本発明は、胚幹（ＥＳ）細胞など、幹細胞における未分化状態および／または多分化能の維持のための方法、組成物、およびキットに関する。本発明はまた、未分化状態に維持されている幹細胞に関する。本発明は、線維芽細胞のフィーダー層、馴化培地、または白血病抑制因子を使用せずに、ＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質、ＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質、および／またはニコチンアミドに富んだ培養培地を用いたこれらの態様を提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスレファランス
本出願は、２００４年３月１０日に出願された特許文献１の出願日の利益を主張し、その全開示の全体が、参照として本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、分子および細胞の生物学の分野に関する。より具体的に、本発明は、培養液中の未分化状態における胚幹細胞の増殖、ならびに細胞過程の研究および医学的に有用な製品のための、このような細胞の利用法に関する。
【背景技術】
【０００３】
幹細胞はそれらの多能性のために、多くのヒト疾患にとって高い有望性を示している。どんな細胞型にも分化するかれらの能力により、それらは、多数の異なった細胞型、組織、および器官を冒す疾患および障害に関する研究ならびに治療法の開発にとって、貴重な供給源となっている。したがって、それらの研究、未分化状態におけるそれらの増殖および維持、ならびに治療にとっての関心対象である細胞型生産のためのそれらの分化制御に、現在、強い関心が持たれている。
【０００４】
健康や生命にとって重要な物質を産生するものを含めて、欠損した、または喪失した身体組織および器官を置換または補足するために、単離された、あるいは新たな遺伝子の導入または欠失もしくは欠失遺伝子の置換によって修飾された成人幹細胞および胚幹細胞などの幹細胞を用いることができるということが提案されてきた。しかし、このタイプの研究およびそれに続く治療にとって必要であるところの、培養液における未分化多能性幹細胞の維持は、明らかに困難である。補足添加物を含有しない培養液に入れると、未分化細胞は、自然に急速な分化を開始し、次いで、典型的には、分裂が遅くなるか分裂を停止させる。したがって、現在、研究および治療開発に実際に利用できる幹細胞はわずかである。この問題を克服するために、研究者は、分化を阻止する一方、細胞の分裂を続行させる外来物質の添加によって幹細胞を未分化状態で培養する方法の発明を試みている。
【０００５】
最も広く研究されている２種の胚幹細胞型は、マウス胚幹細胞（ｍＥＳＣ）およびヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）である。マウス胚幹細胞における未分化状態および多能性の維持には、マウス線維芽細胞フィーダー層（ｍＥＦｓ）の存在または白血球阻止因子（ＬＩＦ）によるＳＴＡＴ３の活性化が必要である。同様に、ｈＥＳＣは典型的に、ｍＥＦｓ上で、または線維芽細胞の増殖から得られた培地中で培養される。ヒト胚幹細胞系は、つい最近、研究に利用できるようになったために、自己複製および分化に関する細胞内経路は、現時点では大部分が不明である。しかし、ｈＥＳＣの増殖要件は、ｍＥＳＣの増殖要件とは著しく異なっているであろうことが、明らかになりつつある。例えば、ｍＥＳＣでの状況とは異なり、ｍＥＦｓ上で増殖させた場合、またはｍＥＦｓからの馴化培地で処理した場合、ｈＥＳＣの分化を阻止するためには、ＳＴＡＴ３の活性化では十分ではない。また、本出願に関する優先文書の出願日後に発行された報告において、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ）と共に、塩基性線維芽細胞因子（ｂＦＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）の一タイプがｈＥＳＣの分化を阻止することが開示された（Ｘｕ，Ｒ．Ｈ．ら、２００５年）。したがって、該著者らによれば、培養培地へのｂＦＧＦの添加により、フィーダー細胞を必要とせずに、ｈＥＳＣの増殖および維持を継続させることができる。
【０００６】
【特許文献１】米国仮特許出願第６０／５５２，３１８号、２００４年３月１０日出願
【特許文献２】米国特許第５，８５３，９９７号
【特許文献３】米国特許第５，９７６，８５３号
【特許文献４】米国特許第５，２９４，５３８号
【特許文献５】米国特許第６，００４，７９１号
【特許文献６】米国特許第５，５８９，３７５号
【特許文献７】米国特許第５，９５５，５９２号
【特許文献８】米国特許第５，９５８，７１９号
【特許文献９】米国特許第５，９５２，２１２号
【特許文献１０】国際公開第８６０６０７６号、１９８６年１０月２３日出願
【非特許文献１】Ｍｕｒｒａｙら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１７頁（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
幹細胞、特に胚幹細胞の培養において、進歩はなされているものの、培養液における、未分化幹細胞の維持および増殖のための実用的で信頼できる方法および材料に対する必要性は依然として存在している。特に、未分化ｈＥＳＣの増殖および維持のための方法および材料に対する必要性が当業界に存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、胚幹細胞などの未分化幹細胞の増殖および維持のための方法、組成物、およびキットを提供する。したがって、本発明は、胚幹細胞における未分化状態および／または多能性の維持に関する。該方法、組成物、およびキットは、研究、研究および医療物質の製造、ならびに疾患および障害、特にヒトを冒す疾患および障害の治療に使用するための幹細胞の培養における使用に好適である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
第１の態様において、本発明は、未分化幹細胞の増殖および維持のための方法を提供する。一般的に、該方法は、幹細胞を、所望の結果を達成する上で十分な時間、該細胞を未分化状態に維持する上で十分な量におけるアクチビンＡなどの形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）ファミリーメンバーのタンパク質に曝露することを含んでなる。所望の結果は、限定はしないが、特定物質の産生、培養プレート上の培養物の集密化、新たな培養培地へ移すために十分な数の細胞産生（すなわち、継代接種のために）、または対象への移植のために十分な数の細胞産生などの任意の医学的または科学的な関連結果であり得る。該方法は、幹細胞を、培養液中、限定はしないが、およそ１０継代またはそれ以上の複数継代を通して細胞の増殖および維持を可能にする上で十分な量において、ＫＧＦ（ＦＧＦ７としても知られている）などの線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーメンバーのタンパク質に曝露することを含んでなり得る。したがって、本発明の方法の種々の形態は、培養液中で少なくとも１０継代、未分化状態における幹細胞の増殖および維持をもたらすことができる。同様に、該方法は、幹細胞を、培養液中、およそ１０継代、２０継代、３０継代、またはそれ以上などの複数継代を通して、細胞の増殖および維持を可能にする上で十分な量において、ニコチンアミド（ＮＩＣ）に曝露することを含んでなり得る。該方法は、フィーダー細胞、馴化培地、および／または白血球阻止因子（ＬＩＦ）の不在下で、培養液中の幹細胞の増殖および維持を可能にし得る。実施形態において、該方法は、該細胞を多能性の状態に維持する。
【００１０】
第２の態様において、本発明は、幹細胞を、未分化または多能性の状態において増殖および／または維持するために使用できる組成物を提供する。一般的に、該組成物は、所望の結果を達成するために、十分な量の時間、幹細胞の少なくとも1種の培養液を、未分化状態において増殖または維持させる上で十分な量および形態のアクチビンＡなどのＴＧＦβファミリーのメンバー、ＫＧＦなどのＦＧＦファミリーのメンバー、もしくはＮＩＣ、またはこれらのうちの2種もしくは全ての組み合わせを含んでなる。上記方法の検討にしたがって、所望の結果は、任意の医学的または科学的な関連結果であり得る。したがって、複数の実施形態において、該組成物は、所望の結果を達成するために、十分な量の時間、幹細胞の少なくとも1種の培養液を、未分化状態において増殖および／または維持させる上で十分な量のＫＧＦを含み得る。複数の実施形態において、該組成物は、所望の結果を達成するために、十分な量の時間、幹細胞の少なくとも1種の培養液を、未分化状態において増殖および／または維持させる上で十分な量のＮＩＣを含み得る。種々の実施形態において、該組成物は、アクチビンＡ、ＫＧＦ、およびＮＩＣのうちの２種以上の組み合わせを含んでなる。本発明の組成物は、一般に、ＴＧＦβファミリーのメンバー、ＦＧＦファミリーのメンバー、および／またはＮＩＣに加えて、一成分を含んでなる。追加成分は、幹細胞の増殖、または幹細胞もしくは幹細胞によって産生された物質を動物対象またはヒト対象への導入にとって好適な、またはそれに適合性であることが知られている任意の物質であり得る。複数の実施形態において、それは培養培地である。幹細胞の増殖および維持における本発明の組成物の有用性の点で、本発明の組成物は、それら自身、ｈＥＳＣなどの胚幹細胞を含めて、幹細胞を含み得る。
【００１１】
第３の態様において、本発明は、胚幹細胞を、未分化状態または多能性状態において増殖および／または維持させる上で必要な材料の一部または全てを含有するキットを提供する。最も基本的形態において、該キットは、所望の結果を達成するために、十分な量の時間、培養液中の幹細胞を、増殖および維持させる上で十分な量のＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質、ＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質、および／またはＮＩＣを含有する少なくとも１つの容器を含んでなる。所望の結果は、特定物質の検出可能な量の産生、培養プレート上の培養物の集密化、対象への移植のために十分な数の細胞産生などの任意の医学的または科学的な関連結果であり得る。
【００１２】
第４の態様において、本発明は、未分化および多能性である幹細胞を提供する。該幹細胞は、本発明の組成物中で増殖および維持される。複数の実施形態において、該幹細胞は、マウス胚のフィーダー層からのフィーダー細胞、馴化培地、および／またはＳＴＡＴ３活性化を含まない組成物中で提供される。
【００１３】
本明細書に組み込まれており、本明細書の一部を構成している添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態の特徴を示しており、文書の説明と一緒になって、本発明の一定の様相を説明する上で役立つものである。
【００１４】
次に、本発明の種々の実施形態に対する記述を行う。本発明の一定の実施形態に対する以下の詳細な説明は、決して本発明を限定するものとして考えるべきではなく、当業者に対して、本発明の記述を助けるための種々の実施形態の説明として認識すべきである。
定義：
【００１５】
本明細書において別に特に定義されない限り、本文書に用いられる全ての用語は、分子生物学および細胞生物学分野における一般的および慣例的用法にしたがっている。次の用語が以下のように定義される：
【００１６】
本明細書に用いられる語の「ある("a","an")」および「該("the")」は、文脈上明らかに別に指示されない限り、単数と複数の双方の意味を含む。
【００１７】
本明細書に用いられる用語の「または(もしくは)("or")」は、挙げられた選択肢のうちの１つ、またはそれらの２つ以上の組み合わせを意味する。
【００１８】
本明細書に用いられる用語の「含んでなる("comprising")」が、ある方法におけるステップの記述の前に置かれている場合、該方法が、明記されたステップに追加して、１つまたは複数のステップを包含すること、ならびに、１つまたは複数の追加ステップが、記述されたステップの前、該ステップとの間、および／または後に実施できることを意味する。例えば、ステップａ、ｂ、およびｃを含んでなる方法は、ステップａ、ｂ、ｘ、およびｃの方法、ステップａ、ｂ、ｃ、およびｘの方法、ならびにステップｘ、ａ、ｂ、およびｃの方法を包含する。さらに、用語の「含んでなる」が、ある方法におけるステップの記述の前に置かれている場合、文脈上明らかに別に指示されない限り、挙げられたステップの連続的実施を必ずしも必要としない。例えば、ステップａ、ｂ、ｃを含んでなる方法は、ステップａ、ｃ、ｂの順序、ステップｃ、ｂ、ａの順序、およびステップｃ、ａ、ｂの順序でステップを実施する方法を包含する。
【００１９】
本明細書に用いられる用語の「接触("contacting")」および「曝露("exposing")」は、交換可能に用いられ、細胞および物質に関連して用いられる場合は、「接触」または「曝露」細胞を生成させるために、該物質を、該細胞に接触させることが可能な場所に、および条件下に置くことを意味する。
【００２０】
本明細書に用いられる用語の「細胞("cell")」とは、単一の細胞ならびに集団（すなわち、１つ超）の細胞を言う。該集団は、１種の細胞型を含んでなる純粋集団であり得る。あるいは、該集団は、１種超の細胞型を含んでなり得る。本発明において、細胞集団が含み得る細胞型の数に制限はない。さらに、本明細書に用いられる用語の「細胞培養物("cell culture")」とは、細胞の任意のインビトロ培養物を言う。この用語には、連続的細胞系（例えば、不死表現型）、一次細胞培養物、有限細胞系（例えば、非形質転換細胞）、およびインビトロで維持された卵母細胞および胚などの他の任意の細胞集団が含まれる。
【００２１】
本明細書に用いられる用語の「混合細胞培養物("mixed cell culture")」とは、２種以上の細胞型の混合物を言う。幾つかの実施形態において、該細胞は、遺伝子設計されていない細胞系であるが、他の実施形態では、該細胞は、遺伝子設計された細胞系である。いくつかの実施形態において、該細胞は、遺伝子設計された分子を含有する。本発明は、限定はしないが、使用された細胞型の全てが遺伝子設計されていない混合細胞培養物、１種以上の細胞型が遺伝子設計されており、残りの細胞型は遺伝子設計されていない混合混合物、および全ての細胞型が遺伝子設計されている混合物を含めて、テラトーマの作製、または欠失、同定、および／またはサンプル中のアポトーシスの定量に好適な細胞型の任意の組み合わせを包含する。
【００２２】
本明細書に用いられる用語の「一次細胞("primary cell")」は、培養なしで、ヒトなどの動物の組織（例えば、血液）または器官から直接得られる細胞である。典型的に、しかし必ずしもそうではないが、一次細胞は、老化および／または増殖の停止の前に、インビトロで１０以下の継代を経ることができる。対照的に、「培養細胞」は、インビトロで１０以上の継代を維持および／または増殖させた細胞である。
【００２３】
本明細書に用いられる用語の「培養細胞("cultured cells")」とは、同じ出所の一次細胞に比較して、増殖の停止および／または老化の前に、インビトロでより多数の継代ができる細胞を言う。培養細胞には、「細胞系("cell lines") 」および「一次培養細胞("primary cultured cells")」が含まれる。
【００２４】
本明細書に用いられる用語の「細胞系("cell line")」とは、一次細胞系、有限細胞系、連続細胞系、および形質転換細胞系などのインビトロで培養される細胞を言う。該用語は、該細胞が培養において無限回、継代できることを必要としない。細胞系は、自然に、または形質転換によって作製できる。
【００２５】
本明細書に用いられる用語の「一次細胞培養物("primary cell culture")」および「一次培養物("primary culture")」とは、動物または昆虫の組織などの細胞からインビボで直接得られた細胞培養物を言う。これらの培養物は成人ならびに胎児の組織に由来し得る。
【００２６】
本明細書に用いられる用語の「単層("monolayer")」、「単層培養物("monolayer culture")」、および「単層細胞培養物("monolayer cell culture")」とは、基質に接着していて、１個の細胞の厚さの層として増殖する細胞を言う。単層細胞は、限定はしないが、フラスコ、管、カバーガラス（例えば、シェルバイアル）、ローラーボトルなどの任意のフォーマットにおいて増殖できる。また、単層細胞は、限定はしないが、ビーズなどのマイクロキャリアに結合して増殖できる。
【００２７】
本明細書に用いられる用語の「懸濁液("suspension")」および「懸濁培養物("suspension culture")」とは、基質に結合せずに生存し、増殖する細胞を言う。懸濁培養物は、造血細胞、形質転換細胞系、および悪性腫瘍からの細胞を用いて作製できる。
【００２８】
本明細書に用いられる用語の「培養培地("culture media")」および「細胞培養培地("cell culture media")」とは、インビトロでの細胞の増殖（すなわち、細胞培養物）を支持する上で好適な培地を言う。例えば、この用語が、特定の培養培地に限定されることは意図されていない。該定義は、増殖培地ならびに維持培地を包含することが意図されている。実際、該用語は、対象の細胞培養物の増殖に好適な培養培地を包含することが意図されている。
【００２９】
本明細書に用いられる用語の「インビトロ("in vitro")」とは、人工的環境ならびに人工的環境内で生じる過程または反応を言う。インビトロ環境は、限定はしないが、試験管および細胞培養物によって例示される。
【００３０】
本明細書に用いられる用語の「インビボ("in vivo")」とは、自然環境（例えば動物または細胞）ならびに自然環境内で生じる過程または反応を言う。
【００３１】
本明細書に用いられる用語の「増殖("proliferation")」または「増加("growth")」は、交換可能に用いられ、細胞数の増加を言う。対照的に、「維持("maintenance")」は、細胞または細胞集団の継続的な生存を意味し、必ずしも細胞数の増加を伴う生存を意味しない。
【００３２】
本明細書に用いられる用語の「分化("differentiate")」およびその全ての形態とは、細胞が経る成熟過程であって、それによって、細胞が弁別的特長を発現し、および／または特定の機能を果たし、および／または分裂しにくくなる過程を言う。
【００３３】
本明細書に用いられる用語の「単離("isolate")」および「精製("purify")」、ならびにそれらの全ての形態とは、サンプルから少なくとも１種の不純物（タンパク質および／または核酸配列）の量を減少させることを言う。したがって、精製は、サンプル中の所望のタンパク質および／または核酸配列の量の「濃縮("enrichment")」（すなわち、増加）をもたらす。
【００３４】
本明細書に用いられる用語の「アミノ酸配列("amino acid sequence")」とは、天然の、または人工のタンパク質分子のアミノ酸配列を言う。「アミノ酸配列」および「ポリペプチド("polypeptide")」、「ペプチド("peptide")」、または「タンパク質("protein")」などの同様な用語は、そのアミノ酸配列を、挙げられたタンパク質分子に関連した完全な天然アミノ酸配列に限定することを意味しない。
【００３５】
本明細書に用いられる用語の「受容体タンパク質("receptor proteins")」および「膜受容体タンパク質("membrane receptor proteins")」とは、リガンド（例えば、ｇｐ１３０、微生物分子；ＬＰＳ、ＬＴＡなどのエンドトキシン；ｄｓＲＮＡなど）に結合する膜全域のタンパク質、またはその一部を言う。
【００３６】
本明細書に用いられる用語の「リガンド("ligand")」とは、第２の分子に結合する分子を言う。ある特定の分子は、リガンドか第２の分子かのいずれか、または双方を言うことができる。第２の分子の例としては、該リガンドの受容体、該リガンドに結合する抗体が挙げられる。
【００３７】
本明細書に用いられる用語の「活性化("activating")」は、生化学的応答（キナーゼ活性など）および／または細胞応答（細胞増殖など）に関する場合、生化学的応答および／または細胞応答の増加を言う。本明細書に用いられる用語の「活性化された」とは、細胞に関する場合、細胞の生理を変化させ、それを生物学的に応答させる方向へ移行させ、生物学的に「活性」になり、したがって、「活性化された」応答を受けた細胞を言う。例えば、単球は活性化されてマクロファージへと成熟する。他に、例えばマクロファージは、エンドトキシン（ＬＰＳなど）と接触すると活性化され、該活性化マクロファージは、活性化に関連した分子（例えば、ｉＮＯＳ、ＭＭＰ−１２メタロエラスターゼなど）の濃度増加および／またはタイプを産生し得る。他の例では、未熟樹状細胞が活性化されて、機能的な樹状細胞へと成熟する。「活性化された」細胞は、増加または増殖を経ることはあり得るが、必ずしもそうであるとは限らない。
【００３８】
本明細書に用いられる用語の「天然("naturally occurring")」、「野生型("wild-type")」、および「ｗｔ」は、分子または組成物（ヌクレオチド配列、アミノ酸配列、細胞、アポトーシスブレブ、外部ホスファチジルセリンなど）に適用される場合、該分子または組成物を天然に見出すことができ、人によって意図的に改変されていないことを意味する。例えば、天然のポリペプチド配列とは、ポリペプチド配列が人によって意図的に改変されていない、天然の供給源から単離できる生物に存在するポリペプチド配列を言う。
【００３９】
本明細書に用いられる用語の「に由来する("derived from")」および「から確立した("established from")」とは、本明細書に開示された細胞に関する場合、限定はしないが、ウィルスによる感染、ＤＮＡ配列のトランスフェクション、例えば、化学物質、放射線などを用いる処理および／または変異誘発、培養親細胞に含有されるいずれかの細胞の選択（連続培養などにより）など、いずれかの操作を用いて、直系卑属における親細胞から得られた（例えば、単離、精製などされた）細胞を言う。誘導細胞は、成長因子、サイトカイン、サイトカイン処理の選択進行、接着、接着欠損、分別処理などに対する応答によって、混合集団から選択できる。
【００４０】
本明細書に用いられる用語の「生物学的に活性("biologically active")」とは、インビボで構造的、調節性、および／または生化学的機能を有する分子（例えば、ペプチド、核酸配列、炭水化物分子、有機または無機分子など）を言う。
【００４１】
分子の濃度および／または現象に関して、別に定義されない限り、用語の「減少させる"reduce"」、「阻害する("inhibit")」、「減少させる("diminish")」、「抑制する("suppress")」、「減少する("decrease")」、およびそれらの全ての形態は、第２のサンプルに対して、第１のサンプルにおけるいずれかの分子の濃度（例えば、タンパク質、核酸配列、タンパク質配列、増殖、分化速度など）、現象（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用、触媒活性、アポト−シス、細胞死、細胞生存、細胞増殖、細胞分化、カスパーゼ開裂、受容体二量化、受容体複合体形成、ＤＮＡ断片化、分子転位、分子への結合、核酸配列の発現、核酸配列の転写、酵素活性など）に関して、第１のサンプルにおける分子の量および／または現象が、検出可能な量で、第２のサンプルにおけるものよりも低いことを意味する。
【００４２】
分子の濃度および／または現象に関して、別に定義されない限り、用語の「増加させる("increase")」、「上昇させる("elevate")」、「上げる("raise")」、およびそれらの全ての形態は、第２のサンプルに対して、第１のサンプルにおけるいずれかの分子の濃度（例えば、タンパク質、核酸配列、タンパク質配列、増殖、分化速度など）、現象（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用、触媒活性、アポト−シス、細胞死、細胞生存、細胞増殖、細胞分化、カスパーゼ開裂、受容体二量化、受容体複合体形成、ＤＮＡ断片化、分子転位、分子への結合、核酸配列の発現、核酸配列の転写、酵素活性など）に関して、第１のサンプルにおける分子の量および／または現象が、業界で認められた統計的解析法を用いて、統計的に有意な量で、第２のサンプルにおけるものよりも高いことを意味する。
【００４３】
本明細書に用いられる用語の「アポトーシス("apoptosis")」とは、後生動物細胞において、内因性の細胞自殺プログラムの活性化に続いて生じる非壊死的死の過程を言う。アポトーシスは、後生動物の適切な発生およびホメオスタシスにおいて正常な過程であり、通常、細胞死に至る。また、アポトーシスは、微生物感染によって病態的に引き起こされ、アポトーシスに対する感受性の増大および／または完全死をもたらす。アポトーシスは連続的、特徴的な形態学的および生物学的変化を含む。アポトーシスの初期のマーカーの１つは、形質膜ホスファチジルセリンの、内側から外側への反転であり、形質膜の「ゼイオーシス（ｚｅｉｏｓｉｓ）」と呼ばれる小胞形成を伴い、アポトーシス体として、ＲＮＡおよびＤＮＡなどの細胞物質を含有する小胞を放出する。アポトーシス時、細胞拡張に続いて、アポトーシス体の放出による縮化および細胞の溶解、核の崩壊、および内因性ヌクレアーゼの活性化による一定のヌクレオソーム内部位における核染色体の断片化がある。アポトーシス体は、典型的には、他の細胞、特に、単球、マクロファージ、未熟樹状細胞などの免疫細胞によって貪食される。アポトーシスを受ける能力の低下によって、細胞増殖の増加を必ずしも必要とせずに（含んでもよいが）、細胞生存率の増加がもたらされることを、当業者は認識している。したがって、本明細書に用いられる用語の「アポトーシスを減少させる("reduce apoptosis")」と「生存率を増加させる("increase survival")」は等価である。同様に、本明細書に用いられる用語の「アポトーシスを増加させる("increase apoptosis")」と「減少させた生存率(" reduced survival")」は等価である。
