腸の炎症性疾患及び１型糖尿病を治療するためのＡＰＬ型ペプチドの使用
本発明は、医薬分野、具体的にはクローン病、潰瘍性大腸炎及び１型真正糖尿病を治療するための医薬組成物を調製するための、６０ｋＤａのヒト熱ショックタンパク質に由来するＡＰＬ型ペプチド又はその類似体の使用に関する。前記ペプチドは消化管内に体内分布し、クローン病患者の腸固有層及び末梢血の活性化Ｔ細胞のアポトーシス誘導を促進する。さらに、このペプチドは、１型真正糖尿病患者の単核細胞のアポトーシスを誘導する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬分野、特に、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎等）及び１型糖尿病を治療するためのＡＰＬペプチド（改変型ペプチドリガンド、略語ＡＰＬ）又はその類似体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
クローン病や潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患は、常在菌に対する強力なエフェクター機能を有する腸固有層Ｔ細胞が活性化されることに起因している。しかし、これらリンパ球を慢性的に活性化する正確な機序は、いまだ明らかでない（Ｂａｌｆｏｕｒ Ｒ（２００６）疾患の機序：クローン病及び潰瘍性大腸炎の発病学（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ：ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）、Ｎａｔｕｒｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ＆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３（７）：３９０〜４０７頁）。
【０００３】
消化管には約２×１０４個の細菌が存在しており、この免疫学的圧力は免疫系に対する驚くべき難題を意味している。免疫系は、病原性微生物に対する適切な応答性と無害な微生物に対する寛容性の間でバランスを取らなければならない。粘膜免疫系は、アポトーシスによって活性化Ｔ細胞を減少させる等、不必要で制御の効かない炎症応答を回避するためのいくつかの機序を有している（Ｐｅｐｐｅｌｅｎｂｏｓｃｈ ＭＰ及びｖａｎ Ｄｅｖｅｎｔｅｒ ＳＪＨ（２００４）Ｔ細胞のアポトーシス及び炎症性腸疾患（Ｔ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｇｕｔ ５３：１５５６〜１５５８頁）。
【０００４】
標準状態の免疫系は、エフェクターＴ細胞の応答を刺激することなく、速やかに侵襲性腸内細菌の感染を除去し、先天性免疫応答を下方制御し、傷ついた粘膜を治癒する。対照的に、遺伝的に感受性の高い宿主の免疫系は、適切な先天性応答を開始すること及び／又は共生微生物因子に対する寛容原性免疫応答を起こすことができず、その後に共生細菌に対する病原性Ｔ細胞の応答を活性化し慢性腸炎へと進行する（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ ＤＫ（２００２）炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４７：４１７〜２９頁）。
【０００５】
すなわち、炎症性腸疾患は、急性腸内感染等の環境刺激によって起こる炎症過程を適切に制御する機序の障害に起因している。Ｔ細胞のアポトーシスに対する抵抗性、下方制御シグナルに対する応答の欠如並びに管腔抗原及び免疫増強剤への継続的な曝露によって、この炎症応答は維持される（Ｍｕｄｔｅｒ Ｊ及びＮｅｕｒａｔｈ ＭＦ（２００７）Ｔ細胞のアポトーシス及び炎症性腸疾患の制御：治療との関連（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｇｕｔ ５６：２９３〜３０３頁）。
【０００６】
クローン病は、マクロファージ、好中球及びＴ細胞の腸への動員の亢進によって特徴づけられ、これらは共刺激性接着分子及びＴＨ１（ヘルパーＴ細胞１、略語ＴＨ１）に関連する炎症誘発性サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ）−６（ＩＬ−６）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α））の発現量の増加、並びにＴＨ１７（ヘルパーＴ細胞１７、略語ＴＨ１７）の細胞応答（ＩＬ−１２、Ｉ−２３及びＩＬ−２７等）をもたらす（Ｂａｌｆｏｕｒ Ｒ（２００６）疾患の機序：クローン病及び潰瘍性大腸炎の病因（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ：ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）、Ｎａｔｕｒｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ＆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３（７）：３９０〜４０７頁）。
【０００７】
腸内の炎症細胞数を、細胞の動員、増殖、及び壊死又はアポトーシスによる細胞死によって測定する。正常な腸粘膜由来の粘膜固有層Ｔ細胞は、活性化誘発性の細胞死（Ｆａｓ／ＦａｓＬ系による）を受けやすく、これによってリンパ球の増殖を制御することができる（Ｂｕ Ｐら（２００１）アポトーシス：腸粘膜免疫系の不応答性を維持する機序の１つ（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｈａｔ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：６３９９〜６４０３頁）。しかし、データはクローン病患者の粘膜固有層Ｔ細胞がアポトーシスに抵抗性であることを示しており、この抵抗性は、疾患の永続化及び炎症の慢性化の一因となる恐れがある活性型エフェクターＴＨ１細胞の集団の増殖をもたらす可能性がある（Ｂｏｉｒｉｖａｎｔ Ｍら（１９９９）クローン病及び他の胃腸炎における粘膜固有層Ｔ細胞は、ＣＤ２経路誘導性アポトーシス障害を示す（Ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｓｈｏｗ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ＣＤ２ ｐａｔｈｒｏｕｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１６：５５７〜５６５頁）。
【０００８】
クローン病患者の粘膜Ｔ細胞におけるアポトーシス障害は、Ｂｃｌ−２のような抗アポトーシス分子とＢａｘのようなアポトーシス促進分子の比率の不均衡に起因しており、この不均衡がこれら細胞の生存を長びかせ、アポトーシスシグナルの抵抗性をもたらす（Ｉｎａ Ｋら（１９９９）複数のアポトーシスシグナルについてのクローン病Ｔ細胞の抵抗性は、粘膜Ｂｃｌ２／Ｂａｘの不均衡と関連している（Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｂｃｌ２／Ｂａｘ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｂａｌａｎｃｅ）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６３：１０８１〜９０頁；Ｉｔｏｈ Ｊら（２００１）粘膜Ｔ細胞によるＢａｘ発現量の減少は、クローン病におけるアポトーシス抵抗性に有利に作用する（Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ Ｂａｘ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｍｕｃｏｓａｌ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆａｖｏｕｒｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｇｕｔ ４９：３５〜４１頁）。一方で、Ｓｔｕｒｍ及び同僚は、クローン病、潰瘍性大腸炎の患者及び健常対照に由来する粘膜Ｔ細胞の細胞周期特性を調べた。クローン病患者の粘膜Ｔ細胞は、潰瘍性大腸炎患者又は健常対照の粘膜細胞と比較して、おそらく活性化依存的アポトーシスの異常の結果として周期が速く進むので、著しく高い細胞増殖能を有していることが明らかになった。これらのことから、クローン病患者の粘膜が反応亢進状態を示すＴ細胞を過剰に含み、また共生細菌に対する寛容性を失っている理由を説明できる可能性がある（Ｓｔｕｒｍ Ａら（２００４）異なる細胞周期速度は、クローン病及び潰瘍性大腸炎の粘膜Ｔ細胞の異なる機能的能力に基づいている（Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ ｔｈｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｍｕｃｏｓａｌ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）、Ｇｕｔ ５３：１６２４〜１６３１頁）。
【０００９】
これらの実験的証拠は、クローン病は、細胞増殖事象がアポトーシスによる死に勝ることにより、この疾患原因における重要な因子である可能性がある、炎症部位への反応性Ｔ細胞の蓄積をもたらす疾患であるという事実を支持している。この意味において、この疾患の治療に使用される最も強力な生物学的製剤は、単球及びＴ細胞においてアポトーシスを誘導する製剤、例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−１２又はＩＬ−６受容体に対する抗体であると思われる（Ｌｕｇｅｒｉｎｇら（２００１）インフリキシマブは、カスパーゼ依存的経路に対する活性を使用して慢性クローン病患者由来の単球にアポトーシスを誘導する。（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｉｔ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｏ ｃａｓｐａｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｒｏｕｔｅ）、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２１：１１４５〜５７頁）、（Ｓｔａｌｌｍａｃｈら（２００４）インターロイキン１２ ｐ４０−ＩｇＧ２ｂ融合タンパク質はＴ細胞に媒介される炎症を抑制する：クローン病及び生きた実験的大腸炎における消炎作用（Ａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１２ ｐ４０−ＩｇＧ２ｂ ｃｏａｌｉｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｂｒｏｇａｔｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ａｌｉｖｅ）、Ｇｕｔ ５３：３３９〜４５頁）、（Ａｔｒｅｙａ Ｒら（２０００）インターロイキン６トランスシグナル遮断薬は、慢性腸炎におけるアポトーシスに対するＴ細胞の抵抗性を抑制する：クローン病及び生きた実験的大腸炎における証拠（Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６ ｔｒａｎｓ−ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｉｎ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ａｌｉｖｅ）、Ｎａｔ Ｍｅｄ ６：５８３〜５８８頁）。特に、ＴＮＦαに対する抗体は、ステロイド無反応性クローン病患者に長期的な寛解を誘導するのに重要な選択肢である。
【００１０】
インフリキシマブは、大きな親和性と特異性によって遊離のＴＮＦα及び結合したＴＮＦαの両方に結合してその効果を中和するマウス可変領域とヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）分子の定常領域を含むキメラモノクローナル抗体（ＡｃＭ）である（Ｋｎｉｇｈｔ ＤＭＫら（１９９３）マウス−ヒトキメラ抗ＴＮＦ抗体の構築及び最初の特徴づけ（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｕｓｅ−ｈｕｍａｎ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉ−ＴＮＦ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０：１４４３〜１４５３頁）。
