脊髄損傷治療剤
【課 題】 脊髄損傷を根本的に治療するのに有効な薬剤を提供することを目的とする。
【解決手段】 ＨＧＦ蛋白質またはそれをコードするＤＮＡを有効成分とする脊髄損傷治療剤。
【解決手段】 ＨＧＦ蛋白質またはそれをコードするＤＮＡを有効成分とする脊髄損傷治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は脊髄損傷治療剤に関し、更に詳しくは肝細胞増殖因子（以下、ＨＧＦと略記する。）またはそれをコードするＤＮＡを有効成分とする脊髄損傷治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊髄損傷（spinal cord injury：ＳＣＩ）とは、交通事故や高所転落に伴う脊脱臼骨折などの外傷で、脊髄実質が損傷されることにより、損傷部以下の末梢の運動・感覚・自律神経系の麻痺を呈する病態のことである。
現在、脊髄損傷の患者は、日本では約１０万人、米国では２５万人に及ぶとされており、年間日本では５千人、米国では１万人以上の患者が増加している。
【０００３】
近年医療の進歩に伴い受傷後の生存率は上昇し、障害の進行を抑えるべく脊椎骨損傷の再建手術の方法も飛躍的に進歩してきた。したがって、２次的な神経症状の増悪を抑えることも成功しはじめている。さらに、リハビリテーションによる機能回復訓練技術の向上や補助器具（電動車いす等）の開発等により、患者の日常生活動作（ＡＤＬ）が向上してきてはいる。しかし、根本的な脊髄損傷自体（神経損傷からの神経保護・再生）への有効な治療法がないために、自立した排尿・排便・手作業や歩行が不能な患者が大量に存在しているのが現状である。
【０００４】
一方、ＨＧＦは、最初に成熟肝細胞に対する強力なマイトージェンとして同定され、１９８９年にその遺伝子クローニングがなされた（非特許文献１、２）。ＨＧＦは肝細胞増殖因子として発見されたが、ノックアウト／ノックインマウスの手法を含む発現および機能的解析における近年の多数の研究により、ＨＧＦは新規な神経栄養因子であることも明らかにされた（非特許文献３、４）。
【０００５】
なお、特許文献１には、パーキンソン病モデルラットを用いて、ＨＧＦ遺伝子のモデルラットへの作用効果を行動学的におよび組織学的に検討した実施例が示されており、ＨＧＦ遺伝子の前投与により中脳黒質ドーパミンニューロンを神経毒６−ＯＨＤＡから保護し、パーキンソン病モデルラットの症状を抑えたとの実験結果が示されている。そして、この特許文献１では、このような実験結果に基づいて、ＨＧＦ遺伝子がパーキンソン病のみならず、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、線条体黒質変性症、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン舞踏病、シャイ・ドレーガー症候群、シャルコー・マリー・トース病、フリードライヒ失調症、重症筋無力症、ウイリス動脈輸閉塞症、アミロイドーシス、ピック病、スモン病、皮膚筋炎・多発性筋炎、クロイツフェルド・ヤコブ病、ベーチェット病、全身性エリテマドーデス、サルコイドーシス、結節性動脈周囲炎、後縦靭帯骨化症、広範性脊柱狭窄症、混合性結合組織病、糖尿病性末梢神経炎、虚血性脳血管障害（脳梗塞、脳出血など）などの神経疾患の治療にも適用できるとし、かかる神経疾患の１つとして脊髄損傷も挙げられている。
【０００６】
しかしながら、パーキンソン病は中脳黒質部のドーパミン作動性ニューロンという特定種のニューロンが選択的に脱落する神経変性疾患であるのに対して、脊髄損傷は主に外傷により脊髄内の多くの種類のニューロンやグリアが広汎に非選択的に傷害される疾患であり、臨床的には全く異なる病態を示す。このため、パーキンソン病モデルラットの上記実験結果のみから、脊髄損傷の治療に有効であるとは到底いえず、また有効であったとする報告もない。
【特許文献１】ＷＯ２００３／０４５４３９
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２２，１４５０−１４５９（１９８４）
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０−４４３（１９８９）
【非特許文献３】Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２，２１３−２１７（１９９９）
【非特許文献４】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，３２７，１−２３（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、脊髄損傷を根本的に治療するのに有効な薬剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決すべく種々研究を重ねた結果、ＨＧＦ蛋白質またはそれをコードするＤＮＡが脊髄損傷に対して優れた治療効果を奏することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）ＨＧＦ蛋白質またはそれをコードするＤＮＡを有効成分とする脊髄損傷治療剤、
（２）有効成分がＨＧＦ蛋白質である前記（１）記載の治療剤、
（３）有効成分がＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡである前記（１）記載の治療剤、
（４）ＨＧＦが、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であってＨＧＦとして作用する蛋白質、又はこれらの部分ペプチドであってＨＧＦとして作用するペプチドである前記（２）記載の治療剤、
（５）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡが、配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦとして作用する蛋白質をコードするＤＮＡである前記（３）記載の治療剤、
（６）脊髄損傷部位に局所適用するための前記（１）〜（５）のいずれかに記載の治療剤、および
（７）髄腔内投与用注射剤の剤型である前記（６）記載の治療剤、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の治療剤は、脊髄損傷に対して極めて優れた治療効果を発揮するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明で使用されるＨＧＦ蛋白質は公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。ＨＧＦ蛋白質の製造方法としては、例えばＨＧＦ蛋白質を産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該ＨＧＦ蛋白質を得ることができる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦ蛋白質をコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦ蛋白質を得ることもできる。（例えば、特開平５−１１１３８２号公報、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９年、第１６３巻，ｐ．９６７等を参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母又は動物細胞等を用いることができる。このようにして得られたＨＧＦ蛋白質は、天然型ＨＧＦ蛋白質と実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数個〔例えば、数個（例えば１〜８個；以下同様である。）〕のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失若しくは付加されていてもよい。そのようなＨＧＦ蛋白質として、下記する５アミノ酸欠損型ＨＧＦ蛋白質を挙げることができる。ここで、アミノ酸配列について、「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加」とは、遺伝子工学的手法、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、又は天然に生じうる程度の数（１〜数個）が、欠失、置換若しくは付加等されていることを意味する。糖鎖が置換、欠失若しくは付加したＨＧＦ蛋白質とは、例えば天然のＨＧＦ蛋白質に付加している糖鎖を酵素等で処理し糖鎖を欠損させたＨＧＦ蛋白質、また糖鎖が付加しない様に糖鎖付加部位のアミノ酸配列に変異が施されたもの、あるいは天然の糖鎖付加部位とは異なる部位に糖鎖が付加するようアミノ酸配列に変異が施されたもの等をいう。
さらに、ＨＧＦ蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上の相同性を有する蛋白質、好ましくは約９０％以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する蛋白質であって、かつＨＧＦとして作用する蛋白質も含まれる。上記アミノ酸配列について「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。
【００１２】
上記ＨＧＦ蛋白質としては、例えば配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。配列番号２で表されるＨＧＦ蛋白質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６１〜１６５番目の５個のアミノ酸残基が欠失している５アミノ酸欠損型ＨＧＦ蛋白質である。配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、両者ともヒト由来の天然ＨＧＦ蛋白質であって、ＨＧＦとしてのマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する。
配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質、例えば配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列から、１〜数個のアミノ酸残基を挿入又は欠失させたアミノ酸配列、１〜数個のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置換させたアミノ酸配列又は１〜数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列等を含む蛋白質であってＨＧＦとして作用する蛋白質であることが好ましい。挿入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる２０種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基を有する限りどのような化合物でもよいが、例えばγ−アミノ酪酸等が挙げられる。
これらの蛋白質は、単独であっても、これらの混合蛋白質であってもよい。
【００１３】
本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル等のＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチル等のＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチル等のα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基等のＣ７−１４アラルキル基のほか、ピバロイルオキシメチル基等が用いられる。本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質が、Ｃ末端以外にカルボキシル基（又はカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも本発明におけるＨＧＦ蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。さらに、本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質には、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。
【００１４】
本発明で用いるＨＧＦ蛋白質の部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある。）としては、上記したＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであればいずれのものであってもよい。本発明において、部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記したＨＧＦ蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも約２０個以上、好ましくは約５０個以上、より好ましくは約１００個以上のアミノ酸配列を含有するペプチド等が好ましい。本発明の部分ペプチドにおいては、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。さらに、部分ペプチドには、上記したＨＧＦ蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド等の複合ペプチド等も含まれる。
【００１５】
本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質又はその部分ペプチドの塩としては、酸又は塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が挙げられる。
【００１６】
本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質の部分ペプチド又はその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＨＧＦ蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれでも良い。すなわち、ＨＧＦ蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は、保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ及びＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６年）、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ及びＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６５年）等に記載された方法が挙げられる。反応後は通常の精製方法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶等を組み合わせてＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００１７】
