腸管出血性大腸菌ワクチン
【課題】分泌性腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）抗原に対する免疫応答を刺激する組成物及びそのための方法を提供する。
【解決手段】上記組成物は、ＥＨＥＣ細胞培養液上清を含む。
【解決手段】上記組成物は、ＥＨＥＣ細胞培養液上清を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管出血性大腸菌に対する哺乳動物の免疫反応を惹起する組成物及び方法に関する。とりわけ、本発明は、哺乳動物における腸管出血性大腸菌の定着（住みつき）を治療、及び阻止するための細胞培養液上清の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）は、志賀毒素大腸菌（ＳＴＥＣ）、ベロ毒素原性大腸菌（ＶＴＥＣ）とも呼ばれるが、人間に、下痢、出血性大腸炎、溶血性尿毒症症候群、腎不全、及び死を引き起こす病原性大腸菌である。志賀毒素様毒素産生性ＥＨＥＣ株の多くは人間に対し病原性を有するが、人間の疾病の主因は、血清型Ｏ１５７：Ｈ７のＥＨＥＣ株である。この大腸菌は、人間の大腸における定着性を有するが、この定着は、幾つかの病原性決定因子が転座インチミンレセプター（translocated Intimin receptor）、すなわちＴｉｒ、を含むIII型分泌系を介して宿主細胞へ輸送されるという独特の機構によって行われる（DeVinney et al., Infect. Immun. (1999) 67:2389）。これら病原体は、とりわけ、腸細胞膜へのＴｉｒの輸送を可能にする病原性決定因子ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、及びＥｓｐＤを分泌する。Ｔｉｒは、宿主細胞膜へ組み込まれ、細菌外膜タンパク、インチミンに対するレセプターとして作用する。Ｔｉｒ−インチミン結合体は、ＥＨＥＣを腸細胞の表面に結合し、結合したＥＨＥＣの下方でアクチン細胞骨格転位（再構成）を引き起こし、このためペデスタル構造（pedestal formation）が形成される。ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、Ｔｉｒ及びインチミンは、すべて、ＥＨＥＣが腸内で首尾よく定着するための本質的要素である。
【０００３】
ＥＨＥＣは、反芻動物及びその他の哺乳動物の腸で定着するが、通常これらの動物には目に見えて分かるような（顕性の）疾病は引き起こさない。しかしながら、血清型Ｏ１５７：Ｈ７のＥＨＥＣ（以下「ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７」という）により汚染された肉や水により、アメリカ合衆国及びカナダにおいては、人間に対しては、年間約５０，０００例のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７感染が起こっており、そのうち約５００人が死に至っている。１９９４年には、人間に対するＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７感染に関連する経済コストは、年間５０億ドル以上と推定されている。
【０００４】
はじめて報告された汚染肉を原因とするＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７（の感染症）の大発生は、１９８２年であった。その後、健康な反芻動物（ウシ、乳牛、羊を含むがこれらに限定されない）にもＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７が感染することが明らかとなった。実際に、ＵＳＤＡの報告によれば、ウシの５０％までがその生涯の任意の時点においてＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７キャリアであり、従ってＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７をその糞便と共に排泄する。
【０００５】
屠殺牛は大量処理され、人間に感染するのに必要なＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の数は少ない（１０〜１００）ので、健康なウシにおけるＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の定着は、相変わらず深刻な健康問題となっている。この問題に対処するため、屠殺の際にＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を検出して殺菌し、腸内ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７数を低減するようウシの餌を変更し、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の定着を阻止するよう動物を免疫（接種）する方法の改善に対し集中的に研究が行われた（Zacek D. Animal Health and Veterinary Vaccines, Alberta Research Counsel, Edmonton, Canada, 1997）。近年、組換えＥｓｐＡ（国際公開ＷＯ ９７／４００６３）、組換えＴＩＲ（国際公開ＷＯ ９９／２４５７６）、組換えＥｓｐＢ及び組換えインチミン（Li et al., Infec. Immun. (2000) 68:5090-5095）を含むＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７タンパク質の組換え生産及びその使用が開示された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ ９７／４００６３
【特許文献２】ＷＯ ９９／２４５７６
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Zacek D. Animal Health and Veterinary Vaccines, Alberta Research Counsel, Edmonton, Canada, 1997
【非特許文献２】Li et al., Infec. Immun. (2000) 68:5090-5095
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、抗原として使用するために必要な量の組換えタンパク質の生産及び精製は、何れも困難且つ高価である。現状では、ウシ及びその他の動物におけるＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の定着を阻止し、及びそれによってＥＨＥＣの環境への排泄を低減するための効果的な方法は見出されていない。
【０００９】
それゆえ、ＥＨＥＣ感染症を治療及び阻止するための、並びにＥＨＥＣで汚染された肉や水と関連する健康問題の発生を低減するよう哺乳動物におけるＥＨＥＣの定着を低減するための新たな組成物及び方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記の必要性を充足するための組成物及び方法を提供する。特に、本発明の方法は、ＥＨＥＣ培養液由来の細胞培養液上清（以下「ＣＣＳ」という）を含む組成物を使用し、１以上のＥＨＥＣ分泌抗原に対する免疫反応を惹起して、ＥＨＥＣ感染症の治療及び/又はＥＨＥＣ感染症の阻止及び/又は哺乳動物におけるＥＨＥＣの定着の低減を行う。本発明の組成物は、同時に投与されるべきアジュバントの有無に拘らず与える（投与）することができる。本発明のある実施形態では、ＥｓｐＡ及びＴｉｒは、上記細胞培養液上清タンパク質のうちの少なくとも２０％を占める。ＥＨＥＣ培養液上清は、ＥＨＥＣの血清型の何れに由来しても良いが、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７やＥＨＥＣ：ＮＭ（非運動性：non-motile）等のＥＨＥＣ Ｏ１５７の培養液に由来するのが好ましい。本発明の細胞培養液上清は、容易且つ比較的安価に製造することができ、毒性が最小となるような投与量でも有効である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、Ｔｉｒ及びインチミンは、宿主上皮細胞シグナル伝達系の活性化（Ａ）及び宿主上皮細胞へのＥＨＥＣの直接的（intimate）付着（Ｅ）のために必要である。従って、以下の仮説に拘束されるわけではないが、本発明のＣＣＳの哺乳動物への投与により、ＥｓｐＡやＴｉｒのような１以上の分泌性抗原に対する、ＥＨＥＣの腸上皮細胞への付着を阻止する免疫反応が刺激されると考えられる。
【００１２】
従って、本発明の目的の１つは、ＥＨＥＣ分泌抗原に対する免疫反応を刺激し、哺乳動物におけるＥＨＥＣ感染症を治療及び/又は阻止するのに有効なワクチンを提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、反芻動物又はその他の哺乳動物におけるＥＨＥＣの定着を低減、阻止及び/又は排除（排出：eliminate）するのに有効なワクチンを提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、ＥＨＥＣを環境へ排泄する動物の数を低減することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、感染動物によりその（外部）環境へ排泄されるＥＨＥＣの数を低減することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、ＥＨＥＣが感染動物により環境へ排泄される時間を低減することである。
【００１７】
本発明の他の目的は、環境のＥＨＥＣ汚染を低減することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、肉及び/又は水のＥＨＥＣ汚染を低減することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、人間へのＥＨＥＣ感染を治療、阻止及び/又は低減することである。
【００２０】
本発明の他の目的は、他の生物学的抗ＥＨＥＣ剤への補助剤として有効なワクチンを提供することである。
【００２１】
本発明の他の目的は、化学的抗ＥＨＥＣ剤への補助剤として有効なワクチンを提供することである。
【００２２】
本発明の他の目的は、生物学的に製造される抗ＥＨＥＣ剤への補助剤として有効なワクチンを提供することである。
【００２３】
本発明の他の目的は、核酸をベースとする抗ＥＨＥＣ剤への補助剤として有効なワクチンを提供することである。
【００２４】
本発明の他の目的は、組換えタンパク質抗ＥＨＥＣ剤への補助剤として有効なワクチンを提供することである。
【００２５】
本発明の他の目的は、反芻動物におけるＥＨＥＣの定着を低減するのに有効なワクチン接種スケジュールを提供することである。
【００２６】
本発明の他の目的は、反芻動物により排泄されるＥＨＥＣを低減するのに有効なワクチン接種スケジュールを提供することである。
【００２７】
本発明の他の目的は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７及び/又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭの定着等のウシにおけるＥＨＥＣ Ｏ１５７の定着を低減するのに有効なワクチンを提供することである。
【００２８】
本発明の他の目的は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７及び/又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭの定着等のウシにおけるＥＨＥＣ Ｏ１５７の定着を阻止するのに有効なワクチンを提供することである。
【００２９】
本発明の他の目的は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７及び/又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭの定着等のウシにおけるＥＨＥＣ Ｏ１５７の定着を排除（排出：eliminate）するのに有効なワクチンを提供することである。
【００３０】
本発明の他の目的は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７及び/又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭの排泄等の、ＥＨＥＣ Ｏ１５７を環境へ排泄するウシの数を低減することである。
【００３１】
本発明の他の目的は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７及び/又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭの排泄等の、感染ウシにより環境へ排泄されるＥＨＥＣ Ｏ１５７の数を低減することである。
【００３２】
本発明の他の目的は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７及び/又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭの排泄等の、ＥＨＥＣ Ｏ１５７が感染ウシにより環境へ排泄される時間を低減することである。
【００３３】
本発明の他の目的は、他の抗ＥＨＥＣ Ｏ１５７剤への補助剤として有効なワクチンを提供することである。
【００３４】
本発明の他の目的は、ウシにおけるＥＨＥＣ Ｏ１５７の定着を低減するのに有効なワクチン接種スケジュールを提供することである。
【００３５】
本発明の他の目的は、ウシによるＥＨＥＣ Ｏ１５７の排泄を低減するのに有効なワクチン接種スケジュールを提供することである。
【００３６】
本発明の一実施形態によれば、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）細胞培養液上清と免疫アジュバントとを含むワクチン組成物が提供される。ある実施形態では、ＥＨＥＣは、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７及び/又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭである。その他の実施形態では、免疫アジュバントは、ミネラルオイル及びジメチルジオクタデシルアンモニウム・ブロマイド等の水中油型エマルジョンから構成される。更なる実施形態では、免疫アジュバントは、ＶＳＡ３である。ＶＳＡ３は、約２０％（ｖ/ｖ）〜約４０％（ｖ/ｖ）の濃度、好ましくは３０％（ｖ/ｖ）の濃度で含有されることが可能である。
【００３７】
更なる実施形態では、ワクチン組成物は、更に、ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、及びＴｉｒからなる群から選択される１又は２以上の組換え又は精製ＥＨＥＣ分泌抗原を含む。他の実施形態では、ＥｓｐＡ＋Ｔｉｒは、ワクチン組成物中において細胞タンパク質の少なくとも２０％を占める。
【００３８】
本発明の他の一実施形態によれば、分泌性腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）抗原に対する哺乳動物の免疫学的反応を惹起する方法が提供される。この方法は、ＥＨＥＣ細胞培養液上清を含む組成物の治療有効量を哺乳動物へ投与することから構成される。他の実施形態では、ＥＨＥＣは、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７及び/又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭである。更なる実施形態では、哺乳動物は、人間、又はウシ等の反芻動物である。更なる実施形態では、上記組成物は、更に、例えばミネラルオイル及びジメチルジオクタデシルアンモニウム・ブロマイド等の水中油型エマルジョン等から構成される免疫アジュバントを含む。更なる実施形態では、当該免疫アジュバントは、ＶＳＡ３である。上記組成物は、更に、ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、及びＴｉｒからなる群から選択される１以上の組換え又は精製ＥＨＥＣ分泌抗原を含むことができる。更なる実施形態では、ＥｓｐＡ＋Ｔｉｒは、上記組成物中において細胞タンパク質の少なくとも２０％を占める。
【００３９】
本発明の更に他の一実施形態によれば、分泌性腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７）抗原に対する反芻動物の免疫学的反応を惹起する方法が提供される。この方法は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７細胞培養液上清及びＶＳＡ３を含む組成物の治療有効量を反芻動物へ投与することから構成される。他の実施形態では、ＶＳＡ３は、約２０％（ｖ/ｖ）〜約４０％（ｖ/ｖ）、好ましくは約３０％（ｖ/ｖ）の濃度で上記組成物中に含有される。
【００４０】
本発明の更なる一実施形態によれば、ＥＨＥＣ細胞培養液上清及び免疫アジュバントを含む組成物の治療有効量を反芻動物へ投与することから構成される、反芻動物における腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）の定着を低減する方法が提供される。
【００４１】
本発明の更に他の一実施形態によれば、ＥＨＥＣ細胞培養液上清及び免疫アジュバントを含む組成物の治療有効量を反芻動物へ投与することから構成される、反芻動物からの腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）の排泄を低減する方法が提供される。
【００４２】
本発明の上記の各実施形態及び更に他の形態は、以下に示す詳細な説明及び図面を参照することにより明らかとなる。更に、より詳細な手順や組成物を記載している参考文献も以下に示してある。
【００４３】
詳細な説明
本発明の実施には、特段の定めがない限り、当業者の通常の知識に含まれる分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術及び免疫学の従来の技術が使用されるものとする。このような技術は、各種文献に詳細に説明されている。例えば、サムブルックら(Sambrook, Fritsch & Maniatis)、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II, and III, Second Edition (1989); パーバル(Perbal, B.)、 A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); 一連の Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); 及び Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)を参照されたい。
【００４４】
Ａ．定義
本発明を説明するにあたって、以下の用語を用いるが、これらの定義は、以下に示すとおりである。
【００４５】
まず注意すべきことは、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形（「a」、「an」、及び「the」）は、特段に明示しない限り複数の対象も意味するということである。従って、例えば、「ＥＨＥＣ細菌（an EHEC bacterium）」という記載は、２又は３以上の当該細菌等も意味するものとする。
【００４６】
本書においては、用語ＥＨＥＣ「細胞培養液上清」又は「ＣＣＳ」は、１以上のＥＨＥＣ血清型の細胞培養液から得られる上清であって、ＥＨＥＣ菌体細胞ないし当該細胞の溶菌液は実質的に含まず、且つ増殖培地に分泌されたＥＨＥＣ抗原の混合物を含む上清を意味するものとする。通常、ＥＨＥＣ「ＣＣＳ」は、少なくとも分泌抗原ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ及びＴｉｒ、及びそれらのフラグメント又は凝集体を含む。 本発明のＣＣＳは、例えばＥｓｐＦ及びＭＡＰ等の他の分泌タンパク質、志賀毒素１及び２の一方又は両方、並びにIII型系によっては分泌されない約１００ｋＤａのタンパク質であるＥｓｐＰも含み得る。ＥＨＥＣ感染症の緩和（lessen）ないし阻止、及び/又はＥＨＥＣの定着の緩和ないし抑制を行うよう宿主の免疫反応を刺激する機能をＣＣＳが維持する限り、タンパク質は、天然の形態、又は変性若しくは分解した形態で存在し得る。場合により、ＣＣＳには、例えば追加的なＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ及び/又はＴｉｒ並びに他の分泌タンパク質の何れかのような追加の組換え又は精製分泌抗原を補充することも可能であり、及びインチミンを補充することも可能である。幾つかの実施形態では、ＥｓｐＡ+Ｔｉｒは、細胞培養液上清タンパク質の少なくとも２０％を占める。
【００４７】
本書においては、組換えＥｓｐＡ、組換えＥｓｐＢ、組換えＥｓｐＤ及び組換えＴｉｒ等の「組換え」ＥＨＥＣ分泌タンパク質、並びに「組換えインチミン」は、当該タンパク質が少なくとも１つの特異的エピトープ又は活性を保持する限り、全長ポリペプチド配列、基準（参照）配列のフラグメント又は基準配列の置換、欠失及び/又は付加を意味するものとする。通常、基準配列の類似体は、全長基準配列に対し、少なくとも約５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約７５％〜８５％の配列同一性、より好ましくは約９０％〜９５％以上の配列同一性を示す。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ゲノムの完全配列（これは種々のＯ１５７：Ｈ７分泌タンパク質の配列を含む）については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号AE005594、AE005595、AP002566、AE005174、NC_002695、NC_002655を参照されたい。幾つかの大腸菌血清型からのＥｓｐＡの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、国際公開番号WO 97/40063、並びにＧｅｎＢａｎｋ登録番号Y13068、U80908、U5681、Z54352、AJ225021、AJ225020、AJ225019、AJ225018、AJ225017、AJ225016、AJ225015、AF022236及びAF200363を参照されたい。幾つかの大腸菌血清型からのＴｉｒの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、国際公開番号ＷＯ９９／２４５７６号、並びにＧｅｎＢａｎｋ登録番号AF125993、AF132728、AF045568、AF022236、AF70067、AF070068、AF013122、AF200363、AF113597、AF070069、AB036053、AB026719、U5904及びU59502を参照されたい。幾つかの大腸菌血清型からのインチミンの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号U32312、U38618、U59503、U66102、AF081183、AF081182、AF130315、AF339751、AJ308551、AF301015、AF329681、AF319597、AJ275089-AJ275113を参照されたい。幾つかの大腸菌血清型からのＥｓｐＢの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号U80796、U65681、Y13068、Y13859、X96953、X99670、X96953、Z21555、AF254454、AF254455、AF254456、AF254457、AF054421、AF059713、AF144008、AF144009を参照されたい。幾つかの大腸菌血清型からのＥｓｐＤの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Y13068、Y13859、Y17875、Y17874、Y09228、U65681、AF054421及びAF064683を参照されたい。
【００４８】
「相同性（ホモロジー）」とは、２つのポリヌクレオチド部分間又は２つのポリペプチド部分間におけるパーセント（で表した）類似性を意味する。２つのＤＮＡないし２つのポリペプチド配列は、分子の所定の長さに亘って配列が少なくとも約８０％〜約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％〜約９８％の配列類似性を示すとき、互いに「実質的に相同」であるという。本書においては、実質的に相同とは、特定のＤＮＡないしポリペプチド配列と完全な同一性を示す配列も意味するものとする。
【００４９】
パーセント配列同一性は、配列を整列させ、当該整列させた２つの配列間でマッチングしている正確な数を数え、より短いほうの配列の長さで割り、その結果を１００倍することにより、２つの分子間の配列情報を直接比較することによって決定することができる。このような分析を支援するために容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用することができる。例えば、ALIGN, Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DCを使用することができるが、これは、ペプチド分析のための Smith and Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2:482-489 の局所的相同性アルゴリズムを採用している。塩基配列の同一性を決定するためのプログラムとしては、Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (Genetics Computer Group, Madison, WIから入手可能) が利用できる。例えば、同様にSmith and Watermanアルゴリズムに基づくＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＧＡＰの各プログラムを利用できる。これらプログラムは、製造元が推奨しかつ上記Wisconsin Sequence Analysis Packageに記載されているデフォルト（規定値）のパラメータによって容易に使用することができる。例えば、基準（参照）配列に対する特定の塩基配列のパーセント同一性は、デフォルトのスコアリングテーブルと６ヶ所の塩基位置のギャップペナルティ（gap penalty）を用いるSmith and Watermanの相同性アルゴリズムによって決定することができる。
【００５０】
また、相同性は、相同性領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイズし、一本鎖特異的ヌクレアーゼによって切断（消化）し、切断されたフラグメントのサイズを決定することによっても決定することもできる。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、特定のシステムについて決められるストリンジェントな条件の下でのサザンブロット法によって同定することができる。適切なハイブリダイゼーションのための条件の決定は、当業者の通常の知識に属する。例えば、サムブルックら（上掲）、DNA Cloning（上掲）、Nucleic Acid Hybridization（上掲）を参照されたい。
【００５１】
本書において、「ワクチン」とは、例えばIII型分泌ＥＨＥＣ抗原のようなＥＨＥＣ抗原に対する免疫反応を刺激（惹起）するよう作用するＣＣＳ組成物を意味するものとする。免疫反応は、ＥＨＥＣ感染又はＥＨＥＣの定着・排泄に対する完全な保護及び／又は治療を提供する必要はない。ＥＨＥＣ細菌の定着・排泄に対する部分的保護であっても、排泄と汚染肉生産が低減される場合は、有用である。場合によっては、ワクチンは、免疫反応を促進するため免疫アジュバントを含み得る。用語「アジュバント」は、特定の抗原又は抗原の組み合わせに対する免疫反応を促進するように非特異的態様で作用する剤であって、従って目的の抗原に対し十分な免疫反応を引き起こすための、所与の何れのワクチンにおける必要な抗原の量、及び／又は必要な接種の回数を低減するものを意味する。例えば、A.C. Allison J. Reticuloendothel. Soc. (1979) 26:619-630を参照されたい。このようなアジュバントについては、以下に詳細に説明する。
【００５２】
本書において、「定着」とは、例えば反芻動物等の哺乳動物の腸管におけるＥＨＥＣの存在を意味するものとする。
【００５３】
本書において、「排泄」とは、糞便中のＥＨＥＣの存在を意味するものとする。
【００５４】
本書において、「治療量」、「有効量」、及び「〜に有効な量」とは、ＣＣＳ中に存在する分泌抗原に対する免疫反応を惹起し、以って例えば反芻動物等の哺乳動物におけるＥＨＥＣ感染症及び／又はＥＨＥＣの定着の低減又は阻止、及び／又はＥＨＥＣを排泄する動物の個体数の低減、及び／又は動物から排泄されるＥＨＥＣの個数の低減、及び／又は動物によるＥＨＥＣ排泄の時間（期間）の低減、をさせるために有効なワクチンの量を意味するものとする。
【００５５】
本書において、「免疫化」又は「免疫する」とは、ＣＣＳの投与であって、当該ＣＣＳに存在する１又は２以上の分泌抗原に対する免疫学的反応を惹起するために、当該ＣＣＳが投与される動物の免疫システムを刺激するのに有効な量で、追加的な組換え又は精製ＥＨＥＣ抗原（例えばＥｓｐＡ、Ｔｉｒ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ及び／又はインチミン）の含有の有無に拘らずに行うＣＣＳの投与を意味するものとする。
【００５６】
用語「エピトープ」は、特定のＢ細胞及び／又はＴ細胞が反応する抗原又はハプテンの部位を意味するものとする。また、「エピトープ」は、「抗原決定因子（antigenic determinant）」ないし「抗原決定基（antigenic determinant site）」と同義である。
【００５７】
