特徴づけるための方法は、血清試料中のｍｉＲＮＡのレベルを測定するステップと、試料中のｍｉＲＮＡのレベルの低下または上昇を決定し、それによって患者における肺がんを特徴づけるステップとを含む。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００９年８月２８日に出願された米国仮特許出願６１／２３７，９７２号への優先権を主張し、この米国仮特許出願は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本願に記載される研究は、国立癌研究所／NIH助成金番号１R43CA１４１７８６−０１の下、合衆国政府により一部支援された。したがって、合衆国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
米国では、全てのがんの中で、肺がんの発生率が最も高く、かつ死亡率が最も高い（ｈｔｔｐ：／／ｓｅｅｒ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ／）。肺がんは、２種の主要なクラス：小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）に分けられ、前者は患者の２０％、後者は８０％が罹患している。ＮＳＣＬＣは３種の主要な亜型：腺癌、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、および大細胞癌からなり、腺癌および扁平上皮癌が大部分を占めている（非特許文献１；非特許文献２）。推定で２１５，０００件の肺がんの新規の症例、およびおよそ１６２，０００件の肺がんによる死が、２００８年中に米国で起こった（非特許文献３）。肺がんの高死亡率は、一部は、肺がん患者の７５％超が、最初に提示されるときに領域転移または遠隔転移が一緒に診断されるという事実に、および一部は、肺がんに対する高度に有効な療法がないことに起因している。肺がんに対する現在通用している治療の選択肢は限られているが、最も早い段階で診断された患者は、５年生存の見込みが、後期に診断された患者（＜１０％）よりも良好である（５０％）ことが示されている（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｓｅｅｒ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ；非特許文献４を参照されたい）。したがって、広範囲にわたる取り組みは、医療介入によって生存を改善することができるように、肺がんを初期に検出することを対象としてきた。
【０００４】
肺がんの危険因子としては、年齢および喫煙によるタバコの摂取（直接的な、および間接的な）が挙げられる。肺がんの全症例のおよそ９０％は喫煙者において発生する。さらに、肺がんの発生率および死亡率の両方で、男性と女性との間に有意差が存在し、これは、２つの性の間の固有の生物学的プロセスの可能性を示唆している。これらの差は、最も一貫して報告されている肺がんにおける重要な危険因子の１つである（非特許文献５）。
【０００５】
肺がんをより早い段階で検出するために設計された、いくつかのスクリーニング試験が着手されている。これらの試験の多くでは、２つの主要な画像処理技術：胸部Ｘ線およびコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）が使用されている。胸部Ｘ線により、肺がんを検証し、分類するために生検することができる肺の腫瘤が明らかになり得る。画像処理技術における改善、中でも、スパイラルコンピュータ断層撮影法（スパイラルＣＴ）の開発により、臨床医が前駆症状性の個体において小さな肺腫瘍を検出することが可能になった。Ｔｈｅ Ｅａｒｌｙ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ａｃｔｉｏｎ ｐｒｏｊｅｃｔ（ＥＬＣＡＰ）は、症状がない、危険性が高い喫煙者を、胸部Ｘ線および低用量ＣＴを使用してスクリーニングするために設計され、それにより、ＣＴによって、小さな、潜在的に治癒できる病変の検出が大きく改善されたことが示された（非特許文献６）。しかし、主要な不都合は、偽陽性率、およびスクリーニングの枠組みでは正当化するのが難しい高費用（平均＄６００）であった。同文献；非特許文献７も参照されたい。
【０００６】
これらの試験は、科学界の内部で、試験の設計、特に無作為化が欠如していることを中心に置いた激しい議論を生み、費用が高いことおよび偽陽性率が高いことの懸念を伴う結論が引き出された（非特許文献６；非特許文献８）。喫煙者および以前喫煙していた者のスパイラルＣＴスキャンの２５〜６０パーセントが良性の異常を示す（非特許文献９）。無症候性患者の画像処理スクリーニングでは良性病変と早期悪性病変が区別されない。低用量ＣＴスキャンに繰り返し曝露することにより、患者は潜在的に有害なレベルの放射線に曝露する恐れがあることも報告されている（非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｅｋｉｄｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１３７８巻：Ｆ２１〜５９頁
【非特許文献２】Ｆｏｒｇａｃｓら、Ｐａｔｈｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｓ、７巻、６〜１３頁（２００１年）
【非特許文献３】Ｊｅｍａｌら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、１００巻、１６７２〜９４頁（２００８年）
【非特許文献４】Ｈｏｒｎｅｒら（編）ＳＥＥＲ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ Ｒｅｖｉｅｗ、１９７５年〜２００６年、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ． Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ
【非特許文献５】Ｖｉｓｂａｌら、Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ、７８巻、２０９〜１５頁（２００４年）
【非特許文献６】Ｈｅｎｓｃｈｋｅら、Ｌａｎｃｅｔ、３５４巻、９９〜１０５頁（１９９９年）
【非特許文献７】Ｈｅｎｓｃｈｋｅら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５５巻、１７６３〜７１頁（２００６年）
【非特許文献８】Ｇｏｕｌｄら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ、３５６巻、７４３〜７４７頁（２００７年）
【非特許文献９】Ｓｗｅｎｓｅｎら、Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ、１６５巻、５０８〜１３頁（２００２年）
【非特許文献１０】Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ、２３１巻、４４０〜５頁（２００４年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在のところ、がんを含めた肺疾患を非侵襲的に検出するため、療法に対する応答をモニターするため、または、肺がんの再発を検出するための、臨床的に関連性のあるマーカーが依然として必要とされている。そのようなアッセイは、妥当な感度を伴って高度に特異的でなければならず、かつ妥当な費用で容易に入手可能でなければならないことも明らかである。循環バイオマーカーにより、以下の有利な点を有する、画像処理に対する代替物が提供される：１）低侵襲的に発見され、基準検体（血液または血液由来の体液）を採取しやすいこと、２）対象においてある期間にわたって頻繁にモニターして正確なベースラインを確立することができ、それによってある期間にわたる変化を検出することが容易になること、３）適度に低い費用で準備することができること、４）高価で潜在的に有害なＣＴスキャンを繰り返し受ける患者の数を限定することができること、および／または５）ＣＴスキャンとは異なり、バイオマーカーでは無痛性の肺病変と攻撃的な肺病変とを潜在的に区別できること（例えば、ＧｒｅｅｎｂｅｒｇおよびＬｅｅ、Ｏｐｉｎ Ｐｕｌｍ Ｍｅｄ、１３巻、２４９〜５５頁（２００７年）を参照されたい）。
【０００９】
現存するバイオマーカーアッセイとしては、いくつかの血清タンパク質マーカー、例えば、ＣＥＡ（Ｏｋａｄａら、Ａｎｎ Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ、７８巻、２１６〜２１頁（２００４年））、ＣＹＦＲＡ２１−１（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ａｄｖ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ、４２巻、１〜４１頁（２００６年））、ＣＲＰ（Ｓｉｅｍｅｓら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ、２４巻、５２１６〜２２頁（２００６年））、ＣＡ−１２５（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、２００６年）など、および神経特異的エノラーゼおよび扁平上皮癌抗原（Ｓｉｅｍｅｓら、２００６年）が挙げられる。良性の肺疾患に起因して感度および特異度が低く、著しい数の偽陽性の結果が伴うことにより、これらのアッセイの適用は制限されている。
【００１０】
ＤＮＡおよびｍＲＮＡなどの循環核酸も、肺がんに対する可能性のある診断マーカーとして評価されている。これらの試験は、循環核酸が、がんを示唆する示差的な発現を示すという知見に基づく（例えば、Ｂｒｅｍｎｅｓら、Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ、４９巻、１〜１２頁（２００５年）；Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｃｅｌｌ、１２０巻、６３５〜４７頁（２００５年）；Ｙａｎａｉｈａｒａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、９巻、１８９〜９８頁（２００６年）；Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、１８巻、９９７〜１００６頁（２００８年）；Ｆａｂｂｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｊ、１４巻、１〜６頁（２００８年）；Ｇａｒｏｆａｌｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２７巻、３８４５〜５５頁（２００８年）；Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、１０５巻、１０５１３〜８頁（２００８年）；Ｓｃｈｉｃｋｅｌら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２７巻、５９５９〜７４頁（２００８年）；Ｗｅｉｓｓら、Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ、１９巻、１０５３〜９頁（２００８年）；およびＹｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、１３巻、４８〜５７頁（２００８年）を参照されたい）。循環中の遊離ＤＮＡの起源は、完全には理解されていないが、損傷を受けた（アポトーシス性の、壊死性の）腫瘍細胞から残った安定な画分を表していると考えられている（Ｊａｈｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６１巻、１６５９〜６５頁（２００１年）；Ｂｉａｎｃｈｉ、Ｐｌａｃｅｎｔａ、２５巻増補Ａ：Ｓ９３〜Ｓ１０１頁（２００４年））。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、本明細書に、血清または血漿からのｍｉＲＮＡを測定することによって肺疾患を検出、診断、またはモニターするための方法について記載する。
【００１２】
一部の実施形態では、本発明は、血清または血漿からｍｉＲＮＡを検出することによって小細胞肺がんまたは非小細胞肺がんなどの肺疾患を検出またはモニターすることに関する。本発明の方法は、疾患を診断するため、および／または肺疾患の予後または攻撃性を評価するために使用することができるバイオマーカーを検出することを含む。さらに、この方法は、肺疾患の進行を特徴づけるために使用することができる。ある特定の実施形態では、本発明の方法を使用して、患者における肺腫瘍または肺病変が癌性であるか、良性であるかを決定することができる。本発明の方法を使用して試験される患者は、当技術分野で公知の他の方法を使用して試験することもできる。
【００１３】
本発明のある特定の実施形態では、診断または予後判定は、肺疾患の対象の血清中または血漿中に存在するレベルが上昇または低下しているｍｉＲＮＡの量を測定することによって実現することができる。ある場合には、肺疾患を特徴づけるために１種の血清ｍｉＲＮＡまたは血漿ｍｉＲＮＡを検出（例えば、増幅および測定）することができ、一方他の実施形態では、２種以上のｍｉＲＮＡを血清または血漿から検出する。一部の実施形態は、ｍｉＲＮＡの対を検出することを含む。ある場合には、肺疾患または肺がんの患者の血清または血漿において、対の一方のｍｉＲＮＡは上昇していて、対の他方のｍｉＲＮＡは低下している。別の状況では、対のｍｉＲＮＡの両方が上昇していてよい、または両方が低下していてよい。ある特定の実施形態では、タンパク質マーカーなどの非ｍｉＲＮＡバイオマーカーも測定することができる。本発明の一部の実施形態は、肺がんを診断または予後判定すること、または患者における肺がんの種類を決定することに関する。一部の実施形態では、患者は、以前に肺疾患についてスクリーニングされたことがある。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態が本出願全体を通して記載されている。本発明の他の目的、特徴、および有利な点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。本発明の１つの態様に関して記載された任意の実施形態は、同様に本発明の他の態様に当てはまり、逆もまた同じである。実施例の節における実施形態は、本発明の全ての態様に適用可能な本発明の実施形態であることが理解される。
【００１５】
しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の特定の実施形態を示しているが、単に例証として示されており、故に、本出願から、本発明の主旨および範囲内のさまざまな変化および改変が当業者に明らかになるであろうことが理解されるべきである。
【００１６】
以下の図は本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図の１つまたは複数を、本明細書で提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによってよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、肺がんについてのマウスモデルに対する研究デザインの概略図である。Ａ／Ｊマウス１１５匹に、ベンゾ（ａ）ピレンを指示用量で経口的な胃管栄養によって、時間（０）において、および最初の胃管栄養の１０週後に投与した。対照マウス１０匹に、週／０日目において発癌物質を伴わない綿実油２００μｌの経口胃管栄養を受けさせた。各時点で屠殺したマウスの数が、矢印の下に示されている。残りのマウスから、１８週までは２週間ごとに、その後は４週間ごとに血を取った。３４週目の終わりに、残りのマウス全てを屠殺した。
【図２Ａ】図２Ａは、肺腫瘍を発症したマウスおよび対照マウスにおける、血漿ｍｉＲＮＡ ｍｉＲ−１８３およびｍｉＲ−１８２の発現の時間的変化を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、肺腫瘍を発症したマウスおよび対照マウスにおける、血漿ｍｉＲＮＡ ｍｉＲ−３６５およびｍｉＲ−１４１の発現の時間的変化を示す。
【図３】図３は、実施例５に記載の、線形判別分析（ＬＤＡ）分類器についての曲線下面積（ＡＵＣ）値の分布を、バイオマーカーの数の関数として示す。この手順により、分類器に使用するための最適なバイオマーカーの数が決定する。黒塗りの丸は、訓練セットからの結果を表し；白抜きの三角形は、試験セットからの結果を表す。垂直の破線は、性能が横ばい状態になるところである。平均ＡＵＣの最大値は特徴の数＝９のところである。
【図４】図４は、実施例５の線形判別分析からの訓練データ、試験データの性能評価を示す。ＳＥＮは感度であり；ＳＰＥＣは特異度であり、ＮＰＶは陰性的中率であり；ＰＰＶは陽性的中率である。６種の示差的なｍｉＲＮＡの対を使用した：ｍｉＲ−１４２−５ｐとｍｉＲ１８１ｄ；ｍｉＲ−１４２−３ｐとｍｉＲ１８１ｄ；ｍｉＲ−１４２−３ｐとｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１４２−５ｐとｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−９２とｍｉＲ−２７ｂ；およびｍｉＲ−２４とｍｉＲ−２７ａ。
【図５Ａ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｂ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｃ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｄ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｅ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｆ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｇ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｈ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｉ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｊ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｋ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｌ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｍ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｎ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｏ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｐ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｑ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｒ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｓ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｔ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【図５Ｕ】図５は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ＤａｔａｂａｓｅのＲｅｌｅａｓｅ １３．０（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）によって提供されたヒト前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）の配列を示す（掲載順に、それぞれ配列番号１〜３２３）。表１〜５からの成熟ｍｉＲＮＡの名称も提供されている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ある特定の態様では、本発明の方法は、血清試料中または血漿試料中のｍｉＲＮＡの量を増幅し、測定し、それによって肺疾患を特徴づけるためのアッセイを提供する。
【００１９】
本発明を理解することの助けとなるように、ある特定の用語を最初に定義している。追加的な定義が本出願全体を通して提供される。
【００２０】
本明細書で使用される、「マイクロＲＮＡ」（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）という用語は、天然に存在し得る、ヒトｍｉＲＮＡ、成熟一本鎖ｍｉＲＮＡ、前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲ）、およびその変異体を含む。ある場合には、「ｍｉＲＮＡ」という用語は、一次ｍｉＲＮＡ転写物および２重鎖ｍｉＲＮＡも含む。特に断りのない限り、本明細書で使用される場合、特定のｍｉＲＮＡの名称は、前駆体ｍｉＲＮＡの成熟ｍｉＲＮＡを指す。例えば、ｍｉＲ−１２２ａは、プレｍｉＲ−１２２から導かれる成熟ｍｉＲＮＡ配列を指す。ヒトの成熟配列および前駆体配列を含めた特定のｍｉＲＮＡの配列は、ｍｉＲＢａｓｅ：：Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ（２０１０年４月に公開された第１５版）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００８年、３６巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１５４〜Ｄ１５８頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６年、３４巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１４０〜Ｄ１４４頁；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００４年、３２巻、Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ、Ｄ１０９〜Ｄ１１１頁）に報告されている。ある特定のｍｉＲＮＡに関しては、単一の前駆体が２種以上の成熟ｍｉＲＮＡ配列を含有する。他の例では、多数の前駆体ｍｉＲＮＡが同じ成熟配列を含有する。ある場合には、成熟ｍｉＲＮＡは、新しい科学的コンセンサスに基づいて改めて命名されている。例えば、本明細書で使用されるｍｉＲ−２１３は、プレｍｉＲ−１８１ａ−１からの成熟ｍｉＲＮＡを指し、ｍｉＲ−１８１ａ^＊とも称される。改めて命名された他のｍｉＲＮＡとしては、プレｍｉＲ−２４−１に由来するｍｉＲ−１８９（ｍｉＲ−２４^＊とも称される）；ｍｉＲ−３６８（ｍｉＲ−３７６ｃとも称される）；およびｍｉＲ−４２２ｂ（ｍｉＲ−３７８^＊とも称される）が挙げられる。当業者は、所与のｍｉＲＮＡについての、具体的には成熟型のｍｉＲＮＡについての正確な核酸配列に関する科学的コンセンサスは時間とともに変化し得ることを理解されたい。本出願のアッセイによって検出されるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの天然に存在する配列を含む。
【００２１】
「特徴づけること」という用語は、本明細書では検出および予後判定を包含するために使用され、疾患の診断上または予後判定上の決定または予測を行うためにｍｉＲＮＡを検出することを含む。ある場合には、特徴づけにより、対象ががんなどの肺疾患を有するかどうかが同定される、または病態が決定される。さらに、本明細書の方法に従ってｍｉＲＮＡを検出することは、肺がんの患者と他の肺疾患を有する患者とを区別するため、または、肺腫瘍を有する患者ががんを有するかどうかを決定するために使用することができるｍｉＲＮＡの量を測定することを含む。別の状況では、「特徴づけること」は、肺がんなどの病態の病期または攻撃性を決定するため、または肺疾患に対する適切な治療方法を決定するために、ｍｉＲＮＡを検出することを含む。
【００２２】
「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」または「ｔｈｅ（その）」という単語の使用は、特許請求の範囲および／または本明細書において「含む」という用語と同時に使用される場合、「ｏｎｅ（１つの）」を意味する場合があるが、「１つまたは複数の」「少なくとも１つの」および「１つ以上の」という意味とも一致する。
Ｉ．試料
血清は、一般には、流動性の、凝固した血液の非細胞部分である。血漿も非細胞の血液試料であるが、血清とは異なり、血漿は凝固因子を含有する。一部の実施形態では、血清試料または血漿試料は以前に肺疾患について別の診断方法を使用してスクリーニングされたヒト患者から得られる。種々の実施形態では、血清試料または血漿試料は、腫瘍または肺病変に対して検査結果が陽性であった患者から得られる。ある特定の実施形態では、患者は、例えば、胸部Ｘ線またはＣＴスキャンによる画像処理検出を受けたことがある。他の実施形態では、方法は、肺疾患についての画像処理結果が陽性である患者においてｍｉＲＮＡを検出することを含む。一部の場合では、試料は、肺腫瘍または肺病変を有する患者から得られる。腫瘍または病変は、胸部Ｘ線もしくはＣＴスキャンによって、または、当技術分野で公知の他の画像処理方法または検出方法によって検出されたことがあってよい。さらなる実施形態は、肺疾患に対する治療を以前受けた、または現在受けている患者からの試料中のｍｉＲＮＡを測定することを含む。さらなる実施形態では、試料は、肺がんを有する疑いがある、または肺がんを発症する危険性がある患者からのものである。アッセイのために得、使用する血漿または血清の体積は、臨床的な目的に応じて変動してよい。
【００２３】
当業者は、血清試料を得、調製するための多くの方法が存在することを理解されよう。一般に、血液は、標準の方法を使用して採取管中に抜き取り、凝固させる。次いで凝固した血液の細胞部分から血清を分離する。一部の方法では、シリカ粒子などの凝固活性化因子を採血管に加える。他の方法では、血液は凝固を容易にするために処置しない。採血管は、多くの供給源から、さまざまな形式で市販されている（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）チューブＳＳＴ（商標）、ガラス血清チューブ、またはプラスティック血清チューブ）。
【００２４】
一部の方法では、血液を静脈穿刺によって採取し、抜き取った後３時間以内に処理して溶血を最小限にし、血液中のインタクトな細胞からのｍｉＲＮＡの放出を最小にする。一部の方法では、血液は、使用するまで氷上で保存する。血液は、遠心分離によって分別して細胞構成成分を除去することができる。一部の実施形態では、血清を調製するための遠心分離は、少なくとも５００×Ｇ、１０００×Ｇ、２０００×Ｇ、３０００×Ｇ、４０００×Ｇ、または５０００×Ｇのスピードであってよい。ある特定の実施形態では、血液を少なくとも１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、９０分間、１２０分間、または１５０分間インキュベートして凝固させることができる。他の実施形態では、血液を最大３時間インキュベートする。血漿を使用する場合、細胞構成成分および無細胞構成成分を分離する前に血液を凝血させない。血清または血漿は、血液の細胞部分から分離した後、さらにアッセイするまで凍結させることができる。
【００２５】
分析前に、当技術分野で公知の方法を使用して、ＲＮＡを血清または血漿から抽出し、精製することができる。全ＲＮＡを単離するための、またはｍｉＲＮＡを含めた低分子ＲＮＡを特異的に抽出するための多くの方法が公知である。ＲＮＡは、市販のキット（例えば、Ｐｅｒｆｅｃｔ ＲＮＡ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｆｉｖｅ Ｐｒｉｍｅ−Ｔｈｒｅｅ Ｐｒｉｍｅ，Ｉｎｃ．；ｍｉｒＶａｎａ（商標）キット、Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を使用して抽出することができる。あるいは、哺乳動物の細胞内ＲＮＡまたはウイルスＲＮＡを抽出するためのＲＮＡ抽出方法を、公開された通りに、または改変を伴って、血漿および血清からＲＮＡを抽出するために適合させることができる。ＲＮＡは、米国特許出願公開第２００８／００５７５０２号に記載の方法または適応において見られるように、シリカ粒子、ガラスビーズ、または珪藻を使用して血漿または血清から抽出することができる。
【００２６】
ＩＩ．肺疾患に対するｍｉＲＮＡマーカー
本発明のある特定の実施形態は、肺疾患に対するマーカーとしての血清ｍｉＲＮＡまたは血漿ｍｉＲＮＡを提供する。一部の実施形態では、肺疾患の患者の血清中および／または血漿中に存在するレベルが上昇しているｍｉＲＮＡを、マーカーとして使用する。他の実施形態では、レベルが低下しているｍｉＲＮＡをマーカーとして使用する。一部の実施形態では、血清または血漿からの２種以上のｍｉＲＮＡをマーカーとして使用することになる。２種以上のｍｉＲＮＡバイオマーカーを使用する場合、全てのｍｉＲＮＡのレベルが上昇していてよい、全てのｍｉＲＮＡのレベルが低下していてよい、または、レベルが上昇しているｍｉＲＮＡとレベルが低下しているｍｉＲＮＡの混合物を使用することができる。
【００２７】
「レベルが低下している」または「レベルが上昇している」という用語は、患者を試験している対象の肺疾患を有さないコホートまたは複数のコホートからの血清中または血漿中のｍｉＲＮＡの量と比較した、患者からの血清試料中または血漿試料中のｍｉＲＮＡの量を指す。例えば、肺がん患者の血清においてレベルが低下しているｍｉＲＮＡは、肺がん患者の血清において、肺がんを有さないドナー（例えば、良性腫瘍を有する患者または正常な患者）からの血清におけるよりも低量で存在している。ある特定のｍｉＲＮＡに関しては、患者の血清試料または血漿試料においてレベルが上昇していることにより、肺疾患の存在または予後が示される。別のｍｉＲＮＡは、肺疾患の患者において存在するレベルが低下している。
【００２８】
肺疾患は、がんおよび良性の状態を含む。肺がんは、肺の悪性腫瘍を指し、小細胞肺がんまたは非小細胞肺がんに分類することができる。一部の実施形態では、非小細胞肺がんは、さらに腺癌、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、および大細胞癌として特徴づけることができる。さらに、がんは、Ｘ線またはＣＴスキャンの結果、攻撃性、病状、および非ｍｉＲＮＡバイオマーカーの測定値、ならびに当技術分野で公知の他の方法に基づいて分類することができる。ある特定の態様では、肺がんは、ＴＮＭ則（Ｔ−原発腫瘍、Ｎ−所属リンパ節、Ｍ−遠隔転移）および／または病期０期、ＩＡ期、ＩＢ期、ＩＩＡ期、ＩＩＢ期、ＩＩＩＡ期、ＩＩＩＢ期またはＩＶ期によって分類される（例えば、Ｌａｂａｂｅｄｅら、Ｃｈｅｓｔ、１１５巻、２３３〜２３５頁（１９９９年）を参照されたい）。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、患者における肺疾患を少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の感度で特徴づけることができる。感度の程度は、疾患を有すると陽性に特徴づけられる、疾患の患者の百分率を示す。さらなる実施形態では、方法は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の特異度（例えば、正確に特徴づけられている非疾患の患者の百分率）を有する。アッセイパラメータを調整して、感度および特異度の両方について最適化することができる。
【００２９】
ある場合では、ｍｉＲＮＡマーカーのレベルを対照と比較して、レベルが低下したか、または上昇したかどうかを決定する。対照は、外部対照、例えば、肺疾患がないことが既知である対象からの血清試料中または血漿試料中のｍｉＲＮＡなどであってよい。外部対照は、正常な（非疾患の）対象からの試料または良性の肺疾患の患者からの試料であってよい。別の状況では、外部対照は、組織試料のような非血清試料からのｍｉＲＮＡまたは既知量の合成ＲＮＡであってよい。外部対照は、プールされた試料、平均試料、または個々の試料であってよい；外部対照は、測定されているｍｉＲＮＡと同じｍｉＲＮＡまたは異なるｍｉＲＮＡであってよい。内部対照は、試験されている試料と同じ血清試料または血漿試料からのマーカー、例えば、ｍｉＲＮＡの対照などであってよい。例えば、その全体が参照により組み込まれる、米国特許出願公開第２００９／００７５２５８号を参照されたい。
【００３０】
表１に肺疾患の患者からの血清においてレベルが上昇または低下しているｍｉＲＮＡを列挙している。これらのｍｉＲＮＡは、本発明に従って使用することができる。ｍｉＲＮＡのいくつかは、がんの種類を区別すること、および／またはがんと良性の肺疾患とを区別することを含めて、肺がんを特徴づけるために有用である。さらに、一部のｍｉＲＮＡを使用して、肺がんの攻撃性または転帰を予測することができる。
表１． 肺がんの患者からの血清においてレベルが上昇または低下しているｍｉＲＮＡ。レベルは、良性の腫瘍または病変を有する患者と比較した、肺がん患者におけるｍｉＲＮＡのレベルである。
【００３１】
【表１】

