腸管毒素原性大腸菌の定着因子（ＣＦ）抗原を発現するためのハイブリッドオペロン
遺伝子集合体を含む組み換えオペロンを開示し、ここで、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に関連した定着因子抗原（ＣＦｓ）の少なくとも２つの主要サブユニットをコードする少なくとも２つの構造遺伝子が存在する。更に、かかる組み換えオペロンを含むように遺伝子操作された、大腸菌細胞等の宿主細胞を開示し、ここで、前記オペロンが、プラスミド等のエピソームエレメント上に位置するか又は前記宿主細胞の染色体に組み込まれている。また、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に関連した定着因子抗原（ＣＦｓ）の少なくとも２つの主要サブユニットを前記オペロンから発現することが可能な宿主細胞の製造方法を開示する。加えて、薬学的に容認される賦形剤、緩衝剤及び／又は希釈剤と共に、かかる宿主細胞を少なくとも一つ含む抗下痢症ワクチン組成物を開示する。最後に、かかるワクチンの製造における前記オペロンの使用を開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管毒素原性大腸菌の定着因子（ＣＦ）抗原を発現するためのハイブリッドオペロンに関し、特には、異なる２つのＣＦｓを発現するための少なくとも２つの構造遺伝子を含む遺伝子を備える組み換えオペロンに関するものである。更に、本発明は、かかるオペロンを宿主細胞のゲノム上に又は宿主細胞に組み込まれたプラスミド中に備えた、大腸菌等の宿主細胞に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）は、旅行者下痢症、並びに世界各地の流行地域における小児の下痢罹患率及び下痢死亡率の主たる原因となる。該細菌の病原性は、腸管への細菌接着を媒介する線毛定着因子（ＣＦｓ）の発現と関連しており（Ｇａａｓｔｒａ ａｎｄ Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，１９９６）、また、腸内の電解質及び体液輸送過程に影響を与えることによって疾病の下痢症特性の原因となる熱不安定性（ＬＴ）及び／又は熱安定性（ＳＴ）毒素の分泌と関連している（Ｑａｄｒｉ ｅｔ ａｌ，２００５ａ；Ｓａｎｃｈｅｚ ａｎｄ Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，２００５）。
【０００３】
ＥＴＥＣの疾病からの保護は、ＣＦｓに対するＬＴ及び免疫応答の抗体媒介性の中和と関係している（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ａｎｄ Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，１９９５；Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｖａｒｉｎｏ，２００４）。一般に、ワクチンの目的は、受容体の免疫応答を誘発することであり、実際の病原菌のその後の投与に対する保護を提供する。これは、弱毒化された生きている病原菌株、即ち、効果的な免疫応答を刺激しつつ疾病を引き起こさないように病原性が低減された株の接種によって、又は感染毒性株に対して効果的な防御免疫応答を誘発できる一つ若しくはそれ以上の死滅した病原性株の投与によって達成され得る。腸内感染症に対する免疫化のため、好ましくは腸粘膜において局所的に効果的な免疫応答を効率よく刺激する経口経路によってワクチンを与えるべきであるが、それのみならず、他の粘膜経路や非経口経路、更には経皮経路でさえ防御免疫を誘発するのに使用できる。
【０００４】
ＥＴＥＣによって引き起こされる疾病から保護する効果的なワクチンの開発は難しい。１００を超えた異なる血清型は、病原菌株に関連してきた。更に、それらの株は、腸内の感染の確立を促進する多数のＣＦｓ（各々は抗原性が異なる）のうち１つ又はそれ以上を保有することができる（Ｑａｄｒｉ ｅｔ ａｌ，２００５ａ）。
【０００５】
