脳疾患を治療するための抗タウｐＳ４２２抗体の使用
配列番号９で表されるリン酸化タウ断片及びタウpS422には特異的に結合するがタウ及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片には結合しないことを特徴とする、セリン４２２がリン酸化されているタウ（pS422）に結合する抗体は、タウオパシーの治療において有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳疾患を治療するための、配列番号９で表されるリン酸化タウ断片（pS422）に特異的に結合する抗体の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ヒトタウ（微小管結合タンパク質タウ（神経原線維変化タンパク質、対らせん状線維−タウ、ＰＨＦ−タウ）は、軸索で主にみられ、チューブリン重合を促進し、そして微小管を安定させる機能を有するニューロンの微小管結合タンパク質である。ヒト脳では、６つのアイソフォーム（アイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、胎児−タウ）がみられ、最長のアイソフォームは、４４１アミノ酸を含む（アイソフォームＦ、Uniprot P10636-8）。タウ及びその特性については、Reynolds, C.H. et al., J. Neurochem. 69 (1997) 191-198にも記載されている。
【０００３】
過剰リン酸化タウは、アルツハイマー病（ＡＤ）脳における神経原線維病変の構成要素である対らせん状線維（ＰＨＦ）の主成分である。タウは、ＧＳＫ３ベータ、ｃｄｋ５、ＭＡＲＫ及びＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーを含む幾つかの異なるキナーゼによって、そのセリン残基又はトレオニン残基がリン酸化され得る。
【０００４】
タウオパシーは、タウの異常な過剰リン酸化を特徴とし、Iqbal, K. et al. (Biochimica et Biophysica Acta (BBA) 1739 (2005) 198-210)によれば以下：
・神経原線維型を含むアルツハイマー病
・ダウン症候群、成人症例
・グアムパーキンソン認知症複合
・ボクサー認知症
・ピック病
・嗜銀顆粒性認知症
・前頭側頭型認知症
・皮質基底核変性症
・淡蒼球−橋−黒質変性（Pallido-ponto-nigral degeneration）
・進行性核上性麻痺
・神経原線維変化を伴うゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病
のものである。
【０００５】
これまでに、アルツハイマー病脳のタウにおいて約４０個のセリン（Ｓ）／スレオニン（Ｔ）リン酸化部位が見出されている（Hanger, D.P. et al., J. Biol. Chem 282 (2007) 23645-23654）。アルツハイマー病におけるタウ病変の発現は、そのリン酸化状態に関係する。しかし、４０個のリン酸化部位のうちのほとんどは、健常な胎児脳組織から抽出されたタウでもみられるので、疾患の病態には関係していない。ほんの少数のリン酸化が病状に特有であり、アルツハイマー病脳のＰＨＦにおけるタウを定義付ける異常で特徴的な不溶性及び凝集に関与していると推測される（Morishima-Kawashima, M. et al., J. Biol. Chem 270 (1995) 823-829）。Pei, J.J. et al., Journal of Alzheimer's Disease 14 (2008) 385-392によれば、既存文献は、これら部位のうちのどの部位がＡＤ脳に特異的であるかに関して、限定された不明瞭な情報しか提供していない。Peiは、タウに対するリン酸化部位特異的抗体のリストを使用し、２２個のＡＤ及び１０個の対照の内側側頭葉のホモジネートにおいてそれらの量を測定した。
【０００６】
Bussiere, T. et al. (Acta Neuropathol. 97 (1999) 221-230)には、タウタンパク質におけるリン酸化セリン４２２が神経原線維変性を伴う幾つかの疾患でみられる病理学的エピトープであると記載されている。Augustinack, J.C. et al., (Acta Neuropathol 103 (2002) 26-35)には、pS422がアルツハイマー病における神経病変の重篤度と相関していると記載されている。Guillozet-Bongaarts, A. (J. Neurochem 97 (2006) 1005-1014)には、S422におけるタウのリン酸化がＰＨＦの成熟過程の一部であると記載されている。また、タウpS422は、アルツハイマー病の様々なトランスジェニックマウスモデルにおける病変の発現と関連していることが見出されている。したがって、Deters, N.らは、Biochem. Biophys. Res. Commun. 379 (2009) 400-405にて、ダブルトランスジェニックDom5/pR5マウスにおいて病理学的S422エピトープが特異的にリン酸化されているタウを含む海馬ニューロン数が７倍増加したと述べている。Goetz, J. et al. (Science 293 (2001) 1491-1495)は、Abeta42原線維を注射されたタウP301Lトランスジェニックマウスの脳において、S422がリン酸化されているタウが出現したことを報告した。
【０００７】
EP 2 009 104は、アルツハイマー病ＰＨＦのタウタンパク質のリン酸化状態で生じるタウタンパク質のエピトープ、及びアルツハイマータウタンパク質を特異的に検出する抗体を産生するための前記エピトープの使用に関する。WO 2002/062851及びUS 7,446,180は、異常に切断された形態のタウタンパク質に対して特異性を有する抗体、並びにアルツハイマー病及び関連するタウオパシーに関する診断的局面及び治療的局面に関する。
【０００８】
WO 98/22120は、リン酸化タウ断片のアミノ酸約２０７〜約２２２、アミノ酸約２２４〜約２４０、及びアミノ酸約３９０〜約４０８に対する抗体を患者に投与する工程を含むアルツハイマー病患者を治療する方法に関する。Asuni, A.A. et al., J. Neuroscience 27 (2007) 9115-9129には、リン酸化タウ断片３７９〜４０８［P-Ser396,404］を用いてタウトランスジェニックマウスにワクチン接種する動物実験にについて述べられている。US 2008/0050383は、タウタンパク質断片を投与することにより被験体のアルツハイマー病又は他のタウオパシーを治療及び予防する方法に関する。
【０００９】
例えば、EP 1 876 185には、タウpS422に対するモノクローナル抗体が記載されている。タウpS422に対するポリクローナル抗体は市販されている（例えば、ProSci Inc.及びBiosource International）。
【００１０】
発明の概要
本発明は、タウオパシーの治療で使用するための、リン酸化タウ断片Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp（配列番号９）及びタウpS422には特異的に結合するが、タウ及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片には結合しないことを特徴とする、セリン４２２がリン酸化されているタウ（タウpS422）に結合する抗体、並びにこのような治療方法を含む。
【００１１】
本発明は、タウオパシーを治療する医薬を製造するための、配列番号９で表されるリン酸化タウ断片及びタウpS422には特異的に結合するが、タウ及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片には結合しないことを特徴とする、セリン４２２がリン酸化されているタウ（タウpS422）に結合する抗体、並びにこのような製造方法を含む。
【００１２】
本発明は、Mab2.10.3（抗タウpS422抗体）が結合するのと同じエピトープに特異的に結合することを特徴とする、リン酸化タウに結合する抗体を含む。
【００１３】
本発明は、タウオパシーの治療で使用するための、又はタウオパシーを治療する医薬の製造を製造するための、Mab2.10.3（抗タウpS422抗体）が結合するのと同じエピトープに特異的に結合することを特徴とする、リン酸化タウに結合する抗体の使用を含む。
【００１４】
本発明に係る抗体は、タウpS422及び凝集した（原線維状）リン酸化タウに特異的に結合する。本発明に係る抗体は、非リン酸化タウ、配列番号１０で表される非リン酸化タウ断片、及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片には結合しない。
【００１５】
本発明に係る抗体は、好ましくはヒトIgG1サブタイプである。本発明の更なる態様では、本発明に係る抗体は、好ましくはヒトIgG4サブタイプである。
【００１６】
本発明は、以下：
ａ）配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、及び配列番号８で表されるCDR3H、
ｂ）配列番号２３で表されるCDR1H、配列番号２４で表されるCDR2H、及び配列番号２５で表されるCDR3H、
ｃ）配列番号３１で表されるCDR1H、配列番号３２で表されるCDR2H、及び配列番号３３で表されるCDR3H、
ｄ）配列番号３９で表されるCDR1H、配列番号４０で表されるCDR2H、及び配列番号４１で表されるCDR3H、
ｅ）配列番号４７で表されるCDR1H、配列番号４８で表されるCDR2H、及び配列番号４９で表されるCDR3H、
ｆ）配列番号５５で表されるCDR1H、配列番号５６で表されるCDR2H、及び配列番号５７で表されるCDR3H、又は
ｇ）配列番号６３で表されるCDR1H、配列番号６４で表されるCDR2H、及び配列番号６５CDR3H
を含むことを特徴とする抗タウpS422抗体を含む。
【００１７】
好ましくは、前記抗体は、以下：
ａ）配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、配列番号８で表されるCDR3H、及び配列番号３で表されるCDR1L、配列番号４で表されるCDR2L、配列番号５で表されるCDR3L、
ｂ）配列番号２３で表されるCDR1H、配列番号２４で表されるCDR2H、配列番号２５で表されるCDR3H、及び配列番号２７で表されるCDR1L、配列番号２８で表されるCDR2L、配列番号２９で表されるCDR3L、
ｃ）配列番号３１で表されるCDR1H、配列番号３２で表されるCDR2H、配列番号３３で表されるCDR3H、及び配列番号３５で表されるCDR1L、配列番号３６で表されるCDR2L、配列番号３７で表されるCDR3L、
ｄ）配列番号３９で表されるCDR1H、配列番号４０で表されるCDR2H、配列番号４１で表されるCDR3H、及び配列番号４３で表されるCDR1L、配列番号４４で表されるCDR2L、配列番号４５で表されるCDR3L、
ｅ）配列番号４７で表されるCDR1H、配列番号４８で表されるCDR2H、配列番号４９で表されるCDR3H、及び配列番号５１で表されるCDR1L、配列番号５２で表されるCDR2L、配列番号５３で表されるCDR3L、
ｆ）配列番号５５で表されるCDR1H、配列番号５６で表されるCDR2H、配列番号５７で表されるCDR3H、及び配列番号５９で表されるCDR1L、配列番号６０で表されるCDR2L、配列番号６１で表されるCDR3L、
ｇ）配列番号６３で表されるCDR1H、配列番号６４で表されるCDR2H、配列番号６５で表されるCDR3H、及び配列番号６７で表されるCDR1L、配列番号６８で表されるCDR2L、配列番号６９で表されるCDR3L
を含むことを特徴とする。
【００１８】
好ましくは、前記抗体は、以下：
ａ）配列番号１で表される可変軽鎖及び配列番号２で表される可変重鎖、
ｂ）配列番号２６で表される可変軽鎖及び配列番号２２で表される可変重鎖、
ｃ）配列番号３４で表される可変軽鎖及び配列番号３０で表される可変重鎖、
ｄ）配列番号４２で表される可変軽鎖及び配列番号３８で表される可変重鎖、
ｅ）配列番号５０で表される可変軽鎖及び配列番号４６で表される可変重鎖、
ｆ）配列番号５８で表される可変軽鎖及び配列番号５４で表される可変重鎖、又は
ｇ）配列番号６６で表される可変軽鎖及び配列番号６２で表される可変重鎖
を含むことを特徴とする。
【００１９】
本発明は、抗タウpS422抗体Mab2.10.3のヒト化変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab2.10.3のキメラ変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab2.10.3のＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。Mab2.10.3は、その可変鎖が配列番号１及び配列番号２で表されることを特徴とする。
【００２０】
本発明は、抗タウpS422抗体Mab005のヒト化変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab005のキメラ変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab005のＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。Mab005は、その可変鎖が配列番号２６及び配列番号２２で表されることを特徴とする。
【００２１】
本発明は、抗タウpS422抗体Mab019のヒト化変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab019のキメラ変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab019のＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。Mab019は、その可変鎖が配列番号３４及び配列番号３０で表されることを特徴とする。
【００２２】
本発明は、抗タウpS422抗体Mab020のヒト化変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab020のキメラ変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab020のＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。Mab020は、その可変鎖が配列番号４２及び配列番号３８で表されることを特徴とする。
【００２３】
本発明は、抗タウpS422抗体Mab085のヒト化変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab085のキメラ変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab085のＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。Mab085は、その可変鎖が配列番号５０及び配列番号４６で表されることを特徴とする。
【００２４】
本発明は、抗タウpS422抗体Mab086のヒト化変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab086のキメラ変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab086のＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。Mab086は、その可変鎖が配列番号５８及び配列番号５４で表されることを特徴とする。
【００２５】
本発明は、抗タウpS422抗体Mab097のヒト化変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab097のキメラ変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab097のＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。Mab097は、その可変鎖が配列番号６６及び配列番号６２で表されることを特徴とする。
【００２６】
本発明は、配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、配列番号８で表されるCDR3H、及び配列番号３で表されるCDR1L、配列番号４で表されるCDR2L、配列番号５で表されるCDR3L、又は配列番号１で表される可変軽鎖及び配列番号２で表される可変重鎖を含む抗タウpS422抗体のキメラ変異体、ヒト化変異体、又はＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。
【００２７】
本発明は、配列番号２３で表されるCDR1H、配列番号２４で表されるCDR2H、配列番号２５で表されるCDR3H、及び配列番号２７で表されるCDR1L、配列番号２８で表されるCDR2L、配列番号２９で表されるCDR3L、又は配列番号２６で表される可変軽鎖及び配列番号２２で表される可変重鎖を含む抗タウpS422抗体のキメラ変異体、ヒト化変異体、又はＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。
【００２８】
本発明は、配列番号３１で表されるCDR1H、配列番号３２で表されるCDR2H、配列番号３３で表されるCDR3H、及び配列番号３５で表されるCDR1L、配列番号３６で表されるCDR2L、配列番号３７で表されるCDR3L、又は配列番号３４で表される可変軽鎖及び配列番号３０で表される可変重鎖を含む抗タウpS422抗体のキメラ変異体、ヒト化変異体、又はＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。
【００２９】
本発明は、配列番号３９で表されるCDR1H、配列番号４０で表されるCDR2H、配列番号４１で表されるCDR3H、及び配列番号４３で表されるCDR1L、配列番号４４で表されるCDR2L、配列番号４５で表されるCDR3L、又は配列番号４２で表される可変軽鎖及び配列番号３８で表される可変重鎖を含む抗タウpS422抗体のキメラ変異体、ヒト化変異体、又はＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。
【００３０】
本発明は、配列番号４７で表されるCDR1H、配列番号４８で表されるCDR2H、配列番号４９で表されるCDR3H、及び配列番号５１で表されるCDR1L、配列番号５２で表されるCDR2L、配列番号５３で表されるCDR3L、又は配列番号５０で表される可変軽鎖及び配列番号４６で表される可変重鎖を含む抗タウpS422抗体のキメラ変異体、ヒト化変異体、又はＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。
【００３１】
本発明は、配列番号５５で表されるCDR1H、配列番号５６で表されるCDR2H、配列番号５７で表されるCDR3H、及び配列番号５９で表されるCDR1L、配列番号６０で表されるCDR2L、配列番号６１で表されるCDR3L、又は配列番号５８で表される可変軽鎖及び配列番号５４で表される可変重鎖を含む抗タウpS422抗体のキメラ変異体、ヒト化変異体、又はＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。
【００３２】
本発明は、配列番号６３で表されるCDR1H、配列番号６４で表されるCDR2H、配列番号６５で表されるCDR3H、及び配列番号６７で表されるCDR1L、配列番号６８で表されるCDR2L、配列番号６９で表されるCDR3L、又は配列番号６６で表される可変軽鎖及び配列番号６２で表される可変重鎖を含む抗タウpS422抗体のキメラ変異体、ヒト化変異体、又はＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。
【００３３】
本発明は、配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、配列番号８で表されるCDR3H、及び配列番号３で表されるCDR1L、配列番号４で表されるCDR2L、配列番号５で表されるCDR3L、又は配列番号１で表される可変軽鎖及び配列番号２で表される可変重鎖を含むことを特徴とする、抗タウpS422抗体をヒト化、又はＴ細胞エピトープ枯渇化、又はキメラ化する方法を含む。
【００３４】
本発明は、配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、配列番号８で表されるCDR3H、及び配列番号３で表されるCDR1L、配列番号４で表されるCDR2L、配列番号５で表されるCDR3L、又は配列番号１で表される可変軽鎖及び配列番号２で表される可変重鎖を含むことを特徴とする、抗タウpS422抗体をヒト化、又はＴ細胞エピトープ枯渇化、又はキメラ化する方法を含む。
【００３５】
本発明は、配列番号２３で表されるCDR1H、配列番号２４で表されるCDR2H、配列番号２５で表されるCDR3H、及び配列番号２７で表されるCDR1L、配列番号２８で表されるCDR2L、配列番号２９で表されるCDR3L、又は配列番号２６で表される可変軽鎖及び配列番号２２で表される可変重鎖を含むことを特徴とする、抗タウpS422抗体をヒト化、又はＴ細胞エピトープ枯渇化、又はキメラ化する方法を含む。
【００３６】
本発明は、配列番号３１で表されるCDR1H、配列番号３２で表されるCDR2H、配列番号３３で表されるCDR3H、及び配列番号３５で表されるCDR1L、配列番号３６で表されるCDR2L、配列番号３７で表されるCDR3L、又は配列番号３４で表される可変軽鎖及び配列番号３０で表される可変重鎖を含むことを特徴とする、抗タウpS422抗体をヒト化、又はＴ細胞エピトープ枯渇化、又はキメラ化する方法を含む。
【００３７】
本発明は、配列番号３９で表されるCDR1H、配列番号４０で表されるCDR2H、配列番号４１で表されるCDR3H、及び配列番号４３で表されるCDR1L、配列番号４４で表されるCDR2L、配列番号４５で表されるCDR3L、又は配列番号４２で表される可変軽鎖及び配列番号３８で表される可変重鎖を含むことを特徴とする、抗タウpS422抗体をヒト化、又はＴ細胞エピトープ枯渇化、又はキメラ化する方法を含む。
【００３８】
本発明は、配列番号４７で表されるCDR1H、配列番号４８で表されるCDR2H、配列番号４９で表されるCDR3H、及び配列番号５１で表されるCDR1L、配列番号５２で表されるCDR2L、配列番号５３で表されるCDR3L、又は配列番号５０で表される可変軽鎖及び配列番号４６で表される可変重鎖を含むことを特徴とする、抗タウpS422抗体をヒト化、又はＴ細胞エピトープ枯渇化、又はキメラ化する方法を含む。
【００３９】
本発明は、配列番号５５で表されるCDR1H、配列番号５６で表されるCDR2H、配列番号５７で表されるCDR3H、及び配列番号５９で表されるCDR1L、配列番号６０で表されるCDR2L、配列番号６１で表されるCDR3L、又は配列番号５８で表される可変軽鎖及び配列番号５４で表される可変重鎖を含むことを特徴とする、抗タウpS422抗体をヒト化、又はＴ細胞エピトープ枯渇化、又はキメラ化する方法を含む。
【００４０】
本発明は、配列番号６３で表されるCDR1H、配列番号６４で表されるCDR2H、配列番号６５で表されるCDR3H、及び配列番号６７で表されるCDR1L、配列番号６８で表されるCDR2L、配列番号６９で表されるCDR3L、又は配列番号６６で表される可変軽鎖及び配列番号６２で表される可変重鎖を含むことを特徴とする、抗タウpS422抗体をヒト化、又はＴ細胞エピトープ枯渇化、又はキメラ化する方法を含む。
【００４１】
好ましくは、タウpS422に結合し、そして、上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする抗体は、ヒトIgG1サブタイプである。好ましくは、タウpS422に結合し、そして、上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする抗体は、ヒトIgG4サブタイプである。
【００４２】
本発明の更なる態様は、本発明に係る抗体を含む医薬組成物である。
【００４３】
本発明の更なる態様は、医薬組成物を製造するための本発明に係る抗体の使用である。
【００４４】
本発明の更なる態様は、神経原線維型を含むアルツハイマー病（ＡＤ）、ダウン症候群（成人症例）、グアムパーキンソン認知症複合、ボクサー認知症、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、前頭側頭型認知症、皮質基底核変性症、淡蒼球−橋−黒質変性、進行性核上性麻痺、及び神経原線維変化を伴うゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病からなる群より選択されるタウオパシーを治療するための、本発明に係る抗体の使用である。
【００４５】
本発明の更なる態様は、本発明に係る抗体を含む医薬組成物を製造するための方法である。
【００４６】
本発明の更なる態様は、本発明に係る抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸である。
【００４７】
本発明は、更に、原核生物又は真核生物のホスト細胞において本発明に係る核酸を発現することができる前記核酸を含む発現ベクター、及びこのような抗体の組換え体を産生するためにこのようなベクターを含むホスト細胞を提供する。
【００４８】
本発明は、更に、本発明に係るベクターを含む原核生物又は真核生物のホスト細胞を含む。
【００４９】
本発明は、更に、原核生物又は真核生物のホスト細胞において本発明に係る核酸を発現させ、そして、前記細胞又は前記細胞培養上清から前記抗体を回収することを特徴とする、本発明に係る組換え型ヒト抗体又はヒト化抗体を産生する方法を含む。本発明は、更に、このような組み換え法によって入手可能な抗体を含む。
【００５０】
本発明は、本発明に係るモノクローナル抗体を選択する方法であって、タウpS422に結合する多数のモノクローナル抗体を提供し、配列番号９で表されるリン酸化タウ断片、タウ、及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片に対する前記抗体の特異的結合を測定し、そして、前記タウに対する結合と比較して少なくとも１０，０００倍、前記リン酸化タウ断片に対して特異的に結合し、且つ前記リン酸化MCAK断片Ile-Gln-Lys-Gln-Lys-Arg-Arg-Ser(PO3H2)-Val-Asn-Ser-Lys-Ile-Pro-Ala（配列番号１７）に対する結合と比較して少なくとも１００倍、前記リン酸化タウ断片に対して特異的に結合する抗体を選択することを特徴とする方法を含む。
【００５１】
好ましくは、本発明は、本発明に係るモノクローナル抗体を選択する方法であって、タウpS422に結合する多数のモノクローナル抗体を提供し、配列番号９で表されるリン酸化タウ断片、タウpS422、タウ、及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片に対する前記抗体の特異的結合を測定し、そして、前記タウに対する結合と比較して少なくとも１０，０００倍、前記リン酸化タウ断片及び前記タウpS422に対して特異的に結合し、且つ前記リン酸化MCAK断片Ile-Gln-Lys-Gln-Lys-Arg-Arg-Ser(PO3H2)-Val-Asn-Ser-Lys-Ile-Pro-Ala（配列番号１７）に対する結合と比較して少なくとも１００倍、前記リン酸化タウ断片に対して特異的に結合する抗体を選択することを特徴とする方法を含む。
【００５２】
好ましくは、本発明は、本発明に係るモノクローナル抗体を選択する方法であって、タウpS422に結合する多数のモノクローナル抗体を提供し、配列番号９で表されるリン酸化タウ断片、タウpS422、タウ、及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片に対する前記抗体の特異的結合を測定し、そして、前記タウに対する結合と比較して少なくとも１０，０００倍、前記リン酸化タウ断片及び前記タウpS422に対して特異的に結合し、且つ前記リン酸化MCAK断片Ile-Gln-Lys-Gln-Lys-Arg-Arg-Ser(PO3H2)-Val-Asn-Ser-Lys-Ile-Pro-Ala（配列番号１７）に対する結合と比較して少なくとも１００倍、前記リン酸化タウ断片及び前記タウpS422に対して特異的に結合する抗体を選択することを特徴とする方法を含む。
【００５３】
本発明に係る抗体は、タウターゲティング療法を必要としている患者に恩恵をもたらす。本発明に係る抗体は、タウオパシー、特にＡＤに罹患している患者に恩恵をもたらす新規且つ創造的な特性を有する。
【００５４】
本発明は、更に、タウオパシー、特にＡＤに罹患している患者を治療する方法であって、このような疾患に罹患していると診断された患者（したがって、このような療法を必要としている患者）に本発明に係るpS422に結合する抗体を投与することを含む方法を提供する。前記抗体は、好ましくは医薬組成物で投与される。
【００５５】
本発明の更なる態様は、タウオパシー、特にＡＤに罹患している患者を治療する方法であって、前記患者に本発明に係る抗体を投与することを特徴とする方法である。
【００５６】
本発明は、更に、タウオパシー、特にＡＤに罹患している患者を治療するための本発明に係る抗体の使用、及び本発明に係る医薬組成物を製造するための本発明に係る抗体の使用を含む。更に、本発明は、本発明に係る医薬組成物を製造するための方法を含む。
【００５７】
本発明は、更に、本発明に係る抗体と共に、任意で、薬学的目的のために抗体の製剤化にとって有用なバッファ及び／又は佐剤を含む医薬組成物を含む。
【００５８】
本発明は、更に、薬学的に許容しうる担体中に本発明に係る抗体を含む医薬組成物を提供する。１つの態様では、前記医薬組成物は、製品又はキットに含まれていてもよい。
【００５９】
本発明の抗体は、リン酸化タウポリペプチドを検出することによって、アルツハイマー病等の神経障害を診断するために使用することができる。本発明の抗体は、タウpS422又は凝集したリン酸化タウの特異的検出にも使用することができる。
【００６０】
発明の詳細な説明
本発明に係る「タウ」という用語は、４４１アミノ酸を含むヒトタウの最長アイソフォーム（アイソフォームＦ、Uniprot P10636-8）を包含する。
【００６１】
本発明に係る「リン酸化タウ（ｐタウ）」という用語は、キナーゼERK2によるS422のリン酸化によって生成される、４４１アミノ酸を含むヒトタウの最長アイソフォーム（アイソフォームＦ、Uniprot P10636-8）のリン酸化された形態を包含する。
【００６２】
本発明に係る「凝集したリン酸化タウ」又は「凝集した（原線維状）リン酸化タウ」という用語は、キナーゼERK2による凝集したタウのリン酸化によって生成される、４４１アミノ酸を含むヒトタウの最長アイソフォーム（アイソフォームＦ、Uniprot P10636-8）の凝集及びリン酸化された形態を包含する。
【００６３】
本発明に係る「タウ断片」という用語は、タウ断片Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp（配列番号１０）を包含する。
【００６４】
本発明に係る「リン酸化タウ断片」という用語は、リン酸化タウ断片Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp（配列番号９）を包含する。
【００６５】