本発明の治療剤は、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを有効成分として含有することもできる。
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性、例えばマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が挙げられる。なお、配列番号３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば上記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍ程度の塩化ナトリウム存在下、約６５℃程度でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる。）を用い、約６５℃程度の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
【００１８】
上記の配列番号３又は４で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとして具体的には、配列番号３又は４で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１：以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す。）に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００１９】
さらに、本発明のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡは上記に限定されず、発現する蛋白質がＨＧＦ蛋白質と実質的に同じ作用を有するＤＮＡである限り、本発明のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡとして使用できる。例えばＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ等もＨＧＦとしての作用を有する部分ペプチドをコードするものであれば、本発明のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡの範疇に含まれる。ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡであればいかなるものであってもよい。また、上記のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡと同様に、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド等いずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することもできる。具体的な本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（ａ）配列番号３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、（ｂ）配列番号３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は上記（ａ）或いは（ｂ）の部分塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。
該ＤＮＡは、例えば通常のハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等により容易に得ることができ、該ＤＮＡの取得は具体的には前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ等の基本書等を参考にして行うことができる。
【００２０】
なお、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質またはそれをコードするＤＮＡは、ヒトに適用する場合は前記したヒト由来のものが好適に用いられるが、ヒト以外の哺乳動物に由来するＨＧＦ蛋白質またはそれをコードするＤＮＡであってもよい。たとえば、ラット由来のＨＧＦ蛋白質は配列番号５で表され、ラットＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡは配列番号６で表される。
また、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質又は部分ペプチドをコードするＲＮＡも、逆転写酵素によりＨＧＦ蛋白質又は部分ペプチドを発現することができるものであれば、本発明に用いることができ、本発明の範囲内である。また該ＲＮＡも公知の手段により得ることができる。
【００２１】
本発明の脊髄損傷治療剤は、ヒトのほか、ヒト以外の哺乳動物（例えば、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコなど）にも適用できる。
【００２２】
本発明の脊髄損傷治療剤を患者に投与する場合、その投与形態、投与方法、投与量などは、有効成分がＨＧＦ蛋白質の場合と、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡの場合と若干異なる。
たとえば、有効成分がＨＧＦ蛋白質である場合は、種々の製剤形態、例えば液剤、固形剤等をとりうるが、一般的にはＨＧＦ蛋白質のみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤、噴射剤、徐放性製剤（例えば、デポ剤）などとされる。上記注射剤は、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）又はｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等）などを適宜添加した溶液に、ＨＧＦ蛋白質を溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。また適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）又は非イオン界面活性剤（ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０等）などを使用してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール等を使用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアルに充填される。注射剤中のＨＧＦ蛋白質含量は、通常約０．０００２〜０．２ｗ／ｖ％程度、好ましくは約０．００１〜０．１ｗ／ｖ％程度に調整される。なお、注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
【００２３】
噴霧剤も製剤上の常套手段によって調製することができる。噴霧剤として製造する場合、その添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添加剤であればいずれのものであってもよく、例えば、噴射剤の他、上記した溶剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤などが用いられる。噴射剤としては、液化ガス噴射剤又は圧縮ガス等が用いられる。液化ガス噴射剤としては、例えば、フッ化炭化水素（ＨＣＦＣ２２、ＨＣＦＣ−１２３、ＨＣＦＣ−１３４ａ、ＨＣＦＣ１４２等の代替フロン類等）、液化石油、ジメチルエーテル等が挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば、可溶性ガス（炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等）又は不溶性ガス（窒素ガス等）などが挙げられる。
【００２４】
また、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質は、生体分解性高分子と共に、徐放性製剤（例えばデポ剤）とすることもできる。ＨＧＦ蛋白質は特にデポ剤とすることにより、投薬回数の低減、作用の持続性及び副作用の軽減等の効果が期待できる。該徐放性製剤は公知の方法に従って製造することができる。本徐放性製剤に使用される生体内分解性高分子は、公知の生体内分解性高分子のなかから適宜選択できるが、例えばデンプン、デキストラン又はキトサン等の多糖類、コラーゲン又はゼラチン等の蛋白質、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリロイシン、ポリアラニン又はポリメチオニン等のポリアミノ酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸重合体又は共重合体、ポリカプロラクトン、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物又はフマル酸・ポリエチレングリコール・ビニルピロリドン共重合体等のポリエステル、ポリオルソエステル又はポリメチル−α−シアノアクリル酸等のポリアルキルシアノアクリル酸、ポリエチレンカーボネート又はポリプロピレンカーボネート等のポリカーボネート等である。好ましくはポリエステル、更に好ましくはポリ乳酸又は乳酸・グリコール酸重合体又は共重合体である。ポリ乳酸−グリコール酸重合体又は共重合体を使用する場合、その組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）は徐放期間によって異なるが、例えば徐放期間が約２週間ないし３カ月、好ましくは約２週間ないし１カ月の場合には、約１００／０ないし５０／５０である。該ポリ乳酸−グリコール酸重合体又は共重合体の重量平均分子量は、一般的には約５，０００ないし２０，０００である。ポリ乳酸−グリコール酸共重合体は、公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の製造法に従って製造できる。生体分解性高分子とＨＧＦ蛋白質の配合比率は特に限定はないが、例えば生体分解性高分子に対して、ＨＧＦ蛋白質が約０．０１〜３０ｗ／ｗ％程度である。
【００２５】
投与方法としては、注射剤もしくは噴霧剤を直接脊髄損傷のある組織に直接注射（髄腔内（intrathecal）投与、徐放性ポンプによる髄腔内持続投与など）もしくは噴霧するか、あるいは徐放性製剤（デポ剤）を脊髄損傷のある組織に近い部位に埋め込むのが好ましい。また、投与量は、剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択されるが、通常、1回当たり１μｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜５０ｍｇである。また、投与回数も剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択され、１回投与とするか、ある間隔をおいて持続投与とすることもできる。持続投与の場合、投与間隔は１日１回から数ヶ月に１回でよく、例えば、徐放性製剤（デポ剤）による投与や徐放性ポンプによる髄腔内持続投与の場合は、数ヶ月に１回でもよい。
【００２６】
一方、有効成分がＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡである場合は、その投与形態としては非ウイルスベクターを用いる場合と、ウイルスベクターを用いる場合とに別れ、その投与方法は常法により行うことができる。
非ウイルスベクターを用いる場合は、慣用の遺伝子発現ベクターが組み込まれた組換え発現ベクターを用いて脊髄損傷の組織へ導入される。組織への遺伝子導入法としては、内包型リポソームによる遺伝子導入法、静電気型リポソームによる遺伝子導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、ＨＶＣ−Ｅベクターを用いる方法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法、ＨＶＣ−Ｅベクターを用いる方法、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体と共にＤＮＡ分子を細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法などに供することにより、組換え発現ベクターを脊髄神経細胞などの細胞に取り込ませることができる。
【００２７】
また、ウイルスベクターを用いる場合は、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることにより、細胞内にＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを導入することが可能である。
【００２８】
本発明の遺伝子治療剤の患者への適用法は、該治療剤を直接脊髄損傷のある組織（例えば、髄腔内）に直接導入するｉｎ ｖｉｖｏ法、および該組織から細胞を取り出し体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を脊髄損傷のある部位へ戻すｅｘ ｖｉｖｏ法がある。本発明ではｉｎ ｖｉｖｏ法が好ましい。
【００２９】
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを患者に投与するには、常法、例えば別冊実験医学，遺伝子治療の基礎技術，羊土社，１９９６、別冊実験医学，遺伝子導入＆発現解析実験法，羊土社，１９９７、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス，１９９９等に記載の方法に従って、行うことができる。
