胚体内胚葉細胞の増殖
本明細書中で開示されるのは、増殖した胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物、並びに培養で胚体内胚葉細胞を増殖するための方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[発明の分野]
本発明は、医学及び細胞生物学の分野に関する。特に本発明は、富化、単離及び／又は精製の前又は後に増殖した胚体内胚葉細胞の組成物、並びにこのような細胞を産生及び使用する方法に関する。
【０００２】
［関連出願］
本出願は、米国特許仮出願第６０／６９３，３１７号（表題「単離された胚体内胚葉細胞の増殖」、２００５年６月２３日出願）の非仮出願であり、それに対する優先権を主張し、そして米国特許仮出願第６０／７３６，５９８号（表題「胚体内胚葉のマーカー」、２００５年１１月１４日出願）の非仮出願であり、それに対する優先権を主張する；本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき、米国特許仮出願第６０／５８７，９４２号（表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体」、２００４年７月１４日出願）；米国特許仮出願第６０／５８６，５６６号（表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体」、２００４年７月９日出願）；及び米国特許仮出願第６０／５３２，００４号（表題「胚体内胚葉」、２００３年１２月２３日出願）に対する非仮出願として優先権を主張する米国特許出願第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉」、２００４年１２月２３日出願）の一部継続出願であり、それに対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
［背景］
ヒト多能性（pluripotent）幹細胞、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞及び胚性生殖（ＥＧ）細胞は、１９９４年に線維芽細胞フィーダーを含有しない（Bongso et al., 1994）そして線維芽細胞フィーダーを含有する（Hogan, 1997）培養でまず単離された。後に、Thomson、Reubinoff及びShamblottは、有糸分裂不活性化マウスフィーダー層を用いたヒトＥＳ及びＥＧ細胞の連続培養を確立した（Reubinoff et al., 2000；Shamblott et al., 1998；Thomson et al., 1998）。
【０００４】
ヒトＥＳ及びＥＧ細胞（ｈＥＳＣ）は、ヒト発生の早期段階を研究するための、並びにいくつかの疾患状態、例えば真性糖尿病及びパーキンソン病における療法的介入のための独自の機会を提供する。例えばｈＥＳＣ由来のインスリン生産β細胞の使用は、糖尿病の治療のためにドナー膵臓からの細胞を利用する現在の細胞療法手順を上回る膨大な改善を提供する。しかしながら現在、ｈＥＳＣからインスリン生産β細胞を生成する方法は分かっていない。したがって、ドナー膵臓からの島細胞を利用する真性糖尿病のための現在の細胞療法処置は、移植に必要とされる高品質の島細胞の不足により制限される。一人のＩ型糖尿病患者のための細胞療法は、約８×１０8個の膵臓島細胞の移植を要する（Shapiro
et al., 2000；Shapiro et al., 2001a；Shapiro et al., 2001b）。したがって、少なくとも２つの健常ドナー器官が、上首尾の移植のために十分な島細胞を得るために必要とされる。ヒト胚性幹細胞は、ヒト細胞療法のための相当量の高品質分化細胞を発生させるための出発材料の供給源を提供する。
【０００５】
ｈＥＳＣを細胞療法用途に独特に適合させる２つの特性は、多能性、並びに培養でこれらの細胞を長期間維持する能力である。多能性は、３つの一次胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）すべての誘導体に分化し、次に胚体外組織（例えば胎盤）及び生殖細胞のほかに、成熟生物体のすべての体細胞型を形成するｈＥＳＣの能力により確定される。多能性はｈＥＳＣに並外れた有用性を付与するが、この特性は、これらの細胞及びそれらの誘導体の研究及び操作のための独特のチャレンジを提起する。ｈＥＳＣ培養物を分化するに際して
生じ得る非常に種々の細胞型のために、混合された細胞集団において膨大な数の細胞型が極めて低い効率で産生される。ｈＥＳＣを、細胞療法用途に有用な細胞を生成するための出発材料として用いるために、上記の問題を克服することは有益であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
［発明の概要］
本発明の実施形態は、増殖した胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に関する。本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、培養で富化、単離及び／又は精製された胚体内胚葉細胞を増殖するための方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書中に記載される方法のいくつかは、細胞培養物中での胚体内胚葉細胞の維持、増殖(growth)、継代培養及び／又は増殖(expansion)に関する。このような実施形態では、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物が得られる。次に細胞は単離され、胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかが細胞培養物中の他の細胞の少なくともいくつかから分離され、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を産生する。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団は、胚体内胚葉細胞の増殖を可能にする条件下で培養される。
【０００８】
本明細書中に記載される方法のその他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、腸管の細胞又はそれに由来する器官に分化し得る多分化能細胞である。好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を分化させることにより得られるヒト胚体内胚葉細胞である。このような実施形態では、胚体内胚葉細胞は、このような細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子、例えばアクチビンＡと接触させることにより、ｈＥＳＣから得られる。他の実施形態では、ヒト及び／又はその他の胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞の既存の培養物から得られる。このような実施形態では、培養物の一部分又は全部が、本明細書中に記載される胚体内胚葉細胞の増殖方法に用いられ得る。
【０００９】
胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を得るほかに、本明細書中に記載される増殖方法のいくつかの実施形態は、富化された胚体内胚葉細胞集団を産生する工程も含む。いくつかの実施形態では、このような富化された胚体内胚葉細胞集団は、細胞培養物中の他の細胞の少なくともいくつかから胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかを分離することにより産生される。したがって、胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかが、細胞培養物中に残存する他の細胞の少なくともいくつかから単離される。いくつかの実施形態では、単離する工程は、上記の胚体内胚葉細胞中で発現されるマーカーと結合するが、細胞培養物中に存在する上記の他の細胞中で実質的に発現されない試薬を細胞培養物中の細胞に提供することを含む。試薬結合胚体内胚葉細胞は次に、試薬非結合細胞から分離され、それにより富化された胚体内胚葉細胞集団を産生する。いくつかの実施形態では、マーカーはＣＸＣＲ４であり、そして試薬はＣＸＣＲ４に対する親和性を有する抗体である。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により分離される。
【００１０】
さらに他の実施形態では、胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかは、培養中の胚体内胚葉細胞を特異的に蛍光標識し、次にＦＡＣＳにより標識細胞を非標識細胞から分離することにより、培養物中の他の細胞の少なくともいくつかから分離される。いくつかの実施形態では、蛍光は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）により発生される。いくつかの実施形態では、ＧＦＰ及び／又はＥＧＦＰは、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーターの制御下で発現される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、上記のように産生される富化された胚体内胚葉細胞集団は、
胚体内胚葉細胞以外の細胞を実質的に含有しない。他の実施形態では、富化された胚体内胚葉細胞集団は、少なくとも約９６％〜少なくとも約１００％の胚体内胚葉細胞を含む。
【００１２】
本明細書中に記載される方法の付加的な実施形態は、胚体内胚葉細胞に富んだ集団又は当該集団の一部分をプレーティングすることを含む、培養する工程も含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトフィブロネクチン及び／又はポリ−オルニチンで被覆された表面でプレーティングされる。他の実施形態では、培養する工程は、約２％（ｖ／ｖ）の血清を含む培地中に富んだ胚体内胚葉細胞集団又はその一部分をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、培地は、少なくとも１つの成長因子も含む。或る特定の実施形態では、少なくとも１つの成長因子は、ＴＧＦβスーパーファミリーの一成員、例えばアクチビンＡを含む成長因子である。或いは、成長因子は、ＩＧＦ１、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ又は別の成長因子であり得る。このような実施形態では、成長因子は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で培地中に存在し得る。いくつかの実施形態では、成長因子の組合せが培地中に存在する。
【００１３】
本明細書中に記載される付加的な実施形態は、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を得て、次に胚体内胚葉細胞を継代培養し、それにより胚体内胚葉細胞を含む複数の細胞培養物を産生することにより培養で胚体内胚葉細胞を増殖する方法に関する。いくつかの実施形態では、細胞培養物中で得られる胚体内胚葉細胞は基材、例えば細胞培養フラスコの表面又はマイクロタイタープレートの表面に付着される。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は酵素的方法を用いて継代培養される。他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は機械的に継代培養される。さらに他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は細胞分散緩衝液を用いて継代培養される。
【００１４】
本明細書中に記載されるさらに他の実施形態は、本明細書中に記載される方法により産生される増殖胚体内胚葉細胞の培養物及び／又は集団に関する。このような実施形態では、胚体内胚葉細胞は、腸管の細胞又はそれに由来する器官に分化し得る多分化能細胞である。
【００１５】
或る特定の権限において、「〜を含む（comprising）」という用語の任意の一般的に許容可能な定義は存在し得ない。本明細書中で用いる場合、「〜を含む」という用語は、任意の付加的な要素の含入を可能にする「オープン」言語を表すよう意図される。これに留意して、本発明の付加的な実施形態を、以下の番号を付した段落を参照しながら説明する。
【００１６】
１． 培養で胚体内胚葉細胞を増殖する方法であって、以下：（ａ）胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得する工程；（ｂ）上記細胞培養物中の他の細胞のうちの少なくともいくつかから上記胚体内胚葉細胞のうちの少なくともいくつかを単離する工程であって、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を作り出す、工程；及び（ｃ）上記胚体内胚葉細胞の増殖を可能にする条件下で上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を培養する工程を含む、方法。
【００１７】
２． 上記胚体内胚葉細胞が腸管の細胞又はそれに由来する器官に分化し得る多分化能細胞である、段落１記載の方法。
【００１８】
３． 上記胚体内胚葉細胞がヒト胚体内胚葉細胞である、段落１記載の方法。
【００１９】
４． 上記胚体内胚葉細胞がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に由来する、段落３記載の方法。
【００２０】
５． 上記取得する工程が、上記ｈＥＳＣのうちの少なくともいくつかの胚体内胚葉細胞への分化を可能にするために、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子とｈＥＳＣを接触させることを含む、段落４記載の方法。
【００２１】
６． 上記ＴＧＦβスーパーファミリーの上記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡを含む、段落５記載の方法。
【００２２】
７． 胚体内胚葉細胞を含む上記細胞培養物を取得する工程が、現存する胚体内胚葉培養物の一部分を取得することをさらに含む、段落１記載の方法。
【００２３】
８． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が胚体内胚葉細胞以外の細胞を実質的に含有しない、段落１記載の方法。
【００２４】
９． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９６％の胚体内胚葉細胞を含む、段落１記載の方法。
【００２５】
１０． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９７％の胚体内胚葉細胞を含む、段落１記載の方法。
【００２６】
１１． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９８％の胚体内胚葉細胞を含む、段落１記載の方法。
【００２７】
１２． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９９％の胚体内胚葉細胞を含む、段落１記載の方法。
【００２８】
１３． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が約１００％の胚体内胚葉細胞を含む、段落１記載の方法。
【００２９】
１４． 上記単離する工程が、上記胚体内胚葉細胞中で発現されるマーカーと結合するが、細胞培養物中に存在する上記他の細胞中で実質的に発現されない試薬を上記細胞培養物に提供すること、及び、細胞培養物中に存在する上記他の細胞から上記試薬に結合された上記胚体内胚葉細胞を分離することであって、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を生じることを含む、段落１記載の方法。
【００３０】
１５． 上記マーカーがＣＸＣＲ４である、段落１４記載の方法。
【００３１】
１６． 上記試薬が抗体である、段落１４記載の方法。
【００３２】
１７． 上記抗体がＣＸＣＲ４に対する親和性を有する、段落１６の方法。
【００３３】
１８． 上記試薬に結合される上記胚体内胚葉細胞が蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により細胞培養物中に存在する上記他の細胞から分離される、段落１４記載の方法。
【００３４】
１９． 上記単離する工程が非標識細胞から蛍光標識胚体内胚葉細胞を分離することを含む、段落１記載の方法。
【００３５】
２０． 上記蛍光標識胚体内胚葉細胞が強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現の結果として標識される、段落１９記載の方法。
【００３６】
２１． ＥＧＦＰの発現がＳＯＸ１７プロモーターの制御下にある、段落２０記載の方
法。
【００３７】
２２． ＥＧＦＰの発現がＣＸＣＲ４プロモーターの制御下にある、段落２０記載の方法。
【００３８】
２３． 上記蛍光標識胚体内胚葉細胞がＦＡＣＳにより非標識細胞から分離される、段落１９の方法。
【００３９】
２４． 上記培養する工程が上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をプレーティングすることを含む、段落１記載の方法。
【００４０】
２５． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分がヒトフィブロネクチンで被覆された表面でプレーティングされる、段落２４記載の方法。
【００４１】
２６． 上記表面がポリオルニチンで被覆される、段落２５記載の方法。
【００４２】
２７． 上記培養する工程が約２％（ｖ／ｖ）の血清を含む培地中で上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、段落１記載の方法。
【００４３】
２８． 上記培養する工程が約２％（ｖ／ｖ）よりも多い血清を含む培地中で上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、段落１記載の方法。
【００４４】
２９． 上記培養する工程が約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、段落１記載の方法。
【００４５】
３０． 上記培養する工程が少なくとも１つの成長因子を含む培地中で上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、段落１記載の方法。
【００４６】
３１． 上記少なくとも１つの成長因子がＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子の一成長因子である、段落３０記載の方法。
【００４７】
３２． 上記ＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子の少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡを含む、段落３１記載の方法。
【００４８】
３３． 上記アクチビンＡが約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で上記培地中に存在する、段落３２記載の方法。
【００４９】
３４． 上記少なくとも１つの成長因子がＩＧＦ１を含む、段落３０記載の方法。
【００５０】
３５． 上記ＩＧＦ１が約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で上記培地中に存在する、段落３４記載の方法。
【００５１】
３６． 上記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡとＩＧＦ１との組合せを含む、段落３０記載の方法。
【００５２】
３７． 上記少なくとも１つの成長因子がｂＦＧＦを含む、段落３０記載の方法。
【００５３】
３８． 上記ｂＦＧＦが約１２ｎｇ／ｍｌの濃度で上記培地中に存在する、段落３７記
載の方法。
【００５４】
３９． 上記少なくとも１つの成長因子がＥＧＦを含む、段落３０記載の方法。
【００５５】
４０． 上記ＥＧＦが約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で上記培地中に存在する、段落３９記載の方法。
【００５６】
４１． 上記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡと、ｂＦＧＦと、ＥＧＦとの組合せを含む、段落３０記載の方法。
【００５７】
４２． 段落１記載の方法により産生される増殖した胚体内胚葉細胞集団。
【００５８】
４３． 培養で胚体内胚葉細胞を増殖する方法であって、以下：（ａ）胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得する工程、及び（ｂ）上記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程であって、それにより胚体内胚葉細胞を含む複数の細胞培養物を産生する工程を含む、方法。
【００５９】
４４． 上記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、上記細胞培養物に少なくとも１つの酵素を提供することを含む、段落４３記載の方法。
【００６０】
４５． 上記少なくとも１つの酵素が少なくとも１つのプロテアーゼを含む、段落４４記載の方法。
【００６１】
４６． 上記少なくとも１つのプロテアーゼがトリプシンを含む、段落４５記載の方法。
【００６２】
４７． 上記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、上記胚体内胚葉細胞間の接触を機械的に妨げることを含む、段落４３記載の方法。
【００６３】
４８． 上記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、細胞分散緩衝液中で上記胚体内胚葉細胞をインキュベートすることを含む、段落４３記載の方法。
【００６４】
４９． 上記胚体内胚葉細胞が基材に付着される、段落４３記載の方法。
【００６５】
５０． 上記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、上記基材から上記胚体内胚葉細胞を剥離することを含む、段落４９記載の方法。
【００６６】
５１． 上記基材が組織培養フラスコの表面である、段落５０記載の方法。
【００６７】
５２． 上記基材がマイクロタイタープレートの表面である、段落５０記載の方法。
【００６８】
５３． 段落４３記載の方法により産生される増殖した胚体内胚葉細胞集団。
【００６９】
上記の方法及び組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞に関することが理解されよう。しかしながら上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ用途のために用いられ得る。
【００７０】
本発明の付加的な実施形態は、米国特許仮出願第６０／５３２，００４号（表題「胚体内胚葉」、２００３年１２月２３日出願）；米国特許仮出願第６０／５６６，２９３号（表題「ＰＤＸ１発現内胚葉」、２００４年４月２７日出願）；米国特許仮出願第６０／５
８６，５６６号（表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体」、２００４年７月９日出願）；米国特許仮出願第６０／５８７，９４２号（表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体」、２００４年７月１４日出願）；米国特許出願第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉」、２００４年１２月２３日出願）；米国特許出願第１１／１１５，８６８号（表題「ＰＤＸ１発現内胚葉」、２００５年４月２６日出願）；米国特許出願第１１／１６５，３０５号（表題「胚体内胚葉を分化させるための因子の同定方法」、２００５年６月２３日出願）；米国特許仮出願第６０／６９３３６４号（表題「前原始線条及び中内胚葉細胞；米国特許仮出願第６０／６９３，３１７号（表題「単離された胚体内胚葉細胞の増殖」、２００５年６月２３日出願）；及び米国特許仮出願第６０／７３６，５９８号（表題「胚体内胚葉のマーカー」、２００５年１１月１４日出願）（これらの開示はその全体が参照により本明細書に援用される）にも見出され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７１】
［詳細な説明］
原腸陥入と呼ばれる初期ヒト発生におけるきわめて重大な段階は、受精後２〜３週間で起こる。原腸陥入は、３つの一次胚葉が最初に特定化され、そして器官形成されるのがこの時期であるため、非常に重要である（Lu et al., 2001；Schoenwolf and Smith, 2000）。外胚葉は、身体の外被及び全神経系の終局的形成を担うが、一方、心臓、血液、骨、骨格筋及びその他の結合組織は中胚葉に由来する。胚体内胚葉は、食道、胃並びに小腸及び大腸を含む全腸管、並びに腸管に由来する器官、例えば肺、肝臓、胸腺、上皮小体及び甲状腺、胆嚢及び膵臓の形成を担う胚葉として定義される（Grapin-Botton and Melton, 2000；Kimelman and Griffin, 2000；Tremblay et al., 2000；Wells and Melton, 1999；Wells and Melton, 2000）。非常に重要な区別は、胚体内胚葉と原始内胚葉と呼ばれる細胞の完全に別個の系統との間でなされるべきである。原始内胚葉は主として、胚体外組織、主に胎盤卵黄嚢の壁側及び臓側内胚葉部分、並びにライヘルト膜の細胞外マトリックス物質の形成を担う。
【００７２】
原腸陥入中、胚体内胚葉形成のプロセスは、中内胚葉細胞（中胚葉又は内胚葉を形成するための細胞構成成分）が原始線条と呼ばれる構造を介して移動する細胞移動事象で開始する。胚体内胚葉は、線条の前部分を通して、そして結節（線条の最前領域での特定構造）を通って移動する細胞に由来する。移動が起こると、胚体内胚葉はまず最前腸管に集合し、そして腸管の後端を形成する。
【００７３】
胚体内胚葉及びそれに由来する内胚葉細胞は、胚体内胚葉系統由来の最終的分化組織及び／又は器官を構成する細胞の誘導のための重要な多分化能出発点を表す。このような細胞、組織及び／又は器官は、細胞療法に非常に有用である。上首尾の細胞療法用途のためには多数の細胞が通常必要であるため、単一細胞型の多数の細胞を用いて分化手順を開始することが有益である。培養中の胚性幹細胞は胚体内胚葉に分化する場合、すべての胚性幹細胞が胚体内胚葉細胞型に転換されるというわけではない。この問題を克服するために、混合細胞培養物中で増殖中の胚体内胚葉細胞は、本明細書中に記載される方法を用いて、富化され、単離され及び／又は精製され得る。このような富化、単離及び／又は精製後、その結果生じた胚体内胚葉細胞は培養で増殖することが容易でないかもしれない。本明細書中に記載される方法は、富化、単離及び／又は精製された胚体内胚葉細胞が細胞培養物中で増殖(grow)及び増殖(expand)する能力を改良する。胚体内胚葉細胞はここで、富化、単離及び／又は精製後に培養で増殖され得るため、胚体内胚葉細胞由来の細胞、組織及び／又は器官がより多数産生され得る。
【００７４】
本発明のいくつかの実施形態は、細胞培養物中で胚体内胚葉細胞を増殖する方法に関する。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、混合細胞培養物中の他の細胞からこれ
らの細胞を分離することにより富化される。富化された胚体内胚葉細胞は次に、それらの増殖を可能にする条件下で培養される。
【００７５】
定義
本出願全体を通して用いられるような或る特定のいくつかの用語及び語句は、以下のように提示される意味を有する：
【００７６】
本明細書中で用いる場合、「胚性」とは、単一接合子で開始し、発生した配偶子細胞以外の多能性又は全能性細胞をもはや含まない多細胞構造で終わる生物体の一連の発生段階を指す。配偶子融合により得られる胚のほかに、「胚性」という用語は、体細胞核移行により得られる胚を指す。
【００７７】
本明細書中で用いる場合、「多分化能」又は「多分化能細胞」は、限られた数の他の特定の細胞型を生じ得る細胞型を指す。
【００７８】
本明細書中で用いる場合、「発現」とは、材料又は物質の産生、並びに材料又は物質の産生のレベル又は量を指す。したがって特定マーカーの発現の確定は、発現されるマーカーの相対量又は絶対量の検出、或いは単にマーカーの存在又は非存在の検出を指す。
【００７９】
本明細書中で用いる場合、「マーカー」とは、観察され得るか又は検出され得る任意の分子を指す。例えばマーカーとしては、核酸、例えば特定遺伝子の転写物、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質又は低分子（例えば１００００ａｍｕ未満の分子量を有する分子）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
細胞培養物及び／又は細胞集団に関連して用いられる場合、「一部分」という用語は、単一細胞から細胞培養物又は細胞集団の全体までの範囲である任意のゼロでない量の細胞培養物又は細胞集団を意味する。
【００８１】
細胞培養物中又は細胞集団中の細胞に関して、「〜を実質的に含有しない」という語句は、細胞培養物又は細胞集団を含有しない特定細胞型が、細胞培養物又は細胞集団中に存在する細胞の総数の約５％未満の量で存在する、ということを意味する。
【００８２】
細胞培地に関して、本明細書中で用いる場合、「低血清ＲＰＭＩ」は、所定の時間中に血清濃度が徐々に増大される低血清含有培地を指す。例えば一実施形態では、低血清ＲＰＭＩは、細胞増殖第１日目に約０．２％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、細胞増殖第２日目に約０．５％ＦＢＳ、そして細胞増殖の第３〜５日目に約２％のＦＢＳの濃度を含む。別の実施形態では、低血清ＲＰＭＩは、１日目に約０％、２日目に約０．２％、そして３日目及びその後日に約２％の濃度を含む。
【００８３】
本明細書中で用いる場合、「ｂＦＧＦ」及び「ＦＧＦ２」という用語は、互換的に用いられる。
【００８４】
胚体内胚葉細胞及びそれらに関連するプロセス
本明細書中に記載する実施形態は、幹細胞のような多能性細胞を、多分化能胚体内胚葉細胞へ分化させることにより培養で胚体内胚葉細胞を産生するための新規の所定のプロセスに関する。上述したように、胚体内胚葉細胞は、外胚葉又は中胚葉から産生される組織へ分化するのではなく、腸管並びに腸管に由来する器官へ分化する。或る特定の好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ｈＥＳＣに由来する。かかるプロセスは、膵臓、肝臓、肺、胃、腸、甲状腺及び胸腺のような組織に由来するヒト内胚葉の効率的な産生に関す
る基盤を提供することができる。例えば、胚体内胚葉の産生は、機能的インスリン生産β細胞への幹細胞の分化における第１の工程であり得る。有用な量のインスリン生産β細胞を得るためには、膵臓島／β細胞運命(fate)に到達する前に起きる分化工程のそれぞれに関して、高効率の分化が望まれる。胚体内胚葉細胞への幹細胞の分化は、機能的膵臓島／β細胞の産生に対しておそらく一番初めの工程を表す（図１に示されるように）ため、この工程での高効率の分化が特に望まれる。
【００８５】
胚体内胚葉細胞への多能性細胞の効率的分化の望ましさに鑑みて、本明細書中に記載される分化プロセスのいくつかの態様は、胚体内胚葉細胞への多能性細胞の約５０〜８０％の転換を生じるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。典型的には、このような方法は、所定の且つ一時的に特定化された様式での培養及び成長因子条件の適用を包含する。胚体内胚葉細胞に関する細胞集団のさらなる富化は、胚体内胚葉細胞と特異的に結合する試薬を用いることにより、集団中の他の細胞からの胚体内胚葉細胞の単離及び／又は精製により達成され得る。したがって、本明細書において記載されるいくつかの実施形態は、胚体内胚葉細胞並びにこのような細胞を産生するための方法及び単離するための方法及び／又は精製するための方法に関する。
【００８６】
細胞培養物又は細胞集団中の胚体内胚葉細胞の量を確定するためには、培養物中又は集団中の他の細胞からこの細胞型を区別する方法が望ましい。したがって、本明細書中に記載される或る特定の実施形態は、その存在、非存在及び／又は相対発現レベルが胚体内胚葉に特異的である細胞マーカー、並びにこのようなマーカーの発現を検出し、確定するための方法に関する。
【００８７】
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、マーカーの存在、非存在及び／又は発現レベルは、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により確定される。例えば或る特定の遺伝子マーカー、例えばＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、ＳＯＸ７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１、ＣＲＩＰ１、並びに本明細書中に記載される他のマーカーにより産生される転写物の量が、定量的Ｑ−ＰＣＲにより確定される。他の実施形態では、免疫組織化学を用いて、上記遺伝子により発現されるタンパク質を検出する。さらに他の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲ及び免疫組織化学的技法が、このようなマーカーの量又は相対的な比率を同定すると共に確定するために用いられる。
【００８８】
１つ又は複数の適切なマーカーの発現を確定するための上述に記載したような方法を使用することにより、胚体内胚葉細胞を同定すること、並びに細胞培養物又は細胞集団における胚体内胚葉細胞の比率を確定することが可能である。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、産生される胚体内胚葉細胞又は細胞集団は、非胚体内胚葉細胞型又は細胞集団よりも約２桁大きいレベルでＳＯＸ１７及び／又はＣＸＣＲ４遺伝子を発現する。他の実施形態では、産生される胚体内胚葉細胞又は細胞集団は、非胚体内胚葉細胞型又は細胞集団よりも２桁を超えるレベルでＳＯＸ１７及び／又はＣＸＣＲ４遺伝子を発現する。さらに他の実施形態では、産生される胚体内胚葉細胞又は細胞集団は、非胚体内胚葉細胞型又は細胞集団よりも約２桁以上大きいレベルでＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択されるマーカーの１つ又は複数を発現する。本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ＰＤＸ１を実質的に発現しない。
【００８９】
本明細書中に記載される実施形態は、胚体内胚葉組成物にも関する。例えばいくつかの実施形態は胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に関するが、一方、他の実施形態は、胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団に関する。いくつかの好ましい実施形態は、培養中の細胞の少なくとも約５０〜８０％が胚体内胚葉細胞である胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に関す
る。特に好ましい実施形態は、培養中のヒト細胞の少なくとも約５０〜８０％が胚体内胚葉細胞であるヒト細胞を含む細胞培養物に関する。分化手順の効率は、或る特定のパラメーター、例えば細胞成長条件、成長因子濃度及び培養工程の時期（これらに限定されない）を修正することにより調整され得るため、本明細書中に記載される分化手順は、胚体内胚葉細胞への多能性細胞の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９５％より多い転換を生じ得る。他の好ましい実施形態では、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団への多能性細胞集団、例えば幹細胞集団の転換が意図される。
【００９０】
本明細書中に記載される組成物及び方法は、いくつかの有用な特徴を有する。例えば胚体内胚葉を含む細胞培養物及び細胞集団、並びにこのような細胞培養物及び細胞集団を産生する方法は、ヒト発生の初期をモデリングするのに有用である。さらに、本明細書中に記載される組成物及び方法は、疾患状態、例えば真性糖尿病における治療的介入にも役立ち得る。例えば胚体内胚葉は限られた数のみの組織のための供給源として役立つため、それは純粋組織又は細胞型の発生に用いられ得る。
【００９１】
多能性細胞からの胚体内胚葉の産生
胚体内胚葉を含む細胞培養物及び富化された細胞集団を産生するように多能性細胞を分化させるプロセスは、以下に、また米国特許第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉」２００４年１２月２３日出願）に記載されている。その開示は、参照により本明細書に全体が援用される。これらのプロセスのいくつかでは、出発材料として使用される多能性細胞は、幹細胞である。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉細胞を含む胚体内胚葉細胞培養物及び富化された細胞集団は、胚性幹細胞から産生される。胚体内胚葉細胞を派生させる好ましい方法は、胚体内胚葉産生のための出発材料として、ヒト胚性幹細胞を利用することである。かかる多能性細胞は、桑実胚に由来する細胞、胚の内部細胞塊又は胚の生殖腺隆起に由来する細胞であり得る。ヒト胚性幹細胞は、当該技術分野で既知の方法を使用して、実質的な分化なしで多能性状態で培養物中に維持されることができる。かかる方法は、例えば米国特許第５，４５３，３５７号、同第５，６７０，３７２号、同第５，６９０，９２６号、同第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号及び同第６，２５１，６７１号に記載されている。これらの開示は参照により本明細書に全体が援用される。
【００９２】
胚体内胚葉細胞を産生するためのいくつかのプロセスにおいて、ｈＥＳＣは、フィーダー層上に維持される。このようなプロセスでは、ｈＥＳＣを多能性状態に維持させる任意のフィーダー層が用いられ得る。ヒト胚性幹細胞を培養するために一般的に用いられる１つのフィーダー層は、マウス線維芽細胞の層である。さらに近年、ヒト線維芽細胞フィーダー層が、ｈＥＳＣの培養に用いるために開発された（その開示は参照により本明細書に全体が援用される、米国特許出願第２００２／００７２１１７号参照）。胚体内胚葉を産生するための代替的プロセスは、フィーダー層の使用を伴わずに多能性ｈＥＳＣの維持を可能にする。フィーダーを使用しない条件下での多能性ｈＥＳＣの維持方法は、米国特許出願第２００３／０１７５９５６号に記載されている。その開示は参照により本明細書に全体が援用される。
【００９３】
本明細書中で用いられるヒト胚性幹細胞は、血清を含有するか又は含有しない培養物中に維持され得る。いくつかの胚性幹細胞維持手順では、血清代替物が用いられる。他の場合には、無血清培養技法、例えば米国特許出願第２００３／０１９０７４８号（その開示は参照により本明細書に全体が援用される）に記載される技法が用いられる。
【００９４】
幹細胞は、それらが胚体内胚葉へ分化されることを望まれるまで、日常的な継代培養に
より多能性状態で培養で維持される。いくつかのプロセスでは、胚体内胚葉への分化は、胚体内胚葉への分化を促進するのに十分な量でＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子を幹細胞培養物へ供給することにより達成される。胚体内胚葉の産生に有用であるＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子は、ノーダル／アクチビン又はＢＭＰサブグループから選択される。いくつかの好ましい分化プロセスでは、成長因子は、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びＢＭＰ４から成る群から選択される。さらに、成長因子Ｗｎｔ３ａ及び他のＷｎｔファミリー成員は、胚体内胚葉細胞の産生に有用である。或る特定の分化プロセスでは、上述の成長因子のいずれかの組合せが使用され得る。
【００９５】
胚体内胚葉細胞への多能性幹細胞の分化のためのプロセスのいくつかに関しては、胚体内胚葉細胞への幹細胞の少なくとも一部分の分化を促すのに十分な濃度で成長因子が培養物中に存在するように、上記成長因子が細胞に提供される。いくつかのプロセスでは、上記成長因子は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度で細胞培養物中に存在する。
【００９６】
胚体内胚葉細胞への多能性幹細胞の分化のための或る特定のプロセスでは、上記の成長因子は、それらの付加後、細胞培養物から除去される。例えば成長因子は、それらの付加後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、又は約１０日以内に除去され得る。好ましいプロセスでは、成長因子は、それらの付加後約４日で除去される。
【００９７】
胚体内胚葉細胞の培養物は、低血清又は無血清を含有する培地中で増殖され得る。或る特定の培養条件下では、血清濃度は約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。例えばいくつかの分化プロセスでは、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、又は約１５％（ｖ／ｖ）未満又は約２０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。いくつかのプロセスでは、胚体内胚葉細胞は、血清を用いずに、又は血清代替物を用いて増殖される。さらに他のプロセスでは、胚体内胚葉細胞はＢ２７の存在下で増殖される。このようなプロセスでは、Ｂ２７サプリメントの濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。
【００９８】
胚体内胚葉への多能性細胞の分化のモニタリング
胚体内胚葉へのｈＥＳＣ培養物の進行は、胚体内胚葉に特徴的なマーカーの発現を確定することによりモニタリングされ得る。いくつかのプロセスでは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより確定される。或いは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより確定され得る。このようなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。マーカー遺伝子により産生されるマーカーの発現を定量する一方法は、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）の使用による。Ｑ−ＰＣＲを実施する方法は、当該技術分野で既知である。当該技術分野で既知である他の方法も、マーカー遺伝子発現を定
量するために用いられ得る。例えばマーカー遺伝子産物の発現は、目的のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより検出され得る。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにｈＥＳＣ及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意の発現の欠如が確定される。
【００９９】
以下の実施例でさらに記載するように、胚体内胚葉の信頼性の大きいマーカーは、ＳＯＸ１７遺伝子である。したがって、本明細書中に記載するプロセスにより産生される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現し、それによりＳＯＸ１７遺伝子産物を産生する。胚体内胚葉の他のマーカーは、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１である。胚体内胚葉細胞は、原始内胚葉及び臓側内胚葉に特徴的であるＳＯＸ７マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現する（表１を参照）ため、いくつかのプロセスでは、ＳＯＸ１７及びＳＯＸ７の両方の発現がモニタリングされる。他のプロセスでは、ｈＥＳＣに特徴的であるＳＯＸ１７マーカー遺伝子及びＯＣＴ４マーカー遺伝子の両方の発現がモニタリングされる。さらに、胚体内胚葉細胞は、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ又はトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現するため、これらの遺伝子の発現もまたモニタリングされ得る。
【０１００】
胚体内胚葉の別のマーカーは、ＣＸＣＲ４遺伝子である。ＣＸＣＲ４遺伝子は、細胞表面ケモカイン受容体をコードし、そのリガンドは、化学誘引物質ＳＤＦ−１である。成体におけるＣＸＣＲ４受容体保有細胞の主要な役割は、骨髄への造血細胞の遊走、リンパ球輸送並びに様々なＢ細胞及びマクロファージ血液細胞系統の分化であると考えられる［Kim, C., and Broxmeyer, H.J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)］。ＣＸＣＲ４受容体はまた、Ｔ細胞へのＨＩＶ−１の進入のための共受容体として機能する［Feng, Y., et al.
Science, 272, 872-877 (1996)］。［McGrath, K.E. et al. Dev. Biology 213, 442-456 (1999)］により実施された広範囲の一連の研究では、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４及びその特有のリガンドであるＳＤＦ−１［Kim, C., and Broxmyer, H., J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)］の発現は、マウスにおいて初期発生及び成体期中に描写された。発生におけるＣＸＣＲ４／ＳＤＦ１相互作用は、いずれかの遺伝子がトランスジェニックマウスで破壊される［Nagasawa et al. Nature, 382, 635-638 (1996), Ma, Q., et al Immunmity, 10, 463-471 (1999)］場合、それが後期胚性致死をもたらしたことが実証された際に明らかとなった。McGrath他は、ＣＸＣＲ４は、RNA分解酵素保護及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成方法論の組合せを使用して初期原腸陥入胚（Ｅ７．５）中に検出される最も豊富なケモカイン受容体メッセンジャーＲＮＡであることを実証した。原腸陥入胚では、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１シグナル伝達は、原始線条胚葉細胞の遊走を誘導することに主に関与するようであり、この時期に存在する胚体内胚葉、中胚葉及び胚体外中胚葉上で発現される。Ｅ７．２−７．８マウス胚では、ＣＸＣＲ４及びα−フェトプロテインは、相互排他的であり、臓側内胚葉における発現の欠如を示している［McGrath, K.E. et al.
