腫瘍の療法のためのＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプ化ＶＳＶベクターおよび腫瘍浸潤性ウイルス産生細胞
本発明は、ＶＳＶのＧタンパク質の代わりにリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰを産生する組換えＶＳＶウイルスおよびウイルスベクター、ＬＣＭＶ−ＧＰ−シュードタイプ化ＶＳＶビリオンを産生するウイルス産生細胞、並びに固形腫瘍、特に脳腫瘍の療法における前記ベクターおよび細胞の使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子を含む水疱性口内炎（ＶＳＶ）由来組換えウイルスおよびウイルスベクター、ＧＰ−ＬＣＭＶ−シュードタイプ化ＶＳＶビリオンを産生するパッケージング細胞、並びに固形腫瘍の療法のための薬学的組成物の調製のための前記ビリオンおよびパッケージング細胞の使用に関する。
【０００２】
従来技術の説明
原発性頭蓋内脳腫瘍の最大の群である悪性神経膠腫は、依然として解決されていない治療問題を示す。熱心な基礎研究に因りこれらの腫瘍の生物学の知識は増えてきたが、臨床的な進歩および予後は、依然として極めて不良である。
【０００３】
悪性神経膠腫は、神経上皮を起源とする腫瘍であり、そして細胞学的に上衣腫、乏突起神経膠腫、乏突起星状細胞腫、星状細胞腫および神経膠芽腫に分類される。６０％超の比率を占めるびまん性浸潤性星状細胞腫（ＷＨＯグレードＩＩ〜ＩＶ）は、頭蓋内腫瘍の最大の群を示す。２００１年に改訂されたＷＨＯ分類は、主として星状細胞腫のための格付けスキームとして確立されている。ＷＨＯによると、脳腫瘍は、組織学的基準により４つの悪性度に割り当てられる(KleihusおよびCavenee, 2000)。びまん性浸潤性星状細胞腫の予後は、一般に不良である。予後は、一方で悪性度に依存し、他方で、腫瘍の位置および療法の手順に依存する。ＷＨＯグレードＩＩの星状細胞腫の患者の平均生存率は５年より長く、ＷＨＯグレードＩＩＩの星状細胞腫では２〜５年であり、ＷＨＯグレードＩＶ（＝神経膠芽腫）の星状細胞腫−神経膠芽腫では１年未満である。
【０００４】
腫瘍の分子病態発生は、複雑な過程であり、そして細胞周期の制御に関与する種々の遺伝子の突然変異に基づく。癌抑制遺伝子ｐ５３の突然変異は、ヒト腫瘍において最も頻繁に見られる変化であり、そして低悪性度の星状細胞腫の発生並びに続発性神経膠芽腫への進行にも関与する。しかしながら、初発の神経膠芽腫は、非常に稀にしかｐ５３の突然変異を有さない。びまん性星状細胞腫の悪性傾向を示すさらに他の遺伝子は、第１９染色体の長腕上に存在すると疑われている。神経膠芽腫の症例において頻繁に変化しているさらに他の遺伝子は、癌遺伝子ＭＤＭ２およびＭＤＭ４並びにまた癌抑制遺伝子ｐ１４ＡＲＦであり、これらはｐ５３依存性の細胞周期の制御に関与している(DaiおよびHolland, 2001)。ＥＧＦレセプター遺伝子の増幅が、原発性神経膠芽腫の３０〜４０％において観察され、それ故、この腫瘍群において最も頻繁に増幅される発癌遺伝子である(Holland, 2001)。大半の悪性神経膠腫は、化学療法または放射線療法に対して良好に応答しない。この理由は、アポトーシスの調節にも関与する細胞周期関連遺伝子の突然変異であると考えられる。
【０００５】
悪性神経膠腫のためのより効果的な療法が、緊急に必要とされる。なぜなら、化学療法または放射線療法などの既存の療法からは、疾病の予後に関する有意な改善が、全く期待されないからである。これに対し、神経膠芽腫の遺伝子療法は、有望な可能性を提供し、これを開拓する必要がある。複数の異なる非常に効果的な遺伝子が、この目的のために開発された。それらの殆どについて、動物実験のデータを入手することができる(ShirおよびLevitzki, 2001)。これらの治療遺伝子を、４つの異なる活性原理に割り当てることができる：
（ｉ）いわゆる自殺遺伝子の遺伝子産物は、前駆体を細胞障害性分子へと変換する。例は、ガンシクロビルの投薬と関連した単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ＴＫ）である。特に有利な点は、毒性のあるガンシクロビル三リン酸が隣接細胞に拡散し、それによってバイスタンダー効果が起こることである。近年、この酵素の活性がさらに増加した。ＨＳＶ ＴＫは、現在、腫瘍細胞並びに移植されたベクター産生細胞を排除するための非常に効率的な可能性のあるものである。
（ｉｉ）ＩＬ−４などの免疫刺激サイトカインの発現は、腫瘍細胞に対する自然免疫を刺激することができる。
（ｉｉｉ）エンドスタチンなどの抗血管新生タンパク質の分泌により血管が欠失し、それ故、代謝的に非常に活発な腫瘍組織における栄養分の供給が欠乏する。腫瘍は、実質的に「飢餓」する。
（ｉｖ）最後に、これらの細胞の制御されていない増殖を阻害するために、腫瘍細胞のシグナル伝達または細胞周期に関与する一連の遺伝子が、記載された。しかしながら、臨床においてこれらの遺伝子を使用する可能性は、限定されている。なぜなら、これらの遺伝子は、遺伝子の改変された細胞自体においてしか作用せず、そして最初に記載した活性原理としてのバイスタンダー効果は有さないからである。このことは、治療効果を達成するために、実質的に全ての悪性細胞を遺伝子的に改変しなければならないことを意味し、これは理想的なベクター系を用いてさえも無理である。
【０００６】
良好な神経膠芽腫の遺伝子療法のための最も重要な必要条件は、多数の既存の非常に効果的な作用原理によって提供される。しかしながら、依然として解決されていない問題は、非効率的な遺伝子導入、および標的細胞における治療遺伝子の不十分な発現である。このことは、多数の効率的な治療遺伝子が存在するにも関わらず、臨床では神経膠芽腫の遺伝子療法が失敗している理由である。
【０００７】
物理化学的トランスフェクション法を上回るウイルスによる遺伝子導入の利点は、より高い遺伝子導入率および遺伝子の長期発現である。なぜなら、ウイルスは、そのゲノムを細胞に導入しそれを発現させるための特に効率的な機序を発達させてきたからである。特に複製能を有するウイルス、例えばとりわけ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス（Ａｄ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、現在、腫瘍退縮ウイルス（ＯＶ）として使用されている。神経膠芽腫の最適なウイルス療法のために、ＯＶは以下の特徴を有するべきである：
（ｉ）それらは、腫瘍特異的な指向性を有するべきであり、それによってウイルス複製および細胞溶解は、腫瘍組織に限定されて留まる。ウイルスエンベロープの改変によって、または腫瘍特異的プロモーターの使用によってこの特性を増強させることができる。神経膠腫細胞のほんの一部しか処置中に分裂していないと想定されるので、増殖中の細胞だけでなく休止細胞にも感染するウイルスが有利である。
（ｉｉ）安全性に関連する面に関しては、高い遺伝子的安定性および腫瘍組織外における低毒性が、臨床使用のために特に適している。このことは、ＧＭＰ条件下における高いウイルス力価およびベクターの精製を可能とする。理想的には、ＯＶはヒトに対して非病原性であるべきであり、そして個体群間で低い感染率を有するべきである。既存免疫は時期尚早なウイルスの中和をもたらし、これにより効率的な療法が可能とならないだろう。
【０００８】
神経膠芽腫の療法における腫瘍退縮ウイルスの顕著な例は、弱毒化ＨＳＶ変異体Ｇ２０７および１７１６並びにアデノウイルスＯＮＹＸ−０１５である。ＣＮＳ腫瘍の処置のための腫瘍退縮ＨＳＶの使用に対する深刻な反対は、正常な脳細胞におけるその高いレベルの複製であり、これは生命を危うくする脳炎をもたらす可能性がある。さらに、残留する可能性に加えて、潜在性ＨＳＶが再活性化される可能性がある。複数の遺伝子を欠失させることによって生成したＨＳＶ変異体１７１６は、ＣＮＳの急速に増殖中の細胞において選択的に複製するが、有糸分裂後のニューロン中では複製しない。これにより、ＨＳＶの神経毒性はかなり減少した。ＨＳＶ１７１６を用いてラットおよびマウスの実験的神経膠腫を処置することより、腫瘍細胞が選択的に破壊されたが、周辺の脳組織は損傷を受けずに留まった。ＯＮＹＸ−０１５は、神経膠芽腫の療法のために開発されたさらなる腫瘍退縮ウイルスである。このアデノウイルスは、Ｅ１Ｂ遺伝子の欠失を通して、ｐ５３の欠損した細胞を選択的に溶解しようとする。
【０００９】
腫瘍退縮ＨＳＶ並びにＯＮＹＸ−０１５は、神経膠腫の処置のためにすでに臨床的に試験された。どちらの弱毒化腫瘍退縮ウイルスも、第Ｉ/ＩＩ相臨床試験において十分な安全性を示した。ウイルスを腫瘍内に注射するかまたは切除空洞に注射するかに関係なく、処置に対して良好な耐容性を示し、そして重篤な副作用は、全く観察されなかった。しかしながら、細胞溶解効果は、単なる一過性の性質であり、その後、常に再発を伴った(Cutter et al., 2206)。通常、神経膠腫の増殖速度は、ウイルスの増幅速度および従って伝播波を上回るので、腫瘍退縮のみによる神経膠腫の破壊は疑問である。事実、効率的な処置のために、複数の活性原理の組合せが、必要とされる。ＯＶにおいて自殺遺伝子または免疫調節遺伝子を使用することによって、前臨床試験において相乗作用が、実証された(Tyminski et al., 2005; Fukuhara et al., 2005)。
【００１０】
前記のＤＮＡウイルスの他に、腫瘍退縮ＲＮＡウイルスも、開発中である。ＶＳＶは、エンベロープを有するマイナス鎖のウイルスであり、その宿主域は、げっ歯類および家畜を含む。ヒトへの感染は、稀であり、そして大半は、無症候性である。個体群間の血清有病率は非常に低いために、ＶＳＶ中和抗体による療法の効率の障害は、予期されない。ＶＳＶの感染および細胞質における複製は、細胞周期とは関係なく行なわれ、よって活発に分裂している細胞および休止細胞に同等に感染する。ＶＳＶによる新生物細胞の効率的かつ優先的な溶解は、これらの細胞における大半は欠陥のあるインターフェロンシグナル伝達経路および随伴するウイルス複製に関連する(Wollmann et al., 2007)。また、細胞性免疫応答とは関係なく、遺伝子Ｍｙｃ、Ｒａｓまたはｐ５３に欠陥を有する腫瘍細胞も、ＶＳＶの繁殖を支持することが実証された(Barber, 2004)。ＶＳＶの腫瘍特異性は、組換えウイルスの調製によって近年さらに最適化された。ここでの主な焦点は、Ｍタンパク質に突然変異を有する変異体（ΔＭ５１）である。この変異体は、健康細胞においてインターフェロン応答を妨げることはできず、これによりそのような細胞におけるウイルス複製は、抑制される。ＩＦＮ応答に欠陥のある腫瘍細胞において、ウイルスは、複製することができ、従って、選択的に腫瘍退縮的に活性であることができる。ＶＳＶΔＭ５１は、全身適用後でさえも、マウスモデルにおいてヒト神経膠腫の安全かつ効率的な腫瘍退縮を示した(Lun et al., 2006)。
【００１１】
脳への直接的なウイルスベクターの適用には、腫瘍細胞に対する高い選択性が必要とされ、そしてそれは比較的少容量でのみ可能である。従って、効率的な遺伝子導入は、神経膠腫細胞に対して強く発達した指向性を有する高度に濃縮されたベクター調製物（＞１０８/ml）を用いてのみ達成することができる。ガンマレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターの場合、ベクターの指向性およびベクターの安定性は、非レトロウイルスエンベロープタンパク質を組み込むことによって影響を受け得る。多くの場合、レトロウイルスエンベロープタンパク質は、より安定なＶＳＶのＧタンパク質で置換されている。これらのいわゆるシュードタイプ化ベクターの問題は、ＶＳＶ−Ｇが、すなわち生産細胞において並びに周囲の健康組織に対して細胞毒性であることであり、これは以前から臨床でこのようなＶＳＶ−Ｇシュードタイプを広範に使用する際の障害であった。
【００１２】
本発明者らは以前、ＣＮＳの神経膠細胞への効率的な遺伝子の導入を可能とする、レトロウイルスベクタータイプを開発した。この新たなベクタータイプでは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質（ＧＰ）がウイルスエンベロープタンパク質としての機能を果たす(Miletic et al., 1999; Beyer et al., 2002; EP 1 006 196)。比較によるin vitroおよびin vivoにおける指向性研究において、ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプは優先的に神経膠腫細胞を形質導入することが実証された(Miletic et al., 2004; Miletic et al., 2007)。これに対し、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプは優先的にニューロンを形質導入し；神経膠腫細胞における遺伝子導入は、ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプよりも効率が低かった。また、個々の浸潤性腫瘍細胞も、ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプによって効率的に形質導入された。ラット神経膠腫モデルにおいて、９０％のラットが、ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプ化レンチウイルスベクターの腫瘍内注射によって治癒された(Miletic et al.; 2007b)。使用したベクターは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードし、形質導入細胞並びに周辺の細胞においてガンシクロビルを細胞障害性の三リン酸化合物へと変換するという効果を伴った。
【００１３】
神経膠腫への選択的な遺伝子の導入、しかしまた腫瘍内全体における効率的なベクターの分布も、療法の成功にとって決定的である。それ故、本発明者らは、腫瘍内全体でシュードタイプ化ベクターを放出すると考えられる腫瘍浸潤性パッケージング細胞を開発した(WO 2006/008074)。遊走能を有する有望な細胞型は、骨髄から単離することができる多能性成体前駆細胞である(Jiang et al., 2002)。移植実験において、これらの細胞の遊走挙動を、ラット神経膠腫モデルを使用して調べた。前駆細胞は腫瘍塊に効率的に浸透したが、周辺の健康な脳組織には浸潤しなかったことが実証された(Fischer et al., 2007)。３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｒａｔ−１ラット線維芽細胞またはヒト２９３Ｔなどの従来の細胞系は、全く腫瘍への浸潤を示さなかった。むしろ、これらの細胞は、注射部位または近傍に局所的に限定され、そして神経膠腫特異的な遊走は、示さなかった。
【００１４】
さらなる研究において、本発明者らは、ラット神経膠腫モデルにおけるＴＫ発現前駆細胞の治療効力を調べた。この研究の結果は、７０％のラットにおける腫瘍の破壊は、前駆細胞と腫瘍細胞との間のバイスタンダー効果だけに起因していたというものであった(Miletic et al., 2007)。さらに、画像診断法を用いて、前駆細胞の腫瘍内局在化が、確認された。処置された無症候ラットの脳の組織学的切片は、腫瘍の位置における顕著な瘢痕組織と共に空洞を有し；このことは、動物における腫瘍が、遺伝子療法によって成功裏に根絶されたことを示す。これらの前駆細胞の強力な増殖能のお陰で、遺伝子改変とその後の個々のパッケージング細胞クローンの選択が、可能である。ガンマレトロウイルスＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプのための、前駆細胞に基づいたパッケージング細胞が、開発された。これらのパッケージング細胞は、１〜７×１０Ｅ３ＴＵ/mlの力価で連続的にレトロウイルスベクターを産生した。力価は数週間にわたりそして細胞の凍結解凍の反復後も安定して留まった(Fischer et al., 2007)。
【００１５】
in vivoにおける非効率な遺伝子導入および治療的に効果的な遺伝子がないことが、現在、神経膠芽腫の良好な遺伝子療法の障害となっている。神経膠腫の遺伝子療法および腫瘍退縮ウイルス療法のための以前から公知のベクターは、種々の理由から最適ではない。以前の遺伝子導入法の効率、特異性および安全性を、患者への治療的に効果的な遺伝子の導入が可能となる程度まで高めなければならない。
【００１６】
それ故、本発明の目的は、神経膠腫といった高度に悪性の脳腫瘍および他の固形腫瘍の療法用の治療遺伝子のための高度に強力な腫瘍退縮ウイルス遺伝子導入系を開発することである。
【００１７】
発明の要約
それ故、本発明の主題は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子を含み、ＶＳＶのエンベロープタンパク質Ｇをコードする機能的遺伝子を全く含まない、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）シュードタイプベクターである。ＬＣＭＶ−ＧＰは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰ−１またはＧＰ−２であり得る。
【００１８】
さらなる態様によると、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターにおいて、ＶＳＶのエンベロープタンパク質Ｇは、ＬＣＭＶのＧＰ（ＬＣＭＶ−ＧＰ）によって置換されている。
【００１９】
さらなる態様によると、前記ベクターは、ＶＳＶのタンパク質Ｎ、Ｌ、ＰおよびＭをコードするｎ、ｌ、ｐおよびｍ遺伝子の群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失する。
【００２０】
さらなる態様によると、ＶＳＶのＭタンパク質は、ＶＳＶの細胞病原性を減少させる突然変異を含む。ＶＳＶの細胞病原性を低減させる突然変異の例は、Ｍタンパク質の３７ＰＳＡＰ４０領域におけるアミノ酸交換並びに突然変異Ｍ３３Ａ、Ｍ５１Ａ、Ｖ２２１Ｆ、Ｓ２２６Ｒまたはその組合せである。
【００２１】