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の公知の製剤形態（例えば、注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）、マイクロカプセル剤など）をとり得ることができる。注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）はＨＧＦ蛋白質の場合と同様にして調製できる。また、マイクロカプセル剤とする場合、例えばＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ若しくはＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現プラスミドを導入した宿主細胞等を芯物質としてこれを公知の方法（例えばコアセルベーション法、界面重合法又は二重ノズル法等）に従って被膜物質で覆うことにより直径約１〜５００、好ましくは約１００〜４００μｍの微粒子として製造することができる。被膜物質としては、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、エチルセルロース、アルギン酸又はその塩、ゼラチン、ゼラチン・アラビアゴム、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール又はヒドロキシプロピルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、キトサン−アルギン酸塩、硫酸セルロース−ポリ（ジメチルジアリル）アンモニウムクロライド、ヒドロキシエチルメタクリレート−メチルメタクリレート、キトサン−カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩−ポリリジン−アルギン酸塩等の膜形成性高分子が挙げられる。
製剤中のＤＮＡの含量や投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができるが、投与量は、通常、ＨＣＶ−ＨＧＦ(ヘルペス単純ウイルス−１由来ベクターにＨＧＦ遺伝子を導入したもの)に換算して、１．５×１０６ｐｆｕ〜１．５×１０１２ｐｆｕ、好ましくは１．５×１０７ｐｆｕ〜１．５×１０１０ｐｆｕであり、これを数日ないし数ヶ月に１回投与するのが好ましい。
【００３０】
以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
また、以下の実施例においては、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡは、ラットＨＧＦ蛋白質のｃＤＮＡを用いた。このラットＨＧＦｃＤＮＡの遺伝子配列は配列番号６の通りである。
【実施例】
【００３１】
［材料および方法］
（試験動物）
妊娠正期のＳＤラットを、１２時間明・１２時間暗サイクル下にある温度調整された部屋で個々の飼育箱で飼育した。一方、生後ニューロン中のＨＧＦの目標発現に特徴を有し、ニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーターのコントロール下にあるＨＧＦ過剰発現トランスジェニックマウス（ＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇ）を、Ｓｕｎらの方法（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２，２２，６５３７−６５４８）によって作成した。野生型同腹子をコントロールとして使用した。全ての実験は慶應義塾大学医学部の“実験動物の飼育と使用ガイドライン”に従って実施した。
【００３２】
(脊髄損傷動物の調製)
ラットに脊髄損傷を生じさせるために、成体雌性ＳＤラットをケタミンおよびキシジンの腹腔内投与により麻酔し、第１０胸椎（以下、Ｔ１０という。）の椎弓および棘突起を除去して硬膜の環状部位を露出させた。第９胸椎（以下、Ｔ９という。）および第１１胸椎（以下、Ｔ１１という。）の棘突起を組織鉗子で挟みつけ、ついでそれをコプフ（Ｋｏｐｆ）のラット脊椎止め具で固定して脊柱を安定化させた。棘突起によりラットの胸部が懸垂するように止め具を上昇させた。Ｔ１０レベルの露出した硬膜上に１Ｈインパクターを用いて２００ｋＤｙｎｅの圧挫損傷モデルを作成した。脊髄損傷後、ラットの筋層を椎弓切除部位で縫合し、皮膚を損傷クリップで閉じた。術後、生理食塩水５ｍｌの皮下注射と抗生物質の筋肉内注射を毎日行い、排尿反射が回復するまで、用手的排尿を１日２回施行した（図１)。
【００３３】
マウスの脊髄損傷のために、成体ＮＳＥ−ＨＧＦトランスジェニックマウスおよびそれの野生型同腹子にＨＳＶ−ＨＧＦまたはＨＳＶ−ＬａｃＺを脊髄損傷３日前に注射した。すなわち、マウスを深く麻酔し、Ｔ１０硬膜をラットの場合と同様にして露出させ、５μｌのＨＳＶ−ＨＧＦまたはＨＳＶ−ＬａｃＺをコプフ（Ｋｏｐｆ）の定位固定インジェクターを用いて注射した。次いで１Ｈインパクターを用いて６０ｋＤｙｎｅの脊髄損傷を引き起こした。
【００３４】
（ＨＳＶ調製とそのインビボ遺伝子導入）
ＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９−ＨＧＦウイルスベクターをＺｈａｏらの方法で調製した。すなわち、ＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９ＧＦＰ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２，２２，６５３７−６５４８）中の緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子を、ＫＴ３エピトープ（ラットＨＧＦＫＴ３）でタグ化した全長ラットＨＧＦｃＤＮＡで置き換え，このベクター（ｐＲ１９ラットＨＧＦＫＴ３ＷＰＲＥ）の信頼性をシークエンス分析で確認した。そしてプラスミドｐＲ１９ラットＨＧＦＫＴ３ＷＰＲＥのＤＮＡとＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９ＧＦＰウイルスＤＮＡのコトランスフェクションによりＭ４９細胞において相同組み換えを実施した。白色プラークを選択し、３回精製し、抗ラットＨＧＦポリクローナル抗体を用いる免疫染色法で、パルマー（Ｐａｌｍｅｒ）らの方法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００，７４，５６０４−５６１８）により、複製能力のないウイルスを増殖させた。ｐＲ１９ラットＨＧＦＫＴ３ＷＰＲＥのＨＳＶ−１ウイルスで感染させたＭ４９細胞のならし培地中で、ラットＨＧＦ−ＫＴ３の発現と産生をウエスターンブロット分析およびラットＨＧＦのＥＬＩＳＡにより確認した。最終的に、１〜２×１０９ｐｆｕ／ｍｌの濃度でＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９−ＨＧＦウイルス（ＨＳＶ−ＨＧＦ）を得た。これを本実験に用いた。
【００３５】
成体雌性ＳＤラットの脊髄のＴ１０レベルの箇所に、ミニポンプを用いてベクター懸濁液５μｌを定位注射した。その後経時的に、ラットを氷冷した４％パラホルムアルデヒド中で灌流固定し、切片を作成した。ｌａｃＺ発現を視覚化するために、注射部位および神経系内での接続部位を、５ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、５ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６Ｏ・６Ｈ２Ｏ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１５０μｇ／ｍｌの４−クロロ−５−ブロモ−３−インドリル−ガラクトシダーゼ（Ｘ−Ｇａｌ）を含む１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で染色した。
【００３６】
（定量的リアルタイムＲＴ ＰＣＲ）
障害を受けた脊髄または擬似手術された脊髄の近位、中位および遠位切片（各４ｍｍ）から、障害後所定時間後に、イソゲン（ＩＳＯＧＥＮ）試薬（日本ジーン社製）を用いて、全ＲＮＡを採取した。全ＲＮＡのうち、ＲＮａｓｅ無含有のＤＮａｓｅ Ｉで前処理した１μｇを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（ライフ テクノロジー社製）を用いてランダムヘキサプライマーにより逆転写して第１鎖ｃＤＮＡとした。ＰＲＩＳＭ７０００リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ社製）を用いて増幅とオンライン定量を行った。リアルタイムＰＣＲ用のプライマーおよびプローブ、ＨＧＦ、Ｍｅｔ、およびＧＡＰＤＨはＡＢＩ社から入手した。プライマーおよびマウスＨＧＦのＴａｑＭａｎ蛍光プローブ（パーキン・エルマー・バイオシステムズ社製）のための配列は次の通りである。
マウスＨＧＦフォワードプライマー：
5’-AAG AGT GGC ATC AAG TGC CAG-3’ 配列番号７
リバースプライマー：
5’-CTG GAT TGC TTG TGA AAC ACC-3’ 配列番号８
プローブ：
5’(FAM)-TGA TCC CCC ATG AAC ACA GCT TTT TG-(TAMARA)3’ 配列番号９
実験サンプルは、同じＰＣＲプロトコールを用い、連続希釈物を増幅することによって作成した標準曲線と対比した。ＲＮＡ回収における変動を是正し逆転写の効率を確実にするために、ｇａｐｄｈ ｃＤＮＡを増幅して、各ｃＤＮＡを定量した。相対的な数を目的遺伝子／ｇａｐｄｈとして算出した。
【００３７】
（ＨＧＦの固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）分析）
組織中のＨＧＦレベルを，抗ラットＨＧＦポリクローナル抗体（特殊免疫研究所社製）を用い、船越らの方法（Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ，２００３，３２７，１−２３）により定量した。ラットＨＧＦ ＥＬＩＳＡシステムは同様のアフィニティーでもって、ラットおよびマウスのＨＧＦを特異的に検出する。
【００３８】
（組織解析）
脊髄損傷もしくは擬似手術から一定時間後、マウスをジエチルエーテル吸入により深く麻酔し、次いでリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中４％パラホルムアルデヒド溶液で心臓内灌流した。３つの４ｍｍ脊椎断片（吻側、中央、尾側）を取り出し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで２４時間、４℃で後固定（postfixed）した。組織サンプルをＰＢＳ中１０％〜２０％シュクロース溶液に２４時間４℃で浸漬し、ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテクニカル社）中に包埋した。包埋組織を液体窒素中で直ちに凍結し、８μｍの軸方向もしくは長手方向の切片に切除した。ついで、切片をヘマトキリンおよびエオシン（ＨＥ）で二重染色し、一般の組織検査を行った。
【００３９】
（免疫組織化学）
特異的抗体：（１）モノクローナル抗ＮｅｕＮ抗体（１：５００希釈）、（２）モノクローナル抗ＧＦＡＰ抗体（１：５００希釈）（ケミコン・インターナショナル社製）、（３）ポリクローナル抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（１：５０希釈）（サンタ・クルツ・バイオテック社製）で切片を染色した。すなわち、ＰＢＳ中５％ヤギ血清・０．１％トリトンＸ−１００で室温１時間ブロッキングを行った後、前記の抗体を４℃で一晩切片に適用した。この切片をＰＢＳで洗浄後、Ａｌｅｘａ４８８（緑）またはＡｌｅｘａ５４６（赤）フルオレッセンス（１：１，０００希釈）で標識した二次抗体を用い、室温１時間インキュベートして免疫反応性を視覚化した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１０μＭ）を用いるカウンター染色を実施して核形態を視覚化した。蛍光免疫染色した切片を蛍光顕微鏡で観察した。
【００４０】
（行動分析）
脊髄損傷から一定時間後に、Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）運動評価スケール（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，１９９５，１２，１−２１）を用いて、ラットまたはマウスの行動機能を評価した。
【００４１】
（統計解析）
統計解析はＳｔａｔｖｉｅｗ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ（ＳＡＳ社製）を用いて実施し、統計的差分は対応のないｔ−検定により評価した。
【００４２】
［結果］
１）ラットの脊髄損傷後、ＨＧＦおよびｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡは特徴的な経時的変化を示した。
脊髄損傷におけるＨＧＦの役割を調べるために、ＨＧＦおよびｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターのｍＲＮＡが脊髄損傷後に調節されているかどうかを定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて検討した。すなわち、成体雌性ラットを麻酔し、“材料および方法”の項で述べた方法により、定量的脊髄圧挫損傷をＴ１０レベルで作成した。擬似手術ラットをコントロールとした。脊髄損傷から一定時間後に、３つの４ｍｍ胸部脊椎断片（吻側、中央、尾側）を切除し、全ＲＮＡを精製し、ｍＲＮＡ分析した。リアルタイムＰＣＲの結果、脊髄損傷から１日および２日後に、吻側断片において、ｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡレベルが著しく増大した。その後、脊髄損傷から１週間までｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡレベルは減少したが、コントロールの非障害脊髄のそれよりも高いレベルで維持された。ｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡは脊髄損傷から２および３週間後に再び上昇し、そのレベルはコントロールの非障害脊髄に較べて３倍になった（図２Ａ）。他方、ＨＧＦのｍＲＮＡレベルは脊髄の中央断片において、緩やかに上昇した。ＨＧＦのｍＲＮＡレベルは脊髄損傷後1〜２週間で特に高い値であった。吻側および尾側の脊髄断片において、ＨＧＦ ｍＲＮＡレベルは障害後わずかに上昇しただけであった（図２Ｂ）。これらの知見は、脊髄損傷後の脊髄におけるＨＧＦおよびｃ−Ｍｅｔの誘導を明らかに示しており、かつ障害由来栄養因子としての機能を果たしている可能性を高めている。しかしながら、ｃ−Ｍｅｔの高度の誘導とは対照的に、障害から１〜３日後の初期時点での著しいＨＧＦ誘導の欠如は、脊髄損傷後の初期の時点においてＨＧＦが不十分なレベルで存在することを示唆しており、注目に値する。