組成物ないしワクチンへの「免疫学的反応」とは、目的の組成物ないしワクチンに対する細胞性及び／又は抗体媒介性免疫反応の宿主における形成を意味するものとする。「免疫学的反応」には、通常、１以上の以下の効果：目的の組成物ないしワクチンに含まれる１又は複数の抗原に対し特異的に形成される抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサＴ細胞、及び／又はキラーＴ細胞及び／又はγδＴ細胞の産生を含むが、これらに限定されない。宿主は、ＥＨＥＣ感染症が緩和（lessen）及び／又は阻止され、ＥＨＥＣの定着に対する抵抗性が腸に付与され、ＥＨＥＣを排泄する動物の個体数が低減され、動物によって排泄されるＥＨＥＣの数が低減され、及び／又は動物によるＥＨＥＣの排泄時間（期間）が低減されるような治療的又は保護的な免疫学的反応を示すことが好ましい。
【００５８】
用語「免疫原性」タンパク質ないしポリペプチドは、上述した免疫学的反応を惹起するアミノ酸配列を意味するものとする。本書においては、「免疫原性」タンパク質ないしポリペプチドは、問題の特定のＥＨＥＣタンパク質の全長配列、そのアナログ、凝集体、又はその免疫原性フラグメントを含むものとする。「免疫原性フラグメント」は、１又は２以上のエピトープを含みかつ従って上述の免疫学的反応を惹起する分泌ＥＨＥＣタンパク質のフラグメントを意味するものとする。このようなフラグメントは、当業者の通常の知識に属する非常に多くのエピトープマッピング技術の何れを用いても同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jerseyを参照されたい。例えば、直鎖状のエピトープは、固相支持体（solid support）上で多数のペプチド（これは、タンパク質分子の部分に相当する）を同時に合成し、該ペプチドを該支持体に付着させたまま該ペプチドを抗体と反応させることによって決定することができる。このような技術は、当業者の通常の知識に属しており、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号、 Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002、Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715を参照されたい。同様に、高次構造を有するエピトープも、例えばＸ線結晶学及び二次元核磁気共鳴を用いアミノ酸の空間的な配座（立体構造）を決定することによって容易に同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols（上掲）を参照されたい。また、タンパク質の抗原性領域は、例えばOxford Molecular Groupから入手可能なソフトウェアプログラムOmiga version 1.0を用いて計算されるプロット等の標準的な抗原性（antigenicity）及び疎水性親水性指標（hydropathy）プロットによって同定することができる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロフィールを決定するためにHopp/Woods法、Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828 を使用し、疎水性親水性指標プロットのためにKyte-Doolittle技術、Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132を使用する。
【００５９】
免疫原性フラグメントは、本発明の目的のためには、通常、親ＥＨＥＣ分泌タンパク質分子の少なくとも約３個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約１０〜約１５個のアミノ酸、最も好ましくは２５個又はそれ以上のアミノ酸を含む。フラグメントの長さに関しては決定的な上限はなく、フラグメントは、タンパク質配列のほぼ全長、或いは特定のＥＨＥＣ分泌タンパク質の２以上のエピトープを含む融合タンパク質でさえも含むことができる。
【００６０】
「天然の」タンパク質ないしポリペプチドとは、タンパク質の自然発生源から単離されるタンパク質ないしポリペプチドを意味する。「組換え」ポリペプチドとは、組換えＤＮＡ技術によって生産される、すなわち目的のポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ構築物が導入された細胞によって生産されるポリペプチドを意味するものとする。「合成」ポリペプチドとは、化学的合成法によって生産されるポリペプチドを意味するものとする。
【００６１】
用語「治療（treatment）」は、本書においては、（i）感染又は再感染の阻止（予防）、又は（ii）目的の感染症（疾病）の症状の緩和ないし解消（治療）を意味するものとする。
【００６２】
「哺乳動物被検体（mammalian subject）」は哺乳類（哺乳綱）の何れのメンバーをも意味し、人間、及び他の全ての乳腺を有する動物（雌雄を問わない）、例えば、ウシ、ブタ、Ovis（ヒツジ及びヤギ）種等を含む反芻動物を含むがこれらに限定されない。本書では、「哺乳動物被検体」を特定の年齢に限定して用いない。従って、成体、新生児、及び胎児の何れもこの語に含まれる。
【００６３】
Ｂ．一般的方法
本発明の中核をなすのは、ＥＨＥＣ分泌抗原を含むＥＨＥＣ培養物に由来する細胞培養液上清が、投与される動物において免疫反応を引き起こし、以って例えば定着に対する保護のようなＥＨＥＣ感染に対する保護作用をなすことを明らかにすることである。幾つかの実施形態では、組成物は、ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ及び／又はＴｉｒ等を含むＥＨＥＣ分泌抗原の混合物を含むがこれらに限定されない。また、本発明のＣＣＳは、例えばＥｓｐＦ、ＭＡＰ、志賀毒素１及び２の一方又は両方、並びにIII型分泌系によっては分泌されないほぼ１００ｋＤａのタンパク質であるＥｓｐＰ等の他の分泌タンパク質も含み得る。他の実施形態では、ＣＣＳは、追加的な組換え又は精製ＥＨＥＣ抗原、例えば、追加的なＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、Ｔｉｒ、インチミン等が補充される。幾つかの実施形態では、ＥｓｐＡ + Ｔｉｒは、細胞培養液上清タンパク質の少なくとも２０％を占める。組成物は、複数のＥＨＥＣ生物に対する保護作用を奏するため２以上のＥＨＥＣ血清型に由来する細胞培養液上清（複数）と追加的なアジュバント（複数）を含むこともできる。更に、医薬的に受容可能なアジュバントを、細胞培養液上清と共に投与することも可能である。組成物は、１又は２以上の分泌抗原に対する免疫反応を惹起し、以ってＥＨＥＣ感染を低減又は排除（eliminate）するのに有効な量が投与される。場合によっては、動物におけるＥＨＥＣの定着は、低減又は排除される。好ましい実施形態では、動物は、ウシ、ヒツジ又はその他の反芻動物である。特に好ましい実施形態では、細胞培養液上清は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭの細胞培養物に由来する。
【００６４】
ＣＣＳによる免疫は、免疫された動物の免疫システムを刺激し、例えばＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、Ｔｉｒ等の１以上の分泌抗原に対する抗体を産生させ、ＥＨＥＣが腸管上皮細胞に付着するのを阻止し、ＥＨＥＣの定着を阻害し、以って動物によるＥＨＥＣの排泄を低減する。このようなＥＨＥＣの排泄の低減により、ＥＨＥＣによる食物や水の汚染は低減し、人間に対しＥＨＥＣにより引き起こされる感染症（疾病）も低減される。更に、ＥＨＥＣの定着及びウシによるＥＨＥＣの排泄を阻止、低減及び排除するというＣＣＳ免疫の予期しなかった驚くような能力は、医学分野において長期に亘って満たされなかったニーズに応え、人間に対する重要な便益を提供する。
【００６５】
更に、本発明のＣＣＳは、例えば人間等の他の哺乳動物におけるＥＨＥＣ感染の治療又は阻止に利用することができる。人間に対して用いられる場合、ＣＣＳは、毒性を低減するため志賀毒素１及び２の一方又は両方をノックアウトすることにより作られた突然変異ＥＨＥＣから作ることができる。
【００６６】
上述の通り、ＣＣＳの治療上の有効性は、１以上の組換え又は精製分泌抗原を添加することによって増強することができる。例えば、組換え又は精製ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、Ｔｉｒ等、それらのフラグメント及び／又はそれらのアナログを添加することによって当該有効性を増強することができる。また、インチミンを添加することも可能である。ＣＣＳの治療有効性を増強する他の方法としては、ＣＣＳと天然又は合成担体との複合体を形成し、他の抗ＥＨＥＣ剤の投与の前／同時／後に当該ＣＣＳを投与する方法があるが、これに限定されない。当該剤としては、生物学的、生物工学的、化学的、核酸ベース的及び組換えタンパク質的抗ＥＨＥＣ剤等が含まれる。
【００６７】
宿主内で定着するためにＥｓｐＡ、Ｔｉｒ等のタンパク質を必要とするＥＨＥＣの血清型以外の病原性細菌に由来するＣＣＳも、動物の免疫システムを刺激し、分泌ＥＨＥＣ抗原に対する抗体を産生させて、細菌が動物の腸管上皮細胞に結合することを低減するために使用することができる。このような細菌種としては、シトロトバクテル・ロデンチウム（Citrotobacter rodentium）が含まれるが、これに限定されない。
【００６８】
本発明で使用されるＣＣＳは、どの血清型のＥＨＥＣの培養物からも取得することができる。当該ＥＨＥＣ血清型には、血清型Ｏ１５７、Ｏ１５８、Ｏ５、Ｏ８、Ｏ１８、Ｏ２６、Ｏ４５、Ｏ４８、Ｏ５２、Ｏ５５、Ｏ７５、Ｏ７６、Ｏ７８、Ｏ８４、Ｏ９１、Ｏ１０３、Ｏ１０４、Ｏ１１１、Ｏ１１３、Ｏ１１４、Ｏ１１６、Ｏ１１８、Ｏ１１９、Ｏ１２１、Ｏ１２５、Ｏ２８、Ｏ１４５、Ｏ１４６、Ｏ１６３、Ｏ１６５が含まれるがこれらに限定されない。このようなＥＨＥＣ血清型は、感染動物の血清から容易に取得できる。ＥＨＥＣの単離方法は、当業者の通常の知識に属する。例えば、Elder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:2999; Van Donkersgoed et al., Can. Vet. J. (1999) 40:332; Van Donkersgoed et al., Can. Vet. J. (2001) 42:714を参照されたい。 このような方法は、通常、セフィキシム及びテルライトを補充したソルビトール・マッコンキー（MacConkey）寒天培地上での直接的なプレーティングか、免疫磁気濃縮後当該同じ培地上でプレーティングすることを必要とする。更に、ＣＣＳは、毒性を低減するため志賀毒素１及び／又は２の発現をノックアウトするよう遺伝子操作されたＥＨＥＣ血清型から取得することもできる。
【００６９】
ＣＣＳは、通常、III型抗原分泌に有利な条件下において好適な培地でＥＨＥＣ細菌を培養することによって作ることができる。ＥＨＥＣ細菌を培養するための好適な培地及び条件は、当業者の通常の知識に属するものであり、例えば、米国特許第６，１３６，５５４号及び第６，１６５，７４３号、並びにLi et al., Infec. Immun. (2000) 68:5090-5095、 Fey et al., Emerg. Infect. Dis. (2000) Volume 6に記載されている。ＣＣＳを取得するための特に好ましい方法によれば、まず、細菌をＬＢ（Luria-Bertani）培地で約８〜４８時間、好ましくは約１２〜２４時間増殖させ、この培地を、２０〜１００ｍＭ、好ましくは３０〜５０ｍＭ、最も好ましくは約４４ｍＭのＮａＨＣＯ２と、４〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、最も好ましくは約８ｍＭのＭｇＳＯ４と、０．１〜１．５％、好ましくは０．２〜１％、最も好ましくは０．４％のグルコースと、０．０５〜０．５％、好ましくは０．０７〜０．２％、最も好ましくは約０．１％のカザミノ酸とを補充したＭ−９最小培地で、約１：５〜１：５０、好ましくは約１：５〜１：２５、より好ましくは約１：１０に希釈する。培地は、通常、３７℃、２〜１０％ＣＯ２、好ましくは約５％ＣＯ２で、約６００ｎｍに対し吸光度０．７〜０．８に維持される。そして遠心機によって細胞を全て除去し、透析、限外濾過等によって、例えば１０〜１０００倍又はそれ以上（例えば１００倍）に上清を濃縮する。総タンパク質は、当業者の通常の知識に属する方法によって容易に決定することができる。
【００７０】
上述の通り、ＣＣＳは、例えばＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ及び／又はＴｉｒ等の追加的なＥＨＥＣ分泌タンパク質で補充することができる。また、インチミンも添加することができる。これらのタンパク質は、当業者の通常の知識に属する組換え技術を用いて作ることができる。例えば、代表的な組換えＥＨＥＣ分泌タンパク質の生産について記載されている国際公開ＷＯ９７／４００６３号及びＷＯ９９／２４５７６号を参照されたい。特に、種々の血清型に由来するＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、Ｔｉｒ及びインチミンの配列は、既知であり且つ文献にも記載されている。例えば、種々のＯ１５７：Ｈ７分泌タンパク質の配列を含む大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ゲノムの完全配列についてＧｅｎＢａｎｋ登録番号AE005594、AE005595、AP002566、AE005174、NC_002695、NC_002655を参照されたい。また、幾つかの大腸菌血清型由来のＥｓｐＡの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、国際公開ＷＯ９７／４００６３号、並びにＧｅｎＢａｎｋ登録番号Y13068、U80908、U5681、Z54352、AJ225021、AJ225020、AJ225019、AJ225018、AJ225017、AJ225016、AJ225015、AF022236及びAF200363を参照されたい。また、幾つかの大腸菌血清型由来のＴｉｒの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、国際公開ＷＯ９９／２４５７６号、並びにＧｅｎＢａｎｋ登録番号AF125993、AF132728、AF045568、AF022236、AF70067、AF070068、AF013122、AF200363、AF113597、AF070069、AB036053、AB026719、U5904及びU59502を参照されたい。また、幾つかの大腸菌血清型由来のインチミンの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号U32312、U38618、U59503、U66102、AF081183、AF081182、AF130315、AF339751、AJ308551、AF301015、AF329681、AF319597、AJ275089-AJ275113を参照されたい。また、幾つかの大腸菌血清型由来のＥｓｐＢの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号U80796、U65681、Y13068、Y13859、X96953、X99670、X96953、Z21555、AF254454、AF254455、AF254456、AF254457、AF054421、AF059713、AF144008、AF144009を参照されたい。また、幾つかの大腸菌血清型由来のＥｓｐＤの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Y13068、Y13859、Y17875、Y17874、Y09228、U65681、AF054421及びAF064683を参照されたい。
【００７１】
これらの配列はオリゴヌクレオチドプローブをデザインするために用いることができ、他の大腸菌血清型からの遺伝子のためのゲノム又はｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いることができる。オリゴヌクレオチドプローブやＤＮＡライブラリーを調製することと同様に、核酸ハイブリダイゼーションによりこれらをスクリーニングするための基本的な戦略は、当該分野の通常の知識を有する者にとって周知である。例えば、DNA Cloning: Vol. I（上掲）、Nucleic Acid Hybridization（上掲）、Oligonucleotide Synthesis（上掲）、Sambrook et al.（上掲）を参照されたい。スクリーニングされたライブラリーからの１つのクローンが陽性ハイブリダイゼーションによって同定されたならば、特定のライブラリー挿入断片がIII型遺伝子又はそのホモログを含んでいることは、制限酵素分析やＤＮＡ塩基配列の決定により確認することができる。次いで、標準的な技法を用いて種々の遺伝子をさらに単離することができ、そして、所望により、ＰＣＲ法又は制限酵素により完全長配列の一部を欠失させることができる。
【００７２】
同様に、フェノール抽出等の公知の方法を用いて細菌から直接遺伝子を単離することができ、当該配列は所望の変更を加えるためにさらに操作される。ＤＮＡの取得、及び単離に用いられる種々の技法については、例えば、Sambrook et al.（上掲）の既述を参照されたい。あるいは、目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、クローン化するよりむしろ合成により調製することができる。特定のアミノ酸配列に適したコドンを用いてＤＮＡ配列をデザインすることができる。一般的に、その配列が発現のために用いられるときは、意図された宿主にとっての好ましいコドンを選択することができるであろう。完全な配列は、標準的な方法によって調製され、重複（オーバーラップ）した複数のオリゴヌクレオチドから組立て、完全なコーディング配列へと構築することができる。例えば、Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984) Science 223:1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311を参照されたい。
【００７３】
所望のタンパク質に対するコーディング配列が調製、又は単離されたならば、それらは任意の好ましいベクター又は複製単位（レプリコン）へクローン化され得る。数多くのクローニングベクターは当業者に公知であり、適切なクローニングベクターを見出すのは、選択の問題である。クローン化のための組換えＤＮＡベクター及びそれらを形質転換できる宿主細胞の具体例は、バクテリオファージλ(大腸菌)、pBR322(大腸菌)、pACYC177(大腸菌)、pKT230(グラム陰性細菌)、 pGV1106(グラム陰性細菌)、pLAFR1(グラム陰性細菌)、pME290(非大腸菌グラム陰性細菌)、pHV14(大腸菌及び枯草菌)、pBD9 (バチルス)、pIJ61(ストレプトマイセス)、pUC6(ストレプトマイセス)、YIp5(酵母)、YCp19(酵母)及びウシパピローマウイルス（哺乳類細胞）である。サムブルックら（上掲）、DNA Cloning（上掲）、パーバル（上掲）を参照されたい。
【００７４】
遺伝子はプロモーター、リボソーム結合部位（細菌での発現の場合）、及び、任意に、オペレーター（以下、「調節」領域と総称する）の制御下に配置することができ、それにより所望のタンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、この発現構築体を含むベクターによって形質転換された宿主細胞中でＲＮＡへ転写される。当該コーディング配列はシグナルペプチド又はリーダー配列を含んでもよく、又は含まなくてもよい。リーダー配列は、翻訳後のプロセッシング段階で宿主により除去され得る。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号、第４，４２５，４３７号、第４，３３８，３９７号を参照されたい。
【００７５】
宿主細胞の増殖に関連して当該タンパク質配列の発現を制御する他の制御配列もまた好ましい。これらの制御配列は当業者に公知であり、例えば、制御物質の存在を含む化学的又は物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオン又はオフにする例が挙げられる。他のタイプの制御領域、例えば、エンハンサー配列もまたベクター内に存在してもよい。
【００７６】
調節配列及び他の制御配列は、上述したクローニングベクターのようなベクターへ挿入される前にコーディング配列に連結され得る。あるいは、コーディング配列は、すでに調節配列と適当な制限酵素切断部位を備えた発現ベクターへ直接クローン化され得る。
【００７７】
ある場合には、適切な向きで調節配列に連結されるようにコーディング配列を改変する必要がある。タンパク質の変異体又は類似体（アナログ）を製造することもまた望ましい。変異体又は類似体は、当該タンパク質をコードする配列の一部を欠失するか、１つの配列を挿入するか、及び／又は当該配列内の１以上のヌクレオチドを置換することによって調製され得る。部位特異的変異導入法のようなヌクレオチド配列を改変する技術は、例えば、サムブルックら（上掲）、DNA Cloning（上掲）、Nucleic Acid Hybridization（上掲）に記載されている。
【００７８】
次いで、当該発現ベクターが適切な宿主細胞を形質転換するために用いられる。数多くの哺乳動物細胞株が技術的に知られ、これらはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株を含む。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞性ガン細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Madin-Darbyウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞のみならずその他の細胞があるが、これらに限定されない。同様に、大腸菌(E.coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、及び連鎖球菌(Streptococcus spp.)等の細菌宿主も本発明の発現構築物として用いられるであろう。本発明に有用な酵母宿主は、とりわけ、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、Kluyveromyces fragilis、 Kluyveromyces lactis、 Pichia guillerimondii、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)及び Yarrowia lipolyticaが含まれる。バキュロウイルス発現ベクターを使用する昆虫細胞には、とりわけ、 Aedes aegypti、 Autographa californica、 Bombyx mori、 Drosophila melanogaster、 Spodoptera frugiperda, 及び Trichoplusia niが含まれる。
【００７９】
発現システム及び選択された宿主にも依存するが、本発明のタンパク質は、目的タンパク質が発現されるような条件下で、上述した発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養することによって製造される。次いで、当該タンパク質は宿主細胞から単離、精製される。適切な増殖条件及び回収方法の選択は当該技術分野における通常の技術である。
【００８０】
本発明のタンパク質は、公知のアミノ酸配列や目的遺伝子のＤＮＡ配列から推測されるアミノ酸配列を用いて、固相ペプチド合成法等の化学合成法により製造することもできる。このような種々の方法は当業者にとって公知であり、例えば、固相ペプチド合成技術としては、J.M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)及び G. Barany and R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross and J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, New York, (1980), pp. 3-254を、及び、古典的な液相合成方法としては、M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984) and E. Gross and J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis,
Biology, 上掲, Vol. 1を参照されたい。ペプチドの化学合成は、当該抗原の小さな断片が目的とする被検体における免疫応答を引き起こすことができる場合には好ましいであろう。
【００８１】
上記細胞培養液上清及び、所望により、さらなる組換え及び／又は精製タンパク質が製造されたならば、それらは哺乳動物被検体へ与えるための組成物へと製剤化される。このＣＣＳは、単独で、あるいは医薬的に許容される溶媒又は賦形剤と混合されて投与される。好ましい溶媒としては、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等、及びそれらの組合わせである。加えて、当該溶媒は少量の補助剤を含んでもよく、この補助剤は、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、又はワクチン組成物の場合のアジュバント等であり、ワクチンの効果を増強する。好ましいアジュバントについては、さらに以下に説明する。本発明の組成物は、薬剤、サイトカイン、又は他の生物学的応答の修飾因子等の補助的な物質を含んでもよい。
【００８２】
上記に説明したように、本発明のワクチン組成物は、１以上のＥＨＥＣ抗原の免疫原性をさらに向上させるためのアジュバントを含んでもよい。このようなアジュバントは任意の化合物又はＥＨＥＣ抗原若しくは抗原の組合わせに対する免疫応答を増強するように作用する化合物を含み、これによりワクチンに必要な抗原量、及び／又は十分な免疫応答を起こすために必要な投与回数を減少させることができる。アジュバントは、例えば、乳化剤、ムラミルジペプチド、アブリジン、水酸化アルミニウム、キトサンをベースとするアジュバント、及び任意のサポニン等の水溶性アジュバント、オイル、及びアンフィジェン、リポ多糖（ＬＰＳ）細菌細胞壁抽出物、細菌ＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド及びそれらの組み合わせ(Schijns et al., Curr. Opi. Immunol. (2000) 12:456)、抗酸菌(Mycobacterial phlei (M. phlei) 細胞壁抽出物（ＭＣＷＥ）(U.S. Patent No.4,744,984)、 抗酸菌ＤＮＡ (M-DNA)、抗酸菌ＤＮＡと抗酸菌細胞壁複合体(MCC)等の、その他の公知の物質を含んでもよい。例えば、ここで乳化剤として役立つであろう化合物は天然の及び合成の乳化剤を含み、陰イオン性のみならず、陽イオン性及び非イオン性化合物である。合成化合物の中で、陰イオン性乳化剤は、例えば、ラウリン酸及びオレイン酸のカリウム、ナトリウム及びアンモニウム塩、脂肪酸のカルシウム、マグネシウム及びアルミニウム塩（すなわち、金属セッケン）、及びラウリル硫酸ナトリウム等の有機スルホン酸塩である。合成陽イオン性化合物は、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド(cetyltrimethylammonium bromide)を含み、一方、合成非イオン性化合物には、グリセロールエステル（例えば、グリセリル・モノステアリン酸(glyceryl monostearate)）、ポリオキシエチレングリコールエステル又はエーテル、並びにソルビタン・脂肪酸エステル（例えば、ソルビタン・モノパルミチン酸(sorbitan monopalmitate)）及びそれらのポリオキシエチレン誘導体（例えば、ポリオキシエチレン・ソルビタン・モノパルミチン酸(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate)）が例示される。天然の乳化剤には、アカシア（アラビアゴム）、ゼラチン、レシチン及びコレステロールが含まれる。
【００８３】
その他の適したアジュバントは、例えば、単一の油、油混合物、油中水型エマルジョン（乳剤）、又は水中油型エマルジョン（乳剤）等の油成分から構成される。油は、ミネラルオイル（鉱油）、植物油、又は動物油でありうる。ミネラルオイル、又は油成分がミネラルオイルである水中油型エマルジョンが好ましい。これについて、「ミネラルオイル（鉱油）」とは、ペトロラタム(petrolatum)から蒸留技術により得られる液体の炭化水素混合物と定義され、「流動パラフィン(liquid paraffin)」、「流動ペトロラタム(liquid petrolatum)」及び「ホワイト油(white mineral oil)」と同義語である。この用語はまた、「軽油(light mineral oil)」すなわち、「ペトロラタムの蒸留によって同様に得られるがミネラルオイルよりも若干低い比重を有する油」をも含むものである。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（上掲）を参照されたい。特に好ましい１つの油成分は、商品名「EMULSIGEN PLUS」としてネブラスカ州ラルストン（Ralston, Nebraska）のMVP Laboratoriesから販売され、軽油と０．０５％ホルマリン及び防腐剤としての３０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む水中油型エマルジョンである。適切な動物油には、例えば、タラの肝油、オヒョウ油( halibut oil)、ニシン油(menhaden oil)、オレンジラフィー油(orange roughy oil)及びサメの肝油が含まれ、これらはすべて市販品として入手可能である。適切な植物油には、カノーラ油 (canola oil)、扁桃油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ピーナツ油、ベニバナ油(safflower oil)、ゴマ油、大豆油等を含むがこれらに限定されない。
【００８４】
あるいは、数多くの脂肪族窒素性塩基がワクチン製剤のアジュバントとして使用され得る。例えば、公知の免疫アジュバントは、アミン類、４級アンモニウム化合物、グアニジン、ベンザミジン及びチオウレア類を含む(Gall, D.