さらなる態様によると、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターは、少なくとも１つの治療的に適用可能な導入遺伝子を含む。導入遺伝子は、自殺遺伝子または免疫刺激遺伝子であり得る。自殺遺伝子の例は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、シトシンデアミナーゼ、ＦＫＢＰ−ＦＡＳまたはＦＫＢＰ−カスパーゼ９をコードする遺伝子である。免疫刺激遺伝子の例は、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、中和性抗ＴＧＦβまたはＦｌｔ３Ｌをコードする遺伝子である。
【００２２】
さらなる態様によると、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターは、マーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子は、ＬａｃＺ、抗生物質耐性遺伝子、または蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＲＥＰ、ＧＧＰなど）をコードする遺伝子であり得る。
【００２３】
本発明の主題はさらに、少なくとも２つの補完的で複製性の（ｃｒ）ＶＳＶベクターを含むＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系であり、前記ベクター系の１つのベクターはＬＣＭＶ−ＧＰをコードする遺伝子ｇｐを含み、前記ベクター系はさらにＶＳＶのタンパク質Ｎ、Ｌ、ＰおよびＭをコードする遺伝子ｎ、ｌ、ｐおよびｍを含み、ＶＳＶのエンベロープタンパク質Ｇをコードする機能的遺伝子は全く含まず、前記ベクター系の各ベクターは、遺伝子（「補完的な遺伝子」）ｇｐ、ｎ、ｌ、ｐおよびｍの１つを欠失し、そして欠失遺伝子は、前記ベクター系のいずれかの他のベクター上に存在する。遺伝子ｍおよびｇｐが、好ましい補完的な遺伝子である。
【００２４】
さらなる態様によると、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系のＭタンパク質は、前記で説明したように、ＶＳＶの細胞病原性を減少させる突然変異を含む。
【００２５】
さらなる態様によると、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系は、前記で説明したように、少なくとも１つの治療的に適用可能な導入遺伝子および／またはマーカー遺伝子を含む。導入遺伝子／マーカー遺伝子は、前記ベクター系のいずれかのベクター上に位置し得る。
【００２６】
本発明の主題はさらに、エンベロープタンパク質としてＬＣＭＶのＧＰタンパク質を含むＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオンである。
【００２７】
本発明の主題はさらに、ＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオンを産生する、ウイルス産生細胞である。
【００２８】
さらなる態様によると、ウイルス産生細胞は、成体幹細胞である。成体幹細胞は、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、またはＭＳＣに由来するＢＭ−ＴＩＣ細胞（骨髄由来腫瘍浸潤細胞）であり得る。
【００２９】
さらなる態様によると、ウイルス産生細胞は、ＶＳＶのタンパク質Ｎ、Ｌ、ＰおよびＭをそれぞれコードする遺伝子ｎ、ｌ、ｐおよびｍ並びにＬＣＭＶ−ＧＰ糖タンパク質をコードする遺伝子ｇｐからなる群より選択される遺伝子の発現のための１つ以上の発現カセットを含む。
【００３０】
さらなる態様によると、ウイルス産生細胞はさらに、ＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオンへのパッケージングのための導入遺伝子用ベクターを含む。
【００３１】
さらなる態様によると、遺伝子導入用ベクターは、前記に説明したように、治療的に適用可能な導入遺伝子および／またはマーカー遺伝子を含む。
【００３２】
本発明の主題はさらに、細胞に導入遺伝子を導入するためのin vitroにおける方法であり、前記方法においては細胞を、ＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオンを用いて形質導入し、ここで前記ビリオンは導入遺伝子を含む。
【００３３】
本発明の主題はさらに、細胞に導入遺伝子を導入するためのin vitroにおける方法であり、前記方法においては細胞を、ＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオンを産生するウイルス産生細胞と接触させ、ここで前記ビリオンは導入遺伝子を含む。
【００３４】
細胞が、腫瘍細胞、例えば神経膠腫細胞であることが好ましい。
【００３５】
本発明の主題はさらに、固形腫瘍の療法のための薬学的組成物の調製のための本発明のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターまたはＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系の使用である。
【００３６】
本発明の主題は、固形腫瘍の療法のための薬学的組成物の調製のためのＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオンの使用である。
【００３７】
本発明の主題はさらに、固形腫瘍の療法のための薬学的組成物の調製のための本発明のウイルス産生細胞の使用である。腫瘍が、脳腫瘍、特に神経膠腫であることが好ましい。
【００３８】
さらなる態様によると、少なくとも２つのウイルス産生細胞が、固形腫瘍の療法のための薬学的組成物の調製のために使用され、第１のウイルス産生細胞は、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＰＧシュードタイプベクター系の第１ベクターを含み、そして第２のパッケージング細胞は、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＰＧシュードタイプベクター系の第２のベクターを含む。
【００３９】
さらに、本発明の主題は、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＰＧシュードタイプベクター、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＰＧシュードタイプベクター系、ＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオン、またはＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオンを産生するウイルス産生細胞を含む薬学的組成物である。前記組成物はまた、適切な補助物質および／または担体を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＬＣＭＶ ＧＰを用いてのＶＳＶｇｆｐ ｎｃｐ−ΔＧベクターのシュードタイプ化。
【図２】ＶＳＶ（ＬＣＭＶ ＧＰ）ベクターを用いての神経膠腫細胞系の形質導入。
【図３】ＢＭ−ＴＩＣにおけるＬＣＭＶ ＧＰを用いてのＶＳＶｇｆｐ ｎｃｐ−ΔＧベクターのシュードタイプ化。
【図４】ｃｒ ＶＳＶ（ＬＣＭＶ−ＧＰ）ベクター系の図解。ａ）ベクターの１つは、リン酸化タンパク質Ｐの代わりにｒｆｐを、そしてＶＳＶ−Ｇの代わりにＬＣＭＶＰ−ＧＰを含む。ｂ）補完的なベクターは、ａ）に欠失しているＰタンパク質をコードするが、治療遺伝子として、ウイルス糖タンパク質の代わりに、例えば単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）を含む。両方のベクターが、改変されたＭ遺伝子（Ｍｎｃｐ）を含む。
【図５】ウイルスベクターの図解。最適化ベクターにおいては、Ｐタンパク質の代わりに治療遺伝子がクローニングされると考えられる。免疫調節遺伝子（ＩＬ−１２、Ｆｌｔ３Ｌ）に加えて、第２ベクターはさらにＨＳＶのチミジンキナーゼも含む。
【００４１】
本発明の説明
本発明は、組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）およびＶＳＶベクターに関する。ＶＳＶゲノムは、タンパク質Ｌ、Ｍ、Ｎ、ＰおよびＧをコードし、そしてウイルスの繁殖に必須である５つの遺伝子ｌ、ｍ、ｎ、ｐおよびｇを含む。Ｎは、ＶＳＶゲノムＲＮＡをパッケージングする核タンパク質であり；ＶＳＶゲノムは、ＲＮＡ−タンパク質複合体としてしか複製することができない。ＬおよびＰは一緒に、ポリメラーゼ複合体を形成し、これは、ＶＳＶゲノムを複製し、そしてＶＳＶｍＲＮＡを転写する。Ｍは、脂質エンベロープとヌクレオカプシドとの間に一種のキットを形成する基質タンパク質であり、そしてこれは細胞膜における粒子の出芽に重要である。Ｇは、ウイルスエンベロープに取り込まれたエンベロープタンパク質であり、そしてこれはウイルスの感染性に必須である。
【００４２】
本発明の主題は、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター、およびＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオンである。本発明のベクターは、ＶＳＶのＧタンパク質をコードする遺伝子ｇの代わりに、ＧＰタンパク質をコードする遺伝子ｇｐを含む。従って、本発明のウイルス／ビリオンは、エンベロープタンパク質としてＬＣＭＶ−ＧＰタンパク質を含む。ＧＰタンパク質は、ＧＰ１またはＧＰ２であり得る。
【００４３】
本発明は、種々のＬＣＭＶ株に由来するＧＰタンパク質を含む。特に、ＬＣＭＶ−ＧＰ変異体は、ＬＣＭＶ野生型またはＬＣＭＶ株のＬＣＭＶ−ＷＥ、ＬＣＭＶ−ＷＥ−ＨＰＩ、ＬＣＭＶ−ＷＥ−ＨＰＩｏｐｔに由来し得る(WO 2006/008074)。
【００４４】
水疱性口内炎ウイルスに基づいたベクターは、レトロウイルスベクターを上回る利点を有する：
（ｉ）ＶＳＶベクターは、腫瘍退縮性であり、そして他の腫瘍退縮性ウイルスベクターと比較して特に高い腫瘍退縮活性を有する：
（ｉｉ）ＶＳＶベクターは、優先的に腫瘍細胞において複製し、そして他の腫瘍退縮性ウイルスベクターと比較して特に高い複製能を有する。
（ｉｉｉ）ＶＳＶベクターは、活発に分裂している細胞と同様に、休止腫瘍細胞にも感染する。
（ｉｖ）ＶＳＶベクターは、強力な自然体液性および細胞性免疫応答を誘導する。
（ｖ）ＶＳＶベクターは、純粋に細胞質で複製し、すなわち、ＲＮＡウイルスのようにそれらは宿主細胞のゲノムに組み込んだり、または複製能を有するウイルス中に組換えたりすることができない。
（ｖｉ）ＶＳＶベクターはパッケージングし易い。
（ｖｉｉ）ＶＳＶ糖タンパク質は、外来のエンベロープタンパク質と交換可能である。ＶＳＶエンベロープに以前に取り込まれた糖タンパク質の例は、ＨＩＶｇｐ１６０(OwensおよびRose 1993)、ＨＣＶＥ１／Ｅ２(Tani et al., 2007)、ＳＡＲＳ Ｓ(Ge et al., 2006)、およびＬａｓｓａ ＧＰ(Garbutt et al., 2004)である。
【００４５】
総合すると、ＶＳＶベクターは、特に高い治療能を有する。
【００４６】
本発明によるＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターの別の利点は、健康な脳細胞、すなわちニューロンに対する、ＬＭＣＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶウイルスのかなり低減された毒性である。ＶＳＶの神経毒性は、ＶＳＶのＧタンパク質に起因する(Shinosaki et al., 2005)。実際に、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプは、優先的に正常ニューロンに感染する。向神経性は、腫瘍退縮性ＶＳＶの全ての適用における用量制限因子であるので、本発明によるベクターの使用は全ての腫瘍に対して非常に利点がある。
【００４７】
さらに、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターは、脳腫瘍細胞に対して向上した特異性を有し、これは使用されるＬＣＭＶ−ＧＰ糖タンパク質の神経膠腫特異的な指向性および腫瘍細胞におけるＶＳＶの選択的な転写／複製に由来する。ＶＳＶ−Ｇとは対照的に、ＬＣＭＶ−ＧＰエンベロープタンパク質は、神経膠芽腫細胞に対して特に指向性を有する。しかしながら、本発明によるベクターを、ＣＮＳ外の他の腫瘍においても使用することができる。なぜなら、そこでも、特に全身適用の場合にはＶＳＶの神経毒性が用量制限因子であるからである。
【００４８】
ＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたベクターは、非シュードタイプ化ベクターが有さない３つの重要な特徴を有する、すなわち：
（ｉ）ＬＣＭＶ−ＧＰは、細胞毒性ではない。
（ｉｉ）ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターを、感染性を失うことなく超遠心分離によって濃縮することができる。
（ｉｉｉ）ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターは、神経膠細胞に対して好ましい指向性を示し、一方ニューロンは非効率的に感染される。
【００４９】
本発明は、複製欠損ウイルス並びに複製能を有するウイルスを含む。後者は追加の利点を有する。なぜなら、繁殖することができるウイルスを使用して高い形質導入率を達成することができるからである。この点で、複製可能な腫瘍退縮性ウイルスベクターは、複製能を有さないベクターよりも効率的である。
【００５０】
治療使用における複製可能なウイルスの使用中の安全性を高めるために、ＶＳＶウイルスの複製、腫瘍退縮および産生が、少なくとも２つの複製欠損性で相互補完性のベクターによって感染された細胞においてしか行なわれないことを確実とするベクター系を、提供する。
【００５１】
それ故、本発明の主題は、少なくとも２つの補完的なＶＳＶベクターを含む、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系である。このような補完的で複製性の（ｃｒ）ＶＳＶベクターを腫瘍内に限定された程度で伝播させることができ、これは遺伝子導入および腫瘍退縮の効率を高める。従って、本発明によるベクター系は、神経膠腫および他の腫瘍への遺伝子導入のための、制限された繁殖能を有する腫瘍退縮性ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターの調製を可能とする。
【００５２】
本発明によるベクター系の原理は、前記系の各ベクターが、ＶＳＶの必須遺伝子ｍ、ｎ、ｌおよびｐの１つまたはＬＣＭＶのｇｐを欠失しているが、しかしながら、前記系のいずれかの他のベクター上に存在するというものである。ＬＣＭＶ−ＧＰをコードする遺伝子ｇｐ並びに可能な追加の遺伝子、例えば治療遺伝子および／またはマーカー遺伝子が、前記系のいずれかのベクター上に存在し得る。
【００５３】
本発明によるベクター系の種々の変異体が、可能である。例えば、ベクター系は、図５に説明したように２つのベクターからなり得る。第１のベクターは、ＶＳＶのＧの代わりにＬＣＭＶのＧＰを含み、そしてＰタンパク質をコードする遺伝子ｐの欠失を含む。また、第２ベクターは、ＶＳＶ−Ｇを全く含まないが、ＶＳＶのＰタンパク質を発現する。各ベクターは、ＶＳＶの核タンパク質（Ｎ）およびポリメラーゼ（Ｌ）並びにＭタンパク質のより細胞病原性の少ない変異体（Ｍｎｃｐ）を発現する。第１ベクターはさらに、マーカー遺伝子ｒｆｐを有し、第２ベクターは、自殺遺伝子ＨＳＶ−ＴＫおよびマーカー遺伝子ｇｆｐを有する。図６に説明した変異体において、両方のベクターが、治療遺伝子を含むことができ、第１ベクターは、例えば、Ｆｌｔ３ＬまたはＩＬ−１２を含み、そして第２ベクターは例えばＨＳＶ−ＴＫを含む。
【００５４】
現在までに、神経膠芽腫の療法のための種々の概念が、探求されてきた：（ｉ）自殺遺伝子の導入、（ｉｉ）免疫刺激遺伝子を使用したおよびサイトカインに基づいた免疫療法を用いての神経膠芽腫に関連した免疫抑制の排除、（ｉｉｉ）腫瘍誘発血管新生に拮抗する因子の導入、（ｉｖ）細胞周期モデュレーターの使用、および（ｖ）アポトーシスの誘導。本発明の目的のために、最初の３つのアプローチ（ｉ〜ｉｉｉ）を最初に考慮する予定である。
【００５５】
その固有の腫瘍退縮特性に加えて、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターおよびそれに基づいたベクター系は、自殺遺伝子および／または免疫刺激遺伝子を導入することによってさらに改良され得る。自殺タンパク質の例は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、サイトカインデアミナーゼ、ＦＫＢＰ−ＦＡＳ、ＦＫＢＰ−カスパーゼ９である。免疫刺激タンパク質の例は、サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２およびＦｌｔ３Ｌ、中和性抗ＴＧＦβである。４．５ｋｂまでのサイズを有する遺伝子の挿入は、ＶＳＶゲノムによって耐容性が示され、よって２つ以上の治療遺伝子（例えばＨＳＶ−ＴＫ＋サイトカイン）を１つのＶＳＶゲノム内で合わせることが可能でさえある。さらに、遺伝子産物は、いわゆるバイスタンダー効果によって非感染腫瘍細胞に対してもその作用を発揮する。
【００５６】
注射されたウイルスベクターは、注射部位から腫瘍組織中にほんの数ミリメートルしか浸透しない。ベクター分布を最適化するために、および腫瘍の標的化破壊のために、腫瘍中に特異的に遊走し、これにより注射部位から遠い部位でウイルスを放出する、腫瘍浸潤性ウイルス産生細胞を使用する。
【００５７】
本発明の意味におけるウイルス産生細胞は、非複製性ベクターからのビリオンの産生のための古典的なパッケージング細胞、並びに繁殖することのできるベクターからのビリオンの産生のための生産細胞を含む。パッケージング細胞は通常、パッケージングしようとするそれぞれのベクターに欠けているおよび／またはビリオンの産生のために必要である、必須遺伝子の発現のための１つ以上のプラスミドを含む。