本発明に係る「MCAK」という用語は、ヒトの有糸分裂セントロメア関連キネシン（キネシン様タンパク質KIF2C、UniProt Q99661）を包含する。MCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]は、セリン９５がリン酸化されたアミノ酸８８〜１０２からなるリン酸化MCAK断片（配列番号１７）である。このリン酸化MCAK断片は、配列番号９で表されるリン酸化タウ断片に対して配列同一性又は類似性を有しない。本発明者らは、リン酸化タウ断片に対する当技術分野の状況に係る抗体が、無関係のリン酸化ヒトペプチド及びタンパク質と顕著な交差反応性を示す場合があることを認識していた。リン酸化MCAK断片に結合しない本発明に係る抗体については、このような望ましくない交差反応性を検出することはできなかった。
【００６６】
電気化学発光を読み取るELISAによって、タウpS422に対する結合及びタウに対する結合を調べる。２μg/mLの濃度でタウ又はタウpS422を固定化し、試験抗体（例えばヒト又はマウス）を添加する。結合した試験抗体を検出するために、それぞれルテニウムタグ付の抗ヒトＩｇＧ又は抗マウスＩｇＧを０．５μg/mLの濃度で添加する。タウpS422及びタウを使用した検出シグナルの関係が、タウpS422の最大結合シグナルにおいて少なくとも１０，０００倍である場合、タウpS422に対して特異的に結合すると考えられる。
【００６７】
配列番号９で表されるリン酸化タウ断片に対する結合、配列番号１０で表される非リン酸化タウ断片に対する結合、及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片に対する結合をELISAによって調べる。前記固定化されたリン酸化タウ断片、及び比較のために前記固定化された非リン酸化タウ断片又はMCAK断片と共に試験抗体をインキュベートする。抗体を標識し、前記標識を検出する。リン酸化タウ断片及び非リン酸化タウ断片を使用した検出シグナルの関係が、リン酸化タウ断片の最大結合シグナルにおいて少なくとも１００である場合、そして、リン酸化タウ断片及びリン酸化MCAK断片を使用した検出シグナルの関係が、リン酸化タウ断片の最大結合シグナルにおいても少なくとも１００である場合、リン酸化タウ断片に対する特異的結合が見出される。
【００６８】
「Mab2.10.3のエピトープ」という用語は、Mab2.10.3によって特異的に認識される、リン酸化タウ断片Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp（配列番号９）内に位置するエピトープを包含する。本発明に係るタウ抗体の前記エピトープ結合特性は、Mab2.10.3がｐタウに対する試験抗体の結合を立体的に妨害する能力を測定するためのBiacore（商標）インビトロクロスブロッキング結合アッセイ等のインビトロクロスブロッキング結合アッセイによって判定される。このようなアッセイでは、Mab2.10.3をBiacoreセンサの一次抗体として捕捉し、次いで、ｐタウ及び試験する二次抗体を順次注入する。前記二次抗体が任意の検出可能な結合シグナルを示さない場合、前記二次抗体はMab2.10.3と同じエピトープに結合する。
【００６９】
本発明に係る抗体は、上記Biacore（商標）分析によって測定されるとき、５×１０−８Ｍ−１〜１０−１２Ｍ−１の親和性でタウpS422に結合する。
【００７０】
タウpS422の原線維状凝集体に対する結合をBiacore分析によって調べる。このアッセイでは、凝集したタウpS422を固定化し、そして、希釈係数２を用いて最高濃度２００nMの様々な濃度の試験抗体を添加した。本発明に係る抗体は、０．１〜３０のＫｄで、好ましくは１０〜２０nMのＫｄで原線維状タウpS422に結合する。
【００７１】
用語「モノクローナル抗体又は抗体」という用語は、様々な形態の抗体を包含し、好ましくはモノクローナル抗体であり、特に好ましくはIgG1又はIgG4モノクローナル抗体である。本発明に係る抗体は、好ましくは、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は本発明に係る特性を保持している限り更に遺伝子的に改変されている抗体である。WO98/08097に記載されている方法を使用することによりＴ細胞エピトープ枯渇抗体を産生することができる。
【００７２】
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、好ましくは、その可変ドメイン、又は少なくともその抗原結合部位を含む。抗体断片の例としては、ダイアボディ、単鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多特異性抗体が挙げられる。scFv抗体は、例えば、Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88に記載されている。更に、抗体断片は、ＶＨドメインの特性を有する、即ち、ＶＬドメインと会合することができる単鎖ポリペプチド、又はタウpS422に対して結合するＶＬドメインの特性を有する、即ち、ＶＨドメインと共に機能抗原結合部位に対して会合することができる単鎖ポリペプチドを含む。「ヒト化抗体」という用語は、親免疫グロブリンと比較して、異なる種の免疫グロブリンのＣＤＲを含むようフレームワーク及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が改変されている抗体を指す。好ましい態様において、
ａ）配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、配列番号８で表されるCDR3H、及び配列番号３で表されるCDR1L、配列番号４で表されるCDR2L、配列番号５で表されるCDR3L、
ｂ）配列番号２３で表されるCDR1H、配列番号２４で表されるCDR2H、配列番号２５で表されるCDR3H、及び配列番号２７で表されるCDR1L、配列番号２８で表されるCDR2L、配列番号２９で表されるCDR3L、
ｃ）配列番号３１で表されるCDR1H、配列番号３２で表されるCDR2H、配列番号３３で表されるCDR3H、及び配列番号３５で表されるCDR1L、配列番号３６で表されるCDR2L、配列番号３７で表されるCDR3L、
ｄ）配列番号３９で表されるCDR1H、配列番号４０で表されるCDR2H、配列番号４１で表されるCDR3H、及び配列番号４３で表されるCDR1L、配列番号４４で表されるCDR2L、配列番号４５で表されるCDR3L、
ｅ）配列番号４７で表されるCDR1H、配列番号４８で表されるCDR2H、配列番号４９で表されるCDR3H、及び配列番号５１で表されるCDR1L、配列番号５２で表されるCDR2L、配列番号５３で表されるCDR3L、
ｆ）配列番号５５で表されるCDR1H、配列番号５６で表されるCDR2H、配列番号５７で表されるCDR3H、及び配列番号５９で表されるCDR1L、配列番号６０で表されるCDR2L、配列番号６１で表されるCDR3L、又は
ｇ）配列番号６３で表されるCDR1H、配列番号６４で表されるCDR2H、配列番号６５で表されるCDR3H、及び配列番号６７で表されるCDR1L、配列番号６８で表されるCDR2L、配列番号６９で表されるCDR3L
をヒト抗体のフレームワーク領域に移植して、「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327;及びNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照されたい。
【００７３】
「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、本明細書で使用するとき、抗原に対する抗体の結合に直接関与する、軽鎖ドメインと重鎖ドメインとの各対を意味する。可変軽鎖ドメイン及び重鎖ドメインは、同じ一般構造を有し、そして、各ドメインは、３つの「超可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）によって連結されている、配列が広く保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、β−シート高次構造を採用し、そして、ＣＤＲは、β−シート構造を連結するループを形成することができる。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域により三次元構造が保持され、そして、他方の鎖のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３領域は、本発明に係る抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たしているので、本発明の更なる目的を提供する。
【００７４】
「抗体の抗原結合部分」という用語は、本明細書で使用するとき、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書で定義されるとき、超可変領域の残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖及び重鎖の可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与し、そして抗体の特性を規定する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準定義及び／又は「超可変性ループ」の残基に従って決定される。
【００７５】
「CDR1H」という用語は、Kabat法に従って計算された重鎖可変領域のＣＤＲ１領域を意味する。CDR2L、CDR3H等は重（Ｈ）鎖、又は軽（Ｌ）鎖のそれぞれの領域を意味する。例えば、配列番号６で表されるCDR1Hを含むことを特徴とする抗体とは、前記抗体がその可変重鎖における重鎖可変鎖ＣＤＲ１領域としてこのアミノ酸配列を含むことを意味する。例えば、配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、配列番号８で表されるCDR3Hを含むことを特徴とする抗体は、前記抗体がＣＤＲ１の配列として配列番号６を、ＣＤＲ２の配列として配列番号７を、及びＣＤＲ３の配列として配列番号８を重鎖中に含むことを意味する。
【００７６】
「核酸」又は「核酸分子」という用語は、本明細書で使用するとき、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、単鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００７７】
「アミノ酸」という用語は、本願で使用するとき、アラニン（３文字表記：ala、１文字表記：Ａ）、アルギニン（arg、Ｒ）、アスパラギン（asn、Ｎ）、アスパラギン酸（asp、Ｄ）、システイン（cys、Ｃ）、グルタミン（gln、Ｑ）、グルタミン酸（glu、Ｅ）、グリシン（gly、Ｇ）、ヒスチジン（his、Ｈ）、イソロイシン（ile、Ｉ）、ロイシン（leu、Ｌ）、リシン（lys、Ｋ）、メチオニン（met、Ｍ）、フェニルアラニン（phe、Ｆ）、プロリン（pro、Ｐ）、セリン（ser、Ｓ）、トレオニン（thr、Ｔ）、トリプトファン（trp、Ｗ）、チロシン（tyr、Ｙ）、及びバリン（val、Ｖ）を含む、天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を意味する。
【００７８】
別の核酸と機能的関係に配置されるとき、核酸は「機能的に連結されている」。例えば、ポリペプチドの分泌に関与する前駆体タンパク質として発現する場合、プレシークエンス又は分泌リーダーのＤＮＡがポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結されていたり；配列の転写に影響を与えるとき、プロモーター又はエンハンサーがコード配列に機能的に連結されていたり；翻訳を促進するように位置付けられるとき、リボソーム結合部位がコード配列に機能的に連結されていたりする。一般的に、「機能的に連結される」は、連結されたＤＮＡ配列が共直線性であることを意味し、そして、分泌リーダーである場合は、隣接し且つインフレームである。しかし、エンハンサーは、隣接していなくてもよい。都合のよい制限酵素部位においてライゲーションすることによって連結が行われる。そのような部位が存在しない場合、常法に従って合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使用する。
【００７９】
本明細書で使用するとき、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という表現は互換的に使用され、このような表記は全て後代を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語句は、対象初代細胞及び継代数に関係なくそれから誘導された培養物を含む。また、全ての後代は、故意の又は偶発的な突然変異により、ＤＮＡ含量が正確に同一であるとは限らないことを理解されたい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングしたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体後代も含まれる。
【００８０】
抗体の「Ｆｃ部」は、抗原に対する抗体の結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体又は免疫グロブリンは、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMのクラスに分類され、そして、これらクラスのうちの幾つかは、例えばIgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4、IgA1及びIgA2等のサブクラス（サブタイプ）に更に分類することができる。重鎖定常領域によって、異なるクラスの免疫グロブリンは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。本発明に係る抗体は、好ましくは、IgG1サブタイプ又はIgG4サブタイプであるヒト起源のＦｃ部を含む。
【００８１】
ヒト定常軽鎖及び重鎖、並びにIgG1サブタイプ及びIgG4サブタイプの定常鎖は、当技術分野において周知であり、例えば、Kabatによって記載されている（例えば、Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照されたい）。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号１３若しくは１４（IgG1）、又は配列番号１５若しくは１６（IgG4）のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号１１で表されるカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。抗体がマウス起原であり、そして、Kabat法に従ってマウス抗体の抗体可変配列枠を含むことが更に好ましい（例えば、Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, E.A. et al., 5thedition, DIANE Publishing (1992)を参照されたい）。
【００８２】
本発明は、本発明に係る抗体を患者に投与することを特徴とする、治療を必要としている患者を治療するための方法を含む。
【００８３】
本発明は、治療のための本発明に係る抗体の使用を含む。
【００８４】
本発明は、タウオパシー、特にＡＤを治療する医薬を調製するための本発明に係る抗体の使用を含む。
【００８５】
本発明は、脳疾患を治療するための、好ましくは、タウオパシー、特にＡＤを治療するための本発明に係る抗体の使用を含む。
【００８６】
本発明の更なる態様は、本発明に係る抗体を生成するための方法であって、本発明に係る抗体の重鎖をコードする核酸の配列、及び前記抗体の軽鎖をコードする核酸を１つ又は２つの発現ベクターに挿入し、前記ベクターを真核生物のホスト細胞に挿入し、コードされている抗体を発現させ、そして、前記ホスト細胞又は上清から回収することを特徴とする方法である。
【００８７】
本発明に係る抗体は、好ましくは、組換え手段によって生成される。このような方法は、当技術分野において広く知られており、原核生物及び真核生物の細胞においてタンパク質を発現させ、次いで、抗体ポリペプチドを単離し、そして、通常、薬学的に許容しうる純度に精製することを含む。タンパク質を発現させるために、軽鎖及び重鎖又はこれらの断片をコードする核酸を標準的な方法によって発現ベクターに挿入する。ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、ＣＯＳ細胞、酵母又は大腸菌細胞等の適切な原核生物又は真核生物のホスト細胞において発現させ、細胞から（上清から、又は細胞溶解後に）抗体を回収する。
【００８８】
抗体の組換え体生成は、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S. et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説に記載されている。
【００８９】
抗体は、全細胞中、細胞溶解物中に存在してもよく、部分的に精製された形態で存在してもよく、又は実質的に純粋な形態で存在してもよい。標準的な技術によって（Ausubel, F. et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照されたい）、他の細胞成分又は他の夾雑物、例えば、他の細胞の核酸又はタンパク質を取り除くために精製を行う。
【００９０】
ＮＳ０細胞における発現は、例えばBarnes, L.M. et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M. et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270に記載されている。一過的発現は、例えば、Durocher, Y. et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L. et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87に記載されている。好ましい一過的発現系（HEK293）は、Schlaeger, E.-J. and Christensen, K.によってCytotechnology 30 (1999) 71-83に、そして、Schlaeger, E.-J.によってJ. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199に記載されている。
【００９１】
モノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、従来の手順を使用して容易に単離され、そして配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ及びＲＮＡ源として機能することができる。一旦単離した後、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、次いで、HEK293細胞、ＣＨＯ細胞、又は他の免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄細胞等のホスト細胞にトランスフェクトして、ホスト細胞で組換え型モノクローナル抗体を合成させることもできる。
【００９２】
抗pS422抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野において公知である様々な方法によって調製される。これらの方法は、天然資源（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）からの単離、ヒト化抗pS422抗体の既に調製されている変異体又は非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド媒介性（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット式変異誘発による調製を含むが、これらに限定されない。
【００９３】
本発明に係る重鎖及び軽鎖可変ドメインは、プロモーター、翻訳開始、定常領域、３’非翻訳領域、ポリアデニル化、及び転写終結の配列と組み合わせられて、発現ベクターのコンストラクトを形成する。重鎖及び軽鎖発現コンストラクトは、単一のベクターに組み込まれてもよく、コトランスフェクトされてもよく、連続的にトランスフェクトされてもよく、又は別々にホスト細胞にトランスフェクトし、次いで、融合させて両鎖を発現する単一のホスト細胞を形成してもよい。
【００９４】
別の局面では、本発明は、薬学的に許容しうる担体と共に製剤化される、本発明のモノクローナル抗体のうちの１つもしくは本発明のモノクローナル抗体の組合せ、又はこれらの抗原結合部分を含有する組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
【００９５】
本明細書で使用するとき、「薬学的に許容しうる担体」は、生理学的に適合する任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌性及び抗真菌性の物質、等張剤、並びに吸収／再吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、注射又は注入に適している。
【００９６】
本発明の組成物は、当技術分野において公知である様々な方法によって投与することができる。当業者によって認識されるように、投与の経路及び／又は方法は、望ましい結果に依存して変化する。
【００９７】
薬学的に許容しうる担体は、無菌の水溶液もしくは分散液、又は無菌の注射溶液又は分散液を調製するための無菌粉末を含む。薬学的活性物質のためにこのような媒体及び剤を使用することは、当技術分野において公知である。水に加えて、担体は、例えば等張の緩衝生理食塩水であってもよい。
【００９８】
選択された投与経路にかかわらず、適切な水和形態で用いてもよい本発明の化合物、及び／又は本発明の医薬組成物は、当業者に公知である従来の方法によって薬学的に許容しうる剤形に製剤化される。
【００９９】
患者にとって毒性ではなく、特定の患者、組成物及び投与方法にとって望ましい治療応答を達成するのに有効な活性成分の量（有効量）を得るために、本発明の医薬組成物中における活性成分の実際の投与量レベルを変更してもよい。選択される投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物、又はそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、使用される特定の組成物と併用される他の医薬、化合物、及び／又は物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康、及び病歴、並びに医学分野において周知である類似要因を含む様々な薬物動態学的要因に依存する。
【０１００】
本発明は、タウオパシー、特にＡＤに罹患している患者を治療するための本発明に係る抗体の使用を含む。
【０１０１】
また、本発明は、本発明に係る抗体を患者に投与することにより、このような疾患に罹患している患者を治療するための方法を含む。
【０１０２】
本発明は、更に、薬学的に許容しうる担体と共に本発明に係る抗体を含む医薬組成物を製造するための方法、及びこのような方法における本発明に係る抗体の使用を提供する。
【０１０３】
本発明は、更に、タウオパシー、特にＡＤに罹患している患者を治療する医薬品を、好ましくは薬学的に許容しうる担体と共に製造するための本発明に係る抗体の使用を提供する。
【０１０４】
また、本発明は、癌、特にタウオパシー、特にＡＤに罹患している患者を治療する医薬品を、好ましくは薬学的に許容しうる担体と共に製造するための本発明に係る抗体の使用を提供する。
【０１０５】
本発明についての理解を助けるために以下の実施例、配列表及び図面を提供し、その真の範囲を特許請求の範囲に記載する。本発明の趣旨から逸脱することなく記載されている手順を変更できることが理解される。
【０１０６】
配列表の説明
配列番号１ Mab2.10.3の可変軽鎖
配列番号２ Mab2.10.3の可変重鎖
配列番号３ CDR1L
配列番号４ CDR2L
配列番号５ CDR3L
配列番号６ CDR1H
配列番号７ CDR2H
配列番号８ CDR3H
配列番号９ リン酸化タウ断片
配列番号１０ 配列番号９の非リン酸化
配列番号１１ ヒトカッパ軽鎖定常領域
配列番号１２ ヒトラムダ軽鎖定常領域
配列番号１３ ヒトγ１（アロタイプG1m1,17）定常領域
配列番号１４ ヒトγ１（アロタイプG1m117）定常領域
配列番号１５ ヒトIgG4定常領域
配列番号１６ ヒトIgG4 SPLE−突然変異体定常領域
配列番号１７ リン酸化MCAK断片（MCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]）
配列番号１８ プライマー
配列番号１９ プライマー
配列番号２０ プライマー
配列番号２１ プライマー
配列番号２２ Mab005の可変重鎖
配列番号２３ CDRH1
配列番号２４ CDRH2
配列番号２５ CDRH3
配列番号２６ Mab005の可変軽鎖
配列番号２７ CDRL1
配列番号２８ CDRL2
配列番号２９ CDRL3
配列番号３０ Mab019の可変重鎖
配列番号３１ CDRH1
配列番号３２ CDRH2
配列番号３３ CDRH3
配列番号３４ Mab019の可変軽鎖
配列番号３５ CDRL1
配列番号３６ CDRL2
配列番号３７ CDRL3
配列番号３８ Mab020の可変重鎖
配列番号３９ CDRH1
配列番号４０ CDRH2
配列番号４１ CDRH3
配列番号４２ Mab020の可変軽鎖
配列番号４３ CDRL1
配列番号４４ CDRL2
配列番号４５ CDRL3
配列番号４６ Mab085の可変重鎖
配列番号４７ CDRH1
配列番号４８ CDRH2
配列番号４９ CDRH3
配列番号５０ Mab085の可変軽鎖
配列番号５１ CDRL1
配列番号５２ CDRL2
配列番号５３ CDRL3
配列番号５４ Mab086の可変重鎖
配列番号５５ CDRH1
配列番号５６ CDRH2
配列番号５７ CDRH3
配列番号５８ Mab086の可変軽鎖
配列番号５９ CDRL1
配列番号６０ CDRL2
配列番号６１ CDRL3
配列番号６２ Mab097の可変重鎖
配列番号６３ CDRH1
配列番号６４ CDRH2
配列番号６５ CDRH3
配列番号６６ Mab097の可変軽鎖
配列番号６７ CDRL1
配列番号６８ CDRL2
配列番号６９ CDRL3
配列番号７０ ウサギ免疫グロブリン定常領域（カッパ）
配列番号７１ ウサギ免疫グロブリン定常領域（ガンマ）
配列番号７２ マウス免疫グロブリン定常領域（カッパ）
配列番号７３ マウス免疫グロブリン定常領域（ガンマ）
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】タウPS2APPマウスモデルにｉｐ投与した後のpS422 IgG1の大脳内局在。Alexa488をコンジュゲートしたIgG1に対する一次抗体、及びAlexa555をコンジュゲートした抗ｐタウ抗体ＡＴ８で多重蛍光染色した後の共焦点顕微鏡写真は、細胞核のＤＡＰＩ染色（Ｃ）と共に、IgG1の結合（Ａ）及びｐタウの沈着（Ｂ）を示した。マージされた画像は、幾つかのｐタウ陽性細胞における、抗IgG1及びｐタウの共局在化染色を示す（Ｄ）。
【図２】タウPS2APPマウスモデルにおけるIgG1の大脳内局在のビヒクル対照。海馬体のＣＡ１領域の概観を示す、タウPS2APP脳切片を多重蛍光染色した後の共焦点顕微鏡写真。Alexa488をコンジュゲートしたIgG1に対する一次抗体による多重染色は陰性である（Ａ）。Alexa555をコンジュゲートした抗ｐタウ抗体ＡＴ８は、ｐタウの沈着を示す（Ｂ）。細胞核のＤＡＰＩ染色（Ｃ）。マージされた画像を（Ｄ）に示す。ビヒクルを注射した後のタウPS2APPマウスにおいて、感知できるほどの抗IgG1免疫蛍光は観察されなかった。
【図３】タウPS2APPマウスモデルにｉｐ投与した後のIgG1の細胞内局在。前頭前皮質内の陽性標識された細胞を示す、タウPS2APP脳切片を多重蛍光染色した後の共焦点顕微鏡写真。Alexa488をコンジュゲートしたIgG1に対する一次抗体、及びAlexa555をコンジュゲートした抗ｐタウ抗体ＡＴ８による多重染色は、IgG1の結合（Ａ）及びｐタウの沈着（Ｂ）を示した。マージされた画像は、青による細胞核のＤＡＰＩ染色（Ｃ）と共に、抗IgG1及びｐタウが共局在化した核周囲及び樹状の染色を示す。
【図４】タウPS2APPマウスモデルにｉｐ投与した後のpS422 IgG1の細胞内局在。海馬のＣＡ１領域の錐体細胞層内の陽性標識された細胞を示す、タウPS2APP脳切片を多重蛍光染色した後の共焦点顕微鏡写真。Alexa488をコンジュゲートしたIgG1に対する一次抗体、及びAlexa555をコンジュゲートした抗ｐタウ抗体ＡＴ８による多重染色は、IgG1の結合（Ａ）及びｐタウの沈着（Ｂ）を示した。マージされた画像は、細胞核のＤＡＰＩ染色（Ｃ）と共に、抗IgG1及びｐタウが共局在化した核周囲及び樹状の染色を示す。
【図５】タウPS2APPマウスモデルにip投与した後のIgG2aの細胞内局在。海馬のＣＡ１領域の錐体細胞層内の陽性標識された細胞を示す、タウPS2APP脳切片を多重蛍光染色した後の共焦点顕微鏡写真。Alexa488をコンジュゲートしたIgG2aに対する一次抗体、及びAlexa555をコンジュゲートした抗ｐタウ抗体ＡＴ８による多重染色は、IgG2aの結合（Ａ）及びｐタウの沈着（Ｂ）を示した。マージされた画像は、細胞核のＤＡＰＩ染色（Ｃ）と共に、抗IgG2a及びｐタウが共局在化した核周囲及び樹状の染色を示す。
【図６】タウPS2APPマウスモデルにip投与した後のIgG2bの細胞内局在。前頭前皮質領域内の陽性標識された細胞を示す、タウPS2APP脳切片を多重蛍光染色した後の共焦点顕微鏡写真。Alexa488をコンジュゲートしたIgG2bに対する一次抗体、及びAlexa555をコンジュゲートした抗ｐタウ抗体ＡＴ８による多重染色は、IgG2bの結合（Ａ）及びｐタウの沈着（Ｂ）を示した。マージされた画像は、矢印（Ｃ）によって示されるように、抗IgG2b及びｐタウが共局在化した核周囲の染色を示す。
【図７】タウPS2APPマウスの分析。Ａ：１６月齢のタウPS2APPマウスの矢状脳切片のGallyas銀染色。典型的なもつれ状ニューロン内構造が黒く見え、免疫蛍光顕微鏡検査法によって明らかにされたｐタウ陽性ニューロンを裏付ける。Ｂ：１６月齢のタウPS2APPマウスの免疫金標識された超薄切片。１０nmのコロイド金（矢印）をコンジュゲートした二次抗体によって明らかにされるように、抗タウpS422 mAbは海馬のＣＡ１領域内の樹状突起における原線維状構造に特異的に結合する。標識された原線維の大きさ及び密度は、前記原線維がアルツハイマー病の変性ニューロンでみられるリン酸化タウタンパク質の対らせん状線維に相当することを示唆する。
【図８】ＡＤ脳切片に対する抗タウpS422抗体のインビトロ結合。陽性標識されたｐタウ沈着物を示す、指定の濃度の抗タウpS422モノクローナル抗体（クローン２．１０．３、２．２０．４及び５．６．１１）によりヒト皮質ＡＤ脳切片を染色した後の蛍光顕微鏡写真。大きな神経原線維変化及び細長い糸屑状構造物のような、細胞内のｐタウ沈着が顕著である。
【図９ａ】タウと比較した、抗タウpS422抗体のタウpS422に対する選択性。タウ（▲）又はタウpS422（●）でコーティングされたプレートを使用した、ELISAによる抗タウpS422抗体の選択性の測定。レファレンスとして、左上のパネルにタウ選択的抗体４／２を示す。
【図９ｂ】タウと比較した、抗タウpS422抗体のタウpS422に対する選択性。タウ（▲）又はタウpS422（●）でコーティングされたプレートを使用した、ELISAによる抗タウpS422抗体の選択性の測定。レファレンスとして、左上のパネルにタウ選択的抗体４／２を示す。