【００４４】
本明細書に用いられる用語の「細胞応答("cellular response")」とは、細胞による活性の増加または減少を言う。例えば「細胞応答」は、限定はしないが、アポトーシス、死、ＤＮＡ断片化、小胞形成、増殖、分化、接着、移入、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成、遺伝子の転写および翻訳および／またはこのような過程のサイトカイン分泌または停止を構成し得る。「細胞応答」は、脱リン酸化、リン酸化、カルシウム流出、標的分子開裂、タンパク質−タンパク質相互作用、核酸−核酸相互作用、および／またはタンパク質／核酸相互作用などの増加または減少を含み得る。本明細書に用いられる用語の「標的分子開裂("target molecule cleavage")」とは、分子の割裂（例えば、アポトーシスの過程、プロカスパーゼの断片への開裂、予想できるサイズの断片へのＤＮＡの開裂などにおける）を言う。本明細書に用いられる用語の「相互作用」は、２種以上の分子の互いに対する相互的な作用または影響を言う。
【００４５】
本明細書に用いられる用語の「遺伝子導入("transgenic")」は、細胞に関して用いられる場合、導入遺伝子を含有した、または導入遺伝子の導入によってそのゲノムが変化した細胞を言う。本明細書に用いられる用語の「遺伝子導入」は、組織に関して用いられる場合、導入遺伝子を含有した、または導入遺伝子の導入によってそのゲノムが変化した１種または複数種の細胞を含む組織を言う。遺伝子導入細胞および遺伝子導入組織は、当業者に公知のものなどの人の介入によって、核酸（通常はＤＮＡ）を含んでなる「導入遺伝子」を標的細胞内へ導入すること、または導入遺伝子を標的細胞の染色体内へ組み込むことなど、いくつかの方法によって作製できる。
【００４６】
本明細書に用いられる用語の「導入遺伝子（"transgene"）」は、実験的操作によって細胞内へ導入される任意の核酸配列を言う。導入遺伝子は、「内在性ＤＮＡ配列("endogenous DNA sequence")」または「異種ＤＮＡ配列("heterologous DNA sequence")」（すなわち、「外来ＤＮＡ("foreign DNA")」）であり得る。用語の「内在性ＤＮＡ配列」とは、それが、天然の配列に比較して、何らかの改変（例えば、点変異、選択性マーカー遺伝子の存在など）を含有しない限り、それが導入される細胞内に天然に見られるヌクレオチド配列を言う。用語の「異種ＤＮＡ配列」とは、天然では結合しない、または天然とは異なる位置に結合する核酸配列に結合する、または結合するように操作されるヌクレオチド配列を言う。異種ＤＮＡは、それが導入される細胞にとって内在性でなく、他の細胞から得たものである。また、異種ＤＮＡには、何らかの改変を含有する内在性ＤＮＡ配列も含まれる。一般に、しかし、必ずしもそうとは限らないが、異種ＤＮＡは、それが発現される細胞によって、通常は産生されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。異種ＤＮＡの例としては、レポーター遺伝子、転写および翻訳調節配列、選択性マーカータンパク質（例えば、薬物耐性を与えるタンパク質）などが挙げられる。
【００４７】
本明細書に用いられる用語の「試剤("agent")」、「試験試剤("test agent")」、「分子("molecule")」、「試験分子("test molecule")」、「化合物("compound")」、および「試験化合物("test compound")」は、本明細書において交換可能に用いられ、任意の出所（例えば、植物、動物、原生生物、および環境源など）から得られたか、または任意の方法（例えば、天然分子の精製、化学合成、および遺伝子工学法など）により調製された任意のタイプの分子（例えば、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、有機分子、および無機分子など）任意の組み合わせ分子、例えば糖脂質など）を言う。したがって、これらの用語は、「物質("substance")」という用語と同義である。一実施形態において、用語の「試験試剤」とは、疾患、疾病、病態または身体機能の障害を治療または予防するために使用できる任意の化学物質、薬剤、薬物などを言う。試験試剤は、公知の治療薬と潜在的治療薬との双方を含む。試験試剤は、本発明のスクリーニング法を用いたスクリーニングによって治療用であることを判定できる。「公知の治療薬」とは、このような治療および予防に効果的であることが示された（動物試験またはヒトへの投与による先行経験により）治療薬を言う。言い替えると、公知の治療薬は、疾患（例えば癌）の治療に有効である試剤に限定されない。試剤の例としては、限定はしないが、抗体、リボザイム配列などの核酸配列、および本明細書にさらに記載されている他の試剤が挙げられる。本発明の方法によって同定される、および／または本発明の方法に使用される試験試剤としては、任意の出所（例えば、植物、動物、および環境源など）から得られたか、または任意の方法（例えば、天然分子の精製、化学合成、および遺伝子工学法など）により調製された任意のタイプの分子（例えば、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、有機分子、および無機分子など）が挙げられる。
【００４８】
別に示されない限り、「正確に("exactly")」、「精密に("precisely")」、または他の等価な用語により、本明細書に用いられる分子量、反応条件などの成分の量、性質を表す数字は全て、全ての場合に、用語の「約」に変更されるものとして認識すべきであり、したがって、当然、実際に挙げられている数字の１０％超または未満までの変更が含まれる。したがって、逆の指示がない限り、本明細書における数値パラメータは、本発明により得られることが求められている所望の性質に依って、変化し得る近似値である。いずれにせよ、各数値パラメータは少なくとも、報告された有意位数の数を考慮に入れ、また、通常の切捨て法を適用して解釈すべきである。本発明の広範囲に記載されている数値範囲および数値パラメータは近似値ではあるが、特定例における数値は、可能な限り精密に報告されている。しかし、いずれの数値も当然、数値の試験測定において見出される誤差から必然的に生じる標準偏差を含む。
【００４９】
本明細書に用いられる用語の「変更する("alter")」およびその形態は全て、任意の分子（例えば、核酸配列、タンパク質配列、アポトーシス小胞、外部ホスファチジルセリンなど）の濃度、および／または現象（例えば、アポト−シス、細胞死、細胞生存、細胞増殖、カスパーゼ開裂、受容体二量化、受容体複合体形成、ＤＮＡ断片化、分子転位、分子への結合、核酸配列の発現、核酸配列の転写、酵素活性など）に関して、量が客観的に判定されるか、および／または主観的に判定されるかに関わりなく、該分子の量および／または現象の増加または減少を言う。
【００５０】
具体的に呼称された任意のタンパク質（アクチビンＡポリペプチド、ＫＧＦなど）に対する本明細書における言及は、何らかの方法によって検出可能な生物学的活性（本明細書に開示された）の少なくとも１つを有する具体的に呼称されたタンパク質のいずれかの、および全ての等価断片、融合蛋白質、および変異体を言う。したがって、タンパク質の呼称は、本明細書に総称されているタンパク質の特定形態を含めて、そのタンパク質の全ての形態を含む。
【００５１】
用語の「断片("fragment")」とは、タンパク質（アクチビンＡポリペプチド、ＫＧＦなど）に関する場合、４つの連続アミノ酸残基から、アミノ酸残基全体から１つのアミノ酸残基を引いた範囲までのサイズであり得る、そのタンパク質の一部を言う。したがって、「少なくともアミノ酸配列の一部」を含んでなるポリペプチド配列は、「断片」と同等であり、該アミノ酸配列の４つの連続アミノ酸残基からアミノ酸配列全体を含んでなる。
【００５２】
本明細書に用いられる用語の「変異体（"variant"）」および「相同体（"homolog"）」（アクチビンＡポリペプチド、ＫＧＦなど）は、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換によって、参照タンパク質と異なるタンパク質を言い、該挿入、欠失、および／または置換は、該参照タンパク質の主要な生物学的機能を変化させないことが好ましい。変異体および相同体としては、参照タンパク質と共通の構造的および機能的特徴を有しているが、異なる種のタンパク質が挙げられる。複数の実施形態において、置換は、１つまたは複数のアミノ酸の保存された変換である。アミノ酸の「保存的置換（"conservative substitution"）」という用語は、そのアミノ酸を、同様の疎水性、極性、および／または構造を有する他のアミノ酸に置き換えることを言う。例えば、中性の側鎖を有する以下の脂肪族アミノ酸は、他のアミノ酸に保存的に置換できるアミノ酸である：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、およびトレオニン。他のアミノ酸に保存的に置換できる、中性の側鎖を有する芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンが挙げられる。システインおよびメチオニンは、他のアミノ酸に保存的に置換できる、イオウ含有アミノ酸である。また、アスパラギンは、グルタミンに保存的に置換でき、その逆もあり得る。双方のアミノ酸とも、ジカルボン酸アミノ酸のアミドだからである。また、アスパラギン酸（アスパルテート）はグルタミン酸（グルタメート）に保存的に置換できる。双方とも酸性の、荷電した（親水性）アミノ酸だからである。また、リジン、アルギニン、およびヒスチジンは、各々、塩基性の、荷電した（親水性）アミノ酸であるため、互いに保存的に置換できる。生物学的および／または免疫学的活性を失わせることなく、どんな、また、どのくらい多くのアミノ酸残基を置換、挿入または欠失できるかを判定する指針は、当業界に良く知られたコンピュータプログラム、例えば、ＤＮＡＳｔａｒ（商標）ソフトウェアを用いて見出すことができる。したがって、ＴＧＦβファミリーおよびＦＧＦファミリーのメンバーなど、タンパク質ファミリーのメンバーは、該ファミリーの他のメンバーの変異体および相同体を含有する。
【００５３】
「ＴＧＦβファミリー」は、公知のＴＧＦβファミリーメンバーの構造的および機能的特徴を有するタンパク質を意味する。タンパク質のＴＧＦβファミリーは、構造的側面と機能的側面の双方から十分に特性化されている。それには、ＴＧＦβタンパク質系、インヒビン類（インヒビンＡおよびインヒビンＢなど）、アクチビン類（アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢなど）、ＭＩＳ（ミュラー抑制物質）、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）、ｄｐｐ（デカペンタプレジック）、Ｖｇ−１、ＭＮＳＦ（モノクローナル非特異的抑制因子）、および他のものが含まれる。ＴＧＦβファミリーメンバーの十分に特性化された種々の活性のうちで、ＴＧＦβは、通常の、および形質転換された上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、リンパ系細胞、および他の造血細胞タイプにとって、最も強力な成長因子であると考えられている。このタンパク質ファミリーの活性は、種々の細胞タイプ上の一定の受容体に対する特異的結合に基づいている。このファミリーのメンバーでは、配列の同一性、特にそれらの機能に関連するＣ末端における配列同一性の領域を共有している。ＴＧＦβファミリーには、アミノ酸配列同一性の少なくとも１つの領域を全てが共有している１００以上の異なるタンパク質が含まれる。
【００５４】
該ファミリーのメンバーとしては、限定はしないが、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号によって同定されるタンパク質が挙げられる：Ｐ０７９９５、Ｐ１８３３１、Ｐ０８４７６、Ｑ０４９９８、Ｐ０３９７０、Ｐ４３０３２、Ｐ５５１０２、Ｐ２７０９２、Ｐ４２９１７、Ｐ０９５２９、Ｐ２７０９３、Ｐ０４０８８、Ｑ０４９９９、Ｐ１７４９１、Ｐ５５１０４、Ｑ９ＷＵＫ５、Ｐ５５１０３、Ｏ８８９５９、Ｏ０８７１７、Ｐ５８１６６、Ｏ６１６４３、Ｐ３５６２１、Ｐ０９５３４、Ｐ４８９７０、Ｑ９ＮＲ２３、Ｐ２５７０３、Ｐ３０８８４、Ｐ１２６４３、Ｐ４９００１、Ｐ２１２７４、Ｏ４６５６４、Ｏ１９００６、Ｐ２２００４、Ｐ２０７２２、Ｑ０４９０６、Ｑ０７１０４、Ｐ３０８８６、Ｐ１８０７５、Ｐ２３３５９、Ｐ２２００３、Ｐ３４８２１、Ｐ４９００３、Ｑ９０７５１、Ｐ２１２７５、Ｑ０６８２６、Ｐ３０８８５、Ｐ３４８２０、Ｑ２９６０７、Ｐ１２６４４、Ｑ９０７５２、Ｏ４６５７６、Ｐ２７５３９、Ｐ４８９６９、Ｑ２６９７４、Ｐ０７７１３、Ｐ９１７０６、Ｐ９１６９９、Ｐ２７０９１、Ｏ４２２２２、Ｑ２４７３５、Ｐ２０８６３、Ｏ１８８２８、Ｐ５５１０６、Ｑ９ＰＴＱ２、Ｏ１４７９３、Ｏ０８６８９、Ｏ４２２２１、Ｏ１８８３０、Ｏ１８８３１、Ｏ１８８３６、Ｏ３５３１２、Ｏ４２２２０、Ｐ４３０２６、Ｐ４３０２７、Ｐ４３０２９、Ｏ９５３９０、Ｑ９Ｒ２２９、Ｏ９３４４９、Ｑ９Ｚ１Ｗ４、Ｑ９ＢＤＷ８、Ｐ４３０２８、Ｑ７Ｚ４Ｐ５、Ｐ５０４１４、Ｐ１７２４６、Ｐ５４８３１、Ｐ０４２０２、Ｐ０１１３７、Ｐ０９５３３、Ｐ１８３４１、Ｏ１９０１１、Ｑ９Ｚ１Ｙ６、Ｐ０７２００、Ｑ９Ｚ２１７、０９５３９３、Ｐ５５１０５、Ｐ３０３７１、Ｑ９ＭＺＥ２、Ｑ０７２５８、Ｑ９６Ｓ４２、Ｐ９７７３７、ＡＡＡ９７４１５．１、ＮＰ＿７７６７８８．１、ＮＰ＿０５８８２４．１、ＥＡＬ２４００１．１、１Ｓ４Ｙ、ＮＰ＿００１００９８５６．１、ＮＰ＿０３２４０６．１、ＮＰ＿９９９１９３．１、ＸＰ＿５１９０６３．１、ＡＡＧ１７２６０．１、ＣＡＡ４０８０６．１、ＮＰ＿００１００９４５８．１、ＡＡＱ５５８０８．１、ＡＡＫ４０３４１．１、ＡＡＰ３３０１９．１、ＡＡＫ２１２６５．１、ＡＡＣ５９７３８．１、ＣＡＩ４６００３．１、Ｂ４０９０５、ＡＡＱ５５８１１．１、ＡＡＫ４０３４２．１、ＸＰ＿５４０３６４．１、Ｐ５５１０２、ＡＡＱ５５８１０．１、ＮＰ＿９９０７２７．１、ＣＡＡ５１１６３．１、ＡＡＤ５０４４８．１、ＪＣ４８６２、ＰＮ０５０４、ＢＡＢ１７６００．１、ＡＡＨ５６７４２．１、ＢＡＢ１７５９６．１、ＣＡＧ０６１８３．１、ＣＡＧ０５３３９．１、ＢＡＢ１７６０１．１、ＣＡＢ４３０９１．１、Ａ３６１９２、ＡＡＡ４９１６２．１、ＡＡＴ４２２００．１、ＮＰ＿７８９８２２．１、ＡＡＡ５９４５１．１、ＡＡＡ５９１６９．１、ＸＰ＿５４１０００．１、ＮＰ＿９９０５３７．１、ＮＰ＿００２１８４．１、ＡＡＣ１４１８７．１、ＡＡＰ８３３１９．１、ＡＡＡ５９１７０．１、ＢＡＢ１６９７３．１、ＡＡＭ６６７６６．１、ＷＦＰＧＢＢ、１２０１２７８Ｃ、ＡＡＨ３００２９．１、ＣＡＡ４９３２６．１、ＸＰ＿３４４１３１．１、ＡＡＨ４８８４５．１、ＸＰ＿１４８９６６．３、Ｉ４８２３５、Ｂ４１３９８、ＡＡＨ７７８５７．１、ＡＡＢ２６８６３．１、１７０６３２７Ａ、ＢＡＡ８３８０４．１、ＮＰ＿５７１１４３．１、ＣＡＧ００８５８．１、ＢＡＢ１７５９９．１、ＢＡＢ１７６０２．１、ＡＡＢ６１４６８．１、ＰＮ０５０５、ＰＮ０５０６、ＣＡＢ４３０９２．１、ＢＡＢ１７５９８．１、ＢＡＡ２２５７０．１、ＢＡＢ１６９７２．１、ＢＡＣ８１６７２．１、ＢＡＡ１２６９４．１、ＢＡＡ０８４９４．１、Ｂ３６１９２、Ｃ３６１９２、ＢＡＢ１６９７１．１、ＮＰ＿０３４６９５．１、ＡＡＡ４９１６０．１、ＣＡＡ６２３４７．１、ＡＡＡ４９１６１．１、ＡＡＤ３０１３２．１、ＣＡＡ５８２９０．１、ＮＰ＿００５５２９．１、ＸＰ＿５２２４４３．１、ＡＡＭ２７４４８．１、ＸＰ＿５３８２４７．１、ＡＡＤ３０１３３．１、ＡＡＣ３６７４１．１、ＡＡＨ１０４０４．１、ＮＰ＿０３２４０８．１、ＡＡＮ０３６８２．１、ＸＰ＿５０９１６１．１、ＡＡＣ３２３１１．１、ＮＰ＿６５１９４２．２、ＡＡＬ５１００５．１、ＡＡＣ３９０８３．１、ＡＡＨ８５５４７．１、ＮＰ＿５７１０２３．１、ＣＡＦ９４１１３．１、ＥＡＬ２９２４７．１、ＡＡＷ３０００７．１、ＡＡＨ９０２３２．１、Ａ２９６１９、ＮＰ＿００１００７９０５．１、ＡＡＨ７３５０８．１、ＡＡＤ０２２０１．１、ＮＰ＿９９９７９３．１、ＮＰ＿９９０５４２．１、ＡＡＦ１９８４１．１、ＡＡＣ９７４８８．１、ＡＡＣ６００３８．１、ＮＰ＿９８９１９７．１、ＮＰ＿５７１４３４．１、ＥＡＬ４１２２９．１、ＡＡＴ０７３０２．１、ＣＡＩ１９４７２．１、ＮＰ＿０３１５８２．１、ＡＡＡ４０５４８．１、ＸＰ＿５３５８８０．１、ＮＰ＿０３７２３９．１、ＡＡＴ７２００７．１、ＸＰ＿４１８９５６．１、ＣＡＡ４１６３４．１、ＢＡＣ３０８６４．１、ＣＡＡ３８８５０．１、ＣＡＢ８１６５７．２、ＣＡＡ４５０１８．１、ＣＡＡ４５０１９．１、ＢＡＣ２８２４７．１、ＮＰ＿０３１５８１．１、ＮＰ＿９９０４７９．１、ＮＰ＿９９９８２０．１、ＡＡＢ２７３３５．１、Ｓ４５３５５、ＣＡＢ８２００７．１、ＸＰ＿５３４３５１．１、ＮＰ＿０５８８７４．１、ＮＰ＿０３１５７９．１、１ＲＥＷ、ＡＡＢ９６７８５．１、ＡＡＢ４６３６７．１、ＣＡＡ０５０３３．１、ＢＡＡ８９０１２．１、１ＥＳ７、ＡＡＰ２０８７０．１、ＢＡＣ２４０８７．１、ＡＡＧ０９７８４．１、ＢＡＣ０６３５２．１、ＡＡＱ８９２３４．１、ＡＡＭ２７０００．１、ＡＡＨ３０９５９．１、ＣＡＧ０１４９１．１、ＮＰ＿５７１４３５．１、１ＲＥＵ、ＡＡＣ６０２８６．１、ＢＡＡ２４４０６．１、Ａ３６１９３、ＡＡＨ５５９５９．１、ＡＡＨ５４６４７．１、ＡＡＨ９０６８９．１、ＣＡＧ０９４２２．１、ＢＡＤ１６７４３．１、ＮＰ＿０３２１３４．１、ＸＰ＿５３２１７９．１、ＡＡＢ２４８７６．１、ＡＡＨ５７７０２．１、ＡＡＡ８２６１６．１、ＣＡＡ４０２２２．１、ＣＡＢ９０２７３．２、ＸＰ＿３４２５９２．１、ＸＰ＿５３４８９６．１、ＸＰ＿５３４４６２．１、１ＬＸＩ、ＸＰ＿４１７４９６．１、ＡＡＦ３４１７９．１、ＡＡＬ７３１８８．１、ＣＡＦ９６２６６．１、ＡＡＢ３４２２６．１、ＡＡＢ３３８４６．１、ＡＡＴ１２４１５．１、ＡＡＯ３３８１９．１、ＡＡＴ７２００８．１、ＡＡＤ３８４０２．１、ＢＡＢ６８３９６．１、ＣＡＡ４５０２１．１、ＡＡＢ２７３３７．１、ＡＡＰ６９９１７．１、ＡＡＴ１２４１６．１、ＮＰ＿５７１３９６．１、ＣＡＡ５３５１３．１、ＡＡＯ３３８２０．１、ＡＡＡ４８５６８．１、ＢＡＣ０２６０５．１、ＢＡＣ０２６０４．１、ＢＡＣ０２６０３．１、ＢＡＣ０２６０２．１、ＢＡＣ０２６０１．１、ＢＡＣ０２５９９．１、ＢＡＣ０２５９８．１、ＢＡＣ０２５９７．１、ＢＡＣ０２５９５．１、ＢＡＣ０２５９３．１、ＢＡＣ０２５９２．１、ＢＡＣ０２５９０．１、ＡＡＤ２８０３９．１、ＡＡＰ７４５６０．１、ＡＡＢ９４７８６．１、ＮＰ＿００１４８３．２、ＸＰ＿５２８１９５．１、ＮＰ＿５７１４１７．１、ＮＰ＿００１００１５５７．１、ＡＡＨ４３２２２．１、ＡＡＭ３３１４３．１、ＣＡＧ１０３８１．１、ＢＡＡ３１１３２．１、ＥＡＬ３９６８０．１、ＥＡＡ１２４８２．２、Ｐ３４８２０、ＡＡＰ８８９７２．１、ＡＡＰ７４５５９．１、ＣＡＩ１６４１８．１、ＡＡＤ３０５３８．１、ＸＰ＿３４５５０２．１、ＮＰ＿０３８５５４．１、ＣＡＧ０４０８９．１、ＣＡＤ６０９３６．２、ＮＰ＿０３１５８４．１、Ｂ５５４５２、ＡＡＣ６０２８５．１、ＢＡＡ０６４１０．１、ＡＡＨ５２８４６．１、ＮＰ＿０３１５８０．１、ＮＰ＿０３６９５９．１、ＣＡＡ４５８３６．１、ＣＡＡ４５０２０．１、Ｑ２９６０７、ＡＡＢ２７３３６．１、ＸＰ＿５４７８１７．１、ＡＡＴ１２４１４．１、ＡＡＭ５４０４９．１、ＡＡＨ７８９０１．１、ＡＡＯ２５７４５．１、ＮＰ＿５７０９１２．１、ＸＰ＿３９２１９４．１、ＡＡＤ２０８２９．１、ＡＡＣ９７１１３．１、ＡＡＣ６１６９４．１、ＡＡＨ６０３４０．１、ＡＡＲ９７９０６．１、ＢＡＡ３２２２７．１、ＢＡＢ６８３９５．１、ＢＡＣ０２８９５．１、ＡＡＷ５１４５１．１、ＡＡＦ８２１８８．１、ＸＰ＿５４４１８９．１、ＮＰ＿９９０５６８．１、ＢＡＣ８０２１１．１、ＡＡＷ８２６２０．１、ＡＡＦ９９５９７．１、ＮＰ＿５７１０６２．１、ＣＡＣ４４１７９．１、ＡＡＢ９７４６７．１、ＡＡＴ９９３０３．１、ＡＡＤ２８０３８．１、ＡＡＨ５２１６８．１、ＮＰ＿００１００４１２２．１、ＣＡＡ７２７３３．１、ＮＰ＿０３２１３３．２、ＸＰ＿３９４２５２．１、ＸＰ＿２２４７３３．２、ＪＨ０８０１、ＡＡＰ９７７２１．１、ＮＰ＿９８９６６９．１、Ｓ４３２９６、Ｐ４３０２９、Ａ５５４５２、ＡＨ３２４９５．１、ＸＰ＿５４２９７４．１、ＮＰ＿０３２１３５．１、ＡＡＫ３０８４２．１、ＡＡＫ２７７９４．１、ＢＡＣ３０８４７．１、ＥＡＡ１２０６４．２、ＡＡＰ９７７２０．１、ＸＰ＿５２５７０４．１、ＡＡＴ０７３０１．１、ＢＡＤ０７０１４．１、ＣＡＦ９４３５６．１、ＡＡＲ２７５８１．１、ＡＡＧ１３４００．１、ＡＡＣ６０１２７．１、ＣＡＦ９２０５５．１、ＸＰ＿５４０１０３．１、ＡＡＯ２０８９５．１、ＣＡＦ９７４４７．１、ＡＡＳ０１７６４．１、ＢＡＤ０８３１９．１、ＣＡＡ１０２６８．１、ＮＰ＿９９８１４０．１、ＡＡＲ０３８２４．１、ＡＡＳ４８４０５．１、ＡＡＳ４８４０３．１、ＡＡＫ５３５４５．１、ＡＡＫ８４６６６．１、ＸＰ＿３９５４２０．１、ＡＡＫ５６９４１．１、ＡＡＣ４７５５５．１、ＡＡＲ８８２５５．１、ＥＡＬ３３０３６．１、ＡＡＷ４７７４０．１、ＡＡＷ２９４４２．１、ＮＰ＿７２２８１３．１、ＡＡＲ０８９０１．１、ＡＡＯ１５４２０．２、ＣＡＣ５９７００．１、ＡＡＬ２６８８６．１、ＡＡＫ７１７０８．１、ＡＡＫ７１７０７．１、ＣＡＣ５１４２７．２、ＡＡＫ６７９８４．１、ＡＡＫ６７９８３．１、ＡＡＫ２８７０６．１、Ｐ０７７１３、Ｐ９１７０６、Ｐ９１６９９、ＣＡＧ０２４５０．１、ＡＡＣ４７５５２．１、ＮＰ＿００５８０２．１、ＸＰ＿３４３１４９．１、ＡＷ３４０５５．１、ＸＰ＿５３８２２１．１、ＡＡＲ２７５８０．１、ＸＰ＿１２５９３５．３、ＡＡＦ２１６３３．１、ＡＡＦ２１６３０．１、ＡＡＤ０５２６７．１、Ｑ９Ｚ１Ｗ４、ＮＰ＿０３１５８５．２、ＮＰ＿５７１０９４．１、ＣＡＤ４３４３９．１、ＣＡＦ９９２１７．１、ＣＡＢ６３５８４．１、ＮＰ＿７２２８４０．１、ＣＡＥ４６４０７．１、
【００５５】
ＸＰ＿４１７６６７．１、ＢＡＣ５３９８９．１、ＢＡＢ１９６５９．１、ＡＡＭ４６９２２．１、ＡＡＡ８１１６９．１、ＡＡＫ２８７０７．１、ＡＡＬ０５９４３．１、ＡＡＢ１７５７３．１、ＣＡＨ２５４４３．１、ＣＡＧ１０２６９．１、ＢＡＤ１６７３１．１、ＥＡＡ００２７６．２、ＡＡＴ０７３２０．１、ＡＡＴ０７３００．１、ＡＡＮ１５０３７．１、ＣＡＨ２５４４２．１、ＡＡＫ０８１５２．２、２００９３８８Ａ、ＡＡＲ１２１６１．１、ＣＡＧ０１９６１．１、ＣＡＢ６３６５６．１、ＣＡＤ６７７１４．１、ＣＡＦ９４１６２．１、ＮＰ＿４７７３４０．１、ＥＡＬ２４７９２．１、ＮＰ＿００１００９４２８．１、ＡＡＢ８６６８６．１、ＡＡＴ４０５７２．１、ＡＡＴ４０５７１．１、ＡＡＴ４０５６９．１、ＮＰ＿０３３８８６．１、ＡＡＢ４９９８５．１、ＡＡＧ３９２６６．１、Ｑ２６９７４、ＡＡＣ７７４６１．１、ＡＡＣ４７２６２．１、ＢＡＣ０５５０９．１、ＮＰ＿０５５２９７．１、ＸＰ＿５４６１４６．１、ＸＰ＿５２５７７２．１、ＮＰ＿０６０５２５．２、ＡＡＨ３３５８５．１、ＡＡＨ６９０８０．１、ＣＡＧ１２７５１．１、ＡＡＨ７４７５７．２、ＮＰ＿０３４９６４．１、ＮＰ＿０３８６３９．１、Ｏ４２２２１、ＡＡＦ０２７７３．１、ＮＰ＿０６２０２４．１、ＡＡＲ１８２４４．１、ＡＡＲ１４３４３．１、ＸＰ＿２２８２８５．２、ＡＡＴ４０５７３．１、ＡＡＴ９４４５６．１、ＡＡＬ３５２７８．１、ＡＡＬ３５２７７．１、ＡＡＬ１７６４０．１、ＡＡＣ０８０３５．１、ＡＡＢ８６６９２．１、ＣＡＢ４０８４４．１、ＢＡＣ３８６３７．１、ＢＡＢ１６０４６．１、ＡＡＮ６３５２２．１、ＮＰ＿５７１０４１．１、ＡＡＢ０４９８６．２、ＡＡＣ２６７９１．１、ＡＡＢ９５２５４．１、ＢＡＡ１１８３５．１、ＡＡＲ１８２４６．１、ＸＰ＿５３８５２８．１、ＢＡＡ３１８５３．１、ＡＡＫ１８０００．１、ＸＰ＿４２０５４０．１、ＡＡＬ３５２７６．１、ＡＡＱ９８６０２．１、ＣＡＥ７１９４４．１、ＡＡＷ５０５８５．１、ＡＡＶ６３９８２．１、ＡＡＷ２９９４１．１、ＡＡＮ８７８９０．１、ＡＡＴ４０５６８．１、ＣＡＤ５７７３０．１、ＡＡＢ８１５０８．１、ＡＡＳ００５３４．１、ＡＡＣ５９７３６．１、ＢＡＢ７９４９８．１、ＡＡＡ９７３９２．１、ＡＡＰ８５５２６．１、ＮＰ＿９９９６００．２、ＮＰ＿８７８２９３．１、ＢＡＣ８２６２９．１、ＣＡＣ６０２６８．１、ＣＡＧ０４９１９．１、ＡＡＮ１０１２３．１、ＣＡＡ０７７０７．１、ＡＡＫ２０９１２．１、ＡＡＲ８８２５４．１、ＣＡＣ３４６２９．１、ＡＡＬ３５２７５．１、ＡＡＤ４６９９７．１、ＡＡＮ０３８４２．１、ＮＰ＿５７１９５１．２、ＣＡＣ５０８８１．１、ＡＡＬ９９３６７．１、ＡＡＬ４９５０２．１、ＡＡＢ７１８３９．１、ＡＡＢ６５４１５．１、ＮＰ＿６２４３５９．１、ＮＰ＿９９０１５３．１、ＡＡＦ７８０６９．１、ＡＡＫ４９７９０．１、ＮＰ＿９１９３６７．２、ＮＰ＿００１１９２．１、ＸＰ＿５４４９４８．１、ＡＡＱ１８０１３．１、ＡＡＶ３８７３９．１、ＮＰ＿８５１２９８．１、ＣＡＡ６７６８５．１、ＡＡＴ６７１７１．１、ＡＡＴ３７５０２．１、ＡＡＤ２７８０４．１、ＡＡＮ７６６６５．１、ＢＡＣ１１９０９．１、ＸＰ＿４２１６４８．１、ＣＡＢ６３７０４．１、ＮＰ＿０３７３０６．１、Ａ５５７０６、ＡＡＦ０２７８０．１、ＣＡＧ０９６２３．１、ＮＰ＿０６７５８９．１、ＮＰ＿０３５７０７．１、ＡＡＶ３０５４７．１、ＡＡＰ４９８１７．１、ＢＡＣ７７４０７．１、ＡＡＬ８７１９９．１、ＣＡＧ０７１７２．１、Ｂ３６１９３、ＣＡＡ３３０２４．１、ＮＰ＿００１００９４００．１、ＡＡＰ３６５３８．１、ＸＰ＿５１２６８７．１、ＸＰ＿５１００８０．１、ＡＡＨ０５５１３．１、１ＫＴＺ、ＡＡＨ１４６９０．１、ＡＡＡ３１５２６．１。
