腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を産生するように遺伝子操作された腫瘍帰巣細胞
本発明は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＩＡＬ）をコードするアデノウイルスベクターを遺伝子導入した、ＴＲＩＡＬを発現する腫瘍帰巣細胞、特にＣＤ３４＋細胞及びＮＫ細胞に関するものである。本発明の細胞は、腫瘍、特にリンパ腫の点滴治療に有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を発現する腫瘍帰巣細胞、及び抗腫瘍療法におけるその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
調節不全のアポトーシスメカニズムは、リンパ球増殖障害の発症機序と進行に主要な役割を果たし、新生細胞を正常な寿命を越えて生存させ、最終的に放射線化学療法耐性を獲得する［１］。したがって、アポトーシス経路は、悪性細胞のアポトーシス感受性を回復させ、又はアポトーシスのアゴニストを活性化するための魅力的な治療標的であることを意味する［２］。アポトーシス遺伝子及びタンパク質を調節するために、アポトーシスの内部経路（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ）、外部経路（ＤＲ４、ＤＲ５、ＦＬＩＰ）、又は集束経路（ｃＩＡＰ２）のいずれかを標的とするいくつかの戦略を想定することができる［３］。
【０００３】
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、細胞死受容体リガンドであるＴＮＦファミリーに属する［４］。
【０００４】
ＴＲＡＩＬをコードする単離ＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を含む発現ベクター、及び組換えＴＲＡＩＬポリペプチドは、ＷＯ９７／０１６３３号に開示されている。
【０００５】
ＴＲＡＩＬは、多くのがん細胞の細胞表面に発現する細胞死受容体４（ＤＲ４）及び細胞死受容体５（ＤＲ５）に結合する［５］。可溶性ＴＲＡＩＬがＤＲ４又はＤＲ５に結合することにより、カスパーゼ活性化とアポトーシスをもたらす［６］。
【０００６】
Ｌｉｕ Ｚｈｏｎｇｙｕら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｖｏｌ．１１２、Ｎｏ．９、２００３．１１．９、１３３２−１３４１は、組換えアデノウイルスによってＴＲＩＡＬを形質導入した樹状細胞、及び関節炎の治療における潜在的な医学的用途について開示している。それらの細胞をがん治療に使用する可能性についての記載はない。
【０００７】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ試験は、可溶性組換えＴＲＡＩＬが、高度ながん細胞特異性及び強力な抗腫瘍活性により、抗がん治療に主要な役割を果たすことを示唆している［７］。実際、ＴＲＡＩＬは、正常細胞に危害を加えずに、多くの形質転換細胞においてアポトーシスを選択性に誘導する［４］。更に、マウスへのＴＲＡＩＬ投与は、大腸癌［８、９］、乳癌［１０］、多発性骨髄腫［１１］、又は神経膠腫［１２、１３］の腫瘍異種移植に対して顕著な効果を発揮する。
【０００８】
マウス及びヒト以外の霊長類における毒性試験により、正常な肝細胞及びケラチン生成細胞は、３量体型ＴＲＡＩＬに耐性である［１４、１５］が、非最適化ＴＲＡＩＬ製剤又はリガンドの抗体結合変異体によって誘導されるアポトーシスに対して顕著な感受性を示す［１６］ことが実証されている。３量体型ＴＲＡＩＬを高用量で用いた場合、肝毒性が主要な問題を代表するかどうかについは依然として議論の余地がある。
【０００９】
可溶性ＴＲＡＩＬの使用に対する更なる限界は、アポトーシスが起こるには長期のインキュベーション時間か非常に高用量の可溶性ＴＲＡＩＬを必要とする相当数の各種腫瘍細胞株において観察されるアポトーシス応答障害によって代表される［１７、１８］。静脈内注入後のＴＲＡＩＬの薬物動態プロファイル（血漿半減期は３２分、排出半減期は４．８時間）を考えると、長期間の曝露や高濃度の条件は、何らかのｉｎ ｖｉｖｏ治療戦略に転換可能ではない［１０］。可溶性組換えＴＲＡＩＬに関する限界を克服し、腫瘍細胞を特異的に標的とするために、さまざまな動物モデルを用いて、いくつかのアデノウイルス介在ＴＲＡＩＬ遺伝子移入アプローチが近年利用されつつある［１９、２０］。
【００１０】
しかしながら、遺伝子移入アプローチは、腫瘍の高率感染と有効であるべき免疫クリアランスの回避とに大きく依存している［２１］。更に、アデノウイルスベクターの全身感染に関するいくつかの安全性の問題は依然として取り組まねばならない問題である［２２］。例えば、ＴＲＡＩＬのアデノウイルスによる遺伝子移入は、肝癌細胞のアポトーシス応答障害を克服するが、初代培養ヒト肝細胞において重度のアポトーシスを引き起こす［１９］。近年、アデノウイルスに基づいた遺伝子治療アプローチは、ＴＲＡＩＬをコードするアデノウイルスの腫瘍内送達に主に依存している［２３］。局所抗腫瘍活性にも関わらず、ＴＲＡＩＬの腫瘍内送達は全身性抗腫瘍活性を示さず、したがって臨床的価値を失っている。
【００１１】
さまざまな細胞種は腫瘍に優先的に帰巣し［２４］、抗がん分子を産生するために必要な構築体を搭載できることが知られている。その帰巣性により、ＣＤ３４＋細胞［２５］及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞［２６］は、抗がん分子の送達媒体として用いることができる。
【００１２】
ＣＤ３４＋細胞は、静脈内注射の後、永続的な骨髄コロニー形成能、並びに一過性の肝臓及び脾臓のコロニー形成能を含めた特異的帰巣性を示す［２７〜３０］。これらの帰巣性は、骨髄微小環境及び腫瘍微小環境に存在する間質細胞で発現する特定リガンド（例えばＳＤＦ−Ｉ、ＶＣＡＭ−Ｉなど）と相互作用する接着受容体（例えばＣＸＣＲ−４、ＶＬＡ−４、ＶＬＡ−５、ＣＤ４４など）の発現に厳密に関連している［３１〜３４］。
【００１３】
ＮＫ細胞は、主要組織適合性複合体の非制限的メカニズムを介して、腫瘍細胞に対する細胞性免疫防御において必須の役割を果たすリンパ球のサブセットである［３５］。静脈内注射の後、ＮＫ細胞は骨髄及びリンパ器官に帰巣し、適切なサイトカインシグナルの影響下で腫瘍部位に血管外遊出する。したがって、多くのグループは、治療目的で腫瘍へ帰巣させるためにＮＫ細胞を使用することを模索している［３６〜３８］。
【００１４】
たとえＮＫ細胞の腫瘍帰巣性が公知であっても、遺伝子改変細胞は、導入遺伝子の種類に応じたストレスを受ける。ＴＲＩＡＬ遺伝子を導入した場合、ストレスの結果として、細胞は元の腫瘍帰巣性を失い得る。したがって、成功への合理的期待は存在せず、検討される特定のアプローチが実行可能であるかどうかを確認するには実際の実験が必要である。
【００１５】
現在、ＴＲＡＩＬを発現するように遺伝子操作されたＣＤ３４＋細胞及びＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞介在抗腫瘍活性を達成するために有利に利用できることがわかっている。
【非特許文献１】Ｄａｎｉａｌ，Ｎ．Ｎ．及びＳ．Ｊ．Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ、細胞死：重要管理点。Ｃｅｌｌ、２００４、１１６（２）：ｐ．２０５−１９．
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【非特許文献７】Ａｌｍａｓａｎ，Ａ．及びＡ．Ａｓｈｋｅｎａｚｉ、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ：アポトーシスシグナル伝達、生物学、及びがん治療の可能性、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ，２００３、１４（３−４）：ｐ．３３７−４８．
【非特許文献８】ＬｅＢｌａｎｃ，Ｈ．ら、プロアポトーシスＢｃｌ−２相同体Ｂａｘの突然変異による不活性化を介した細胞死受容体誘導性アポトーシスに対する腫瘍細胞の耐性。Ｎａｔ Ｍｅｄ、２００２、８（３）：ｐ．２７４−８１．
【非特許文献９】Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．ら、組換え可溶性Ａｐｏ２リガンドの安全性と抗腫瘍活性。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９９、１０４（２）：ｐ．１５５−１６２．
【非特許文献１０】Ｗａｌｃｚａｋ，Ｈ．ら、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドのｉｎ ｖｉｖｏ殺腫瘍活性。Ｎａｔ Ｍｅｄ、１９９９、５（２）：ｐ．１５７−６３．
【非特許文献１１】Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ，Ｃ．Ｓ．ら、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌリガンドは多発性骨髄腫においてアポトーシスを選択的に誘導し、薬物耐性を克服する：治療への応用。Ｂｌｏｏｄ、２００１、９８（３）：ｐ．７９５−８０４．
【非特許文献１２】Ｆｕｌｄａ，Ｓ．ら、Ｓｍａｃアゴニストは、ｉｎ ｖｉｖｏでＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ誘導性又は抗がん剤誘導性アポトーシスに対する感受性を増加させ、悪性神経膠腫の退縮を誘導する。Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００２、８（８）：ｐ．８０８−８１５．
【非特許文献１３】Ｐｏｌｌａｃｋ，Ｉ．Ｆ．、Ｍ．Ｅｒｆｆ、及びＡ．Ａｓｈｋｅｎａｚｉ、可溶性Ａｐｏ２Ｌ／腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドによるアポトーシスシグナル伝達の直接刺激は、神経膠腫細胞を選択的に殺傷する。Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１、７（５）：ｐ．１３６２−１３６９．
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【非特許文献３９】Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｔ．Ｓ．ら、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド／Ａｐｏ−２リガンド遺伝子のアデノウイルス介在移入は腫瘍細胞アポトーシスを誘導する。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００、１６５（５）：ｐ．２８８６−９４．
【非特許文献４０】Ｋａｚｈｄａｎ Ｉ．及びＲ．Ａ． Ｍａｒｃｉｎｉａｋ、細胞死受容体４（ＤＲ４）は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）に対する感受性にかかわりなく乳癌細胞を効率的に殺傷する。Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２００４、１１：ｐ．６９１−６９８．
【発明の詳細な説明】
【００１６】
発明の説明
本発明によれば、腫瘍帰巣細胞は、アデノウイルス介在遺伝子移入によって、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を産生するように遺伝子操作されている。本発明による細胞は、上記欠点を引き起こすことなく、腫瘍部位へＴＲＡＩＬを送達するために全身投与することができる。
【００１７】
したがって、本発明は、ＴＲＡＩＬを発現する腫瘍帰巣細胞、及びそれらを含有するＴＲＡＩＬ製剤に関するものである。また、本発明は、抗がん治療用、特にヒトリンパ腫治療用の細胞組成物を調製するための細胞の使用に関するものである。
【００１８】
本発明の細胞は、腫瘍帰巣細胞に、好適なプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターの制御下にてヒトＴＲＡＩＬ遺伝子（Ａｄ−ＴＲＡＩＬ）をコードする複製欠損性アデノウイルスを導入することによって得ることができる。形質導入は、分子生物学者に周知の方法にしたがって、好ましくは実施例に記載の方法にしたがって、実施することができる。
【００１９】
本発明によれば、「腫瘍帰巣」細胞という用語は：（１）静脈内注射の後、腫瘍組織へ帰巣可能であり、且つ（２）適当量の膜結合ＴＲＡＩＬ（ｍＴＲＡＩＬ）を少なくとも数日間発現可能な細胞を定義するために用いられる。
【００２０】
血液から腫瘍堆積物へ帰巣可能な腫瘍帰巣細胞の例としては、造血細胞、即ち成長因子で処置されたがん患者の末梢血から採取したＣＤ３４＋造血細胞；末梢血から採取したＮＫ細胞；末梢血単核球の生体外培養によって得たサイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ）；内皮細胞及び内皮前駆細胞；腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）；リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）；マクロファージ；間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（末梢血又はヒト組織から新たに単離したもの、又は生体外培養したもの）、並びに腫瘍探索能を保持し、ｍＴＲＡＩＬを発現するように遺伝子操作されたヒト細胞株が挙げられる。ｍＴＲＡＩＬを適当に発現させるには、組織特異的プロモーター及び／又はエンハンサーのような適切な遺伝子調節配列を伴うプラスミドやウイルスベクターの使用を含め、いくつかの方法を想定することができる。
【００２１】
ＣＤ３４＋細胞とＮＫ細胞が特に好ましい。
【００２２】