【図１０】インビトロにおいて凝集したタウは原線維である。陰性染色されている凝集したタウの電子顕微鏡写真。
【図１１】陽性標識されたｐタウ沈着物及び線維を示す、抗タウpS422ウサギモノクローナル抗体であるMab005（第１列）、Mab019（第２列）、Mab020（第３列）、Mab085（第４列）、Mab086（第５列）及びMab097（第６列）で染色されたヒト皮質のＡＤ脳切片の蛍光顕微鏡写真。ＩｇＧの連続希釈物を、２．０μg/mL（左）から始めて、０．４μg/mL、０．０８μg/mL及び０．０１６μg/mLと各列に示す。
【０１０８】
実施例１
抗体の調製及び精製
ａ）抗体生成
タウの最長のヒトアイソフォームのアミノ酸４１６〜４３０に相当する配列番号９で表されるタウ断片（Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp）でマウスを免疫した。チオールを介してＫＬＨに直接カップリングさせるために、タウ断片のＮ末端にシステインを付加した。後続の免疫プロトコール、融合、及びクローニング、並びに抗タウpS422特異的抗体のスクリーニングについては、EP 1 876 185に記載されている。
【０１０９】
ｂ）クローン２．１０．３、２．２０．４及び５．６．１１の精製
５０mMのTrisCl（ｐＨ８．０）で平衡化された２５mLのMEP Hypercellカラム（pall Biosciences）に無細胞ハイブリドーマ培養上清（２５０〜３００mL）をロードした。平衡バッファで洗浄した後、３０mMのクエン酸ナトリウム、１００mMのNaCl（ｐＨ４．１）で抗体を溶出した。抗体を含有している画分をプールし、次いで、１０mMのTrisCl（ｐＨ８．０）５リットルに対して４℃で一晩Spectra-Por 6-8000の透析チューブにて透析した。１０mMのTrisCl（ｐＨ８．０）（バッファＡ）で平衡化した１０mLのSource 17Qカラム（GE Healthcare）に、透析された材料をロードした。バッファＡで洗浄した後、１０カラム体積の０〜２５％バッファＢで抗体を勾配溶出した。バッファＢは、１０mMのTrisCl、１ＭのNaCl（ｐＨ８．０）を含有していた。約２００mMのNaClで抗体を溶出した。SDS-PAGEによって個々の画分の純度をチェックし、最も純度の高い画分をプールした。
【０１１０】
マウスに注射する前日、ＰＢＳに対して各抗体を透析し、そして、抗体濃度を３．２mg/mLに調整した。
【０１１１】
実施例２
タウ、タウpS422、凝集したタウ、及び凝集したタウpS422の調製
Ｎ末端に(His)6-SUMO融合タグを有するタウをE.coliで発現させ、そして、HiTrapQ (GE Healthcare, Switzerland)上でイオン交換クロマトグラフィーによって、次いで、Ni-NTA Sepharose (Qiagen, Switzerland)上でアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。次いで、SUMOプロテアーゼ(Invitrogen, Netherlands)で消化することによって融合タグを切断し、次いで、２回目のNi-NTA Sepharoseクロマトグラフィー工程を行って、融合タグを除去する。
【０１１２】
ERK2プロテインキナーゼと共にタウをインキュベートすることによってタウ-pSer422を調製した。１mMのＭｇＣｌ２及び２mMのＡＴＰを含有している１０mMのTrisCl（ｐＨ８．０）中で３７℃にて一晩インキュベートした後にS422が最も多くリン酸化されるERK2：タウのモル比（計算値１：１０）を選択した。次いで、これが４２２の部位における化学量論的リン酸化を表すと仮定した。タウのpS422に特異的なインハウスのモノクローナル抗体を使用して、ウエスタンブロットによってリン酸化をチェックした。
【０１１３】
５０μMのアラキドン酸（Sigma, Switzerland）を含有している１０mMのTrisCl（ｐＨ８．０）中で最終濃度５μMの精製タウをインキュベートすることにより、凝集した（原線維状）タウを調製した。１６時間３７℃でインキュベートを行った。１０μMのチオＳの存在下において蛍光分光法によって（Barghorn and Mandelkow [2002] Biochemistry 41:14885-14896）、及び電子顕微鏡（図１０）によって凝集状態を調べた。図１０が示すように、凝集したタウは、原線維状の外観を有する。上記の通り、予め凝集しているタウをERK2キナーゼと共にインキュベートすることによって、凝集したリン酸化タウを調製した。
【０１１４】
実施例３
抗タウpS422モノクローナル抗体は、S422がリン酸化されているタウに対する選択性が高い
ａ）ペプチド合成
Fmoc化学反応を使用して、自動ペプチド合成機においてペプチド合成を行った。反復サイクルにおいて、対応するFmocアミノ酸を順次カップリングすることによりペプチド配列を組立てた。全てのカップリング工程において、Ｎ−メチルピロリドン中２０％ピペリジンを含む樹脂で処理することによってＮ末端のFmoc基を除去した。ＤＭＦ中HBTU/HOBt（１mmol、各々）及びDIPEA（２mmol）によって活性化されたFmoc保護アミノ酸（１mmol）を使用して、カップリングを実行した。全てのカップリング工程後、ＮＭＰ中酢酸（０．５Ｍ）、DIPEA（０．１２５Ｍ）及びHOBt（０．０１５Ｍ）の混合物で処理することによって（１０分間、ボルテックス）、未反応アミノ基をキャッピングした。各工程間に、Ｎ−メチルピロリドン及びＤＭＦで樹脂を洗浄した。立体障害アミノ酸の取込みは、自動ダブルカップリングにおいて達成された。この目的のために、カップリングサイクルにおいてキャッピング工程を行うことなく、１mmolの活性化された構成単位で樹脂を２回処理した。リン酸化ペプチド配列では、対応するセリン誘導体をFmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH構成単位として組込んだ。標的配列が完成したら、標準的なアミノ酸カップリング条件を使用して、Fmoc-Glu（ビオチニル-PEG)-OH（ＰＥＧスペーサーを介して結合されたビオチン）をMCAKペプチドにカップリングし、一方、標準的な条件を使用して、４×β−アラニン（Ｕ）及び１×ε−リジンをホスホ−タウ配列に結合させた。次いで、ＤＭＴｒ−ビオチンをホスホ−タウペプチドにコンジュゲートさせて、ビオチン化された標的配列を得た。最後のFmoc脱保護（MCAKのみ）後、フィルターフリットに全てのペプチド樹脂を別々に入れ、そして、トリフルオロ酢酸、水及びトリイソプロピルシラン（１９mL：０．５mL：０．５mL）の混合物で２．５時間処理した。切断溶液を濾過し、冷（０℃）ジイソプロピルエーテル（３００mL）を添加することによってペプチドを沈殿させて、無色の固体を得、これをジイソプロピルエーテルで繰り返し洗浄した。粗生成物を酢酸／水の混合物に再溶解させ、凍結乾燥させ、次いで、０．１％のＴＦＡを含有しているアセトニトリル／水勾配を使用して、分取逆相HPLCによって精製した。
【０１１５】
HBTU：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HOBt：ヒドロキシベンゾトリアゾール
DIPEA：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
NMP：Ｎ−メチル−２−ピロリドン
【０１１６】
ｂ）リン酸化タウペプチドを用いたアッセイ
タウpS422配列４１６−４３０（リン酸化及び非リン酸化）及びMCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]を表すペプチドを合成し、ビオチン化して、ストレプトアビジンで標識されたマイクロタイタープレートをコーティングさせた。アッセイプレートに対するタウリンペプチドの最大結合を試験するために、１ng/mLから２０００ng/mLに及ぶ様々な濃度のタウリンペプチドをコーティングに使用した。最終的に、室温で６０分間コーティングするために５０ng/mLのタウリンペプチドを使用した。１０００ng/mL以下の濃度で６０分間、ペプチドで標識されたマイクロタイタープレート内で、抗タウpS422抗体２．１０．３、２．２０．４．及び５．６．１１をインキュベートした。洗浄後、ＰＯＤで標識された抗マウス−ＩｇＧ Ｆｃ抗体を使用して、抗体の結合を検出した。室温で２０分間ＡＢＴＳ（登録商標）と共にインキュベートした後、４０５nm〜４９２nmの吸収度（O.D.）を測定した。ＥＣ５０によって抗体結合を測定した。２．１０．３については１００ng/mL、２．２０．４については８ng/mL、及び５．６．１１については１ng/mLの範囲において典型的なＥＣ５０値を決定することができた。非リン酸化タウ断片、及び（MCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]）を対照として使用した。対照ペプチドの結合は、観察することができなかった。典型的なバックグラウンド値は約３０ｍＥ（表１）であり、これは、リン酸化タウ断片で測定された最大値の約１％である。したがって、Mab2.10.3は、配列番号１０で表される非リン酸化タウペプチド及びMCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]と比較して少なくとも１００倍の選択性でリン酸化タウ断片に結合する。結果を表１に示す。
【０１１７】
【表１】
【０１１８】
ｃ）完全長タウ及びタウpS422を用いたアッセイ
Meso Scale Discovery（商標）アッセイプラットフォーム（MSD, Gaithersburg, Maryland, USAMD）を使用してアッセイを行った。室温で１時間、ＰＢＳバッファ中２μg/mLの濃度のタウ又はタウpS422でＭＳＤ９６ウェルマイクロタイタープレートをコーティングした。次いで、１時間５％のＢＳＡ及び１％のTween20を含有しているＰＢＳを添加することにより、プレートをブロッキングした。０．１％のＢＳＡ及び０．１％のTween（登録商標）20を含有しているLow Crossバッファ(MSD)で抗体を（濃度域が３ng/mL〜２５０ng/mLであったクローン２．１０．３を除いて）３０pg/mL〜２０ng/mLの濃度に希釈し、コーティング及びブロッキングされたプレートに添加し、そして、室温で３時間インキュベートした。次いで、１％のTweenを含有しているＰＢＳバッファでプレートを３回洗浄した。結合した抗体の検出については、０．５μg/mLの濃度のSULFOタグ付抗マウスＩｇＧ（ＭＳＤ）を添加し、そして、室温で１時間プレートをインキュベートした。Readバッファ（ＭＳＤ）を添加した後、MSD Sector Imager 600プレートリーダでプレートを読み取った。図９は、抗タウpS422モノクローナル抗体（クローン５．６．１１、２．２０．４及び２．１０．３）の結合パートナーとしてタウ又はタウpS422のいずれかを用いて得られたデータを示す。タウ及びタウpS422の両方を認識する抗タウ抗体（クローン４／２）を参照としてタウpS422抗体と比較する。タウpS422及びタウに対する結合と比較することによって、タウに対する結合のシグナルは、バックグラウンドシグナルと識別することができなかったので、タウに対する結合は検出されなかったことが分かった。したがって、タウと比較して、少なくとも１０，０００倍の選択性でタウpS422に対して３つの各抗タウpS422抗体が結合すると推定された。
【０１１９】
実施例４
抗タウpS422抗体はタウpS422の原線維状凝集体に結合する
Biacore（商標）分析を用いて、凝集した原線維状タウpS422の調製物に対する抗タウpS422（クローン２．１０．３）の結合を測定した。リン酸化原線維は、インビトロにおける、アルツハイマー病脳に生じるタウのＰＨＦ形態を表すと考えられる。実施例２に記載されているように原線維状物質を調製し、リン酸化した。
【０１２０】
センサチップ上への固定：
ＣＭ５センサチップ上でアミンカップリングすることによって、凝集したタウpS422を共有結合的に固定化した。この目的のために、凝集したタウpS422を１０mMの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で１９倍に希釈した。チップ上に望ましい量のタンパク質が固定化されるまで、活性化されたセンサ表面をタンパク質溶液と接触させた。その後、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．０）を注入することにより、残りの反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをブロッキングした。抗タウpS422（クローン２．１０．３）の結合挙動の特性評価を行うために、４５０反応単位（ＲＵ）のタンパク質を固定化した。ＲＴで固定アッセイを実行し、ランニングバッファとしてＰＢＳを使用した。
【０１２１】
動的滴定：
抗体の特性評価については、ランニングバッファを１０mMのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、２５０mMのNaClに変更し、以下の一連の濃度の抗体を調製した：５つの異なる濃度、希釈係数２、最大濃度２００nM。最低濃度で開始して、抗体の異なる溶液を連続的に注入した。所謂動的滴定の後に、１００mMのＨ３ＰＯ４でセンサ表面を再生した。この測定を３回行った。
【０１２２】
Biaevalソフトウェアによってデータ評価を行った。パラメータの計算は、凝集したタウpS422に対する抗体の結合が完全に一価であるという仮定に基づく。固定化されたタンパク質の抗体の結合挙動を特徴づける動的及び熱力学的パラメータを表２に示す。
【０１２３】
【表２】
【０１２４】
したがって、抗タウpS422（クローン２．１０．３）は、１７nMのＫＤで原線維のホスホタウに結合する。
【０１２５】
実施例５
アルツハイマー病患者の脳切片における細胞内ｐタウに対する抗タウpS422モノクローナル抗体のインビトロ結合
ＡＤ患者のヒト脳組織の低温切片を用いる免疫組織化学的染色実験によって、アルツハイマー病脳組織における病理学的に関連するｐタウ病変の免疫装飾（immunodecoration）の特異性及び感受性について調べた。Braak VIとして神経病理学に病期分類されたＡＤ患者の凍結死後脳組織を使用することにより評価を行った。任意の化学薬品、即ち、アルデヒドで固定することなく、免疫組織化学法のために脳組織を低温切片化し、そして、処理した。マウスＩｇＧに特異的な蛍光標識された二次抗体を用いてｐタウ沈着物の検出を行い、そして、蛍光光学顕微鏡によってモニタした。
【０１２６】
簡潔に述べると、アルツハイマー病陽性であると診断された患者の死後に得られた皮質脳領域の固定されてない脳組織のクライオスタット切片を間接免疫蛍光法によって標識した。本報告では、ＡＤ患者（症例０１−０５；国内の脳バンク）の眼窩前頭組織から得られた画像を示す。連続２段階インキュベーションを用いて様々なクローンから結合したマウス抗体を検出したが、これはＣｙ３（Jackson Immuno Research）をコンジュゲートしたアフィニティー精製されたヤギ抗マウスIgG(H+L)によって明らかになった。切片化、染色、及び蛍光顕微鏡観察は、標準的な手順に従って行った。
【０１２７】
ｐタウ病変が特異的且つ高感度で染色されることは、クローン２．１０．３、２．２０．４及び５．６．１１について明らかである（図８）。全ての種類のｐタウ沈着物（即ち神経原線維変化）、糸屑状構造物及び異栄養性神経突起が安定して染色されていることが、明らかに視認できる。調査したクローン全てについて最小有効濃度は０．０５μg/mLであると決定され、これは、純粋なヒトｐタウ沈着物に対して高感度で結合することを示す。
【０１２８】
また、ｐタウ沈着物の検出は、本発明に係るIgG4抗体、及びヒトIgG4に特異的な蛍光標識された二次抗体を用いることによって行い、そして、蛍光光学顕微鏡によってモニタしてもよい。
【０１２９】
実施例６
タウPS2APPトリプルトランスジェニックマウスの作製
Ｂ６．１７２Ｈ系統のホモ接合体ＰＳ２ＡＰＰ雌（Ozmen, L. et al., Neurodegen. Dis. 6 (2009) 29-36）をタウＰ３０１Ｌ系統のホモ接合体タウ雄（Goetz et al., Science 293 (2001) 1491-1495）と交配することによってトランスジェニックタウPS2APPマウスを作製した。得られたトランスジェニックマウスは全て、ヒトＡＰＰスウェーデン型突然変異、ヒトプレセニリン２ N141I突然変異及びヒトタウP301L突然変異についてヘテロ接合体である。ヒトＡＰＰ及びタウトランスジーンの場合にはマウスＴｈｙ−１プロモーターによって、そして、ヒトプレセニリン２トランスジーンの場合にはプリオンプロモーターによって、トランスジーンの発現が駆動される。
【０１３０】
１２時間明暗サイクルで動物を飼育し、自由に食餌及び水を与えた。飼育施設は、Accreditation of Laboratory Animal Careによって認証された。全ての手順は、Swiss federal regulations on animal protection及びAssociation for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Careの規則を厳守し、国内の獣医学の専門家による明示的承認を受けて実施した。
【０１３１】
免疫組織化学法のためのマウスの処理：４％のイソフルランを使用してマウスに麻酔をかけ、断頭術によって屠殺した。EDTANaFでコーティングされたチューブ（Milian）に血液を回収した。脳を摘出し、ドライアイス上で直ちに凍結させ、更に使用するまで−８０℃で保存した。
【０１３２】
実験では、２０月齢の雄及び雌のマウスを用いた。この月齢では、これまでに試験した全てのマウスの脳で、細胞内の過リン酸化タウの蓄積及び神経原線維の病変が増加していることが明らかである。
【０１３３】
実施例７
タウPS2APPマウスモデルにおけるｐタウ沈着物の組織学的及び超微細構造的解析
タウPS2APPマウスは、幾つかの脳領域において検出可能な神経原線維変化に類似する構造を有するニューロン内のｐタウ沈着を伴う、年齢依存性且つ進行性の表現型を発現する。２４月齢で実質的なｐタウ病変が観察される。典型的に、細胞内のタウpS422について陽性である幾つかのニューロンは、海馬のＣＡ１領域の前頭前皮質及び錐体細胞層内、及び隣接する鉤状回でみられる。この月齢においてｐタウは、多形細胞層に、そして、海馬の白板境界に沿ってＣＡ３及び海馬采領域に、また線条に広がることが分かった。
【０１３４】
記載されている方法（Gallyas, F., Acta Morphologica Acad. Sci. Hung. 19 (1971) 1-8）に軽微な変更を施してGallyas銀染色を行った、即ち、３％の過ヨウ素酸中でプレインキュベートし、０．５％の酢酸で洗浄した後、更に５％のチオ硫酸ナトリウムで更に２分間洗浄した。標準的なヘマトキシリン及びエオシンを用いて対比染色を行った。Gallyas銀染色によって、タウPS2APPマウスの海馬及び皮質において多数のもつれ状沈着物が発生していることが確認された（図７Ａ）。
【０１３５】
免疫電子顕微鏡によってｐタウ沈着物の超微細構造を調べた。ＰＢＳ中２％のホルムアルデヒド及び０．５％のグルタルアルデヒドで１６月齢のタウPS2APPマウスを灌流した。Lowicryl HM20に脳切片を包埋し、そして、既に記載されている通り超薄切片を調製した（Richards, J.G. et al., J. Neurosci. 23 (2003) 8989-9003）。簡潔に述べると、１時間２％のＢＳＡを含むＰＢＳ中１０μg/mLの抗タウpS422と共に切片をインキュベートした。ＰＢＳ／２％ＢＳＡで６回洗浄した後、二次ヤギ抗マウスＩｇＧ（Amersham, Arlington Heights, IL）と共に切片をインキュベートし、１時間ＰＢＳ／２％ＢＳＡ／０．１％Tween（登録商標）20中１：２０にて１０nmの金にコンジュゲートさせ、そして、２％のＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄した。対照として、正常マウス血清で処理された切片を使用したところ、１０μm２の面積に金粒子が１０個未満という無視できる程度のバックグラウンドしか生じなかった。１００kVでJEOL 1210を用いて電子顕微鏡写真を撮影した。
【０１３６】
多数のｐタウ陽性ニューロンを有する１６月齢のタウPS2APPの海馬の超微細構造を観察したところ、樹状突起内で対らせん状線維（ＰＨＦ）に典型的な沈着物が免疫金標識されていることが明らかになった（図７Ｂ）。抗タウpS422 mAbで標識された超薄切片によって、黒い点として視認できる１０nmのコロイド金にコンジュゲートされた二次抗体によって明らかである通り、海馬のＣＡ１領域の樹状突起内の原線維状構造物に対して特異的に結合することが明らかになった（図７Ｂ）。免疫金標識によって、調べたタウPS2APPマウスのニューロンにおける細胞内原線維状構造物にタウのpS422エピトープが局在していることが立証された。標識された原線維の大きさ及び密度は、前記原線維がＡＤ患者の変性ニューロンにおいて観察されるＰＨＦに構造上相当することを示唆する。ｐタウＰＨＦの局在は、トランスジェニックタウPS2APPマウスにおける凝集したｐタウ沈着物の細胞内分布を明白に実証する。
【０１３７】
実施例８
免疫組織化学及び共焦点レーザー走査顕微鏡によって明らかにされたアルツハイマー病のｐタウマウスモデルの脳内の細胞内ｐタウに対する抗タウpS422モノクローナル抗体のインビボ結合
選択した抗タウpS422抗体（表１を参照）を２４月齢のタウPS2APPトリプルトランスジェニックマウスにおいて試験し、そして、インビボにおけるｐタウ沈着物に対する結合について評価した。実施例４に記載されているように、幾つかの脳領域において検出可能な神経原線維変化に類似する構造を有するニューロン内ｐタウ沈着を伴う年齢依存性及び進行性の表現型を発現するタウPS2APPマウスモデルにおいて研究を行った。
【０１３８】
使用されたタウpS422に対する抗体を２０mg/kgの用量でｉ．ｐ投与した。ｉｐ投与の２日後に免疫組織化学的染色を行って、ｐタウ沈着及び結合しているマウスＩｇＧサブタイプ抗体を検出した。投与の２日後に各群３匹のマウスを屠殺した。マウスに深く麻酔をかけ（５%v/vのForene（商標）で約２分間、ほとんど窒息状態に達するまで）、次いで、胸部を切開し、心膜を摘出し、ＰＢＳで灌流し、断頭し、脳を半分にし、そして、ドライアイスにおいてスナップ冷凍した。新鮮凍結脳の傍矢状クライオスタット切片をクライオスタット（CM3050S, Leica）で２０μmの厚さに切断し、予冷したHistobondスライド（Marienfeld, Lauda-Konigshofen, Germany）に載せて、−２０℃で保存した。
【０１３９】
結合している抗タウpS422抗体を検出するために三重免疫蛍光染色を適用した。ＰＢＳで切片を水和し、２分間−２０℃に予冷した１００％アセトンで処理した。室温にて染色オートマット（Autostainer Plus DakoCytomation, High Wycombe, UK）において全ての更なる工程を順次行った。０．０１％のTween20を含有しているＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５分間、脳切片を載せたスライドを洗浄し、そして、１％のウシ血清アルブミン、１％のオバルブミン及び１％の正常ヤギ血清を含むＰＢＳ中で２０分間順次インキュベートすることによって非特異的な結合部位のブロッキングを行った。ＰＢＳ及び０．０１％のTween20で洗浄した後、ＩｇＧアイソタイプ特異的検出抗体、即ち、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡ（ｐＨ７．４）中２０μg/mLでAlexa Fluor（登録商標）４８８色素（A21121、A21131又はA21141、Molecular Probes）に共有結合しているアフィニティー精製ヤギ抗マウスIgG1、IgG2a又はIgG2bと共に１時間スライドをインキュベートした。０．０１％のTween20を含むＰＢＳで洗浄した後、５μg/mLの抗ｐタウ抗体（ＡＴ−８、Pierce Biotechnology）、即ち、Alexa Fluor（登録商標）５５５色素に共有結合したタウタンパク質におけるリン酸化S202/S205エピトープに対するマウスモノクローナル抗体で標識し、１時間１％のウシ血清アルブミン、１％のオバルブミン及び１％の正常ヤギ血清を含むＰＢＳに適用することによってｐタウの局在を評価した。０．０１％のTween20を含むＰＢＳで洗浄した後、５分間ＰＢＳ中の１μg/mLの４，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（DAPI）で細胞核を対比染色した。０．０１％のTween（登録商標）20を含むＰＢＳで洗浄した後、５０mMの酢酸アンモニウム中４mMのCuSO4（ｐＨ５）において３０分間インキュベートしてクエンチすることによって、リポフスチンの自己蛍光を低下させた。再蒸留水でスライドをすすぎ、そしてＰＢＳ及び０．０１％のTween（登録商標）20で最後に洗浄した後、蛍光封入剤（S3023 DakoCytomation, High Wycombe, UK）でスライドを包埋した。ピンホールが１Airyに設定されたLeica SP2, AOBS共焦点レーザー走査顕微鏡で記録された、重複していない放射チャネルにおける最大投影像（Maximum projection image）を連続して記録した。
【０１４０】
２４月齢のタウPS2APPマウスにおいて実質的なｐタウ病変がみられた。典型的に、細胞内のタウpS422について強陽性である幾つかのニューロンは、海馬のＣＡ１領域の前頭前皮質及び錐体細胞層内、及び隣接する鉤状回にみられた。この月齢では、ｐタウは、多形細胞層に広がり、そして、海馬白板に沿ってＣＡ３及びフィンブリア領域、そして分界条へも広がっていることが分かった。
【０１４１】
２４月齢のタウPS2APPマウスの海馬体からの前頭前皮質及びＣＡ１領域における免疫染色を共焦点顕微鏡画像（図１〜６）で示す。明らかに、細胞内ｐタウ及び投与されたＩｇＧサブタイプ抗体を検出可能であり、実質的なｐタウ病変を含む脳領域の細胞に共局在していることが見出された。細胞内のIgG1局在についての例示を、ビヒクル対照（図２）と共に図１、３、及び４に示す。幾つかの細胞でIgG2a陽性細胞（図５）及びIgG2b（図６）もみられた。ｐタウ陽性細胞のうちの幾つかは、ＡＤ患者の脳組織の変性ニューロンでみられる神経原線維変化に類似する典型的な神経原線維の形態を示した。マウスＩｇＧサブタイプ抗体、特にIgG1及びｐタウの共局在した免疫反応性が、樹状突起、典型的には海馬体のＣＡ１領域の前頭前皮質及び顆粒細胞層において観察された（図３及び４）。
【０１４２】
試験した抗タウpS422抗体は全て、細胞内ｐタウ沈着物に対する特異的結合を示した。しかし、表３に示されるように、３つのＩｇＧアイソタイプ間で結合の程度は異なっていた。
【０１４３】
【表３】
表中、Ｘ＝軽度、ＸＸ＝中等度、及びＸＸＸ＝強いＩＨＣ反応性である。
【０１４４】
実施例９
抗タウpS422モノクローナル抗体による長期間処理がアルツハイマー病のマウスモデルにおけるタウ病変を減少させる
マウス抗タウpS422 Mabがアルツハイマー病マウスのマウスモデルにおけるタウ病変を減少させる能力について、タウ.PS2APPトリプルトランスジェニックマウスに前記抗体を４ヶ月間にわたって投与することにより試験する。したがって、２０匹のタウ.PS2APPトリプルトランスジェニックマウスの群（７月齢）を、マウス抗タウpS422Mab（クローン２．１０．３）のｉｐ投与によって週１回処理する。最終用量が２０mg/kgになるようにビヒクル（２０mMのヒスチジン、１４０mMのNaCl（ｐＨ６．０））中２mg/mLの濃度で抗体を投与する。２０匹のトリプルトランスジェニックのマウスの第２の群には、等体積のビヒクルを投与する。４か月後に、マウスを全て屠殺し、実施例５に記載されている通り脳を摘出した。次いで、脳をそれぞれ２つの半球に分割し、そのうち１つを、実施例５に記載されている通り免疫組織化学法用に調製する。第２の半球は、下記のようなイムノアッセイによりｐタウ量を定量するために使用する。
【０１４５】
１． タウ及びｐタウアッセイのためのマウス脳の抽出
脳を計量し、２５mMのTrisCl、８００mMのNaCl、１０％のスクロース（ｐＨ７．５）を含む氷冷バッファ１０体積中にてガラスホモジナイザーを用いてホモジネートする。次いて、２０，０００×ｇでホモジネートを遠心分離する。得られる上清を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／１％Tween（登録商標）20で１：１００（タウアッセイの場合）又は１：１０（ｐタウアッセイの場合）に希釈する。
【０１４６】
２． タウ及びｐタウのアッセイ
Meso Scale Discovery（商標）アッセイプラットフォーム（MSD, Gaithersburg, Maryland, USAMD）を使用して全てのアッセイを行った。ＭＳＤによって提供される標準プロトコールに従って、捕捉抗体及び検出抗体をそれぞれビオチン及びSULFO-Tag（商標）で標識する。以下の抗体をアッセイで使用した：（ｉ）Johnson, G.V. et al., J. Neurochem 68 (1997) 430-433に記載されている、タウのアミノ酸１９〜４６に対するマウス抗体である５Ａ６；（ii）タウのｐＴ２３１に対して検出されたマウス抗体であるＡＴ１８０［Innogenetics, Belgium］；（iii）EP1876185A1に記載されているマウス抗タウpS422クローン２．５．２；（iv）完全長タウに対するマウス抗タウクローン４／５３。捕捉抗体として抗体５Ａ６を使用し、残りの抗体は検出抗体として使用する。
【０１４７】
ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルＭＳＤプレートを５％のＢＳＡでＲＴにて１時間ブロッキングする。洗浄バッファ（ＰＢＳ、０．０５％のTween（登録商標）20）でプレートを３回洗浄する。次いで、アッセイバッファ（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／１％Tween（登録商標）20）で希釈した捕捉抗体を添加し、そして、プレートを３０分間４℃でインキュベートした。続いてプレートを１回洗浄する。次いで、７５μLのアッセイバッファを各ウェルに添加し、次いで、２５μLの希釈した脳上清及び２５μLのSulfoタグ付検出抗体を添加した。１時間４℃でプレートを振盪し、続いて、１回洗浄した。最後に、１７０μLのＭＳＤリードバッファを添加し、MSD Sector Imager 6000でプレートを読み取った。
【０１４８】
マウス脳抽出物におけるタウ及びタウpS422を定量するために、実施例２に記載されているように調製されたタウ及びタウpS422を使用して検量線を作成した。
【０１４９】
抗タウpS422モノクローナル抗体で長期間処理することによるタウ.PS2APPトリプルトランスジェニックマウスのタウ病変の減少は、同月齢のビヒクル処理マウスと比べて、１１月齢の抗体で処理されたマウスで典型的なタウ病変の減少が観察されたことによって証明される。この減少は、免疫組織化学によって検出される神経原線維変化量の減少、及び定量的イムノアッセイによって測定される脳抽出物中に存在する様々なｐタウ種の量の減少によって表される。
【０１５０】
実施例１０
ウサギ抗体の調製及び精製
ａ）免疫