【００５６】
「ＦＧＦファミリー」とは、公知のＦＧＦファミリーメンバーの構造的かつ機能的と特徴を有するタンパク質を意味する。タンパク質のＦＧＦファミリーは、構造的かつ機能的態様の双方を十分に特徴づけられる。タンパク質のＦＧＦファミリーは、特定のＦＧＦシリーズのタンパク質（ＦＧＦ１およびＦＧＦ２）、Ｋ−ＦＧＦ（カポジ肉腫に見られる）、およびＫＧＦタンパク質など、少なくとも２０の異なるメンバー（変異体および相同体を含まず）を含む。今日まで同定されているこのファミリーのメンバーは、３０〜７０％アミノ酸相同性を示す。
【００５７】
該ファミリーのメンバーとしては、限定はしないが、以下のＧｅｎＢａｎｋ登録番号により同定されているものが挙げられる：Ｐ２１７８１、Ｐ７９１５０、Ｐ４８８０８、Ｑ９Ｎ１９８、Ｐ３６３６３、Ｑ０２１９５、Ｐ７０４９２、Ｏ１５５２０、Ｏ３５５６５、Ｑ９ＥＳＳ２、Ｑ９ＨＣＴ０、Ｐ３６３６４、Ｐ５４１３０、Ｐ３１３７１、Ｏ４３３２０、Ｑ９１８７５、Ｑ９ＮＰ９５、Ｏ５４７６９、Ｐ４８８０１、Ｐ３６３８６、Ｐ０５５２４、Ｐ１１４８７、Ｐ４８８０２、Ｑ９２９１５、Ｐ１２０３４、Ｐ４８８０７、Ｐ１５６５６、Ｐ７０３７９、Ｐ４８８０６、Ｑ８Ｒ５Ｌ７、Ｐ４８８０５、Ｐ７０３７７、Ｐ４８８０４、Ｑ９２９１３、Ｐ６１３２９、Ｑ１１１８４、Ｐ１０７６７、Ｑ９２９１４、Ｐ２１６５８、Ｐ７０３７８、Ｐ０８６２０、Ｐ６１１４８、Ｑ６Ｉ６Ｍ７、Ｐ４８８００、Ｐ３４００４、Ｐ１５６５５、Ｐ１３１０９、Ｐ０９０３８、Ｐ４８８０３、Ｑ６ＰＢＴ８、Ｐ０５２３０、Ｐ０３９６９、Ｑ７ＳＩＦ８、Ｐ２０００３、Ｐ４８７９８、Ｐ１２２２６、Ｑ６ＧＬＲ６、Ｐ２０００２、Ｐ０３９６８、Ｑ７Ｍ３０３、Ｐ１９５９６、Ｑ６０４８７＿３、Ｑ６ＳＪＰ８、Ｐ４８７９９、Ｏ７６０９３、Ｏ８９１０１、Ｏ８８１８２、Ｐ１１４０３、Ｏ６０２５８、Ｐ６３０７５、Ｐ３７２３７、Ｑ９Ｎ１Ｓ８、Ｐ５５０７５、Ｑ９０７２２、Ｑ８０５Ｂ２、Ｏ３５６２２、Ｏ９５７５０、Ｑ９ＪＪＮ１、Ｑ９ＮＳＡ１、Ｑ９ＧＺＶ９、Ｐ４１４４４、Ｏ１０２８４、Ｑ９ＥＰＣ２、Ｑ８ＶＩ８２、Ｏ６２６８２、Ｑ９ＪＹＡ０、Ｑ９ＪＴ８２、Ｐ０１０３０＿３、ＮＰ＿００２０００．１、ＡＡＡ６７３３５．１、ＡＡＸ１９００３．１、ＮＰ＿００１００３２３７．１、ＮＰ＿００１００９２３５．１、ＮＰ＿０３２０３４．１、Ｓ２６０４９、ＡＡＦ２６７３４．１、ＢＡＣ３９７０７．１、ＮＰ＿０７１５１８．１、ＡＡＬ１６０５９．１、ＡＡＧ３１５９７．１、ＢＡＤ８４１６５．１、ＡＡＨ８８５３２．１、ＡＡＲ８７８７２．１、Ｂ４６２８９、Ｃ４６２８９、ＮＰ＿００１００７７６２．１、ＣＡＢ９０３９３．１、Ｄ４６２８９、ＮＰ＿００４４５６．１、ＸＰ＿５２６９３１．１、ＮＰ＿０３７０８３．１、ＢＡＢ６０７７９．１、ＡＡＭ４６９２６．１、ＣＡＧ４６４８９．１、ＮＰ＿０３２０２８．１、ＢＡＤ７４１２３．１、ＡＡＬ０５８７５．１、ＡＡＫ５９７００．１、ＮＰ＿００１００９２３０．１、ＡＡＲ３７４１３．１、ＮＰ＿９９００２７．１、ＣＡＢ７６３６８．１、ＣＡＤ２９１８２．１、ＡＡＣ７８７８９．１、ＣＡＧ０８５８６．１、ＮＰ＿８７８２９０．１、ＡＡＬ１６９５９．１、ＮＰ＿５７０１０７．１、ＮＰ＿０７５７９３．１、ＡＡＨ１０９５６．１、ＢＡＣ５７９７６．１、ＡＡＱ９３３５７．１、ＡＡＣ２５０９６．１、ＡＡＬ１６９６３．１、ＡＡＯ２５６１７．１、ＡＡＧ２９５０１．１、ＮＰ＿９８９７３０．１、ＮＰ＿９９８９６６．１、ＣＡＣ１７６９２．１、ＮＰ＿０３８５４６．１、ＮＰ＿０３７０８４．１、ＮＰ＿００３８５９．１、ＸＰ＿４２０３０４．１、ＮＰ＿０６８６３９．１、ＢＡＢ７１７２９．１、ＡＡＴ８５８０４．１、ＮＰ＿０８５１１７．１、ＣＡＦ９９０８１．１、ＮＰ＿０７６４５１．１、ＮＰ＿０８５１１３．１、ＢＡＣ３４８９２．１、ＣＡＦ９１０４４．１、ＸＰ＿４２６３３５．１、ＣＡＡ８７６３５．１、ＣＡＧ１３２６２．１、ＣＡＡ８０９８７．１、ＡＡＨ８１３６７．１、ＣＡＧ０１３７０．１、ＮＰ＿０３２０３３．１、ＮＰ＿５７０８３０．１、ＮＰ＿５７１３６６．１、ＮＰ＿００５２３８．１、ＡＡＣ０６１４８．１、ＢＡＣ２２０６９．１、ＸＰ＿５２９０４９．１、ＡＡＨ７６７２１．１、ＮＰ＿００１００１７４３．１、ＡＡＦ３１３９８．１、ＡＡＯ３３２９１．１、ＡＡＬ１６９５７．１、ＣＡＡ４４４８０．１、ＮＰ＿９９１２６５．１、ＡＡＮ１６０２５．１、ＡＡＢ１８９１８．１、ＣＡＩ１５７６８．１、ＮＰ＿０３４３３０．２、ＮＰ＿９９０１０８．１、ＮＰ＿４４５８８０．１、ＡＡＦ３１３９２．１、ＡＡＢ７１６０６．１、Ｐ７０３７９、ＸＰ＿５４２６５６．１、ＮＰ＿０７１５５９．２、ＮＰ＿９９７５５０．１、ＣＡＡ４４４７９．１、ＡＡＬ８３９０４．１、ＮＰ＿００１０１２３８２．１、ＮＰ＿００１００９５６１．１、ＡＡＷ６９５５１．１、ＡＡＮ０４０９７．１、ＴＶＨＵＦ５、ＮＰ＿００４４５５．１、Ｐ１２０３４、ＮＰ＿３７８６６８．１、ＮＰ＿００４１０５．１、ＡＡＨ８５４３９．１、ＣＡＩ４３１８９．１、ＣＡＩ４２７００．１、ＣＡＩ４２６９９．１、ＢＡＤ７２８８７．１、ＣＡＧ０９６２６．１、ＮＰ＿００１００９５６３．１、ＸＰ＿５３４５３４．１、ＸＰ＿５２４０１９．１、ＮＰ＿００１０１２３８０．１、ＮＰ＿０７１５４７．１、ＮＰ＿０３４３３３．１、ＮＰ＿９９０２１９．１、ＡＡＦ３１３９０．１、ＸＰ＿５４９０９４．１、ＣＡＡ７６４２２．１、ＣＡＧ０７６７４．１、ＮＰ＿００４１０４．３、ＸＰ＿５２６４２５．１、ＸＰ＿５３５８４５．１、ＸＰ＿５２１２８７．１、ＮＰ＿５７０８２７．１、ＣＡＨ９１８０２．１、ＡＡＨ２２５２４．１、Ｐ４８８０４、ＡＡＢ７１６０７．１、ＡＡＶ９０６３０．１、ＣＡＦ９８８９０．１、ＡＡＢ５３８２５．２、ＣＡＨ９３０４６．１、ＣＡＧ０１５５７．１、Ｈ８８４８１、ＪＧ０１８４、ＡＡＢ１８７８６．３、ＣＡＡ９４２４０．１、ＮＰ＿００４１０３．１、ＸＰ＿５１１２９７．１、ＣＡＤ１９８３０．１、ＡＡＣ９８８１２．１、ＢＡＢ８８６７３．１、ＮＰ＿０６６２７６．２、ＸＰ＿５４３８６２．１、ＣＡＡ４５０５４．１、ＣＡＩ５１９６０．１、ＸＰ＿５４６５９１．１、ＸＰ＿４８５８２５．１、ＮＰ＿５７０８２９．１、ＣＡＧ０７２８８．１、ＣＡＡ３５９２５．１、ＣＡＡ９４２３９．１、ＢＡＣ３９６８６．１、ＢＡＢ６３２４９．１、ＡＡＡ６２２６１．１、２０２０４２６Ａ、ＮＰ＿５７１９８３．１、ＮＰ＿５７１７１０．１、ＣＡＧ０４６８１．１、ＣＡＧ０９８１８．１、ＣＡＦ９９８５４．１、ＡＡＬ１６９６１．１、ＣＡＦ９９０７３．１、ＣＡＢ３７６４８．２、ＡＡＰ３２１５５．１、１ＢＦＧ、１ＩＩＬ、１ＦＱ９、１ＢＬＤ、１ＢＦＣ、１ＢＡＳ、ＡＡＨ３７６０１．１、ＢＡＤ２４６６６．１、ＮＰ＿９５７０５４．１、Ａ６０７２１、ＣＡＧ１１７１１．１、１Ｋ５Ｖ、ＮＰ＿００１９９８．１、１ＪＹ０、ＢＡＤ６９６１５．１、ＣＡＧ００６７９．１、ＡＡＨ３２６９７．１、ＣＡＩ２９６１０．１、ＢＡＣ２２０７２．１、ＡＡＢ２９０５７．２、１ＪＱＺ、１６０５２０６Ａ、ＣＡＩ４３０９７．１、ＣＡＥ７２４８４．１、１ＩＪＴ、Ａ４８８３４、ＮＰ＿００１００１３９８．１、ＮＰ＿９９０７６４．１、ＡＡＨ７４３９１．１、１Ｐ６３、ＣＡＦ９４６６６．１、１ＪＴＣ、ＡＡＡ５２５３４．１、Ａ３２３９８、Ｐ０９０３８、ＡＡＱ７３２０４．１、ＡＡＶ７４２９７．１、ＮＰ＿００１９９７．４、ＡＡＶ７０４８７．１、ＡＡＡ５２５３２．１、１ＪＴ４、１ＪＴ３、１ＢＦＦ、２ＢＦＨ、ＮＰ＿０６２１７８．１、１Ｅ０Ｏ、ＸＰ＿５２６５７２．１、ＮＰ＿０３２０３２．１、１ＨＫＮ、１ＤＺＤ、１ＤＺＣ、１ＥＶＴ、２ＡＸＭ、ＸＰ＿５４４９４６．１、ＡＡＬ８２８１９．１、Ｑ７ＳＩＦ８、１ＪＴ５、Ｐ４８８０３、ＣＡＡ４２８６９．１、１ＰＺＺ、１Ｍ１６、Ｓ００１８５、Ｐ４８７９８、ＮＰ＿７７６４８１．１、ＮＰ＿００１００９７６９．１、ＡＡＶ６７３８０．１、ＸＰ＿５３３２９８．１、Ａ４０１１７、１Ｑ０３、ＧＫＢＯＢ、ＡＡＣ３５９１２．１、ＣＡＡ７８８５４．１、ＪＣ４２６８、Ｓ３１６２２、ＢＡＢ４０８３５．１、ＡＡＡ７２２０９．１、ＢＡＡ８９４８３．１、ＡＡＡ５７２７５．１、１ＪＴ７、ＣＡＡ４６３４１．１、ＡＡＨ７４３２４．１、１Ｑ０４、ＢＡＣ３８６３１．１、１ＮＺＫ、ＣＡＧ０２４２６．１、１Ｋ５Ｕ、１ＤＪＳ、ＮＰ＿７７６４８０．１、ＮＰ＿０３４３３２．１、ＢＡＣ２２０７０．１、ＣＡＧ０６２３９．１、１ＡＦＣ、ＢＡＣ２２０６６．１、１２０１１９５Ａ、ＣＡＡ４３８６３．１、Ｑ７Ｍ３０３、ＮＰ＿９９９９７３．１、ＸＰ＿５２２０９１．１、ＮＰ＿９９０５１１．１、ＣＡＧ０２１６５．１、ＡＡＫ５２３０８．１、ＢＡＣ２２０６７．１、Ｑ６０４８７＿３、ＸＰ＿４２６４１４．１、ＸＰ＿５４０８０１．１、１ＢＡＲ、ＡＡＶ３８３７８．１、ＮＰ＿０３２０３１．１、ＮＰ＿０６２０７２．１、Ｐ４８７９９、ＮＰ＿９９００４５．１、ＡＡＫ３７９６２．１、ＣＡＧ０４６７１．１、ＢＡＡ１３９５８．１、ＸＰ＿５４４３２２．１、ＮＰ＿４４６２６１．１、ＡＡＱ８９２２８．１、ＮＰ＿００３８５８．１、ＸＰ＿５２２３２５．１、ＸＰ＿５２８０８０．１、ＮＰ＿０６２０７１．１、ＢＡＣ３８６５６．１、ＡＡＦ７５５２４．１、ＡＡＯ３８８５４．１、ＢＡＤ７４１２４．１、ＸＰ＿３９６４３４．１、ＢＡＤ７２８７５．１、ＡＡＰ２２３７２．１、ＣＡＦ９０７８４．１、ＡＡＣ６０３０３．１、ＡＡＦ７３２２５．１、ＣＡＦ９０９１３．１、ＡＡＰ９２３８５．１、ＢＡＢ６８３９７．１、ＮＰ＿０３４３３５．１、ＡＡＦ７３２２６．１、ＡＡＨ８６７１８．１、ＣＡＡ７１３６５．１、ＡＡＯ１５５９３．１、ＡＡＧ４５６７４．１、ＡＡＢ８２６１４．１、ＡＡＡ９３２９８．１、ＡＡＭ２２６８４．１、Ｑ９０７２２、ＣＡＦ９１３８５．１、
【００５８】
ＮＰ＿１４９３５４．１、ＮＰ＿５７９８２０．１、ＡＡＢ３４２５５．１、ＡＡＭ５５２３８．１、ＡＡＨ４８７３４．１、ＡＡＨ６９１０６．１、ＡＡＮ７３０３６．１、ＢＡＣ０２８９４．１、ＡＡＨ８２３４４．１、ＣＡＢ６４３４９．１、ＡＡＫ５２３１０．１、ＡＡＫ５２３０９．１、ＡＡＡ４８６１６．１、ＡＡＬ１６９５８．１、ＸＰ＿５４３９８２．１、ＡＡＯ２５６１８．１、ＣＡＥ１１７９１．１、ＣＡＦ９５４３０．１、ＡＡＤ１３８５３．１、ＥＡＬ２９２０３．１、ＮＰ＿９９０００５．１、ＸＰ＿５４３２５８．１、ＸＰ＿５４７８８３．１、ＸＰ＿５２７１１７．１、ＮＰ＿８７８２７６．１、ＢＡＣ０３４７７．１、ＣＡＣ８６０２８．１、ＮＰ＿００１０１２３７９．１、ＮＰ＿７３２４５２．１、ＮＰ＿７３２４５３．１、ＡＡＯ４１４７３．１、ＡＡＣ４７４２７．１、ＮＰ＿００１０１２２４６．１、ＸＰ＿５２２６２４．１、ＡＡＱ８９９５４．１、ＡＡＨ６６８５９．１、ＮＰ＿０３２０２９．１、ＹＰ＿１６４２３９．１、ＸＰ＿５４９２９４．１、１ＰＷＡ、ＢＡＤ０６５８４．１、ＡＡＦ７０３７４．１、ＮＰ＿５７０１０９．１、ＡＡＱ８８６６９．１、ＡＡＰ３６６３６．１、ＹＰ＿１９５０１４．１、ＣＡＧ０６６５６．１、ＮＰ＿５７０１０８．１、ＢＡＡ８５１３０．１、ＡＡＱ８９４４４．１、ＸＰ＿５２４３３３．１、ＮＰ＿０６４３９７．１、ＡＡＨ１８４０４．１、ＮＰ＿０６１９８６．１、ＢＡＡ８５１２９．１、ＮＰ＿００１００９５６４．２、ＢＡＤ６９７１７．１、ＢＡＣ２２０７１．１、ＡＡＮ２８１０４．１、ＡＡＱ８８６８９．１、ＡＡＦ６５５６６．１、ＡＡＢ７１６０８．１、ＸＰ＿５４０８０２．１、ＣＡＩ２５６１４．１、ＡＡＣ５９０２６．１、ＡＡＤ１５８９８．１、ＡＡＡ８５３９４．１、ＣＡＧ０６６５５．１、ＣＡＡ４１７８８．１、ＡＡＡ６６６６２．１、ＸＰ＿５４１５１０．１、ＣＡＧ０１３７１．１、ＢＡＤ０２８２９．１、ＢＡＣ２２０６８．１、ＸＰ＿４２５６６３．１、ＢＡＣ５５９６５．１、ＮＰ＿０７３１４８．１、ＸＰ＿４２１７２０．１、ＢＡＤ６０７８５．１、ＡＡＣ６３７０８．１、Ｏ６２６８２、ＸＰ＿５２２０９２．１、ＮＰ＿５７０１１０．１、ＸＰ＿３９２１０６．１、ＣＡＧ０２４２５．１、ＡＡＶ９７５９３．１、ＢＡＢ６８３４６．１、ＡＡＬ１６９６２．１、ＹＰ＿１６４２４０．１、ＹＰ＿１９５０１５．１、ＮＰ＿８４８３３９．１、ＣＡＦ９９３２１．１、ＣＡＡ７１９６７．１、Ａ３２４８４、ＣＡＡ２８０２９．１、ＡＡＬ０１８０４．１、ＡＡＫ８５５８９．１、ＡＡＭ９３４２２．１、ＣＡＡ０５８８８．１、ＡＡＯ２７５７６．１、ＡＡＯ２７５７５．１、ＣＡＨ９３７０５．１、ＡＡＵ００９９１．１、ＡＡＬ３７３６８．１、ＥＡＬ４６１９６．１、ＮＰ＿７０１６９１．１。
【００５９】
用語の「テラトーマ("teratoma")」とは、３つの発生学的胚細胞層：外胚葉、中胚葉、および内胚葉の細胞から生じる腫瘍を称す。本明細書に用いられる用語の「発生学的胚細胞層("embryologic germ cell layers")」とは、特殊化され、それらの最終発生形態においてある一定の特徴的形質を発現する胚における細胞層（例えば、外胚葉、中胚葉、および内胚葉）を称す。用語の「内胚葉("endoderm")」とは、腸管内へと発達する内胚葉胚層の細胞を称す。用語の「中胚葉("mesoderm")」とは、血管へと発達する中胚葉胚層の細胞を称す。用語の「外胚葉("ectoderm")」とは、中枢神経および末梢神経内、皮膚の表皮へと発達する外胚葉胚層の細胞を称す。
【００６０】
用語の「幹細胞("stem cell")」、「非特殊化細胞("unspecialized cell")」、「非委任細胞("uncommitted cell")」、および「未分化細胞("undifferentiated cell")」とは、細胞自体を再生し、身体の組織および臓器を作り上げる特殊細胞型を生じさせるユニークな能力を有する細胞を称す。幹細胞は、組織特異的構造および組織特異的機能（例えば、心筋細胞、神経細胞など）がない。幹細胞は、胚（例えば、胚幹細胞）、胎児組織、および成人組織に由来し得る。用語の「特殊細胞("specialized")」、「委任細胞("committed")」、および「分化細胞("differentiated")」とは、組織特異的構造および／または組織特異的機能（例えば、心筋細胞、神経細胞など）を有する細胞を称す。用語の「分化」とは、細胞に関する場合、非特殊化細胞が、特殊細胞（例えば、心臓、肝臓、または筋肉細胞）の形質を獲得する過程を称す。
【００６１】
用語の「始原細胞("progenitor cell")」とは、胎児組織および／または成人組織における細胞を称し、部分的に特殊化され、分裂でき、分化細胞を生じさせる。
【００６２】
用語の「胚幹細胞("embryonic stem cell")」、「ＥＳ細胞("ES cell")」、および「多分化能細胞("pluripotent cell")」とは、いずれかの特殊細胞型となる可能性を有する胚の内部細胞塊に由来する未分化細胞を称す。用語の「胚生殖細胞("embryonic germ cell")」とは、例えば、５週から１０週の胎児の性腺稜線の始原性細胞などの胎児組織に由来する細胞を称す。
【００６３】
用語の「哺乳動物の胚幹細胞("mammalian embryonic stem cell")」とは、哺乳動物に由来するＥＳ細胞を称す。それは、幹細胞を供給できる哺乳動物を限定することを意味しておらず、したがって、ヒト（ｈＥＳ）、サル、大型類人猿、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、マウス、ラットなどを含むことができる。
【００６４】
用語の「成人幹細胞("adult stem cell")」、「多分化能幹細胞("multipotent stem cell")」、および「体幹細胞("somatic stem cell")」とは、分化組織に見られ、増殖し、分化して起源となる組織の特殊細胞型を生成できる未分化細胞を称す。
【００６５】
用語の「クローン性由来幹細胞("clonality derived stem cell")」とは、単一幹細胞の分裂によって発生し、その幹細胞と遺伝的に同一の幹細胞を称す。
【００６６】
用語の「分化全能性("totipotent")」、「多能性("pluripotent")」、および「多分化能性("multipotent")」とは、異なる発生段階の細胞を称す。用語の「分化全能性幹細胞("totipotent stem cell")」とは、受精卵の分裂後に形成でき、胚盤胞を形成でき、完全個体へと発達できる細胞（例えば、マウスＯｃｔ−４＋細胞）を称す。用語の「多能性細胞("pluripotent cell")」とは、任意の細胞型に発達する可能性を有する細胞を称す。用語の「多分化能幹細胞("multipotent stem cell")」とは、組織および臓器における古くなった細胞（例えば、血液細胞など）を置き換えるために身体によって形成される少なくとも２種以上の分化派生細胞へと分化する能力を有する成熟組織に見られる細胞を称す。
【００６７】
用語の「可塑性("plasticity")」とは、別の組織の分化および特殊細胞型を発生させる、一成人組織からの幹細胞の能力を称す。
【００６８】
用語の「フィーダー層("feeder layer")」とは、所望の効果、例えば、多能性幹細胞を維持するために共培養に使用される細胞を称す。
【００６９】
用語の「馴化培地("conditioned medium")」とは、生細胞と接触させた培養培地を称し、後続の細胞バッチと接触させて入れられた場合、後続の細胞の増殖または分化を増強し得る一連の細胞由来分子（例えば、成長物質など）を含有する。用語の「非馴化培地("non-conditioned medium")」とは、細胞と接触させていない培養培地を称す。記載のない場合、培地は、非馴化培地を意味していることを解すべきである。
【００７０】
用語の「線維芽細胞フィーダー("fibroblast feeder")」とは、線維芽細胞を含んでなるフィーダー層を称す。用語の「線維芽細胞("fibroblast")」とは、コラーゲン線維などの線維を形成でき、結合組織に存在する細胞質過程を有する星状（星型）または紡錘状細胞を称す。用語の「マウス線維芽細胞フィーダー」、および「ｍＥＦ」とは、マウス線維芽細胞を含んでなるフィーダー層を称し、一方、用語の「マウス線維芽細胞フィーダーの馴化培地」とは、マウス線維芽細胞に曝露させた培養培地を称す。
【００７１】
用語の「ラミニン("laminin")」および「ＬＡＭ」とは、シートへと組み立てて細胞結合物質として作用させ、また成長因子として作用する（例えば、分化誘導など）リガンドとして作用させることのできる多くの機能性ドメインを含有する細胞外マトリックスタンパク質を称す。
【００７２】
用語「ＰＯＵ」は、３種の哺乳動物転写因子、脳下垂体特異的Ｐｉｔ−１、オクタマー結合タンパク質Ｏｃｔ−１とＯｃｔ−２、および線虫からの神経性Ｕｎｃ−８６の名称に由来する頭字語である。用語の「ＰＯＵ転写因子("POU transcription factor")」とは、プロモーターまたはエンハンサー領域内で、オクタマーモチーフと呼ばれるオクタマー配列を含有するシス作用性因子を有する遺伝子の転写を活性化できるＤＮＡ結合タンパク質である多くのＰＯＵ遺伝子ファミリーを称す。
【００７３】
用語の「Ｏｃｔ−４ＰＯＵ転写因子("Oct-4 POU transcription factor")」、「オクタマー結合転写因子３("octamer-binding transcription factor 3")」、「Ｏｃｔ−３」、「ＯＣＴ３」、「オクタマー結合転写因子４("Octamer-binding transcription factor 4"(」、「Ｏｃｔ−４」、「ＯＣＴ４」、「ＰＯＵ５Ｆ１」、「ＯＴＦ３」、「クラスＶ ＰＯＵ因子Ｏｃｔ−３("class V POU factor Oct-3")」、および「ＰＯＵドメイン、クラス５、転写因子１("POU domain, class 5, transcription factor 1")」とは、未分化幹細胞におけるＰＯＵ転写因子を称す。
【００７４】
用語の「ｎａｎｏｇ」とは、未分化幹細胞に見られるホメオボックス転写因子を称す。
【００７５】
用語の「腫瘍拒絶抗原」、「ＴＲＡ」、および「ヒト胚性癌腫マーカー抗原("human embryonal carcinoma marker antigen")」とは、ケラチンサルフェート結合抗原を称す。これらは、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−１−８５、ＴＲＡ−２−５４、ＴＲＡ−２−４９に関するモノクローナル抗体により検出されたタンパク質を含む。
【００７６】
用語の「形成期特異的胚抗原("stage-specific embryonic antigens")」、「ＳＳＥＡ−１」、「ＳＳＥＡ−２」、「ＳＳＥＡ−３」、および「ＳＳＥＡ−４」とは、分化の際に細胞表面の発現が変化する糖質抗原を称す。例えば、マウスＥＳ細胞において、未分化マウス多能性細胞は、ＳＳＥＡ−１を発現するが、分化はＳＳＥＡ−１発現の喪失を特徴とし、幾つかの場合においてＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４の出現により達成できる。例えば、ヒトにおいて、未分化ヒトＥＣ、ＥＳおよびＥＧ細胞は、抗原ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１を発現するが、一方、分化ヒトＥＣおよびＥＳ細胞は、ＳＳＥＡ−１発現の増加およびＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４のダウンレギュレーションを特徴とする。
【００７７】
用語の「アクチビンＡ("Activin A")」、「ＡＣＴＡ」、「ＡＣＴａ」、および「ＡＣＴ」とは、「インヒビンベータ−Ａ鎖("inhibin beta-A chain")」または「アクチビンベータ−Ａ鎖("activin beta-A chain")」のホモ二量体を称す。用語の「アクチビンＢ」とは、「インヒビンベータ−Ｂ鎖」のホモ二量体または「アクチビンベータ−Ｂ鎖」のホモ二量体を称す。用語の「アクチビンＡＢ」とは、「インヒビンベータ−Ａ鎖およびベータ−Ｂ鎖」の二量体を称す。これらのタンパク質は全て、タンパク質のＴＧＦβファミリーのメンバーである、タンパク質のアクチビンタンパク質群のメンバーである。用語の「インヒビン」および「インヒビン類」とは、視床下部および脳下垂体ホルモン分泌、生殖腺ホルモン分泌、幹細胞の発生と成熟、赤芽球分化、インスリン分泌、神経細胞生存、胚軸発生、骨成長などの多様な生物学的機能を阻害するＴＧＦβファミリーのメンバーを称し、それらの機能がサブユニット組成に関連するアクチビンの機能と対立し得る。用語のインヒビンは、インヒビンＡとインヒビンＢとを含む。
【００７８】
用語の「ケラチノサイト成長因子("keratinocyte growth factor")」、「ＫＧＦ」、「線維芽細胞成長因子−７("Fibroblast growth factor-7")」、「ＦＧＦ−７」、「ＨＢＧＦ−７」、および「ヘパリン結合成長因子−７("heparin-binding growth factor-7")」とは、ケラチノサイトに対して活性な線維芽細胞成長因子ファミリーの成長因子を称す。用語の「ケラチノサイト」とは、ケラチンを作る細胞を称す。用語の「ケラチン」とは、皮膚、毛髪、爪、および動物の角の上層細胞などの特殊上皮細胞に見られる大型の分子を称す。
【００７９】
用語の「白血病抑制因子("leukemia inhibitory factor")」、「ＬＩＦ」、「白血病抑制因子前駆体("leukemia inhibitory factor precursor")」、「分化刺激因子("differentiation-stimulating factor")」、「Ｄ因子」、「黒色腫由来ＬＰＬ阻害剤("melanoma-derived LPL inhibitor")」、「ＭＬＰＬＩ」、「ＨＩＬＤＡ」、「ＤＡ細胞に関するヒトインターロイキン("human interleukin for DA cells)"」、「ＤＡ細胞に関する骨髄性成長因子ヒトインターロイキン("myeloid growth factor human interleukin for DA cells")」」とは、幹細胞の分化を阻害し、白血病細胞における終末分化を誘導し、正常な細胞および骨髄性白血病細胞における造血分化を誘導する細胞メッセンジャータンパク質を称す。
【００８０】
用語の「胚("embryo")」とは、受精時から、著しい分化が生じるまで、例えば、ヒトでは、胎児として認められるようになる妊娠８週末までの発生中の生物を称す。
【００８１】
用語の「ＳＴＡＴ」および「シグナルトランスデューサーおよび転写の活性化因子("Signal Transducers and Activators of Transcription")」とは、遺伝子（例えば、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６など）を調節するタンパク質のファミリー中の分子を称す。用語の「ＳＴＡＴ３」とは、サイクリンＤ１、ｃ−Ｍｙｃ、ｂｃｌ−ｘ１などの発現の活性化に関与し、細胞分裂周期の進行促進、細胞形質転換に関与し、アポトーシス防止に関与している癌遺伝子を称す。
【００８２】
本明細書に用いられる用語の「タンパク質キナーゼ("protein kinase")」とは、ヌクレオシド三リン酸からタンパク質中のアミノ酸へのリン酸基の付加を触媒するタンパク質を称す。キナーゼ類は、公知の最も大きな酵素のスーパーファミリーを含んでなり、それらの標的タンパク質は種々多様である。キナーゼ類は、チロシン残基をリン酸化する（例えば、ヤヌス(Janus)ファミリーチロシンキナーゼ（ＪＡＫ）類）タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）類、およびセリンおよび／またはトレオニン残基などをリン酸化するタンパク質セリン／トレオニンキナーゼ（ＳＴＫ）類として分類できる。
【００８３】