ある特定の実施形態では、１種の血清ｍｉＲＮＡを使用して肺疾患および／または肺がんを検出する、診断する、特徴づける、またはモニターする。他の実施形態では、２種以上のｍｉＲＮＡをマーカーとして使用する。さらなる実施形態では、２種以上のｍｉＲＮＡを使用して肺疾患を特徴づける。ある特定の実施形態では、本発明の方法において少なくとも２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、または１０種のｍｉＲＮＡを検出する。ある特定の方法では、肺疾患の患者からの血清または血漿においてレベルが低下しているｍｉＲＮＡを、バイオマーカーとして使用する。他の実施形態では、血清または血漿においてレベルが上昇しているｍｉＲＮＡを、バイオマーカーとして使用することができる。ある特定の実施形態では、患者は肺腫瘍または肺病変を有する。さらなる実施形態では、患者は、以前に肺疾患についてスクリーニングされたことがある。
【００３２】
一部の実施形態では、肺がんを診断するためのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−４９８、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２２２、およびｌｅｔ−７ｃから選択される。
【００３３】
ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｅ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５１、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３６１、ｍｉＲ−３６５、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−４３２、ｍｉＲ−４８５−３ｐ、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５０２、ｍｉＲ−５８４、ｍｉＲ−６３８、ｍｉＲ−６６０、ｍｉＲ−９２、およびｍｉＲ−９３から選択される。
【００３４】
さらなる実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２６^＊、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−５１８ｂ、およびｍｉＲ−９２から選択される。
【００３５】
他の実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲＮＡは、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ^＊、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３６５、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−４３２、ｍｉＲ−４８５−３ｐ、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−５０５、ｍｉＲ−５１８ｂ、ｍｉＲ−５２５、ｍｉＲ−５６６、ｍｉＲ−６０５、ｍｉＲ−６３８、ｍｉＲ−６６０、およびｍｉＲ−９３から選択される。
【００３６】
さらなる実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１２６^＊、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−４２２ｂ、ｌｅｔ−７ｉ、およびｌｅｔ−７ｇから選択される。
【００３７】
別の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４０、およびｍｉＲ−２０２から選択される。一部の実施形態では、これらのｍｉＲのうちの２種、３種、４種、５種、６種、７種、または８種を使用して、肺がんの患者と良性の肺腫瘍または病変を有する患者とを区別することができる。さらなる実施形態では、２種、３種、４種、５種、６種、７種、または８種のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、およびｍｉＲ−４２２ａから選択される。
【００３８】
ある特定の実施形態では、非がん試料と対照して肺がん試料を特徴づけるためのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−４２２ｂ、およびｍｉＲ−９２から選択される。非がん試料としては、良性の肺腫瘍または病変がある対象からの試料、または正常な対象からの試料が挙げられる。
【００３９】
ある特定の実施形態は、患者における肺疾患および／または肺がんを特徴づけるための方法であって、血清試料中のｍｉＲＮＡのレベルを測定するステップであって、ｍｉＲＮＡが、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ^＊、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３６５、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−４３２、ｍｉＲ−４８５−３ｐ、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−５０５、ｍｉＲ−５１８ｂ、ｍｉＲ−５２５、ｍｉＲ−５６６、ｍｉＲ−６０５、ｍｉＲ−６３８、ｍｉＲ−６６０、およびｍｉＲ−９３から選択されるステップと、試料中のｍｉＲＮＡのレベルの低下または上昇を決定し、それによって肺疾患または肺がんを特徴づけるステップと
を含む方法を含む。
【００４０】
表２に、肺疾患の患者からの血漿においてレベルが上昇または低下しているｍｉＲＮＡを列挙している。これらのｍｉＲＮＡは、本発明に従って使用することができる。
表２． 肺疾患の患者からの血漿においてレベルが上昇または低下しているｍｉＲＮＡ。レベルは、肺がんでない患者と比較した、肺がん患者におけるｍｉＲＮＡのレベルである。
【００４１】
【表２−１】