【００４３】
２）ｃ−Ｍｅｔは、コントロールの非障害脊髄のニューロンで発現し、ラットで脊髄損傷から1週間後に反応性星状細胞において誘導される。
ｃ−ＭｅｔおよびＮｅｕＮ（ニューロンマーカー）または星状細胞マーカーのいずれかとを二重免疫染色することにより、脊髄損傷後にどのタイプの細胞がＨＧＦ機能にかかわっているかを調べた。蛍光免疫染色により、ｃ−Ｍｅｔ免疫反応性（ｃ−Ｍｅｔ−ＩＲ）が正常な脊髄のＮｅｕＮ−陽性のニューロンに存在していることが明らかになった。免疫反応性は大運動ニューロンにおいてより大きかった。ｃ−Ｍｅｔ−ＩＲはＧＦＡＰ陽性の星状細胞には存在していなかった（図３Ａ）。これとは対照的に、ｃ−Ｍｅｔ−ＩＲは損傷から1週間後に反応性星状細胞において誘導された（図３Ｂ）。この知見は、ＡＬＳから入手したマウスモデルの反応性星状細胞におけるｃ−Ｍｅｔの誘導（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００２，２２，６５３７−６５４８）と一致しており、脊髄ニューロンおよび反応性星状細胞における脊髄損傷後のＨＧＦに対する役割を示唆している。
【００４４】
３）ＨＧＦのニューロン特異的なトランスジェニック過剰発現が脊髄組織像と運動機能障害を改善する。
脊髄損傷後の脊髄ニューロンにおけるＨＧＦの役割を直接評価するために、本発明者らはニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）遺伝子プロモーターのコントロール下にあるＨＧＦを過剰発現しているトランスジェニックマウス（ＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇマウス）を利用した。ここで、誘導されたＨＧＦの発現は、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００２，２２，６５３７−６５４８に記載されているように、生後ニューロンに特異的に局在していた。１Ｈインパクターを用いて、ＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇマウスおよびその野生型同腹子のＴ１０レベルで、６０ｋＤｙｎｅ脊髄打撲障害を作成し、ＨＥ染色した軸断片および矢状断片において組織学的差異を解析した。
【００４５】
野生型同腹子の脊髄のＨＥ染色した軸方向像において、脊髄構造が大きく破壊されていた。すなわち、多量の神経細胞死および炎症細胞浸潤がはっきりと見られた。加えて、脊髄損傷後、脊髄にいくつかの空洞が形成された（図４、上部パネル）。野生型同腹子の矢状方向像において、脊髄の広範囲にわたる神経細胞死に加えて、軸索変性が長い範囲ではっきりと見られた。野性型同腹子とは対照的に、ＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇマウスの軸方向像および矢状方向像のいずれにおいても、より少ない神経細胞死とより少ない軸索変性が見られた（図４）。ＢＢＢスケールにより後肢運動機能解析から、脊髄損傷7日後から良好な機能回復が観察され、スコアは、その後、脊髄損傷４２日後までさらに増加した（図５）。これらの知見は、ニューロン特異的なＨＧＦの過剰発現は脊髄ニューロンにおける神経細胞変性および軸索変性を改善すること、およびＨＧＦが脊髄の再生にとってより良好な環境を生じていることを明確に立証している。
【００４６】
４）複製能力のないＨＳＶ１由来ベクターを用いるＨＧＦの遺伝子導入は脊髄ニューロンおよびその軸索の変性を改善し、ラットの脊髄損傷モデルにおいて運動機能の回復を促進する。
トランスジェニックにおけるＨＧＦ過剰発現は人為的なアプローチであり、ヒトの患者に適用することは難しい。このため、本発明者らは次に、複製能力のないヘルペス単純ウイルス−１由来ベクター（ＨＳＶ）を用いるＨＧＦの遺伝子導入が、ＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇマウスの結果を再現できるかどうかという問題に取り組んだ。ヘルペス単純ウイルス タイプ−１は向神経性の二重鎖ＤＮＡウイルスであり、大きな遺伝子を組み込む能力を有している。そのため、本発明者らは、必須の前初期遺伝子ＩＣＰ２７およびＩＣＰ４の欠損による複製能力のないＨＳＶを用いた。これはニューロン特異的でかつＨＳＶの複製能を欠失させたものである（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００１，７５（９），４３４３−４３５６）。複製能力のないＨＳＶを用いた理由は、ニューロンを効率的に形質転換することが示されており、かつ筋萎縮性側索硬化症のトランスジェニックマウスモデルにおいて安全にかつ非毒性的にニューロンへ遺伝子導入して持続的な発現を行うためにＨＳＶベクターを用いる可能性が示されていたためである。ＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９−ＨＧＦウイルス由来ベクター（ＨＳＶ−ＨＧＦ）は、“材料および方法”の項で記載した方法で調製した。また、ＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９−ＬａｃＺウイルス由来ベクター（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）はコントロールとして用いた。
【００４７】
本発明者らは、まず、ミニポンプを組み込んだ定位固定インジェクターを用いてラットのＴ１０脊髄にＨＳＶ−ＬａｃＺを直接接種することにより脊髄ニューロンにＬａｃＺを効率的に導入できるかどうかを確認した。図６に示されているように、β−ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）染色により、多数の緑色β−ｇａｌ染色されたＬａｃＺ発現ニューロンが、注入３日後に、脊髄にはっきりと認められ、これによりＨＳＶを脊髄ニューロンへ首尾よく導入できることが立証された。
【００４８】
本発明者らは、次に、ＨＳＶ−ＨＧＦの脊髄ニューロンへの直接接種がＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇで示された向神経性活性を再現でき、ラットにおける脊髄損傷後の自発運動機能の結果に影響を与えるかどうかを検討した。脊髄損傷３日前に、成体雌性ＳＤラットにＨＳＶ−ＨＧＦまたはＨＳＶ−ＬａｃＺを前注入することにより、脊髄損傷後早い時点で、脊髄ニューロンにＨＧＦまたはＬａｃＺを発現させた。その理由は、ｈｇｆレベルが、脊髄で高度に誘導されたｃ−ｍｅｔレベルと較べて、損傷後早い時点、すなわち１〜７日目には、相対的に低かったからである（図２）。ＨＳＶ−ＨＧＦ注入ラットおよびＨＳＶ−ＬａｃＺ注入ラットに、１Ｈインパクターを用いて、“材料および方法”の項で述べた方法で、２００ｋＤｙｎｅ量の脊髄打撲障害を生じさせた。脊髄のＨＥ染色断片から、ＨＳＶ−ＨＧＦ注入群はＨＳＶ−ＬａｃＺ注入群に較べて、脊髄損傷後に補修した組織の比率が大きく、また神経細胞死およびその軸索変性が少なかったことが分かった（図７）。さらに、ＢＢＢスコアから、ＨＳＶ−ＨＧＦ注入群はＨＳＶ−ＬａｃＺ注入群に較べて、顕著に良好な運動能力を示したことが分かった（図８）。このことから、脊髄にラットＨＧＦをＨＳＶ介在遺伝子で導入することが神経細胞保護および脊髄障害のラットモデルにおいて運動機能の回復に有益であることが分かる。
【００４９】
なお、上記実施例はＨＧＦ遺伝子を導入したものであるが、ＨＧＦ遺伝子の代わりに５残基欠失型リコンビナントヒトＨＧＦ蛋白質（配列番号２）を髄腔内注射（投与量：２００μｇ／月）する以外は、上記と同様の実験を行うことにより、ＨＧＦ蛋白質が脊髄損傷治療剤となることが確認できる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明により、脊髄損傷の治療に有用な薬剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は脊髄損傷のラットモデルを模式的に示した図である。 成体雌性ラットを深く麻酔し、脊髄のＴ１０レベルでＩＨインパクターを用いて、２００ｋＤｙｎｅの定量的脊髄圧挫損傷を作成した。４ｍｍの断片（吻側、中央、尾側）を切除した。この断片は免疫染色に用いると共に、ＳＣＩから一定時間後にＨＧＦおよびｃ−Ｍｅｔの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行うために用いた。
【図２】ラットの脊髄損傷後の脊髄におけるｃ−ＭｅｔおよびＨＧＦのｍＲＮＡの発現変化を示す線図である。 全ＲＮＡをＳＣＩから一定時間後に脊髄の各断片（吻側、中央、尾側）から精製し、ｃ−ｍｅｔ（Ａ）およびｈｇｆ（Ｂ）の定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを“材料および方法”の項で記載した方法で実施した。ＧＡＰＤＨをコントロールとして使用した。
【図３】正常な脊髄ニューロンにおいて発現されるｃ−Ｍｅｔと、反応性星状細胞においてラット脊髄損傷1週間後に誘導されるｃ−Ｍｅｔを示す写真である。 定量的脊髄圧挫損傷（２００ｋＤｙｎｅ）を“材料および方法”の項で記載した方法で成体雌性ＳＤラットの脊髄のＴ１０レベルで作成した。ニューロンマーカーＮｅｕＮと星状細胞マーカーＧＦＡＰを用いるｃ−Ｍｅｔの二重標識免疫染色を正常コントロールラットとＳＣＩラットで実施した。（Ａ）：コントロールラットの脊髄、（Ｂ）：ＳＣＩから1週間後の障害ラットの脊髄
【図４】ＮＳＥ−ＨＧＦマウスと野生型同腹子との、脊髄損傷後に補修した組織を示す写真である。 定量的脊髄圧挫損傷（２００ｋＤｙｎｅ）を“材料および方法”の項で記載した方法でＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇおよび野生型同腹子の脊髄のＴ１０レベルで作成し、ＨＥ染色した軸索断片および矢状断片を作成した。Ｗｔ：野生型同腹子、ＮＳＥ−ＨＧＦ：ＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇ
【図５】ＮＳＥ−ＨＧＦトランスジェニックマウスと野生型同腹子との、脊髄損傷後のＢＢＢスコアを示す線図である。 定量的脊髄圧挫損傷（２００ｋＤｙｎｅ）を“材料および方法”の項で記載した方法でＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇおよび野生型同腹子の脊髄のＴ１０レベルで作成し、後肢運動機能を所定時間にＢＢＢスコアで分析した。Ｗｔ：野生型同腹子、ＮＳＥ−ＨＧＦ：ＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇ
【図６】複製能力のないＨＳＶ−ＬａｃＺを脊髄に注入し、その３日後にβ−ｇａｌ染色した矢状断片の写真である。 ＨＳＶ−ＬａｃＺ（１．５×１０９ｐｆｕ／ｍｌ）５μｌを、深麻酔下に、成体ラットの脊髄（Ｔ１０レベル）に、ミニポンプを用いて定位固定的に注入した。注入３日後、ラットをＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで灌流し、ＰＢＳ中の２０％シュクロース溶液でクレオプロテクションし、冷凍断片を作成した。ついで、ＨＳＶ−ＬａｃＺベクターに起因するβ−ガラクトシダーゼ発現をβ−ｇａｌ染色した。
【図７】脊髄損傷３日前に投与したＨＳＶ−ＨＧＦ注入群とＨＳＶ−ＬａｃＺ注入群のＨＥ染色した軸索断片と矢状断片を示す写真である。 ＨＳＶ−ＨＧＦ注入またはＨＳＶ−ＬａｃＺ注入３日後に、定量的脊髄圧挫損傷（２００ｋＤｙｎｅ）を“材料および方法”の項で記載した方法で、成体雌性ＳＤラットの脊髄のＴ１０レベルで作成し、ＳＣＩから１週間後に、ＨＥ染色した軸索断片および矢状断片を作成した。ＨＳＶ−Ｌａｃ：ＳＣＩの３日前にＨＳＶ−Ｌａｃを前注射した脊髄、ＨＳＶ−ＨＧＦ：ＳＣＩ３日前にＨＳＶ−ＨＧＦを前注射した脊髄。
【図８】ＨＳＶ−ＨＧＦ注入群とＨＳＶ−ＬａｃＺ注入群におけるＢＢＢスコアを示す線図である。 ＨＳＶ−ＨＧＦまたはＨＳＶ−ＬａｃＺをＳＣＩの３日前に前注射した成体雌性ＳＤラットの脊髄のＴ１０レベルで、定量的脊髄圧挫損傷（２００ｋＤｙｎｅ）を“材料および方法”の項で記載した方法で作成し、ＳＣＩから一定時間後に後肢運動機能をＢＢＢスコアにより分析した。ＬａｃＺ：ＨＳＶ−ＬａｃＺ前注射群、ＨＧＦ：ＨＳＶ−ＨＧＦ前注射群。
【技術分野】
【０００１】
本発明は脊髄損傷治療剤に関し、更に詳しくは肝細胞増殖因子（以下、ＨＧＦと略記する。）またはそれをコードするＤＮＡを有効成分とする脊髄損傷治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊髄損傷（spinal cord injury：ＳＣＩ）とは、交通事故や高所転落に伴う脊脱臼骨折などの外傷で、脊髄実質が損傷されることにより、損傷部以下の末梢の運動・感覚・自律神経系の麻痺を呈する病態のことである。
現在、脊髄損傷の患者は、日本では約１０万人、米国では２５万人に及ぶとされており、年間日本では５千人、米国では１万人以上の患者が増加している。
【０００３】
近年医療の進歩に伴い受傷後の生存率は上昇し、障害の進行を抑えるべく脊椎骨損傷の再建手術の方法も飛躍的に進歩してきた。したがって、２次的な神経症状の増悪を抑えることも成功しはじめている。さらに、リハビリテーションによる機能回復訓練技術の向上や補助器具（電動車いす等）の開発等により、患者の日常生活動作（ＡＤＬ）が向上してきてはいる。しかし、根本的な脊髄損傷自体（神経損傷からの神経保護・再生）への有効な治療法がないために、自立した排尿・排便・手作業や歩行が不能な患者が大量に存在しているのが現状である。
【０００４】
一方、ＨＧＦは、最初に成熟肝細胞に対する強力なマイトージェンとして同定され、１９８９年にその遺伝子クローニングがなされた（非特許文献１、２）。ＨＧＦは肝細胞増殖因子として発見されたが、ノックアウト／ノックインマウスの手法を含む発現および機能的解析における近年の多数の研究により、ＨＧＦは新規な神経栄養因子であることも明らかにされた（非特許文献３、４）。
【０００５】