【００５８】
以前の研究において、ウイルスベクターを導入するためにパッケージング細胞を、使用したが；しかしながら、これは、腫瘍内では遊走しない線維芽細胞が主に関与していた(Short et al., 1990, Culver et al., 1992)。これに対し、成体幹細胞、特に神経幹細胞（ＮＳＣ）および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、高い遊走能を有する。それらは、腫瘍組織に限局されて留まり、これにより腫瘍組織への非常に効率的であるがしかしまた特異的でもある遺伝子の導入が、達成される。しかしながら、これらの幹細胞は、in vitroにおいて有限の継代能しか有さない。
【００５９】
成体間葉系幹細胞の亜集団、いわゆるＢＭ−ＴＣＩ（骨髄由来腫瘍浸潤性細胞）は、実験的に誘発した神経膠腫への注射後、全体の腫瘍に浸潤し、そしてさらに、腫瘍塊から遠くの個々の腫瘍細胞を追跡する(Miletic et al., 2007)。ＢＭ−ＴＩＣは、成体骨髄から単離され、高い増殖能を有し、そしてＭＬＶ(Fischer et al., 2007)およびＶＳＶベクターのための遊走産生細胞として使用することができる。
【００６０】
従って、本発明の主題は、腫瘍退縮性ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターを産生するウイルス産生細胞である。特に、これらは、その遊走中に腫瘍内で前記ベクターを放出する、腫瘍浸潤性生産細胞である。好ましい細胞は、成体幹細胞、特に神経幹細胞（ＮＳＣ）および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。特に好ましい細胞は、ＭＳＣに由来するＢＭ−ＴＩＣ細胞である。
【００６１】
ラブドウイルス産生細胞の調製のための障害は、タンパク質ＭおよびＧの細胞病原性である。ＶＳＶのＧタンパク質は、本発明のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターにおいてＬＣＭＶの神経膠腫特異的かつ非細胞毒性の糖タンパク質によって置換されているので、Ｍタンパク質のみが、依然として問題である。ＶＳＶ産生細胞系におけるＭタンパク質の毒性を低減させるために、Ｍタンパク質の非細胞病原性変異体を、使用することができる。
【００６２】
それ故、本発明のウイルス産生細胞、および従ってまた前記細胞によって産生されたＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターは、突然変異Ｍタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。このベクター変異体は、腫瘍細胞に対して選択的に腫瘍退縮性であるが、健康細胞に対しては毒性ではない。Ｍタンパク質の３７ＰＳＡＰ４０領域におけるアミノ酸交換を有するか、またはＭタンパク質のＰＳＡＰ領域外に単一（Ｍ５１Ｒ）もしくは複数（Ｖ２２１ＦおよびＳ２２６Ｒ；Ｍ３３ＡおよびＭ５１Ａ）の突然変異を有する、Ｍ変異体が好ましい。突然変異Ｍ３３Ａ、Ｍ５１Ｒ、Ｖ２２ＦおよびＳ２２６Ｒを有するＭタンパク質が特に好ましい。パッケージング細胞における効率的なウイルス産生を確実にするために、Ｍ変異体を、ウイルス性インターフェロンアンタゴニストを用いて安定にトランスフェクションすることができる。
【００６３】
さらに、本発明の主題は、遺伝子導入のためのin vitroにおける方法であり、導入遺伝子を含むＬＣＭＶ−ＧＰ−ＶＳＶシュードタイプベクターまたはＬＣＭＶ−ＧＰ−ＶＳＶシュードタイプベクター系を、細胞に、直接的にまたは本発明によるウイルス産生細胞（パッケージング細胞）を用いてのいずれかで導入する。少なくとも２つのベクターを有するｃｒベクター系を使用する場合、少なくとも２つのパッケージング細胞を使用し、細胞の各々が、（複製能を有さない）ｃｒベクターの１つを産生する。ＶＳＶウイルスの産生は、ｃｒベクター系の全てのベクターを用いて感染させ、従って全ての必須なウイルス遺伝子を含む細胞においてのみ行なわれる。
【００６４】
さらに、本発明は、治療方法における薬物としての本発明によるベクターおよびウイルス産生細胞の使用に関する。特に、本発明によるベクターおよびウイルス産生細胞は、固形腫瘍の療法のために使用される。治療効果は、治療遺伝子の使用によってだけでなく、組換えベクターおよびウイルスの腫瘍退縮特性によっても引き起こされる。
【００６５】
固形腫瘍は、脳腫瘍、肝臓腫瘍、特に肝細胞癌、肺腫瘍、特に気管支癌、および腸腫瘍、特に結腸癌であり得る。好ましい腫瘍は、脳腫瘍、例えば神経膠腫、特に上衣腫、乏突起神経膠腫、乏突起星状細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽腫または髄芽腫である。
【００６６】
本発明の主題はさらに、本発明のベクター、ビリオン、ウイルス産生細胞並びに場合により担体および補助物質などの添加剤を含む、薬学的組成物である。
【００６７】
治療遺伝子のウイルス退縮および導入効率を高めるために、ベクターを連続的に放出する腫瘍浸潤性ウイルス産生細胞を、腫瘍への直接的な移植のために製剤化する。
【００６８】
本発明は、以下の実施例を用いて説明される。
【００６９】
実施例
実施例１：ＬＣＭＶ−ＧＰ−シュードタイプ化ベクターによる神経膠腫細胞の形質導入
ＧＦＰをコードするがウイルスエンベロープタンパク質はコードしない欠陥ＶＳＶベクター（ＶＳＶｇｆｐ−ｎｃｐ−ΔＧ）を、今度はＬＣＭＶのＧＰを安定に発現するＢＨＫ−２１およびｖｅｒｏ細胞に形質導入した。２４ウェルプレートの１つの窪みあたり１×１０Ｅ５個の細胞（ＢＨＫ−２１、−ＧＰ、ｖｅｒｏ、−ＧＰ）を播種し、そして４時間後にＭＯＩ＝５でＶＳＶｇｆｐ−ｎｃｐ−ΔＧベクターを用いて形質導入した。２４時化後、培養上清を回収し、そしてＢＨＫ−２１における力価を、ＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析によって決定した。図１は、形質導入細胞がＬＣＭＶ−ＧＰ−シュードタイプ化ＶＳＶベクターを産生し、使用する細胞型に依存して、シュードタイプ力価は２〜７×１０Ｅ５ＴＵ/mlの間で変動したことを示す。
【００７０】
シュードタイプは神経膠腫への遺伝子導入に用いられる予定であったので、ベクターの形質導入効率を、種々の神経膠腫細胞系について確認した。２つのヒト神経膠腫細胞系（Ｕ８７、Ｇ４４）および１つのラット神経膠腫細胞系（９Ｌ）を試験した。ＢＨＫ−２１を再度対照として使用した。２４ウェルプレートの１つの窪みあたり１×１０Ｅ５個の細胞を播種し、そして４時間後にＭＯＩ＝０．３（ＢＨＫ−２１上で滴定）でＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターを用いて形質導入した。２４時間後、ＧＦＰ発現細胞の比率をＦＡＣＳによって決定し、そして力価をそれから計算した。図２は、神経膠腫細胞系がＬＣＭＶ−ＧＰ−シュードタイプ化ＶＳＶベクターによって効率的に形質導入されたことを示す。
【００７１】
実施例２：多能性前駆細胞へのＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターのパッケージング
本発明者らは、C. Verfaillie (Jiang et al., 2002)のプロトコールに従って単離された幹細胞が、腫瘍浸潤特性を有することをすでに実証している。その遊走能だけを調べ、その分化能は調べなかったので、これらの細胞をＢＭ−ＴＩＣと呼んだ（骨髄由来種腫瘍浸潤細胞、bone marrow derived tumor infiltrating cells）。ＶＳＶベクターについてのＢＭ−ＴＩＣのパッケージング能を試験するために、ＬＣＭＶ−ＧＰ−発現ＢＭ−ＴＩＣを、欠陥ＶＳＶ-ＧＦＰベクターを用いて形質導入した。２４ウェルプレートの１つの窪みあたり１×１０Ｅ５個の細胞（ＢＭ−ＴＩＣ、−ＧＰ、ＢＨＫ−２１）を播種し、そして４時間後にＭＯＩ=５でＶＳＶｇｆｐ−ｎｃｐ−ΔＧベクターを用いて形質導入した。２４時間後、培養上清を回収し、そしてＢＨＫ−２１細胞上で滴定した。図３は、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプをまたＢＭ−ＴＩＣ中でも調製することができることを示す。しかしながら、力価は、例えばＢＨＫ−２１細胞の場合よりも低い（図１参照）。
【００７２】
実施例３：補完的で複製性の（ｃｒ）ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターの開発
繁殖することのできるウイルスを用いて高い形質導入率を、達成することができる。神経膠腫への遺伝子導入率を高め、そして同時に高度の安全性を確実にするために、限定された程度で複製能を有するＶＳＶシュードタイプベクターを、確立した。補完的で欠陥のあるウイルスを用いた系が、レトロウイルス(Trajecevski et al., 2004)および種々のフラビウイルス(Riepl & Mandl, 2007)のために記載されている。このような系の原理は、２つの不完全なレプリコンの間にウイルスゲノムを分配することである。１つの同じ細胞が両方のベクターで感染され、そしてこの同時感染を通してのみウイルスゲノムをパッケージングするために必要な全ての成分を含む場合にのみ、感染性ウイルスが産生される。
【００７３】
図４は、本発明によるベクター系の補完的なベクターの例を示す。効率的な複製およびパッケージングのために、第１ベクターはリン酸化タンパク質Ｐを欠失している。これらのベクターのウイルス力価をより簡単な方法で決定できるようにするために、ベクターは、Ｐの代わりに赤色蛍光タンパク質（ｒｆｐ）を含む。欠失しているＰの機能は、第２ベクターによる細胞の同時感染中に補完される。しかしながら、後者単独では繁殖できない。なぜなら、必須のエンベロープタンパク質ＶＳＶ−Ｇを欠失しているからである。このベクターを用いて、治療遺伝子が適用される。
【００７４】
プラス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡのみが感染性であるが、ＶＳＶなどのマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、クローン化ウイルスｃＤＮＡから感染性ビリオンを生成するために、ウイルスＲＮＡゲノムに加えて、少なくともウイルス核タンパク質（Ｎ）およびウイルスポリメラーゼ（Ｌ）を必要とする。組換えＶＳＶを調製するための系は、ＢＳＲ Ｔ７/５細胞において構成的に発現されているＴ７−ＲＮＡポリメラーゼを使用した、ウイルス（＋）ＲＮＡ並びにウイルスタンパク質Ｎ、ＰおよびＬの細胞質における発現に基づく。所望のベクターを調製するために、ゲノム構築物を、Ｎ、ＰおよびＬのための発現プラスミド並びにベクターｂ）（図４）の場合さらにＶＳＶ−Ｇのための発現プラスミドと共に、ＢＳＲ Ｔ７/５に同時トランスフェクションする。欠失している成分をトランスで発現する細胞上でこのようにして得られたウイルスを継代させることによって、力価をかなり高めることができる。ＬＣＭＶ−ＧＰ欠損ベクターのために、ＧＰを安定に発現するＢＨＫ−２１細胞系が確立された。Ｐ欠損ベクターのために、Ｐタンパク質を発現するＢＨＫ−２１細胞系が確立された。
【００７５】
ｃｒ ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプＶＳＶベクターの調製および特徴付け
その力価およびその形質導入効率に関して個々のベクターを特徴付けた後、in vitroにおけるベクターの伝播を調べる。このために、ＢＨＫ−２１細胞を、両方のベクターで同時感染させ、そしてネイティブなＢＨＫ−２１上での培養上清の連続継代による新たなベクターの複製および従って生成を調べる。これらの実験を、単層並びにスフェロイドとして培養される種々の神経膠芽腫細胞系（Ｇ４４、Ｇ６２、Ｕ８７）を用いて繰り返す。
【００７６】
腫瘍スフェロイドは、単層培養物よりも腫瘍の性質および不均一性を反映する、３次元のオルガノイド細胞群である。活発に分裂している腫瘍細胞は、緩い構造で細胞凝集物の縁に位置し、一方、内側のより深部に位置する細胞はもはや分裂せず、壊死領域の形成がここで起こる(Carlson et al., 1984)。スフェロイドを用いての実験は、ｃｒ ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系の腫瘍内形質導入効率、伝播の動態学、および腫瘍退縮効果に関する情報を提供する。従って、これらのスフェロイドは、動物において実験を実施する必要を伴わず、前記系の初期の最適化を可能とする。ｃｒ ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプ化ＶＳＶベクターの毒性の可能性、腫瘍退縮の治療的有効性、および腫瘍排除後の残留ウイルスの存在を、動物モデルにおいて調べる（実施例６参照）。
【００７７】
ウイルスＲＮＡポリメラーゼは、全くリコンビナーゼ活性を有さず、そして細胞質には全く細胞性リコンビナーゼが存在しないので、２つのマイナス鎖ＲＮＡウイルス間の組換えは、ＲＮＡポリメラーゼのテンプレートスイッチによってのみ行なうことができる。しかしながら、これは極めてまれな事象である(Finke & Conzelmann, 2005; Spann et al., 2003)。組換え体で複製性のＶＳＶの生成は安全性リスクを示し、そしてこれを調べる。このために、ウイルスＲＮＡを同時感染細胞の培養上清から種々の時点で単離し、そしてノザンブロットで導入遺伝子特異的（例えばｇｆｐ）プローブを用いて調べる。「過剰な長さ」を有するＲＮＡ種を検出できる場合、上清からのウイルスをプラーク精製し、そしてその感染性について標準的な方法を用いて調べ、そしてその後、分子生物学を用いて特徴付ける。
【００７８】
実施例４：治療的に効果的なＶＳＶ（ＬＣＭＶ−ＧＰ）シュードタイプベクターの調製のための遊走生産細胞の確立
遊走ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰ生産細胞を、ｃｒＶＳＶベクターおよび複製能を有するＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰベクターのために確立する。
【００７９】
種々のＭ変異体の調製および特徴付け
ＶＳＶ Ｍタンパク質はＶＳＶサイクル内に２つの必須の仕事を有する。一方で、それは、ウイルスの会合および出芽のためのビリオンの構造成分として必須である。他方で、それは、宿主のタンパク質合成に向けられるその「宿主シャットオフ」活性を通して、およびアポトーシスの誘導を通してウイルスの病態発生に著しく寄与する。これに関して、Ｍの重要な機能は、ＩＦＮ ｍＲＮＡの核−細胞質輸送の阻害である。それにより、ウイルス感染に対する細胞の最初の防御機序が、抑制される。
【００８０】
この強力な細胞障害性効果に因り、長期間、細胞系においてＭタンパク質を発現することは、不可能である。しかしながら、ウイルスの弱毒化をもたらすＭタンパク質における複数の突然変異が知られている。Irieおよび共同研究者は、Ｍタンパク質のいわゆる３７ＰＳＡＰ４０領域におけるアミノ酸交換によって、細胞病原性の大きく低下したＶＳＶ突然変異体を作製したことを実証した(Irie et al., 2007)。さらに、マウス実験において示されるように、ＰＳＡＰ領域外に単一（Ｍ５１Ｒ）または複数（Ｖ２２１ＦおよびＳ２２６Ｒ；Ｍ３３ＡおよびＭ５１Ａ）の突然変異を有するＭ変異体もまた、非常に弱毒化される(Desforges et al., 2001; JayakarおよびWhitt, 2002)。これらのウイルスは、ＩＦＮ−α/βの放出を抑制することができず、従って、感染から動物を防御する抗ウイルス状態を誘導する。しかしながら、ＩＦＮ系において欠陥を有することが多い腫瘍においては、これらのウイルスは、繁殖しそして腫瘍を溶解することができる。安全性の理由から、このような弱毒化変異体は、遺伝子療法のために特に重要である。なぜならそれらは、腫瘍細胞において優先的に複製するからである。
【００８１】
また、本発明者らは、記載の突然変異Ｍ３３Ａ、Ｍ５１Ｒ、Ｖ２２１ＦおよびＳ２２６Ｒを含み、そしてもはやＩＦＮ−βの合成を抑制することができない、Ｍタンパク質の非細胞病原性変異体（Ｍｎｃｐ）をクローニングした。この変異体は、ＩＦＮ非コンピテント細胞上で親ウイルスと類似した効率的な様式で複製するが、ＩＦＮコンピテント細胞上では減弱される。ＢＭ−ＴＩＣにおける効率的なウイルス産生を確実にするために、細胞を、ウイルス性インターフェロンアンタゴニストを用いて安定にトランスフェクションする(Haller et al., 2006)。
【００８２】
ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターのためのＢＭ−ＴＩＣ由来産生細胞の調製および特徴付け
腫瘍細胞は主に、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプの神経膠腫特異的指向性に因り形質導入される。それ故、依然として特定の細胞病原性を示すＭ変異体を用いて作業することも、可能である。ＢＭ−ＴＩＣにおける毒性作用を低く維持するために、抗ウイルス性ＭｘＡタンパク質を、Ｔｅｔ誘導性プロモーターを介して細胞中で発現させるべきである。Ｔｅｔ誘導性プロモーターを有するレトロウイルスベクターは公知である(Loew et al., 2006)。Ｔｅｔ応答性エレメント（ｔＴＡ）も、レトロウイルスベクターを介してＢＭ−ＴＩＣに導入する。ＭｘＡは、ＲＮＡウイルスに対して抗ウイルス活性を有するインターフェロン誘導ＧＴＰアーゼである(Pavlovic et al., 1992; StaeheliおよびPavlovic, 1991)。それは細胞質中で大きなオリゴマーの形態で存在し、毒性ではなく、そして今まで知られていない機序によってＶＳＶの複製を阻害する。ＬＣＭＶ−ＧＰを発現するＢＭ−ＴＩＣを、Ｔｅｔにより調節されるＭｘＡおよびｔＴＡベクターを用いて形質導入し、そして続いてＶＳＶベクターを用いて感染させる。抗生物質が培地中に存在する限り、細胞は、ＭｘＡの存在に因りＶＳＶ（ＬＣＭＶ−ＧＰ）を用いての増殖性感染に対して抵抗性である。in vivoにおける適用中にのみ、抗生物質が除去され、そしてＶＳＶ（ＬＣＭＶ−ＧＰ）のウイルス複製および産生が、次第に始まる。２日間の半減期を有するＭｘＡは非常に安定であるので、突然変異体ＭｘＡ（Ｌ６１２Ｋ）を代替的に使用することができる。ＭｘＡ（Ｌ６１２Ａ）は、野生型タンパク質と同じ有効性でＶＳＶの感染を阻害するが、オリゴマーを形成することはできない。これによってそれは不安定化され、そして僅か２時間という短い半減期を有する(Janzen et al., 2000)。