【００４２】
【表２−２】

一部の実施形態では、単一の血漿ｍｉＲＮＡを使用して肺がんを特徴づけることができる。他の実施形態では、肺がんを特徴づけるために、表２のｍｉＲＮＡの１つを単独で、または１つまたは複数の追加的なｍｉＲＮＡマーカーと組み合わせて使用することができる。
【００４３】
ある特定の実施形態では、方法により、肺がんと良性の肺疾患とが区別される。一部の場合では、少なくとも１種の測定されたｍｉＲＮＡが、良性の状態の患者または疾患がない患者と比較して、肺がん患者の血清または血漿において上昇している。一部の場合では、少なくとも１種の測定されたｍｉＲＮＡが低下している。ある特定の実施形態では、少なくとも１種の測定されたｍｉＲＮＡが上昇し、少なくとも１種のｍｉＲＮＡが低下している。他の実施形態では、少なくとも２種の上昇したｍｉＲＮＡまたは少なくとも２種の低下したｍｉＲＮＡが測定される。
【００４４】
ある特定の実施形態では、患者が肺がんを有するかどうかを決定するために、以下のｍｉＲＮＡの１つを少なくとも１種の他のｍｉＲＮＡバイオマーカーと組み合わせて使用する：ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２６^＊、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５１、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９３ａ、ｍｉＲ−１９９ａ^＊、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−４２２ｂ、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５１８ｂ、ｍｉＲ−６６０、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−９９ａ、またはｍｉＲ−９９ｂ。
【００４５】
他の実施形態では、患者が肺がんを有するかどうかを決定するため、または肺がんと良性の肺疾患とを区別するために、以下のｍｉＲＮＡの１つを少なくとも１種の他のｍｉＲＮＡバイオマーカーと組み合わせて使用する：ｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−２９ｂ；ｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１４２−５ｐ；ｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｍｉＲ−１８１ｄ；ｍｉＲ−２７ｂ；ｍｉＲ−３７８；ｍｉＲ−２７ａ；ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ；ｍｉＲ−１８１ａ；ｍｉＲ−１２６；ｍｉＲ−３４２；ｍｉＲ−１４０；ｍｉＲ−１５ａ；ｍｉＲ−３２４−３ｐ；ｍｉＲ−３７４；ｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−５１８ｂ；ｍｉＲ−１０６ｂ；ｍｉＲ−１４５；ｍｉＲ−１５０；ｍｉＲ−１９１；ｍｉＲ−３４５；ｍｉＲ−１２６^＊；ｍｉＲ−１４８ｂ；ｍｉＲ−２１４；ｍｉＲ−３２０；ｌｅｔ−７ｇ；ｌｅｔ−７ｉ；ｍｉＲ−１４６ａ；ｍｉＲ−１５ｂ；ｍｉＲ−１８５；ｍｉＲ−１８６；ｍｉＲ−２３ａ；ｍｉＲ−２４；ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｍｉＲ−３４０；ｍｉＲ−３４ａ；ｍｉＲ−１０１；ｍｉＲ−１３２；ｍｉＲ−１８１ｂ；ｍｉＲ−１９９ａ^＊；ｍｉＲ−２０２；ｍｉＲ−２２２；ｍｉＲ−４２２ｂ；ｍｉＲ−６６０；ｍｉＲ−７；またはｍｉＲ−９３。
【００４６】
他の実施形態では、患者が肺がんを有するかどうかを決定するために、以下のｍｉＲＮＡの１つを少なくとも１種の他のｍｉＲＮＡバイオマーカーと組み合わせて使用する：ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２６^＊、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−４２２ｂ、ｍｉＲ−４８６、またはｍｉＲ−９２。
【００４７】
本発明の一部の実施形態は、血清からの少なくとも１組のｍｉＲＮＡの対を増幅し、測定することに関する。表３は、肺疾患を特徴づけるために使用することができる対を含む。これらの対は、他の肺疾患のバイオマーカーと組み合わせて使用することができる。
【００４８】
表３． 血清試料において測定されたｍｉＲＮＡの対
【００４９】
【表３−１】

【００５０】
【表３−２】

ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡの対は、ｍｉＲ−２０２およびｍｉＲ−２９ｂ；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−２４およびｍｉＲ−２７ａ；ｍｉＲ−２７ｂおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１４０およびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１８５およびｍｉＲ−９３；ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−１８１ｄ；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐおよびｍｉＲ−３４５；ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−３２４−５ｐおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−３７４およびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１４０およびｍｉＲ−３４５；ｍｉＲ−２３ａおよびｍｉＲ−２７ａ；ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−３７８；ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−６６０およびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１０６ｂおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｌｅｔ−７ｇおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１０１およびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１２６^＊およびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１２６^＊およびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１５０およびｍｉＲ−２９ａ；ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐおよびｍｉＲ−３２４−３ｐ；ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−３７８；ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１３２およびｍｉＲ−２９ｂ；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１８１ａ；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−３７８；ｍｉＲ−１４８ｂおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１８１ｂおよびｍｉＲ−２９ｂ；ｍｉＲ−２６ａおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１４６ａおよびｍｉＲ−２７ｂ；ｍｉＲ−１４８ｂおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｌｅｔ−７ｉおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−３４０およびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−１５０；ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−３７８；ｍｉＲ−１５ｂおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−２７ｂおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−２７ａおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−３４２；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−２２３；ｍｉＲ−２７ｂおよびｍｉＲ−３７８；ｍｉＲ−１８６およびｍｉＲ−２７ａ；ｍｉＲ−１０６ｂおよびｍｉＲ−３２４−３ｐ；ｍｉＲ−３４ａおよびｍｉＲ−５１８ｂ；ｍｉＲ−２７ａおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−３０ａ−３ｐおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１８１ｄおよびｍｉＲ−２９ｂ；ｍｉＲ−１５ｂおよびｍｉＲ−１９１；ｍｉＲ−１９２およびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−４２２ａおよびｍｉＲ−５７６；ｍｉＲ−３０ｃおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１４５；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１８１ｄ；ｍｉＲ−１８１ｄおよびｍｉＲ−２７ｂ；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−１８６；ｍｉＲ−１５０およびｍｉＲ−２９ｃ；ｍｉＲ−２００ｃおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１８５およびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１４８ａおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−３４ａおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−３２およびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−２１４およびｍｉＲ−５６６；ｍｉＲ−２０６およびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−２１４およびｍｉＲ−５１８ｂ；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−３２０；ｍｉＲ−３３１およびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−２６ｂおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−３４５；ｍｉＲ−２７ｂおよびｍｉＲ−３２４−３ｐ；ｍｉＲ−３０ａ−５ｐおよびｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ；ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１９１およびｍｉＲ−２７ａ；ｍｉＲ−１４０およびｍｉＲ−１８１ｄ；ｍｉＲ−４２２ａおよびｍｉＲ−６６０；ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−１８１ａ；ｍｉＲ−１２６^＊およびｍｉＲ−３７８；ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１８１ｄ；ｌｅｔ−７ｆおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−２７ｂ；ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−３２４−３ｐ；ｍｉＲ−１３２およびｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ；ｍｉＲ−２１４およびｍｉＲ−４２２ｂ；ｍｉＲ−１４０およびｍｉＲ−３７８；ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｌｅｔ−７ａおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−１９１；ｍｉＲ−２４およびｍｉＲ−２７ｂ；ｍｉＲ−１２６^＊およびｍｉＲ−１８１ｄ；ｍｉＲ−１８１ｄおよびｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１９１；ｍｉＲ−１８１ｃおよびｍｉＲ−２９ｂ；ｍｉＲ−１８１ｄおよびｍｉＲ−２７ａ；ｍｉＲ−１４８ｂおよびｍｉＲ−３７８；ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−３２０；ｍｉＲ−１９９ａ^＊およびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１４６ａおよびｍｉＲ−２７ａ；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−１８１ａ；ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−２７ｂおよびｍｉＲ−３４２；ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−２７ａ；ｌｅｔ−７ｇおよびｍｉＲ−３４２；ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−３４５；ｌｅｔ−７ｅおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−４２２ｂ；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−２０２；ｍｉＲ−２１４およびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−１４５；ｍｉＲ−４２２ａおよびｍｉＲ−４９７；ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−４３３；ｍｉＲ−１４０およびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１８１ｂ；ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐおよびｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１９６ｂおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−２２２およびｍｉＲ−２９ｂ；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−５１８ｂ；ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−３０ｄ；ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−３６１；ｍｉＲ−３４２およびｍｉＲ−３４ａ；ｍｉＲ−１０６ｂおよびｍｉＲ−１８１ｄ；ｍｉＲ−３４０およびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−４８６およびｍｉＲ−７；ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１０６ｂおよびｍｉＲ−９２；ｌｅｔ−７ｉおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１０１およびｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−２９ｂ；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−１５０；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−３４２；ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−５１８ｂ；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−１８１ｄ；ｍｉＲ−１９３ｂおよびｍｉＲ−２９ｂ；ｍｉＲ−１４６ｂおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１５ｂおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−２３ａ；ｍｉＲ−２７ａおよびｍｉＲ−３７８；ｍｉＲ−１９７およびｍｉＲ−２９ｂ；ｍｉＲ−３４２およびｍｉＲ−３７４；ｍｉＲ−４２２ａおよびｍｉＲ−４８７ｂ；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−９９ｂ；ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−３２０；ｍｉＲ−３４０およびｍｉＲ−３７８；ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−２３ａおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−２２２およびｍｉＲ−２７ｂ；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−２４；ｍｉＲ−１４８ｂおよびｍｉＲ−１８１ｄ；ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−３４２；ｍｉＲ−１５２およびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−７およびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−２１０およびｍｉＲ−４２２ａ；ｌｅｔ−７ｃおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−２７ｂおよびｍｉＲ−５１８ｂ；ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−３７４；ｍｉＲ−２７ａおよびｍｉＲ−３２４−３ｐ；ｍｉＲ−１４０およびｍｉＲ−１８６；ｍｉＲ−１８５およびｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−４２２ａおよびｍｉＲ−４９６；ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−１９９ａ^＊；ｍｉＲ−４２２ａおよびｍｉＲ−４３２；ｍｉＲ−１８１ｄおよびｍｉＲ−２３ｂ；ｍｉＲ−１２５ｂおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−２９ｂ；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−１４６ａ；ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−３２０；ｍｉＲ−１９１およびｍｉＲ−３７４；ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−１４５；ｍｉＲ−１５０およびｍｉＲ−２９ｂ；ｍｉＲ−１３３ｂおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−３２４−３ｐ；ｍｉＲ−２７ｂおよびｍｉＲ−３４５；ｍｉＲ−３７４およびｍｉＲ−３７８；ｌｅｔ−７ｂおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−３４６およびｍｉＲ−４３２^＊；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−５１８ｂ；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−３２８；ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−３７４；ｌｅｔ−７ｇおよびｍｉＲ−１８１ｄ；ｍｉＲ−１０６ｂおよびｍｉＲ−３７８；ｍｉＲ−３０ａ−５ｐおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−３３９およびｍｉＲ−４２２ａ；ｌｅｔ−７ｉおよびｍｉＲ−３７８；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−９３；およびｍｉＲ−２２４およびｍｉＲ−４２２ａから選択される。
【００５１】
ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡの対は、ｌｅｔ−７ａおよびｍｉＲ−１８１ａ；ｌｅｔ−７ａおよびｍｉＲ−１８１ｄ；ｌｅｔ−７ｂおよびｍｉＲ−１５０；ｌｅｔ−７ｂおよびｍｉＲ−１８１ｄ；ｌｅｔ−７ｂおよびｍｉＲ−９２；ｌｅｔ−７ｃおよびｍｉＲ−１５０；ｌｅｔ−７ｃおよびｍｉＲ−１８１ｄ；ｌｅｔ−７ｃおよびｍｉＲ−９２；ｌｅｔ−７ｅおよびｍｉＲ−３７８；ｌｅｔ−７ｆおよびｍｉＲ−１８１ａ；ｌｅｔ−７ｆおよびｍｉＲ−１８１ｄ；ｌｅｔ−７ｆおよびｍｉＲ−３４２；ｌｅｔ−７ｆおよびｍｉＲ−９２；ｌｅｔ−７ｇおよびｍｉＲ−１５０；ｌｅｔ−７ｇおよびｍｉＲ−１８１ａ；ｌｅｔ−７ｇおよびｍｉＲ−１８１ｄ；ｌｅｔ−７ｇおよびｍｉＲ−３４２；ｌｅｔ−７ｇおよびｍｉＲ−９２；ｌｅｔ−７ｉおよびｍｉＲ−４８６；ｌｅｔ−７ｉおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１０６ｂおよびｍｉＲ−１５０；ｍｉＲ−１０６ｂおよびｍｉＲ−１８１ｄ；ｍｉＲ−１０６ｂおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１２５ａおよびｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｍｉＲ−１２５ａおよびｍｉＲ−３７４；ｍｉＲ−１２６^＊およびｍｉＲ−１８１ｄ；ｍｉＲ−１２６^＊およびｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｍｉＲ−１２６^＊およびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−１４６ａ；ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−１５０；ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−１８１ａ；ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−１８１ｄ；ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−３４２；ｍｉＲ−１２６およびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１３０ｂおよびｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｍｉＲ−１３２およびｍｉＲ−１４２−３ｐ；ｍｉＲ−１３２およびｍｉＲ−２１４；ｍｉＲ−１４０およびｍｉＲ−１５０；ｍｉＲ−１４０およびｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｍｉＲ−１４０およびｍｉＲ−３４５；ｍｉＲ−１４０およびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１４６ａ；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１５０；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１５１；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１８１ａ；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１８１ｂ；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１８１ｄ；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−１８６；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−２２；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−２３ａ；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−２４；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−３４２；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−３４５；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−４２５；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１４２−３ｐおよびｍｉＲ−９９ｂ；ｍｉＲ−１４２−５ｐおよびｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−２２３；ｍｉＲ−１４３およびｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１５０およびｍｉＲ−１５ｂ；ｍｉＲ−１５０およびｍｉＲ−２１４；ｍｉＲ−１５０およびｍｉＲ−２９ｂ；ｍｉＲ−１５０およびｍｉＲ−３７４；ｍｉＲ−１５０およびｍｉＲ−５７６；ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１８１ａ；ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１８１ｂ；ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−１８１ｄ；ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−２１０；ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−３４２；ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−３４５；ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１５ａおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１５ｂおよびｍｉＲ−１７−５ｐ；ｍｉＲ−１５ｂおよびｍｉＲ−１８１ａ；ｍｉＲ−１５ｂおよびｍｉＲ−１８１ｄ；ｍｉＲ−１５ｂおよびｍｉＲ−２４；ｍｉＲ−１５ｂおよびｍｉＲ−３４２；ｍｉＲ−１５ｂおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１６およびｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１６およびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−２１４；ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−２６ａ；ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−２６ｂ；ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−３０ｂ；ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−３０ｃ；ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−３７４；ｍｉＲ−１８１ａおよびｍｉＲ−９８；ｍｉＲ−１８１ｂおよびｍｉＲ−２１４；ｍｉＲ−１８１ｂおよびｍｉＲ−３７４；ｍｉＲ−１８１ｄおよびｍｉＲ−２１４；ｍｉＲ−１８１ｄおよびｍｉＲ−２６ｂ；ｍｉＲ−１８１ｄおよびｍｉＲ−３０ｂ；ｍｉＲ−１８１ｄおよびｍｉＲ−３０ｃ；ｍｉＲ−１８１ｄおよびｍｉＲ−３７４；ｍｉＲ−１８１ｄおよびｍｉＲ−４３２；ｍｉＲ−１８１ｄおよびｍｉＲ−４９６；ｍｉＲ−１８１ｄおよびｍｉＲ−６３８；ｍｉＲ−１８１ｄおよびｍｉＲ−９８；ｍｉＲ−１９３ａおよびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１９５およびｍｉＲ−４８６；ｍｉＲ−１９９ａ^＊およびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−２０ａおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−２１４およびｍｉＲ−３４２；ｍｉＲ−２１４およびｍｉＲ−４２２ｂ；ｍｉＲ−２１４およびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−２４およびｍｉＲ−３７４；ｍｉＲ−２６ａおよびｍｉＲ−３４２；ｍｉＲ−２６ａおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−２６ｂおよびｍｉＲ−３４２；ｍｉＲ−２６ｂおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−２７ａおよびｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｍｉＲ−２７ｂおよびｍｉＲ−３０ｄ；ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−３４２；ｍｉＲ−３０ｂおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−３０ｃおよびｍｉＲ−３４２；ｍｉＲ−３０ｃおよびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−３２０およびｍｉＲ−９８；ｍｉＲ−３４２およびｍｉＲ−３７４；ｍｉＲ−３４６およびｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−３４６およびｍｉＲ−５１８ｂ；ｍｉＲ−３４６およびｍｉＲ−５６６；ｍｉＲ−３７４およびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−４２２ａおよびｍｉＲ−４９６；ｍｉＲ−４２２ａおよびｍｉＲ−６３８；ｍｉＲ−４２２ａおよびｍｉＲ−９８；ｍｉＲ−４３２およびｍｉＲ−９２；ｍｉＲ−４９６およびｍｉＲ−９２；およびｍｉＲ−７およびｍｉＲ−９２から選択される。
【００５２】
他の実施形態では、ｍｉＲＮＡの対は、ｍｉＲ−１４２−５ｐとｍｉＲ１８１ｄ；ｍｉＲ−１４２−３ｐとｍｉＲ１８１ｄ；ｍｉＲ−１４２−３ｐとｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１４２−５ｐとｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−９２とｍｉＲ−２７ｂ；およびｍｉＲ−２４とｍｉＲ−２７ａから選択される。さらなる実施形態では、ｍｉＲＮＡの対は、ｍｉＲ−１０６ａとｍｉＲ−４２２ｂ；ｍｉＲ−１２６^＊とｍｉＲ−２６ｂ；ｍｉＲ−１０６ａとｍｉＲ−２６ｂ；ｍｉＲ−１５ｂとｍｉＲ−３０ａ−５ｐ；ｌｅｔ−７ａとｍｉＲ−２６ｂ；ｌｅｔ−７ｇとｍｉＲ−１０６ａ；ｍｉＲ−１２６^＊とｍｉＲ−１５ｂ；ｍｉＲ−１２６^＊とｍｉＲ−３０ｂ；およびｍｉＲ−１０６ａとｍｉＲ−１０６ｂから選択される。
【００５３】
一部の実施形態では、血清試料において対を測定する。場合によって、１つまたは複数の追加的なｍｉＲＮＡを測定する。
【００５４】
さらなる実施形態では、ある特定のｍｉＲＮＡの対を使用して、女性患者または男性患者において肺疾患を特徴づけることができる（表４）。ある特定の実施形態では、本方法により、性別特異的なｍｉＲＮＡバイオマーカーを検出する。
表４： 女性患者または男性患者において肺疾患を特徴づけるためのｍｉＲＮＡの対
【００５５】
【表４−１】