Charles River Laboratories International, Inc製のＮＺＷウサギを免疫に使用した。ＫＬＨにカップリングしたリンペプチドタウ(416-430)[pS422]を１mg/mLの濃度でK3PO4バッファ（ｐＨ７．０）に溶解させ、安定なエマルションが生成されるまで完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合した（１：１）。３匹のウサギに、２mLのエマルションを皮内（i.d.）注射し、次いで、１週間間隔でそれぞれ１mLを２回目は筋肉内（i.m.）、３回目は皮下（s.c.）に注射した。４回目の１mLのi.m.注射を２週間後に実施し、次いで、４週間間隔で１mLのs.c.注射を更に２回行った。各動物の末梢全血サンプル１０mLを３、４、５、及び６回目の注射の４〜６日後に採取し、ＦＡＣＳにおける単一細胞選別に用いた。同時に各動物から更に０．５mLの血清を採取し、タウ(416-463)[pS422]に特異的な抗体応答の決定に使用した。
【０１５１】
ｂ）抗体応答
ELISAを用いて血清の連続希釈物によって免疫に対する抗体応答を決定し、ここでは、予めストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレート（MC1347, Micro Coat Biotechnologie GmbH, Bernried, Germany）上で一晩４℃にて１×ＰＢＳ中において、１ウェルあたり３０ngのビオチン化タウ(416-430)[pS422]をインキュベートした。検出については、ワサビペルオキシダーゼ（The Jackson laboratory）に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧを１：１６０００希釈して使用した。可視化のために、Roche Diagnostics GmbH製の既製溶液であり、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を沈殿させるBM Blue POD Substratを使用した。１ＮのＨＣｌを用いて反応を停止させ、４５０／６９０nmでTecan製Infiniteによって測定した。
【０１５２】
ｃ）Ｂ細胞クローニング
プレートのコーティング
無菌のストレプトアビジンコーティングされた６ウェルプレート（細胞培養グレード）を、１時間室温で、それぞれＰＢＳ中０．５〜１μg/mLの濃度の３つのビオチン化された対照ペプチド（非リン酸化タウ(416-430)、MCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]及びＭＡＰ２＿ヒト(1802-1816)[pSer-1802]）の混合物又はビオチン化リンペプチドタウ(416-430)[pS422]と共にインキュベートした。使用前に無菌ＰＢＳでプレートを３回洗浄した。４℃で一晩、炭酸塩バッファ（０．１Ｍの重炭酸ナトリウム、３４mMの炭酸水素二ナトリウム、ｐＨ９．５５）中２μg/mLのＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）で細胞培養用６ウェルプレートをコーティングした。使用前に無菌ＰＢＳでプレートを３回洗浄した。
【０１５３】
ウサギ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
ウサギＰＢＭＣを単離するために実施したlympholyte mammal (Cedarlane Laboratories)による密度遠心分離の前に、１×ＰＢＳでEDTA含有全血を２倍に希釈した。抗体で染色する前に２回ＰＢＭＣを洗浄した。
【０１５４】
ＥＬ−４ Ｂ５培地
１０％のＦＣＳ(Hyclone, Logan, UT, USA)、２mMのグルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（PAA, Pasching, Austria）、２mMのピルビン酸ナトリウム、１０mMのHEPES（PAN Biotech, Aidenbach, Germany）及び０．０５mMのベータ−メルカプトエタノール(Gibco, Paisley, Scotland)を添加したRPMI 1640（Pan Biootech, Aidenbach, Germany）。
【０１５５】
マクロファージ／単球の枯渇
無菌６ウェルプレート（細胞培養グレード）を使用して、非特異的な付着によってマクロファージ及び単球を枯渇させた。ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）か又はストレプトアビジン及び対照ペプチドのいずれかでウェルをコーティングした。各ウェルに最大４mLの培地及び免疫したウサギの６×１０６以下の末梢血単核細胞を充填し、インキュベータにおいて３７℃で１時間結合させた。パニング工程のために上清中の細胞の５０％を使用した；残りの５０％の細胞は、免疫蛍光染色及び単一細胞選別に直接供した。
【０１５６】
ペプチドにおけるＢ細胞のパニング
６ウェル組織培養プレートをストレプトアビジン及びビオチン化されたペプチドタウ(416-430)[pS422]でコーティングし、４mLの培地につき６×１０６以下の細胞になるように播種し、インキュベータにおいて３７℃で１時間結合させた。１×ＰＢＳで１〜２回ウェルを慎重に洗浄することにより、非付着細胞を除去した。インキュベータにおいて３７℃で１０分間、トリプシンによって残りの粘着性細胞を剥がし、次いで、培地で２回洗浄した。免疫蛍光染色まで細胞を冷凍しておいた。
【０１５７】
免疫蛍光染色及び単一細胞選別
単一細胞選別に使用した抗ウサギIgG FITCは、AbD Serotec (STAR121F, Dusseldorf, Germany)製であった。表面の染色については、枯渇及びパニング工程から得られた細胞を暗条件下の４℃の冷温室で回転させながら、３０分間ＰＢＳ中で抗ウサギIgG FITC抗体と共にインキュベートした。遠心分離後、吸引によって上清を除去した。ＰＢＭＣを２サイクルの遠心分離に供し、氷冷ＰＢＳで洗浄した。最後に、氷冷ＰＢＳにＰＢＭＣを再懸濁させ、直ちにＦＡＣＳ分析に供した。死細胞と生細胞とを識別するために、ＦＡＣＳ分析前に５μg/mLの濃度のヨウ化プロピジウム（BD Pharmingen, San Diego, CA, USA）を添加した。FACSDivaソフトウェア(BD Biosciences, USA)を備えるBecton Dickinson FACSAriaを用いてＦＡＣＳを実施したところ、ＦＩＴＣで標識された生細胞が１個、９６ウェルプレートに付着した。
【０１５８】
Ｂ細胞の培養
Zubler, R.H. et al., J Immunol. 134 (1985) 3662-3668によって記載されている方法に類似の方法によってＢ細胞培養物を調製した。簡潔に述べると、インキュベータにおいて５％ＣＯ２雰囲気、３７℃で７日間、Pansorbin細胞（１：２００００）(Calbiochem (Merck), Darmstadt, Deutschland)、５％のウサギ胸腺細胞上清及びガンマ線を照射したEL-4 B5マウス胸腺腫細胞（２×１０４／ウェル）を含む２１０μL／ウェルのEL-4 B5培地と共に、単一選別されたＢ細胞を９６ウェルプレートで培養した。スクリーニングのためにＢ細胞培養液上清を除去し、そして、可変領域遺伝子クローニングのために直ちに細胞を収集したか、又は１００μLのＲＬＴバッファ(Qiagen, Hilden, Germany)中にて−８０℃で凍結させた。
【０１５９】
ｄ）Ｂ細胞クローンのスクリーニング
ELISAによって、ビオチン化されたタウ(416-430)[pS422]に対する結合についてＢ細胞培養液上清をスクリーニングした。対照抗原として非リン酸化タウ(416-430)、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）及び無関係なリンペプチドMCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]を使用した。ELISAプレートの調製については、室温で１時間５０ng/mLのビオチン化されたタウ(415-430)[pS422]と共に、ストレプトアビジンで予めコーティングされたマイクロタイタープレートをインキュベートした。ＫＬＨ又は対照のペプチドによるコーティングは、１μg/mLで行った。Ｂ細胞上清を１：５〜１：１０で希釈し、６０分間、抗原でコーティングされたマイクロタイタープレートにおいてインキュベートした。激しく洗浄した後、ヒツジ抗ウサギＩｇＧジゴキシゲニンがコンジュゲートした検出抗体（Chemicon AQ301D）を使用して、ウサギ抗体の結合を検出した。室温でＴＭＢと共にインキュベートした後、３７０nm〜４９２nmで吸光度を測定した。ビオチン化タウ(416-430)[pS422]ではバックグラウンドを超えるシグナルが得られたが、ＫＬＨ及びMCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]では得られなかったＢ細胞クローンを更に検討し、可変領域遺伝子クローニングに供した。
【０１６０】
ｅ）ＶドメインのＰＣＲ増幅及び配列決定
製造業者のプロトコールに従ってNucleoSpin（登録商標）8/96 RNA kit (Macherey&Nagel;740709.4, 740698)を使用して、全ＲＮＡを調製した。工程は全てepMotion 5075液体ハンドリングシステム（Eppendorf）で行った。６０μLのRNase不含水でＲＮＡを溶出した。製造業者の指示に従ってSuperscript III First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen 18080-400)及びoligo dT−プライマーを使用して、逆転写酵素反応によってｃＤＮＡを生成するために６μLのＲＮＡを使用した。重鎖にはプライマーrbHCfinal.up及びrbHCfinal.do、軽鎖にはrbLCfinal.up及びrbLCfinal.doを使用して（表４）、最終体積５０μLのAccuPrime Supermix(Invitrogen 12344-040)で免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を増幅するために４μLのｃＤＮＡを使用した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９４℃で５分間ホットスタート；９４℃で２０秒間、７０℃で２０秒間、６８℃で４５秒間を３５サイクル、及び６８℃で７分間最終伸長。
【０１６１】
【表４】
【０１６２】
48E-Gel 2%(Invitrogen G8008-02)に５０μLのＰＣＲ溶液のうち８μLをロードした。製造業者のプロトコールに従ってNucleoSpin（登録商標）Extract IIキット（Macherey&Nagel;740609250）を使用して陽性ＰＣＲ反応物を精製し、５０μLの溶出バッファに溶出した。１２μLの精製ＰＣＲ生成物を、重鎖にはrbHCfinal.up及びrbHCfinal.do、軽鎖にはrbLCfinal.up及びrbLCfinal.doを使用して（表４）、両方向に直接配列決定した。
【０１６３】
ｄ）ウサギモノクローナル抗体及びウサギ／マウスキメラ抗体の組み換え発現
ウサギモノクローナル抗体の組み換え発現については、オーバーハングクローニング法（Haun, R.S. et al., Biotechniques 13 (1992) 515-518; Li, M.Z., et al., Nature Methods 4 (2007) 251-256）によってＶＨ又はＶＬをコードするＰＣＲ生成物をｃＤＮＡとして発現ベクターにクローニングした。重複するプライマーを使用するＰＣＲによって、ＶＨ挿入物のウサギのカッパ又はガンマ定常領域及びＶＬをコードする線形化された発現プラスミドを増幅させた。一本鎖オーバーハングを生成するＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと共に精製されたＰＣＲ生成物をインキュベートした。ｄＣＴＰを添加することにより反応を停止させた。次の工程で、プラスミド及び挿入物を組換え、部位特異的組換を誘導するｒｅｃＡと共にインキュベートした。組換えされたプラスミドをE.coliに形質転換した。翌日、増殖したコロニーを取り、プラスミド調製、制限解析及びＤＮＡ配列決定によって正確な再結合されたプラスミドについて試験した。抗体発現については、単離されたＨＣ及びＬＣプラスミドを一過的にHEK293細胞へコトランスフェクトし、１週間後に上清を収集した。ウサギマウスキメラ抗体のクローニング及び発現については、ＰＣＲによってＶＨ及びＶＬの領域を増幅し、マウス定常カッパ又はマウス定常ガンマ１領域を含む発現ベクターへサブクローニングした。ウサギ／マウスキメラＨＣ及びＬＣプラスミドを単離し、正確に挿入するために制限解析及びＤＮＡ配列決定によって試験し、HEK293細胞へ一過的にコトランスフェクトした。トランスフェクションの１週間後に上清を収穫した。
【０１６４】
ｅ）抗体精製
組換え発現したウサギ抗体をMabSelectSuRe（商標）カラム(GE Healthcare)で細胞培養上清から精製した。サンプルをカラムにロードする前に、２５mmol/LのTris-HCl、２５mmol/LのNaCl（ｐＨ７．４）でカラムを平衡化した。５０mmol/Lの酢酸塩（ｐＨ３．１４）で抗体を溶出した。溶出されたサンプルを直ちに脱塩カラム（Sephadex G25, GE Healthcare）にロードし、２０mmol/LのHis-HCl、１４０mmol/LのNaCl（ｐＨ６．０）に溶出した。精製された抗体の保存にもこのバッファを使用した。一般的な保存温度は４℃であり、精製工程後は室温であり、分注後は−８０℃であった。細胞培養上清から得られた組換え発現したウサギ／マウスキメラ抗体をMabSelectSuRe(商標)カラム(GE Healthcare)で精製した。サンプルをロードする前に、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でカラムを平衡化した。１００mmol/Lのクエン酸塩（ｐＨ３．０）で抗体を溶出した。溶出されたサンプルを直ちに２mol/LのTris/HCl（ｐＨ９．０）で中和した。サイズ排除カラム(Superdex 200, GE Healthcare)に抗体をロードした後、２０mmol/LのHis-HCl、１４０mmol/LのNaCl（ｐＨ６．０）に溶出した。精製された抗体の保存にもこのバッファを使用した。一般的な保存温度は４℃であり、精製工程後は室温であり、分注後は−８０℃であった。
【０１６５】
実施例１１
抗タウpS422モノクローナルウサギ抗体は、pS422がリン酸化されたタウに対して高度に選択的であり、タウpS422の原線維状凝集体に結合する
ａ）ELISA
HEK293細胞においてウサギモノクローナル抗体を組み換え発現させた。ELISAにより、ビオチン化タウ(416-430)[pS422]、非リン酸化タウ(416-430)、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）及び無関係なリンペプチドMCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]に対する結合について、細胞培養上清又は精製されたウサギ抗体を試験した。ELISAプレートの調製については、室温で１時間５０ng/mLのビオチン化タウ(415-430)[pS422]と共に、ストレプトアビジンで予めコーティングされたマイクロタイタープレートをインキュベートした。ＫＬＨ又は対照ペプチドによるコーティングは、１μg/mLで行った。様々な濃度で６０分間、抗原で標識されたマイクロタイタープレートにおいて、ウサギ抗タウpS422抗体（Abcam AB51071）又は上清を含有しているウサギ抗体をインキュベートした。激しく洗浄した後、ヒツジ抗ウサギＩｇＧジゴキシゲニンがコンジュゲートした検出抗体（Chemicon AQ301D）を使用して、ウサギ抗体の結合を検出した。室温でＴＭＢと共にインキュベートした後、３７０nm〜４９２nmで吸光度を測定した。ＥＣ５０値によって抗体結合の特性評価を行った。ビオチン化タウ(416-430)［pS422］及び非リン酸化タウ(416-430)ペプチドに対する抗体結合を、そのＥＣ５０値によって特性評価した。高濃度、即ち、１：５で希釈された細胞培養上清における一点測定によって、ＫＬＨ又はMCAKリンペプチドの交差反応性を推定した。結果を表５に示す。リンタウペプチドに対する結合のＥＣ５０値は、タウペプチドに対する結合のＥＣ５０値の１００分の１未満であることが見出され、これは、非リン酸化タウペプチドに比べてリン酸化タウ断片に対する選択性が少なくとも１００位であることを示唆する。ＫＬＨ及びMCAK対照リンペプチドに対する結合は、全ての抗体でバックグラウンドレベルであり、これは、タウリンペプチドの最大値測定の約１＜３％である。
【０１６６】
【表５】
【０１６７】
可溶性であり、そして凝集した完全長タウpS422に対する特異性も試験した。室温で一晩、タウpS422（３００μg/mL）の原線維状凝集体をポリスチレン系MaxiSorbマイクロタイタープレート（Nunc）にコーティングした。同様の方法で、MaxiSorbマイクロタイタープレートに可溶性の完全長タウ及びタウpS422をコーティングした。ウサギ抗タウpS422抗体対照（Abcam AB51071）又は精製されたウサギ抗体を添加し、そして、１０００ng/mL以下の濃度で６０分間インキュベートした。激しく洗浄した後、ヒツジ抗ウサギＩｇＧジゴキシゲニンがコンジュゲートした検出抗体（Chemicon AQ301D）を使用して、ウサギ抗体の結合を検出した。室温でＴＭＢと共にインキュベートした後、３７０nm〜４９２nmで吸光度を測定した。ＥＣ５０値によって抗体結合の特性評価を行った。結果を表６に示す。
【０１６８】
【表６】
【０１６９】
ウサギモノクローナル抗体は、１ng/mL未満のＥＣ５０値でタウ−pS422タンパク質に結合した。０．４ng/mL〜１４ng/mLのＥＣ５０値で原線維状タウpS422を検出した。非リン酸化の完全長タウタンパク質に対する結合のシグナルは、バックグラウンドレベルと判別不可能であった。したがって、タウと比較して、少なくとも１００倍の選択性で、それぞれの抗体がタウpS422及び原線維状タウpS422に結合すると評価された。
【０１７０】
ｂ）Biacore（商標）
BIAcore（商標）分析によって、原線維状タウpS422凝集体に対する結合について更に調べ、確認した。３７℃でBIAcore 3000機器を使用して測定を行った。システム及びサンプルのバッファは、HBS-EP（１０mMのHEPES、１５０mMのNaCl、３．４mMのEDTA、０．００５％のポリソルベート２０(v/v)）であった。BIAcore（商標）ＣＭ５センサチップをプレコンディショニング手順に供した。連続して、フローセルＦＣ１、ＦＣ２、ＦＣ３及びＦＣ４上に３０秒間０．１％のＳＤＳ、５０mMのNaOH、１０mMのＨＣｌ及び１００mMのH3PO4を注入した。アミンカップリング手順は、BIAcore 3000（商標）ウィザードｖ．４．１を使用して、製造業者の指示に従って行った。センサ表面をＥＤＣ／ＮＨＳで活性化した後、センサのフローセルＦＣ２、ＦＣ３及びＦＣ４上に非リン選択性抗タウ抗体mAb<TAU>M-4/53-IgGを固定化した。対照として、無関係の抗原を認識するCK-MM（クレアチンキナーゼアイソタイプ）に対する抗体をＦＣ１上に捕捉した。１０mMのＮａＡｃ（ｐＨ５．０）中３０μg/mLになるようにmAb<TAU>M-4/53-IgG及びCK-MMに対する抗体を希釈し、１０．０００ＲＵの抗体捕捉系を固定化するために、７分間の接触時間で１０μL／分にて注入した。１Ｍエタノールアミンで飽和させることによって表面を不活化した。２分間１０μL／分で溶液中のアナライトとしてリン酸化線維状タウタンパク質（原液０．３mg/mLをHBS-EPで１：１００に希釈した）を用いて５サイクル、センサをコンディショニングした。３分間、３０μL／分で１０mMのグリシン（ｐＨ２．５）で再生を行った。mAb 4/53からのｐタウ線維の解離を観察することができなかったので、mAb 4/53に対するアナライトの結合はｐタウ線維を解離させないと仮定する。全ての更なる測定サイクルについては、０．３mg/mLのｐタウ線維をHBS-EPバッファで１：１００に希釈し、不均一なサンドイッチ法において各抗体アナライトにｐタウを提示するために、１分間、１０μL／分で注入した。抗体アナライトをHBS-EPバッファで１００nMの濃度に希釈し、３分間２０μL／分で系に注入した。３分間の解離後、１００μL／分で１分間、１０mMのグリシン（ｐＨ２．５）を２回注入し、次いで、１００μL／分で１５秒間ＨＢＳで洗浄することによってセンサ表面を再生した。相互作用の会合及び解離相をモニタした。溶液中の抗体アナライトが二価であるので、アビディティに重み付けした（avidity-burdened）抗体―ｐタウカイネティクスを、速やかな親和性に基づく早期解離工程と、後半の錯体解離におけるアビディティは安定化しているが、律速であるカイネティック工程からなる二相解離モデルによって特性評価した。アナライト注入が終了した１０秒後（早期）及び５０秒後（後期）、可能な場合ｋｄ及びｔ／２ ｄｉｓｓを定量した。ダブルレファレンシング手順を使用して、カイネティクス測定値を評価した。先ず、ＦＣ１レファレンスからのシグナルを減じて、バッファの溶液効果及び非特異的結合を補正した。次に、０nMのアナライト注入を減じて、それぞれの捕捉系からの一次抗体の解離を補正した。Biacore（商標）評価ソフトウェアｖ．４．１に従ってラングミュア１．１解離適合モデルを使用して、反応速度を評価した。式ｌｎ（２）／６０×ｋｄに従って抗原／抗体複合体安定半減期（分）を計算した。
【０１７１】
結果を表７に要約する。
【０１７２】
【表７】
【０１７３】
実施例１２
アルツハイマー病患者の脳切片における細胞内ｐタウに対する抗タウpS422モノクローナルウサギ抗体の結合
ＡＤ患者のヒト脳組織の低温切片を用いる免疫蛍光染色実験によって、モノクローナルウサギ抗タウpS422抗体によるアルツハイマー病脳組織のｐタウ病変の免疫組織化学的検出の特異性及び感受性について調べた。この手順は基本的に実施例Ｘ（マウス抗体）に記載されているのと同じ手順であった。ヤギ抗ウサギAlexa Fluor488（登録商標）をコンジュゲートした二次抗体（Invitrogen/MolecularProbes A11034）によってウサギＩｇＧを検出した。ｐタウ沈着物及び線維は、クローンMab005、Mab019、Mab020、Mab085、Mab086及びMab097についての特異的且つ高感度に染色されていることが明らかである。大きな神経原線維変化及び細長い糸屑状構造物のような、細胞内のｐタウ沈着が顕著である。調査したクローン全てについて最小有効濃度は０．０８〜０．０１６μg/mLであると測定され、これは、純粋なヒトｐタウ沈着物に対して高感度で結合することを示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脳疾患を治療するための、配列番号９で表されるリン酸化タウ断片（pS422）に特異的に結合する抗体の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ヒトタウ（微小管結合タンパク質タウ（神経原線維変化タンパク質、対らせん状線維−タウ、ＰＨＦ−タウ）は、軸索で主にみられ、チューブリン重合を促進し、そして微小管を安定させる機能を有するニューロンの微小管結合タンパク質である。ヒト脳では、６つのアイソフォーム（アイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、胎児−タウ）がみられ、最長のアイソフォームは、４４１アミノ酸を含む（アイソフォームＦ、Uniprot P10636-8）。タウ及びその特性については、Reynolds, C.H. et al., J. Neurochem. 69 (1997) 191-198にも記載されている。
【０００３】
過剰リン酸化タウは、アルツハイマー病（ＡＤ）脳における神経原線維病変の構成要素である対らせん状線維（ＰＨＦ）の主成分である。タウは、ＧＳＫ３ベータ、ｃｄｋ５、ＭＡＲＫ及びＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーを含む幾つかの異なるキナーゼによって、そのセリン残基又はトレオニン残基がリン酸化され得る。
【０００４】
タウオパシーは、タウの異常な過剰リン酸化を特徴とし、Iqbal, K. et al. (Biochimica et Biophysica Acta (BBA) 1739 (2005) 198-210)によれば以下：
・神経原線維型を含むアルツハイマー病
・ダウン症候群、成人症例
・グアムパーキンソン認知症複合
・ボクサー認知症
・ピック病
・嗜銀顆粒性認知症
・前頭側頭型認知症
・皮質基底核変性症
・淡蒼球−橋−黒質変性（Pallido-ponto-nigral degeneration）
・進行性核上性麻痺
・神経原線維変化を伴うゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病
のものである。
【０００５】
これまでに、アルツハイマー病脳のタウにおいて約４０個のセリン（Ｓ）／スレオニン（Ｔ）リン酸化部位が見出されている（Hanger, D.P. et al., J. Biol. Chem 282 (2007) 23645-23654）。アルツハイマー病におけるタウ病変の発現は、そのリン酸化状態に関係する。しかし、４０個のリン酸化部位のうちのほとんどは、健常な胎児脳組織から抽出されたタウでもみられるので、疾患の病態には関係していない。ほんの少数のリン酸化が病状に特有であり、アルツハイマー病脳のＰＨＦにおけるタウを定義付ける異常で特徴的な不溶性及び凝集に関与していると推測される（Morishima-Kawashima, M. et al., J. Biol. Chem 270 (1995) 823-829）。Pei, J.J. et al., Journal of Alzheimer's Disease 14 (2008) 385-392によれば、既存文献は、これら部位のうちのどの部位がＡＤ脳に特異的であるかに関して、限定された不明瞭な情報しか提供していない。Peiは、タウに対するリン酸化部位特異的抗体のリストを使用し、２２個のＡＤ及び１０個の対照の内側側頭葉のホモジネートにおいてそれらの量を測定した。
【０００６】
Bussiere, T. et al. (Acta Neuropathol. 97 (1999) 221-230)には、タウタンパク質におけるリン酸化セリン４２２が神経原線維変性を伴う幾つかの疾患でみられる病理学的エピトープであると記載されている。Augustinack, J.C. et al., (Acta Neuropathol 103 (2002) 26-35)には、pS422がアルツハイマー病における神経病変の重篤度と相関していると記載されている。Guillozet-Bongaarts, A. (J. Neurochem 97 (2006) 1005-1014)には、S422におけるタウのリン酸化がＰＨＦの成熟過程の一部であると記載されている。また、タウpS422は、アルツハイマー病の様々なトランスジェニックマウスモデルにおける病変の発現と関連していることが見出されている。したがって、Deters, N.らは、Biochem. Biophys. Res. Commun. 379 (2009) 400-405にて、ダブルトランスジェニックDom5/pR5マウスにおいて病理学的S422エピトープが特異的にリン酸化されているタウを含む海馬ニューロン数が７倍増加したと述べている。Goetz, J. et al. (Science 293 (2001) 1491-1495)は、Abeta42原線維を注射されたタウP301Lトランスジェニックマウスの脳において、S422がリン酸化されているタウが出現したことを報告した。
【０００７】
EP 2 009 104は、アルツハイマー病ＰＨＦのタウタンパク質のリン酸化状態で生じるタウタンパク質のエピトープ、及びアルツハイマータウタンパク質を特異的に検出する抗体を産生するための前記エピトープの使用に関する。WO 2002/062851及びUS 7,446,180は、異常に切断された形態のタウタンパク質に対して特異性を有する抗体、並びにアルツハイマー病及び関連するタウオパシーに関する診断的局面及び治療的局面に関する。
【０００８】
WO 98/22120は、リン酸化タウ断片のアミノ酸約２０７〜約２２２、アミノ酸約２２４〜約２４０、及びアミノ酸約３９０〜約４０８に対する抗体を患者に投与する工程を含むアルツハイマー病患者を治療する方法に関する。Asuni, A.A. et al., J. Neuroscience 27 (2007) 9115-9129には、リン酸化タウ断片３７９〜４０８［P-Ser396,404］を用いてタウトランスジェニックマウスにワクチン接種する動物実験にについて述べられている。US 2008/0050383は、タウタンパク質断片を投与することにより被験体のアルツハイマー病又は他のタウオパシーを治療及び予防する方法に関する。
【０００９】
例えば、EP 1 876 185には、タウpS422に対するモノクローナル抗体が記載されている。タウpS422に対するポリクローナル抗体は市販されている（例えば、ProSci Inc.及びBiosource International）。
【００１０】
発明の概要
本発明は、タウオパシーの治療で使用するための、リン酸化タウ断片Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp（配列番号９）及びタウpS422には特異的に結合するが、タウ及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片には結合しないことを特徴とする、セリン４２２がリン酸化されているタウ（タウpS422）に結合する抗体、並びにこのような治療方法を含む。
【００１１】
本発明は、タウオパシーを治療する医薬を製造するための、配列番号９で表されるリン酸化タウ断片及びタウpS422には特異的に結合するが、タウ及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片には結合しないことを特徴とする、セリン４２２がリン酸化されているタウ（タウpS422）に結合する抗体、並びにこのような製造方法を含む。
【００１２】
本発明は、Mab2.10.3（抗タウpS422抗体）が結合するのと同じエピトープに特異的に結合することを特徴とする、リン酸化タウに結合する抗体を含む。
【００１３】
本発明は、タウオパシーの治療で使用するための、又はタウオパシーを治療する医薬の製造を製造するための、Mab2.10.3（抗タウpS422抗体）が結合するのと同じエピトープに特異的に結合することを特徴とする、リン酸化タウに結合する抗体の使用を含む。
【００１４】
本発明に係る抗体は、タウpS422及び凝集した（原線維状）リン酸化タウに特異的に結合する。本発明に係る抗体は、非リン酸化タウ、配列番号１０で表される非リン酸化タウ断片、及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片には結合しない。
【００１５】
本発明に係る抗体は、好ましくはヒトIgG1サブタイプである。本発明の更なる態様では、本発明に係る抗体は、好ましくはヒトIgG4サブタイプである。
【００１６】
本発明は、以下：
ａ）配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、及び配列番号８で表されるCDR3H、
ｂ）配列番号２３で表されるCDR1H、配列番号２４で表されるCDR2H、及び配列番号２５で表されるCDR3H、
ｃ）配列番号３１で表されるCDR1H、配列番号３２で表されるCDR2H、及び配列番号３３で表されるCDR3H、
ｄ）配列番号３９で表されるCDR1H、配列番号４０で表されるCDR2H、及び配列番号４１で表されるCDR3H、