ＣＦｓに対して向けられる免疫応答が保護的である、及び腸内の粘膜免疫応答が保護のために特に重要であるというかなりの証拠がある（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ， １９８８，１９９０；Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ，１９９４；Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｖａｒｉｎｏ，２００４）。そのような応答を誘発するため、好ましくはＥＴＥＣワクチンを経口で投与すべきである。我々は、細胞全体が死滅した経口ＥＴＥＣワクチンを以前に開発しており、一般的なＥＴＥＣ血清型を表す五つの株を含有し、組み換えコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ，ＥＴＥＣ ＬＴのＢサブユニットと非常に相同である）と共に最も一般的に遭遇するＣＦｓ（幾つかの場合においては、通常、コリ表面［ＣＳ］タンパク質と呼ばれる）、即ちＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４及びＣＳ５のうち幾つかを発現する（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ａｎｄ Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，１９９５；Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｖａｒｉｎｏ，２００４）。このワクチンの初期臨床試験は、ＣＴＢ及びワクチン内に存在する特異的ＣＦｓの両方に対して有意な免疫応答を起こし、これはスウェーデン人のボランティアにおいて見られたほか、続いてエジプト、バングラデシュの成人及び小児においても見られた（Ｊｅｒｔｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ，１９９３；Ａｈｒｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９８；Ｓａｖａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ，１９９８，１９９９，Ｑａｄｒｉ ｅｔ ａｌ，２００５ａ，２００５ｂ）。また、該ワクチンは、メキシコ及びグアテマラへのアメリカ人旅行者の日常の活動を妨害する十分に深刻な下痢症に対して、有意な保護を提供した（Ｓａｃｋ ｅｔ ａｌ，２００２；Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｖａｒｉｎｏ ２００４）。しかしながら、エジプト人の生後６〜１８か月の乳児において、該ワクチンの保護効果が低いことが分かった（Ｓａｖａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ，によって発表される）。このことは、該ワクチンが旅行者のより深刻な疾病に対して効果的である一方で、流行地域に住む乳児を保護するのには十分に強力でないことを示唆した（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓｔｅｅｌｅ，２００４）。
【０００６】
前述のＥＴＥＣワクチンの有効性が乳児において低いことについては、この年齢層においてＣＦ抗原に対して見られる抗体応答が比較的弱いことが理由の一つとして考えられている（Ｓａｖａｒｉｎｏ ａｎｄ Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，２００４）。この応答の低さは、異なるＣＦｓの用量を増やすことで改善されるであろうことから、ワクチン投与量中の該抗体の量を増加させることが、細胞全体が死滅したＥＴＥＣワクチンの今後の開発における優先事項である。不活性化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２プラシーボ調製物でさえ）を生後６〜１８か月の幼児に多量に与えると、おそらくエンドトキシン（ＬＰＳ）の量が多いことにより、嘔吐という形での拒絶反応が起きることが分かったことから、各ワクチン用量で投与されるＥＴＥＣ細菌の数をただ単に増やすことは適切ではない。それら有害作用は、細菌の用量を少なくした（４倍少なくした）場合、観察されなかった（Ｑａｄｒｉ ｅｔ ａｌ ２００５ｂ，Ｓａｖａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ，によって発表される）。
【０００７】