【００１１】
エタネルセプトは、ヒト腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）の可溶性部位をヒトＩｇＧ１のＦｃ部位に融合させた単量体鎖を２本含む組み換えタンパク質である（Ｍｏｈｌｅｒ ＫＭら（１９９３）可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体は、致死的な内毒血症の有効な治療薬であり、ＴＮＦ運搬体及びＴＮＦ拮抗薬として同時に機能する（Ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ （ＴＮＦ） ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｉｎ ｌｅｔｈａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ａｓ ｂｏｔｈ ＴＮＦ ｃａｒｒｉｅｒｓ ａｎｄ ＴＮＦ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５１：１５４８〜１５６１頁）。この分子は、関節リウマチ（ＲＡ）等、別の炎症性疾患の治療における利用が奏功している（Ｍｏｒｅｌａｎｄ ＬＷら（１９９９）関節リウマチにおけるエタネルセプト治療、無作為及び対照臨床試験へ（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｔｏ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ）、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １３０：４７８〜４８６頁）。しかしインフリキシマブに反して、エタネルセプトはクローン病において臨床的な有益性を示さない。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒａｎｄｅと同僚は、クローン病の治療における両薬剤の効果の差が、単球及び活性化した粘膜固有層Ｔ細胞のアポトーシスを誘導するインフリキシマブの能力に起因することを実証した（Ｖａｎ ｄｅ Ｂｒａｎｄｅ ＪＭＨら（２００３）インフリキシマブは、クローン病患者由来の粘膜固有層Ｔリンパ球のアポトーシスを誘導するが、エタネルセプトは誘導しない（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ ｂｕｔ ｎｏｔ Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２４：１７７４〜１７８５頁）。エタネルセプトは、アポトーシス促進効果によってクローン病に有効であると示唆されてきたインフリキシマブのようなアポトーシスを誘導しない。
【００１２】
インフリキシマブ及びＴ細胞にアポトーシスを誘導する他の薬剤を使用して治療したクローン病患者で得た臨床結果は、粘膜のＴ細胞区画においてアポトーシスが回復することがクローン病の成功治療の重要な因子になる可能性を示唆している。
【００１３】
これまでに、インフリキシマブはクローン病患者の治療用として最も成功した治療法である。この治療法は、潰瘍性大腸炎患者においても有望な結果を伴って利用されている。しかし、この治療法を使用すると広範囲にわたって免疫抑制が起こるためこれらの患者において結核及びマイコプラズマ病のような疾患の発病率を増加させる等、一群の副作用が生じる（Ｋｏｏｌｏｏｓ ＷＭ．（２００７）関節リウマチ及びクローン病の抗ＴＮＦ治療における薬理遺伝学の潜在的役割（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ ａｎｔｉ−ＴＮＦ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １２：１２５〜３１頁）。従って、現在の主要な課題は特異性を有し、広範囲にわたる免疫抑制を引き起こすことなく病原性細胞を排除できる治療戦略を開発することである。
【００１４】
この目的のために、この１年、免疫応答を抑制するのでなくそれを調節することを意図して抗原特異的戦略が応用されてきた。この意味で、末梢寛容性機序を誘導するために、このような条件で天然自己抗原又はＡＰＬペプチドが使用され投与されてきた（Ｐｒａｋｋｅｎ Ｂら（２００４）エピトープ特異的免疫療法は、ＲＡにおける炎症誘発性Ｔ細胞の免疫偏向を誘導する（Ｅｐｉｔｏｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＲＡ）、ＰＮＡＳ １２（１０１）：４２２８〜３３頁；Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄ Ｈら（２００５）二重改変ペプチドリガンドによるＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性事象を介した筋無力症誘起性Ｔ細胞応答の下方制御は、アポトーシスを引き起こす（Ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙａｓｔｈｅｎｏｇｅｎｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ｔｏ ｄｕａｌ ａｌｔｅｒｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄ ｖｉａ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｖｅｎｔｓ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、ＰＮＡＳ １０２（６）：２０２８〜３３頁；Ｐａａｓ−Ｒｏｚｎｅｒ Ｍら（２００１）異なる経路によって投与された二重改変ペプチドリガンドによる実験的自己免疫重症筋無力症に関連する応答の能動的抑制の性質（Ｔｈｅ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ ｂｙ ａ ｄｕａｌ ａｌｔｅｒｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄ ａｄｍｉｎｉｓｔｒｅｒｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｏｕｔｅｓ）、ＰＮＡＳ ９８（２２）：１２６４２〜７頁）。
【００１５】
ＡＰＬは、Ｔ細胞受容体又は主要組織適合複合体との接触に不可欠な位置に１つ又は複数の置換を有し、Ｔ細胞が完全に活性化するために必要な事象のカスケードを妨害又は改変する免疫原性ペプチドの類似体である（Ｂｉｅｌｅｋｏｖａ Ｂ及びＭａｒｔｉｎ Ｒ（２００１）改変ペプチドリガンドを介した抗原特異的免疫調節（Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｖｉａ ａｌｔｅｒｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ）、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７９：５５２〜６５頁）。ペプチドリガンドの固有の特性を実験的に操作する能力により、免疫細胞応答の性質、経過及び力を適当に変えることができる。国際特許出願公開第２００６／０３２２１６号において、６０ｋＤａのヒト熱ショックタンパク質（略語Ｈｓｐ６０）に由来するＡＰＬペプチド、及びＲＡを治療するためのこれらペプチドの製剤の使用が特許請求されている。１型真正糖尿病は、インスリンを産生する膵臓のβ細胞を破壊するＴ細胞によって媒介される自己免疫器官特異的疾患であり、糖代謝の調節解除を引き起こす（Ｂｒｏｗｎ Ｌ及びＥｉｓｅｎｂａｒｔｈ ＧＳ（１９９０）１型糖尿病：ヒト、マウス及びラットの慢性自己免疫疾患（Ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ：Ａ ｃｈｒｏｎｉｃ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ， ｍｏｕｓｅ， ａｎｄ ｒａｔ）、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：６４７〜７９頁）。この疾患の臨床症状は、免疫系が８０〜９０％近くの膵臓細胞を不活性化した後に現れる。現在の治療法は、インスリンの体内生産を維持するために膵細胞に永久的な損傷が起こる前に、自己免疫過程を止めるための安全で、特異的で有効な方法を発見することを目的としている。寛容性の誘導は、１型糖尿病の治療にまで拡大した概念である。Ｉｒｕｎ Ｃｏｈｅｎ及び同僚は、この疾患を診断及び治療するためのヒトＨｓｐ６０ペプチドの使用を保護している（米国特許第６，６８２，８９７号）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、前述した問題を解決し、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎等）及び１型真正糖尿病を治療するための新規な治療選択肢を提供する。本発明の本質は、炎症性腸疾患及び１型真正糖尿病を治療するための医薬組成物を製造するための、ヒトＨｓｐ６０に由来する免疫調節因子ＡＰＬペプチド又はその類似体の使用である。配列がＳＩＤＬＫＤＫＹＫＮＩＧＡＫＬＶＱＬＶＡＮＮＴＮＥＥＡであるこのペプチドを、配列番号１として配列表中で識別する。
【００１７】
このペプチドは、クローン病患者の活性化された腸固有層及び末梢血Ｔ細胞のアポトーシス誘導を促進することにより、ＴＮＦα抗体の使用に伴って起こるような非特異的免疫抑制を引き起こすことなく、この疾患の発病機序に関与するＴ細胞クローンの阻害をもたらす。炎症性腸疾患を治療するための、この免疫調節因子ＡＰＬペプチド又はその類似体の使用は、この疾患に特徴的な炎症過程に寄与しているＴ細胞クローンを中和することを対象としている。
【００１８】
本発明の製剤は、病原性活性型Ｔ細胞を中和するためのその高い特異性によって特徴づけられる。この製剤は結核やマイコプラズマ病を引き起こす日和見感染のような副作用を最小限に抑え、この事実はこの製剤の安全性に著しく寄与している。日和見感染は、インフリキシマブのような薬剤の使用又はメトトレキセートの使用に起因するリンパ腫等の腫瘍過程の発症によって起こる広範囲にわたる免疫抑制と関連している。
【００１９】
炎症性腸疾患を治療するための薬剤の製造における前述の免疫調節因子ペプチドの使用には、それを非経口的経路（例えば、皮内、皮下、静脈等）によって投与することとは、その活性成分は主に消化管（胃、小腸及び大腸）へと体内分布される利点もある。また、このペプチドは必要な時間これらの器官に滞留し、その生物学的機序を発揮する。前述したように、腸疾患では消化管内で常在菌に対するエフェクターＴ細胞の制御の効かない活性化が起こっている。このペプチドの体内分布及び病原性管腔Ｔ細胞のアポトーシス誘導能が、クローン病及び潰瘍性大腸炎の治療にこのＡＰＬペプチドを使用することの合理性を正当化している。本発明の製剤の使用は、１型糖尿病のような寛解−再発症状によって特徴づけられる他の炎症性疾患にまで広げることができ、それら疾患においても自己反応性Ｔ細胞が重要な役割を担っている。
【００２０】
配列表中で配列番号１として識別されるＡＰＬは、国際特許出願公開第２００６／０３２２１６号においてＲＡを治療するためのペプチド製剤の使用について特許請求されている。しかしこの特許出願は、このペプチドが炎症性腸疾患及び１型真正糖尿病の治療に使用され得るということを特許請求も示唆もしていない。
【００２１】
炎症性腸疾患は自己免疫性疾患とみなされていない。なぜなら自己抗原に対する免疫応答がその炎症の開始及び維持に関与しておらず、少なくとも現在まで必然的に関連がある自己抗原は知られていないからであり、この点が自己免疫性疾患とは対照的である。これら疾患の原因は、常在菌の存在及び共生生物に対する免疫応答に依存している。この事実を支持する実験的証拠の１つは、無菌条件下では腸管内菌叢が再構成されない限り実験的ＩＢＤ疾患（炎症性腸疾患）が誘導され得ないことである（Ｃｈａｎｄｒａｎら（２００３）炎症性腸疾患：ＧＡＬＴ及び腸管内細菌叢の機能不全（ＩＩ）（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ：ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＡＬＴ ａｎｄ ｇｕｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｌｏｒａ（ＩＩ））、Ｓｕｒｇｅｏｎ １：１２５〜１３６頁；Ｓｔｒｏｂｅｒら（２００２）炎症の粘膜モデルの免疫学（Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍｕｃｏｓａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０：４９５〜５４９頁）。従っておそらく、細菌抗原がこの疾患の誘導を引き起こすものと予想される。