Dev. Biology 213, 442-456 (1999)］。
【０１０１】
多能性細胞を分化させることにより産生される胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現するため、胚体内胚葉細胞の産生を追跡するために、ＣＸＣＲ４の発現をモニタリングすることができる。さらに、本明細書中に記載する方法により産生される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１を包含するが、これらに限定されない胚体内胚葉の他のマーカーを発現する。胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ７マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現するため、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ７の両方の発現がモニタリングされ得る。他のプロセスでは、ＣＸＣＲ４マーカー遺伝子及びＯＣＴ４マーカー遺伝子の両方の発現がモニタリングされる。さら
に、胚体内胚葉細胞は、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ又はトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現するため、これらの遺伝子の発現もまたモニタリングされ得る。
【０１０２】
内胚葉細胞におけるＣＸＣＲ４の発現は、ＳＯＸ１７の発現を妨げないことが理解されよう。したがって、本明細書中に記載するプロセスにより産生される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４を大いに発現するが、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ又はＰＤＸ１を大いには発現するものではない。
【０１０３】
ＳＯＸ１７及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、分化条件に応じて、胚体内胚葉細胞において多種多様なレベルにわたって誘導されることが理解されよう。したがって、本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞又は細胞集団（例えば、多能性幹細胞）におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現よりも少なくとも約２倍〜少なくとも約１０，０００倍高い。他の実施形態では、胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞又は細胞集団（例えば、多能性幹細胞）におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現よりも、少なくとも約４倍高いか、少なくとも約６倍高いか、少なくとも約８倍高いか、少なくとも約１０倍高いか、少なくとも約１５倍高いか、少なくとも約２０倍高いか、少なくとも約４０倍高いか、少なくとも約８０倍高いか、少なくとも約１００倍高いか、少なくとも約１５０倍高いか、少なくとも約２００倍高いか、少なくとも約５００倍高いか、少なくとも約７５０倍高いか、少なくとも約１０００倍高いか、少なくとも約２５００倍高いか、少なくとも約５０００倍高いか、少なくとも約７５００倍高いか、或いは少なくとも約１００００倍高い。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞又は細胞集団（例えば、多能性幹細胞）におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現よりも飛躍的に高い。
【０１０４】
同様に、本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択されるマーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１の発現と比較して増大されていることが理解されよう。
【０１０５】
さらに、胚体内胚葉細胞中でのＳＯＸ１７マーカーの発現レベルと、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現レベルとの間に或る範囲の差が存在することが理解されよう。同様に、胚体内胚葉細胞中でのＣＸＣＲ４マーカーの発現レベルと、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現レベルとの間に或る範囲の差が存在する。したがって、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７マーカー又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現より少なくとも約２倍〜少なくとも約１００００倍高い。他の実施形態では、ＳＯＸ１７マーカー又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現レベルより少なくとも約４倍高い、少なくとも約６倍高い、少なくとも約８倍高い、少なくとも約１０倍高い、少なくとも約１５倍高い、少なくとも約２０倍高い、少なくとも約４０倍高い、少なくとも約８０倍高い、少なくとも約１００倍高い、少なくとも約１５０倍高い、少なくとも約２００倍高い、少なくとも約５００倍高い、少なくとも約７５０倍高い、少なくとも約１０００倍高い、少なくとも約２５００倍高い、少なくとも約５０００倍高い、少なくとも約７５００倍高いか又は少なくとも約１００００倍高い。いくつかの実施形
態では、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーは、胚体内胚葉細胞中で有意に発現されない。
【０１０６】
本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞におけるＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択されるマーカーの発現は、胚体内胚葉細胞におけるＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７の発現と比較して増大されていることが理解されよう。
【０１０７】
胚体内胚葉の富化、単離及び／又は精製
上述のプロセスのいずれかにより産生される胚体内胚葉細胞は、かかる細胞に特異的である親和性タグを使用することにより、富化、単離及び／又は精製することができる。胚体内胚葉細胞に特異的な親和性タグの例は、胚体内胚葉細胞の細胞表面上に存在するが、本明細書中に記載する方法により産生される細胞培養物中に見出されるであろう他の細胞型上には実質的に存在しないマーカー分子（例えば、ポリペプチド）に特異的である抗体、リガンド又は他の結合剤である。いくつかのプロセスでは、ＣＸＣＲ４に結合する抗体は、胚体内胚葉細胞の富化、単離又は精製用の親和性タグとして使用される。他のプロセスでは、ケモカインＳＤＦ−１又はＳＤＦ−１に基づく他の分子もまた、親和性タグとして使用され得る。かかる分子としては、ＳＤＦ−１フラグメント、ＳＤＦ−１融合体又はＳＤＦ−１模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
抗体を作製し、また細胞単離のためにそれらを使用する方法は当該技術分野で既知であり、かかる方法は、本明細書中に記載する抗体及び胚体内胚葉細胞を用いた使用に実施することができる。一プロセスでは、ＣＸＣＲ４に結合する抗体を磁気ビーズへ結合させた後、細胞間接着及び基材接着を低減させるように酵素的に処理した細胞培養物中の胚体内胚葉細胞へ結合させる。続いて、ビーズ結合された胚体内胚葉細胞と未結合細胞を分離するのに使用される可動性磁界へ細胞／抗体／ビーズ複合体を暴露させる。胚体内胚葉細胞が培養中の他の細胞と物理的に分離されると、抗体結合は妨げられて、細胞は、適切な組織培養培地中で再度プレーティングされる。
【０１０９】
富化、単離又は精製された胚体内胚葉細胞培養物又は集団を得るためのさらなる方法もまた使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ４抗体を、細胞間接着及び基材接着を低減させるように処理した胚体内胚葉含有細胞培養物とともにインキュベートさせる。続いて、細胞を洗浄して、遠心分離して、再懸濁させる。次に、細胞懸濁液を、一次抗体に結合することが可能な二次抗体（例えば、ＦＩＴＣ結合抗体）とともにインキュベートさせる。続いて、細胞を洗浄して、遠心分離して、緩衝液中に再懸濁させる。次に、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使用して、細胞懸濁液を分析及び選別する。ＣＸＣＲ４陽性細胞を、ＣＸＣＲ４陰性細胞と分離して収集して、それによりかかる細胞型の単離をもたらす。望ましい場合、単離された細胞組成物は、代替的な親和性ベースの方法を使用することにより、或いは胚体内胚葉に特異的な同じか又は異なるマーカーを使用したさらなる一連の選別によりさらに精製することができる。
【０１１０】
さらに他のプロセスでは、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４に結合するリガンド又は他の分子を使用して、富化、単離及び／又は精製される。いくつかのプロセスでは、分子はＳＤＦ−１又はそれらのフラグメント、融合体又は模倣物である。
【０１１１】
本明細書中に記載されるプロセスのいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は蛍光標識され、次に蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いて非標識細胞から単離される。このような実施形態では、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸又は発現可能蛍光マーカー遺伝子をコードする別の核酸を用いて、ＰＤＸ１陽性細胞を標識する。例えば
いくつかの実施形態では、ＧＦＰ遺伝子産物又はその生物学的活性断片の発現がＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーターの制御下にあるように、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片の少なくとも１つのコピーが、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーターの下流の多能性細胞、好ましくはヒト胚性幹細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４をコードする核酸の全コード領域が、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片により取って代わられる。他の実施形態では、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片は、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４をコードする核酸の少なくとも一部分とフレーム内で融合され、それにより融合タンパク質を形成する。このような実施形態では、融合タンパク質はＧＦＰと類似の蛍光活性を保有する。
【０１１２】
蛍光標識する細胞、例えば上記の多能性細胞は、上記のように胚体内胚葉に分化される。胚体内胚葉細胞は蛍光マーカー遺伝子を発現するが、一方、他の細胞型はそうではないため、胚体内胚葉細胞は他の細胞型から分離され得る。いくつかの実施形態では、蛍光標識胚体内胚葉細胞及び非標識非胚体内胚葉細胞の混合物を含む細胞懸濁液は、ＦＡＣＳを用いて分類される。胚体内胚葉細胞は非蛍光細胞と別個に収集され、それにより胚体内胚葉の単離を生じる。所望であれば、単離された細胞組成物は、胚体内胚葉に特異的である同一の又は異なるマーカーを用いて、さらに一連の分類によりさらに精製され得る。
【０１１３】
好ましいプロセスでは、胚体内胚葉細胞は、幹細胞培養物が胚体内胚葉系統へと分化するように誘導された後、他の非胚体内胚葉細胞から富化、単離及び／又は精製される。上述の富化、単離及び精製手法は、分化の任意の段階でかかる培養物を用いて使用することができることが理解されよう。
【０１１４】
直ぐ上で記載された手法のほかに、胚体内胚葉細胞は、細胞単離のための他の技法によっても単離され得る。さらに胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞の選択的生存又は選択的増殖を促す成長条件で連続継代培養する方法によっても、富化されるか又は単離され得る。
【０１１５】
本明細書中に記載される方法を用いて、富化、単離及び／又は精製された胚体内胚葉細胞の集団又は組織が、少なくとも何らかの分化を受けた多能性細胞培養物又は細胞集団、例えば幹細胞培養物又は集団からｉｎ ｖｉｔｒｏで産生され得る。いくつかの方法では、細胞は無作為な分化を受ける。しかしながら好ましい方法では、細胞は主に胚体内胚葉に分化するよう指図される。いくつかの好ましい富化、単離及び／又は精製方法は、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生に関する。
【０１１６】
本明細書中に記載される方法を用いて、細胞集団又は細胞培養物は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２〜約１０００倍、胚体内胚葉含量が富化され得る。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約５〜約５００倍、富化され得る。他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約１０〜約２００倍、富化され得る。さらに他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２０〜約１００倍、富化され得る。さらに他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約４０〜約８０倍、富化され得る。或る特定の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２〜約２０倍、富化され得る。
【０１１７】
胚体内胚葉細胞を含む組成物
上記の方法により産生される細胞組成物としては、胚体内胚葉を含む細胞培養物、並びに胚体内胚葉に富んだ細胞集団が挙げられる。例えば、培養中の細胞の少なくとも約５０〜８０％が胚体内胚葉細胞である胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物が産生され得る。分化
プロセスの効率は、或る特定のパラメーター、例えば細胞増殖条件、成長因子濃度及び培養工程の時期（これらに限定されない）を修正することにより調整され得るため、本明細書中に記載される分化手順は、胚体内胚葉への多能性細胞の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９５％より多い転換を生じ得る。胚体内胚葉細胞の単離が用いられるプロセスでは、例えばＣＸＣＲ４受容体と結合する親和性試薬を用いることにより、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団が回収され得る。
【０１１８】
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、多能性細胞、例えば幹細胞と、胚体内胚葉細胞との両方を含む細胞集団及び細胞培養物のような組成物に関する。例えば本明細書中に記載される方法を用いて、ｈＥＳＣ及び胚体内胚葉細胞の混合物を含む組成物が産生され得る。いくつかの実施形態では、約９５個の多能性細胞につき少なくとも約５個の胚体内胚葉細胞を含む組成物が産生される。他の実施形態では、約５個の多能性細胞につき少なくとも約９５個の胚体内胚葉細胞を含む組成物が産生される。さらに、胚体内胚葉細胞対多能性細胞の他の比を含む組成物が意図される。例えば約１，０００，０００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１００，０００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１０，０００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１，０００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約５００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１０個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約５個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約２個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約２個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約５個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１０個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約２０個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約５０個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１００個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１，０００個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１０，０００個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１００，０００個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１，０００，０００個の胚体内胚葉細胞を含む組成物が意図される。いくつかの実施形態では、多能性細胞はヒト多能性幹細胞である。或る特定の実施形態では、幹細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊、又は胚の生殖腺隆起に由来する。或る特定の他の実施形態では、多能性細胞は、胚期が終わって発生した多細胞構造の生殖腺又は胚組織に由来する。
【０１１９】
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、少なくとも約５％の胚体内胚葉細胞〜少なくとも約９９％の胚体内胚葉細胞から成る細胞培養物又は細胞集団に関する。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団は、哺乳類細胞を含む。好ましい実施形態では、細胞培養物又は細胞集団はヒト細胞を含む。例えばいくつかの特定の実施形態は、ヒト細胞の少なくとも約５％〜少なくとも約９５％が胚体内胚葉細胞であるヒト細胞から成る細胞培養物に関する。他の実施形態は、ヒト細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は９０％より多くが胚体内胚葉細胞であるヒト細胞から成る細胞培養物に関する。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
【０１２０】
本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、ヒト細胞、例えばヒト胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関するが、この場合、ＳＯＸ１７マーカー又はＣＸＣＲ４マーカーのいずれかの発現は、少なくとも約５％のヒト細胞では、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現より多い。他の実施形態では、ＳＯＸ１７マーカー又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、少なくとも約１０％のヒト細胞では、少なくとも約１５％のヒト細胞では、少なくとも約２０％のヒト細胞では、少なくとも約２５％のヒト細胞では、少なくとも約３０％のヒト細胞では、少なくとも約３５％のヒト細胞では、少なくとも約４０％のヒト細胞では、少なくとも約４５％のヒト細胞では、少なくとも約５０％のヒト細胞では、少なくとも約５５％のヒト細胞では、少なくとも約６０％のヒト細胞では、少なくとも約６５％のヒト細胞では、少なくとも約７０％のヒト細胞では、少なくとも約７５％のヒト細胞では、少なくとも約８０％のヒト細胞では、少なくとも約８５％のヒト細胞では、少なくとも約９０％のヒト細胞では、少なくとも約９５％のヒト細胞では、又は９５％より多くのヒト細胞では、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現より多い。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
【０１２１】
本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、ヒト胚体内胚葉細胞のようなヒト細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、少なくとも約５％〜少なくとも約９５％を上回るヒト細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きいことが理解されよう。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団におけるヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
【０１２２】
本明細書中に記載するさらに他の実施形態は、ヒト胚体内胚葉細胞のようなヒト細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現は、少なくとも約５％のヒト細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。他の実施形態では、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現は、少なくとも約１０％のヒト細胞において、少なくとも約１５％のヒト細胞において、少なくとも約２０％のヒト細胞において、少なくとも約２５％のヒト細胞において、少なくとも約３０％のヒト細胞において、少なくとも約３５％のヒト細胞において、少なくとも約４０％のヒト細胞において、少なくとも約４５％のヒト細胞において、少なくとも約５０％のヒト細胞において、少なくとも約５５％のヒト細胞において、少なくとも約６０％のヒト細胞において、少なくとも約６５％のヒト細胞において、少なくとも約７０％のヒト細胞において、少なくとも約７５％のヒト細胞において、少なくとも約８０％のヒト細胞において、少なくとも約８５％のヒト細胞において、少なくとも約９０％のヒト細胞において、少なくとも約９５％のヒト細胞において、或いは少なくとも約９５％を上回るヒト細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団におけるヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
【０１２３】
本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、ヒト胚体内胚葉細胞のようなヒト細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１マーカーの発現は、少なくとも約５％〜少なくとも約９５％を上回るヒト細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大
きいことが理解されよう。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団におけるヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
【０１２４】
本明細書中に記載するさらなる実施形態は、ヒト内胚葉細胞のような哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４マーカーのいずれかの発現は、少なくとも約５％の内胚葉細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。他の実施形態では、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４マーカーのいずれかの発現は、少なくとも約１０％の内胚葉細胞において、少なくとも約１５％の内胚葉細胞において、少なくとも約２０％の内胚葉細胞において、少なくとも約２５％の内胚葉細胞において、少なくとも約３０％の内胚葉細胞において、少なくとも約３５％の内胚葉細胞において、少なくとも約４０％の内胚葉細胞において、少なくとも約４５％の内胚葉細胞において、少なくとも約５０％の内胚葉細胞において、少なくとも約５５％の内胚葉細胞において、少なくとも約６０％の内胚葉細胞において、少なくとも約６５％の内胚葉細胞において、少なくとも約７０％の内胚葉細胞において、少なくとも約７５％の内胚葉細胞において、少なくとも約８０％の内胚葉細胞において、少なくとも約８５％の内胚葉細胞において、少なくとも約９０％の内胚葉細胞において、少なくとも約９５％の内胚葉細胞において、或いは少なくとも約９５％を上回る内胚葉細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。
【０１２５】
本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、少なくとも約５％〜少なくとも約９５％を上回る内胚葉細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きいことが理解されよう。
【０１２６】
本明細書中に記載するさらなる他の実施形態は、ヒト内胚葉細胞のような哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現は、少なくとも約５％の内胚葉細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。他の実施形態では、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現は、少なくとも約１０％の内胚葉細胞において、少なくとも約１５％の内胚葉細胞において、少なくとも約２０％の内胚葉細胞において、少なくとも約２５％の内胚葉細胞において、少なくとも約３０％の内胚葉細胞において、少なくとも約３５％の内胚葉細胞において、少なくとも約４０％の内胚葉細胞において、少なくとも約４５％の内胚葉細胞において、少なくとも約５０％の内胚葉細胞において、少なくとも約５５％の内胚葉細胞において、少なくとも約６０％の内胚葉細胞において、少なくとも約６５％の内胚葉細胞において、少なくとも約７０％の内胚葉細胞において、少なくとも約７５％の内胚葉細胞において、少なくとも約８０％の内胚葉細胞において、少なくとも約８５％の内胚葉細胞において、少なくとも約９０％の内胚葉細胞において、少なくとも約９５％の内胚葉細胞において、或いは少なくとも約９５％を上回る内胚葉細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。
【０１２７】
本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１マーカーの発現は、少なくとも約５％〜少なくとも約９５％を上回る内胚葉細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きいことが理解さ
れよう。
【０１２８】
本明細書中に記載される方法を用いて、他の細胞型を実質的に含有しない胚体内胚葉細胞を含む組成物が産生され得る。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法により産生される胚体内胚葉細胞集団又は細胞培養物は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ、ＴＭ、ＺＩＣ１又はＢＲＡＣＨマーカー遺伝子を有意に発現する細胞を実質的に含有しない。
【０１２９】
一実施形態では、マーカー遺伝子の発現に基づいた胚体内胚葉細胞の説明は、ＳＯＸ１７高、ＭＩＸＬ１高、ＡＦＰ低、ＳＰＡＲＣ低、トロンボモジュリン低、ＳＯＸ７低及びＣＸＣＲ４高である。
【０１３０】
胚体内胚葉細胞の増殖
本明細書中に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法のいくつかによれば、胚体内胚葉細胞は、細胞培養で維持され、増殖され、継代培養され、及び／又は増殖される。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、いかなる有意の分化も伴わずに、維持され、増殖され、継代培養され、及び／又は増殖される。言い換えれば、このような実施形態では、胚体内胚葉細胞は、細胞培養で維持され、増殖され、継代培養され、及び／又は増殖される間、胚体内胚葉表現型を維持する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される増殖方法に用いられる胚体内胚葉細胞は、腸管の細胞又はそれに由来する器官に分化し得る多分化能細胞である。このような細胞としては、膵臓、肝臓、肺、胃、小腸、甲状腺、胸腺、咽頭、胆嚢及び膀胱の細胞、並びにこのような細胞の前駆体が挙げられるが、これらに限定されない。さらにこれらの細胞は、より高等な構造、例えば組織及び／又は器官にさらに発達し得る。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞はヒト胚体内胚葉細胞である。
【０１３２】
本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態は、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得する工程を含む。細胞培養物は、胚体内胚葉細胞の純粋培養物、或いは胚体内胚葉細胞並びに他の型の細胞を含む混合細胞培養物であり得る。例えば細胞培養物は、胚体内胚葉細胞及びヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の両方を含む培養物であり得る。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞培養物は、ｈＥＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物を分化させることにより得られる。或る特定の実施形態では、ｈＥＳＣは、桑実胚、胚の内部細胞塊又は胚の生殖腺隆起から得られる。或る特定の他の実施形態では、多能性細胞は、胚期が終わって発生した多細胞構造の生殖腺又は胚組織に由来する。
【０１３３】
ヒト胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を産生するためのｈＥＳＣの分化方法は、本出願全体に、そして米国特許出願第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉」、２００４年１２月２３日出願）（この開示は参照により本明細書にその全体が援用される）に記載されている。しかしながら、ｈＥＳＣから、又は他のヒト細胞型からヒト胚体内胚葉細胞を産生するための任意の既知の方法が用いられ得ることが理解されよう。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、ｈＥＳＣを分化させることにより産生される胚体内胚葉細胞の培養物は、胚体内胚葉細胞及び1つ又は複数の型の他の細胞を含む混合された胚体内胚葉培養物、富化された胚体内胚葉細胞培養物及び／又は精製された胚体内胚葉細胞培養物であり得る。ｈＥＳＣから胚体内胚葉細胞を取得するためのいくつかの方法は、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子とｈＥＳＣを接触させるか、そうでなければそれらの因子をｈＥＳＣに提供することを含む。このような成長因子としては、ノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、成長因子は、５ｎｇ／ｍｌ〜５０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でｈＥＳＣに提供される。或る特定の実施形態では、成長因子は、少なくとも約５ｎｇ／ｍ
ｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度で培養中のｈＥＳＣに提供される。
【０１３４】
本明細書中に記載される方法の他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞の既存の培養物から得られる。このような実施形態では、培養物の一部分又は全部が、本明細書中に記載される胚体内胚葉増殖方法に用いられ得る。
【０１３５】
胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を得るほかに、本明細書中に記載される増殖方法のいくつかの実施形態は、細胞培養物から胚体内胚葉細胞のうちの少なくともいくつかを単離する工程も包含する。このような実施形態では、胚体内胚葉細胞のうちの少なくともいくつかは、細胞培養物中の他の細胞のうちの少なくともいくつかから分離され、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を産生する。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞のうちの少なくともいくつかは細胞培養物から除去されるが、一方他の細胞のうちの少なくともいくつかは細胞培養物中に残存する。細胞培養物中に存在する他の細胞としては、ｈＥＳＣ、原始内胚葉、栄養外胚葉、中胚葉及び外胚葉が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
本明細書中に記載される他の実施形態では、単離する工程は、上記胚体内胚葉細胞中で発現されるマーカーと結合するが、細胞培養物中に存在する上記他の細胞中では実質的に発現されない試薬を細胞培養物中の細胞に提供することを含む。本明細書中で上記されたように、いくつかの実施形態では、マーカーは、胚体内胚葉細胞に特異的である任意の細胞表面マーカーであり得る。本出願全体に（特に以下の実施例参照）記載されるこのような一マーカーは、ＣＸＣＲ４マーカーである。本明細書中に上記されたように、試薬結合胚体内胚葉細胞は、多数の方法により試薬非結合細胞から分離され得る。例えば胚体内胚葉細胞の表面に選択的に存在するＣＸＣＲ４受容体に対する抗体は、細胞培養物中の胚体内胚葉細胞に提供され得る。抗体結合胚体内胚葉細胞は次に、例えば蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、抗体を固体支持体に結合すること、或いは磁界で適切にタグされた抗体を単離することにより、培養物中の他の細胞から分離される。いくつかの実施形態では、抗体は、分離プロセス後に胚体内胚葉細胞から放出される。
【０１３７】
分離の代替的手段として、胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかは、培養中の胚体内胚葉細胞を特異的に蛍光標識し、次にＦＡＣＳにより非標識細胞から標識細胞を分離することにより、培養物中の他の細胞の少なくともいくつかから分離される。上記のようにそして実施例に記載されるように、このような実施形態では、ｈＥＳＣは、胚体内胚葉細胞中で高度に発現されるが、他の細胞型中では有意に発現されないマーカー遺伝子のプロモーターの制御下で、蛍光レポーター遺伝子を含むベクターでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、蛍光レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＧＦＰ及び／又はＥＧＦＰは、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーターの制御下で発現される。トランスフェクトされたｈＥＳＣは次に、胚体内胚葉の産生を特異的に誘導する分化因子の存在下で培養で増殖される。好ましい実施形態では、分化因子はアクチビンＡである。他の好ましい実施形態では、アクチビンＡは、１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物に付加される。
【０１３８】
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、単離する工程の結果として産生され
る富化された胚体内胚葉細胞集団は、胚体内胚葉細胞以外の細胞を実質的に含有しない。他の実施形態では、富化された胚体内胚葉細胞集団は、少なくとも約９６％〜少なくとも約１００％の胚体内胚葉細胞を含む。さらに他の実施形態では、富化された胚体内胚葉細胞集団は、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％並びに少なくとも約１００％の胚体内胚葉細胞を含む。
【０１３９】
本明細書中に記載される増殖方法のさらなる実施形態によれば、細胞培養工程が意図される。例えばいくつかの実施形態は、胚体内胚葉細胞に富んだ集団又は集団の一部分をプレーティングすることを含む、培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、細胞はヒトフィブロネクチンで被覆された表面でプレーティングされる。他の実施形態では、プレートは、ポリオルニチンで被覆される。さらに他の実施形態では、プレートはポリオルニチン及びヒトフィブロネクチンで被覆される。好ましい実施形態では、プレートは、ポリオルニチン及びヒトフィブロネクチンの両方で被覆されたＩＶＦプレートである。ヒトフィブロネクチンは本明細書中に記載されるプレートのための好ましいコーティングであり、他の供給源からのフィブロネクチンはプレートをコーティングするために十分であることは理解されよう。
【０１４０】
他の実施形態では、培養する工程は、約２％（ｖ／ｖ）の血清を含む増殖培地中に富んだ胚体内胚葉細胞集団又はその一部分をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、血清濃度は、約０％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。例えば本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）、約７％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、約９％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）又は約２０％（ｖ／ｖ）であり得る。いくつかの実施形態では、血清代替物が培地中に含まれる。
【０１４１】
本明細書中に記載される増殖方法のさらに他の実施形態では、増殖培地は、少なくとも１つの成長因子も含む。或る特定の実施形態では、少なくとも１つの成長因子は、ＴＧＦβスーパーファミリーの一成員を含む成長因子である。このような実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子としては、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びこれらの成長因子の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。或いは、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの成長因子は、ＩＧＦ１又はＩＧＦとＴＧＦβスーパーファミリーの一成長因子の組合せであり得る。他の実施形態では、少なくとも１つの成長因子は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ又は別の成長因子であり得る。さらに他の実施形態では、少なくとも１つの成長因子は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ及びＴＧＦβスーパーファミリーの一成長因子の組合せであり得る。上記実施形態の各々において、1つ又は複数の成長因子は、約１ｎｇ／ｍｌ〜５０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在し得る。このような実施形態では、培地中の成長因子の濃度は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度である。或る特定の実施形態では、成長因子の組合せが培地中に存在する。このような実施形態では、各成長因子は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少な
くとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度で培地中に存在する。
【０１４２】
上記の増殖方法のほかに、いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、まず、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得し、次に胚体内胚葉細胞を継代培養することによって増殖し、それにより胚体内胚葉細胞を含む複数の細胞培養物を産生する。細胞を継代培養することによる胚体内胚葉細胞のこれらの増殖方法は、このような培養物が得られる方法に関係なく、任意の胚体内胚葉培養物を用いて実施され得る。例えばこれらの方法は、上記の増殖方法において細胞を単離する工程の次に起こる、培養する工程の一部分として実施され得るし、或いはこの方法は、ｈＥＳＣから新たに分化された胚体内胚葉細胞を用いて実施され得る。
【０１４３】
本明細書中に記載される増殖方法の或る特定の態様に従って、胚体内胚葉細胞を継代培養する工程は、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に少なくとも１つの酵素を提供することを含む。例えば少なくとも１つの酵素は、パパイン、プロナーゼ、Ｉ型コラゲナーゼ、ＩＩ型コラゲナーゼ、ＩＩＩ型コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、トリプシン、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、DNase Ｉ及びディスパーゼから成る群から選択される１つ又は複数の酵素であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの酵素は、少なくとも１つのプロテアーゼを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つのプロテアーゼは、トリプシンを含む。例えば或る特定の実施形態では、培養容器中で増殖中の胚体内胚葉細胞は、まず細胞から培地を除去することにより、トリプシンを用いて継代培養される。次に滅菌トリプシン溶液が、室温で数分間、胚体内胚葉細胞に提供される。トリプシン溶液は次に、細胞を撹乱しないよう、静かに除去される。トリプシン溶液が除去された後、胚体内胚葉細胞は２％（ｖ／ｖ）の血清を含有するＲＰＭＩのような培地を提供され、そして次に、細胞培養容器を撹拌し、細胞接着を妨げ、細胞懸濁液を生成する。いくつかの実施形態では、細胞培地は、残留トリプシンを不活性化するためにトリプシン阻害剤を含む。
【０１４４】
トリプシンは種々の滅菌溶液中に提供され得る、例えばトリプシンはハンクス緩衝塩溶液のような平衡塩溶液中の胚体内胚葉細胞に提供され得ることが理解されよう。或いはトリプシンは、例えば低血清ＲＰＭＩ中で、血清を含有するか又は含有しない培地中の胚体内胚葉に提供され得る。
【０１４５】
本明細書中に記載される増殖方法の他の態様に従って、胚体内胚葉細胞を継代培養する工程は、上記胚体内胚葉細胞間の接触を機械的に妨げることを包含する。このような機械的阻害技法は、細胞接触及び基材を実質的に妨げるのに十分であるべきであるが、しかしながらこれらの技法は細胞生存度に影響を及ぼすほど厳しくあるべきではない。機械的細胞阻害技法、例えば研和(trituration)は、当業者に既知である。
【０１４６】
本明細書中に記載される増殖方法のさらに他の態様に従って、胚体内胚葉細胞を継代培養する工程は、細胞分散緩衝液中で上記の胚体内胚葉細胞をインキュベートすることを含む。細胞分散緩衝液は、当該技術分野で既知の任意の分散緩衝液、例えば市販の化学解離緩衝液であり得る。
【０１４７】
本明細書中に記載される増殖方法のいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、細胞培養容器中で増殖される。細胞培養容器としては、例えば組織培養フラスコ及び細胞培養プレート、例えばマイクロタイタープレートが挙げられるが、これらに限定されない。い
くつかの実施形態では、培養中の胚体内胚葉細胞は、基材に付着される。或る特定の実施形態では、上記の胚体内胚葉細胞を継代培養する工程は、基材から上記胚体内胚葉細胞を引き剥がすことを含む。好ましい実施形態では、基材は組織培養フラスコの表面である。他の好ましい実施形態では、基材はマイクロタイタープレートの表面である。