(1966) Immunology 11:369-386)。具体的な化合物には、dimethyldioctadecyl-ammonium bromide (DDA)(available from Kodak) and N,N-dioctadecyl-N,N-bis(2-hydroxyethyl)propanediamine ("avridine")が含まれる。免疫アジュバントとしてのＤＤＡの使用は、例えば、the Kodak Laboratory Chemicals Bulletin 56(1): 1-5 (1986); Adv. Drug Deliv. Rev. 5(3):163-187 (1990); J. Controlled Release 7:123-132 (1988); Clin. Exp. Immunol. 78(2):256-262 (1989); J. Immunol. Methods 97(2):159-164 (1987); Immunology 58(2):245-250 (1986); and Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 68(3):201-208 (1982)に記載されている。アブリジンもまた周知のアジュバントである。例えば、Wolff, IIIらに与えられた米国特許第４，３１０，５５０号を参照されたい。ここには、一般名としてのN,N-higher alkyl-N',N'-bis(2-hydroxyethyl)propane diamines、及び具体的にはアブリジンのワクチンアジュバントとしての使用について記載されている。Babiukに与えられた米国特許第５，１５１，２６７号、及びBabiuk et al. (1986) Virology 159:57-66もまたワクチンアジュバントとしてのアブリジンの使用に関する。
【００８５】
ここでの使用に特に好ましいものは、ＤＤＡを含み、EMULSIGEN PLUSアジュバントの改良型で「ＶＳＡ３」として知られているアジュバントである(米国特許第５，９５１，９８８号参照)。
【００８６】
ＣＣＳワクチン組成物は、ＣＣＳ製剤とアジュバントとを均一且つ親密に会合させることにより調製することができ、それには当業者に周知である混合、超音波処理、及び微小流体化を含む技法が用いられるがこれらに限定されない。アジュバントは、好ましくはワクチンの約１０〜５０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約２０〜４０％（ｖ／ｖ）及び最も好ましくは約２０〜３０％又は３５％（ｖ／ｖ）又はこれらの範囲内の整数％含むであろう。
【００８７】
本発明の組成物は、通常、注射剤として、液体溶液又は懸濁液の何れか、又は注射の前に液体溶媒中に溶液又は懸濁液とするに適した固形の形態として調製される。当該製剤はまた、乳化された、又は有効成分がリポソーム媒体又は他の持続する運搬のために用いられる特定の担体（carriers）に封入された(encapsulated)固形の形態として調製されてもよい。例えば、当該ワクチンは油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、部位特異的エマルジョン、長期滞在型エマルジョン、粘着性エマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、リポソーム、微粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ナノ粒子及び種々の天然又は合成ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテートコポリマーやHytrel（登録商標）コポリマー等の非再吸収性不浸透性ポリマー、ハイドロゲル等の膨潤性ポリマー、又はコラーゲンや吸収性縫合糸を製造するために用いられるような特定のポリ酸又はポリエステル等の再吸収性ポリマーの形態であってもよく、これらはワクチンの持続的な放出を可能とする。
【００８８】
さらに、ポリペプチドは中性の、又は塩の形態の何れかで組成物へ製剤化することができる。医薬的に許容される塩には、酸付加塩（有効成分のポリペプチドのアミノ基が遊離の形態で）を含み、これらは、例えば、塩酸又はリン酸等の無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸で形成される。遊離のカルボキシル基から形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化第二鉄等の無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカニン等の有機塩基に由来してもよい。
【００８９】
このような剤形の実際の調製方法は、当業者にとって公知であるか、又は明白であろう。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18th edition, 1990を参照されたい。
【００９０】
当該組成物は、分泌されたＥＨＥＣ抗原の有効量を含むように処方され、その厳密な量は当業者によって容易に決定することができる。当該投与量は治療される動物及び当該動物の免疫系の抗体合成能力に依存する。投与される成分又は剤形は治療される被検動物に所望の状態を達成するに十分な１以上の分泌されたＥＨＥＣ抗原の一定量を含む。本発明の目的のための、組換え及び／又は精製された分泌ＥＨＥＣ抗原を添加又は無添加のＣＣＳを含有するワクチンの１つの治療上の有効量は、約０．０５〜１５００μｇの分泌されたＥＨＥＣタンパク質、好ましくは約１０〜１０００μｇの分泌されたＥＨＥＣタンパク質、より好ましくは約３０〜５００μｇの、最も好ましくは約４０〜３００μｇの分泌されたＥＨＥＣタンパク質、又はこれらの範囲内の整数を含む。ＥｓｐＡ＋Ｔｉｒだけでなく、他のＥＨＥＣ抗原は全ＣＣＳタンパク質の約１０％から５０％含まれても良く、例えば、約１５％から４０％及び好ましくは約１５％から２５％である。もし、組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒを補充する場合は、当該ワクチンは約５〜５００μｇのタンパク質、より好ましくは約１０〜２５０μｇ及び最も好ましくは約２０〜１２５μｇ含むことができる。
【００９１】
投与の経路は、経口、局所、皮下、筋肉内、静脈内の、皮下の、皮内の、経皮的な及び皮下を含むがこれらに限定されない。投与の経路によって投与量あたりの用量は、好ましくは約０．００１〜１０ｍｌ、より好ましくは約０．０１から５ｍｌ及び最も好ましくは約０．１〜３ｍｌである。ワクチンは１回の投与により投与することができ、又は複数回投与（ブースト）により１つの予定に従い、そして年齢、体重及び被検体動物の状態に適した期間にわたって、特定のワクチン製剤及び投与経路で投与することができる。
【００９２】
如何なる適切な医薬投与手段も当該ワクチンを脊椎動物へ投与することができる。例えば、従来の注射針、ばね、又は圧縮ガス（空気）インジェクター(U.S. Patent Nos. 1,605,763 to Smoot; 3,788,315 to Laurens; 3,853,125 to Clark et al.; 4,596,556 to Morrow et al.; and 5,062,830 to Dunlap)、液体ジェットインジェクター(U.S. Patent Nos. 2,754,818 to Scherer; 3,330,276 to Gordon; and 4,518,385 to Lindmayer et al.)、及び粒子インジェクター(U.S. Patent Nos. 5,149,655 to McCabe et al. and 5,204,253 to Sanford et al.)はすべて当該組成物の投与に適当である。
【００９３】
ジェットインジェクターを用いる場合は、液体ワクチン組成物の１回のジェットを高圧、高速条件下、例えば、１２００〜１４００ＰＳＩで噴出され、それによって皮膚に穴をあけ、免疫に適した深さまで貫通する。
【００９４】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、同時に、その範囲の如何なる限定をも構成するものではない。それどころか、それらの種々の他の実施形態、改変、及び均等物であって、その記載を読むことによって本発明の精神及び／又は添付請求の範囲から逸脱することなく当業者に示唆するものを当然含むと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離されたＣＣＳタンパク質の電気泳動パターンである。
【図２】ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離されたＥｓｐＡ、Ｔｉｒ、ＥｓｐＢ、及びインチミンの電気泳動パターンである。
【図３】ＣＣＳワクチンで免疫し、続いてＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を投与したウシによるＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の糞便からの排泄量である。
【図４】以前に感染したことのあるウシにおける、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の糞便からの排泄の再活性化である。
【図５】組換えＥｓｐＡ＋Ｔｉｒワクチン、及び組換えＥｓｐＢ＋インチミンワクチンによる免疫化に対する血清学的反応である。
【図６】組換えＥｓｐＡ＋Ｔｉｒワクチン、及び生理食塩水ワクチンによる免疫後の排泄糞便中のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７である。
【図７】実施例６のワクチン試験における大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を排泄する動物の個体数の経時変化。生理食塩水中に再懸濁された糞便試料を、セフィキシム及びテルライトを補充したソルビトール・マッコンキー(Sorbitol MaConkey)寒天培地に直接プレーティングすることにより菌体を検出した。棒グラフの塗り潰した部分はコントロールのグループであり、斜線部分はＥＨＥＣワクチン投与グループである。
【図８】ＥＨＥＣ分泌タンパクに対するワクチン接種した動物の血清のイムノブロット分析。各ブロットには、野生型大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ）、III型分泌変異体（ΔＳｅｐＢ）、Ｔｉｒ変異体（ΔＴｉｒ）及び精製グルタチオン-ｓ−トランスフェラーゼ：Ｔｉｒ融合タンパク（ＧＳＴ−Ｔｉｒ）からの分泌タンパクが含まれる。各タンパクは、ＳＤＳ−１０％ＰＡＧＥによって分離し、クーマシーブルーで染色し（図８Ａ、左上のパネル）、又はニトロセルロースに移し、３種類のワクチン処方物によってそれぞれ免疫された動物の代表血清で標識した（図８Ａ、上の（右側の３つの）各パネル）。下の４つのパネル（図８Ｂ）は、試験開始後０日、２１日、２５日及び４９日に採取した、ＥＨＥＣワクチンが投与された１匹の代表動物の血清で標識したものに関する。
【図９】実施例６の試験の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を排泄した動物の各グループのパーセント（図９Ａ）及び回収菌体総数（図９Ｂ）の経時変化。J. Van Donkersgoed et al., Can. Vet. J. (2001) 42:714に記載されている免疫磁気濃縮後、セフィキシム及びテルライトを補充したソルビトール・マッコンキー（Sorbitol MaConkey）寒天培地に糞便をプレーティングすることにより菌体を検出した。図９Ａの棒グラフの塗り潰し部分は、コントロール、斜線部分は、ＥＨＥＣワクチン、空白部分は、ΔＴｉｒワクチンを表す。図９Ｂの■はコントロール、●はＥＨＥＣワクチン、▲はΔＴｉｒワクチンを表す。
【実施例１】
【００９６】
細胞培養液上清（ＣＣＳ）の調製
野生型ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７をＣＣＳタンパク質の合成が最大となる条件で増殖させた（Li et al., Infect. Immun. (2000) 68:5090）。簡単に説明すると、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の一晩静置培養液は、３７℃（±５％炭酸ガス）で一晩ＬＢ(Luria-Betani)培地で増殖させた。この培養液を０．１％カザミノ酸、０．４％グルコース、８ｍＭ硫酸マグネシウム(ＭｇＳＯ４)及び４４ｍＭ炭酸水素ナトリウム(ＮａＨＣＯ２)を添加したＭ９最小培地で１：１０に希釈した。培養液は、５％炭酸ガスの下３７℃で静置し６００ｎｍの吸光度が０．７〜０．８になるまで培養した（６〜８時間）。４℃で、８０００回転、２０分間遠心分離することにより細菌を除去した。この上清を限外ろ過により１００倍に濃縮し、全タンパク質量をＢＣＡ(bicinchonic acid)プロテインアッセイ法で決定した。
【００９７】
図１は、ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）と、続いてクーマシーブルー染色によって得られた分子量マーカー（レーン１）及び典型的なＣＣＳタンパク質パターン（レーン２）を示す。ＥｓｐＡ（２５ｋＤ）、ＥｓｐＢ／ＥｓｐＤ（４０ｋＤ）、分解されていないＴｉｒ（７０ｋＤ）及び分解されたＴｉｒ（５５ｋＤ）の位置を示した。HP Scanjet 5100C及びID softwareプログラムを用いた濃度測定分析により決定した結果、ＥｓｐＡは、分解されていないＴｉｒの約５％、分解されたＴｉｒの約２０％、及び全タンパク質の約６％であった。しかしながら、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの濃度測定により決定されたタンパク質の割合は、バックグラウンド染色の変動や、クーマシーブルー染色の取り込みの変動や、バンドによる濃さのばらつきや、その他当業者に公知の種々の因子のために正確ではない。
【実施例２】
【００９８】
組換えタンパク質の調製
ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、インチミン及びＴｉｒをコードする遺伝子を単離した（Li et al., Infect. Immun. (2000) 68:5090）。ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の臨床分離株をＤＮＡの供給源として用いた。ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、Ｔｉｒ、及びインチミンの２８０個のカルボキシ末端アミノ酸をコードするｅａｅ領域は、染色体ＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、単一の制限酵素切断部位を導入して適当なプラスミドにクローン化した。生成したプラスミドを切断し、ヒスチジンタグ融合物が生成するように連結した。プラスミドは発現用大腸菌株に電気的に導入し、この大腸菌を増殖させた（Ngeleka et al., Infect. Immun. (1996) 64:3118）。遺伝子発現はＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトプラノシド）による誘導により、Ｔａｃプロモーターを用いて作動させた。細菌はペレット化し、トリス緩衝化生理的食塩水中に再懸濁し、超音波処理により溶菌させた。溶菌液は不溶物を除去するために遠心分離し、ヒスチジンタグを含むタンパク質を特異的に結合するニッケルアフィニティークロマトグラフィーカラム固定相を通してヒスチジンタグタンパク質を精製した。調製されたすべてのタンパク質は使用時まで−２０℃で保存した。
【００９９】
組換えタンパク質の純度は１０％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、クーマシーブルー染色により評価した。上記クロマトグラフィーにより精製された組換えタンパク質の典型的なゲルパターンを図２に示す。組換えＥｓｐＡ（レーン２）、組換えＥｓｐＢ（レーン３）及び組換えインチミン（レーン４）は、比較的純粋な形態で回収されたが、組換えＴｉｒ（レーン５）は多少の分解を受けていた。
【実施例３】
【０１００】
ワクチンの製剤化および投与
ワクチンは、ＣＣＳ又は組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒを、３０〜４０％アジュバントを含む基材２ｍｌに混合することにより製剤化した。ワクチンは皮下に投与した。動物を１日目及び、３〜４週間の間隔をおいて再び免疫（追加免疫又はブーストという。）した。最初の免疫の前、夫々のブースト時、及び実験終了時に血清試料を採取した。
【０１０１】
免疫に対する血清学的な応答を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて決定した。１００μｌの組換えＥｓｐＡ (０．１６μg/ウェル)、組換えＴｉｒ (０．１μg/ウェル)、組換えＥｓｐＢ (０．２４μg/ウェル)及び組換えインチミン (０．１８７μg/ウェル)を用いてマイクロタイタープレートのウェルにコート（被膜）し、当該プレートを４℃で一晩インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、０．５％脱脂乾燥ミルクを含むリン酸緩衝化生理的食塩水でブロッキングした。段階希釈した血清を各ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ウェルを洗浄及びブロッキングし、１００μｌのペルオキシダーゼ接合ウサギ抗ウシ免疫グロブリンＧ抗体（１：５０００）を各ウェルに添加して３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、プレートを４９２ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【実施例４】
【０１０２】
実験動物
８歳から１２歳の間の複数のウシを地元の牧場から購入した。夫々の動物から１４日間毎日糞便試料を採取した。糞便試料中のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の数をレインボーアガーにプレーティングして測定した。当該プレートを３７℃で２日間インキュベートし、黒いコロニー数を数えた。増殖は０〜５で得点（スコア）化した。スコア０（ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７なし）の動物をすべての実験に用いた。
【実施例５】
【０１０３】
動物定着モデル
２ヶ月より長い間感染が維持されたウシのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７定着モデルを用量−滴定プロトコルにより開発した。
【０１０４】
ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７は実施例１に示した方法で増殖させた。２４頭のウシを８頭ずつ３つのグループに分割した。グループ１は１０６、グループ２は１０８、グループ３は１０１０ＣＦＵ（定着ユニット）のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を、第０日に５０ｍｌ容量で口腔−胃挿管によって接種された。
【０１０５】
排泄を監視（モニター）するため、第１日から第１４日まで糞便材料を収集した。糞便材料は重さを測定し、滅菌した生理的食塩水に懸濁し、培養液に接種した。培養液の濁度は実施例１のように測定した。
【０１０６】
図３に示したように、グループ２（１０８ＣＦＵ）のウシにより排泄されたＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の数と、グループ３（１０１０ＣＦＵ）のウシにより排泄されたＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の数との間には有意な差異は認められなかった。グループ２のウシは、１４日間の夫々の日にほとんどのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄した。グループ２のウシにより排泄されたＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の数は第６日に最大値に達し第１４日にはゼロにまで減少した。
【０１０７】
ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄した動物（以下「陽性」という。）は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の排泄が検出できないレベルに減少するまで、さらに４０日間維持した。以前に陽性であった動物（以下「キャリアー（保菌動物）」という。）により排泄されたＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７は、２４時間摂食を抑制し、市販のクロストリジウムの又はH. somnusワクチンを接種することにより再活性化した。図４に示したように、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄する保菌動物の数は、第６及び７日には約５０％の最大値に達し、第１５日にはゼロに減少した。
【０１０８】
１０８ＣＦＵの投与量は、感染後の１４日間に検出可能な数の排泄されたＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を産生し（図３）、持続的に感染した動物に帰結した（図４）ため、以後の実験において投与する量としてこの投与量を用いた。
【実施例６】
【０１０９】
ＣＣＳの保護能力
分泌タンパク質のワクチンとしての潜在能力をテストするため、ＣＣＳを油を主材料とするアジュバントであるＶＳＡ３（米国特許第5,951,988号、S. van Drunen Littel-van den Hurk et al., Vaccine (1993) 11:25）と、２ｍｌ中に２００μｇのＣＣＳタンパク質と３０容量％(v/v)のアジュバントとなるように混合した（ＣＣＳワクチン）。対照群のために、滅菌した生理的食塩水をＶＳＡ３と、２ｍｌ中に０μｇのＣＣＳタンパク質と３０容量％(v/v)のアジュバントとなるように混合した（生理食塩水ワクチン）。
【０１１０】
１６頭のウシを８頭ずつ２つのグループに分けた。第１日及び第２２日（ブースト）に、グループ１のウシは２ｍｌのＣＣＳワクチンを皮下に投与され（試験群）、グループ２のウシは２ｍｌの生理食塩水ワクチンを皮下に投与された（対照群）。ＥＬＩＳＡ（実施例３）により、第１日（免疫前）、第２２日及び第３６日に抗体陽転が起きたかどうか検定した。表１の第２２日に示したように、グループ１の動物は、ＥｓｐＡ及びＴｉｒに対する特異的な抗体価を示した。また、第３６日には、これらの抗体価は大きく増加を示した。グループ２の動物は、第２２日及び第３６日に特異的な抗体価を示さなかった。特に、ＥＨＥＣワクチンを接種されたグループは、初回免疫と第１回の追加免疫後にタイプ３分泌タンパク質に対する特異的な抗体価が１３倍に上昇し、偽薬ワクチングループでは１頭だけが抗体陽転したのに対し、ＥＨＥＣワクチングループの８頭の動物は特異的な抗体価において４５倍の増加を示した(X２, p=0.0002)。
【０１１１】
［表１］ＣＣＳ免疫に対する血清学的応答
【０１１２】
第３６日に、グループ１及びグループ２の動物に１０８ＣＦＵのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を口腔−胃挿管によって投与し、糞便への排泄を１４日間モニターした（実施例５）。表２にまとめたように、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄した試験群の動物は対照群の動物より少なく、その排泄した試験群動物は、対照群動物よりも短い期間ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄した（図７）。特に、ワクチン接種した動物において排泄された日数の中央値は、偽薬グループの３．５日に比べて１．５日であった（Wilcoxin Signed Rank Test, p=0.08）。偽薬で免疫された８頭の動物のうち７頭が試験期間中当該細菌を排泄し、それらの動物のうち４頭が４日又はそれ以上の連続する期間当該細菌を排泄した。このことは、それらの動物は持続的に感染していることを示している。ＥＨＥＣワクチンで免疫した８頭の動物のうち５頭は試験期間中のある時点で当該細菌を排泄したが１頭だけが連続する２日以上の間当該細菌を排泄した。このことは、定着は一過性であり、偽薬グループよりも有意に少ないことを示す。糞便試料から単離された全細菌数は、ＥＨＥＣで免疫されたグループでは偽薬グループに比べて有意に低下していた（Wilcoxin Signed Rank Test, p=0.05）。前者は回収された糞便１ｇ当たりの６．２５定着ユニット（ＣＦＵ）の中央値を有するのに対し、後者は８１．２５ＣＦＵ／ｇの中央値を有した。従って、３型分泌タンパク質を用いたワクチンは、糞便の培養液で検出される排泄された細菌数だけでなく当該生物を排泄した動物の排泄日数の減少によって反映されるように、当該生物の小腸への定着能力を減少させるように思われる。
【０１１３】
［表２］試験群及び対照群による排泄
【０１１４】
これらのデータは、ＣＣＳがウシにおいて、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄する動物数及びＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７が排泄される日数の両方を減少させる抗体応答を誘導することを示す。
【０１１５】