当該技術分野において周知のように、ＥＴＥＣのヒト病原性株に関連したＣＦｓには幾つかのタイプがあるが、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＦＡ／ＩＩ及びＣＦＡ／ＩＶが主なタイプであり、現在のところ、およそ４０〜８０％の臨床分離株と関連している。ＣＦＡ／Ｉは、単一の線毛抗原であり、一方、ＣＦＡ／ＩＩ及びＣＦＡ／ＩＶは、ＣＦ／ＣＳタンパク質の二つ以上のタイプから構成される場合がある。
【０００８】
野生型ＥＴＥＣにおけるＣＦの発現は、天然株のみが最大で２種又は３種のＣＦ抗原を特定の組み合わせで発現するように制限されていると考えられる。従って、天然のＣＦＡ／ＩＩ ＥＴＥＣ株は、一般にＣＳ１とＣＳ３、ＣＳ２とＣＳ３又はＣＳ３単独で発現する。同様に、天然のＣＦＡ／ＩＶ ＥＴＥＣ株は、一般にＣＳ４とＣＳ６、ＣＳ５とＣＳ６又はＣＳ６単独で発現する。しかしながら、例えば、ＣＳ１とＣＳ２は、同一の野生型株中で見つかったことがなく、同様に、ＣＳ４とＣＳ５は、自然発生の株において同時に発現されない。更に、ＣＳ４、ＣＳ５又はＣＳ６がＣＳ１、ＣＳ２又はＣＳ３と共に発現することは、野生型株について説明されていない。
【０００９】
ＥＴＥＣに対するワクチンに提案された最低限の必要条件は、ＣＦＡ／ＩとＣＦＡ／ＩＩ及びＣＦＡ／ＩＶの異なるサブ成分、即ちＣＳ１〜ＣＳ６とを発現するＥＴＥＣ株に対する保護を誘発する可能性を有することである。従って、野生型株に基づいたＥＴＥＣワクチンは、少なくとも５つの細菌株が最低限必要となり得、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１＋ＣＳ３、ＣＳ２＋ＣＳ３、ＣＳ４＋ＣＳ６及びＣＳ５＋ＣＳ６を発現する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この問題を解決するための一つの方策は、我々の係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ２００７／０５００５１において述べられており、そこでは、高濃度のＥＴＥＣ ＣＦｓを発現する大腸菌株が使用された。従って、ワクチン中の大腸菌の総数を増やすことなく、それら抗原の量をワクチン中で増加させることができる。この方策を、ＥＴＥＣ ＣＦを発現する少なくとも一つの組み換えプラスミドの他のＥＴＥＣ ＣＦを発現する細菌細胞中への挿入と組み合わせて、１つの細菌株から発現ＣＦｓの不自然な組み合わせを提供する。
【００１１】
本願は、抗下痢症ワクチンに用いるＥＴＥＣ線毛を多数発現する大腸菌株の構築上の問題に対する他の解決策を与える。
【００１２】
本発明は、一の態様において、遺伝子集合体を含む組み換えオペロンを提供するものであり、ここで、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に関連した定着因子抗原（ＣＦｓ）の少なくとも２つの主要サブユニットをコードする少なくとも２つの構造遺伝子が存在する。このため、このオペロンからＣＦｓの少なくとも２つの主要サブユニットをコードする少なくとも２つの構造遺伝子を発現することができ、ワクチン組成物中に必要とされる細菌細胞の数の低減を可能にする。
【００１３】
本発明の他の態様においては、宿主細胞が、上述の組み換えオペロンを含むように遺伝子操作されており、ここで、前記オペロンは、エピソームエレメント上に位置するか又は前記宿主細胞の染色体に組み込まれている。
【００１４】
本発明の第１の実施態様においては、上記宿主細胞中のエピソームエレメントがプラスミドである。
【００１５】
本発明の第２の実施態様においては、上記定着因子抗原（ＣＦｓ）の少なくとも２つの主要サブユニットが、同じものであるか又は異なるものである。例えば、あるＣＦのオペロン１がＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを備え、ここで、Ｂが主要サブユニットであり、他のＣＦのオペロン２がＡ'、Ｂ'、Ｃ'及びＤ'を備え、ここで、Ｂ'が主要サブユニットである場合、そのときのオペロン１及び２をＡ、Ｂ、Ｂ'、Ｃ及びＤ又はＡ'、Ｂ'、Ｂ、Ｃ'及びＤ'に組み合わせることができる。いずれの場合においても、２つの異なる主要サブユニットが、同一のオペロンから発現されることになる。定着因子の２つの主要サブユニットが同一である場合、該オペロンは、例えば、Ｂが主要サブユニットである場合、Ａ、Ｂ、Ｂ、Ｃ、Ｄとなる。これは、より少量の細胞から主要サブユニットＢに対するより強い免疫応答を誘発することになり得る。遺伝子断片の順序の他の例は、Ｂ、Ａ、Ｃ、Ｄがあり得、主要サブユニットの２つの構造遺伝子を持つオペロンが、それぞれＢ、Ｂ、Ａ、Ｃ、Ｄ又はＢ'、Ｂ、Ａ、Ｃ、Ｄとなる。ＣＦｓの主要サブユニットをコードする幾つかの構造遺伝子が同一のオペロン中に含まれる場合、それらはＢ''、Ｂ'''等と名付けられる。この方法の一の例を後述すると、ＣＳ２の主要サブユニットをコードする構造遺伝子がＣＦＡ／Ｉオペロンに含まれる場合、ハイブリット線毛ＣＦＡ／Ｉ＋ＣＳ２の発現をもたらす。