【００２２】
米国特許第６，６８２，８９７号において、Ｉｒｕｎ Ｃｏｈｅｎ及び同僚は、１型糖尿病を診断及び治療するためのヒトＨｓｐ６０ペプチドの使用を公開した。配列番号１として識別される配列はその特許に含まれておらず、配列番号１のペプチドに類似の生物学的活性も考慮されていない。これらの著者とは異なり、本発明者らは、この病状の発生に関与する病原性Ｔ細胞にアポトーシスを誘導するための配列番号１のペプチド（ヒトＨｓｐ６０由来ＡＰＬペプチド）の使用を本発明において開示する。
【００２３】
本発明の例によって、配列番号１のペプチドの特性が初めて明らかになった。その特性は、消化管へのペプチドの体内分布、並びにクローン病、潰瘍性大腸炎及び１型糖尿病を治療するためのこのペプチドの使用を可能にする病原性Ｔ細胞クローンのアポトーシスを誘導するそのペプチドの能力と関連している。当業者は、国際特許出願公開第２００６／０３２２１６号において提供される要素に基づいて本発明で特許請求されているこのペプチドの新規な使用を予測することはできなかった。
【００２４】
配列番号１として識別される配列のペプチド又はその類似体は、常法のペプチド合成法によって作製することができ、後で示す例に記載されているような実験において誘導される免疫応答のレベル及び特性によって評価することができる。
【００２５】
本発明の状況において、類似体という用語は、記載された配列（配列番号１）に１個又は複数個の変異を含むが、その記載されたペプチドと同じ生物学的活性を保持しているＡＰＬペプチドを指す。この修飾は、１つのアミノ酸の置換、欠失又は挿入（好ましくは置換）であることができる。この類似体は、記載されたペプチドのうち好ましくは９個未満の修飾、より好ましくは６個未満の修飾、さらに好ましくは２個未満の修飾を含むことができる。
【００２６】
配列番号１として識別されるヒトＨｓｐ６０由来のＡＰＬペプチド又はその類似体を含む、炎症性腸疾患及び１型糖尿病を治療するための医薬組成物も本発明の目的である。本発明の医薬組成物中のペプチドの量は、宿主において有効な免疫応答をもたらす量である。その有効量は、クローン病の炎症兆候を著しく減少させこれら疾患の経過に特徴的な消化管の炎症性病巣を消滅させる、Ｔ細胞のアポトーシスを誘導する投与量である。治療過程で患者に投与されるこの医薬組成物の量は、一般に年齢、性別、全体的な健康、及び免疫応答レベルのような特定の要因によって変化する可能性がある。
【００２７】
本発明は、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎等）及び１型糖尿病の治療方法にも関する。その方法は、配列番号１として識別されるペプチド又はその類似体を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む。本発明によれば、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎等）及び１型糖尿病の治療過程でこの医薬組成物は非経口的又は粘膜経路で投与される。本発明によれば、この医薬組成物は、皮内経路、皮下経路、筋肉内経路及び静脈経路を含む群から選択される非経口的経路によって投与される。他の実施形態では、この医薬組成物は、直腸経路及び経口経路を含む群から選択される粘膜経路によって投与される。これらの疾患の性質から、このＡＰＬペプチド又はその類似体は、浣腸として、又は経口経路で投与するのに適した医薬品形態として投与される製剤の一部であることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】活動性クローン病患者（Ａ）及び健常なドナー（Ｂ）由来の末梢血単核細胞の生存率に対する配列番号１のペプチドの効果を表す図である。異なる文字は、陰性対照（０μｇ／ｍＬ）とこの群中で評価した各用量のペプチドとの間の統計的有意差を示している。
【図２】クローン病患者由来の末梢血単核細胞において配列番号１のペプチドによって誘導されるアポトーシスを実証するための透過型電子顕微鏡の図である。パネルＡ、Ｂ：無処理の細胞（陰性対照）。パネルＣ〜Ｈ：配列番号１のペプチド（４０μｇ／ｍＬ）を用いて処理した細胞。大量の空胞形成（ＡＶ）；核断片化（ＮＦ）；クロマチンの核周囲への凝縮及び移動（ＣＭＣ）；完全な細胞質オルガネラ（ＩＣＯ）；アポトーシス小体（ＡＢ）；アポトーシス小体の貪食（Ｐ ＡＢ）。
【図３】クローン病患者の腸固有層由来の単核細胞において配列番号１のペプチドによって誘導されるアポトーシスを実証するための透過型電子顕微鏡の図である。パネルＡ、Ｂ：無処理の細胞（陰性対照）。パネルＣ、Ｄ：配列番号１のペプチド（４０μｇ／ｍＬ）を用いて処理した細胞。核断片化（ＮＦ）；クロマチンの核周囲への凝縮及び移動（ＣＭＣ）；アポトーシス小体（ＡＢ）。
【図４】非活動性クローン病患者由来の単核細胞の生存率に対する配列番号１のペプチドの効果を表す図である。Ｘ軸において、Ａ：抗ＣＤ３抗体を用いて活性化していない細胞、Ｂ：抗ＣＤ３抗体を用いて活性化した細胞。異なる文字は、陰性対照（０μｇ／ｍＬ）とこの群中で評価した各用量のペプチドとの間の統計的有意差を示している。
【図５】１型真正糖尿病患者由来の末梢血単核細胞において配列番号１のペプチドによって誘導されるアポトーシスを実証するための透過型電子顕微鏡の図である。パネルＡ、Ｂ：無処理の細胞（陰性対照）。パネルＣ、Ｄ：配列番号１のペプチド（４０μｇ／ｍＬ）を用いて処理した細胞。核断片化（ＮＦ）；クロマチンの核周囲への凝縮及び移動（ＣＭＣ）；アポトーシス小体（ＡＢ）；アポトーシス小体の貪食（Ｐ ＡＢ）。
【図６Ａ】ルイスラット（Ｌｅｗｉｓ Ｒａｔ）における配列番号１のペプチドの体内分布試験の図である。静脈経路０．２５ｍｇ／体重１ｋｇ。分析した組織は：１．肝臓；２．脾臓；３．腎臓；４．心臓；５．肺；６．頸神経節；７．腋窩上腕神経節；８．腸間膜幹神経節；９．骨盤神経節；１０．甲状腺；１１．胃；１２．小腸；１３．大腸である。
【図６Ｂ】ルイスラット（Ｌｅｗｉｓ Ｒａｔ）における配列番号１のペプチドの体内分布試験の図である。静脈経路１ｍｇ／体重１ｋｇ。分析した組織は、１．肝臓；２．脾臓；３．腎臓；４．心臓；５．肺；６．頸神経節；７．腋窩上腕神経節；８．腸間膜幹神経節；９．骨盤神経節；１０．甲状腺；１１．胃；１２．小腸；１３．大腸である。
【図６Ｃ】ルイスラット（Ｌｅｗｉｓ Ｒａｔ）における配列番号１のペプチドの体内分布試験の図である。皮内経路０．２５ｍｇ／体重１ｋｇ。分析した組織は、１．肝臓；２．脾臓；３．腎臓；４．心臓；５．肺；６．頸神経節；７．腋窩上腕神経節；８．腸間膜幹神経節；９．骨盤神経節；１０．甲状腺；１１．胃；１２．小腸；１３．大腸である。
【図６Ｄ】ルイスラット（Ｌｅｗｉｓ Ｒａｔ）における配列番号１のペプチドの体内分布試験の図である。皮内経路１ｍｇ／体重１ｋｇ。分析した組織は、１．肝臓；２．脾臓；３．腎臓；４．心臓；５．肺；６．頸神経節；７．腋窩上腕神経節；８．腸間膜幹神経節；９．骨盤神経節；１０．甲状腺；１１．胃；１２．小腸；１３．大腸である。
【実施例】
【００２９】
（例１）
活動性クローン病患者及び健常なドナー由来の末梢血単核細胞の生存率に対するＡＰＬペプチドの効果。
クローン病患者及び健常なドナー由来の血液を静脈穿刺によって抽出し、抗凝固剤溶液（クエン酸ナトリウム１２３ｍＭ、リン酸一ナトリウム１８．５ｍＭ、クエン酸１７ｍＭ、ブドウ糖１４１．５ｍＭ）を含む無菌チューブに採取した。各患者由来の血液を１×リン酸緩衝生理食塩水溶液（略語１×ＰＢＳ）で１：２に希釈し、１５ｍＬの遠心分離チューブ中で５ｍＬのこの希釈液を３ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）に添加し、１２００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。単核細胞に相当する環を抽出した。その後、この細胞を１５ｍＬの１×ＰＢＳで２回洗浄し、各洗浄の後にそれらを９００ｒｐｍで遠心分離した。最後に、この細胞ペレットを１０％のウシ胎児血清を含み、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、ＨＥＰＥＳ ２５ｍＭ／Ｌ、Ｌ−グルタミン２ｍＭ（全てＧｉｂｃｏ ＢＲＬから入手した）を補充したＲＰＭＩ１６４０に懸濁した。希釈した細胞懸濁液由来の細胞（補充したＲＰＭＩで１：２０に希釈し、トリパンブルー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で１：２に希釈）を、ノイバウエル（Ｎｅｕｂａｕｅｒ）血球計算板を使用して計数した。
【００３０】
単核細胞を、平底９６穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳＡ）に１００μＬの最終容量で１０５個細胞／ウェルの密度で播種し、異なる濃度のＡＰＬペプチド（配列番号１）（１０、４０、１６０μｇ／ｍＬ）と一緒に３個組で７２時間処理した。無処理の細胞を、基礎増殖の対照として使用した。
【００３１】
細胞生存率に対するＡＰＬペプチドの効果を、３−（４，５−ジメチルジアゾール−２−イル）−２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）法を使用して、供給元によって記載された手順に従って測定した。ＭＴＴは、代謝的に活性な細胞中に見られるミトコンドリア脱水素酵素によって組織培養培地に不溶のホルマザン生成物へと還元される。５６２ｎｍの吸光度によって測定されるホルマザン生成物の量は、培養液中の生細胞数に正比例する。５％ＣＯ２の湿潤雰囲気下、３７℃で７２時間細胞を培養した後、２０μＬのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。次に、プレートを、等しい培養条件で４時間インキュベーションした。その後、１００μＬの２−ブタノール溶液（２０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０％の２−ブタノール、５ｍＬの２Ｎ塩酸）を添加し、穏やかにピペッティングして各ウェルを均質化した。その後、ホルマザン生成物を完全に溶解するために、プレートを３７℃で３０分間連続的に撹拌し続けた。最後に、９６穴プレートリーダーを使用して５６２ｎｍの吸光度を記録した。
【００３２】
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅプログラムを使用して統計解析した。そのデータを、平均値±標準誤差（ＳＥ）として表示した。統計的検定にクラスカル−ウォリス検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）を使用した。これは多重比較用のノンパラメトリック検定法である。次に、ダン検定（Ｄｕｎｎ ｔｅｓｔ）を使用して、統計的に差異のある培地の群を特定した。ｐ＜０．０５の値を有意であるとみなした。
【００３３】
図１に示すように、ＡＰＬペプチド処理は、全てのペプチド投与量において活動性クローン病患者由来の末梢血単核細胞の生存率を無処理の細胞と比較して有意に減少させる（ｐ＜０．００１）。しかし、このペプチドを用いた処理は、健常なドナー由来の単核細胞の生存率には影響を及ぼさない（この実験で評価したＡＰＬペプチドのどの用量においても及ぼさない）。この結果は、クローン病患者の細胞においてこのペプチドによって誘導される細胞死機序に特異性があることを示唆している。これらの結果は、５人の活動性クローン病患者及び５人の健常なドナーを代表している。
【００３４】
（例２）
クローン病患者由来の末梢血単核細胞においてＡＰＬペプチドが誘導する細胞死機序の透過型電子顕微鏡による同定。
活動性クローン病患者由来の末梢血単核細胞においてＡＰＬペプチド（本発明において配列番号１と識別される）によって誘導される細胞死機序が、アポトーシスによって媒介されるかどうか同定するために、この試料を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で分析した。この技術によって、アポトーシスの発生の異論のない判定基準となるアポトーシス細胞の形態的特徴を可視化することが可能になる。これらの特徴は以下の通りである：高電子密度の核（初期のクロマチンの核周囲移動）、核断片化、無秩序で完全な細胞質オルガネラ、大きくて識別可能な空胞、細胞表面の変化及びアポトーシス小体への細胞の崩壊。隣接した細胞によるアポトーシス小体の貪食過程も、この技術で観察することができる（Ｗｈｉｔｅ Ｍら（２００４）電子顕微鏡に基づいてアポトーシスを検出するための形態学的手法（Ａ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８５：１０５〜１１頁）。