ＮＫ細胞の最適な形質導入効率は、ＮＫ細胞をＮ−アセチルシステイン（１０ｍＭ）とともに１８時間プレインキュベーションすることによって得ることができる。プレインキュベーション後、ＮＫ細胞を、無血清条件下、３７℃でＡｄ−ＴＲＡＩＬの段階的感染効率（ＭＯＩ）（５０〜５００）に曝露する。次に血清添加培地（ＲＰＭＩ−１６４０／ＦＢＳ ２０％）を加え、数時間後、培養物にＧｅｎｅ Ｂｏｏｓｔｅｒ（１：２００）を添加し、更に１８時間インキュベーションする。
【００２３】
ＣＤ３４＋細胞に対し、Ｎ−アセチルシステインとのプレインキュベーション以外は、同様の方法を用いることができる。
【００２４】
本発明の組成物は、『レミントンの薬学』（Ｍａｃｋ出版社、ニュージャージー州、１９９１）に報告されているもののような、非経口投与、特に静脈内投与に好適なビヒクルを用いることによって調製することができる。
【００２５】
例えば、使用できる賦形剤には、組成物を受容する個人に有害でない医薬品、例えば、湿潤剤又は乳化剤、緩衝液のような補助剤との混合物であってもよい、水、食塩水、グリセロール、及びエタノールなどが含まれる。適切な用量は、いくつかある要因の中で特に、処置すべき被験者の性別、年齢、及び病態、疾患の重篤度に依存するであろう。適切な有効量は、熟練技術者によって容易に決定することができ、いずれにせよ臨床試験により決定することができる。治療的に有効な用量は、通常約１０３〜約１０１５の形質導入細胞であろう。他の用量は、当然ながら、慣用の実験、即ち、用量反応曲線に依拠し、最大許容量（ＭＴＤ）を決定し、又は限定数の患者において第Ｉ相臨床試験を実施することによって確立することができる。投薬処置は、単回用量であっても、複数回用量のスケジュールであってもよい。更に、必要に応じて高用量を被験者に投与することもできる。熟練技術者は、最も有効な用法・用量を容易に決定するであろう。
【００２６】
以下の実施例により、明解で説得力のある下記の証拠を提供しつつ、本発明をより詳細に説明する：
（ｉ） ＣＤ３４＋幹細胞及びＮＫ細胞は、ＴＲＡＩＬを発現するアデノベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に形質導入することができる；
（ｉｉ） 形質導入により、これらの細胞サブタイプは細胞表面でＴＲＡＩＬを一過性に発現する；
（ｉｉｉ） このように短期間のＴＲＡＩＬ発現は、形質導入細胞とともに共培養したＴＲＡＩＬ感受性及びＴＲＡＩＬ耐性腫瘍細胞において検出される強力なアポトーシス効果と関連がある；
（ｉｖ） 初期腫瘍又は進行腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤへの形質導入細胞のｉｎ ｖｉｖｏ注射は、マウスの生存期間の顕著な延長と関連があり、アデノウイルスで形質導入されたＣＤ３４＋細胞及びＮＫ細胞は、治療目的の全身ＴＲＡＩＬ送達のための媒体として効率的に役立つことができることを示唆している。
【００２７】
静脈内投与の有効性は、腫瘍内送達に基づいたプロトコールと比較して、本発明の明確な利点を提供する。
【００２８】
ｍＴＲＡＩＬ発現ヒト細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍効果のメカニズムは、ｍＴＲＡＩＬと腫瘍細胞上のその同族受容体との直接反応によって引き起こされるアポトーシスである可能性が最も高いが、そのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性のメカニズムは不明である。腫瘍細胞の直接殺傷は、ＴＲＡＩＬ受容体を発現する、腫瘍を埋め込んだ非腫瘍細胞（血管、血管周囲、間質、並びに腫瘍の成長及び腫瘍細胞の生存に重大な役割を有する他の細胞種）のアポトーシスから生ずる間接的増殖阻害効果とおそらく共役している。当然ながら、本発明は、観察された活性の実際のメカニズムに基づいた仮説によって限定されるものではなく、現行の実験は、ｉｎ ｖｉｖｏで観察される抗腫瘍活性のメカニズムをよりよく理解することを目的としている。
【実施例１】
【００２９】
アデノウイルス介在遺伝子移入後にＴＲＡＩＬを発現するＣＤ３４＋細胞又はＮＫ細胞とともに共培養したリンパ腫細胞株におけるアポトーシスのｉｎ ｖｉｔｒｏ誘発
リンパ腫細胞株と、アデノウイルス介在遺伝子移入後にＴＲＡＩＬを発現するように遺伝子操作されたＣＤ３４＋細胞又はＮＫ細胞との共培養の効果について評価した。
【００３０】
最初のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、ＴＲＡＩＬを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＴＲＡＩＬ）を用いて、ＣＤ３４＋細胞及びＮＫ細胞のアデノウイルス感染のための最適条件を定めた。次いで、ＰＥ結合−抗ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体（クローンＲｉｋ−２）を用いて、ＣＤ３４＋細胞及びＮＫ細胞の表面におけるＴＲＡＩＬ発現の経時変化をモニターした。最後に、Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞をリンパ腫細胞株と共培養することによって、膜結合ＴＲＡＩＬのリンパ腫細胞株におけるアポトーシス誘導能について評価した。
【００３１】
方法
ヒトＴＲＡＩＬ遺伝子をコードするアデノウイルス ＣＭＶプロモーターから発現されるヒトＴＲＡＩＬ遺伝子をコードする複製欠損性アデノウイルス（Ａｄ−ＴＲＡＩＬ）をこれらの実験に用いた［３９］。Ａｄ−ＴＲＡＩＬは、ｐＡｄ５ＣＭＶＫ−ＮｐＡのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ部位にクローニングされたヒトＴＲＡＩＬの全長コード配列を含有する。得られたプラスミドとＥ１遺伝子を欠失させたアデノウイルス骨格配列（Ａｄ５）とをヒト胚性腎２９３細胞へトランスフェクションし、ウイルス粒子を単離し、ＴＲＡＩＬ発現の解析のために増幅させる。Ａ５４９プラークアッセイにより、組換えアデノウイルスを複製適格ウイルスに対してスクリーニングし、２９３細胞のプラークアッセイによりウイルス力価を決定する。精製ウイルスを、３％ショ糖含有ＰＢＳ中に保存し、使用するまで−８０℃に維持する。ＴＲＡＩＬ遺伝子産物を形質導入細胞の細胞表面で発現させ、フローサイトメトリーで測定することができる。
【００３２】
ＣＤ３４＋細胞へのアデノウイルス形質導入 Ａｄ−ＴＲＡＩＬを形質導入すべきＣＤ３４＋細胞は、化学療法を受け、造血成長因子で処置された同意したがん患者の末梢血から採取した。ＣＤ３４＋細胞は、白血球搬出法サンプルから、免疫磁気技術と正の選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により濃縮した。アデノウイルスを形質導入するため、ＣＤ３４＋細胞を、最終感染効率（ＭＯＩ）が１００〜１，０００となるよう適切に希釈されたＡｄ−ＴＲＡＩＬストックを含有する１ｍｌの無血清培地（ＩＭＤＭ）の入った３５ｍｍペトリ皿に２×１０６／ｍｌで蒔いた。２時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、培養物に１ｍｌのＩＭＤＭ／ＦＢＳ ２０％を添加し、４時間後、ＧｅｎｅＢｏｏｓｔｅｒ（１：２００）を加えた。細胞を更に１８時間インキュベーションし、次に血清含有培地で大規模に洗浄し（３回）、最後に、ＰＥ結合−抗ＴＲＡＩＬ抗体を用いた直接免疫蛍光法で形質導入効率について評価した。
【００３３】
ＮＫ細胞へのアデノウイルス形質導入 Ａｄ−ＴＲＡＩＬを形質導入すべきＮＫ細胞は、同意した健常ドナーの末梢血から採取した。ＮＫ細胞は、白血球搬出法サンプルから免疫磁気技術と正の選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により濃縮した。形質導入前に、ＮＫ細胞を、１０％ＦＢＳ及びＮ−アセチルシステイン（１０ｍＭ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０中でインキュベーションした（１８時間、３７℃）。アデノウイルスを形質導入するため、ＮＫ細胞を、最終感染効率（ＭＯＩ）が５０〜５００となるよう適切に希釈されたＡｄ−ＴＲＡＩＬストックを含有する１ｍｌの無血清培地（ＲＰＭＩ−１６４０）の入った３５ｍｍペトリ皿に２×１０６／ｍｌで蒔いた。２時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、培養物に１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０／ＦＢＳ ２０％を添加し、４時間後、ＧｅｎｅＢｏｏｓｔｅｒ（１：２００）を加えた。細胞を更に１８時間インキュベーションし、次に血清含有培地で大規模に洗浄し（３回）、最後に、ＰＥ結合−抗ＴＲＡＩＬ抗体を用いた直接免疫抗体法で形質導入効率について評価した。
【００３４】
共培養 ＣＤ３４＋細胞又はＮＫ細胞の膜上に発現したＴＲＡＩＬのアポトーシス誘発活性を共培養実験にてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。簡潔に言えば、Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞（エフェクター細胞）をリンパ腫細胞（標的細胞）と共培養した。共培養開始後２４時間及び４８時間にアポトーシス誘導を評価した。これらの実験では、エフェクター細胞の形質導入効率に基づいて、エフェクター細胞：標的細胞の比を計算した。
【００３５】
結果
ＣＤ３４＋細胞へのアデノウイルス形質導入 予備実験により、ＣＤ３４＋細胞の最適形質導入効率は、ＣＤ３４＋細胞（２×１０６／ｍｌ）を、無血清条件下、段階的ＭＯＩ（１００〜１，０００の範囲）のＡｄ−ＴＲＡＩＬに２時間（３７℃）曝露することによって一貫して達成されたことを実証した。次に等量の血清添加培地（ＩＭＤＭ／ＦＢＳ ２０％）を加え、４時間後、培養物にＧｅｎｅ Ｂｏｏｓｔｅｒ（１：２００）を添加し、更に１８時間インキュベーションした。最後に、細胞を血清含有培地で大規模に洗浄し（３回）、ＰＥ結合−抗ＴＲＡＩＬ抗体を用いた直接免疫蛍光法でトランス遺伝子発現について評価した。
【００３６】
対照細胞ではバックグラウンドＴＲＡＩＬシグナルは検出されなかったが、アデノウイルスに曝露した細胞は、ＭＯＩ依存性様式で増加するＴＲＡＩＬ陽性ＣＤ３４＋細胞の割合を示した。代表的な実験では、ＴＲＡＩＬ陽性ＣＤ３４＋細胞の割合は、ＭＯＩが１００及び１，０００においてそれぞれ２５％及び８４％であった。
【００３７】
上記感染プロトコールは、ＭＯＩ １，０００において、ＴＲＡＩＬ発現ＣＤ３４＋細胞の平均（±ＳＤ）が８３±８％（７０〜９５％の範囲、ｎ＝５）の最大遺伝子移入効率を一貫して生じた。トリパンブルーによる色素排除試験にて評価した細胞生存率は、ＭＯＩ １，０００もの高率に影響されなかった（生存細胞≧８５％）。
【００３８】
トランス遺伝子発現の経時変化について評価するために、ＣＤ３４＋細胞にＭＯＩ １，０００で形質導入し、形質導入後７日目までＴＲＡＩＬ発現について解析した。これらの実験では、ＣＤ３４＋細胞を生存させるために、培養物に低用量（３ｎｇ／ｍｌ）の顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を添加した。表１に示すように、相当な割合のＣＤ３４＋細胞（２５％）が、形質導入後１２０時間までＴＲＡＩＬを発現し続けた。
【００３９】
【表１】
【００４０】
ＮＫ細胞へのアデノウイルス形質導入 予備実験により、ＮＫ細胞の最適形質導入効率は、ＮＫ細胞をＮ−アセチルシステイン（１０ｍＭ）とともに１８時間プレインキュベーションすることによって一貫して達成されたことを実証した。プレインキュベーション後、ＮＫ細胞（２×１０６／ｍｌ）を、無血清条件下、段階的ＭＯＩ（５０〜５００の範囲）のＡｄ−ＴＲＡＩＬに２時間（３７℃）曝露した。次に等量の血清添加培地（ＲＰＭＩ−１６４０／ＦＢＳ ２０％）を加え、４時間後、培養物にＧｅｎｅ Ｂｏｏｓｔｅｒ（１：２００）を添加し、更に１８時間インキュベーションした。最後に、細胞を血清含有培地で大規模に洗浄し（３回）、ＰＥ結合−抗ＴＲＡＩＬ抗体を用いた直接免疫蛍光法でトランス遺伝子発現について評価した。
【００４１】
アデノウイルスに曝露した細胞は、ＭＯＩ依存性様式で増加するＴＲＡＩＬ陽性ＮＫ細胞の割合を示した。代表的な実験では、ＴＲＡＩＬ陽性ＮＫ細胞の割合は、ＭＯＩが５０、１００、及び５００においてそれぞれ３０％、４５％、及び４６％であった。
【００４２】
上記感染プロトコールは、ＭＯＩ １００において、ＴＲＡＩＬ発現ＮＫ細胞の平均（±ＳＤ）が６１±１８％（４５〜８４％の範囲、ｎ＝４）の最大遺伝子移入効率を一貫して生じた。トリパンブルーによる色素排除試験にて評価した細胞生存率は、ＭＯＩ １００もの高率に影響されなかった（生存細胞≧８５％）。
【００４３】
トランス遺伝子発現の経時変化について評価するために、ＮＫ細胞にＭＯＩ １００で形質導入し、形質導入後７日目までＴＲＡＩＬ発現について解析した。表２に示すように、形質導入したＮＫ細胞は、形質導入後１６８時間までＴＲＡＩＬを発現し続けた。
【００４４】
【表２】
【００４５】
共培養 最後に、Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞（エフェクター細胞）と腫瘍細胞株（標的細胞）とを共培養することによって、リンパ細胞株における膜結合ＴＲＡＩＬのアポトーシス誘発能について評価した。これらの実験のために、可溶性ＴＲＡＩＬに対する感受性によって２つの細胞株を選択した。具体的には、ＴＲＡＩＬ感受性ＫＭＳ−１１細胞株及びＴＲＡＩＬ耐性ＪＶＭ−２細胞株を用いた。
【００４６】
上記感染プロトコールにしたがい、最適条件下で形質導入したＣＤ３４＋細胞又はＮＫ細胞を、アデノウイルスへの初期曝露２４時間後に収集し、大規模に洗浄し、ＫＭＳ−１１細胞又はＪＶＭ−２細胞と共培養した。
【００４７】
Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞をエフェクター細胞：標的細胞比０．８：１で共培養したところ、２４時間の共培養後、ＫＭＳ−１１細胞に関し、相当な割合（８１％）のアポトーシス細胞及び壊死細胞を検出した。アポトーシス細胞の量は、４８時間の共培養後、更に増加した（アポトーシス細胞９３％）。
【００４８】
Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞をエフェクター細胞：標的細胞比０．６：１で共培養したところ、２４時間の共培養後、ＫＭＳ−１１細胞に関し、相当な割合（８３％）のアポトーシス細胞及び壊死細胞を検出した。アポトーシス細胞の量は、４８時間の共培養後、更に増加した（アポトーシス細胞８５％）。
【００４９】
ＴＲＡＩＬ感受性ＫＭＳ−１１細胞株の場合、膜結合ＴＲＡＩＬが発揮するアポトーシス効果の有効性は、高用量（１００ｎｇ／ｍｌ）の可溶性ＴＲＡＩＬに２４時間〜４８時間曝露することによって発揮される有効性と同様であった（表３）。しかしながら、静脈内注入後のＴＲＡＩＬの薬物動態プロファイル（血漿半減期は３２分、排出半減期は４．８時間）を考えると、４８時間又は２４時間でさえも、ｉｎ ｖｉｖｏで１００ｎｇ／ｍｌで持続曝露を達成することはできない。
【００５０】
【表３】
【００５１】
また、Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞を可溶性ＴＲＡＩＬ耐性ＪＶＭ−２細胞株とインキュベーションすることによって、共培養実験を行った。
【００５２】
Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞をエフェクター細胞：標的細胞比０．８：１で共培養したところ、４８時間の共培養後、ＴＲＡＩＬ耐性ＪＶＭ−２細胞に関し、相当な割合（５１％）のアポトーシス細胞及び壊死細胞を検出した。
【００５３】
Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞をエフェクター細胞：標的細胞比０．６：１で共培養したところ、４８時間の共培養後、ＴＲＡＩＬ耐性ＪＶＭ−２細胞に関し、相当な割合（５３％）のアポトーシス細胞及び壊死細胞を検出した。
【００５４】
ＴＲＡＩＬ耐性ＪＶＭ−２細胞株の場合、膜結合ＴＲＡＩＬが発揮するアポトーシス効果の有効性は、高用量（１００ｎｇ／ｍｌ）の可溶性ＴＲＡＩＬに４８時間曝露することによって発揮される有効性よりも顕著に高かった（表４）。
【００５５】
【表４】
【００５６】
細胞介在ＴＲＡＩＬ送達によるアポトーシス活性の有効性を更に探究するため、エフェクター細胞（Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞）を、標的細胞（ＫＭＳ−１１細胞株）と、さまざまなエフェクター細胞：標的細胞比で２４時間共培養した。
【００５７】
表５に示すように、Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞は、エフェクター細胞：標的細胞比０．４：１に調整した共培養において、相当な割合（６６％）のＫＭＳ−１１細胞のアポトーシス又は壊死を誘発した。
【００５８】
【表５】
【００５９】
表６に示すように、Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞は、エフェクター細胞：標的細胞比０．３：１に調整した共培養において、相当な割合（６４％）のＫＭＳ−１１細胞のアポトーシス又は壊死を誘発した。
【００６０】
【表６】
【実施例２】
【００６１】
アデノウイルス介在遺伝子移入後にＴＲＡＩＬを発現するように遺伝子操作されたＣＤ３４＋細胞又はＮＫ細胞の、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ抗がん活性の評価
Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞による治療可能性について調べるために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、ＴＲＡＩＬ感受性ＫＭＳ−１１多発性骨髄腫細胞株を再注入した。その後、マウスにＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞を注射し、細胞に基づいたＴＲＡＩＬ送達による抗腫瘍効果の計測値としてマウスの生存を用いた。
【００６２】
方法
Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞の抗腫瘍活性の評価 体重２０〜２５ｇの６〜８週齢雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（ミラノ、イタリア）から購入した。マウスは、我々の施設の指針にしたがい、標準的実験室条件下で飼育した。動物に対して実施した実験手順は、国立腫瘍学研究所の動物実験に関する倫理委員会によって認可されており、英国癌研究調整委員会の指針にしたがって実施した。
【００６３】
マウスに、ＫＭＳ−１１細胞を静脈内（ＩＶ）接種した（０．５×１０６／マウス）。Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞による処置（１×１０６／マウス）は、腫瘍細胞の接種後７日目又は１７日目に開始し、４週間にわたる毎週のＩＶ注射から成る。再注入したＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞の平均形質導入効率は、それぞれ８３±８％及び６１±１８％であった。したがって、各マウスは、４回の注射にわたり、平均３．３２×１０６ＴＲＡＩＬ発現ＣＤ３４＋細胞数及び２．４４×１０６ＴＲＡＩＬ発現ＮＫ細胞数を受けた。腫瘍の出現、体重測定、及び毒性に関して週２回マウスをチェックした。各群の動物の生存期間を記録し、群間の差異を統計解析によって評価した。適切な対照群には：（ｉ）腫瘍細胞のみを注射したマウス；（ｉｉｉ）腫瘍細胞＋非形質導入ＣＤ３４＋細胞又はＮＫ細胞を注射したマウス、が含まれる。
【００６４】
結果
Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞 ＫＭＳ−１１細胞を異種移植したマウス（０．５×１０６／マウス）を、２つの異なるスケジュールにしたがい、週１回の頻度でＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞の４回のＩＶ注射により処置した。即ち、早期腫瘍の治療はＫＭＳ−１１細胞の注射後７日目に開始し、進行腫瘍の治療は１７日目に開始した。再注入したＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞の平均形質導入効率は８３±８％（平均±ＳＤ、ｎ＝９）であったため、各マウスは、４回の注射にわたり、平均３．３２×１０６ＴＲＡＩＬ発現ＣＤ３４＋細胞数を受けた。
【００６５】
図１に示すように、ＫＭＳ−１１細胞単独を注射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生存期間の中央値は５６日であった。野生型ＣＤ３４＋細胞の注射は生存期間の中央値（５６日）に影響を及ぼさなかったが、初期腫瘍に対しＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞で処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生存期間の中央値は１１１日を示した（ｐ≦０．００１）。
【００６６】
進行腫瘍をＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞で処置した効果を図２に示す。ＫＭＳ−１１細胞単独を注射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生存期間の中央値は５６日であった。野生型ＣＤ３４＋細胞の注射は生存期間の中央値（５６日）に影響を及ぼさなかったが、進行腫瘍のＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞による処置は、生存期間の中央値の顕著な延長（９８日、ｐ≦０．００７）を伴った。
【００６７】
Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞 ＫＭＳ−１１細胞を異種移植したマウス（０．５×１０６／マウス）を、週１回の頻度でＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞の４回のＩＶ注射により処置した。ＮＫ細胞の再注入は、腫瘍増殖初期のＫＭＳ−１１細胞注射後７日目に開始した。この実験の場合、再注入したＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞の平均形質導入効率は６１±１８％であった。したがって、各マウスは、４回の注射にわたり、平均２．４４×１０６ＴＲＡＩＬ発現ＮＫ細胞数を受けた。
【００６８】
図３に示すように、ＫＭＳ−１１細胞単独を注射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生存期間の中央値は５６日であった。野生型ＮＫ細胞の注射は生存期間の中央値（５０日）に影響を及ぼさなかったが、初期腫瘍のＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞による処置は、生存期間の中央値の顕著な延長（７４日、ｐ≦０．０３）を伴った。
【実施例３】
【００６９】
ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ細胞の乳癌細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性
かなりの割合の乳癌細胞株は、ＴＲＡＩＬおとり受容体によるＴＲＡＩＬ隔離、Ｒ１及びＲ２受容体の発現喪失、ＦＬＩＰ過剰発現などを含めた多くのメカニズムにより、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して耐性である［４０］。ｓＴＲＡＩＬ耐性リンパ腫細胞株は、ｍＴＲＡＩＬに曝露したとき、実際にＴＲＡＩＬ反応性になることを示した我々の先の結果に基づき、２つの乳癌細胞株のｓＴＲＡＩＬ及びｍＴＲＡＩＬに対する感受性を調べた。
【００７０】
乳癌細胞株のｓＴＲＡＩＬの殺傷効果に対する感受性を、ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ細胞と共培養したｓＴＲＡＩＬ感受性及びｓＴＲＡＩＬ耐性乳癌細胞株のアポトーシスのｉｎ ｖｉｔｒｏ誘発に関する評価と比較して評価した。
【００７１】
２つの乳癌細胞株、即ちＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−３６１を用いた。ｓＴＲＡＩＬの殺傷効果に対する個々の細胞株の感受性を評価するために、腫瘍細胞（５〜１０×１０４／ｍｌ）を、低用量（１０ｎｇ／ｍｌ）及び高用量（１００ｎｇ／ｍｌ）のｓＴＲＡＩＬに７２時間曝露した。その後、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム２重染色でアポトーシスについて評価した。
【００７２】
方法
細胞株 乳癌細胞株ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−３６１は、それぞれ、ＤＳＭＺ（ブラウンシュワイク、ドイツ、ＥＵ）及びＡＴＣＣ（マナッサス、バージニア州、米国）から購入した。細胞は、マイコプラズマの混入に関し、ポリメラーゼ連鎖反応によって定期的に試験した。全てのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験は、指数関数的に増殖している細胞を用いて行った。
【００７３】
アネキシンＶの発現 アネキシンＶ−ＦＩＴＣアッセイ（ファーミンジェン）を用いて、初期又は後期アポトーシス及び壊死を起こした細胞の割合を定量した。簡潔に言えば、解析すべき細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、次に結合バッファー（１０ｎＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｎＭ ＮａＣｌ、５ｎＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。インキュベーション後、０．１ｍｌの細胞懸濁液を５ｍｌの培養管に移し、５μＬのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ及び１０μＬのヨウ化プロピジウムを加えた。ボルテックス後、サンプルを暗所中、室温にて１５分間インキュベーションした。インキュベーションの終わりに、０．４ｍＬの結合バッファーを加え、フローサイトメトリーにて直ちに細胞を解析した。
【００７４】
結果
ｓＴＲＡＩＬとのインキュベーションがアポトーシスの誘発に関連するかどうかを調べるため、ＭＣＦ−７細胞株及びＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞株をｓＴＲＡＩＬ（１０〜１００ｎｇ／ｍｌ、７２時間）に曝露し、次にアポトーシス細胞及び壊死細胞の割合をＦＡＣＳ解析にて検出した。表７に示すように、ＭＣＦ−７細胞ではｓＴＲＡＩＬに曝露してもアポトーシス反応を誘導しなかったが、１００ｎｇ／ｍｌのｓＴＲＡＩＬに７２時間曝露したとき、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞によって顕著な細胞死反応が生じた。これらの結果によれば、ＭＣＦ−７はｓＴＲＡＩＬ耐性細胞株であるが、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１はｓＴＲＡＩＬ感受性細胞株である。
【００７５】
【表７】
【００７６】
次に、アデノウイルス介在遺伝子移入後にＴＲＡＩＬを発現するＣＤ３４＋細胞（ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ）と共培養した乳癌細胞株におけるアポトーシスのｉｎ ｖｉｔｒｏ誘発について評価した。
【００７７】
方法
ヒトＴＲＡＩＬ遺伝子をコードするアデノウイルス ＣＭＶプロモーターから発現されるヒトＴＲＡＩＬ遺伝子をコードする複製欠損性アデノウイルス（Ａｄ−ＴＲＡＩＬ）をこれらの実験に用いた［３９］。Ａｄ−ＴＲＡＩＬは、ｐＡｄ５ＣＭＶＫ−ＮｐＡのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ部位にクローニングされたヒトＴＲＡＩＬの全長コード配列を含有する。得られたプラスミドとＥ１遺伝子を欠失させたアデノウイルス骨格配列（Ａｄ５）とをヒト胚性腎２９３細胞へトランスフェクションし、ウイルス粒子を単離し、ＴＲＡＩＬ発現の解析のために増幅させる。Ａ５４９プラークアッセイにより、組換えアデノウイルスを複製適格ウイルスに対してスクリーニングし、２９３細胞のプラークアッセイによりウイルス力価を決定する。精製ウイルスを、３％ショ糖含有ＰＢＳ中に保存し、使用するまで−８０℃に維持する。ＴＲＡＩＬ遺伝子産物を形質導入細胞の細胞表面で発現させ、フローサイトメトリーで測定することができる。