【００５６】
【表４−２】

本発明の一部の実施形態は、血漿からの２種以上のｍｉＲＮＡを増幅し、測定することに関する。以下のｍｉＲＮＡ血漿バイオマーカーの１つを、少なくとも１種の他のｍｉＲＮＡと組み合わせて使用することができる：ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１５１、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−１２６^＊、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−３１、ｍｉＲ−１９７、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２９ｃ、ｌｅｔ−７ｃ、ｍｉＲ−１８１ｃ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１２７、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−２１３、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ^＊、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−１８８、ｍｉＲ−１９３ａ、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ、ｍｉＲ−２１２、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３３８、ｍｉＲ−３６１、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１８ａ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−３２３、ｍｉＲ−３６２、ｌｅｔ−７ａ、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３７６ａ、ｍｉＲ−３７９、ｍｉＲ−４９１、ｌｅｔ−７ｄ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１８２、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−３８２、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−４３２^＊、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１９３ｂ、ｍｉＲ−１９６ａ、ｍｉＲ−１９９ａ^＊、ｍｉＲ−１９９ｂ、ｍｉＲ−２８、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−４２３、ｍｉＲ−４３３、ｍｉＲ−４８５−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ、ｍｉＲ−２３ｂ、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−４２２ｂ、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３６５、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−３３１、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−４５２、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−５１２−５ｐ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−３２、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−４３２、ｍｉＲ−４８５−３ｐ、ｍｉＲ−４８７ｂ、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５０５、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−３６９−３ｐ、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−５０２、ｍｉＲ−５１１、ｍｉＲ−５１６−３ｐ、ｍｉＲ−５１７ｃ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−９９ａ、またはｍｉＲ−９９ｂ。
【００５７】
表５は、肺がんを特徴づけるために使用することができる血漿試料からのｍｉＲＮＡの対を含む。場合によって、１つまたは複数の追加的なｍｉＲＮＡを測定する。
表５． 血漿試料において測定されるｍｉＲＮＡの対
【００５８】
【表５】