本明細書に用いられる用語の「タンパク質ホスファターゼ("protein phosphatase")」とは、タンパク質からホスフェート基を除去するタンパク質を称す。タンパク質ホスファターゼ類は、一般に２つの群、受容体タイプタンパク質と非受容体タイプタンパク質（例えば、細胞内）とに分けられる。さらなる群としては、二重特異性ホスファターゼ類が挙げられる。タンパク質ホスファターゼ類の例としては、限定はしないが、ヒトタンパク質ホスファターゼ（ＰＲＯＰＨＯ）、ＦＩＮ１３、ｃｄｃ２５チロシンホスファターゼ、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）２０、ＰＴＰ １Ｄ、ＰＴＰ−Ｄ１、ＰＴＰラムダ、ＰＴＰ−Ｓ３１（例えば、特許文献２；特許文献３；特許文献４；特許文献５；特許文献６；特許文献７；特許文献８；および特許文献９を参照されたい；それらの全ては、参照として本明細書に組み込まれている）が挙げられる。タンパク質ホスファターゼに対する標的例は、ＳＴＡＴ類である。
【００８４】
本明細書に用いられる「対象("subject")」は、限定はしないが、幹細胞または幹細胞を用いて産生された物質を導入できる動物などの生物である。本明細書に用いられる用語の「動物("animal")」には、「非ヒト動物("non-human animals")」との記載によって別に特記しない限りヒトが含まれる。
代表的な実施形態の記載
【００８５】
本発明は、幹細胞における未分化状態および／または多能性の維持に関する。具体的な実施形態において、本発明は、線維芽細胞のフィーダー層または白血病阻害因子を使用せずに、アクチビンＡなどのＴＧＦβファミリーのメンバー、ケラチノサイト成長因子などのＦＧＦファミリーのメンバー、ニコチンアミド（ＮＩＣ）、またはこれらのうちの２つまたは全ての組合わせに富んだ培養培地を用いて、ヒト胚幹細胞系などの未分化幹細胞の維持に関する。
【００８６】
第１の態様において、本発明は、未分化幹細胞の維持方法を提供し、該方法は、所望の結果を得るために十分な時間量、該細胞を未分化状態に維持するのに十分な量で、ＴＧＦβファミリーのタンパク質の１種以上のタンパク質に幹細胞を曝露させることを含んでなる。幾つかの実施形態において、ＴＧＦβファミリーのタンパク質のメンバーは、アクチビンＡなどのアクチビンである。幾つかの実施形態において、ＦＧＦファミリーのメンバーはＫＧＦである。複数の実施形態において、該方法はまた、未分化幹細胞の増殖方法である。該方法は、最初の曝露で用いられた量と同じか、または異なる量でさらなる（すなわち、新たな）ＴＧＦβファミリーのタンパク質のメンバー、ＦＧＦファミリーのメンバー、および／またはＮＩＣとの曝露ステップを反復させることを含むことができる。該方法は、インビトロ法であることが好ましい。
【００８７】
上記に検討されたように、幹細胞は、単一細胞あっても細胞集団であってもよい。さらに、該細胞は、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウマ、ヒツジ、ブタなどを含む任意の種に由来し得る。同様に、幹細胞は、天然のものでも組換え体でもよい。一定の実施形態において、幹細胞を準備するために新鮮な生検材料が使用される。他の実施形態において、培養された幹細胞が使用される。後者に関して、本発明が、培養材料の特定の培養法によって限定されることは意図されていない。一実施形態において、該方法に用いられる幹細胞は、無血清の培養培地で培養される。一実施形態において、該方法に用いられる幹細胞は、補足されたＤＳＲ培地で培養される（実施例１に記載されるように）。
【００８８】
ある一定の実施形態において、本発明は、対象細胞が哺乳動物細胞である方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、対象細胞がヒト細胞である方法を提供する。種々の幹細胞型は、限定はしないが、胚細胞および胎児幹細胞よりなる群から選択される幹細胞など、本発明の組成物と方法によって培養できる。本発明は、幹細胞の供給源によって限定されることも意図されていない。したがって、複数の実施形態において、幹細胞は、胚組織に由来する。他の実施形態において、幹細胞は、胎児組織に由来する。一実施形態において、幹細胞は、血液に由来する。
【００８９】
上記に検討されたように、該方法は、幹細胞の供給源である種を限定しない。種々の種は、限定はしないが、ヒト、大型猿人、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、キンギョ、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュなど、幹細胞の供給源として使用できる。さらに、本発明は、本明細書に開示された種々の物質に曝露される場合、細胞の分化状態に限定されない。したがって、複数の実施形態において、本発明は、対象細胞が未分化である方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、接触細胞が未分化である方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、接触細胞が多能性である方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、接触細胞がインビボ多能性である方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、接触細胞がインビトロ多能性である方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、接触細胞が対象細胞と同じ核型を有する方法を提供する。
【００９０】
本発明の方法によれば、曝露は、アクチビンＡなどのＴＧＦβファミリーのタンパク質を、幹細胞と接触させる任意の作用であり得る。したがって曝露は、アクチビンＡなどのＴＧＦβファミリーのタンパク質を、幹細胞が存在する培地に単に加えることができる。曝露はまた、アクチビンＡなどのＴＧＦβファミリーのタンパク質の前駆体を、前記前駆体をアクチビンＡなどの機能性タンパク質に変換できる細胞、タンパク質、または化学物質と共に培地に加えることができる。曝露は、手動で（例えば、人がアクチビンＡを幹細胞の培地に加えることにより）または自動的に（例えば、器械により）実施できる。
【００９１】
使用され、細胞に曝露されるＴＧＦβファミリーのタンパク質の量は、細胞型、所望の結果、細胞数、細胞が増殖する培地の容量、および結果を得るための所望の速度に依って変わり得る。加える量の変化は、これらおよび他のパラメータに基づいて予想できるが、本発明は、約５ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌ（培地中の最終濃度）のＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質の使用を考慮している。したがって、複数の実施形態において、該方法は、５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌ、１７ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２４ｎｇ／ｍｌ、２６ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、５５ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８５ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１２０ｎｇ／ｍｌ、１４０ｎｇ／ｍｌ、１７０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２４０ｎｇ／ｍｌ、２９０ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、４５０ｎｇ／ｍｌ、または５００ｎｇ／ｍｌ、あるいは５ｎｇ／ｍｌと５００ｎｇ／ｍｌとの間の任意の他の特定量の最終濃度を達成するのに十分な量で少なくとも１種のＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質を加えることを含んでなる。複数の実施形態において、ＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質はアクチビンＡである。
【００９２】
あるいは、ＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質は、約０．０１ｎＭから約１００ｎＭの濃度で培地中に存在できる。したがって、種々の実施形態において、培地は、正確にあるいは凡そ０．０１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、８ｎＭ、１０ｎＭ、１６ｎＭ、２５ｎＭ、３２ｎＭ、４５ｎＭ、６４ｎＭ、７５ｎＭ、８５ｎＭ、または１００ｎＭ（または０．０１ｎＭと１００ｎＭとの間の任意の他の特定量）のアクチビンＡなどのＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質を含んでなる。
【００９３】
細胞が未分化状態で維持される時間量は、最終的な所望の結果に依って変わる。時間量は、１時間以下から、数日、数週、数年まで変わり得る。例えば、時間量は、約１０週以上、約１５週以上、約２０週以上、約２５週以上、約３０週以上であり得る。該方法により、細胞に曝露されたＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質の量、曝露時間を調整することによって幹細胞の維持および増殖を実務者が管理でき、曝露が繰り返される。最初の曝露に続く曝露が、少なくとも一部、追加のＴＧＦβファミリーのメンンバーにより実施されることが考慮されている。本発明によれば、先に細胞に曝露させた同じＴＧＦβファミリーメンバーのみを含んでなるＴＧＦβファミリーメンバーを用いた後続の曝露により、元の曝露の単なる拡大が考慮されている。時間量は、培地中に増殖させた細胞の継代数において都合よく発現する。一般に該方法により、１回未満の継代から３０回以上の継代の間細胞の維持または増殖が可能になる。したがって、特定の実施形態において、該方法は、１回の継代、２回の継代、３回の継代、４回の継代、５回の継代、６回の継代、７回の継代、８回の継代、９回の継代、１０回の継代、１１回の継代、１２回の継代、１３回の継代、１４回の継代、１５回の継代、１６回の継代、１７回の継代、１８回の継代、１９回の継代、２０回の継代、２１回の継代、２２回の継代、２３回の継代、２４回の継代、２５回の継代、２６回の継代、２７回の継代、２８回の継代、２９回の継代、３０回の継代、またはそれ以上の継代の間、細胞の維持または増殖が可能になる。さらに本発明によれば、アクチビンＡなどのＴＧＦβファミリーのメンバーへの細胞の曝露は、１／１０継代、１／５継代、１／３継代、１／２継代、２／３継代、および４／５継代などの継代の分数の間、細胞の維持または増殖を可能にする。実際には、該方法により、実務者が数日間、数週間、数ヵ月間、数年間幹細胞を維持および／または増殖させることができる。
【００９４】
将来の使用のために細胞培養細胞を分割し、保存する標準的な実施を考慮して、本発明は、当該方法に従って処理された細胞を保存することを考慮している。保存は、長期保存のために細胞の凍結を含むものなど、任意の公知の方法により達成できる。
【００９５】
細胞の維持および／または増殖を介して得られる所望の結果は、限定はしないが、特定の物質の生産、培養プレート上の培養の集密性、新たな培養培地への移行のために（すなわち、継代のために）十分な細胞数の生産、または対象への移植用に十分な細胞数の生産など、医学的または科学的に関連する結果であり得る。限定はしないが、癌治療後の血液細胞の再増殖、アルツハイマー病およびパーキンソン病などのＣＮＳ変性疾患の治療、および糖尿病の治療など、幹細胞に関して多数かつ種々使用法が提案され、実施されている。提案され、実施されている使用法のいずれか、また全ては、本法による好適な所望の結果である。
【００９６】
ＴＧＦβタンパク質は、天然または組換えで得ることができる。さらに、本発明の方法に関して本明細書に用いられるように、用語のアクチビンＡには、下記および上記に定義されるとおり、アクチビンＡの断片および誘導体を含む。用語のアクチビンＡに包含されている１つの特定のヒトアクチビンＡの配列は、配列番号：１に得られる。ヒトアクチビンＡの他の非限定例は、配列番号：２〜１６で得られ、一方、ヒトアクチビンＡをコードする核酸の非限定例は、配列番号３３〜３４で得られる。
【００９７】
該方法は、所望の結果を得るために十分な時間量、細胞の維持および／または増殖を可能にするのに十分な量で、ＫＧＦなどのＦＧＦタンパク質ファミリーのメンバーに幹細胞を曝露させることを含み得る。ＫＧＦなどのＦＧＦファミリーのメンバーの幹細胞の培地への付加は、これらの細胞の増殖を改善することが判明している。特にＦＧＦファミリーメンバーメンバーの追加は、典型的に幹細胞培養に見られる増殖の減速および休止を防ぐ。実際、ＫＧＦなどのＦＧＦファミリーのメンバーの幹細胞培養への添加は、必ずしも１０回以上の継代に限定されないが、複数継代の間、培養の維持および増殖を可能にすることが判明している。この効果は、またアクチビンＡなどのＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質を含有する培養物で特に明白である。
【００９８】
ＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質が、ＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質と共に細胞に曝露される複数の実施形態において、ＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質は、ＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質への曝露前、曝露と同時に、または曝露後に細胞に曝露できる。
【００９９】
ＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質は、ＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質と同じ細胞に曝露されるため、細胞に関する上記の開示は、ＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質に細胞を曝露することを含んでなる方法にも等しく適用可能であることが明らかである。同様に、望まれ得る結果は、上記に開示されたものと重複し得、当業者により望まれであろう。
【０１００】
ＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質は、上記の検討によれば、所望の結果を達成するのに十分な量において細胞に曝露できる。曝露は、ＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質に関して上記に検討された作用のいずれかによって達成できる。したがって、時間量は、１回の継代、２回の継代、３回の継代、４回の継代、５回の継代、６回の継代、７回の継代、８回の継代、９回の継代、１０回の継代、またはそれ以上であり得る。上記の検討によれば、時間量は、３０回以上の任意の継代数または部分的な継代であり得る。さらに、１つ以上の継代の任意の部分は、所望の時間量であり得る。したがって、時間量は、１時間未満から１日以上または１週以上の範囲であり得る。時間量は、約５週、約１０週、約１５週、約２０週、約２５週、約３０週、またはそれ以上であり得、これら代表的な数字の間の任意の具体的な週数を含む。
【０１０１】
種々の実施形態において、ＦＧＦファミリーのタンパク質は、０．５ｎｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの濃度で細胞を含んでなる培地に存在するような様式で細胞に曝露される。したがって、特定の実施形態において、ＫＧＦなどのＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質は、正確にまたは凡そ１ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、３ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、７．５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、４５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、５５ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７５ｎｇ／ｍｌ、８５ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、１７５ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、３５０ｎｇ／ｍｌ、または５００ｎｇ／ｍｌ（または０．５０ｎｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌとの間の任意の量）の量で存在する。
【０１０２】
ＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質に細胞を曝露させる場合のように、細胞のＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質への曝露は、曝露ステップを反復させることを含んでなり得る。ＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質の細胞への曝露の反復は、アクチビンＡなどのＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質の細胞への曝露に関して上記に検討された同じパラメータ下で考慮されている。
【０１０３】
ＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質は、天然または組替え体から得ることができる。さらに、本発明の方法の特定の実施形態に関して本明細書に用いられるように、用語のＫＧＦは、下記および上記に定義されるとおり、ＫＧＦの断片および誘導体ならびにＫＧＦの種として考慮されている分子を含む。用語のＫＧＦにより包含されている１つの特定のヒトＫＧＦの配列は、配列番号：１７に得られる。ＫＧＦの他の非限定例は、配列番号：１８〜２４に得られ、一方、ＫＧＦをコードする核酸の非限定例は、配列番号２５〜３１に得られる。
【０１０４】
本発明の方法は、同様に、複数継代を介して培養における細胞の増殖および維持を可能にするのに十分な量におけるニコチンアミド（ＮＩＣ）に対して幹細胞の曝露を含むことができる。ＮＩＣ中の幹細胞の培養は、期間を延長して維持および増殖を可能にすることが判明している。したがって、本法の実施形態によれば、所望の結果は、少なくとも１回、５回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、またはそれ以上の継代（この範囲内の任意の他の継代整数、およびそれらの分数）を介する細胞の継代であり得る。
【０１０５】
ＮＩＣに対する細胞の曝露は、ＴＧＦβファミリーのタンパク質および／またはＦＧＦファミリーのタンパク質に関して上記に検討された作用および要件を用いて達成できる。同様に、該細胞の維持および増殖期間を延長することに加えて、ＮＩＣは、ＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質に関して上記に検討されたものなど、当業者に明らかと思われる多くの理由のうちのいずれかにによって該細胞に曝露することができる。上記に掲げられた該細胞と特性により、反復曝露に関する結果および要件のとおりＮＩＣに対する該細胞の曝露を含んでなる実施形態に等しく適用できる。
【０１０６】
ＴＧＦβおよびＦＧＦファミリーのメンバーでの場合のように、細胞に曝露させるＮＩＣの量は、所望の結果、細胞量、および他のパラメータに依って変わり得る。一般に、細胞を含有する培地に存在できるＮＩＣの量は、約０．５ｍＭから約５００ｍＭまで変わり得る。したがって、特定の実施形態において、ＮＩＣは、正確にまたは凡そ０．５ｍＭ、１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１７ｍＭ、２０ｍＭ、２４ｍＭ、２６ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８５ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１４０ｍＭ、１７０ｍＭ、２００ｍＭ、２４０ｍＭ、２９０ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、または５００ｍＭの濃度で培地中に存在する。
【０１０７】
上記に検討されたように、ＮＩＣに対する細胞の曝露により、多能性状態または核型を変化させることなく増殖期間の延長が可能となる。さらに、ある一定の良く知られた表面マーカーは、ＮＩＣに対する曝露延長後、細胞表面に残る。
【０１０８】
一般に、本発明の方法は、いずれのフィーダー細胞、馴化培地、または白血病抑制因子（ＬＩＦ）の不在下で培養物中の幹細胞の増殖および維持を可能にする。複数の実施形態において、該方法は、多能性状態の細胞を維持する。種々の実施形態において、該方法は、未分化幹細胞の分化を阻止するか、または遅延させる方法である。複数の実施形態において、該方法は、未分化幹細胞の喪失を阻止するか、または遅延させる（すなわち、幹細胞のある特定の細胞型への拘束を遅延させる）方法である。
【０１０９】
上記の開示を考慮して、本発明は、哺乳動物の胚幹細胞（ＥＳ）細胞を維持し、および／または増殖する方法を提供することは明らかであって、該方法は：ａ）ｉ）対象のＥｓ細胞、およびｉｉ）アクチビンＡ、ケラチノサイト成長因子、およびニコチンアミドの１つ以上を提供すること；ｂ）接触ＥＳ細胞を生産するために、ＥＳ細胞を、アクチビンＡ、ケラチノサイト成長因子、および／またはニコチンアミドと接触させることを含んでなる。他の中でもとりわけ、このような方法は、未分化幹細胞を維持する手段、細胞分裂による細胞増殖を促進する手段、および未分化細胞数を増加させるために増殖を促進する一方で、未分化状態における細胞を維持する手段を提供する。複数の実施形態において、本法は、該接触がマウスの線維芽細胞フィーダー細胞の不在下にある方法である。さらに他の実施形態において、本発明は、該接触がマウスの線維芽細胞フィーダー細胞による馴化培地の不在下にある方法である。さらなる実施形態において、本発明は、該接触が白血病抑制因子の不在下にある方法である。さらに、維持が達成される実施形態および細胞が、細胞の増殖を可能にするのに十分な時間、アクチビンＡ、ＫＧＦ、および／またはＮＩＣと接触し続ける実施形態において、接触は、少なくとも部分的にマウス線維芽細胞のフィーダー細胞、マウス線維芽細胞のフィーダー細胞の馴化培地、および／または白血病抑制因子の不在下で実施される。本発明は、幹細胞が維持され、増殖される様式に限定されることを意図していない。
【０１１０】
特定の実施形態において、本発明は、哺乳動物の胚幹細胞（ＥＳ）細胞を維持し、および／または増殖する方法を提供し、該方法は：ａ）ｉ）対象のＥｓ細胞、およびｉｉ）配列番号：１に少なくとも９０％の同一性を有する第１のポリペプチドおよび／または配列番号：１７に少なくとも９０％の同一性を有する第２のポリペプチドのうちの１つ以上を提供すること；ｂ）接触ＥＳ細胞を生産するために、ＥＳ細胞を第１および第２のポリペプチドと接触させることを含んでなる。複数の実施形態において、本発明は、第１のポリペプチドの濃度が、接触ＥＳ細胞を未分化状態に維持する方法を提供する。別の実施形態において、本発明は、第２のポリペプチドの濃度が、接触ＥＳ細胞の増殖を維持する方法を提供する。
【０１１１】
本発明の方法により処理された幹細胞は、正常な核型およびこれらの未分化細胞に対するマーカーを典型的に示し、多能性を典型的に残すことに注意すべきである。
【０１１２】
本発明の第２の態様において、本発明は、未分化状態または多能性状態の幹細胞を維持および／または増殖するために使用できる組成物、または幹細胞を含んでなる組成物を提供する。一般に、該組成物は、所望の結果を得るために十分な時間量、未分化状態において幹細胞の少なくとも１つの培養の増殖および／または維持を可能にするのに十分な量および形態で、幹細胞および／またはアクチビンＡなどのＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質、ＫＧＦなどのＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質、および／またはＮＩＣを含んでなる。上記方法の検討によれば、所望の結果は、保存のための十分な細胞数を調製することを含む、医学的または科学的に関連する結果であり得る。したがって、本発明の態様による組成物は、本発明の方法を実施するのに有用なものである。複数の実施形態において、ＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質は、基本的な線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）ではない。複数の実施形態において、該組成物は、幹細胞、ＴＧＦβファミリーメンバー、ＦＧＦファミリーのメンバー、ＮＩＣ、またはこれら２つ以上の組み合わせを含んでなる製薬組成物である。該組成物は、他の中でもとりわけ幹細胞療法に有用となり得る。
【０１１３】
ＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質を含んでなる組成物は、任意の供給源の任意の形態のメンバーのタンパク質を含んでもよい。したがって、アクチビンＡを含んでなる組成物は、任意の供給源の任意の形態のタンパク質を含め得る。上記に検討されたように、アクチビンＡタンパク質の多数の例は、配列表において得られ、ＧｅｎＢａｎｋの登録番号により本明細書に記載されている。また、他のものも包含されている。同様に、未分化状態における幹細胞の維持および増殖を促進するために、配列表に提供されているか、または当業界に公知の配列を有するが、アクチビンＡの能力に負の影響を及ぼさない翻訳後の修飾を有するものなどの誘導体は、本発明により包含されている。例えば、本明細書に提供されているか、またはアクチビンＡ配列として当業界に公知の１つ以上の配列を有するかなりのアミノ酸同一性を有する変異体が包含されている。配列番号：１などの本明細書に開示されている１つ以上の配列と８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性を共有するタンパク質を含んでなる組成物は、本発明により包含されている。複数の実施形態において、本発明は、配列番号：１に対して少なくとも９０％同一のポリペプチドを含んでなる組換えアクチビンＡを含んでなる組成物を提供する。したがって、他の実施形態において、組換えアクチビンＡのポリペプチドは、配列番号：１または３〜１６のいずれに対しても少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（またはそれ以上）の同一性である。特定の実施形態において、本発明は、組換えヒトアクチビンＡを含んでなる組成物を提供する。
【０１１４】
ある一定の実施形態において、該組成物は、アクチビンＡなどのＴＧＦβファミリーのメンバーをコードする核酸を含み得る。これらの実施形態において、該組成物はまた、アクチビンＡを発現するために核酸の発現を可能にする他の物質を含んでなる。これらの実施形態において、核酸は、本明細書に開示されているものか、または当業者に公知のものである。核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で１種以上のアクチビンＡコード化核酸にハイブリダイズする核酸、または８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性など、１種以上のアクチビンＡコード化核酸により高い同一性を共有する核酸を含む。
【０１１５】
ＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質を含んでなる組成物は、任意の供給源の任意の形態のメンバーのタンパク質を含むことができる。したがって、ＫＧＦを含んでなる組成物は、任意の供給源の任意の形態のタンパク質を含むことができる。上記に検討されたように、ＫＧＦタンパク質の多数の例は、配列表に得られる。その上、限定されていないが、線維芽細胞因子（ＦＧＦ）などの他のものも包含されている。同様に、未分化状態における幹細胞の維持および増殖を促進するために、上記に掲げた配列表に提供されているか、または当業界に公知の配列を有するが、ＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質の能力に負の影響を及ぼさない翻訳後の修飾を有するものなどの誘導体は、本発明により包含されている。例えば、本明細書に提供されているか、またはＫＧＦ配列として当業界に公知の１つ以上の配列を有するかなりのアミノ酸同一性を有する変異体が包含されている。配列番号：１７などの本明細書に開示されている１つ以上の配列と８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性を共有するタンパク質を含んでなる組成物が、本発明により包含されている。
【０１１６】
ある一定の実施形態において、該組成物は、ＫＧＦなどのＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質をコードする核酸を含むことができる。これらの実施形態において、核酸は、本明細書に開示されているものであるか、または当業者に公知のものである。核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で１種以上のＦＧＦファミリーコード化核酸にハイブリダイズする核酸、または８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性など、１種以上のＦＧＦファミリーコード化核酸により高い同一性を共有する核酸を含む。当業者により理解されるように、対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を生産することは有利であり得、該ヌクレオチド配列は、非天然コドンを有する。したがって、幾つかの実施形態において、特定の原核生物宿主または真核生物宿主により好ましいコドン（非特許文献１）は、例えば、発現率増加させるために、または天然配列から生産される転写物よりも長期半減期などの所望の性質を有する組換えＲＮＡ転写物を生産するために選択される。本発明は、供給源（例えば、細胞型、組織、動物など）、性質（例えば、細胞抽出物からの合成、組換え、精製など）、および／または対象のヌクレオチド配列および／または対象のタンパク質の配列に限定されない。
【０１１７】
複数の実施形態において、本発明は、ＴＧＦβファミリーのメンバーおよびＦＧＦファミリーのメンバーを含んでなる組成物を提供する。一実施形態において、本発明は、アクチビンＡ（ＡＣＴａ）およびケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を含んでなる組成物を提供し、該組成物中のＡＣＴａの濃度は、未分化状態において胚幹細胞を維持し、該組成物中のＫＧＦの濃度は、胚幹細胞の増殖を維持する。一実施形態において、本発明は、アクチビンＡによる未分化状態の維持、およびケラチノサイト成長因子、ＮＩＣ、または双方による増殖を増加させるための組成物に関する。
【０１１８】
複数の実施形態において、アクチビンＡ、ＫＧＦ、または双方は組換え体である。
【０１１９】
一実施形態において、本発明は、配列番号：１に対して少なくとも９０％の同一性を有する第１のポリペプチド、および配列番号：１７に対して少なくとも９０％の同一性を有する第２のポリペプチドを含んでなる組成物を提供し、該組成物中の第１のポリペプチドの濃度は、未分化状態において胚幹細胞を維持するのに十分であり、該組成物中の第２のポリペプチドの濃度は、胚幹細胞の増殖を維持するのに十分である。したがって、他の実施形態において、第１のポリペプチドは、配列番号：１および３〜１６のいずれに対しても少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（またはそれ以上）同一性である。同様に、他の実施形態において、第２のポリペプチドは、配列番号：１７〜２４のいずれに対しても少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（またはそれ以上）同一性である。
【０１２０】
一実施形態において、アクチビンＡおよび／またはＫＧＦの変異体が存在し、各変異体の配列は独立して、開示された配列のうちの１つの配列と少なくとも９５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも７０％の同一性、および／または少なくとも６５％の同一性を有する。
【０１２１】
別の実施形態において、本発明は、組換えＫＧＦを含んでなる組成物を提供し、組換えケラチノサイト成長因子は、配列番号：１７に対し少なくとも９０％同一性のポリペプチドを含んでなる。別の実施形態において、本発明は、ケラチノサイト成長因子が、配列番号：１１〜１４の１つ以上に由来する組成物を提供する。したがって、他の実施形態において、第２のポリペプチドは、配列番号：１７〜２４のいずれに対しても少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（またはそれ以上）同一性である。
【０１２２】
本発明による組成物は、ニコチナミドを含むことができる。ＮＩＣは、所望の長さの期間、生育能力を維持し、および／または増殖するために幹細胞の少なくとも１つの培養を可能にするのに十分な量で組成物に存在できる。
【０１２３】
ＴＧＦβおよびＦＧＦファミリーのメンバーならびにＮＩＣは、独立して液体または固体（乾燥）形態などの任意の物理形態で提供できる。液体形態で提供された場合、追加の安定化剤を、保存に役立てるように含むことができる。乾燥形態は、乾燥時または再水和時の安定性に役立てるように添加できる、乾燥時に含ませる追加の物質を含むことができる。
【０１２４】
本発明の組成物は、一般にＴＧＦβおよびＦＧＦファミリーのメンバーならびにＮＩＣに加えて成分を含んでなる。追加の成分は、幹細胞の増殖または幹細胞あるいは幹細胞により生産された物質の動物またはヒト対象への導入に好適であるか、または適合性であることが知られている任意の物質であり得る。例えば、それは、例えば、塩類（例えば、ＮａＣｌ）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、および他の成分（例えば、デンハート液、ドライミルク、サケ精子ＤＮＡなど）を含むことができる。あるいは、それは、血液あるいは血清または血清成分などの血液製剤を含むことができる。したがって、それは、「ＫＯ」血清培地または「ＫＯ」血清を含有する培地として当業界に一般に公知の増殖培地を含む増殖（すなわち、培養）培地であり得る。該培養培地は、ＴＧＦβファミリーのメンバー、ＦＧＦファミリーのメンバーおよびＮＩＣ、あるいはこれらのうちの２つまたは３つ全ての組合わせを含むことができる。該組成物の各々および全ての成分も生物学的に適合性である必要はないが、該成分は、生体適合性を評価するために典型的に用いられる多くの評価基準に基づいて、生物学的に適合性であるか、または許容できるレベルまでの該成分の負の生物学的作用を最少にするように十分に低い濃度で存在することが好ましい。ＴＧＦβおよびＦＧＦファミリーのメンバーならびにＮＩＣを含んでなる組成物は、無菌（もちろん、組成物に意図して含ませた幹細胞または他の細胞に関するもの以外）であることが好ましい。幹細胞の増殖および維持において本発明の組成物の有用性に鑑みて、本発明の組成物は、それら自体ｈＥＳＣなどの胚幹細胞などの幹細胞を含むことができることは明らかである。
【０１２５】
直前で述べられたように、一定の実施形態において、該組成物は幹細胞を含んでなる。該幹細胞は、１種以上のＴＧＦβファミリーのメンバー、１種以上のＦＧＦファミリーのメンバー、ＮＩＣ、またはこれらのうちの２つまたは３つ全ての組合わせの存在下で増殖される細胞であり得る。該幹細胞は、未分化状態であってもよいが、必ずしもそうでなくてもよい。さらに、組成物中の細胞全てが未分化状態であることが望ましいことが多いが、細胞の増殖と生存における不均質性のため、恐らく所望の特性を有する組成物中の細胞は、１００％未満である傾向がることが認められる。この事実は、未分化状態または多能性状態の有意な細胞数（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上）を有する組成物を除外するものとして理解することができない。
【０１２６】
第３の態様において、本発明は、未分化状態または多能性状態の胚幹細胞を増殖および／または維持するのに必要とされる材料のある部分または全てを含有するキットを提供する。その最も基本的な形態において、該キットは、所望の結果を達成するための十分な時間量、培養中の幹細胞を増殖および維持するのに十分な量でアクチビンＡなどのＴＧＦβファミリーのメンバー、ＫＧＦなどのＦＧＦファミリーのメンバー、ＮＩＣ、またはこれらのうちの２つまたは３つ全ての組合わせを含有する少なくとも１つの容器を含んでなる。該細胞は、未分化状態または多分化能状態であることが好ましい。所望の結果としては、特定の物質の検出可能な量の産生、培養プレート上の培養物の集密化、対象への移植のために有意な細胞数の生産などの医学的または科学的に関連する結果であり得る。複数の実施形態において、該キットは、本発明の方法の１つ以上の実施形態を実施するのに必要な全ての成分を含む。本発明に従ってキット中の材料を使用するための取扱い説明書である補助的な部品もまた、キットのある一定の実施形態に含まれる。
【０１２７】
したがって、ある一定の実施形態において、該キットは、ＴＧＦβファミリーのメンバー（アクチビンＡなど）、ＦＧＦファミリーのメンバー（ＫＧＦなど）、ＮＩＣ、またはこれらのうちの２つまたは３つ全ての組合わせを含有する単独の容器を含んでなる。他の実施形態において、該キットは、各々がアクチビンＡなどのＴＧＦβファミリーのメンバー、ＫＧＦなどのＦＧＦファミリーのメンバー、ＮＩＣの１つ以上を含有する２つまたは３つの容器を含んでなる。後者の場合において、容器は、組合わせを１つに包装して（すなわち、キット自体であり得るが、必ずしもそうではない単独容器）提供される。すなわち、例えば、アクチビンＡ、ＫＧＦ、ＮＩＣ、またはこれらのうちの２つまたは３つ全ての組合わせを含んでなる組成物を、第１の容器に含有し、これらの成分（任意の量で）の１つ以上を独立して含んでなる別の組成物を、第２の異なる容器に含有して、双方とも単一包装に含まれる。本発明による種々の組成物（ならびに本発明に有用な他の組成物）の複数の容器を単独キットに含めることができ、実務者が、本発明の方法を実施する上で種々の容量の材料を使用することを可能にする。この方法において、実務者は、複数キットを得る必要はなく、本発明を複数回または大容量の細胞で実施できる。
【０１２８】
ＴＧＦβおよびＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質および／またはＮＩＣの量は、所望の時間量で維持または増殖される幹細胞の少なくとも１つの培養を可能にするのに十分であるように独立して選択される。各物質は、それ自体の容器に含有することができるか、または２種以上が単独容器に含有することができる。この方法で、実務者は、適切な物質または必要とされる具体的な適用のための物質の組合わせを選択できる。
【０１２９】
ある一定の実施形態において、アクチビンＡなどのＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質、ＫＧＦなどのＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質、およびＮＩＣのうちの少なくとも２つは、組み合わせを１つの包装にして一緒に提供される。すなわち、これらのうちの少なくとも２つ、および好ましくは、３つが、キット内の単容器に含まれる。キット内に２つまたは３つを提供することにより、実務者がキットを開封後、それらを組合わせる必要が省かれ、本発明の方法を実施するのに必要な時間を短縮することができるか、または成分を量る誤差、あるいはこぼれなどによる材料の損失を最少にできる。他の実施形態として、本実施形態によるキットは、キット内に複数の容器を含むことができ、各容器は、同じ材料、異なる材料、または容器の幾つかが他と同じ材料を含有する一方、幾つかの容器はユニークな内容物を含有する。
【０１３０】
複数の実施形態において、１つ以上の個々の成分（例えば、アクチビンＡ、ＫＧＦ、およびＮＩＣ）の複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）の容器がキット内に含まれる。複数の実施形態において、２つ以上の成分の複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ）の容器がキット内に共に含まれている。複数の実施形態において、手袋および／または他の供給品または試薬（限定はしないが、キットの１つ以上の成分を再水和させるための滅菌水または滅菌水溶液など）も含まれる。
【０１３１】
上記の検討から見ることができるように、所望の場合、ＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質、ＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質、および／またはＮＩＣ以外をキットに含むことができる。例えば、これら物質用の溶媒または希釈剤を含むことができる。さらに、シリンジ、ピペットなどのキットの成分を量るか、または送達するための材料を含むことができる。これら追加の部品などの各々を、１品目以上の包装で含むことができるか、または別個に無包装の品目として含むことができる。
【０１３２】
容器は、含有されるＴＧＦβファミリーのタンパク質、ＦＧＦファミリーのタンパク質、および／またはＮＩＣ、および／または任意の追加の部品に好適なものであり得る。したがって、容器は、限定はしないが、金属、プラスチック、ゴム、サラン、およびガラスで作製されたものなど、チューブ、アンプル、バイアル、缶、バッグ、またはジャーであり得る。複数の実施形態において、容器は、幹細胞を含んでなる培地に成分を供給するのに好適なシリンジまたはピペットなどの送達用具であり得る。容器は、最初の開封後、未使用の内容物を保存するために再密封できるか、または自動的に密封されることが好ましい。容器およびそれらの内容物は、無菌（または開封前に滅菌）であることが好ましい。
【０１３３】
キットそれら自体は、ボール紙、プラスチック、金属、またはガラスなどの任意の好適な材料から製作できる。ボール紙とプラスチックは、好ましいキット用材料である。
【０１３４】
キットの１つ以上の成分の使用、または本発明の方法を実施するための取扱い説明書を、キットに含むことができる。取扱い説明書は、紙、カード、プラスチックシートなどの印刷材料など、別個の部品として供給できる。あるいは、取扱い説明書は、キット自体、例えば、キットの側部または上部または底部に提供できる。あるいは、取扱い説明書は、キットの成分用容器に提供できる。
【０１３５】
第４の態様において、本発明は、未分化および多能性である幹細胞を提供する。幹細胞は、フィーダー細胞、マウス胚フィーダー層により馴化された培地、および／またはＳＴＡＴ３の活性化処理を含まない組成物中に提供できる。複数の実施形態において、該幹細胞は、アクチビンＡなどのＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質、ＫＧＦなどのＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質、ＮＩＣ、またはこれらのうちの２つまたは３つ全ての組合わせを含んでなる組成物中に提供される。複数の実施形態において、該組成物は、アクチビンＡ、ＫＧＦ、およびＮＩＣを含んでなる。該幹細胞は、上記に開示された任意の細胞であってもよいが、好ましい実施形態において、該細胞は、ヒト胚幹細胞などのヒト幹細胞である。
【０１３６】
一般に、該幹細胞は、本発明の方法の使用により生産された細胞である。すなわち、本発明の幹細胞は、ＴＧＦβファミリーメンバーのタンパク質、ＦＧＦファミリーメンバーのタンパク質、ＮＩＣ、またはこれらのうちの２つまたは３つ全ての組合わせに対する幹細胞の暴露により生産されたものである。該幹細胞は、馴化培地、フィーダー細胞、またはＬＩＦの不在下で１種以上のこれらの物質に曝露させる。該幹細胞は、上記のとおり複数回継代させた細胞であり得る。
【実施例】
【０１３７】
本発明は、以下の実施例によりさらに説明されるが、これは、本発明を単に例示するものであることが意図されており、決して本発明を限定するものと考えてはならない。
【０１３８】
実施例１：フィーダー細胞または馴化培地の不在下で幹細胞の多能性の維持
【０１３９】
本発明は、胚幹（ＥＳ）細胞における未分化状態および／または多能性の維持、特にＴＧＦβファミリーのメンバー、ＦＧＦファミリーのメンバー、および／またはＮＩＣに富んだ培養培地を用いて、未分化ヒト幹細胞系を維持するための組成物および方法に関する。本実施例は、ＴＧＦβファミリーメンバーのアクチビンＡの存在下での増殖は、幹細胞の多能性を維持し、ＦＧＦファミリーメンバーのケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）の添加により、細胞が老化に入ることなく増殖できる時間量を延長することが示される。また、培養培地に対するＮＩＣの添加により、細胞が老化しないで増殖できる時間量を延長することが示される。
【０１４０】
マウスＥＳにおける未分化状態および多能性の維持は、マウス線維芽細胞のフィーダー層（ｍＥＦｓ）の存在または白血病抑制因子（ＬＩＦ）によるＳＴＡＴ３の活性化¹を必要とする。ヒト胚幹細胞系（ｈＥＳ）は、最近、研究^2、3用にのみ利用されてきており、自己再生と分化に関する細胞内経路は、この時点で大部分が不明である。最近、本発明者と協力者⁴ならびに他の研究者⁵により、ＳＴＡＴ３活性化は、ｍＥＦｓに対して増殖された場合、またはｍＥＦｓにより馴化培地で処理された場合、ヒトＥＳ細胞系の分化を遮断するのに十分ではないことが示されている。本実施例は、アクチビンＡに富んだ培養培地が、フィーダー層、ｍＥＦｓにより馴化された培地、またはＳＴＡＴ３の活性化処理を必要とせずに、少なくとも１０回の継代の間、未分化状態にｈＥＳを維持できることを示している。ｈＥＳ細胞は、ＯＣＴ−４、ｎａｎｏｇおよびＴＲＡ−１−６０など、未分化状態のマーカーを保持し、テラトーマのインビボ形成により示されるように、多能性を存続した。
【０１４１】
ｈＥＳの多分化能は、ｍＥＦｓ^2、3、ｍＥＦｓによる馴化培地⁶、またはヒトフィーダー層⁷に対して増殖させた場合にのみ維持されることが公表されている。さらに、フィーダー層から受けたシグナルは、ＬＩＦ／ｇｐ１３０経路を介して操作されないことが報告されている^4、5。したがって、馴化培地（ＣＭ）に存在するフィーダー層および／または溶解性因子へのｈＥＳ細胞の接触によって作動され易い代りの経路が、多能性の維持の原因となっているに違いない。位相差顕微鏡下、組織学的染色法を用いて、本発明者と協力者が以前に示したように⁴、ＨＳＦ６の増殖と表現型の特性は、ラミニン被覆皿上で増殖された場合のフィーダー層上およびｍＥＦ ＣＭ内と同様である。この場合、細胞は互いに異なる未分化コロニー内で増殖する。したがって、フィーダー層によって分泌される溶解性因子は、多能性の維持に役立つように見える。これらの因子が何であるかを判定するために、我々は、ヒト胎児膵臓組織の培養における経験に基づいて成長因子の種々の組合わせを試験した。本発明者らは、予備的実験およびｈＥＳ細胞における高レベルのｂ１発現に基づいて接着に関してラミニン１を用いた⁶。しかしながら、フィブロネクチンおよびコラーゲンなどの接着に関する他の公知の基質も、等しく有効に使用できたことを解すべきである。
【０１４２】
ｈＥＳ細胞が、アクチビンＡおよびＫＧＦの存在下でラミニン上で増殖された場合、それらは、フィーダー層上またはＣＭ内の細胞に対する染色と同等に、幹細胞マーカーＴＲＡ−１−６０およびＯＣＴ−４に対して均一に染色し、１０回の継代にわたる連続増殖後、未分化のままであった。ｏｃｔ−４、ｎａｎｏｇ、およびテロメラーゼのロバスト遺伝子発現もまた、フィーダー層上で増殖するコロニー内で得られたものと同等のレベルで、細胞単層内でＲＴ−ＰＣＲにより見られた。形態は、通常のタイトコロニー形成から、元のコロニーに見られるものよりも大きく出現する均一形状細胞の不規則単層まで徐々に変化した。そのままにしておくと、最終的に細胞は、連続単層を形成し、皿上に盛り上がった。しかしながら、これらの形態変化は、可逆性であり；細胞をフィーダー層に戻して置くと、それらは、フィーダー層上で予想された形態と同様のコロニー形成を徐々に再開した。
【０１４３】
アクチビンＡを増殖培地から除くと、細胞形態は、より分化されたタイプに急速に変化した；１週後もはや細胞はｎａｎｏｇを発現せず、免疫反応性ＴＲＡ−１−６０の喪失と、ＯＣＴ−４タンパク質レベルの減少が同時にあった。アクチビンＡをＢＭＰ−４で置き換えた場合、細胞は、１週後、未分化表現型を維持することができず、ｎａｎｏｇ、ｏｃｔ−４、およびテロメラーゼの発現が喪失した；ＫＧＦが除去されると、細胞は、未分化表現型を維持したが、増殖速度は減少し、１回の継代を超えて継代培養ができなかった。
【０１４４】
形質変換成長因子のβファミリーのメンバーであるアクチビンＡは、ＦＳＨ合成および分泌の刺激物質としてブタ濾胞性液^8、9から最初に単離された。「アクチビン」、「アクチビンＡ」、「アクチビンＢ」、「アクチビンＡＢ」、「赤芽球分化誘導タンパク質」、および「ＥＤＦ」は、ＴＧＦ−ベータ−ファミリーのメンバーであり、これは、低体温および脳下垂体ホルモン分泌、生殖腺ホルモン分泌、幹細胞発生および成熟化、赤芽球分化誘導、インスリン分泌、神経細胞生存、胚軸発生、骨成長などの多様な生物学的機能を活性化するが、それらの機能は、サブユニット組成物に関連する。それは、多様な生物学的な機能の自己分泌またはパラ分泌レギュレーターとして多種多様の組織において同定されている（レビューを参照¹⁰）。重要なことに、本発明者は、ｍＥＦｓ中にアクチビンＡ転写体の高発現およびｍＥＦｓにより馴化された培地中に豊富な分泌タンパク質を認めた。さらに、ＨＳＦ６細胞は、フォリスタチン、アクチビンＡの天然阻害剤の存在下、ｍＥＦｓに対して増殖させた場合に分化した¹⁰。興味深いことに、アクチビンＢは、他の間葉細胞により分泌されることが示され、その分泌は、ｍＥＦｓに対するｈＥＳを培養する際にルーチンに使用されるＦＧＦ２によりアップレギュレートされる¹¹。これらのデータを一緒にすると、ｍＥＦｓにより分泌されるアクチビンＡは、ｈＥＳ細胞の「ステムネス("stemness")」の維持の原因となることを意味している。
【０１４５】
ｈＥＳにおける分化誘導阻害は、アクチビンＡに特異的であった。別のＴＧＦβファミリーのメンバーであるＢＭＰ−４は、マウスＥＳ細胞における多能性を維持できるが¹²、ｈＥＳの場合はそうではない。これは、これら２種の細胞の間の唯一の違いではなく、ｍＥＳとｈＥＳｔは、維持のＬＩＦに依存性が異なる⁴。ｍＥＳ細胞において、ＢＭＰ−４は、多能性および分化誘導の双方の維持に逆説的な役割を演じ¹²、¹³、存在する他の因子または発生段階に極めて依存し易い。ｈＥＳ細胞は、ＢＭＰ−４およびＫＧＦの存在下で急速に分化し、培養１週後にｏｃｔ−４、ｎａｎｏｇ、およびテロメラーゼの発現が喪失した。
【０１４６】