【００７８】
ＣＤ３４＋細胞へのアデノウイルス形質導入 Ａｄ−ＴＲＡＩＬを形質導入すべきＣＤ３４＋細胞は、化学療法を受け、造血成長因子で処置された同意したがん患者の末梢血から採取した。ＣＤ３４＋細胞は、白血球搬出法サンプルから、免疫磁気技術と正の選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により濃縮した。アデノウイルスを形質導入するため、ＣＤ３４＋細胞を、感染効率（ＭＯＩ）が５００となるように適切に希釈されたＡｄ−ＴＲＡＩＬストックを含有する１ｍｌの無血清培地（ＩＭＤＭ）の入った３５ｍｍペトリ皿に２×１０６／ｍｌで蒔いた。２時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、培養物に１ｍｌのＩＭＤＭ／ＦＢＳ ２０％を添加し、４時間後、ＧｅｎｅＢｏｏｓｔｅｒ（１：２００）を加えた。細胞を更に１８時間インキュベーションし、次に血清含有培地で大規模に洗浄し（３回）、最後に、ＰＥ結合−抗ＴＲＡＩＬ抗体を用いた直接免疫蛍光法で形質導入効率について評価した。
【００７９】
共培養 ｍＴＲＡＩＬのアポトーシス誘発活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養実験にて試験した。簡潔に言えば、ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ細胞（エフェクター細胞）を乳癌細胞（標的細胞）と共培養した。共培養開始後４８時間にアポトーシス誘導を評価した。これらの実験では、エフェクター細胞：標的細胞比１：１及び４：１を用いた。
【００８０】
結果
ＣＤ３４＋細胞へのアデノウイルス形質導入 ＣＤ３４＋細胞の最適形質導入効率は、ＣＤ３４＋細胞（２×１０６／ｍｌ）を、無血清条件下、段階的Ａｄ−ＴＲＡＩＬに２時間（３７℃）曝露することによって、ＭＯＩ ５００にて一貫して達成された。対照細胞ではバックグラウンドＴＲＡＩＬシグナルが検出されなかったが、ＴＲＡＩＬ発現細胞は、ＴＲＡＩＬ陽性ＣＤ３４＋細胞の割合が９３±８％（平均±ＳＤ）を示した。トリパンブルーによる色素排除試験にて評価した細胞生存率は、ＭＯＩ １，０００もの高率に影響されなかった（生存細胞≧８５％）。
【００８１】
共培養 ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ細胞（エフェクター細胞）と腫瘍細胞（標的細胞）とを共培養することによって、乳癌細胞株におけるｍＴＲＡＩＬのアポトーシス誘発能について評価した。ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ細胞を、アデノウイルスへの初期曝露後２４時間に収集し、大規模に洗浄し、ＭＣＦ−７細胞又はＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞と共培養した。これらの実験では、２つのエフェクター細胞：標的細胞比、即ち１：１及び４：１を用いた。結果を表８にまとめる。
【００８２】
【表８】
【００８３】
ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ細胞を、ｓＴＲＡＩＬ感受性ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞とＥ：Ｔ比１：１（細胞死＝２８％）及びＥ：Ｔ比４：１（細胞死＝５０％）にて４８時間共培養することによって顕著な割合の細胞死が検出された。
【００８４】
ｓＴＲＡＩＬ感受性ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞株の場合、ｍＴＲＡＩＬに４８時間曝露することによって発揮されるアポトーシス効果の有効性は、高用量（１００ｎｇ／ｍｌ）のｓＴＲＡＩＬに７２時間曝露することによって発揮される有効性と同様であった（表７）。
【００８５】
ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬの細胞障害効果が実際にｍＴＲＡＩＬによるものであることを証明するために、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞を擬似形質導入ＣＤ３４＋細胞と共培養した。表２に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞と模擬形質導入ＣＤ３４＋細胞との共培養は、最高のＥ：Ｔ比にてのみ検出されるわずかな細胞死効果を伴った。このようにわずかな細胞死誘導は、過密培養に関連していると思われる。
【００８６】
ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬの細胞死活性が、ＣＤ３４のＡｄ−ＴＲＡＩＬ感染の終わりに洗浄除去されなかった遊離のアデノウイルス粒子によるものである可能性を排除するため、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞を１０６プラーク形成単位（ｐｆｕ）に曝露させた。ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞を１０６ウイルス粒子に曝露させても細胞毒性の証拠は全く検出できなかった（表８）。
【００８７】
ｐｆｕ数は以下のようにして計算した。
【００８８】
５×１０５ＣＤ３４＋細胞をＭＯＩ ５００にて感染させるために、２５０×１０６ｐｆｕを用いて、これを１ｍｌのＣＤ３４＋細胞懸濁液に加えた。
【００８９】
感染の終わりに、ＣＤ３４＋細胞を培地中で３回洗浄した。各洗浄工程に関し、１：２０の希釈係数を用いた。即ち、懸濁培養物を少なくとも８，０００倍に希釈した。
【００９０】
洗浄工程の終わりに２５０×１０６ｐｆｕが依然として懸濁培養中にあることを想定して、これを８，０００倍に希釈した。即ち、＜５０，０００の残存ｐｆｕを共培養に加えることが予想された。
【００９１】
したがって、共培養において検出された細胞死活性が、洗浄除去されなかった遊離のアデノウイルス粒子によるものであることを排除するため、乳癌細胞株を、２０を乗じた理論残存ｐｆｕ値と等しいｐｆｕ数（＃３を参照されたい）に曝露させた（即ち５０，０００×２０＝１０６ｐｆｕ）。
【００９２】
次に、ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ細胞をｓＴＲＡＩＬ耐性ＭＣＦ−７細胞株とともにインキュベーションすることによって共培養実験を行った。これらの実験では、ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ細胞をｓＴＲＡＩＬ耐性ＭＣＦ−７細胞とＥ：Ｔ比４：１にて４８時間共培養することにより、顕著な割合の細胞死を検出した（細胞死＝６４％）が、Ｅ：Ｔ比１：１では細胞死は全く検出できなかった。
【００９３】
ｓＴＲＡＩＬ耐性ＭＣＦ−７細胞株の場合、ｍＴＲＡＩＬに４８時間曝露することによって発揮されるアポトーシス効果の有効性は、高用量（１００ｎｇ／ｍｌ）のｓＴＲＡＩＬに７２時間曝露することによって発揮される有効性よりも顕著に高かった（表７及び表８）。
【００９４】
ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬの細胞障害効果が実際にｍＴＲＡＩＬによるものであることを証明するため、ＭＣＦ−７細胞を擬似形質導入ＣＤ３４＋細胞と共培養した。表８に示すように、ＭＣＦ−７細胞と擬似形質導入ＣＤ３４＋細胞との共培養は、過密培養に関連していると思われるわずかな細胞死効果を伴った。
【００９５】
ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬの細胞死活性が、ＣＤ３４のＡｄ−ＴＲＡＩＬ感染の終わりに洗浄除去されなかった遊離のアデノウイルス粒子によるものである可能性を排除するため、ＭＣＦ−７細胞を１０６ｐｆｕに曝露させた。ＭＣＦ−７細胞を１０６ｐｆｕに曝露しても細胞毒性の証拠は全く検出できなかった（表８）。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】初期ＫＭＳ−１１異種移植片を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生存期間に対するＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞の効果を示す。
【図２】進行期ＫＭＳ−１１異種移植片を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生存期間に対するＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞の効果を示す。
【図３】初期ＫＭＳ−１１異種移植片を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生存期間に対するＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞の効果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を発現する腫瘍帰巣細胞、及び抗腫瘍療法におけるその使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
調節不全のアポトーシスメカニズムは、リンパ球増殖障害の発症機序と進行に主要な役割を果たし、新生細胞を正常な寿命を越えて生存させ、最終的に放射線化学療法耐性を獲得する［１］。したがって、アポトーシス経路は、悪性細胞のアポトーシス感受性を回復させ、又はアポトーシスのアゴニストを活性化するための魅力的な治療標的であることを意味する［２］。アポトーシス遺伝子及びタンパク質を調節するために、アポトーシスの内部経路（Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ）、外部経路（ＤＲ４、ＤＲ５、ＦＬＩＰ）、又は集束経路（ｃＩＡＰ２）のいずれかを標的とするいくつかの戦略を想定することができる［３］。
【０００３】
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、細胞死受容体リガンドであるＴＮＦファミリーに属する［４］。
【０００４】
ＴＲＡＩＬをコードする単離ＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を含む発現ベクター、及び組換えＴＲＡＩＬポリペプチドは、ＷＯ９７／０１６３３号に開示されている。
【０００５】
ＴＲＡＩＬは、多くのがん細胞の細胞表面に発現する細胞死受容体４（ＤＲ４）及び細胞死受容体５（ＤＲ５）に結合する［５］。可溶性ＴＲＡＩＬがＤＲ４又はＤＲ５に結合することにより、カスパーゼ活性化とアポトーシスをもたらす［６］。
【０００６】
Ｌｉｕ Ｚｈｏｎｇｙｕら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．Ｖｏｌ．１１２、Ｎｏ．９、２００３．１１．９、１３３２−１３４１は、組換えアデノウイルスによってＴＲＩＡＬを形質導入した樹状細胞、及び関節炎の治療における潜在的な医学的用途について開示している。それらの細胞をがん治療に使用する可能性についての記載はない。
【０００７】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ試験は、可溶性組換えＴＲＡＩＬが、高度ながん細胞特異性及び強力な抗腫瘍活性により、抗がん治療に主要な役割を果たすことを示唆している［７］。実際、ＴＲＡＩＬは、正常細胞に危害を加えずに、多くの形質転換細胞においてアポトーシスを選択性に誘導する［４］。更に、マウスへのＴＲＡＩＬ投与は、大腸癌［８、９］、乳癌［１０］、多発性骨髄腫［１１］、又は神経膠腫［１２、１３］の腫瘍異種移植に対して顕著な効果を発揮する。
【０００８】
マウス及びヒト以外の霊長類における毒性試験により、正常な肝細胞及びケラチン生成細胞は、３量体型ＴＲＡＩＬに耐性である［１４、１５］が、非最適化ＴＲＡＩＬ製剤又はリガンドの抗体結合変異体によって誘導されるアポトーシスに対して顕著な感受性を示す［１６］ことが実証されている。３量体型ＴＲＡＩＬを高用量で用いた場合、肝毒性が主要な問題を代表するかどうかについは依然として議論の余地がある。
【０００９】
可溶性ＴＲＡＩＬの使用に対する更なる限界は、アポトーシスが起こるには長期のインキュベーション時間か非常に高用量の可溶性ＴＲＡＩＬを必要とする相当数の各種腫瘍細胞株において観察されるアポトーシス応答障害によって代表される［１７、１８］。静脈内注入後のＴＲＡＩＬの薬物動態プロファイル（血漿半減期は３２分、排出半減期は４．８時間）を考えると、長期間の曝露や高濃度の条件は、何らかのｉｎ ｖｉｖｏ治療戦略に転換可能ではない［１０］。可溶性組換えＴＲＡＩＬに関する限界を克服し、腫瘍細胞を特異的に標的とするために、さまざまな動物モデルを用いて、いくつかのアデノウイルス介在ＴＲＡＩＬ遺伝子移入アプローチが近年利用されつつある［１９、２０］。
【００１０】
しかしながら、遺伝子移入アプローチは、腫瘍の高率感染と有効であるべき免疫クリアランスの回避とに大きく依存している［２１］。更に、アデノウイルスベクターの全身感染に関するいくつかの安全性の問題は依然として取り組まねばならない問題である［２２］。例えば、ＴＲＡＩＬのアデノウイルスによる遺伝子移入は、肝癌細胞のアポトーシス応答障害を克服するが、初代培養ヒト肝細胞において重度のアポトーシスを引き起こす［１９］。近年、アデノウイルスに基づいた遺伝子治療アプローチは、ＴＲＡＩＬをコードするアデノウイルスの腫瘍内送達に主に依存している［２３］。局所抗腫瘍活性にも関わらず、ＴＲＡＩＬの腫瘍内送達は全身性抗腫瘍活性を示さず、したがって臨床的価値を失っている。
【００１１】