【０１４８】
以下の実施例の多くは、多能性ヒト細胞の使用を記載する。多能性ヒト細胞の産生方法は当該技術分野で周知であり、そして多数の科学出版物、例えば米国特許第５，４５３，３５７号、第５，６７０，３７２号、第５，６９０，９２６号、第６，０９０，６２２号、第６，２００，８０６号及び第６，２５１，６７１号、並びに米国特許出願公開第２００４／０２２９３５０号（これらの開示は参照により本明細書中にその全体が援用される）に記載されている。
【実施例１】
【０１４９】
ヒトＥＳ細胞
内胚葉発生についてのわれわれの研究のために、多能性であり、そして正常核型を維持しながら培養中に外見上無限に分裂し得るヒト胚性幹細胞を用いた。単離のために免疫学的又は機械的方法を用いて、５日齢胚内部細胞塊からＥＳ細胞を得た。特にヒト胚性幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５を、患者によるインフォームドコンセント後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精周期からの過剰凍結胚から得た。解凍時に、ＥＳ培地（ＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、及びＦＧＦ２）中のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上に孵化胚盤胞をプレーティングした。胚が培養皿に接着し、そして約２週間後、非分化ｈＥＳＣの領域を、ＭＥＦとともに新たな皿に移した。機械的に切断し、ディスパーゼで手短に消化し、その後、細胞クラスターを機械的に取り出して、洗浄し、再度プレーティングすることにより移動を成し遂げた。誘導以来、ｈＥＳＣｙｔ−２５を、１００回にわたって連続継代培養した。胚体内胚葉の産生のための出発物質として、ｈＥＳＣｙｔ−２５ヒト胚性幹細胞株を用いた。
【０１５０】
幹細胞又は他の多能性細胞は本明細書中に記載される分化手順のための出発物質としても用いられ得ることが当業者には理解されよう。例えば当該技術分野で既知の方法により単離され得る胚性生殖腺隆起から得られる細胞は、多能性細胞出発物質として用いられ得る。
【実施例２】
【０１５１】
ｈＥＳＣｙｔ−２５特徴付け
ヒト胚性幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５は、培養で１８ヶ月にわたって、正常形態学、核型、増殖及び自己再生特性を維持した。この細胞株は、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ−４及びＴＲＡ−１−６０抗原（これらはすべて、非分化ｈＥＳＣに特有である）に対する強免疫反応性を示し、そしてアルカリホスファターゼ活性、並びに他の確立されたｈＥＳＣ株と同一の形態学を示す。さらにヒト幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５は、懸濁液中で培養される場合、胚様体（ＥＢ）も容易に形成する。その多能性性質の実証として、ｈＥＳＣｙＴ−２５は、３つの主要な胚葉を表す種々の細胞型に分化する。ＺＩＣ１に関するＱ−ＰＣＲ、並びにネスチン及びより成熟したニューロンマーカーに関する免疫細胞化学（ＩＣＣ）により、外胚葉産生を実証した。β−ＩＩＩチューブリンに関する免疫細胞化学染色を、初期ニューロンに特徴的な伸長細胞のクラスター中で観察した。予め、レチノイン酸で懸濁液中のＥＢを処理して、臓側内胚葉（ＶＥ）、胚体外系統への多能性幹細胞の分化を誘導した。処理細胞は、高レベルのα−フェトタンパク質（ＡＦＰ）及びＳＯＸ７（ＶＥの２つのマーカー）を５４時間の処理により発現した。単層中で分化された細胞は、免疫細胞化学染色により実証されるように、散在性パッチ中でＡＦＰを発現した。以下で記載するように、ｈＥＳＣｙＴ−２５細胞株は、ＡＦＰ発現の非存在下でのＳＯＸ１７に関するリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）及び免疫細胞化学により立証される
ように、胚体内胚葉も形成し得た。中胚葉への分化を実証するために、分化中のＥＢを、いくつかの時点でのブラキュリ（Brachyury）遺伝子発現に関して分析した。ブラキュリ発現は、実験経過中に漸進的に増大した。上記に鑑みて、三胚葉を表す細胞を形成する能力により示されるように、ｈＥＳＣｙＴ−２５株は多能性である。
【実施例３】
【０１５２】
ＳＯＸ１７抗体の産生
ｈＥＳＣ培養物における胚体内胚葉の同定に対する主要な妨害は、適切なツールの欠如である。したがって、本発明者等は、ヒトＳＯＸ１７タンパク質に対して産生される抗体の産生に着手した。
【０１５３】
マーカーＳＯＸ１７は、それが原腸陥入中に形成する際に胚体内胚葉全体にわたって発現され、その発現は、器官形成の開始まで腸管で維持される（しかし、発現のレベルは、Ａ−Ｐ軸に沿って様々である）。ＳＯＸ１７はまた、胚体外内胚葉細胞のサブセットでも発現される。このタンパク質の発現はまた、中胚葉又は外胚葉では観察されていない。ＳＯＸ１７は、胚体外系統を排除するためのマーカーと併用される場合、胚体内胚葉系統に適切なマーカーであることが現在発見されている。
【０１５４】
本明細書中で詳述するように、ＳＯＸ１７抗体を、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の産生を目的とした様々な処理及び分化手順の影響を具体的に検査するのに利用した。ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ及びトロンボモジュリンに対して反応性の他の抗体もまた、臓側及び壁側内胚葉（胚体外内胚葉）の産生を除外するのに使用された。
【０１５５】
ＳＯＸ１７に対する抗体を産生するために、ＳＯＸ１７タンパク質のカルボキシ末端におけるアミノ酸１７２〜４１４（配列番号２）に相当するヒトＳＯＸ１７ ｃＤＮＡ（配列番号１）の一部分（図２）を、抗体産生会社GENOVAC(Freiberg, Germany)にて、そこで開発された手順に従って、ラットにおける遺伝子免疫化に使用した。遺伝子免疫化に関する手順は、米国特許第５，８３０，８７６号、同第５，８１７，６３７号、同第６，１６５，９９３号及び同第６，２６１，２８１号、並びに国際特許出願公開第ＷＯ００／２９４４２号及び同第ＷＯ９９／１３９１５号に見出すことができる。それらの開示は参照により本明細書に全体が援用される。
【０１５６】
遺伝子免疫化に関する他の適切な方法はまた、非特許文献にも記載されている。例えば、Barry他は、Biotechniques 16: 616-620, 1994（その開示が参照により本明細書に全体が援用される）において遺伝子免疫化によるモノクローナル抗体の産生について記載している。特異的タンパク質に対する抗体を産生するための遺伝子免疫化方法の具体例は、例えば、Costaglia et al., (1998) Genetic immunization against the human thyrotropin receptor causes thyroiditis and allows production of monoclonal antibodies recognizing the native receptor, J. Immunol. 160: 1458-1465、Kilpatrick et al (1998) Gene gun delivered DNA-based immunizations mediate rapid production of murine monoclonal antibodies to the Flt-3 receptor, Hybridoma 17: 569-576、Schmolke et al., (1998) Identification of hepatitis G virus particles in human serum by E2-specific monoclonal antibodides generated by DNA immunization, J. Virol. 72: 4541-4545、Krasemann et al., (1999) Generation of monoclonal antibodides against proteins with an unconventional nucleic acid-based immunization strategy, J. Biotechnol. 73: 119-129、及びUlivieri et al, (1996) Generation of a monoclonal antibody to a defined portion of the Heliobacter pylori vacuolating cytotoxin by DNA immunization, J. Biotechnol. 51: 191-194に見出すことができる。それらの開示は参照により本明細書に全体が援用される。
【０１５７】
ＳＯＸ７及びＳＯＸ１８は、図３に示される関係樹状図に表されるようにＳＯＸ１７に対して最も密接なＳｏｘファミリーである。本発明者等は、遺伝子免疫化により産生されるＳＯＸ１７抗体がＳＯＸ１７に特異的であり、またその最も密接なファミリー成員と反応しないことを実証するために、陰性対照としてヒトＳＯＸ７ポリペプチドを用いた。特に、ＳＯＸ７及び他のタンパク質は、ヒト線維芽細胞において発現させ、続いてウェスタンブロット及びＩＣＣによりＳＯＸ１７抗体との交差反応性に関して分析した。例えば、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７及びＥＧＦＰ発現ベクターの産生、ヒト線維芽細胞へのそれらのトランスフェクション、並びにウェスタンブロットによる分析に関して以下の方法を利用した。ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７及びＥＧＦＰの産生に用いられる発現ベクターは、それぞれｐＣＭＶ６(OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD)、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６(Invitrogen, Carlsbad, CA)及びｐＥＧＦＰ−Ｎ１(Clonetech, Palo Alto, CA)であった。タンパク質産生に関して、テロメラーゼ不死化ＭＤＸヒト線維芽細胞を、リポフェクタミン２０００(Invitrogen Carlsbad, CA)の存在下で、スーパーコイルＤＮＡで一過的にトランスフェクトした。総細胞溶解産物は、トランスフェクションの３６時間後に、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)を含有する５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸中に収集した。ＮｕＰＡＧＥ（４〜１２％勾配ポリアクリルアミド、Invitrogen, Carlsbad, CA)上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、且つＰＤＶＦ膜(Hercules, CA)上へのエレクトロブロッティングにより移動された細胞タンパク質１００μｇのウェスタンブロット分析は、１０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０(Sigma, St. Louis, MO)中のラットＳＯＸ１７抗血清の１／１０００希釈で、続いてアルカリホスファターゼ結合抗ラットＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)プローブして、ベクターブラックアルカリホスファターゼ染色(Vector Laboratories, Burlingame, CA)により明らかにした。使用されるタンパク質サイズ標準物質は、広範囲の色彩マーカー(Sigma, St. Louis, MO)であった。
【０１５８】
図４では、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７又はＥＧＦＰ ｃＤＮＡで一過的にトランスフェクトされたヒト線維芽細胞から作製されるタンパク質抽出物を、ＳＯＸ１７抗体によりウェスタンブロットでプローブした。ｈＳＯＸ１７トランスフェクト細胞からのタンパク質抽出物のみが、ヒトＳＯＸ１７タンパク質の予測された４６Ｋｄａ分子量に近い約５１Ｋｄａのバンドを生じた。ヒトＳＯＸ７又はＥＧＦＰトランスフェクト細胞のいずれかから作製される抽出物に対してＳＯＸ１７抗体の反応性は見られなかった。さらに、ＳＯＸ１７抗体は、ｈＳＯＸ１７発現構築物でトランスフェクトしたヒト線維芽細胞の核を明らかに標識したが、ＥＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞は標識しなかった。したがって、ＳＯＸ１７抗体は、ＩＣＣによる特異性を示す。
【実施例４】
【０１５９】
胚体内胚葉のマーカーとしてのＳＯＸ１７抗体の確証
部分的に分化させたｈＥＳＣをＳＯＸ１７及びＡＦＰ抗体で同時標識して、ＳＯＸ１７抗体がヒトＳＯＸ１７タンパク質に特異的であり、さらに胚体内胚葉をマークすることを実証した。ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７（これは、ＳＯＸ遺伝子ファミリーサブグループＦの密接に関連する成員である（図３））及びＡＦＰはそれぞれ、臓側内胚葉で発現されることが実証されている。しかしながら、ＡＦＰ及びＳＯＸ７は、ＩＣＣにより検出可能なレベルでは、胚体内胚葉細胞では発現されず、したがってそれらは、真正の胚体内胚葉細胞に関する陰性マーカーとして用いることができる。ＳＯＸ１７抗体は、細胞の別個の分類として存在するか、或いはＡＦＰ陽性細胞と混合される細胞の集団を標識することが示された。特に、図５Ａは、少数のＳＯＸ１７細胞がＡＦＰで同時標識されることを示すが、ＳＯＸ１７+細胞の視野においてＡＦＰ+細胞がほとんど存在しないか、或いは全く存在しない領域も見られた（図５Ｂ）。同様に、壁側内胚葉は、ＳＯＸ１７を発現することが報告
されているため、壁側マーカーＳＰＡＲＣ及び／又はトロンボモジュリン（ＴＭ）と共にＳＯＸ１７による抗体同時標識を使用して、壁側内胚葉であるＳＯＸ１７+細胞を同定することができる。図６Ａ〜図６Ｃに示されるように、トロンボモジュリン及びＳＯＸ１７で同時標識された壁側内胚葉細胞は、ｈＥＳ細胞の無作為分化により産生された。
【０１６０】
上記細胞標識実験を考慮して、胚体内胚葉細胞の同一性は、マーカープロフィールＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo／［ＴＭlo又はＳＰＡＲＣlo］により樹立され得る。換言すると、ＳＯＸ１７マーカーの発現は、臓側内胚葉に特徴的であるＡＦＰマーカー、及び壁側内胚葉に特徴的であるＴＭ又はＳＰＡＲＣマーカーの発現よりも多い。したがって、ＳＯＸ１７に関して陽性であるが、ＡＦＰに対して陰性であり、且つＴＭ又はＳＰＡＲＣに対して陰性である細胞は、胚体内胚葉である。
【０１６１】
胚体内胚葉の予測となるようなＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo／ＴＭlo／ＳＰＡＲＣloマーカープロフィールの特異性のさらなる徴候として、ＳＯＸ１７及びＡＦＰ遺伝子発現が、抗体標識細胞の相対数と定量的に比較された。図７Ａに示されるように、レチノイン酸（臓側内胚葉誘導物質）又はアクチビンＡ（胚体内胚葉誘導物質）で処理したｈＥＳＣは、ＳＯＸ１７ ｍＲＮＡ発現のレベルにおいて１０倍の差をもたらした。この結果は、ＳＯＸ１７抗体標識細胞数における１０倍の差を反映している（図７Ｂ）。さらに、図８Ａに示されるように、ｈＥＳＣのアクチビンＡ処理は、処理なしと比較して６．８倍分ＡＦＰ遺伝子発現を抑制した。これは、図８Ｂ及び図８Ｃに示されるように、これらの培養物におけるＡＦＰ標識細胞の数の劇的な減少により可視的に反映された。これをさらに定量化するために、ＡＦＰ遺伝子発現におけるこのおよそ７倍の減少は、フローサイトメトリーにより測定される場合のＡＦＰ抗体標識細胞数における同様の７倍の減少の結果であることが実証された（図９Ａ及び図９Ｂ）。この結果は、Ｑ−ＰＣＲにより観察されるような遺伝子発現の定量的変化は、抗体染色により観察されるような細胞型特定化における変化を反映することを示すという点で極めて重要である。
【０１６２】
ノーダルファミリー成員（ノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢ−ＮＡＡ）の存在下でのｈＥＳＣのインキュベーションは、経時的にＳＯＸ１７抗体標識細胞の有意な増大をもたらした。連続的なアクチビン処理の５日目までには、５０％を超える細胞がＳＯＸ１７で標識された（図１０Ａ〜図１０Ｆ）。アクチビン処理の５日後にはＡＦＰで標識された細胞はほとんど存在しなかったか、或いは全く存在しなかった。
【０１６３】
要約すると、ヒトＳＯＸ１７タンパク質のカルボキシ末端の２４２個のアミノ酸に対して産生される抗体は、ウェスタンブロットでヒトＳＯＸ１７タンパク質を同定したが、その最も密接なＳｏｘファミリー類縁体であるＳＯＸ７を認識しなかった。ＳＯＸ１７抗体は、主としてＳＯＸ１７+／ＡＦＰlo/-である分化ｈＥＳＣ培養物における細胞のサブセット（９５％を超える標識細胞）並びにＳＯＸ１７及びＡＦＰ（臓側内胚葉）に関して同時標識する少量パーセント（５％未満）の細胞を認識した。アクチビンによるｈＥＳＣ培養物の処理は、ＳＯＸ１７遺伝子発現並びにＳＯＸ１７標識細胞の顕著な増大をもたらし、ＡＦＰ ｍＲＮＡの発現及びＡＦＰ抗体で標識した細胞の数を劇的に抑制した。
【実施例５】
【０１６４】
Ｑ−ＰＣＲ遺伝子発現アッセイ
以下の実験では、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）が、ｈＥＳＣ分化に対する様々な処理の影響をスクリーニングするのに使用される主要なアッセイであった。特に、遺伝子発現のリアルタイム測定値が、Ｑ−ＰＣＲにより多数の時点で多数のマーカー遺伝子に関して分析された。細胞集団の全体的な動態のより良好な理解を得るために、所望の細胞型並びに望ましくない細胞型のマーカー遺伝子の特徴を評価した。Ｑ−ＰＣＲ分析の長所として、ゲノム配列が容易に入手可能である場合、その極度の感受性及び必要
なマーカーを開発することが比較的容易であることが挙げられる。さらに、Ｑ−ＰＣＲの極めて高い感受性により、相当大きな集団内での比較的少数の細胞からの遺伝子発現の検出が可能となる。さらに、非常に低レベルの遺伝子発現を検出する能力は、集団内の「分化の偏り」に関する指標を提供する。これらの細胞の表現型の明白な分化に先立つ特定の分化経路に向かう偏りは、免疫細胞化学的技法を使用して認知することができない。このため、Ｑ−ＰＣＲは、分化処理の成功をスクリーニングするための、免疫組織化学的技法に対して少なくとも補完的であり且つ免疫組織化学的技法よりも潜在的に相当優れている分析の方法を提供する。さらに、Ｑ−ＰＣＲは、半ハイスループットスケール(semi-high
throughput scale)の分析にて定量的方式で分化プロトコルの成功を評価するメカニズムを提供する。
【０１６５】
本実施例で採用するアプローチは、Ｒｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ ３０００機器(Corbett Research)上でのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ化学及び２段階ＲＴ−ＰＣＲ方式を使用して相対定量を実施することであった。かかるアプローチにより、今後のさらなるマーカー遺伝子の分析用のｃＤＮＡサンプルの積上げが可能となり、このようにして、サンプル間の逆転写効率における可変性を回避した。
【０１６６】
プライマーは、これが混入ゲノムＤＮＡからの増殖を排除すると実験的に確定されているため、エクソン間境界にわたって存在するか、又は可能であれば少なくとも８００ｂｐのイントロンにまたがるように設計された。イントロンを含まないマーカー遺伝子を使用したか、又はマーカー遺伝子が偽遺伝子を保有した場合、ＲＮＡサンプルのDNase Ｉ処理を実施した。
【０１６７】
本発明者等は、細胞サンプルにおける遺伝子発現の広範囲のプロフィール描写を提供するために、日常的にＱ−ＰＣＲを使用して、標的及び非標的細胞型の多数のマーカーの遺伝子発現を測定した。ｈＥＳＣ分化の初期（具体的には、外胚葉、中胚葉、胚体内胚葉及び胚体外内胚葉）に関連し、且つ確証されたプライマー組が利用可能であるマーカーを以下の表１に提供する。これらのプライマー組のヒト特異性もまた実証されている。ｈＥＳＣが多くの場合マウスフィーダー層上で増殖するため、このことは重要な事実である。最も典型的には、三重反復サンプルが各条件に関して採取され、各定量的確定に関連した生物学的可変性を評価するために二重反復で個別に分析した。
【０１６８】
ＰＣＲ鋳型を生成するために、総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ(Qiagen)を使用して単離して、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ(Molecular Probes)を用いて定量化した。総ＲＮＡ ３５０〜５００ｎｇからの逆転写を、オリゴｄＴ及びランダムプライマーのミックスを含有するｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素キット(BioRad)を使用して実施した。続いて、反応物それぞれ２０μＬを総容量１００μＬにまで希釈して、このうち３μＬを、それぞれ４００ｎＭ順方向プライマー及び逆方向プライマー並びに２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス(Qiagen) ５μＬを含有するＱ−ＰＣＲ反応物１０μＬにおいて使用した。２段階サイクリングパラメータは、８５〜９４℃（具体的には各プライマー組に関するアンプリコンの融点に従って選択される）で５秒の変性、続く６０℃での４５秒のアニール／伸長を用いて使用した。各伸長段階の最後の１５秒の間に、蛍光データを収集した。３点の１０倍希釈シリーズを使用して、各実施に関する標準曲線を作成して、サイクル閾値（Ｃｔ）をこの標準曲線に基づいて定量値へ変換した。各サンプルに関する定量値は、ハウスキーピング遺伝子性能に対して標準化し、続いて平均値及び標準偏差は、三重反復サンプルに関して算出した。ＰＣＲサイクリングの終わりには、融解曲線分析を実施して、反応物の特異性を確かめた。単一の特異的産物は、そのＰＣＲアンプリコンに適したＴmでの単一ピークにより示された。さらに、逆転写酵素なしで実施される反応は、陰性対照として役立ち、増殖しない。
【０１６９】
Ｑ−ＰＣＲ方法論を確立する際の第１の工程は、実験系における適切なハウスキーピング遺伝子（ＨＧ）の検証であった。ＨＧは、ＲＮＡインプット、ＲＮＡ完全性及びＲＴ効率に関してサンプルにわたって標準化するのに使用されるため、標準化が意味のあるものであるためには、ＨＧがすべてのサンプル型において経時的に一定レベルの発現を示すことが重要であった。本発明者等は、分化ｈＥＳＣにおけるサイクロフィリンＧ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ）、β−２−ミクログロブリン、ヒドロキシメチルビランシンターゼ(hydroxymethylbiane synthase)（ＨＭＢＳ）、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）及びグルクロニダーゼβ（ＧＵＳ）の発現レベルを測定した。本発明者等の結果により、β−２−ミクログロブリン発現レベルが、分化の間に増大されることが示され、したがって本発明者等は、標準化のためにこの遺伝子の使用を排除した。他の遺伝子は、経時的に、並びに複数の処理にわたって一貫した発現レベルを示した。本発明者等は日常的に、サイクロフィリンＧ及びＧＵＳの両方を使用して、すべてのサンプルに関して標準化因子を算出した。多数のＨＧの使用は、同時に標準化プロセスに対する固有の可変性を低減し、相対遺伝子発現値の信頼性を増大させる。
【０１７０】
標準化において使用するための遺伝子を取得した後、続いてＱ−ＰＣＲを利用して、種々の実験処理を施したサンプルにわたる多くのマーカー遺伝子の相対遺伝子発現レベルを確定した。用いたマーカー遺伝子は、それらが初期胚葉の代表的な特異的集団において富化を示すことから選択されており、特に胚体内胚葉及び胚体外内胚葉で差次的に発現される遺伝子の組に焦点を当てている。これらの遺伝子並びにそれらの関連富化プロフィールを表１に強調している。
【０１７１】
【表１】
【０１７２】
多くの遺伝子が、２つ以上の多い胚葉で発現されるため、同じ実験内で多くの遺伝子の発現レベルを定量的に比較することが有用である。ＳＯＸ１７は、胚体内胚葉で、またより程度は低いが、臓側及び壁側内胚葉で発現される。ＳＯＸ７及びＡＦＰは、この初期発生時点で、臓側内胚葉で発現される。ＳＰＡＲＣ及びＴＭは、壁側内胚葉で発現され、ブラキュリは、初期中胚葉で発現される。
【０１７３】
胚体内胚葉細胞は、高レベルのＳＯＸ１７ ｍＲＮＡ並びに低レベルのＡＦＰ及びＳＯＸ７（臓側内胚葉）、ＳＰＡＲＣ（壁側内胚葉）及びブラキュリ（中胚葉）を発現すると予測された。さらに、ＺＩＣ１は、初期外胚葉の誘導をさらに除外するのに本明細書で使用した。最後に、ＧＡＴＡ４及びＨＮＦ３ｂは、胚体及び胚体外内胚葉の両方で発現され、したがって、胚体内胚葉におけるＳＯＸ１７発現と相関する（表１）。表１に記載する
マーカー遺伝子が、様々なサンプル間でどのように互いに相関するかを実証し、したがって、胚体内胚葉及び胚体外内胚葉への、並びに中胚葉及び神経細胞型への分化の特異的パターンを強調する代表的な実験を図１１〜図１４に示している。
【０１７４】
上記データを考慮すると、漸増用量のアクチビンが、ＳＯＸ１７遺伝子発現の増大をもたらしたことが明らかである。さらに、このＳＯＸ１７発現は、胚体外内胚葉とは対照的に主として胚体内胚葉を表した。この結論は、ＳＯＸ１７遺伝子発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７及びＳＰＡＲＣ遺伝子発現と逆相関したという観察から生じる。
【実施例６】
【０１７５】
胚体内胚葉へのヒトＥＳ細胞の定方向分化
ヒトＥＳ細胞培養物は、それらの未分化状態を能動的に維持しない条件下で培養される場合に、無作為に分化する。この不均一分化は、壁側及び臓側内胚葉の両方から構成される胚体外内胚葉細胞（ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ及びＳＯＸ７発現）並びにＺＩＣ１及びネスチン（外胚葉）及びブラキュリ（中胚葉）発現によりマークされるような初期外胚葉誘導体及び中胚葉誘導体の産生をもたらす。胚体内胚葉細胞出現は、ＥＳ細胞培養物における特異的抗体マーカーの欠如に関して検査又は特定されていない。それ自体で、また初期状態で、ＥＳ細胞培養物における初期胚体内胚葉産生は、十分研究されていない。胚体内胚葉細胞に関する満足のいく抗体試薬が入手不可能であったため、特性化の大部分が、外胚葉及び胚体外内胚葉に焦点を当ててきた。概して、無作為に分化されたＥＳ細胞培養物においてＳＯＸ１７hi胚体内胚葉細胞と比較して、有意により多数の胚体外細胞型及び神経外胚葉細胞型が存在する。
【０１７６】
未分化ｈＥＳＣコロニーは線維芽細胞フィーダーの床上で増殖するため、コロニーの縁にある細胞は、コロニーの内部に存在する細胞とは異なった別の形態を呈する。これらの外側の縁細胞の多くが、それらのあまり一様ではない、より大きな細胞体の形態により、またより高いレベルのＯＣＴ４の発現により識別され得る。ＥＳ細胞が分化し始めると、ＥＳ細胞は、未分化ＥＳ細胞に対して、ＯＣＴ４発現のレベルを上方又は下方へ変更させることが記載されている。未分化閾値を上回るか、又は下回るＯＣＴ４レベルの変更は、多能性状態から離れた分化の初期段階の表れであり得る。
【０１７７】
未分化コロニーがＳＯＸ１７免疫細胞化学により検査される場合、時折ＳＯＸ１７陽性細胞の小さな１０〜１５個の細胞クラスターが、外縁上の無作為な位置で、また未分化ｈＥＳＣコロニー間の接合部で検出された。上述したように、外側コロニー縁のこれらの散在ポケットは、コロニーのサイズが拡大し、且つより混雑してくるため、古典的なＥＳ細胞形態から離れて分化するための第１の細胞のいくつかであるようであった。より若くてより小さな完全未分化コロニー（１ｍｍ未満、４〜５日齢）は、コロニー内で又はコロニーの縁でＳＯＸ１７陽性細胞を示さなかったのに対して、より老齢のより大きなコロニー（直径１〜２ｍｍ、５日齢超）は、いくつかのコロニーの外縁で、或いは上述の古典的なｈＥＳＣ形態を示さない縁に対して内部の領域で、ＳＯＸ１７陽性ＡＦＰ陰性細胞の散発的な単離パッチを有していた。これが有効なＳＯＸ１７抗体の第１の発達であると考えると、かかる初期「未分化」ＥＳ細胞培養物で発生する胚体内胚葉細胞は、これまでに実証されていない。
【０１７８】
Ｑ−ＰＣＲによるＳＯＸ１７及びＳＰＡＲＣ遺伝子発現レベルの逆相関に基づくと、これらのＳＯＸ１７陽性ＡＦＰ陰性細胞の大部分が、抗体同時標識による壁側内胚葉マーカーに関して陰性であろう。これは、図１５Ａ及び図１５Ｂに示されるように、ＴＭ発現壁側内胚葉細胞に関して具体的に実証された。ノーダル因子であるアクチビンＡ及びＢへの暴露は、ＴＭ発現の強度及びＴＭ陽性細胞の数の劇的な減少をもたらした。アクチビン処理培養物に関するＳＯＸ１７、ＡＦＰ及びＴＭ抗体を使用した三重標識により、ＡＦＰ及
びＴＭに関しても陰性であるＳＯＸ１７陽性細胞のクラスターが観察された（図１６Ａ〜図１６Ｄ）。これらは、分化ｈＥＳＣ培養物におけるＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の第１の細胞標示である（図１６Ａ〜図１６Ｄ及び図１７）。
【０１７９】
上述のＳＯＸ１７抗体及びＱ−ＰＣＲツールを用いて、本発明者等は、ＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo／ＳＰＡＲＣ／ＴＭlo胚体内胚葉細胞となるようにｈＥＳＣを効率的にプログラミングすることが可能な多数の手順を探究してきた。本発明者等は、ＳＯＸ１７遺伝子発現に関してＱ−ＰＣＲにより集団レベルで、及びＳＯＸ１７タンパク質の抗体標識により個々の細胞のレベルで測定される場合、これらの細胞の数及び増殖能力を増大させることを目的とした様々な分化プロトコルを適用した。
【０１８０】
本発明者等はまず、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物において胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を創出するのに使用するためのノーダル／アクチビン／ＢＭＰのようなＴＧＦβファミリー成長因子の影響を分析及び記載した。通常の実験では、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ又はこれらの成長因子の組合せを未分化ヒト幹細胞系ｈＥＳＣｙｔ−２５の培養物へ添加して、分化プロセスを開始させた。
【０１８１】
図１９に示されるように、１００ｎｇ／ｍｌでのアクチビンＡの添加は、分化の４日目までに、未分化ｈＥＳＣに対して、ＳＯＸ１７遺伝子発現の１９倍の誘導をもたらした。アクチビンＡと共に、アクチビンファミリーの第２の成員であるアクチビンＢを添加することにより、併用アクチビン処理の４日目までに、未分化ｈＥＳＣを上回る３７倍の誘導がもたらされた。最後に、アクチビンＡ及びアクチビンＢと共に、ノーダル／アクチビン由来のＴＧＦβファミリーの第３の成員、並びにＢＭＰサブグループであるＢＭＰ４を添加することにより、未分化ｈＥＳＣの誘導の５７倍に誘導を増大させた（図１９）。アクチビン及びＢＭＰによるＳＯＸ１７誘導を、因子なしの培地対照と比較した場合、５倍、１０倍及び１５倍の誘導が４日目の時点で生じた。アクチビンＡ、Ｂ及びＢＭＰによる三重処理の５日目までに、ＳＯＸ１７は、ｈＥＳＣの７０倍より高く誘導された。これらのデータは、ノーダル／アクチビン ＴＧＦβファミリー成員のより高い用量及びより長い処理時間がＳＯＸ１７の増大された発現をもたらすことを示している。
【０１８２】
ノーダル並びに関連分子アクチビンＡ、Ｂ及びＢＭＰは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＯＸ１７の発現及び胚体内胚葉形成を促進する。さらに、ＢＭＰの添加は、おそらくノーダル補助受容体であるＣｒｉｐｔｏのさらなる誘導により、改善されたＳＯＸ１７の誘導をもたらす。
【０１８３】
本発明者等は、ＢＭＰ４と一緒のアクチビンＡ及びＢの組合せが、ＳＯＸ１７誘導、したがって胚体内胚葉形成の相加的増大をもたらすことを実証している。アクチビンＡ及びＢと組み合わせた長期間（４日を超える）のＢＭＰ４添加は、壁側及び臓側内胚葉並びに胚体内胚葉においてＳＯＸ１７を誘導し得る。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、添加の４日以内に処理からＢＭＰ４を除去することは有益である。
【０１８４】
個々の細胞レベルでのＴＧＦβ因子処理の影響を確定するために、経時的なＴＧＦβ因子添加を、ＳＯＸ１７抗体標識を使用して検査した。すでに図１０Ａ〜図１０Ｆで示したように、経時的にＳＯＸ１７標識細胞の相対数の劇的な増大が見られた。相対定量化（図２０）は、ＳＯＸ１７標識細胞の２０倍を超える増大を示す。この結果は、細胞の数並びにＳＯＸ１７遺伝子発現レベルの両方が、ＴＧＦβ因子暴露の時間とともに増大していることを示す。図２１に示されるように、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びＢＭＰ４への暴露の４日後に、ＳＯＸ１７誘導のレベルは、未分化ｈＥＳＣに対して１６８倍に到達した。図２２は、ＳＯＸ１７陽性細胞の相対数もまた、用量応答性であったことを示す。１００ｎｇ／ｍｌ又はそれ以上のアクチビンＡ用量は、ＳＯＸ１７遺伝子発現及び
細胞数を強力に誘導することが可能であった。
【０１８５】
ＴＧＦβファミリー成員のほかに、Ｗｎｔファミリーの分子が、胚体内胚葉の特定化及び／又は維持において役割を果たし得る。Ｗｎｔ分子の使用もまた、アクチビン単独を上回るアクチビン＋Ｗｎｔ３ａで処理したサンプルにおける増大したＳＯＸ１７遺伝子発現により示されるように、胚体内胚葉へのｈＥＳＣの分化に有益であった（図２３）。
【０１８６】
上述の実験はすべて、添加因子を伴って１０％血清を含有する組織培養培地を使用して実施した。驚くべきことに、図２４Ａ〜図２４Ｃに示されるように、血清の濃度が、添加アクチビンの存在下でＳＯＸ１７発現のレベルに対して影響することを本発明者等は発見した。血清レベルが１０％から２％へ低減すると、ＳＯＸ１７発現は、アクチビンＡ及びＢの存在下で３倍になった。
【０１８７】
最後に、本発明者等は、アクチビン誘導ＳＯＸ１７+細胞が、図２５Ａ〜図２５Ｄに表されるように培養中に分裂することを実証した。矢印は、ＰＣＮＡ／ＤＡＰＩ標識有糸分裂プレートパターン及び位相コントラスト有糸分裂プロフィールにより明らかなように有糸分裂中であるＳＯＸ１７／ＰＣＮＡ／ＤＡＰＩで標識された細胞を示す。
【実施例７】
【０１８８】
ケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）発現は、胚体内胚葉に関するマーカーと相関し、中胚葉、外胚葉又は臓側内胚葉に関するマーカーとは相関しない
上述したように、ｈＥＳＣは、ＴＧＦβファミリー、より具体的にはアクチビン／ノーダルサブファミリーのサイトカインの適用により、胚体内胚葉の胚葉へ分化するように誘導することができる。さらに、本発明者等は、分化培養培地におけるウシ胎児血清（ＦＢＳ）の比率が、ｈＥＳＣからの胚体内胚葉分化の効率に影響を及ぼすことを示している。この影響は、培地においてアクチビンＡの所定濃度で、より高いレベルのＦＢＳが胚体内胚葉への最大限の分化を阻害するようなものである。外因性アクチビンＡの非存在下では、胚体内胚葉系統へのｈＥＳＣの分化は、非常に非効率であり、ＦＢＳ濃度は、ｈＥＳＣの分化プロセスに対して相当穏やかに影響する。
【０１８９】
これらの実験では、０．５％、２．０％又は１０％ＦＢＳを補充し、且つ１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを伴うか、又は伴わないＲＰＭＩ培地（Invitrogen, Carlsbad, CA；ｃａｔ＃６１８７０−０３６）中で６日間増殖させることにより、ｈＥＳＣを分化させた。さらに、分化の最初の３日間にわたる０．５％〜２．０％に及ぶＦＢＳのグラジエントもまた、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡと併用した。６日後に、反復サンプルを各培養条件から収集して、リアルタイム定量的ＰＣＲにより相対遺伝子発現に関して分析した。残存細胞は、ＳＯＸ１７タンパク質の免疫蛍光検出用に固定した。
【０１９０】
ＣＸＣＲ４の発現レベルは、使用した７つの培養条件にわたって劇的に変化した（図２６）。概して、ＣＸＣＲ４発現は、アクチビンＡ処理培養物（Ａ１００）では高く、外因性アクチビンＡを施さない培養物（ＮＦ）では低かった。さらに、Ａ１００処理培養物の中でも、ＣＸＣＲ４発現は、ＦＢＳ濃度が最も低かった場合に最も高かった。相対発現が、アクチビンＡを施さない条件（ＮＦ）により一致するように、１０％ＦＢＳ条件におけるＣＸＣＲ４レベルの顕著な低減が見られた。
【０１９１】
上述したように、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＨＮＦ３β遺伝子の発現は、胚体内胚葉としての細胞の特徴づけと一致する。７つの分化条件にわたるこれらの４つの遺伝子の相対発現は、ＣＸＣＲ４の相対発現を反映する（図２７Ａ〜図２７Ｄ）。このことは、ＣＸＣＲ４もまた胚体内胚葉のマーカーであることを実証する。
【０１９２】
外胚葉及び中胚葉系統は、各種マーカーのそれらの発現により胚体内胚葉と識別することができる。初期中胚葉は、遺伝子ブラキュリ及びＭＯＸ１を発現する一方で、新生神経外胚葉は、ＳＯＸ１及びＺＩＣ１を発現する。図２８Ａ〜図２８Ｄは、外因性アクチビンＡを施さない培養物が、中胚葉及び外胚葉遺伝子発現に関して優先的に富化されたこと、及びアクチビンＡ処理培養物の中でも、１０％ＦＢＳ条件がまた、中胚葉及び外胚葉マーカー発現の増大レベルを有したことを実証している。これらのパターンの発現はＣＸＣＲ４のパターンの逆であって、ＣＸＣＲ４が、この発生期間にｈＥＳＣに由来する中胚葉又は外胚葉中ではそれほど高度に発現されないことを示した。
【０１９３】
哺乳類発生中の初期に、胚体外系統への分化もまた起こる。ここでは、ＳＯＸ１７を包含する胚体内胚葉と共通して多くの遺伝子の発現を共有する臓側内胚葉の分化が特に関連している。胚体内胚葉を胚体外臓側内胚葉と識別するためには、これらの２つの間を識別できるマーカーを検査するべきである。ＳＯＸ７は、臓側内胚葉では発現されるが、胚体内胚葉系統では発現されないマーカーを表す。したがって、ＳＯＸ７発現の非存在下での強健なＳＯＸ１７遺伝子発現を示す培養条件は、胚体内胚葉を含有し、臓側内胚葉を含有しない可能性が高い。ＳＯＸ７が、アクチビンＡを施さない培養において高度に発現され、ＳＯＸ７はまた、ＦＢＳが１０％で包含される場合に、アクチビンＡの存在下でさえ増大された発現を示したことが図２８Ｅに示されている。このパターンは、ＣＸＣＲ４発現パターンの逆であり、ＣＸＣＲ４が、臓側内胚葉ではあまり高度に発現されないことを示唆する。
【０１９４】
上述の分化条件それぞれに存在するＳＯＸ１７免疫反応性（ＳＯＸ１７+）細胞の相対数もまた確定した。ｈＥＳＣは、高用量アクチビンＡ及び低ＦＢＳ濃度（０．５％〜２．０％）の存在下で分化させた場合、ＳＯＸ１７+細胞は、培養物全体にわたって遍在的に分布した。高用量アクチビンＡを使用したが、ＦＢＳは１０％（ｖ／ｖ）で包含された場合、ＳＯＸ１７+細胞は、相当低い頻度で出現し、培養物全体にわたって均一に分布されるのではなく、常に単離クラスターで出現した（図２９Ａ及び図２９Ｃ、並びに図２９Ｂ及び図２９Ｅ）。外因性アクチビンＡが使用されなかった場合に、ＳＯＸ１７+細胞のさらなる減少が観察された。これらの条件下では、ＳＯＸ１７+細胞はまたクラスターで出現し、これらのクラスターは、高アクチビンＡ低ＦＢＳ処理で見出されるものよりも小さく、且つ相当稀であった（図２９Ｃ及び図２９Ｆ）。これらの結果は、ＣＸＣＲ４発現パターンが、各条件下で胚体内胚葉遺伝子発現に対応するだけでなく、胚体内胚葉細胞の数にも対応することを実証している。
【実施例８】
【０１９５】
胚体内胚葉に関して富化する分化条件は、ＣＸＣＲ４陽性細胞の比率を増大させる
アクチビンＡの用量はまた、胚体内胚葉がｈＥＳＣから得られ得る効率に影響を及ぼす。この実施例は、アクチビンＡの用量を増大させることにより培養物におけるＣＸＣＲ４+細胞の比率が増大することを実証する。
【０１９６】
ｈＥＳＣは、０．５％〜２％ＦＢＳ（分化の最初の３日にわたって０．５％から１．０％、そして２．０％へ増大される）及び０、１０又は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを補充したＲＰＭＩ培地中で分化させた。分化の７日後に、２％ＦＢＳ及び２ｍＭ（ＥＤＴＡ）を含有するＣａ2+／Ｍｇ2+を伴わないＰＢＳ中で、室温で５分間、細胞を解離させた。細胞は、３５μｍナイロンフィルタに通して濾過して、計数して、ペレット化した。ペレットは、小容量の５０％ヒト血清／５０％正常ロバ血清中に再懸濁させて、氷上で２分間インキュベートして、非特異的抗体結合部位をブロックした。これに、５０μｌ（およそ１０5個の細胞を含有する）当たりマウス抗ＣＸＣＲ４抗体（Abcam、ｃａｔ＃ ａｂ１０４０３−１００）１μｌを添加して、標識を氷上で４５分間進めた。細胞は、２％ヒト血清を含有するＰＢＳ（緩衝液）５ｍｌを添加することにより洗浄して、ペレット化した
。緩衝液５ｍｌによる第２の洗浄を完了させた後、細胞は、１０5個の細胞当たり緩衝液５０μｌ中に再懸濁させた。二次抗体（ＦＩＴＣ結合ロバ抗マウス、Jackson ImmunoResearch、ｃａｔ＃ ７１５−０９６−１５１）を最終濃度５μｇ／ｍｌで添加して、３０分間標識させた後、上述のように緩衝液中で２回洗浄を行った。細胞は、緩衝液中に５×１０6個の細胞／ｍｌで再懸濁させて、フローサイトメトリーの中心的な施設(The Scripps Research Institute)にてスタッフによりＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ(Beckton Dickenson)を使用して分析及び選別した。細胞は、これに続くリアルタイム定量的ＰＣＲによる遺伝子発現分析用の総ＲＮＡの単離のために、ＲＬＴ溶解緩衝液(Qiagen)へ直接収集した。
【０１９７】
フローサイトメトリーにより確定される場合のＣＸＣＲ４+細胞の数は、アクチビンＡの用量が分化培養培地中で増大されると、劇的に増大することが観察された（図３０Ａ〜図３０Ｃ）。ＣＸＣＲ４+細胞は、Ｒ４ゲート内に納まり、このゲートは、事象の０．２％がＲ４ゲートに位置される二次抗体のみの対照を使用して設定された。劇的に増大するＣＸＣＲ４+細胞数は、アクチビンＡ用量が増大される場合に、胚体内胚葉遺伝子発現における強健な増大と相関する（図３１Ａ〜図３１Ｄ）。
【実施例９】
【０１９８】
ＣＸＣＲ４陽性細胞の単離は、胚体内胚葉遺伝子発現に関して富化し、また中胚葉、外胚葉及び臓側内胚葉のマーカーを発現する細胞を枯渇させる
上記実施例８で同定されるＣＸＣＲ４+及びＣＸＣＲ４-細胞を収集して、相対遺伝子発現に関して分析し、母集団の遺伝子発現を同時に確定した。
【０１９９】
ＣＸＣＲ４遺伝子発現の相対レベルは、アクチビンＡの用量の増大に伴って劇的に増大した（図３２）。これは、ＣＸＣＲ４+細胞のアクチビンＡ用量依存的増大と極めて強く相関した（図３０Ａ〜図３０Ｃ）。また、各集団からのＣＸＣＲ４+細胞の単離は、この集団におけるほぼすべてのＣＸＣＲ４遺伝子発現を占めたことも明らかである。これは、これらの細胞を収集するためのＦＡＣＳ方法の効率を実証している。
【０２００】
遺伝子発現分析により、ＣＸＣＲ４+細胞は、ＣＸＣＲ４遺伝子発現の大部分を含有するだけでなく、ＣＸＣＲ４+細胞はまた、胚体内胚葉の他のマーカーに関する遺伝子発現も含有することが明らかとなった。図３１Ａ〜図３１Ｄに示されるように、ＣＸＣＲ４+細胞はさらに、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＨＮＦ３Ｂ及びＭＩＸＬ１に関して母Ａ１００集団を上回って富化した。さらに、ＣＸＣＲ４-画分は、これらの胚体内胚葉マーカーに関して非常に少ない遺伝子発現を含有した。さらに、ＣＸＣＲ４+及びＣＸＣＲ４-集団は、中胚葉、外胚葉及び胚体外内胚葉のマーカーに関して逆パターンの遺伝子発現を示した。図３３Ａ〜図３３Ｄは、ＣＸＣＲ４+細胞が、Ａ１００母集団に対してブラキュリ、ＭＯＸ１、ＺＩＣ１及びＳＯＸ７の遺伝子発現に関して枯渇したことを示す。このＡ１００母集団は、低用量条件又はアクチビンＡなしの条件に対して、これらのマーカーの発現がすでに低かった。これらの結果は、高アクチビンＡの存在下で分化されるｈＥＳＣからのＣＸＣＲ４+細胞の単離は、胚体内胚葉に関して高度に富化され、且つ実質的に純粋な胚体内胚葉である集団を生じることを示す。
【実施例１０】
【０２０１】
ＣＸＣＲ４を使用した細胞集団における胚体内胚葉細胞の定量
本明細書中ですでに確定されるような、及び２００３年１２月２３日に出願された「胚体内胚葉」と題する米国仮特許出願第６０／５３２，００４号（その開示が参照により全体が本明細書に援用される）で確定されるような細胞培養物又は細胞集団中に存在する胚体内胚葉細胞の比率の定量を確認するために、ＣＸＣＲ４及び胚体内胚葉の他のマーカーを発現する細胞をＦＡＣＳにより分析した。