なお、特許文献１には、パーキンソン病モデルラットを用いて、ＨＧＦ遺伝子のモデルラットへの作用効果を行動学的におよび組織学的に検討した実施例が示されており、ＨＧＦ遺伝子の前投与により中脳黒質ドーパミンニューロンを神経毒６−ＯＨＤＡから保護し、パーキンソン病モデルラットの症状を抑えたとの実験結果が示されている。そして、この特許文献１では、このような実験結果に基づいて、ＨＧＦ遺伝子がパーキンソン病のみならず、アルツハイマー病、脊髄小脳変性症、多発性硬化症、線条体黒質変性症、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン舞踏病、シャイ・ドレーガー症候群、シャルコー・マリー・トース病、フリードライヒ失調症、重症筋無力症、ウイリス動脈輸閉塞症、アミロイドーシス、ピック病、スモン病、皮膚筋炎・多発性筋炎、クロイツフェルド・ヤコブ病、ベーチェット病、全身性エリテマドーデス、サルコイドーシス、結節性動脈周囲炎、後縦靭帯骨化症、広範性脊柱狭窄症、混合性結合組織病、糖尿病性末梢神経炎、虚血性脳血管障害（脳梗塞、脳出血など）などの神経疾患の治療にも適用できるとし、かかる神経疾患の１つとして脊髄損傷も挙げられている。
【０００６】
しかしながら、パーキンソン病は中脳黒質部のドーパミン作動性ニューロンという特定種のニューロンが選択的に脱落する神経変性疾患であるのに対して、脊髄損傷は主に外傷により脊髄内の多くの種類のニューロンやグリアが広汎に非選択的に傷害される疾患であり、臨床的には全く異なる病態を示す。このため、パーキンソン病モデルラットの上記実験結果のみから、脊髄損傷の治療に有効であるとは到底いえず、また有効であったとする報告もない。
【特許文献１】ＷＯ２００３／０４５４３９
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２２，１４５０−１４５９（１９８４）
【非特許文献２】Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０−４４３（１９８９）
【非特許文献３】Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２，２１３−２１７（１９９９）
【非特許文献４】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，３２７，１−２３（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、脊髄損傷を根本的に治療するのに有効な薬剤を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前記課題を解決すべく種々研究を重ねた結果、ＨＧＦ蛋白質またはそれをコードするＤＮＡが脊髄損傷に対して優れた治療効果を奏することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、
（１）ＨＧＦ蛋白質またはそれをコードするＤＮＡを有効成分とする脊髄損傷治療剤、
（２）有効成分がＨＧＦ蛋白質である前記（１）記載の治療剤、
（３）有効成分がＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡである前記（１）記載の治療剤、
（４）ＨＧＦが、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であってＨＧＦとして作用する蛋白質、又はこれらの部分ペプチドであってＨＧＦとして作用するペプチドである前記（２）記載の治療剤、
（５）ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡが、配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦとして作用する蛋白質をコードするＤＮＡである前記（３）記載の治療剤、
（６）脊髄損傷部位に局所適用するための前記（１）〜（５）のいずれかに記載の治療剤、および
（７）髄腔内投与用注射剤の剤型である前記（６）記載の治療剤、
に関する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の治療剤は、脊髄損傷に対して極めて優れた治療効果を発揮するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明で使用されるＨＧＦ蛋白質は公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。ＨＧＦ蛋白質の製造方法としては、例えばＨＧＦ蛋白質を産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該ＨＧＦ蛋白質を得ることができる。あるいは遺伝子工学的手法によりＨＧＦ蛋白質をコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨＧＦ蛋白質を得ることもできる。（例えば、特開平５−１１１３８２号公報、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９年、第１６３巻，ｐ．９６７等を参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母又は動物細胞等を用いることができる。このようにして得られたＨＧＦ蛋白質は、天然型ＨＧＦ蛋白質と実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数個〔例えば、数個（例えば１〜８個；以下同様である。）〕のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失若しくは付加されていてもよい。そのようなＨＧＦ蛋白質として、下記する５アミノ酸欠損型ＨＧＦ蛋白質を挙げることができる。ここで、アミノ酸配列について、「１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加」とは、遺伝子工学的手法、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、又は天然に生じうる程度の数（１〜数個）が、欠失、置換若しくは付加等されていることを意味する。糖鎖が置換、欠失若しくは付加したＨＧＦ蛋白質とは、例えば天然のＨＧＦ蛋白質に付加している糖鎖を酵素等で処理し糖鎖を欠損させたＨＧＦ蛋白質、また糖鎖が付加しない様に糖鎖付加部位のアミノ酸配列に変異が施されたもの、あるいは天然の糖鎖付加部位とは異なる部位に糖鎖が付加するようアミノ酸配列に変異が施されたもの等をいう。
さらに、ＨＧＦ蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上の相同性を有する蛋白質、好ましくは約９０％以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する蛋白質であって、かつＨＧＦとして作用する蛋白質も含まれる。上記アミノ酸配列について「相同」とは、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残基の一致の程度の意味である。
【００１２】
上記ＨＧＦ蛋白質としては、例えば配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。配列番号２で表されるＨＧＦ蛋白質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列の１６１〜１６５番目の５個のアミノ酸残基が欠失している５アミノ酸欠損型ＨＧＦ蛋白質である。配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は、両者ともヒト由来の天然ＨＧＦ蛋白質であって、ＨＧＦとしてのマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する。
配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む蛋白質、例えば配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列から、１〜数個のアミノ酸残基を挿入又は欠失させたアミノ酸配列、１〜数個のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と置換させたアミノ酸配列又は１〜数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列等を含む蛋白質であってＨＧＦとして作用する蛋白質であることが好ましい。挿入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる２０種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基を有する限りどのような化合物でもよいが、例えばγ−アミノ酪酸等が挙げられる。
これらの蛋白質は、単独であっても、これらの混合蛋白質であってもよい。
【００１３】
本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチル等のＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチル等のＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチル等のフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチル等のα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基等のＣ７−１４アラルキル基のほか、ピバロイルオキシメチル基等が用いられる。本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質が、Ｃ末端以外にカルボキシル基（又はカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも本発明におけるＨＧＦ蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステル等が用いられる。さらに、本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質には、上記した蛋白質において、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基等）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル等のＣ２−６アルカノイル基等のＣ１−６アシル基等）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。
【００１４】
本発明で用いるＨＧＦ蛋白質の部分ペプチド（以下、部分ペプチドと略記する場合がある。）としては、上記したＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドであればいずれのものであってもよい。本発明において、部分ペプチドのアミノ酸の数は、上記したＨＧＦ蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも約２０個以上、好ましくは約５０個以上、より好ましくは約１００個以上のアミノ酸配列を含有するペプチド等が好ましい。本発明の部分ペプチドにおいては、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）又はエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。さらに、部分ペプチドには、上記したＨＧＦ蛋白質と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド等の複合ペプチド等も含まれる。
【００１５】
本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質又はその部分ペプチドの塩としては、酸又は塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩等が挙げられる。
【００１６】
本発明に用いられるＨＧＦ蛋白質の部分ペプチド又はその塩は、公知のペプチドの合成法に従って、あるいはＨＧＦ蛋白質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれでも良い。すなわち、ＨＧＦ蛋白質を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は、保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ及びＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６年）、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ及びＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９６５年）等に記載された方法が挙げられる。反応後は通常の精製方法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶等を組み合わせてＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
【００１７】
本発明の治療剤は、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを有効成分として含有することもできる。
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番号３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性、例えばマイトゲン活性、モートゲン活性等を有する蛋白質をコードするＤＮＡ等が挙げられる。なお、配列番号３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば上記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍ程度の塩化ナトリウム存在下、約６５℃程度でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる。）を用い、約６５℃程度の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
【００１８】