本発明の方法において使用することができる他のｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ群は、本明細書に記載の実施例から明らかになるであろう。
【００５９】
ＩＩＩ．ｍｉＲＮＡのレベルを測定するための方法
ｍｉＲＮＡのレベルまたは量を測定する多くの方法が考えられている。信頼でき、感度がよく、特異的な任意の方法を使用することができる。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡを、測定する前に増幅する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡのレベルを、増幅プロセス中に測定する。さらに他の方法では、ｍｉＲＮＡは、測定する前に増幅しない。
【００６０】
Ａ．増幅反応
成熟ｍｉＲＮＡ、前駆体ｍｉＲＮＡ、および一次ｍｉＲＮＡなどのｍｉＲＮＡの核酸配列を増幅するための多くの方法が存在する。適切な核酸の重合技法および増幅技法としては、逆転写（ＲＴ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（定量的ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ））、核酸配列に基づく増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応、多重ライゲーション可能なプローブ増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｌｉｇａｔａｂｌｅ ｐｒｏｂｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、インベーダー技術（ｉｎｖａｄｅｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ）、ローリングサークル増幅、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）、鎖置換増幅、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ＲＮＡ（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ）増幅、および当業者に公知の他の方法が挙げられる。ある特定の実施形態では、逆転写の後にリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）など、２種以上の増幅方法を使用する（Ｃｈｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３３巻（２０号）：ｅ１７９頁（２００５年））。
【００６１】
典型的なＰＣＲ反応は、標的核酸種を選択的に増幅する多数の増幅ステップまたはサイクル：標的核酸を変性させる変性ステップ；ＰＣＲプライマーセット（フォワードプライマーおよびリバースプライマー）が相補的なＤＮＡ鎖にアニーリングするアニーリングステップ；および熱安定性のＤＮＡポリメラーゼによってプライマーが伸長する伸長ステップを含む。これらのステップを多数回繰り返すことにより、ＤＮＡ断片が増幅されて、標的ＤＮＡ配列に対応するアンプリコンが産生される。典型的なＰＣＲ反応は、変性、アニーリング、および伸長のサイクルを２０回以上含む。多くの場合、アニーリングステップおよび伸長ステップは、同時に実施することができ、その場合、サイクルは２つのステップのみを含有する。成熟ｍｉＲＮＡは一本鎖であるので、逆転写反応（相補的なｃＤＮＡ配列が産生される）は、ＰＣＲ反応の前に実施することができる。逆転写反応は、例えば、ＲＮＡベースのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）およびプライマーの使用を含む。
【００６２】
ＰＣＲ法およびｑ−ＰＣＲ法では、例えば、各標的配列に対してプライマーセットを使用する。ある特定の実施形態では、プライマーの長さは、これらに限定されないが、プライマー間の望ましいハイブリダイゼーション温度、標的核酸配列、および増幅される種々の標的核酸配列の複雑さを含めた多くの因子に左右される。ある特定の実施形態では、プライマーは、長さが約１５〜約３５ヌクレオチドである。他の実施形態では、プライマーは、長さが１５ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下、２５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、または３５ヌクレオチド以下である。さらなる実施形態では、プライマーは長さが少なくとも３５ヌクレオチドである。
【００６３】
別の態様では、フォワードプライマーは、ｍｉＲＮＡバイオマーカーにアニーリングする少なくとも１種の配列を含んでよく、代わりに追加的な５’の非相補的領域を含んでよい。別の態様では、逆転写されたｍｉＲＮＡの相補物にアニーリングさせるためにリバースプライマーを設計することができる。リバースプライマーは、ｍｉＲＮＡバイオマーカー配列とは独立していてよく、同じリバースプライマーを使用して多数のｍｉＲＮＡバイオマーカーを増幅することができる。あるいは、リバースプライマーは、ｍｉＲＮＡバイオマーカーに特異的であってよい。
【００６４】
一部の実施形態では、２種以上のｍｉＲＮＡを単一の反応容積で増幅する。一態様は、２種以上のプライマー対および／または２種以上のプローブを使用することにより、１つの反応容積で少なくとも２種の対象のｍｉＲＮＡを同時に増幅し、定量化することを可能にする、ｑＲＴ−ＰＣＲなどの複合ｑ−ＰＣＲを含む。プライマー対は、各ｍｉＲＮＡにユニークに結合する少なくとも１種の増幅プライマーを含み、プローブは、互いに区別可能になるように標識され、したがって多数のｍｉＲＮＡを同時に定量化することが可能になる。複合ｑＲＴ−ＰＣＲは、これらに限定されないが、診断、予後判定、および治療に適用するためのｍｉＲＮＡを検出することを含めた、研究用途および診断用途を有する。
【００６５】
ｑＲＴ−ＰＣＲ反応は、逆転写酵素およびＤＮＡベースの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの両方を含めることによって、逆転写反応とさらに組み合わせることができる。２種のポリメラーゼを使用する場合、「ホットスタート」手法を使用して、アッセイの性能を最大にすることができる（米国特許第５，４１１，８７６号および同第５，９８５，６１９号）。例えば、逆転写酵素反応およびＰＣＲ反応の構成成分を１つまたは複数の熱活性化（ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）法または化学的変質を使用して隔離して、重合効率を改善することができる（米国特許第５，５５０，０４４号、同第５，４１３，９２４号および同第６，４０３，３４１号）。
【００６６】
Ｂ．ｍｉＲＮＡの検出
ある特定の実施形態では、標識、色素、または標識されたプローブおよび／またはプライマーを使用して、増幅されたｍｉＲＮＡまたは増幅されなかったｍｉＲＮＡを検出することができる。当業者は、検出方法の感度および標的の存在量に基づいて、どの検出方法が適切であるかを理解されよう。検出方法の感度および標的の存在量に応じて、検出する前に増幅することが必要な場合がある、または必要でない場合がある。当業者は、ｍｉＲＮＡを増幅することが好ましい検出方法を理解されよう。
【００６７】
プローブまたはプライマーは、ワトソン−クリック塩基または修飾塩基を含んでよい。修飾塩基としては、これらに限定されないが、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号、同第５，９６５，３６４号および同第６，００１，９８３号に記載されているＡＥＧＩＳ塩基（Ｅｒａｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓより）が挙げられる。ある特定の態様では、塩基は、天然のホスホジエステル結合または別の化学結合によってつながっている。別の化学結合としては、これらに限定されないが、例えば、米国特許第７，０６０，８０９号に記載されている、ペプチド結合またはロックド核酸（ＬＮＡ）結合が挙げられる。
【００６８】
別の態様では、増幅反応において存在するオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、時間に応じて産生される増幅産物の量をモニターするために適している。ある特定の態様では、異なる一本鎖対二本鎖特性を有するプローブを使用して核酸を検出することができる。プローブとしては、これらに限定されないが、５’−エキソヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴａｑＭａｎ（商標））プローブ（米国特許第５，５３８，８４８号を参照されたい）、ステムループ分子ビーコン（例えば、米国特許第６，１０３，４７６号および同第５，９２５，５１７号を参照されたい）、ステムレスまたは直鎖状のビーコン（例えば、ＷＯ９９２１８８１、米国特許第６，４８５，９０１号および同第６，６４９，３４９号を参照されたい）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子ビーコン（例えば、米国特許第６，３５５，４２１号および同第６，５９３，０９１号を参照されたい）、直鎖状のＰＮＡビーコン（例えば、米国特許第６，３２９，１４４号を参照されたい）、非ＦＲＥＴプローブ（例えば、米国特許第６，１５０，０９７号を参照されたい）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）／ＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒＢ（商標）プローブ（例えば、米国特許第６，５４８，２５０号を参照されたい）、ステムループおよび２重鎖のＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プローブ（例えば、米国特許第６，５８９，７４３号を参照されたい）、バルジループプローブ（例えば、米国特許第６，５９０，０９１号を参照されたい）、シュードノットプローブ（例えば、米国特許第６，５４８，２５０号を参照されたい）、サイクリコン（ｃｙｃｌｉｃｏｎ）（例えば、米国特許第６，３８３，７５２号を参照されたい）、ＭＧＢ Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヘアピンプローブ（例えば、米国特許第６，５９６，４９０号を参照されたい）、ＰＮＡライトアッププローブ（ＰＮＡ ｌｉｇｈｔ−ｕｐ ｐｒｏｂｅ）、アンチプライマークエンチプローブ（ａｎｔｉｐｒｉｍｅｒ ｑｕｅｎｃｈ ｐｒｏｂｅ）（Ｌｉら、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ５３巻：６２４〜６３３頁（２００６年））、自己組織化ナノ粒子プローブ、および、例えば米国特許第６，４８５，９０１号に記載のフェロセン修飾されたプローブが挙げられる。
【００６９】
ある特定の実施形態では、増幅反応におけるプライマーの１つまたは複数が標識を含んでよい。さらに別の実施形態では、種々のプローブまたはプライマーが、互いに区別することができる検出可能な標識を含む。一部の実施形態では、プローブまたはプライマーなどの核酸を、２種以上の、区別することができる標識で標識することができる。
【００７０】
一部の態様では、標識は、１つまたは複数のプローブに付着し、以下の性質の１つまたは複数を有する：（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第２の標識と相互作用して第２の標識によってもたらされる検出可能なシグナル、例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を修飾する；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション、例えば、２重鎖の形成を安定化する；および（ｉｖ）結合複合体または親和性のセット、例えば、親和性、抗体−抗原、イオン結合性錯体、ハプテン−リガンド（例えば、ビオチン−アビジン）のメンバーを提供する。さらに他の態様では、標識の使用は、公知の標識、結合、連結基、試薬、反応条件、分析方法および精製方法を利用する多数の公知の技法のいずれか１つを使用して実現することができる。
【００７１】
ｍｉＲＮＡは、直接的な方法または間接的な方法によって検出することができる。直接的な検出方法では、核酸分子に連結した検出可能な標識によって１つまたは複数のｍｉＲＮＡを検出する。そのような方法では、ｍｉＲＮＡは、プローブに結合させる前に標識することができる。したがって、結合は、プローブに結合している標識されたｍｉＲＮＡについてスクリーニングすることによって検出する。プローブは、場合によって、反応容積内のビーズに連結される。
【００７２】
ある特定の実施形態では、標識したプローブと直接結合させ、その後プローブを検出することによって核酸を検出する。本発明の一実施形態では、所望の核酸を捕捉するためのプローブとコンジュゲートしたＦｌｅｘＭＡＰミクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用して、増幅されたｍｉＲＮＡなどの核酸を検出する。いくつかの方法は、例えば、蛍光標識で修飾したポリヌクレオチドプローブを用いた検出、または分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）検出を含む。
【００７３】
他の実施形態では、間接的な検出方法によって核酸を検出する。例えば、ビオチン化したプローブを、ストレプトアビジンとコンジュゲートした色素と組み合わせて、結合した核酸を検出する。ストレプトアビジン分子が増幅されたｍｉＲＮＡ上のビオチン標識に結合し、結合したｍｉＲＮＡを、ストレプトアビジン分子に付着した色素分子を検出することによって検出する。一実施形態では、ストレプトアビジンとコンジュゲートした色素分子は、Ｐｈｙｃｏｌｉｎｋ（登録商標）Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＲＯｚｙｍｅ）を含む。他のコンジュゲートした色素分子は、当業者に公知である。
【００７４】
標識としては、これらに限定されないが、検出可能な蛍光シグナル、化学発光シグナル、または生物発光シグナルを生成またはクエンチする光放射性化合物、光散乱性化合物、および光吸収性化合物が挙げられる（例えば、Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９２年）およびＧａｒｍａｎ Ａ．、Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９７年）を参照されたい）。標識として有用な蛍光レポーター色素としては、これらに限定されないが、フルオレセイン（例えば、米国特許第５，１８８，９３４号、同第６，００８，３７９号および同第６，０２０，４８１号を参照されたい）、ローダミン（例えば、米国特許第５，３６６，８６０号、同第５，８４７，１６２号、同第５，９３６，０８７号、同第６，０５１，７１９号、および同第６，１９１，２７８号を参照されたい）、ベンゾフェノキサジン（例えば、米国特許第６，１４０，５００号を参照されたい）、ドナーとアクセプターの対を含むエネルギー転移蛍光色素（例えば、米国特許第５，８６３，７２７号；同第５，８００，９９６号；および同第５，９４５，５２６号を参照されたい）、およびシアニン（例えば、ＷＯ９７４５５３９を参照されたい）、リサミン、フィコエリトリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ５００、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＲＥＧ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ、Ｒｅｎｏｇｒａｐｈｉｎ、ＲＯＸ、ＳＹＰＲＯ、ＴＡＭＲＡ、テトラメチルローダミン、および／またはＴｅｘａｓ Ｒｅｄ、ならびに検出可能なシグナルを生成することができる任意の他の蛍光部分が挙げられる。フルオレセイン色素の例としては、これらに限定されないが、６−カルボキシフルオレセイン；２’，４’，１，４，−テトラクロロフルオレセイン；および２’，４’，５’，７’，１，４−ヘキサクロロフルオレセインが挙げられる。ある特定の態様では、蛍光標識は、ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ、６−カルボキシフルオレセイン（「ＦＡＭ」）、ＴＥＴ、ＲＯＸ、ＶＩＣＴＭ、およびＪＯＥから選択される。例えば、ある特定の実施形態では、標識は、別の、スペクトル的に分解可能な波長で光を放射することができる別のフルオロフォア（例えば、異なる４色のフルオロフォア）であり；ある特定のそのような標識したプローブは、当技術分野で公知であり、上記されており、また、米国特許第６，１４０，０５４号に記載されている。一部の実施形態では、レポーターフルオロフォアおよびクエンチャーフルオロフォアを含む二重標識した蛍光プローブを使用する。フルオロフォアの対は、それらを容易に区別することができるように、別個の発光スペクトルを有するように選択されることが理解されよう。
【００７５】
さらに別の態様では、標識は、２重鎖のハイブリダイゼーションを増強する、安定化する、またはそれに影響を及ぼす機能を果たすハイブリダイゼーション安定化部分、例えば、インターカレーターおよびインターカレート色素（これらに限定されないが、臭化エチジウムおよびＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎを含む）、副溝結合剤、ならびに架橋官能基である（例えば、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら編「ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６年）を参照されたい）。
【００７６】
別の態様では、オリゴヌクレオチドライゲーション（ＯＬＡ）法を含めた、ｍｉＲＮＡを定量化するためにハイブリダイゼーションおよび／またはライゲーションに頼る方法、および標的核酸配列とハイブリダイズする区別可能なプローブを結合していないプローブから分離することを可能にする方法を使用することができる。例として、米国特許出願公開第２００６／００７８８９４号に開示されているようなＨＡＲＰ様プローブを使用して、ｍｉＲＮＡの数量を測定することができる。そのような方法では、プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションの後に、ハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズしていないプローブとを区別するためにプローブを修飾する。その後、プローブを増幅し、かつ／または検出することができる。一般に、プローブ不活性化領域は、プローブの標的ハイブリダイゼーション領域内にヌクレオチドのサブセットを含む。その標的核酸とハイブリダイズしていないＨＡＲＰプローブの増幅または検出を低下させるまたは妨げるために、およびこのようにして標的核酸の検出を可能にするために、ハイブリダイゼーションの後にプローブを不活性化するステップを、その標的核酸配列とハイブリダイズしたＨＡＲＰプローブと、対応するハイブリダイズしていないＨＡＲＰプローブとを区別することができる作用剤を使用して行う。作用剤は、ハイブリダイズしていないＨＡＲＰプローブを、それが増幅されないように不活性化または修飾することができる。
【００７７】
方法のさらなる実施形態では、プローブライゲーション反応を使用して、ｍｉＲＮＡを定量化することができる。多重ライゲーション依存性プローブ増幅（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｐｒｏｂｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＭＬＰＡ）技法（Ｓｃｈｏｕｔｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３０巻：ｅ５７頁（２００２年））では、互いにすぐ隣接して標的核酸とハイブリダイズするプローブの対は、標的核酸が存在するときにのみ互いにライゲーションする。一部の態様では、ＭＬＰＡプローブはフランキングＰＣＲプライマー結合部位を有する。ＭＬＰＡプローブは、ライゲーションしている場合にのみ増幅することができ、したがって、ｍｉＲＮＡバイオマーカーを検出し、定量化することが可能になる。
【実施例】
【００７８】
以下の実施例は、本発明のさまざまな実施形態を例示し、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７９】
本明細書に記載の実施例は、ＰＣＲ産物を、エンドポイント測定によるのではなく、対数期の間にリアルタイムにモニターすることを含む、ｑＲＴ−ＰＣＲの使用を含む。実施例における閾値サイクル数（Ｃ_ｔ）の測定値は、蛍光シグナルの所定のポイントに到達するのにかかるサイクルの数を指す。
【００８０】
実施例では、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析の使用についても記載している。受信者動作特性曲線は、識別閾値が変動するような二項分類器システムについての感度対特異度のグラフィカルプロットである。ＲＯＣ分析により、クラス分布から独立して（かつそれを特定する前に）、おそらく最適であるモデルを選択し、最適以下のモデルを棄却するためのツールがもたらされる。疾患を診断するためのバイオマーカーを選択し、適用することにおける適用を含めた、多数のＲＯＣ分析の例が文献に存在する（Ｐｅｐｅら、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ６２巻：２２１〜２２９頁（２００６年）；Ｄｏｄｄら、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ５９巻：６１４〜６２３頁（２００３年））。ＲＯＣ分析では、感度および特異度の連続体を捕捉するが、それは、単一の数量、すなわち、ＲＯＣの曲線下面積（ＡＵＣ）として要約することができる。ＡＵＣは、ノンパラメトリックなウィルコクソン検定と密接に関連し、クラスの分離を全閾値にわたって要約している。ＲＯＣ技法の有利な点としては、（１）ロジスティック回帰法において必要とされるようなクラス確率のパラメトリック形式を仮定しないこと（２）医学研究において広く使用されている結果依存サンプリング、例えば症例対照計画に適応できること、および（３）偽陽性および偽陰性に異なる「コスト」を割り当てるのが比較的簡単であること（Ｄｏｄｄ ２００３年；Ｐｅｐｅ ２００６年）が挙げられる。
【００８１】
（実施例１）
肺がんを早期検出するためのマウスモデル
Ａ／Ｊマウスモデルを使用して肺腫瘍を化学的に誘導し、血漿中のｍｉＲＮＡの発現プロファイルをモニターした。ベンゾ［ａ］ピレン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ；カタログ番号４８５６４）が、マウスにおいて肺腫瘍を化学的に誘導するための発癌物質としての機能を果たした。Ａ／Ｊマウス（雄６７匹、雌６８匹）をＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ、ＵＳＡ；ストック番号 ０００６４６）から購入し、６週齢でＰｅｒｒｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）に送付した。発癌物質を投与すること、動物をモニターすること、採血および血漿処理を含めた全ての動物関連実験をＰｅｒｒｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃが実施した。
【００８２】
ベースラインデータを得るために、発癌物質を投与する２週間前に、１２５匹のマウスから眼窩静脈叢を介して採血し、１０匹のマウスをイソフルラン吸入によって屠殺し、心臓穿刺によって採血した。０日目に、実験群のマウスに、発癌物質を、綿実油（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｃ７７６７）２００μｌ中２０μＭ（体重１ｋｇ当たり２５０ｍｇ）に相当する用量で経口胃管栄養によって投薬した。１０匹の対照マウス（雄５匹、雌５匹）に、発癌物質を伴わない綿実油２００μｌの経口胃管栄養を受けさせた。第２の発癌物質用量（体重１ｋｇ当たり２５０ｍｇ）を、最初の胃管栄養の１０週後に試験群に投与し、対照の動物には上記の綿実油の第２の胃管栄養を受けさせた。マウスを特定の時点（図１）で屠殺し、残りのマウスから２週間ごとに採血した（図１）。終わりに、動物を秤量し、心臓穿刺によって採血し、肺葉を採取した。対照マウスについては、試験全体を通して採血し、発癌物質を投与した３４週後に屠殺した。
【００８３】
血液試料を個々に処理して血漿にした。血漿を調製するために、血液試料をＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）Ｋ２ＥＤＴＡチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ；カタログ番号３６７８４１）に採取した。血液を２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、その後、血漿層を吸引し、新しいチューブに入れ、２，５００×ｇで１０分間、遠心分離した。生じた血漿を、ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ；カタログ番号ＡＭ１５６０）からの２×の変性緩衝液を加えることによって直ちに安定化して、最終的な濃度１×を実現した。血漿と緩衝液をボルテックスすることによって混合し、Ａｓｕｒａｇｅｎへ出荷するまでドライアイス上−８０℃で直ちに凍結した。細胞ペレットも−８０℃で凍結させ、血漿試料と一緒にＡｓｕｒａｇｅｎへ出荷した。
【００８４】
血漿ＲＮＡを、ｍｉｒＶａｎａ ＰＡＲＩＳ（商標）Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．；品番ＡＭ１５５６）の有機抽出を以下の改変を伴って使用して精製した。酸性フェノール：クロロホルムを加え、ボルテックスした後、試料を氷上で５分間インキュベートし、次いで４℃、１３，０００×ｇで１０分間遠心分離した。水層を取り出し、クロロホルムで抽出し、再度遠心分離した。水層を第２の抽出物から取り出し、試料に３ＭのＮａＯＡｃ（１／１０の体積）、グリコーゲン（５ｍｇ／ｍｌ）および１００％エタノール（１．５倍の体積）を加えた。溶解物／エタノールの混合物をｍｉｒＶａｎａ ＰＡＲＩＳ（商標）フィルターカートリッジに通し、フィルターをＷａｓｈ１緩衝液６５０μｌで１回、Ｗａｓｈ２／３緩衝液６５０μｌで２回洗浄した。ＲＮＡを、ヌクレアーゼを含まない水の一定分量（５０μｌ）×２を用いて溶出し、−８０℃で貯蔵した。
【００８５】
各マウスからの肺葉の半分を１０％緩衝ホルマリンに一晩固定し、パラフィン（ＦＦＰＥ）に包埋し、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色したスライドとして処理した。あとの半分を−８０℃でスナップ凍結した。ＦＦＰＥ肺切片を、５ｍｍ間隔で段階的に切片作製した。以下の切片作製のガイドラインを使用した：いずれの肺にも肉眼で見える腫瘍が存在しない場合、各肺から３つのランダムな５×５×５ｍｍの切片をスナップ凍結用、およびＦＦＰＥ調製用に取得した。肉眼で見える腫瘍が存在した場合、各肺から１つの腫瘍の５×５×５ｍｍ切片１つをスナップ凍結し、あとの半分をＦＦＰＥとして調製した。１つの肺のみが腫瘍を有した場合、関係していない肺からのランダムな領域をスナップ凍結し、ＦＦＰＥ調製した。病理組織検査のために、ホルマリン中に保存した肺葉をＰａｃｉｆｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）に送付し、そこでパラフィンに包埋し、切片作製し、ヘマトキシリン−エオシンで染色し、スライドに調製した。
【００８６】
Ｈ＆Ｅ染色したスライドをＡｓｕｒａｇｅｎに送付し、それを専門委員会によって認可された病理医が分析し、肺について正常、過形成、腺腫、または腺癌に分類した。表６に、屠殺した動物それぞれにおいて観察された目に見える腫瘍の数、および肺葉のそれぞれにおける病理診断を示している。
【００８７】
表６． 実験マウスおよび対照マウスからの肺腫瘍および病理診断。ＳＣＣは扁平上皮癌である。
【００８８】
【表６−１】