さまざまな細胞種は腫瘍に優先的に帰巣し［２４］、抗がん分子を産生するために必要な構築体を搭載できることが知られている。その帰巣性により、ＣＤ３４＋細胞［２５］及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞［２６］は、抗がん分子の送達媒体として用いることができる。
【００１２】
ＣＤ３４＋細胞は、静脈内注射の後、永続的な骨髄コロニー形成能、並びに一過性の肝臓及び脾臓のコロニー形成能を含めた特異的帰巣性を示す［２７〜３０］。これらの帰巣性は、骨髄微小環境及び腫瘍微小環境に存在する間質細胞で発現する特定リガンド（例えばＳＤＦ−Ｉ、ＶＣＡＭ−Ｉなど）と相互作用する接着受容体（例えばＣＸＣＲ−４、ＶＬＡ−４、ＶＬＡ−５、ＣＤ４４など）の発現に厳密に関連している［３１〜３４］。
【００１３】
ＮＫ細胞は、主要組織適合性複合体の非制限的メカニズムを介して、腫瘍細胞に対する細胞性免疫防御において必須の役割を果たすリンパ球のサブセットである［３５］。静脈内注射の後、ＮＫ細胞は骨髄及びリンパ器官に帰巣し、適切なサイトカインシグナルの影響下で腫瘍部位に血管外遊出する。したがって、多くのグループは、治療目的で腫瘍へ帰巣させるためにＮＫ細胞を使用することを模索している［３６〜３８］。
【００１４】
たとえＮＫ細胞の腫瘍帰巣性が公知であっても、遺伝子改変細胞は、導入遺伝子の種類に応じたストレスを受ける。ＴＲＩＡＬ遺伝子を導入した場合、ストレスの結果として、細胞は元の腫瘍帰巣性を失い得る。したがって、成功への合理的期待は存在せず、検討される特定のアプローチが実行可能であるかどうかを確認するには実際の実験が必要である。
【００１５】
現在、ＴＲＡＩＬを発現するように遺伝子操作されたＣＤ３４＋細胞及びＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞介在抗腫瘍活性を達成するために有利に利用できることがわかっている。
【非特許文献１】Ｄａｎｉａｌ，Ｎ．Ｎ．及びＳ．Ｊ．Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ、細胞死：重要管理点。Ｃｅｌｌ、２００４、１１６（２）：ｐ．２０５−１９．
【非特許文献２】Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ，Ｍ．Ｖ．、がん細胞において細胞死を選択的に実行するための有望な戦略。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００４、２３（１６）：ｐ．２９６７−７５．
【非特許文献３】Ｗａｘｍａｎ，Ｄ．Ｊ．及びＰ．Ｓ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ、改良された抗がん遺伝子治療のためのアポトーシスの利用。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、２００３、６３（２４）：ｐ．８５６３−７２．
【非特許文献４】Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．及びＶ．Ｍ．Ｄｉｘｉｔ、細胞死受容体：シグナル伝達と調節。Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２８１（５３８１）：ｐ．１３０５−８．
【非特許文献５】Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．及びＶ．Ｍ．Ｄｉｘｉｔ、細胞死受容体とおとり受容体によるアポトーシス制御。Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１９９９、１１（２）：ｐ．２５５−６０．
【非特許文献６】Ｗａｎｇ，Ｓ．及びＷ．Ｓ．Ｅｌ−Ｄｅｉｒｙ、ＴＲＡＩＬ、及びＴＮＦファミリー細胞死受容体によるアポトーシス誘導。Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２００３、２２（５３）：ｐ．８６２８−３３．
【非特許文献７】Ａｌｍａｓａｎ，Ａ．及びＡ．Ａｓｈｋｅｎａｚｉ、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ：アポトーシスシグナル伝達、生物学、及びがん治療の可能性、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ，２００３、１４（３−４）：ｐ．３３７−４８．
【非特許文献８】ＬｅＢｌａｎｃ，Ｈ．ら、プロアポトーシスＢｃｌ−２相同体Ｂａｘの突然変異による不活性化を介した細胞死受容体誘導性アポトーシスに対する腫瘍細胞の耐性。Ｎａｔ Ｍｅｄ、２００２、８（３）：ｐ．２７４−８１．
【非特許文献９】Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．ら、組換え可溶性Ａｐｏ２リガンドの安全性と抗腫瘍活性。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９９、１０４（２）：ｐ．１５５−１６２．
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【非特許文献１１】Ｍｉｔｓｉａｄｅｓ，Ｃ．Ｓ．ら、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌリガンドは多発性骨髄腫においてアポトーシスを選択的に誘導し、薬物耐性を克服する：治療への応用。Ｂｌｏｏｄ、２００１、９８（３）：ｐ．７９５−８０４．
【非特許文献１２】Ｆｕｌｄａ，Ｓ．ら、Ｓｍａｃアゴニストは、ｉｎ ｖｉｖｏでＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ誘導性又は抗がん剤誘導性アポトーシスに対する感受性を増加させ、悪性神経膠腫の退縮を誘導する。Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００２、８（８）：ｐ．８０８−８１５．
【非特許文献１３】Ｐｏｌｌａｃｋ，Ｉ．Ｆ．、Ｍ．Ｅｒｆｆ、及びＡ．Ａｓｈｋｅｎａｚｉ、可溶性Ａｐｏ２Ｌ／腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドによるアポトーシスシグナル伝達の直接刺激は、神経膠腫細胞を選択的に殺傷する。Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００１、７（５）：ｐ．１３６２−１３６９．
【非特許文献１４】Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｄ．ら、組換え型Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの特異的肝細胞毒性。Ｎａｔ Ｍｅｄ、２００１、７（４）：ｐ．３８３−５．
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【非特許文献２０】Ｖｏｅｌｋｅｌ−Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｃ、Ｄ．Ｌ．Ｋｉｎｇ、及びＪ．Ｓ．Ｎｏｒｒｉｓ、可溶性ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）に対する前立腺癌細胞の耐性は、ドキソルビシン、又は全長ＴＲＡＩＬのアデノウイルスによる送達によって克服することができる。Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２００２、９（２）：ｐ．１６４−７２．
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【非特許文献３６】Ｂａｓｓｅ，Ｐ．Ｈ．、Ｔ．Ｌ．Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ、及びＲ．Ｂ．Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ、マウス及びヒトにおける腫瘍免疫療法のための活性化ナチュラルキラー細胞の使用。Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２０００、１２１：ｐ．８１−９４．
【非特許文献３７】ｄｅＭａｇａｌｈａｅｓ−Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｍ．ら、転移性乳癌患者における活性化ナチュラルキラー細胞を用いた移植後の養子免疫療法。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、２０００、２３（１）：ｐ．１５４−６０．
【非特許文献３８】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、進行がん患者を治療するための高用量インターロイキン２単独又はリンホカイン活性化キラー細胞との併用の有望な無作為化試験。Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ、１９９３、８５（８）：ｐ．６２２−３２．
【非特許文献３９】Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｔ．Ｓ．ら、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド／Ａｐｏ−２リガンド遺伝子のアデノウイルス介在移入は腫瘍細胞アポトーシスを誘導する。Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００、１６５（５）：ｐ．２８８６−９４．
【非特許文献４０】Ｋａｚｈｄａｎ Ｉ．及びＲ．Ａ． Ｍａｒｃｉｎｉａｋ、細胞死受容体４（ＤＲ４）は、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）に対する感受性にかかわりなく乳癌細胞を効率的に殺傷する。Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２００４、１１：ｐ．６９１−６９８．
【発明の詳細な説明】
【００１６】
発明の説明
本発明によれば、腫瘍帰巣細胞は、アデノウイルス介在遺伝子移入によって、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を産生するように遺伝子操作されている。本発明による細胞は、上記欠点を引き起こすことなく、腫瘍部位へＴＲＡＩＬを送達するために全身投与することができる。
【００１７】
したがって、本発明は、ＴＲＡＩＬを発現する腫瘍帰巣細胞、及びそれらを含有するＴＲＡＩＬ製剤に関するものである。また、本発明は、抗がん治療用、特にヒトリンパ腫治療用の細胞組成物を調製するための細胞の使用に関するものである。
【００１８】
本発明の細胞は、腫瘍帰巣細胞に、好適なプロモーター、例えばＣＭＶプロモーターの制御下にてヒトＴＲＡＩＬ遺伝子（Ａｄ−ＴＲＡＩＬ）をコードする複製欠損性アデノウイルスを導入することによって得ることができる。形質導入は、分子生物学者に周知の方法にしたがって、好ましくは実施例に記載の方法にしたがって、実施することができる。
【００１９】
本発明によれば、「腫瘍帰巣」細胞という用語は：（１）静脈内注射の後、腫瘍組織へ帰巣可能であり、且つ（２）適当量の膜結合ＴＲＡＩＬ（ｍＴＲＡＩＬ）を少なくとも数日間発現可能な細胞を定義するために用いられる。
【００２０】
血液から腫瘍堆積物へ帰巣可能な腫瘍帰巣細胞の例としては、造血細胞、即ち成長因子で処置されたがん患者の末梢血から採取したＣＤ３４＋造血細胞；末梢血から採取したＮＫ細胞；末梢血単核球の生体外培養によって得たサイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ）；内皮細胞及び内皮前駆細胞；腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）；リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）；マクロファージ；間葉系幹細胞（ＭＳＣ）（末梢血又はヒト組織から新たに単離したもの、又は生体外培養したもの）、並びに腫瘍探索能を保持し、ｍＴＲＡＩＬを発現するように遺伝子操作されたヒト細胞株が挙げられる。ｍＴＲＡＩＬを適当に発現させるには、組織特異的プロモーター及び／又はエンハンサーのような適切な遺伝子調節配列を伴うプラスミドやウイルスベクターの使用を含め、いくつかの方法を想定することができる。
【００２１】
ＣＤ３４＋細胞とＮＫ細胞が特に好ましい。
【００２２】
ＮＫ細胞の最適な形質導入効率は、ＮＫ細胞をＮ−アセチルシステイン（１０ｍＭ）とともに１８時間プレインキュベーションすることによって得ることができる。プレインキュベーション後、ＮＫ細胞を、無血清条件下、３７℃でＡｄ−ＴＲＡＩＬの段階的感染効率（ＭＯＩ）（５０〜５００）に曝露する。次に血清添加培地（ＲＰＭＩ−１６４０／ＦＢＳ ２０％）を加え、数時間後、培養物にＧｅｎｅ Ｂｏｏｓｔｅｒ（１：２００）を添加し、更に１８時間インキュベーションする。
【００２３】
ＣＤ３４＋細胞に対し、Ｎ−アセチルシステインとのプレインキュベーション以外は、同様の方法を用いることができる。
【００２４】
本発明の組成物は、『レミントンの薬学』（Ｍａｃｋ出版社、ニュージャージー州、１９９１）に報告されているもののような、非経口投与、特に静脈内投与に好適なビヒクルを用いることによって調製することができる。
【００２５】
例えば、使用できる賦形剤には、組成物を受容する個人に有害でない医薬品、例えば、湿潤剤又は乳化剤、緩衝液のような補助剤との混合物であってもよい、水、食塩水、グリセロール、及びエタノールなどが含まれる。適切な用量は、いくつかある要因の中で特に、処置すべき被験者の性別、年齢、及び病態、疾患の重篤度に依存するであろう。適切な有効量は、熟練技術者によって容易に決定することができ、いずれにせよ臨床試験により決定することができる。治療的に有効な用量は、通常約１０３〜約１０１５の形質導入細胞であろう。他の用量は、当然ながら、慣用の実験、即ち、用量反応曲線に依拠し、最大許容量（ＭＴＤ）を決定し、又は限定数の患者において第Ｉ相臨床試験を実施することによって確立することができる。投薬処置は、単回用量であっても、複数回用量のスケジュールであってもよい。更に、必要に応じて高用量を被験者に投与することもできる。熟練技術者は、最も有効な用法・用量を容易に決定するであろう。