【０２０２】
上記実施例に記載されるような方法を使用して、ｈＥＳＣを分化させて、胚体内胚葉を産生した。特に、分化細胞培養物における収率及び純度を増大させるために、培地の血清濃度を以下の通りに制御した：１日目には０．２％ＦＢＳ、２日目には１．０％ＦＢＳ及び３〜６日目には２．０％ＦＢＳ。分化培養物は、３つの細胞表面エピトープであるＥ−カドヘリン、ＣＸＣＲ４及びトロンボモジュリンを使用して、ＦＡＣＳにより選別した。続いて、選別した細胞集団をＱ−ＰＣＲにより分析して、胚体及び胚体外内胚葉並びに他の細胞型に関するマーカーの相対発現レベルを確定した。最適に分化させた培養物から採取されるＣＸＣＲ４選別した細胞は、９８％を超える純度の胚体内胚葉細胞の単離をもたらした。
【０２０３】
表２は、本明細書中に記載する方法を使用してｈＥＳＣから分化させた胚体内胚葉培養物に関するマーカー分析の結果を示す。
【０２０４】
【表２】
【０２０５】
特に、表２は、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７陽性細胞（内胚葉）が細胞培養物における細胞の７０〜８０％を構成していたことを示す。これらのＳＯＸ１７発現細胞のうち、２％未満がＴＭ（壁側内胚葉）を発現し、１％未満がＡＦＰ（臓側内胚葉）を発現した。ＴＭ陽性細胞及びＡＦＰ陽性細胞の比率（組み合わせた壁側内胚葉及び臓側内胚葉、総計３％）をＳＯＸ１７／ＣＸＣＲ４陽性細胞の比率から差し引きした後、細胞培養物の約６７％〜約７７％が胚体内胚葉であったことが観察され得る。およそ１０％の細胞が、ｈＥＳＣに関するマーカーであるＥ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）に関して陽性であり、細胞の約１０〜２０％が他の細胞型であった。
【０２０６】
ＦＡＣＳ分離前に得られる分化細胞培養物における胚体内胚葉の純度は、５〜６日の分化手順全体にわたって０．５％以下でＦＢＳ濃度を維持することにより、上述の低血清手順と比較して改善させることができることを本発明者等は発見している。しかしながら、５〜６日の分化手順全体にわたって０．５％以下で細胞培養物を維持することはまた、産生される総胚体内胚葉細胞数の低減をもたらす。
【０２０７】
本明細書中に記載する方法により産生される胚体内胚葉細胞は、それほどの分化を伴わずに５０日よりも長い間、アクチビンの存在下で培養において維持及び増殖されている。かかる場合では、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β発現は、培養期間にわたって維持される。さらに、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＺＩＣ１及びＢＲＡＣＨは、これらの培養物では検出されなかった。かかる細胞は、それほどの分化を伴わずに５０日よりも実質的に長い間、培養において維持及び増殖させることができる可能性が高い。
【実施例１１】
【０２０８】
胚体内胚葉細胞のさらなるマーカー
以下の実験では、精製胚体内胚葉及びヒト胚性幹細胞集団からＲＮＡを単離した。続いて、遺伝子発現は、各精製集団由来のＲＮＡの遺伝子チップ分析により分析した。Ｑ−ＰＣＲも実施して、胚体内胚葉に関するマーカーとして、胚体内胚葉では発現されるが、胚性幹細胞では発現されない遺伝子の可能性をさらに研究した。
【０２０９】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、２０％ノックアウト血清代替物、４ｎｇ／ｍｌの組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で維持された。ｈＥＳＣは、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトアクチビンＡ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地中で５日間培養することにより胚体内胚葉へ分化させた。ＦＢＳの濃度は、毎日以下の通りに変化させた：０．１％（１日目）、０．２％（２日目）、２％（３〜５日目）。
【０２１０】
遺伝子発現分析のためにｈＥＳＣ及び胚体内胚葉の精製集団を得るために、細胞を蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により単離した。免疫精製は、ｈＥＳＣに関してはＳＳＥＡ４抗原（R&D Systems、ｃａｔ＃ＦＡＢ１４３５Ｐ）を使用して、また胚体内胚葉に関してはＣＸＣＲ４（R&D Systems、ｃａｔ＃ＦＡＢ１７０Ｐ）を使用して達成した。細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡ（Invitrogen、ｃａｔ＃２５３００−０５４）を使用して解離させて、２％ヒト血清を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄して、氷上で１０分間１００％ヒト血清中に再懸濁させて、非特異的結合をブロックした。染色は、ヒト血清８００μｌ中で５×１０6個の細胞にフィコエリトリン結合抗体２００μｌを添加することにより氷上で３０分間実施した。細胞をＰＢＳ緩衝液８ｍｌで２度洗浄して、同１ｍｌ中に再懸濁させた。ＦＡＣＳ単離は、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ(BD Biosciences)を使用して、The Scripps Research Instituteの中心的な施設により実施された。細胞は、ＲＬＴ溶解緩衝液へ直接収集して、ＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮｅａｓｙ(Qiagen)により単離した。
【０２１１】
精製ＲＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォーム及びＵ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０高密度オリゴヌクレオチドアレイを使用して、発現プロフィールデータの作成のためにExpression Analysis(Durham, NC)へ二連で提出した。提示されたデータは、２つの集団、すなわちｈＥＳＣと胚体内胚葉の間で差次的に発現する遺伝子を同定する群の比較である。ｈＥＳＣに見出される発現レベルを上回る発現レベルの頑強な上方変化を示す遺伝子は、胚体内胚葉に高度に特徴的な新たな候補マーカーとして選択された。選択遺伝子は、上述のようにＱ−ＰＣＲによりアッセイして、遺伝子チップ上に見られる遺伝子発現変化を確証し、またｈＥＳＣ分化の経時変化中のこれらの遺伝子の発現パターンを研究した。
【０２１２】
図３４Ａ〜図３４Ｍは、或る特定のマーカーに関する遺伝子発現の結果を示す。結果は、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの添加の１日後、３日後及び５日後に分析した細胞培養物、５日目の分化手順の終わりに精製されたＣＸＣＲ４発現性胚体内胚葉細胞（ＣＸＤＥ）に関して、及び精製ｈＥＳＣにおいて表示される。図３４Ｃ及び図３４Ｇ〜図３４Ｍの比較により、６つのマーカー遺伝子、すなわちＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１が、互いにほぼ一致し、且つまたＣＸＣＲ４の発現のパターン及びＳＯＸ１７／ＳＯＸ７の比と同一である発現パターンを示す。上述したように、ＳＯＸ１７は、胚体内胚葉並びにＳＯＸ７発現胚体外内胚葉の両方において発現される。ＳＯＸ７は胚体内胚葉で発現されないため、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７の比は、全体として集団において証明されるＳＯＸ１７発現への胚体内胚葉の寄与の信頼性の高い推定を提供する。パネルＣに対するパネルＧ〜Ｌ及びＭの類似性は、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１が、胚体内胚葉のマーカーである可能性
が高いこと、及びそれらが胚体外内胚葉細胞で有意に発現されないことを示す。
【０２１３】
本明細書中に記載されるＱ−ＰＣＲの結果は、ＩＣＣによりさらに確認することができることが理解されよう。
【実施例１２】
【０２１４】
ＳＯＸ１７プロモーター−ＥＧＦＰトランスジェニックｈＥＳＣ系統及びＣＸＣＲ４プロモーター−ＥＧＦＰトランスジェニックｈＥＳＣ系統の産生
ＣＸＣＲ４特異的抗体を用いる胚体内胚葉の精製の代替方法として、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーターとのＥＧＦＰ融合が用いられ得る。特に本実施例は、ＳＯＸ１７調節領域の制御下でのレポーター遺伝子を含むレポーターカセットを含むベクターの構築を記載する。さらに、ＣＸＣＲ４調節領域の制御下でのレポーター遺伝子を含むレポーターカセットを含むベクターの構築が記載される。本実施例は、これらのベクターのうちの１つ又は複数でトランスフェクトされた細胞、例えばヒト胚性幹細胞、並びにそのゲノムに結合されるこれらのレポーターカセットのこの一方又は両方を有する細胞の調製も記載する。
【０２１５】
レポーター遺伝子で遺伝的に標識されたＳＯＸ１７発現胚体内胚葉細胞系統及びＣＸＲＣ４発現胚体内胚葉細胞系統を、それぞれＳＯＸ１７遺伝子又はＣＸＣＲ４遺伝子の調節領域（プロモーター）の制御下にＧＦＰレポーター遺伝子を置くことにより構築する。まず、ＥＧＦＰ発現がヒトＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４遺伝子プロモーターにより駆動されるプラスミド構築物を、ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Clonetech）のＣＭＶプロモーターをヒトＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４制御領域と取り替えることにより作製する。これらの制御領域はＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４遺伝子の特性化調節エレメントを含有し、そしてそれらはトランスジェニックマウスにおけるこれらの遺伝子の正常発現パターンを付与するのに十分である。その結果生じるベクターでは、ＥＦＧＰの発現はＳＯＸ１７プロモーター又はＣＸＣＲ４プロモーターにより駆動される。いくつかの実験において、このベクターをｈＥＳＣ中にトランスフェクトし得る。
【０２１６】
ＳＯＸ１７プロモーター／ＥＧＦＰカセット又はＣＸＣＲ４プロモーター／ＥＧＦＰカセットを上記のベクターから切り出し、次に、ホスホグリセレートキナーゼ−１プロモーターの制御下でネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有する選択ベクター中にサブクローニングする。カセットの除去を可能にするために、選択カセットは、ｆｌｐリコンビナーゼ認識部位に隣接する。この選択ベクターを直線化し、次に標準リポフェクション方法を用いてｈＥＳＣ中に導入する。Ｇ４１８における選択の１０〜１４日後、非分化トランスジェニックｈＥＳＣクローンを単離し、増殖させる。
【０２１７】
レポーターがＦＡＣＳによる細胞分離を可能にするという条件で、ＧＦＰ又はＥＧＦＰ以外のレポーター遺伝子が上記の構築物のいずれかで用いられ得ることが理解されよう。
【実施例１３】
【０２１８】
胚体内胚葉の代替的単離
以下の実施例は、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーター／ＥＧＦＰカセットを含むｈＥＳＣが胚体内胚葉細胞に分化し、次に蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）によりその後単離される、ということを実証する。
【０２１９】
ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーター／ＥＧＦＰトランスジェニックｈＥＳＣを、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含有し、血清を含有しない増殖培地中で約６、１２及び１８時間分化させる。次に分化細胞をトリプシン消化により収穫し、Becton DickinsonＦＡＣＳ Ｄｉｖａで直接ＲＮＡ溶解緩衝液又はＰＢＳ中に分類する。単一生細胞の試料を
ＥＧＦＰに関するゲーティングなしに採取し、そして単一生細胞をＥＧＦＰ陽性及びＧＦＰ陰性集団にゲーティングする。別個の実験で、蛍光強度（高低）によってＥＧＦＰ陽性画分を２つの等サイズ集団に分離する。
【０２２０】
分類後、Ｑ−ＰＣＲ及び免疫細胞化学により、細胞集団を分析する。Ｑ−ＰＣＲ分析のために、QiagenＲＮｅａｓｙカラムを用いてＲＮＡを調製し、次にｃＤＮＡに転換する。前記のようにＱ−ＰＣＲを実行する。免疫細胞化学分析のために、細胞をＰＢＳ中に分類し、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ遠心分離を用いてガラススライドに接着させる。一次抗体はＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４である。ＦＩＴＣ（緑色）又はローダミン（赤色）に結合される適切な二次抗体を用いて、第１の抗体の結合を検出する。
【０２２１】
分類細胞をさらにＱ−ＰＣＲ分析に付す。分化細胞は、ＥＧＦＰ蛍光と内因性ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４発現遺伝子発現との相関を示す。非蛍光細胞と比較して、ＥＧＦＰ陽性細胞は、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４発現レベルの２倍より大きい増大を示す。高及び低ＥＧＦＰ強度細胞の分離は、ＥＧＦＰ発現レベルがＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４発現レベルと相関する、ということを示す。ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡ分析のほかに、分類細胞をＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４ポリペプチドの免疫細胞化学分析に付す（ＣＸＣＲ４／ＥＧＦＰ融合体を用いる実施形態では、ＳＯＸ１７ポリペプチド発現を分析し、そしてＳＯＸ１７／ＥＧＦＰ融合体を用いる場合には、ＣＸＣＲ４ポリペプチド発現を分析する）。ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４ポリペプチドの実質的発現は、富化ＥＧＦＰ陽性画分で観察され得る。それに対して、ＥＧＦＰ陰性画分中では、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４ポリペプチドの発現はほとんど観察されない。
【０２２２】
これらの結果を考えると、分類前に分化細胞培養物中に存在する細胞の少なくとも約５％は、ＳＯＸ１７／ＣＸＣＲ４陽性胚体内胚葉細胞である。分類細胞集団中の細胞の少なくとも約９０％は、ＳＯＸ１７／ＣＸＣＲ４陽性胚体内胚葉細胞である。
【実施例１４】
【０２２３】
培養での胚体内胚葉細胞の継代培養
本実施例は、本明細書中に記載される胚体内胚葉細胞が細胞培養で維持されて、さらなる分化を伴わずに継代培養され得る、ということを実証する。
【０２２４】
低血清ＲＭＰＩ中の１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの存在下で、ＣｙＴ２５ ｈＥＳＣ系統の２つの関連継代培養（ＥＢ及びＥＶと呼ばれる）から、胚体内胚葉細胞を分化させた。低血清ＲＰＭＩは、０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を１日目に、０．２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを２日目に、そして２％血清をそれ以後の各日目に含有した。４日間の分化後、分化の誘導から測定して合計で３６日間、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの存在下又は非存在下で培養で細胞を維持した。３６日間の培養期間中、胚体内胚葉細胞を２回、継代培養した。さらに２９〜３６日目に、ＥＶと呼ばれる群の細胞をさらに５０ｍｇ／ｍｌのＥＧＦと接触させた。培養の４、９、２３、２９及び３６日目に、Ｑ−ＰＣＲを用いて、胚体内胚葉を示すマーカー遺伝子の発現を測定した。
【０２２５】
図３５Ａ〜図３５Ｄは、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを提供された細胞培養物中で、ｈＥＳＣからの胚体内胚葉細胞の誘導（４〜３６日目）後、３２日間の培養期間中、胚体内胚葉マーカーＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＣＸＣＲ４の発現が維持された、ということを示す。アクチビンＡの非存在下で増殖した細胞培養物中では、これらのマーカーの発現はほとんど観察されなかった。５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの付加は、胚体内胚葉マーカーのいずれの発現も有意に増大するように見えなかった。
【実施例１５】
【０２２６】
精製胚体内胚葉細胞の増殖
本実施例は、本明細書中に記載される胚体内胚葉細胞がｈＥＳＣから分化され、精製され、次に再増殖されて、細胞培養で増殖され得る、ということを実証する。
【０２２７】
図３６は、胚体内胚葉精製／増殖実験の計画を示す。特に、低血清ＲＭＰＩ中で１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの存在下で、ｈＥＳＣ系統ＣｙＴ２５の９６回目の継代培養から、胚体内胚葉細胞を分化させた。低血清ＲＰＭＩは、０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を１日目に、０．２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを２日目に、そして２％血清をそれ以後の各日目に含有した。５日間の分化後、上記実施例に記載したように、ＣＸＣＲ４に対する抗体を用いて、細胞をＦＡＣＳ精製に付した。次に精製細胞集団を、以下の４つの成長因子条件のうちの１つの下で、２％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ中でポリオルニチン及び１０μｇ／ｍｌヒトフィブロネクチンで被覆されたＩＶＦ皿上で培養した：因子添加なし（ＮＦ）；１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ａ）；１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１（ＡＩ）；又は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、１２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（ＡＦＥ）。１１日目に、標準トリプシン処理法を用いて、増殖胚体内胚葉細胞を継代培養した。次に細胞培養物の各々を、継代培養後さらに１０日間増殖させた（アクチビンＡとの最初の接触後、全体で２１日）。図３６に示すように、ｍＲＮＡの試料を、０、５、１１及び２１日目に得た。
【０２２８】
図３７Ａ〜図３７Ｅは、培養条件の各々に関して試料時点の各々での種々の胚性細胞型に関するマーカー遺伝子の発現を示す。図３７Ａ及び図３７Ｂに示すように、胚体内胚葉マーカーＳＯＸ１７及びＧＳＣは、５日齢非精製胚体内胚葉培養物中で高度に発現されたが、ｈＥＳＣ中では発現されなかった。この発現は、ｈＥＳＣマーカーＯＣＴ４の発現と対照を成す（図３７Ｃ）。胚体内胚葉細胞の精製の６日後（１１日目）、ＳＯＸ１７の発現及びＧＳＣ発現は、成長因子（単数又は複数）で処理された細胞培養物の各々においては高度に残存したが、アクチビンＡの非存在下で増殖した細胞培養物中には残存しなかった（図３７Ａ及び図３７Ｂ）。継代培養の１０日後（２１日目）に、これらのマーカーに関して類似の発現パターンを観察した（図３７Ａ及び図３７Ｂ）。ｈＥＳＣ（ＯＣＴ４）、中胚葉（ブラキュリ）又は外胚葉（ＺＩＣ１及びＳＯＸ１）のマーカーに関するｍＲＮＡの発現は、精製後の細胞培養物のいずれにおいても観察されなかった。この結果は、アクチビンＡの非存在下でさえ、精製胚体内胚葉細胞がｈＥＳＣ又は他の２つの胚性細胞系統の細胞を形成しない、ということを示す（図３７Ｃ〜図３７Ｆ）。
【０２２９】
本明細書中に記載される方法、組成物及び装置は、目下、好ましい実施形態を代表するものであり、例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。その変更及びその他の使用は当業者に思い付かれ、これらは本発明の精神に包含され、そして開示の範囲により規定される。したがって本発明の範囲及び精神を逸脱することなく、本明細書に開示される発明に種々の置換及び修正がなされ得るということは、当業者には明らかである。
【０２３０】
添付の特許請求の範囲及び本開示全体を通して用いられる場合、「本質的に〜から成る」という語句は、当該語句の後ろに列挙される任意の要素を含むことを意味し、列挙した要素に関する開示において特定される活性又は作用を妨害しないか又は寄与しない他の要素に限定される。したがって「本質的に〜から成る」という語句は、列挙した要素が必要とされるか又は必須であるが、他の要素は任意であり、それらが列挙した要素の活性又は作用に影響を及ぼすか否かによって、存在してもよいし存在しなくてもよい、ということを示す。
【０２３１】
［参考文献］
多数の文献及び特許参考文献を、本特許出願中で引用してきた。本特許出願で引用され
る参考文献のそれぞれ及び全てが、参照として本明細書中に全体が援用される。
【０２３２】
いくつかの参考文献に関しては、全引用が文書の本文中に存在する。他の参考文献に関しては、文書の本文中における引用は著者及び年で示しているが、全引用を以下に示す：
【０２３３】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
【表３−６】
【図面の簡単な説明】
【０２３４】
【図１】ｈＥＳＣからのβ細胞の産生のための提案された分化経路の模式図である。当該経路の第１の工程は、ＥＳ細胞を胚体内胚葉細胞系列に関係付け(commit)、そして膵臓内胚葉、内分泌性内胚葉又は島／β細胞へのＥＳ細胞のさらなる分化における既知の最も初期の工程のうちの１つを表す。この移行を媒介するために有用ないくつかの因子は、ＴＧＦβファミリーの成員であり、例としては、アクチビン及びノーダルが挙げられるが、これらに限定されない。胚体内胚葉標的細胞を規定するための例示的マーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＭＩＸ１及びＣＸＣＲ４である。
【図２】保存モチーフの位置を表示し、且つＧＥＮＯＶＡＣによる免疫化手順に使用される領域を強調するヒトＳＯＸ１７ ｃＤＮＡの略図である。
【図３】ＳＯＸ１７が、ＳＯＸ７に、また幾分劣るがＳＯＸ１８に最も密接に関連することを示す相関系統樹である。ＳＯＸ１７タンパク質は、同種内のＳＯＸ Ｆ群サブファミリーの他の成員に対するよりも種相同体間でより密接に関連する。
【図４】ラット抗ＳＯＸ１７抗体でプローブしたウェスタンブロットである。このブロットは、線維芽細胞において過剰発現されるヒトＳＯＸ１７タンパク質に関するこの抗体の特異性（レーン１）及びＥＧＦＰとの免疫反応性の欠如（レーン２）或いは最も密接に関連するＳＯＸスーパーファミリー成員であるＳＯＸ７（レーン３）を実証する。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、相当数のＡＦＰ+同時標識細胞を表示するＳＯＸ１７+細胞のクラスター（Ａ）を示す顕微鏡写真である。これは、ＡＦＰ+細胞がほとんど又は全く観察されない他のＳＯＸ１７+クラスター（Ｂ）と著しい対比を成す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｃは、壁側内胚葉及びＳＯＸ１７を示す顕微鏡写真である。パネルＡは、ｈＥＳ細胞の無作為に分化された培養物における壁内胚葉細胞の細胞表面上に位置するヒトトロンボモジュリン（ＴＭ）タンパク質に関する免疫細胞化学を示す。パネルＢは、ＴＭ及びＳＯＸ１７に関して二重標識されたＡで示されるのと同一視野である。パネルＣは、ＤＡＰＩ標識された核を伴う同一視野の位相コントラスト画像である。ＤＡＰＩ標識された核とＳＯＸ１７ラベリングの完全な相関に留意されたい。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によるＳＯＸ１７遺伝子発現及びＳＯＸ１７特異的抗体による抗ＳＯＸ１７陽性細胞を示す棒グラフである。パネルＡは、未分化対照培地（ＳＲ２０）と比較して、アクチビンＡがＳＯＸ１７遺伝子発現を増大させる一方で、レチノイン酸（ＲＡ）はＳＯＸ１７発現を強力に抑制することを示す。パネルＢは、これらの変化の同一パターン並びに類似した規模が、ＳＯＸ１７+細胞数に反映されることを示しており、ＳＯＸ１７遺伝子発現のＱ−ＰＣＲ測定は、単一細胞レベルでの変化を大きく反映することを示す。
【図８】図８Ａは、アクチビンＡの存在下での分化ｈＥＳＣの培養は、低レベルのＡＦＰ遺伝子発現を維持するのに対して、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で無作為に分化することが可能とされる細胞は、ＡＦＰの強力なアップレギュレーションを示すことを示す棒グラフである。発現レベルの差異は、およそ７倍である。図８Ｂ及び図８Ｃは、１０％ＦＢＳ単独（上）に対するアクチビンＡ処理状態（下）で観察されるＡＦＰ+細胞の非常に希少且つ小さなクラスターにより示されるように、アクチビンＡによるＡＦＰ発現の抑制もまた単一細胞レベルで明白であることを示す２つの顕微鏡写真の画像である。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、フローサイトメトリーを使用したＡＦＰ+細胞数の定量化を示す比較画像である。この図は、アクチビンＡの存在（右パネル）及び非存在（左パネル）下でのＡＦＰ遺伝子発現の変化の規模（図８Ａ）がＡＦＰ+細胞の数に正確に対応することを実証し、さらに個々の細胞レベルで起こる変化を示すためのＱ−ＰＣＲ分析の有用性を支持する。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｆは、ノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢ（ＮＡＡ）へのｈＥＳＣの暴露が、５日間にわたってＳＯＸ１７+細胞の数の著しい増大をもたらすことを示す顕微鏡写真である（Ａ〜Ｃ）。ＤＡＰＩ染色された核により示されるように（Ｄ〜Ｆ）、ＳＯＸ１７+細胞の相対存在量を、各視野に存在する細胞の総数と比較することにより、すべての細胞のおよそ３０〜５０％が、ＮＡＡによる５日の処理後にＳＯＸ１７に対して免疫反応性であることがわかる。
【図１１】アクチビンＡ（０、１０、３０又は１００ｎｇ／ｍｌ）は、分化ｈＥＳＣにおけるＳＯＸ１７遺伝子発現を用量依存的に増大させることを実証する棒グラフである。増大された発現は、接着培養物上での３日間の処理後にすでに強健であり、同様に続く１、３及び５日の懸濁培養まで継続する。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｃは、ＭＩＸＬ１（パネルＡ）、ＧＡＴＡ４（パネルＢ）及びＨＮＦ３ｂ（パネルＣ）の発現に対するアクチビンＡの影響を実証する棒グラフである。アクチビンＡ用量依存的増大はまた、胚体内胚葉の３つの他のマーカーであるＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４及びＨＮＦ３ｂに関しても観察される。アクチビン用量に応答した増大された発現の規模は、ＳＯＸ１７に関して観察される規模と際立って類似しており、アクチビンＡが、４つすべての遺伝子（ＳＯＸ１７+、ＭＩＸＬ１+、ＧＡＴＡ４+及びＨＮＦ３ｂ+）を同時発現する細胞の集団を特定していることを強力に示している。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｃは、ＡＦＰ（パネルＡ）、ＳＯＸ７（パネルＢ）及びＳＰＡＲＣ（パネルＣ）の発現に対するアクチビンＡの影響を実証する棒グラフである。臓側内胚葉マーカーＡＦＰの発現においてアクチビンＡ用量依存的減少が見られる。原始内胚葉（ＳＯＸ７）及び壁側内胚葉（ＳＰＡＲＣ）のマーカーは、未変化のままであるか、或いはいくつかの時点で抑制を示すことから、アクチビンＡが、これらの胚体外内胚葉細胞型を特定するように作用しないことを示している。このことはさらに、ＳＯＸ１７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４及びＨＮＦ３ｂの増大された発現が、アクチビンＡに応答した胚体内胚葉細胞の数の増大に起因し得るという事実を支持する。
【図１４】図１４Ａ及び図１４Ｂは、ＺＩＣ１（パネルＡ）及びブラキュリ発現（パネルＢ）に対するアクチビンＡの影響を示す棒グラフである。神経マーカーＺＩＣ１の一貫した発現は、神経分化に対するアクチビンＡの用量依存的影響が見られないことを実証する。ブラキュリの減少された発現により示されるように、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ処理により媒介される中胚葉分化の顕著な抑制が見られる。これは、中内胚葉前駆体からの胚体内胚葉の増大された特異化の結果である可能性が高い。より低レベルのアクチビンＡ処理（１０及び３０ｎｇ／ｍｌ）は、未処理対照培養物に対して分化のより後期の時点でブラキュリの発現を維持する。
【図１５】図１５Ａ及び図１５Ｂは、アクチビンによる処理に応答した減少された壁側内胚葉分化を示す顕微鏡写真である。ＴＭhi壁側内胚葉の領域は、血清単独中で分化される場合、培養物の至るところで見られる（Ａ）のに対して、アクチビンが包含される場合、ＴＭ+細胞への分化は乏しく（Ｂ）、ＴＭ免疫反応性の全体的な強度はより低い。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｄは、アクチビンＡ及びアクチビンＢによる処理に応答したマーカー発現を示す顕微鏡写真である。ｈＥＳＣは、アクチビンＡ及びアクチビンＢにより連続４日間処理して、ＳＯＸ１７、ＡＦＰ及びＴＭ抗体で三重標識した。パネルＡ−ＳＯＸ１７、パネルＢ−ＡＦＰ、パネルＣ−ＴＭ及びパネルＤ−相／ＤＡＰＩ。ＡＦＰ（Ｂ）及びＴＭ（Ｃ）免疫反応性の完全な非存在と関連した無数のＳＯＸ１７陽性細胞（Ａ）に注目されたい。
【図１７】ｈＥＳＣからのｉｎ ｖｉｔｒｏでの胚体内胚葉及び臓側内胚葉の出現を示す顕微鏡写真である。臓側内胚葉の領域は、ＡＦＰhi／ＳＯＸ１７lo/-により同定される一方で、胚体内胚葉は、完全に反対のプロフィールであるＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo/-を示す。この視野は、これらの２つの領域の互いに対する近接性に起因して選択的に選択された。しかしながら、何度もＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo/-領域がＡＦＰhi細胞の任意の領域からの絶対的な単離で観察され、これは臓側内胚葉細胞とは別個の胚体内胚葉細胞の起源を示唆する。
【図１８】ＴＧＦβファミリーのリガンド及び受容体を表す略図である。ＡＲ Ｓｍａｄ及びＢＲ Ｓｍａｄを活性化する因子は、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉の産生に有用である（J Cell Physiol. 187: 265-76を参照）。
【図１９】個々のＴＧＦβ因子及びＴＧＦβ因子の組合せによる処理の結果として、経時的にＳＯＸ１７発現の誘導を示す棒グラフである。
【図２０】ＴＧＦβ因子の組合せによる処理の結果として、経時的にＳＯＸ１７+細胞数の増大を示す棒グラフである。
【図２１】ＴＧＦβ因子の組合せによる処理の結果として、経時的にＳＯＸ１７発現の誘導を示す棒グラフである。
【図２２】アクチビンＡが、ＳＯＸ１７+細胞数の用量依存的増大を誘導することを示す棒グラフである。
【図２３】アクチビンＡ及びアクチビンＢ処理培養物へのＷｎｔ３ａの添加が、アクチビンＡ及びアクチビンＢ単独により誘導されるレベルを上回ってＳＯＸ１７発現を増大させることを示す棒グラフである。
【図２４】図２４Ａ〜図２４Ｃは、胚体内胚葉への分化が低ＦＢＳ条件で増強されることを示す棒グラフである。２％ＦＢＳを含有する培地中（２ＡＡ）でのアクチビンＡ及びＢによるｈＥＳＣの処理は、１０％ＦＢＳ培地（１０ＡＡ）中での同じ処理と比較して、２〜３倍高いレベルのＳＯＸ１７発現をもたらす（パネルＡ）。胚体内胚葉マーカーＭＩＸＬ１の誘導（パネルＢ）はまた、同じ方法で影響を及ぼされ、ＡＦＰ（臓側内胚葉）の抑制（パネルＣ）は、１０％ＦＢＳ条件よりも２％ＦＢＳにおいて高い。
【図２５】図２５Ａ〜図２５Ｄは、ＳＯＸ１７+細胞が培養中に分裂していることを示す顕微鏡写真である。ＳＯＸ１７免疫反応性細胞は、ｈＥＳＣコロニーの分化の瀬戸際(edge)に存在し（Ｃ、Ｄ）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）で標識される（パネルＢ）が、ＯＣＴ４では共同標識されていない（パネルＣ）。さらに、明確な有糸分裂の形が、ＳＯＸ１７+細胞（矢印）並びにＯＣＴ４+の未分化ｈＥＳＣ（矢じり）の両方において核のＤＡＰＩラベリングにより観察することができる（Ｄ）。
【図２６】様々な培地条件下での分化ｈＥＳＣにおけるＣＸＣＲ４の相対発現レベルを示す棒グラフである。
【図２７】図２７Ａ〜図２７Ｄは、胚体内胚葉マーカーのパネルが、どのようにして図２６で示されるのと同じ分化処理にわたってＣＸＣＲ４と非常に類似した発現のパターンを共有するかを示す棒グラフである。
【図２８】図２８Ａ〜図２８Ｅは、中胚葉（ブラキュリ、ＭＯＸ１）、外胚葉（ＳＯＸ１、ＺＩＣ１）及び臓側内胚葉（ＳＯＸ７）に関するマーカーが、どのようにして図２６で示されるのと同じ処理にわたってＣＸＣＲ４発現に対する逆相関を示すかを示す棒グラフである。
【図２９】図２９Ａ〜図２９Ｆは、図２６〜図２８で示される３つの培地条件にわたってＳＯＸ１７免疫反応性細胞における相対的な差異を示す顕微鏡写真である。
【図３０】図３０Ａ〜図３０Ｃは、分化培地に添加されるアクチビンＡの増大濃度によるＣＸＣＲ４+細胞数の増大を実証するフローサイトメトリードットプロットである。
【図３１】図３１Ａ〜図３１Ｄは、高用量アクチビンＡ処理から単離されるＣＸＣＲ４+細胞（Ａ１００−ＣＸ＋）が、母集団（Ａ１００）よりも胚体内胚葉マーカーに関してさらに一層富化されることを示す棒グラフである。
【図３２】蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して単離されるＣＸＣＲ４+細胞及びＣＸＣＲ４-細胞からの遺伝子発現、並びに母集団における遺伝子発現を示す棒グラフである。これは、ＣＸＣＲ４+細胞が各母集団に存在する本質的にすべてのＣＸＣＲ４遺伝子発現を含有し、またＣＸＣＲ４-集団がＣＸＣＲ４遺伝子発現をほとんど含有しないか、或いは全く含有しないことを実証する。
【図３３】図３３Ａ〜図３３Ｄは、これらの非胚体内胚葉マーカーの発現においてすでに抑制されている高用量アクチビンＡ処理から単離されるＣＸＣＲ４+細胞における中胚葉（ブラキュリ、ＭＯＸ１）、外胚葉（ＺＩＣ１）及び臓側内胚葉（ＳＯＸ７）遺伝子発現の欠乏を実証する棒グラフである。
【図３４−１】図３４Ａ〜図３４Ｍは、胚体内胚葉細胞を同定するのに使用することができるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーであるＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１の発現分析は、それぞれパネルＧ〜Ｌに示される。これまでに記載した系統マーキング遺伝子であるＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１及びＭＯＸ１の発現分析は、それぞれパネルＡ〜Ｆに示される。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現分析を示す。パネルＡ〜Ｍそれぞれに関して、ｈＥＳＣと標識した欄は、精製ヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、２％ＦＢＳで処理した細胞（アクチビン添加なし）を示し、０．１Ａ１００は、０．１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、２Ａ１００は、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す。
【図３４−２】図３４Ａ〜図３４Ｍは、胚体内胚葉細胞を同定するのに使用することができるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーであるＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１の発現分析は、それぞれパネルＧ〜Ｌに示される。これまでに記載した系統マーキング遺伝子であるＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１及びＭＯＸ１の発現分析は、それぞれパネルＡ〜Ｆに示される。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現分析を示す。パネルＡ〜Ｍそれぞれに関して、ｈＥＳＣと標識した欄は、精製ヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、２％ＦＢＳで処理した細胞（アクチビン添加なし）を示し、０．１Ａ１００は、０．１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、２Ａ１００は、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す。
【図３４−３】図３４Ａ〜図３４Ｍは、胚体内胚葉細胞を同定するのに使用することができるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーであるＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１の発現分析は、それぞれパネルＧ〜Ｌに示される。これまでに記載した系統マーキング遺伝子であるＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１及びＭＯＸ１の発現分析は、それぞれパネルＡ〜Ｆに示される。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現分析を示す。パネルＡ〜Ｍそれぞれに関して、ｈＥＳＣと標識した欄は、精製ヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、２％ＦＢＳで処理した細胞（アクチビン添加なし）を示し、０．１Ａ１００は、０．１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、２Ａ１００は、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す。
【図３５】図３５Ａ〜図３５Ｄは、種々の増殖条件下で３６日間維持された細胞培養物中の胚体内胚葉マーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＣＸＣＲ４の発現分析を、それぞれパネルＡ〜Ｄに示す。ＥＢ及びＥＶは、ｈＣｙＴ２５ ｈＥＳＣ系列から各々細胞集団を分離することを意味するために使用される。略号ＮＦはアクチビンＡの非存在下での細胞成長を示し、一方、Ａ１００は、１００ｎｇ／ｍｌのこの因子の存在下での細胞増殖を示す。ＥＧＦは、５０ｎｇ／ｍｌの上皮細胞成長因子を示す。
【図３６】胚体内胚葉細胞に関する細胞分化、単離及び増殖手順を示す線図である。略号は以下の通りである：ｈＥＳＣはヒト胚性幹細胞を指す；ｄ５ ｈＥＳＣ−ＤＥは非精製胚体内胚葉細胞を指す；ｄ６ ＦＡＣＳ−ＤＥはＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞を指す；そしてｐ１ ｄ１０ ＦＡＣＳ−ＤＥは、１回継代培養され、そして継代培養後さらに１０日間増殖した精製胚体内胚葉細胞を指す。ＲＮＡ試料を採取し、指定日の各々でマーカー発現に関して分析した。
【図３７】図３７Ａ〜図３７Ｆは、胚体内胚葉に分化され、次にその後ＣＸＣＲ４抗体を蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）と共に用いて精製された細胞培養物中の種々の胚性細胞系統マーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。略号は以下の通りである：ｐ９６ ｈＥＳＣは、ＣｙＴ２５ヒト胚性幹細胞の９６回目の継代培養からのｍＲＮＡを指す；ｄ５ ＤＥは、ｐ９６ ｈＥＳＣからの分化の５日目の非精製胚体内胚葉細胞からのｍＲＮＡを指す；ＮＦ ｄ６−ＦＡＣＳは、アクチビンＡの非存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞から分化後１１日目に採取されたｍＲＮＡを指す；Ａは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの分化後１１日目に採取されたｍＲＮＡを指す；ＡＩは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ及び１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１の存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの分化後１１日目に採取されたｍＲＮＡを指す；ＡＦＥは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ、１２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの分化後１１日目に採取されたｍＲＮＡを指す；ＮＦ ｐ１−ｄ１０−ＦＡＣＳは、アクチビンＡの非存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞の継代培養後１０日目に採取されたｍＲＮＡを指す；Ａは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの継代培養後１０日目に採取されたｍＲＮＡを指す；ＡＩは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ及び１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１の存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの継代培養後１０日目に採取されたｍＲＮＡを指す；そしてＡＦＥは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ、１２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの継代培養後１０日目に採取されたｍＲＮＡを指す。パネルＡ−ＳＯＸ１７；Ｂ−ＧＳＣ；Ｃ−ＯＣＴ４；Ｄ−ブラキュリ；Ｅ−ＺＩＣ１；Ｆ−ＳＯＸ１。
【技術分野】
【０００１】
[発明の分野]
本発明は、医学及び細胞生物学の分野に関する。特に本発明は、富化、単離及び／又は精製の前又は後に増殖した胚体内胚葉細胞の組成物、並びにこのような細胞を産生及び使用する方法に関する。
【０００２】
［関連出願］
本出願は、米国特許仮出願第６０／６９３，３１７号（表題「単離された胚体内胚葉細胞の増殖」、２００５年６月２３日出願）の非仮出願であり、それに対する優先権を主張し、そして米国特許仮出願第６０／７３６，５９８号（表題「胚体内胚葉のマーカー」、２００５年１１月１４日出願）の非仮出願であり、それに対する優先権を主張する；本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき、米国特許仮出願第６０／５８７，９４２号（表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体」、２００４年７月１４日出願）；米国特許仮出願第６０／５８６，５６６号（表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体」、２００４年７月９日出願）；及び米国特許仮出願第６０／５３２，００４号（表題「胚体内胚葉」、２００３年１２月２３日出願）に対する非仮出願として優先権を主張する米国特許出願第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉」、２００４年１２月２３日出願）の一部継続出願であり、それに対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
［背景］