【００３５】
クローン病患者の末梢血から単離した単核細胞（１０×１０６個細胞）を、濃度４０μｇ／ｍＬのＡＰＬペプチドを含む場合と含まない場合とで７２時間培養した。無処理の細胞を、このアッセイの対照として使用した。７２時間インキュベーションした後、この試料を０．１Ｍリン酸緩衝液中の１％のグルタルアルデヒド溶液及び４％のパラホルムアルデヒドを使用して１時間固定した。次に、この細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、２％の四酸化オスミウム溶液を使用して１時間処理した。その後、細胞を０．１Ｍのカコジル酸緩衝液を用いて２回洗浄し、アルコールの濃度を増加させながら（３０〜１００％）その試料を脱水した。続いて、エポキシ樹脂Ｓｐｕｒｒを使用してこの細胞に浸透させ（Ｓｐｕｒｒ ＡＲ（１９６９）電子顕微鏡用低粘性エポキシ樹脂包埋剤（Ａ ｌｏｗ−ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ｅｐｏｘｙ ｒｅｓｉｎ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、Ｊ Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔ Ｈｅａｄ ２６（１）：３１〜４３頁）、７０℃で２４時間重合させた。この超微細切片（４０ｎｍ）を、ウルトラミクロトーム（Ｎｏｖａ、ＬＫＢ）を使用して切り、ニッケルグリルに封入した。その後、これらの試料をメタノールに過飽和させたウラニル酢酸溶液を用いて５分間染色した。Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＪＥＯＬ／ＪＥＭ ２０００ ＥＸ（ＪＥＯＬ、日本）で分析を行った。
【００３６】
ＴＥＭによって得た活動性クローン病患者由来の単核細胞の結果を図２に示す。観察される通り、無処理の細胞は正常な形態（Ａ、Ｂ）を有する。しかし、ＡＰＬペプチド（配列番号１）を用いて処理した細胞では、アポトーシス過程に特徴的な形態的変化を観察することができる（Ｃ〜Ｈ）。特に、クロマチンの核周囲への凝縮及び移動（ＣＭＣ）を観察することができる。ＣＭＣは細胞の核（Ｎ）においてアポトーシス中に起こる最初の形態的変化の１つである。同様に、これら試料中に核断片化（ＮＦ）及びアポトーシス小体（ＡＢ）を観察した。さらに、細胞残屑が存在することから、アポトーシス小体の貪食（Ｐ ＡＢ）が起こったことが分かる。図２Ｆに観察されるように、細胞質オルガネラは完全なままであり（ＩＣＯ）、これはアポトーシスによる細胞死の特徴である。これらの結果は、活動性クローン病患者由来の単核細胞においてこのＡＰＬペプチドで誘導される細胞死の機序が、アポトーシスによって媒介されていることを実証している。
【００３７】
ＴＥＭによって行ったこれら患者細胞の分析により、単核細胞の中でアポトーシスを起こしている細胞集団を同定することも可能になった。血液の異なる型の白血球（単球、リンパ球及び多形核球）が異なる形態を有するので、この結果が可能であった。単核細胞の中で、リンパ球がアポトーシスを起こしている集団であることを同定した。形態的な観点から言えば、リンパ球は単球より小さく、また丸い核を有し、細胞原形質が少ない。さらに、リンパ球は単球の特徴である弛緩したクロマチン又は馬蹄形をした核を呈さない（Ｊｕｎｑｕｅｉｒａ ＬＣ及びＣａｒｎｅｉｒｏ Ｊ（２００５）Ｂａｓｉｃ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ、第６版、Ｍａｓｓｏｎ編、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）。
【００３８】
（例３）
クローン病患者由来の腸固有層単核細胞においてＡＰＬペプチドによって誘導される細胞死機序の同定。
文書同意が得られたら、炎症部分に相当する腸組織由来の試料を採取した。試料を、マグネシウム及びカルシウムを含まない冷ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で維持した。Ｂｕｌｌ及びＢｏｏｋｍａｎによって記されているジチオスレイトール／エチレンジアミン四酢酸／コラーゲン分解酵素法（Ｂｕｌｌ ＤＭＫ及びＢｏｏｋｍａｎ ＭＡ（１９７７）ヒト腸管粘膜リンパ性細胞の単離及び機能的な特徴づけ（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ５９：９６６〜９７４頁）に、Ｖａｎ Ｔｏｌ及び同僚によって行われた修正（Ｖａｎ Ｔｏｌ ＥＡら（１９９２）ＣＤ５６細胞接着分子は、腸固有層由来の非主要組織適合複合体拘束性細胞毒性単核細胞を検出するための主要な決定因子である（Ｔｈｅ ＣＤ５６ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｎｏｎ−ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ）、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２２：２３〜２９頁）を加えて使用し、これらの組織から粘膜固有層単核細胞を単離した。
【００３９】
クローン病患者由来の粘膜固有層単核細胞（１０×１０６個細胞）を、ＡＰＬペプチド（配列番号１）（４０μｇ／ｍＬ）を含む場合と含まない場合とで７２時間培養した。ＴＥＭで行った分析から、ＡＰＬペプチドで処理した細胞において、クロマチンの核周辺への移動（ＣＭＣ）、核断片化（ＮＦ）及びアポトーシス小体（ＡＢ）等、この型の細胞死に特徴的ないくつかの形態が観察できるように、このペプチドがこの集団の大部分にアポトーシスによる死を誘導することが明らかになった（Ｃ〜Ｅ）（図３）。無処理の細胞は、正常な形態（Ａ〜Ｂ）を有している。
【００４０】
（例４）
抗ＣＤ３抗体で活性化した後の、不活性クローン病患者由来の末梢血単核細胞の生存率の減少。
不活性クローン病患者由来の末梢血単核細胞を、抗ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて５％ＣＯ２の湿った雰囲気中で、３７℃で７２時間活性化した。抗ＣＤ３抗体の添加により、この細胞集団中のＴ細胞にポリクローナル活性化がもたらされる。活性化したリンパ球を、１×ＰＢＳ溶液で洗浄し、続いて１×１０５個細胞を異なる濃度（１０、４０、１６０μｇ／ｍＬ）のＡＰＬペプチド（配列番号１）と一緒に１時間インキュベーションした。抗ＣＤ３抗体無しに７２時間培養した末梢血単核細胞を、活性化アッセイの対照（非活性化細胞）として使用した。その後、これら活性化していない細胞を同濃度のＡＰＬペプチドと一緒に培養した。
【００４１】
例１で説明したように細胞生存率をＭＴＴ法を使用して測定した。図４Ａに観察できる通り、ＡＰＬペプチドは不活性クローン病患者由来の単核細胞の生存率を減少させない。しかし、このペプチドは、抗ＣＤ３抗体を用いてあらかじめ活性化したこれら細胞（Ｂ）の生存率を著しく減少させた。この結果と例１及び例２において示される結果、つまりこのペプチドは健常なドナー由来の単核細胞の生存率に影響を及ぼさない（例１）、及び活動性クローン病患者由来の単核細胞の主要な集団としてアポトーシスを起こしているリンパ球が同定される（例２）という結果と合わせるとこのＡＰＬペプチド（配列番号１）が高い特異性を持って病原性活性化Ｔ細胞にアポトーシスを誘導できるということが示唆される。
【００４２】
（例５）
１型真正糖尿病患者由来の末梢血単核細胞の生存率に対するＡＰＬペプチドの効果の評価。
例１で記載したように、１型真正糖尿病患者由来の末梢血単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳに重層し遠心分離することにより単離した。評価のために、１０×１０６個細胞をＡＰＬペプチド（４０μｇ／ｍＬ）で７２時間処理した。無処理の細胞を、このアッセイの対照として使用した。図５に示す通り、このペプチドで処理した細胞は、（例２において）前述したアポトーシス途中の細胞の形態を有している（パネルＣ〜Ｄ）。一方で、無処理の細胞（パネルＡ、Ｂ）は、正常な形態を有している。この結果は、このＡＰＬペプチドが１型真正糖尿病患者由来の単核細胞にアポトーシスを誘導することを実証している。
【００４３】
（例６）
ルイスラットにおけるＡＰＬペプチド（配列番号１として識別される）の体内分布試験。
ＡＰＬペプチド（配列番号１として識別される）を同位体Ｉ１２５で標識し、これを静脈経路及び皮内経路によって０．２５ｍｇ及び１ｍｇ／体重１ｋｇの用量でルイスラットに投与した。ペプチドを接種して４時間後及び２４時間後に、各実験群から６匹の動物を屠殺した。異なる器官で放射能レベルを測定した。結果を、放射能用量パーセント／組織１ｇで表している。
【００４４】
この試験から、このペプチドが消化管（胃、小腸及び大腸）へと体内分布され、その生物学的機序を発揮するのに必要な時間これらの器官にとどまっていることが示された。この結果は、クローン病及び潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患を治療するためのこのペプチドの使用を支持している。さらに、消化管は末梢寛容性の誘導に優れた部位であるので、このペプチドを１型真正糖尿病のような他の自己免疫性疾患の治療に対して適用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬分野、特に、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎等）及び１型糖尿病を治療するためのＡＰＬペプチド（改変型ペプチドリガンド、略語ＡＰＬ）又はその類似体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
クローン病や潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患は、常在菌に対する強力なエフェクター機能を有する腸固有層Ｔ細胞が活性化されることに起因している。しかし、これらリンパ球を慢性的に活性化する正確な機序は、いまだ明らかでない（Ｂａｌｆｏｕｒ Ｒ（２００６）疾患の機序：クローン病及び潰瘍性大腸炎の発病学（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ：ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）、Ｎａｔｕｒｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ＆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３（７）：３９０〜４０７頁）。
【０００３】
消化管には約２×１０４個の細菌が存在しており、この免疫学的圧力は免疫系に対する驚くべき難題を意味している。免疫系は、病原性微生物に対する適切な応答性と無害な微生物に対する寛容性の間でバランスを取らなければならない。粘膜免疫系は、アポトーシスによって活性化Ｔ細胞を減少させる等、不必要で制御の効かない炎症応答を回避するためのいくつかの機序を有している（Ｐｅｐｐｅｌｅｎｂｏｓｃｈ ＭＰ及びｖａｎ Ｄｅｖｅｎｔｅｒ ＳＪＨ（２００４）Ｔ細胞のアポトーシス及び炎症性腸疾患（Ｔ ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｇｕｔ ５３：１５５６〜１５５８頁）。
【０００４】
標準状態の免疫系は、エフェクターＴ細胞の応答を刺激することなく、速やかに侵襲性腸内細菌の感染を除去し、先天性免疫応答を下方制御し、傷ついた粘膜を治癒する。対照的に、遺伝的に感受性の高い宿主の免疫系は、適切な先天性応答を開始すること及び／又は共生微生物因子に対する寛容原性免疫応答を起こすことができず、その後に共生細菌に対する病原性Ｔ細胞の応答を活性化し慢性腸炎へと進行する（Ｐｏｄｏｌｓｋｙ ＤＫ（２００２）炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３４７：４１７〜２９頁）。
【０００５】
すなわち、炎症性腸疾患は、急性腸内感染等の環境刺激によって起こる炎症過程を適切に制御する機序の障害に起因している。Ｔ細胞のアポトーシスに対する抵抗性、下方制御シグナルに対する応答の欠如並びに管腔抗原及び免疫増強剤への継続的な曝露によって、この炎症応答は維持される（Ｍｕｄｔｅｒ Ｊ及びＮｅｕｒａｔｈ ＭＦ（２００７）Ｔ細胞のアポトーシス及び炎症性腸疾患の制御：治療との関連（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ：ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｇｕｔ ５６：２９３〜３０３頁）。