【００２６】
以下の実施例により、明解で説得力のある下記の証拠を提供しつつ、本発明をより詳細に説明する：
（ｉ） ＣＤ３４＋幹細胞及びＮＫ細胞は、ＴＲＡＩＬを発現するアデノベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に形質導入することができる；
（ｉｉ） 形質導入により、これらの細胞サブタイプは細胞表面でＴＲＡＩＬを一過性に発現する；
（ｉｉｉ） このように短期間のＴＲＡＩＬ発現は、形質導入細胞とともに共培養したＴＲＡＩＬ感受性及びＴＲＡＩＬ耐性腫瘍細胞において検出される強力なアポトーシス効果と関連がある；
（ｉｖ） 初期腫瘍又は進行腫瘍を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤへの形質導入細胞のｉｎ ｖｉｖｏ注射は、マウスの生存期間の顕著な延長と関連があり、アデノウイルスで形質導入されたＣＤ３４＋細胞及びＮＫ細胞は、治療目的の全身ＴＲＡＩＬ送達のための媒体として効率的に役立つことができることを示唆している。
【００２７】
静脈内投与の有効性は、腫瘍内送達に基づいたプロトコールと比較して、本発明の明確な利点を提供する。
【００２８】
ｍＴＲＡＩＬ発現ヒト細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍効果のメカニズムは、ｍＴＲＡＩＬと腫瘍細胞上のその同族受容体との直接反応によって引き起こされるアポトーシスである可能性が最も高いが、そのｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性のメカニズムは不明である。腫瘍細胞の直接殺傷は、ＴＲＡＩＬ受容体を発現する、腫瘍を埋め込んだ非腫瘍細胞（血管、血管周囲、間質、並びに腫瘍の成長及び腫瘍細胞の生存に重大な役割を有する他の細胞種）のアポトーシスから生ずる間接的増殖阻害効果とおそらく共役している。当然ながら、本発明は、観察された活性の実際のメカニズムに基づいた仮説によって限定されるものではなく、現行の実験は、ｉｎ ｖｉｖｏで観察される抗腫瘍活性のメカニズムをよりよく理解することを目的としている。
【実施例１】
【００２９】
アデノウイルス介在遺伝子移入後にＴＲＡＩＬを発現するＣＤ３４＋細胞又はＮＫ細胞とともに共培養したリンパ腫細胞株におけるアポトーシスのｉｎ ｖｉｔｒｏ誘発
リンパ腫細胞株と、アデノウイルス介在遺伝子移入後にＴＲＡＩＬを発現するように遺伝子操作されたＣＤ３４＋細胞又はＮＫ細胞との共培養の効果について評価した。
【００３０】
最初のｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、ＴＲＡＩＬを発現するアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＴＲＡＩＬ）を用いて、ＣＤ３４＋細胞及びＮＫ細胞のアデノウイルス感染のための最適条件を定めた。次いで、ＰＥ結合−抗ＴＲＡＩＬモノクローナル抗体（クローンＲｉｋ−２）を用いて、ＣＤ３４＋細胞及びＮＫ細胞の表面におけるＴＲＡＩＬ発現の経時変化をモニターした。最後に、Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞をリンパ腫細胞株と共培養することによって、膜結合ＴＲＡＩＬのリンパ腫細胞株におけるアポトーシス誘導能について評価した。
【００３１】
方法
ヒトＴＲＡＩＬ遺伝子をコードするアデノウイルス ＣＭＶプロモーターから発現されるヒトＴＲＡＩＬ遺伝子をコードする複製欠損性アデノウイルス（Ａｄ−ＴＲＡＩＬ）をこれらの実験に用いた［３９］。Ａｄ−ＴＲＡＩＬは、ｐＡｄ５ＣＭＶＫ−ＮｐＡのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ部位にクローニングされたヒトＴＲＡＩＬの全長コード配列を含有する。得られたプラスミドとＥ１遺伝子を欠失させたアデノウイルス骨格配列（Ａｄ５）とをヒト胚性腎２９３細胞へトランスフェクションし、ウイルス粒子を単離し、ＴＲＡＩＬ発現の解析のために増幅させる。Ａ５４９プラークアッセイにより、組換えアデノウイルスを複製適格ウイルスに対してスクリーニングし、２９３細胞のプラークアッセイによりウイルス力価を決定する。精製ウイルスを、３％ショ糖含有ＰＢＳ中に保存し、使用するまで−８０℃に維持する。ＴＲＡＩＬ遺伝子産物を形質導入細胞の細胞表面で発現させ、フローサイトメトリーで測定することができる。
【００３２】
ＣＤ３４＋細胞へのアデノウイルス形質導入 Ａｄ−ＴＲＡＩＬを形質導入すべきＣＤ３４＋細胞は、化学療法を受け、造血成長因子で処置された同意したがん患者の末梢血から採取した。ＣＤ３４＋細胞は、白血球搬出法サンプルから、免疫磁気技術と正の選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により濃縮した。アデノウイルスを形質導入するため、ＣＤ３４＋細胞を、最終感染効率（ＭＯＩ）が１００〜１，０００となるよう適切に希釈されたＡｄ−ＴＲＡＩＬストックを含有する１ｍｌの無血清培地（ＩＭＤＭ）の入った３５ｍｍペトリ皿に２×１０６／ｍｌで蒔いた。２時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、培養物に１ｍｌのＩＭＤＭ／ＦＢＳ ２０％を添加し、４時間後、ＧｅｎｅＢｏｏｓｔｅｒ（１：２００）を加えた。細胞を更に１８時間インキュベーションし、次に血清含有培地で大規模に洗浄し（３回）、最後に、ＰＥ結合−抗ＴＲＡＩＬ抗体を用いた直接免疫蛍光法で形質導入効率について評価した。
【００３３】
ＮＫ細胞へのアデノウイルス形質導入 Ａｄ−ＴＲＡＩＬを形質導入すべきＮＫ細胞は、同意した健常ドナーの末梢血から採取した。ＮＫ細胞は、白血球搬出法サンプルから免疫磁気技術と正の選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により濃縮した。形質導入前に、ＮＫ細胞を、１０％ＦＢＳ及びＮ−アセチルシステイン（１０ｍＭ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０中でインキュベーションした（１８時間、３７℃）。アデノウイルスを形質導入するため、ＮＫ細胞を、最終感染効率（ＭＯＩ）が５０〜５００となるよう適切に希釈されたＡｄ−ＴＲＡＩＬストックを含有する１ｍｌの無血清培地（ＲＰＭＩ−１６４０）の入った３５ｍｍペトリ皿に２×１０６／ｍｌで蒔いた。２時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、培養物に１ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０／ＦＢＳ ２０％を添加し、４時間後、ＧｅｎｅＢｏｏｓｔｅｒ（１：２００）を加えた。細胞を更に１８時間インキュベーションし、次に血清含有培地で大規模に洗浄し（３回）、最後に、ＰＥ結合−抗ＴＲＡＩＬ抗体を用いた直接免疫抗体法で形質導入効率について評価した。
【００３４】
共培養 ＣＤ３４＋細胞又はＮＫ細胞の膜上に発現したＴＲＡＩＬのアポトーシス誘発活性を共培養実験にてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。簡潔に言えば、Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞（エフェクター細胞）をリンパ腫細胞（標的細胞）と共培養した。共培養開始後２４時間及び４８時間にアポトーシス誘導を評価した。これらの実験では、エフェクター細胞の形質導入効率に基づいて、エフェクター細胞：標的細胞の比を計算した。
【００３５】
結果
ＣＤ３４＋細胞へのアデノウイルス形質導入 予備実験により、ＣＤ３４＋細胞の最適形質導入効率は、ＣＤ３４＋細胞（２×１０６／ｍｌ）を、無血清条件下、段階的ＭＯＩ（１００〜１，０００の範囲）のＡｄ−ＴＲＡＩＬに２時間（３７℃）曝露することによって一貫して達成されたことを実証した。次に等量の血清添加培地（ＩＭＤＭ／ＦＢＳ ２０％）を加え、４時間後、培養物にＧｅｎｅ Ｂｏｏｓｔｅｒ（１：２００）を添加し、更に１８時間インキュベーションした。最後に、細胞を血清含有培地で大規模に洗浄し（３回）、ＰＥ結合−抗ＴＲＡＩＬ抗体を用いた直接免疫蛍光法でトランス遺伝子発現について評価した。
【００３６】
対照細胞ではバックグラウンドＴＲＡＩＬシグナルは検出されなかったが、アデノウイルスに曝露した細胞は、ＭＯＩ依存性様式で増加するＴＲＡＩＬ陽性ＣＤ３４＋細胞の割合を示した。代表的な実験では、ＴＲＡＩＬ陽性ＣＤ３４＋細胞の割合は、ＭＯＩが１００及び１，０００においてそれぞれ２５％及び８４％であった。
【００３７】
上記感染プロトコールは、ＭＯＩ １，０００において、ＴＲＡＩＬ発現ＣＤ３４＋細胞の平均（±ＳＤ）が８３±８％（７０〜９５％の範囲、ｎ＝５）の最大遺伝子移入効率を一貫して生じた。トリパンブルーによる色素排除試験にて評価した細胞生存率は、ＭＯＩ １，０００もの高率に影響されなかった（生存細胞≧８５％）。
【００３８】
トランス遺伝子発現の経時変化について評価するために、ＣＤ３４＋細胞にＭＯＩ １，０００で形質導入し、形質導入後７日目までＴＲＡＩＬ発現について解析した。これらの実験では、ＣＤ３４＋細胞を生存させるために、培養物に低用量（３ｎｇ／ｍｌ）の顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を添加した。表１に示すように、相当な割合のＣＤ３４＋細胞（２５％）が、形質導入後１２０時間までＴＲＡＩＬを発現し続けた。
【００３９】
【表１】
【００４０】
ＮＫ細胞へのアデノウイルス形質導入 予備実験により、ＮＫ細胞の最適形質導入効率は、ＮＫ細胞をＮ−アセチルシステイン（１０ｍＭ）とともに１８時間プレインキュベーションすることによって一貫して達成されたことを実証した。プレインキュベーション後、ＮＫ細胞（２×１０６／ｍｌ）を、無血清条件下、段階的ＭＯＩ（５０〜５００の範囲）のＡｄ−ＴＲＡＩＬに２時間（３７℃）曝露した。次に等量の血清添加培地（ＲＰＭＩ−１６４０／ＦＢＳ ２０％）を加え、４時間後、培養物にＧｅｎｅ Ｂｏｏｓｔｅｒ（１：２００）を添加し、更に１８時間インキュベーションした。最後に、細胞を血清含有培地で大規模に洗浄し（３回）、ＰＥ結合−抗ＴＲＡＩＬ抗体を用いた直接免疫蛍光法でトランス遺伝子発現について評価した。
【００４１】
アデノウイルスに曝露した細胞は、ＭＯＩ依存性様式で増加するＴＲＡＩＬ陽性ＮＫ細胞の割合を示した。代表的な実験では、ＴＲＡＩＬ陽性ＮＫ細胞の割合は、ＭＯＩが５０、１００、及び５００においてそれぞれ３０％、４５％、及び４６％であった。
【００４２】
上記感染プロトコールは、ＭＯＩ １００において、ＴＲＡＩＬ発現ＮＫ細胞の平均（±ＳＤ）が６１±１８％（４５〜８４％の範囲、ｎ＝４）の最大遺伝子移入効率を一貫して生じた。トリパンブルーによる色素排除試験にて評価した細胞生存率は、ＭＯＩ １００もの高率に影響されなかった（生存細胞≧８５％）。
【００４３】
トランス遺伝子発現の経時変化について評価するために、ＮＫ細胞にＭＯＩ １００で形質導入し、形質導入後７日目までＴＲＡＩＬ発現について解析した。表２に示すように、形質導入したＮＫ細胞は、形質導入後１６８時間までＴＲＡＩＬを発現し続けた。
【００４４】
【表２】
【００４５】
共培養 最後に、Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞（エフェクター細胞）と腫瘍細胞株（標的細胞）とを共培養することによって、リンパ細胞株における膜結合ＴＲＡＩＬのアポトーシス誘発能について評価した。これらの実験のために、可溶性ＴＲＡＩＬに対する感受性によって２つの細胞株を選択した。具体的には、ＴＲＡＩＬ感受性ＫＭＳ−１１細胞株及びＴＲＡＩＬ耐性ＪＶＭ−２細胞株を用いた。
【００４６】
上記感染プロトコールにしたがい、最適条件下で形質導入したＣＤ３４＋細胞又はＮＫ細胞を、アデノウイルスへの初期曝露２４時間後に収集し、大規模に洗浄し、ＫＭＳ−１１細胞又はＪＶＭ−２細胞と共培養した。
【００４７】
Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞をエフェクター細胞：標的細胞比０．８：１で共培養したところ、２４時間の共培養後、ＫＭＳ−１１細胞に関し、相当な割合（８１％）のアポトーシス細胞及び壊死細胞を検出した。アポトーシス細胞の量は、４８時間の共培養後、更に増加した（アポトーシス細胞９３％）。
【００４８】
Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞をエフェクター細胞：標的細胞比０．６：１で共培養したところ、２４時間の共培養後、ＫＭＳ−１１細胞に関し、相当な割合（８３％）のアポトーシス細胞及び壊死細胞を検出した。アポトーシス細胞の量は、４８時間の共培養後、更に増加した（アポトーシス細胞８５％）。
【００４９】
ＴＲＡＩＬ感受性ＫＭＳ−１１細胞株の場合、膜結合ＴＲＡＩＬが発揮するアポトーシス効果の有効性は、高用量（１００ｎｇ／ｍｌ）の可溶性ＴＲＡＩＬに２４時間〜４８時間曝露することによって発揮される有効性と同様であった（表３）。しかしながら、静脈内注入後のＴＲＡＩＬの薬物動態プロファイル（血漿半減期は３２分、排出半減期は４．８時間）を考えると、４８時間又は２４時間でさえも、ｉｎ ｖｉｖｏで１００ｎｇ／ｍｌで持続曝露を達成することはできない。
【００５０】
【表３】
【００５１】
また、Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞を可溶性ＴＲＡＩＬ耐性ＪＶＭ−２細胞株とインキュベーションすることによって、共培養実験を行った。
【００５２】
Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞をエフェクター細胞：標的細胞比０．８：１で共培養したところ、４８時間の共培養後、ＴＲＡＩＬ耐性ＪＶＭ−２細胞に関し、相当な割合（５１％）のアポトーシス細胞及び壊死細胞を検出した。
【００５３】
Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞をエフェクター細胞：標的細胞比０．６：１で共培養したところ、４８時間の共培養後、ＴＲＡＩＬ耐性ＪＶＭ−２細胞に関し、相当な割合（５３％）のアポトーシス細胞及び壊死細胞を検出した。
【００５４】
ＴＲＡＩＬ耐性ＪＶＭ−２細胞株の場合、膜結合ＴＲＡＩＬが発揮するアポトーシス効果の有効性は、高用量（１００ｎｇ／ｍｌ）の可溶性ＴＲＡＩＬに４８時間曝露することによって発揮される有効性よりも顕著に高かった（表４）。
【００５５】
【表４】
【００５６】
細胞介在ＴＲＡＩＬ送達によるアポトーシス活性の有効性を更に探究するため、エフェクター細胞（Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞）を、標的細胞（ＫＭＳ−１１細胞株）と、さまざまなエフェクター細胞：標的細胞比で２４時間共培養した。
【００５７】
表５に示すように、Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞は、エフェクター細胞：標的細胞比０．４：１に調整した共培養において、相当な割合（６６％）のＫＭＳ−１１細胞のアポトーシス又は壊死を誘発した。
【００５８】
【表５】
【００５９】
表６に示すように、Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞は、エフェクター細胞：標的細胞比０．３：１に調整した共培養において、相当な割合（６４％）のＫＭＳ−１１細胞のアポトーシス又は壊死を誘発した。
【００６０】
【表６】
【実施例２】
【００６１】
アデノウイルス介在遺伝子移入後にＴＲＡＩＬを発現するように遺伝子操作されたＣＤ３４＋細胞又はＮＫ細胞の、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ抗がん活性の評価
Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞による治療可能性について調べるために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、ＴＲＡＩＬ感受性ＫＭＳ−１１多発性骨髄腫細胞株を再注入した。その後、マウスにＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞を注射し、細胞に基づいたＴＲＡＩＬ送達による抗腫瘍効果の計測値としてマウスの生存を用いた。
【００６２】
方法
Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞の抗腫瘍活性の評価 体重２０〜２５ｇの６〜８週齢雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（ミラノ、イタリア）から購入した。マウスは、我々の施設の指針にしたがい、標準的実験室条件下で飼育した。動物に対して実施した実験手順は、国立腫瘍学研究所の動物実験に関する倫理委員会によって認可されており、英国癌研究調整委員会の指針にしたがって実施した。
【００６３】
マウスに、ＫＭＳ−１１細胞を静脈内（ＩＶ）接種した（０．５×１０６／マウス）。Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞による処置（１×１０６／マウス）は、腫瘍細胞の接種後７日目又は１７日目に開始し、４週間にわたる毎週のＩＶ注射から成る。再注入したＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞又はＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞の平均形質導入効率は、それぞれ８３±８％及び６１±１８％であった。したがって、各マウスは、４回の注射にわたり、平均３．３２×１０６ＴＲＡＩＬ発現ＣＤ３４＋細胞数及び２．４４×１０６ＴＲＡＩＬ発現ＮＫ細胞数を受けた。腫瘍の出現、体重測定、及び毒性に関して週２回マウスをチェックした。各群の動物の生存期間を記録し、群間の差異を統計解析によって評価した。適切な対照群には：（ｉ）腫瘍細胞のみを注射したマウス；（ｉｉｉ）腫瘍細胞＋非形質導入ＣＤ３４＋細胞又はＮＫ細胞を注射したマウス、が含まれる。
【００６４】
結果
Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞 ＫＭＳ−１１細胞を異種移植したマウス（０．５×１０６／マウス）を、２つの異なるスケジュールにしたがい、週１回の頻度でＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞の４回のＩＶ注射により処置した。即ち、早期腫瘍の治療はＫＭＳ−１１細胞の注射後７日目に開始し、進行腫瘍の治療は１７日目に開始した。再注入したＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞の平均形質導入効率は８３±８％（平均±ＳＤ、ｎ＝９）であったため、各マウスは、４回の注射にわたり、平均３．３２×１０６ＴＲＡＩＬ発現ＣＤ３４＋細胞数を受けた。
【００６５】
図１に示すように、ＫＭＳ−１１細胞単独を注射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生存期間の中央値は５６日であった。野生型ＣＤ３４＋細胞の注射は生存期間の中央値（５６日）に影響を及ぼさなかったが、初期腫瘍に対しＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞で処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生存期間の中央値は１１１日を示した（ｐ≦０．００１）。
【００６６】
進行腫瘍をＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞で処置した効果を図２に示す。ＫＭＳ−１１細胞単独を注射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生存期間の中央値は５６日であった。野生型ＣＤ３４＋細胞の注射は生存期間の中央値（５６日）に影響を及ぼさなかったが、進行腫瘍のＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞による処置は、生存期間の中央値の顕著な延長（９８日、ｐ≦０．００７）を伴った。
【００６７】
Ａｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞 ＫＭＳ−１１細胞を異種移植したマウス（０．５×１０６／マウス）を、週１回の頻度でＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞の４回のＩＶ注射により処置した。ＮＫ細胞の再注入は、腫瘍増殖初期のＫＭＳ−１１細胞注射後７日目に開始した。この実験の場合、再注入したＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞の平均形質導入効率は６１±１８％であった。したがって、各マウスは、４回の注射にわたり、平均２．４４×１０６ＴＲＡＩＬ発現ＮＫ細胞数を受けた。
【００６８】
図３に示すように、ＫＭＳ−１１細胞単独を注射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生存期間の中央値は５６日であった。野生型ＮＫ細胞の注射は生存期間の中央値（５０日）に影響を及ぼさなかったが、初期腫瘍のＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞による処置は、生存期間の中央値の顕著な延長（７４日、ｐ≦０．０３）を伴った。
【実施例３】
【００６９】
ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ細胞の乳癌細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性
かなりの割合の乳癌細胞株は、ＴＲＡＩＬおとり受容体によるＴＲＡＩＬ隔離、Ｒ１及びＲ２受容体の発現喪失、ＦＬＩＰ過剰発現などを含めた多くのメカニズムにより、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスに対して耐性である［４０］。ｓＴＲＡＩＬ耐性リンパ腫細胞株は、ｍＴＲＡＩＬに曝露したとき、実際にＴＲＡＩＬ反応性になることを示した我々の先の結果に基づき、２つの乳癌細胞株のｓＴＲＡＩＬ及びｍＴＲＡＩＬに対する感受性を調べた。
【００７０】
乳癌細胞株のｓＴＲＡＩＬの殺傷効果に対する感受性を、ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ細胞と共培養したｓＴＲＡＩＬ感受性及びｓＴＲＡＩＬ耐性乳癌細胞株のアポトーシスのｉｎ ｖｉｔｒｏ誘発に関する評価と比較して評価した。
【００７１】
２つの乳癌細胞株、即ちＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−３６１を用いた。ｓＴＲＡＩＬの殺傷効果に対する個々の細胞株の感受性を評価するために、腫瘍細胞（５〜１０×１０４／ｍｌ）を、低用量（１０ｎｇ／ｍｌ）及び高用量（１００ｎｇ／ｍｌ）のｓＴＲＡＩＬに７２時間曝露した。その後、アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム２重染色でアポトーシスについて評価した。
【００７２】
方法
細胞株 乳癌細胞株ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−３６１は、それぞれ、ＤＳＭＺ（ブラウンシュワイク、ドイツ、ＥＵ）及びＡＴＣＣ（マナッサス、バージニア州、米国）から購入した。細胞は、マイコプラズマの混入に関し、ポリメラーゼ連鎖反応によって定期的に試験した。全てのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験は、指数関数的に増殖している細胞を用いて行った。
【００７３】
アネキシンＶの発現 アネキシンＶ−ＦＩＴＣアッセイ（ファーミンジェン）を用いて、初期又は後期アポトーシス及び壊死を起こした細胞の割合を定量した。簡潔に言えば、解析すべき細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、次に結合バッファー（１０ｎＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｎＭ ＮａＣｌ、５ｎＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。インキュベーション後、０．１ｍｌの細胞懸濁液を５ｍｌの培養管に移し、５μＬのアネキシンＶ−ＦＩＴＣ及び１０μＬのヨウ化プロピジウムを加えた。ボルテックス後、サンプルを暗所中、室温にて１５分間インキュベーションした。インキュベーションの終わりに、０．４ｍＬの結合バッファーを加え、フローサイトメトリーにて直ちに細胞を解析した。
【００７４】
結果
ｓＴＲＡＩＬとのインキュベーションがアポトーシスの誘発に関連するかどうかを調べるため、ＭＣＦ−７細胞株及びＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞株をｓＴＲＡＩＬ（１０〜１００ｎｇ／ｍｌ、７２時間）に曝露し、次にアポトーシス細胞及び壊死細胞の割合をＦＡＣＳ解析にて検出した。表７に示すように、ＭＣＦ−７細胞ではｓＴＲＡＩＬに曝露してもアポトーシス反応を誘導しなかったが、１００ｎｇ／ｍｌのｓＴＲＡＩＬに７２時間曝露したとき、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞によって顕著な細胞死反応が生じた。これらの結果によれば、ＭＣＦ−７はｓＴＲＡＩＬ耐性細胞株であるが、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１はｓＴＲＡＩＬ感受性細胞株である。
【００７５】
【表７】
【００７６】
次に、アデノウイルス介在遺伝子移入後にＴＲＡＩＬを発現するＣＤ３４＋細胞（ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ）と共培養した乳癌細胞株におけるアポトーシスのｉｎ ｖｉｔｒｏ誘発について評価した。
【００７７】
方法
ヒトＴＲＡＩＬ遺伝子をコードするアデノウイルス ＣＭＶプロモーターから発現されるヒトＴＲＡＩＬ遺伝子をコードする複製欠損性アデノウイルス（Ａｄ−ＴＲＡＩＬ）をこれらの実験に用いた［３９］。Ａｄ−ＴＲＡＩＬは、ｐＡｄ５ＣＭＶＫ−ＮｐＡのＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ部位にクローニングされたヒトＴＲＡＩＬの全長コード配列を含有する。得られたプラスミドとＥ１遺伝子を欠失させたアデノウイルス骨格配列（Ａｄ５）とをヒト胚性腎２９３細胞へトランスフェクションし、ウイルス粒子を単離し、ＴＲＡＩＬ発現の解析のために増幅させる。Ａ５４９プラークアッセイにより、組換えアデノウイルスを複製適格ウイルスに対してスクリーニングし、２９３細胞のプラークアッセイによりウイルス力価を決定する。精製ウイルスを、３％ショ糖含有ＰＢＳ中に保存し、使用するまで−８０℃に維持する。ＴＲＡＩＬ遺伝子産物を形質導入細胞の細胞表面で発現させ、フローサイトメトリーで測定することができる。
【００７８】
ＣＤ３４＋細胞へのアデノウイルス形質導入 Ａｄ−ＴＲＡＩＬを形質導入すべきＣＤ３４＋細胞は、化学療法を受け、造血成長因子で処置された同意したがん患者の末梢血から採取した。ＣＤ３４＋細胞は、白血球搬出法サンプルから、免疫磁気技術と正の選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により濃縮した。アデノウイルスを形質導入するため、ＣＤ３４＋細胞を、感染効率（ＭＯＩ）が５００となるように適切に希釈されたＡｄ−ＴＲＡＩＬストックを含有する１ｍｌの無血清培地（ＩＭＤＭ）の入った３５ｍｍペトリ皿に２×１０６／ｍｌで蒔いた。２時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、培養物に１ｍｌのＩＭＤＭ／ＦＢＳ ２０％を添加し、４時間後、ＧｅｎｅＢｏｏｓｔｅｒ（１：２００）を加えた。細胞を更に１８時間インキュベーションし、次に血清含有培地で大規模に洗浄し（３回）、最後に、ＰＥ結合−抗ＴＲＡＩＬ抗体を用いた直接免疫蛍光法で形質導入効率について評価した。