ｅ）配列番号４７で表されるCDR1H、配列番号４８で表されるCDR2H、及び配列番号４９で表されるCDR3H、
ｆ）配列番号５５で表されるCDR1H、配列番号５６で表されるCDR2H、及び配列番号５７で表されるCDR3H、又は
ｇ）配列番号６３で表されるCDR1H、配列番号６４で表されるCDR2H、及び配列番号６５CDR3H
を含むことを特徴とする抗タウpS422抗体を含む。
【００１７】
好ましくは、前記抗体は、以下：
ａ）配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、配列番号８で表されるCDR3H、及び配列番号３で表されるCDR1L、配列番号４で表されるCDR2L、配列番号５で表されるCDR3L、
ｂ）配列番号２３で表されるCDR1H、配列番号２４で表されるCDR2H、配列番号２５で表されるCDR3H、及び配列番号２７で表されるCDR1L、配列番号２８で表されるCDR2L、配列番号２９で表されるCDR3L、
ｃ）配列番号３１で表されるCDR1H、配列番号３２で表されるCDR2H、配列番号３３で表されるCDR3H、及び配列番号３５で表されるCDR1L、配列番号３６で表されるCDR2L、配列番号３７で表されるCDR3L、
ｄ）配列番号３９で表されるCDR1H、配列番号４０で表されるCDR2H、配列番号４１で表されるCDR3H、及び配列番号４３で表されるCDR1L、配列番号４４で表されるCDR2L、配列番号４５で表されるCDR3L、
ｅ）配列番号４７で表されるCDR1H、配列番号４８で表されるCDR2H、配列番号４９で表されるCDR3H、及び配列番号５１で表されるCDR1L、配列番号５２で表されるCDR2L、配列番号５３で表されるCDR3L、
ｆ）配列番号５５で表されるCDR1H、配列番号５６で表されるCDR2H、配列番号５７で表されるCDR3H、及び配列番号５９で表されるCDR1L、配列番号６０で表されるCDR2L、配列番号６１で表されるCDR3L、
ｇ）配列番号６３で表されるCDR1H、配列番号６４で表されるCDR2H、配列番号６５で表されるCDR3H、及び配列番号６７で表されるCDR1L、配列番号６８で表されるCDR2L、配列番号６９で表されるCDR3L
を含むことを特徴とする。
【００１８】
好ましくは、前記抗体は、以下：
ａ）配列番号１で表される可変軽鎖及び配列番号２で表される可変重鎖、
ｂ）配列番号２６で表される可変軽鎖及び配列番号２２で表される可変重鎖、
ｃ）配列番号３４で表される可変軽鎖及び配列番号３０で表される可変重鎖、
ｄ）配列番号４２で表される可変軽鎖及び配列番号３８で表される可変重鎖、
ｅ）配列番号５０で表される可変軽鎖及び配列番号４６で表される可変重鎖、
ｆ）配列番号５８で表される可変軽鎖及び配列番号５４で表される可変重鎖、又は
ｇ）配列番号６６で表される可変軽鎖及び配列番号６２で表される可変重鎖
を含むことを特徴とする。
【００１９】
本発明は、抗タウpS422抗体Mab2.10.3のヒト化変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab2.10.3のキメラ変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab2.10.3のＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。Mab2.10.3は、その可変鎖が配列番号１及び配列番号２で表されることを特徴とする。
【００２０】
本発明は、抗タウpS422抗体Mab005のヒト化変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab005のキメラ変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab005のＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。Mab005は、その可変鎖が配列番号２６及び配列番号２２で表されることを特徴とする。
【００２１】
本発明は、抗タウpS422抗体Mab019のヒト化変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab019のキメラ変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab019のＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。Mab019は、その可変鎖が配列番号３４及び配列番号３０で表されることを特徴とする。
【００２２】
本発明は、抗タウpS422抗体Mab020のヒト化変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab020のキメラ変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab020のＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。Mab020は、その可変鎖が配列番号４２及び配列番号３８で表されることを特徴とする。
【００２３】
本発明は、抗タウpS422抗体Mab085のヒト化変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab085のキメラ変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab085のＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。Mab085は、その可変鎖が配列番号５０及び配列番号４６で表されることを特徴とする。
【００２４】
本発明は、抗タウpS422抗体Mab086のヒト化変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab086のキメラ変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab086のＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。Mab086は、その可変鎖が配列番号５８及び配列番号５４で表されることを特徴とする。
【００２５】
本発明は、抗タウpS422抗体Mab097のヒト化変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab097のキメラ変異体を含む。本発明は、抗タウpS422抗体Mab097のＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。Mab097は、その可変鎖が配列番号６６及び配列番号６２で表されることを特徴とする。
【００２６】
本発明は、配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、配列番号８で表されるCDR3H、及び配列番号３で表されるCDR1L、配列番号４で表されるCDR2L、配列番号５で表されるCDR3L、又は配列番号１で表される可変軽鎖及び配列番号２で表される可変重鎖を含む抗タウpS422抗体のキメラ変異体、ヒト化変異体、又はＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。
【００２７】
本発明は、配列番号２３で表されるCDR1H、配列番号２４で表されるCDR2H、配列番号２５で表されるCDR3H、及び配列番号２７で表されるCDR1L、配列番号２８で表されるCDR2L、配列番号２９で表されるCDR3L、又は配列番号２６で表される可変軽鎖及び配列番号２２で表される可変重鎖を含む抗タウpS422抗体のキメラ変異体、ヒト化変異体、又はＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。
【００２８】
本発明は、配列番号３１で表されるCDR1H、配列番号３２で表されるCDR2H、配列番号３３で表されるCDR3H、及び配列番号３５で表されるCDR1L、配列番号３６で表されるCDR2L、配列番号３７で表されるCDR3L、又は配列番号３４で表される可変軽鎖及び配列番号３０で表される可変重鎖を含む抗タウpS422抗体のキメラ変異体、ヒト化変異体、又はＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。
【００２９】
本発明は、配列番号３９で表されるCDR1H、配列番号４０で表されるCDR2H、配列番号４１で表されるCDR3H、及び配列番号４３で表されるCDR1L、配列番号４４で表されるCDR2L、配列番号４５で表されるCDR3L、又は配列番号４２で表される可変軽鎖及び配列番号３８で表される可変重鎖を含む抗タウpS422抗体のキメラ変異体、ヒト化変異体、又はＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。
【００３０】
本発明は、配列番号４７で表されるCDR1H、配列番号４８で表されるCDR2H、配列番号４９で表されるCDR3H、及び配列番号５１で表されるCDR1L、配列番号５２で表されるCDR2L、配列番号５３で表されるCDR3L、又は配列番号５０で表される可変軽鎖及び配列番号４６で表される可変重鎖を含む抗タウpS422抗体のキメラ変異体、ヒト化変異体、又はＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。
【００３１】
本発明は、配列番号５５で表されるCDR1H、配列番号５６で表されるCDR2H、配列番号５７で表されるCDR3H、及び配列番号５９で表されるCDR1L、配列番号６０で表されるCDR2L、配列番号６１で表されるCDR3L、又は配列番号５８で表される可変軽鎖及び配列番号５４で表される可変重鎖を含む抗タウpS422抗体のキメラ変異体、ヒト化変異体、又はＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。
【００３２】
本発明は、配列番号６３で表されるCDR1H、配列番号６４で表されるCDR2H、配列番号６５で表されるCDR3H、及び配列番号６７で表されるCDR1L、配列番号６８で表されるCDR2L、配列番号６９で表されるCDR3L、又は配列番号６６で表される可変軽鎖及び配列番号６２で表される可変重鎖を含む抗タウpS422抗体のキメラ変異体、ヒト化変異体、又はＴ細胞エピトープ枯渇変異体を含む。
【００３３】
本発明は、配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、配列番号８で表されるCDR3H、及び配列番号３で表されるCDR1L、配列番号４で表されるCDR2L、配列番号５で表されるCDR3L、又は配列番号１で表される可変軽鎖及び配列番号２で表される可変重鎖を含むことを特徴とする、抗タウpS422抗体をヒト化、又はＴ細胞エピトープ枯渇化、又はキメラ化する方法を含む。
【００３４】
本発明は、配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、配列番号８で表されるCDR3H、及び配列番号３で表されるCDR1L、配列番号４で表されるCDR2L、配列番号５で表されるCDR3L、又は配列番号１で表される可変軽鎖及び配列番号２で表される可変重鎖を含むことを特徴とする、抗タウpS422抗体をヒト化、又はＴ細胞エピトープ枯渇化、又はキメラ化する方法を含む。
【００３５】
本発明は、配列番号２３で表されるCDR1H、配列番号２４で表されるCDR2H、配列番号２５で表されるCDR3H、及び配列番号２７で表されるCDR1L、配列番号２８で表されるCDR2L、配列番号２９で表されるCDR3L、又は配列番号２６で表される可変軽鎖及び配列番号２２で表される可変重鎖を含むことを特徴とする、抗タウpS422抗体をヒト化、又はＴ細胞エピトープ枯渇化、又はキメラ化する方法を含む。
【００３６】
本発明は、配列番号３１で表されるCDR1H、配列番号３２で表されるCDR2H、配列番号３３で表されるCDR3H、及び配列番号３５で表されるCDR1L、配列番号３６で表されるCDR2L、配列番号３７で表されるCDR3L、又は配列番号３４で表される可変軽鎖及び配列番号３０で表される可変重鎖を含むことを特徴とする、抗タウpS422抗体をヒト化、又はＴ細胞エピトープ枯渇化、又はキメラ化する方法を含む。
【００３７】
本発明は、配列番号３９で表されるCDR1H、配列番号４０で表されるCDR2H、配列番号４１で表されるCDR3H、及び配列番号４３で表されるCDR1L、配列番号４４で表されるCDR2L、配列番号４５で表されるCDR3L、又は配列番号４２で表される可変軽鎖及び配列番号３８で表される可変重鎖を含むことを特徴とする、抗タウpS422抗体をヒト化、又はＴ細胞エピトープ枯渇化、又はキメラ化する方法を含む。
【００３８】
本発明は、配列番号４７で表されるCDR1H、配列番号４８で表されるCDR2H、配列番号４９で表されるCDR3H、及び配列番号５１で表されるCDR1L、配列番号５２で表されるCDR2L、配列番号５３で表されるCDR3L、又は配列番号５０で表される可変軽鎖及び配列番号４６で表される可変重鎖を含むことを特徴とする、抗タウpS422抗体をヒト化、又はＴ細胞エピトープ枯渇化、又はキメラ化する方法を含む。
【００３９】
本発明は、配列番号５５で表されるCDR1H、配列番号５６で表されるCDR2H、配列番号５７で表されるCDR3H、及び配列番号５９で表されるCDR1L、配列番号６０で表されるCDR2L、配列番号６１で表されるCDR3L、又は配列番号５８で表される可変軽鎖及び配列番号５４で表される可変重鎖を含むことを特徴とする、抗タウpS422抗体をヒト化、又はＴ細胞エピトープ枯渇化、又はキメラ化する方法を含む。
【００４０】
本発明は、配列番号６３で表されるCDR1H、配列番号６４で表されるCDR2H、配列番号６５で表されるCDR3H、及び配列番号６７で表されるCDR1L、配列番号６８で表されるCDR2L、配列番号６９で表されるCDR3L、又は配列番号６６で表される可変軽鎖及び配列番号６２で表される可変重鎖を含むことを特徴とする、抗タウpS422抗体をヒト化、又はＴ細胞エピトープ枯渇化、又はキメラ化する方法を含む。
【００４１】
好ましくは、タウpS422に結合し、そして、上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする抗体は、ヒトIgG1サブタイプである。好ましくは、タウpS422に結合し、そして、上述のアミノ酸配列及びアミノ酸配列断片を特徴とする抗体は、ヒトIgG4サブタイプである。
【００４２】
本発明の更なる態様は、本発明に係る抗体を含む医薬組成物である。
【００４３】
本発明の更なる態様は、医薬組成物を製造するための本発明に係る抗体の使用である。
【００４４】
本発明の更なる態様は、神経原線維型を含むアルツハイマー病（ＡＤ）、ダウン症候群（成人症例）、グアムパーキンソン認知症複合、ボクサー認知症、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、前頭側頭型認知症、皮質基底核変性症、淡蒼球−橋−黒質変性、進行性核上性麻痺、及び神経原線維変化を伴うゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病からなる群より選択されるタウオパシーを治療するための、本発明に係る抗体の使用である。
【００４５】
本発明の更なる態様は、本発明に係る抗体を含む医薬組成物を製造するための方法である。
【００４６】
本発明の更なる態様は、本発明に係る抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードする核酸である。
【００４７】
本発明は、更に、原核生物又は真核生物のホスト細胞において本発明に係る核酸を発現することができる前記核酸を含む発現ベクター、及びこのような抗体の組換え体を産生するためにこのようなベクターを含むホスト細胞を提供する。
【００４８】
本発明は、更に、本発明に係るベクターを含む原核生物又は真核生物のホスト細胞を含む。
【００４９】
本発明は、更に、原核生物又は真核生物のホスト細胞において本発明に係る核酸を発現させ、そして、前記細胞又は前記細胞培養上清から前記抗体を回収することを特徴とする、本発明に係る組換え型ヒト抗体又はヒト化抗体を産生する方法を含む。本発明は、更に、このような組み換え法によって入手可能な抗体を含む。
【００５０】
本発明は、本発明に係るモノクローナル抗体を選択する方法であって、タウpS422に結合する多数のモノクローナル抗体を提供し、配列番号９で表されるリン酸化タウ断片、タウ、及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片に対する前記抗体の特異的結合を測定し、そして、前記タウに対する結合と比較して少なくとも１０，０００倍、前記リン酸化タウ断片に対して特異的に結合し、且つ前記リン酸化MCAK断片Ile-Gln-Lys-Gln-Lys-Arg-Arg-Ser(PO3H2)-Val-Asn-Ser-Lys-Ile-Pro-Ala（配列番号１７）に対する結合と比較して少なくとも１００倍、前記リン酸化タウ断片に対して特異的に結合する抗体を選択することを特徴とする方法を含む。
【００５１】
好ましくは、本発明は、本発明に係るモノクローナル抗体を選択する方法であって、タウpS422に結合する多数のモノクローナル抗体を提供し、配列番号９で表されるリン酸化タウ断片、タウpS422、タウ、及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片に対する前記抗体の特異的結合を測定し、そして、前記タウに対する結合と比較して少なくとも１０，０００倍、前記リン酸化タウ断片及び前記タウpS422に対して特異的に結合し、且つ前記リン酸化MCAK断片Ile-Gln-Lys-Gln-Lys-Arg-Arg-Ser(PO3H2)-Val-Asn-Ser-Lys-Ile-Pro-Ala（配列番号１７）に対する結合と比較して少なくとも１００倍、前記リン酸化タウ断片に対して特異的に結合する抗体を選択することを特徴とする方法を含む。
【００５２】
好ましくは、本発明は、本発明に係るモノクローナル抗体を選択する方法であって、タウpS422に結合する多数のモノクローナル抗体を提供し、配列番号９で表されるリン酸化タウ断片、タウpS422、タウ、及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片に対する前記抗体の特異的結合を測定し、そして、前記タウに対する結合と比較して少なくとも１０，０００倍、前記リン酸化タウ断片及び前記タウpS422に対して特異的に結合し、且つ前記リン酸化MCAK断片Ile-Gln-Lys-Gln-Lys-Arg-Arg-Ser(PO3H2)-Val-Asn-Ser-Lys-Ile-Pro-Ala（配列番号１７）に対する結合と比較して少なくとも１００倍、前記リン酸化タウ断片及び前記タウpS422に対して特異的に結合する抗体を選択することを特徴とする方法を含む。
【００５３】
本発明に係る抗体は、タウターゲティング療法を必要としている患者に恩恵をもたらす。本発明に係る抗体は、タウオパシー、特にＡＤに罹患している患者に恩恵をもたらす新規且つ創造的な特性を有する。
【００５４】
本発明は、更に、タウオパシー、特にＡＤに罹患している患者を治療する方法であって、このような疾患に罹患していると診断された患者（したがって、このような療法を必要としている患者）に本発明に係るpS422に結合する抗体を投与することを含む方法を提供する。前記抗体は、好ましくは医薬組成物で投与される。
【００５５】
本発明の更なる態様は、タウオパシー、特にＡＤに罹患している患者を治療する方法であって、前記患者に本発明に係る抗体を投与することを特徴とする方法である。
【００５６】
本発明は、更に、タウオパシー、特にＡＤに罹患している患者を治療するための本発明に係る抗体の使用、及び本発明に係る医薬組成物を製造するための本発明に係る抗体の使用を含む。更に、本発明は、本発明に係る医薬組成物を製造するための方法を含む。
【００５７】
本発明は、更に、本発明に係る抗体と共に、任意で、薬学的目的のために抗体の製剤化にとって有用なバッファ及び／又は佐剤を含む医薬組成物を含む。
【００５８】
本発明は、更に、薬学的に許容しうる担体中に本発明に係る抗体を含む医薬組成物を提供する。１つの態様では、前記医薬組成物は、製品又はキットに含まれていてもよい。
【００５９】
本発明の抗体は、リン酸化タウポリペプチドを検出することによって、アルツハイマー病等の神経障害を診断するために使用することができる。本発明の抗体は、タウpS422又は凝集したリン酸化タウの特異的検出にも使用することができる。
【００６０】
発明の詳細な説明
本発明に係る「タウ」という用語は、４４１アミノ酸を含むヒトタウの最長アイソフォーム（アイソフォームＦ、Uniprot P10636-8）を包含する。
【００６１】
本発明に係る「リン酸化タウ（ｐタウ）」という用語は、キナーゼERK2によるS422のリン酸化によって生成される、４４１アミノ酸を含むヒトタウの最長アイソフォーム（アイソフォームＦ、Uniprot P10636-8）のリン酸化された形態を包含する。
【００６２】
本発明に係る「凝集したリン酸化タウ」又は「凝集した（原線維状）リン酸化タウ」という用語は、キナーゼERK2による凝集したタウのリン酸化によって生成される、４４１アミノ酸を含むヒトタウの最長アイソフォーム（アイソフォームＦ、Uniprot P10636-8）の凝集及びリン酸化された形態を包含する。
【００６３】
本発明に係る「タウ断片」という用語は、タウ断片Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp（配列番号１０）を包含する。
【００６４】
本発明に係る「リン酸化タウ断片」という用語は、リン酸化タウ断片Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp（配列番号９）を包含する。
【００６５】
本発明に係る「MCAK」という用語は、ヒトの有糸分裂セントロメア関連キネシン（キネシン様タンパク質KIF2C、UniProt Q99661）を包含する。MCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]は、セリン９５がリン酸化されたアミノ酸８８〜１０２からなるリン酸化MCAK断片（配列番号１７）である。このリン酸化MCAK断片は、配列番号９で表されるリン酸化タウ断片に対して配列同一性又は類似性を有しない。本発明者らは、リン酸化タウ断片に対する当技術分野の状況に係る抗体が、無関係のリン酸化ヒトペプチド及びタンパク質と顕著な交差反応性を示す場合があることを認識していた。リン酸化MCAK断片に結合しない本発明に係る抗体については、このような望ましくない交差反応性を検出することはできなかった。
【００６６】
電気化学発光を読み取るELISAによって、タウpS422に対する結合及びタウに対する結合を調べる。２μg/mLの濃度でタウ又はタウpS422を固定化し、試験抗体（例えばヒト又はマウス）を添加する。結合した試験抗体を検出するために、それぞれルテニウムタグ付の抗ヒトＩｇＧ又は抗マウスＩｇＧを０．５μg/mLの濃度で添加する。タウpS422及びタウを使用した検出シグナルの関係が、タウpS422の最大結合シグナルにおいて少なくとも１０，０００倍である場合、タウpS422に対して特異的に結合すると考えられる。
【００６７】
配列番号９で表されるリン酸化タウ断片に対する結合、配列番号１０で表される非リン酸化タウ断片に対する結合、及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片に対する結合をELISAによって調べる。前記固定化されたリン酸化タウ断片、及び比較のために前記固定化された非リン酸化タウ断片又はMCAK断片と共に試験抗体をインキュベートする。抗体を標識し、前記標識を検出する。リン酸化タウ断片及び非リン酸化タウ断片を使用した検出シグナルの関係が、リン酸化タウ断片の最大結合シグナルにおいて少なくとも１００である場合、そして、リン酸化タウ断片及びリン酸化MCAK断片を使用した検出シグナルの関係が、リン酸化タウ断片の最大結合シグナルにおいても少なくとも１００である場合、リン酸化タウ断片に対する特異的結合が見出される。
【００６８】
「Mab2.10.3のエピトープ」という用語は、Mab2.10.3によって特異的に認識される、リン酸化タウ断片Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp（配列番号９）内に位置するエピトープを包含する。本発明に係るタウ抗体の前記エピトープ結合特性は、Mab2.10.3がｐタウに対する試験抗体の結合を立体的に妨害する能力を測定するためのBiacore（商標）インビトロクロスブロッキング結合アッセイ等のインビトロクロスブロッキング結合アッセイによって判定される。このようなアッセイでは、Mab2.10.3をBiacoreセンサの一次抗体として捕捉し、次いで、ｐタウ及び試験する二次抗体を順次注入する。前記二次抗体が任意の検出可能な結合シグナルを示さない場合、前記二次抗体はMab2.10.3と同じエピトープに結合する。
【００６９】
本発明に係る抗体は、上記Biacore（商標）分析によって測定されるとき、５×１０−８Ｍ−１〜１０−１２Ｍ−１の親和性でタウpS422に結合する。
【００７０】
タウpS422の原線維状凝集体に対する結合をBiacore分析によって調べる。このアッセイでは、凝集したタウpS422を固定化し、そして、希釈係数２を用いて最高濃度２００nMの様々な濃度の試験抗体を添加した。本発明に係る抗体は、０．１〜３０のＫｄで、好ましくは１０〜２０nMのＫｄで原線維状タウpS422に結合する。
【００７１】
用語「モノクローナル抗体又は抗体」という用語は、様々な形態の抗体を包含し、好ましくはモノクローナル抗体であり、特に好ましくはIgG1又はIgG4モノクローナル抗体である。本発明に係る抗体は、好ましくは、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又は本発明に係る特性を保持している限り更に遺伝子的に改変されている抗体である。WO98/08097に記載されている方法を使用することによりＴ細胞エピトープ枯渇抗体を産生することができる。
【００７２】
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、好ましくは、その可変ドメイン、又は少なくともその抗原結合部位を含む。抗体断片の例としては、ダイアボディ、単鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多特異性抗体が挙げられる。scFv抗体は、例えば、Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88に記載されている。更に、抗体断片は、ＶＨドメインの特性を有する、即ち、ＶＬドメインと会合することができる単鎖ポリペプチド、又はタウpS422に対して結合するＶＬドメインの特性を有する、即ち、ＶＨドメインと共に機能抗原結合部位に対して会合することができる単鎖ポリペプチドを含む。「ヒト化抗体」という用語は、親免疫グロブリンと比較して、異なる種の免疫グロブリンのＣＤＲを含むようフレームワーク及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）が改変されている抗体を指す。好ましい態様において、
ａ）配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、配列番号８で表されるCDR3H、及び配列番号３で表されるCDR1L、配列番号４で表されるCDR2L、配列番号５で表されるCDR3L、
ｂ）配列番号２３で表されるCDR1H、配列番号２４で表されるCDR2H、配列番号２５で表されるCDR3H、及び配列番号２７で表されるCDR1L、配列番号２８で表されるCDR2L、配列番号２９で表されるCDR3L、
ｃ）配列番号３１で表されるCDR1H、配列番号３２で表されるCDR2H、配列番号３３で表されるCDR3H、及び配列番号３５で表されるCDR1L、配列番号３６で表されるCDR2L、配列番号３７で表されるCDR3L、
ｄ）配列番号３９で表されるCDR1H、配列番号４０で表されるCDR2H、配列番号４１で表されるCDR3H、及び配列番号４３で表されるCDR1L、配列番号４４で表されるCDR2L、配列番号４５で表されるCDR3L、
ｅ）配列番号４７で表されるCDR1H、配列番号４８で表されるCDR2H、配列番号４９で表されるCDR3H、及び配列番号５１で表されるCDR1L、配列番号５２で表されるCDR2L、配列番号５３で表されるCDR3L、
ｆ）配列番号５５で表されるCDR1H、配列番号５６で表されるCDR2H、配列番号５７で表されるCDR3H、及び配列番号５９で表されるCDR1L、配列番号６０で表されるCDR2L、配列番号６１で表されるCDR3L、又は
ｇ）配列番号６３で表されるCDR1H、配列番号６４で表されるCDR2H、配列番号６５で表されるCDR3H、及び配列番号６７で表されるCDR1L、配列番号６８で表されるCDR2L、配列番号６９で表されるCDR3L
をヒト抗体のフレームワーク領域に移植して、「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327;及びNeuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270を参照されたい。
【００７３】
「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）、重鎖の可変ドメイン（ＶＨ））は、本明細書で使用するとき、抗原に対する抗体の結合に直接関与する、軽鎖ドメインと重鎖ドメインとの各対を意味する。可変軽鎖ドメイン及び重鎖ドメインは、同じ一般構造を有し、そして、各ドメインは、３つの「超可変領域」（又は相補性決定領域、ＣＤＲ）によって連結されている、配列が広く保存されている４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。フレームワーク領域は、β−シート高次構造を採用し、そして、ＣＤＲは、β−シート構造を連結するループを形成することができる。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域により三次元構造が保持され、そして、他方の鎖のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ３領域は、本発明に係る抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たしているので、本発明の更なる目的を提供する。
【００７４】
「抗体の抗原結合部分」という用語は、本明細書で使用するとき、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。抗体の抗原結合部分は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域は、本明細書で定義されるとき、超可変領域の残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖及び重鎖の可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４を含む。特に、重鎖のＣＤＲ３は、抗原結合に最も寄与し、そして抗体の特性を規定する領域である。ＣＤＲ及びＦＲ領域は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準定義及び／又は「超可変性ループ」の残基に従って決定される。
【００７５】