【００１６】
本発明の第３の実施態様においては、上記ＣＦｓが、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５、ＣＳ６、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、及び推定定着因子Ｏ７１（ＰＣＦＯ７１）からなる群から選択される。これらのうちＣＦＡ／１、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ４、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９及び推定定着因子Ｏ７１（ＰＣＤＯ７１）は、同様に構築されるオペロンを有する。従って、それらを相互に組み合わせることが好ましい。
【００１７】
本発明の第４の実施態様においては、上記宿主細胞が、オペロン中でＣＦｓの少なくとも２つの主要サブユニットを発現する。
【００１８】
本発明の第５の実施態様においては、上記宿主細胞が、細菌及び単細胞真核生物からなる群から選択される生存可能な微生物である。該細菌は、コレラ菌、大腸菌等の種でよく、また、単細胞真核生物は、酵母等の種、特には出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母種でよい。
【００１９】
本発明の第６の実施態様においては、上記宿主細胞が、大腸菌細胞である。
【００２０】
本発明の第７の実施態様においては、上記宿主細胞が、毒素非産生性の大腸菌細胞である。
【００２１】
本発明の第８の実施態様においては、上記宿主細胞が、抗生物質耐性遺伝子を発現しない。
【００２２】
本発明の第９の実施態様においては、上記宿主細胞が、一つ又はそれ以上のプラスミドによって補完される一つ又はそれ以上の補完可能な染色体欠失又は染色体変異を保有する。該染色体欠失は、例えば、必須アミノ酸の産生に必要な遺伝子が位置している場所に位置し得る。
【００２３】
本発明の他の態様は、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に関連した定着因子抗原（ＣＦｓ）の少なくとも２つの主要サブユニットを発現することが可能な組み換えプラスミドを少なくとも一つ保有する宿主細胞の製造方法に関するものであり、オペロン内にハイブリッドＥＴＥＣ ＣＦの発現に必要な遺伝子又は遺伝子断片を集合させる工程と、上記サブユニットの発現を制御するプロモーターを集合させる工程と、上記宿主細胞のゲノムに上記オペロンを組み込むか又は上記オペロン、プラスミドを維持するための選択マーカー及び複製開始点を備えるプラスミドで上記宿主細胞を形質転換させる工程とを含む。
【００２４】
本発明に従って産生される宿主細胞は、ＥＴＥＣ下痢症に対するワクチンの製造に使用されることができる。
【００２５】
従って、本発明の更に他の態様は、ワクチンの経口送達用に選択されるような、薬学的に容認される賦形剤、緩衝剤及び／又は希釈剤と共に、本発明に従う宿主細胞を少なくとも一つ含む抗下痢症ワクチンを対象とする。ワクチンに適した賦形剤、緩衝剤及び／又は希釈剤は、ヨーロッパ薬局方又はアメリカ薬局方で見つけることができる。
【００２６】
本発明の最後の態様においては、ワクチンの製造における本発明に従うオペロンの使用を提供するものである。
【００２７】
上記の方法は、自然に発生する特定の組み合わせにおいてＣＦ抗原の発現についての先の制限を回避するため、本発明は、わずか１〜２つの宿主株を備える抗下痢症ワクチンを提供する場合があり、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ４の主要サブユニット、即ちＣＦｓの少なくとも２つの主要サブユニットをそれぞれの株で一緒に発現する。従って、上記ワクチンは、合計で、より少ない株を含むことになり、おそらく、以前試験された死滅したＥＴＥＣワクチンの場合と比べてそれぞれの株をより少ない用量で使用することができるという追加の利点がある。