【００７９】
共培養 ｍＴＲＡＩＬのアポトーシス誘発活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで共培養実験にて試験した。簡潔に言えば、ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ細胞（エフェクター細胞）を乳癌細胞（標的細胞）と共培養した。共培養開始後４８時間にアポトーシス誘導を評価した。これらの実験では、エフェクター細胞：標的細胞比１：１及び４：１を用いた。
【００８０】
結果
ＣＤ３４＋細胞へのアデノウイルス形質導入 ＣＤ３４＋細胞の最適形質導入効率は、ＣＤ３４＋細胞（２×１０６／ｍｌ）を、無血清条件下、段階的Ａｄ−ＴＲＡＩＬに２時間（３７℃）曝露することによって、ＭＯＩ ５００にて一貫して達成された。対照細胞ではバックグラウンドＴＲＡＩＬシグナルが検出されなかったが、ＴＲＡＩＬ発現細胞は、ＴＲＡＩＬ陽性ＣＤ３４＋細胞の割合が９３±８％（平均±ＳＤ）を示した。トリパンブルーによる色素排除試験にて評価した細胞生存率は、ＭＯＩ １，０００もの高率に影響されなかった（生存細胞≧８５％）。
【００８１】
共培養 ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ細胞（エフェクター細胞）と腫瘍細胞（標的細胞）とを共培養することによって、乳癌細胞株におけるｍＴＲＡＩＬのアポトーシス誘発能について評価した。ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ細胞を、アデノウイルスへの初期曝露後２４時間に収集し、大規模に洗浄し、ＭＣＦ−７細胞又はＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞と共培養した。これらの実験では、２つのエフェクター細胞：標的細胞比、即ち１：１及び４：１を用いた。結果を表８にまとめる。
【００８２】
【表８】
【００８３】
ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ細胞を、ｓＴＲＡＩＬ感受性ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞とＥ：Ｔ比１：１（細胞死＝２８％）及びＥ：Ｔ比４：１（細胞死＝５０％）にて４８時間共培養することによって顕著な割合の細胞死が検出された。
【００８４】
ｓＴＲＡＩＬ感受性ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞株の場合、ｍＴＲＡＩＬに４８時間曝露することによって発揮されるアポトーシス効果の有効性は、高用量（１００ｎｇ／ｍｌ）のｓＴＲＡＩＬに７２時間曝露することによって発揮される有効性と同様であった（表７）。
【００８５】
ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬの細胞障害効果が実際にｍＴＲＡＩＬによるものであることを証明するために、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞を擬似形質導入ＣＤ３４＋細胞と共培養した。表２に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞と模擬形質導入ＣＤ３４＋細胞との共培養は、最高のＥ：Ｔ比にてのみ検出されるわずかな細胞死効果を伴った。このようにわずかな細胞死誘導は、過密培養に関連していると思われる。
【００８６】
ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬの細胞死活性が、ＣＤ３４のＡｄ−ＴＲＡＩＬ感染の終わりに洗浄除去されなかった遊離のアデノウイルス粒子によるものである可能性を排除するため、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞を１０６プラーク形成単位（ｐｆｕ）に曝露させた。ＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞を１０６ウイルス粒子に曝露させても細胞毒性の証拠は全く検出できなかった（表８）。
【００８７】
ｐｆｕ数は以下のようにして計算した。
【００８８】
５×１０５ＣＤ３４＋細胞をＭＯＩ ５００にて感染させるために、２５０×１０６ｐｆｕを用いて、これを１ｍｌのＣＤ３４＋細胞懸濁液に加えた。
【００８９】
感染の終わりに、ＣＤ３４＋細胞を培地中で３回洗浄した。各洗浄工程に関し、１：２０の希釈係数を用いた。即ち、懸濁培養物を少なくとも８，０００倍に希釈した。
【００９０】
洗浄工程の終わりに２５０×１０６ｐｆｕが依然として懸濁培養中にあることを想定して、これを８，０００倍に希釈した。即ち、＜５０，０００の残存ｐｆｕを共培養に加えることが予想された。
【００９１】
したがって、共培養において検出された細胞死活性が、洗浄除去されなかった遊離のアデノウイルス粒子によるものであることを排除するため、乳癌細胞株を、２０を乗じた理論残存ｐｆｕ値と等しいｐｆｕ数（＃３を参照されたい）に曝露させた（即ち５０，０００×２０＝１０６ｐｆｕ）。
【００９２】
次に、ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ細胞をｓＴＲＡＩＬ耐性ＭＣＦ−７細胞株とともにインキュベーションすることによって共培養実験を行った。これらの実験では、ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬ細胞をｓＴＲＡＩＬ耐性ＭＣＦ−７細胞とＥ：Ｔ比４：１にて４８時間共培養することにより、顕著な割合の細胞死を検出した（細胞死＝６４％）が、Ｅ：Ｔ比１：１では細胞死は全く検出できなかった。
【００９３】
ｓＴＲＡＩＬ耐性ＭＣＦ−７細胞株の場合、ｍＴＲＡＩＬに４８時間曝露することによって発揮されるアポトーシス効果の有効性は、高用量（１００ｎｇ／ｍｌ）のｓＴＲＡＩＬに７２時間曝露することによって発揮される有効性よりも顕著に高かった（表７及び表８）。
【００９４】
ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬの細胞障害効果が実際にｍＴＲＡＩＬによるものであることを証明するため、ＭＣＦ−７細胞を擬似形質導入ＣＤ３４＋細胞と共培養した。表８に示すように、ＭＣＦ−７細胞と擬似形質導入ＣＤ３４＋細胞との共培養は、過密培養に関連していると思われるわずかな細胞死効果を伴った。
【００９５】
ＣＤ３４／Ａｄ−ＴＲＡＩＬの細胞死活性が、ＣＤ３４のＡｄ−ＴＲＡＩＬ感染の終わりに洗浄除去されなかった遊離のアデノウイルス粒子によるものである可能性を排除するため、ＭＣＦ−７細胞を１０６ｐｆｕに曝露させた。ＭＣＦ−７細胞を１０６ｐｆｕに曝露しても細胞毒性の証拠は全く検出できなかった（表８）。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】初期ＫＭＳ−１１異種移植片を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生存期間に対するＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞の効果を示す。
【図２】進行期ＫＭＳ−１１異種移植片を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生存期間に対するＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＣＤ３４＋細胞の効果を示す。
【図３】初期ＫＭＳ−１１異種移植片を有するＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの生存期間に対するＡｄ−ＴＲＡＩＬ／ＮＫ細胞の効果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドを発現する、樹状細胞ではない腫瘍帰巣細胞。
【請求項２】
腫瘍帰巣細胞に腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドをコードするアデノウイルスベクターを形質導入することによって得ることが可能な、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
腫瘍帰巣細胞が、成長因子で処置されたがん患者の末梢血から採取したＣＤ３４＋造血細胞；末梢血から採取したＮＫ細胞；末梢血単核球の生体外培養によって得たサイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ）；内皮細胞及び内皮前駆細胞；腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）；リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）；マクロファージ；間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から選択される、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
ＮＫ細胞又はＣＤ３４＋細胞に腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドをコードするアデノウイルスベクターを形質導入することによって得ることが可能な、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞を、生理的に許容可能なビヒクルとの混合物で含有する細胞製剤。
【請求項６】
腫瘍治療用医薬を調製するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞の使用。
【請求項７】
腫瘍がリンパ腫である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
腫瘍が乳癌である、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
医薬が静脈内投与される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１】
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドを発現する、樹状細胞ではない腫瘍帰巣細胞。
【請求項２】
腫瘍帰巣細胞に腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドをコードするアデノウイルスベクターを形質導入することによって得ることが可能な、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
腫瘍帰巣細胞が、成長因子で処置されたがん患者の末梢血から採取したＣＤ３４＋造血細胞；末梢血から採取したＮＫ細胞；末梢血単核球の生体外培養によって得たサイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ）；内皮細胞及び内皮前駆細胞；腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）；リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）；マクロファージ；間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から選択される、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
ＮＫ細胞又はＣＤ３４＋細胞に腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンドをコードするアデノウイルスベクターを形質導入することによって得ることが可能な、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞を、生理的に許容可能なビヒクルとの混合物で含有する細胞製剤。
【請求項６】
腫瘍治療用医薬を調製するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞の使用。
【請求項７】
腫瘍がリンパ腫である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
腫瘍が乳癌である、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
医薬が静脈内投与される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００８−５０７９６１（Ｐ２００８−５０７９６１Ａ）
【公表日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５２２９８９（Ｐ２００７−５２２９８９）
【出願日】平成１７年７月２１日（２００５．７．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００７９５７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１０５５８
【国際公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【出願人】（５０６１０２２９３）ドムペ・ファ．ル．マ・ソチエタ・ペル・アツィオーニ (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月２１日（２００５．７．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００７９５７
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０１０５５８
【国際公開日】平成１８年２月２日（２００６．２．２）
【出願人】（５０６１０２２９３）ドムペ・ファ．ル．マ・ソチエタ・ペル・アツィオーニ (11)
【Ｆターム（参考）】
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