ワクチン製剤の有効性を高めるために、６頭の子ウシのグループを上記方法により、分泌タンパク質の３つの投与量（５０μg、１００μg、２００μg）の１つ又は偽薬で免疫し、第０日、第２1日（ブースト）および第３５日に採取した血清サンプルを用いて血清学的応答を測定した。ＥＨＥＣワクチンを投与されたグループの間では如何なる時点においても抗-ＥＨＥＣ、抗-Ｔｉｒ、又は抗-ＥｓｐＡ応答について有意な差異は認められなかったが、３つの投与量のすべてのグループは、第２１日及び第３５日における偽薬グループよりも有意に高かった。従って、第２のワクチン投与試験は、１歳児のウシの３つのグループに５０μgの分泌タンパク質（ｎ＝１３）、Ｔｉｒ変異株から得られた５０μgの分泌タンパク質（ΔＴｉｒ, ｎ＝１０）又は偽薬（ｎ＝２５）を用いて３回免疫するように計画した。用いたアジュバントはＶＳＡ３であり、動物は第０日、第２１日、第３５日に皮下投与により免疫され、続いて第４９日に大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を投与された。免疫に対する血清学的応答を表３に示した（第０日及び第４９日のみ）。上述した試験と同様の結果が観察された。ΔＴｉｒワクチンを投与されたグループは、野生株から調製されたワクチンを投与されたグループと同様に全分泌タンパク質に対して同等の応答を示したが、予測したように、Ｔｉｒに対しては有意に減少した応答を示した（Wilcoxin Signed Rank Test, p=0.006）。しかしながら、前者のグループは、確かに抗-Ｔｉｒ抗体レベルの上昇を示しており（Wilcoxin Signed Rank Test, p=0.009）、これは、免疫的に関連する分子を生産する生物に曝すか、又は大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に曝すかの何れかであることを示している。これは、さらに偽薬グループにおいては大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の投与日において抗-Ｔｉｒ抗体に有意な上昇があったが、偽薬グループとΔＴｉｒグループとで差がないという観察によって支持される。ＥｓｐＡに対する応答はＥＨＥＣとΔＴｉｒワクチングループの両方で同様であり、偽薬で免疫した動物よりもはるかに高い。ＥｓｐＡに対する応答は、ＥＨＥＣ及びΔＴｉｒワクチングループの双方において同様であり(p=0.45, Kruskal-Wallis ANOVA)、偽薬グループよりも有意に高い応答を示した(p<0.0001)。
【０１１６】
［表３］野生型大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ）、又は同質遺伝子型Ｔｉｒ変異株（ΔＴｉｒ）から調製された分泌タンパク質、又は偽薬を用いた血清学的免疫応答中央値。力価は血清の最後の陽性希釈率（ ）の幾何平均値として表した。括弧内の数字は２５％から７５％の順位を示す。
【０１１７】
夫々のワクチン製剤に対する免疫応答は、グループごとに代表的な２頭の動物から得られた血清を用いたウェスタンブロッティングによっても定性的に分析した。代表的な動物についての結果を図８に示した。III型分泌系によって分泌されたタンパク質はウシにおいて高度に免疫原性を有することが示された。ＥＨＥＣ及びΔＴｉｒワクチングループにおける応答は、後者のグループにおいて欠けているＴｉｒに対する応答を除いて同様であった（図８、上部パネル）。ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ及びＴｉｒはすべて反応性があり、第２１日の第２免疫によってリポ多糖類に対する大きな応答も認められた。ワクチン接種動物における免疫応答の速度論（キネティクス）は、抗−Ｔｉｒ抗体が４３ｋＤａ及び１００ｋＤａタンパク質に対する抗体のように単一の免疫によって検出できることを示す（図８、下部パネル）。後者のタンパク質はｓｅｐＢ及びｔｉｒ変異株と同様に野生株によっても生産され、１００ｋＤａタンパク質はおそらく、III型でないＥＨＥＣ分泌タンパク質であるＥｓｐＰである。
【０１１８】
第４９日に大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を経口投与した後、夫々のグループは当該生物の糞便中への排泄について１４日間毎日モニターされた。この実験においては、細菌は直接プレーティング法よりも以下の免疫濃縮法（J. Van Donkersgoed et al., Can. Vet. J. (2001) 42:714、Chapman及びSiddons, J. Med. Microbiol. (1996) 44:267）により培養された。なぜならば、この感染モデルにおいては１歳児のウシは子ウシよりも少ない量しか排泄しないからである。投与の日、偽薬グループの２頭の動物は大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７について培養陽性であり、試験から除外した。偽薬で免疫した動物は、２つのＥＨＥＣワクチングループに比べて、投与後当該生物をはるかに多く排泄した（図９）。偽薬ワクチンを接種された動物は、中央値で４日間当該生物を排泄したが、これは他の２つのワクチンを接種されたグループによる中央値の０日よりも有意に長かった(p=0.0002, Kruskal-Wallis ANOVA)。ＥＨＥＣ及びΔＴｉｒワクチングループから回収された細菌は著しく少なかった(p=0.04, Kruskal-Wallis ANOVA)。感染後２日目以降、偽薬ワクチングループ動物の７８％は少なくとも１日当該生物を排泄したが、これに比べてＥＨＥＣワクチングループでは１５％、及びΔＴｉｒワクチングループでは３０％であった（表４）。
【０１１９】
上記に示されたデータは、ＥＨＥＣの病原性因子、すなわち、III型分泌系によって分泌されるそれらは、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７等のようなＥＨＥＣ細菌のウシへの定着を減少させるための有効なワクチン成分として使用し得ることを示す。ウシは当該生物へ自然にさらされただけではこれらのタンパク質に対して通常大きな血清学的な応答を示さないが、これらのタンパク質はヒトにおける感染後の免疫応答の主要なターゲットである(Li et al., Infect. Immun. (2000) 68:5090)。しかしながら、これらのタンパク質を用いてワクチン接種された動物は抗原刺激されており、当該生物の経口投与によって抗−ＥＨＥＣ及び抗−Ｔｉｒ価の上昇を示す。
【０１２０】
Ｔｉｒはウシ小腸への定着にとって必要と思われ、このことはΔＴｉｒ大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株からの分泌タンパク質を含むワクチンが同質遺伝子型の野生型単離株からの同様な製剤ほど有効でないという観察によって支持される。しかしながら、前者のワクチンは偽薬よりもはるかに有効であることから、定着に対する免疫は自然界では多因子性であることを示唆する。このことは免疫応答においてリポ多糖類だけでなく何種類かのタンパク質成分が認識されることを示すウェスタンブロッティング分析によって支持される。リポ多糖類による保護の寄与は知られていないがこの分子に対する抗体の存在は、ネズミＥＨＥＣモデルにおける保護と関連していない(Conlan et al., Can. J. Microbiol. (1999) 45:279; Conlan et al., Can. J. Microbiol. (2000) 46:283)。また、組換えＴｉｒ及びＥｓｐＡを用いた免疫は排泄された細菌数を減少させることができるが、実際の動物数や排泄期間は減少しない。
【０１２１】
非Ｏ１５７血清型の罹患率は、北アメリカにおいて上昇しており、他の地理的位置においてもＥＨＥＣ感染のかなりの割合を占めると思われる。タイプ３の分泌抗原は非Ｏ１５７ＥＨＥＣ血清型間で比較的保存されているらしく、このワクチン製剤はＯ１５７ＬＰＳ抗原に基づく製剤に比べて広く交差保護的である可能性がある。
【０１２２】
［表４］投与後２日から１４日の間に大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を排泄した動物数
【実施例７】
【０１２３】
組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒ及び組換えＥｓｐＢ＋組換えインチミンの保護能力
組換えＥｓｐＡ、組換えＴｉｒ、組換えＥｓｐＢ及び組換えインチミンは、油基材のアジュバント、ＶＳＡ３と混合し、２ｍｌの投与量あたり５０μｇの組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒ又は組換えＥｓｐＢ＋組換えインチミンと３０％(v/v)のアジュバントを含むようにした。滅菌した生理食塩水をＶＳＡ３と混合し、２ｍｌの投与量あたり０μｇの組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒ又は組換えＥｓｐＢ＋組換えインチミンと３０％(v/v)のアジュバントを含むようにした。
【０１２４】
３４頭のウシを４つのグループに分けた。グループ１の１０頭のウシを組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒワクチン（試験群）で、及びグループ２の１０頭のウシを組換えＥｓｐＢ＋組換えインチミンワクチン（試験群）で第１日、第２２日（ブースト）及び第３６日に免疫した。グループ３の７頭のウシと、グループ４の７頭のウシを生理食塩水ワクチン（対照群）で第１日、第２２日（ブースト）及び第３６日に免疫した。抗体陽転を第１日（免疫前）、第２２日及び第３６日にＥＬＩＳＡ法（実施例３）により試験した。図５に示したように、第２２日には、グループ１の動物は組換えＥｓｐＡ及び組換えＴｉｒに対する特異的な抗体価を示し、グループ２の動物は組換えＥｓｐＢ及び組換えインチミンに対する特異的な抗体価を示した。また、図５に示したように、第３６日には、グループ１の動物は組換えＴｉｒに対しては特異的な抗体価の上昇を示したが組換えＥｓｐＡに対しては特異的な抗体価に変化がなく、グループ２の動物は組換えインチミンに対しては特異的な抗体価の上昇を示したが組換えＥｓｐＢに対しては特異的な抗体価の減少を示した。グループ３と４の動物は第２２日及び第３６日において特異的な抗体価を示さなかった。
【０１２５】
第３６日に、グループ１〜４の動物に１０８ＣＦＵのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を投与し、１４日間毎日排泄物をモニターした（実施例５）。図６に示したように、グループ１（組換えＴｉｒ＋組換えＥｓｐＡ）の動物とグループ３（生理食塩水）の動物との排泄物の違いは、投与後の最初の５日間は小さかった。しかし、投与後の第２週には、グループ１の動物とグループ３の動物との違いは明らかとなった。ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄したグループ１の動物数はグループ３の動物数よりも少なかった。グループ１の動物は、グループ２の動物よりも少ない量のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を糞便中に、より少ない期間排泄した。グループ２（組換えＥｓｐＢ＋組換えインチミン）とグループ４（生理食塩水）の動物の間での排泄量の差は、排泄した動物数、排泄したＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の数及び排泄した期間に関しては明らかでなかった。
【０１２６】
これらのデータは、組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒワクチンによって誘発された抗体応答はウシのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７定着を阻止するが、組換えＥｓｐＢ＋組換えインチミンワクチンによって誘発された抗体応答はウシのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７定着を阻止しなかったことを示す。
【実施例８】
【０１２７】
ＣＣＳ＋組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒの保護能力
ＣＣＳ、ＣＣＳ＋組換えＥｓｐＡ、ＣＣＳ＋組換えＴｉｒ、ＣＣＳ＋組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒ及び生理食塩水を夫々アジュバントと混合する。
【０１２８】
２５頭のウシを５頭ずつ５つのグループに分け、第１日、及び第２２日（ブースト）に免疫する。グループ１はＣＣＳワクチンを、グループ２はＣＣＳ＋組換えＥｓｐＡワクチンを、グループ３はＣＣＳ＋組換えＴｉｒワクチンを、グループ４はＣＣＳ＋組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒワクチンを、及びグループ５は生理食塩水ワクチンを夫々投与する。抗体陽転を第１日（免疫前）、第２２日（ブースト）及び第３６日にＥＬＩＳＡ法（実施例３）により試験する。第２２日、及び第３６日に、１〜５の夫々のグループはＥｓｐＡ及びＴｉｒに対する特異的な抗体価を示すが、グループ６の動物は特異的な抗体価を示さない。
【０１２９】
第３６日に、グループ１〜５の動物に１０８ＣＦＵのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を投与し、１４日間毎日排泄物をモニターする。ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄するグループ１〜４の動物はグループ５の動物よりも少ない。グループ５の動物はほとんどのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄する。グループ１の動物はグループ５の動物よりも少ない量のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄し、グループ２〜４の動物はグループ１の動物よりも少ない量のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄する。
【実施例９】
【０１３０】
種々の抗原を用いたＣＣＳの保護能力
ＣＣＳは、２ｍｌの用量が夫々０、５０、１００又は２００μｇのＣＣＳと３０％（v/v）のアジュバントを含有するようにアジュバントと混合される（表５）。
【０１３１】
［表５］種々のアジュバントによるＣＣＳの保護能力
【０１３２】
７２頭のウシを８頭ずつ９グループに分ける。グループ１〜８の動物はＣＣＳ＋アジュバント（表５）で、グループ９のウシは生理食塩水＋アジュバントで、第１日及び第２２日（ブースト）に免疫される。抗体陽転が起きたかどうかを、第１日（免疫前）、第２２日（ブースト）及び第３６日にＥＬＩＳＡ（実施例３）により試験される。グループ１〜８（ＣＣＳ＋アジュバント）の動物は、第２２日及び第３６日に、ＥｓｐＡ及びＴｉｒに対する特異的な抗体価を示す。グループ９（生理食塩水＋アジュバント）の動物は第２２日及び第３６日に特異的な抗体価を示さない。
【実施例１０】
【０１３３】
乳牛におけるＣＣＳの保護能力
２０頭の成人の乳牛を１０頭の２グループに分ける。グループ１はＣＣＳワクチンで、グループ２は生理食塩水ワクチンで、夫々第１日及び第２２日（ブースト）に免疫する。抗体陽転が起きたかどうかを、第１日（免疫前）、第２２日及び第３６日にＥＬＩＳＡ（実施例３）により試験する。第２２日及び第３６日にグループ１の乳牛はＥｓｐＡ及びＴｉｒに対する特異的な抗体価を示すが、グループ２の乳牛は特異的な抗体価を示さない。
【０１３４】
第３６日に、グループ１および２の乳牛に１０８ＣＦＵのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を投与し、１４日間毎日排泄物をモニターする。ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄したグループ１の乳牛はグループ２の乳牛よりも少ない。グループ１の乳牛は、グループ２の乳牛よりも少ない量のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７をより少ない期間排泄する。
【０１３５】
初期免疫から６ヵ月後、グループ１および２の乳牛に皮下を経由して再度免疫する（第２ブースト）。第２ブースト後１４日目に抗体価をＥＬＩＳＡ（実施例３）により試験する。グループ１の乳牛はＥｓｐＡ及びＴｉｒに対する特異的な抗体価を示すが、グループ２の乳牛は特異的な抗体価を示さない。
【０１３６】
第２ブースト後１４日目に、グループ１および２の乳牛に再度１０８ＣＦＵのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を投与し、１４日間毎日排泄物をモニターする（実施例５）。ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄したグループ１（ＣＣＳ）の乳牛はグループ２（生理食塩水）の乳牛よりも少ない。グループ１の乳牛は、グループ２の乳牛よりも少ない量のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７をより少ない期間排泄する。
【実施例１１】
【０１３７】
子ウシにおけるＣＣＳの保護能力
１０頭の離乳した子ウシ（生後３〜６ヶ月）を５頭ずつの２グループに分け、肥育場へ入る前（第０日）及び肥育場へ入る日（第１日、ブースト）に免疫する。グループ１の子ウシはＣＣＳワクチンを投与され、グループ２の子ウシは生理食塩水ワクチンを投与される。抗体陽転が起きたかどうかを、第０日、第１日、及び第１４日にＥＬＩＳＡ（実施例３）により試験する。グループ１（ＣＣＳ）の子ウシはＥｓｐＡ及びＴｉｒに対する特異的な抗体価を示すのに対して、グループ２（生理食塩水）の子ウシは特異的な抗体価を示さない。
【０１３８】
第１４日に、グループ１および２の子ウシに１０８ＣＦＵのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を投与し、１４日間毎日排泄物をモニターする（実施例５）。ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄するグループ１の子ウシはグループ２の子ウシよりも少ない。グループ１の子ウシは、グループ２の子ウシよりもＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７をより少ない期間排泄する。
【０１３９】
１０頭の離乳した子ウシ（生後３〜６ヶ月）を５頭ずつの２グループに分け、肥育場へ入る日（第１日）及び肥育場における第２２日（ブースト）に免疫する。グループ１の子ウシはＣＣＳワクチンを投与され、グループ２の子ウシは生理食塩水ワクチンを投与される。抗体陽転が起きたかどうかを、第１日（免疫前）、第２２日及び第３６日にＥＬＩＳＡ（実施例３）により試験する。グループ１（ＣＣＳ）の子ウシはＥｓｐＡ及びＴｉｒに対する特異的な抗体価を示すのに対して、グループ２（生理食塩水）の子ウシは特異的な抗体価を示さない。
【０１４０】
第３６日に、グループ１および２の子ウシに１０８ＣＦＵのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を投与し、１４日間毎日排泄物をモニターする（実施例５）。ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄するグループ１の子ウシはグループ２の子ウシよりも少ない。グループ１の子ウシは、グループ２の子ウシよりもＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７をより少ない期間排泄する。
【実施例１２】
【０１４１】
ヒツジにおけるＣＣＳの保護能力
２０頭の成人のヒツジを１０頭ずつの２グループに分ける。グループ１はＣＣＳワクチンで、グループ２は生理食塩水ワクチンで、夫々第１日及び第２２日（ブースト）に免疫する。抗体陽転が起きたかどうかを、第１日（免疫前）、第２２日及び第３６日にＥＬＩＳＡ（実施例３）により試験する。第２２日及び第３６日にグループ１の乳牛はＥｓｐＡ及びＴｉｒに対する特異的な抗体価を示すのに対し、グループ２の乳牛は特異的な抗体価を示さない。
【０１４２】
第３６日に、グループ１および２のヒツジに１０８ＣＦＵのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を投与し、１４日間毎日排泄物をモニターする。ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄するグループ１のヒツジはグループ２のヒツジよりも少ない。グループ１の乳牛は、グループ２の乳牛よりも少ない量のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７をより少ない期間排泄する。
【０１４３】
このように、腸管出血性大腸菌の哺乳動物への定着を治療し、阻止する組成物及びそのための方法が開示された。本発明の主題についての好ましい実施形態が詳細に開示されているが、その明らかな変形は、添付クレームに規定された本発明の精神と範囲から逸脱しないものと理解される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管出血性大腸菌に対する哺乳動物の免疫反応を惹起する組成物及び方法に関する。とりわけ、本発明は、哺乳動物における腸管出血性大腸菌の定着（住みつき）を治療、及び阻止するための細胞培養液上清の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）は、志賀毒素大腸菌（ＳＴＥＣ）、ベロ毒素原性大腸菌（ＶＴＥＣ）とも呼ばれるが、人間に、下痢、出血性大腸炎、溶血性尿毒症症候群、腎不全、及び死を引き起こす病原性大腸菌である。志賀毒素様毒素産生性ＥＨＥＣ株の多くは人間に対し病原性を有するが、人間の疾病の主因は、血清型Ｏ１５７：Ｈ７のＥＨＥＣ株である。この大腸菌は、人間の大腸における定着性を有するが、この定着は、幾つかの病原性決定因子が転座インチミンレセプター（translocated Intimin receptor）、すなわちＴｉｒ、を含むIII型分泌系を介して宿主細胞へ輸送されるという独特の機構によって行われる（DeVinney et al., Infect. Immun. (1999) 67:2389）。これら病原体は、とりわけ、腸細胞膜へのＴｉｒの輸送を可能にする病原性決定因子ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、及びＥｓｐＤを分泌する。Ｔｉｒは、宿主細胞膜へ組み込まれ、細菌外膜タンパク、インチミンに対するレセプターとして作用する。Ｔｉｒ−インチミン結合体は、ＥＨＥＣを腸細胞の表面に結合し、結合したＥＨＥＣの下方でアクチン細胞骨格転位（再構成）を引き起こし、このためペデスタル構造（pedestal formation）が形成される。ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、Ｔｉｒ及びインチミンは、すべて、ＥＨＥＣが腸内で首尾よく定着するための本質的要素である。
【０００３】
ＥＨＥＣは、反芻動物及びその他の哺乳動物の腸で定着するが、通常これらの動物には目に見えて分かるような（顕性の）疾病は引き起こさない。しかしながら、血清型Ｏ１５７：Ｈ７のＥＨＥＣ（以下「ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７」という）により汚染された肉や水により、アメリカ合衆国及びカナダにおいては、人間に対しては、年間約５０，０００例のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７感染が起こっており、そのうち約５００人が死に至っている。１９９４年には、人間に対するＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７感染に関連する経済コストは、年間５０億ドル以上と推定されている。
【０００４】
はじめて報告された汚染肉を原因とするＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７（の感染症）の大発生は、１９８２年であった。その後、健康な反芻動物（ウシ、乳牛、羊を含むがこれらに限定されない）にもＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７が感染することが明らかとなった。実際に、ＵＳＤＡの報告によれば、ウシの５０％までがその生涯の任意の時点においてＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７キャリアであり、従ってＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７をその糞便と共に排泄する。
【０００５】
屠殺牛は大量処理され、人間に感染するのに必要なＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の数は少ない（１０〜１００）ので、健康なウシにおけるＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の定着は、相変わらず深刻な健康問題となっている。この問題に対処するため、屠殺の際にＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を検出して殺菌し、腸内ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７数を低減するようウシの餌を変更し、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の定着を阻止するよう動物を免疫（接種）する方法の改善に対し集中的に研究が行われた（Zacek D. Animal Health and Veterinary Vaccines, Alberta Research Counsel, Edmonton, Canada, 1997）。近年、組換えＥｓｐＡ（国際公開ＷＯ ９７／４００６３）、組換えＴＩＲ（国際公開ＷＯ ９９／２４５７６）、組換えＥｓｐＢ及び組換えインチミン（Li et al., Infec. Immun. (2000) 68:5090-5095）を含むＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７タンパク質の組換え生産及びその使用が開示された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ ９７／４００６３
【特許文献２】ＷＯ ９９／２４５７６
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Zacek D. Animal Health and Veterinary Vaccines, Alberta Research Counsel, Edmonton, Canada, 1997
【非特許文献２】Li et al., Infec. Immun. (2000) 68:5090-5095
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、抗原として使用するために必要な量の組換えタンパク質の生産及び精製は、何れも困難且つ高価である。現状では、ウシ及びその他の動物におけるＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の定着を阻止し、及びそれによってＥＨＥＣの環境への排泄を低減するための効果的な方法は見出されていない。
【０００９】