ヒト多能性（pluripotent）幹細胞、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞及び胚性生殖（ＥＧ）細胞は、１９９４年に線維芽細胞フィーダーを含有しない（Bongso et al., 1994）そして線維芽細胞フィーダーを含有する（Hogan, 1997）培養でまず単離された。後に、Thomson、Reubinoff及びShamblottは、有糸分裂不活性化マウスフィーダー層を用いたヒトＥＳ及びＥＧ細胞の連続培養を確立した（Reubinoff et al., 2000；Shamblott et al., 1998；Thomson et al., 1998）。
【０００４】
ヒトＥＳ及びＥＧ細胞（ｈＥＳＣ）は、ヒト発生の早期段階を研究するための、並びにいくつかの疾患状態、例えば真性糖尿病及びパーキンソン病における療法的介入のための独自の機会を提供する。例えばｈＥＳＣ由来のインスリン生産β細胞の使用は、糖尿病の治療のためにドナー膵臓からの細胞を利用する現在の細胞療法手順を上回る膨大な改善を提供する。しかしながら現在、ｈＥＳＣからインスリン生産β細胞を生成する方法は分かっていない。したがって、ドナー膵臓からの島細胞を利用する真性糖尿病のための現在の細胞療法処置は、移植に必要とされる高品質の島細胞の不足により制限される。一人のＩ型糖尿病患者のための細胞療法は、約８×１０8個の膵臓島細胞の移植を要する（Shapiro
et al., 2000；Shapiro et al., 2001a；Shapiro et al., 2001b）。したがって、少なくとも２つの健常ドナー器官が、上首尾の移植のために十分な島細胞を得るために必要とされる。ヒト胚性幹細胞は、ヒト細胞療法のための相当量の高品質分化細胞を発生させるための出発材料の供給源を提供する。
【０００５】
ｈＥＳＣを細胞療法用途に独特に適合させる２つの特性は、多能性、並びに培養でこれらの細胞を長期間維持する能力である。多能性は、３つの一次胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）すべての誘導体に分化し、次に胚体外組織（例えば胎盤）及び生殖細胞のほかに、成熟生物体のすべての体細胞型を形成するｈＥＳＣの能力により確定される。多能性はｈＥＳＣに並外れた有用性を付与するが、この特性は、これらの細胞及びそれらの誘導体の研究及び操作のための独特のチャレンジを提起する。ｈＥＳＣ培養物を分化するに際して
生じ得る非常に種々の細胞型のために、混合された細胞集団において膨大な数の細胞型が極めて低い効率で産生される。ｈＥＳＣを、細胞療法用途に有用な細胞を生成するための出発材料として用いるために、上記の問題を克服することは有益であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
［発明の概要］
本発明の実施形態は、増殖した胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に関する。本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、培養で富化、単離及び／又は精製された胚体内胚葉細胞を増殖するための方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書中に記載される方法のいくつかは、細胞培養物中での胚体内胚葉細胞の維持、増殖(growth)、継代培養及び／又は増殖(expansion)に関する。このような実施形態では、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物が得られる。次に細胞は単離され、胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかが細胞培養物中の他の細胞の少なくともいくつかから分離され、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を産生する。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団は、胚体内胚葉細胞の増殖を可能にする条件下で培養される。
【０００８】
本明細書中に記載される方法のその他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、腸管の細胞又はそれに由来する器官に分化し得る多分化能細胞である。好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）を分化させることにより得られるヒト胚体内胚葉細胞である。このような実施形態では、胚体内胚葉細胞は、このような細胞を、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子、例えばアクチビンＡと接触させることにより、ｈＥＳＣから得られる。他の実施形態では、ヒト及び／又はその他の胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞の既存の培養物から得られる。このような実施形態では、培養物の一部分又は全部が、本明細書中に記載される胚体内胚葉細胞の増殖方法に用いられ得る。
【０００９】
胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を得るほかに、本明細書中に記載される増殖方法のいくつかの実施形態は、富化された胚体内胚葉細胞集団を産生する工程も含む。いくつかの実施形態では、このような富化された胚体内胚葉細胞集団は、細胞培養物中の他の細胞の少なくともいくつかから胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかを分離することにより産生される。したがって、胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかが、細胞培養物中に残存する他の細胞の少なくともいくつかから単離される。いくつかの実施形態では、単離する工程は、上記の胚体内胚葉細胞中で発現されるマーカーと結合するが、細胞培養物中に存在する上記の他の細胞中で実質的に発現されない試薬を細胞培養物中の細胞に提供することを含む。試薬結合胚体内胚葉細胞は次に、試薬非結合細胞から分離され、それにより富化された胚体内胚葉細胞集団を産生する。いくつかの実施形態では、マーカーはＣＸＣＲ４であり、そして試薬はＣＸＣＲ４に対する親和性を有する抗体である。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により分離される。
【００１０】
さらに他の実施形態では、胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかは、培養中の胚体内胚葉細胞を特異的に蛍光標識し、次にＦＡＣＳにより標識細胞を非標識細胞から分離することにより、培養物中の他の細胞の少なくともいくつかから分離される。いくつかの実施形態では、蛍光は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）により発生される。いくつかの実施形態では、ＧＦＰ及び／又はＥＧＦＰは、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーターの制御下で発現される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、上記のように産生される富化された胚体内胚葉細胞集団は、
胚体内胚葉細胞以外の細胞を実質的に含有しない。他の実施形態では、富化された胚体内胚葉細胞集団は、少なくとも約９６％〜少なくとも約１００％の胚体内胚葉細胞を含む。
【００１２】
本明細書中に記載される方法の付加的な実施形態は、胚体内胚葉細胞に富んだ集団又は当該集団の一部分をプレーティングすることを含む、培養する工程も含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトフィブロネクチン及び／又はポリ−オルニチンで被覆された表面でプレーティングされる。他の実施形態では、培養する工程は、約２％（ｖ／ｖ）の血清を含む培地中に富んだ胚体内胚葉細胞集団又はその一部分をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、培地は、少なくとも１つの成長因子も含む。或る特定の実施形態では、少なくとも１つの成長因子は、ＴＧＦβスーパーファミリーの一成員、例えばアクチビンＡを含む成長因子である。或いは、成長因子は、ＩＧＦ１、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ又は別の成長因子であり得る。このような実施形態では、成長因子は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で培地中に存在し得る。いくつかの実施形態では、成長因子の組合せが培地中に存在する。
【００１３】
本明細書中に記載される付加的な実施形態は、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を得て、次に胚体内胚葉細胞を継代培養し、それにより胚体内胚葉細胞を含む複数の細胞培養物を産生することにより培養で胚体内胚葉細胞を増殖する方法に関する。いくつかの実施形態では、細胞培養物中で得られる胚体内胚葉細胞は基材、例えば細胞培養フラスコの表面又はマイクロタイタープレートの表面に付着される。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は酵素的方法を用いて継代培養される。他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は機械的に継代培養される。さらに他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は細胞分散緩衝液を用いて継代培養される。
【００１４】
本明細書中に記載されるさらに他の実施形態は、本明細書中に記載される方法により産生される増殖胚体内胚葉細胞の培養物及び／又は集団に関する。このような実施形態では、胚体内胚葉細胞は、腸管の細胞又はそれに由来する器官に分化し得る多分化能細胞である。
【００１５】
或る特定の権限において、「〜を含む（comprising）」という用語の任意の一般的に許容可能な定義は存在し得ない。本明細書中で用いる場合、「〜を含む」という用語は、任意の付加的な要素の含入を可能にする「オープン」言語を表すよう意図される。これに留意して、本発明の付加的な実施形態を、以下の番号を付した段落を参照しながら説明する。
【００１６】
１． 培養で胚体内胚葉細胞を増殖する方法であって、以下：（ａ）胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得する工程；（ｂ）上記細胞培養物中の他の細胞のうちの少なくともいくつかから上記胚体内胚葉細胞のうちの少なくともいくつかを単離する工程であって、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を作り出す、工程；及び（ｃ）上記胚体内胚葉細胞の増殖を可能にする条件下で上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を培養する工程を含む、方法。
【００１７】
２． 上記胚体内胚葉細胞が腸管の細胞又はそれに由来する器官に分化し得る多分化能細胞である、段落１記載の方法。
【００１８】
３． 上記胚体内胚葉細胞がヒト胚体内胚葉細胞である、段落１記載の方法。
【００１９】
４． 上記胚体内胚葉細胞がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に由来する、段落３記載の方法。
【００２０】
５． 上記取得する工程が、上記ｈＥＳＣのうちの少なくともいくつかの胚体内胚葉細胞への分化を可能にするために、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子とｈＥＳＣを接触させることを含む、段落４記載の方法。
【００２１】
６． 上記ＴＧＦβスーパーファミリーの上記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡを含む、段落５記載の方法。
【００２２】
７． 胚体内胚葉細胞を含む上記細胞培養物を取得する工程が、現存する胚体内胚葉培養物の一部分を取得することをさらに含む、段落１記載の方法。
【００２３】
８． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が胚体内胚葉細胞以外の細胞を実質的に含有しない、段落１記載の方法。
【００２４】
９． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９６％の胚体内胚葉細胞を含む、段落１記載の方法。
【００２５】
１０． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９７％の胚体内胚葉細胞を含む、段落１記載の方法。
【００２６】
１１． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９８％の胚体内胚葉細胞を含む、段落１記載の方法。
【００２７】
１２． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９９％の胚体内胚葉細胞を含む、段落１記載の方法。
【００２８】
１３． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が約１００％の胚体内胚葉細胞を含む、段落１記載の方法。
【００２９】
１４． 上記単離する工程が、上記胚体内胚葉細胞中で発現されるマーカーと結合するが、細胞培養物中に存在する上記他の細胞中で実質的に発現されない試薬を上記細胞培養物に提供すること、及び、細胞培養物中に存在する上記他の細胞から上記試薬に結合された上記胚体内胚葉細胞を分離することであって、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を生じることを含む、段落１記載の方法。
【００３０】
１５． 上記マーカーがＣＸＣＲ４である、段落１４記載の方法。
【００３１】
１６． 上記試薬が抗体である、段落１４記載の方法。
【００３２】
１７． 上記抗体がＣＸＣＲ４に対する親和性を有する、段落１６の方法。
【００３３】
１８． 上記試薬に結合される上記胚体内胚葉細胞が蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により細胞培養物中に存在する上記他の細胞から分離される、段落１４記載の方法。
【００３４】
１９． 上記単離する工程が非標識細胞から蛍光標識胚体内胚葉細胞を分離することを含む、段落１記載の方法。
【００３５】
２０． 上記蛍光標識胚体内胚葉細胞が強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現の結果として標識される、段落１９記載の方法。
【００３６】
２１． ＥＧＦＰの発現がＳＯＸ１７プロモーターの制御下にある、段落２０記載の方
法。
【００３７】
２２． ＥＧＦＰの発現がＣＸＣＲ４プロモーターの制御下にある、段落２０記載の方法。
【００３８】
２３． 上記蛍光標識胚体内胚葉細胞がＦＡＣＳにより非標識細胞から分離される、段落１９の方法。
【００３９】
２４． 上記培養する工程が上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をプレーティングすることを含む、段落１記載の方法。
【００４０】
２５． 上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分がヒトフィブロネクチンで被覆された表面でプレーティングされる、段落２４記載の方法。
【００４１】
２６． 上記表面がポリオルニチンで被覆される、段落２５記載の方法。
【００４２】
２７． 上記培養する工程が約２％（ｖ／ｖ）の血清を含む培地中で上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、段落１記載の方法。
【００４３】
２８． 上記培養する工程が約２％（ｖ／ｖ）よりも多い血清を含む培地中で上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、段落１記載の方法。
【００４４】
２９． 上記培養する工程が約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、段落１記載の方法。
【００４５】
３０． 上記培養する工程が少なくとも１つの成長因子を含む培地中で上記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、段落１記載の方法。
【００４６】
３１． 上記少なくとも１つの成長因子がＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子の一成長因子である、段落３０記載の方法。
【００４７】
３２． 上記ＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子の少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡを含む、段落３１記載の方法。
【００４８】
３３． 上記アクチビンＡが約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で上記培地中に存在する、段落３２記載の方法。
【００４９】
３４． 上記少なくとも１つの成長因子がＩＧＦ１を含む、段落３０記載の方法。
【００５０】
３５． 上記ＩＧＦ１が約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で上記培地中に存在する、段落３４記載の方法。
【００５１】
３６． 上記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡとＩＧＦ１との組合せを含む、段落３０記載の方法。
【００５２】
３７． 上記少なくとも１つの成長因子がｂＦＧＦを含む、段落３０記載の方法。
【００５３】
３８． 上記ｂＦＧＦが約１２ｎｇ／ｍｌの濃度で上記培地中に存在する、段落３７記
載の方法。
【００５４】
３９． 上記少なくとも１つの成長因子がＥＧＦを含む、段落３０記載の方法。
【００５５】
４０． 上記ＥＧＦが約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で上記培地中に存在する、段落３９記載の方法。
【００５６】
４１． 上記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡと、ｂＦＧＦと、ＥＧＦとの組合せを含む、段落３０記載の方法。
【００５７】
４２． 段落１記載の方法により産生される増殖した胚体内胚葉細胞集団。
【００５８】
４３． 培養で胚体内胚葉細胞を増殖する方法であって、以下：（ａ）胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得する工程、及び（ｂ）上記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程であって、それにより胚体内胚葉細胞を含む複数の細胞培養物を産生する工程を含む、方法。
【００５９】
４４． 上記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、上記細胞培養物に少なくとも１つの酵素を提供することを含む、段落４３記載の方法。
【００６０】
４５． 上記少なくとも１つの酵素が少なくとも１つのプロテアーゼを含む、段落４４記載の方法。
【００６１】
４６． 上記少なくとも１つのプロテアーゼがトリプシンを含む、段落４５記載の方法。
【００６２】
４７． 上記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、上記胚体内胚葉細胞間の接触を機械的に妨げることを含む、段落４３記載の方法。
【００６３】
４８． 上記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、細胞分散緩衝液中で上記胚体内胚葉細胞をインキュベートすることを含む、段落４３記載の方法。
【００６４】
４９． 上記胚体内胚葉細胞が基材に付着される、段落４３記載の方法。
【００６５】
５０． 上記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、上記基材から上記胚体内胚葉細胞を剥離することを含む、段落４９記載の方法。
【００６６】
５１． 上記基材が組織培養フラスコの表面である、段落５０記載の方法。
【００６７】
５２． 上記基材がマイクロタイタープレートの表面である、段落５０記載の方法。
【００６８】
５３． 段落４３記載の方法により産生される増殖した胚体内胚葉細胞集団。
【００６９】
上記の方法及び組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞に関することが理解されよう。しかしながら上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ分化細胞組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ用途のために用いられ得る。
【００７０】
本発明の付加的な実施形態は、米国特許仮出願第６０／５３２，００４号（表題「胚体内胚葉」、２００３年１２月２３日出願）；米国特許仮出願第６０／５６６，２９３号（表題「ＰＤＸ１発現内胚葉」、２００４年４月２７日出願）；米国特許仮出願第６０／５
８６，５６６号（表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体」、２００４年７月９日出願）；米国特許仮出願第６０／５８７，９４２号（表題「胚体内胚葉の単離のためのケモカイン細胞表面受容体」、２００４年７月１４日出願）；米国特許出願第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉」、２００４年１２月２３日出願）；米国特許出願第１１／１１５，８６８号（表題「ＰＤＸ１発現内胚葉」、２００５年４月２６日出願）；米国特許出願第１１／１６５，３０５号（表題「胚体内胚葉を分化させるための因子の同定方法」、２００５年６月２３日出願）；米国特許仮出願第６０／６９３３６４号（表題「前原始線条及び中内胚葉細胞；米国特許仮出願第６０／６９３，３１７号（表題「単離された胚体内胚葉細胞の増殖」、２００５年６月２３日出願）；及び米国特許仮出願第６０／７３６，５９８号（表題「胚体内胚葉のマーカー」、２００５年１１月１４日出願）（これらの開示はその全体が参照により本明細書に援用される）にも見出され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７１】
［詳細な説明］
原腸陥入と呼ばれる初期ヒト発生におけるきわめて重大な段階は、受精後２〜３週間で起こる。原腸陥入は、３つの一次胚葉が最初に特定化され、そして器官形成されるのがこの時期であるため、非常に重要である（Lu et al., 2001；Schoenwolf and Smith, 2000）。外胚葉は、身体の外被及び全神経系の終局的形成を担うが、一方、心臓、血液、骨、骨格筋及びその他の結合組織は中胚葉に由来する。胚体内胚葉は、食道、胃並びに小腸及び大腸を含む全腸管、並びに腸管に由来する器官、例えば肺、肝臓、胸腺、上皮小体及び甲状腺、胆嚢及び膵臓の形成を担う胚葉として定義される（Grapin-Botton and Melton, 2000；Kimelman and Griffin, 2000；Tremblay et al., 2000；Wells and Melton, 1999；Wells and Melton, 2000）。非常に重要な区別は、胚体内胚葉と原始内胚葉と呼ばれる細胞の完全に別個の系統との間でなされるべきである。原始内胚葉は主として、胚体外組織、主に胎盤卵黄嚢の壁側及び臓側内胚葉部分、並びにライヘルト膜の細胞外マトリックス物質の形成を担う。
【００７２】
原腸陥入中、胚体内胚葉形成のプロセスは、中内胚葉細胞（中胚葉又は内胚葉を形成するための細胞構成成分）が原始線条と呼ばれる構造を介して移動する細胞移動事象で開始する。胚体内胚葉は、線条の前部分を通して、そして結節（線条の最前領域での特定構造）を通って移動する細胞に由来する。移動が起こると、胚体内胚葉はまず最前腸管に集合し、そして腸管の後端を形成する。
【００７３】
胚体内胚葉及びそれに由来する内胚葉細胞は、胚体内胚葉系統由来の最終的分化組織及び／又は器官を構成する細胞の誘導のための重要な多分化能出発点を表す。このような細胞、組織及び／又は器官は、細胞療法に非常に有用である。上首尾の細胞療法用途のためには多数の細胞が通常必要であるため、単一細胞型の多数の細胞を用いて分化手順を開始することが有益である。培養中の胚性幹細胞は胚体内胚葉に分化する場合、すべての胚性幹細胞が胚体内胚葉細胞型に転換されるというわけではない。この問題を克服するために、混合細胞培養物中で増殖中の胚体内胚葉細胞は、本明細書中に記載される方法を用いて、富化され、単離され及び／又は精製され得る。このような富化、単離及び／又は精製後、その結果生じた胚体内胚葉細胞は培養で増殖することが容易でないかもしれない。本明細書中に記載される方法は、富化、単離及び／又は精製された胚体内胚葉細胞が細胞培養物中で増殖(grow)及び増殖(expand)する能力を改良する。胚体内胚葉細胞はここで、富化、単離及び／又は精製後に培養で増殖され得るため、胚体内胚葉細胞由来の細胞、組織及び／又は器官がより多数産生され得る。
【００７４】
本発明のいくつかの実施形態は、細胞培養物中で胚体内胚葉細胞を増殖する方法に関する。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、混合細胞培養物中の他の細胞からこれ
らの細胞を分離することにより富化される。富化された胚体内胚葉細胞は次に、それらの増殖を可能にする条件下で培養される。
【００７５】
定義
本出願全体を通して用いられるような或る特定のいくつかの用語及び語句は、以下のように提示される意味を有する：
【００７６】
本明細書中で用いる場合、「胚性」とは、単一接合子で開始し、発生した配偶子細胞以外の多能性又は全能性細胞をもはや含まない多細胞構造で終わる生物体の一連の発生段階を指す。配偶子融合により得られる胚のほかに、「胚性」という用語は、体細胞核移行により得られる胚を指す。
【００７７】
本明細書中で用いる場合、「多分化能」又は「多分化能細胞」は、限られた数の他の特定の細胞型を生じ得る細胞型を指す。
【００７８】
本明細書中で用いる場合、「発現」とは、材料又は物質の産生、並びに材料又は物質の産生のレベル又は量を指す。したがって特定マーカーの発現の確定は、発現されるマーカーの相対量又は絶対量の検出、或いは単にマーカーの存在又は非存在の検出を指す。
【００７９】
本明細書中で用いる場合、「マーカー」とは、観察され得るか又は検出され得る任意の分子を指す。例えばマーカーとしては、核酸、例えば特定遺伝子の転写物、遺伝子のポリペプチド産物、非遺伝子産物ポリペプチド、糖タンパク質、炭水化物、糖脂質、脂質、リポタンパク質又は低分子（例えば１００００ａｍｕ未満の分子量を有する分子）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
細胞培養物及び／又は細胞集団に関連して用いられる場合、「一部分」という用語は、単一細胞から細胞培養物又は細胞集団の全体までの範囲である任意のゼロでない量の細胞培養物又は細胞集団を意味する。
【００８１】
細胞培養物中又は細胞集団中の細胞に関して、「〜を実質的に含有しない」という語句は、細胞培養物又は細胞集団を含有しない特定細胞型が、細胞培養物又は細胞集団中に存在する細胞の総数の約５％未満の量で存在する、ということを意味する。
【００８２】
細胞培地に関して、本明細書中で用いる場合、「低血清ＲＰＭＩ」は、所定の時間中に血清濃度が徐々に増大される低血清含有培地を指す。例えば一実施形態では、低血清ＲＰＭＩは、細胞増殖第１日目に約０．２％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、細胞増殖第２日目に約０．５％ＦＢＳ、そして細胞増殖の第３〜５日目に約２％のＦＢＳの濃度を含む。別の実施形態では、低血清ＲＰＭＩは、１日目に約０％、２日目に約０．２％、そして３日目及びその後日に約２％の濃度を含む。
【００８３】
本明細書中で用いる場合、「ｂＦＧＦ」及び「ＦＧＦ２」という用語は、互換的に用いられる。
【００８４】
胚体内胚葉細胞及びそれらに関連するプロセス
本明細書中に記載する実施形態は、幹細胞のような多能性細胞を、多分化能胚体内胚葉細胞へ分化させることにより培養で胚体内胚葉細胞を産生するための新規の所定のプロセスに関する。上述したように、胚体内胚葉細胞は、外胚葉又は中胚葉から産生される組織へ分化するのではなく、腸管並びに腸管に由来する器官へ分化する。或る特定の好ましい実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ｈＥＳＣに由来する。かかるプロセスは、膵臓、肝臓、肺、胃、腸、甲状腺及び胸腺のような組織に由来するヒト内胚葉の効率的な産生に関す
る基盤を提供することができる。例えば、胚体内胚葉の産生は、機能的インスリン生産β細胞への幹細胞の分化における第１の工程であり得る。有用な量のインスリン生産β細胞を得るためには、膵臓島／β細胞運命(fate)に到達する前に起きる分化工程のそれぞれに関して、高効率の分化が望まれる。胚体内胚葉細胞への幹細胞の分化は、機能的膵臓島／β細胞の産生に対しておそらく一番初めの工程を表す（図１に示されるように）ため、この工程での高効率の分化が特に望まれる。
【００８５】
胚体内胚葉細胞への多能性細胞の効率的分化の望ましさに鑑みて、本明細書中に記載される分化プロセスのいくつかの態様は、胚体内胚葉細胞への多能性細胞の約５０〜８０％の転換を生じるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法に関する。典型的には、このような方法は、所定の且つ一時的に特定化された様式での培養及び成長因子条件の適用を包含する。胚体内胚葉細胞に関する細胞集団のさらなる富化は、胚体内胚葉細胞と特異的に結合する試薬を用いることにより、集団中の他の細胞からの胚体内胚葉細胞の単離及び／又は精製により達成され得る。したがって、本明細書において記載されるいくつかの実施形態は、胚体内胚葉細胞並びにこのような細胞を産生するための方法及び単離するための方法及び／又は精製するための方法に関する。
【００８６】
細胞培養物又は細胞集団中の胚体内胚葉細胞の量を確定するためには、培養物中又は集団中の他の細胞からこの細胞型を区別する方法が望ましい。したがって、本明細書中に記載される或る特定の実施形態は、その存在、非存在及び／又は相対発現レベルが胚体内胚葉に特異的である細胞マーカー、並びにこのようなマーカーの発現を検出し、確定するための方法に関する。
【００８７】
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、マーカーの存在、非存在及び／又は発現レベルは、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）により確定される。例えば或る特定の遺伝子マーカー、例えばＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、ＳＯＸ７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１、ＣＲＩＰ１、並びに本明細書中に記載される他のマーカーにより産生される転写物の量が、定量的Ｑ−ＰＣＲにより確定される。他の実施形態では、免疫組織化学を用いて、上記遺伝子により発現されるタンパク質を検出する。さらに他の実施形態では、Ｑ−ＰＣＲ及び免疫組織化学的技法が、このようなマーカーの量又は相対的な比率を同定すると共に確定するために用いられる。
【００８８】
１つ又は複数の適切なマーカーの発現を確定するための上述に記載したような方法を使用することにより、胚体内胚葉細胞を同定すること、並びに細胞培養物又は細胞集団における胚体内胚葉細胞の比率を確定することが可能である。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、産生される胚体内胚葉細胞又は細胞集団は、非胚体内胚葉細胞型又は細胞集団よりも約２桁大きいレベルでＳＯＸ１７及び／又はＣＸＣＲ４遺伝子を発現する。他の実施形態では、産生される胚体内胚葉細胞又は細胞集団は、非胚体内胚葉細胞型又は細胞集団よりも２桁を超えるレベルでＳＯＸ１７及び／又はＣＸＣＲ４遺伝子を発現する。さらに他の実施形態では、産生される胚体内胚葉細胞又は細胞集団は、非胚体内胚葉細胞型又は細胞集団よりも約２桁以上大きいレベルでＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択されるマーカーの１つ又は複数を発現する。本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、ＰＤＸ１を実質的に発現しない。
【００８９】
本明細書中に記載される実施形態は、胚体内胚葉組成物にも関する。例えばいくつかの実施形態は胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に関するが、一方、他の実施形態は、胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団に関する。いくつかの好ましい実施形態は、培養中の細胞の少なくとも約５０〜８０％が胚体内胚葉細胞である胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に関す
る。特に好ましい実施形態は、培養中のヒト細胞の少なくとも約５０〜８０％が胚体内胚葉細胞であるヒト細胞を含む細胞培養物に関する。分化手順の効率は、或る特定のパラメーター、例えば細胞成長条件、成長因子濃度及び培養工程の時期（これらに限定されない）を修正することにより調整され得るため、本明細書中に記載される分化手順は、胚体内胚葉細胞への多能性細胞の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９５％より多い転換を生じ得る。他の好ましい実施形態では、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団への多能性細胞集団、例えば幹細胞集団の転換が意図される。
【００９０】
本明細書中に記載される組成物及び方法は、いくつかの有用な特徴を有する。例えば胚体内胚葉を含む細胞培養物及び細胞集団、並びにこのような細胞培養物及び細胞集団を産生する方法は、ヒト発生の初期をモデリングするのに有用である。さらに、本明細書中に記載される組成物及び方法は、疾患状態、例えば真性糖尿病における治療的介入にも役立ち得る。例えば胚体内胚葉は限られた数のみの組織のための供給源として役立つため、それは純粋組織又は細胞型の発生に用いられ得る。
【００９１】
多能性細胞からの胚体内胚葉の産生
胚体内胚葉を含む細胞培養物及び富化された細胞集団を産生するように多能性細胞を分化させるプロセスは、以下に、また米国特許第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉」２００４年１２月２３日出願）に記載されている。その開示は、参照により本明細書に全体が援用される。これらのプロセスのいくつかでは、出発材料として使用される多能性細胞は、幹細胞である。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉細胞を含む胚体内胚葉細胞培養物及び富化された細胞集団は、胚性幹細胞から産生される。胚体内胚葉細胞を派生させる好ましい方法は、胚体内胚葉産生のための出発材料として、ヒト胚性幹細胞を利用することである。かかる多能性細胞は、桑実胚に由来する細胞、胚の内部細胞塊又は胚の生殖腺隆起に由来する細胞であり得る。ヒト胚性幹細胞は、当該技術分野で既知の方法を使用して、実質的な分化なしで多能性状態で培養物中に維持されることができる。かかる方法は、例えば米国特許第５，４５３，３５７号、同第５，６７０，３７２号、同第５，６９０，９２６号、同第５，８４３，７８０号、同第６，２００，８０６号及び同第６，２５１，６７１号に記載されている。これらの開示は参照により本明細書に全体が援用される。
【００９２】
胚体内胚葉細胞を産生するためのいくつかのプロセスにおいて、ｈＥＳＣは、フィーダー層上に維持される。このようなプロセスでは、ｈＥＳＣを多能性状態に維持させる任意のフィーダー層が用いられ得る。ヒト胚性幹細胞を培養するために一般的に用いられる１つのフィーダー層は、マウス線維芽細胞の層である。さらに近年、ヒト線維芽細胞フィーダー層が、ｈＥＳＣの培養に用いるために開発された（その開示は参照により本明細書に全体が援用される、米国特許出願第２００２／００７２１１７号参照）。胚体内胚葉を産生するための代替的プロセスは、フィーダー層の使用を伴わずに多能性ｈＥＳＣの維持を可能にする。フィーダーを使用しない条件下での多能性ｈＥＳＣの維持方法は、米国特許出願第２００３／０１７５９５６号に記載されている。その開示は参照により本明細書に全体が援用される。
【００９３】
本明細書中で用いられるヒト胚性幹細胞は、血清を含有するか又は含有しない培養物中に維持され得る。いくつかの胚性幹細胞維持手順では、血清代替物が用いられる。他の場合には、無血清培養技法、例えば米国特許出願第２００３／０１９０７４８号（その開示は参照により本明細書に全体が援用される）に記載される技法が用いられる。
【００９４】
幹細胞は、それらが胚体内胚葉へ分化されることを望まれるまで、日常的な継代培養に
より多能性状態で培養で維持される。いくつかのプロセスでは、胚体内胚葉への分化は、胚体内胚葉への分化を促進するのに十分な量でＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子を幹細胞培養物へ供給することにより達成される。胚体内胚葉の産生に有用であるＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子は、ノーダル／アクチビン又はＢＭＰサブグループから選択される。いくつかの好ましい分化プロセスでは、成長因子は、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びＢＭＰ４から成る群から選択される。さらに、成長因子Ｗｎｔ３ａ及び他のＷｎｔファミリー成員は、胚体内胚葉細胞の産生に有用である。或る特定の分化プロセスでは、上述の成長因子のいずれかの組合せが使用され得る。
【００９５】
胚体内胚葉細胞への多能性幹細胞の分化のためのプロセスのいくつかに関しては、胚体内胚葉細胞への幹細胞の少なくとも一部分の分化を促すのに十分な濃度で成長因子が培養物中に存在するように、上記成長因子が細胞に提供される。いくつかのプロセスでは、上記成長因子は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度で細胞培養物中に存在する。
【００９６】
胚体内胚葉細胞への多能性幹細胞の分化のための或る特定のプロセスでは、上記の成長因子は、それらの付加後、細胞培養物から除去される。例えば成長因子は、それらの付加後、約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、又は約１０日以内に除去され得る。好ましいプロセスでは、成長因子は、それらの付加後約４日で除去される。
【００９７】
胚体内胚葉細胞の培養物は、低血清又は無血清を含有する培地中で増殖され得る。或る特定の培養条件下では、血清濃度は約０．０５％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。例えばいくつかの分化プロセスでは、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）未満、約０．１％（ｖ／ｖ）未満、約０．２％（ｖ／ｖ）未満、約０．３％（ｖ／ｖ）未満、約０．４％（ｖ／ｖ）未満、約０．５％（ｖ／ｖ）未満、約０．６％（ｖ／ｖ）未満、約０．７％（ｖ／ｖ）未満、約０．８％（ｖ／ｖ）未満、約０．９％（ｖ／ｖ）未満、約１％（ｖ／ｖ）未満、約２％（ｖ／ｖ）未満、約３％（ｖ／ｖ）未満、約４％（ｖ／ｖ）未満、約５％（ｖ／ｖ）未満、約６％（ｖ／ｖ）未満、約７％（ｖ／ｖ）未満、約８％（ｖ／ｖ）未満、約９％（ｖ／ｖ）未満、約１０％（ｖ／ｖ）未満、又は約１５％（ｖ／ｖ）未満又は約２０％（ｖ／ｖ）未満であり得る。いくつかのプロセスでは、胚体内胚葉細胞は、血清を用いずに、又は血清代替物を用いて増殖される。さらに他のプロセスでは、胚体内胚葉細胞はＢ２７の存在下で増殖される。このようなプロセスでは、Ｂ２７サプリメントの濃度は、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。
【００９８】
胚体内胚葉への多能性細胞の分化のモニタリング
胚体内胚葉へのｈＥＳＣ培養物の進行は、胚体内胚葉に特徴的なマーカーの発現を確定することによりモニタリングされ得る。いくつかのプロセスでは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーの存在又は非存在を検出することにより確定される。或いは、或る特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物又は細胞集団の細胞中に存在するレベルを測定することにより確定され得る。このようなプロセスでは、マーカー発現の測定は、定性的又は定量的であり得る。マーカー遺伝子により産生されるマーカーの発現を定量する一方法は、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）の使用による。Ｑ−ＰＣＲを実施する方法は、当該技術分野で既知である。当該技術分野で既知である他の方法も、マーカー遺伝子発現を定
量するために用いられ得る。例えばマーカー遺伝子産物の発現は、目的のマーカー遺伝子産物に特異的な抗体を用いることにより検出され得る。或る特定のプロセスでは、胚体内胚葉に特徴的なマーカー遺伝子の発現並びにｈＥＳＣ及び他の細胞型に特徴的なマーカー遺伝子の有意の発現の欠如が確定される。
【００９９】
以下の実施例でさらに記載するように、胚体内胚葉の信頼性の大きいマーカーは、ＳＯＸ１７遺伝子である。したがって、本明細書中に記載するプロセスにより産生される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現し、それによりＳＯＸ１７遺伝子産物を産生する。胚体内胚葉の他のマーカーは、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１である。胚体内胚葉細胞は、原始内胚葉及び臓側内胚葉に特徴的であるＳＯＸ７マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現する（表１を参照）ため、いくつかのプロセスでは、ＳＯＸ１７及びＳＯＸ７の両方の発現がモニタリングされる。他のプロセスでは、ｈＥＳＣに特徴的であるＳＯＸ１７マーカー遺伝子及びＯＣＴ４マーカー遺伝子の両方の発現がモニタリングされる。さらに、胚体内胚葉細胞は、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ又はトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＳＯＸ１７マーカー遺伝子を発現するため、これらの遺伝子の発現もまたモニタリングされ得る。
【０１００】
胚体内胚葉の別のマーカーは、ＣＸＣＲ４遺伝子である。ＣＸＣＲ４遺伝子は、細胞表面ケモカイン受容体をコードし、そのリガンドは、化学誘引物質ＳＤＦ−１である。成体におけるＣＸＣＲ４受容体保有細胞の主要な役割は、骨髄への造血細胞の遊走、リンパ球輸送並びに様々なＢ細胞及びマクロファージ血液細胞系統の分化であると考えられる［Kim, C., and Broxmeyer, H.J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)］。ＣＸＣＲ４受容体はまた、Ｔ細胞へのＨＩＶ−１の進入のための共受容体として機能する［Feng, Y., et al.
Science, 272, 872-877 (1996)］。［McGrath, K.E. et al. Dev. Biology 213, 442-456 (1999)］により実施された広範囲の一連の研究では、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４及びその特有のリガンドであるＳＤＦ−１［Kim, C., and Broxmyer, H., J. Leukocyte Biol. 65, 6-15 (1999)］の発現は、マウスにおいて初期発生及び成体期中に描写された。発生におけるＣＸＣＲ４／ＳＤＦ１相互作用は、いずれかの遺伝子がトランスジェニックマウスで破壊される［Nagasawa et al. Nature, 382, 635-638 (1996), Ma, Q., et al Immunmity, 10, 463-471 (1999)］場合、それが後期胚性致死をもたらしたことが実証された際に明らかとなった。McGrath他は、ＣＸＣＲ４は、RNA分解酵素保護及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成方法論の組合せを使用して初期原腸陥入胚（Ｅ７．５）中に検出される最も豊富なケモカイン受容体メッセンジャーＲＮＡであることを実証した。原腸陥入胚では、ＣＸＣＲ４／ＳＤＦ−１シグナル伝達は、原始線条胚葉細胞の遊走を誘導することに主に関与するようであり、この時期に存在する胚体内胚葉、中胚葉及び胚体外中胚葉上で発現される。Ｅ７．２−７．８マウス胚では、ＣＸＣＲ４及びα−フェトプロテインは、相互排他的であり、臓側内胚葉における発現の欠如を示している［McGrath, K.E. et al.