【００２８】
本発明に従うワクチンの製造のために意図され発現ＣＦｓは、哺乳類、特にはヒトの腸内感染症及び疾病を引き起こすＥＴＥＣと関連している。
【００２９】
好ましくは、本発明に従う細胞は、宿主細胞の表面上に、前記ＣＦｓを発現する。
【００３０】
本発明で得られる宿主細胞の表面上におけるＣＦｓの発現レベルは、免疫学的な方法により、例えば阻害ＥＬＩＳＡアッセイを適用することで検出できる。
【００３１】
本発明の一の実施態様においては、本発明の細胞により発現されるＣＦｓの主要サブユニットが、腸内ＥＴＥＣ感染症の哺乳類の排泄物から元来単離されるＥＴＥＣ株からのＣＦｓの対応する主要サブユニットに対して産生される特異的抗体と反応することのできる形で発現される。
【００３２】
本発明の他の実施形態において、本発明の細胞により発現されるＣＦは、該細胞が哺乳類の免疫化に効果的な量で使用される場合に、腸内ＥＴＥＣ感染症の哺乳類の排泄物から元来単離されるＥＴＥＣ株からのＣＦｓの対応する主要サブユニットと反応できるＣＦｓの発現主要サブユニットに対する抗体の形成を導く形で発現される。
【００３３】
本発明の更に他の実施態様において、本発明の細胞により発現されるハイブリッドＣＦｓは、ホルマリン処理又は他の手段による細胞の不活性化後に、腸内ＥＴＥＣ感染症の哺乳類の排泄物から元来単離されるＥＴＥＣ株からのＣＦｓの対応する主要サブユニットに対して産生される特異的抗体と反応することのできる形で発現される。
【００３４】
本発明の更に他の実施態様において、本発明の細胞により発現されるＣＦｓは、ホルマリン処理又は他の手段による細胞の不活性化後、該細胞が哺乳類の免疫化に効果的な量で使用される場合に、腸内ＥＴＥＣ感染症の哺乳類の排泄物から元来単離されるＥＴＥＣ株からの対応するＣＦｓと反応できる発現ＣＦｓに対する抗体の形成を導く形で発現される。
【００３５】
本発明に従う宿主細胞は、前記ハイブリッドＣＦｓの発現を提供する液体培地において該細胞を生体外で培養するための方法によって培養される。
【００３６】
本発明の培養細胞は、ホルマリン若しくはフェノール又は他の手段による穏やかな処理を用いて該細胞の複製を防ぎ、不活性化前の細胞と実質的に同一の量（元の量の少なくとも５０％）で発現ハイブリッドＣＦｓを保有し、実質的に同一の抗体との反応性と、ほぼ同一の免疫原性とを持つ細胞をもたらすことによって不活性化できる。
【００３７】
本発明の宿主細胞の一つ又は幾つかは、哺乳類に下痢症のワクチン接種をする方法での使用に特に適しており、それは、本発明に従う細胞の株又は組み合わせを哺乳類に投与することを含む。
【００３８】
本発明の一の実施態様において、本発明の宿主細胞の一つ又は幾つかは、子豚、子牛、子羊又は馬、特にはヒト等、哺乳類のワクチン接種用のワクチンとして、単独で又は組み合わせて使用される。かかるワクチンは、経口経路で投与されるのが好ましい。
【００３９】
以下、図面の説明、図面、配列表、材料及び方法、実施例、並びに表によって、本発明を説明することになるが、該発明が開示されるいかなる詳細事項によっても限定されるものでないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ハイブリッド発現ベクターｐＪＴ−ＣＦＡ／Ｉ−ＣＳ２（ＣｏｔＡ）の構築を示す。ＣｏｔＡ及びｐＪＴ−ＣＦＡ／Ｉ−Ａｍｐ全体を増幅するための特異的プライマーを用いることで、２つの断片を増幅させて連結した。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
材料及び方法
菌種及び培養条件
本願に記載の株を表１に収載する。線毛ファミリーのメンバーのうち２つの主要サブユニットを含むハイブリッドタンパク質を発現する組み換え細胞の構築は、ＣＦＡ／Ｉ及びＣＳ２双方の主要サブユニットを発現する株の構築によって例証される。
【００４２】
株は、使用するまでグリセロール含有凍結培地中−７０℃にて冷凍保存された。増殖及び純度を確認するために３７℃にて一晩寒天板を接種した後、細菌を３７℃で１６〜１８時間振とうしながらＣＦＡ培養液（リットル当たり、カザミノ酸１０ｇ、酵母抽出物１．５ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ １０２ｍｇ、ＭｎＣｌ２４Ｈ２Ｏ ８ｍｇ）中で増殖させた。必要な場合には、該培地をクロラムフェニコール（１２．５μｇ／ｍｌ）又はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）で補った。