上記の配列番号３又は４で表される塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとして具体的には、配列番号３又は４で表わされる塩基配列と約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１：以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す。）に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００１９】
さらに、本発明のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡは上記に限定されず、発現する蛋白質がＨＧＦ蛋白質と実質的に同じ作用を有するＤＮＡである限り、本発明のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡとして使用できる。例えばＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ等もＨＧＦとしての作用を有する部分ペプチドをコードするものであれば、本発明のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡの範疇に含まれる。ＨＧＦ蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、上記した部分ペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡであればいかなるものであってもよい。また、上記のＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡと同様に、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミド等いずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて、直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することもできる。具体的な本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、（ａ）配列番号３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、（ｂ）配列番号３又は４で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦ蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、又は上記（ａ）或いは（ｂ）の部分塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。
該ＤＮＡは、例えば通常のハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等により容易に得ることができ、該ＤＮＡの取得は具体的には前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ等の基本書等を参考にして行うことができる。
【００２０】
なお、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質またはそれをコードするＤＮＡは、ヒトに適用する場合は前記したヒト由来のものが好適に用いられるが、ヒト以外の哺乳動物に由来するＨＧＦ蛋白質またはそれをコードするＤＮＡであってもよい。たとえば、ラット由来のＨＧＦ蛋白質は配列番号５で表され、ラットＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡは配列番号６で表される。
また、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質又は部分ペプチドをコードするＲＮＡも、逆転写酵素によりＨＧＦ蛋白質又は部分ペプチドを発現することができるものであれば、本発明に用いることができ、本発明の範囲内である。また該ＲＮＡも公知の手段により得ることができる。
【００２１】
本発明の脊髄損傷治療剤は、ヒトのほか、ヒト以外の哺乳動物（例えば、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコなど）にも適用できる。
【００２２】
本発明の脊髄損傷治療剤を患者に投与する場合、その投与形態、投与方法、投与量などは、有効成分がＨＧＦ蛋白質の場合と、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡの場合と若干異なる。
たとえば、有効成分がＨＧＦ蛋白質である場合は、種々の製剤形態、例えば液剤、固形剤等をとりうるが、一般的にはＨＧＦ蛋白質のみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤、噴射剤、徐放性製剤（例えば、デポ剤）などとされる。上記注射剤は、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤、例えば等張化剤（塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤（リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤（パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）又はｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等）などを適宜添加した溶液に、ＨＧＦ蛋白質を溶解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。また適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）又は非イオン界面活性剤（ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０等）などを使用してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール等を使用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアルに充填される。注射剤中のＨＧＦ蛋白質含量は、通常約０．０００２〜０．２ｗ／ｖ％程度、好ましくは約０．００１〜０．１ｗ／ｖ％程度に調整される。なお、注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
【００２３】
噴霧剤も製剤上の常套手段によって調製することができる。噴霧剤として製造する場合、その添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添加剤であればいずれのものであってもよく、例えば、噴射剤の他、上記した溶剤、保存剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤などが用いられる。噴射剤としては、液化ガス噴射剤又は圧縮ガス等が用いられる。液化ガス噴射剤としては、例えば、フッ化炭化水素（ＨＣＦＣ２２、ＨＣＦＣ−１２３、ＨＣＦＣ−１３４ａ、ＨＣＦＣ１４２等の代替フロン類等）、液化石油、ジメチルエーテル等が挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば、可溶性ガス（炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等）又は不溶性ガス（窒素ガス等）などが挙げられる。
【００２４】
また、本発明で用いられるＨＧＦ蛋白質は、生体分解性高分子と共に、徐放性製剤（例えばデポ剤）とすることもできる。ＨＧＦ蛋白質は特にデポ剤とすることにより、投薬回数の低減、作用の持続性及び副作用の軽減等の効果が期待できる。該徐放性製剤は公知の方法に従って製造することができる。本徐放性製剤に使用される生体内分解性高分子は、公知の生体内分解性高分子のなかから適宜選択できるが、例えばデンプン、デキストラン又はキトサン等の多糖類、コラーゲン又はゼラチン等の蛋白質、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリロイシン、ポリアラニン又はポリメチオニン等のポリアミノ酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸重合体又は共重合体、ポリカプロラクトン、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物又はフマル酸・ポリエチレングリコール・ビニルピロリドン共重合体等のポリエステル、ポリオルソエステル又はポリメチル−α−シアノアクリル酸等のポリアルキルシアノアクリル酸、ポリエチレンカーボネート又はポリプロピレンカーボネート等のポリカーボネート等である。好ましくはポリエステル、更に好ましくはポリ乳酸又は乳酸・グリコール酸重合体又は共重合体である。ポリ乳酸−グリコール酸重合体又は共重合体を使用する場合、その組成比（乳酸／グリコール酸）（モル％）は徐放期間によって異なるが、例えば徐放期間が約２週間ないし３カ月、好ましくは約２週間ないし１カ月の場合には、約１００／０ないし５０／５０である。該ポリ乳酸−グリコール酸重合体又は共重合体の重量平均分子量は、一般的には約５，０００ないし２０，０００である。ポリ乳酸−グリコール酸共重合体は、公知の製造法、例えば特開昭６１−２８５２１号公報に記載の製造法に従って製造できる。生体分解性高分子とＨＧＦ蛋白質の配合比率は特に限定はないが、例えば生体分解性高分子に対して、ＨＧＦ蛋白質が約０．０１〜３０ｗ／ｗ％程度である。
【００２５】
投与方法としては、注射剤もしくは噴霧剤を直接脊髄損傷のある組織に直接注射（髄腔内（intrathecal）投与、徐放性ポンプによる髄腔内持続投与など）もしくは噴霧するか、あるいは徐放性製剤（デポ剤）を脊髄損傷のある組織に近い部位に埋め込むのが好ましい。また、投与量は、剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択されるが、通常、1回当たり１μｇ〜５００ｍｇ、好ましくは１０μｇ〜５０ｍｇである。また、投与回数も剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて適宜選択され、１回投与とするか、ある間隔をおいて持続投与とすることもできる。持続投与の場合、投与間隔は１日１回から数ヶ月に１回でよく、例えば、徐放性製剤（デポ剤）による投与や徐放性ポンプによる髄腔内持続投与の場合は、数ヶ月に１回でもよい。
【００２６】
一方、有効成分がＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡである場合は、その投与形態としては非ウイルスベクターを用いる場合と、ウイルスベクターを用いる場合とに別れ、その投与方法は常法により行うことができる。
非ウイルスベクターを用いる場合は、慣用の遺伝子発現ベクターが組み込まれた組換え発現ベクターを用いて脊髄損傷の組織へ導入される。組織への遺伝子導入法としては、内包型リポソームによる遺伝子導入法、静電気型リポソームによる遺伝子導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、ＨＶＣ−Ｅベクターを用いる方法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法、ＨＶＣ−Ｅベクターを用いる方法、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体と共にＤＮＡ分子を細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、正電荷ポリマーによる導入法などに供することにより、組換え発現ベクターを脊髄神経細胞などの細胞に取り込ませることができる。
【００２７】
また、ウイルスベクターを用いる場合は、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることにより、細胞内にＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを導入することが可能である。
【００２８】
本発明の遺伝子治療剤の患者への適用法は、該治療剤を直接脊髄損傷のある組織（例えば、髄腔内）に直接導入するｉｎ ｖｉｖｏ法、および該組織から細胞を取り出し体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を脊髄損傷のある部位へ戻すｅｘ ｖｉｖｏ法がある。本発明ではｉｎ ｖｉｖｏ法が好ましい。
【００２９】
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを患者に投与するには、常法、例えば別冊実験医学，遺伝子治療の基礎技術，羊土社，１９９６、別冊実験医学，遺伝子導入＆発現解析実験法，羊土社，１９９７、日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス，１９９９等に記載の方法に従って、行うことができる。
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の公知の製剤形態（例えば、注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）、マイクロカプセル剤など）をとり得ることができる。注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）はＨＧＦ蛋白質の場合と同様にして調製できる。また、マイクロカプセル剤とする場合、例えばＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡ若しくはＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現プラスミドを導入した宿主細胞等を芯物質としてこれを公知の方法（例えばコアセルベーション法、界面重合法又は二重ノズル法等）に従って被膜物質で覆うことにより直径約１〜５００、好ましくは約１００〜４００μｍの微粒子として製造することができる。被膜物質としては、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテートフタレート、エチルセルロース、アルギン酸又はその塩、ゼラチン、ゼラチン・アラビアゴム、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール又はヒドロキシプロピルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、キトサン−アルギン酸塩、硫酸セルロース−ポリ（ジメチルジアリル）アンモニウムクロライド、ヒドロキシエチルメタクリレート−メチルメタクリレート、キトサン−カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩−ポリリジン−アルギン酸塩等の膜形成性高分子が挙げられる。