【００８３】
両方の生産細胞、すなわち、非細胞病原性Ｍを有するベクターを産生するＢＭ−ＴＩＣ並びにＭｘＡの発現を通してＶＳＶに関連した溶解に対して防御されているＢＭ−ＴＩＣは、以下のように特徴付けられる：
（ｉ）ベクター力価およびベクター産生持続時間を決定する。
（ｉｉ）ベクター力価に対する細胞の凍結および解凍の影響を分析する。
（ｉｉｉ）細胞が依然として腫瘍浸潤特性を有し、そしてその形質導入効率が腫瘍組織において達成されるかどうかを、最初にスフェロイドモデルにおいてそしてその後は動物モデルにおいて分析する。
（ｉｖ）産生されたベクター上清を、複製性ＶＳＶの存在について確認する。
【００８４】
実施例５：治療遺伝子のクローニングおよびパッケージング
自殺遺伝子を、本発明に従って治療遺伝子として使用することができる。このような遺伝子の例は、臨床において最も多くの経験を有する単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）である。ＨＳＶ−ＴＫの恒常的発現を通して、パッケージング細胞および形質導入細胞を療法の終了時に確実に排除することができ、これによって有糸分裂の活発なパッケージング細胞から危険が生じる可能性が全くなくなる。
【００８５】
悪性神経膠腫の免疫療法のために、すなわち、脳における不十分に発達した局所的な免疫応答を強化するために、免疫調節遺伝子を使用することができる。このような遺伝子の例は、サイトカイン、特にＩＬ−１２およびＦｌｔ３Ｌである。抗原による刺激後、ＩＬ−１２は、樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞などの抗原提示細胞によって自然に分泌され、そして強力なＴｈ１に基づいた抗腫瘍免疫応答を媒介する。それはＴｈ１細胞へのナイーブＴ細胞の成長および分化を増強し、従って、神経膠腫により誘発されるＴ細胞増殖およびＩＦＮ−γ産生の抑制に拮抗する。ＩＬ−１２は、ナチュラルキラー細胞およびＣＤ８＋細胞の細胞障害活性を増強し、そしてさらに抗血管新生活性も有する(Majewski et al., 1996)。複数の動物モデルにおいて、神経膠腫に対するＩＬ−１２により媒介される免疫応答の有効性が、すでに印象的な方法で実証されている(Toda et al., 1998; Kikuchi et al., 1999)。サイトカインＦｌｔ３Ｌは、抗原提示樹状細胞の増殖および分化にとって必須であり、従って、遺伝子療法の目的に特によく適しているようである。Sumiaおよび共同研究者は、ラット／マウスにおいて、Ｆｌｔ３Ｌ遺伝子を用いて神経膠腫を脳内で形質導入した後、樹状細胞の強力で局所的な流入を観察した。処置したラットの７０％が、腫瘍退縮を示し、そして生き残った。
【００８６】
サイトカインと自殺遺伝子（ＴＫ）の組合せは、最大限の安全性を提供するだけでなく、バイスタンダー効果に因り低い形質導入効率で良好な療法を可能とする。このアプローチは、神経膠芽腫の遺伝子療法の効率を増加させるために、３つの活性原理、すなわち、ウイルス性腫瘍退縮、自殺遺伝子により誘発されるアポトーシス、および局所的な免疫刺激を組み合わせる。
【００８７】
最初に、ＩＬ−１２およびＦｌｔ３Ｌを、ＶＳＶベクターにクローニングする。ＩＬ−１２は種特異的に活性であり、よってラット神経膠腫モデルにおいて試験するためにはマウスＩＬ−１２を使用しなければならない。これに対し、ヒトおよびマウスＦｌｔ３Ｌの７０％超が相同であり、そして両方の種において交差反応性である。免疫刺激遺伝子を、ｐ遺伝子の位置にクローニングし、他方で第２ベクター上ではＴＫｇｆｐまたはｇｆｐに、ＶＳＶ−Ｇ遺伝子を置き換える。以下の遺伝子組合せを、ｃｒ ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系の２つのベクターにクローニングする（図５）：
１）ベクターａ＝ＩＬ１２またはＦｌｔ３Ｌ＋ベクターｂ＝ＴＫｇｆｐ（またはＴＫ）
２）ベクターａ＝ＩＬ１２またはＦｌｔ３Ｌ＋ベクターｂ＝ｇｆｐ
３）ベクターａ＝ＩＬ１２またはＦｌｔ３Ｌ＋ベクターｂ＝空
４）ベクターａ＝空＋ベクターｂ＝ＴＫｇｆｐ（またはＴＫ）
５）ベクターａ＝空＋ベクターｂ＝ｇｆｐ
６）ベクターａ＝空＋ベクターｂ＝空
【００８８】
クローニング後、神経膠腫細胞系およびＢＭ−ＴＩＣを形質導入し、そして上清中に含まれるサイトカインの濃度をＥＬＩＳＡによって確認する。生理学的に関連する量の産生のために、ベクターを超遠心分離を介して濃縮する。ベクターを最初にスフェロイドの形質導入のために使用し、そしてバイスタンダー致死に対するその受容能をこの系において調べる。その後、ベクター上清を、調製したパッケージング細胞と一緒に、ベルゲンの我々の共同パートナーに送る。そこで、同系ラット神経膠腫モデルにおけるin vivo試験を行なう。ガンシクロビルの適用後の処置マウスの生存率を評価する。同時に、ＴＫの非存在下における免疫療法の治療有効性を調べる。ベクター組合せ６）は、腫瘍退縮の有効性に関する情報を提供する。腫瘍のサイズおよび従って療法の成功を、ＭＲＩおよびＰＥＴを介してモニタリングする(Miletic et al., 2007)。免疫調節遺伝子の効果を、浸潤細胞検出のための免疫組織化学的方法により評価する。以下の段落で記載するように、治療アプローチを、ヒト神経膠腫モデルにおいても調べる。
【００８９】
実施例６：２つの神経膠腫モデルにおける治療活性原理の試験
組換えＶＳＶベクターを最初にin vitroにおいて特徴付け、そしてその後、その有効性について動物モデルにおいて調査する。この目的のために、２つの特に意味のあるラットモデルを使用する。
【００９０】
同系９Ｌラット神経膠腫モデルを、免疫学的局面の検査および免疫治療法の実施のために使用する。この目的のために、神経膠腫細胞系をFisherラットの脳に移植し、これはその後、数日以内に腫瘍を発達させる。Fisherラットから単離された９Ｌ神経膠肉腫細胞は、腫瘍細胞系として役立てた。その後、種々のベクターまたは細胞系を、誘発された腫瘍に定位的に注射する。このラットモデルは以下の特徴を有する：
（ｉ）それは、個体間のばらつきの少ない再現性の良好な系を示す。
（ｉｉ）腫瘍は、ヒト神経膠腫と類似した特徴、例えば、侵襲性および活動性の増殖挙動並びに免疫抑制因子としてのＴＧＦβ２の産生などを有する。
（ｉｉｉ）ＳＣＩＤ／ヌードマウスモデルまたはラット異種移植片モデルとは対照的に、前記系は、免疫学的局面の検査または免疫治療法の試験を可能とする。
【００９１】
ヌードラットにおけるヒト神経膠腫モデルを、ヒト神経膠腫細胞に対する、本発明によるベクターおよび細胞の腫瘍退縮活性を試験するために使用する。ラット異種移植片モデルは、ヒト神経膠腫の種々の増殖特徴をシミュレーションする。ここでは規定の神経膠芽腫細胞系ではなく患者由来の原発性の腫瘍材料を、腫瘍の確立のために使用し、これはヒト神経膠腫内の異質性をシミュレーションすることを可能とする(Sakariassen et al., 2006)。ヌードラットにおけるヒト神経膠腫の連続継代によって、悪性腫瘍発達の種々の時期をマッピングすることができ、これにより療法の成功を調べることができる。ヒト神経膠腫モデルは、治療アプローチの検証に特に良く適している。なぜならそれは以下の特徴を有するからである：
（ｉ）腫瘍は、ヒト神経膠腫に類似した特徴、例えば侵襲性および活動性の増殖挙動などを有する。神経膠腫細胞系ではなく原発性の患者の材料を、腫瘍の確立のために使用する。
（ｉｉ）腫瘍の連続継代を通して、悪性腫瘍発達の種々の時期をマッピングすることができ、そして療法の成功を確認することができる。第１世代の腫瘍は、ゆっくりと成長し、高度に侵襲性であり、そして低度の神経血管新生を有する。強力な増殖および低下した侵襲性を有する高度に血管新生化した表現型は継代を通して発達する。
（ｉｉｉ）高度に侵襲性で非血管新生性の神経膠腫の細胞表現型は、腫瘍幹細胞の１つに類似している。従って、この動物モデルは、ヒトＧＢＭの幹細胞成分に対する我々の概念の治療有効性の試験を可能とする。
【００９２】
腫瘍の２つのカテゴリーを識別することができる。
（ｉ）ゆっくりとした高度に侵襲性の増殖挙動を有する初期腫瘍。これらの腫瘍は、低度の血管新生しか有さない。
（ｉｉ）血液が十分に供給されそして急速に増殖する後期腫瘍。この表現型は、侵襲性が低い。
【００９３】
ヒト神経膠腫モデルは、自殺遺伝子療法並びにウイルス腫瘍退縮を調べるのに非常に良く適している。しかしながら、現在までに、遺伝子治療法の免疫治療有効性の分析のために使用することができるヒト神経膠芽腫のための動物モデルは、全く存在しない。
【００９４】
療法の成功は、画像診断法によりおよび最終的には組織学的技術を用いて分析および評価される。最初に、補完的で複製性のＶＳＶ（ＬＣＭＶ−ＧＰ）シュードタイプの作用機構を、ラット神経膠腫モデルへの濃縮ベクター上清の腫瘍内注射によって調べる。形質導入効率および腫瘍内のｇｆｐコードベクターの分布を、数日後に、凍結切片の蛍光顕微鏡分析を用いて調べる。さらに、免疫細胞の腫瘍退縮および侵襲を免疫組織化学的に評価する。補足として、ヒト神経膠芽腫のための動物モデルにおける有効性も調べる。
【００９５】
同じモデルにおいて、ＢＭ−ＴＩＣ産生細胞の遊走能および産生されたＶＳＶベクターの感染性を調べる。この目的のために、細胞を緑色のダイで染色し、ここで放出されたベクターはｒｆｐをコードする。このアプローチは、ＢＭ−ＴＩＣと形質導入された腫瘍細胞との間の簡単な蛍光に基づいた識別を可能とする。
【００９６】
最後に、個々の導入遺伝子をコードするシュードタイプの治療効率を比較する。この目的のために、パッケージング細胞およびまた濃縮ベクター上清を、確立された９Ｌ腫瘍に注射する。ベクターは、ＴＫと組み合わせた免疫刺激遺伝子を含む。ガンシクロビル投与は、ベクターまたはパッケージング細胞の定位的投与の２日後に開始する。ベクターの免疫調節成分の治療効力を、ＴＫのみを含むベクターを受けた動物において評価する。処置の完了時に、個々の療法概念の有効性を、画像診断法（ＭＲＩ；ＰＥＴ）を用いて腫瘍サイズに基づいて評価する。免疫療法を用いて処置されたラットの脳の一部を、免疫状態の特徴付けのために使用する。凍結切片上におけるＭＨＣ分子の発現並びにＴ細胞、顆粒球、マクロファージおよびミクログリア細胞の分布を、免疫組織化学的方法によって調べる。さらに、脳内浸潤細胞の量および表現型組成を、フローサイトメトリーによって分析する。最善の治療効果を有する製剤を、ヒト神経膠腫の処置のために適応させる。このようなプロトタイプを直接、前臨床安全性試験に、およびＧＭＰ製造のためのそれぞれの方法を確立した後に臨床試験に移行することができる。
【００９７】
【表１】
【００９８】
【表２】
【００９９】
【表３】
【図４ａ）】
【図４ｂ）】
【図５ａ）】
【図５ｂ）】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子を含む水疱性口内炎（ＶＳＶ）由来組換えウイルスおよびウイルスベクター、ＧＰ−ＬＣＭＶ−シュードタイプ化ＶＳＶビリオンを産生するパッケージング細胞、並びに固形腫瘍の療法のための薬学的組成物の調製のための前記ビリオンおよびパッケージング細胞の使用に関する。
【０００２】
従来技術の説明
原発性頭蓋内脳腫瘍の最大の群である悪性神経膠腫は、依然として解決されていない治療問題を示す。熱心な基礎研究に因りこれらの腫瘍の生物学の知識は増えてきたが、臨床的な進歩および予後は、依然として極めて不良である。
【０００３】
悪性神経膠腫は、神経上皮を起源とする腫瘍であり、そして細胞学的に上衣腫、乏突起神経膠腫、乏突起星状細胞腫、星状細胞腫および神経膠芽腫に分類される。６０％超の比率を占めるびまん性浸潤性星状細胞腫（ＷＨＯグレードＩＩ〜ＩＶ）は、頭蓋内腫瘍の最大の群を示す。２００１年に改訂されたＷＨＯ分類は、主として星状細胞腫のための格付けスキームとして確立されている。ＷＨＯによると、脳腫瘍は、組織学的基準により４つの悪性度に割り当てられる(KleihusおよびCavenee, 2000)。びまん性浸潤性星状細胞腫の予後は、一般に不良である。予後は、一方で悪性度に依存し、他方で、腫瘍の位置および療法の手順に依存する。ＷＨＯグレードＩＩの星状細胞腫の患者の平均生存率は５年より長く、ＷＨＯグレードＩＩＩの星状細胞腫では２〜５年であり、ＷＨＯグレードＩＶ（＝神経膠芽腫）の星状細胞腫−神経膠芽腫では１年未満である。
【０００４】
腫瘍の分子病態発生は、複雑な過程であり、そして細胞周期の制御に関与する種々の遺伝子の突然変異に基づく。癌抑制遺伝子ｐ５３の突然変異は、ヒト腫瘍において最も頻繁に見られる変化であり、そして低悪性度の星状細胞腫の発生並びに続発性神経膠芽腫への進行にも関与する。しかしながら、初発の神経膠芽腫は、非常に稀にしかｐ５３の突然変異を有さない。びまん性星状細胞腫の悪性傾向を示すさらに他の遺伝子は、第１９染色体の長腕上に存在すると疑われている。神経膠芽腫の症例において頻繁に変化しているさらに他の遺伝子は、癌遺伝子ＭＤＭ２およびＭＤＭ４並びにまた癌抑制遺伝子ｐ１４ＡＲＦであり、これらはｐ５３依存性の細胞周期の制御に関与している(DaiおよびHolland, 2001)。ＥＧＦレセプター遺伝子の増幅が、原発性神経膠芽腫の３０〜４０％において観察され、それ故、この腫瘍群において最も頻繁に増幅される発癌遺伝子である(Holland, 2001)。大半の悪性神経膠腫は、化学療法または放射線療法に対して良好に応答しない。この理由は、アポトーシスの調節にも関与する細胞周期関連遺伝子の突然変異であると考えられる。
【０００５】
悪性神経膠腫のためのより効果的な療法が、緊急に必要とされる。なぜなら、化学療法または放射線療法などの既存の療法からは、疾病の予後に関する有意な改善が、全く期待されないからである。これに対し、神経膠芽腫の遺伝子療法は、有望な可能性を提供し、これを開拓する必要がある。複数の異なる非常に効果的な遺伝子が、この目的のために開発された。それらの殆どについて、動物実験のデータを入手することができる(ShirおよびLevitzki, 2001)。これらの治療遺伝子を、４つの異なる活性原理に割り当てることができる：
（ｉ）いわゆる自殺遺伝子の遺伝子産物は、前駆体を細胞障害性分子へと変換する。例は、ガンシクロビルの投薬と関連した単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ＴＫ）である。特に有利な点は、毒性のあるガンシクロビル三リン酸が隣接細胞に拡散し、それによってバイスタンダー効果が起こることである。近年、この酵素の活性がさらに増加した。ＨＳＶ ＴＫは、現在、腫瘍細胞並びに移植されたベクター産生細胞を排除するための非常に効率的な可能性のあるものである。
（ｉｉ）ＩＬ−４などの免疫刺激サイトカインの発現は、腫瘍細胞に対する自然免疫を刺激することができる。
（ｉｉｉ）エンドスタチンなどの抗血管新生タンパク質の分泌により血管が欠失し、それ故、代謝的に非常に活発な腫瘍組織における栄養分の供給が欠乏する。腫瘍は、実質的に「飢餓」する。
（ｉｖ）最後に、これらの細胞の制御されていない増殖を阻害するために、腫瘍細胞のシグナル伝達または細胞周期に関与する一連の遺伝子が、記載された。しかしながら、臨床においてこれらの遺伝子を使用する可能性は、限定されている。なぜなら、これらの遺伝子は、遺伝子の改変された細胞自体においてしか作用せず、そして最初に記載した活性原理としてのバイスタンダー効果は有さないからである。このことは、治療効果を達成するために、実質的に全ての悪性細胞を遺伝子的に改変しなければならないことを意味し、これは理想的なベクター系を用いてさえも無理である。
【０００６】
良好な神経膠芽腫の遺伝子療法のための最も重要な必要条件は、多数の既存の非常に効果的な作用原理によって提供される。しかしながら、依然として解決されていない問題は、非効率的な遺伝子導入、および標的細胞における治療遺伝子の不十分な発現である。このことは、多数の効率的な治療遺伝子が存在するにも関わらず、臨床では神経膠芽腫の遺伝子療法が失敗している理由である。
【０００７】
物理化学的トランスフェクション法を上回るウイルスによる遺伝子導入の利点は、より高い遺伝子導入率および遺伝子の長期発現である。なぜなら、ウイルスは、そのゲノムを細胞に導入しそれを発現させるための特に効率的な機序を発達させてきたからである。特に複製能を有するウイルス、例えばとりわけ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、アデノウイルス（Ａｄ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）および水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、現在、腫瘍退縮ウイルス（ＯＶ）として使用されている。神経膠芽腫の最適なウイルス療法のために、ＯＶは以下の特徴を有するべきである：
（ｉ）それらは、腫瘍特異的な指向性を有するべきであり、それによってウイルス複製および細胞溶解は、腫瘍組織に限定されて留まる。ウイルスエンベロープの改変によって、または腫瘍特異的プロモーターの使用によってこの特性を増強させることができる。神経膠腫細胞のほんの一部しか処置中に分裂していないと想定されるので、増殖中の細胞だけでなく休止細胞にも感染するウイルスが有利である。
（ｉｉ）安全性に関連する面に関しては、高い遺伝子的安定性および腫瘍組織外における低毒性が、臨床使用のために特に適している。このことは、ＧＭＰ条件下における高いウイルス力価およびベクターの精製を可能とする。理想的には、ＯＶはヒトに対して非病原性であるべきであり、そして個体群間で低い感染率を有するべきである。既存免疫は時期尚早なウイルスの中和をもたらし、これにより効率的な療法が可能とならないだろう。
【０００８】