【０００６】
クローン病は、マクロファージ、好中球及びＴ細胞の腸への動員の亢進によって特徴づけられ、これらは共刺激性接着分子及びＴＨ１（ヘルパーＴ細胞１、略語ＴＨ１）に関連する炎症誘発性サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ）−６（ＩＬ−６）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α））の発現量の増加、並びにＴＨ１７（ヘルパーＴ細胞１７、略語ＴＨ１７）の細胞応答（ＩＬ−１２、Ｉ−２３及びＩＬ−２７等）をもたらす（Ｂａｌｆｏｕｒ Ｒ（２００６）疾患の機序：クローン病及び潰瘍性大腸炎の病因（Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅ：ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）、Ｎａｔｕｒｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ＆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ３（７）：３９０〜４０７頁）。
【０００７】
腸内の炎症細胞数を、細胞の動員、増殖、及び壊死又はアポトーシスによる細胞死によって測定する。正常な腸粘膜由来の粘膜固有層Ｔ細胞は、活性化誘発性の細胞死（Ｆａｓ／ＦａｓＬ系による）を受けやすく、これによってリンパ球の増殖を制御することができる（Ｂｕ Ｐら（２００１）アポトーシス：腸粘膜免疫系の不応答性を維持する機序の１つ（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｈａｔ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６：６３９９〜６４０３頁）。しかし、データはクローン病患者の粘膜固有層Ｔ細胞がアポトーシスに抵抗性であることを示しており、この抵抗性は、疾患の永続化及び炎症の慢性化の一因となる恐れがある活性型エフェクターＴＨ１細胞の集団の増殖をもたらす可能性がある（Ｂｏｉｒｉｖａｎｔ Ｍら（１９９９）クローン病及び他の胃腸炎における粘膜固有層Ｔ細胞は、ＣＤ２経路誘導性アポトーシス障害を示す（Ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｓｈｏｗ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ＣＤ２ ｐａｔｈｒｏｕｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１６：５５７〜５６５頁）。
【０００８】
クローン病患者の粘膜Ｔ細胞におけるアポトーシス障害は、Ｂｃｌ−２のような抗アポトーシス分子とＢａｘのようなアポトーシス促進分子の比率の不均衡に起因しており、この不均衡がこれら細胞の生存を長びかせ、アポトーシスシグナルの抵抗性をもたらす（Ｉｎａ Ｋら（１９９９）複数のアポトーシスシグナルについてのクローン病Ｔ細胞の抵抗性は、粘膜Ｂｃｌ２／Ｂａｘの不均衡と関連している（Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｂｃｌ２／Ｂａｘ ｍｕｃｏｓａｌ ｉｍｂａｌａｎｃｅ）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６３：１０８１〜９０頁；Ｉｔｏｈ Ｊら（２００１）粘膜Ｔ細胞によるＢａｘ発現量の減少は、クローン病におけるアポトーシス抵抗性に有利に作用する（Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ Ｂａｘ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｍｕｃｏｓａｌ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆａｖｏｕｒｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｇｕｔ ４９：３５〜４１頁）。一方で、Ｓｔｕｒｍ及び同僚は、クローン病、潰瘍性大腸炎の患者及び健常対照に由来する粘膜Ｔ細胞の細胞周期特性を調べた。クローン病患者の粘膜Ｔ細胞は、潰瘍性大腸炎患者又は健常対照の粘膜細胞と比較して、おそらく活性化依存的アポトーシスの異常の結果として周期が速く進むので、著しく高い細胞増殖能を有していることが明らかになった。これらのことから、クローン病患者の粘膜が反応亢進状態を示すＴ細胞を過剰に含み、また共生細菌に対する寛容性を失っている理由を説明できる可能性がある（Ｓｔｕｒｍ Ａら（２００４）異なる細胞周期速度は、クローン病及び潰瘍性大腸炎の粘膜Ｔ細胞の異なる機能的能力に基づいている（Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ ｔｈｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｍｕｃｏｓａｌ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｕｌｃｅｒａｔｉｖｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）、Ｇｕｔ ５３：１６２４〜１６３１頁）。
【０００９】
これらの実験的証拠は、クローン病は、細胞増殖事象がアポトーシスによる死に勝ることにより、この疾患原因における重要な因子である可能性がある、炎症部位への反応性Ｔ細胞の蓄積をもたらす疾患であるという事実を支持している。この意味において、この疾患の治療に使用される最も強力な生物学的製剤は、単球及びＴ細胞においてアポトーシスを誘導する製剤、例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−１２又はＩＬ−６受容体に対する抗体であると思われる（Ｌｕｇｅｒｉｎｇら（２００１）インフリキシマブは、カスパーゼ依存的経路に対する活性を使用して慢性クローン病患者由来の単球にアポトーシスを誘導する。（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｉｔ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｏ ｃａｓｐａｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｒｏｕｔｅ）、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２１：１１４５〜５７頁）、（Ｓｔａｌｌｍａｃｈら（２００４）インターロイキン１２ ｐ４０−ＩｇＧ２ｂ融合タンパク質はＴ細胞に媒介される炎症を抑制する：クローン病及び生きた実験的大腸炎における消炎作用（Ａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１２ ｐ４０−ＩｇＧ２ｂ ｃｏａｌｉｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｂｒｏｇａｔｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ａｌｉｖｅ）、Ｇｕｔ ５３：３３９〜４５頁）、（Ａｔｒｅｙａ Ｒら（２０００）インターロイキン６トランスシグナル遮断薬は、慢性腸炎におけるアポトーシスに対するＴ細胞の抵抗性を抑制する：クローン病及び生きた実験的大腸炎における証拠（Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６ ｔｒａｎｓ−ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｉｎ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ａｌｉｖｅ）、Ｎａｔ Ｍｅｄ ６：５８３〜５８８頁）。特に、ＴＮＦαに対する抗体は、ステロイド無反応性クローン病患者に長期的な寛解を誘導するのに重要な選択肢である。
【００１０】
インフリキシマブは、大きな親和性と特異性によって遊離のＴＮＦα及び結合したＴＮＦαの両方に結合してその効果を中和するマウス可変領域とヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）分子の定常領域を含むキメラモノクローナル抗体（ＡｃＭ）である（Ｋｎｉｇｈｔ ＤＭＫら（１９９３）マウス−ヒトキメラ抗ＴＮＦ抗体の構築及び最初の特徴づけ（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｏｕｓｅ−ｈｕｍａｎ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉ−ＴＮＦ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０：１４４３〜１４５３頁）。
【００１１】
エタネルセプトは、ヒト腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）の可溶性部位をヒトＩｇＧ１のＦｃ部位に融合させた単量体鎖を２本含む組み換えタンパク質である（Ｍｏｈｌｅｒ ＫＭら（１９９３）可溶性腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体は、致死的な内毒血症の有効な治療薬であり、ＴＮＦ運搬体及びＴＮＦ拮抗薬として同時に機能する（Ｓｏｌｕｂｌｅ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ （ＴＮＦ） ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｉｎ ｌｅｔｈａｌ ｅｎｄｏｔｏｘｅｍｉａ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ａｓ ｂｏｔｈ ＴＮＦ ｃａｒｒｉｅｒｓ ａｎｄ ＴＮＦ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ）、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５１：１５４８〜１５６１頁）。この分子は、関節リウマチ（ＲＡ）等、別の炎症性疾患の治療における利用が奏功している（Ｍｏｒｅｌａｎｄ ＬＷら（１９９９）関節リウマチにおけるエタネルセプト治療、無作為及び対照臨床試験へ（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｔｏ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ）、Ａｎｎ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ １３０：４７８〜４８６頁）。しかしインフリキシマブに反して、エタネルセプトはクローン病において臨床的な有益性を示さない。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒａｎｄｅと同僚は、クローン病の治療における両薬剤の効果の差が、単球及び活性化した粘膜固有層Ｔ細胞のアポトーシスを誘導するインフリキシマブの能力に起因することを実証した（Ｖａｎ ｄｅ Ｂｒａｎｄｅ ＪＭＨら（２００３）インフリキシマブは、クローン病患者由来の粘膜固有層Ｔリンパ球のアポトーシスを誘導するが、エタネルセプトは誘導しない（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ ｂｕｔ ｎｏｔ Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２４：１７７４〜１７８５頁）。エタネルセプトは、アポトーシス促進効果によってクローン病に有効であると示唆されてきたインフリキシマブのようなアポトーシスを誘導しない。
【００１２】
インフリキシマブ及びＴ細胞にアポトーシスを誘導する他の薬剤を使用して治療したクローン病患者で得た臨床結果は、粘膜のＴ細胞区画においてアポトーシスが回復することがクローン病の成功治療の重要な因子になる可能性を示唆している。
【００１３】
これまでに、インフリキシマブはクローン病患者の治療用として最も成功した治療法である。この治療法は、潰瘍性大腸炎患者においても有望な結果を伴って利用されている。しかし、この治療法を使用すると広範囲にわたって免疫抑制が起こるためこれらの患者において結核及びマイコプラズマ病のような疾患の発病率を増加させる等、一群の副作用が生じる（Ｋｏｏｌｏｏｓ ＷＭ．（２００７）関節リウマチ及びクローン病の抗ＴＮＦ治療における薬理遺伝学の潜在的役割（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ ａｎｔｉ−ＴＮＦ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ １２：１２５〜３１頁）。従って、現在の主要な課題は特異性を有し、広範囲にわたる免疫抑制を引き起こすことなく病原性細胞を排除できる治療戦略を開発することである。