アクチビンＡはまた、ｍＥＳの中胚葉への分化誘導¹³、膵臓前駆体細胞のβ細胞への分化誘導¹⁴、神経分化誘導の阻害^15、16、さらに最近ｈＥＳ細胞における内胚葉の誘導¹⁷に関係している。しかしながら、本開示は、未分化状態での幹細胞の維持においてアクチビンＡの重要な役割に関し、またｍＥＦｓより馴化された培地中のその存在に関する最初の文書資料である。
【０１４７】
アクチビンＡとＫＧＦの存在下、単層で増殖されたｈＥＳの移植後のヌードマウスで増殖されたテラトーマは、多くの外肺葉、内胚葉、および中胚葉を示した。さらに、胚葉体からＲＮＡに対して実施されたＲＴ−ＰＣＲは、全て３層の胚細胞層に特異的な遺伝子発現を示した。これらのデータは、アクチビンＡを含有する培地中のｈＥＳの維持は、他の外来細胞またはヒト細胞との共培養の必要がなく、多分化能の維持を可能にすることを示している。
【０１４８】
非膜内外ＰＴＫｓは、細胞膜受容体の細胞基質ドメインとのシグナル伝達複合体を形成する。非膜内外ＰＴＫｓを介してシグナル伝達する受容体としては、サイトカイン（例えば、糖タンパク質１３０（ｇｐ１３０）ファミリー）、ホルモン、および抗原特異的リンパ球性受容体が挙げられる。多くのＰＴＫｓは、ＰＴＫ活性化によりもはや正常な細胞制御に供されなかった癌細胞の発癌遺伝子産物として最初に同定された。実際、公知の発癌遺伝子の約三分の一は、ＰＴＫｓをコードする。さらに細胞形質転換（腫瘍形成）は、チロシンリン酸化活性の増加により達成されることが多い²²。したがって、ＰＴＫ活性の調節は、幾つかのタイプの癌を制御するのに重要な戦略となり得る。
【０１４９】
材料と方法：以下のものは、実施例に用いられる代表的な材料と方法である。
【０１５０】
幹細胞培養：ｈＥＳ細胞系ＨＳＦ６は、以前に記載された¹⁹、ノックアウト血清リプレーサー、グルタミン、非必須アミノ酸類、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（全てＧｉｂｃｏより、カリフォルニア州カールスバッド；www.invitrogen.com）を含有する高グルコースＤＭＥＭからなるＤＳＲ培地中、またはラミニン（２０μｇ／ｍｌ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、www.chemicon.com）被覆皿上、または５０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えアクチビンＡ（ＡＣＴ Ａ）、５０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）（双方ともＰｒｅｐｒｏｔｅｃｈ社より、ニュージャージー州ロッキーヒル；www.preprotech.com）を含有するＤＳＲ中、３７℃、５％ＣＯ₂でマイトマイシンＣ処理ＣＦ１マウスフィーダー層（ｍＥＦ）上に維持された。これらの濃度は、ヒト胎児膵細胞培養による以前の実験^14、20から決定された。幾つかの実験において、１０ｎｇ／ｍｌのヒト組換え骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス、www.RnDSystems.com）は、ＡＣＴ Ａの代りに用いられ、０．４μｇ／ｍｌのフォリスタチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造元の指示に従って５０ｎｇ／ｍｌのＡｃｔ Ａを中和するのに十分なｍＥＦｓに対して増殖されたＥＳ細胞に加えた。培地は、ｍＥＦｓ上で増殖される細胞に対して毎日、成長因子によりラミニン上で増殖される細胞に対して１日おきに変えた。細胞は、１：３または１：４希釈で週１回継代培養を行った。
【０１５１】
あるいは、ｈＥＳ細胞系ＨＳＦ６は、以前に記載された⁴ＤＳＲ中、３７℃、５％ＣＯ₂でマイトマイシンＣ処理ＣＦ１マウスフィーダー層（ｍＥＦ）上に維持された。本明細書に記載された実験に関して、継代４３ｈＥＳ細胞は、１０ｎｇ／ｍｌの基本的線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ２；Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ社より、ニュージャージー州ロッキーヒル；www.preprotech.com）で補足されたｍＥＦｓにより馴化された培地（ＣＭ）の存在下、ラミニン（２０μｇ／ｍｌ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、www.chemicon.com）被覆皿上、または５０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えアクチビンＡ、５０ｎｇ／ｍｌのヒト組換えＫＧＦ（双方ともＰｒｅｐｒｏｔｅｃｈより）、および１０ｍＭのニコチンアミド（ＮＩＣ；Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）を含有するＤＳＲ培地中ラミニン上で培養された。５ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、および１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを用いてｈＥＳ細胞による用量応答により、５０ｎｇ／ｍｌが、未分化状態での細胞を維持するのに最適であることが示された。
【０１５２】
幾つかの実験において、１０ｎｇ／ｍｌのヒト組換え骨形成タンパク質４（ＢＭＰ−４；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス、www.RnDSystems.com）は、アクチビンＡの代りに用いられ、２μｇ／ｍｌの組換えマウスＦＳ−２８８フォリスタチン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造元の指示に従って５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡを中和するのに十分なｍＥＦｓに対して増殖されたＥＳ細胞に加えた。培地は、ｍＥＦｓ上またはＣＭ内で増殖される細胞に対して毎日、成長因子によりラミニン上で増殖される細胞に対して１日おきに変えた。細胞は、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＶ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で５分間の緩やかな処理によって１：３または１：４希釈で週１回継代培養を行い、次いでかき取った。
【０１５３】
免疫組織化学：幹細胞培養物を、ｍＥＦｓで被覆されたカバースリップ上、または４％パラホルムアルデヒドで固定されたラミニン上で増殖し、染色した。幹細胞マーカーＴＲＡ−１−６０およびＯｃｔ−４のタンパク質発現を、第一次マウス坑ＴＲＡ−１−６０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）およびウサギ坑ＯＣＴ−４坑血清（Ｕ Ｐｅｎｎ、ハンス・スコーラー（Ｈａｎｓ Ｓｃｈｏｌｅｒ）博士より恵与）を用いて免疫組織化学により分析した。対照スライドを、マウスＩｇＭおよびウサギＩｇＧと共に温置した。アフィニティ精製ローダミンレッド−複合化ロバ坑マウスＩｇＭおよびフルオレセイン−複合化ロバ坑ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を、第一次抗体に向けた。カバースリップを、フェード防止培地（Ｂｉｏｍｅｄａ社、カリフォルニア州フォスターシティー；http://biomeda.com）に取り付け、蛍光付属装置が具備されたＮｉｋｏｎエクリプスＥ８００顕微鏡（ＮｉｋｏｎＵＳＡ，ニューヨーク州メルビレ；www.nikonusa.com）で観察した。画像は、ＳＰＯＴデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、ミシガン州スターリングハイツ；www.diaginc.com）で捕捉し、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ４．０（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、メリーランド州シルバースプリング；www.mediacy,com）を介して獲得した。カラー合成写真は、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ７．０（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州マウンテンビユー；www.adobe.com）を用いて処理された。
【０１５４】
あるいは、ｈＥＳ細胞培養を、ｍＥＦｓで被覆されたカバースリップ上、または４％パラホルムアルデヒドで固定されたラミニン上で増殖し、以前に記載された⁴とおり免疫染色した。幹細胞マーカーＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ−４およびＯｃｔ−４のタンパク質発現を、第一次マウス坑ＴＲＡ−１−６０ＩｇＭ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）マウス坑ＳＳＥＡ−４ＩｇＧ３（ＤＳＨＢ、アイオワのＵ、アイオワ州アイオワシティー）、およびウサギ坑ＯＣＴ−４坑血清（Ｕ Ｐｅｎｎ、ハンス・スコーラー（Ｈａｎｓ Ｓｃｈｏｌｅｒ）博士より恵与）を用いて分析した。対照スライドを、マウスＩｇＭまたはＩｇＧおよびウサギＩｇＧと共に温置した。
【０１５５】
ＲＴ−ＰＣＲ：ＲＮＡを、ＤＮアーゼ処理を含むＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州ヴァレンシア；www1.qiagen.com）を用いて精製し、３．２μｇのランダムプライマーによるＡＭＶ（双方ともＲｏｃｈｅ、インディアナ州インディアナポリス；www.roche-applied-science.com）および２０μＬの反応容量中１μｇの全ＲＮＡを用いて逆転写した。５０μＬの全容量中、１μＬのｃＤＮＡを各ＰＣＲ反応に用いた。β−アクチン発現を、サンプル定量化および比較（すなわち、内部対照として）のために用いた。
【０１５６】
ヒトｏｃｔ−４、ｎａｎｏｇ、およびテロメラーゼに特異的プローブを調製した。実施例に用いられたオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有した：
β−アクチン 順方向：ｃｇｃａｃｃａｃｔｇｇｃａｔｔｇｔｃａｔ(配列番号36)
逆方向：ｔｔｃｔｃｃｔｔｇａｔｇｔｃａｃｇｃａｃ(配列番号37)
ｏｃｔ−４ 順方向：ｇａｇｃａａａａｃｃｃｇｇａｇｇａｇｔ(配列番号38)
逆方向：ｔｔｃｔｃｔｔｔｃｇｇｇｃｃｔｇｃａｃ(配列番号39)
ｎａｎｏｇ 順方向：ｇｃｔｔｇｃｃｔｔｇｃｔｔｔｇａａｇｃａ(配列番号40)
逆方向：ｔｔｃｔｔｇａｃｔｇｇｇａｃｃｔｔｇｔｃ(配列番号41)
アクチビンＡ 順方向：ｃｔｔｇａａｇａａｇａｇａｃｃｃｇａｔ(配列番号42)
逆方向：ｃｔｔｃｔｇｃａｃｇｃｔｃｃａｃｔａｃ(配列番号43)
神経Ｄ： 順方向：ｇａｇａｃｔａｔｃａｃｔｇｃｔｃａｇｇａ(配列番号44)
逆方向：ｇａｔａａｇｃｃｃｔｔｇｃａａａｇｃｇｔ(配列番号45)
短尾
Ｔ遺伝子： 順方向：ｃａａｃｃａｃｃｇｃｔｇｇａａｇｔａｃ(配列番号46)
逆方向：ｃｃｇｃｔａｔｇａａｃｔｇｇｇｃｔｃ(配列番号47)
α−胎児
タンパク質： 順方向：ａｇａａｃｃｔｇｔｃａｃａａｇｃｔｇｔｇ(配列番号48)
逆方向：ｇａｃａｇｃａａｇｃｔｇａｇｇａｔｇｔｃ(配列番号49)
ＡＬＫ−４： 順方向：ｃａｃｇｔｇｔｇａｇａｃａｇａｔｇｇｇ(配列番号50)
逆方向：ｇｇｃｇｇｔｔｇｔｇａｔａｇａｃａｃｇ(配列番号51)
ＡＣＶＲ−２： 順方向：ｇｇｇａｇｃｔｇｃｔｇｃａａａｇｔｔｇ(配列番号52)
逆方向：ｃｃａｃａｔｃａａｃａｃｔｇｇｔｇｃｃ(配列番号53)
ＡＣＶＲ−２Ｂ：順方向：ｃａｃｃａｔｃｇａｇｃｔｃｇｔａａｇ(配列番号54)
逆方向：ｇａｇｃｃｃｔｔｇｔｃａｔｇｇａａｇｇ(配列番号55)
ｈＴＥＲＴ 順方向：ｃａｇｃｔｃｃｃａｔｔｔｃａｔｃａｇｃａ(配列番号56)
逆方向：ｃｇａｃａｔｃｃｃｔｇｃｇｔｔｃｔｔｇ(配列番号57)
【０１５７】
ＰＣＲ産物を、１．２％アガロースゲル（ｈｔｅｒｔに関して１．６％）上に乗せて臭化エチジウムにより染色した。
【０１５８】
多能性：多能性は、膵島前駆細胞の分化誘導の分析のために以前に記載された²¹ヌードマウスの腎嚢下にｈＥＳ細胞の移植８週後のテラトーマ形成を調べることによってインビボ評価された。短時間に、ｈＥＳを、ラミニンまたはｍＦＥｓから取り出し、Ｃｏｓｔａｒ Ｕｌｇｔｒａ Ｌｏｗ Ｃｌｕｓｔｅｒ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、ニューヨーク州コーニング；www.corning.com）中で一晩、胚葉体を形成させた。それらをペレットに遠心分離し、１０μｌの陽圧ピペットで採取し、腎嚢下に注意深く挿入した。この方法は、極めて首尾よく実験的に膵島移植され、またｈＥＳ細胞からのテラトーマ分析に非常に有効である。移植片を取り出し、固定し、ヘマトキシリンとエオシンとで染色した。多分化能は、記載された胚葉体形成後の遺伝子発現を評価することによりインビトロ評価された。
【０１５９】
あるいは、多能性は、内分泌膵前駆細胞の分化誘導の分析のために以前に記載された²⁰ヌードマウスの腎嚢下にｈＥＳ細胞の移植８週後のテラトーマ形成を調べることによってインビボ評価された。移植片を取り出し、固定し、ヘマトキシリンとエオシンとで染色した。多能性は、ｈＥＳ細胞に由来し、１７日間培養された胚葉体における遺伝子発現を分析することによりインビトロ評価された。
【０１６０】
異なる培養条件下で増殖率を定量化するための増殖アッセイ：細胞を、フィーダー層からＦＧＦ２補足ＣＭあるいはアクチビンＡ、ＫＧＦ、ＮＩＣ、またはこれら３つの因子の組合わせの存在下、ラミニン上の６ウェルプレート内で培養した。培養物を、新たに補充された培地中、１μＣｉ／ｍｌ［メチル³Ｈ］チミジン（比放射能６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ；ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、カリフォルニア州アーバイン；www.mpbio.com）によりパルス化した。１６時間後、細胞を収穫し、チミジンの細胞への取込みを以前に記載された²³とおり定量化した。手短にＤＮＡ含量を蛍光的に測定し、³Ｈチミジンの取込みは、音波処理細胞のトリクロロ酢酸沈殿の液体シンチレーションカウントすることにより測定された。観察された統計学的有意差は、分散分析およびＳｔａｔｖｉｅｗ ＩＶ（Ａｂａｃｕｓ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ、カリフォルニア州バークレイ）を用いて有意限界として９５％レベルを有するフィッシャーの保護最小有意差検定により判定された。
【０１６１】
フローサイトメトリー分析：フローサイトメトリーは、異なる培養条件下で未分化細胞を定量化するために使用された。細胞を、６０分のコラゲナーゼ処理を用いて収穫し、次いで単一細胞懸濁液にせん断し、７０ミクロン細胞フィルタを用いてろ過した。各条件から単一細胞を、マウス坑ＴＲＡ−１−６０またはマウスＩｇＭ（対照のため）およびＦＩＴＣ−複合化ロバ坑マウスＩｇＭ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）により標識した。細胞は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎを用いて分析し、細胞表面抗原発現は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて定量化した。
【０１６２】
二次元電気泳動：単独またはｈＥＳ細胞によるフィーダー層として増殖されたｍＥＦｓからの非分画性馴化培地は、以前に記載された²⁴等電点電気泳動および二次元電気泳動によりアッセイした。サンプルを、ニトロセルロースに移し、ＵＣＳＤ、スンイチ・シミサキ（Ｓｕｎｉｃｈｉ Ｓｈｉｍｉｓａｋｉ）博士より恵与のウサギ坑ブタアクチビン抗体によりブロットした。
【０１６３】
ウェスタンブロッティング：ウェスタンブロッティングは、リン酸化Ｓｍａｄ２に用いられ、以前に記載された⁴ＨＳＦ６細胞のライセートに実施された。アクチビンＡの存在下で培養された細胞を、バナジン酸塩（１０μＭ）およびミクロシスチン（１μＭ）で補足された緩衝液を含有する界面活性剤で溶解し、ホスホＳｍａｄ２（ｓｅｒ４６５／４６７）抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、cellsignal.com）により最初にブロットされた。次にブロットをストリップし、Ｓｍａｄ２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）により再プローブ化した。
【０１６４】
核型：核型分析は、標準法（Ｇバンディング）を用いて我々の実験室で、またはＵＣＳＤ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより実施された。少なくとも１５種の細胞を各サンプルから調べた。
【０１６５】
図面に示された結果の記載：
ＨＳＦ６細胞は、細胞増殖に対するアクチビンＡの作用、形態、および幹細胞に対する分化状態を測定するために使用された。本実施例に関連する実験は、上記のとおり実施され、実験から得られた結果を検討し、要約する。この実験結果は、図１の種々の部分およびパネルに示している。
【０１６６】
図１は、アクチビンＡの不在下でｈＥＳ細胞の分化を示す。より具体的には、図１ａは、位相差顕微鏡（上層）、および免疫組織化学（下層）により観察されたＨＳＦ６細胞の形態および分化状態を示す。免疫組織化学分析に関して、ヒト幹細胞マーカーＴＲＡ−１−６０（細胞質）およびＯｃｔ−４（核）に対する抗体を用いた。パネルＩは、ｍＥＦｓに対して培養されたＨＳＦ６細胞が、幹細胞マーカーに対する均一な染色により典型的なコロニー形成を示している。パネルＩＩは、アクチビンＡ、ＮＩＣ、およびＫＧＦ（ＡＮＫ）の存在下、ラミニン上で培養されたＨＳＦ６細胞が、ｍＥＦｓ上で増殖された場合よりも大きな細胞サイズを有する不規則単層として増殖するが、ＴＲＡ−１−６０およびＯｃｔ−４に対するロバスト染色、未分化状態の証拠を示している。パネルＩＩＩは、ｍＥＦｓに戻した場合、パネルＩＩの細胞が、１週後にコロニー形態を再開することを示している。パネルＩＶは、１週間アクチビンＡ（ＮＫ）の不在下で増殖された場合、パネルＩＩの細胞が、ＴＲＡ−１−６０に対して染色せず、またＯｃｔ−４に対して極めて僅かな染色により、分化を示す形態および表現型の明確な変化を示している。パネルＶは、１週間（Ａ）ＫＧＦおよびＮＩＣの不在下で増殖された場合、パネルＩＩの細胞が、表現型に変化を示さないことを示している。しかしながら、増殖は減少し、それらは、さらに継代培養ができなかった。拡大バー＝１００μＭ。
【０１６７】
図１ｂは、ｍＦＥｓ（レーン１）上またはラミニン（レーン２〜５）上の種々の培養条件下でｏｃｔ−４およびｎａｎｏｇに関するｈＥＳ細胞の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ（２６サイクル）を示している。アクチビンの不在下、ラミニン上で１週間培養された細胞において幹細胞マーカーの発現が喪失し（レーン３，５）、未分化表現型を維持するためにアクチビンの必要性を示した。ｍＥＦ＝マウスフィーダー層、ＡＮＫ＝アクチビンＡ＋ＮＩＣ＋ＫＧＦ、ＮＫ＝ＮＩＣ＋ＫＧＦ、ＢＭＰ＝ＢＭＰ−４、＋／−：逆転写酵素。
【０１６８】
図１ｃは、ＦＡＣＳを用いる細胞表面の代表的な比較実験を示している。異なる培養条件からの単一細胞懸濁液を、ＴＲＡ−１−６０に関して免疫染色し、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦａｃＳｃａｎおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。上部パネル：マウス坑ＴＲＡ−１−６０またはマウスＩｇＭ（対照）で染色されたＡＮＫにより培養された細胞のフローサイトメトリー分析。下部パネル：異なる条件下でのＴＲＡ−１−６０を発現する細胞のパーセンテージの比較（ＣＭ＝馴化培地、ＡＮＫ＝アクチビンＡ＋ＮＩＣ＋ＫＧＦ、ＮＫ＝ＮＩＣ＋ＫＧＦ）。細胞は、１週間ＮＫと、また＜１週間ＣＭ中で（不純物のｍＥＦｓを除去するために）、２０回の継代のためＡＮＫと培養した。
【０１６９】
図１ｄは、アクチビンＡ（Ａ）、ＮＩＣ（Ｎ）、ＫＧＦ（Ｋ）または全て３つ（ＡＮＫ）の組合わせの存在下、およびＦＧＦ２補足ＣＭ中、ｈＥＳ細胞の増殖に関する代表的な比較実験を示している。各条件に関する四つ組のウェルを、³Ｈチミジンにより１６時間パルス化した。増殖率は、他の全ての処理と比較してアクチビン処理細胞において減少し、ＫＧＦ存在下の増殖率は、ＡＮＫと同様であり、ＣＭよりも有意に高く、ｈＥＳ細胞の複製におけるＫＧＦの役割を示した。ｎ＝４；ｐ＜０．０００１ＡＮＫ対Ａ、Ｋ対Ａ、ＣＭ対Ａ。ｐ＜０．００５ＡＮＫ対Ｎ、Ｎ対Ａ、Ｋ対Ｎ。ｐ＜０．０５Ｋ対ＣＭ。ｎ．ｓ．ＡＮＫ対Ｋ、ＡＮＫ対ＣＭ、Ｎ対ＣＭ。
【０１７０】
図２は、ＨＳＦ６細胞における多分化能のｍＥＦ維持に対するアクチビン／フォリスタチンの効果を示している。より具体的には、図２ａは、１週間（左パネル）および２週間（右パネル）フォリスタチンの存在下、ｍＥＦｓ上で培養された図１パネルＩからのＨＳＦ６細胞を示している。１週後、コロニーは、明確な形態変化（上部パネル）を示し、ＴＲＡ−１−６０（細胞質）に関して染色を失い、Ｏｃｔ−４（核）に関して染色を減じた（下部パネル）。フォリスタチンの存在下２週後、コロニーは増殖を続けたが、規定された形状を失い、Ｏｃｔ−４免疫反応性は、完全に消失し、分化を示した。拡大バー＝１００μＭ。
【０１７１】
図２ｂは、フォリスタチンの存在下および不在下でｏｃｔ−４およびｎａｎｏｇに関するｍＥＦｓに対するＨＳＦ６の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ（２６サイクル）を示している。幹細胞マーカーの発現は、フォリスタチンの存在下、ｍＥＦｓ上で１週間培養された細胞において無い（ｎａｎｏｇ）か、または著しく減少（ｏｃｔ−４）し、２週後には完全に喪失し、分化を示した。ＲＴ＝逆転写酵素。
【０１７２】
図２ｃは、ＣＦ−１マウスに由来のｍＥＦｓにおけるアクチビンＡ転写体ならびにＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットを用いてｍＥＦ馴化培地中の前駆体タンパク質の同定を示している。左パネル：アクチビンＡ発現を示すＲＴ−ＰＣＲであってＰＣＲ産物サイズは、２６２ｂｐであり；＋／−：逆転写酵素。右パネル：アクチビンＡ前駆体タンパク質を示すウェスタンブロット。サンプルは、二次元電気泳動、坑アクチビン抗体を用いたウェスタンブロットにより分析された。
【０１７３】
図２ｄは、ＨＳＦ６細胞におけるアクチビン経路シグナル伝達成分の同定を示している。左パネル：ＨＳＦ６細胞におけるタイプ１受容体ＡＬＫ−４ならびにタイプＩＩ受容体ＡＣＶＲ−２およびＡＣＶＲ−２Ｂ転写体。ＰＣＲ産物サイズは、それぞれ３４６ｂｐ、７８３ｂｐおよび６１１ｂｐであり；＋／−：逆転写酵素。右パネル：アクチビンＡの存在下で増殖されたＨＳＦ６細胞においてホスホ−Ｓｍａｄ２を示す坑Ｓｍａｄ抗体を用いたウェスタンブロット。Ｓｍａｄ−２分子量＝６０ｋＤａ。細胞は、バナジン酸塩（１０μＭ）およびミクロシスチン（１μＭ）で補足された緩衝液を含有する界面活性剤で溶解した。ブロットは、坑ホスホＳｍａｄ２（ｓｅｒ／４６５／４６７）（パネルＩ）によりプローブ化してから、ストリップし、坑Ｓｍａｄ２（パネルＩＩ）により再プローブ化した。
【０１７４】
図３は、アクチビンＡ、ＮＩＣおよびＫＧＦで培養されたｈＥＳ細胞における多分化能の長期維持を示している。より具体的には、図３ａは、２０回継代のためにアクチビンＡ、ＫＧＦ、およびＮＩＣの存在下で培養されたＨＳＦ６細胞における幹細胞マーカーの分析を示している。上部パネル：免疫組織化学分析は、ＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ−４（赤）およびＯｃｔ−４（緑）に関してロバスト染色を示している。拡大バー＝２００μＭ。下部パネル：ｏｃｔ−４、ｎａｎｏｇ（２６サイクル）およびｈＴＥＲＴ（３５サイクル；産物＝１１４ｂｐ）に関するＲＴＰＣＲ分析。同等の継代数に関してｍＥＦｓ上で培養された細胞の比較のため、同じアッセイで分析され、全てのマーカーの発現が同等のレベルを示した。
【０１７５】
図３ｂは、ヌードマウスにおけるテラトーマ形成を示している。アクチビンＡ、ＫＧＦ、およびＮＩＣの存在下で培養されたＨＳＦ６細胞の代表的な組織構造は、ヌードマウスの腎嚢下に移植された。８週後、腎臓を取り出し、細胞層の３層全ての証拠を示すテラトーマが観察された。Ｃ＝軟骨細胞（中胚葉）、ＰＮＣ＝神経周囲（シュワン）細胞（外肺葉）、ＲＥ＝気道上皮（内肺葉）。拡大バー＝１００μＭ。
【０１７６】
図３ｃは、アクチビンＡ、ＫＧＦ、およびＮＩＣの存在下で培養されたｈＥＳ細胞に由来する胚様体における系列特異的マーカーのＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。それは、全ての細胞型のＲＮＡ発現を示す。神経Ｄ＝外肺葉、Ｔ遺伝子＝中肺葉；α−ＦＰ＝内肺葉、＋／−：逆転写酵素。
実施例の要約
【０１７７】
本試験において、我々は、アクチビンＡ、ニコチンアミド（ＮＩＣ）、およびケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）の存在下、ラミニン上で増殖されたｈＥＳ細胞は、２０回の継代を超えた連続増殖時に未分化のままであることを示す。
【０１７８】