神経膠芽腫の療法における腫瘍退縮ウイルスの顕著な例は、弱毒化ＨＳＶ変異体Ｇ２０７および１７１６並びにアデノウイルスＯＮＹＸ−０１５である。ＣＮＳ腫瘍の処置のための腫瘍退縮ＨＳＶの使用に対する深刻な反対は、正常な脳細胞におけるその高いレベルの複製であり、これは生命を危うくする脳炎をもたらす可能性がある。さらに、残留する可能性に加えて、潜在性ＨＳＶが再活性化される可能性がある。複数の遺伝子を欠失させることによって生成したＨＳＶ変異体１７１６は、ＣＮＳの急速に増殖中の細胞において選択的に複製するが、有糸分裂後のニューロン中では複製しない。これにより、ＨＳＶの神経毒性はかなり減少した。ＨＳＶ１７１６を用いてラットおよびマウスの実験的神経膠腫を処置することより、腫瘍細胞が選択的に破壊されたが、周辺の脳組織は損傷を受けずに留まった。ＯＮＹＸ−０１５は、神経膠芽腫の療法のために開発されたさらなる腫瘍退縮ウイルスである。このアデノウイルスは、Ｅ１Ｂ遺伝子の欠失を通して、ｐ５３の欠損した細胞を選択的に溶解しようとする。
【０００９】
腫瘍退縮ＨＳＶ並びにＯＮＹＸ−０１５は、神経膠腫の処置のためにすでに臨床的に試験された。どちらの弱毒化腫瘍退縮ウイルスも、第Ｉ/ＩＩ相臨床試験において十分な安全性を示した。ウイルスを腫瘍内に注射するかまたは切除空洞に注射するかに関係なく、処置に対して良好な耐容性を示し、そして重篤な副作用は、全く観察されなかった。しかしながら、細胞溶解効果は、単なる一過性の性質であり、その後、常に再発を伴った(Cutter et al., 2206)。通常、神経膠腫の増殖速度は、ウイルスの増幅速度および従って伝播波を上回るので、腫瘍退縮のみによる神経膠腫の破壊は疑問である。事実、効率的な処置のために、複数の活性原理の組合せが、必要とされる。ＯＶにおいて自殺遺伝子または免疫調節遺伝子を使用することによって、前臨床試験において相乗作用が、実証された(Tyminski et al., 2005; Fukuhara et al., 2005)。
【００１０】
前記のＤＮＡウイルスの他に、腫瘍退縮ＲＮＡウイルスも、開発中である。ＶＳＶは、エンベロープを有するマイナス鎖のウイルスであり、その宿主域は、げっ歯類および家畜を含む。ヒトへの感染は、稀であり、そして大半は、無症候性である。個体群間の血清有病率は非常に低いために、ＶＳＶ中和抗体による療法の効率の障害は、予期されない。ＶＳＶの感染および細胞質における複製は、細胞周期とは関係なく行なわれ、よって活発に分裂している細胞および休止細胞に同等に感染する。ＶＳＶによる新生物細胞の効率的かつ優先的な溶解は、これらの細胞における大半は欠陥のあるインターフェロンシグナル伝達経路および随伴するウイルス複製に関連する(Wollmann et al., 2007)。また、細胞性免疫応答とは関係なく、遺伝子Ｍｙｃ、Ｒａｓまたはｐ５３に欠陥を有する腫瘍細胞も、ＶＳＶの繁殖を支持することが実証された(Barber, 2004)。ＶＳＶの腫瘍特異性は、組換えウイルスの調製によって近年さらに最適化された。ここでの主な焦点は、Ｍタンパク質に突然変異を有する変異体（ΔＭ５１）である。この変異体は、健康細胞においてインターフェロン応答を妨げることはできず、これによりそのような細胞におけるウイルス複製は、抑制される。ＩＦＮ応答に欠陥のある腫瘍細胞において、ウイルスは、複製することができ、従って、選択的に腫瘍退縮的に活性であることができる。ＶＳＶΔＭ５１は、全身適用後でさえも、マウスモデルにおいてヒト神経膠腫の安全かつ効率的な腫瘍退縮を示した(Lun et al., 2006)。
【００１１】
脳への直接的なウイルスベクターの適用には、腫瘍細胞に対する高い選択性が必要とされ、そしてそれは比較的少容量でのみ可能である。従って、効率的な遺伝子導入は、神経膠腫細胞に対して強く発達した指向性を有する高度に濃縮されたベクター調製物（＞１０８/ml）を用いてのみ達成することができる。ガンマレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターの場合、ベクターの指向性およびベクターの安定性は、非レトロウイルスエンベロープタンパク質を組み込むことによって影響を受け得る。多くの場合、レトロウイルスエンベロープタンパク質は、より安定なＶＳＶのＧタンパク質で置換されている。これらのいわゆるシュードタイプ化ベクターの問題は、ＶＳＶ−Ｇが、すなわち生産細胞において並びに周囲の健康組織に対して細胞毒性であることであり、これは以前から臨床でこのようなＶＳＶ−Ｇシュードタイプを広範に使用する際の障害であった。
【００１２】
本発明者らは以前、ＣＮＳの神経膠細胞への効率的な遺伝子の導入を可能とする、レトロウイルスベクタータイプを開発した。この新たなベクタータイプでは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質（ＧＰ）がウイルスエンベロープタンパク質としての機能を果たす(Miletic et al., 1999; Beyer et al., 2002; EP 1 006 196)。比較によるin vitroおよびin vivoにおける指向性研究において、ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプは優先的に神経膠腫細胞を形質導入することが実証された(Miletic et al., 2004; Miletic et al., 2007)。これに対し、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプは優先的にニューロンを形質導入し；神経膠腫細胞における遺伝子導入は、ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプよりも効率が低かった。また、個々の浸潤性腫瘍細胞も、ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプによって効率的に形質導入された。ラット神経膠腫モデルにおいて、９０％のラットが、ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプ化レンチウイルスベクターの腫瘍内注射によって治癒された(Miletic et al.; 2007b)。使用したベクターは、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードし、形質導入細胞並びに周辺の細胞においてガンシクロビルを細胞障害性の三リン酸化合物へと変換するという効果を伴った。
【００１３】
神経膠腫への選択的な遺伝子の導入、しかしまた腫瘍内全体における効率的なベクターの分布も、療法の成功にとって決定的である。それ故、本発明者らは、腫瘍内全体でシュードタイプ化ベクターを放出すると考えられる腫瘍浸潤性パッケージング細胞を開発した(WO 2006/008074)。遊走能を有する有望な細胞型は、骨髄から単離することができる多能性成体前駆細胞である(Jiang et al., 2002)。移植実験において、これらの細胞の遊走挙動を、ラット神経膠腫モデルを使用して調べた。前駆細胞は腫瘍塊に効率的に浸透したが、周辺の健康な脳組織には浸潤しなかったことが実証された(Fischer et al., 2007)。３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｒａｔ−１ラット線維芽細胞またはヒト２９３Ｔなどの従来の細胞系は、全く腫瘍への浸潤を示さなかった。むしろ、これらの細胞は、注射部位または近傍に局所的に限定され、そして神経膠腫特異的な遊走は、示さなかった。
【００１４】
さらなる研究において、本発明者らは、ラット神経膠腫モデルにおけるＴＫ発現前駆細胞の治療効力を調べた。この研究の結果は、７０％のラットにおける腫瘍の破壊は、前駆細胞と腫瘍細胞との間のバイスタンダー効果だけに起因していたというものであった(Miletic et al., 2007)。さらに、画像診断法を用いて、前駆細胞の腫瘍内局在化が、確認された。処置された無症候ラットの脳の組織学的切片は、腫瘍の位置における顕著な瘢痕組織と共に空洞を有し；このことは、動物における腫瘍が、遺伝子療法によって成功裏に根絶されたことを示す。これらの前駆細胞の強力な増殖能のお陰で、遺伝子改変とその後の個々のパッケージング細胞クローンの選択が、可能である。ガンマレトロウイルスＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプのための、前駆細胞に基づいたパッケージング細胞が、開発された。これらのパッケージング細胞は、１〜７×１０Ｅ３ＴＵ/mlの力価で連続的にレトロウイルスベクターを産生した。力価は数週間にわたりそして細胞の凍結解凍の反復後も安定して留まった(Fischer et al., 2007)。
【００１５】
in vivoにおける非効率な遺伝子導入および治療的に効果的な遺伝子がないことが、現在、神経膠芽腫の良好な遺伝子療法の障害となっている。神経膠腫の遺伝子療法および腫瘍退縮ウイルス療法のための以前から公知のベクターは、種々の理由から最適ではない。以前の遺伝子導入法の効率、特異性および安全性を、患者への治療的に効果的な遺伝子の導入が可能となる程度まで高めなければならない。
【００１６】
それ故、本発明の目的は、神経膠腫といった高度に悪性の脳腫瘍および他の固形腫瘍の療法用の治療遺伝子のための高度に強力な腫瘍退縮ウイルス遺伝子導入系を開発することである。
【００１７】
発明の要約
それ故、本発明の主題は、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子を含み、ＶＳＶのエンベロープタンパク質Ｇをコードする機能的遺伝子を全く含まない、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）シュードタイプベクターである。ＬＣＭＶ−ＧＰは、ＬＣＭＶの糖タンパク質ＧＰ−１またはＧＰ−２であり得る。
【００１８】
さらなる態様によると、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターにおいて、ＶＳＶのエンベロープタンパク質Ｇは、ＬＣＭＶのＧＰ（ＬＣＭＶ−ＧＰ）によって置換されている。
【００１９】
さらなる態様によると、前記ベクターは、ＶＳＶのタンパク質Ｎ、Ｌ、ＰおよびＭをコードするｎ、ｌ、ｐおよびｍ遺伝子の群より選択される少なくとも１つの遺伝子を欠失する。
【００２０】
さらなる態様によると、ＶＳＶのＭタンパク質は、ＶＳＶの細胞病原性を減少させる突然変異を含む。ＶＳＶの細胞病原性を低減させる突然変異の例は、Ｍタンパク質の３７ＰＳＡＰ４０領域におけるアミノ酸交換並びに突然変異Ｍ３３Ａ、Ｍ５１Ａ、Ｖ２２１Ｆ、Ｓ２２６Ｒまたはその組合せである。
【００２１】
さらなる態様によると、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターは、少なくとも１つの治療的に適用可能な導入遺伝子を含む。導入遺伝子は、自殺遺伝子または免疫刺激遺伝子であり得る。自殺遺伝子の例は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、シトシンデアミナーゼ、ＦＫＢＰ−ＦＡＳまたはＦＫＢＰ−カスパーゼ９をコードする遺伝子である。免疫刺激遺伝子の例は、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、中和性抗ＴＧＦβまたはＦｌｔ３Ｌをコードする遺伝子である。
【００２２】
さらなる態様によると、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターは、マーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子は、ＬａｃＺ、抗生物質耐性遺伝子、または蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＲＥＰ、ＧＧＰなど）をコードする遺伝子であり得る。
【００２３】
本発明の主題はさらに、少なくとも２つの補完的で複製性の（ｃｒ）ＶＳＶベクターを含むＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系であり、前記ベクター系の１つのベクターはＬＣＭＶ−ＧＰをコードする遺伝子ｇｐを含み、前記ベクター系はさらにＶＳＶのタンパク質Ｎ、Ｌ、ＰおよびＭをコードする遺伝子ｎ、ｌ、ｐおよびｍを含み、ＶＳＶのエンベロープタンパク質Ｇをコードする機能的遺伝子は全く含まず、前記ベクター系の各ベクターは、遺伝子（「補完的な遺伝子」）ｇｐ、ｎ、ｌ、ｐおよびｍの１つを欠失し、そして欠失遺伝子は、前記ベクター系のいずれかの他のベクター上に存在する。遺伝子ｍおよびｇｐが、好ましい補完的な遺伝子である。
【００２４】
さらなる態様によると、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系のＭタンパク質は、前記で説明したように、ＶＳＶの細胞病原性を減少させる突然変異を含む。
【００２５】
さらなる態様によると、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系は、前記で説明したように、少なくとも１つの治療的に適用可能な導入遺伝子および／またはマーカー遺伝子を含む。導入遺伝子／マーカー遺伝子は、前記ベクター系のいずれかのベクター上に位置し得る。
【００２６】
本発明の主題はさらに、エンベロープタンパク質としてＬＣＭＶのＧＰタンパク質を含むＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオンである。
【００２７】
本発明の主題はさらに、ＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオンを産生する、ウイルス産生細胞である。
【００２８】
さらなる態様によると、ウイルス産生細胞は、成体幹細胞である。成体幹細胞は、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、またはＭＳＣに由来するＢＭ−ＴＩＣ細胞（骨髄由来腫瘍浸潤細胞）であり得る。
【００２９】
さらなる態様によると、ウイルス産生細胞は、ＶＳＶのタンパク質Ｎ、Ｌ、ＰおよびＭをそれぞれコードする遺伝子ｎ、ｌ、ｐおよびｍ並びにＬＣＭＶ−ＧＰ糖タンパク質をコードする遺伝子ｇｐからなる群より選択される遺伝子の発現のための１つ以上の発現カセットを含む。
【００３０】
さらなる態様によると、ウイルス産生細胞はさらに、ＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオンへのパッケージングのための導入遺伝子用ベクターを含む。
【００３１】
さらなる態様によると、遺伝子導入用ベクターは、前記に説明したように、治療的に適用可能な導入遺伝子および／またはマーカー遺伝子を含む。
【００３２】
本発明の主題はさらに、細胞に導入遺伝子を導入するためのin vitroにおける方法であり、前記方法においては細胞を、ＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオンを用いて形質導入し、ここで前記ビリオンは導入遺伝子を含む。
【００３３】
本発明の主題はさらに、細胞に導入遺伝子を導入するためのin vitroにおける方法であり、前記方法においては細胞を、ＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオンを産生するウイルス産生細胞と接触させ、ここで前記ビリオンは導入遺伝子を含む。
【００３４】
細胞が、腫瘍細胞、例えば神経膠腫細胞であることが好ましい。
【００３５】
本発明の主題はさらに、固形腫瘍の療法のための薬学的組成物の調製のための本発明のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターまたはＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系の使用である。
【００３６】
本発明の主題は、固形腫瘍の療法のための薬学的組成物の調製のためのＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオンの使用である。
【００３７】
本発明の主題はさらに、固形腫瘍の療法のための薬学的組成物の調製のための本発明のウイルス産生細胞の使用である。腫瘍が、脳腫瘍、特に神経膠腫であることが好ましい。
【００３８】
さらなる態様によると、少なくとも２つのウイルス産生細胞が、固形腫瘍の療法のための薬学的組成物の調製のために使用され、第１のウイルス産生細胞は、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＰＧシュードタイプベクター系の第１ベクターを含み、そして第２のパッケージング細胞は、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＰＧシュードタイプベクター系の第２のベクターを含む。
【００３９】
さらに、本発明の主題は、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＰＧシュードタイプベクター、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＰＧシュードタイプベクター系、ＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオン、またはＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオンを産生するウイルス産生細胞を含む薬学的組成物である。前記組成物はまた、適切な補助物質および／または担体を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ＬＣＭＶ ＧＰを用いてのＶＳＶｇｆｐ ｎｃｐ−ΔＧベクターのシュードタイプ化。
【図２】ＶＳＶ（ＬＣＭＶ ＧＰ）ベクターを用いての神経膠腫細胞系の形質導入。
【図３】ＢＭ−ＴＩＣにおけるＬＣＭＶ ＧＰを用いてのＶＳＶｇｆｐ ｎｃｐ−ΔＧベクターのシュードタイプ化。
【図４】ｃｒ ＶＳＶ（ＬＣＭＶ−ＧＰ）ベクター系の図解。ａ）ベクターの１つは、リン酸化タンパク質Ｐの代わりにｒｆｐを、そしてＶＳＶ−Ｇの代わりにＬＣＭＶＰ−ＧＰを含む。ｂ）補完的なベクターは、ａ）に欠失しているＰタンパク質をコードするが、治療遺伝子として、ウイルス糖タンパク質の代わりに、例えば単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）を含む。両方のベクターが、改変されたＭ遺伝子（Ｍｎｃｐ）を含む。