【００１４】
この目的のために、この１年、免疫応答を抑制するのでなくそれを調節することを意図して抗原特異的戦略が応用されてきた。この意味で、末梢寛容性機序を誘導するために、このような条件で天然自己抗原又はＡＰＬペプチドが使用され投与されてきた（Ｐｒａｋｋｅｎ Ｂら（２００４）エピトープ特異的免疫療法は、ＲＡにおける炎症誘発性Ｔ細胞の免疫偏向を誘導する（Ｅｐｉｔｏｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＲＡ）、ＰＮＡＳ １２（１０１）：４２２８〜３３頁；Ｂｅｎ−Ｄａｖｉｄ Ｈら（２００５）二重改変ペプチドリガンドによるＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性事象を介した筋無力症誘起性Ｔ細胞応答の下方制御は、アポトーシスを引き起こす（Ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙａｓｔｈｅｎｏｇｅｎｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ｔｏ ｄｕａｌ ａｌｔｅｒｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄ ｖｉａ ＣＤ４＋ＣＤ２５＋−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｅｖｅｎｔｓ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）、ＰＮＡＳ １０２（６）：２０２８〜３３頁；Ｐａａｓ−Ｒｏｚｎｅｒ Ｍら（２００１）異なる経路によって投与された二重改変ペプチドリガンドによる実験的自己免疫重症筋無力症に関連する応答の能動的抑制の性質（Ｔｈｅ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ ｂｙ ａ ｄｕａｌ ａｌｔｅｒｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄ ａｄｍｉｎｉｓｔｒｅｒｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｏｕｔｅｓ）、ＰＮＡＳ ９８（２２）：１２６４２〜７頁）。
【００１５】
ＡＰＬは、Ｔ細胞受容体又は主要組織適合複合体との接触に不可欠な位置に１つ又は複数の置換を有し、Ｔ細胞が完全に活性化するために必要な事象のカスケードを妨害又は改変する免疫原性ペプチドの類似体である（Ｂｉｅｌｅｋｏｖａ Ｂ及びＭａｒｔｉｎ Ｒ（２００１）改変ペプチドリガンドを介した抗原特異的免疫調節（Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｖｉａ ａｌｔｅｒｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｇａｎｄｓ）、Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７９：５５２〜６５頁）。ペプチドリガンドの固有の特性を実験的に操作する能力により、免疫細胞応答の性質、経過及び力を適当に変えることができる。国際特許出願公開第２００６／０３２２１６号において、６０ｋＤａのヒト熱ショックタンパク質（略語Ｈｓｐ６０）に由来するＡＰＬペプチド、及びＲＡを治療するためのこれらペプチドの製剤の使用が特許請求されている。１型真正糖尿病は、インスリンを産生する膵臓のβ細胞を破壊するＴ細胞によって媒介される自己免疫器官特異的疾患であり、糖代謝の調節解除を引き起こす（Ｂｒｏｗｎ Ｌ及びＥｉｓｅｎｂａｒｔｈ ＧＳ（１９９０）１型糖尿病：ヒト、マウス及びラットの慢性自己免疫疾患（Ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ：Ａ ｃｈｒｏｎｉｃ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ， ｍｏｕｓｅ， ａｎｄ ｒａｔ）、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：６４７〜７９頁）。この疾患の臨床症状は、免疫系が８０〜９０％近くの膵臓細胞を不活性化した後に現れる。現在の治療法は、インスリンの体内生産を維持するために膵細胞に永久的な損傷が起こる前に、自己免疫過程を止めるための安全で、特異的で有効な方法を発見することを目的としている。寛容性の誘導は、１型糖尿病の治療にまで拡大した概念である。Ｉｒｕｎ Ｃｏｈｅｎ及び同僚は、この疾患を診断及び治療するためのヒトＨｓｐ６０ペプチドの使用を保護している（米国特許第６，６８２，８９７号）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、前述した問題を解決し、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎等）及び１型真正糖尿病を治療するための新規な治療選択肢を提供する。本発明の本質は、炎症性腸疾患及び１型真正糖尿病を治療するための医薬組成物を製造するための、ヒトＨｓｐ６０に由来する免疫調節因子ＡＰＬペプチド又はその類似体の使用である。配列がＳＩＤＬＫＤＫＹＫＮＩＧＡＫＬＶＱＬＶＡＮＮＴＮＥＥＡであるこのペプチドを、配列番号１として配列表中で識別する。
【００１７】
このペプチドは、クローン病患者の活性化された腸固有層及び末梢血Ｔ細胞のアポトーシス誘導を促進することにより、ＴＮＦα抗体の使用に伴って起こるような非特異的免疫抑制を引き起こすことなく、この疾患の発病機序に関与するＴ細胞クローンの阻害をもたらす。炎症性腸疾患を治療するための、この免疫調節因子ＡＰＬペプチド又はその類似体の使用は、この疾患に特徴的な炎症過程に寄与しているＴ細胞クローンを中和することを対象としている。
【００１８】
本発明の製剤は、病原性活性型Ｔ細胞を中和するためのその高い特異性によって特徴づけられる。この製剤は結核やマイコプラズマ病を引き起こす日和見感染のような副作用を最小限に抑え、この事実はこの製剤の安全性に著しく寄与している。日和見感染は、インフリキシマブのような薬剤の使用又はメトトレキセートの使用に起因するリンパ腫等の腫瘍過程の発症によって起こる広範囲にわたる免疫抑制と関連している。
【００１９】
炎症性腸疾患を治療するための薬剤の製造における前述の免疫調節因子ペプチドの使用には、それを非経口的経路（例えば、皮内、皮下、静脈等）によって投与することとは、その活性成分は主に消化管（胃、小腸及び大腸）へと体内分布される利点もある。また、このペプチドは必要な時間これらの器官に滞留し、その生物学的機序を発揮する。前述したように、腸疾患では消化管内で常在菌に対するエフェクターＴ細胞の制御の効かない活性化が起こっている。このペプチドの体内分布及び病原性管腔Ｔ細胞のアポトーシス誘導能が、クローン病及び潰瘍性大腸炎の治療にこのＡＰＬペプチドを使用することの合理性を正当化している。本発明の製剤の使用は、１型糖尿病のような寛解−再発症状によって特徴づけられる他の炎症性疾患にまで広げることができ、それら疾患においても自己反応性Ｔ細胞が重要な役割を担っている。
【００２０】
配列表中で配列番号１として識別されるＡＰＬは、国際特許出願公開第２００６／０３２２１６号においてＲＡを治療するためのペプチド製剤の使用について特許請求されている。しかしこの特許出願は、このペプチドが炎症性腸疾患及び１型真正糖尿病の治療に使用され得るということを特許請求も示唆もしていない。
【００２１】
炎症性腸疾患は自己免疫性疾患とみなされていない。なぜなら自己抗原に対する免疫応答がその炎症の開始及び維持に関与しておらず、少なくとも現在まで必然的に関連がある自己抗原は知られていないからであり、この点が自己免疫性疾患とは対照的である。これら疾患の原因は、常在菌の存在及び共生生物に対する免疫応答に依存している。この事実を支持する実験的証拠の１つは、無菌条件下では腸管内菌叢が再構成されない限り実験的ＩＢＤ疾患（炎症性腸疾患）が誘導され得ないことである（Ｃｈａｎｄｒａｎら（２００３）炎症性腸疾患：ＧＡＬＴ及び腸管内細菌叢の機能不全（ＩＩ）（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ：ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＡＬＴ ａｎｄ ｇｕｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｌｏｒａ（ＩＩ））、Ｓｕｒｇｅｏｎ １：１２５〜１３６頁；Ｓｔｒｏｂｅｒら（２００２）炎症の粘膜モデルの免疫学（Ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｍｕｃｏｓａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０：４９５〜５４９頁）。従っておそらく、細菌抗原がこの疾患の誘導を引き起こすものと予想される。
【００２２】
米国特許第６，６８２，８９７号において、Ｉｒｕｎ Ｃｏｈｅｎ及び同僚は、１型糖尿病を診断及び治療するためのヒトＨｓｐ６０ペプチドの使用を公開した。配列番号１として識別される配列はその特許に含まれておらず、配列番号１のペプチドに類似の生物学的活性も考慮されていない。これらの著者とは異なり、本発明者らは、この病状の発生に関与する病原性Ｔ細胞にアポトーシスを誘導するための配列番号１のペプチド（ヒトＨｓｐ６０由来ＡＰＬペプチド）の使用を本発明において開示する。
【００２３】
本発明の例によって、配列番号１のペプチドの特性が初めて明らかになった。その特性は、消化管へのペプチドの体内分布、並びにクローン病、潰瘍性大腸炎及び１型糖尿病を治療するためのこのペプチドの使用を可能にする病原性Ｔ細胞クローンのアポトーシスを誘導するそのペプチドの能力と関連している。当業者は、国際特許出願公開第２００６／０３２２１６号において提供される要素に基づいて本発明で特許請求されているこのペプチドの新規な使用を予測することはできなかった。
【００２４】
配列番号１として識別される配列のペプチド又はその類似体は、常法のペプチド合成法によって作製することができ、後で示す例に記載されているような実験において誘導される免疫応答のレベル及び特性によって評価することができる。
【００２５】
本発明の状況において、類似体という用語は、記載された配列（配列番号１）に１個又は複数個の変異を含むが、その記載されたペプチドと同じ生物学的活性を保持しているＡＰＬペプチドを指す。この修飾は、１つのアミノ酸の置換、欠失又は挿入（好ましくは置換）であることができる。この類似体は、記載されたペプチドのうち好ましくは９個未満の修飾、より好ましくは６個未満の修飾、さらに好ましくは２個未満の修飾を含むことができる。
【００２６】
配列番号１として識別されるヒトＨｓｐ６０由来のＡＰＬペプチド又はその類似体を含む、炎症性腸疾患及び１型糖尿病を治療するための医薬組成物も本発明の目的である。本発明の医薬組成物中のペプチドの量は、宿主において有効な免疫応答をもたらす量である。その有効量は、クローン病の炎症兆候を著しく減少させこれら疾患の経過に特徴的な消化管の炎症性病巣を消滅させる、Ｔ細胞のアポトーシスを誘導する投与量である。治療過程で患者に投与されるこの医薬組成物の量は、一般に年齢、性別、全体的な健康、及び免疫応答レベルのような特定の要因によって変化する可能性がある。
【００２７】
本発明は、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎等）及び１型糖尿病の治療方法にも関する。その方法は、配列番号１として識別されるペプチド又はその類似体を含む有効量の医薬組成物を患者に投与することを含む。本発明によれば、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎等）及び１型糖尿病の治療過程でこの医薬組成物は非経口的又は粘膜経路で投与される。本発明によれば、この医薬組成物は、皮内経路、皮下経路、筋肉内経路及び静脈経路を含む群から選択される非経口的経路によって投与される。他の実施形態では、この医薬組成物は、直腸経路及び経口経路を含む群から選択される粘膜経路によって投与される。これらの疾患の性質から、このＡＰＬペプチド又はその類似体は、浣腸として、又は経口経路で投与するのに適した医薬品形態として投与される製剤の一部であることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】活動性クローン病患者（Ａ）及び健常なドナー（Ｂ）由来の末梢血単核細胞の生存率に対する配列番号１のペプチドの効果を表す図である。異なる文字は、陰性対照（０μｇ／ｍＬ）とこの群中で評価した各用量のペプチドとの間の統計的有意差を示している。