それゆえ、ＥＨＥＣ感染症を治療及び阻止するための、並びにＥＨＥＣで汚染された肉や水と関連する健康問題の発生を低減するよう哺乳動物におけるＥＨＥＣの定着を低減するための新たな組成物及び方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、上記の必要性を充足するための組成物及び方法を提供する。特に、本発明の方法は、ＥＨＥＣ培養液由来の細胞培養液上清（以下「ＣＣＳ」という）を含む組成物を使用し、１以上のＥＨＥＣ分泌抗原に対する免疫反応を惹起して、ＥＨＥＣ感染症の治療及び/又はＥＨＥＣ感染症の阻止及び/又は哺乳動物におけるＥＨＥＣの定着の低減を行う。本発明の組成物は、同時に投与されるべきアジュバントの有無に拘らず与える（投与）することができる。本発明のある実施形態では、ＥｓｐＡ及びＴｉｒは、上記細胞培養液上清タンパク質のうちの少なくとも２０％を占める。ＥＨＥＣ培養液上清は、ＥＨＥＣの血清型の何れに由来しても良いが、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７やＥＨＥＣ：ＮＭ（非運動性：non-motile）等のＥＨＥＣ Ｏ１５７の培養液に由来するのが好ましい。本発明の細胞培養液上清は、容易且つ比較的安価に製造することができ、毒性が最小となるような投与量でも有効である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、Ｔｉｒ及びインチミンは、宿主上皮細胞シグナル伝達系の活性化（Ａ）及び宿主上皮細胞へのＥＨＥＣの直接的（intimate）付着（Ｅ）のために必要である。従って、以下の仮説に拘束されるわけではないが、本発明のＣＣＳの哺乳動物への投与により、ＥｓｐＡやＴｉｒのような１以上の分泌性抗原に対する、ＥＨＥＣの腸上皮細胞への付着を阻止する免疫反応が刺激されると考えられる。
【００１２】
従って、本発明の目的の１つは、ＥＨＥＣ分泌抗原に対する免疫反応を刺激し、哺乳動物におけるＥＨＥＣ感染症を治療及び/又は阻止するのに有効なワクチンを提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、反芻動物又はその他の哺乳動物におけるＥＨＥＣの定着を低減、阻止及び/又は排除（排出：eliminate）するのに有効なワクチンを提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、ＥＨＥＣを環境へ排泄する動物の数を低減することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、感染動物によりその（外部）環境へ排泄されるＥＨＥＣの数を低減することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、ＥＨＥＣが感染動物により環境へ排泄される時間を低減することである。
【００１７】
本発明の他の目的は、環境のＥＨＥＣ汚染を低減することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、肉及び/又は水のＥＨＥＣ汚染を低減することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、人間へのＥＨＥＣ感染を治療、阻止及び/又は低減することである。
【００２０】
本発明の他の目的は、他の生物学的抗ＥＨＥＣ剤への補助剤として有効なワクチンを提供することである。
【００２１】
本発明の他の目的は、化学的抗ＥＨＥＣ剤への補助剤として有効なワクチンを提供することである。
【００２２】
本発明の他の目的は、生物学的に製造される抗ＥＨＥＣ剤への補助剤として有効なワクチンを提供することである。
【００２３】
本発明の他の目的は、核酸をベースとする抗ＥＨＥＣ剤への補助剤として有効なワクチンを提供することである。
【００２４】
本発明の他の目的は、組換えタンパク質抗ＥＨＥＣ剤への補助剤として有効なワクチンを提供することである。
【００２５】
本発明の他の目的は、反芻動物におけるＥＨＥＣの定着を低減するのに有効なワクチン接種スケジュールを提供することである。
【００２６】
本発明の他の目的は、反芻動物により排泄されるＥＨＥＣを低減するのに有効なワクチン接種スケジュールを提供することである。
【００２７】
本発明の他の目的は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７及び/又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭの定着等のウシにおけるＥＨＥＣ Ｏ１５７の定着を低減するのに有効なワクチンを提供することである。
【００２８】
本発明の他の目的は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７及び/又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭの定着等のウシにおけるＥＨＥＣ Ｏ１５７の定着を阻止するのに有効なワクチンを提供することである。
【００２９】
本発明の他の目的は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７及び/又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭの定着等のウシにおけるＥＨＥＣ Ｏ１５７の定着を排除（排出：eliminate）するのに有効なワクチンを提供することである。
【００３０】
本発明の他の目的は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７及び/又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭの排泄等の、ＥＨＥＣ Ｏ１５７を環境へ排泄するウシの数を低減することである。
【００３１】
本発明の他の目的は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７及び/又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭの排泄等の、感染ウシにより環境へ排泄されるＥＨＥＣ Ｏ１５７の数を低減することである。
【００３２】
本発明の他の目的は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７及び/又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭの排泄等の、ＥＨＥＣ Ｏ１５７が感染ウシにより環境へ排泄される時間を低減することである。
【００３３】
本発明の他の目的は、他の抗ＥＨＥＣ Ｏ１５７剤への補助剤として有効なワクチンを提供することである。
【００３４】
本発明の他の目的は、ウシにおけるＥＨＥＣ Ｏ１５７の定着を低減するのに有効なワクチン接種スケジュールを提供することである。
【００３５】
本発明の他の目的は、ウシによるＥＨＥＣ Ｏ１５７の排泄を低減するのに有効なワクチン接種スケジュールを提供することである。
【００３６】
本発明の一実施形態によれば、腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）細胞培養液上清と免疫アジュバントとを含むワクチン組成物が提供される。ある実施形態では、ＥＨＥＣは、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７及び/又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭである。その他の実施形態では、免疫アジュバントは、ミネラルオイル及びジメチルジオクタデシルアンモニウム・ブロマイド等の水中油型エマルジョンから構成される。更なる実施形態では、免疫アジュバントは、ＶＳＡ３である。ＶＳＡ３は、約２０％（ｖ/ｖ）〜約４０％（ｖ/ｖ）の濃度、好ましくは３０％（ｖ/ｖ）の濃度で含有されることが可能である。
【００３７】
更なる実施形態では、ワクチン組成物は、更に、ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、及びＴｉｒからなる群から選択される１又は２以上の組換え又は精製ＥＨＥＣ分泌抗原を含む。他の実施形態では、ＥｓｐＡ＋Ｔｉｒは、ワクチン組成物中において細胞タンパク質の少なくとも２０％を占める。
【００３８】
本発明の他の一実施形態によれば、分泌性腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）抗原に対する哺乳動物の免疫学的反応を惹起する方法が提供される。この方法は、ＥＨＥＣ細胞培養液上清を含む組成物の治療有効量を哺乳動物へ投与することから構成される。他の実施形態では、ＥＨＥＣは、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７及び/又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭである。更なる実施形態では、哺乳動物は、人間、又はウシ等の反芻動物である。更なる実施形態では、上記組成物は、更に、例えばミネラルオイル及びジメチルジオクタデシルアンモニウム・ブロマイド等の水中油型エマルジョン等から構成される免疫アジュバントを含む。更なる実施形態では、当該免疫アジュバントは、ＶＳＡ３である。上記組成物は、更に、ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、及びＴｉｒからなる群から選択される１以上の組換え又は精製ＥＨＥＣ分泌抗原を含むことができる。更なる実施形態では、ＥｓｐＡ＋Ｔｉｒは、上記組成物中において細胞タンパク質の少なくとも２０％を占める。
【００３９】
本発明の更に他の一実施形態によれば、分泌性腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７）抗原に対する反芻動物の免疫学的反応を惹起する方法が提供される。この方法は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７細胞培養液上清及びＶＳＡ３を含む組成物の治療有効量を反芻動物へ投与することから構成される。他の実施形態では、ＶＳＡ３は、約２０％（ｖ/ｖ）〜約４０％（ｖ/ｖ）、好ましくは約３０％（ｖ/ｖ）の濃度で上記組成物中に含有される。
【００４０】
本発明の更なる一実施形態によれば、ＥＨＥＣ細胞培養液上清及び免疫アジュバントを含む組成物の治療有効量を反芻動物へ投与することから構成される、反芻動物における腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）の定着を低減する方法が提供される。
【００４１】
本発明の更に他の一実施形態によれば、ＥＨＥＣ細胞培養液上清及び免疫アジュバントを含む組成物の治療有効量を反芻動物へ投与することから構成される、反芻動物からの腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）の排泄を低減する方法が提供される。
【００４２】
本発明の上記の各実施形態及び更に他の形態は、以下に示す詳細な説明及び図面を参照することにより明らかとなる。更に、より詳細な手順や組成物を記載している参考文献も以下に示してある。
【００４３】
詳細な説明
本発明の実施には、特段の定めがない限り、当業者の通常の知識に含まれる分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術及び免疫学の従来の技術が使用されるものとする。このような技術は、各種文献に詳細に説明されている。例えば、サムブルックら(Sambrook, Fritsch & Maniatis)、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II, and III, Second Edition (1989); パーバル(Perbal, B.)、 A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); 一連の Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); 及び Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)を参照されたい。
【００４４】
Ａ．定義
本発明を説明するにあたって、以下の用語を用いるが、これらの定義は、以下に示すとおりである。
【００４５】
まず注意すべきことは、本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形（「a」、「an」、及び「the」）は、特段に明示しない限り複数の対象も意味するということである。従って、例えば、「ＥＨＥＣ細菌（an EHEC bacterium）」という記載は、２又は３以上の当該細菌等も意味するものとする。
【００４６】
本書においては、用語ＥＨＥＣ「細胞培養液上清」又は「ＣＣＳ」は、１以上のＥＨＥＣ血清型の細胞培養液から得られる上清であって、ＥＨＥＣ菌体細胞ないし当該細胞の溶菌液は実質的に含まず、且つ増殖培地に分泌されたＥＨＥＣ抗原の混合物を含む上清を意味するものとする。通常、ＥＨＥＣ「ＣＣＳ」は、少なくとも分泌抗原ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ及びＴｉｒ、及びそれらのフラグメント又は凝集体を含む。 本発明のＣＣＳは、例えばＥｓｐＦ及びＭＡＰ等の他の分泌タンパク質、志賀毒素１及び２の一方又は両方、並びにIII型系によっては分泌されない約１００ｋＤａのタンパク質であるＥｓｐＰも含み得る。ＥＨＥＣ感染症の緩和（lessen）ないし阻止、及び/又はＥＨＥＣの定着の緩和ないし抑制を行うよう宿主の免疫反応を刺激する機能をＣＣＳが維持する限り、タンパク質は、天然の形態、又は変性若しくは分解した形態で存在し得る。場合により、ＣＣＳには、例えば追加的なＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ及び/又はＴｉｒ並びに他の分泌タンパク質の何れかのような追加の組換え又は精製分泌抗原を補充することも可能であり、及びインチミンを補充することも可能である。幾つかの実施形態では、ＥｓｐＡ+Ｔｉｒは、細胞培養液上清タンパク質の少なくとも２０％を占める。
【００４７】
本書においては、組換えＥｓｐＡ、組換えＥｓｐＢ、組換えＥｓｐＤ及び組換えＴｉｒ等の「組換え」ＥＨＥＣ分泌タンパク質、並びに「組換えインチミン」は、当該タンパク質が少なくとも１つの特異的エピトープ又は活性を保持する限り、全長ポリペプチド配列、基準（参照）配列のフラグメント又は基準配列の置換、欠失及び/又は付加を意味するものとする。通常、基準配列の類似体は、全長基準配列に対し、少なくとも約５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約７５％〜８５％の配列同一性、より好ましくは約９０％〜９５％以上の配列同一性を示す。大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ゲノムの完全配列（これは種々のＯ１５７：Ｈ７分泌タンパク質の配列を含む）については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号AE005594、AE005595、AP002566、AE005174、NC_002695、NC_002655を参照されたい。幾つかの大腸菌血清型からのＥｓｐＡの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、国際公開番号WO 97/40063、並びにＧｅｎＢａｎｋ登録番号Y13068、U80908、U5681、Z54352、AJ225021、AJ225020、AJ225019、AJ225018、AJ225017、AJ225016、AJ225015、AF022236及びAF200363を参照されたい。幾つかの大腸菌血清型からのＴｉｒの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、国際公開番号ＷＯ９９／２４５７６号、並びにＧｅｎＢａｎｋ登録番号AF125993、AF132728、AF045568、AF022236、AF70067、AF070068、AF013122、AF200363、AF113597、AF070069、AB036053、AB026719、U5904及びU59502を参照されたい。幾つかの大腸菌血清型からのインチミンの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号U32312、U38618、U59503、U66102、AF081183、AF081182、AF130315、AF339751、AJ308551、AF301015、AF329681、AF319597、AJ275089-AJ275113を参照されたい。幾つかの大腸菌血清型からのＥｓｐＢの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号U80796、U65681、Y13068、Y13859、X96953、X99670、X96953、Z21555、AF254454、AF254455、AF254456、AF254457、AF054421、AF059713、AF144008、AF144009を参照されたい。幾つかの大腸菌血清型からのＥｓｐＤの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Y13068、Y13859、Y17875、Y17874、Y09228、U65681、AF054421及びAF064683を参照されたい。
【００４８】
「相同性（ホモロジー）」とは、２つのポリヌクレオチド部分間又は２つのポリペプチド部分間におけるパーセント（で表した）類似性を意味する。２つのＤＮＡないし２つのポリペプチド配列は、分子の所定の長さに亘って配列が少なくとも約８０％〜約８５％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％〜約９８％の配列類似性を示すとき、互いに「実質的に相同」であるという。本書においては、実質的に相同とは、特定のＤＮＡないしポリペプチド配列と完全な同一性を示す配列も意味するものとする。
【００４９】
パーセント配列同一性は、配列を整列させ、当該整列させた２つの配列間でマッチングしている正確な数を数え、より短いほうの配列の長さで割り、その結果を１００倍することにより、２つの分子間の配列情報を直接比較することによって決定することができる。このような分析を支援するために容易に入手可能なコンピュータプログラムを使用することができる。例えば、ALIGN, Dayhoff, M.O. in Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DCを使用することができるが、これは、ペプチド分析のための Smith and Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2:482-489 の局所的相同性アルゴリズムを採用している。塩基配列の同一性を決定するためのプログラムとしては、Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (Genetics Computer Group, Madison, WIから入手可能) が利用できる。例えば、同様にSmith and Watermanアルゴリズムに基づくＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＧＡＰの各プログラムを利用できる。これらプログラムは、製造元が推奨しかつ上記Wisconsin Sequence Analysis Packageに記載されているデフォルト（規定値）のパラメータによって容易に使用することができる。例えば、基準（参照）配列に対する特定の塩基配列のパーセント同一性は、デフォルトのスコアリングテーブルと６ヶ所の塩基位置のギャップペナルティ（gap penalty）を用いるSmith and Watermanの相同性アルゴリズムによって決定することができる。
【００５０】
また、相同性は、相同性領域間で安定な二重鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイズし、一本鎖特異的ヌクレアーゼによって切断（消化）し、切断されたフラグメントのサイズを決定することによっても決定することもできる。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、特定のシステムについて決められるストリンジェントな条件の下でのサザンブロット法によって同定することができる。適切なハイブリダイゼーションのための条件の決定は、当業者の通常の知識に属する。例えば、サムブルックら（上掲）、DNA Cloning（上掲）、Nucleic Acid Hybridization（上掲）を参照されたい。
【００５１】
本書において、「ワクチン」とは、例えばIII型分泌ＥＨＥＣ抗原のようなＥＨＥＣ抗原に対する免疫反応を刺激（惹起）するよう作用するＣＣＳ組成物を意味するものとする。免疫反応は、ＥＨＥＣ感染又はＥＨＥＣの定着・排泄に対する完全な保護及び／又は治療を提供する必要はない。ＥＨＥＣ細菌の定着・排泄に対する部分的保護であっても、排泄と汚染肉生産が低減される場合は、有用である。場合によっては、ワクチンは、免疫反応を促進するため免疫アジュバントを含み得る。用語「アジュバント」は、特定の抗原又は抗原の組み合わせに対する免疫反応を促進するように非特異的態様で作用する剤であって、従って目的の抗原に対し十分な免疫反応を引き起こすための、所与の何れのワクチンにおける必要な抗原の量、及び／又は必要な接種の回数を低減するものを意味する。例えば、A.C. Allison J. Reticuloendothel. Soc. (1979) 26:619-630を参照されたい。このようなアジュバントについては、以下に詳細に説明する。
【００５２】
本書において、「定着」とは、例えば反芻動物等の哺乳動物の腸管におけるＥＨＥＣの存在を意味するものとする。
【００５３】
本書において、「排泄」とは、糞便中のＥＨＥＣの存在を意味するものとする。
【００５４】
本書において、「治療量」、「有効量」、及び「〜に有効な量」とは、ＣＣＳ中に存在する分泌抗原に対する免疫反応を惹起し、以って例えば反芻動物等の哺乳動物におけるＥＨＥＣ感染症及び／又はＥＨＥＣの定着の低減又は阻止、及び／又はＥＨＥＣを排泄する動物の個体数の低減、及び／又は動物から排泄されるＥＨＥＣの個数の低減、及び／又は動物によるＥＨＥＣ排泄の時間（期間）の低減、をさせるために有効なワクチンの量を意味するものとする。
【００５５】
本書において、「免疫化」又は「免疫する」とは、ＣＣＳの投与であって、当該ＣＣＳに存在する１又は２以上の分泌抗原に対する免疫学的反応を惹起するために、当該ＣＣＳが投与される動物の免疫システムを刺激するのに有効な量で、追加的な組換え又は精製ＥＨＥＣ抗原（例えばＥｓｐＡ、Ｔｉｒ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ及び／又はインチミン）の含有の有無に拘らずに行うＣＣＳの投与を意味するものとする。
【００５６】
用語「エピトープ」は、特定のＢ細胞及び／又はＴ細胞が反応する抗原又はハプテンの部位を意味するものとする。また、「エピトープ」は、「抗原決定因子（antigenic determinant）」ないし「抗原決定基（antigenic determinant site）」と同義である。
【００５７】
組成物ないしワクチンへの「免疫学的反応」とは、目的の組成物ないしワクチンに対する細胞性及び／又は抗体媒介性免疫反応の宿主における形成を意味するものとする。「免疫学的反応」には、通常、１以上の以下の効果：目的の組成物ないしワクチンに含まれる１又は複数の抗原に対し特異的に形成される抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサＴ細胞、及び／又はキラーＴ細胞及び／又はγδＴ細胞の産生を含むが、これらに限定されない。宿主は、ＥＨＥＣ感染症が緩和（lessen）及び／又は阻止され、ＥＨＥＣの定着に対する抵抗性が腸に付与され、ＥＨＥＣを排泄する動物の個体数が低減され、動物によって排泄されるＥＨＥＣの数が低減され、及び／又は動物によるＥＨＥＣの排泄時間（期間）が低減されるような治療的又は保護的な免疫学的反応を示すことが好ましい。
【００５８】
用語「免疫原性」タンパク質ないしポリペプチドは、上述した免疫学的反応を惹起するアミノ酸配列を意味するものとする。本書においては、「免疫原性」タンパク質ないしポリペプチドは、問題の特定のＥＨＥＣタンパク質の全長配列、そのアナログ、凝集体、又はその免疫原性フラグメントを含むものとする。「免疫原性フラグメント」は、１又は２以上のエピトープを含みかつ従って上述の免疫学的反応を惹起する分泌ＥＨＥＣタンパク質のフラグメントを意味するものとする。このようなフラグメントは、当業者の通常の知識に属する非常に多くのエピトープマッピング技術の何れを用いても同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jerseyを参照されたい。例えば、直鎖状のエピトープは、固相支持体（solid support）上で多数のペプチド（これは、タンパク質分子の部分に相当する）を同時に合成し、該ペプチドを該支持体に付着させたまま該ペプチドを抗体と反応させることによって決定することができる。このような技術は、当業者の通常の知識に属しており、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号、 Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002、Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715を参照されたい。同様に、高次構造を有するエピトープも、例えばＸ線結晶学及び二次元核磁気共鳴を用いアミノ酸の空間的な配座（立体構造）を決定することによって容易に同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols（上掲）を参照されたい。また、タンパク質の抗原性領域は、例えばOxford Molecular Groupから入手可能なソフトウェアプログラムOmiga version 1.0を用いて計算されるプロット等の標準的な抗原性（antigenicity）及び疎水性親水性指標（hydropathy）プロットによって同定することができる。このコンピュータプログラムは、抗原性プロフィールを決定するためにHopp/Woods法、Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828 を使用し、疎水性親水性指標プロットのためにKyte-Doolittle技術、Kyte et al., J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132を使用する。
【００５９】
免疫原性フラグメントは、本発明の目的のためには、通常、親ＥＨＥＣ分泌タンパク質分子の少なくとも約３個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約１０〜約１５個のアミノ酸、最も好ましくは２５個又はそれ以上のアミノ酸を含む。フラグメントの長さに関しては決定的な上限はなく、フラグメントは、タンパク質配列のほぼ全長、或いは特定のＥＨＥＣ分泌タンパク質の２以上のエピトープを含む融合タンパク質でさえも含むことができる。