初期の実験において、我々は、膵内分泌系列への分化誘導を方向付けると思われるｈＥＳ細胞を培養する培地を開発しようとした。細胞接着に関して、我々は、ｈＥＳ細胞におけるα６ β１発現の高レベルに基づいて⁶、ラミニン１を用いた。ヒト胎児膵細胞における細胞増殖および分化誘導を調節することが以前に示されている種々の成長因子および化学物質のカクテルを試験した。驚くべきことに、これらの条件下で数週間培養されたｈＥＳ細胞は、細胞形態に何ら変化を示さなかった。引き続き、各因子を連続して除外され、多分化能は、ヒト幹細胞に関する公知のマーカー：ＴＲＡ−１−６０、ｎａｎｏｇ、およびＯｃｔ−４の発現によって評価した（データは示していない）。成長因子と、未分化状態で複製するｈＥＳ細胞を維持した化学物質との組合わせが、アクチビンＡ、ＮＩＣ、およびＫＧＦに狭められたら、これら成長因子の各々が単独または種々組合わせて、実験が繰り返された。全て３つの因子（Ａ、Ｎ、Ｋ）を含有する培養物の染色は、幹細胞マーカーＴＲＡ−１−６０およびＯｃｔ−４（図３ａ、パネルＩＩ）に関して均一であり、フィーダー層（図３ａ、パネルＩ）またはｍＥＦｓからのＣＭ（示していない）における細胞に対する染色と同等であった。ｏｃｔ−４およびｎａｎｏｇのロバスト遺伝子発現もまた、フィーダー層上で増殖するコロニー内で得られたものと同等のレベルで細胞単層におけるＲＴ−ＰＣＲにより観察された（図１ｂ）。
【０１７９】
幹細胞および「ステムネス」のホールマークは、束ね増殖である。興味深いことに、ｈＥＳ細胞の外観は、通常のタイトコロニー形成から均一形状細胞の不規則な単層まで徐々に変化した。細胞は、元のコロニーで見られたものよりも大きく出現した（図１ａ、パネルＩＩ）。連続増殖に伴い、それらは、最後には連続単層を形成し、皿に盛り上がった。しかしながら、これらの変化は、可逆性であり：細胞をフィーダー層に戻すと、それらは、フィーダー層で以前に観察された（図１ａ、パネルＩＩＩ）ものと同様にコロニー形成を再開した。
【０１８０】
増殖培地からアクチビンの除去により、細胞形態において分化表現型への急激な変化を生じた（図１ａ、パネルＩＶ）；アクチビンＡなしの１週後、免疫反応性のＴＲＡ−１−６０の同時喪失（図１ａ、パネルＩＶ）と共に、細胞はもはやｎａｎｏｇを発現せず(図１ｂ)、Ｏｃｔ−４タンパク質（図１ａ、パネルＩＶ）およびメッセージ（図１ｂ）のレベルが減少した。免疫組織化学およびＲＴ−ＰＣＲデータは、フローサイトメトリーによる細胞表面抗原発現の定量化により検証された。ＥＳ細胞系Ｈ７およびＨ１４におけるＴＲＡ−１−６０発現における以前の報告²⁵と一致して、ｍＥＦ馴化培地の存在下、ラミニン上で増殖されたＨＳＦ６の６０．３％がＴＲＡ−１−６０を発現した。親細胞と同様のパターンの発現で（図１ｃ）、規定の培地中で増殖された細胞の中で、４５．９６％が、継代２で発現し、継代１０で６０．４６％、継代２０で７１．９％発現した。対照的に、アクチビンが、１週間培地から除かれると、発現レベルは３．９％まで減少した（図１ｃ）。
【０１８１】
規定の培養培地で培養された細胞は、継代２０までの多分化能のマーカーに関して調べられ、試験された全てのマーカーを発現することが判明した：ＴＲＡ−１−６０、ＳＳＥＡ−４、Ｏｃｔ−４（免疫組織化学分析）、ｏｃｔ−４ｎａｎｏｇ、およびテロメラーゼ逆転写酵素（ｈｔｅｒｔ）（ＲＴ−ＰＣＲ）（図３ａ）。
【０１８２】
培地からＫＧＦおよびＮＩＣの除去は、異なる作用を有した；細胞は未分化表現型を維持した（図１ａ、パネルＶ、および図１ｂ）。しかしながら、３つの因子（Ａ、Ｎ、Ｋ）の組み合わせと比較してアクチビン、ＫＧＦ、またはＮＩＣ単独で培養した場合、細胞増殖に有意差があった。アクチビン単独で培養された細胞は、分化しなかった（Ａ：図１ａ、パネルＶ；図１ｂ）；しかしながら、増殖率は、組合わせ（ＡＮＫ）、あるいはＫＧＦまたはＮＩＣ単独で培養されたものと比較して有意に減少した（図１ｄ、ｎ＝４；ｐ＜０．０００１対ＡＮＫまたはＫＧＦ、ｐ＜０．００５対ＮＩＣ）。対照的に、組み合わせで培養された細胞と比較して、ＫＧＦで培養された細胞の増殖率において統計学的差異はなかった。ＮＩＣ単独で培養された細胞増殖は、中間であったが、ＫＧＦまたはＡＮＫ処理細胞よりも有意に少なく（図１ｄ、ｎ＝４；ｐ＜０．００５）、その率は、アクチビン処理細胞よりも有意に高かった（図１ｄ、ｎ＝４；ｐ＜０．００５）。これらのデータから、アクチビンは重要であり、多能性の維持のために恐らく必要であり、ＫＧＦ、およびより少ない程度であるがＮＩＣは、増殖の維持および連続増殖に役立つと、我々は、結論付けた。ＮＩＣの不在下でアクチビンおよびＫＧＦ（ＡＫ）により培養された細胞は、未分化のままで短期間で増殖に成功したが、それらの増殖は、可能性としてその文書化された坑アポトーシス作用のため²⁶、ＮＩＣを含んだこれらの培養と比較して数回の継代にわたって最適以下であった（データは示していない）。したがって、ＮＩＣは、２０回の継代中に使用される成長因子の組合わせに含まれた。重要なこととして、２０回の継代のために未分化細胞のマーカーを維持することに加えて、これらの細胞もまた、正常な核型を保持した（データは示していない）。
【０１８３】
我々は次に、形質転換成長因子−β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーの別のメンバーが、多能性を維持できるかどうかを調査した。アクチビンのように、骨形成タンパク質は、ｈＥＳ細胞の栄養外胚葉への分化誘導など²⁸、多くの細胞応答を調節するタンパク質を分泌する²⁷。分化におけるその役割に加えて、ＢＭＰ−４はまた、ｍＥＳ細胞における多能性を維持することが示されている¹²。対照的に、アクチビンＡが、培地中のＢＭＰ−４と置き換わると、ｈＥＳ細胞は、未分化表現型を維持できず、ｎａｎｏｇおよびｏｃｔ−４発現の完全喪失が、１週後に生じた（図１ｂ）。ｍＥＳ細胞において、ＢＭＰ−４は、恐らく発生の特定の段階に存在する他の成長因子との相互作用のため、また細胞が曝露されるペプチドの濃度のため²⁹、多能性および分化誘導双方の維持において逆説的な役割を演じる^12、13。ある一定の条件下でｈＥＳ細胞のアクチビンＡ誘導分化が既に示されているので³⁰、同様の状態が、アクチビンＡおよびｈＥＳ細胞に生じ得る。
【０１８４】
アクチビンＡは、多様な生物学的機能の自己分泌または内分泌制御因子として多種多様の組織に同定されている^8、10。我々は、ｍＥＦｓにより馴化された培地中、ｍＥＦｓにおけるアクチビンＡ転写体および分泌アクチビンＡ前駆体タンパク質の高発現を見出したことは重要である（図２ｃ）。さらにＨＳＦ６細胞は、タイプＩおよびタイプＩＩ双方のアクチビン受容体およびロバストＳｍａｄ２リン酸化の高レベルを発現する（図２ｄ）。さらに、アクチビン阻害剤のフォリスタチンの存在下で２週後、ｍＥＦｓ上で増殖されたＨＳＦ６細胞は分化し、規定の培地からアクチビンＡの除去により見られた効果（図１ａ〜ｂ）と同様にＥＳマーカーのＴＲＡ−１−６０、Ｏｃｔ−４、およびｎａｎｏｇを完全に喪失した（図２ａ〜ｂ）。これらの実験に用いられたフォリスタチンのイソ体であるＦＳ−２８８は、アクチビンＡに極めて高い親和性であり、ＢＭＰファミリーのメンバーに低い親和性であり、ＴＧＦβに結合しない^10、31。我々は、既にＢＭＰ−４細胞が、ｈＥＳ細胞において多能性を維持するのに無効であることを示しており；したがって、我々が見る分化は、恐らく特定のアクチビン／フォリスタチン相互作用から生じると考えられる。
【０１８５】
アクチビンＡは、ｍＥＳの中胚葉への分化¹³、ヒト膵前駆体細胞のβ細胞への分化¹⁴、神経分化の阻害^15、16、より最近、ｈＥＳ細胞における中胚葉の誘導¹⁷に関係している。しかしながら、これは、ｍＥＦｓにより馴化された培地中のアクチビンの存在、引き続く未分化状態での幹細胞の維持において新規な役割についての最初の文書である。我々は、ｈＥＳ細胞における数種のＷｎｔの発現を検出した（データは示していない）。したがって、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化を介してｈＥＳ多能性維持の最近の報告⁵と共に、我々の知見は、ｈＥＳ細胞における多能性維持のための規定の分子経路を明瞭にさせる可能性がある。
【０１８６】
アクチビンＡに富んだ培地中に維持されたｈＥＳ細胞の多能性のさらなる証拠は、インビボテラトーマ形成によって提供された。ヌードマウスの腎嚢下にｈＥＳ細胞の移植後、移植片は、外胚葉構造、内胚葉構造、および中胚葉構造の証拠を示した（図３ｂ）。さらに、またアクチビンＡの存在下で培養された細胞に由来する１７日齢の胚葉体に対するＲＴ−ＰＣＲによって得られた系列特異的遺伝子発現プロフィルは、全て３層の細胞層に関して同様のパターンの発現を示した（図３ｃ）。これらのデータは、アクチビンＡを含有する培地中のｈＥＳの維持は、他の外来細胞またはヒトの細胞との共培養を必要としないで多能性維持を可能にする。
【０１８７】
これらの細胞事象を媒介する上で重要な因子としてアクチビンＡの同定は、「ステムネス」の原因となる生物学的な経路を解明させるであろう。臨床適用の可能性のためにヒト幹細胞の産生と培養における効率性の増加により、非政府支持研究に利用でき、最近の報告¹⁸における１７種の新規に誘導された幹細胞系がタイムリーに得られる。本明細書に報告された知見は、動物またはヒトのフィーダー層を使用することなく、新規なヒト胚幹細胞系の誘導を促進するであろう。
【０１８８】
種々の変更および変化が、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、本発明の実施が成され得ることは当業者にとって明白であろう。本発明の他の実施形態は、本発明の明細書および実施を考慮することにより当業者にとって明らかとなろう。本発明は以下の請求項によって示されるのが真の範囲および精神であって、明細書および実施例は、単に例示するものであるように意図されている。
【０１８９】
引用文献
本明細書に引用されている他の文献と共に以下の引用文献は、参照としてそれらの全体が本明細書に組み込まれている。
１． スミス，エイ・ジー（Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｇ．）「マウスおよびヒトの胎芽由来の幹細胞」、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １７、４３５−４６２頁 （２００１）。
２． トムソン，ジェー・エイ（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．）ら、「ヒトの胚盤胞に由来する胎芽幹細胞系」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２、１１４５−１１４７頁（１９９８）。
３． ロイビノフ，ビー・エー（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ，Ｂ．Ｅ．）、ペラ，エム・エフ（Ｐｅｒａ，Ｍ．Ｆ．）、フォング，シー・ワイ（Ｆｏｎｇ，Ｃ．Ｙ．）、トロウンソン，エイ（Ｔｒｏｕｎｓｏｎ， Ａ．）およびボンソ，エイ（Ｂｏｎｇｓｏ，Ａ．）「ヒトの胚盤胞に由来する胎芽幹細胞系：インビトロ体細胞分化」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８，３９９−４０４頁（２０００）。
４． ハンフレイ，アール（Ｈｕｍｐｈｒｅｙ，Ｒ．）、ビーティー，ジー・エム（Ｂｅａｔｔｉｅ ＧＭ）、ロペズ，エイ・ディー（Ｌｏｐｅｚ，ＡＤ）、キング，シー・シー（Ｋｉｎｇ ＣＣ）、ブケイ，エヌ（Ｂｕｃａｙ Ｎ）、ヘイエク，エイ（Ｈａｙｅｋ Ａ）「ヒト胎芽幹細胞における多分化能の維持は、独立したＳＴＡＴ３である」、 Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２、５２２−５３０ （２００４）．
５． Ｓａｔｏ，Ｎ．，Ｍｅｉｊｅｒ，Ｌ．， Ｓｋａｌｔｓｏｕｎｉｓ，Ｌ．，Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ，Ｐ．＆ Ｂｒｉｖａｎｌｏｕ，Ａ．Ｈ．「薬理的ＧＳＫ−３特異的阻害剤によるＷｎｔシグナル伝達の活性化を介して、ヒトおよびマウスの胎芽幹細胞における多分化能の維持」、Ｎａｔ Ｍｅｄ １０、５５−６３頁（２００４）。
６． クスウ，シー（Ｘｕ，Ｃ．）ら、「未分化ヒト胎芽幹細胞のフィーダー細胞のない増殖」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９、９７１−９７４頁（２００１）。
７． リチャーズ，エム（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｍ．）、フォング，シー・ワイ（Ｆｏｎｇ，Ｃ．Ｙ．）、チャン，ダブリュー・ケイ（Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｋ．）、ウォング，ピー・シー（Ｗｏｎｇ，Ｐ．Ｃ．）およびボンソ，エイ（Ｂｏｎｇｓｏ，Ａ．）「ヒト内細胞塊および胎芽幹細胞のヒトフィーダー細胞の支持延長による未分化増殖」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０、９３３−９３６頁（２００２）。
８． ヴェール，ダブリュー（Ｖａｌｅ，Ｗ．）ら、「ブタ卵胞液からタンパク質を放出するＦＳＨの精製と特性化」、Ｎａｔｕｒｅ ３２１、７７６−７７９頁（１９８６）。
９． リング，エヌ（Ｌｉｎｇ，Ｎ．）ら、「脳下垂体ＦＳＨは、２つの形態のインヒビンからベータ−サブユニットのヘテロダイマーにより放出される」、Ｎａｔｕｒｅ ３２１、７７９−７８２頁（１９８６）。
１０． ルイシ，エス（Ｌｕｉｓｉ，Ｓ．）、フロリオ，ピー（Ｆｌｏｒｉｏ，Ｐ．）、 ライス，エフ・エム（Ｒｅｉｓ，Ｆ．Ｍ．）およびペトラグリア，エフ（Ｐｅｔｒａｇｌｉａ，Ｆ．）「アクチビンＡの発現と分泌：可能な生理的および臨床的な関係」、Ｅｕｒ Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １４５、 ２２５−２３６頁（２００１）。
１１． シャブ−タル，ワイ（Ｓｈａｖ−Ｔａｌ，Ｙ．）およびジポリ，ディー（Ｚｉｐｏｒｉ，Ｄ．）「ホモポイエシスの調節におけるアクチビンＡの役割」、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２０、４９３−５００頁（２００２）。
１２． イング，キュー・エル（Ｙｉｎｇ，Ｑ．Ｌ．）、ニコルス，ジェイ（Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．）、チャンバーズ，アイ（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｉ．）およびスミス，エイ（Ｓｍｉｔｈ，Ａ．）「Ｉｄタンパク質のＢＭＰ誘導は分化を抑制して、ＳＴＡＴ３と協同で胎芽幹細胞自体の再生を維持する」、Ｃｅｌｌ １１５、２８１−２９２頁（２００３）。
１３． ジョハンソン，ビー・エム（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｂ．Ｍ．）およびウィレス，エム・ヴィ（Ｗｉｌｅｓ，Ｍ．Ｖ．）「哺乳動物の中胚葉および造血発達におけるアクチビンＡおよび骨形成タンパク質４の関与に関する証拠、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５、１４１−１５１頁（１９９５）。
１４． デメテルコ，シー（Ｄｅｍｅｔｅｒｃｏ，Ｃ．）、ビーティー，ジー・エム（Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｇ．Ｍ．）、ジブ，エス・エイ（Ｄｉｂ，Ｓ．Ａ．）、ロペズ，エイ・ディー（Ｌｏｐｅｚ，ＡＤ）およびヘイエク，エイ（Ｈａｙｅｋ Ａ）「ヒト胎児の膵臓細胞の分化および増殖におけるアクチビンＡおよびベタセルリンの役割」、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ８５、３８９２−３８９７頁（２０００）。
１５． ハシモト，エム（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｍ．）ら、「神経分化の阻害剤としてのアクチビン／ＥＤＦ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １７３、１９３−２００頁（１９９０）。
１６． ハーランド，アール（Ｈａｒｌａｎｄ，Ｒ．）「神経誘導」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ １０、３５７−３６２（２０００）。
１７． レーベンバーグ，エス（Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．）ら、「三次元ポリマー骨格上のヒト胎芽幹細胞の分化」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． １００、１２７４１−１２７４６頁（２００３）。
１８． コーワン，シー・エイ（Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．）ら、「ヒト胚盤胞から胎芽幹細胞系の誘導」、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５０：１３５３−１３５６頁（２００４）。
１９． アベイタ エム，シー・エイ（Ａｂｅｙｔａ Ｍ，Ｃ．Ａ．）、ロドリグエズ，アール（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．）、ボドナール，エム（Ｂｏｄｎａｒ，Ｍ．）、レイジョ ペラ，アール（Ｒｅｉｊｏ Ｐｅｒａ Ｒ．）、フィルポ，エム・ティー（Ｆｉｒｐｏ， Ｍ．Ｔ）「独立して誘導されるヒト胎芽幹細胞系のユニークな遺伝子発現の符号」、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３、ｉｎ ｐｒｅｓｓ（２００４）．
２０． モヴァサト，ジェイ（Ｍｏｖａｓｓａｔ，Ｊ．）、ビーティー，ジー・エム（Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｇ．Ｍ．）、ロペズ，エイ・ディー（Ｌｏｐｅｚ，Ａ．Ｄ．）、ポルサ，ビー（Ｐｏｒｔｈａ，Ｂ．）およびヘイエク，エイ（Ｈａｙｅｋ，Ａ．）「ヒト胎児膵臓内分泌前駆体細胞におけるケラチノサイト成長因子およびベータ細胞分化」、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ４６、８２２−８２９頁（２００３）。
２１． ヘイエク，エイ（Ｈａｙｅｋ Ａ）およびビーティー，ジー・エム（Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｇ．Ｍ．）「ヒト胎児および成人膵島の実験的移植」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ８２ ８号、２４７１−２４７５頁（１９９７）。
２２． カルボノイ，エイチ（Ｃａｒｂｏｎｎｅａｕ，Ｈ．）およびトンクス（Ｔｏｎｋｓ）、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８：４６３−９３頁、１９９２年。
２３． ヘイエク，エイ（Ｈａｙｅｋ Ａ）、ビーティー，ジー・エム（Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｇ．Ｍ．）、シルリ，ヴイー（Ｃｉｒｕｌｌｉ Ｖ）ら、「ヒト成人ベータ細胞の成長因子／マトリックス誘導増殖」、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４４：１４５８−１４６０頁（１９９５）。
２４． キング，シー・シー（Ｋｉｎｇ ＣＣ）、ニュートン，エイ・シー（Ｎｅｗｔｏｎ ＡＣ）「アダプタータンパク質ｇｒｂ１４は、３−ホスホイノシチド依存キナーゼ−１の局在化を調節する」、 Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９：３７５１８−３７５２７頁（２００４）。
２５． ヘンダーソン，ジェイ・ケイ（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ＪＫ）、ドレイパー，ジェイ・エス（Ｄｒａｐｅｒ ＪＳ）、ベイリー，エイチ・エス（Ｂａｉｌｌｉｅ ＨＳ） ら、「移植前ヒト胎芽および胎芽幹細胞は、段階特異的胎芽抗原の比較可能な発現」、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２０：３２９−３３７頁（２００２）。
２６． ビーティー，ジー・エム（Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｇ．Ｍ．）、レイボウィッツ，ジー（Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ Ｇ）、ロペズ，エイ・ディー（Ｌｏｐｅｚ，Ａ．Ｄ．）ら、「培養されたヒト胎児膵臓細胞における細胞死からの保護」、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ９：４３１−４３８頁（２０００）。
２７． イトウ，エス（Ｉｔｏｈ Ｓ）、イトウ，エフ（Ｉｔｏｈ Ｆ）、ゴウマンス，エム・ジェイ（Ｇｏｕｍａｎｓ ＭＪ）ら、「ｓｍａｄタンパク質を介する成長因子−ベータファミリーメンバーを形質転換させるシグナル伝達」、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６７：６９５４−６９６７頁（２０００）。
２８． クスー，アール・エイチ（Ｘｕ ＲＨ）、チェン，エックス（Ｃｈｅｎ Ｘ）、リー，ディー・エス（Ｌｉ ＤＳ）ら、「Ｂｍｐ４は、栄養芽細胞へのヒト胎芽幹細胞分化を開始する」、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：１２６１−１２６４頁（２００２）。
２９． グミエンニイ，ティー・エル（Ｇｕｍｉｅｎｎｙ ＴＬ）、パジェット，アール・ダブリュー（Ｐａｄｇｅｔｔ ＲＷ）「ｔｇｆ−ベータスーパーファミリーシグナル調節の他の側面：細胞外部の思考」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ １３：２９５−２９９頁（２００２）。
３０． ミヤザワ，ケイ（Ｍｉｙａｚａｗａ Ｋ）、シノザキ，エム（Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ Ｍ）、ハラ，ティー（Ｈａｒａ Ｔ）ら、「ｔｇｆ−ベータスーパーファミリーシグナル伝達における２つの主要なｓｍａｄ経路」、Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ７：１１９１−１２０４頁（２００２）。
３１． シディス，ワイ（Ｓｉｄｉｓ Ｙ）、トルトリエロ，ディー・ヴィー（Ｔｏｒｔｏｒｉｅｌｌｏ ＤＶ）、ホルメス，ダブリュー・イー（Ｈｏｌｍｅｓ ＷＥ）ら、「フォリスタチン関連タンパク質およびフォリスタチンは、内因性アクチビン対外因性アクチビンを中和する」、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １４３：１６１３−１６２４頁（２００２）。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１ａ】アクチビンＡの不在下、ｈＥＳ細胞の分化を示す図である。位相差顕微鏡（上段）および免疫組織化学（下段）によって見られたＨＳＦ６細胞の形態および分化状態を示す図である。
【図１ｂ】ｍＥＦｓ（レーン１）またはラミニン（レーン２〜５）における種々の培養条件下でのｏｃｔ−４およびｎａｎｏｇに関するｈＥＳ細胞の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ（２６サイクル）を示す図である。
【図１ｃ】ＦＡＣＳを用いた細胞表面−抗原発現を比較する代表的実験を示す図である。
【図１ｄ】アクチビンＡ（Ａ）、ＮＩＣ（Ｎ）、ＫＧＦ（Ｋ）、または３つ全ての組み合わせ（ＡＮＫ）の存在下、およびＣＭを添加したＦＧＦ２におけるｈＥＳ細胞の増殖を比較する代表的実験を示す図である。
【図２ａ】ＨＳＦ６細胞における多能性のｍＥＦ維持に及ぼすアクチビン／フォリスタチンの効果を示す図である。フォリスタチンの１週間（左パネル）および２週間（右パネル）存在下、ｍＥＦｓ上で培養した図１、パネルＩのＨＳＦ６細胞を示す図である。
【図２ｂ】フォリスタチン存在下ならびに不在下でのｏｃｔ−４およびｎａｎｏｇに関するｍＥＦｓ上のＨＳＦ６細胞の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ（２６サイクル）を示す図である。
【図２ｃ】ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット法を用いた、ＣＦ−１マウス由来ｍＥＦｓにおけるアクチビンＡ転写体ならびにｍＥＦ馴化培地における前駆体タンパク質の同定を示す図である。
【図２ｄ】ＨＳＦ６細胞における成分をシグナル伝達するアクチビン経路の同定を示す図である。
【図３ａ】アクチビンＡ ＮＩＣおよびＫＧＦと共に培養したｈＥＳ細胞における多能性の長期維持を示す図である。アクチビンＡ、ＫＧＦおよびＮＩＣの存在下、２０継代培養したＨＳＦ６細胞における幹細胞マーカーの分析を示す図である。
【図３ｂ】ヌードマウスにおけるテラトーマ形成を示す図である。
【図３ｃ】アクチビンＡ、ＫＧＦおよびＮＩＣの存在下で培養したｈＥＳ細胞由来の胚様体における系統特異的マーカーのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。
【０１９１】
[配列表]
配列番号：０１：
インヒビンベータＡサブユニット（アクチビンＡ）ホモサピエンス（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈおよびＧｅｎＢａｎｋ Ｘ０４４４７）マクロファージ細胞系Ｕ９３７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５３９））アミノ酸配列：