【図５】ウイルスベクターの図解。最適化ベクターにおいては、Ｐタンパク質の代わりに治療遺伝子がクローニングされると考えられる。免疫調節遺伝子（ＩＬ−１２、Ｆｌｔ３Ｌ）に加えて、第２ベクターはさらにＨＳＶのチミジンキナーゼも含む。
【００４１】
本発明の説明
本発明は、組換え水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）およびＶＳＶベクターに関する。ＶＳＶゲノムは、タンパク質Ｌ、Ｍ、Ｎ、ＰおよびＧをコードし、そしてウイルスの繁殖に必須である５つの遺伝子ｌ、ｍ、ｎ、ｐおよびｇを含む。Ｎは、ＶＳＶゲノムＲＮＡをパッケージングする核タンパク質であり；ＶＳＶゲノムは、ＲＮＡ−タンパク質複合体としてしか複製することができない。ＬおよびＰは一緒に、ポリメラーゼ複合体を形成し、これは、ＶＳＶゲノムを複製し、そしてＶＳＶｍＲＮＡを転写する。Ｍは、脂質エンベロープとヌクレオカプシドとの間に一種のキットを形成する基質タンパク質であり、そしてこれは細胞膜における粒子の出芽に重要である。Ｇは、ウイルスエンベロープに取り込まれたエンベロープタンパク質であり、そしてこれはウイルスの感染性に必須である。
【００４２】
本発明の主題は、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター、およびＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオンである。本発明のベクターは、ＶＳＶのＧタンパク質をコードする遺伝子ｇの代わりに、ＧＰタンパク質をコードする遺伝子ｇｐを含む。従って、本発明のウイルス／ビリオンは、エンベロープタンパク質としてＬＣＭＶ−ＧＰタンパク質を含む。ＧＰタンパク質は、ＧＰ１またはＧＰ２であり得る。
【００４３】
本発明は、種々のＬＣＭＶ株に由来するＧＰタンパク質を含む。特に、ＬＣＭＶ−ＧＰ変異体は、ＬＣＭＶ野生型またはＬＣＭＶ株のＬＣＭＶ−ＷＥ、ＬＣＭＶ−ＷＥ−ＨＰＩ、ＬＣＭＶ−ＷＥ−ＨＰＩｏｐｔに由来し得る(WO 2006/008074)。
【００４４】
水疱性口内炎ウイルスに基づいたベクターは、レトロウイルスベクターを上回る利点を有する：
（ｉ）ＶＳＶベクターは、腫瘍退縮性であり、そして他の腫瘍退縮性ウイルスベクターと比較して特に高い腫瘍退縮活性を有する：
（ｉｉ）ＶＳＶベクターは、優先的に腫瘍細胞において複製し、そして他の腫瘍退縮性ウイルスベクターと比較して特に高い複製能を有する。
（ｉｉｉ）ＶＳＶベクターは、活発に分裂している細胞と同様に、休止腫瘍細胞にも感染する。
（ｉｖ）ＶＳＶベクターは、強力な自然体液性および細胞性免疫応答を誘導する。
（ｖ）ＶＳＶベクターは、純粋に細胞質で複製し、すなわち、ＲＮＡウイルスのようにそれらは宿主細胞のゲノムに組み込んだり、または複製能を有するウイルス中に組換えたりすることができない。
（ｖｉ）ＶＳＶベクターはパッケージングし易い。
（ｖｉｉ）ＶＳＶ糖タンパク質は、外来のエンベロープタンパク質と交換可能である。ＶＳＶエンベロープに以前に取り込まれた糖タンパク質の例は、ＨＩＶｇｐ１６０(OwensおよびRose 1993)、ＨＣＶＥ１／Ｅ２(Tani et al., 2007)、ＳＡＲＳ Ｓ(Ge et al., 2006)、およびＬａｓｓａ ＧＰ(Garbutt et al., 2004)である。
【００４５】
総合すると、ＶＳＶベクターは、特に高い治療能を有する。
【００４６】
本発明によるＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターの別の利点は、健康な脳細胞、すなわちニューロンに対する、ＬＭＣＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶウイルスのかなり低減された毒性である。ＶＳＶの神経毒性は、ＶＳＶのＧタンパク質に起因する(Shinosaki et al., 2005)。実際に、ＶＳＶ−Ｇシュードタイプは、優先的に正常ニューロンに感染する。向神経性は、腫瘍退縮性ＶＳＶの全ての適用における用量制限因子であるので、本発明によるベクターの使用は全ての腫瘍に対して非常に利点がある。
【００４７】
さらに、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターは、脳腫瘍細胞に対して向上した特異性を有し、これは使用されるＬＣＭＶ−ＧＰ糖タンパク質の神経膠腫特異的な指向性および腫瘍細胞におけるＶＳＶの選択的な転写／複製に由来する。ＶＳＶ−Ｇとは対照的に、ＬＣＭＶ−ＧＰエンベロープタンパク質は、神経膠芽腫細胞に対して特に指向性を有する。しかしながら、本発明によるベクターを、ＣＮＳ外の他の腫瘍においても使用することができる。なぜなら、そこでも、特に全身適用の場合にはＶＳＶの神経毒性が用量制限因子であるからである。
【００４８】
ＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたベクターは、非シュードタイプ化ベクターが有さない３つの重要な特徴を有する、すなわち：
（ｉ）ＬＣＭＶ−ＧＰは、細胞毒性ではない。
（ｉｉ）ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターを、感染性を失うことなく超遠心分離によって濃縮することができる。
（ｉｉｉ）ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターは、神経膠細胞に対して好ましい指向性を示し、一方ニューロンは非効率的に感染される。
【００４９】
本発明は、複製欠損ウイルス並びに複製能を有するウイルスを含む。後者は追加の利点を有する。なぜなら、繁殖することができるウイルスを使用して高い形質導入率を達成することができるからである。この点で、複製可能な腫瘍退縮性ウイルスベクターは、複製能を有さないベクターよりも効率的である。
【００５０】
治療使用における複製可能なウイルスの使用中の安全性を高めるために、ＶＳＶウイルスの複製、腫瘍退縮および産生が、少なくとも２つの複製欠損性で相互補完性のベクターによって感染された細胞においてしか行なわれないことを確実とするベクター系を、提供する。
【００５１】
それ故、本発明の主題は、少なくとも２つの補完的なＶＳＶベクターを含む、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系である。このような補完的で複製性の（ｃｒ）ＶＳＶベクターを腫瘍内に限定された程度で伝播させることができ、これは遺伝子導入および腫瘍退縮の効率を高める。従って、本発明によるベクター系は、神経膠腫および他の腫瘍への遺伝子導入のための、制限された繁殖能を有する腫瘍退縮性ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターの調製を可能とする。
【００５２】
本発明によるベクター系の原理は、前記系の各ベクターが、ＶＳＶの必須遺伝子ｍ、ｎ、ｌおよびｐの１つまたはＬＣＭＶのｇｐを欠失しているが、しかしながら、前記系のいずれかの他のベクター上に存在するというものである。ＬＣＭＶ−ＧＰをコードする遺伝子ｇｐ並びに可能な追加の遺伝子、例えば治療遺伝子および／またはマーカー遺伝子が、前記系のいずれかのベクター上に存在し得る。
【００５３】
本発明によるベクター系の種々の変異体が、可能である。例えば、ベクター系は、図５に説明したように２つのベクターからなり得る。第１のベクターは、ＶＳＶのＧの代わりにＬＣＭＶのＧＰを含み、そしてＰタンパク質をコードする遺伝子ｐの欠失を含む。また、第２ベクターは、ＶＳＶ−Ｇを全く含まないが、ＶＳＶのＰタンパク質を発現する。各ベクターは、ＶＳＶの核タンパク質（Ｎ）およびポリメラーゼ（Ｌ）並びにＭタンパク質のより細胞病原性の少ない変異体（Ｍｎｃｐ）を発現する。第１ベクターはさらに、マーカー遺伝子ｒｆｐを有し、第２ベクターは、自殺遺伝子ＨＳＶ−ＴＫおよびマーカー遺伝子ｇｆｐを有する。図６に説明した変異体において、両方のベクターが、治療遺伝子を含むことができ、第１ベクターは、例えば、Ｆｌｔ３ＬまたはＩＬ−１２を含み、そして第２ベクターは例えばＨＳＶ−ＴＫを含む。
【００５４】
現在までに、神経膠芽腫の療法のための種々の概念が、探求されてきた：（ｉ）自殺遺伝子の導入、（ｉｉ）免疫刺激遺伝子を使用したおよびサイトカインに基づいた免疫療法を用いての神経膠芽腫に関連した免疫抑制の排除、（ｉｉｉ）腫瘍誘発血管新生に拮抗する因子の導入、（ｉｖ）細胞周期モデュレーターの使用、および（ｖ）アポトーシスの誘導。本発明の目的のために、最初の３つのアプローチ（ｉ〜ｉｉｉ）を最初に考慮する予定である。
【００５５】
その固有の腫瘍退縮特性に加えて、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターおよびそれに基づいたベクター系は、自殺遺伝子および／または免疫刺激遺伝子を導入することによってさらに改良され得る。自殺タンパク質の例は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、サイトカインデアミナーゼ、ＦＫＢＰ−ＦＡＳ、ＦＫＢＰ−カスパーゼ９である。免疫刺激タンパク質の例は、サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２およびＦｌｔ３Ｌ、中和性抗ＴＧＦβである。４．５ｋｂまでのサイズを有する遺伝子の挿入は、ＶＳＶゲノムによって耐容性が示され、よって２つ以上の治療遺伝子（例えばＨＳＶ−ＴＫ＋サイトカイン）を１つのＶＳＶゲノム内で合わせることが可能でさえある。さらに、遺伝子産物は、いわゆるバイスタンダー効果によって非感染腫瘍細胞に対してもその作用を発揮する。
【００５６】
注射されたウイルスベクターは、注射部位から腫瘍組織中にほんの数ミリメートルしか浸透しない。ベクター分布を最適化するために、および腫瘍の標的化破壊のために、腫瘍中に特異的に遊走し、これにより注射部位から遠い部位でウイルスを放出する、腫瘍浸潤性ウイルス産生細胞を使用する。
【００５７】
本発明の意味におけるウイルス産生細胞は、非複製性ベクターからのビリオンの産生のための古典的なパッケージング細胞、並びに繁殖することのできるベクターからのビリオンの産生のための生産細胞を含む。パッケージング細胞は通常、パッケージングしようとするそれぞれのベクターに欠けているおよび／またはビリオンの産生のために必要である、必須遺伝子の発現のための１つ以上のプラスミドを含む。
【００５８】
以前の研究において、ウイルスベクターを導入するためにパッケージング細胞を、使用したが；しかしながら、これは、腫瘍内では遊走しない線維芽細胞が主に関与していた(Short et al., 1990, Culver et al., 1992)。これに対し、成体幹細胞、特に神経幹細胞（ＮＳＣ）および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、高い遊走能を有する。それらは、腫瘍組織に限局されて留まり、これにより腫瘍組織への非常に効率的であるがしかしまた特異的でもある遺伝子の導入が、達成される。しかしながら、これらの幹細胞は、in vitroにおいて有限の継代能しか有さない。
【００５９】
成体間葉系幹細胞の亜集団、いわゆるＢＭ−ＴＣＩ（骨髄由来腫瘍浸潤性細胞）は、実験的に誘発した神経膠腫への注射後、全体の腫瘍に浸潤し、そしてさらに、腫瘍塊から遠くの個々の腫瘍細胞を追跡する(Miletic et al., 2007)。ＢＭ−ＴＩＣは、成体骨髄から単離され、高い増殖能を有し、そしてＭＬＶ(Fischer et al., 2007)およびＶＳＶベクターのための遊走産生細胞として使用することができる。
【００６０】
従って、本発明の主題は、腫瘍退縮性ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターを産生するウイルス産生細胞である。特に、これらは、その遊走中に腫瘍内で前記ベクターを放出する、腫瘍浸潤性生産細胞である。好ましい細胞は、成体幹細胞、特に神経幹細胞（ＮＳＣ）および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。特に好ましい細胞は、ＭＳＣに由来するＢＭ−ＴＩＣ細胞である。
【００６１】
ラブドウイルス産生細胞の調製のための障害は、タンパク質ＭおよびＧの細胞病原性である。ＶＳＶのＧタンパク質は、本発明のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターにおいてＬＣＭＶの神経膠腫特異的かつ非細胞毒性の糖タンパク質によって置換されているので、Ｍタンパク質のみが、依然として問題である。ＶＳＶ産生細胞系におけるＭタンパク質の毒性を低減させるために、Ｍタンパク質の非細胞病原性変異体を、使用することができる。
【００６２】
それ故、本発明のウイルス産生細胞、および従ってまた前記細胞によって産生されたＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターは、突然変異Ｍタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。このベクター変異体は、腫瘍細胞に対して選択的に腫瘍退縮性であるが、健康細胞に対しては毒性ではない。Ｍタンパク質の３７ＰＳＡＰ４０領域におけるアミノ酸交換を有するか、またはＭタンパク質のＰＳＡＰ領域外に単一（Ｍ５１Ｒ）もしくは複数（Ｖ２２１ＦおよびＳ２２６Ｒ；Ｍ３３ＡおよびＭ５１Ａ）の突然変異を有する、Ｍ変異体が好ましい。突然変異Ｍ３３Ａ、Ｍ５１Ｒ、Ｖ２２ＦおよびＳ２２６Ｒを有するＭタンパク質が特に好ましい。パッケージング細胞における効率的なウイルス産生を確実にするために、Ｍ変異体を、ウイルス性インターフェロンアンタゴニストを用いて安定にトランスフェクションすることができる。
【００６３】
さらに、本発明の主題は、遺伝子導入のためのin vitroにおける方法であり、導入遺伝子を含むＬＣＭＶ−ＧＰ−ＶＳＶシュードタイプベクターまたはＬＣＭＶ−ＧＰ−ＶＳＶシュードタイプベクター系を、細胞に、直接的にまたは本発明によるウイルス産生細胞（パッケージング細胞）を用いてのいずれかで導入する。少なくとも２つのベクターを有するｃｒベクター系を使用する場合、少なくとも２つのパッケージング細胞を使用し、細胞の各々が、（複製能を有さない）ｃｒベクターの１つを産生する。ＶＳＶウイルスの産生は、ｃｒベクター系の全てのベクターを用いて感染させ、従って全ての必須なウイルス遺伝子を含む細胞においてのみ行なわれる。
【００６４】
さらに、本発明は、治療方法における薬物としての本発明によるベクターおよびウイルス産生細胞の使用に関する。特に、本発明によるベクターおよびウイルス産生細胞は、固形腫瘍の療法のために使用される。治療効果は、治療遺伝子の使用によってだけでなく、組換えベクターおよびウイルスの腫瘍退縮特性によっても引き起こされる。
【００６５】
固形腫瘍は、脳腫瘍、肝臓腫瘍、特に肝細胞癌、肺腫瘍、特に気管支癌、および腸腫瘍、特に結腸癌であり得る。好ましい腫瘍は、脳腫瘍、例えば神経膠腫、特に上衣腫、乏突起神経膠腫、乏突起星状細胞腫、星状細胞腫、神経膠芽腫または髄芽腫である。
【００６６】
本発明の主題はさらに、本発明のベクター、ビリオン、ウイルス産生細胞並びに場合により担体および補助物質などの添加剤を含む、薬学的組成物である。
【００６７】
治療遺伝子のウイルス退縮および導入効率を高めるために、ベクターを連続的に放出する腫瘍浸潤性ウイルス産生細胞を、腫瘍への直接的な移植のために製剤化する。
【００６８】
本発明は、以下の実施例を用いて説明される。
【００６９】
実施例
実施例１：ＬＣＭＶ−ＧＰ−シュードタイプ化ベクターによる神経膠腫細胞の形質導入
ＧＦＰをコードするがウイルスエンベロープタンパク質はコードしない欠陥ＶＳＶベクター（ＶＳＶｇｆｐ−ｎｃｐ−ΔＧ）を、今度はＬＣＭＶのＧＰを安定に発現するＢＨＫ−２１およびｖｅｒｏ細胞に形質導入した。２４ウェルプレートの１つの窪みあたり１×１０Ｅ５個の細胞（ＢＨＫ−２１、−ＧＰ、ｖｅｒｏ、−ＧＰ）を播種し、そして４時間後にＭＯＩ＝５でＶＳＶｇｆｐ−ｎｃｐ−ΔＧベクターを用いて形質導入した。２４時化後、培養上清を回収し、そしてＢＨＫ−２１における力価を、ＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析によって決定した。図１は、形質導入細胞がＬＣＭＶ−ＧＰ−シュードタイプ化ＶＳＶベクターを産生し、使用する細胞型に依存して、シュードタイプ力価は２〜７×１０Ｅ５ＴＵ/mlの間で変動したことを示す。
【００７０】
シュードタイプは神経膠腫への遺伝子導入に用いられる予定であったので、ベクターの形質導入効率を、種々の神経膠腫細胞系について確認した。２つのヒト神経膠腫細胞系（Ｕ８７、Ｇ４４）および１つのラット神経膠腫細胞系（９Ｌ）を試験した。ＢＨＫ−２１を再度対照として使用した。２４ウェルプレートの１つの窪みあたり１×１０Ｅ５個の細胞を播種し、そして４時間後にＭＯＩ＝０．３（ＢＨＫ−２１上で滴定）でＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターを用いて形質導入した。２４時間後、ＧＦＰ発現細胞の比率をＦＡＣＳによって決定し、そして力価をそれから計算した。図２は、神経膠腫細胞系がＬＣＭＶ−ＧＰ−シュードタイプ化ＶＳＶベクターによって効率的に形質導入されたことを示す。
【００７１】
実施例２：多能性前駆細胞へのＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターのパッケージング
本発明者らは、C. Verfaillie (Jiang et al., 2002)のプロトコールに従って単離された幹細胞が、腫瘍浸潤特性を有することをすでに実証している。その遊走能だけを調べ、その分化能は調べなかったので、これらの細胞をＢＭ−ＴＩＣと呼んだ（骨髄由来種腫瘍浸潤細胞、bone marrow derived tumor infiltrating cells）。ＶＳＶベクターについてのＢＭ−ＴＩＣのパッケージング能を試験するために、ＬＣＭＶ−ＧＰ−発現ＢＭ−ＴＩＣを、欠陥ＶＳＶ-ＧＦＰベクターを用いて形質導入した。２４ウェルプレートの１つの窪みあたり１×１０Ｅ５個の細胞（ＢＭ−ＴＩＣ、−ＧＰ、ＢＨＫ−２１）を播種し、そして４時間後にＭＯＩ=５でＶＳＶｇｆｐ−ｎｃｐ−ΔＧベクターを用いて形質導入した。２４時間後、培養上清を回収し、そしてＢＨＫ−２１細胞上で滴定した。図３は、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプをまたＢＭ−ＴＩＣ中でも調製することができることを示す。しかしながら、力価は、例えばＢＨＫ−２１細胞の場合よりも低い（図１参照）。