【００６０】
「天然の」タンパク質ないしポリペプチドとは、タンパク質の自然発生源から単離されるタンパク質ないしポリペプチドを意味する。「組換え」ポリペプチドとは、組換えＤＮＡ技術によって生産される、すなわち目的のポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ構築物が導入された細胞によって生産されるポリペプチドを意味するものとする。「合成」ポリペプチドとは、化学的合成法によって生産されるポリペプチドを意味するものとする。
【００６１】
用語「治療（treatment）」は、本書においては、（i）感染又は再感染の阻止（予防）、又は（ii）目的の感染症（疾病）の症状の緩和ないし解消（治療）を意味するものとする。
【００６２】
「哺乳動物被検体（mammalian subject）」は哺乳類（哺乳綱）の何れのメンバーをも意味し、人間、及び他の全ての乳腺を有する動物（雌雄を問わない）、例えば、ウシ、ブタ、Ovis（ヒツジ及びヤギ）種等を含む反芻動物を含むがこれらに限定されない。本書では、「哺乳動物被検体」を特定の年齢に限定して用いない。従って、成体、新生児、及び胎児の何れもこの語に含まれる。
【００６３】
Ｂ．一般的方法
本発明の中核をなすのは、ＥＨＥＣ分泌抗原を含むＥＨＥＣ培養物に由来する細胞培養液上清が、投与される動物において免疫反応を引き起こし、以って例えば定着に対する保護のようなＥＨＥＣ感染に対する保護作用をなすことを明らかにすることである。幾つかの実施形態では、組成物は、ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ及び／又はＴｉｒ等を含むＥＨＥＣ分泌抗原の混合物を含むがこれらに限定されない。また、本発明のＣＣＳは、例えばＥｓｐＦ、ＭＡＰ、志賀毒素１及び２の一方又は両方、並びにIII型分泌系によっては分泌されないほぼ１００ｋＤａのタンパク質であるＥｓｐＰ等の他の分泌タンパク質も含み得る。他の実施形態では、ＣＣＳは、追加的な組換え又は精製ＥＨＥＣ抗原、例えば、追加的なＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、Ｔｉｒ、インチミン等が補充される。幾つかの実施形態では、ＥｓｐＡ + Ｔｉｒは、細胞培養液上清タンパク質の少なくとも２０％を占める。組成物は、複数のＥＨＥＣ生物に対する保護作用を奏するため２以上のＥＨＥＣ血清型に由来する細胞培養液上清（複数）と追加的なアジュバント（複数）を含むこともできる。更に、医薬的に受容可能なアジュバントを、細胞培養液上清と共に投与することも可能である。組成物は、１又は２以上の分泌抗原に対する免疫反応を惹起し、以ってＥＨＥＣ感染を低減又は排除（eliminate）するのに有効な量が投与される。場合によっては、動物におけるＥＨＥＣの定着は、低減又は排除される。好ましい実施形態では、動物は、ウシ、ヒツジ又はその他の反芻動物である。特に好ましい実施形態では、細胞培養液上清は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７又はＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭの細胞培養物に由来する。
【００６４】
ＣＣＳによる免疫は、免疫された動物の免疫システムを刺激し、例えばＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、Ｔｉｒ等の１以上の分泌抗原に対する抗体を産生させ、ＥＨＥＣが腸管上皮細胞に付着するのを阻止し、ＥＨＥＣの定着を阻害し、以って動物によるＥＨＥＣの排泄を低減する。このようなＥＨＥＣの排泄の低減により、ＥＨＥＣによる食物や水の汚染は低減し、人間に対しＥＨＥＣにより引き起こされる感染症（疾病）も低減される。更に、ＥＨＥＣの定着及びウシによるＥＨＥＣの排泄を阻止、低減及び排除するというＣＣＳ免疫の予期しなかった驚くような能力は、医学分野において長期に亘って満たされなかったニーズに応え、人間に対する重要な便益を提供する。
【００６５】
更に、本発明のＣＣＳは、例えば人間等の他の哺乳動物におけるＥＨＥＣ感染の治療又は阻止に利用することができる。人間に対して用いられる場合、ＣＣＳは、毒性を低減するため志賀毒素１及び２の一方又は両方をノックアウトすることにより作られた突然変異ＥＨＥＣから作ることができる。
【００６６】
上述の通り、ＣＣＳの治療上の有効性は、１以上の組換え又は精製分泌抗原を添加することによって増強することができる。例えば、組換え又は精製ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、Ｔｉｒ等、それらのフラグメント及び／又はそれらのアナログを添加することによって当該有効性を増強することができる。また、インチミンを添加することも可能である。ＣＣＳの治療有効性を増強する他の方法としては、ＣＣＳと天然又は合成担体との複合体を形成し、他の抗ＥＨＥＣ剤の投与の前／同時／後に当該ＣＣＳを投与する方法があるが、これに限定されない。当該剤としては、生物学的、生物工学的、化学的、核酸ベース的及び組換えタンパク質的抗ＥＨＥＣ剤等が含まれる。
【００６７】
宿主内で定着するためにＥｓｐＡ、Ｔｉｒ等のタンパク質を必要とするＥＨＥＣの血清型以外の病原性細菌に由来するＣＣＳも、動物の免疫システムを刺激し、分泌ＥＨＥＣ抗原に対する抗体を産生させて、細菌が動物の腸管上皮細胞に結合することを低減するために使用することができる。このような細菌種としては、シトロトバクテル・ロデンチウム（Citrotobacter rodentium）が含まれるが、これに限定されない。
【００６８】
本発明で使用されるＣＣＳは、どの血清型のＥＨＥＣの培養物からも取得することができる。当該ＥＨＥＣ血清型には、血清型Ｏ１５７、Ｏ１５８、Ｏ５、Ｏ８、Ｏ１８、Ｏ２６、Ｏ４５、Ｏ４８、Ｏ５２、Ｏ５５、Ｏ７５、Ｏ７６、Ｏ７８、Ｏ８４、Ｏ９１、Ｏ１０３、Ｏ１０４、Ｏ１１１、Ｏ１１３、Ｏ１１４、Ｏ１１６、Ｏ１１８、Ｏ１１９、Ｏ１２１、Ｏ１２５、Ｏ２８、Ｏ１４５、Ｏ１４６、Ｏ１６３、Ｏ１６５が含まれるがこれらに限定されない。このようなＥＨＥＣ血清型は、感染動物の血清から容易に取得できる。ＥＨＥＣの単離方法は、当業者の通常の知識に属する。例えば、Elder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:2999; Van Donkersgoed et al., Can. Vet. J. (1999) 40:332; Van Donkersgoed et al., Can. Vet. J. (2001) 42:714を参照されたい。 このような方法は、通常、セフィキシム及びテルライトを補充したソルビトール・マッコンキー（MacConkey）寒天培地上での直接的なプレーティングか、免疫磁気濃縮後当該同じ培地上でプレーティングすることを必要とする。更に、ＣＣＳは、毒性を低減するため志賀毒素１及び／又は２の発現をノックアウトするよう遺伝子操作されたＥＨＥＣ血清型から取得することもできる。
【００６９】
ＣＣＳは、通常、III型抗原分泌に有利な条件下において好適な培地でＥＨＥＣ細菌を培養することによって作ることができる。ＥＨＥＣ細菌を培養するための好適な培地及び条件は、当業者の通常の知識に属するものであり、例えば、米国特許第６，１３６，５５４号及び第６，１６５，７４３号、並びにLi et al., Infec. Immun. (2000) 68:5090-5095、 Fey et al., Emerg. Infect. Dis. (2000) Volume 6に記載されている。ＣＣＳを取得するための特に好ましい方法によれば、まず、細菌をＬＢ（Luria-Bertani）培地で約８〜４８時間、好ましくは約１２〜２４時間増殖させ、この培地を、２０〜１００ｍＭ、好ましくは３０〜５０ｍＭ、最も好ましくは約４４ｍＭのＮａＨＣＯ２と、４〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１０ｍＭ、最も好ましくは約８ｍＭのＭｇＳＯ４と、０．１〜１．５％、好ましくは０．２〜１％、最も好ましくは０．４％のグルコースと、０．０５〜０．５％、好ましくは０．０７〜０．２％、最も好ましくは約０．１％のカザミノ酸とを補充したＭ−９最小培地で、約１：５〜１：５０、好ましくは約１：５〜１：２５、より好ましくは約１：１０に希釈する。培地は、通常、３７℃、２〜１０％ＣＯ２、好ましくは約５％ＣＯ２で、約６００ｎｍに対し吸光度０．７〜０．８に維持される。そして遠心機によって細胞を全て除去し、透析、限外濾過等によって、例えば１０〜１０００倍又はそれ以上（例えば１００倍）に上清を濃縮する。総タンパク質は、当業者の通常の知識に属する方法によって容易に決定することができる。
【００７０】
上述の通り、ＣＣＳは、例えばＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ及び／又はＴｉｒ等の追加的なＥＨＥＣ分泌タンパク質で補充することができる。また、インチミンも添加することができる。これらのタンパク質は、当業者の通常の知識に属する組換え技術を用いて作ることができる。例えば、代表的な組換えＥＨＥＣ分泌タンパク質の生産について記載されている国際公開ＷＯ９７／４００６３号及びＷＯ９９／２４５７６号を参照されたい。特に、種々の血清型に由来するＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、Ｔｉｒ及びインチミンの配列は、既知であり且つ文献にも記載されている。例えば、種々のＯ１５７：Ｈ７分泌タンパク質の配列を含む大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ゲノムの完全配列についてＧｅｎＢａｎｋ登録番号AE005594、AE005595、AP002566、AE005174、NC_002695、NC_002655を参照されたい。また、幾つかの大腸菌血清型由来のＥｓｐＡの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、国際公開ＷＯ９７／４００６３号、並びにＧｅｎＢａｎｋ登録番号Y13068、U80908、U5681、Z54352、AJ225021、AJ225020、AJ225019、AJ225018、AJ225017、AJ225016、AJ225015、AF022236及びAF200363を参照されたい。また、幾つかの大腸菌血清型由来のＴｉｒの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、国際公開ＷＯ９９／２４５７６号、並びにＧｅｎＢａｎｋ登録番号AF125993、AF132728、AF045568、AF022236、AF70067、AF070068、AF013122、AF200363、AF113597、AF070069、AB036053、AB026719、U5904及びU59502を参照されたい。また、幾つかの大腸菌血清型由来のインチミンの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号U32312、U38618、U59503、U66102、AF081183、AF081182、AF130315、AF339751、AJ308551、AF301015、AF329681、AF319597、AJ275089-AJ275113を参照されたい。また、幾つかの大腸菌血清型由来のＥｓｐＢの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号U80796、U65681、Y13068、Y13859、X96953、X99670、X96953、Z21555、AF254454、AF254455、AF254456、AF254457、AF054421、AF059713、AF144008、AF144009を参照されたい。また、幾つかの大腸菌血清型由来のＥｓｐＤの塩基配列及びアミノ酸配列については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Y13068、Y13859、Y17875、Y17874、Y09228、U65681、AF054421及びAF064683を参照されたい。
【００７１】
これらの配列はオリゴヌクレオチドプローブをデザインするために用いることができ、他の大腸菌血清型からの遺伝子のためのゲノム又はｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いることができる。オリゴヌクレオチドプローブやＤＮＡライブラリーを調製することと同様に、核酸ハイブリダイゼーションによりこれらをスクリーニングするための基本的な戦略は、当該分野の通常の知識を有する者にとって周知である。例えば、DNA Cloning: Vol. I（上掲）、Nucleic Acid Hybridization（上掲）、Oligonucleotide Synthesis（上掲）、Sambrook et al.（上掲）を参照されたい。スクリーニングされたライブラリーからの１つのクローンが陽性ハイブリダイゼーションによって同定されたならば、特定のライブラリー挿入断片がIII型遺伝子又はそのホモログを含んでいることは、制限酵素分析やＤＮＡ塩基配列の決定により確認することができる。次いで、標準的な技法を用いて種々の遺伝子をさらに単離することができ、そして、所望により、ＰＣＲ法又は制限酵素により完全長配列の一部を欠失させることができる。
【００７２】
同様に、フェノール抽出等の公知の方法を用いて細菌から直接遺伝子を単離することができ、当該配列は所望の変更を加えるためにさらに操作される。ＤＮＡの取得、及び単離に用いられる種々の技法については、例えば、Sambrook et al.（上掲）の既述を参照されたい。あるいは、目的タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、クローン化するよりむしろ合成により調製することができる。特定のアミノ酸配列に適したコドンを用いてＤＮＡ配列をデザインすることができる。一般的に、その配列が発現のために用いられるときは、意図された宿主にとっての好ましいコドンを選択することができるであろう。完全な配列は、標準的な方法によって調製され、重複（オーバーラップ）した複数のオリゴヌクレオチドから組立て、完全なコーディング配列へと構築することができる。例えば、Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984) Science 223:1299; Jay et al. (1984) J. Biol. Chem. 259:6311を参照されたい。
【００７３】
所望のタンパク質に対するコーディング配列が調製、又は単離されたならば、それらは任意の好ましいベクター又は複製単位（レプリコン）へクローン化され得る。数多くのクローニングベクターは当業者に公知であり、適切なクローニングベクターを見出すのは、選択の問題である。クローン化のための組換えＤＮＡベクター及びそれらを形質転換できる宿主細胞の具体例は、バクテリオファージλ(大腸菌)、pBR322(大腸菌)、pACYC177(大腸菌)、pKT230(グラム陰性細菌)、 pGV1106(グラム陰性細菌)、pLAFR1(グラム陰性細菌)、pME290(非大腸菌グラム陰性細菌)、pHV14(大腸菌及び枯草菌)、pBD9 (バチルス)、pIJ61(ストレプトマイセス)、pUC6(ストレプトマイセス)、YIp5(酵母)、YCp19(酵母)及びウシパピローマウイルス（哺乳類細胞）である。サムブルックら（上掲）、DNA Cloning（上掲）、パーバル（上掲）を参照されたい。
【００７４】
遺伝子はプロモーター、リボソーム結合部位（細菌での発現の場合）、及び、任意に、オペレーター（以下、「調節」領域と総称する）の制御下に配置することができ、それにより所望のタンパク質をコードしているＤＮＡ配列は、この発現構築体を含むベクターによって形質転換された宿主細胞中でＲＮＡへ転写される。当該コーディング配列はシグナルペプチド又はリーダー配列を含んでもよく、又は含まなくてもよい。リーダー配列は、翻訳後のプロセッシング段階で宿主により除去され得る。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号、第４，４２５，４３７号、第４，３３８，３９７号を参照されたい。
【００７５】
宿主細胞の増殖に関連して当該タンパク質配列の発現を制御する他の制御配列もまた好ましい。これらの制御配列は当業者に公知であり、例えば、制御物質の存在を含む化学的又は物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオン又はオフにする例が挙げられる。他のタイプの制御領域、例えば、エンハンサー配列もまたベクター内に存在してもよい。
【００７６】
調節配列及び他の制御配列は、上述したクローニングベクターのようなベクターへ挿入される前にコーディング配列に連結され得る。あるいは、コーディング配列は、すでに調節配列と適当な制限酵素切断部位を備えた発現ベクターへ直接クローン化され得る。
【００７７】
ある場合には、適切な向きで調節配列に連結されるようにコーディング配列を改変する必要がある。タンパク質の変異体又は類似体（アナログ）を製造することもまた望ましい。変異体又は類似体は、当該タンパク質をコードする配列の一部を欠失するか、１つの配列を挿入するか、及び／又は当該配列内の１以上のヌクレオチドを置換することによって調製され得る。部位特異的変異導入法のようなヌクレオチド配列を改変する技術は、例えば、サムブルックら（上掲）、DNA Cloning（上掲）、Nucleic Acid Hybridization（上掲）に記載されている。
【００７８】
次いで、当該発現ベクターが適切な宿主細胞を形質転換するために用いられる。数多くの哺乳動物細胞株が技術的に知られ、これらはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株を含む。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞性ガン細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Madin-Darbyウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞のみならずその他の細胞があるが、これらに限定されない。同様に、大腸菌(E.coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、及び連鎖球菌(Streptococcus spp.)等の細菌宿主も本発明の発現構築物として用いられるであろう。本発明に有用な酵母宿主は、とりわけ、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、Kluyveromyces fragilis、 Kluyveromyces lactis、 Pichia guillerimondii、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)及び Yarrowia lipolyticaが含まれる。バキュロウイルス発現ベクターを使用する昆虫細胞には、とりわけ、 Aedes aegypti、 Autographa californica、 Bombyx mori、 Drosophila melanogaster、 Spodoptera frugiperda, 及び Trichoplusia niが含まれる。
【００７９】
発現システム及び選択された宿主にも依存するが、本発明のタンパク質は、目的タンパク質が発現されるような条件下で、上述した発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を培養することによって製造される。次いで、当該タンパク質は宿主細胞から単離、精製される。適切な増殖条件及び回収方法の選択は当該技術分野における通常の技術である。
【００８０】
本発明のタンパク質は、公知のアミノ酸配列や目的遺伝子のＤＮＡ配列から推測されるアミノ酸配列を用いて、固相ペプチド合成法等の化学合成法により製造することもできる。このような種々の方法は当業者にとって公知であり、例えば、固相ペプチド合成技術としては、J.M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)及び G. Barany and R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross and J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, New York, (1980), pp. 3-254を、及び、古典的な液相合成方法としては、M. Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984) and E. Gross and J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis,
Biology, 上掲, Vol. 1を参照されたい。ペプチドの化学合成は、当該抗原の小さな断片が目的とする被検体における免疫応答を引き起こすことができる場合には好ましいであろう。
【００８１】
上記細胞培養液上清及び、所望により、さらなる組換え及び／又は精製タンパク質が製造されたならば、それらは哺乳動物被検体へ与えるための組成物へと製剤化される。このＣＣＳは、単独で、あるいは医薬的に許容される溶媒又は賦形剤と混合されて投与される。好ましい溶媒としては、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等、及びそれらの組合わせである。加えて、当該溶媒は少量の補助剤を含んでもよく、この補助剤は、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、又はワクチン組成物の場合のアジュバント等であり、ワクチンの効果を増強する。好ましいアジュバントについては、さらに以下に説明する。本発明の組成物は、薬剤、サイトカイン、又は他の生物学的応答の修飾因子等の補助的な物質を含んでもよい。
【００８２】
上記に説明したように、本発明のワクチン組成物は、１以上のＥＨＥＣ抗原の免疫原性をさらに向上させるためのアジュバントを含んでもよい。このようなアジュバントは任意の化合物又はＥＨＥＣ抗原若しくは抗原の組合わせに対する免疫応答を増強するように作用する化合物を含み、これによりワクチンに必要な抗原量、及び／又は十分な免疫応答を起こすために必要な投与回数を減少させることができる。アジュバントは、例えば、乳化剤、ムラミルジペプチド、アブリジン、水酸化アルミニウム、キトサンをベースとするアジュバント、及び任意のサポニン等の水溶性アジュバント、オイル、及びアンフィジェン、リポ多糖（ＬＰＳ）細菌細胞壁抽出物、細菌ＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド及びそれらの組み合わせ(Schijns et al., Curr. Opi. Immunol. (2000) 12:456)、抗酸菌(Mycobacterial phlei (M. phlei) 細胞壁抽出物（ＭＣＷＥ）(U.S. Patent No.4,744,984)、 抗酸菌ＤＮＡ (M-DNA)、抗酸菌ＤＮＡと抗酸菌細胞壁複合体(MCC)等の、その他の公知の物質を含んでもよい。例えば、ここで乳化剤として役立つであろう化合物は天然の及び合成の乳化剤を含み、陰イオン性のみならず、陽イオン性及び非イオン性化合物である。合成化合物の中で、陰イオン性乳化剤は、例えば、ラウリン酸及びオレイン酸のカリウム、ナトリウム及びアンモニウム塩、脂肪酸のカルシウム、マグネシウム及びアルミニウム塩（すなわち、金属セッケン）、及びラウリル硫酸ナトリウム等の有機スルホン酸塩である。合成陽イオン性化合物は、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド(cetyltrimethylammonium bromide)を含み、一方、合成非イオン性化合物には、グリセロールエステル（例えば、グリセリル・モノステアリン酸(glyceryl monostearate)）、ポリオキシエチレングリコールエステル又はエーテル、並びにソルビタン・脂肪酸エステル（例えば、ソルビタン・モノパルミチン酸(sorbitan monopalmitate)）及びそれらのポリオキシエチレン誘導体（例えば、ポリオキシエチレン・ソルビタン・モノパルミチン酸(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate)）が例示される。天然の乳化剤には、アカシア（アラビアゴム）、ゼラチン、レシチン及びコレステロールが含まれる。
【００８３】
その他の適したアジュバントは、例えば、単一の油、油混合物、油中水型エマルジョン（乳剤）、又は水中油型エマルジョン（乳剤）等の油成分から構成される。油は、ミネラルオイル（鉱油）、植物油、又は動物油でありうる。ミネラルオイル、又は油成分がミネラルオイルである水中油型エマルジョンが好ましい。これについて、「ミネラルオイル（鉱油）」とは、ペトロラタム(petrolatum)から蒸留技術により得られる液体の炭化水素混合物と定義され、「流動パラフィン(liquid paraffin)」、「流動ペトロラタム(liquid petrolatum)」及び「ホワイト油(white mineral oil)」と同義語である。この用語はまた、「軽油(light mineral oil)」すなわち、「ペトロラタムの蒸留によって同様に得られるがミネラルオイルよりも若干低い比重を有する油」をも含むものである。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（上掲）を参照されたい。特に好ましい１つの油成分は、商品名「EMULSIGEN PLUS」としてネブラスカ州ラルストン（Ralston, Nebraska）のMVP Laboratoriesから販売され、軽油と０．０５％ホルマリン及び防腐剤としての３０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む水中油型エマルジョンである。適切な動物油には、例えば、タラの肝油、オヒョウ油( halibut oil)、ニシン油(menhaden oil)、オレンジラフィー油(orange roughy oil)及びサメの肝油が含まれ、これらはすべて市販品として入手可能である。適切な植物油には、カノーラ油 (canola oil)、扁桃油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ピーナツ油、ベニバナ油(safflower oil)、ゴマ油、大豆油等を含むがこれらに限定されない。
【００８４】
あるいは、数多くの脂肪族窒素性塩基がワクチン製剤のアジュバントとして使用され得る。例えば、公知の免疫アジュバントは、アミン類、４級アンモニウム化合物、グアニジン、ベンザミジン及びチオウレア類を含む(Gall, D.