【００８９】
【表６−２】

【００９０】
【表６−３】

肺腺癌が病理学的に確認されたマウスからの血漿試料および発癌物質を受けなかった対照マウスからの血漿試料においてｍｉＲＮＡの発現を評価した。対照マウスは、腺癌のマウスと年齢を釣り合わせた。３２９種のｍｉＲＮＡの発現レベルを、各ｍｉＲＮＡに特異的なＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。ｍｉＲＮＡのサブセット（１７０種）が、マウスおよびヒトの両方において同一の成熟配列を有し、残りは対応するヒトｍｉＲＮＡのマウス相同体である。逆転写（ＲＴ）反応の構成成分（表７）を、ＲＮＡ鋳型を加える前に氷上に集め、各１０μｌの反応物当たり約１ｎｇの血漿ＲＮＡを含めた。ＲＴ反応物を、３８４ウェルのＧｅｎｅＡｍｐ（登録商業）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、１６℃で３０分間、次いで４２℃で３０分間、次いで８５℃で５分間インキュベートした。次いで、ＲＴ反応物を−２０℃で凍結させた。
【００９１】
表７． 逆転写反応の構成成分
【００９２】
【表７】

ＰＣＲの構成成分（表８）を、ＲＴ反応物からのｃＤＮＡ（２μｌ）を加える前に氷上に集めた。反応物を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標）７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、９５℃で１分間、次いで、９５℃で５秒間および６０℃で３０秒間の５０サイクル、インキュベートした。結果を、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムＳＤＳ Ｖ２．３ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した。
【００９３】
表８． ＰＣＲの構成成分
【００９４】
【表８】

表９に、ｑＲＴ−ＰＣＲ実験からのがんマウス対対照マウスについての平均Ｃｔのデータ、ｄｄＣｔ値を示している。ｐ値が０．１以下のｍｉＲＮＡが示されている。
【００９５】
表９． 肺腺癌が病理学的に確認されたマウスからの血漿試料および発癌物質を受けなかった対照マウスからの血漿試料におけるｍｉＲＮＡの発現
【００９６】
【表９】

さらに、肺腺癌と診断された動物におけるｍｉＲＮＡの発現を検査するために時間的研究を実施した。図２Ａおよび図２Ｂに、選択されたｍｉＲＮＡの、腫瘍を検出する前のある期間にわたる発現の変化を示している。この図により、早ければ発癌物質を投与した１０週間後−少なくとも腫瘍を検出する６週間前に、ｍｉＲＮＡの示差的な発現を検出することができることが示されている。これらの結果により、ｍｉＲＮＡは、早い段階で肺がんを検出するために使用することができ、肺がんについてのスクリーニングのために適していることが実証されている。
【００９７】
（実施例２）
肺がんを検出するためのｍｉＲＮＡバイオマーカーの、ｑＲＴ−ＰＣＲによる同定
１２種のｍｉＲＮＡの発現を、８人の肺がん患者および８人の正常な患者からの血清試料において評価した。肺がん患者および正常なドナーから、血液をＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｅｒｕｍ Ｔｕｂｅに採取した。全ての血液を診断時、しかし、腫瘍の切除または治療などのあらゆる医療介入の前に、採取した。血液を１，０００×ｇで１０分間遠心分離し、血清を新しいチューブに移し、−８０℃で直ちに凍結させた。血清ＲＮＡを、ｍｉｒＶａｎａ ＰＡＲＩＳ（商標）Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ；品番ＡＭ１５５６）の有機抽出を以下の改変を伴って使用して抽出した。酸性フェノール：クロロホルムを加え、ボルテックスした後、試料を氷上で５分間インキュベートし、次いで４℃、１３，０００×ｇで１０分間遠心分離した。水層を取り出し、クロロホルムで抽出し、再度遠心分離した。水層を第２の抽出物から取り出し、試料に３ＭのＮａＯＡｃ（１／１０の体積）、グリコーゲン（５ｍｇ／ｍｌ）、および１００％エタノール（１．５倍の体積）を加えた。溶解物／エタノールの混合物をｍｉｒＶａｎａ ＰＡＲＩＳ（商標）フィルターカートリッジに通し、フィルターをＷａｓｈ１緩衝液６５０μｌで１回、Ｗａｓｈ２／３緩衝液６５０μｌで２回洗浄した。ＲＮＡを、ヌクレアーゼを含まない水の一定分量（５０μｌ）×２を用いて溶出し、−８０℃で貯蔵した。
【００９８】
ｍｉＲＮＡの発現レベルを、各ｍｉＲＮＡに特異的なＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用したｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。逆転写（ＲＴ）反応を、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ；カタログ番号４３６６５９７）を使用して実施した。表１０に列挙されている反応の構成成分を、ＲＮＡ鋳型を加える前に氷上に集めた。反応の構成成分は全て、製造者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）から多数の構成成分を伴うキットとして提供された。血清ＲＮＡ（反応当たり１ｎｇの全ＲＮＡ）を加え、混合した。ＲＴ反応物を、３８４ウェルのＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、１６℃で３０分間、次いで４２℃で３０分間、次いで８５℃で５分間インキュベートした。次いで、ＲＴ反応物を−２０℃で凍結させた。
【００９９】
表１０． 逆転写反応の構成成分
【０１００】
【表１０】

ＰＣＲの構成成分（表１１）を、ＲＴ反応物からのｃＤＮＡ（４μｌ）を加える前に氷上に集めた。反応物を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標）７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、９５℃で１分間、次いで、９５℃で５秒間および６０℃で３０秒間の５０サイクル、インキュベートした。結果を、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムＳＤＳ Ｖ２．３ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した。
【０１０１】
表１１． ＰＣＲの構成成分
【０１０２】
【表１１】

表１２に、がん試料および正常試料についての各ｍｉＲＮＡの平均ｄＣｔ値を提供する。さらに、ｄｄＣｔ値は、がん試料と正常試料との間の発現の差を表す。
【０１０３】
表１２： 肺がんの患者からの血清および肺がんでない患者からの血清におけるｍｉＲＮＡの発現
【０１０４】
【表１２】

拡大したパネルにおいて、１８０種のｍｉＲＮＡの発現を、肺がん患者１６人からの血清試料および良性の肺の状態のある１２人からの血清試料おいて評価した（表１３）。表１３において、Ｄｉｆｆは、腫瘍の分化の状況を表し；ＭＯＤは、中程度を表し；ＡＣは腺癌を表し；ＳＣＣは扁平上皮癌を表し；Ｒは右側を表し；ＲＵＬは右上葉を表し；ＲＭＬは右中葉を表し；ＲＬＬは右下葉を表し；ＬＵＬは左上葉を表し；ＬＬＬは左下葉を表す。
【０１０５】
表１３． 肺がんの検体および良性の検体についての病理組織学的な情報および患者の情報
【０１０６】
【表１３】

肺がん患者および比較器ドナーから、血液をＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｓｅｒｕｍ Ｔｕｂｅに採取し、最初のヒト試料について上記している通り処理した。
【０１０７】
表１４に、がん試料および良性試料についてのｍｉＲＮＡの示差的な発現のデータを、平均ｄＣｔ値の形で提供する。さらに、ｄｄＣｔ値は、がん試料と良性試料との間の発現の差を表す。
【０１０８】
表１４． 肺がんの患者または良性の肺の状態の患者からの血清におけるｍｉＲＮＡの発現
【０１０９】
【表１４−１】

【０１１０】
【表１４−２】

【０１１１】
【表１４−３】

ｍｉＲＮＡバイオマーカーの対も、これらの試料について、患者からの血清を区別するそれらの能力について評価した。正規化していないｑＲＴ−ＰＣＲデータを使用して、評価した各ｍｉＲＮＡの対についてｄＣｔ値を算出した。さまざまなｍｉＲＮＡの対のｄＣｔ値を、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を使用して分析して、肺がんに対する診断用のｍｉＲＮＡの対を同定した。本実施例では、ＲＯＣ曲線を使用して、個々のバイオマーカー候補およびバイオマーカー候補の組合せの、患者のクラスを区別する力を評価した。バイオマーカー候補の存在量を測定し、測定値を使用して、その真陽性率および偽陽性率がＲＯＣ曲線にプロットされた分類器を開発した。次いで、各分類器についてＡＵＣを算出した。理想的な分類器のＲＯＣのＡＵＣ値は１であり、各分類器のＲＯＣのＡＵＣがどのくらい１に近いかに基づいて分類器を順位づけた。
【０１１２】
表１５は、肺がんの患者と良性の肺の状態の患者とを区別するｍｉＲＮＡの対を含む。表１５のｍｉＲＮＡの対は、ＲＯＣのＡＵＣが減少する順に列挙されている。良性の肺の状態の患者と対照してがんの患者を分類するための血清ｍｉＲＮＡバイオマーカーの対が提示されている。平均値は、対の２種のｍｉＲＮＡ間のＣｔ値の差の平均を表す。表１５において、「良性の平均」は、良性の肺の状態の対象１２人からのデータの平均を表し；「がんの平均」は、肺がん患者１６人からのデータの平均を表し；「良性のＳＤ」は、良性の肺の状態の患者からのデータの標準偏差であり；「がんのＳＤ」は、肺がん患者からのデータの標準偏差であり；「良性対がんの関連」は、良性／肺がんの診断に関連するｐ値を指し；ＲＯＣは、受信者動作特性を表し；ＡＵＣは曲線下面積である。
【０１１３】
表１５． マイクロＲＮＡバイオマーカーの対−良性の肺および肺がん患者の血清
【０１１４】
【表１５−１】

【０１１５】
【表１５−２】

【０１１６】
【表１５−３】

【０１１７】
【表１５−４】

【０１１８】
【表１５−５】

【０１１９】
【表１５−６】

【０１２０】
【表１５−７】

【０１２１】
【表１５−８】

【０１２２】
【表１５−９】

【０１２３】
【表１５−１０】

【０１２４】
【表１５−１１】

【０１２５】
【表１５−１２】

【０１２６】
【表１５−１３】

【０１２７】
【表１５−１４】

【０１２８】
【表１５−１５】

【０１２９】
【表１５−１６】

【０１３０】
【表１５−１７】

【０１３１】
【表１５−１８】

表１５からの対解析における血清バイオマーカーの分布率が表１６に示されている。
【０１３２】
表１６： 血清バイオマーカーの対での分布率
【０１３３】
【表１６】

表１５および表１６のデータは、血清試料において、患者の性別またはがんの種類に関係なく、良性の状態の肺の患者と肺がんの患者とを区別することができるｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡバイオマーカーの対を示している。これらのｍｉＲＮＡは、肺がんを診断するために有用である。がん患者からの血清試料は、肺がんの初期Ｉ期から病期ＩＩＩ期までの患者由来である。これらの結果により、ｍｉＲＮＡが早い段階で肺がんを検出するのに適し、かつ患者をスクリーニングし、良性の肺の状態の患者と肺がんの患者とを区別するために有効であることが示されている。
【０１３４】
（実施例３）
男性の肺がん患者および女性の肺がん患者からの血清において示差的に発現されるｍｉＲＮＡ
表１５および表１６の血清ｍｉＲＮＡにより良性の肺の状態の患者と肺がんの患者とを区別することができるが、実施例２からのデータをさらに解析することにより、ある特定のｍｉＲＮＡの対が、特定の性別の中でこれらの患者群を区別するために優れていることが明らかになった。具体的には、いくつものｍｉＲＮＡの対のＡＵＣ ＲＯＣが１．００であった（表１７）。これらの対は、女性の良性の肺の状態の患者と女性の肺がん患者とを区別する場合にＲＯＣのＡＵＣに有意な改善を示した。同様に、男性の良性の肺の状態の患者と男性の肺がんの患者とを区別する場合にも特定のｍｉＲＮＡの対についてＡＵＣの改善が観察された（表１８）。表１７および表１８のｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの対は、それぞれ女性の患者および男性の患者において肺がんを診断するために有用である。これらのｍｉＲＮＡは、２種以上を組み合わせて使用することができる。
【０１３５】
表１７． 女性の肺がん患者と比較して、女性の良性の肺の状態の患者の血清において示差的に発現されたマイクロＲＮＡの対
【０１３６】
【表１７−１】

【０１３７】
【表１７−２】

【０１３８】
【表１７−３】

表１８． 男性の肺がん患者と比較して、男性の良性の肺の状態の患者の血清において示差的に発現されたマイクロＲＮＡの対
【０１３９】
【表１８】

（実施例４）
肺がんの対象と、良性の状態を有する、または良性の状態を有さない、がんのない対象とを区別するｍｉＲＮＡマーカー
追加的な試験において、肺がん患者と、良性の状態を有する、または良性の状態を有さない、がんのないヒト対象とを区別する血清ｍｉＲＮＡを同定する。良性の状態の患者、正常な患者、および肺がん患者から血清試料を得た（表１９）。全ての手順およびデータ解析を上記の通り実施した。
【０１４０】
表１９． 肺がんの検体および良性の検体についての病理組織学的な情報および患者の情報
【０１４１】
【表１９−１】