Dev. Biology 213, 442-456 (1999)］。
【０１０１】
多能性細胞を分化させることにより産生される胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現するため、胚体内胚葉細胞の産生を追跡するために、ＣＸＣＲ４の発現をモニタリングすることができる。さらに、本明細書中に記載する方法により産生される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１を包含するが、これらに限定されない胚体内胚葉の他のマーカーを発現する。胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ７マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現するため、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ７の両方の発現がモニタリングされ得る。他のプロセスでは、ＣＸＣＲ４マーカー遺伝子及びＯＣＴ４マーカー遺伝子の両方の発現がモニタリングされる。さら
に、胚体内胚葉細胞は、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ又はトロンボモジュリン（ＴＭ）マーカー遺伝子のレベルよりも高いレベルでＣＸＣＲ４マーカー遺伝子を発現するため、これらの遺伝子の発現もまたモニタリングされ得る。
【０１０２】
内胚葉細胞におけるＣＸＣＲ４の発現は、ＳＯＸ１７の発現を妨げないことが理解されよう。したがって、本明細書中に記載するプロセスにより産生される胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４を大いに発現するが、ＡＦＰ、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ又はＰＤＸ１を大いには発現するものではない。
【０１０３】
ＳＯＸ１７及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、分化条件に応じて、胚体内胚葉細胞において多種多様なレベルにわたって誘導されることが理解されよう。したがって、本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞又は細胞集団（例えば、多能性幹細胞）におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現よりも少なくとも約２倍〜少なくとも約１０，０００倍高い。他の実施形態では、胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞又は細胞集団（例えば、多能性幹細胞）におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現よりも、少なくとも約４倍高いか、少なくとも約６倍高いか、少なくとも約８倍高いか、少なくとも約１０倍高いか、少なくとも約１５倍高いか、少なくとも約２０倍高いか、少なくとも約４０倍高いか、少なくとも約８０倍高いか、少なくとも約１００倍高いか、少なくとも約１５０倍高いか、少なくとも約２００倍高いか、少なくとも約５００倍高いか、少なくとも約７５０倍高いか、少なくとも約１０００倍高いか、少なくとも約２５００倍高いか、少なくとも約５０００倍高いか、少なくとも約７５００倍高いか、或いは少なくとも約１００００倍高い。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞又は細胞集団（例えば、多能性幹細胞）におけるＳＯＸ１７マーカー及び／又はＣＸＣＲ４マーカーの発現よりも飛躍的に高い。
【０１０４】
同様に、本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択されるマーカーの発現は、非胚体内胚葉細胞又は細胞集団におけるＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１の発現と比較して増大されていることが理解されよう。
【０１０５】
さらに、胚体内胚葉細胞中でのＳＯＸ１７マーカーの発現レベルと、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現レベルとの間に或る範囲の差が存在することが理解されよう。同様に、胚体内胚葉細胞中でのＣＸＣＲ４マーカーの発現レベルと、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現レベルとの間に或る範囲の差が存在する。したがって、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７マーカー又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現より少なくとも約２倍〜少なくとも約１００００倍高い。他の実施形態では、ＳＯＸ１７マーカー又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現レベルより少なくとも約４倍高い、少なくとも約６倍高い、少なくとも約８倍高い、少なくとも約１０倍高い、少なくとも約１５倍高い、少なくとも約２０倍高い、少なくとも約４０倍高い、少なくとも約８０倍高い、少なくとも約１００倍高い、少なくとも約１５０倍高い、少なくとも約２００倍高い、少なくとも約５００倍高い、少なくとも約７５０倍高い、少なくとも約１０００倍高い、少なくとも約２５００倍高い、少なくとも約５０００倍高い、少なくとも約７５００倍高いか又は少なくとも約１００００倍高い。いくつかの実施形
態では、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーは、胚体内胚葉細胞中で有意に発現されない。
【０１０６】
本明細書中に記載するいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞におけるＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択されるマーカーの発現は、胚体内胚葉細胞におけるＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７の発現と比較して増大されていることが理解されよう。
【０１０７】
胚体内胚葉の富化、単離及び／又は精製
上述のプロセスのいずれかにより産生される胚体内胚葉細胞は、かかる細胞に特異的である親和性タグを使用することにより、富化、単離及び／又は精製することができる。胚体内胚葉細胞に特異的な親和性タグの例は、胚体内胚葉細胞の細胞表面上に存在するが、本明細書中に記載する方法により産生される細胞培養物中に見出されるであろう他の細胞型上には実質的に存在しないマーカー分子（例えば、ポリペプチド）に特異的である抗体、リガンド又は他の結合剤である。いくつかのプロセスでは、ＣＸＣＲ４に結合する抗体は、胚体内胚葉細胞の富化、単離又は精製用の親和性タグとして使用される。他のプロセスでは、ケモカインＳＤＦ−１又はＳＤＦ−１に基づく他の分子もまた、親和性タグとして使用され得る。かかる分子としては、ＳＤＦ−１フラグメント、ＳＤＦ−１融合体又はＳＤＦ−１模倣物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０８】
抗体を作製し、また細胞単離のためにそれらを使用する方法は当該技術分野で既知であり、かかる方法は、本明細書中に記載する抗体及び胚体内胚葉細胞を用いた使用に実施することができる。一プロセスでは、ＣＸＣＲ４に結合する抗体を磁気ビーズへ結合させた後、細胞間接着及び基材接着を低減させるように酵素的に処理した細胞培養物中の胚体内胚葉細胞へ結合させる。続いて、ビーズ結合された胚体内胚葉細胞と未結合細胞を分離するのに使用される可動性磁界へ細胞／抗体／ビーズ複合体を暴露させる。胚体内胚葉細胞が培養中の他の細胞と物理的に分離されると、抗体結合は妨げられて、細胞は、適切な組織培養培地中で再度プレーティングされる。
【０１０９】
富化、単離又は精製された胚体内胚葉細胞培養物又は集団を得るためのさらなる方法もまた使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＸＣＲ４抗体を、細胞間接着及び基材接着を低減させるように処理した胚体内胚葉含有細胞培養物とともにインキュベートさせる。続いて、細胞を洗浄して、遠心分離して、再懸濁させる。次に、細胞懸濁液を、一次抗体に結合することが可能な二次抗体（例えば、ＦＩＴＣ結合抗体）とともにインキュベートさせる。続いて、細胞を洗浄して、遠心分離して、緩衝液中に再懸濁させる。次に、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を使用して、細胞懸濁液を分析及び選別する。ＣＸＣＲ４陽性細胞を、ＣＸＣＲ４陰性細胞と分離して収集して、それによりかかる細胞型の単離をもたらす。望ましい場合、単離された細胞組成物は、代替的な親和性ベースの方法を使用することにより、或いは胚体内胚葉に特異的な同じか又は異なるマーカーを使用したさらなる一連の選別によりさらに精製することができる。
【０１１０】
さらに他のプロセスでは、胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４に結合するリガンド又は他の分子を使用して、富化、単離及び／又は精製される。いくつかのプロセスでは、分子はＳＤＦ−１又はそれらのフラグメント、融合体又は模倣物である。
【０１１１】
本明細書中に記載されるプロセスのいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は蛍光標識され、次に蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）を用いて非標識細胞から単離される。このような実施形態では、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸又は発現可能蛍光マーカー遺伝子をコードする別の核酸を用いて、ＰＤＸ１陽性細胞を標識する。例えば
いくつかの実施形態では、ＧＦＰ遺伝子産物又はその生物学的活性断片の発現がＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーターの制御下にあるように、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片の少なくとも１つのコピーが、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーターの下流の多能性細胞、好ましくはヒト胚性幹細胞中に導入される。いくつかの実施形態では、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４をコードする核酸の全コード領域が、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片により取って代わられる。他の実施形態では、ＧＦＰをコードする核酸又はその生物学的活性断片は、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４をコードする核酸の少なくとも一部分とフレーム内で融合され、それにより融合タンパク質を形成する。このような実施形態では、融合タンパク質はＧＦＰと類似の蛍光活性を保有する。
【０１１２】
蛍光標識する細胞、例えば上記の多能性細胞は、上記のように胚体内胚葉に分化される。胚体内胚葉細胞は蛍光マーカー遺伝子を発現するが、一方、他の細胞型はそうではないため、胚体内胚葉細胞は他の細胞型から分離され得る。いくつかの実施形態では、蛍光標識胚体内胚葉細胞及び非標識非胚体内胚葉細胞の混合物を含む細胞懸濁液は、ＦＡＣＳを用いて分類される。胚体内胚葉細胞は非蛍光細胞と別個に収集され、それにより胚体内胚葉の単離を生じる。所望であれば、単離された細胞組成物は、胚体内胚葉に特異的である同一の又は異なるマーカーを用いて、さらに一連の分類によりさらに精製され得る。
【０１１３】
好ましいプロセスでは、胚体内胚葉細胞は、幹細胞培養物が胚体内胚葉系統へと分化するように誘導された後、他の非胚体内胚葉細胞から富化、単離及び／又は精製される。上述の富化、単離及び精製手法は、分化の任意の段階でかかる培養物を用いて使用することができることが理解されよう。
【０１１４】
直ぐ上で記載された手法のほかに、胚体内胚葉細胞は、細胞単離のための他の技法によっても単離され得る。さらに胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞の選択的生存又は選択的増殖を促す成長条件で連続継代培養する方法によっても、富化されるか又は単離され得る。
【０１１５】
本明細書中に記載される方法を用いて、富化、単離及び／又は精製された胚体内胚葉細胞の集団又は組織が、少なくとも何らかの分化を受けた多能性細胞培養物又は細胞集団、例えば幹細胞培養物又は集団からｉｎ ｖｉｔｒｏで産生され得る。いくつかの方法では、細胞は無作為な分化を受ける。しかしながら好ましい方法では、細胞は主に胚体内胚葉に分化するよう指図される。いくつかの好ましい富化、単離及び／又は精製方法は、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉のｉｎ ｖｉｔｒｏ産生に関する。
【０１１６】
本明細書中に記載される方法を用いて、細胞集団又は細胞培養物は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２〜約１０００倍、胚体内胚葉含量が富化され得る。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約５〜約５００倍、富化され得る。他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約１０〜約２００倍、富化され得る。さらに他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２０〜約１００倍、富化され得る。さらに他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約４０〜約８０倍、富化され得る。或る特定の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、非処理細胞集団又は細胞培養物と比較して、少なくとも約２〜約２０倍、富化され得る。
【０１１７】
胚体内胚葉細胞を含む組成物
上記の方法により産生される細胞組成物としては、胚体内胚葉を含む細胞培養物、並びに胚体内胚葉に富んだ細胞集団が挙げられる。例えば、培養中の細胞の少なくとも約５０〜８０％が胚体内胚葉細胞である胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物が産生され得る。分化
プロセスの効率は、或る特定のパラメーター、例えば細胞増殖条件、成長因子濃度及び培養工程の時期（これらに限定されない）を修正することにより調整され得るため、本明細書中に記載される分化手順は、胚体内胚葉への多能性細胞の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９５％より多い転換を生じ得る。胚体内胚葉細胞の単離が用いられるプロセスでは、例えばＣＸＣＲ４受容体と結合する親和性試薬を用いることにより、実質的に純粋な胚体内胚葉細胞集団が回収され得る。
【０１１８】
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、多能性細胞、例えば幹細胞と、胚体内胚葉細胞との両方を含む細胞集団及び細胞培養物のような組成物に関する。例えば本明細書中に記載される方法を用いて、ｈＥＳＣ及び胚体内胚葉細胞の混合物を含む組成物が産生され得る。いくつかの実施形態では、約９５個の多能性細胞につき少なくとも約５個の胚体内胚葉細胞を含む組成物が産生される。他の実施形態では、約５個の多能性細胞につき少なくとも約９５個の胚体内胚葉細胞を含む組成物が産生される。さらに、胚体内胚葉細胞対多能性細胞の他の比を含む組成物が意図される。例えば約１，０００，０００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１００，０００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１０，０００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１，０００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約５００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１００個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１０個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約５個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約２個の多能性細胞につき少なくとも約１個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約２個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約５個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１０個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約２０個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約５０個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１００個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１，０００個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１０，０００個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１００，０００個の胚体内胚葉細胞、約１個の多能性細胞につき少なくとも約１，０００，０００個の胚体内胚葉細胞を含む組成物が意図される。いくつかの実施形態では、多能性細胞はヒト多能性幹細胞である。或る特定の実施形態では、幹細胞は、桑実胚、胚の内部細胞塊、又は胚の生殖腺隆起に由来する。或る特定の他の実施形態では、多能性細胞は、胚期が終わって発生した多細胞構造の生殖腺又は胚組織に由来する。
【０１１９】
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、少なくとも約５％の胚体内胚葉細胞〜少なくとも約９９％の胚体内胚葉細胞から成る細胞培養物又は細胞集団に関する。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は細胞集団は、哺乳類細胞を含む。好ましい実施形態では、細胞培養物又は細胞集団はヒト細胞を含む。例えばいくつかの特定の実施形態は、ヒト細胞の少なくとも約５％〜少なくとも約９５％が胚体内胚葉細胞であるヒト細胞から成る細胞培養物に関する。他の実施形態は、ヒト細胞の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は９０％より多くが胚体内胚葉細胞であるヒト細胞から成る細胞培養物に関する。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
【０１２０】
本明細書中に記載されるさらなる実施形態は、ヒト細胞、例えばヒト胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関するが、この場合、ＳＯＸ１７マーカー又はＣＸＣＲ４マーカーのいずれかの発現は、少なくとも約５％のヒト細胞では、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トロンボモジュリン（ＴＭ）及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現より多い。他の実施形態では、ＳＯＸ１７マーカー又はＣＸＣＲ４マーカーの発現は、少なくとも約１０％のヒト細胞では、少なくとも約１５％のヒト細胞では、少なくとも約２０％のヒト細胞では、少なくとも約２５％のヒト細胞では、少なくとも約３０％のヒト細胞では、少なくとも約３５％のヒト細胞では、少なくとも約４０％のヒト細胞では、少なくとも約４５％のヒト細胞では、少なくとも約５０％のヒト細胞では、少なくとも約５５％のヒト細胞では、少なくとも約６０％のヒト細胞では、少なくとも約６５％のヒト細胞では、少なくとも約７０％のヒト細胞では、少なくとも約７５％のヒト細胞では、少なくとも約８０％のヒト細胞では、少なくとも約８５％のヒト細胞では、少なくとも約９０％のヒト細胞では、少なくとも約９５％のヒト細胞では、又は９５％より多くのヒト細胞では、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現より多い。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団中のヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
【０１２１】
本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、ヒト胚体内胚葉細胞のようなヒト細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、少なくとも約５％〜少なくとも約９５％を上回るヒト細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きいことが理解されよう。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団におけるヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
【０１２２】
本明細書中に記載するさらに他の実施形態は、ヒト胚体内胚葉細胞のようなヒト細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現は、少なくとも約５％のヒト細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。他の実施形態では、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現は、少なくとも約１０％のヒト細胞において、少なくとも約１５％のヒト細胞において、少なくとも約２０％のヒト細胞において、少なくとも約２５％のヒト細胞において、少なくとも約３０％のヒト細胞において、少なくとも約３５％のヒト細胞において、少なくとも約４０％のヒト細胞において、少なくとも約４５％のヒト細胞において、少なくとも約５０％のヒト細胞において、少なくとも約５５％のヒト細胞において、少なくとも約６０％のヒト細胞において、少なくとも約６５％のヒト細胞において、少なくとも約７０％のヒト細胞において、少なくとも約７５％のヒト細胞において、少なくとも約８０％のヒト細胞において、少なくとも約８５％のヒト細胞において、少なくとも約９０％のヒト細胞において、少なくとも約９５％のヒト細胞において、或いは少なくとも約９５％を上回るヒト細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団におけるヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
【０１２３】
本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、ヒト胚体内胚葉細胞のようなヒト細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１マーカーの発現は、少なくとも約５％〜少なくとも約９５％を上回るヒト細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大
きいことが理解されよう。細胞培養物又は細胞集団がヒトフィーダー細胞を含む実施形態では、上記のパーセンテージは、細胞培養物又は細胞集団におけるヒトフィーダー細胞を考慮せずに算出される。
【０１２４】
本明細書中に記載するさらなる実施形態は、ヒト内胚葉細胞のような哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４マーカーのいずれかの発現は、少なくとも約５％の内胚葉細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。他の実施形態では、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４マーカーのいずれかの発現は、少なくとも約１０％の内胚葉細胞において、少なくとも約１５％の内胚葉細胞において、少なくとも約２０％の内胚葉細胞において、少なくとも約２５％の内胚葉細胞において、少なくとも約３０％の内胚葉細胞において、少なくとも約３５％の内胚葉細胞において、少なくとも約４０％の内胚葉細胞において、少なくとも約４５％の内胚葉細胞において、少なくとも約５０％の内胚葉細胞において、少なくとも約５５％の内胚葉細胞において、少なくとも約６０％の内胚葉細胞において、少なくとも約６５％の内胚葉細胞において、少なくとも約７０％の内胚葉細胞において、少なくとも約７５％の内胚葉細胞において、少なくとも約８０％の内胚葉細胞において、少なくとも約８５％の内胚葉細胞において、少なくとも約９０％の内胚葉細胞において、少なくとも約９５％の内胚葉細胞において、或いは少なくとも約９５％を上回る内胚葉細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。
【０１２５】
本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１から成る群から選択される１つ又は複数のマーカーの発現は、少なくとも約５％〜少なくとも約９５％を上回る内胚葉細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きいことが理解されよう。
【０１２６】
本明細書中に記載するさらなる他の実施形態は、ヒト内胚葉細胞のような哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現は、少なくとも約５％の内胚葉細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。他の実施形態では、ＳＯＸ１７及びＣＸＣＲ４マーカーの両方の発現は、少なくとも約１０％の内胚葉細胞において、少なくとも約１５％の内胚葉細胞において、少なくとも約２０％の内胚葉細胞において、少なくとも約２５％の内胚葉細胞において、少なくとも約３０％の内胚葉細胞において、少なくとも約３５％の内胚葉細胞において、少なくとも約４０％の内胚葉細胞において、少なくとも約４５％の内胚葉細胞において、少なくとも約５０％の内胚葉細胞において、少なくとも約５５％の内胚葉細胞において、少なくとも約６０％の内胚葉細胞において、少なくとも約６５％の内胚葉細胞において、少なくとも約７０％の内胚葉細胞において、少なくとも約７５％の内胚葉細胞において、少なくとも約８０％の内胚葉細胞において、少なくとも約８５％の内胚葉細胞において、少なくとも約９０％の内胚葉細胞において、少なくとも約９５％の内胚葉細胞において、或いは少なくとも約９５％を上回る内胚葉細胞において、ＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きい。
【０１２７】
本明細書中に記載するいくつかの実施形態は、哺乳類内胚葉細胞を含む細胞培養物又は細胞集団のような組成物に関し、ここでＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１マーカーの発現は、少なくとも約５％〜少なくとも約９５％を上回る内胚葉細胞においてＯＣＴ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、ＴＭ及び／又はＳＯＸ７マーカーの発現よりも大きいことが理解さ
れよう。
【０１２８】
本明細書中に記載される方法を用いて、他の細胞型を実質的に含有しない胚体内胚葉細胞を含む組成物が産生され得る。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法により産生される胚体内胚葉細胞集団又は細胞培養物は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ７、ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ、ＴＭ、ＺＩＣ１又はＢＲＡＣＨマーカー遺伝子を有意に発現する細胞を実質的に含有しない。
【０１２９】
一実施形態では、マーカー遺伝子の発現に基づいた胚体内胚葉細胞の説明は、ＳＯＸ１７高、ＭＩＸＬ１高、ＡＦＰ低、ＳＰＡＲＣ低、トロンボモジュリン低、ＳＯＸ７低及びＣＸＣＲ４高である。
【０１３０】
胚体内胚葉細胞の増殖
本明細書中に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏ方法のいくつかによれば、胚体内胚葉細胞は、細胞培養で維持され、増殖され、継代培養され、及び／又は増殖される。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、いかなる有意の分化も伴わずに、維持され、増殖され、継代培養され、及び／又は増殖される。言い換えれば、このような実施形態では、胚体内胚葉細胞は、細胞培養で維持され、増殖され、継代培養され、及び／又は増殖される間、胚体内胚葉表現型を維持する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される増殖方法に用いられる胚体内胚葉細胞は、腸管の細胞又はそれに由来する器官に分化し得る多分化能細胞である。このような細胞としては、膵臓、肝臓、肺、胃、小腸、甲状腺、胸腺、咽頭、胆嚢及び膀胱の細胞、並びにこのような細胞の前駆体が挙げられるが、これらに限定されない。さらにこれらの細胞は、より高等な構造、例えば組織及び／又は器官にさらに発達し得る。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞はヒト胚体内胚葉細胞である。
【０１３２】
本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態は、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得する工程を含む。細胞培養物は、胚体内胚葉細胞の純粋培養物、或いは胚体内胚葉細胞並びに他の型の細胞を含む混合細胞培養物であり得る。例えば細胞培養物は、胚体内胚葉細胞及びヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の両方を含む培養物であり得る。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞培養物は、ｈＥＳＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物を分化させることにより得られる。或る特定の実施形態では、ｈＥＳＣは、桑実胚、胚の内部細胞塊又は胚の生殖腺隆起から得られる。或る特定の他の実施形態では、多能性細胞は、胚期が終わって発生した多細胞構造の生殖腺又は胚組織に由来する。
【０１３３】
ヒト胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を産生するためのｈＥＳＣの分化方法は、本出願全体に、そして米国特許出願第１１／０２１，６１８号（表題「胚体内胚葉」、２００４年１２月２３日出願）（この開示は参照により本明細書にその全体が援用される）に記載されている。しかしながら、ｈＥＳＣから、又は他のヒト細胞型からヒト胚体内胚葉細胞を産生するための任意の既知の方法が用いられ得ることが理解されよう。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、ｈＥＳＣを分化させることにより産生される胚体内胚葉細胞の培養物は、胚体内胚葉細胞及び1つ又は複数の型の他の細胞を含む混合された胚体内胚葉培養物、富化された胚体内胚葉細胞培養物及び／又は精製された胚体内胚葉細胞培養物であり得る。ｈＥＳＣから胚体内胚葉細胞を取得するためのいくつかの方法は、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子とｈＥＳＣを接触させるか、そうでなければそれらの因子をｈＥＳＣに提供することを含む。このような成長因子としては、ノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、成長因子は、５ｎｇ／ｍｌ〜５０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度でｈＥＳＣに提供される。或る特定の実施形態では、成長因子は、少なくとも約５ｎｇ／ｍ
ｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度で培養中のｈＥＳＣに提供される。
【０１３４】
本明細書中に記載される方法の他の実施形態では、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉細胞の既存の培養物から得られる。このような実施形態では、培養物の一部分又は全部が、本明細書中に記載される胚体内胚葉増殖方法に用いられ得る。
【０１３５】
胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を得るほかに、本明細書中に記載される増殖方法のいくつかの実施形態は、細胞培養物から胚体内胚葉細胞のうちの少なくともいくつかを単離する工程も包含する。このような実施形態では、胚体内胚葉細胞のうちの少なくともいくつかは、細胞培養物中の他の細胞のうちの少なくともいくつかから分離され、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を産生する。いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞のうちの少なくともいくつかは細胞培養物から除去されるが、一方他の細胞のうちの少なくともいくつかは細胞培養物中に残存する。細胞培養物中に存在する他の細胞としては、ｈＥＳＣ、原始内胚葉、栄養外胚葉、中胚葉及び外胚葉が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
本明細書中に記載される他の実施形態では、単離する工程は、上記胚体内胚葉細胞中で発現されるマーカーと結合するが、細胞培養物中に存在する上記他の細胞中では実質的に発現されない試薬を細胞培養物中の細胞に提供することを含む。本明細書中で上記されたように、いくつかの実施形態では、マーカーは、胚体内胚葉細胞に特異的である任意の細胞表面マーカーであり得る。本出願全体に（特に以下の実施例参照）記載されるこのような一マーカーは、ＣＸＣＲ４マーカーである。本明細書中に上記されたように、試薬結合胚体内胚葉細胞は、多数の方法により試薬非結合細胞から分離され得る。例えば胚体内胚葉細胞の表面に選択的に存在するＣＸＣＲ４受容体に対する抗体は、細胞培養物中の胚体内胚葉細胞に提供され得る。抗体結合胚体内胚葉細胞は次に、例えば蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）、抗体を固体支持体に結合すること、或いは磁界で適切にタグされた抗体を単離することにより、培養物中の他の細胞から分離される。いくつかの実施形態では、抗体は、分離プロセス後に胚体内胚葉細胞から放出される。
【０１３７】
分離の代替的手段として、胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかは、培養中の胚体内胚葉細胞を特異的に蛍光標識し、次にＦＡＣＳにより非標識細胞から標識細胞を分離することにより、培養物中の他の細胞の少なくともいくつかから分離される。上記のようにそして実施例に記載されるように、このような実施形態では、ｈＥＳＣは、胚体内胚葉細胞中で高度に発現されるが、他の細胞型中では有意に発現されないマーカー遺伝子のプロモーターの制御下で、蛍光レポーター遺伝子を含むベクターでトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、蛍光レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする遺伝子である。いくつかの実施形態では、ＧＦＰ及び／又はＥＧＦＰは、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーターの制御下で発現される。トランスフェクトされたｈＥＳＣは次に、胚体内胚葉の産生を特異的に誘導する分化因子の存在下で培養で増殖される。好ましい実施形態では、分化因子はアクチビンＡである。他の好ましい実施形態では、アクチビンＡは、１００ｎｇ／ｍｌの濃度で細胞培養物に付加される。
【０１３８】
本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、単離する工程の結果として産生され
る富化された胚体内胚葉細胞集団は、胚体内胚葉細胞以外の細胞を実質的に含有しない。他の実施形態では、富化された胚体内胚葉細胞集団は、少なくとも約９６％〜少なくとも約１００％の胚体内胚葉細胞を含む。さらに他の実施形態では、富化された胚体内胚葉細胞集団は、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％並びに少なくとも約１００％の胚体内胚葉細胞を含む。
【０１３９】
本明細書中に記載される増殖方法のさらなる実施形態によれば、細胞培養工程が意図される。例えばいくつかの実施形態は、胚体内胚葉細胞に富んだ集団又は集団の一部分をプレーティングすることを含む、培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、細胞はヒトフィブロネクチンで被覆された表面でプレーティングされる。他の実施形態では、プレートは、ポリオルニチンで被覆される。さらに他の実施形態では、プレートはポリオルニチン及びヒトフィブロネクチンで被覆される。好ましい実施形態では、プレートは、ポリオルニチン及びヒトフィブロネクチンの両方で被覆されたＩＶＦプレートである。ヒトフィブロネクチンは本明細書中に記載されるプレートのための好ましいコーティングであり、他の供給源からのフィブロネクチンはプレートをコーティングするために十分であることは理解されよう。
【０１４０】
他の実施形態では、培養する工程は、約２％（ｖ／ｖ）の血清を含む増殖培地中に富んだ胚体内胚葉細胞集団又はその一部分をインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、血清濃度は、約０％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり得る。例えば本明細書中に記載されるいくつかの実施形態では、培地の血清濃度は、約０．０５％（ｖ／ｖ）、約０．１％（ｖ／ｖ）、約０．２％（ｖ／ｖ）、約０．３％（ｖ／ｖ）、約０．４％（ｖ／ｖ）、約０．５％（ｖ／ｖ）、約０．６％（ｖ／ｖ）、約０．７％（ｖ／ｖ）、約０．８％（ｖ／ｖ）、約０．９％（ｖ／ｖ）、約１％（ｖ／ｖ）、約２％（ｖ／ｖ）、約３％（ｖ／ｖ）、約４％（ｖ／ｖ）、約５％（ｖ／ｖ）、約６％（ｖ／ｖ）、約７％（ｖ／ｖ）、約８％（ｖ／ｖ）、約９％（ｖ／ｖ）、約１０％（ｖ／ｖ）、約１５％（ｖ／ｖ）又は約２０％（ｖ／ｖ）であり得る。いくつかの実施形態では、血清代替物が培地中に含まれる。
【０１４１】
本明細書中に記載される増殖方法のさらに他の実施形態では、増殖培地は、少なくとも１つの成長因子も含む。或る特定の実施形態では、少なくとも１つの成長因子は、ＴＧＦβスーパーファミリーの一成員を含む成長因子である。このような実施形態では、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子としては、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びこれらの成長因子の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。或いは、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの成長因子は、ＩＧＦ１又はＩＧＦとＴＧＦβスーパーファミリーの一成長因子の組合せであり得る。他の実施形態では、少なくとも１つの成長因子は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ又は別の成長因子であり得る。さらに他の実施形態では、少なくとも１つの成長因子は、ｂＦＧＦ、ＥＧＦ及びＴＧＦβスーパーファミリーの一成長因子の組合せであり得る。上記実施形態の各々において、1つ又は複数の成長因子は、約１ｎｇ／ｍｌ〜５０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在し得る。このような実施形態では、培地中の成長因子の濃度は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度である。或る特定の実施形態では、成長因子の組合せが培地中に存在する。このような実施形態では、各成長因子は、少なくとも約５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約７５ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、少な
くとも約２００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約２０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約３０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約４０００ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０００ｎｇ／ｍｌ又は約５０００ｎｇ／ｍｌより高い濃度で培地中に存在する。
【０１４２】
上記の増殖方法のほかに、いくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、まず、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得し、次に胚体内胚葉細胞を継代培養することによって増殖し、それにより胚体内胚葉細胞を含む複数の細胞培養物を産生する。細胞を継代培養することによる胚体内胚葉細胞のこれらの増殖方法は、このような培養物が得られる方法に関係なく、任意の胚体内胚葉培養物を用いて実施され得る。例えばこれらの方法は、上記の増殖方法において細胞を単離する工程の次に起こる、培養する工程の一部分として実施され得るし、或いはこの方法は、ｈＥＳＣから新たに分化された胚体内胚葉細胞を用いて実施され得る。
【０１４３】
本明細書中に記載される増殖方法の或る特定の態様に従って、胚体内胚葉細胞を継代培養する工程は、胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物に少なくとも１つの酵素を提供することを含む。例えば少なくとも１つの酵素は、パパイン、プロナーゼ、Ｉ型コラゲナーゼ、ＩＩ型コラゲナーゼ、ＩＩＩ型コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、トリプシン、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、DNase Ｉ及びディスパーゼから成る群から選択される１つ又は複数の酵素であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの酵素は、少なくとも１つのプロテアーゼを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つのプロテアーゼは、トリプシンを含む。例えば或る特定の実施形態では、培養容器中で増殖中の胚体内胚葉細胞は、まず細胞から培地を除去することにより、トリプシンを用いて継代培養される。次に滅菌トリプシン溶液が、室温で数分間、胚体内胚葉細胞に提供される。トリプシン溶液は次に、細胞を撹乱しないよう、静かに除去される。トリプシン溶液が除去された後、胚体内胚葉細胞は２％（ｖ／ｖ）の血清を含有するＲＰＭＩのような培地を提供され、そして次に、細胞培養容器を撹拌し、細胞接着を妨げ、細胞懸濁液を生成する。いくつかの実施形態では、細胞培地は、残留トリプシンを不活性化するためにトリプシン阻害剤を含む。
【０１４４】
トリプシンは種々の滅菌溶液中に提供され得る、例えばトリプシンはハンクス緩衝塩溶液のような平衡塩溶液中の胚体内胚葉細胞に提供され得ることが理解されよう。或いはトリプシンは、例えば低血清ＲＰＭＩ中で、血清を含有するか又は含有しない培地中の胚体内胚葉に提供され得る。
【０１４５】
本明細書中に記載される増殖方法の他の態様に従って、胚体内胚葉細胞を継代培養する工程は、上記胚体内胚葉細胞間の接触を機械的に妨げることを包含する。このような機械的阻害技法は、細胞接触及び基材を実質的に妨げるのに十分であるべきであるが、しかしながらこれらの技法は細胞生存度に影響を及ぼすほど厳しくあるべきではない。機械的細胞阻害技法、例えば研和(trituration)は、当業者に既知である。
【０１４６】
本明細書中に記載される増殖方法のさらに他の態様に従って、胚体内胚葉細胞を継代培養する工程は、細胞分散緩衝液中で上記の胚体内胚葉細胞をインキュベートすることを含む。細胞分散緩衝液は、当該技術分野で既知の任意の分散緩衝液、例えば市販の化学解離緩衝液であり得る。
【０１４７】
本明細書中に記載される増殖方法のいくつかの実施形態では、胚体内胚葉細胞は、細胞培養容器中で増殖される。細胞培養容器としては、例えば組織培養フラスコ及び細胞培養プレート、例えばマイクロタイタープレートが挙げられるが、これらに限定されない。い
くつかの実施形態では、培養中の胚体内胚葉細胞は、基材に付着される。或る特定の実施形態では、上記の胚体内胚葉細胞を継代培養する工程は、基材から上記胚体内胚葉細胞を引き剥がすことを含む。好ましい実施形態では、基材は組織培養フラスコの表面である。他の好ましい実施形態では、基材はマイクロタイタープレートの表面である。
【０１４８】
以下の実施例の多くは、多能性ヒト細胞の使用を記載する。多能性ヒト細胞の産生方法は当該技術分野で周知であり、そして多数の科学出版物、例えば米国特許第５，４５３，３５７号、第５，６７０，３７２号、第５，６９０，９２６号、第６，０９０，６２２号、第６，２００，８０６号及び第６，２５１，６７１号、並びに米国特許出願公開第２００４／０２２９３５０号（これらの開示は参照により本明細書中にその全体が援用される）に記載されている。
【実施例１】
【０１４９】
ヒトＥＳ細胞
内胚葉発生についてのわれわれの研究のために、多能性であり、そして正常核型を維持しながら培養中に外見上無限に分裂し得るヒト胚性幹細胞を用いた。単離のために免疫学的又は機械的方法を用いて、５日齢胚内部細胞塊からＥＳ細胞を得た。特にヒト胚性幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５を、患者によるインフォームドコンセント後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精周期からの過剰凍結胚から得た。解凍時に、ＥＳ培地（ＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、β−メルカプトエタノール、及びＦＧＦ２）中のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上に孵化胚盤胞をプレーティングした。胚が培養皿に接着し、そして約２週間後、非分化ｈＥＳＣの領域を、ＭＥＦとともに新たな皿に移した。機械的に切断し、ディスパーゼで手短に消化し、その後、細胞クラスターを機械的に取り出して、洗浄し、再度プレーティングすることにより移動を成し遂げた。誘導以来、ｈＥＳＣｙｔ−２５を、１００回にわたって連続継代培養した。胚体内胚葉の産生のための出発物質として、ｈＥＳＣｙｔ−２５ヒト胚性幹細胞株を用いた。
【０１５０】
幹細胞又は他の多能性細胞は本明細書中に記載される分化手順のための出発物質としても用いられ得ることが当業者には理解されよう。例えば当該技術分野で既知の方法により単離され得る胚性生殖腺隆起から得られる細胞は、多能性細胞出発物質として用いられ得る。
【実施例２】
【０１５１】
ｈＥＳＣｙｔ−２５特徴付け
ヒト胚性幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５は、培養で１８ヶ月にわたって、正常形態学、核型、増殖及び自己再生特性を維持した。この細胞株は、ＯＣＴ４、ＳＳＥＡ−４及びＴＲＡ−１−６０抗原（これらはすべて、非分化ｈＥＳＣに特有である）に対する強免疫反応性を示し、そしてアルカリホスファターゼ活性、並びに他の確立されたｈＥＳＣ株と同一の形態学を示す。さらにヒト幹細胞株ｈＥＳＣｙｔ−２５は、懸濁液中で培養される場合、胚様体（ＥＢ）も容易に形成する。その多能性性質の実証として、ｈＥＳＣｙＴ−２５は、３つの主要な胚葉を表す種々の細胞型に分化する。ＺＩＣ１に関するＱ−ＰＣＲ、並びにネスチン及びより成熟したニューロンマーカーに関する免疫細胞化学（ＩＣＣ）により、外胚葉産生を実証した。β−ＩＩＩチューブリンに関する免疫細胞化学染色を、初期ニューロンに特徴的な伸長細胞のクラスター中で観察した。予め、レチノイン酸で懸濁液中のＥＢを処理して、臓側内胚葉（ＶＥ）、胚体外系統への多能性幹細胞の分化を誘導した。処理細胞は、高レベルのα−フェトタンパク質（ＡＦＰ）及びＳＯＸ７（ＶＥの２つのマーカー）を５４時間の処理により発現した。単層中で分化された細胞は、免疫細胞化学染色により実証されるように、散在性パッチ中でＡＦＰを発現した。以下で記載するように、ｈＥＳＣｙＴ−２５細胞株は、ＡＦＰ発現の非存在下でのＳＯＸ１７に関するリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）及び免疫細胞化学により立証される
ように、胚体内胚葉も形成し得た。中胚葉への分化を実証するために、分化中のＥＢを、いくつかの時点でのブラキュリ（Brachyury）遺伝子発現に関して分析した。ブラキュリ発現は、実験経過中に漸進的に増大した。上記に鑑みて、三胚葉を表す細胞を形成する能力により示されるように、ｈＥＳＣｙＴ−２５株は多能性である。
【実施例３】
【０１５２】
ＳＯＸ１７抗体の産生
ｈＥＳＣ培養物における胚体内胚葉の同定に対する主要な妨害は、適切なツールの欠如である。したがって、本発明者等は、ヒトＳＯＸ１７タンパク質に対して産生される抗体の産生に着手した。
【０１５３】
マーカーＳＯＸ１７は、それが原腸陥入中に形成する際に胚体内胚葉全体にわたって発現され、その発現は、器官形成の開始まで腸管で維持される（しかし、発現のレベルは、Ａ−Ｐ軸に沿って様々である）。ＳＯＸ１７はまた、胚体外内胚葉細胞のサブセットでも発現される。このタンパク質の発現はまた、中胚葉又は外胚葉では観察されていない。ＳＯＸ１７は、胚体外系統を排除するためのマーカーと併用される場合、胚体内胚葉系統に適切なマーカーであることが現在発見されている。
【０１５４】
本明細書中で詳述するように、ＳＯＸ１７抗体を、ＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の産生を目的とした様々な処理及び分化手順の影響を具体的に検査するのに利用した。ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ及びトロンボモジュリンに対して反応性の他の抗体もまた、臓側及び壁側内胚葉（胚体外内胚葉）の産生を除外するのに使用された。
【０１５５】
ＳＯＸ１７に対する抗体を産生するために、ＳＯＸ１７タンパク質のカルボキシ末端におけるアミノ酸１７２〜４１４（配列番号２）に相当するヒトＳＯＸ１７ ｃＤＮＡ（配列番号１）の一部分（図２）を、抗体産生会社GENOVAC(Freiberg, Germany)にて、そこで開発された手順に従って、ラットにおける遺伝子免疫化に使用した。遺伝子免疫化に関する手順は、米国特許第５，８３０，８７６号、同第５，８１７，６３７号、同第６，１６５，９９３号及び同第６，２６１，２８１号、並びに国際特許出願公開第ＷＯ００／２９４４２号及び同第ＷＯ９９／１３９１５号に見出すことができる。それらの開示は参照により本明細書に全体が援用される。
【０１５６】