(1966) Immunology 11:369-386)。具体的な化合物には、dimethyldioctadecyl-ammonium bromide (DDA)(available from Kodak) and N,N-dioctadecyl-N,N-bis(2-hydroxyethyl)propanediamine ("avridine")が含まれる。免疫アジュバントとしてのＤＤＡの使用は、例えば、the Kodak Laboratory Chemicals Bulletin 56(1): 1-5 (1986); Adv. Drug Deliv. Rev. 5(3):163-187 (1990); J. Controlled Release 7:123-132 (1988); Clin. Exp. Immunol. 78(2):256-262 (1989); J. Immunol. Methods 97(2):159-164 (1987); Immunology 58(2):245-250 (1986); and Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 68(3):201-208 (1982)に記載されている。アブリジンもまた周知のアジュバントである。例えば、Wolff, IIIらに与えられた米国特許第４，３１０，５５０号を参照されたい。ここには、一般名としてのN,N-higher alkyl-N',N'-bis(2-hydroxyethyl)propane diamines、及び具体的にはアブリジンのワクチンアジュバントとしての使用について記載されている。Babiukに与えられた米国特許第５，１５１，２６７号、及びBabiuk et al. (1986) Virology 159:57-66もまたワクチンアジュバントとしてのアブリジンの使用に関する。
【００８５】
ここでの使用に特に好ましいものは、ＤＤＡを含み、EMULSIGEN PLUSアジュバントの改良型で「ＶＳＡ３」として知られているアジュバントである(米国特許第５，９５１，９８８号参照)。
【００８６】
ＣＣＳワクチン組成物は、ＣＣＳ製剤とアジュバントとを均一且つ親密に会合させることにより調製することができ、それには当業者に周知である混合、超音波処理、及び微小流体化を含む技法が用いられるがこれらに限定されない。アジュバントは、好ましくはワクチンの約１０〜５０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約２０〜４０％（ｖ／ｖ）及び最も好ましくは約２０〜３０％又は３５％（ｖ／ｖ）又はこれらの範囲内の整数％含むであろう。
【００８７】
本発明の組成物は、通常、注射剤として、液体溶液又は懸濁液の何れか、又は注射の前に液体溶媒中に溶液又は懸濁液とするに適した固形の形態として調製される。当該製剤はまた、乳化された、又は有効成分がリポソーム媒体又は他の持続する運搬のために用いられる特定の担体（carriers）に封入された(encapsulated)固形の形態として調製されてもよい。例えば、当該ワクチンは油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、部位特異的エマルジョン、長期滞在型エマルジョン、粘着性エマルジョン、マイクロエマルジョン、ナノエマルジョン、リポソーム、微粒子、ミクロスフェア、ナノスフェア、ナノ粒子及び種々の天然又は合成ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテートコポリマーやHytrel（登録商標）コポリマー等の非再吸収性不浸透性ポリマー、ハイドロゲル等の膨潤性ポリマー、又はコラーゲンや吸収性縫合糸を製造するために用いられるような特定のポリ酸又はポリエステル等の再吸収性ポリマーの形態であってもよく、これらはワクチンの持続的な放出を可能とする。
【００８８】
さらに、ポリペプチドは中性の、又は塩の形態の何れかで組成物へ製剤化することができる。医薬的に許容される塩には、酸付加塩（有効成分のポリペプチドのアミノ基が遊離の形態で）を含み、これらは、例えば、塩酸又はリン酸等の無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸で形成される。遊離のカルボキシル基から形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化第二鉄等の無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカニン等の有機塩基に由来してもよい。
【００８９】
このような剤形の実際の調製方法は、当業者にとって公知であるか、又は明白であろう。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18th edition, 1990を参照されたい。
【００９０】
当該組成物は、分泌されたＥＨＥＣ抗原の有効量を含むように処方され、その厳密な量は当業者によって容易に決定することができる。当該投与量は治療される動物及び当該動物の免疫系の抗体合成能力に依存する。投与される成分又は剤形は治療される被検動物に所望の状態を達成するに十分な１以上の分泌されたＥＨＥＣ抗原の一定量を含む。本発明の目的のための、組換え及び／又は精製された分泌ＥＨＥＣ抗原を添加又は無添加のＣＣＳを含有するワクチンの１つの治療上の有効量は、約０．０５〜１５００μｇの分泌されたＥＨＥＣタンパク質、好ましくは約１０〜１０００μｇの分泌されたＥＨＥＣタンパク質、より好ましくは約３０〜５００μｇの、最も好ましくは約４０〜３００μｇの分泌されたＥＨＥＣタンパク質、又はこれらの範囲内の整数を含む。ＥｓｐＡ＋Ｔｉｒだけでなく、他のＥＨＥＣ抗原は全ＣＣＳタンパク質の約１０％から５０％含まれても良く、例えば、約１５％から４０％及び好ましくは約１５％から２５％である。もし、組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒを補充する場合は、当該ワクチンは約５〜５００μｇのタンパク質、より好ましくは約１０〜２５０μｇ及び最も好ましくは約２０〜１２５μｇ含むことができる。
【００９１】
投与の経路は、経口、局所、皮下、筋肉内、静脈内の、皮下の、皮内の、経皮的な及び皮下を含むがこれらに限定されない。投与の経路によって投与量あたりの用量は、好ましくは約０．００１〜１０ｍｌ、より好ましくは約０．０１から５ｍｌ及び最も好ましくは約０．１〜３ｍｌである。ワクチンは１回の投与により投与することができ、又は複数回投与（ブースト）により１つの予定に従い、そして年齢、体重及び被検体動物の状態に適した期間にわたって、特定のワクチン製剤及び投与経路で投与することができる。
【００９２】
如何なる適切な医薬投与手段も当該ワクチンを脊椎動物へ投与することができる。例えば、従来の注射針、ばね、又は圧縮ガス（空気）インジェクター(U.S. Patent Nos. 1,605,763 to Smoot; 3,788,315 to Laurens; 3,853,125 to Clark et al.; 4,596,556 to Morrow et al.; and 5,062,830 to Dunlap)、液体ジェットインジェクター(U.S. Patent Nos. 2,754,818 to Scherer; 3,330,276 to Gordon; and 4,518,385 to Lindmayer et al.)、及び粒子インジェクター(U.S. Patent Nos. 5,149,655 to McCabe et al. and 5,204,253 to Sanford et al.)はすべて当該組成物の投与に適当である。
【００９３】
ジェットインジェクターを用いる場合は、液体ワクチン組成物の１回のジェットを高圧、高速条件下、例えば、１２００〜１４００ＰＳＩで噴出され、それによって皮膚に穴をあけ、免疫に適した深さまで貫通する。
【００９４】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、同時に、その範囲の如何なる限定をも構成するものではない。それどころか、それらの種々の他の実施形態、改変、及び均等物であって、その記載を読むことによって本発明の精神及び／又は添付請求の範囲から逸脱することなく当業者に示唆するものを当然含むと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離されたＣＣＳタンパク質の電気泳動パターンである。
【図２】ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分離されたＥｓｐＡ、Ｔｉｒ、ＥｓｐＢ、及びインチミンの電気泳動パターンである。
【図３】ＣＣＳワクチンで免疫し、続いてＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を投与したウシによるＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の糞便からの排泄量である。
【図４】以前に感染したことのあるウシにおける、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の糞便からの排泄の再活性化である。
【図５】組換えＥｓｐＡ＋Ｔｉｒワクチン、及び組換えＥｓｐＢ＋インチミンワクチンによる免疫化に対する血清学的反応である。
【図６】組換えＥｓｐＡ＋Ｔｉｒワクチン、及び生理食塩水ワクチンによる免疫後の排泄糞便中のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７である。
【図７】実施例６のワクチン試験における大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を排泄する動物の個体数の経時変化。生理食塩水中に再懸濁された糞便試料を、セフィキシム及びテルライトを補充したソルビトール・マッコンキー(Sorbitol MaConkey)寒天培地に直接プレーティングすることにより菌体を検出した。棒グラフの塗り潰した部分はコントロールのグループであり、斜線部分はＥＨＥＣワクチン投与グループである。
【図８】ＥＨＥＣ分泌タンパクに対するワクチン接種した動物の血清のイムノブロット分析。各ブロットには、野生型大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ）、III型分泌変異体（ΔＳｅｐＢ）、Ｔｉｒ変異体（ΔＴｉｒ）及び精製グルタチオン-ｓ−トランスフェラーゼ：Ｔｉｒ融合タンパク（ＧＳＴ−Ｔｉｒ）からの分泌タンパクが含まれる。各タンパクは、ＳＤＳ−１０％ＰＡＧＥによって分離し、クーマシーブルーで染色し（図８Ａ、左上のパネル）、又はニトロセルロースに移し、３種類のワクチン処方物によってそれぞれ免疫された動物の代表血清で標識した（図８Ａ、上の（右側の３つの）各パネル）。下の４つのパネル（図８Ｂ）は、試験開始後０日、２１日、２５日及び４９日に採取した、ＥＨＥＣワクチンが投与された１匹の代表動物の血清で標識したものに関する。
【図９】実施例６の試験の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を排泄した動物の各グループのパーセント（図９Ａ）及び回収菌体総数（図９Ｂ）の経時変化。J. Van Donkersgoed et al., Can. Vet. J. (2001) 42:714に記載されている免疫磁気濃縮後、セフィキシム及びテルライトを補充したソルビトール・マッコンキー（Sorbitol MaConkey）寒天培地に糞便をプレーティングすることにより菌体を検出した。図９Ａの棒グラフの塗り潰し部分は、コントロール、斜線部分は、ＥＨＥＣワクチン、空白部分は、ΔＴｉｒワクチンを表す。図９Ｂの■はコントロール、●はＥＨＥＣワクチン、▲はΔＴｉｒワクチンを表す。
【実施例１】
【００９６】
細胞培養液上清（ＣＣＳ）の調製
野生型ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７をＣＣＳタンパク質の合成が最大となる条件で増殖させた（Li et al., Infect. Immun. (2000) 68:5090）。簡単に説明すると、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の一晩静置培養液は、３７℃（±５％炭酸ガス）で一晩ＬＢ(Luria-Betani)培地で増殖させた。この培養液を０．１％カザミノ酸、０．４％グルコース、８ｍＭ硫酸マグネシウム(ＭｇＳＯ４)及び４４ｍＭ炭酸水素ナトリウム(ＮａＨＣＯ２)を添加したＭ９最小培地で１：１０に希釈した。培養液は、５％炭酸ガスの下３７℃で静置し６００ｎｍの吸光度が０．７〜０．８になるまで培養した（６〜８時間）。４℃で、８０００回転、２０分間遠心分離することにより細菌を除去した。この上清を限外ろ過により１００倍に濃縮し、全タンパク質量をＢＣＡ(bicinchonic acid)プロテインアッセイ法で決定した。
【００９７】
図１は、ＳＤＳ−１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）と、続いてクーマシーブルー染色によって得られた分子量マーカー（レーン１）及び典型的なＣＣＳタンパク質パターン（レーン２）を示す。ＥｓｐＡ（２５ｋＤ）、ＥｓｐＢ／ＥｓｐＤ（４０ｋＤ）、分解されていないＴｉｒ（７０ｋＤ）及び分解されたＴｉｒ（５５ｋＤ）の位置を示した。HP Scanjet 5100C及びID softwareプログラムを用いた濃度測定分析により決定した結果、ＥｓｐＡは、分解されていないＴｉｒの約５％、分解されたＴｉｒの約２０％、及び全タンパク質の約６％であった。しかしながら、クーマシーブルーで染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの濃度測定により決定されたタンパク質の割合は、バックグラウンド染色の変動や、クーマシーブルー染色の取り込みの変動や、バンドによる濃さのばらつきや、その他当業者に公知の種々の因子のために正確ではない。
【実施例２】
【００９８】
組換えタンパク質の調製
ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、インチミン及びＴｉｒをコードする遺伝子を単離した（Li et al., Infect. Immun. (2000) 68:5090）。ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の臨床分離株をＤＮＡの供給源として用いた。ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、Ｔｉｒ、及びインチミンの２８０個のカルボキシ末端アミノ酸をコードするｅａｅ領域は、染色体ＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、単一の制限酵素切断部位を導入して適当なプラスミドにクローン化した。生成したプラスミドを切断し、ヒスチジンタグ融合物が生成するように連結した。プラスミドは発現用大腸菌株に電気的に導入し、この大腸菌を増殖させた（Ngeleka et al., Infect. Immun. (1996) 64:3118）。遺伝子発現はＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトプラノシド）による誘導により、Ｔａｃプロモーターを用いて作動させた。細菌はペレット化し、トリス緩衝化生理的食塩水中に再懸濁し、超音波処理により溶菌させた。溶菌液は不溶物を除去するために遠心分離し、ヒスチジンタグを含むタンパク質を特異的に結合するニッケルアフィニティークロマトグラフィーカラム固定相を通してヒスチジンタグタンパク質を精製した。調製されたすべてのタンパク質は使用時まで−２０℃で保存した。
【００９９】
組換えタンパク質の純度は１０％ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、クーマシーブルー染色により評価した。上記クロマトグラフィーにより精製された組換えタンパク質の典型的なゲルパターンを図２に示す。組換えＥｓｐＡ（レーン２）、組換えＥｓｐＢ（レーン３）及び組換えインチミン（レーン４）は、比較的純粋な形態で回収されたが、組換えＴｉｒ（レーン５）は多少の分解を受けていた。
【実施例３】
【０１００】
ワクチンの製剤化および投与
ワクチンは、ＣＣＳ又は組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒを、３０〜４０％アジュバントを含む基材２ｍｌに混合することにより製剤化した。ワクチンは皮下に投与した。動物を１日目及び、３〜４週間の間隔をおいて再び免疫（追加免疫又はブーストという。）した。最初の免疫の前、夫々のブースト時、及び実験終了時に血清試料を採取した。
【０１０１】
免疫に対する血清学的な応答を酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ法）を用いて決定した。１００μｌの組換えＥｓｐＡ (０．１６μg/ウェル)、組換えＴｉｒ (０．１μg/ウェル)、組換えＥｓｐＢ (０．２４μg/ウェル)及び組換えインチミン (０．１８７μg/ウェル)を用いてマイクロタイタープレートのウェルにコート（被膜）し、当該プレートを４℃で一晩インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、０．５％脱脂乾燥ミルクを含むリン酸緩衝化生理的食塩水でブロッキングした。段階希釈した血清を各ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ウェルを洗浄及びブロッキングし、１００μｌのペルオキシダーゼ接合ウサギ抗ウシ免疫グロブリンＧ抗体（１：５０００）を各ウェルに添加して３７℃で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、プレートを４９２ｎｍの波長で吸光度を測定した。
【実施例４】
【０１０２】
実験動物
８歳から１２歳の間の複数のウシを地元の牧場から購入した。夫々の動物から１４日間毎日糞便試料を採取した。糞便試料中のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の数をレインボーアガーにプレーティングして測定した。当該プレートを３７℃で２日間インキュベートし、黒いコロニー数を数えた。増殖は０〜５で得点（スコア）化した。スコア０（ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７なし）の動物をすべての実験に用いた。
【実施例５】
【０１０３】
動物定着モデル
２ヶ月より長い間感染が維持されたウシのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７定着モデルを用量−滴定プロトコルにより開発した。
【０１０４】
ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７は実施例１に示した方法で増殖させた。２４頭のウシを８頭ずつ３つのグループに分割した。グループ１は１０６、グループ２は１０８、グループ３は１０１０ＣＦＵ（定着ユニット）のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を、第０日に５０ｍｌ容量で口腔−胃挿管によって接種された。
【０１０５】
排泄を監視（モニター）するため、第１日から第１４日まで糞便材料を収集した。糞便材料は重さを測定し、滅菌した生理的食塩水に懸濁し、培養液に接種した。培養液の濁度は実施例１のように測定した。
【０１０６】
図３に示したように、グループ２（１０８ＣＦＵ）のウシにより排泄されたＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の数と、グループ３（１０１０ＣＦＵ）のウシにより排泄されたＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の数との間には有意な差異は認められなかった。グループ２のウシは、１４日間の夫々の日にほとんどのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄した。グループ２のウシにより排泄されたＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の数は第６日に最大値に達し第１４日にはゼロにまで減少した。
【０１０７】
ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄した動物（以下「陽性」という。）は、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の排泄が検出できないレベルに減少するまで、さらに４０日間維持した。以前に陽性であった動物（以下「キャリアー（保菌動物）」という。）により排泄されたＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７は、２４時間摂食を抑制し、市販のクロストリジウムの又はH. somnusワクチンを接種することにより再活性化した。図４に示したように、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄する保菌動物の数は、第６及び７日には約５０％の最大値に達し、第１５日にはゼロに減少した。
【０１０８】
１０８ＣＦＵの投与量は、感染後の１４日間に検出可能な数の排泄されたＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を産生し（図３）、持続的に感染した動物に帰結した（図４）ため、以後の実験において投与する量としてこの投与量を用いた。
【実施例６】
【０１０９】
ＣＣＳの保護能力
分泌タンパク質のワクチンとしての潜在能力をテストするため、ＣＣＳを油を主材料とするアジュバントであるＶＳＡ３（米国特許第5,951,988号、S. van Drunen Littel-van den Hurk et al., Vaccine (1993) 11:25）と、２ｍｌ中に２００μｇのＣＣＳタンパク質と３０容量％(v/v)のアジュバントとなるように混合した（ＣＣＳワクチン）。対照群のために、滅菌した生理的食塩水をＶＳＡ３と、２ｍｌ中に０μｇのＣＣＳタンパク質と３０容量％(v/v)のアジュバントとなるように混合した（生理食塩水ワクチン）。
【０１１０】
１６頭のウシを８頭ずつ２つのグループに分けた。第１日及び第２２日（ブースト）に、グループ１のウシは２ｍｌのＣＣＳワクチンを皮下に投与され（試験群）、グループ２のウシは２ｍｌの生理食塩水ワクチンを皮下に投与された（対照群）。ＥＬＩＳＡ（実施例３）により、第１日（免疫前）、第２２日及び第３６日に抗体陽転が起きたかどうか検定した。表１の第２２日に示したように、グループ１の動物は、ＥｓｐＡ及びＴｉｒに対する特異的な抗体価を示した。また、第３６日には、これらの抗体価は大きく増加を示した。グループ２の動物は、第２２日及び第３６日に特異的な抗体価を示さなかった。特に、ＥＨＥＣワクチンを接種されたグループは、初回免疫と第１回の追加免疫後にタイプ３分泌タンパク質に対する特異的な抗体価が１３倍に上昇し、偽薬ワクチングループでは１頭だけが抗体陽転したのに対し、ＥＨＥＣワクチングループの８頭の動物は特異的な抗体価において４５倍の増加を示した(X２, p=0.0002)。
【０１１１】
［表１］ＣＣＳ免疫に対する血清学的応答
【０１１２】
第３６日に、グループ１及びグループ２の動物に１０８ＣＦＵのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を口腔−胃挿管によって投与し、糞便への排泄を１４日間モニターした（実施例５）。表２にまとめたように、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄した試験群の動物は対照群の動物より少なく、その排泄した試験群動物は、対照群動物よりも短い期間ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄した（図７）。特に、ワクチン接種した動物において排泄された日数の中央値は、偽薬グループの３．５日に比べて１．５日であった（Wilcoxin Signed Rank Test, p=0.08）。偽薬で免疫された８頭の動物のうち７頭が試験期間中当該細菌を排泄し、それらの動物のうち４頭が４日又はそれ以上の連続する期間当該細菌を排泄した。このことは、それらの動物は持続的に感染していることを示している。ＥＨＥＣワクチンで免疫した８頭の動物のうち５頭は試験期間中のある時点で当該細菌を排泄したが１頭だけが連続する２日以上の間当該細菌を排泄した。このことは、定着は一過性であり、偽薬グループよりも有意に少ないことを示す。糞便試料から単離された全細菌数は、ＥＨＥＣで免疫されたグループでは偽薬グループに比べて有意に低下していた（Wilcoxin Signed Rank Test, p=0.05）。前者は回収された糞便１ｇ当たりの６．２５定着ユニット（ＣＦＵ）の中央値を有するのに対し、後者は８１．２５ＣＦＵ／ｇの中央値を有した。従って、３型分泌タンパク質を用いたワクチンは、糞便の培養液で検出される排泄された細菌数だけでなく当該生物を排泄した動物の排泄日数の減少によって反映されるように、当該生物の小腸への定着能力を減少させるように思われる。
【０１１３】
［表２］試験群及び対照群による排泄
【０１１４】
これらのデータは、ＣＣＳがウシにおいて、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄する動物数及びＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７が排泄される日数の両方を減少させる抗体応答を誘導することを示す。
【０１１５】
ワクチン製剤の有効性を高めるために、６頭の子ウシのグループを上記方法により、分泌タンパク質の３つの投与量（５０μg、１００μg、２００μg）の１つ又は偽薬で免疫し、第０日、第２1日（ブースト）および第３５日に採取した血清サンプルを用いて血清学的応答を測定した。ＥＨＥＣワクチンを投与されたグループの間では如何なる時点においても抗-ＥＨＥＣ、抗-Ｔｉｒ、又は抗-ＥｓｐＡ応答について有意な差異は認められなかったが、３つの投与量のすべてのグループは、第２１日及び第３５日における偽薬グループよりも有意に高かった。従って、第２のワクチン投与試験は、１歳児のウシの３つのグループに５０μgの分泌タンパク質（ｎ＝１３）、Ｔｉｒ変異株から得られた５０μgの分泌タンパク質（ΔＴｉｒ, ｎ＝１０）又は偽薬（ｎ＝２５）を用いて３回免疫するように計画した。用いたアジュバントはＶＳＡ３であり、動物は第０日、第２１日、第３５日に皮下投与により免疫され、続いて第４９日に大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を投与された。免疫に対する血清学的応答を表３に示した（第０日及び第４９日のみ）。上述した試験と同様の結果が観察された。ΔＴｉｒワクチンを投与されたグループは、野生株から調製されたワクチンを投与されたグループと同様に全分泌タンパク質に対して同等の応答を示したが、予測したように、Ｔｉｒに対しては有意に減少した応答を示した（Wilcoxin Signed Rank Test, p=0.006）。しかしながら、前者のグループは、確かに抗-Ｔｉｒ抗体レベルの上昇を示しており（Wilcoxin Signed Rank Test, p=0.009）、これは、免疫的に関連する分子を生産する生物に曝すか、又は大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７に曝すかの何れかであることを示している。これは、さらに偽薬グループにおいては大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の投与日において抗-Ｔｉｒ抗体に有意な上昇があったが、偽薬グループとΔＴｉｒグループとで差がないという観察によって支持される。ＥｓｐＡに対する応答はＥＨＥＣとΔＴｉｒワクチングループの両方で同様であり、偽薬で免疫した動物よりもはるかに高い。ＥｓｐＡに対する応答は、ＥＨＥＣ及びΔＴｉｒワクチングループの双方において同様であり(p=0.45, Kruskal-Wallis ANOVA)、偽薬グループよりも有意に高い応答を示した(p<0.0001)。
【０１１６】
［表３］野生型大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ）、又は同質遺伝子型Ｔｉｒ変異株（ΔＴｉｒ）から調製された分泌タンパク質、又は偽薬を用いた血清学的免疫応答中央値。力価は血清の最後の陽性希釈率（ ）の幾何平均値として表した。括弧内の数字は２５％から７５％の順位を示す。
【０１１７】
夫々のワクチン製剤に対する免疫応答は、グループごとに代表的な２頭の動物から得られた血清を用いたウェスタンブロッティングによっても定性的に分析した。代表的な動物についての結果を図８に示した。III型分泌系によって分泌されたタンパク質はウシにおいて高度に免疫原性を有することが示された。ＥＨＥＣ及びΔＴｉｒワクチングループにおける応答は、後者のグループにおいて欠けているＴｉｒに対する応答を除いて同様であった（図８、上部パネル）。ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ及びＴｉｒはすべて反応性があり、第２１日の第２免疫によってリポ多糖類に対する大きな応答も認められた。ワクチン接種動物における免疫応答の速度論（キネティクス）は、抗−Ｔｉｒ抗体が４３ｋＤａ及び１００ｋＤａタンパク質に対する抗体のように単一の免疫によって検出できることを示す（図８、下部パネル）。後者のタンパク質はｓｅｐＢ及びｔｉｒ変異株と同様に野生株によっても生産され、１００ｋＤａタンパク質はおそらく、III型でないＥＨＥＣ分泌タンパク質であるＥｓｐＰである。
【０１１８】