「CDR1H」という用語は、Kabat法に従って計算された重鎖可変領域のＣＤＲ１領域を意味する。CDR2L、CDR3H等は重（Ｈ）鎖、又は軽（Ｌ）鎖のそれぞれの領域を意味する。例えば、配列番号６で表されるCDR1Hを含むことを特徴とする抗体とは、前記抗体がその可変重鎖における重鎖可変鎖ＣＤＲ１領域としてこのアミノ酸配列を含むことを意味する。例えば、配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、配列番号８で表されるCDR3Hを含むことを特徴とする抗体は、前記抗体がＣＤＲ１の配列として配列番号６を、ＣＤＲ２の配列として配列番号７を、及びＣＤＲ３の配列として配列番号８を重鎖中に含むことを意味する。
【００７６】
「核酸」又は「核酸分子」という用語は、本明細書で使用するとき、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、単鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００７７】
「アミノ酸」という用語は、本願で使用するとき、アラニン（３文字表記：ala、１文字表記：Ａ）、アルギニン（arg、Ｒ）、アスパラギン（asn、Ｎ）、アスパラギン酸（asp、Ｄ）、システイン（cys、Ｃ）、グルタミン（gln、Ｑ）、グルタミン酸（glu、Ｅ）、グリシン（gly、Ｇ）、ヒスチジン（his、Ｈ）、イソロイシン（ile、Ｉ）、ロイシン（leu、Ｌ）、リシン（lys、Ｋ）、メチオニン（met、Ｍ）、フェニルアラニン（phe、Ｆ）、プロリン（pro、Ｐ）、セリン（ser、Ｓ）、トレオニン（thr、Ｔ）、トリプトファン（trp、Ｗ）、チロシン（tyr、Ｙ）、及びバリン（val、Ｖ）を含む、天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を意味する。
【００７８】
別の核酸と機能的関係に配置されるとき、核酸は「機能的に連結されている」。例えば、ポリペプチドの分泌に関与する前駆体タンパク質として発現する場合、プレシークエンス又は分泌リーダーのＤＮＡがポリペプチドのＤＮＡに機能的に連結されていたり；配列の転写に影響を与えるとき、プロモーター又はエンハンサーがコード配列に機能的に連結されていたり；翻訳を促進するように位置付けられるとき、リボソーム結合部位がコード配列に機能的に連結されていたりする。一般的に、「機能的に連結される」は、連結されたＤＮＡ配列が共直線性であることを意味し、そして、分泌リーダーである場合は、隣接し且つインフレームである。しかし、エンハンサーは、隣接していなくてもよい。都合のよい制限酵素部位においてライゲーションすることによって連結が行われる。そのような部位が存在しない場合、常法に従って合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーを使用する。
【００７９】
本明細書で使用するとき、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という表現は互換的に使用され、このような表記は全て後代を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語句は、対象初代細胞及び継代数に関係なくそれから誘導された培養物を含む。また、全ての後代は、故意の又は偶発的な突然変異により、ＤＮＡ含量が正確に同一であるとは限らないことを理解されたい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングしたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体後代も含まれる。
【００８０】
抗体の「Ｆｃ部」は、抗原に対する抗体の結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて定義される。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体又は免疫グロブリンは、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMのクラスに分類され、そして、これらクラスのうちの幾つかは、例えばIgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4、IgA1及びIgA2等のサブクラス（サブタイプ）に更に分類することができる。重鎖定常領域によって、異なるクラスの免疫グロブリンは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。本発明に係る抗体は、好ましくは、IgG1サブタイプ又はIgG4サブタイプであるヒト起源のＦｃ部を含む。
【００８１】
ヒト定常軽鎖及び重鎖、並びにIgG1サブタイプ及びIgG4サブタイプの定常鎖は、当技術分野において周知であり、例えば、Kabatによって記載されている（例えば、Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218を参照されたい）。例えば、有用なヒト重鎖定常領域は、配列番号１３若しくは１４（IgG1）、又は配列番号１５若しくは１６（IgG4）のアミノ酸配列を含む。例えば、有用なヒト軽鎖定常領域は、配列番号１１で表されるカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。抗体がマウス起原であり、そして、Kabat法に従ってマウス抗体の抗体可変配列枠を含むことが更に好ましい（例えば、Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, E.A. et al., 5thedition, DIANE Publishing (1992)を参照されたい）。
【００８２】
本発明は、本発明に係る抗体を患者に投与することを特徴とする、治療を必要としている患者を治療するための方法を含む。
【００８３】
本発明は、治療のための本発明に係る抗体の使用を含む。
【００８４】
本発明は、タウオパシー、特にＡＤを治療する医薬を調製するための本発明に係る抗体の使用を含む。
【００８５】
本発明は、脳疾患を治療するための、好ましくは、タウオパシー、特にＡＤを治療するための本発明に係る抗体の使用を含む。
【００８６】
本発明の更なる態様は、本発明に係る抗体を生成するための方法であって、本発明に係る抗体の重鎖をコードする核酸の配列、及び前記抗体の軽鎖をコードする核酸を１つ又は２つの発現ベクターに挿入し、前記ベクターを真核生物のホスト細胞に挿入し、コードされている抗体を発現させ、そして、前記ホスト細胞又は上清から回収することを特徴とする方法である。
【００８７】
本発明に係る抗体は、好ましくは、組換え手段によって生成される。このような方法は、当技術分野において広く知られており、原核生物及び真核生物の細胞においてタンパク質を発現させ、次いで、抗体ポリペプチドを単離し、そして、通常、薬学的に許容しうる純度に精製することを含む。タンパク質を発現させるために、軽鎖及び重鎖又はこれらの断片をコードする核酸を標準的な方法によって発現ベクターに挿入する。ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、ＣＯＳ細胞、酵母又は大腸菌細胞等の適切な原核生物又は真核生物のホスト細胞において発現させ、細胞から（上清から、又は細胞溶解後に）抗体を回収する。
【００８８】
抗体の組換え体生成は、例えば、Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S. et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880の総説に記載されている。
【００８９】
抗体は、全細胞中、細胞溶解物中に存在してもよく、部分的に精製された形態で存在してもよく、又は実質的に純粋な形態で存在してもよい。標準的な技術によって（Ausubel, F. et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)を参照されたい）、他の細胞成分又は他の夾雑物、例えば、他の細胞の核酸又はタンパク質を取り除くために精製を行う。
【００９０】
ＮＳ０細胞における発現は、例えばBarnes, L.M. et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M. et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270に記載されている。一過的発現は、例えば、Durocher, Y. et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L. et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87に記載されている。好ましい一過的発現系（HEK293）は、Schlaeger, E.-J. and Christensen, K.によってCytotechnology 30 (1999) 71-83に、そして、Schlaeger, E.-J.によってJ. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199に記載されている。
【００９１】
モノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡ及びＲＮＡは、従来の手順を使用して容易に単離され、そして配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡ及びＲＮＡ源として機能することができる。一旦単離した後、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、次いで、HEK293細胞、ＣＨＯ細胞、又は他の免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄細胞等のホスト細胞にトランスフェクトして、ホスト細胞で組換え型モノクローナル抗体を合成させることもできる。
【００９２】
抗pS422抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、当技術分野において公知である様々な方法によって調製される。これらの方法は、天然資源（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）からの単離、ヒト化抗pS422抗体の既に調製されている変異体又は非変異体バージョンのオリゴヌクレオチド媒介性（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット式変異誘発による調製を含むが、これらに限定されない。
【００９３】
本発明に係る重鎖及び軽鎖可変ドメインは、プロモーター、翻訳開始、定常領域、３’非翻訳領域、ポリアデニル化、及び転写終結の配列と組み合わせられて、発現ベクターのコンストラクトを形成する。重鎖及び軽鎖発現コンストラクトは、単一のベクターに組み込まれてもよく、コトランスフェクトされてもよく、連続的にトランスフェクトされてもよく、又は別々にホスト細胞にトランスフェクトし、次いで、融合させて両鎖を発現する単一のホスト細胞を形成してもよい。
【００９４】
別の局面では、本発明は、薬学的に許容しうる担体と共に製剤化される、本発明のモノクローナル抗体のうちの１つもしくは本発明のモノクローナル抗体の組合せ、又はこれらの抗原結合部分を含有する組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
【００９５】
本明細書で使用するとき、「薬学的に許容しうる担体」は、生理学的に適合する任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌性及び抗真菌性の物質、等張剤、並びに吸収／再吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、注射又は注入に適している。
【００９６】
本発明の組成物は、当技術分野において公知である様々な方法によって投与することができる。当業者によって認識されるように、投与の経路及び／又は方法は、望ましい結果に依存して変化する。
【００９７】
薬学的に許容しうる担体は、無菌の水溶液もしくは分散液、又は無菌の注射溶液又は分散液を調製するための無菌粉末を含む。薬学的活性物質のためにこのような媒体及び剤を使用することは、当技術分野において公知である。水に加えて、担体は、例えば等張の緩衝生理食塩水であってもよい。
【００９８】
選択された投与経路にかかわらず、適切な水和形態で用いてもよい本発明の化合物、及び／又は本発明の医薬組成物は、当業者に公知である従来の方法によって薬学的に許容しうる剤形に製剤化される。
【００９９】
患者にとって毒性ではなく、特定の患者、組成物及び投与方法にとって望ましい治療応答を達成するのに有効な活性成分の量（有効量）を得るために、本発明の医薬組成物中における活性成分の実際の投与量レベルを変更してもよい。選択される投与量レベルは、使用される本発明の特定の組成物、又はそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排泄速度、使用される特定の組成物と併用される他の医薬、化合物、及び／又は物質、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的な健康、及び病歴、並びに医学分野において周知である類似要因を含む様々な薬物動態学的要因に依存する。
【０１００】
本発明は、タウオパシー、特にＡＤに罹患している患者を治療するための本発明に係る抗体の使用を含む。
【０１０１】
また、本発明は、本発明に係る抗体を患者に投与することにより、このような疾患に罹患している患者を治療するための方法を含む。
【０１０２】
本発明は、更に、薬学的に許容しうる担体と共に本発明に係る抗体を含む医薬組成物を製造するための方法、及びこのような方法における本発明に係る抗体の使用を提供する。
【０１０３】
本発明は、更に、タウオパシー、特にＡＤに罹患している患者を治療する医薬品を、好ましくは薬学的に許容しうる担体と共に製造するための本発明に係る抗体の使用を提供する。
【０１０４】
また、本発明は、癌、特にタウオパシー、特にＡＤに罹患している患者を治療する医薬品を、好ましくは薬学的に許容しうる担体と共に製造するための本発明に係る抗体の使用を提供する。
【０１０５】
本発明についての理解を助けるために以下の実施例、配列表及び図面を提供し、その真の範囲を特許請求の範囲に記載する。本発明の趣旨から逸脱することなく記載されている手順を変更できることが理解される。
【０１０６】
配列表の説明
配列番号１ Mab2.10.3の可変軽鎖
配列番号２ Mab2.10.3の可変重鎖
配列番号３ CDR1L
配列番号４ CDR2L
配列番号５ CDR3L
配列番号６ CDR1H
配列番号７ CDR2H
配列番号８ CDR3H
配列番号９ リン酸化タウ断片
配列番号１０ 配列番号９の非リン酸化
配列番号１１ ヒトカッパ軽鎖定常領域
配列番号１２ ヒトラムダ軽鎖定常領域
配列番号１３ ヒトγ１（アロタイプG1m1,17）定常領域
配列番号１４ ヒトγ１（アロタイプG1m117）定常領域
配列番号１５ ヒトIgG4定常領域
配列番号１６ ヒトIgG4 SPLE−突然変異体定常領域
配列番号１７ リン酸化MCAK断片（MCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]）
配列番号１８ プライマー
配列番号１９ プライマー
配列番号２０ プライマー
配列番号２１ プライマー
配列番号２２ Mab005の可変重鎖
配列番号２３ CDRH1
配列番号２４ CDRH2
配列番号２５ CDRH3
配列番号２６ Mab005の可変軽鎖
配列番号２７ CDRL1
配列番号２８ CDRL2
配列番号２９ CDRL3
配列番号３０ Mab019の可変重鎖
配列番号３１ CDRH1
配列番号３２ CDRH2
配列番号３３ CDRH3
配列番号３４ Mab019の可変軽鎖
配列番号３５ CDRL1
配列番号３６ CDRL2
配列番号３７ CDRL3
配列番号３８ Mab020の可変重鎖
配列番号３９ CDRH1
配列番号４０ CDRH2
配列番号４１ CDRH3
配列番号４２ Mab020の可変軽鎖
配列番号４３ CDRL1
配列番号４４ CDRL2
配列番号４５ CDRL3
配列番号４６ Mab085の可変重鎖
配列番号４７ CDRH1
配列番号４８ CDRH2
配列番号４９ CDRH3
配列番号５０ Mab085の可変軽鎖
配列番号５１ CDRL1
配列番号５２ CDRL2
配列番号５３ CDRL3
配列番号５４ Mab086の可変重鎖
配列番号５５ CDRH1
配列番号５６ CDRH2
配列番号５７ CDRH3
配列番号５８ Mab086の可変軽鎖
配列番号５９ CDRL1
配列番号６０ CDRL2
配列番号６１ CDRL3
配列番号６２ Mab097の可変重鎖
配列番号６３ CDRH1
配列番号６４ CDRH2
配列番号６５ CDRH3
配列番号６６ Mab097の可変軽鎖
配列番号６７ CDRL1
配列番号６８ CDRL2
配列番号６９ CDRL3
配列番号７０ ウサギ免疫グロブリン定常領域（カッパ）
配列番号７１ ウサギ免疫グロブリン定常領域（ガンマ）
配列番号７２ マウス免疫グロブリン定常領域（カッパ）
配列番号７３ マウス免疫グロブリン定常領域（ガンマ）
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】タウPS2APPマウスモデルにｉｐ投与した後のpS422 IgG1の大脳内局在。Alexa488をコンジュゲートしたIgG1に対する一次抗体、及びAlexa555をコンジュゲートした抗ｐタウ抗体ＡＴ８で多重蛍光染色した後の共焦点顕微鏡写真は、細胞核のＤＡＰＩ染色（Ｃ）と共に、IgG1の結合（Ａ）及びｐタウの沈着（Ｂ）を示した。マージされた画像は、幾つかのｐタウ陽性細胞における、抗IgG1及びｐタウの共局在化染色を示す（Ｄ）。
【図２】タウPS2APPマウスモデルにおけるIgG1の大脳内局在のビヒクル対照。海馬体のＣＡ１領域の概観を示す、タウPS2APP脳切片を多重蛍光染色した後の共焦点顕微鏡写真。Alexa488をコンジュゲートしたIgG1に対する一次抗体による多重染色は陰性である（Ａ）。Alexa555をコンジュゲートした抗ｐタウ抗体ＡＴ８は、ｐタウの沈着を示す（Ｂ）。細胞核のＤＡＰＩ染色（Ｃ）。マージされた画像を（Ｄ）に示す。ビヒクルを注射した後のタウPS2APPマウスにおいて、感知できるほどの抗IgG1免疫蛍光は観察されなかった。
【図３】タウPS2APPマウスモデルにｉｐ投与した後のIgG1の細胞内局在。前頭前皮質内の陽性標識された細胞を示す、タウPS2APP脳切片を多重蛍光染色した後の共焦点顕微鏡写真。Alexa488をコンジュゲートしたIgG1に対する一次抗体、及びAlexa555をコンジュゲートした抗ｐタウ抗体ＡＴ８による多重染色は、IgG1の結合（Ａ）及びｐタウの沈着（Ｂ）を示した。マージされた画像は、青による細胞核のＤＡＰＩ染色（Ｃ）と共に、抗IgG1及びｐタウが共局在化した核周囲及び樹状の染色を示す。
【図４】タウPS2APPマウスモデルにｉｐ投与した後のpS422 IgG1の細胞内局在。海馬のＣＡ１領域の錐体細胞層内の陽性標識された細胞を示す、タウPS2APP脳切片を多重蛍光染色した後の共焦点顕微鏡写真。Alexa488をコンジュゲートしたIgG1に対する一次抗体、及びAlexa555をコンジュゲートした抗ｐタウ抗体ＡＴ８による多重染色は、IgG1の結合（Ａ）及びｐタウの沈着（Ｂ）を示した。マージされた画像は、細胞核のＤＡＰＩ染色（Ｃ）と共に、抗IgG1及びｐタウが共局在化した核周囲及び樹状の染色を示す。
【図５】タウPS2APPマウスモデルにip投与した後のIgG2aの細胞内局在。海馬のＣＡ１領域の錐体細胞層内の陽性標識された細胞を示す、タウPS2APP脳切片を多重蛍光染色した後の共焦点顕微鏡写真。Alexa488をコンジュゲートしたIgG2aに対する一次抗体、及びAlexa555をコンジュゲートした抗ｐタウ抗体ＡＴ８による多重染色は、IgG2aの結合（Ａ）及びｐタウの沈着（Ｂ）を示した。マージされた画像は、細胞核のＤＡＰＩ染色（Ｃ）と共に、抗IgG2a及びｐタウが共局在化した核周囲及び樹状の染色を示す。
【図６】タウPS2APPマウスモデルにip投与した後のIgG2bの細胞内局在。前頭前皮質領域内の陽性標識された細胞を示す、タウPS2APP脳切片を多重蛍光染色した後の共焦点顕微鏡写真。Alexa488をコンジュゲートしたIgG2bに対する一次抗体、及びAlexa555をコンジュゲートした抗ｐタウ抗体ＡＴ８による多重染色は、IgG2bの結合（Ａ）及びｐタウの沈着（Ｂ）を示した。マージされた画像は、矢印（Ｃ）によって示されるように、抗IgG2b及びｐタウが共局在化した核周囲の染色を示す。
【図７】タウPS2APPマウスの分析。Ａ：１６月齢のタウPS2APPマウスの矢状脳切片のGallyas銀染色。典型的なもつれ状ニューロン内構造が黒く見え、免疫蛍光顕微鏡検査法によって明らかにされたｐタウ陽性ニューロンを裏付ける。Ｂ：１６月齢のタウPS2APPマウスの免疫金標識された超薄切片。１０nmのコロイド金（矢印）をコンジュゲートした二次抗体によって明らかにされるように、抗タウpS422 mAbは海馬のＣＡ１領域内の樹状突起における原線維状構造に特異的に結合する。標識された原線維の大きさ及び密度は、前記原線維がアルツハイマー病の変性ニューロンでみられるリン酸化タウタンパク質の対らせん状線維に相当することを示唆する。
【図８】ＡＤ脳切片に対する抗タウpS422抗体のインビトロ結合。陽性標識されたｐタウ沈着物を示す、指定の濃度の抗タウpS422モノクローナル抗体（クローン２．１０．３、２．２０．４及び５．６．１１）によりヒト皮質ＡＤ脳切片を染色した後の蛍光顕微鏡写真。大きな神経原線維変化及び細長い糸屑状構造物のような、細胞内のｐタウ沈着が顕著である。
【図９ａ】タウと比較した、抗タウpS422抗体のタウpS422に対する選択性。タウ（▲）又はタウpS422（●）でコーティングされたプレートを使用した、ELISAによる抗タウpS422抗体の選択性の測定。レファレンスとして、左上のパネルにタウ選択的抗体４／２を示す。
【図９ｂ】タウと比較した、抗タウpS422抗体のタウpS422に対する選択性。タウ（▲）又はタウpS422（●）でコーティングされたプレートを使用した、ELISAによる抗タウpS422抗体の選択性の測定。レファレンスとして、左上のパネルにタウ選択的抗体４／２を示す。
【図１０】インビトロにおいて凝集したタウは原線維である。陰性染色されている凝集したタウの電子顕微鏡写真。
【図１１】陽性標識されたｐタウ沈着物及び線維を示す、抗タウpS422ウサギモノクローナル抗体であるMab005（第１列）、Mab019（第２列）、Mab020（第３列）、Mab085（第４列）、Mab086（第５列）及びMab097（第６列）で染色されたヒト皮質のＡＤ脳切片の蛍光顕微鏡写真。ＩｇＧの連続希釈物を、２．０μg/mL（左）から始めて、０．４μg/mL、０．０８μg/mL及び０．０１６μg/mLと各列に示す。
【０１０８】
実施例１
抗体の調製及び精製
ａ）抗体生成
タウの最長のヒトアイソフォームのアミノ酸４１６〜４３０に相当する配列番号９で表されるタウ断片（Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp）でマウスを免疫した。チオールを介してＫＬＨに直接カップリングさせるために、タウ断片のＮ末端にシステインを付加した。後続の免疫プロトコール、融合、及びクローニング、並びに抗タウpS422特異的抗体のスクリーニングについては、EP 1 876 185に記載されている。
【０１０９】
ｂ）クローン２．１０．３、２．２０．４及び５．６．１１の精製
５０mMのTrisCl（ｐＨ８．０）で平衡化された２５mLのMEP Hypercellカラム（pall Biosciences）に無細胞ハイブリドーマ培養上清（２５０〜３００mL）をロードした。平衡バッファで洗浄した後、３０mMのクエン酸ナトリウム、１００mMのNaCl（ｐＨ４．１）で抗体を溶出した。抗体を含有している画分をプールし、次いで、１０mMのTrisCl（ｐＨ８．０）５リットルに対して４℃で一晩Spectra-Por 6-8000の透析チューブにて透析した。１０mMのTrisCl（ｐＨ８．０）（バッファＡ）で平衡化した１０mLのSource 17Qカラム（GE Healthcare）に、透析された材料をロードした。バッファＡで洗浄した後、１０カラム体積の０〜２５％バッファＢで抗体を勾配溶出した。バッファＢは、１０mMのTrisCl、１ＭのNaCl（ｐＨ８．０）を含有していた。約２００mMのNaClで抗体を溶出した。SDS-PAGEによって個々の画分の純度をチェックし、最も純度の高い画分をプールした。
【０１１０】
マウスに注射する前日、ＰＢＳに対して各抗体を透析し、そして、抗体濃度を３．２mg/mLに調整した。
【０１１１】
実施例２
タウ、タウpS422、凝集したタウ、及び凝集したタウpS422の調製
Ｎ末端に(His)6-SUMO融合タグを有するタウをE.coliで発現させ、そして、HiTrapQ (GE Healthcare, Switzerland)上でイオン交換クロマトグラフィーによって、次いで、Ni-NTA Sepharose (Qiagen, Switzerland)上でアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。次いで、SUMOプロテアーゼ(Invitrogen, Netherlands)で消化することによって融合タグを切断し、次いで、２回目のNi-NTA Sepharoseクロマトグラフィー工程を行って、融合タグを除去する。
【０１１２】
ERK2プロテインキナーゼと共にタウをインキュベートすることによってタウ-pSer422を調製した。１mMのＭｇＣｌ２及び２mMのＡＴＰを含有している１０mMのTrisCl（ｐＨ８．０）中で３７℃にて一晩インキュベートした後にS422が最も多くリン酸化されるERK2：タウのモル比（計算値１：１０）を選択した。次いで、これが４２２の部位における化学量論的リン酸化を表すと仮定した。タウのpS422に特異的なインハウスのモノクローナル抗体を使用して、ウエスタンブロットによってリン酸化をチェックした。
【０１１３】
５０μMのアラキドン酸（Sigma, Switzerland）を含有している１０mMのTrisCl（ｐＨ８．０）中で最終濃度５μMの精製タウをインキュベートすることにより、凝集した（原線維状）タウを調製した。１６時間３７℃でインキュベートを行った。１０μMのチオＳの存在下において蛍光分光法によって（Barghorn and Mandelkow [2002] Biochemistry 41:14885-14896）、及び電子顕微鏡（図１０）によって凝集状態を調べた。図１０が示すように、凝集したタウは、原線維状の外観を有する。上記の通り、予め凝集しているタウをERK2キナーゼと共にインキュベートすることによって、凝集したリン酸化タウを調製した。
【０１１４】
実施例３
抗タウpS422モノクローナル抗体は、S422がリン酸化されているタウに対する選択性が高い
ａ）ペプチド合成
Fmoc化学反応を使用して、自動ペプチド合成機においてペプチド合成を行った。反復サイクルにおいて、対応するFmocアミノ酸を順次カップリングすることによりペプチド配列を組立てた。全てのカップリング工程において、Ｎ−メチルピロリドン中２０％ピペリジンを含む樹脂で処理することによってＮ末端のFmoc基を除去した。ＤＭＦ中HBTU/HOBt（１mmol、各々）及びDIPEA（２mmol）によって活性化されたFmoc保護アミノ酸（１mmol）を使用して、カップリングを実行した。全てのカップリング工程後、ＮＭＰ中酢酸（０．５Ｍ）、DIPEA（０．１２５Ｍ）及びHOBt（０．０１５Ｍ）の混合物で処理することによって（１０分間、ボルテックス）、未反応アミノ基をキャッピングした。各工程間に、Ｎ−メチルピロリドン及びＤＭＦで樹脂を洗浄した。立体障害アミノ酸の取込みは、自動ダブルカップリングにおいて達成された。この目的のために、カップリングサイクルにおいてキャッピング工程を行うことなく、１mmolの活性化された構成単位で樹脂を２回処理した。リン酸化ペプチド配列では、対応するセリン誘導体をFmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH構成単位として組込んだ。標的配列が完成したら、標準的なアミノ酸カップリング条件を使用して、Fmoc-Glu（ビオチニル-PEG)-OH（ＰＥＧスペーサーを介して結合されたビオチン）をMCAKペプチドにカップリングし、一方、標準的な条件を使用して、４×β−アラニン（Ｕ）及び１×ε−リジンをホスホ−タウ配列に結合させた。次いで、ＤＭＴｒ−ビオチンをホスホ−タウペプチドにコンジュゲートさせて、ビオチン化された標的配列を得た。最後のFmoc脱保護（MCAKのみ）後、フィルターフリットに全てのペプチド樹脂を別々に入れ、そして、トリフルオロ酢酸、水及びトリイソプロピルシラン（１９mL：０．５mL：０．５mL）の混合物で２．５時間処理した。切断溶液を濾過し、冷（０℃）ジイソプロピルエーテル（３００mL）を添加することによってペプチドを沈殿させて、無色の固体を得、これをジイソプロピルエーテルで繰り返し洗浄した。粗生成物を酢酸／水の混合物に再溶解させ、凍結乾燥させ、次いで、０．１％のＴＦＡを含有しているアセトニトリル／水勾配を使用して、分取逆相HPLCによって精製した。
【０１１５】
HBTU：２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HOBt：ヒドロキシベンゾトリアゾール
DIPEA：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
NMP：Ｎ−メチル−２−ピロリドン
【０１１６】
ｂ）リン酸化タウペプチドを用いたアッセイ
タウpS422配列４１６−４３０（リン酸化及び非リン酸化）及びMCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]を表すペプチドを合成し、ビオチン化して、ストレプトアビジンで標識されたマイクロタイタープレートをコーティングさせた。アッセイプレートに対するタウリンペプチドの最大結合を試験するために、１ng/mLから２０００ng/mLに及ぶ様々な濃度のタウリンペプチドをコーティングに使用した。最終的に、室温で６０分間コーティングするために５０ng/mLのタウリンペプチドを使用した。１０００ng/mL以下の濃度で６０分間、ペプチドで標識されたマイクロタイタープレート内で、抗タウpS422抗体２．１０．３、２．２０．４．及び５．６．１１をインキュベートした。洗浄後、ＰＯＤで標識された抗マウス−ＩｇＧ Ｆｃ抗体を使用して、抗体の結合を検出した。室温で２０分間ＡＢＴＳ（登録商標）と共にインキュベートした後、４０５nm〜４９２nmの吸収度（O.D.）を測定した。ＥＣ５０によって抗体結合を測定した。２．１０．３については１００ng/mL、２．２０．４については８ng/mL、及び５．６．１１については１ng/mLの範囲において典型的なＥＣ５０値を決定することができた。非リン酸化タウ断片、及び（MCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]）を対照として使用した。対照ペプチドの結合は、観察することができなかった。典型的なバックグラウンド値は約３０ｍＥ（表１）であり、これは、リン酸化タウ断片で測定された最大値の約１％である。したがって、Mab2.10.3は、配列番号１０で表される非リン酸化タウペプチド及びMCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]と比較して少なくとも１００倍の選択性でリン酸化タウ断片に結合する。結果を表１に示す。
【０１１７】
【表１】
【０１１８】
ｃ）完全長タウ及びタウpS422を用いたアッセイ