【０１４２】
【表１９−２】

表２０に、がん試料およびその他の試料（その他＝良性および正常）についてのｍｉＲＮＡの示差的な発現のデータを、平均ｄＣｔ値の形で提供する。表２１に、肺がん患者からの試料と正常な患者および良性腫瘍を有する患者からの試料とを区別する、示差的に発現されたｍｉＲＮＡバイオマーカーの対を示している。そのようなｍｉＲＮＡおよびバイオマーカーの対は、肺がんをスクリーニングし、診断するために使用することができる。
表２０． 肺がんの患者からの血清または良性の状態もしくは正常な状態の患者からの血清におけるｍｉＲＮＡの発現。その他＝良性の症例および正常の症例である。
【０１４３】
【表２０−１】

【０１４４】
【表２０−２】

【０１４５】
【表２０−３】

表２１． 肺がん患者と、肺腫瘍のない正常な患者および良性の肺腫瘍を有する患者とを区別する、示差的に発現されたｍｉＲＮＡバイオマーカーの対。その他＝良性の症例および正常の症例である。
【０１４６】
【表２１−１】

【０１４７】
【表２１−２】

【０１４８】
【表２１−３】

【０１４９】
【表２１−４】

【０１５０】
【表２１−５】

【０１５１】
【表２１−６】

【０１５２】
【表２１−７】

表２２に、肺疾患を特徴づけるために他のｍｉＲＮＡバイオマーカーと組み合わせて使用することができるｍｉＲＮＡ、ならびにこれらのバイオマーカーの、表２１からの対での分布率を示している。
【０１５３】
表２２： がん患者対（正常な、および良性の）患者の対解析における血清バイオマーカーの分布率
【０１５４】
【表２２】

（実施例５）
肺がん分類器の開発
表１５の対から１４種のｍｉＲＮＡの最初の訓練セットを選択して、それらの診断的な潜在力をさらに検証した。これらのｍｉＲＮＡは、これらのｍｉＲＮＡを含むｍｉＲＮＡバイオマーカーの対についてのＡＵＣ ＲＯＣスコアが高いことによって証明されるように、良性の肺の状態の患者と肺がんの患者とを区別するための診断的な潜在力を有することが上で示された。年齢および性別を釣り合わせた患者から、２０個の良性の肺試料および３４個の肺がん試料の一群（表２３）、訓練試料のセット（良性１２個、肺がん１６個）を選択した。実施例２において上記の通りｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【０１５５】
表２３．肺がんの検体および良性の検体についての病理組織学的な情報および患者の情報
【０１５６】
【表２３−１】

【０１５７】
【表２３−２】

訓練セット内の１４種のｍｉＲＮＡのサブセットを検証するために、８個の良性試料および１８個のＬｕＣａ試料で構成される別々の試験試料セットを表２３から選択した。ｍｉＲＮＡバイオマーカーの選択および分類器の評価を、訓練試料に対する５倍交差検証を２５回繰り返し実施し、ＡＵＣ ＲＯＣ値をｍｉＲＮＡバイオマーカーの数（特徴）の関数として測定することによって作成した。分類するための特徴の最適な数を決定するために、さまざまなバイオマーカーを使用した。５倍交差検証は、訓練セットを８０％の試料セットと２０％の試料セットに細分し、８０％の訓練試料に対して特徴の選択および分類器の訓練を実施するプロセスである。特徴の選択および分類器の訓練に使用しない残りの２０％の試料を分類することによって、性能を測定する。全ての試料が２０％の試験セットの中に１回ずつ入るように、このプロセスを５回繰り返した。５倍交差検証を１回反復することにより、単一のＡＵＣ値がもたらされた。８０％のセットと２０％セットの組合せのよりよいサンプリングを実現するため、および分類器内の所与のバイオマーカーの数についてのＡＵＣ値の経験的な分布を同定するために、５倍交差検証を２５回繰り返した。訓練のための線形判別分析（ＬＤＡ）分類器への入力として、単純なウエルチのｔ検定による最上位のバイオマーカーを使用した。バイオマーカーを、１種のｍｉＲＮＡの発現値を別のｍｉＲＮＡの発現値から引いたところのｍｉＲＮＡの対（２種のｍｉＲＮＡの示差的な発現）として定義した。可能性のある対の全てを調査した。図３に、ＬＤＡ分類器についてのＡＵＣ値の分布をバイオマーカーの数の関数として示している。この手順により、分類器に使用するために最適なバイオマーカーの数が決定され、性能の予想が前進し続ける。本実験では、示差的に発現された６種のｍｉＲＮＡの対（ｍｉＲ−１４２−５ｐとｍｉＲ１８１ｄ；ｍｉＲ−１４２−３ｐとｍｉＲ１８１ｄ；ｍｉＲ−１４２−３ｐとｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−１４２−５ｐとｍｉＲ−４２２ａ；ｍｉＲ−９２とｍｉＲ−２７ｂ；ｍｉＲ−２４とｍｉＲ−２７ａ）の分類器を、肺がんを診断するために最適な分類器として同定した。この分類器は、図３において垂直の点線で印がつけられている。連続的に値をつけた分類確率が、患者が肺がん（分類器陽性）または良性の（分類器陰性）腫瘍を有すると診断するコールに変換されるように、ＬＤＡ分類器に対するカットオフを設定した。簡単にするために、０．５のカットポイントを閾値として選択した。この値により、最大に近い感度および特異度がもたらされた。６種のバイオマーカーの対に対して訓練したＬＤＡ分類器の、０．５のカットオフを使用した訓練データおよび試験データの性能評価が図４で提供されている。感度（ＳＥＮＳ）、特異度（ＳＰＥＣ）、陰性的中率（ＮＰＶ）および陽性的中率（ＰＰＶ）は、示されている通りである。
【０１５８】
この実験において分類器の一部として同定された６種の対はいずれも、肺がんを診断するために使用することができる。最適な分類器セットからの２種以上の対を使用することによって予測の正確度を増加させることができる。
【０１５９】
（実施例６）
ヒト肺がん患者の血漿ＲＮＡにおけるマイクロＲＮＡの発現を評価するためのｑＲＴ−ＰＣＲ
ヒト血漿中の、肺がんについてのｍｉＲＮＡバイオマーカーを同定するために、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、肺がんの患者（ｎ＝１４）の血漿中に存在するｍｉＲＮＡのレベルと、肺がんのない患者（ｎ＝１２）におけるレベルを比較した。表２４に患者の情報および肺がんの病理の情報が示されている。
【０１６０】
表２４． ヒトの肺がん患者および正常な患者の情報および腫瘍病理。ＴＮＭ病期（ＳｏｂｉｎおよびＷｉｔｔｅｋｉｎｄ、２００２年）
【０１６１】
【表２４】

血漿を調製するために、各ドナーから全血（１０ｍｌ）をＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）Ｋ２ＥＤＴＡチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）に採取した。血液採取後直ちにチューブを８〜１０回ひっくり返し、次いで採取の２時間以内に２，０００×ｇで１０分間、遠心分離した。血清用ピペットを使用して血漿を新しいチューブに移し、ＲＮＡ単離に供すまで−８０℃で凍結させた。
【０１６２】
血漿ＲＮＡを、ｍｉｒＶａｎａ ＰＡＲＩＳ（商標）Ｋｉｔ（品番 ＡＭ１５５６；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ；Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）の有機抽出を以下の改変を伴って使用して精製した。血漿を氷上で解凍した後、ｍｉｒＶａｎａ ＰＡＲＩＳ（商標）Ｋｉｔからの２×変性溶液を等体積加え、混合物を氷上で５分間インキュベートした。等体積の酸性フェノール：クロロホルムを加え、次いで混合物を１分間ボルテックスし、氷上で５分間インキュベートした。チューブを４℃、１３，０００×ｇで１５分間遠心分離し、水相を新しいチューブに取り出した。試料にグリコーゲン（５ｍｇ／ｍｌ）、３ＭのＮａＯＡｃ（１／１０の体積）、および１００％エタノール（１．５倍の体積）を加えた。試料を、ひっくり返すことによって混合し、室温でインキュベートした。溶解物／エタノールの混合物をｍｉｒＶａｎａ ＰＡＲＩＳ（商標）フィルターカートリッジに通し、フィルターを、Ｗａｓｈ１緩衝液６５０μｌで１回、Ｗａｓｈ２／３緩衝液６５０μｌで２回洗浄した。ＲＮＡをヌクレアーゼを含まない水（５０μｌ、９５℃に加熱した）を用いて１０，０００×ｇで１分間遠心分離することによって溶出した。
【０１６３】
ｑＲＴ−ＰＣＲ反応を、個々のｍｉＲＮＡに特異的なＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して実施した。逆転写反応物を、ＲＮＡ鋳型を加える前に氷上に集めた（表２５）。次に、反応当たり０．２５μｌの血漿ＲＮＡ鋳型を加え、混合した。ＲＴ反応物を、３８４ウェルのＧｅｎｅＡｍｐ（登録商業）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、１６℃で３０分間、次いで４２℃で３０分間、次いで８５℃で５分間インキュベートし、次いで、−２０℃の冷凍装置内で凍結させた。
【０１６４】
表２５． 逆転写反応の構成成分
【０１６５】
【表２５】

ＰＣＲの構成成分を、ＲＴ反応物からのｃＤＮＡを加える前に氷上に集めた（表２６）。ＰＣＲを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標）７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、９５℃で１分間、次いで９５℃で５秒間を５０サイクル、次いで６０℃で３０秒間、インキュベートした。最初のデータ解析を、７５００ Ｆａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ ＳＤＳ Ｖ２．３ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。
【０１６６】
表２６． リアルタイムＰＣＲの構成成分
【０１６７】
【表２６】

ｑＲＴ−ＰＣＲデータを、最初に外れ値について査定した。所与の試料中の、生のＣｔ値が５０であるｍｉＲＮＡの全てをさらなる解析から排除した。５０未満の生のＣｔ値を有するｍｉＲＮＡが１５０種未満である試料からのデータを全て排除した。各血漿試料において検出された５０種のｍｉＲＮＡについての生のＣｔの平均を、個々の試料について算出した。所与の試料についての平均Ｃｔを、対応する試料中の各ｍｉＲＮＡについての生のＣｔ値から引いて、検出された各ｍｉＲＮＡについてのｄＣｔを生じさせた。これらの正規化された測定値を使用して、正常なドナーからの血漿試料および肺がん患者からの血漿試料に有意に異なるレベルで存在するｍｉＲＮＡを同定した。
【０１６８】
正常なドナーの試料中および肺がん患者の試料中の各ｍｉＲＮＡに対する平均ｄＣｔ値を算出した。肺がん患者の試料についての平均ｄＣｔ値を、正常なドナーについての平均ｄＣｔ値から引いて、２種の患者セット間のさまざまなｍｉＲＮＡのレベルの分散を決定した。次いで、スチューデントｔ検定を使用して、さまざまなｍｉＲＮＡの、肺がん患者の血漿と正常なドナーの血漿とを区別する力を評価した。
【０１６９】
表２７に、がん試料および正常試料についてのｍｉＲＮＡの示差的な発現のデータを、平均ｄＣｔ値の形で提供する。さらに、ｄｄＣｔ値は、がん試料と正常試料との間の発現の差を表す。
表２７． 肺がん患者の血漿試料と正常な患者の血漿試料との間で示差的に発現されたｍｉＲＮＡバイオマーカ
【０１７０】
【表２７−１】

【０１７１】
【表２７−２】

【０１７２】
【表２７−３】

【０１７３】
【表２７−４】

【０１７４】
【表２７−５】

【０１７５】
【表２７−６】

【０１７６】
【表２７−７】

（実施例７）
ヒト肺がん患者の血漿ＲＮＡにおけるマイクロＲＮＡの発現を評価するためのｑＲＴ−ＰＣＲ
肺がん患者および正常な患者の別個のセットから単離した血漿試料の第２のセット（表２８）を使用して、肺がん患者および正常な患者において発現されるｍｉＲＮＡのさらなる比較を実施した。表２８におけるＴＮＭ（腫瘍、節、転移）病期は、ＳｏｂｉｎおよびＷｉｔｔｅｋｉｎｄ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、２００２年に記載されている。表２８では以下の略語が使用されている：腺癌（ＡＤＣＡ）；気管支肺胞の（ＢＡ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、および該当なし（ＮＡ）。
【０１７７】
表２８． ヒトの肺がん患者および正常な患者の情報および腫瘍病理
【０１７８】
【表２８】

ｍｉＲＮＡの発現を査定するために、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによる検出を使用して、７個の正常なヒトの血漿試料および９個の肺がん患者の血漿試料から単離したＲＮＡをスクリーニングした。
【０１７９】
実施例６において上記の通り血漿ＲＮＡを単離した。ｑＲＴ−ＰＣＲ反応を、個々のｍｉＲＮＡに特異的なＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して実施した。逆転写反応物を、ＲＮＡ鋳型を加える前に氷上に集めた（表２９）。次に、反応当たり０．２５μｌの血漿ＲＮＡ鋳型を加え、混合した。ＲＴ反応物を、３８４ウェルのＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、１６℃で３０分間、次いで４２℃で３０分間、次いで８５℃で５分間インキュベートし、次いで、−２０℃の冷凍装置内で凍結させた。
【０１８０】
表２９．逆転写反応の構成成分
【０１８１】
【表２９】

ＰＣＲの構成成分を、ＲＴ反応物からのｃＤＮＡを加える前に氷上に集めた（表３０）。ＰＣＲを、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（商標）７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、９５℃で１分間、次いで９５℃で５秒間を５０サイクル、次いで６０℃で３０秒間、インキュベートした。最初のデータ解析を、７５００ Ｆａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ ＳＤＳ Ｖ２．３ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行った。
【０１８２】
表３０． リアルタイムＰＣＲの構成成分
【０１８３】
【表３０】