第４９日に大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を経口投与した後、夫々のグループは当該生物の糞便中への排泄について１４日間毎日モニターされた。この実験においては、細菌は直接プレーティング法よりも以下の免疫濃縮法（J. Van Donkersgoed et al., Can. Vet. J. (2001) 42:714、Chapman及びSiddons, J. Med. Microbiol. (1996) 44:267）により培養された。なぜならば、この感染モデルにおいては１歳児のウシは子ウシよりも少ない量しか排泄しないからである。投与の日、偽薬グループの２頭の動物は大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７について培養陽性であり、試験から除外した。偽薬で免疫した動物は、２つのＥＨＥＣワクチングループに比べて、投与後当該生物をはるかに多く排泄した（図９）。偽薬ワクチンを接種された動物は、中央値で４日間当該生物を排泄したが、これは他の２つのワクチンを接種されたグループによる中央値の０日よりも有意に長かった(p=0.0002, Kruskal-Wallis ANOVA)。ＥＨＥＣ及びΔＴｉｒワクチングループから回収された細菌は著しく少なかった(p=0.04, Kruskal-Wallis ANOVA)。感染後２日目以降、偽薬ワクチングループ動物の７８％は少なくとも１日当該生物を排泄したが、これに比べてＥＨＥＣワクチングループでは１５％、及びΔＴｉｒワクチングループでは３０％であった（表４）。
【０１１９】
上記に示されたデータは、ＥＨＥＣの病原性因子、すなわち、III型分泌系によって分泌されるそれらは、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７等のようなＥＨＥＣ細菌のウシへの定着を減少させるための有効なワクチン成分として使用し得ることを示す。ウシは当該生物へ自然にさらされただけではこれらのタンパク質に対して通常大きな血清学的な応答を示さないが、これらのタンパク質はヒトにおける感染後の免疫応答の主要なターゲットである(Li et al., Infect. Immun. (2000) 68:5090)。しかしながら、これらのタンパク質を用いてワクチン接種された動物は抗原刺激されており、当該生物の経口投与によって抗−ＥＨＥＣ及び抗−Ｔｉｒ価の上昇を示す。
【０１２０】
Ｔｉｒはウシ小腸への定着にとって必要と思われ、このことはΔＴｉｒ大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７株からの分泌タンパク質を含むワクチンが同質遺伝子型の野生型単離株からの同様な製剤ほど有効でないという観察によって支持される。しかしながら、前者のワクチンは偽薬よりもはるかに有効であることから、定着に対する免疫は自然界では多因子性であることを示唆する。このことは免疫応答においてリポ多糖類だけでなく何種類かのタンパク質成分が認識されることを示すウェスタンブロッティング分析によって支持される。リポ多糖類による保護の寄与は知られていないがこの分子に対する抗体の存在は、ネズミＥＨＥＣモデルにおける保護と関連していない(Conlan et al., Can. J. Microbiol. (1999) 45:279; Conlan et al., Can. J. Microbiol. (2000) 46:283)。また、組換えＴｉｒ及びＥｓｐＡを用いた免疫は排泄された細菌数を減少させることができるが、実際の動物数や排泄期間は減少しない。
【０１２１】
非Ｏ１５７血清型の罹患率は、北アメリカにおいて上昇しており、他の地理的位置においてもＥＨＥＣ感染のかなりの割合を占めると思われる。タイプ３の分泌抗原は非Ｏ１５７ＥＨＥＣ血清型間で比較的保存されているらしく、このワクチン製剤はＯ１５７ＬＰＳ抗原に基づく製剤に比べて広く交差保護的である可能性がある。
【０１２２】
［表４］投与後２日から１４日の間に大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を排泄した動物数
【実施例７】
【０１２３】
組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒ及び組換えＥｓｐＢ＋組換えインチミンの保護能力
組換えＥｓｐＡ、組換えＴｉｒ、組換えＥｓｐＢ及び組換えインチミンは、油基材のアジュバント、ＶＳＡ３と混合し、２ｍｌの投与量あたり５０μｇの組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒ又は組換えＥｓｐＢ＋組換えインチミンと３０％(v/v)のアジュバントを含むようにした。滅菌した生理食塩水をＶＳＡ３と混合し、２ｍｌの投与量あたり０μｇの組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒ又は組換えＥｓｐＢ＋組換えインチミンと３０％(v/v)のアジュバントを含むようにした。
【０１２４】
３４頭のウシを４つのグループに分けた。グループ１の１０頭のウシを組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒワクチン（試験群）で、及びグループ２の１０頭のウシを組換えＥｓｐＢ＋組換えインチミンワクチン（試験群）で第１日、第２２日（ブースト）及び第３６日に免疫した。グループ３の７頭のウシと、グループ４の７頭のウシを生理食塩水ワクチン（対照群）で第１日、第２２日（ブースト）及び第３６日に免疫した。抗体陽転を第１日（免疫前）、第２２日及び第３６日にＥＬＩＳＡ法（実施例３）により試験した。図５に示したように、第２２日には、グループ１の動物は組換えＥｓｐＡ及び組換えＴｉｒに対する特異的な抗体価を示し、グループ２の動物は組換えＥｓｐＢ及び組換えインチミンに対する特異的な抗体価を示した。また、図５に示したように、第３６日には、グループ１の動物は組換えＴｉｒに対しては特異的な抗体価の上昇を示したが組換えＥｓｐＡに対しては特異的な抗体価に変化がなく、グループ２の動物は組換えインチミンに対しては特異的な抗体価の上昇を示したが組換えＥｓｐＢに対しては特異的な抗体価の減少を示した。グループ３と４の動物は第２２日及び第３６日において特異的な抗体価を示さなかった。
【０１２５】
第３６日に、グループ１〜４の動物に１０８ＣＦＵのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を投与し、１４日間毎日排泄物をモニターした（実施例５）。図６に示したように、グループ１（組換えＴｉｒ＋組換えＥｓｐＡ）の動物とグループ３（生理食塩水）の動物との排泄物の違いは、投与後の最初の５日間は小さかった。しかし、投与後の第２週には、グループ１の動物とグループ３の動物との違いは明らかとなった。ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄したグループ１の動物数はグループ３の動物数よりも少なかった。グループ１の動物は、グループ２の動物よりも少ない量のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を糞便中に、より少ない期間排泄した。グループ２（組換えＥｓｐＢ＋組換えインチミン）とグループ４（生理食塩水）の動物の間での排泄量の差は、排泄した動物数、排泄したＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７の数及び排泄した期間に関しては明らかでなかった。
【０１２６】
これらのデータは、組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒワクチンによって誘発された抗体応答はウシのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７定着を阻止するが、組換えＥｓｐＢ＋組換えインチミンワクチンによって誘発された抗体応答はウシのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７定着を阻止しなかったことを示す。
【実施例８】
【０１２７】
ＣＣＳ＋組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒの保護能力
ＣＣＳ、ＣＣＳ＋組換えＥｓｐＡ、ＣＣＳ＋組換えＴｉｒ、ＣＣＳ＋組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒ及び生理食塩水を夫々アジュバントと混合する。
【０１２８】
２５頭のウシを５頭ずつ５つのグループに分け、第１日、及び第２２日（ブースト）に免疫する。グループ１はＣＣＳワクチンを、グループ２はＣＣＳ＋組換えＥｓｐＡワクチンを、グループ３はＣＣＳ＋組換えＴｉｒワクチンを、グループ４はＣＣＳ＋組換えＥｓｐＡ＋組換えＴｉｒワクチンを、及びグループ５は生理食塩水ワクチンを夫々投与する。抗体陽転を第１日（免疫前）、第２２日（ブースト）及び第３６日にＥＬＩＳＡ法（実施例３）により試験する。第２２日、及び第３６日に、１〜５の夫々のグループはＥｓｐＡ及びＴｉｒに対する特異的な抗体価を示すが、グループ６の動物は特異的な抗体価を示さない。
【０１２９】
第３６日に、グループ１〜５の動物に１０８ＣＦＵのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を投与し、１４日間毎日排泄物をモニターする。ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄するグループ１〜４の動物はグループ５の動物よりも少ない。グループ５の動物はほとんどのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄する。グループ１の動物はグループ５の動物よりも少ない量のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄し、グループ２〜４の動物はグループ１の動物よりも少ない量のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄する。
【実施例９】
【０１３０】
種々の抗原を用いたＣＣＳの保護能力
ＣＣＳは、２ｍｌの用量が夫々０、５０、１００又は２００μｇのＣＣＳと３０％（v/v）のアジュバントを含有するようにアジュバントと混合される（表５）。
【０１３１】
［表５］種々のアジュバントによるＣＣＳの保護能力
【０１３２】
７２頭のウシを８頭ずつ９グループに分ける。グループ１〜８の動物はＣＣＳ＋アジュバント（表５）で、グループ９のウシは生理食塩水＋アジュバントで、第１日及び第２２日（ブースト）に免疫される。抗体陽転が起きたかどうかを、第１日（免疫前）、第２２日（ブースト）及び第３６日にＥＬＩＳＡ（実施例３）により試験される。グループ１〜８（ＣＣＳ＋アジュバント）の動物は、第２２日及び第３６日に、ＥｓｐＡ及びＴｉｒに対する特異的な抗体価を示す。グループ９（生理食塩水＋アジュバント）の動物は第２２日及び第３６日に特異的な抗体価を示さない。
【実施例１０】
【０１３３】
乳牛におけるＣＣＳの保護能力
２０頭の成人の乳牛を１０頭の２グループに分ける。グループ１はＣＣＳワクチンで、グループ２は生理食塩水ワクチンで、夫々第１日及び第２２日（ブースト）に免疫する。抗体陽転が起きたかどうかを、第１日（免疫前）、第２２日及び第３６日にＥＬＩＳＡ（実施例３）により試験する。第２２日及び第３６日にグループ１の乳牛はＥｓｐＡ及びＴｉｒに対する特異的な抗体価を示すが、グループ２の乳牛は特異的な抗体価を示さない。
【０１３４】
第３６日に、グループ１および２の乳牛に１０８ＣＦＵのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を投与し、１４日間毎日排泄物をモニターする。ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄したグループ１の乳牛はグループ２の乳牛よりも少ない。グループ１の乳牛は、グループ２の乳牛よりも少ない量のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７をより少ない期間排泄する。
【０１３５】
初期免疫から６ヵ月後、グループ１および２の乳牛に皮下を経由して再度免疫する（第２ブースト）。第２ブースト後１４日目に抗体価をＥＬＩＳＡ（実施例３）により試験する。グループ１の乳牛はＥｓｐＡ及びＴｉｒに対する特異的な抗体価を示すが、グループ２の乳牛は特異的な抗体価を示さない。
【０１３６】
第２ブースト後１４日目に、グループ１および２の乳牛に再度１０８ＣＦＵのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を投与し、１４日間毎日排泄物をモニターする（実施例５）。ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄したグループ１（ＣＣＳ）の乳牛はグループ２（生理食塩水）の乳牛よりも少ない。グループ１の乳牛は、グループ２の乳牛よりも少ない量のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７をより少ない期間排泄する。
【実施例１１】
【０１３７】
子ウシにおけるＣＣＳの保護能力
１０頭の離乳した子ウシ（生後３〜６ヶ月）を５頭ずつの２グループに分け、肥育場へ入る前（第０日）及び肥育場へ入る日（第１日、ブースト）に免疫する。グループ１の子ウシはＣＣＳワクチンを投与され、グループ２の子ウシは生理食塩水ワクチンを投与される。抗体陽転が起きたかどうかを、第０日、第１日、及び第１４日にＥＬＩＳＡ（実施例３）により試験する。グループ１（ＣＣＳ）の子ウシはＥｓｐＡ及びＴｉｒに対する特異的な抗体価を示すのに対して、グループ２（生理食塩水）の子ウシは特異的な抗体価を示さない。
【０１３８】
第１４日に、グループ１および２の子ウシに１０８ＣＦＵのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を投与し、１４日間毎日排泄物をモニターする（実施例５）。ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄するグループ１の子ウシはグループ２の子ウシよりも少ない。グループ１の子ウシは、グループ２の子ウシよりもＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７をより少ない期間排泄する。
【０１３９】
１０頭の離乳した子ウシ（生後３〜６ヶ月）を５頭ずつの２グループに分け、肥育場へ入る日（第１日）及び肥育場における第２２日（ブースト）に免疫する。グループ１の子ウシはＣＣＳワクチンを投与され、グループ２の子ウシは生理食塩水ワクチンを投与される。抗体陽転が起きたかどうかを、第１日（免疫前）、第２２日及び第３６日にＥＬＩＳＡ（実施例３）により試験する。グループ１（ＣＣＳ）の子ウシはＥｓｐＡ及びＴｉｒに対する特異的な抗体価を示すのに対して、グループ２（生理食塩水）の子ウシは特異的な抗体価を示さない。
【０１４０】
第３６日に、グループ１および２の子ウシに１０８ＣＦＵのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を投与し、１４日間毎日排泄物をモニターする（実施例５）。ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄するグループ１の子ウシはグループ２の子ウシよりも少ない。グループ１の子ウシは、グループ２の子ウシよりもＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７をより少ない期間排泄する。
【実施例１２】
【０１４１】
ヒツジにおけるＣＣＳの保護能力
２０頭の成人のヒツジを１０頭ずつの２グループに分ける。グループ１はＣＣＳワクチンで、グループ２は生理食塩水ワクチンで、夫々第１日及び第２２日（ブースト）に免疫する。抗体陽転が起きたかどうかを、第１日（免疫前）、第２２日及び第３６日にＥＬＩＳＡ（実施例３）により試験する。第２２日及び第３６日にグループ１の乳牛はＥｓｐＡ及びＴｉｒに対する特異的な抗体価を示すのに対し、グループ２の乳牛は特異的な抗体価を示さない。
【０１４２】
第３６日に、グループ１および２のヒツジに１０８ＣＦＵのＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を投与し、１４日間毎日排泄物をモニターする。ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７を排泄するグループ１のヒツジはグループ２のヒツジよりも少ない。グループ１の乳牛は、グループ２の乳牛よりも少ない量のＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７をより少ない期間排泄する。
【０１４３】
このように、腸管出血性大腸菌の哺乳動物への定着を治療し、阻止する組成物及びそのための方法が開示された。本発明の主題についての好ましい実施形態が詳細に開示されているが、その明らかな変形は、添付クレームに規定された本発明の精神と範囲から逸脱しないものと理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）細胞培養液上清と免疫アジュバントとを含むことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項２】
前記ＥＨＥＣは、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７であることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記ＥＨＥＣは、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭであることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記免疫アジュバントは、水中油型エマルジョンから構成されることを特徴とする請求項１〜３の一に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記免疫アジュバントは、ミネラルオイルとジメチルジオクタデシルアンモニウム・ブロマイドとを含むことを特徴とする請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記免疫アジュバントは、ＶＳＡ３であることを特徴とする請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記ＶＳＡ３は、約２０％（ｖ/ｖ）〜約４０％（ｖ/ｖ）の濃度でワクチン組成物中に含まれることを特徴とする請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記ＶＳＡ３は、約３０％（ｖ/ｖ）の濃度でワクチン組成物中に含まれることを特徴とする請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、Ｔｉｒ及びインチミンからなる群から選択される１以上の組換え又は精製ＥＨＥＣ抗原を更に含むことを特徴とする請求項１〜８の一に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
ＥｓｐＡ＋Ｔｉｒ は、ワクチン組成物中の細胞タンパク質の少なくとも２０％を占めることを特徴とする請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
分泌性ＥＨＥＣ抗原に対する哺乳動物の免疫反応を惹起する組成物の製造への腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）細胞培養液上清の使用。
【請求項１２】
前記ＥＨＥＣは、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７であることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記哺乳動物は、反芻動物であることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記反芻動物は、ウシ（bovine subject）であることを特徴とする請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記組成物は、更に、免疫アジュバントを含むことを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
前記免疫アジュバントは、水中油型エマルジョンから構成されることを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記免疫アジュバントは、ミネラルオイルとジメチルジオクタデシルアンモニウム・ブロマイドとを含むことを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記免疫アジュバントは、ＶＳＡ３であることを特徴とする請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、Ｔｉｒ及びインチミンからなる群から選択される１以上の組換え又は精製ＥＨＥＣ抗原を更に含むことを特徴とする請求項１１〜１８の一に記載の使用。
【請求項２０】
ＥｓｐＡ＋Ｔｉｒ は、ワクチン組成物中の細胞タンパク質の少なくとも２０％を占めることを特徴とする請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
分泌性腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）抗原に対する哺乳動物の免疫反応を惹起する方法であって、ＥＨＥＣ細胞培養液上清を含む組成物の治療有効量を該哺乳動物へ投与することを特徴とする方法。
【請求項２２】
分泌性腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７）抗原に対する反芻動物の免疫反応を惹起する方法であって、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７細胞培養液上清及びＶＳＡ３を含む組成物の治療有効量を該反芻動物へ投与することを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記ＶＳＡ３は、約２０％（ｖ/ｖ）〜約４０％（ｖ/ｖ）の濃度で前記組成物中に含まれることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＶＳＡ３は、約３０％（ｖ/ｖ）の濃度でワクチン組成物中に含まれることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
反芻動物における分泌性腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）の定着（住みつき）を低減する方法であって、ＥＨＥＣ細胞培養液上清及び免疫アジュバントを含む組成物の治療有効量を該反芻動物へ投与することを特徴とする方法。
【請求項２６】
反芻動物からの分泌性腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）の排泄（shedding）を低減する方法であって、ＥＨＥＣ細胞培養液上清及び免疫アジュバントを含む組成物の治療有効量を該反芻動物へ投与することを特徴とする方法。
【請求項１】
腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）細胞培養液上清と免疫アジュバントとを含むことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項２】
前記ＥＨＥＣは、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７であることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項３】
前記ＥＨＥＣは、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：ＮＭであることを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項４】
前記免疫アジュバントは、水中油型エマルジョンから構成されることを特徴とする請求項１〜３の一に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
前記免疫アジュバントは、ミネラルオイルとジメチルジオクタデシルアンモニウム・ブロマイドとを含むことを特徴とする請求項４に記載のワクチン組成物。
【請求項６】
前記免疫アジュバントは、ＶＳＡ３であることを特徴とする請求項５に記載のワクチン組成物。
【請求項７】
前記ＶＳＡ３は、約２０％（ｖ/ｖ）〜約４０％（ｖ/ｖ）の濃度でワクチン組成物中に含まれることを特徴とする請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項８】
前記ＶＳＡ３は、約３０％（ｖ/ｖ）の濃度でワクチン組成物中に含まれることを特徴とする請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、Ｔｉｒ及びインチミンからなる群から選択される１以上の組換え又は精製ＥＨＥＣ抗原を更に含むことを特徴とする請求項１〜８の一に記載のワクチン組成物。
【請求項１０】
ＥｓｐＡ＋Ｔｉｒ は、ワクチン組成物中の細胞タンパク質の少なくとも２０％を占めることを特徴とする請求項９に記載のワクチン組成物。
【請求項１１】
分泌性ＥＨＥＣ抗原に対する哺乳動物の免疫反応を惹起する組成物の製造への腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）細胞培養液上清の使用。
【請求項１２】
前記ＥＨＥＣは、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７であることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記哺乳動物は、反芻動物であることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１４】
前記反芻動物は、ウシ（bovine subject）であることを特徴とする請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記組成物は、更に、免疫アジュバントを含むことを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１６】
前記免疫アジュバントは、水中油型エマルジョンから構成されることを特徴とする請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記免疫アジュバントは、ミネラルオイルとジメチルジオクタデシルアンモニウム・ブロマイドとを含むことを特徴とする請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記免疫アジュバントは、ＶＳＡ３であることを特徴とする請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
ＥｓｐＡ、ＥｓｐＢ、ＥｓｐＤ、Ｔｉｒ及びインチミンからなる群から選択される１以上の組換え又は精製ＥＨＥＣ抗原を更に含むことを特徴とする請求項１１〜１８の一に記載の使用。
【請求項２０】
ＥｓｐＡ＋Ｔｉｒ は、ワクチン組成物中の細胞タンパク質の少なくとも２０％を占めることを特徴とする請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
分泌性腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）抗原に対する哺乳動物の免疫反応を惹起する方法であって、ＥＨＥＣ細胞培養液上清を含む組成物の治療有効量を該哺乳動物へ投与することを特徴とする方法。
【請求項２２】
分泌性腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７（ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７）抗原に対する反芻動物の免疫反応を惹起する方法であって、ＥＨＥＣ Ｏ１５７：Ｈ７細胞培養液上清及びＶＳＡ３を含む組成物の治療有効量を該反芻動物へ投与することを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記ＶＳＡ３は、約２０％（ｖ/ｖ）〜約４０％（ｖ/ｖ）の濃度で前記組成物中に含まれることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＶＳＡ３は、約３０％（ｖ/ｖ）の濃度でワクチン組成物中に含まれることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
反芻動物における分泌性腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）の定着（住みつき）を低減する方法であって、ＥＨＥＣ細胞培養液上清及び免疫アジュバントを含む組成物の治療有効量を該反芻動物へ投与することを特徴とする方法。
【請求項２６】
反芻動物からの分泌性腸管出血性大腸菌（ＥＨＥＣ）の排泄（shedding）を低減する方法であって、ＥＨＥＣ細胞培養液上清及び免疫アジュバントを含む組成物の治療有効量を該反芻動物へ投与することを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００９−１３２７４２（Ｐ２００９−１３２７４２Ａ）
【公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−６６４４８（Ｐ２００９−６６４４８）
【出願日】平成２１年３月１８日（２００９．３．１８）
【分割の表示】特願２００２−５５４１３０（Ｐ２００２−５５４１３０）の分割
【原出願日】平成１４年１月３日（２００２．１．３）
【出願人】（５０３２４０７４７）ユニバーシティー オブ サスカチェワン (1)
【出願人】（３０３０６１１６６）ザ ユニバーシティー オブ ブリティッシュ コロンビア (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年６月１８日（２００９．６．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１８日（２００９．３．１８）
【分割の表示】特願２００２−５５４１３０（Ｐ２００２−５５４１３０）の分割
【原出願日】平成１４年１月３日（２００２．１．３）
【出願人】（５０３２４０７４７）ユニバーシティー オブ サスカチェワン (1)
【出願人】（３０３０６１１６６）ザ ユニバーシティー オブ ブリティッシュ コロンビア (2)
【Ｆターム（参考）】
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