遺伝子免疫化に関する他の適切な方法はまた、非特許文献にも記載されている。例えば、Barry他は、Biotechniques 16: 616-620, 1994（その開示が参照により本明細書に全体が援用される）において遺伝子免疫化によるモノクローナル抗体の産生について記載している。特異的タンパク質に対する抗体を産生するための遺伝子免疫化方法の具体例は、例えば、Costaglia et al., (1998) Genetic immunization against the human thyrotropin receptor causes thyroiditis and allows production of monoclonal antibodies recognizing the native receptor, J. Immunol. 160: 1458-1465、Kilpatrick et al (1998) Gene gun delivered DNA-based immunizations mediate rapid production of murine monoclonal antibodies to the Flt-3 receptor, Hybridoma 17: 569-576、Schmolke et al., (1998) Identification of hepatitis G virus particles in human serum by E2-specific monoclonal antibodides generated by DNA immunization, J. Virol. 72: 4541-4545、Krasemann et al., (1999) Generation of monoclonal antibodides against proteins with an unconventional nucleic acid-based immunization strategy, J. Biotechnol. 73: 119-129、及びUlivieri et al, (1996) Generation of a monoclonal antibody to a defined portion of the Heliobacter pylori vacuolating cytotoxin by DNA immunization, J. Biotechnol. 51: 191-194に見出すことができる。それらの開示は参照により本明細書に全体が援用される。
【０１５７】
ＳＯＸ７及びＳＯＸ１８は、図３に示される関係樹状図に表されるようにＳＯＸ１７に対して最も密接なＳｏｘファミリーである。本発明者等は、遺伝子免疫化により産生されるＳＯＸ１７抗体がＳＯＸ１７に特異的であり、またその最も密接なファミリー成員と反応しないことを実証するために、陰性対照としてヒトＳＯＸ７ポリペプチドを用いた。特に、ＳＯＸ７及び他のタンパク質は、ヒト線維芽細胞において発現させ、続いてウェスタンブロット及びＩＣＣによりＳＯＸ１７抗体との交差反応性に関して分析した。例えば、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７及びＥＧＦＰ発現ベクターの産生、ヒト線維芽細胞へのそれらのトランスフェクション、並びにウェスタンブロットによる分析に関して以下の方法を利用した。ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７及びＥＧＦＰの産生に用いられる発現ベクターは、それぞれｐＣＭＶ６(OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD)、ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ６(Invitrogen, Carlsbad, CA)及びｐＥＧＦＰ−Ｎ１(Clonetech, Palo Alto, CA)であった。タンパク質産生に関して、テロメラーゼ不死化ＭＤＸヒト線維芽細胞を、リポフェクタミン２０００(Invitrogen Carlsbad, CA)の存在下で、スーパーコイルＤＮＡで一過的にトランスフェクトした。総細胞溶解産物は、トランスフェクションの３６時間後に、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)を含有する５０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＳＤＳ、０．５％デオキシコール酸中に収集した。ＮｕＰＡＧＥ（４〜１２％勾配ポリアクリルアミド、Invitrogen, Carlsbad, CA)上でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、且つＰＤＶＦ膜(Hercules, CA)上へのエレクトロブロッティングにより移動された細胞タンパク質１００μｇのウェスタンブロット分析は、１０ｍＭ ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０(Sigma, St. Louis, MO)中のラットＳＯＸ１７抗血清の１／１０００希釈で、続いてアルカリホスファターゼ結合抗ラットＩｇＧ(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)プローブして、ベクターブラックアルカリホスファターゼ染色(Vector Laboratories, Burlingame, CA)により明らかにした。使用されるタンパク質サイズ標準物質は、広範囲の色彩マーカー(Sigma, St. Louis, MO)であった。
【０１５８】
図４では、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７又はＥＧＦＰ ｃＤＮＡで一過的にトランスフェクトされたヒト線維芽細胞から作製されるタンパク質抽出物を、ＳＯＸ１７抗体によりウェスタンブロットでプローブした。ｈＳＯＸ１７トランスフェクト細胞からのタンパク質抽出物のみが、ヒトＳＯＸ１７タンパク質の予測された４６Ｋｄａ分子量に近い約５１Ｋｄａのバンドを生じた。ヒトＳＯＸ７又はＥＧＦＰトランスフェクト細胞のいずれかから作製される抽出物に対してＳＯＸ１７抗体の反応性は見られなかった。さらに、ＳＯＸ１７抗体は、ｈＳＯＸ１７発現構築物でトランスフェクトしたヒト線維芽細胞の核を明らかに標識したが、ＥＧＦＰのみでトランスフェクトした細胞は標識しなかった。したがって、ＳＯＸ１７抗体は、ＩＣＣによる特異性を示す。
【実施例４】
【０１５９】
胚体内胚葉のマーカーとしてのＳＯＸ１７抗体の確証
部分的に分化させたｈＥＳＣをＳＯＸ１７及びＡＦＰ抗体で同時標識して、ＳＯＸ１７抗体がヒトＳＯＸ１７タンパク質に特異的であり、さらに胚体内胚葉をマークすることを実証した。ＳＯＸ１７、ＳＯＸ７（これは、ＳＯＸ遺伝子ファミリーサブグループＦの密接に関連する成員である（図３））及びＡＦＰはそれぞれ、臓側内胚葉で発現されることが実証されている。しかしながら、ＡＦＰ及びＳＯＸ７は、ＩＣＣにより検出可能なレベルでは、胚体内胚葉細胞では発現されず、したがってそれらは、真正の胚体内胚葉細胞に関する陰性マーカーとして用いることができる。ＳＯＸ１７抗体は、細胞の別個の分類として存在するか、或いはＡＦＰ陽性細胞と混合される細胞の集団を標識することが示された。特に、図５Ａは、少数のＳＯＸ１７細胞がＡＦＰで同時標識されることを示すが、ＳＯＸ１７+細胞の視野においてＡＦＰ+細胞がほとんど存在しないか、或いは全く存在しない領域も見られた（図５Ｂ）。同様に、壁側内胚葉は、ＳＯＸ１７を発現することが報告
されているため、壁側マーカーＳＰＡＲＣ及び／又はトロンボモジュリン（ＴＭ）と共にＳＯＸ１７による抗体同時標識を使用して、壁側内胚葉であるＳＯＸ１７+細胞を同定することができる。図６Ａ〜図６Ｃに示されるように、トロンボモジュリン及びＳＯＸ１７で同時標識された壁側内胚葉細胞は、ｈＥＳ細胞の無作為分化により産生された。
【０１６０】
上記細胞標識実験を考慮して、胚体内胚葉細胞の同一性は、マーカープロフィールＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo／［ＴＭlo又はＳＰＡＲＣlo］により樹立され得る。換言すると、ＳＯＸ１７マーカーの発現は、臓側内胚葉に特徴的であるＡＦＰマーカー、及び壁側内胚葉に特徴的であるＴＭ又はＳＰＡＲＣマーカーの発現よりも多い。したがって、ＳＯＸ１７に関して陽性であるが、ＡＦＰに対して陰性であり、且つＴＭ又はＳＰＡＲＣに対して陰性である細胞は、胚体内胚葉である。
【０１６１】
胚体内胚葉の予測となるようなＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo／ＴＭlo／ＳＰＡＲＣloマーカープロフィールの特異性のさらなる徴候として、ＳＯＸ１７及びＡＦＰ遺伝子発現が、抗体標識細胞の相対数と定量的に比較された。図７Ａに示されるように、レチノイン酸（臓側内胚葉誘導物質）又はアクチビンＡ（胚体内胚葉誘導物質）で処理したｈＥＳＣは、ＳＯＸ１７ ｍＲＮＡ発現のレベルにおいて１０倍の差をもたらした。この結果は、ＳＯＸ１７抗体標識細胞数における１０倍の差を反映している（図７Ｂ）。さらに、図８Ａに示されるように、ｈＥＳＣのアクチビンＡ処理は、処理なしと比較して６．８倍分ＡＦＰ遺伝子発現を抑制した。これは、図８Ｂ及び図８Ｃに示されるように、これらの培養物におけるＡＦＰ標識細胞の数の劇的な減少により可視的に反映された。これをさらに定量化するために、ＡＦＰ遺伝子発現におけるこのおよそ７倍の減少は、フローサイトメトリーにより測定される場合のＡＦＰ抗体標識細胞数における同様の７倍の減少の結果であることが実証された（図９Ａ及び図９Ｂ）。この結果は、Ｑ−ＰＣＲにより観察されるような遺伝子発現の定量的変化は、抗体染色により観察されるような細胞型特定化における変化を反映することを示すという点で極めて重要である。
【０１６２】
ノーダルファミリー成員（ノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢ−ＮＡＡ）の存在下でのｈＥＳＣのインキュベーションは、経時的にＳＯＸ１７抗体標識細胞の有意な増大をもたらした。連続的なアクチビン処理の５日目までには、５０％を超える細胞がＳＯＸ１７で標識された（図１０Ａ〜図１０Ｆ）。アクチビン処理の５日後にはＡＦＰで標識された細胞はほとんど存在しなかったか、或いは全く存在しなかった。
【０１６３】
要約すると、ヒトＳＯＸ１７タンパク質のカルボキシ末端の２４２個のアミノ酸に対して産生される抗体は、ウェスタンブロットでヒトＳＯＸ１７タンパク質を同定したが、その最も密接なＳｏｘファミリー類縁体であるＳＯＸ７を認識しなかった。ＳＯＸ１７抗体は、主としてＳＯＸ１７+／ＡＦＰlo/-である分化ｈＥＳＣ培養物における細胞のサブセット（９５％を超える標識細胞）並びにＳＯＸ１７及びＡＦＰ（臓側内胚葉）に関して同時標識する少量パーセント（５％未満）の細胞を認識した。アクチビンによるｈＥＳＣ培養物の処理は、ＳＯＸ１７遺伝子発現並びにＳＯＸ１７標識細胞の顕著な増大をもたらし、ＡＦＰ ｍＲＮＡの発現及びＡＦＰ抗体で標識した細胞の数を劇的に抑制した。
【実施例５】
【０１６４】
Ｑ−ＰＣＲ遺伝子発現アッセイ
以下の実験では、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）が、ｈＥＳＣ分化に対する様々な処理の影響をスクリーニングするのに使用される主要なアッセイであった。特に、遺伝子発現のリアルタイム測定値が、Ｑ−ＰＣＲにより多数の時点で多数のマーカー遺伝子に関して分析された。細胞集団の全体的な動態のより良好な理解を得るために、所望の細胞型並びに望ましくない細胞型のマーカー遺伝子の特徴を評価した。Ｑ−ＰＣＲ分析の長所として、ゲノム配列が容易に入手可能である場合、その極度の感受性及び必要
なマーカーを開発することが比較的容易であることが挙げられる。さらに、Ｑ−ＰＣＲの極めて高い感受性により、相当大きな集団内での比較的少数の細胞からの遺伝子発現の検出が可能となる。さらに、非常に低レベルの遺伝子発現を検出する能力は、集団内の「分化の偏り」に関する指標を提供する。これらの細胞の表現型の明白な分化に先立つ特定の分化経路に向かう偏りは、免疫細胞化学的技法を使用して認知することができない。このため、Ｑ−ＰＣＲは、分化処理の成功をスクリーニングするための、免疫組織化学的技法に対して少なくとも補完的であり且つ免疫組織化学的技法よりも潜在的に相当優れている分析の方法を提供する。さらに、Ｑ−ＰＣＲは、半ハイスループットスケール(semi-high
throughput scale)の分析にて定量的方式で分化プロトコルの成功を評価するメカニズムを提供する。
【０１６５】
本実施例で採用するアプローチは、Ｒｏｔｏｒ Ｇｅｎｅ ３０００機器(Corbett Research)上でのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ化学及び２段階ＲＴ−ＰＣＲ方式を使用して相対定量を実施することであった。かかるアプローチにより、今後のさらなるマーカー遺伝子の分析用のｃＤＮＡサンプルの積上げが可能となり、このようにして、サンプル間の逆転写効率における可変性を回避した。
【０１６６】
プライマーは、これが混入ゲノムＤＮＡからの増殖を排除すると実験的に確定されているため、エクソン間境界にわたって存在するか、又は可能であれば少なくとも８００ｂｐのイントロンにまたがるように設計された。イントロンを含まないマーカー遺伝子を使用したか、又はマーカー遺伝子が偽遺伝子を保有した場合、ＲＮＡサンプルのDNase Ｉ処理を実施した。
【０１６７】
本発明者等は、細胞サンプルにおける遺伝子発現の広範囲のプロフィール描写を提供するために、日常的にＱ−ＰＣＲを使用して、標的及び非標的細胞型の多数のマーカーの遺伝子発現を測定した。ｈＥＳＣ分化の初期（具体的には、外胚葉、中胚葉、胚体内胚葉及び胚体外内胚葉）に関連し、且つ確証されたプライマー組が利用可能であるマーカーを以下の表１に提供する。これらのプライマー組のヒト特異性もまた実証されている。ｈＥＳＣが多くの場合マウスフィーダー層上で増殖するため、このことは重要な事実である。最も典型的には、三重反復サンプルが各条件に関して採取され、各定量的確定に関連した生物学的可変性を評価するために二重反復で個別に分析した。
【０１６８】
ＰＣＲ鋳型を生成するために、総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ(Qiagen)を使用して単離して、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ(Molecular Probes)を用いて定量化した。総ＲＮＡ ３５０〜５００ｎｇからの逆転写を、オリゴｄＴ及びランダムプライマーのミックスを含有するｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素キット(BioRad)を使用して実施した。続いて、反応物それぞれ２０μＬを総容量１００μＬにまで希釈して、このうち３μＬを、それぞれ４００ｎＭ順方向プライマー及び逆方向プライマー並びに２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎマスターミックス(Qiagen) ５μＬを含有するＱ−ＰＣＲ反応物１０μＬにおいて使用した。２段階サイクリングパラメータは、８５〜９４℃（具体的には各プライマー組に関するアンプリコンの融点に従って選択される）で５秒の変性、続く６０℃での４５秒のアニール／伸長を用いて使用した。各伸長段階の最後の１５秒の間に、蛍光データを収集した。３点の１０倍希釈シリーズを使用して、各実施に関する標準曲線を作成して、サイクル閾値（Ｃｔ）をこの標準曲線に基づいて定量値へ変換した。各サンプルに関する定量値は、ハウスキーピング遺伝子性能に対して標準化し、続いて平均値及び標準偏差は、三重反復サンプルに関して算出した。ＰＣＲサイクリングの終わりには、融解曲線分析を実施して、反応物の特異性を確かめた。単一の特異的産物は、そのＰＣＲアンプリコンに適したＴmでの単一ピークにより示された。さらに、逆転写酵素なしで実施される反応は、陰性対照として役立ち、増殖しない。
【０１６９】
Ｑ−ＰＣＲ方法論を確立する際の第１の工程は、実験系における適切なハウスキーピング遺伝子（ＨＧ）の検証であった。ＨＧは、ＲＮＡインプット、ＲＮＡ完全性及びＲＴ効率に関してサンプルにわたって標準化するのに使用されるため、標準化が意味のあるものであるためには、ＨＧがすべてのサンプル型において経時的に一定レベルの発現を示すことが重要であった。本発明者等は、分化ｈＥＳＣにおけるサイクロフィリンＧ、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ）、β−２−ミクログロブリン、ヒドロキシメチルビランシンターゼ(hydroxymethylbiane synthase)（ＨＭＢＳ）、ＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）及びグルクロニダーゼβ（ＧＵＳ）の発現レベルを測定した。本発明者等の結果により、β−２−ミクログロブリン発現レベルが、分化の間に増大されることが示され、したがって本発明者等は、標準化のためにこの遺伝子の使用を排除した。他の遺伝子は、経時的に、並びに複数の処理にわたって一貫した発現レベルを示した。本発明者等は日常的に、サイクロフィリンＧ及びＧＵＳの両方を使用して、すべてのサンプルに関して標準化因子を算出した。多数のＨＧの使用は、同時に標準化プロセスに対する固有の可変性を低減し、相対遺伝子発現値の信頼性を増大させる。
【０１７０】
標準化において使用するための遺伝子を取得した後、続いてＱ−ＰＣＲを利用して、種々の実験処理を施したサンプルにわたる多くのマーカー遺伝子の相対遺伝子発現レベルを確定した。用いたマーカー遺伝子は、それらが初期胚葉の代表的な特異的集団において富化を示すことから選択されており、特に胚体内胚葉及び胚体外内胚葉で差次的に発現される遺伝子の組に焦点を当てている。これらの遺伝子並びにそれらの関連富化プロフィールを表１に強調している。
【０１７１】
【表１】
【０１７２】
多くの遺伝子が、２つ以上の多い胚葉で発現されるため、同じ実験内で多くの遺伝子の発現レベルを定量的に比較することが有用である。ＳＯＸ１７は、胚体内胚葉で、またより程度は低いが、臓側及び壁側内胚葉で発現される。ＳＯＸ７及びＡＦＰは、この初期発生時点で、臓側内胚葉で発現される。ＳＰＡＲＣ及びＴＭは、壁側内胚葉で発現され、ブラキュリは、初期中胚葉で発現される。
【０１７３】
胚体内胚葉細胞は、高レベルのＳＯＸ１７ ｍＲＮＡ並びに低レベルのＡＦＰ及びＳＯＸ７（臓側内胚葉）、ＳＰＡＲＣ（壁側内胚葉）及びブラキュリ（中胚葉）を発現すると予測された。さらに、ＺＩＣ１は、初期外胚葉の誘導をさらに除外するのに本明細書で使用した。最後に、ＧＡＴＡ４及びＨＮＦ３ｂは、胚体及び胚体外内胚葉の両方で発現され、したがって、胚体内胚葉におけるＳＯＸ１７発現と相関する（表１）。表１に記載する
マーカー遺伝子が、様々なサンプル間でどのように互いに相関するかを実証し、したがって、胚体内胚葉及び胚体外内胚葉への、並びに中胚葉及び神経細胞型への分化の特異的パターンを強調する代表的な実験を図１１〜図１４に示している。
【０１７４】
上記データを考慮すると、漸増用量のアクチビンが、ＳＯＸ１７遺伝子発現の増大をもたらしたことが明らかである。さらに、このＳＯＸ１７発現は、胚体外内胚葉とは対照的に主として胚体内胚葉を表した。この結論は、ＳＯＸ１７遺伝子発現が、ＡＦＰ、ＳＯＸ７及びＳＰＡＲＣ遺伝子発現と逆相関したという観察から生じる。
【実施例６】
【０１７５】
胚体内胚葉へのヒトＥＳ細胞の定方向分化
ヒトＥＳ細胞培養物は、それらの未分化状態を能動的に維持しない条件下で培養される場合に、無作為に分化する。この不均一分化は、壁側及び臓側内胚葉の両方から構成される胚体外内胚葉細胞（ＡＦＰ、ＳＰＡＲＣ及びＳＯＸ７発現）並びにＺＩＣ１及びネスチン（外胚葉）及びブラキュリ（中胚葉）発現によりマークされるような初期外胚葉誘導体及び中胚葉誘導体の産生をもたらす。胚体内胚葉細胞出現は、ＥＳ細胞培養物における特異的抗体マーカーの欠如に関して検査又は特定されていない。それ自体で、また初期状態で、ＥＳ細胞培養物における初期胚体内胚葉産生は、十分研究されていない。胚体内胚葉細胞に関する満足のいく抗体試薬が入手不可能であったため、特性化の大部分が、外胚葉及び胚体外内胚葉に焦点を当ててきた。概して、無作為に分化されたＥＳ細胞培養物においてＳＯＸ１７hi胚体内胚葉細胞と比較して、有意により多数の胚体外細胞型及び神経外胚葉細胞型が存在する。
【０１７６】
未分化ｈＥＳＣコロニーは線維芽細胞フィーダーの床上で増殖するため、コロニーの縁にある細胞は、コロニーの内部に存在する細胞とは異なった別の形態を呈する。これらの外側の縁細胞の多くが、それらのあまり一様ではない、より大きな細胞体の形態により、またより高いレベルのＯＣＴ４の発現により識別され得る。ＥＳ細胞が分化し始めると、ＥＳ細胞は、未分化ＥＳ細胞に対して、ＯＣＴ４発現のレベルを上方又は下方へ変更させることが記載されている。未分化閾値を上回るか、又は下回るＯＣＴ４レベルの変更は、多能性状態から離れた分化の初期段階の表れであり得る。
【０１７７】
未分化コロニーがＳＯＸ１７免疫細胞化学により検査される場合、時折ＳＯＸ１７陽性細胞の小さな１０〜１５個の細胞クラスターが、外縁上の無作為な位置で、また未分化ｈＥＳＣコロニー間の接合部で検出された。上述したように、外側コロニー縁のこれらの散在ポケットは、コロニーのサイズが拡大し、且つより混雑してくるため、古典的なＥＳ細胞形態から離れて分化するための第１の細胞のいくつかであるようであった。より若くてより小さな完全未分化コロニー（１ｍｍ未満、４〜５日齢）は、コロニー内で又はコロニーの縁でＳＯＸ１７陽性細胞を示さなかったのに対して、より老齢のより大きなコロニー（直径１〜２ｍｍ、５日齢超）は、いくつかのコロニーの外縁で、或いは上述の古典的なｈＥＳＣ形態を示さない縁に対して内部の領域で、ＳＯＸ１７陽性ＡＦＰ陰性細胞の散発的な単離パッチを有していた。これが有効なＳＯＸ１７抗体の第１の発達であると考えると、かかる初期「未分化」ＥＳ細胞培養物で発生する胚体内胚葉細胞は、これまでに実証されていない。
【０１７８】
Ｑ−ＰＣＲによるＳＯＸ１７及びＳＰＡＲＣ遺伝子発現レベルの逆相関に基づくと、これらのＳＯＸ１７陽性ＡＦＰ陰性細胞の大部分が、抗体同時標識による壁側内胚葉マーカーに関して陰性であろう。これは、図１５Ａ及び図１５Ｂに示されるように、ＴＭ発現壁側内胚葉細胞に関して具体的に実証された。ノーダル因子であるアクチビンＡ及びＢへの暴露は、ＴＭ発現の強度及びＴＭ陽性細胞の数の劇的な減少をもたらした。アクチビン処理培養物に関するＳＯＸ１７、ＡＦＰ及びＴＭ抗体を使用した三重標識により、ＡＦＰ及
びＴＭに関しても陰性であるＳＯＸ１７陽性細胞のクラスターが観察された（図１６Ａ〜図１６Ｄ）。これらは、分化ｈＥＳＣ培養物におけるＳＯＸ１７陽性胚体内胚葉細胞の第１の細胞標示である（図１６Ａ〜図１６Ｄ及び図１７）。
【０１７９】
上述のＳＯＸ１７抗体及びＱ−ＰＣＲツールを用いて、本発明者等は、ＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo／ＳＰＡＲＣ／ＴＭlo胚体内胚葉細胞となるようにｈＥＳＣを効率的にプログラミングすることが可能な多数の手順を探究してきた。本発明者等は、ＳＯＸ１７遺伝子発現に関してＱ−ＰＣＲにより集団レベルで、及びＳＯＸ１７タンパク質の抗体標識により個々の細胞のレベルで測定される場合、これらの細胞の数及び増殖能力を増大させることを目的とした様々な分化プロトコルを適用した。
【０１８０】
本発明者等はまず、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物において胚性幹細胞から胚体内胚葉細胞を創出するのに使用するためのノーダル／アクチビン／ＢＭＰのようなＴＧＦβファミリー成長因子の影響を分析及び記載した。通常の実験では、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＢＭＰ又はこれらの成長因子の組合せを未分化ヒト幹細胞系ｈＥＳＣｙｔ−２５の培養物へ添加して、分化プロセスを開始させた。
【０１８１】
図１９に示されるように、１００ｎｇ／ｍｌでのアクチビンＡの添加は、分化の４日目までに、未分化ｈＥＳＣに対して、ＳＯＸ１７遺伝子発現の１９倍の誘導をもたらした。アクチビンＡと共に、アクチビンファミリーの第２の成員であるアクチビンＢを添加することにより、併用アクチビン処理の４日目までに、未分化ｈＥＳＣを上回る３７倍の誘導がもたらされた。最後に、アクチビンＡ及びアクチビンＢと共に、ノーダル／アクチビン由来のＴＧＦβファミリーの第３の成員、並びにＢＭＰサブグループであるＢＭＰ４を添加することにより、未分化ｈＥＳＣの誘導の５７倍に誘導を増大させた（図１９）。アクチビン及びＢＭＰによるＳＯＸ１７誘導を、因子なしの培地対照と比較した場合、５倍、１０倍及び１５倍の誘導が４日目の時点で生じた。アクチビンＡ、Ｂ及びＢＭＰによる三重処理の５日目までに、ＳＯＸ１７は、ｈＥＳＣの７０倍より高く誘導された。これらのデータは、ノーダル／アクチビン ＴＧＦβファミリー成員のより高い用量及びより長い処理時間がＳＯＸ１７の増大された発現をもたらすことを示している。
【０１８２】
ノーダル並びに関連分子アクチビンＡ、Ｂ及びＢＭＰは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＯＸ１７の発現及び胚体内胚葉形成を促進する。さらに、ＢＭＰの添加は、おそらくノーダル補助受容体であるＣｒｉｐｔｏのさらなる誘導により、改善されたＳＯＸ１７の誘導をもたらす。
【０１８３】
本発明者等は、ＢＭＰ４と一緒のアクチビンＡ及びＢの組合せが、ＳＯＸ１７誘導、したがって胚体内胚葉形成の相加的増大をもたらすことを実証している。アクチビンＡ及びＢと組み合わせた長期間（４日を超える）のＢＭＰ４添加は、壁側及び臓側内胚葉並びに胚体内胚葉においてＳＯＸ１７を誘導し得る。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、添加の４日以内に処理からＢＭＰ４を除去することは有益である。
【０１８４】
個々の細胞レベルでのＴＧＦβ因子処理の影響を確定するために、経時的なＴＧＦβ因子添加を、ＳＯＸ１７抗体標識を使用して検査した。すでに図１０Ａ〜図１０Ｆで示したように、経時的にＳＯＸ１７標識細胞の相対数の劇的な増大が見られた。相対定量化（図２０）は、ＳＯＸ１７標識細胞の２０倍を超える増大を示す。この結果は、細胞の数並びにＳＯＸ１７遺伝子発現レベルの両方が、ＴＧＦβ因子暴露の時間とともに増大していることを示す。図２１に示されるように、ノーダル、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びＢＭＰ４への暴露の４日後に、ＳＯＸ１７誘導のレベルは、未分化ｈＥＳＣに対して１６８倍に到達した。図２２は、ＳＯＸ１７陽性細胞の相対数もまた、用量応答性であったことを示す。１００ｎｇ／ｍｌ又はそれ以上のアクチビンＡ用量は、ＳＯＸ１７遺伝子発現及び
細胞数を強力に誘導することが可能であった。
【０１８５】
ＴＧＦβファミリー成員のほかに、Ｗｎｔファミリーの分子が、胚体内胚葉の特定化及び／又は維持において役割を果たし得る。Ｗｎｔ分子の使用もまた、アクチビン単独を上回るアクチビン＋Ｗｎｔ３ａで処理したサンプルにおける増大したＳＯＸ１７遺伝子発現により示されるように、胚体内胚葉へのｈＥＳＣの分化に有益であった（図２３）。
【０１８６】
上述の実験はすべて、添加因子を伴って１０％血清を含有する組織培養培地を使用して実施した。驚くべきことに、図２４Ａ〜図２４Ｃに示されるように、血清の濃度が、添加アクチビンの存在下でＳＯＸ１７発現のレベルに対して影響することを本発明者等は発見した。血清レベルが１０％から２％へ低減すると、ＳＯＸ１７発現は、アクチビンＡ及びＢの存在下で３倍になった。
【０１８７】
最後に、本発明者等は、アクチビン誘導ＳＯＸ１７+細胞が、図２５Ａ〜図２５Ｄに表されるように培養中に分裂することを実証した。矢印は、ＰＣＮＡ／ＤＡＰＩ標識有糸分裂プレートパターン及び位相コントラスト有糸分裂プロフィールにより明らかなように有糸分裂中であるＳＯＸ１７／ＰＣＮＡ／ＤＡＰＩで標識された細胞を示す。
【実施例７】
【０１８８】
ケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）発現は、胚体内胚葉に関するマーカーと相関し、中胚葉、外胚葉又は臓側内胚葉に関するマーカーとは相関しない
上述したように、ｈＥＳＣは、ＴＧＦβファミリー、より具体的にはアクチビン／ノーダルサブファミリーのサイトカインの適用により、胚体内胚葉の胚葉へ分化するように誘導することができる。さらに、本発明者等は、分化培養培地におけるウシ胎児血清（ＦＢＳ）の比率が、ｈＥＳＣからの胚体内胚葉分化の効率に影響を及ぼすことを示している。この影響は、培地においてアクチビンＡの所定濃度で、より高いレベルのＦＢＳが胚体内胚葉への最大限の分化を阻害するようなものである。外因性アクチビンＡの非存在下では、胚体内胚葉系統へのｈＥＳＣの分化は、非常に非効率であり、ＦＢＳ濃度は、ｈＥＳＣの分化プロセスに対して相当穏やかに影響する。
【０１８９】
これらの実験では、０．５％、２．０％又は１０％ＦＢＳを補充し、且つ１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを伴うか、又は伴わないＲＰＭＩ培地（Invitrogen, Carlsbad, CA；ｃａｔ＃６１８７０−０３６）中で６日間増殖させることにより、ｈＥＳＣを分化させた。さらに、分化の最初の３日間にわたる０．５％〜２．０％に及ぶＦＢＳのグラジエントもまた、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡと併用した。６日後に、反復サンプルを各培養条件から収集して、リアルタイム定量的ＰＣＲにより相対遺伝子発現に関して分析した。残存細胞は、ＳＯＸ１７タンパク質の免疫蛍光検出用に固定した。
【０１９０】
ＣＸＣＲ４の発現レベルは、使用した７つの培養条件にわたって劇的に変化した（図２６）。概して、ＣＸＣＲ４発現は、アクチビンＡ処理培養物（Ａ１００）では高く、外因性アクチビンＡを施さない培養物（ＮＦ）では低かった。さらに、Ａ１００処理培養物の中でも、ＣＸＣＲ４発現は、ＦＢＳ濃度が最も低かった場合に最も高かった。相対発現が、アクチビンＡを施さない条件（ＮＦ）により一致するように、１０％ＦＢＳ条件におけるＣＸＣＲ４レベルの顕著な低減が見られた。
【０１９１】
上述したように、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＨＮＦ３β遺伝子の発現は、胚体内胚葉としての細胞の特徴づけと一致する。７つの分化条件にわたるこれらの４つの遺伝子の相対発現は、ＣＸＣＲ４の相対発現を反映する（図２７Ａ〜図２７Ｄ）。このことは、ＣＸＣＲ４もまた胚体内胚葉のマーカーであることを実証する。
【０１９２】
外胚葉及び中胚葉系統は、各種マーカーのそれらの発現により胚体内胚葉と識別することができる。初期中胚葉は、遺伝子ブラキュリ及びＭＯＸ１を発現する一方で、新生神経外胚葉は、ＳＯＸ１及びＺＩＣ１を発現する。図２８Ａ〜図２８Ｄは、外因性アクチビンＡを施さない培養物が、中胚葉及び外胚葉遺伝子発現に関して優先的に富化されたこと、及びアクチビンＡ処理培養物の中でも、１０％ＦＢＳ条件がまた、中胚葉及び外胚葉マーカー発現の増大レベルを有したことを実証している。これらのパターンの発現はＣＸＣＲ４のパターンの逆であって、ＣＸＣＲ４が、この発生期間にｈＥＳＣに由来する中胚葉又は外胚葉中ではそれほど高度に発現されないことを示した。
【０１９３】
哺乳類発生中の初期に、胚体外系統への分化もまた起こる。ここでは、ＳＯＸ１７を包含する胚体内胚葉と共通して多くの遺伝子の発現を共有する臓側内胚葉の分化が特に関連している。胚体内胚葉を胚体外臓側内胚葉と識別するためには、これらの２つの間を識別できるマーカーを検査するべきである。ＳＯＸ７は、臓側内胚葉では発現されるが、胚体内胚葉系統では発現されないマーカーを表す。したがって、ＳＯＸ７発現の非存在下での強健なＳＯＸ１７遺伝子発現を示す培養条件は、胚体内胚葉を含有し、臓側内胚葉を含有しない可能性が高い。ＳＯＸ７が、アクチビンＡを施さない培養において高度に発現され、ＳＯＸ７はまた、ＦＢＳが１０％で包含される場合に、アクチビンＡの存在下でさえ増大された発現を示したことが図２８Ｅに示されている。このパターンは、ＣＸＣＲ４発現パターンの逆であり、ＣＸＣＲ４が、臓側内胚葉ではあまり高度に発現されないことを示唆する。
【０１９４】
上述の分化条件それぞれに存在するＳＯＸ１７免疫反応性（ＳＯＸ１７+）細胞の相対数もまた確定した。ｈＥＳＣは、高用量アクチビンＡ及び低ＦＢＳ濃度（０．５％〜２．０％）の存在下で分化させた場合、ＳＯＸ１７+細胞は、培養物全体にわたって遍在的に分布した。高用量アクチビンＡを使用したが、ＦＢＳは１０％（ｖ／ｖ）で包含された場合、ＳＯＸ１７+細胞は、相当低い頻度で出現し、培養物全体にわたって均一に分布されるのではなく、常に単離クラスターで出現した（図２９Ａ及び図２９Ｃ、並びに図２９Ｂ及び図２９Ｅ）。外因性アクチビンＡが使用されなかった場合に、ＳＯＸ１７+細胞のさらなる減少が観察された。これらの条件下では、ＳＯＸ１７+細胞はまたクラスターで出現し、これらのクラスターは、高アクチビンＡ低ＦＢＳ処理で見出されるものよりも小さく、且つ相当稀であった（図２９Ｃ及び図２９Ｆ）。これらの結果は、ＣＸＣＲ４発現パターンが、各条件下で胚体内胚葉遺伝子発現に対応するだけでなく、胚体内胚葉細胞の数にも対応することを実証している。
【実施例８】
【０１９５】
胚体内胚葉に関して富化する分化条件は、ＣＸＣＲ４陽性細胞の比率を増大させる
アクチビンＡの用量はまた、胚体内胚葉がｈＥＳＣから得られ得る効率に影響を及ぼす。この実施例は、アクチビンＡの用量を増大させることにより培養物におけるＣＸＣＲ４+細胞の比率が増大することを実証する。
【０１９６】
ｈＥＳＣは、０．５％〜２％ＦＢＳ（分化の最初の３日にわたって０．５％から１．０％、そして２．０％へ増大される）及び０、１０又は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを補充したＲＰＭＩ培地中で分化させた。分化の７日後に、２％ＦＢＳ及び２ｍＭ（ＥＤＴＡ）を含有するＣａ2+／Ｍｇ2+を伴わないＰＢＳ中で、室温で５分間、細胞を解離させた。細胞は、３５μｍナイロンフィルタに通して濾過して、計数して、ペレット化した。ペレットは、小容量の５０％ヒト血清／５０％正常ロバ血清中に再懸濁させて、氷上で２分間インキュベートして、非特異的抗体結合部位をブロックした。これに、５０μｌ（およそ１０5個の細胞を含有する）当たりマウス抗ＣＸＣＲ４抗体（Abcam、ｃａｔ＃ ａｂ１０４０３−１００）１μｌを添加して、標識を氷上で４５分間進めた。細胞は、２％ヒト血清を含有するＰＢＳ（緩衝液）５ｍｌを添加することにより洗浄して、ペレット化した
。緩衝液５ｍｌによる第２の洗浄を完了させた後、細胞は、１０5個の細胞当たり緩衝液５０μｌ中に再懸濁させた。二次抗体（ＦＩＴＣ結合ロバ抗マウス、Jackson ImmunoResearch、ｃａｔ＃ ７１５−０９６−１５１）を最終濃度５μｇ／ｍｌで添加して、３０分間標識させた後、上述のように緩衝液中で２回洗浄を行った。細胞は、緩衝液中に５×１０6個の細胞／ｍｌで再懸濁させて、フローサイトメトリーの中心的な施設(The Scripps Research Institute)にてスタッフによりＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ(Beckton Dickenson)を使用して分析及び選別した。細胞は、これに続くリアルタイム定量的ＰＣＲによる遺伝子発現分析用の総ＲＮＡの単離のために、ＲＬＴ溶解緩衝液(Qiagen)へ直接収集した。
【０１９７】
フローサイトメトリーにより確定される場合のＣＸＣＲ４+細胞の数は、アクチビンＡの用量が分化培養培地中で増大されると、劇的に増大することが観察された（図３０Ａ〜図３０Ｃ）。ＣＸＣＲ４+細胞は、Ｒ４ゲート内に納まり、このゲートは、事象の０．２％がＲ４ゲートに位置される二次抗体のみの対照を使用して設定された。劇的に増大するＣＸＣＲ４+細胞数は、アクチビンＡ用量が増大される場合に、胚体内胚葉遺伝子発現における強健な増大と相関する（図３１Ａ〜図３１Ｄ）。
【実施例９】
【０１９８】
ＣＸＣＲ４陽性細胞の単離は、胚体内胚葉遺伝子発現に関して富化し、また中胚葉、外胚葉及び臓側内胚葉のマーカーを発現する細胞を枯渇させる
上記実施例８で同定されるＣＸＣＲ４+及びＣＸＣＲ４-細胞を収集して、相対遺伝子発現に関して分析し、母集団の遺伝子発現を同時に確定した。
【０１９９】
ＣＸＣＲ４遺伝子発現の相対レベルは、アクチビンＡの用量の増大に伴って劇的に増大した（図３２）。これは、ＣＸＣＲ４+細胞のアクチビンＡ用量依存的増大と極めて強く相関した（図３０Ａ〜図３０Ｃ）。また、各集団からのＣＸＣＲ４+細胞の単離は、この集団におけるほぼすべてのＣＸＣＲ４遺伝子発現を占めたことも明らかである。これは、これらの細胞を収集するためのＦＡＣＳ方法の効率を実証している。
【０２００】
遺伝子発現分析により、ＣＸＣＲ４+細胞は、ＣＸＣＲ４遺伝子発現の大部分を含有するだけでなく、ＣＸＣＲ４+細胞はまた、胚体内胚葉の他のマーカーに関する遺伝子発現も含有することが明らかとなった。図３１Ａ〜図３１Ｄに示されるように、ＣＸＣＲ４+細胞はさらに、ＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＨＮＦ３Ｂ及びＭＩＸＬ１に関して母Ａ１００集団を上回って富化した。さらに、ＣＸＣＲ４-画分は、これらの胚体内胚葉マーカーに関して非常に少ない遺伝子発現を含有した。さらに、ＣＸＣＲ４+及びＣＸＣＲ４-集団は、中胚葉、外胚葉及び胚体外内胚葉のマーカーに関して逆パターンの遺伝子発現を示した。図３３Ａ〜図３３Ｄは、ＣＸＣＲ４+細胞が、Ａ１００母集団に対してブラキュリ、ＭＯＸ１、ＺＩＣ１及びＳＯＸ７の遺伝子発現に関して枯渇したことを示す。このＡ１００母集団は、低用量条件又はアクチビンＡなしの条件に対して、これらのマーカーの発現がすでに低かった。これらの結果は、高アクチビンＡの存在下で分化されるｈＥＳＣからのＣＸＣＲ４+細胞の単離は、胚体内胚葉に関して高度に富化され、且つ実質的に純粋な胚体内胚葉である集団を生じることを示す。
【実施例１０】
【０２０１】
ＣＸＣＲ４を使用した細胞集団における胚体内胚葉細胞の定量
本明細書中ですでに確定されるような、及び２００３年１２月２３日に出願された「胚体内胚葉」と題する米国仮特許出願第６０／５３２，００４号（その開示が参照により全体が本明細書に援用される）で確定されるような細胞培養物又は細胞集団中に存在する胚体内胚葉細胞の比率の定量を確認するために、ＣＸＣＲ４及び胚体内胚葉の他のマーカーを発現する細胞をＦＡＣＳにより分析した。
【０２０２】
上記実施例に記載されるような方法を使用して、ｈＥＳＣを分化させて、胚体内胚葉を産生した。特に、分化細胞培養物における収率及び純度を増大させるために、培地の血清濃度を以下の通りに制御した：１日目には０．２％ＦＢＳ、２日目には１．０％ＦＢＳ及び３〜６日目には２．０％ＦＢＳ。分化培養物は、３つの細胞表面エピトープであるＥ−カドヘリン、ＣＸＣＲ４及びトロンボモジュリンを使用して、ＦＡＣＳにより選別した。続いて、選別した細胞集団をＱ−ＰＣＲにより分析して、胚体及び胚体外内胚葉並びに他の細胞型に関するマーカーの相対発現レベルを確定した。最適に分化させた培養物から採取されるＣＸＣＲ４選別した細胞は、９８％を超える純度の胚体内胚葉細胞の単離をもたらした。
【０２０３】
表２は、本明細書中に記載する方法を使用してｈＥＳＣから分化させた胚体内胚葉培養物に関するマーカー分析の結果を示す。
【０２０４】
【表２】
【０２０５】
特に、表２は、ＣＸＣＲ４及びＳＯＸ１７陽性細胞（内胚葉）が細胞培養物における細胞の７０〜８０％を構成していたことを示す。これらのＳＯＸ１７発現細胞のうち、２％未満がＴＭ（壁側内胚葉）を発現し、１％未満がＡＦＰ（臓側内胚葉）を発現した。ＴＭ陽性細胞及びＡＦＰ陽性細胞の比率（組み合わせた壁側内胚葉及び臓側内胚葉、総計３％）をＳＯＸ１７／ＣＸＣＲ４陽性細胞の比率から差し引きした後、細胞培養物の約６７％〜約７７％が胚体内胚葉であったことが観察され得る。およそ１０％の細胞が、ｈＥＳＣに関するマーカーであるＥ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）に関して陽性であり、細胞の約１０〜２０％が他の細胞型であった。
【０２０６】
ＦＡＣＳ分離前に得られる分化細胞培養物における胚体内胚葉の純度は、５〜６日の分化手順全体にわたって０．５％以下でＦＢＳ濃度を維持することにより、上述の低血清手順と比較して改善させることができることを本発明者等は発見している。しかしながら、５〜６日の分化手順全体にわたって０．５％以下で細胞培養物を維持することはまた、産生される総胚体内胚葉細胞数の低減をもたらす。
【０２０７】
本明細書中に記載する方法により産生される胚体内胚葉細胞は、それほどの分化を伴わずに５０日よりも長い間、アクチビンの存在下で培養において維持及び増殖されている。かかる場合では、ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３β発現は、培養期間にわたって維持される。さらに、ＴＭ、ＳＰＡＲＣ、ＯＣＴ４、ＡＦＰ、ＳＯＸ７、ＺＩＣ１及びＢＲＡＣＨは、これらの培養物では検出されなかった。かかる細胞は、それほどの分化を伴わずに５０日よりも実質的に長い間、培養において維持及び増殖させることができる可能性が高い。
【実施例１１】
【０２０８】
胚体内胚葉細胞のさらなるマーカー
以下の実験では、精製胚体内胚葉及びヒト胚性幹細胞集団からＲＮＡを単離した。続いて、遺伝子発現は、各精製集団由来のＲＮＡの遺伝子チップ分析により分析した。Ｑ−ＰＣＲも実施して、胚体内胚葉に関するマーカーとして、胚体内胚葉では発現されるが、胚性幹細胞では発現されない遺伝子の可能性をさらに研究した。
【０２０９】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、２０％ノックアウト血清代替物、４ｎｇ／ｍｌの組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で維持された。ｈＥＳＣは、１００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトアクチビンＡ、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地中で５日間培養することにより胚体内胚葉へ分化させた。ＦＢＳの濃度は、毎日以下の通りに変化させた：０．１％（１日目）、０．２％（２日目）、２％（３〜５日目）。
【０２１０】
遺伝子発現分析のためにｈＥＳＣ及び胚体内胚葉の精製集団を得るために、細胞を蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により単離した。免疫精製は、ｈＥＳＣに関してはＳＳＥＡ４抗原（R&D Systems、ｃａｔ＃ＦＡＢ１４３５Ｐ）を使用して、また胚体内胚葉に関してはＣＸＣＲ４（R&D Systems、ｃａｔ＃ＦＡＢ１７０Ｐ）を使用して達成した。細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡ（Invitrogen、ｃａｔ＃２５３００−０５４）を使用して解離させて、２％ヒト血清を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄して、氷上で１０分間１００％ヒト血清中に再懸濁させて、非特異的結合をブロックした。染色は、ヒト血清８００μｌ中で５×１０6個の細胞にフィコエリトリン結合抗体２００μｌを添加することにより氷上で３０分間実施した。細胞をＰＢＳ緩衝液８ｍｌで２度洗浄して、同１ｍｌ中に再懸濁させた。ＦＡＣＳ単離は、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ(BD Biosciences)を使用して、The Scripps Research Instituteの中心的な施設により実施された。細胞は、ＲＬＴ溶解緩衝液へ直接収集して、ＲＮＡは、製造業者の指示書に従ってＲＮｅａｓｙ(Qiagen)により単離した。
【０２１１】
精製ＲＮＡは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォーム及びＵ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０高密度オリゴヌクレオチドアレイを使用して、発現プロフィールデータの作成のためにExpression Analysis(Durham, NC)へ二連で提出した。提示されたデータは、２つの集団、すなわちｈＥＳＣと胚体内胚葉の間で差次的に発現する遺伝子を同定する群の比較である。ｈＥＳＣに見出される発現レベルを上回る発現レベルの頑強な上方変化を示す遺伝子は、胚体内胚葉に高度に特徴的な新たな候補マーカーとして選択された。選択遺伝子は、上述のようにＱ−ＰＣＲによりアッセイして、遺伝子チップ上に見られる遺伝子発現変化を確証し、またｈＥＳＣ分化の経時変化中のこれらの遺伝子の発現パターンを研究した。
【０２１２】
図３４Ａ〜図３４Ｍは、或る特定のマーカーに関する遺伝子発現の結果を示す。結果は、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの添加の１日後、３日後及び５日後に分析した細胞培養物、５日目の分化手順の終わりに精製されたＣＸＣＲ４発現性胚体内胚葉細胞（ＣＸＤＥ）に関して、及び精製ｈＥＳＣにおいて表示される。図３４Ｃ及び図３４Ｇ〜図３４Ｍの比較により、６つのマーカー遺伝子、すなわちＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１が、互いにほぼ一致し、且つまたＣＸＣＲ４の発現のパターン及びＳＯＸ１７／ＳＯＸ７の比と同一である発現パターンを示す。上述したように、ＳＯＸ１７は、胚体内胚葉並びにＳＯＸ７発現胚体外内胚葉の両方において発現される。ＳＯＸ７は胚体内胚葉で発現されないため、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７の比は、全体として集団において証明されるＳＯＸ１７発現への胚体内胚葉の寄与の信頼性の高い推定を提供する。パネルＣに対するパネルＧ〜Ｌ及びＭの類似性は、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１が、胚体内胚葉のマーカーである可能性
が高いこと、及びそれらが胚体外内胚葉細胞で有意に発現されないことを示す。
【０２１３】
本明細書中に記載されるＱ−ＰＣＲの結果は、ＩＣＣによりさらに確認することができることが理解されよう。
【実施例１２】
【０２１４】
ＳＯＸ１７プロモーター−ＥＧＦＰトランスジェニックｈＥＳＣ系統及びＣＸＣＲ４プロモーター−ＥＧＦＰトランスジェニックｈＥＳＣ系統の産生
ＣＸＣＲ４特異的抗体を用いる胚体内胚葉の精製の代替方法として、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーターとのＥＧＦＰ融合が用いられ得る。特に本実施例は、ＳＯＸ１７調節領域の制御下でのレポーター遺伝子を含むレポーターカセットを含むベクターの構築を記載する。さらに、ＣＸＣＲ４調節領域の制御下でのレポーター遺伝子を含むレポーターカセットを含むベクターの構築が記載される。本実施例は、これらのベクターのうちの１つ又は複数でトランスフェクトされた細胞、例えばヒト胚性幹細胞、並びにそのゲノムに結合されるこれらのレポーターカセットのこの一方又は両方を有する細胞の調製も記載する。
【０２１５】
レポーター遺伝子で遺伝的に標識されたＳＯＸ１７発現胚体内胚葉細胞系統及びＣＸＲＣ４発現胚体内胚葉細胞系統を、それぞれＳＯＸ１７遺伝子又はＣＸＣＲ４遺伝子の調節領域（プロモーター）の制御下にＧＦＰレポーター遺伝子を置くことにより構築する。まず、ＥＧＦＰ発現がヒトＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４遺伝子プロモーターにより駆動されるプラスミド構築物を、ベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Clonetech）のＣＭＶプロモーターをヒトＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４制御領域と取り替えることにより作製する。これらの制御領域はＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４遺伝子の特性化調節エレメントを含有し、そしてそれらはトランスジェニックマウスにおけるこれらの遺伝子の正常発現パターンを付与するのに十分である。その結果生じるベクターでは、ＥＦＧＰの発現はＳＯＸ１７プロモーター又はＣＸＣＲ４プロモーターにより駆動される。いくつかの実験において、このベクターをｈＥＳＣ中にトランスフェクトし得る。
【０２１６】
ＳＯＸ１７プロモーター／ＥＧＦＰカセット又はＣＸＣＲ４プロモーター／ＥＧＦＰカセットを上記のベクターから切り出し、次に、ホスホグリセレートキナーゼ−１プロモーターの制御下でネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有する選択ベクター中にサブクローニングする。カセットの除去を可能にするために、選択カセットは、ｆｌｐリコンビナーゼ認識部位に隣接する。この選択ベクターを直線化し、次に標準リポフェクション方法を用いてｈＥＳＣ中に導入する。Ｇ４１８における選択の１０〜１４日後、非分化トランスジェニックｈＥＳＣクローンを単離し、増殖させる。
【０２１７】
レポーターがＦＡＣＳによる細胞分離を可能にするという条件で、ＧＦＰ又はＥＧＦＰ以外のレポーター遺伝子が上記の構築物のいずれかで用いられ得ることが理解されよう。
【実施例１３】
【０２１８】
胚体内胚葉の代替的単離
以下の実施例は、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーター／ＥＧＦＰカセットを含むｈＥＳＣが胚体内胚葉細胞に分化し、次に蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）によりその後単離される、ということを実証する。
【０２１９】
ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４プロモーター／ＥＧＦＰトランスジェニックｈＥＳＣを、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを含有し、血清を含有しない増殖培地中で約６、１２及び１８時間分化させる。次に分化細胞をトリプシン消化により収穫し、Becton DickinsonＦＡＣＳ Ｄｉｖａで直接ＲＮＡ溶解緩衝液又はＰＢＳ中に分類する。単一生細胞の試料を
ＥＧＦＰに関するゲーティングなしに採取し、そして単一生細胞をＥＧＦＰ陽性及びＧＦＰ陰性集団にゲーティングする。別個の実験で、蛍光強度（高低）によってＥＧＦＰ陽性画分を２つの等サイズ集団に分離する。
【０２２０】
分類後、Ｑ−ＰＣＲ及び免疫細胞化学により、細胞集団を分析する。Ｑ−ＰＣＲ分析のために、QiagenＲＮｅａｓｙカラムを用いてＲＮＡを調製し、次にｃＤＮＡに転換する。前記のようにＱ−ＰＣＲを実行する。免疫細胞化学分析のために、細胞をＰＢＳ中に分類し、４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、Ｃｙｔｏｓｐｉｎ遠心分離を用いてガラススライドに接着させる。一次抗体はＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４である。ＦＩＴＣ（緑色）又はローダミン（赤色）に結合される適切な二次抗体を用いて、第１の抗体の結合を検出する。
【０２２１】
分類細胞をさらにＱ−ＰＣＲ分析に付す。分化細胞は、ＥＧＦＰ蛍光と内因性ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４発現遺伝子発現との相関を示す。非蛍光細胞と比較して、ＥＧＦＰ陽性細胞は、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４発現レベルの２倍より大きい増大を示す。高及び低ＥＧＦＰ強度細胞の分離は、ＥＧＦＰ発現レベルがＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４発現レベルと相関する、ということを示す。ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡ分析のほかに、分類細胞をＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４ポリペプチドの免疫細胞化学分析に付す（ＣＸＣＲ４／ＥＧＦＰ融合体を用いる実施形態では、ＳＯＸ１７ポリペプチド発現を分析し、そしてＳＯＸ１７／ＥＧＦＰ融合体を用いる場合には、ＣＸＣＲ４ポリペプチド発現を分析する）。ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４ポリペプチドの実質的発現は、富化ＥＧＦＰ陽性画分で観察され得る。それに対して、ＥＧＦＰ陰性画分中では、ＳＯＸ１７又はＣＸＣＲ４ポリペプチドの発現はほとんど観察されない。
【０２２２】