Meso Scale Discovery（商標）アッセイプラットフォーム（MSD, Gaithersburg, Maryland, USAMD）を使用してアッセイを行った。室温で１時間、ＰＢＳバッファ中２μg/mLの濃度のタウ又はタウpS422でＭＳＤ９６ウェルマイクロタイタープレートをコーティングした。次いで、１時間５％のＢＳＡ及び１％のTween20を含有しているＰＢＳを添加することにより、プレートをブロッキングした。０．１％のＢＳＡ及び０．１％のTween（登録商標）20を含有しているLow Crossバッファ(MSD)で抗体を（濃度域が３ng/mL〜２５０ng/mLであったクローン２．１０．３を除いて）３０pg/mL〜２０ng/mLの濃度に希釈し、コーティング及びブロッキングされたプレートに添加し、そして、室温で３時間インキュベートした。次いで、１％のTweenを含有しているＰＢＳバッファでプレートを３回洗浄した。結合した抗体の検出については、０．５μg/mLの濃度のSULFOタグ付抗マウスＩｇＧ（ＭＳＤ）を添加し、そして、室温で１時間プレートをインキュベートした。Readバッファ（ＭＳＤ）を添加した後、MSD Sector Imager 600プレートリーダでプレートを読み取った。図９は、抗タウpS422モノクローナル抗体（クローン５．６．１１、２．２０．４及び２．１０．３）の結合パートナーとしてタウ又はタウpS422のいずれかを用いて得られたデータを示す。タウ及びタウpS422の両方を認識する抗タウ抗体（クローン４／２）を参照としてタウpS422抗体と比較する。タウpS422及びタウに対する結合と比較することによって、タウに対する結合のシグナルは、バックグラウンドシグナルと識別することができなかったので、タウに対する結合は検出されなかったことが分かった。したがって、タウと比較して、少なくとも１０，０００倍の選択性でタウpS422に対して３つの各抗タウpS422抗体が結合すると推定された。
【０１１９】
実施例４
抗タウpS422抗体はタウpS422の原線維状凝集体に結合する
Biacore（商標）分析を用いて、凝集した原線維状タウpS422の調製物に対する抗タウpS422（クローン２．１０．３）の結合を測定した。リン酸化原線維は、インビトロにおける、アルツハイマー病脳に生じるタウのＰＨＦ形態を表すと考えられる。実施例２に記載されているように原線維状物質を調製し、リン酸化した。
【０１２０】
センサチップ上への固定：
ＣＭ５センサチップ上でアミンカップリングすることによって、凝集したタウpS422を共有結合的に固定化した。この目的のために、凝集したタウpS422を１０mMの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で１９倍に希釈した。チップ上に望ましい量のタンパク質が固定化されるまで、活性化されたセンサ表面をタンパク質溶液と接触させた。その後、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．０）を注入することにより、残りの反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをブロッキングした。抗タウpS422（クローン２．１０．３）の結合挙動の特性評価を行うために、４５０反応単位（ＲＵ）のタンパク質を固定化した。ＲＴで固定アッセイを実行し、ランニングバッファとしてＰＢＳを使用した。
【０１２１】
動的滴定：
抗体の特性評価については、ランニングバッファを１０mMのトリス−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、２５０mMのNaClに変更し、以下の一連の濃度の抗体を調製した：５つの異なる濃度、希釈係数２、最大濃度２００nM。最低濃度で開始して、抗体の異なる溶液を連続的に注入した。所謂動的滴定の後に、１００mMのＨ３ＰＯ４でセンサ表面を再生した。この測定を３回行った。
【０１２２】
Biaevalソフトウェアによってデータ評価を行った。パラメータの計算は、凝集したタウpS422に対する抗体の結合が完全に一価であるという仮定に基づく。固定化されたタンパク質の抗体の結合挙動を特徴づける動的及び熱力学的パラメータを表２に示す。
【０１２３】
【表２】
【０１２４】
したがって、抗タウpS422（クローン２．１０．３）は、１７nMのＫＤで原線維のホスホタウに結合する。
【０１２５】
実施例５
アルツハイマー病患者の脳切片における細胞内ｐタウに対する抗タウpS422モノクローナル抗体のインビトロ結合
ＡＤ患者のヒト脳組織の低温切片を用いる免疫組織化学的染色実験によって、アルツハイマー病脳組織における病理学的に関連するｐタウ病変の免疫装飾（immunodecoration）の特異性及び感受性について調べた。Braak VIとして神経病理学に病期分類されたＡＤ患者の凍結死後脳組織を使用することにより評価を行った。任意の化学薬品、即ち、アルデヒドで固定することなく、免疫組織化学法のために脳組織を低温切片化し、そして、処理した。マウスＩｇＧに特異的な蛍光標識された二次抗体を用いてｐタウ沈着物の検出を行い、そして、蛍光光学顕微鏡によってモニタした。
【０１２６】
簡潔に述べると、アルツハイマー病陽性であると診断された患者の死後に得られた皮質脳領域の固定されてない脳組織のクライオスタット切片を間接免疫蛍光法によって標識した。本報告では、ＡＤ患者（症例０１−０５；国内の脳バンク）の眼窩前頭組織から得られた画像を示す。連続２段階インキュベーションを用いて様々なクローンから結合したマウス抗体を検出したが、これはＣｙ３（Jackson Immuno Research）をコンジュゲートしたアフィニティー精製されたヤギ抗マウスIgG(H+L)によって明らかになった。切片化、染色、及び蛍光顕微鏡観察は、標準的な手順に従って行った。
【０１２７】
ｐタウ病変が特異的且つ高感度で染色されることは、クローン２．１０．３、２．２０．４及び５．６．１１について明らかである（図８）。全ての種類のｐタウ沈着物（即ち神経原線維変化）、糸屑状構造物及び異栄養性神経突起が安定して染色されていることが、明らかに視認できる。調査したクローン全てについて最小有効濃度は０．０５μg/mLであると決定され、これは、純粋なヒトｐタウ沈着物に対して高感度で結合することを示す。
【０１２８】
また、ｐタウ沈着物の検出は、本発明に係るIgG4抗体、及びヒトIgG4に特異的な蛍光標識された二次抗体を用いることによって行い、そして、蛍光光学顕微鏡によってモニタしてもよい。
【０１２９】
実施例６
タウPS2APPトリプルトランスジェニックマウスの作製
Ｂ６．１７２Ｈ系統のホモ接合体ＰＳ２ＡＰＰ雌（Ozmen, L. et al., Neurodegen. Dis. 6 (2009) 29-36）をタウＰ３０１Ｌ系統のホモ接合体タウ雄（Goetz et al., Science 293 (2001) 1491-1495）と交配することによってトランスジェニックタウPS2APPマウスを作製した。得られたトランスジェニックマウスは全て、ヒトＡＰＰスウェーデン型突然変異、ヒトプレセニリン２ N141I突然変異及びヒトタウP301L突然変異についてヘテロ接合体である。ヒトＡＰＰ及びタウトランスジーンの場合にはマウスＴｈｙ−１プロモーターによって、そして、ヒトプレセニリン２トランスジーンの場合にはプリオンプロモーターによって、トランスジーンの発現が駆動される。
【０１３０】
１２時間明暗サイクルで動物を飼育し、自由に食餌及び水を与えた。飼育施設は、Accreditation of Laboratory Animal Careによって認証された。全ての手順は、Swiss federal regulations on animal protection及びAssociation for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Careの規則を厳守し、国内の獣医学の専門家による明示的承認を受けて実施した。
【０１３１】
免疫組織化学法のためのマウスの処理：４％のイソフルランを使用してマウスに麻酔をかけ、断頭術によって屠殺した。EDTANaFでコーティングされたチューブ（Milian）に血液を回収した。脳を摘出し、ドライアイス上で直ちに凍結させ、更に使用するまで−８０℃で保存した。
【０１３２】
実験では、２０月齢の雄及び雌のマウスを用いた。この月齢では、これまでに試験した全てのマウスの脳で、細胞内の過リン酸化タウの蓄積及び神経原線維の病変が増加していることが明らかである。
【０１３３】
実施例７
タウPS2APPマウスモデルにおけるｐタウ沈着物の組織学的及び超微細構造的解析
タウPS2APPマウスは、幾つかの脳領域において検出可能な神経原線維変化に類似する構造を有するニューロン内のｐタウ沈着を伴う、年齢依存性且つ進行性の表現型を発現する。２４月齢で実質的なｐタウ病変が観察される。典型的に、細胞内のタウpS422について陽性である幾つかのニューロンは、海馬のＣＡ１領域の前頭前皮質及び錐体細胞層内、及び隣接する鉤状回でみられる。この月齢においてｐタウは、多形細胞層に、そして、海馬の白板境界に沿ってＣＡ３及び海馬采領域に、また線条に広がることが分かった。
【０１３４】
記載されている方法（Gallyas, F., Acta Morphologica Acad. Sci. Hung. 19 (1971) 1-8）に軽微な変更を施してGallyas銀染色を行った、即ち、３％の過ヨウ素酸中でプレインキュベートし、０．５％の酢酸で洗浄した後、更に５％のチオ硫酸ナトリウムで更に２分間洗浄した。標準的なヘマトキシリン及びエオシンを用いて対比染色を行った。Gallyas銀染色によって、タウPS2APPマウスの海馬及び皮質において多数のもつれ状沈着物が発生していることが確認された（図７Ａ）。
【０１３５】
免疫電子顕微鏡によってｐタウ沈着物の超微細構造を調べた。ＰＢＳ中２％のホルムアルデヒド及び０．５％のグルタルアルデヒドで１６月齢のタウPS2APPマウスを灌流した。Lowicryl HM20に脳切片を包埋し、そして、既に記載されている通り超薄切片を調製した（Richards, J.G. et al., J. Neurosci. 23 (2003) 8989-9003）。簡潔に述べると、１時間２％のＢＳＡを含むＰＢＳ中１０μg/mLの抗タウpS422と共に切片をインキュベートした。ＰＢＳ／２％ＢＳＡで６回洗浄した後、二次ヤギ抗マウスＩｇＧ（Amersham, Arlington Heights, IL）と共に切片をインキュベートし、１時間ＰＢＳ／２％ＢＳＡ／０．１％Tween（登録商標）20中１：２０にて１０nmの金にコンジュゲートさせ、そして、２％のＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄した。対照として、正常マウス血清で処理された切片を使用したところ、１０μm２の面積に金粒子が１０個未満という無視できる程度のバックグラウンドしか生じなかった。１００kVでJEOL 1210を用いて電子顕微鏡写真を撮影した。
【０１３６】
多数のｐタウ陽性ニューロンを有する１６月齢のタウPS2APPの海馬の超微細構造を観察したところ、樹状突起内で対らせん状線維（ＰＨＦ）に典型的な沈着物が免疫金標識されていることが明らかになった（図７Ｂ）。抗タウpS422 mAbで標識された超薄切片によって、黒い点として視認できる１０nmのコロイド金にコンジュゲートされた二次抗体によって明らかである通り、海馬のＣＡ１領域の樹状突起内の原線維状構造物に対して特異的に結合することが明らかになった（図７Ｂ）。免疫金標識によって、調べたタウPS2APPマウスのニューロンにおける細胞内原線維状構造物にタウのpS422エピトープが局在していることが立証された。標識された原線維の大きさ及び密度は、前記原線維がＡＤ患者の変性ニューロンにおいて観察されるＰＨＦに構造上相当することを示唆する。ｐタウＰＨＦの局在は、トランスジェニックタウPS2APPマウスにおける凝集したｐタウ沈着物の細胞内分布を明白に実証する。
【０１３７】
実施例８
免疫組織化学及び共焦点レーザー走査顕微鏡によって明らかにされたアルツハイマー病のｐタウマウスモデルの脳内の細胞内ｐタウに対する抗タウpS422モノクローナル抗体のインビボ結合
選択した抗タウpS422抗体（表１を参照）を２４月齢のタウPS2APPトリプルトランスジェニックマウスにおいて試験し、そして、インビボにおけるｐタウ沈着物に対する結合について評価した。実施例４に記載されているように、幾つかの脳領域において検出可能な神経原線維変化に類似する構造を有するニューロン内ｐタウ沈着を伴う年齢依存性及び進行性の表現型を発現するタウPS2APPマウスモデルにおいて研究を行った。
【０１３８】
使用されたタウpS422に対する抗体を２０mg/kgの用量でｉ．ｐ投与した。ｉｐ投与の２日後に免疫組織化学的染色を行って、ｐタウ沈着及び結合しているマウスＩｇＧサブタイプ抗体を検出した。投与の２日後に各群３匹のマウスを屠殺した。マウスに深く麻酔をかけ（５%v/vのForene（商標）で約２分間、ほとんど窒息状態に達するまで）、次いで、胸部を切開し、心膜を摘出し、ＰＢＳで灌流し、断頭し、脳を半分にし、そして、ドライアイスにおいてスナップ冷凍した。新鮮凍結脳の傍矢状クライオスタット切片をクライオスタット（CM3050S, Leica）で２０μmの厚さに切断し、予冷したHistobondスライド（Marienfeld, Lauda-Konigshofen, Germany）に載せて、−２０℃で保存した。
【０１３９】
結合している抗タウpS422抗体を検出するために三重免疫蛍光染色を適用した。ＰＢＳで切片を水和し、２分間−２０℃に予冷した１００％アセトンで処理した。室温にて染色オートマット（Autostainer Plus DakoCytomation, High Wycombe, UK）において全ての更なる工程を順次行った。０．０１％のTween20を含有しているＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５分間、脳切片を載せたスライドを洗浄し、そして、１％のウシ血清アルブミン、１％のオバルブミン及び１％の正常ヤギ血清を含むＰＢＳ中で２０分間順次インキュベートすることによって非特異的な結合部位のブロッキングを行った。ＰＢＳ及び０．０１％のTween20で洗浄した後、ＩｇＧアイソタイプ特異的検出抗体、即ち、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡ（ｐＨ７．４）中２０μg/mLでAlexa Fluor（登録商標）４８８色素（A21121、A21131又はA21141、Molecular Probes）に共有結合しているアフィニティー精製ヤギ抗マウスIgG1、IgG2a又はIgG2bと共に１時間スライドをインキュベートした。０．０１％のTween20を含むＰＢＳで洗浄した後、５μg/mLの抗ｐタウ抗体（ＡＴ−８、Pierce Biotechnology）、即ち、Alexa Fluor（登録商標）５５５色素に共有結合したタウタンパク質におけるリン酸化S202/S205エピトープに対するマウスモノクローナル抗体で標識し、１時間１％のウシ血清アルブミン、１％のオバルブミン及び１％の正常ヤギ血清を含むＰＢＳに適用することによってｐタウの局在を評価した。０．０１％のTween20を含むＰＢＳで洗浄した後、５分間ＰＢＳ中の１μg/mLの４，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（DAPI）で細胞核を対比染色した。０．０１％のTween（登録商標）20を含むＰＢＳで洗浄した後、５０mMの酢酸アンモニウム中４mMのCuSO4（ｐＨ５）において３０分間インキュベートしてクエンチすることによって、リポフスチンの自己蛍光を低下させた。再蒸留水でスライドをすすぎ、そしてＰＢＳ及び０．０１％のTween（登録商標）20で最後に洗浄した後、蛍光封入剤（S3023 DakoCytomation, High Wycombe, UK）でスライドを包埋した。ピンホールが１Airyに設定されたLeica SP2, AOBS共焦点レーザー走査顕微鏡で記録された、重複していない放射チャネルにおける最大投影像（Maximum projection image）を連続して記録した。
【０１４０】
２４月齢のタウPS2APPマウスにおいて実質的なｐタウ病変がみられた。典型的に、細胞内のタウpS422について強陽性である幾つかのニューロンは、海馬のＣＡ１領域の前頭前皮質及び錐体細胞層内、及び隣接する鉤状回にみられた。この月齢では、ｐタウは、多形細胞層に広がり、そして、海馬白板に沿ってＣＡ３及びフィンブリア領域、そして分界条へも広がっていることが分かった。
【０１４１】
２４月齢のタウPS2APPマウスの海馬体からの前頭前皮質及びＣＡ１領域における免疫染色を共焦点顕微鏡画像（図１〜６）で示す。明らかに、細胞内ｐタウ及び投与されたＩｇＧサブタイプ抗体を検出可能であり、実質的なｐタウ病変を含む脳領域の細胞に共局在していることが見出された。細胞内のIgG1局在についての例示を、ビヒクル対照（図２）と共に図１、３、及び４に示す。幾つかの細胞でIgG2a陽性細胞（図５）及びIgG2b（図６）もみられた。ｐタウ陽性細胞のうちの幾つかは、ＡＤ患者の脳組織の変性ニューロンでみられる神経原線維変化に類似する典型的な神経原線維の形態を示した。マウスＩｇＧサブタイプ抗体、特にIgG1及びｐタウの共局在した免疫反応性が、樹状突起、典型的には海馬体のＣＡ１領域の前頭前皮質及び顆粒細胞層において観察された（図３及び４）。
【０１４２】
試験した抗タウpS422抗体は全て、細胞内ｐタウ沈着物に対する特異的結合を示した。しかし、表３に示されるように、３つのＩｇＧアイソタイプ間で結合の程度は異なっていた。
【０１４３】
【表３】
表中、Ｘ＝軽度、ＸＸ＝中等度、及びＸＸＸ＝強いＩＨＣ反応性である。
【０１４４】
実施例９
抗タウpS422モノクローナル抗体による長期間処理がアルツハイマー病のマウスモデルにおけるタウ病変を減少させる
マウス抗タウpS422 Mabがアルツハイマー病マウスのマウスモデルにおけるタウ病変を減少させる能力について、タウ.PS2APPトリプルトランスジェニックマウスに前記抗体を４ヶ月間にわたって投与することにより試験する。したがって、２０匹のタウ.PS2APPトリプルトランスジェニックマウスの群（７月齢）を、マウス抗タウpS422Mab（クローン２．１０．３）のｉｐ投与によって週１回処理する。最終用量が２０mg/kgになるようにビヒクル（２０mMのヒスチジン、１４０mMのNaCl（ｐＨ６．０））中２mg/mLの濃度で抗体を投与する。２０匹のトリプルトランスジェニックのマウスの第２の群には、等体積のビヒクルを投与する。４か月後に、マウスを全て屠殺し、実施例５に記載されている通り脳を摘出した。次いで、脳をそれぞれ２つの半球に分割し、そのうち１つを、実施例５に記載されている通り免疫組織化学法用に調製する。第２の半球は、下記のようなイムノアッセイによりｐタウ量を定量するために使用する。
【０１４５】
１． タウ及びｐタウアッセイのためのマウス脳の抽出
脳を計量し、２５mMのTrisCl、８００mMのNaCl、１０％のスクロース（ｐＨ７．５）を含む氷冷バッファ１０体積中にてガラスホモジナイザーを用いてホモジネートする。次いて、２０，０００×ｇでホモジネートを遠心分離する。得られる上清を、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／１％Tween（登録商標）20で１：１００（タウアッセイの場合）又は１：１０（ｐタウアッセイの場合）に希釈する。
【０１４６】
２． タウ及びｐタウのアッセイ
Meso Scale Discovery（商標）アッセイプラットフォーム（MSD, Gaithersburg, Maryland, USAMD）を使用して全てのアッセイを行った。ＭＳＤによって提供される標準プロトコールに従って、捕捉抗体及び検出抗体をそれぞれビオチン及びSULFO-Tag（商標）で標識する。以下の抗体をアッセイで使用した：（ｉ）Johnson, G.V. et al., J. Neurochem 68 (1997) 430-433に記載されている、タウのアミノ酸１９〜４６に対するマウス抗体である５Ａ６；（ii）タウのｐＴ２３１に対して検出されたマウス抗体であるＡＴ１８０［Innogenetics, Belgium］；（iii）EP1876185A1に記載されているマウス抗タウpS422クローン２．５．２；（iv）完全長タウに対するマウス抗タウクローン４／５３。捕捉抗体として抗体５Ａ６を使用し、残りの抗体は検出抗体として使用する。
【０１４７】
ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルＭＳＤプレートを５％のＢＳＡでＲＴにて１時間ブロッキングする。洗浄バッファ（ＰＢＳ、０．０５％のTween（登録商標）20）でプレートを３回洗浄する。次いで、アッセイバッファ（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／１％Tween（登録商標）20）で希釈した捕捉抗体を添加し、そして、プレートを３０分間４℃でインキュベートした。続いてプレートを１回洗浄する。次いで、７５μLのアッセイバッファを各ウェルに添加し、次いで、２５μLの希釈した脳上清及び２５μLのSulfoタグ付検出抗体を添加した。１時間４℃でプレートを振盪し、続いて、１回洗浄した。最後に、１７０μLのＭＳＤリードバッファを添加し、MSD Sector Imager 6000でプレートを読み取った。
【０１４８】
マウス脳抽出物におけるタウ及びタウpS422を定量するために、実施例２に記載されているように調製されたタウ及びタウpS422を使用して検量線を作成した。
【０１４９】
抗タウpS422モノクローナル抗体で長期間処理することによるタウ.PS2APPトリプルトランスジェニックマウスのタウ病変の減少は、同月齢のビヒクル処理マウスと比べて、１１月齢の抗体で処理されたマウスで典型的なタウ病変の減少が観察されたことによって証明される。この減少は、免疫組織化学によって検出される神経原線維変化量の減少、及び定量的イムノアッセイによって測定される脳抽出物中に存在する様々なｐタウ種の量の減少によって表される。
【０１５０】
実施例１０
ウサギ抗体の調製及び精製
ａ）免疫
Charles River Laboratories International, Inc製のＮＺＷウサギを免疫に使用した。ＫＬＨにカップリングしたリンペプチドタウ(416-430)[pS422]を１mg/mLの濃度でK3PO4バッファ（ｐＨ７．０）に溶解させ、安定なエマルションが生成されるまで完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合した（１：１）。３匹のウサギに、２mLのエマルションを皮内（i.d.）注射し、次いで、１週間間隔でそれぞれ１mLを２回目は筋肉内（i.m.）、３回目は皮下（s.c.）に注射した。４回目の１mLのi.m.注射を２週間後に実施し、次いで、４週間間隔で１mLのs.c.注射を更に２回行った。各動物の末梢全血サンプル１０mLを３、４、５、及び６回目の注射の４〜６日後に採取し、ＦＡＣＳにおける単一細胞選別に用いた。同時に各動物から更に０．５mLの血清を採取し、タウ(416-463)[pS422]に特異的な抗体応答の決定に使用した。
【０１５１】
ｂ）抗体応答
ELISAを用いて血清の連続希釈物によって免疫に対する抗体応答を決定し、ここでは、予めストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルマイクロタイタープレート（MC1347, Micro Coat Biotechnologie GmbH, Bernried, Germany）上で一晩４℃にて１×ＰＢＳ中において、１ウェルあたり３０ngのビオチン化タウ(416-430)[pS422]をインキュベートした。検出については、ワサビペルオキシダーゼ（The Jackson laboratory）に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧを１：１６０００希釈して使用した。可視化のために、Roche Diagnostics GmbH製の既製溶液であり、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を沈殿させるBM Blue POD Substratを使用した。１ＮのＨＣｌを用いて反応を停止させ、４５０／６９０nmでTecan製Infiniteによって測定した。
【０１５２】
ｃ）Ｂ細胞クローニング
プレートのコーティング
無菌のストレプトアビジンコーティングされた６ウェルプレート（細胞培養グレード）を、１時間室温で、それぞれＰＢＳ中０．５〜１μg/mLの濃度の３つのビオチン化された対照ペプチド（非リン酸化タウ(416-430)、MCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]及びＭＡＰ２＿ヒト(1802-1816)[pSer-1802]）の混合物又はビオチン化リンペプチドタウ(416-430)[pS422]と共にインキュベートした。使用前に無菌ＰＢＳでプレートを３回洗浄した。４℃で一晩、炭酸塩バッファ（０．１Ｍの重炭酸ナトリウム、３４mMの炭酸水素二ナトリウム、ｐＨ９．５５）中２μg/mLのＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）で細胞培養用６ウェルプレートをコーティングした。使用前に無菌ＰＢＳでプレートを３回洗浄した。
【０１５３】
ウサギ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
ウサギＰＢＭＣを単離するために実施したlympholyte mammal (Cedarlane Laboratories)による密度遠心分離の前に、１×ＰＢＳでEDTA含有全血を２倍に希釈した。抗体で染色する前に２回ＰＢＭＣを洗浄した。
【０１５４】
ＥＬ−４ Ｂ５培地
１０％のＦＣＳ(Hyclone, Logan, UT, USA)、２mMのグルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシン溶液（PAA, Pasching, Austria）、２mMのピルビン酸ナトリウム、１０mMのHEPES（PAN Biotech, Aidenbach, Germany）及び０．０５mMのベータ−メルカプトエタノール(Gibco, Paisley, Scotland)を添加したRPMI 1640（Pan Biootech, Aidenbach, Germany）。
【０１５５】
マクロファージ／単球の枯渇
無菌６ウェルプレート（細胞培養グレード）を使用して、非特異的な付着によってマクロファージ及び単球を枯渇させた。ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）か又はストレプトアビジン及び対照ペプチドのいずれかでウェルをコーティングした。各ウェルに最大４mLの培地及び免疫したウサギの６×１０６以下の末梢血単核細胞を充填し、インキュベータにおいて３７℃で１時間結合させた。パニング工程のために上清中の細胞の５０％を使用した；残りの５０％の細胞は、免疫蛍光染色及び単一細胞選別に直接供した。
【０１５６】
ペプチドにおけるＢ細胞のパニング
６ウェル組織培養プレートをストレプトアビジン及びビオチン化されたペプチドタウ(416-430)[pS422]でコーティングし、４mLの培地につき６×１０６以下の細胞になるように播種し、インキュベータにおいて３７℃で１時間結合させた。１×ＰＢＳで１〜２回ウェルを慎重に洗浄することにより、非付着細胞を除去した。インキュベータにおいて３７℃で１０分間、トリプシンによって残りの粘着性細胞を剥がし、次いで、培地で２回洗浄した。免疫蛍光染色まで細胞を冷凍しておいた。
【０１５７】
免疫蛍光染色及び単一細胞選別
単一細胞選別に使用した抗ウサギIgG FITCは、AbD Serotec (STAR121F, Dusseldorf, Germany)製であった。表面の染色については、枯渇及びパニング工程から得られた細胞を暗条件下の４℃の冷温室で回転させながら、３０分間ＰＢＳ中で抗ウサギIgG FITC抗体と共にインキュベートした。遠心分離後、吸引によって上清を除去した。ＰＢＭＣを２サイクルの遠心分離に供し、氷冷ＰＢＳで洗浄した。最後に、氷冷ＰＢＳにＰＢＭＣを再懸濁させ、直ちにＦＡＣＳ分析に供した。死細胞と生細胞とを識別するために、ＦＡＣＳ分析前に５μg/mLの濃度のヨウ化プロピジウム（BD Pharmingen, San Diego, CA, USA）を添加した。FACSDivaソフトウェア(BD Biosciences, USA)を備えるBecton Dickinson FACSAriaを用いてＦＡＣＳを実施したところ、ＦＩＴＣで標識された生細胞が１個、９６ウェルプレートに付着した。
【０１５８】
Ｂ細胞の培養
Zubler, R.H. et al., J Immunol. 134 (1985) 3662-3668によって記載されている方法に類似の方法によってＢ細胞培養物を調製した。簡潔に述べると、インキュベータにおいて５％ＣＯ２雰囲気、３７℃で７日間、Pansorbin細胞（１：２００００）(Calbiochem (Merck), Darmstadt, Deutschland)、５％のウサギ胸腺細胞上清及びガンマ線を照射したEL-4 B5マウス胸腺腫細胞（２×１０４／ウェル）を含む２１０μL／ウェルのEL-4 B5培地と共に、単一選別されたＢ細胞を９６ウェルプレートで培養した。スクリーニングのためにＢ細胞培養液上清を除去し、そして、可変領域遺伝子クローニングのために直ちに細胞を収集したか、又は１００μLのＲＬＴバッファ(Qiagen, Hilden, Germany)中にて−８０℃で凍結させた。
【０１５９】
ｄ）Ｂ細胞クローンのスクリーニング
ELISAによって、ビオチン化されたタウ(416-430)[pS422]に対する結合についてＢ細胞培養液上清をスクリーニングした。対照抗原として非リン酸化タウ(416-430)、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）及び無関係なリンペプチドMCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]を使用した。ELISAプレートの調製については、室温で１時間５０ng/mLのビオチン化されたタウ(415-430)[pS422]と共に、ストレプトアビジンで予めコーティングされたマイクロタイタープレートをインキュベートした。ＫＬＨ又は対照のペプチドによるコーティングは、１μg/mLで行った。Ｂ細胞上清を１：５〜１：１０で希釈し、６０分間、抗原でコーティングされたマイクロタイタープレートにおいてインキュベートした。激しく洗浄した後、ヒツジ抗ウサギＩｇＧジゴキシゲニンがコンジュゲートした検出抗体（Chemicon AQ301D）を使用して、ウサギ抗体の結合を検出した。室温でＴＭＢと共にインキュベートした後、３７０nm〜４９２nmで吸光度を測定した。ビオチン化タウ(416-430)[pS422]ではバックグラウンドを超えるシグナルが得られたが、ＫＬＨ及びMCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]では得られなかったＢ細胞クローンを更に検討し、可変領域遺伝子クローニングに供した。
【０１６０】
ｅ）ＶドメインのＰＣＲ増幅及び配列決定