配列番号：０２：
インヒビンベータＡサブユニット（アクチビンベータ−Ａ鎖）ホモサピエンス（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ０４４４７）３’−領域マクロファージ細胞系Ｕ９３７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５３９）核酸配列：

配列番号：０３：
インヒビンベータＡ鎖（アクチビンベータ−Ａ鎖）ホモサピエンス（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０８４７６）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ１３４３６）（赤芽球分化誘導タンパク質）（ＥＤＦ）卵巣アミノ酸配列：

配列番号：０４：インヒビンベータＢサブユニット−組換えインヒビン
特許文献１０（ＧｅｎＢａｎｋ Ａ１４４２２）アミノ酸配列：

配列番号：０５：精巣ホモサピエンスにおけるインヒビンベータＢサブユニット（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ７２４９８）アミノ酸配列：

配列番号：０６：インヒビンＢサブユニット赤芽球分化誘導タンパク質ｍＲＮＡ（ＥＤＦ）、急性単球性白血病細胞系ＴＨＰ−１、ホモサピエンス（ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ０３６３４）アミノ酸配列：

配列番号：０７：
インヒビンベータＡ鎖（アクチビンベータ−Ａ鎖）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｑ０４９９８）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ６９６１９；ＢＣ０５３５２７）−ハツカネズミ（マウス）アミノ酸配列：

配列番号：０８：
インヒビンベータＡ鎖（アクチビンベータ−Ａ鎖）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ１８３３１）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ３７４８２）−Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ(ラット)アミノ酸配列：

配列番号：０９：
インヒビンベータＡ鎖（アクチビンベータ−Ａ鎖）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ２７０９２）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ２６９４６；Ｕ４２３７７；Ｍ６１１６７；Ｍ５７４０７）−Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ(ニワトリ)アミノ酸配列：

配列番号：１０：
インヒビンベータＡ鎖（アクチビンベータ−Ａ鎖）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０７９９５）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ１６２３９；Ｕ１６２３８結合；Ｍ１３２７４）−Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ（ウシ）アミノ酸配列：

配列番号：１１：
インヒビンベータＡ鎖（アクチビンベータ−Ａ鎖）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ５５１０２）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｄ５０３２６）−Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ（ウマ）アミノ酸配列：

配列番号：１２：
インヒビンベータＡ鎖（アクチビンベータ−Ａ鎖）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０３９７０）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ０３２６６）−Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）アミノ酸配列：

配列番号：１３：
インヒビンベータＡ鎖（アクチビンベータ−Ａ鎖）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ４３０３２）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｌ１９２１８）−Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ（ヒツジ）アミノ酸配列：

配列番号：１４：
インヒビンベータＡ鎖（アクチビンベータ−Ａ鎖）（ＧｅｎＢａｎｋ ＢＣ０５６７４２）−Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ（ネコ）アミノ酸配列：

配列番号：１５：
インヒビンベータＡ鎖（アクチビンベータ−Ａ鎖）（ＧｅｎＢａｎｋ ＢＣ０５６７４２）−Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ（ゼブラフィッシュ）アミノ酸配列：

配列番号：１６：
インヒビンベータＡ鎖（アクチビンベータ−Ａ鎖）（ＧｅｎＢａｎｋ ＢＣ０５６７４２）−Ｃａｒａｓｓｉｕｓ ａｕｒａｔｕｓ（キンギョ）アミノ酸配列：

配列番号：１７：
ケラチノサイト成長因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）−ホモサピエンス（ヒト）アミノ酸配列アミノ酸配列：

配列番号：１８：
ケラチノサイト成長因子（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ２１７８１）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ６０８２６；Ｓ８１６６１）−ホモサピエンス（ヒト）アミノ酸配列：

配列番号：１９：
ケラチノサイト成長因子（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ３６３６３）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ２２７０３；Ｕ５８５０３；ＢＣ０５２８４７）−ハツカネズミ（マウス）アミノ酸配列：

配列番号：２０：
ケラチノサイト成長因子（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ７９１５０）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ８０８００）−Ｃａｎｉｓ fａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）アミノ酸配列：

配列番号：２１：
ケラチノサイト成長因子（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｑ９Ｎ１９８）（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ２１７４６３）−Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）アミノ酸配列：

配列番号：２２：
ケラチノサイト成長因子（ＨＢＧＦ−７）（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｑ０２１９５）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ５６５５１）−Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ(ラット)アミノ酸配列：

配列番号：２３：
ケラチノサイト成長因子（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ４８８０８）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ４６２３６）−Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ（ヒツジ）アミノ酸配列：

配列番号：２４：
ケラチノサイト成長因子（ＦＧＦ−７）（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ４２０２３２）−Ｍｕｓｔｅｌａ ｖｉｓｏｎ（アメリカミンク）アミノ酸配列：

配列番号：２５：
ケラチノサイト成長因子（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ２１７８１）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｓ８１６６１）−ホモサピエンス（ヒト）核酸配列：

配列番号：２６：
ケラチノサイト成長因子（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ３６３６３）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ２２７０３）−ハツカネズミ（マウス）核酸配列：

配列番号：２７：
ケラチノサイト成長因子（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ７９１５０）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ８０８００）−Ｃａｎｉｓ fａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）核酸配列：

配列番号：２８：
ケラチノサイト成長因子（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｑ９Ｎ１９８）（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ２１７４６３）−Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ（ブタ）核酸配列：

配列番号：２９：
ケラチノサイト成長因子（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｑ０２１９５）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ５６５５１）−Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ(ラット)核酸配列：

配列番号：３０：
ケラチノサイト成長因子（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ４８８０８）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｚ４６２３６）−Ｏｖｉｓ ａｒｉｅｓ（ヒツジ）核酸配列：

配列番号：３１：
ケラチノサイト成長因子（ＦＧＦ−７）（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ４２０２３２）−Ｍｕｓｔｅｌａ ｖｉｓｏｎ（アメリカミンク）核酸配列：

配列番号：３２：
インヒビンベータＡ鎖（アクチビンベータ−Ａ鎖）ホモサピエンス（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ１３４３６）（赤芽球分化誘導タンパク質）（ＥＤＦ）卵巣アミノ酸配列：

配列番号：３３：
インヒビンＢサブユニット−組換えインヒビン
特許文献１０（ＧｅｎＢａｎｋ Ａ１４４２２）：

配列番号：３４：
精巣ホモサピエンスにおいて成熟サブユニットベータ（Ａ）インヒビンに関してコードする核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ｘ７２４９８）：

配列番号：３５：
ヒト赤芽球分化誘導タンパク質ｍＲＮＡ（ＥＤＦ）、原資料テキスト：急性単球性白血病細胞系ＴＨＰ−１、ホモサピエンス（ＧｅｎＢａｎｋ Ｊ０３６３４）：

【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化幹細胞を維持するための方法であって、所望の結果を得るために十分な時間量、前記細胞を未分化状態に維持するのに十分な量で、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦβ）タンパク質ファミリーのメンバー、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）タンパク質ファミリーのメンバー、またはニコチンアミド（ＮＩＣ）に幹細胞を曝露させることを含む方法。
【請求項２】
前記方法が、ＴＧＦβファミリーのメンバー、ＦＧＦファミリーのメンバー、およびＮＩＣのうちの２種以上に前記細胞を曝露させることを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、ＴＧＦβファミリーのメンバー、ＦＧＦファミリーのメンバー、およびＮＩＣに前記細胞を曝露させることを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＴＧＦβファミリーのメンバーが、アクチビンＡである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＦＧＦファミリーのメンバーが、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記曝露が、前記細胞の増殖をもたらす請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記曝露が、少なくとも１回反復される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞が、哺乳動物の幹細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞が、ヒトの幹細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞が、胚幹細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記所望の結果が、前記幹細胞を１０回以上継代培養することを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記所望の結果が、前記幹細胞を３０回以上継代培養することを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＧＦβファミリーのメンバーが、配列番号：１と３０％以上の配列同一性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＴＧＦβファミリーのメンバーが、配列番号：１と８０％以上の配列同一性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＴＧＦβファミリーのメンバーが、配列番号：１と９０％以上の配列同一性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＴＧＦβファミリーのメンバーが、配列番号：１と９５％以上の配列同一性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＴＧＦβファミリーのメンバーが、配列番号：１と９９％以上の配列同一性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＦＧＦファミリーのメンバーが、配列番号：１７と３０％以上の配列同一性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＦＧＦファミリーのメンバーが、配列番号：１７と８０％以上の配列同一性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＦＧＦファミリーメンバーが、配列番号：１７と９０％以上の配列同一性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＦＧＦファミリーのメンバーが、配列番号：１７と９５％以上の配列同一性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＦＧＦファミリーのメンバーが、配列番号：１７と９９％以上の配列同一性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ａ）培養培地およびｂ）ＴＧＦβファミリーのメンバー、ＦＧＦファミリーのメンバー、ＮＩＣ、またはこれらのうちの２種以上の組み合わせを含んでなる組成物。
【請求項２４】
前記ＴＧＦβファミリーのメンバーが、アクチビンＡである請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＦＧＦファミリーのメンバーが、ＫＧＦである請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
幹細胞をさらに含んでなる請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記幹細胞が、哺乳動物の幹細胞である請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記幹細胞が、ヒトの幹細胞である請求項２６に記載の組成物。
【請求項２９】
前記幹細胞が、胚幹細胞である請求項２６に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＴＧＦβファミリーのメンバーが、配列番号：１と３０％以上の配列同一性を示す請求項２３に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ＴＧＦβファミリーのメンバーが、配列番号：１と８０％以上の配列同一性を示す請求項２３に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ＴＧＦβファミリーのメンバーが、配列番号：１と９０％以上の配列同一性を示す請求項２３に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ＴＧＦβファミリーのメンバーが、配列番号：１と９５％以上の配列同一性を示す請求項２３に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ＴＧＦβファミリーのメンバーが、配列番号：１と９９％以上の配列同一性を示す請求項２３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ＦＧＦファミリーのメンバーが、配列番号：１７と３０％以上の配列同一性を示す請求項２３に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ＦＧＦファミリーのメンバーが、配列番号：１７と８０％以上の配列同一性を示す請求項２３に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ＦＧＦファミリーのメンバーが、配列番号：１７と９０％以上の配列同一性を示す請求項２３に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ＦＧＦファミリーのメンバーが、配列番号：１７と９５％以上の配列同一性を示す請求項２３に記載の組成物。
【請求項３９】
前記ＦＧＦファミリーのメンバーが、配列番号：１７と９９％以上の配列同一性を示す請求項２３に記載の組成物。
【請求項４０】
ａ）少なくとも１種の精製ＴＧＦβタンパク質ファミリーのメンバー、ｂ）少なくとも１種の精製ＦＧＦタンパク質ファミリーのメンバー、３）精製ＮＩＣ、のうちの２種以上の組み合わせを含んでなる組成物。
【請求項４１】
幹細胞のための培養培地である請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記幹細胞が、哺乳動物の幹細胞である請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記幹細胞が、ヒトの幹細胞である請求項４１に記載の組成物。
【請求項４４】
前記幹細胞が、胚幹細胞である請求項４１に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ＴＧＦβファミリーのメンバーが、アクチビンＡである請求項４１に記載の組成物。
【請求項４６】
前記ＦＧＦファミリーのメンバーが、ＫＧＦである請求項４１に記載の組成物。
【請求項４７】
少なくとも１０回継代接種された培養物に由来する未分化多能性幹細胞。
【請求項４８】
前記培養物が、少なくとも２０回継代接種された請求項４７に記載の幹細胞。
【請求項４９】
前記培養が、少なくとも３０回継代接種された請求項４７に記載の幹細胞。
【請求項５０】
前記幹細胞が、馴化培地、フィーダー細胞、またはＬＩＦの存在下ではなく、ＴＧＦβファミリーのメンバー、ＦＧＦファミリーのメンバー、またはＮＩＣを含んでなる培地の存在下で継代接種された請求項４７に記載の幹細胞。
【請求項５１】
前記幹細胞が、哺乳動物の幹細胞である請求項４７に記載の幹細胞。
【請求項５２】
前記幹細胞が、ヒトの幹細胞である請求項４７に記載の幹細胞。
【請求項５３】
前記幹細胞が、胚幹細胞である請求項４７に記載の幹細胞。
【請求項５４】
細胞を未分化状態に維持するのに十分な量で、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦβ）タンパク質ファミリーのメンバー、維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）タンパク質ファミリーのメンバー、またはニコチンアミド（ＮＩＣ）に幹細胞を曝露させることを含む方法により生産された幹細胞。
【請求項５５】
以下の：
ａ）ＴＧＦβファミリーのメンバー、
ｂ）ＦＧＦファミリーのメンバー、
ｃ）ＮＩＣ、
ｄ）幹細胞、および
ｅ）幹細胞の培養培地、のうちの２種以上を含んでなるキット。
【請求項５６】
前記ＴＧＦβファミリーのメンバーが、アクチビンＡである請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
前記ＦＧＦファミリーのメンバーが、ＫＧＦである請求項５５に記載のキット。
【請求項５８】
前記幹細胞が、哺乳動物の幹細胞である請求項５５に記載のキット。
【請求項５９】
前記幹細胞が、ヒトの幹細胞である請求項５５に記載のキット。
【請求項６０】
前記幹細胞が、胚幹細胞である請求項５５に記載のキット。
【請求項６１】
未分化幹細胞を維持する方法であって、所望の結果を得るために十分な時間量、前記細胞を未分化状態に維持するのに十分な量で、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦβ）タンパク質ファミリーのメンバー、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）タンパク質ファミリーのメンバー、またはニコチンアミド（ＮＩＣ）に幹細胞を曝露させることを含んでなり、前記幹細胞を、フィーダー細胞、馴化培地、または白血病阻害因子には曝露させることもない方法。
【請求項６２】
組成物が、ａ）培養培地およびｂ）ＴＧＦβファミリーのメンバー、ＦＧＦファミリーのメンバー、ＮＩＣ、またはこれらの２つ以上の組み合わせを含んでなるが、フィーダー細胞、馴化培地、またはＬＩＦを含まない組成物。
【請求項６３】
細胞を未分化状態に維持するのに十分な量で、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦβ）タンパク質ファミリーのメンバー、維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）タンパク質ファミリーのメンバー、またはニコチンアミド（ＮＩＣ）に幹細胞を曝露させることを含む方法によって増殖されたか、または維持された幹細胞に由来する未分化細胞。
【請求項６４】
細胞を未分化状態に維持するのに十分な量で、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦβ）タンパク質ファミリーのメンバー、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）タンパク質ファミリーのメンバー、またはニコチンアミド（ＮＩＣ）に幹細胞を曝露させることを含む方法によって増殖されたか、または維持された胚幹細胞。
【請求項６５】
細胞を未分化状態に維持するのに十分な量で、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦβ）タンパク質ファミリーのメンバー、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）タンパク質ファミリーのメンバー、またはニコチンアミド（ＮＩＣ）に幹細胞を曝露させることを含む方法によって増殖されたか、または維持された幹細胞を含んでなる製薬組成物。
【請求項６６】
細胞を未分化状態に維持するのに十分な量で、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦβ）タンパク質ファミリーのメンバー、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）タンパク質ファミリーのメンバー、またはニコチンアミド（ＮＩＣ）に幹細胞を曝露させることを含む方法によって増殖されたか、または維持された幹細胞に由来する細胞。

【図１ａ】

【図１ｂ】

【図１ｃ】

【図１ｄ】

【図２ａ】

【図２ｂ】

【図２ｃ】

【図２ｄ】

【図３ａ】

【図３ｂ】

【図３ｃ】

【公表番号】特表２００７−５２８２２６（Ｐ２００７−５２８２２６Ａ）
【公表日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０２９４７（Ｐ２００７−５０２９４７）
【出願日】平成１７年３月９日（２００５．３．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００７７０４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０８６８４５
【国際公開日】平成１７年９月２２日（２００５．９．２２）
【出願人】（５０５０９３８４０）リージェンツ　オブ　ザ　ユニヴァーシティ　オブ　カリフォルニア (1)
【氏名又は名称原語表記】Ｒｅｇｅｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
【住所又は居所原語表記】１１１１　Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｓｔｒｅｅｔ，　１２ｔｈ　Ｆｌｏｏｒ，　Ｏａｋｌａｎｄ，　ＣＡ　９４６０７，　ＵＳＡ
【Ｆターム（参考）】