【００７２】
実施例３：補完的で複製性の（ｃｒ）ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターの開発
繁殖することのできるウイルスを用いて高い形質導入率を、達成することができる。神経膠腫への遺伝子導入率を高め、そして同時に高度の安全性を確実にするために、限定された程度で複製能を有するＶＳＶシュードタイプベクターを、確立した。補完的で欠陥のあるウイルスを用いた系が、レトロウイルス(Trajecevski et al., 2004)および種々のフラビウイルス(Riepl & Mandl, 2007)のために記載されている。このような系の原理は、２つの不完全なレプリコンの間にウイルスゲノムを分配することである。１つの同じ細胞が両方のベクターで感染され、そしてこの同時感染を通してのみウイルスゲノムをパッケージングするために必要な全ての成分を含む場合にのみ、感染性ウイルスが産生される。
【００７３】
図４は、本発明によるベクター系の補完的なベクターの例を示す。効率的な複製およびパッケージングのために、第１ベクターはリン酸化タンパク質Ｐを欠失している。これらのベクターのウイルス力価をより簡単な方法で決定できるようにするために、ベクターは、Ｐの代わりに赤色蛍光タンパク質（ｒｆｐ）を含む。欠失しているＰの機能は、第２ベクターによる細胞の同時感染中に補完される。しかしながら、後者単独では繁殖できない。なぜなら、必須のエンベロープタンパク質ＶＳＶ−Ｇを欠失しているからである。このベクターを用いて、治療遺伝子が適用される。
【００７４】
プラス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡのみが感染性であるが、ＶＳＶなどのマイナス鎖ＲＮＡウイルスは、クローン化ウイルスｃＤＮＡから感染性ビリオンを生成するために、ウイルスＲＮＡゲノムに加えて、少なくともウイルス核タンパク質（Ｎ）およびウイルスポリメラーゼ（Ｌ）を必要とする。組換えＶＳＶを調製するための系は、ＢＳＲ Ｔ７/５細胞において構成的に発現されているＴ７−ＲＮＡポリメラーゼを使用した、ウイルス（＋）ＲＮＡ並びにウイルスタンパク質Ｎ、ＰおよびＬの細胞質における発現に基づく。所望のベクターを調製するために、ゲノム構築物を、Ｎ、ＰおよびＬのための発現プラスミド並びにベクターｂ）（図４）の場合さらにＶＳＶ−Ｇのための発現プラスミドと共に、ＢＳＲ Ｔ７/５に同時トランスフェクションする。欠失している成分をトランスで発現する細胞上でこのようにして得られたウイルスを継代させることによって、力価をかなり高めることができる。ＬＣＭＶ−ＧＰ欠損ベクターのために、ＧＰを安定に発現するＢＨＫ−２１細胞系が確立された。Ｐ欠損ベクターのために、Ｐタンパク質を発現するＢＨＫ−２１細胞系が確立された。
【００７５】
ｃｒ ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプＶＳＶベクターの調製および特徴付け
その力価およびその形質導入効率に関して個々のベクターを特徴付けた後、in vitroにおけるベクターの伝播を調べる。このために、ＢＨＫ−２１細胞を、両方のベクターで同時感染させ、そしてネイティブなＢＨＫ−２１上での培養上清の連続継代による新たなベクターの複製および従って生成を調べる。これらの実験を、単層並びにスフェロイドとして培養される種々の神経膠芽腫細胞系（Ｇ４４、Ｇ６２、Ｕ８７）を用いて繰り返す。
【００７６】
腫瘍スフェロイドは、単層培養物よりも腫瘍の性質および不均一性を反映する、３次元のオルガノイド細胞群である。活発に分裂している腫瘍細胞は、緩い構造で細胞凝集物の縁に位置し、一方、内側のより深部に位置する細胞はもはや分裂せず、壊死領域の形成がここで起こる(Carlson et al., 1984)。スフェロイドを用いての実験は、ｃｒ ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系の腫瘍内形質導入効率、伝播の動態学、および腫瘍退縮効果に関する情報を提供する。従って、これらのスフェロイドは、動物において実験を実施する必要を伴わず、前記系の初期の最適化を可能とする。ｃｒ ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプ化ＶＳＶベクターの毒性の可能性、腫瘍退縮の治療的有効性、および腫瘍排除後の残留ウイルスの存在を、動物モデルにおいて調べる（実施例６参照）。
【００７７】
ウイルスＲＮＡポリメラーゼは、全くリコンビナーゼ活性を有さず、そして細胞質には全く細胞性リコンビナーゼが存在しないので、２つのマイナス鎖ＲＮＡウイルス間の組換えは、ＲＮＡポリメラーゼのテンプレートスイッチによってのみ行なうことができる。しかしながら、これは極めてまれな事象である(Finke & Conzelmann, 2005; Spann et al., 2003)。組換え体で複製性のＶＳＶの生成は安全性リスクを示し、そしてこれを調べる。このために、ウイルスＲＮＡを同時感染細胞の培養上清から種々の時点で単離し、そしてノザンブロットで導入遺伝子特異的（例えばｇｆｐ）プローブを用いて調べる。「過剰な長さ」を有するＲＮＡ種を検出できる場合、上清からのウイルスをプラーク精製し、そしてその感染性について標準的な方法を用いて調べ、そしてその後、分子生物学を用いて特徴付ける。
【００７８】
実施例４：治療的に効果的なＶＳＶ（ＬＣＭＶ−ＧＰ）シュードタイプベクターの調製のための遊走生産細胞の確立
遊走ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰ生産細胞を、ｃｒＶＳＶベクターおよび複製能を有するＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰベクターのために確立する。
【００７９】
種々のＭ変異体の調製および特徴付け
ＶＳＶ Ｍタンパク質はＶＳＶサイクル内に２つの必須の仕事を有する。一方で、それは、ウイルスの会合および出芽のためのビリオンの構造成分として必須である。他方で、それは、宿主のタンパク質合成に向けられるその「宿主シャットオフ」活性を通して、およびアポトーシスの誘導を通してウイルスの病態発生に著しく寄与する。これに関して、Ｍの重要な機能は、ＩＦＮ ｍＲＮＡの核−細胞質輸送の阻害である。それにより、ウイルス感染に対する細胞の最初の防御機序が、抑制される。
【００８０】
この強力な細胞障害性効果に因り、長期間、細胞系においてＭタンパク質を発現することは、不可能である。しかしながら、ウイルスの弱毒化をもたらすＭタンパク質における複数の突然変異が知られている。Irieおよび共同研究者は、Ｍタンパク質のいわゆる３７ＰＳＡＰ４０領域におけるアミノ酸交換によって、細胞病原性の大きく低下したＶＳＶ突然変異体を作製したことを実証した(Irie et al., 2007)。さらに、マウス実験において示されるように、ＰＳＡＰ領域外に単一（Ｍ５１Ｒ）または複数（Ｖ２２１ＦおよびＳ２２６Ｒ；Ｍ３３ＡおよびＭ５１Ａ）の突然変異を有するＭ変異体もまた、非常に弱毒化される(Desforges et al., 2001; JayakarおよびWhitt, 2002)。これらのウイルスは、ＩＦＮ−α/βの放出を抑制することができず、従って、感染から動物を防御する抗ウイルス状態を誘導する。しかしながら、ＩＦＮ系において欠陥を有することが多い腫瘍においては、これらのウイルスは、繁殖しそして腫瘍を溶解することができる。安全性の理由から、このような弱毒化変異体は、遺伝子療法のために特に重要である。なぜならそれらは、腫瘍細胞において優先的に複製するからである。
【００８１】
また、本発明者らは、記載の突然変異Ｍ３３Ａ、Ｍ５１Ｒ、Ｖ２２１ＦおよびＳ２２６Ｒを含み、そしてもはやＩＦＮ−βの合成を抑制することができない、Ｍタンパク質の非細胞病原性変異体（Ｍｎｃｐ）をクローニングした。この変異体は、ＩＦＮ非コンピテント細胞上で親ウイルスと類似した効率的な様式で複製するが、ＩＦＮコンピテント細胞上では減弱される。ＢＭ−ＴＩＣにおける効率的なウイルス産生を確実にするために、細胞を、ウイルス性インターフェロンアンタゴニストを用いて安定にトランスフェクションする(Haller et al., 2006)。
【００８２】
ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターのためのＢＭ−ＴＩＣ由来産生細胞の調製および特徴付け
腫瘍細胞は主に、ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプの神経膠腫特異的指向性に因り形質導入される。それ故、依然として特定の細胞病原性を示すＭ変異体を用いて作業することも、可能である。ＢＭ−ＴＩＣにおける毒性作用を低く維持するために、抗ウイルス性ＭｘＡタンパク質を、Ｔｅｔ誘導性プロモーターを介して細胞中で発現させるべきである。Ｔｅｔ誘導性プロモーターを有するレトロウイルスベクターは公知である(Loew et al., 2006)。Ｔｅｔ応答性エレメント（ｔＴＡ）も、レトロウイルスベクターを介してＢＭ−ＴＩＣに導入する。ＭｘＡは、ＲＮＡウイルスに対して抗ウイルス活性を有するインターフェロン誘導ＧＴＰアーゼである(Pavlovic et al., 1992; StaeheliおよびPavlovic, 1991)。それは細胞質中で大きなオリゴマーの形態で存在し、毒性ではなく、そして今まで知られていない機序によってＶＳＶの複製を阻害する。ＬＣＭＶ−ＧＰを発現するＢＭ−ＴＩＣを、Ｔｅｔにより調節されるＭｘＡおよびｔＴＡベクターを用いて形質導入し、そして続いてＶＳＶベクターを用いて感染させる。抗生物質が培地中に存在する限り、細胞は、ＭｘＡの存在に因りＶＳＶ（ＬＣＭＶ−ＧＰ）を用いての増殖性感染に対して抵抗性である。in vivoにおける適用中にのみ、抗生物質が除去され、そしてＶＳＶ（ＬＣＭＶ−ＧＰ）のウイルス複製および産生が、次第に始まる。２日間の半減期を有するＭｘＡは非常に安定であるので、突然変異体ＭｘＡ（Ｌ６１２Ｋ）を代替的に使用することができる。ＭｘＡ（Ｌ６１２Ａ）は、野生型タンパク質と同じ有効性でＶＳＶの感染を阻害するが、オリゴマーを形成することはできない。これによってそれは不安定化され、そして僅か２時間という短い半減期を有する(Janzen et al., 2000)。
【００８３】
両方の生産細胞、すなわち、非細胞病原性Ｍを有するベクターを産生するＢＭ−ＴＩＣ並びにＭｘＡの発現を通してＶＳＶに関連した溶解に対して防御されているＢＭ−ＴＩＣは、以下のように特徴付けられる：
（ｉ）ベクター力価およびベクター産生持続時間を決定する。
（ｉｉ）ベクター力価に対する細胞の凍結および解凍の影響を分析する。
（ｉｉｉ）細胞が依然として腫瘍浸潤特性を有し、そしてその形質導入効率が腫瘍組織において達成されるかどうかを、最初にスフェロイドモデルにおいてそしてその後は動物モデルにおいて分析する。
（ｉｖ）産生されたベクター上清を、複製性ＶＳＶの存在について確認する。
【００８４】
実施例５：治療遺伝子のクローニングおよびパッケージング
自殺遺伝子を、本発明に従って治療遺伝子として使用することができる。このような遺伝子の例は、臨床において最も多くの経験を有する単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）である。ＨＳＶ−ＴＫの恒常的発現を通して、パッケージング細胞および形質導入細胞を療法の終了時に確実に排除することができ、これによって有糸分裂の活発なパッケージング細胞から危険が生じる可能性が全くなくなる。
【００８５】
悪性神経膠腫の免疫療法のために、すなわち、脳における不十分に発達した局所的な免疫応答を強化するために、免疫調節遺伝子を使用することができる。このような遺伝子の例は、サイトカイン、特にＩＬ−１２およびＦｌｔ３Ｌである。抗原による刺激後、ＩＬ−１２は、樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞などの抗原提示細胞によって自然に分泌され、そして強力なＴｈ１に基づいた抗腫瘍免疫応答を媒介する。それはＴｈ１細胞へのナイーブＴ細胞の成長および分化を増強し、従って、神経膠腫により誘発されるＴ細胞増殖およびＩＦＮ−γ産生の抑制に拮抗する。ＩＬ−１２は、ナチュラルキラー細胞およびＣＤ８＋細胞の細胞障害活性を増強し、そしてさらに抗血管新生活性も有する(Majewski et al., 1996)。複数の動物モデルにおいて、神経膠腫に対するＩＬ−１２により媒介される免疫応答の有効性が、すでに印象的な方法で実証されている(Toda et al., 1998; Kikuchi et al., 1999)。サイトカインＦｌｔ３Ｌは、抗原提示樹状細胞の増殖および分化にとって必須であり、従って、遺伝子療法の目的に特によく適しているようである。Sumiaおよび共同研究者は、ラット／マウスにおいて、Ｆｌｔ３Ｌ遺伝子を用いて神経膠腫を脳内で形質導入した後、樹状細胞の強力で局所的な流入を観察した。処置したラットの７０％が、腫瘍退縮を示し、そして生き残った。
【００８６】
サイトカインと自殺遺伝子（ＴＫ）の組合せは、最大限の安全性を提供するだけでなく、バイスタンダー効果に因り低い形質導入効率で良好な療法を可能とする。このアプローチは、神経膠芽腫の遺伝子療法の効率を増加させるために、３つの活性原理、すなわち、ウイルス性腫瘍退縮、自殺遺伝子により誘発されるアポトーシス、および局所的な免疫刺激を組み合わせる。
【００８７】
最初に、ＩＬ−１２およびＦｌｔ３Ｌを、ＶＳＶベクターにクローニングする。ＩＬ−１２は種特異的に活性であり、よってラット神経膠腫モデルにおいて試験するためにはマウスＩＬ−１２を使用しなければならない。これに対し、ヒトおよびマウスＦｌｔ３Ｌの７０％超が相同であり、そして両方の種において交差反応性である。免疫刺激遺伝子を、ｐ遺伝子の位置にクローニングし、他方で第２ベクター上ではＴＫｇｆｐまたはｇｆｐに、ＶＳＶ−Ｇ遺伝子を置き換える。以下の遺伝子組合せを、ｃｒ ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系の２つのベクターにクローニングする（図５）：
１）ベクターａ＝ＩＬ１２またはＦｌｔ３Ｌ＋ベクターｂ＝ＴＫｇｆｐ（またはＴＫ）
２）ベクターａ＝ＩＬ１２またはＦｌｔ３Ｌ＋ベクターｂ＝ｇｆｐ
３）ベクターａ＝ＩＬ１２またはＦｌｔ３Ｌ＋ベクターｂ＝空
４）ベクターａ＝空＋ベクターｂ＝ＴＫｇｆｐ（またはＴＫ）
５）ベクターａ＝空＋ベクターｂ＝ｇｆｐ
６）ベクターａ＝空＋ベクターｂ＝空
【００８８】
クローニング後、神経膠腫細胞系およびＢＭ−ＴＩＣを形質導入し、そして上清中に含まれるサイトカインの濃度をＥＬＩＳＡによって確認する。生理学的に関連する量の産生のために、ベクターを超遠心分離を介して濃縮する。ベクターを最初にスフェロイドの形質導入のために使用し、そしてバイスタンダー致死に対するその受容能をこの系において調べる。その後、ベクター上清を、調製したパッケージング細胞と一緒に、ベルゲンの我々の共同パートナーに送る。そこで、同系ラット神経膠腫モデルにおけるin vivo試験を行なう。ガンシクロビルの適用後の処置マウスの生存率を評価する。同時に、ＴＫの非存在下における免疫療法の治療有効性を調べる。ベクター組合せ６）は、腫瘍退縮の有効性に関する情報を提供する。腫瘍のサイズおよび従って療法の成功を、ＭＲＩおよびＰＥＴを介してモニタリングする(Miletic et al., 2007)。免疫調節遺伝子の効果を、浸潤細胞検出のための免疫組織化学的方法により評価する。以下の段落で記載するように、治療アプローチを、ヒト神経膠腫モデルにおいても調べる。
【００８９】
実施例６：２つの神経膠腫モデルにおける治療活性原理の試験
組換えＶＳＶベクターを最初にin vitroにおいて特徴付け、そしてその後、その有効性について動物モデルにおいて調査する。この目的のために、２つの特に意味のあるラットモデルを使用する。
【００９０】
同系９Ｌラット神経膠腫モデルを、免疫学的局面の検査および免疫治療法の実施のために使用する。この目的のために、神経膠腫細胞系をFisherラットの脳に移植し、これはその後、数日以内に腫瘍を発達させる。Fisherラットから単離された９Ｌ神経膠肉腫細胞は、腫瘍細胞系として役立てた。その後、種々のベクターまたは細胞系を、誘発された腫瘍に定位的に注射する。このラットモデルは以下の特徴を有する：
（ｉ）それは、個体間のばらつきの少ない再現性の良好な系を示す。
（ｉｉ）腫瘍は、ヒト神経膠腫と類似した特徴、例えば、侵襲性および活動性の増殖挙動並びに免疫抑制因子としてのＴＧＦβ２の産生などを有する。
（ｉｉｉ）ＳＣＩＤ／ヌードマウスモデルまたはラット異種移植片モデルとは対照的に、前記系は、免疫学的局面の検査または免疫治療法の試験を可能とする。
【００９１】
ヌードラットにおけるヒト神経膠腫モデルを、ヒト神経膠腫細胞に対する、本発明によるベクターおよび細胞の腫瘍退縮活性を試験するために使用する。ラット異種移植片モデルは、ヒト神経膠腫の種々の増殖特徴をシミュレーションする。ここでは規定の神経膠芽腫細胞系ではなく患者由来の原発性の腫瘍材料を、腫瘍の確立のために使用し、これはヒト神経膠腫内の異質性をシミュレーションすることを可能とする(Sakariassen et al., 2006)。ヌードラットにおけるヒト神経膠腫の連続継代によって、悪性腫瘍発達の種々の時期をマッピングすることができ、これにより療法の成功を調べることができる。ヒト神経膠腫モデルは、治療アプローチの検証に特に良く適している。なぜならそれは以下の特徴を有するからである：
（ｉ）腫瘍は、ヒト神経膠腫に類似した特徴、例えば侵襲性および活動性の増殖挙動などを有する。神経膠腫細胞系ではなく原発性の患者の材料を、腫瘍の確立のために使用する。