製剤中のＤＮＡの含量や投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができるが、投与量は、通常、ＨＣＶ−ＨＧＦ(ヘルペス単純ウイルス−１由来ベクターにＨＧＦ遺伝子を導入したもの)に換算して、１．５×１０６ｐｆｕ〜１．５×１０１２ｐｆｕ、好ましくは１．５×１０７ｐｆｕ〜１．５×１０１０ｐｆｕであり、これを数日ないし数ヶ月に１回投与するのが好ましい。
【００３０】
以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
また、以下の実施例においては、ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡは、ラットＨＧＦ蛋白質のｃＤＮＡを用いた。このラットＨＧＦｃＤＮＡの遺伝子配列は配列番号６の通りである。
【実施例】
【００３１】
［材料および方法］
（試験動物）
妊娠正期のＳＤラットを、１２時間明・１２時間暗サイクル下にある温度調整された部屋で個々の飼育箱で飼育した。一方、生後ニューロン中のＨＧＦの目標発現に特徴を有し、ニューロン特異的エノラーゼ遺伝子プロモーターのコントロール下にあるＨＧＦ過剰発現トランスジェニックマウス（ＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇ）を、Ｓｕｎらの方法（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２，２２，６５３７−６５４８）によって作成した。野生型同腹子をコントロールとして使用した。全ての実験は慶應義塾大学医学部の“実験動物の飼育と使用ガイドライン”に従って実施した。
【００３２】
(脊髄損傷動物の調製)
ラットに脊髄損傷を生じさせるために、成体雌性ＳＤラットをケタミンおよびキシジンの腹腔内投与により麻酔し、第１０胸椎（以下、Ｔ１０という。）の椎弓および棘突起を除去して硬膜の環状部位を露出させた。第９胸椎（以下、Ｔ９という。）および第１１胸椎（以下、Ｔ１１という。）の棘突起を組織鉗子で挟みつけ、ついでそれをコプフ（Ｋｏｐｆ）のラット脊椎止め具で固定して脊柱を安定化させた。棘突起によりラットの胸部が懸垂するように止め具を上昇させた。Ｔ１０レベルの露出した硬膜上に１Ｈインパクターを用いて２００ｋＤｙｎｅの圧挫損傷モデルを作成した。脊髄損傷後、ラットの筋層を椎弓切除部位で縫合し、皮膚を損傷クリップで閉じた。術後、生理食塩水５ｍｌの皮下注射と抗生物質の筋肉内注射を毎日行い、排尿反射が回復するまで、用手的排尿を１日２回施行した（図１)。
【００３３】
マウスの脊髄損傷のために、成体ＮＳＥ−ＨＧＦトランスジェニックマウスおよびそれの野生型同腹子にＨＳＶ−ＨＧＦまたはＨＳＶ−ＬａｃＺを脊髄損傷３日前に注射した。すなわち、マウスを深く麻酔し、Ｔ１０硬膜をラットの場合と同様にして露出させ、５μｌのＨＳＶ−ＨＧＦまたはＨＳＶ−ＬａｃＺをコプフ（Ｋｏｐｆ）の定位固定インジェクターを用いて注射した。次いで１Ｈインパクターを用いて６０ｋＤｙｎｅの脊髄損傷を引き起こした。
【００３４】
（ＨＳＶ調製とそのインビボ遺伝子導入）
ＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９−ＨＧＦウイルスベクターをＺｈａｏらの方法で調製した。すなわち、ＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９ＧＦＰ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００２，２２，６５３７−６５４８）中の緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子を、ＫＴ３エピトープ（ラットＨＧＦＫＴ３）でタグ化した全長ラットＨＧＦｃＤＮＡで置き換え，このベクター（ｐＲ１９ラットＨＧＦＫＴ３ＷＰＲＥ）の信頼性をシークエンス分析で確認した。そしてプラスミドｐＲ１９ラットＨＧＦＫＴ３ＷＰＲＥのＤＮＡとＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９ＧＦＰウイルスＤＮＡのコトランスフェクションによりＭ４９細胞において相同組み換えを実施した。白色プラークを選択し、３回精製し、抗ラットＨＧＦポリクローナル抗体を用いる免疫染色法で、パルマー（Ｐａｌｍｅｒ）らの方法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００，７４，５６０４−５６１８）により、複製能力のないウイルスを増殖させた。ｐＲ１９ラットＨＧＦＫＴ３ＷＰＲＥのＨＳＶ−１ウイルスで感染させたＭ４９細胞のならし培地中で、ラットＨＧＦ−ＫＴ３の発現と産生をウエスターンブロット分析およびラットＨＧＦのＥＬＩＳＡにより確認した。最終的に、１〜２×１０９ｐｆｕ／ｍｌの濃度でＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９−ＨＧＦウイルス（ＨＳＶ−ＨＧＦ）を得た。これを本実験に用いた。
【００３５】
成体雌性ＳＤラットの脊髄のＴ１０レベルの箇所に、ミニポンプを用いてベクター懸濁液５μｌを定位注射した。その後経時的に、ラットを氷冷した４％パラホルムアルデヒド中で灌流固定し、切片を作成した。ｌａｃＺ発現を視覚化するために、注射部位および神経系内での接続部位を、５ｍＭ Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、５ｍＭ Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６Ｏ・６Ｈ２Ｏ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１５０μｇ／ｍｌの４−クロロ−５−ブロモ−３−インドリル−ガラクトシダーゼ（Ｘ−Ｇａｌ）を含む１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で染色した。
【００３６】
（定量的リアルタイムＲＴ ＰＣＲ）
障害を受けた脊髄または擬似手術された脊髄の近位、中位および遠位切片（各４ｍｍ）から、障害後所定時間後に、イソゲン（ＩＳＯＧＥＮ）試薬（日本ジーン社製）を用いて、全ＲＮＡを採取した。全ＲＮＡのうち、ＲＮａｓｅ無含有のＤＮａｓｅ Ｉで前処理した１μｇを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（ライフ テクノロジー社製）を用いてランダムヘキサプライマーにより逆転写して第１鎖ｃＤＮＡとした。ＰＲＩＳＭ７０００リアルタイムＰＣＲシステム（ＡＢＩ社製）を用いて増幅とオンライン定量を行った。リアルタイムＰＣＲ用のプライマーおよびプローブ、ＨＧＦ、Ｍｅｔ、およびＧＡＰＤＨはＡＢＩ社から入手した。プライマーおよびマウスＨＧＦのＴａｑＭａｎ蛍光プローブ（パーキン・エルマー・バイオシステムズ社製）のための配列は次の通りである。
マウスＨＧＦフォワードプライマー：
5’-AAG AGT GGC ATC AAG TGC CAG-3’ 配列番号７
リバースプライマー：
5’-CTG GAT TGC TTG TGA AAC ACC-3’ 配列番号８
プローブ：
5’(FAM)-TGA TCC CCC ATG AAC ACA GCT TTT TG-(TAMARA)3’ 配列番号９
実験サンプルは、同じＰＣＲプロトコールを用い、連続希釈物を増幅することによって作成した標準曲線と対比した。ＲＮＡ回収における変動を是正し逆転写の効率を確実にするために、ｇａｐｄｈ ｃＤＮＡを増幅して、各ｃＤＮＡを定量した。相対的な数を目的遺伝子／ｇａｐｄｈとして算出した。
【００３７】
（ＨＧＦの固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）分析）
組織中のＨＧＦレベルを，抗ラットＨＧＦポリクローナル抗体（特殊免疫研究所社製）を用い、船越らの方法（Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ，２００３，３２７，１−２３）により定量した。ラットＨＧＦ ＥＬＩＳＡシステムは同様のアフィニティーでもって、ラットおよびマウスのＨＧＦを特異的に検出する。
【００３８】
（組織解析）
脊髄損傷もしくは擬似手術から一定時間後、マウスをジエチルエーテル吸入により深く麻酔し、次いでリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中４％パラホルムアルデヒド溶液で心臓内灌流した。３つの４ｍｍ脊椎断片（吻側、中央、尾側）を取り出し、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで２４時間、４℃で後固定（postfixed）した。組織サンプルをＰＢＳ中１０％〜２０％シュクロース溶液に２４時間４℃で浸漬し、ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテクニカル社）中に包埋した。包埋組織を液体窒素中で直ちに凍結し、８μｍの軸方向もしくは長手方向の切片に切除した。ついで、切片をヘマトキリンおよびエオシン（ＨＥ）で二重染色し、一般の組織検査を行った。
【００３９】
（免疫組織化学）
特異的抗体：（１）モノクローナル抗ＮｅｕＮ抗体（１：５００希釈）、（２）モノクローナル抗ＧＦＡＰ抗体（１：５００希釈）（ケミコン・インターナショナル社製）、（３）ポリクローナル抗ｃ−Ｍｅｔ抗体（１：５０希釈）（サンタ・クルツ・バイオテック社製）で切片を染色した。すなわち、ＰＢＳ中５％ヤギ血清・０．１％トリトンＸ−１００で室温１時間ブロッキングを行った後、前記の抗体を４℃で一晩切片に適用した。この切片をＰＢＳで洗浄後、Ａｌｅｘａ４８８（緑）またはＡｌｅｘａ５４６（赤）フルオレッセンス（１：１，０００希釈）で標識した二次抗体を用い、室温１時間インキュベートして免疫反応性を視覚化した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１０μＭ）を用いるカウンター染色を実施して核形態を視覚化した。蛍光免疫染色した切片を蛍光顕微鏡で観察した。
【００４０】
（行動分析）
脊髄損傷から一定時間後に、Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）運動評価スケール（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，１９９５，１２，１−２１）を用いて、ラットまたはマウスの行動機能を評価した。
【００４１】
（統計解析）
統計解析はＳｔａｔｖｉｅｗ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ（ＳＡＳ社製）を用いて実施し、統計的差分は対応のないｔ−検定により評価した。
【００４２】
［結果］
１）ラットの脊髄損傷後、ＨＧＦおよびｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡは特徴的な経時的変化を示した。
脊髄損傷におけるＨＧＦの役割を調べるために、ＨＧＦおよびｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターのｍＲＮＡが脊髄損傷後に調節されているかどうかを定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて検討した。すなわち、成体雌性ラットを麻酔し、“材料および方法”の項で述べた方法により、定量的脊髄圧挫損傷をＴ１０レベルで作成した。擬似手術ラットをコントロールとした。脊髄損傷から一定時間後に、３つの４ｍｍ胸部脊椎断片（吻側、中央、尾側）を切除し、全ＲＮＡを精製し、ｍＲＮＡ分析した。リアルタイムＰＣＲの結果、脊髄損傷から１日および２日後に、吻側断片において、ｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡレベルが著しく増大した。その後、脊髄損傷から１週間までｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡレベルは減少したが、コントロールの非障害脊髄のそれよりも高いレベルで維持された。ｃ−ＭｅｔのｍＲＮＡは脊髄損傷から２および３週間後に再び上昇し、そのレベルはコントロールの非障害脊髄に較べて３倍になった（図２Ａ）。他方、ＨＧＦのｍＲＮＡレベルは脊髄の中央断片において、緩やかに上昇した。ＨＧＦのｍＲＮＡレベルは脊髄損傷後1〜２週間で特に高い値であった。吻側および尾側の脊髄断片において、ＨＧＦ ｍＲＮＡレベルは障害後わずかに上昇しただけであった（図２Ｂ）。これらの知見は、脊髄損傷後の脊髄におけるＨＧＦおよびｃ−Ｍｅｔの誘導を明らかに示しており、かつ障害由来栄養因子としての機能を果たしている可能性を高めている。しかしながら、ｃ−Ｍｅｔの高度の誘導とは対照的に、障害から１〜３日後の初期時点での著しいＨＧＦ誘導の欠如は、脊髄損傷後の初期の時点においてＨＧＦが不十分なレベルで存在することを示唆しており、注目に値する。
【００４３】
２）ｃ−Ｍｅｔは、コントロールの非障害脊髄のニューロンで発現し、ラットで脊髄損傷から1週間後に反応性星状細胞において誘導される。
ｃ−ＭｅｔおよびＮｅｕＮ（ニューロンマーカー）または星状細胞マーカーのいずれかとを二重免疫染色することにより、脊髄損傷後にどのタイプの細胞がＨＧＦ機能にかかわっているかを調べた。蛍光免疫染色により、ｃ−Ｍｅｔ免疫反応性（ｃ−Ｍｅｔ−ＩＲ）が正常な脊髄のＮｅｕＮ−陽性のニューロンに存在していることが明らかになった。免疫反応性は大運動ニューロンにおいてより大きかった。ｃ−Ｍｅｔ−ＩＲはＧＦＡＰ陽性の星状細胞には存在していなかった（図３Ａ）。これとは対照的に、ｃ−Ｍｅｔ−ＩＲは損傷から1週間後に反応性星状細胞において誘導された（図３Ｂ）。この知見は、ＡＬＳから入手したマウスモデルの反応性星状細胞におけるｃ−Ｍｅｔの誘導（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００２，２２，６５３７−６５４８）と一致しており、脊髄ニューロンおよび反応性星状細胞における脊髄損傷後のＨＧＦに対する役割を示唆している。
【００４４】
３）ＨＧＦのニューロン特異的なトランスジェニック過剰発現が脊髄組織像と運動機能障害を改善する。