【図２】クローン病患者由来の末梢血単核細胞において配列番号１のペプチドによって誘導されるアポトーシスを実証するための透過型電子顕微鏡の図である。パネルＡ、Ｂ：無処理の細胞（陰性対照）。パネルＣ〜Ｈ：配列番号１のペプチド（４０μｇ／ｍＬ）を用いて処理した細胞。大量の空胞形成（ＡＶ）；核断片化（ＮＦ）；クロマチンの核周囲への凝縮及び移動（ＣＭＣ）；完全な細胞質オルガネラ（ＩＣＯ）；アポトーシス小体（ＡＢ）；アポトーシス小体の貪食（Ｐ ＡＢ）。
【図３】クローン病患者の腸固有層由来の単核細胞において配列番号１のペプチドによって誘導されるアポトーシスを実証するための透過型電子顕微鏡の図である。パネルＡ、Ｂ：無処理の細胞（陰性対照）。パネルＣ、Ｄ：配列番号１のペプチド（４０μｇ／ｍＬ）を用いて処理した細胞。核断片化（ＮＦ）；クロマチンの核周囲への凝縮及び移動（ＣＭＣ）；アポトーシス小体（ＡＢ）。
【図４】非活動性クローン病患者由来の単核細胞の生存率に対する配列番号１のペプチドの効果を表す図である。Ｘ軸において、Ａ：抗ＣＤ３抗体を用いて活性化していない細胞、Ｂ：抗ＣＤ３抗体を用いて活性化した細胞。異なる文字は、陰性対照（０μｇ／ｍＬ）とこの群中で評価した各用量のペプチドとの間の統計的有意差を示している。
【図５】１型真正糖尿病患者由来の末梢血単核細胞において配列番号１のペプチドによって誘導されるアポトーシスを実証するための透過型電子顕微鏡の図である。パネルＡ、Ｂ：無処理の細胞（陰性対照）。パネルＣ、Ｄ：配列番号１のペプチド（４０μｇ／ｍＬ）を用いて処理した細胞。核断片化（ＮＦ）；クロマチンの核周囲への凝縮及び移動（ＣＭＣ）；アポトーシス小体（ＡＢ）；アポトーシス小体の貪食（Ｐ ＡＢ）。
【図６Ａ】ルイスラット（Ｌｅｗｉｓ Ｒａｔ）における配列番号１のペプチドの体内分布試験の図である。静脈経路０．２５ｍｇ／体重１ｋｇ。分析した組織は：１．肝臓；２．脾臓；３．腎臓；４．心臓；５．肺；６．頸神経節；７．腋窩上腕神経節；８．腸間膜幹神経節；９．骨盤神経節；１０．甲状腺；１１．胃；１２．小腸；１３．大腸である。
【図６Ｂ】ルイスラット（Ｌｅｗｉｓ Ｒａｔ）における配列番号１のペプチドの体内分布試験の図である。静脈経路１ｍｇ／体重１ｋｇ。分析した組織は、１．肝臓；２．脾臓；３．腎臓；４．心臓；５．肺；６．頸神経節；７．腋窩上腕神経節；８．腸間膜幹神経節；９．骨盤神経節；１０．甲状腺；１１．胃；１２．小腸；１３．大腸である。
【図６Ｃ】ルイスラット（Ｌｅｗｉｓ Ｒａｔ）における配列番号１のペプチドの体内分布試験の図である。皮内経路０．２５ｍｇ／体重１ｋｇ。分析した組織は、１．肝臓；２．脾臓；３．腎臓；４．心臓；５．肺；６．頸神経節；７．腋窩上腕神経節；８．腸間膜幹神経節；９．骨盤神経節；１０．甲状腺；１１．胃；１２．小腸；１３．大腸である。
【図６Ｄ】ルイスラット（Ｌｅｗｉｓ Ｒａｔ）における配列番号１のペプチドの体内分布試験の図である。皮内経路１ｍｇ／体重１ｋｇ。分析した組織は、１．肝臓；２．脾臓；３．腎臓；４．心臓；５．肺；６．頸神経節；７．腋窩上腕神経節；８．腸間膜幹神経節；９．骨盤神経節；１０．甲状腺；１１．胃；１２．小腸；１３．大腸である。
【実施例】
【００２９】
（例１）
活動性クローン病患者及び健常なドナー由来の末梢血単核細胞の生存率に対するＡＰＬペプチドの効果。
クローン病患者及び健常なドナー由来の血液を静脈穿刺によって抽出し、抗凝固剤溶液（クエン酸ナトリウム１２３ｍＭ、リン酸一ナトリウム１８．５ｍＭ、クエン酸１７ｍＭ、ブドウ糖１４１．５ｍＭ）を含む無菌チューブに採取した。各患者由来の血液を１×リン酸緩衝生理食塩水溶液（略語１×ＰＢＳ）で１：２に希釈し、１５ｍＬの遠心分離チューブ中で５ｍＬのこの希釈液を３ｍＬのＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ、Ｓｗｅｄｅｎ）に添加し、１２００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。単核細胞に相当する環を抽出した。その後、この細胞を１５ｍＬの１×ＰＢＳで２回洗浄し、各洗浄の後にそれらを９００ｒｐｍで遠心分離した。最後に、この細胞ペレットを１０％のウシ胎児血清を含み、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、ＨＥＰＥＳ ２５ｍＭ／Ｌ、Ｌ−グルタミン２ｍＭ（全てＧｉｂｃｏ ＢＲＬから入手した）を補充したＲＰＭＩ１６４０に懸濁した。希釈した細胞懸濁液由来の細胞（補充したＲＰＭＩで１：２０に希釈し、トリパンブルー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で１：２に希釈）を、ノイバウエル（Ｎｅｕｂａｕｅｒ）血球計算板を使用して計数した。
【００３０】
単核細胞を、平底９６穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳＡ）に１００μＬの最終容量で１０５個細胞／ウェルの密度で播種し、異なる濃度のＡＰＬペプチド（配列番号１）（１０、４０、１６０μｇ／ｍＬ）と一緒に３個組で７２時間処理した。無処理の細胞を、基礎増殖の対照として使用した。
【００３１】
細胞生存率に対するＡＰＬペプチドの効果を、３−（４，５−ジメチルジアゾール−２−イル）−２，５ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）法を使用して、供給元によって記載された手順に従って測定した。ＭＴＴは、代謝的に活性な細胞中に見られるミトコンドリア脱水素酵素によって組織培養培地に不溶のホルマザン生成物へと還元される。５６２ｎｍの吸光度によって測定されるホルマザン生成物の量は、培養液中の生細胞数に正比例する。５％ＣＯ２の湿潤雰囲気下、３７℃で７２時間細胞を培養した後、２０μＬのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。次に、プレートを、等しい培養条件で４時間インキュベーションした。その後、１００μＬの２−ブタノール溶液（２０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、５０％の２−ブタノール、５ｍＬの２Ｎ塩酸）を添加し、穏やかにピペッティングして各ウェルを均質化した。その後、ホルマザン生成物を完全に溶解するために、プレートを３７℃で３０分間連続的に撹拌し続けた。最後に、９６穴プレートリーダーを使用して５６２ｎｍの吸光度を記録した。
【００３２】
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅプログラムを使用して統計解析した。そのデータを、平均値±標準誤差（ＳＥ）として表示した。統計的検定にクラスカル−ウォリス検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ）を使用した。これは多重比較用のノンパラメトリック検定法である。次に、ダン検定（Ｄｕｎｎ ｔｅｓｔ）を使用して、統計的に差異のある培地の群を特定した。ｐ＜０．０５の値を有意であるとみなした。
【００３３】
図１に示すように、ＡＰＬペプチド処理は、全てのペプチド投与量において活動性クローン病患者由来の末梢血単核細胞の生存率を無処理の細胞と比較して有意に減少させる（ｐ＜０．００１）。しかし、このペプチドを用いた処理は、健常なドナー由来の単核細胞の生存率には影響を及ぼさない（この実験で評価したＡＰＬペプチドのどの用量においても及ぼさない）。この結果は、クローン病患者の細胞においてこのペプチドによって誘導される細胞死機序に特異性があることを示唆している。これらの結果は、５人の活動性クローン病患者及び５人の健常なドナーを代表している。
【００３４】
（例２）
クローン病患者由来の末梢血単核細胞においてＡＰＬペプチドが誘導する細胞死機序の透過型電子顕微鏡による同定。
活動性クローン病患者由来の末梢血単核細胞においてＡＰＬペプチド（本発明において配列番号１と識別される）によって誘導される細胞死機序が、アポトーシスによって媒介されるかどうか同定するために、この試料を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で分析した。この技術によって、アポトーシスの発生の異論のない判定基準となるアポトーシス細胞の形態的特徴を可視化することが可能になる。これらの特徴は以下の通りである：高電子密度の核（初期のクロマチンの核周囲移動）、核断片化、無秩序で完全な細胞質オルガネラ、大きくて識別可能な空胞、細胞表面の変化及びアポトーシス小体への細胞の崩壊。隣接した細胞によるアポトーシス小体の貪食過程も、この技術で観察することができる（Ｗｈｉｔｅ Ｍら（２００４）電子顕微鏡に基づいてアポトーシスを検出するための形態学的手法（Ａ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２８５：１０５〜１１頁）。
【００３５】
クローン病患者の末梢血から単離した単核細胞（１０×１０６個細胞）を、濃度４０μｇ／ｍＬのＡＰＬペプチドを含む場合と含まない場合とで７２時間培養した。無処理の細胞を、このアッセイの対照として使用した。７２時間インキュベーションした後、この試料を０．１Ｍリン酸緩衝液中の１％のグルタルアルデヒド溶液及び４％のパラホルムアルデヒドを使用して１時間固定した。次に、この細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、２％の四酸化オスミウム溶液を使用して１時間処理した。その後、細胞を０．１Ｍのカコジル酸緩衝液を用いて２回洗浄し、アルコールの濃度を増加させながら（３０〜１００％）その試料を脱水した。続いて、エポキシ樹脂Ｓｐｕｒｒを使用してこの細胞に浸透させ（Ｓｐｕｒｒ ＡＲ（１９６９）電子顕微鏡用低粘性エポキシ樹脂包埋剤（Ａ ｌｏｗ−ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ ｅｐｏｘｙ ｒｅｓｉｎ ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、Ｊ Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔ Ｈｅａｄ ２６（１）：３１〜４３頁）、７０℃で２４時間重合させた。この超微細切片（４０ｎｍ）を、ウルトラミクロトーム（Ｎｏｖａ、ＬＫＢ）を使用して切り、ニッケルグリルに封入した。その後、これらの試料をメタノールに過飽和させたウラニル酢酸溶液を用いて５分間染色した。Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＪＥＯＬ／ＪＥＭ ２０００ ＥＸ（ＪＥＯＬ、日本）で分析を行った。
【００３６】
ＴＥＭによって得た活動性クローン病患者由来の単核細胞の結果を図２に示す。観察される通り、無処理の細胞は正常な形態（Ａ、Ｂ）を有する。しかし、ＡＰＬペプチド（配列番号１）を用いて処理した細胞では、アポトーシス過程に特徴的な形態的変化を観察することができる（Ｃ〜Ｈ）。特に、クロマチンの核周囲への凝縮及び移動（ＣＭＣ）を観察することができる。ＣＭＣは細胞の核（Ｎ）においてアポトーシス中に起こる最初の形態的変化の１つである。同様に、これら試料中に核断片化（ＮＦ）及びアポトーシス小体（ＡＢ）を観察した。さらに、細胞残屑が存在することから、アポトーシス小体の貪食（Ｐ ＡＢ）が起こったことが分かる。図２Ｆに観察されるように、細胞質オルガネラは完全なままであり（ＩＣＯ）、これはアポトーシスによる細胞死の特徴である。これらの結果は、活動性クローン病患者由来の単核細胞においてこのＡＰＬペプチドで誘導される細胞死の機序が、アポトーシスによって媒介されていることを実証している。
【００３７】
ＴＥＭによって行ったこれら患者細胞の分析により、単核細胞の中でアポトーシスを起こしている細胞集団を同定することも可能になった。血液の異なる型の白血球（単球、リンパ球及び多形核球）が異なる形態を有するので、この結果が可能であった。単核細胞の中で、リンパ球がアポトーシスを起こしている集団であることを同定した。形態的な観点から言えば、リンパ球は単球より小さく、また丸い核を有し、細胞原形質が少ない。さらに、リンパ球は単球の特徴である弛緩したクロマチン又は馬蹄形をした核を呈さない（Ｊｕｎｑｕｅｉｒａ ＬＣ及びＣａｒｎｅｉｒｏ Ｊ（２００５）Ｂａｓｉｃ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ、第６版、Ｍａｓｓｏｎ編、Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、Ｓｐａｉｎ）。
【００３８】
（例３）