（ｉｉ）腫瘍の連続継代を通して、悪性腫瘍発達の種々の時期をマッピングすることができ、そして療法の成功を確認することができる。第１世代の腫瘍は、ゆっくりと成長し、高度に侵襲性であり、そして低度の神経血管新生を有する。強力な増殖および低下した侵襲性を有する高度に血管新生化した表現型は継代を通して発達する。
（ｉｉｉ）高度に侵襲性で非血管新生性の神経膠腫の細胞表現型は、腫瘍幹細胞の１つに類似している。従って、この動物モデルは、ヒトＧＢＭの幹細胞成分に対する我々の概念の治療有効性の試験を可能とする。
【００９２】
腫瘍の２つのカテゴリーを識別することができる。
（ｉ）ゆっくりとした高度に侵襲性の増殖挙動を有する初期腫瘍。これらの腫瘍は、低度の血管新生しか有さない。
（ｉｉ）血液が十分に供給されそして急速に増殖する後期腫瘍。この表現型は、侵襲性が低い。
【００９３】
ヒト神経膠腫モデルは、自殺遺伝子療法並びにウイルス腫瘍退縮を調べるのに非常に良く適している。しかしながら、現在までに、遺伝子治療法の免疫治療有効性の分析のために使用することができるヒト神経膠芽腫のための動物モデルは、全く存在しない。
【００９４】
療法の成功は、画像診断法によりおよび最終的には組織学的技術を用いて分析および評価される。最初に、補完的で複製性のＶＳＶ（ＬＣＭＶ−ＧＰ）シュードタイプの作用機構を、ラット神経膠腫モデルへの濃縮ベクター上清の腫瘍内注射によって調べる。形質導入効率および腫瘍内のｇｆｐコードベクターの分布を、数日後に、凍結切片の蛍光顕微鏡分析を用いて調べる。さらに、免疫細胞の腫瘍退縮および侵襲を免疫組織化学的に評価する。補足として、ヒト神経膠芽腫のための動物モデルにおける有効性も調べる。
【００９５】
同じモデルにおいて、ＢＭ−ＴＩＣ産生細胞の遊走能および産生されたＶＳＶベクターの感染性を調べる。この目的のために、細胞を緑色のダイで染色し、ここで放出されたベクターはｒｆｐをコードする。このアプローチは、ＢＭ−ＴＩＣと形質導入された腫瘍細胞との間の簡単な蛍光に基づいた識別を可能とする。
【００９６】
最後に、個々の導入遺伝子をコードするシュードタイプの治療効率を比較する。この目的のために、パッケージング細胞およびまた濃縮ベクター上清を、確立された９Ｌ腫瘍に注射する。ベクターは、ＴＫと組み合わせた免疫刺激遺伝子を含む。ガンシクロビル投与は、ベクターまたはパッケージング細胞の定位的投与の２日後に開始する。ベクターの免疫調節成分の治療効力を、ＴＫのみを含むベクターを受けた動物において評価する。処置の完了時に、個々の療法概念の有効性を、画像診断法（ＭＲＩ；ＰＥＴ）を用いて腫瘍サイズに基づいて評価する。免疫療法を用いて処置されたラットの脳の一部を、免疫状態の特徴付けのために使用する。凍結切片上におけるＭＨＣ分子の発現並びにＴ細胞、顆粒球、マクロファージおよびミクログリア細胞の分布を、免疫組織化学的方法によって調べる。さらに、脳内浸潤細胞の量および表現型組成を、フローサイトメトリーによって分析する。最善の治療効果を有する製剤を、ヒト神経膠腫の処置のために適応させる。このようなプロトタイプを直接、前臨床安全性試験に、およびＧＭＰ製造のためのそれぞれの方法を確立した後に臨床試験に移行することができる。
【００９７】
【表１】
【００９８】
【表２】
【００９９】
【表３】
【図４ａ）】
【図４ｂ）】
【図５ａ）】
【図５ｂ）】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターが、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子を含み、そしてＶＳＶのエンベロープタンパク質Ｇをコードする機能的遺伝子を欠失していることを特徴とする、前記ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター。
【請求項２】
エンベロープタンパク質Ｇが、ＬＣＭＶのＧＰによって置換されていることを特徴とする、請求項１に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター。
【請求項３】
ＶＳＶのＭタンパク質が、ＶＳＶの細胞病原性を減少させる突然変異を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター。
【請求項４】
系が、少なくとも１つの導入遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター。
【請求項５】
導入遺伝子が、自殺タンパク質、免疫刺激タンパク質またはマーカータンパク質をコードすることを特徴とする、請求項４に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター。
【請求項６】
自殺タンパク質が、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、シトシンデアミナーゼ、ＦＫＢＰ−ＦＡＳまたはＦＫＢＰ−カスパーゼ９であることを特徴とする、請求項５に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター。
【請求項７】
免疫刺激タンパク質が、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、中和性抗ＴＧＦβまたはＦｌｔ３Ｌであることを特徴とする、請求項５に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター。
【請求項８】
ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系が、少なくとも２つの補完的で複製性のＶＳＶベクターを含み、ここで前記系は、ＶＳＶのタンパク質Ｎ、Ｌ、ＰおよびＭをコードする遺伝子ｎ、ｌ、ｐおよびｍ、ならびにＬＣＭＶ−ＧＰをコードする遺伝子ｇｐを含み、そしてＶＳＶのＧタンパク質をコードする機能的遺伝子を欠失し、ここで前記系の各ベクターは、遺伝子ｎ、ｌ、ｐ、ｍおよびｇｐの１つを欠失し、そしてここで欠失遺伝子は、前記系のいずれかの他のベクター上に存在することを特徴とする、前記ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系。
【請求項９】
ＶＳＶのＭタンパク質が、ＶＳＶの細胞病原性を減少させる少なくとも１つの突然変異を含むことを特徴とする、請求項８に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系。
【請求項１０】
前記系が、少なくとも１つの導入遺伝子を含むことを特徴とする、請求項８に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系。
【請求項１１】
ビリオンが、エンベロープタンパク質としてＬＣＭＶのＧＰタンパク質を含むことを特徴とする、シュードタイプ化ＶＳＶビリオン。
【請求項１２】
細胞が、請求項１１に記載のシュードタイプ化ＶＳＶビリオンを産生することを特徴とする、ウイルス産生細胞。
【請求項１３】
細胞が、成体幹細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載のウイルス産生細胞。
【請求項１４】
成体幹細胞が、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または骨髄由来腫瘍浸潤細胞（ＢＭ−ＴＩＣ）であることを特徴とする、請求項１２または１３に記載のウイルス産生細胞。
【請求項１５】
ウイルス産生細胞が、ＶＳＶのタンパク質Ｎ、Ｌ、ＰおよびＭをコードする遺伝子ｎ、ｌ、ｐおよびｍならびにＬＣＭＶ−ＧＰ糖タンパク質をコードする遺伝子ｇｐからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現のための１つ以上の発現カセットを含むことを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の前記ウイルス産生細胞。
【請求項１６】
ウイルス産生細胞が、ＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオン中にパッケージングするための遺伝子導入用ベクターを含み、前記遺伝子導入用ベクターは導入遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のウイルス産生細胞。
【請求項１７】
導入遺伝子が、自殺タンパク質、免疫刺激タンパク質および／またはマーカータンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項１６に記載のウイルス産生細胞。
【請求項１８】
細胞を、請求項１１に記載のシュードタイプ化ビリオンを用いて形質導入し、前記ビリオンは導入遺伝子を含むことを特徴とする、in vitroにおいて細胞に導入遺伝子を導入するための方法。
【請求項１９】
細胞に、請求項１６または１７に記載のウイルス産生細胞を接触させることを特徴とする、in vitroにおいて細胞に導入遺伝子を導入するための方法。
【請求項２０】
細胞が、腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
固形腫瘍の療法のための薬学的組成物の調製のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系、請求項１１に記載のシュードタイプ化ＶＳＶビリオン、または請求項１２〜１７のいずれか１項に記載のウイルス産生細胞の使用。
【請求項２２】
腫瘍が、脳腫瘍であることを特徴とする、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
腫瘍が、悪性脳腫瘍であることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
薬学的組成物が、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系、請求項１１に記載のシュードタイプ化ＶＳＶビリオン、または請求項１２〜１７のいずれか１項に記載のウイルス産生細胞を含むことを特徴とする、前記薬学的組成物。
【請求項１】
ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクターが、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の糖タンパク質ＧＰをコードする遺伝子を含み、そしてＶＳＶのエンベロープタンパク質Ｇをコードする機能的遺伝子を欠失していることを特徴とする、前記ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター。
【請求項２】
エンベロープタンパク質Ｇが、ＬＣＭＶのＧＰによって置換されていることを特徴とする、請求項１に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター。
【請求項３】
ＶＳＶのＭタンパク質が、ＶＳＶの細胞病原性を減少させる突然変異を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター。
【請求項４】
系が、少なくとも１つの導入遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター。
【請求項５】
導入遺伝子が、自殺タンパク質、免疫刺激タンパク質またはマーカータンパク質をコードすることを特徴とする、請求項４に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター。
【請求項６】
自殺タンパク質が、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）、シトシンデアミナーゼ、ＦＫＢＰ−ＦＡＳまたはＦＫＢＰ−カスパーゼ９であることを特徴とする、請求項５に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター。
【請求項７】
免疫刺激タンパク質が、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、中和性抗ＴＧＦβまたはＦｌｔ３Ｌであることを特徴とする、請求項５に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター。
【請求項８】
ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系が、少なくとも２つの補完的で複製性のＶＳＶベクターを含み、ここで前記系は、ＶＳＶのタンパク質Ｎ、Ｌ、ＰおよびＭをコードする遺伝子ｎ、ｌ、ｐおよびｍ、ならびにＬＣＭＶ−ＧＰをコードする遺伝子ｇｐを含み、そしてＶＳＶのＧタンパク質をコードする機能的遺伝子を欠失し、ここで前記系の各ベクターは、遺伝子ｎ、ｌ、ｐ、ｍおよびｇｐの１つを欠失し、そしてここで欠失遺伝子は、前記系のいずれかの他のベクター上に存在することを特徴とする、前記ＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系。
【請求項９】
ＶＳＶのＭタンパク質が、ＶＳＶの細胞病原性を減少させる少なくとも１つの突然変異を含むことを特徴とする、請求項８に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系。
【請求項１０】
前記系が、少なくとも１つの導入遺伝子を含むことを特徴とする、請求項８に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系。
【請求項１１】
ビリオンが、エンベロープタンパク質としてＬＣＭＶのＧＰタンパク質を含むことを特徴とする、シュードタイプ化ＶＳＶビリオン。
【請求項１２】
細胞が、請求項１１に記載のシュードタイプ化ＶＳＶビリオンを産生することを特徴とする、ウイルス産生細胞。
【請求項１３】
細胞が、成体幹細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載のウイルス産生細胞。
【請求項１４】
成体幹細胞が、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または骨髄由来腫瘍浸潤細胞（ＢＭ−ＴＩＣ）であることを特徴とする、請求項１２または１３に記載のウイルス産生細胞。
【請求項１５】
ウイルス産生細胞が、ＶＳＶのタンパク質Ｎ、Ｌ、ＰおよびＭをコードする遺伝子ｎ、ｌ、ｐおよびｍならびにＬＣＭＶ−ＧＰ糖タンパク質をコードする遺伝子ｇｐからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の発現のための１つ以上の発現カセットを含むことを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の前記ウイルス産生細胞。
【請求項１６】
ウイルス産生細胞が、ＬＣＭＶ−ＧＰを用いてシュードタイプ化されたＶＳＶビリオン中にパッケージングするための遺伝子導入用ベクターを含み、前記遺伝子導入用ベクターは導入遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のウイルス産生細胞。
【請求項１７】
導入遺伝子が、自殺タンパク質、免疫刺激タンパク質および／またはマーカータンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする、請求項１６に記載のウイルス産生細胞。
【請求項１８】
細胞を、請求項１１に記載のシュードタイプ化ビリオンを用いて形質導入し、前記ビリオンは導入遺伝子を含むことを特徴とする、in vitroにおいて細胞に導入遺伝子を導入するための方法。
【請求項１９】
細胞に、請求項１６または１７に記載のウイルス産生細胞を接触させることを特徴とする、in vitroにおいて細胞に導入遺伝子を導入するための方法。
【請求項２０】
細胞が、腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
固形腫瘍の療法のための薬学的組成物の調製のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系、請求項１１に記載のシュードタイプ化ＶＳＶビリオン、または請求項１２〜１７のいずれか１項に記載のウイルス産生細胞の使用。
【請求項２２】
腫瘍が、脳腫瘍であることを特徴とする、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
腫瘍が、悪性脳腫瘍であることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
薬学的組成物が、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のＶＳＶ−ＬＣＭＶ−ＧＰシュードタイプベクター系、請求項１１に記載のシュードタイプ化ＶＳＶビリオン、または請求項１２〜１７のいずれか１項に記載のウイルス産生細胞を含むことを特徴とする、前記薬学的組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２０１２−５０４９４４（Ｐ２０１２−５０４９４４Ａ）
【公表日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３０４１７（Ｐ２０１１−５３０４１７）
【出願日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００７２３０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４０５２６
【国際公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（５１１０８９８２６）
【氏名又は名称原語表記】ＬＡＥＲ，Ｄｏｒｏｔｈｅｅ ｖｏｎ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／００７２３０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４０５２６
【国際公開日】平成２２年４月１５日（２０１０．４．１５）
【出願人】（５１１０８９８２６）
【氏名又は名称原語表記】ＬＡＥＲ，Ｄｏｒｏｔｈｅｅ ｖｏｎ
【Ｆターム（参考）】
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