脊髄損傷後の脊髄ニューロンにおけるＨＧＦの役割を直接評価するために、本発明者らはニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）遺伝子プロモーターのコントロール下にあるＨＧＦを過剰発現しているトランスジェニックマウス（ＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇマウス）を利用した。ここで、誘導されたＨＧＦの発現は、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２００２，２２，６５３７−６５４８に記載されているように、生後ニューロンに特異的に局在していた。１Ｈインパクターを用いて、ＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇマウスおよびその野生型同腹子のＴ１０レベルで、６０ｋＤｙｎｅ脊髄打撲障害を作成し、ＨＥ染色した軸断片および矢状断片において組織学的差異を解析した。
【００４５】
野生型同腹子の脊髄のＨＥ染色した軸方向像において、脊髄構造が大きく破壊されていた。すなわち、多量の神経細胞死および炎症細胞浸潤がはっきりと見られた。加えて、脊髄損傷後、脊髄にいくつかの空洞が形成された（図４、上部パネル）。野生型同腹子の矢状方向像において、脊髄の広範囲にわたる神経細胞死に加えて、軸索変性が長い範囲ではっきりと見られた。野性型同腹子とは対照的に、ＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇマウスの軸方向像および矢状方向像のいずれにおいても、より少ない神経細胞死とより少ない軸索変性が見られた（図４）。ＢＢＢスケールにより後肢運動機能解析から、脊髄損傷7日後から良好な機能回復が観察され、スコアは、その後、脊髄損傷４２日後までさらに増加した（図５）。これらの知見は、ニューロン特異的なＨＧＦの過剰発現は脊髄ニューロンにおける神経細胞変性および軸索変性を改善すること、およびＨＧＦが脊髄の再生にとってより良好な環境を生じていることを明確に立証している。
【００４６】
４）複製能力のないＨＳＶ１由来ベクターを用いるＨＧＦの遺伝子導入は脊髄ニューロンおよびその軸索の変性を改善し、ラットの脊髄損傷モデルにおいて運動機能の回復を促進する。
トランスジェニックにおけるＨＧＦ過剰発現は人為的なアプローチであり、ヒトの患者に適用することは難しい。このため、本発明者らは次に、複製能力のないヘルペス単純ウイルス−１由来ベクター（ＨＳＶ）を用いるＨＧＦの遺伝子導入が、ＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇマウスの結果を再現できるかどうかという問題に取り組んだ。ヘルペス単純ウイルス タイプ−１は向神経性の二重鎖ＤＮＡウイルスであり、大きな遺伝子を組み込む能力を有している。そのため、本発明者らは、必須の前初期遺伝子ＩＣＰ２７およびＩＣＰ４の欠損による複製能力のないＨＳＶを用いた。これはニューロン特異的でかつＨＳＶの複製能を欠失させたものである（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００１，７５（９），４３４３−４３５６）。複製能力のないＨＳＶを用いた理由は、ニューロンを効率的に形質転換することが示されており、かつ筋萎縮性側索硬化症のトランスジェニックマウスモデルにおいて安全にかつ非毒性的にニューロンへ遺伝子導入して持続的な発現を行うためにＨＳＶベクターを用いる可能性が示されていたためである。ＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９−ＨＧＦウイルス由来ベクター（ＨＳＶ−ＨＧＦ）は、“材料および方法”の項で記載した方法で調製した。また、ＨＳＶ１７６４／−４／ｐＲ１９−ＬａｃＺウイルス由来ベクター（ＨＳＶ−ＬａｃＺ）はコントロールとして用いた。
【００４７】
本発明者らは、まず、ミニポンプを組み込んだ定位固定インジェクターを用いてラットのＴ１０脊髄にＨＳＶ−ＬａｃＺを直接接種することにより脊髄ニューロンにＬａｃＺを効率的に導入できるかどうかを確認した。図６に示されているように、β−ｇａｌ（β−ガラクトシダーゼ）染色により、多数の緑色β−ｇａｌ染色されたＬａｃＺ発現ニューロンが、注入３日後に、脊髄にはっきりと認められ、これによりＨＳＶを脊髄ニューロンへ首尾よく導入できることが立証された。
【００４８】
本発明者らは、次に、ＨＳＶ−ＨＧＦの脊髄ニューロンへの直接接種がＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇで示された向神経性活性を再現でき、ラットにおける脊髄損傷後の自発運動機能の結果に影響を与えるかどうかを検討した。脊髄損傷３日前に、成体雌性ＳＤラットにＨＳＶ−ＨＧＦまたはＨＳＶ−ＬａｃＺを前注入することにより、脊髄損傷後早い時点で、脊髄ニューロンにＨＧＦまたはＬａｃＺを発現させた。その理由は、ｈｇｆレベルが、脊髄で高度に誘導されたｃ−ｍｅｔレベルと較べて、損傷後早い時点、すなわち１〜７日目には、相対的に低かったからである（図２）。ＨＳＶ−ＨＧＦ注入ラットおよびＨＳＶ−ＬａｃＺ注入ラットに、１Ｈインパクターを用いて、“材料および方法”の項で述べた方法で、２００ｋＤｙｎｅ量の脊髄打撲障害を生じさせた。脊髄のＨＥ染色断片から、ＨＳＶ−ＨＧＦ注入群はＨＳＶ−ＬａｃＺ注入群に較べて、脊髄損傷後に補修した組織の比率が大きく、また神経細胞死およびその軸索変性が少なかったことが分かった（図７）。さらに、ＢＢＢスコアから、ＨＳＶ−ＨＧＦ注入群はＨＳＶ−ＬａｃＺ注入群に較べて、顕著に良好な運動能力を示したことが分かった（図８）。このことから、脊髄にラットＨＧＦをＨＳＶ介在遺伝子で導入することが神経細胞保護および脊髄障害のラットモデルにおいて運動機能の回復に有益であることが分かる。
【００４９】
なお、上記実施例はＨＧＦ遺伝子を導入したものであるが、ＨＧＦ遺伝子の代わりに５残基欠失型リコンビナントヒトＨＧＦ蛋白質（配列番号２）を髄腔内注射（投与量：２００μｇ／月）する以外は、上記と同様の実験を行うことにより、ＨＧＦ蛋白質が脊髄損傷治療剤となることが確認できる。
【産業上の利用可能性】
【００５０】
本発明により、脊髄損傷の治療に有用な薬剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は脊髄損傷のラットモデルを模式的に示した図である。 成体雌性ラットを深く麻酔し、脊髄のＴ１０レベルでＩＨインパクターを用いて、２００ｋＤｙｎｅの定量的脊髄圧挫損傷を作成した。４ｍｍの断片（吻側、中央、尾側）を切除した。この断片は免疫染色に用いると共に、ＳＣＩから一定時間後にＨＧＦおよびｃ−Ｍｅｔの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行うために用いた。
【図２】ラットの脊髄損傷後の脊髄におけるｃ−ＭｅｔおよびＨＧＦのｍＲＮＡの発現変化を示す線図である。 全ＲＮＡをＳＣＩから一定時間後に脊髄の各断片（吻側、中央、尾側）から精製し、ｃ−ｍｅｔ（Ａ）およびｈｇｆ（Ｂ）の定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを“材料および方法”の項で記載した方法で実施した。ＧＡＰＤＨをコントロールとして使用した。
【図３】正常な脊髄ニューロンにおいて発現されるｃ−Ｍｅｔと、反応性星状細胞においてラット脊髄損傷1週間後に誘導されるｃ−Ｍｅｔを示す写真である。 定量的脊髄圧挫損傷（２００ｋＤｙｎｅ）を“材料および方法”の項で記載した方法で成体雌性ＳＤラットの脊髄のＴ１０レベルで作成した。ニューロンマーカーＮｅｕＮと星状細胞マーカーＧＦＡＰを用いるｃ−Ｍｅｔの二重標識免疫染色を正常コントロールラットとＳＣＩラットで実施した。（Ａ）：コントロールラットの脊髄、（Ｂ）：ＳＣＩから1週間後の障害ラットの脊髄
【図４】ＮＳＥ−ＨＧＦマウスと野生型同腹子との、脊髄損傷後に補修した組織を示す写真である。 定量的脊髄圧挫損傷（２００ｋＤｙｎｅ）を“材料および方法”の項で記載した方法でＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇおよび野生型同腹子の脊髄のＴ１０レベルで作成し、ＨＥ染色した軸索断片および矢状断片を作成した。Ｗｔ：野生型同腹子、ＮＳＥ−ＨＧＦ：ＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇ
【図５】ＮＳＥ−ＨＧＦトランスジェニックマウスと野生型同腹子との、脊髄損傷後のＢＢＢスコアを示す線図である。 定量的脊髄圧挫損傷（２００ｋＤｙｎｅ）を“材料および方法”の項で記載した方法でＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇおよび野生型同腹子の脊髄のＴ１０レベルで作成し、後肢運動機能を所定時間にＢＢＢスコアで分析した。Ｗｔ：野生型同腹子、ＮＳＥ−ＨＧＦ：ＮＳＥ−ＨＧＦ−Ｔｇ
【図６】複製能力のないＨＳＶ−ＬａｃＺを脊髄に注入し、その３日後にβ−ｇａｌ染色した矢状断片の写真である。 ＨＳＶ−ＬａｃＺ（１．５×１０９ｐｆｕ／ｍｌ）５μｌを、深麻酔下に、成体ラットの脊髄（Ｔ１０レベル）に、ミニポンプを用いて定位固定的に注入した。注入３日後、ラットをＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで灌流し、ＰＢＳ中の２０％シュクロース溶液でクレオプロテクションし、冷凍断片を作成した。ついで、ＨＳＶ−ＬａｃＺベクターに起因するβ−ガラクトシダーゼ発現をβ−ｇａｌ染色した。
【図７】脊髄損傷３日前に投与したＨＳＶ−ＨＧＦ注入群とＨＳＶ−ＬａｃＺ注入群のＨＥ染色した軸索断片と矢状断片を示す写真である。 ＨＳＶ−ＨＧＦ注入またはＨＳＶ−ＬａｃＺ注入３日後に、定量的脊髄圧挫損傷（２００ｋＤｙｎｅ）を“材料および方法”の項で記載した方法で、成体雌性ＳＤラットの脊髄のＴ１０レベルで作成し、ＳＣＩから１週間後に、ＨＥ染色した軸索断片および矢状断片を作成した。ＨＳＶ−Ｌａｃ：ＳＣＩの３日前にＨＳＶ−Ｌａｃを前注射した脊髄、ＨＳＶ−ＨＧＦ：ＳＣＩ３日前にＨＳＶ−ＨＧＦを前注射した脊髄。
【図８】ＨＳＶ−ＨＧＦ注入群とＨＳＶ−ＬａｃＺ注入群におけるＢＢＢスコアを示す線図である。 ＨＳＶ−ＨＧＦまたはＨＳＶ−ＬａｃＺをＳＣＩの３日前に前注射した成体雌性ＳＤラットの脊髄のＴ１０レベルで、定量的脊髄圧挫損傷（２００ｋＤｙｎｅ）を“材料および方法”の項で記載した方法で作成し、ＳＣＩから一定時間後に後肢運動機能をＢＢＢスコアにより分析した。ＬａｃＺ：ＨＳＶ−ＬａｃＺ前注射群、ＨＧＦ：ＨＳＶ−ＨＧＦ前注射群。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＧＦ蛋白質またはそれをコードするＤＮＡを有効成分とする脊髄損傷治療剤。
【請求項２】
有効成分がＨＧＦ蛋白質である請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
有効成分がＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡである請求項１記載の治療剤。
【請求項４】
ＨＧＦ蛋白質が、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であってＨＧＦとして作用する蛋白質、又はこれらの部分ペプチドであってＨＧＦとして作用するペプチドである請求項２記載の治療剤。
【請求項５】
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡが、配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦとして作用する蛋白質をコードするＤＮＡである請求項３記載の治療剤。
【請求項６】
脊髄損傷部位に局所適用するための請求項１〜５のいずれかに記載の治療剤。
【請求項７】
髄腔内投与用注射剤の剤型である請求項６記載の治療剤。
【請求項１】
ＨＧＦ蛋白質またはそれをコードするＤＮＡを有効成分とする脊髄損傷治療剤。
【請求項２】
有効成分がＨＧＦ蛋白質である請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
有効成分がＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡである請求項１記載の治療剤。
【請求項４】
ＨＧＦ蛋白質が、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であってＨＧＦとして作用する蛋白質、又はこれらの部分ペプチドであってＨＧＦとして作用するペプチドである請求項２記載の治療剤。
【請求項５】
ＨＧＦ蛋白質をコードするＤＮＡが、配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡ、あるいは配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦとして作用する蛋白質をコードするＤＮＡである請求項３記載の治療剤。
【請求項６】
脊髄損傷部位に局所適用するための請求項１〜５のいずれかに記載の治療剤。
【請求項７】
髄腔内投与用注射剤の剤型である請求項６記載の治療剤。
【図２】
【図５】
【図８】
【図１】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【図５】
【図８】
【図１】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００７−７７１２５（Ｐ２００７−７７１２５Ａ）
【公開日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２７０９１５（Ｐ２００５−２７０９１５）
【出願日】平成１７年９月１６日（２００５．９．１６）
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【出願人】（５０２０６８９０８）クリングルファーマ株式会社 (16)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月２９日（２００７．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年９月１６日（２００５．９．１６）
【出願人】（８９９００００７９）学校法人慶應義塾 (742)
【出願人】（５０２０６８９０８）クリングルファーマ株式会社 (16)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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