クローン病患者由来の腸固有層単核細胞においてＡＰＬペプチドによって誘導される細胞死機序の同定。
文書同意が得られたら、炎症部分に相当する腸組織由来の試料を採取した。試料を、マグネシウム及びカルシウムを含まない冷ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で維持した。Ｂｕｌｌ及びＢｏｏｋｍａｎによって記されているジチオスレイトール／エチレンジアミン四酢酸／コラーゲン分解酵素法（Ｂｕｌｌ ＤＭＫ及びＢｏｏｋｍａｎ ＭＡ（１９７７）ヒト腸管粘膜リンパ性細胞の単離及び機能的な特徴づけ（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ）、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ５９：９６６〜９７４頁）に、Ｖａｎ Ｔｏｌ及び同僚によって行われた修正（Ｖａｎ Ｔｏｌ ＥＡら（１９９２）ＣＤ５６細胞接着分子は、腸固有層由来の非主要組織適合複合体拘束性細胞毒性単核細胞を検出するための主要な決定因子である（Ｔｈｅ ＣＤ５６ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｎｏｎ−ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｌａｍｉｎａ ｐｒｏｐｒｉａ）、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２２：２３〜２９頁）を加えて使用し、これらの組織から粘膜固有層単核細胞を単離した。
【００３９】
クローン病患者由来の粘膜固有層単核細胞（１０×１０６個細胞）を、ＡＰＬペプチド（配列番号１）（４０μｇ／ｍＬ）を含む場合と含まない場合とで７２時間培養した。ＴＥＭで行った分析から、ＡＰＬペプチドで処理した細胞において、クロマチンの核周辺への移動（ＣＭＣ）、核断片化（ＮＦ）及びアポトーシス小体（ＡＢ）等、この型の細胞死に特徴的ないくつかの形態が観察できるように、このペプチドがこの集団の大部分にアポトーシスによる死を誘導することが明らかになった（Ｃ〜Ｅ）（図３）。無処理の細胞は、正常な形態（Ａ〜Ｂ）を有している。
【００４０】
（例４）
抗ＣＤ３抗体で活性化した後の、不活性クローン病患者由来の末梢血単核細胞の生存率の減少。
不活性クローン病患者由来の末梢血単核細胞を、抗ＣＤ３抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて５％ＣＯ２の湿った雰囲気中で、３７℃で７２時間活性化した。抗ＣＤ３抗体の添加により、この細胞集団中のＴ細胞にポリクローナル活性化がもたらされる。活性化したリンパ球を、１×ＰＢＳ溶液で洗浄し、続いて１×１０５個細胞を異なる濃度（１０、４０、１６０μｇ／ｍＬ）のＡＰＬペプチド（配列番号１）と一緒に１時間インキュベーションした。抗ＣＤ３抗体無しに７２時間培養した末梢血単核細胞を、活性化アッセイの対照（非活性化細胞）として使用した。その後、これら活性化していない細胞を同濃度のＡＰＬペプチドと一緒に培養した。
【００４１】
例１で説明したように細胞生存率をＭＴＴ法を使用して測定した。図４Ａに観察できる通り、ＡＰＬペプチドは不活性クローン病患者由来の単核細胞の生存率を減少させない。しかし、このペプチドは、抗ＣＤ３抗体を用いてあらかじめ活性化したこれら細胞（Ｂ）の生存率を著しく減少させた。この結果と例１及び例２において示される結果、つまりこのペプチドは健常なドナー由来の単核細胞の生存率に影響を及ぼさない（例１）、及び活動性クローン病患者由来の単核細胞の主要な集団としてアポトーシスを起こしているリンパ球が同定される（例２）という結果と合わせるとこのＡＰＬペプチド（配列番号１）が高い特異性を持って病原性活性化Ｔ細胞にアポトーシスを誘導できるということが示唆される。
【００４２】
（例５）
１型真正糖尿病患者由来の末梢血単核細胞の生存率に対するＡＰＬペプチドの効果の評価。
例１で記載したように、１型真正糖尿病患者由来の末梢血単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳに重層し遠心分離することにより単離した。評価のために、１０×１０６個細胞をＡＰＬペプチド（４０μｇ／ｍＬ）で７２時間処理した。無処理の細胞を、このアッセイの対照として使用した。図５に示す通り、このペプチドで処理した細胞は、（例２において）前述したアポトーシス途中の細胞の形態を有している（パネルＣ〜Ｄ）。一方で、無処理の細胞（パネルＡ、Ｂ）は、正常な形態を有している。この結果は、このＡＰＬペプチドが１型真正糖尿病患者由来の単核細胞にアポトーシスを誘導することを実証している。
【００４３】
（例６）
ルイスラットにおけるＡＰＬペプチド（配列番号１として識別される）の体内分布試験。
ＡＰＬペプチド（配列番号１として識別される）を同位体Ｉ１２５で標識し、これを静脈経路及び皮内経路によって０．２５ｍｇ及び１ｍｇ／体重１ｋｇの用量でルイスラットに投与した。ペプチドを接種して４時間後及び２４時間後に、各実験群から６匹の動物を屠殺した。異なる器官で放射能レベルを測定した。結果を、放射能用量パーセント／組織１ｇで表している。
【００４４】
この試験から、このペプチドが消化管（胃、小腸及び大腸）へと体内分布され、その生物学的機序を発揮するのに必要な時間これらの器官にとどまっていることが示された。この結果は、クローン病及び潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患を治療するためのこのペプチドの使用を支持している。さらに、消化管は末梢寛容性の誘導に優れた部位であるので、このペプチドを１型真正糖尿病のような他の自己免疫性疾患の治療に対して適用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性腸疾患及び１型糖尿病を治療するための医薬組成物を製造するための、ヒトｈｓｐ６０に由来し配列番号１として識別されるＡＰＬペプチド又はその類似体の使用。
【請求項２】
前記炎症性腸疾患が、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む群から選択される、請求項１に記載のＡＰＬペプチドの使用。
【請求項３】
前記医薬組成物が、媒体又は医薬として許容される賦形剤を含む、請求項１に記載のＡＰＬペプチドの使用。
【請求項４】
炎症性腸疾患及び１型糖尿病の患者の病原性Ｔ細胞クローンにアポトーシスを誘導するための、ヒトｈｓｐ６０に由来し配列番号１として識別されるＡＰＬペプチド又はその類似体の使用。
【請求項５】
前記炎症性腸疾患が、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む群から選択される、請求項４に記載のＡＰＬペプチドの使用。
【請求項６】
前記医薬組成物が、非経口又は粘膜経路によって投与される、請求項１に記載のＡＰＬペプチドの使用。
【請求項７】
前記医薬組成物が、皮内経路、皮下経路、筋肉内経路、静脈経路を含む群から選択される非経口経路によって投与される、請求項６に記載のＡＰＬペプチドの使用。
【請求項８】
前記医薬組成物が、直腸経路及び経口経路を含む群から選択される粘膜経路によって投与される、請求項６に記載のＡＰＬペプチドの使用。
【請求項９】
ヒトｈｓｐ６０に由来し配列番号１として識別されるＡＰＬペプチド又はその類似体を含む治療上有効な量の医薬組成物を患者に投与することを含む、炎症性腸疾患及び１型糖尿病の治療方法。
【請求項１０】
前記炎症性腸疾患がクローン病及び潰瘍性大腸炎を含む群から選択される、請求項９に記載の治療方法。
【請求項１１】
前記医薬組成物が非経口又は粘膜経路によって投与される、請求項９に記載の治療方法。
【請求項１２】
前記医薬組成物が、皮内経路、皮下経路、筋肉内経路、静脈経路を含む群から選択される非経口経路によって投与される、請求項１１に記載の治療方法。
【請求項１３】
前記医薬組成物が、直腸経路及び経口経路を含む群から選択される粘膜経路によって投与される、請求項１１に記載の治療方法。
【請求項１４】
配列番号１として識別されるヒトｈｓｐ６０に由来するＡＰＬペプチド又はその類似体を含む、炎症性腸疾患及び１型糖尿病を治療するための医薬組成物。
【請求項１５】
前記炎症性腸疾患が、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１】
炎症性腸疾患及び１型糖尿病を治療するための医薬組成物を製造するための、ヒトｈｓｐ６０に由来し配列番号１として識別されるＡＰＬペプチド又はその類似体の使用。
【請求項２】
前記炎症性腸疾患が、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む群から選択される、請求項１に記載のＡＰＬペプチドの使用。
【請求項３】
前記医薬組成物が、媒体又は医薬として許容される賦形剤を含む、請求項１に記載のＡＰＬペプチドの使用。
【請求項４】
炎症性腸疾患及び１型糖尿病の患者の病原性Ｔ細胞クローンにアポトーシスを誘導するための、ヒトｈｓｐ６０に由来し配列番号１として識別されるＡＰＬペプチド又はその類似体の使用。
【請求項５】
前記炎症性腸疾患が、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む群から選択される、請求項４に記載のＡＰＬペプチドの使用。
【請求項６】
前記医薬組成物が、非経口又は粘膜経路によって投与される、請求項１に記載のＡＰＬペプチドの使用。
【請求項７】
前記医薬組成物が、皮内経路、皮下経路、筋肉内経路、静脈経路を含む群から選択される非経口経路によって投与される、請求項６に記載のＡＰＬペプチドの使用。
【請求項８】
前記医薬組成物が、直腸経路及び経口経路を含む群から選択される粘膜経路によって投与される、請求項６に記載のＡＰＬペプチドの使用。
【請求項９】
ヒトｈｓｐ６０に由来し配列番号１として識別されるＡＰＬペプチド又はその類似体を含む治療上有効な量の医薬組成物を患者に投与することを含む、炎症性腸疾患及び１型糖尿病の治療方法。
【請求項１０】
前記炎症性腸疾患がクローン病及び潰瘍性大腸炎を含む群から選択される、請求項９に記載の治療方法。
【請求項１１】
前記医薬組成物が非経口又は粘膜経路によって投与される、請求項９に記載の治療方法。
【請求項１２】
前記医薬組成物が、皮内経路、皮下経路、筋肉内経路、静脈経路を含む群から選択される非経口経路によって投与される、請求項１１に記載の治療方法。
【請求項１３】
前記医薬組成物が、直腸経路及び経口経路を含む群から選択される粘膜経路によって投与される、請求項１１に記載の治療方法。
【請求項１４】
配列番号１として識別されるヒトｈｓｐ６０に由来するＡＰＬペプチド又はその類似体を含む、炎症性腸疾患及び１型糖尿病を治療するための医薬組成物。
【請求項１５】
前記炎症性腸疾患が、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【図２】
【図３】
【図５】
【図１】
【図４】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【図３】
【図５】
【図１】
【図４】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図６Ｄ】
【公表番号】特表２０１２−５１４０１３（Ｐ２０１２−５１４０１３Ａ）
【公表日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４３９７３（Ｐ２０１１−５４３９７３）
【出願日】平成２１年１２月２９日（２００９．１２．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００９／０００００９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７５８２４
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年６月２１日（２０１２．６．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月２９日（２００９．１２．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＵ２００９／０００００９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０７５８２４
【国際公開日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【出願人】（３０４０１２８９５）セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア (46)
【Ｆターム（参考）】
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