これらの結果を考えると、分類前に分化細胞培養物中に存在する細胞の少なくとも約５％は、ＳＯＸ１７／ＣＸＣＲ４陽性胚体内胚葉細胞である。分類細胞集団中の細胞の少なくとも約９０％は、ＳＯＸ１７／ＣＸＣＲ４陽性胚体内胚葉細胞である。
【実施例１４】
【０２２３】
培養での胚体内胚葉細胞の継代培養
本実施例は、本明細書中に記載される胚体内胚葉細胞が細胞培養で維持されて、さらなる分化を伴わずに継代培養され得る、ということを実証する。
【０２２４】
低血清ＲＭＰＩ中の１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの存在下で、ＣｙＴ２５ ｈＥＳＣ系統の２つの関連継代培養（ＥＢ及びＥＶと呼ばれる）から、胚体内胚葉細胞を分化させた。低血清ＲＰＭＩは、０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を１日目に、０．２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを２日目に、そして２％血清をそれ以後の各日目に含有した。４日間の分化後、分化の誘導から測定して合計で３６日間、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの存在下又は非存在下で培養で細胞を維持した。３６日間の培養期間中、胚体内胚葉細胞を２回、継代培養した。さらに２９〜３６日目に、ＥＶと呼ばれる群の細胞をさらに５０ｍｇ／ｍｌのＥＧＦと接触させた。培養の４、９、２３、２９及び３６日目に、Ｑ−ＰＣＲを用いて、胚体内胚葉を示すマーカー遺伝子の発現を測定した。
【０２２５】
図３５Ａ〜図３５Ｄは、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを提供された細胞培養物中で、ｈＥＳＣからの胚体内胚葉細胞の誘導（４〜３６日目）後、３２日間の培養期間中、胚体内胚葉マーカーＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＣＸＣＲ４の発現が維持された、ということを示す。アクチビンＡの非存在下で増殖した細胞培養物中では、これらのマーカーの発現はほとんど観察されなかった。５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの付加は、胚体内胚葉マーカーのいずれの発現も有意に増大するように見えなかった。
【実施例１５】
【０２２６】
精製胚体内胚葉細胞の増殖
本実施例は、本明細書中に記載される胚体内胚葉細胞がｈＥＳＣから分化され、精製され、次に再増殖されて、細胞培養で増殖され得る、ということを実証する。
【０２２７】
図３６は、胚体内胚葉精製／増殖実験の計画を示す。特に、低血清ＲＭＰＩ中で１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡの存在下で、ｈＥＳＣ系統ＣｙＴ２５の９６回目の継代培養から、胚体内胚葉細胞を分化させた。低血清ＲＰＭＩは、０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を１日目に、０．２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを２日目に、そして２％血清をそれ以後の各日目に含有した。５日間の分化後、上記実施例に記載したように、ＣＸＣＲ４に対する抗体を用いて、細胞をＦＡＣＳ精製に付した。次に精製細胞集団を、以下の４つの成長因子条件のうちの１つの下で、２％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ中でポリオルニチン及び１０μｇ／ｍｌヒトフィブロネクチンで被覆されたＩＶＦ皿上で培養した：因子添加なし（ＮＦ）；１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ａ）；１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ及び１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１（ＡＩ）；又は１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ、１２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（ＡＦＥ）。１１日目に、標準トリプシン処理法を用いて、増殖胚体内胚葉細胞を継代培養した。次に細胞培養物の各々を、継代培養後さらに１０日間増殖させた（アクチビンＡとの最初の接触後、全体で２１日）。図３６に示すように、ｍＲＮＡの試料を、０、５、１１及び２１日目に得た。
【０２２８】
図３７Ａ〜図３７Ｅは、培養条件の各々に関して試料時点の各々での種々の胚性細胞型に関するマーカー遺伝子の発現を示す。図３７Ａ及び図３７Ｂに示すように、胚体内胚葉マーカーＳＯＸ１７及びＧＳＣは、５日齢非精製胚体内胚葉培養物中で高度に発現されたが、ｈＥＳＣ中では発現されなかった。この発現は、ｈＥＳＣマーカーＯＣＴ４の発現と対照を成す（図３７Ｃ）。胚体内胚葉細胞の精製の６日後（１１日目）、ＳＯＸ１７の発現及びＧＳＣ発現は、成長因子（単数又は複数）で処理された細胞培養物の各々においては高度に残存したが、アクチビンＡの非存在下で増殖した細胞培養物中には残存しなかった（図３７Ａ及び図３７Ｂ）。継代培養の１０日後（２１日目）に、これらのマーカーに関して類似の発現パターンを観察した（図３７Ａ及び図３７Ｂ）。ｈＥＳＣ（ＯＣＴ４）、中胚葉（ブラキュリ）又は外胚葉（ＺＩＣ１及びＳＯＸ１）のマーカーに関するｍＲＮＡの発現は、精製後の細胞培養物のいずれにおいても観察されなかった。この結果は、アクチビンＡの非存在下でさえ、精製胚体内胚葉細胞がｈＥＳＣ又は他の２つの胚性細胞系統の細胞を形成しない、ということを示す（図３７Ｃ〜図３７Ｆ）。
【０２２９】
本明細書中に記載される方法、組成物及び装置は、目下、好ましい実施形態を代表するものであり、例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。その変更及びその他の使用は当業者に思い付かれ、これらは本発明の精神に包含され、そして開示の範囲により規定される。したがって本発明の範囲及び精神を逸脱することなく、本明細書に開示される発明に種々の置換及び修正がなされ得るということは、当業者には明らかである。
【０２３０】
添付の特許請求の範囲及び本開示全体を通して用いられる場合、「本質的に〜から成る」という語句は、当該語句の後ろに列挙される任意の要素を含むことを意味し、列挙した要素に関する開示において特定される活性又は作用を妨害しないか又は寄与しない他の要素に限定される。したがって「本質的に〜から成る」という語句は、列挙した要素が必要とされるか又は必須であるが、他の要素は任意であり、それらが列挙した要素の活性又は作用に影響を及ぼすか否かによって、存在してもよいし存在しなくてもよい、ということを示す。
【０２３１】
［参考文献］
多数の文献及び特許参考文献を、本特許出願中で引用してきた。本特許出願で引用され
る参考文献のそれぞれ及び全てが、参照として本明細書中に全体が援用される。
【０２３２】
いくつかの参考文献に関しては、全引用が文書の本文中に存在する。他の参考文献に関しては、文書の本文中における引用は著者及び年で示しているが、全引用を以下に示す：
【０２３３】
【表３−１】
【表３−２】
【表３−３】
【表３−４】
【表３−５】
【表３−６】
【図面の簡単な説明】
【０２３４】
【図１】ｈＥＳＣからのβ細胞の産生のための提案された分化経路の模式図である。当該経路の第１の工程は、ＥＳ細胞を胚体内胚葉細胞系列に関係付け(commit)、そして膵臓内胚葉、内分泌性内胚葉又は島／β細胞へのＥＳ細胞のさらなる分化における既知の最も初期の工程のうちの１つを表す。この移行を媒介するために有用ないくつかの因子は、ＴＧＦβファミリーの成員であり、例としては、アクチビン及びノーダルが挙げられるが、これらに限定されない。胚体内胚葉標的細胞を規定するための例示的マーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＭＩＸ１及びＣＸＣＲ４である。
【図２】保存モチーフの位置を表示し、且つＧＥＮＯＶＡＣによる免疫化手順に使用される領域を強調するヒトＳＯＸ１７ ｃＤＮＡの略図である。
【図３】ＳＯＸ１７が、ＳＯＸ７に、また幾分劣るがＳＯＸ１８に最も密接に関連することを示す相関系統樹である。ＳＯＸ１７タンパク質は、同種内のＳＯＸ Ｆ群サブファミリーの他の成員に対するよりも種相同体間でより密接に関連する。
【図４】ラット抗ＳＯＸ１７抗体でプローブしたウェスタンブロットである。このブロットは、線維芽細胞において過剰発現されるヒトＳＯＸ１７タンパク質に関するこの抗体の特異性（レーン１）及びＥＧＦＰとの免疫反応性の欠如（レーン２）或いは最も密接に関連するＳＯＸスーパーファミリー成員であるＳＯＸ７（レーン３）を実証する。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、相当数のＡＦＰ+同時標識細胞を表示するＳＯＸ１７+細胞のクラスター（Ａ）を示す顕微鏡写真である。これは、ＡＦＰ+細胞がほとんど又は全く観察されない他のＳＯＸ１７+クラスター（Ｂ）と著しい対比を成す。
【図６】図６Ａ〜図６Ｃは、壁側内胚葉及びＳＯＸ１７を示す顕微鏡写真である。パネルＡは、ｈＥＳ細胞の無作為に分化された培養物における壁内胚葉細胞の細胞表面上に位置するヒトトロンボモジュリン（ＴＭ）タンパク質に関する免疫細胞化学を示す。パネルＢは、ＴＭ及びＳＯＸ１７に関して二重標識されたＡで示されるのと同一視野である。パネルＣは、ＤＡＰＩ標識された核を伴う同一視野の位相コントラスト画像である。ＤＡＰＩ標識された核とＳＯＸ１７ラベリングの完全な相関に留意されたい。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、定量的ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によるＳＯＸ１７遺伝子発現及びＳＯＸ１７特異的抗体による抗ＳＯＸ１７陽性細胞を示す棒グラフである。パネルＡは、未分化対照培地（ＳＲ２０）と比較して、アクチビンＡがＳＯＸ１７遺伝子発現を増大させる一方で、レチノイン酸（ＲＡ）はＳＯＸ１７発現を強力に抑制することを示す。パネルＢは、これらの変化の同一パターン並びに類似した規模が、ＳＯＸ１７+細胞数に反映されることを示しており、ＳＯＸ１７遺伝子発現のＱ−ＰＣＲ測定は、単一細胞レベルでの変化を大きく反映することを示す。
【図８】図８Ａは、アクチビンＡの存在下での分化ｈＥＳＣの培養は、低レベルのＡＦＰ遺伝子発現を維持するのに対して、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中で無作為に分化することが可能とされる細胞は、ＡＦＰの強力なアップレギュレーションを示すことを示す棒グラフである。発現レベルの差異は、およそ７倍である。図８Ｂ及び図８Ｃは、１０％ＦＢＳ単独（上）に対するアクチビンＡ処理状態（下）で観察されるＡＦＰ+細胞の非常に希少且つ小さなクラスターにより示されるように、アクチビンＡによるＡＦＰ発現の抑制もまた単一細胞レベルで明白であることを示す２つの顕微鏡写真の画像である。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、フローサイトメトリーを使用したＡＦＰ+細胞数の定量化を示す比較画像である。この図は、アクチビンＡの存在（右パネル）及び非存在（左パネル）下でのＡＦＰ遺伝子発現の変化の規模（図８Ａ）がＡＦＰ+細胞の数に正確に対応することを実証し、さらに個々の細胞レベルで起こる変化を示すためのＱ−ＰＣＲ分析の有用性を支持する。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｆは、ノーダル、アクチビンＡ及びアクチビンＢ（ＮＡＡ）へのｈＥＳＣの暴露が、５日間にわたってＳＯＸ１７+細胞の数の著しい増大をもたらすことを示す顕微鏡写真である（Ａ〜Ｃ）。ＤＡＰＩ染色された核により示されるように（Ｄ〜Ｆ）、ＳＯＸ１７+細胞の相対存在量を、各視野に存在する細胞の総数と比較することにより、すべての細胞のおよそ３０〜５０％が、ＮＡＡによる５日の処理後にＳＯＸ１７に対して免疫反応性であることがわかる。
【図１１】アクチビンＡ（０、１０、３０又は１００ｎｇ／ｍｌ）は、分化ｈＥＳＣにおけるＳＯＸ１７遺伝子発現を用量依存的に増大させることを実証する棒グラフである。増大された発現は、接着培養物上での３日間の処理後にすでに強健であり、同様に続く１、３及び５日の懸濁培養まで継続する。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｃは、ＭＩＸＬ１（パネルＡ）、ＧＡＴＡ４（パネルＢ）及びＨＮＦ３ｂ（パネルＣ）の発現に対するアクチビンＡの影響を実証する棒グラフである。アクチビンＡ用量依存的増大はまた、胚体内胚葉の３つの他のマーカーであるＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４及びＨＮＦ３ｂに関しても観察される。アクチビン用量に応答した増大された発現の規模は、ＳＯＸ１７に関して観察される規模と際立って類似しており、アクチビンＡが、４つすべての遺伝子（ＳＯＸ１７+、ＭＩＸＬ１+、ＧＡＴＡ４+及びＨＮＦ３ｂ+）を同時発現する細胞の集団を特定していることを強力に示している。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｃは、ＡＦＰ（パネルＡ）、ＳＯＸ７（パネルＢ）及びＳＰＡＲＣ（パネルＣ）の発現に対するアクチビンＡの影響を実証する棒グラフである。臓側内胚葉マーカーＡＦＰの発現においてアクチビンＡ用量依存的減少が見られる。原始内胚葉（ＳＯＸ７）及び壁側内胚葉（ＳＰＡＲＣ）のマーカーは、未変化のままであるか、或いはいくつかの時点で抑制を示すことから、アクチビンＡが、これらの胚体外内胚葉細胞型を特定するように作用しないことを示している。このことはさらに、ＳＯＸ１７、ＭＩＸＬ１、ＧＡＴＡ４及びＨＮＦ３ｂの増大された発現が、アクチビンＡに応答した胚体内胚葉細胞の数の増大に起因し得るという事実を支持する。
【図１４】図１４Ａ及び図１４Ｂは、ＺＩＣ１（パネルＡ）及びブラキュリ発現（パネルＢ）に対するアクチビンＡの影響を示す棒グラフである。神経マーカーＺＩＣ１の一貫した発現は、神経分化に対するアクチビンＡの用量依存的影響が見られないことを実証する。ブラキュリの減少された発現により示されるように、１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ処理により媒介される中胚葉分化の顕著な抑制が見られる。これは、中内胚葉前駆体からの胚体内胚葉の増大された特異化の結果である可能性が高い。より低レベルのアクチビンＡ処理（１０及び３０ｎｇ／ｍｌ）は、未処理対照培養物に対して分化のより後期の時点でブラキュリの発現を維持する。
【図１５】図１５Ａ及び図１５Ｂは、アクチビンによる処理に応答した減少された壁側内胚葉分化を示す顕微鏡写真である。ＴＭhi壁側内胚葉の領域は、血清単独中で分化される場合、培養物の至るところで見られる（Ａ）のに対して、アクチビンが包含される場合、ＴＭ+細胞への分化は乏しく（Ｂ）、ＴＭ免疫反応性の全体的な強度はより低い。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｄは、アクチビンＡ及びアクチビンＢによる処理に応答したマーカー発現を示す顕微鏡写真である。ｈＥＳＣは、アクチビンＡ及びアクチビンＢにより連続４日間処理して、ＳＯＸ１７、ＡＦＰ及びＴＭ抗体で三重標識した。パネルＡ−ＳＯＸ１７、パネルＢ−ＡＦＰ、パネルＣ−ＴＭ及びパネルＤ−相／ＤＡＰＩ。ＡＦＰ（Ｂ）及びＴＭ（Ｃ）免疫反応性の完全な非存在と関連した無数のＳＯＸ１７陽性細胞（Ａ）に注目されたい。
【図１７】ｈＥＳＣからのｉｎ ｖｉｔｒｏでの胚体内胚葉及び臓側内胚葉の出現を示す顕微鏡写真である。臓側内胚葉の領域は、ＡＦＰhi／ＳＯＸ１７lo/-により同定される一方で、胚体内胚葉は、完全に反対のプロフィールであるＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo/-を示す。この視野は、これらの２つの領域の互いに対する近接性に起因して選択的に選択された。しかしながら、何度もＳＯＸ１７hi／ＡＦＰlo/-領域がＡＦＰhi細胞の任意の領域からの絶対的な単離で観察され、これは臓側内胚葉細胞とは別個の胚体内胚葉細胞の起源を示唆する。
【図１８】ＴＧＦβファミリーのリガンド及び受容体を表す略図である。ＡＲ Ｓｍａｄ及びＢＲ Ｓｍａｄを活性化する因子は、ヒト胚性幹細胞からの胚体内胚葉の産生に有用である（J Cell Physiol. 187: 265-76を参照）。
【図１９】個々のＴＧＦβ因子及びＴＧＦβ因子の組合せによる処理の結果として、経時的にＳＯＸ１７発現の誘導を示す棒グラフである。
【図２０】ＴＧＦβ因子の組合せによる処理の結果として、経時的にＳＯＸ１７+細胞数の増大を示す棒グラフである。
【図２１】ＴＧＦβ因子の組合せによる処理の結果として、経時的にＳＯＸ１７発現の誘導を示す棒グラフである。
【図２２】アクチビンＡが、ＳＯＸ１７+細胞数の用量依存的増大を誘導することを示す棒グラフである。
【図２３】アクチビンＡ及びアクチビンＢ処理培養物へのＷｎｔ３ａの添加が、アクチビンＡ及びアクチビンＢ単独により誘導されるレベルを上回ってＳＯＸ１７発現を増大させることを示す棒グラフである。
【図２４】図２４Ａ〜図２４Ｃは、胚体内胚葉への分化が低ＦＢＳ条件で増強されることを示す棒グラフである。２％ＦＢＳを含有する培地中（２ＡＡ）でのアクチビンＡ及びＢによるｈＥＳＣの処理は、１０％ＦＢＳ培地（１０ＡＡ）中での同じ処理と比較して、２〜３倍高いレベルのＳＯＸ１７発現をもたらす（パネルＡ）。胚体内胚葉マーカーＭＩＸＬ１の誘導（パネルＢ）はまた、同じ方法で影響を及ぼされ、ＡＦＰ（臓側内胚葉）の抑制（パネルＣ）は、１０％ＦＢＳ条件よりも２％ＦＢＳにおいて高い。
【図２５】図２５Ａ〜図２５Ｄは、ＳＯＸ１７+細胞が培養中に分裂していることを示す顕微鏡写真である。ＳＯＸ１７免疫反応性細胞は、ｈＥＳＣコロニーの分化の瀬戸際(edge)に存在し（Ｃ、Ｄ）、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）で標識される（パネルＢ）が、ＯＣＴ４では共同標識されていない（パネルＣ）。さらに、明確な有糸分裂の形が、ＳＯＸ１７+細胞（矢印）並びにＯＣＴ４+の未分化ｈＥＳＣ（矢じり）の両方において核のＤＡＰＩラベリングにより観察することができる（Ｄ）。
【図２６】様々な培地条件下での分化ｈＥＳＣにおけるＣＸＣＲ４の相対発現レベルを示す棒グラフである。
【図２７】図２７Ａ〜図２７Ｄは、胚体内胚葉マーカーのパネルが、どのようにして図２６で示されるのと同じ分化処理にわたってＣＸＣＲ４と非常に類似した発現のパターンを共有するかを示す棒グラフである。
【図２８】図２８Ａ〜図２８Ｅは、中胚葉（ブラキュリ、ＭＯＸ１）、外胚葉（ＳＯＸ１、ＺＩＣ１）及び臓側内胚葉（ＳＯＸ７）に関するマーカーが、どのようにして図２６で示されるのと同じ処理にわたってＣＸＣＲ４発現に対する逆相関を示すかを示す棒グラフである。
【図２９】図２９Ａ〜図２９Ｆは、図２６〜図２８で示される３つの培地条件にわたってＳＯＸ１７免疫反応性細胞における相対的な差異を示す顕微鏡写真である。
【図３０】図３０Ａ〜図３０Ｃは、分化培地に添加されるアクチビンＡの増大濃度によるＣＸＣＲ４+細胞数の増大を実証するフローサイトメトリードットプロットである。
【図３１】図３１Ａ〜図３１Ｄは、高用量アクチビンＡ処理から単離されるＣＸＣＲ４+細胞（Ａ１００−ＣＸ＋）が、母集団（Ａ１００）よりも胚体内胚葉マーカーに関してさらに一層富化されることを示す棒グラフである。
【図３２】蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を使用して単離されるＣＸＣＲ４+細胞及びＣＸＣＲ４-細胞からの遺伝子発現、並びに母集団における遺伝子発現を示す棒グラフである。これは、ＣＸＣＲ４+細胞が各母集団に存在する本質的にすべてのＣＸＣＲ４遺伝子発現を含有し、またＣＸＣＲ４-集団がＣＸＣＲ４遺伝子発現をほとんど含有しないか、或いは全く含有しないことを実証する。
【図３３】図３３Ａ〜図３３Ｄは、これらの非胚体内胚葉マーカーの発現においてすでに抑制されている高用量アクチビンＡ処理から単離されるＣＸＣＲ４+細胞における中胚葉（ブラキュリ、ＭＯＸ１）、外胚葉（ＺＩＣ１）及び臓側内胚葉（ＳＯＸ７）遺伝子発現の欠乏を実証する棒グラフである。
【図３４−１】図３４Ａ〜図３４Ｍは、胚体内胚葉細胞を同定するのに使用することができるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーであるＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１の発現分析は、それぞれパネルＧ〜Ｌに示される。これまでに記載した系統マーキング遺伝子であるＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１及びＭＯＸ１の発現分析は、それぞれパネルＡ〜Ｆに示される。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現分析を示す。パネルＡ〜Ｍそれぞれに関して、ｈＥＳＣと標識した欄は、精製ヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、２％ＦＢＳで処理した細胞（アクチビン添加なし）を示し、０．１Ａ１００は、０．１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、２Ａ１００は、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す。
【図３４−２】図３４Ａ〜図３４Ｍは、胚体内胚葉細胞を同定するのに使用することができるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーであるＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１の発現分析は、それぞれパネルＧ〜Ｌに示される。これまでに記載した系統マーキング遺伝子であるＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１及びＭＯＸ１の発現分析は、それぞれパネルＡ〜Ｆに示される。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現分析を示す。パネルＡ〜Ｍそれぞれに関して、ｈＥＳＣと標識した欄は、精製ヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、２％ＦＢＳで処理した細胞（アクチビン添加なし）を示し、０．１Ａ１００は、０．１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、２Ａ１００は、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す。
【図３４−３】図３４Ａ〜図３４Ｍは、胚体内胚葉細胞を同定するのに使用することができるマーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーであるＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＭＫＯＲ１及びＣＲＩＰ１の発現分析は、それぞれパネルＧ〜Ｌに示される。これまでに記載した系統マーキング遺伝子であるＳＯＸ１７、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７／ＳＯＸ７、ＴＭ、ＺＩＣ１及びＭＯＸ１の発現分析は、それぞれパネルＡ〜Ｆに示される。パネルＭは、ＣＸＣＲ４の発現分析を示す。パネルＡ〜Ｍそれぞれに関して、ｈＥＳＣと標識した欄は、精製ヒト胚性幹細胞からの遺伝子発現を示し、２ＮＦは、２％ＦＢＳで処理した細胞（アクチビン添加なし）を示し、０．１Ａ１００は、０．１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、１Ａ１００は、１％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示し、２Ａ１００は、２％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡで処理した細胞を示す。
【図３５】図３５Ａ〜図３５Ｄは、種々の増殖条件下で３６日間維持された細胞培養物中の胚体内胚葉マーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。胚体内胚葉マーカーＳＯＸ１７、ＧＳＣ、ＭＩＸＬ１及びＣＸＣＲ４の発現分析を、それぞれパネルＡ〜Ｄに示す。ＥＢ及びＥＶは、ｈＣｙＴ２５ ｈＥＳＣ系列から各々細胞集団を分離することを意味するために使用される。略号ＮＦはアクチビンＡの非存在下での細胞成長を示し、一方、Ａ１００は、１００ｎｇ／ｍｌのこの因子の存在下での細胞増殖を示す。ＥＧＦは、５０ｎｇ／ｍｌの上皮細胞成長因子を示す。
【図３６】胚体内胚葉細胞に関する細胞分化、単離及び増殖手順を示す線図である。略号は以下の通りである：ｈＥＳＣはヒト胚性幹細胞を指す；ｄ５ ｈＥＳＣ−ＤＥは非精製胚体内胚葉細胞を指す；ｄ６ ＦＡＣＳ−ＤＥはＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞を指す；そしてｐ１ ｄ１０ ＦＡＣＳ−ＤＥは、１回継代培養され、そして継代培養後さらに１０日間増殖した精製胚体内胚葉細胞を指す。ＲＮＡ試料を採取し、指定日の各々でマーカー発現に関して分析した。
【図３７】図３７Ａ〜図３７Ｆは、胚体内胚葉に分化され、次にその後ＣＸＣＲ４抗体を蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）と共に用いて精製された細胞培養物中の種々の胚性細胞系統マーカー遺伝子の発現パターンを示す棒グラフである。略号は以下の通りである：ｐ９６ ｈＥＳＣは、ＣｙＴ２５ヒト胚性幹細胞の９６回目の継代培養からのｍＲＮＡを指す；ｄ５ ＤＥは、ｐ９６ ｈＥＳＣからの分化の５日目の非精製胚体内胚葉細胞からのｍＲＮＡを指す；ＮＦ ｄ６−ＦＡＣＳは、アクチビンＡの非存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞から分化後１１日目に採取されたｍＲＮＡを指す；Ａは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの分化後１１日目に採取されたｍＲＮＡを指す；ＡＩは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ及び１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１の存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの分化後１１日目に採取されたｍＲＮＡを指す；ＡＦＥは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ、１２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの分化後１１日目に採取されたｍＲＮＡを指す；ＮＦ ｐ１−ｄ１０−ＦＡＣＳは、アクチビンＡの非存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞の継代培養後１０日目に採取されたｍＲＮＡを指す；Ａは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡの存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの継代培養後１０日目に採取されたｍＲＮＡを指す；ＡＩは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ及び１００ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１の存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの継代培養後１０日目に採取されたｍＲＮＡを指す；そしてＡＦＥは、１００ｎｇ／ｍｌアクチビンＡ、１２ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下でインキュベートされたＣＸＣＲ４抗体／ＦＡＣＳ精製胚体内胚葉細胞からの継代培養後１０日目に採取されたｍＲＮＡを指す。パネルＡ−ＳＯＸ１７；Ｂ−ＧＳＣ；Ｃ−ＯＣＴ４；Ｄ−ブラキュリ；Ｅ−ＺＩＣ１；Ｆ−ＳＯＸ１。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養で胚体内胚葉細胞を増殖する方法であって、以下：
（ａ）胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得する工程；
（ｂ）前記細胞培養物中の他の細胞のうちの少なくともいくつかから前記胚体内胚葉細胞のうちの少なくともいくつかを単離する工程であって、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を作り出す、工程；及び
（ｃ）前記胚体内胚葉細胞の増殖を可能にする条件下で前記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を培養する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記胚体内胚葉細胞が腸管の細胞又はそれに由来する器官に分化し得る多分化能細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記胚体内胚葉細胞がヒト胚体内胚葉細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記胚体内胚葉細胞がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に由来する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記取得する工程が、前記ｈＥＳＣのうちの少なくともいくつかの胚体内胚葉細胞への分化を可能にするために、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子とｈＥＳＣを接触させることを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーの前記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
胚体内胚葉細胞を含む前記細胞培養物を取得する工程が、現存する胚体内胚葉培養物の一部分を取得することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が胚体内胚葉細胞以外の細胞を実質的に含有しない、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９６％の胚体内胚葉細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９８％の胚体内胚葉細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が約１００％の胚体内胚葉細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記単離する工程が、前記胚体内胚葉細胞中で発現されるマーカーと結合するが、細胞培養物中に存在する前記他の細胞中で実質的に発現されない試薬を前記細胞培養物に提供すること、及び、細胞培養物中に存在する前記他の細胞から前記試薬に結合された前記胚体内胚葉細胞を分離することであって、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を生じることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記マーカーがＣＸＣＲ４である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記試薬が抗体である、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記試薬に結合された前記胚体内胚葉細胞が蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により細胞培養物中に存在する前記他の細胞から分離される、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記単離する工程が非標識細胞から蛍光標識胚体内胚葉細胞を分離することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記蛍光標識胚体内胚葉細胞が強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現の結果として標識される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ＥＧＦＰの発現がＳＯＸ１７プロモーターの制御下にある、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ＥＧＦＰの発現がＣＸＣＲ４プロモーターの制御下にある、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記培養する工程が、前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をプレーティングすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分がヒトフィブロネクチンで被覆された表面でプレーティングされる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記表面がポリオルニチンで被覆される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記培養する工程が、約２％（ｖ／ｖ）の血清を含む培地中で前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
前記培養する工程が、約２％（ｖ／ｖ）よりも多い血清を含む培地中で前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
前記培養する工程が、約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
前記培養する工程が、少なくとも１つの成長因子を含む培地中で前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの成長因子がＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子の一成長因子である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡを含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記アクチビンＡが約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培地中に存在する、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの成長因子がＩＧＦ１を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
前記ＩＧＦ１が約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培地中に存在する、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡとＩＧＦ１との組合せを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの成長因子がｂＦＧＦを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３４】
前記ｂＦＧＦが約１２ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培地中に存在する、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの成長因子がＥＧＦを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３６】
前記ＥＧＦが約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培地中に存在する、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡと、ｂＦＧＦと、ＥＧＦとの組合せを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３８】
請求項１記載の方法により産生される増殖した胚体内胚葉細胞集団。
【請求項３９】
培養で胚体内胚葉細胞を増殖する方法であって、以下：
（ａ）胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得する工程、及び
（ｂ）前記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程であって、それにより胚体内胚葉細胞を含む複数の細胞培養物を産生する工程を含む、方法。
【請求項４０】
前記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、前記細胞培養物に少なくとも１つの酵素を提供することを含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの酵素が少なくとも１つのプロテアーゼを含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのプロテアーゼがトリプシンを含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、前記胚体内胚葉細胞間の接触を機械的に妨げることを含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４４】
前記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、細胞分散緩衝液中で前記胚体内胚葉細胞をインキュベートすることを含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４５】
前記胚体内胚葉細胞が基材に付着される、請求項３９記載の方法。
【請求項４６】
前記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、前記基材から前記胚体内胚葉細胞を剥離することを含む、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記基材が組織培養フラスコの表面である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記基材がマイクロタイタープレートの表面である、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
請求項３９記載の方法により産生される増殖した胚体内胚葉細胞集団。
【請求項１】
培養で胚体内胚葉細胞を増殖する方法であって、以下：
（ａ）胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得する工程；
（ｂ）前記細胞培養物中の他の細胞のうちの少なくともいくつかから前記胚体内胚葉細胞のうちの少なくともいくつかを単離する工程であって、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を作り出す、工程；及び
（ｃ）前記胚体内胚葉細胞の増殖を可能にする条件下で前記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を培養する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記胚体内胚葉細胞が腸管の細胞又はそれに由来する器官に分化し得る多分化能細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記胚体内胚葉細胞がヒト胚体内胚葉細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記胚体内胚葉細胞がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に由来する、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記取得する工程が、前記ｈＥＳＣのうちの少なくともいくつかの胚体内胚葉細胞への分化を可能にするために、ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子とｈＥＳＣを接触させることを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーの前記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡを含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
胚体内胚葉細胞を含む前記細胞培養物を取得する工程が、現存する胚体内胚葉培養物の一部分を取得することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が胚体内胚葉細胞以外の細胞を実質的に含有しない、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９６％の胚体内胚葉細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が少なくとも約９８％の胚体内胚葉細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団が約１００％の胚体内胚葉細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記単離する工程が、前記胚体内胚葉細胞中で発現されるマーカーと結合するが、細胞培養物中に存在する前記他の細胞中で実質的に発現されない試薬を前記細胞培養物に提供すること、及び、細胞培養物中に存在する前記他の細胞から前記試薬に結合された前記胚体内胚葉細胞を分離することであって、それにより胚体内胚葉細胞に富んだ細胞集団を生じることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記マーカーがＣＸＣＲ４である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記試薬が抗体である、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記試薬に結合された前記胚体内胚葉細胞が蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）により細胞培養物中に存在する前記他の細胞から分離される、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記単離する工程が非標識細胞から蛍光標識胚体内胚葉細胞を分離することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記蛍光標識胚体内胚葉細胞が強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の発現の結果として標識される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
ＥＧＦＰの発現がＳＯＸ１７プロモーターの制御下にある、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ＥＧＦＰの発現がＣＸＣＲ４プロモーターの制御下にある、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記培養する工程が、前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をプレーティングすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分がヒトフィブロネクチンで被覆された表面でプレーティングされる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記表面がポリオルニチンで被覆される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記培養する工程が、約２％（ｖ／ｖ）の血清を含む培地中で前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
前記培養する工程が、約２％（ｖ／ｖ）よりも多い血清を含む培地中で前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
前記培養する工程が、約２％（ｖ／ｖ）未満の血清を含む培地中で前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
前記培養する工程が、少なくとも１つの成長因子を含む培地中で前記胚体内胚葉細胞に富んだ集団又はその一部分をインキュベートすることを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの成長因子がＴＧＦβスーパーファミリーの成長因子の一成長因子である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記ＴＧＦβスーパーファミリーの少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡを含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記アクチビンＡが約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培地中に存在する、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの成長因子がＩＧＦ１を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
前記ＩＧＦ１が約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培地中に存在する、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡとＩＧＦ１との組合せを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの成長因子がｂＦＧＦを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３４】
前記ｂＦＧＦが約１２ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培地中に存在する、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの成長因子がＥＧＦを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３６】
前記ＥＧＦが約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で前記培地中に存在する、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの成長因子がアクチビンＡと、ｂＦＧＦと、ＥＧＦとの組合せを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項３８】
請求項１記載の方法により産生される増殖した胚体内胚葉細胞集団。
【請求項３９】
培養で胚体内胚葉細胞を増殖する方法であって、以下：
（ａ）胚体内胚葉細胞を含む細胞培養物を取得する工程、及び
（ｂ）前記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程であって、それにより胚体内胚葉細胞を含む複数の細胞培養物を産生する工程を含む、方法。
【請求項４０】
前記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、前記細胞培養物に少なくとも１つの酵素を提供することを含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの酵素が少なくとも１つのプロテアーゼを含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのプロテアーゼがトリプシンを含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、前記胚体内胚葉細胞間の接触を機械的に妨げることを含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４４】
前記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、細胞分散緩衝液中で前記胚体内胚葉細胞をインキュベートすることを含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４５】
前記胚体内胚葉細胞が基材に付着される、請求項３９記載の方法。
【請求項４６】
前記胚体内胚葉細胞を継代培養する工程が、前記基材から前記胚体内胚葉細胞を剥離することを含む、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記基材が組織培養フラスコの表面である、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記基材がマイクロタイタープレートの表面である、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
請求項３９記載の方法により産生される増殖した胚体内胚葉細胞集団。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４−１】
【図３４−２】
【図３４−３】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図５】
【図６】
【図８】
【図１０】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２５】
【図２９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図７】
【図９】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４−１】
【図３４−２】
【図３４−３】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図５】
【図６】
【図８】
【図１０】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２５】
【図２９】
【公表番号】特表２００８−５２５０４０（Ｐ２００８−５２５０４０Ａ）
【公表日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４８５９２（Ｐ２００７−５４８５９２）
【出願日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４７１７５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７１９１１
【国際公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【出願人】（５０３４３１７９２）サイセラ，インコーポレイテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年７月１７日（２００８．７．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４７１７５
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７１９１１
【国際公開日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【出願人】（５０３４３１７９２）サイセラ，インコーポレイテッド (9)
【Ｆターム（参考）】
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