ｑＲＴ−ＰＣＲデータを、最初に外れ値について査定した。所与の試料中の、生のＣｔ値が５０であるｍｉＲＮＡの全てをさらなる解析から排除した。５０未満の生のＣｔ値を有するｍｉＲＮＡが１５０種未満である試料からのデータを全て排除した。各血漿試料において検出された５０種のｍｉＲＮＡについての生のＣｔの平均を、個々の試料について算出した。所与の試料についての平均Ｃｔを、対応する試料中の各ｍｉＲＮＡについての生のＣｔ値からから引いて、検出された各ｍｉＲＮＡについてのｄＣｔを生じさせた。これらの正規化された測定値を使用して、正常なドナーからの血漿試料および肺がん患者からの血漿試料に有意に異なるレベルで存在するｍｉＲＮＡを同定した。
【０１８４】
正常なドナーの試料中および肺がん患者の試料中の各ｍｉＲＮＡに対する平均ｄＣｔ値を算出した。肺がん患者の試料についての平均ｄＣｔ値を、正常なドナーについての平均ｄＣｔ値からから引いて、２種の患者セット間のさまざまなｍｉＲＮＡのレベルの分散を決定した。次いで、スチューデントｔ検定を使用して、さまざまなｍｉＲＮＡの、肺がん患者の血漿と正常なドナーの血漿とを区別する力を評価した。
【０１８５】
表３１に、正常な患者およびがん患者についてのｄＣｔ値、ならびにがん試料対正常試料についての各ｍｉＲＮＡのｄｄＣｔ値を提供する。
【０１８６】
表３１． 肺がん患者の血漿試料と正常な患者の血漿試料との間で示差的に発現されたｍｉＲＮＡバイオマーカー
【０１８７】
【表３１−１】

【０１８８】
【表３１−２】

【０１８９】
【表３１−３】

【０１９０】
【表３１−４】

【０１９１】
【表３１−５】

（実施例８）
肺がん患者からの血漿と正常な患者からの血漿とを区別するｍｉＲＮＡの組合せ
実施例６に記載の通り生成した正規化していないｑＲＴ−ＰＣＲデータを使用して、定量化されたｍｉＲＮＡの対のそれぞれについてのｄＣｔ値を算出した。肺がんのドナーの血漿試料および正常なドナーの血漿試料におけるさまざまなｍｉＲＮＡの対についてのｄＣｔ結果を、どのｍｉＲＮＡの対が肺がん患者からの血漿試料と正常な患者からの血漿試料とを区別する力を有するかを決定するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を使用して分析した。１組のｍｉＲＮＡの対（ｌｅｔ−７ｃ：ｍｉＲ−３２６）により、分析した１４個の肺がん患者の試料および１２個の正常なドナーの試料が正確に分類された（表３２）。２０組の追加的なｍｉＲＮＡの対により、２６個の試料のうち１つを除く全てが正確に分類され（ＲＯＣ ＡＵＣ ＞０．９８）、２２１組のｍｉＲＮＡの対が少なくとも０．９３のＲＯＣのＡＵＣスコアを有した（表３２）。表３２の２２１組のｍｉＲＮＡの対に、１６６種の独立したｍｉＲＮＡが少なくとも１回含まれた（表３３）。多数のｍｉＲＮＡを多数のバイオマーカーの対に使用し、肺がん患者の血漿と正常なドナーの血漿におけるそれらの可変レベルの強度が示されている。
【０１９２】
表３２． 肺がん患者からの血漿を同定するために使用することができるバイオマーカーの対
【０１９３】
【表３２−１】

【０１９４】
【表３２−２】

【０１９５】
【表３２−３】

【０１９６】
【表３２−４】

【０１９７】
【表３２−５】

【０１９８】
【表３２−６】

【０１９９】
【表３２−７】

表３３．肺がん患者からの血漿を同定するために組合せで使用することができるバイオマーカー、および各ｍｉＲＮＡの分布率
【０２００】
【表３３−１】

【０２０１】
【表３３−２】

（実施例９）
ヒト肺がん患者の血清ＲＮＡにおけるマイクロＲＮＡの発現を評価するためのｑＲＴ−ＰＣＲ
ある特定のｍｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの組合せの選択性および感度をさらに査定するために、肺がん患者および正常な対象の別個のセットから単離した血清試料の追加的なセット（表３４）を使用して、肺がん患者からの血清および正常な対象からの血清において発現されるｍｉＲＮＡを比較した。病理診断を決定するために、専門委員会によって認可された病理医によるがん患者からの肺葉切片および正常な対象からの肺葉切片の病理組織学的分析を実施した。
【０２０２】
表３４． 血清試料についての病理組織学的な情報および患者の情報。ＡＤＣＡは腺癌であり；ＳＣＣＡは扁平上皮癌である。
【０２０３】
【表３４−１】

【０２０４】
【表３４−２】

まず、３０人の肺がん患者および２０人の正常な対象（表３４）からの血清ＲＮＡにおける１８０種のｍｉＲＮＡの発現を評価した。血液採取、血清ＲＮＡの抽出、およびｑＲＴ−ＰＣＲを、上の実施例２に記載の通り実施した。表３５に、血清試料からのｍｉＲＮＡをＰＣＲ増幅した後の平均ｄＣｔ値およびｄｄＣｔ値を示している。ｄＣｔ値を、特定のｍｉＲＮＡのＣｔと、正規化群としての、発現されたｍｉＲＮＡの最上位５０種についての平均Ｃｔとの間の差として算出した。ｍｉＲＮＡを、ｔ検定のｐ値が大きくなるように並べた。
【０２０５】
表３５． 肺がんを有する患者からの血清および正常な対象からの血清におけるｍｉＲＮＡの発現
【０２０６】
【表３５−１】

【０２０７】
【表３５−２】

【０２０８】
【表３５−３】

【０２０９】
【表３５−４】

示差的に発現されたｍｉＲＮＡの対の分析に基づいて、追加的な５５人の肺がん患者からの血清試料および７５人のがんのない、推定の正常な個体からの血清試料におけるさらなる検証のために、２７種のｍｉＲＮＡを選択した（表３６）。
【０２１０】
表３６． 肺がん患者、腫瘍病理、および正常な対象の情報。ＴＮＭ病期（ＳｏｂｉｎおよびＷｉｔｔｅｋｉｎｄ、２００２年）；ＡＪＣＣ病期（Ｇｒｅｅｎｅ、２００２年）；ＡＤＣＡは腺癌であり；ＡＤＣＡ／ＢＡは気管支肺胞の腺癌であり；ＳＣＣＡは扁平上皮癌であり；ＮＡは該当なしである。
【０２１１】
【表３６−１】

【０２１２】
【表３６−２】

【０２１３】
【表３６−３】

２７種のｍｉＲＮＡを、表３６に示されている肺がん患者の試料と正常な対象の試料とを区別するそれらの能力について評価した。表３７に、がん群および正常群についての各ｍｉＲＮＡの平均Ｃｔ値および標準偏差を示している。ｄＣｔ値は、がん群と正常群との間のＣｔの差を表す。ｍｉＲＮＡは、ｔ検定のｐ値が大きくなるように並べた。２７種のｍｉＲＮＡのうち２４種が、高い統計的有意なレベルで示差的に発現され、０．００１未満のｔ検定のｐ値を有した。これら２４種のｍｉＲＮＡを、肺がんを診断するために使用することができる。
【０２１４】
表３７． 肺がんを有する患者からの血清または正常な対象からの血清におけるｍｉＲＮＡの発現
【０２１５】
【表３７】

受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を使用して、肺がん患者の血清試料と正常な患者の血清試料とを区別する力を有するｍｉＲＮＡの対を同定した。正常な患者とがん患者を区別した示差的に発現された対の選択が表３８に示され、０．９９〜０．７４にわたるＡＵＣが減少するように並べられている。
【０２１６】
表３８． 肺がん患者からの血清を同定するために使用することができるｍｉＲＮＡバイオマーカーの対
【０２１７】
【表３８−１】

【０２１８】
【表３８−２】

【０２１９】
【表３８−３】

ｍｉＲＮＡの示差的な対解析（表３８）に加えて、肺がんの対照と正常な（がんのない）対象を識別したいくつかのｍｉＲＮＡバイオマーカーに基づく分類器モデルを評価した。表３４に記載の試料から得られたデータを用いて分類器モデルを設計した。表３６に示されている無関係な試料に適用した際、このモデルの、肺がん患者と正常な対象を識別することにおける良い性能が実証された。
【０２２０】
詳細には、単純なウエルチのｔ検定およびＲｅｌｉｅｆ法（ＫｉｒａおよびＲｅｎｄｅｌ、Ｐｒｏｃ １０^ｔｈ Ｎａｔｌ Ｃｏｎｆ ｏｎ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ、ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ、１２９〜１３４頁（１９９２年））を使用して、入力として特徴（すなわち、ｍｉＲＮＡ）を選択し、線形判別分析（ＬＤＡ）および線形サポートベクターマシン（ＬＳＶＭ）を、訓練中の分類器として使用した（Ｂｕｒｇｅｓ、Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２巻：１２１〜１６７頁（１９９８年））。表３９に、訓練セットおよび試験セットの両方において肺がんの対象とがんのない対象を区別した代表的な分類器モデルの例を示している。
【０２２１】
表３９． 正常な対象および肺がん患者の訓練セットおよび試験セットにおける分類モデルの性能および特徴の選択
【０２２２】
【表３９】

モデルの性能を、実施例５において前記されている通り、訓練試料に対する５倍交差検証を２５回繰り返し実施し、ＲＯＣのＡＵＣ値を測定することによって、訓練データに対して推定した。分類モデルのそれぞれにおけるｍｉＲＮＡの対の出現頻度が表４０に示されている。
【０２２３】
表４０． 分類器生成における対でのバイオマーカーの分布率。分類モデルは、示されている通りである。
【０２２４】
【表４０】

表４０からの分類器モデルに最も頻繁に関連したユニークなｍｉＲＮＡおよび肺がんの対象とがんのない対象を区別したユニークなｍｉＲＮＡが表４１に示されている。これらのｍｉＲＮＡは、肺がんの患者とがんのない対象とを区別するために使用することができ、したがって、肺がんを特徴づけること、または診断することにおいて使用することができる。
表４１： 肺がんの患者とがんのない対象とを区別するために使用することができるｍｉＲＮＡ
【０２２５】
【表４１】

本明細書を考察し、本明細書に開示されている本発明を実行することにより、本発明の他の実施形態が当業者に明らかになるであろう。本明細書および実施例は単に例示的なものとみなし、本発明の真の範囲および主旨は以下の特許請求の範囲によって示されるものとする。
【０２２６】
本明細書において引用された全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれている刊行物および特許または特許出願が本明細書に含有されている本発明と矛盾する場合には、矛盾する材料のいずれに対しても本明細書が取って代わる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺腫瘍または肺病変を有する患者において肺がんを特徴づける方法であって、
ａ．血清試料中のｍｉＲＮＡのレベルを測定するステップであって、前記ｍｉＲＮＡが、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｅ、ｍｉＲ−１０ａ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３９、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１９６ｂ、ｍｉＲ−１９９ａ^＊、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０ｂ、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３３９、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３６５、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−４３２、ｍｉＲ−４８５−３ｐ、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−５０５、ｍｉＲ−５１８ｂ、ｍｉＲ−５２５、ｍｉＲ−５６６、ｍｉＲ−６０５、ｍｉＲ−６３８、ｍｉＲ−６６０、およびｍｉＲ−９３から選択されるステップと、
ｂ．前記試料中の前記ｍｉＲＮＡのレベルの低下または上昇を決定し、それによって前記患者における肺がんを特徴づけるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記肺がんが小細胞肺がんまたは非小細胞肺がんである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者が、以前に肺疾患についてスクリーニングされたことがある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記患者が、肺がんを有する疑いがある、または肺がんを発症する危険性がある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記スクリーニングが、ＣＴスキャンまたは胸部Ｘ線によるものであった、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ｍｉＲＮＡを増幅するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅が、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によるものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第２のｍｉＲＮＡを増幅し、測定し、そのレベルの低下または上昇を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
患者における肺疾患を特徴づける方法であって、
ａ．血清試料中の第１のｍｉＲＮＡおよび第２のｍｉＲＮＡのレベルを測定するステップであって、前記第１のｍｉＲＮＡが、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−１０６ａ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２６^＊、ｍｉＲ−１３０ｂ、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４６ｂ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５１、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−１８６、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−１９３ａ、ｍｉＲ−１９９ａ^＊、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２６ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−３０１、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ、ｍｉＲ−３０ｃ、ｍｉＲ−３０ｄ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３３５、ｍｉＲ−３４０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−４２２ｂ、ｍｉＲ−４２５、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−４９６、ｍｉＲ−５１８ｂ、ｍｉＲ−６６０、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−９３、ｍｉＲ−９８、ｍｉＲ−９９ａ、およびｍｉＲ−９９ｂから選択されるステップと、
ｂ．前記試料中の前記第１のｍｉＲＮＡおよび前記第２のｍｉＲＮＡのレベルの低下または上昇を検出し、それによって前記患者における肺疾患を特徴づけるステップと
を含む方法。
【請求項１０】
前記第１のｍｉＲＮＡが、ｌｅｔ−７ｇ、ｍｉＲ−１０６ｂ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１２６^＊、ｍｉＲ−１３２、ｍｉＲ−１４０、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１８１ａ、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−１８１ｄ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−３４２、ｍｉＲ−３４５、ｍｉＲ−３７４、ｍｉＲ−４２２ａ、ｍｉＲ−４２２ｂ、ｍｉＲ−４８６、およびｍｉＲ−９２から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のｍｉＲＮＡおよび前記第２のｍｉＲＮＡが、表３から選択される対である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記肺疾患ががんである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記患者が肺腫瘍または肺病変を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者が、以前に肺疾患についてスクリーニングされたことがある、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記がんが小細胞肺がんまたは非小細胞肺がんである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のｍｉＲＮＡおよび前記第２のｍｉＲＮＡを増幅するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅が、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によるものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記患者が男性である、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者が女性である、請求項９に記載の方法。

【図１】

【図２Ａ】

【図２Ｂ】

【図３】

【図４】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図５Ｅ】

【図５Ｆ】

【図５Ｇ】

【図５Ｈ】

【図５Ｉ】

【図５Ｊ】

【図５Ｋ】

【図５Ｌ】

【図５Ｍ】

【図５Ｎ】

【図５Ｏ】

【図５Ｐ】

【図５Ｑ】

【図５Ｒ】

【図５Ｓ】

【図５Ｔ】

【図５Ｕ】

【公表番号】特表２０１３−５０２９３１（Ｐ２０１３−５０２９３１Ａ）
【公表日】平成２５年１月３１日（２０１３．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２７０１１（Ｐ２０１２−５２７０１１）
【出願日】平成２２年８月２７日（２０１０．８．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６９１６
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２５９１９
【国際公開日】平成２３年３月３日（２０１１．３．３）
【出願人】（５０９０６７５５５）アスラジェン，　インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】