製造業者のプロトコールに従ってNucleoSpin（登録商標）8/96 RNA kit (Macherey&Nagel;740709.4, 740698)を使用して、全ＲＮＡを調製した。工程は全てepMotion 5075液体ハンドリングシステム（Eppendorf）で行った。６０μLのRNase不含水でＲＮＡを溶出した。製造業者の指示に従ってSuperscript III First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen 18080-400)及びoligo dT−プライマーを使用して、逆転写酵素反応によってｃＤＮＡを生成するために６μLのＲＮＡを使用した。重鎖にはプライマーrbHCfinal.up及びrbHCfinal.do、軽鎖にはrbLCfinal.up及びrbLCfinal.doを使用して（表４）、最終体積５０μLのAccuPrime Supermix(Invitrogen 12344-040)で免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を増幅するために４μLのｃＤＮＡを使用した。ＰＣＲ条件は以下の通りであった：９４℃で５分間ホットスタート；９４℃で２０秒間、７０℃で２０秒間、６８℃で４５秒間を３５サイクル、及び６８℃で７分間最終伸長。
【０１６１】
【表４】
【０１６２】
48E-Gel 2%(Invitrogen G8008-02)に５０μLのＰＣＲ溶液のうち８μLをロードした。製造業者のプロトコールに従ってNucleoSpin（登録商標）Extract IIキット（Macherey&Nagel;740609250）を使用して陽性ＰＣＲ反応物を精製し、５０μLの溶出バッファに溶出した。１２μLの精製ＰＣＲ生成物を、重鎖にはrbHCfinal.up及びrbHCfinal.do、軽鎖にはrbLCfinal.up及びrbLCfinal.doを使用して（表４）、両方向に直接配列決定した。
【０１６３】
ｄ）ウサギモノクローナル抗体及びウサギ／マウスキメラ抗体の組み換え発現
ウサギモノクローナル抗体の組み換え発現については、オーバーハングクローニング法（Haun, R.S. et al., Biotechniques 13 (1992) 515-518; Li, M.Z., et al., Nature Methods 4 (2007) 251-256）によってＶＨ又はＶＬをコードするＰＣＲ生成物をｃＤＮＡとして発現ベクターにクローニングした。重複するプライマーを使用するＰＣＲによって、ＶＨ挿入物のウサギのカッパ又はガンマ定常領域及びＶＬをコードする線形化された発現プラスミドを増幅させた。一本鎖オーバーハングを生成するＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと共に精製されたＰＣＲ生成物をインキュベートした。ｄＣＴＰを添加することにより反応を停止させた。次の工程で、プラスミド及び挿入物を組換え、部位特異的組換を誘導するｒｅｃＡと共にインキュベートした。組換えされたプラスミドをE.coliに形質転換した。翌日、増殖したコロニーを取り、プラスミド調製、制限解析及びＤＮＡ配列決定によって正確な再結合されたプラスミドについて試験した。抗体発現については、単離されたＨＣ及びＬＣプラスミドを一過的にHEK293細胞へコトランスフェクトし、１週間後に上清を収集した。ウサギマウスキメラ抗体のクローニング及び発現については、ＰＣＲによってＶＨ及びＶＬの領域を増幅し、マウス定常カッパ又はマウス定常ガンマ１領域を含む発現ベクターへサブクローニングした。ウサギ／マウスキメラＨＣ及びＬＣプラスミドを単離し、正確に挿入するために制限解析及びＤＮＡ配列決定によって試験し、HEK293細胞へ一過的にコトランスフェクトした。トランスフェクションの１週間後に上清を収穫した。
【０１６４】
ｅ）抗体精製
組換え発現したウサギ抗体をMabSelectSuRe（商標）カラム(GE Healthcare)で細胞培養上清から精製した。サンプルをカラムにロードする前に、２５mmol/LのTris-HCl、２５mmol/LのNaCl（ｐＨ７．４）でカラムを平衡化した。５０mmol/Lの酢酸塩（ｐＨ３．１４）で抗体を溶出した。溶出されたサンプルを直ちに脱塩カラム（Sephadex G25, GE Healthcare）にロードし、２０mmol/LのHis-HCl、１４０mmol/LのNaCl（ｐＨ６．０）に溶出した。精製された抗体の保存にもこのバッファを使用した。一般的な保存温度は４℃であり、精製工程後は室温であり、分注後は−８０℃であった。細胞培養上清から得られた組換え発現したウサギ／マウスキメラ抗体をMabSelectSuRe(商標)カラム(GE Healthcare)で精製した。サンプルをロードする前に、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でカラムを平衡化した。１００mmol/Lのクエン酸塩（ｐＨ３．０）で抗体を溶出した。溶出されたサンプルを直ちに２mol/LのTris/HCl（ｐＨ９．０）で中和した。サイズ排除カラム(Superdex 200, GE Healthcare)に抗体をロードした後、２０mmol/LのHis-HCl、１４０mmol/LのNaCl（ｐＨ６．０）に溶出した。精製された抗体の保存にもこのバッファを使用した。一般的な保存温度は４℃であり、精製工程後は室温であり、分注後は−８０℃であった。
【０１６５】
実施例１１
抗タウpS422モノクローナルウサギ抗体は、pS422がリン酸化されたタウに対して高度に選択的であり、タウpS422の原線維状凝集体に結合する
ａ）ELISA
HEK293細胞においてウサギモノクローナル抗体を組み換え発現させた。ELISAにより、ビオチン化タウ(416-430)[pS422]、非リン酸化タウ(416-430)、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）及び無関係なリンペプチドMCAK＿ヒト(88-102)[95-pSer]に対する結合について、細胞培養上清又は精製されたウサギ抗体を試験した。ELISAプレートの調製については、室温で１時間５０ng/mLのビオチン化タウ(415-430)[pS422]と共に、ストレプトアビジンで予めコーティングされたマイクロタイタープレートをインキュベートした。ＫＬＨ又は対照ペプチドによるコーティングは、１μg/mLで行った。様々な濃度で６０分間、抗原で標識されたマイクロタイタープレートにおいて、ウサギ抗タウpS422抗体（Abcam AB51071）又は上清を含有しているウサギ抗体をインキュベートした。激しく洗浄した後、ヒツジ抗ウサギＩｇＧジゴキシゲニンがコンジュゲートした検出抗体（Chemicon AQ301D）を使用して、ウサギ抗体の結合を検出した。室温でＴＭＢと共にインキュベートした後、３７０nm〜４９２nmで吸光度を測定した。ＥＣ５０値によって抗体結合の特性評価を行った。ビオチン化タウ(416-430)［pS422］及び非リン酸化タウ(416-430)ペプチドに対する抗体結合を、そのＥＣ５０値によって特性評価した。高濃度、即ち、１：５で希釈された細胞培養上清における一点測定によって、ＫＬＨ又はMCAKリンペプチドの交差反応性を推定した。結果を表５に示す。リンタウペプチドに対する結合のＥＣ５０値は、タウペプチドに対する結合のＥＣ５０値の１００分の１未満であることが見出され、これは、非リン酸化タウペプチドに比べてリン酸化タウ断片に対する選択性が少なくとも１００位であることを示唆する。ＫＬＨ及びMCAK対照リンペプチドに対する結合は、全ての抗体でバックグラウンドレベルであり、これは、タウリンペプチドの最大値測定の約１＜３％である。
【０１６６】
【表５】
【０１６７】
可溶性であり、そして凝集した完全長タウpS422に対する特異性も試験した。室温で一晩、タウpS422（３００μg/mL）の原線維状凝集体をポリスチレン系MaxiSorbマイクロタイタープレート（Nunc）にコーティングした。同様の方法で、MaxiSorbマイクロタイタープレートに可溶性の完全長タウ及びタウpS422をコーティングした。ウサギ抗タウpS422抗体対照（Abcam AB51071）又は精製されたウサギ抗体を添加し、そして、１０００ng/mL以下の濃度で６０分間インキュベートした。激しく洗浄した後、ヒツジ抗ウサギＩｇＧジゴキシゲニンがコンジュゲートした検出抗体（Chemicon AQ301D）を使用して、ウサギ抗体の結合を検出した。室温でＴＭＢと共にインキュベートした後、３７０nm〜４９２nmで吸光度を測定した。ＥＣ５０値によって抗体結合の特性評価を行った。結果を表６に示す。
【０１６８】
【表６】
【０１６９】
ウサギモノクローナル抗体は、１ng/mL未満のＥＣ５０値でタウ−pS422タンパク質に結合した。０．４ng/mL〜１４ng/mLのＥＣ５０値で原線維状タウpS422を検出した。非リン酸化の完全長タウタンパク質に対する結合のシグナルは、バックグラウンドレベルと判別不可能であった。したがって、タウと比較して、少なくとも１００倍の選択性で、それぞれの抗体がタウpS422及び原線維状タウpS422に結合すると評価された。
【０１７０】
ｂ）Biacore（商標）
BIAcore（商標）分析によって、原線維状タウpS422凝集体に対する結合について更に調べ、確認した。３７℃でBIAcore 3000機器を使用して測定を行った。システム及びサンプルのバッファは、HBS-EP（１０mMのHEPES、１５０mMのNaCl、３．４mMのEDTA、０．００５％のポリソルベート２０(v/v)）であった。BIAcore（商標）ＣＭ５センサチップをプレコンディショニング手順に供した。連続して、フローセルＦＣ１、ＦＣ２、ＦＣ３及びＦＣ４上に３０秒間０．１％のＳＤＳ、５０mMのNaOH、１０mMのＨＣｌ及び１００mMのH3PO4を注入した。アミンカップリング手順は、BIAcore 3000（商標）ウィザードｖ．４．１を使用して、製造業者の指示に従って行った。センサ表面をＥＤＣ／ＮＨＳで活性化した後、センサのフローセルＦＣ２、ＦＣ３及びＦＣ４上に非リン選択性抗タウ抗体mAb<TAU>M-4/53-IgGを固定化した。対照として、無関係の抗原を認識するCK-MM（クレアチンキナーゼアイソタイプ）に対する抗体をＦＣ１上に捕捉した。１０mMのＮａＡｃ（ｐＨ５．０）中３０μg/mLになるようにmAb<TAU>M-4/53-IgG及びCK-MMに対する抗体を希釈し、１０．０００ＲＵの抗体捕捉系を固定化するために、７分間の接触時間で１０μL／分にて注入した。１Ｍエタノールアミンで飽和させることによって表面を不活化した。２分間１０μL／分で溶液中のアナライトとしてリン酸化線維状タウタンパク質（原液０．３mg/mLをHBS-EPで１：１００に希釈した）を用いて５サイクル、センサをコンディショニングした。３分間、３０μL／分で１０mMのグリシン（ｐＨ２．５）で再生を行った。mAb 4/53からのｐタウ線維の解離を観察することができなかったので、mAb 4/53に対するアナライトの結合はｐタウ線維を解離させないと仮定する。全ての更なる測定サイクルについては、０．３mg/mLのｐタウ線維をHBS-EPバッファで１：１００に希釈し、不均一なサンドイッチ法において各抗体アナライトにｐタウを提示するために、１分間、１０μL／分で注入した。抗体アナライトをHBS-EPバッファで１００nMの濃度に希釈し、３分間２０μL／分で系に注入した。３分間の解離後、１００μL／分で１分間、１０mMのグリシン（ｐＨ２．５）を２回注入し、次いで、１００μL／分で１５秒間ＨＢＳで洗浄することによってセンサ表面を再生した。相互作用の会合及び解離相をモニタした。溶液中の抗体アナライトが二価であるので、アビディティに重み付けした（avidity-burdened）抗体―ｐタウカイネティクスを、速やかな親和性に基づく早期解離工程と、後半の錯体解離におけるアビディティは安定化しているが、律速であるカイネティック工程からなる二相解離モデルによって特性評価した。アナライト注入が終了した１０秒後（早期）及び５０秒後（後期）、可能な場合ｋｄ及びｔ／２ ｄｉｓｓを定量した。ダブルレファレンシング手順を使用して、カイネティクス測定値を評価した。先ず、ＦＣ１レファレンスからのシグナルを減じて、バッファの溶液効果及び非特異的結合を補正した。次に、０nMのアナライト注入を減じて、それぞれの捕捉系からの一次抗体の解離を補正した。Biacore（商標）評価ソフトウェアｖ．４．１に従ってラングミュア１．１解離適合モデルを使用して、反応速度を評価した。式ｌｎ（２）／６０×ｋｄに従って抗原／抗体複合体安定半減期（分）を計算した。
【０１７１】
結果を表７に要約する。
【０１７２】
【表７】
【０１７３】
実施例１２
アルツハイマー病患者の脳切片における細胞内ｐタウに対する抗タウpS422モノクローナルウサギ抗体の結合
ＡＤ患者のヒト脳組織の低温切片を用いる免疫蛍光染色実験によって、モノクローナルウサギ抗タウpS422抗体によるアルツハイマー病脳組織のｐタウ病変の免疫組織化学的検出の特異性及び感受性について調べた。この手順は基本的に実施例Ｘ（マウス抗体）に記載されているのと同じ手順であった。ヤギ抗ウサギAlexa Fluor488（登録商標）をコンジュゲートした二次抗体（Invitrogen/MolecularProbes A11034）によってウサギＩｇＧを検出した。ｐタウ沈着物及び線維は、クローンMab005、Mab019、Mab020、Mab085、Mab086及びMab097についての特異的且つ高感度に染色されていることが明らかである。大きな神経原線維変化及び細長い糸屑状構造物のような、細胞内のｐタウ沈着が顕著である。調査したクローン全てについて最小有効濃度は０．０８〜０．０１６μg/mLであると測定され、これは、純粋なヒトｐタウ沈着物に対して高感度で結合することを示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タウオパシーの治療で使用するための、配列番号９で表されるリン酸化タウ断片及びタウpS422には特異的に結合するが、タウ及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片には結合しないことを特徴とする、セリン４２２がリン酸化されているタウ（タウpS422）に結合する抗体。
【請求項２】
前記抗体が、ヒトのIgG1サブタイプ又はIgG4サブタイプの抗体であることを特徴とする請求項１に記載の通り使用するための抗体。
【請求項３】
タウオパシーを治療する医薬を製造するための、配列番号９で表されるリン酸化タウ断片及びタウpS422には特異的に結合するが、タウ及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片には結合しないことを特徴とする、セリン４２２がリン酸化されているタウ（タウpS422）に結合する抗体の使用。
【請求項４】
前記抗体が、ヒトのIgG1サブタイプ又はIgG4サブタイプの抗体であることを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項５】
以下：
ａ）配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、及び配列番号８で表されるCDR3H、
ｂ）配列番号２３で表されるCDR1H、配列番号２４で表されるCDR2H、及び配列番号２５で表されるCDR3H、
ｃ）配列番号３１で表されるCDR1H、配列番号３２で表されるCDR2H、及び配列番号３３で表されるCDR3H、
ｄ）配列番号３９で表されるCDR1H、配列番号４０で表されるCDR2H、及び配列番号４１で表されるCDR3H、
ｅ）配列番号４７で表されるCDR1H、配列番号４８で表されるCDR2H、及び配列番号４９で表されるCDR3H、
ｆ）配列番号５５で表されるCDR1H、配列番号５６で表されるCDR2H、及び配列番号５７で表されるCDR3H、又は
ｇ）配列番号６３で表されるCDR1H、配列番号６４で表されるCDR2H、及び配列番号６５CDR3H
を含むことを特徴とする、セリン４２２がリン酸化されているタウ（タウpS422）に結合する抗体。
【請求項６】
以下：
ａ）配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、配列番号８で表されるCDR3H、及び配列番号３で表されるCDR1L、配列番号４で表されるCDR2L、配列番号５で表されるCDR3L、
ｂ）配列番号２３で表されるCDR1H、配列番号２４で表されるCDR2H、配列番号２５で表されるCDR3H、及び配列番号２７で表されるCDR1L、配列番号２８で表されるCDR2L、配列番号２９で表されるCDR3L、
ｃ）配列番号３１で表されるCDR1H、配列番号３２で表されるCDR2H、配列番号３３で表されるCDR3H、及び配列番号３５で表されるCDR1L、配列番号３６で表されるCDR2L、配列番号３７で表されるCDR3L、
ｄ）配列番号３９で表されるCDR1H、配列番号４０で表されるCDR2H、配列番号４１で表されるCDR3H、及び配列番号４３で表されるCDR1L、配列番号４４で表されるCDR2L、配列番号４５で表されるCDR3L、
ｅ）配列番号４７で表されるCDR1H、配列番号４８で表されるCDR2H、配列番号４９で表されるCDR3H、及び配列番号５１で表されるCDR1L、配列番号５２で表されるCDR2L、配列番号５３で表されるCDR3L、
ｆ）配列番号５５で表されるCDR1H、配列番号５６で表されるCDR2H、配列番号５７で表されるCDR3H、及び配列番号５９で表されるCDR1L、配列番号６０で表されるCDR2L、配列番号６１で表されるCDR3L、又は
ｇ）配列番号６３で表されるCDR1H、配列番号６４で表されるCDR2H、配列番号６５で表されるCDR3H、及び配列番号６７で表されるCDR1L、配列番号６８で表されるCDR2L、配列番号６９で表されるCDR3L
を含むことを特徴とする請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
以下：
ａ）配列番号１で表される可変軽鎖及び配列番号２で表される可変重鎖、
ｂ）配列番号２６で表される可変軽鎖及び配列番号２２で表される可変重鎖、
ｃ）配列番号３４で表される可変軽鎖及び配列番号３０で表される可変重鎖、
ｄ）配列番号４２で表される可変軽鎖及び配列番号３８で表される可変重鎖、
ｅ）配列番号５０で表される可変軽鎖及び配列番号４６で表される可変重鎖、
ｆ）配列番号５８で表される可変軽鎖及び配列番号５４で表される可変重鎖、又は
ｇ）配列番号６６で表される可変軽鎖及び配列番号６２で表される可変重鎖
を含むことを特徴とする請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
ヒトのIgG1サブタイプ又はIgG4サブタイプの抗体であることを特徴とする請求項５から７のいずれかに記載の抗体。
【請求項９】
請求項５から８のいずれかに記載の抗体のキメラ抗体変異体、ヒト化抗体変異体、又はＴ細胞エピトープ枯渇抗体変異体。
【請求項１０】
タウオパシーを治療する医薬を製造するための、請求項５から９のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項１１】
前記抗体が、ヒトのIgG1サブタイプ又はIgG4サブタイプの抗体であることを特徴とする請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
請求項５から９のいずれかに記載の抗体を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
医薬組成物を製造するための、請求項５から９のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項１４】
神経原線維型アルツハイマー病を含むアルツハイマー病（ＡＤ）、ダウン症候群（成人症例）、グアムパーキンソン認知症複合、ボクサー認知症、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、前頭側頭型認知症、皮質基底核変性症、淡蒼球−橋−黒質変性、進行性核上性麻痺、及び神経原線維変化を伴うゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病からなる群より選択されるタウオパシーを治療するための、請求項５から９のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項１５】
請求項５から９のいずれかに記載の抗体を含むことを特徴とする医薬組成物を製造するための方法。
【請求項１６】
請求項５から９のいずれかに記載の抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードすることを特徴とする核酸。
【請求項１７】
請求項５から９のいずれかに記載の組換えヒト抗体又は組換えヒト化抗体を生成するための方法であって、原核生物又は真核生物のホスト細胞において請求項１６に記載の核酸を発現させ、前記細胞又は細胞培養上清から前記抗体を回収することを特徴とする方法。
【請求項１８】
タウオパシー、特にＡＤに罹患している患者を治療するための方法であって、請求項５から９のいずれかに記載の抗体を前記患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項１９】
タウオパシーを治療する医薬を製造するための、配列番号１で表される可変軽鎖及び配列番号２で表される可変重鎖を含む抗体が結合するのと同じエピトープでセリン４２２がリン酸化されているタウに特異的に結合することを特徴とする抗体の使用。
【請求項２０】
抗体が、ヒトのIgG1サブタイプ又はIgG4サブタイプの抗体であることを特徴とする請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
タウオパシーの治療に用いるための、配列番号１で表される可変軽鎖及び配列番号２で表される可変重鎖を含む抗体が結合するのと同じエピトープでセリン４２２がリン酸化されているタウに特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項２２】
ヒトのIgG1サブタイプ又はIgG4サブタイプの抗体であることを特徴とする請求項２０に記載の使用のための抗体。
【請求項２３】
配列番号９で表されるリン酸化タウ断片及びタウpS422には特異的に結合するがタウ及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片には結合しない、セリン４２２がリン酸化されているタウ（タウpS422）に結合する抗体の治療有効量と、薬学的に許容しうる担体とを含む医薬組成物。
【請求項１】
タウオパシーの治療で使用するための、配列番号９で表されるリン酸化タウ断片及びタウpS422には特異的に結合するが、タウ及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片には結合しないことを特徴とする、セリン４２２がリン酸化されているタウ（タウpS422）に結合する抗体。
【請求項２】
前記抗体が、ヒトのIgG1サブタイプ又はIgG4サブタイプの抗体であることを特徴とする請求項１に記載の通り使用するための抗体。
【請求項３】
タウオパシーを治療する医薬を製造するための、配列番号９で表されるリン酸化タウ断片及びタウpS422には特異的に結合するが、タウ及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片には結合しないことを特徴とする、セリン４２２がリン酸化されているタウ（タウpS422）に結合する抗体の使用。
【請求項４】
前記抗体が、ヒトのIgG1サブタイプ又はIgG4サブタイプの抗体であることを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項５】
以下：
ａ）配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、及び配列番号８で表されるCDR3H、
ｂ）配列番号２３で表されるCDR1H、配列番号２４で表されるCDR2H、及び配列番号２５で表されるCDR3H、
ｃ）配列番号３１で表されるCDR1H、配列番号３２で表されるCDR2H、及び配列番号３３で表されるCDR3H、
ｄ）配列番号３９で表されるCDR1H、配列番号４０で表されるCDR2H、及び配列番号４１で表されるCDR3H、
ｅ）配列番号４７で表されるCDR1H、配列番号４８で表されるCDR2H、及び配列番号４９で表されるCDR3H、
ｆ）配列番号５５で表されるCDR1H、配列番号５６で表されるCDR2H、及び配列番号５７で表されるCDR3H、又は
ｇ）配列番号６３で表されるCDR1H、配列番号６４で表されるCDR2H、及び配列番号６５CDR3H
を含むことを特徴とする、セリン４２２がリン酸化されているタウ（タウpS422）に結合する抗体。
【請求項６】
以下：
ａ）配列番号６で表されるCDR1H、配列番号７で表されるCDR2H、配列番号８で表されるCDR3H、及び配列番号３で表されるCDR1L、配列番号４で表されるCDR2L、配列番号５で表されるCDR3L、
ｂ）配列番号２３で表されるCDR1H、配列番号２４で表されるCDR2H、配列番号２５で表されるCDR3H、及び配列番号２７で表されるCDR1L、配列番号２８で表されるCDR2L、配列番号２９で表されるCDR3L、
ｃ）配列番号３１で表されるCDR1H、配列番号３２で表されるCDR2H、配列番号３３で表されるCDR3H、及び配列番号３５で表されるCDR1L、配列番号３６で表されるCDR2L、配列番号３７で表されるCDR3L、
ｄ）配列番号３９で表されるCDR1H、配列番号４０で表されるCDR2H、配列番号４１で表されるCDR3H、及び配列番号４３で表されるCDR1L、配列番号４４で表されるCDR2L、配列番号４５で表されるCDR3L、
ｅ）配列番号４７で表されるCDR1H、配列番号４８で表されるCDR2H、配列番号４９で表されるCDR3H、及び配列番号５１で表されるCDR1L、配列番号５２で表されるCDR2L、配列番号５３で表されるCDR3L、
ｆ）配列番号５５で表されるCDR1H、配列番号５６で表されるCDR2H、配列番号５７で表されるCDR3H、及び配列番号５９で表されるCDR1L、配列番号６０で表されるCDR2L、配列番号６１で表されるCDR3L、又は
ｇ）配列番号６３で表されるCDR1H、配列番号６４で表されるCDR2H、配列番号６５で表されるCDR3H、及び配列番号６７で表されるCDR1L、配列番号６８で表されるCDR2L、配列番号６９で表されるCDR3L
を含むことを特徴とする請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
以下：
ａ）配列番号１で表される可変軽鎖及び配列番号２で表される可変重鎖、
ｂ）配列番号２６で表される可変軽鎖及び配列番号２２で表される可変重鎖、
ｃ）配列番号３４で表される可変軽鎖及び配列番号３０で表される可変重鎖、
ｄ）配列番号４２で表される可変軽鎖及び配列番号３８で表される可変重鎖、
ｅ）配列番号５０で表される可変軽鎖及び配列番号４６で表される可変重鎖、
ｆ）配列番号５８で表される可変軽鎖及び配列番号５４で表される可変重鎖、又は
ｇ）配列番号６６で表される可変軽鎖及び配列番号６２で表される可変重鎖
を含むことを特徴とする請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
ヒトのIgG1サブタイプ又はIgG4サブタイプの抗体であることを特徴とする請求項５から７のいずれかに記載の抗体。
【請求項９】
請求項５から８のいずれかに記載の抗体のキメラ抗体変異体、ヒト化抗体変異体、又はＴ細胞エピトープ枯渇抗体変異体。
【請求項１０】
タウオパシーを治療する医薬を製造するための、請求項５から９のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項１１】
前記抗体が、ヒトのIgG1サブタイプ又はIgG4サブタイプの抗体であることを特徴とする請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
請求項５から９のいずれかに記載の抗体を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
医薬組成物を製造するための、請求項５から９のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項１４】
神経原線維型アルツハイマー病を含むアルツハイマー病（ＡＤ）、ダウン症候群（成人症例）、グアムパーキンソン認知症複合、ボクサー認知症、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、前頭側頭型認知症、皮質基底核変性症、淡蒼球−橋−黒質変性、進行性核上性麻痺、及び神経原線維変化を伴うゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー病からなる群より選択されるタウオパシーを治療するための、請求項５から９のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項１５】
請求項５から９のいずれかに記載の抗体を含むことを特徴とする医薬組成物を製造するための方法。
【請求項１６】
請求項５から９のいずれかに記載の抗体の重鎖可変ドメイン及び／又は軽鎖可変ドメインをコードすることを特徴とする核酸。
【請求項１７】
請求項５から９のいずれかに記載の組換えヒト抗体又は組換えヒト化抗体を生成するための方法であって、原核生物又は真核生物のホスト細胞において請求項１６に記載の核酸を発現させ、前記細胞又は細胞培養上清から前記抗体を回収することを特徴とする方法。
【請求項１８】
タウオパシー、特にＡＤに罹患している患者を治療するための方法であって、請求項５から９のいずれかに記載の抗体を前記患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項１９】
タウオパシーを治療する医薬を製造するための、配列番号１で表される可変軽鎖及び配列番号２で表される可変重鎖を含む抗体が結合するのと同じエピトープでセリン４２２がリン酸化されているタウに特異的に結合することを特徴とする抗体の使用。
【請求項２０】
抗体が、ヒトのIgG1サブタイプ又はIgG4サブタイプの抗体であることを特徴とする請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
タウオパシーの治療に用いるための、配列番号１で表される可変軽鎖及び配列番号２で表される可変重鎖を含む抗体が結合するのと同じエピトープでセリン４２２がリン酸化されているタウに特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項２２】
ヒトのIgG1サブタイプ又はIgG4サブタイプの抗体であることを特徴とする請求項２０に記載の使用のための抗体。
【請求項２３】
配列番号９で表されるリン酸化タウ断片及びタウpS422には特異的に結合するがタウ及び配列番号１７で表されるリン酸化MCAK断片には結合しない、セリン４２２がリン酸化されているタウ（タウpS422）に結合する抗体の治療有効量と、薬学的に許容しうる担体とを含む医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１０】
【図８】
【図９ａ】
【図９ｂ】
【図１１】
【公表番号】特表２０１２−５２９２７５（Ｐ２０１２−５２９２７５Ａ）
【公表日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１４３８０（Ｐ２０１２−５１４３８０）
【出願日】平成２２年６月８日（２０１０．６．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００３４３７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４２４２３
【国際公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月８日（２０１０．６．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００３４３７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４２４２３
【国際公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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