【００４３】
発現ベクターにおけるＥＴＥＣ ＣＦｓオペロンのクローン化
ハイブリッド線毛としてのＣＦＡ／Ｉ＋ＣＳ２の産生
ＣＳ２の主要サブユニット、並びにアシャー、シャペロン、ＣＦＡ／Ｉのマイナーサブユニット及び主要サブユニットからなるハイブリッド線毛の産生は、幾つかの工程で行われた。Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム（ロシュ・ダイアグノスティックス・ＧｍｂＨ）、プライマーＣＳ２−Ｆ−Ｈｙｂ及びＣＳ２−Ｒ−Ｈｙｂ（表１）を用い、またテンプレートとしてプラスミドｐＪＴ−ＣＳ２−Ｃｍ（係属中の特許出願ＰＣＴ／ＳＥ２００７／０５００５１参照）を用いたＰＣＲによって、ＣＳ２の主要サブユニットを含有する断片ＣｏｔＡを増幅した。加えて、プラスミドｐＪＴ−ＣＦＡ／Ｉ−Ａｍｐ（係属中の特許出願ＰＣＴ／ＳＥ２００７／０５００５１参照）に対して、プライマーＣＦＡ／Ｉ−Ｆ−Ｈｙｂ及びＣＦＡ／Ｉ−Ｒ−Ｈｙｂ（表１）を用いたリバースＰＣＲを行い、最初のプラスミドを含有する断片が得られた。Ｅｃｏ３１Ｉを持つ両断片の制限を受けて、両断片を連結し、ＣｆａＢの下流にＣＦＡ／Ｉ及びＣｏｔＡのオペロン全体を含有するプラスミドが得られた。
【００４４】
ＣＦｓの発現
各組み換えＴＯＰ１０株の一晩培養物を、アンピシリン又はクロラムフェニコールがそれぞれ１００又は１２．５μｇ／ｍｌで補われたＣＦＡ培養液（表１）中で１／１００に希釈し、３７℃及び１５０ｒｅｖ／ｍｉｎで２時間インキュベートし、次いで１ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを加えて、同一の条件で更に４時間インキュベートした。その後、細菌を収集し、ＰＢＳ中で再懸濁した。
【００４５】
ドットブロットテスト
先に説明されるように、特異的モノクローナル抗ＣＦＡｓ抗体を用いて、クローン化株における各ＣＦＡｓの発現を評価した（Ｂｉｎｓｚｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ １９９１）。簡潔に述べると、ＰＢＳで洗浄し、ＣＦＡ／Ｉ発現のためにＩＰＴＧで誘発した細菌培養物（ＰＢＳ中１０９細菌／ｍｌ）２μｌをニトロセルロース濾紙に塗布し、ＭＡｂｓと、次いでＨＲＰに抱合されたヤギの抗マウスＩｇＧと共にそれぞれ１．５時間インキュベートした。最後の展開をＴＢＳ中の４−クロロ−１−ナフトール−Ｈ２Ｏ２によって最大で１５分間行った。
【００４６】
血球凝集
ヒト又はウシの新鮮な赤血球を０．８５％のＮａＣｌ中で２度洗浄し、１％マンノースの生理食塩水中で３％に懸濁させた。この混合液１０μｌと、ＣＦＡｓの発現のために導入されＰＢＳで洗浄した、同体積の被験細菌のＰＢＳ懸濁液（１０９細菌／ｍｌ）とを混合し、２分後、室温にて血球凝集を観察した。
【００４７】
電子顕微鏡検査
ＰＢＳで一度洗浄した各細菌の懸濁液（ＰＢＳ中１０１０細菌／ｍｌ）１０μｌをパラフィルム上に塗布した。フォルムバール被覆グリッドを２分間懸濁液に置いた。次いで、該グリッドを、パラフィルム上のＰＢＳ−１％ＢＳＡ ２５μｌに適用することで、１０秒ずつ２回洗浄し、次いでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０５％−ＢＳＡ０．１％中に希釈された特異的モノクローナル抗体２５μｌと共に１５分間該グリッドをインキュベートした。該グリッドを上記のＰＢＳ−１％ＢＳＡで６回洗浄し、次いでＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ中の抗マウスＩｇＧ−金抱合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）と共に１５分間インキュベートした。その後、グリッドをＰＢＳ−０．１％ＢＳＡで３回、蒸留水で３回洗浄した。該グリッドを１％モリブデン酸アンモニウム（ｐＨ７．０）２５μｌに５０〜６０秒間適用して、ネガティブ染色を行い、次いでグリッドを濾紙上で５分間空気乾燥させた。電子顕微鏡検査を行うまで、グリッドを４℃で貯蔵した。
【００４８】
ＥＬＩＳＡ
先に説明されるように、細菌表面上のＣＦＡ／Ｉ又はＣＳ２の量を阻害ＥＬＩＳＡアッセイで定量化し（Ｌｏｐｅｚ−Ｖｉｄａｌ ｅｔ ａｌ １９９８）、血清中のＩｇＡ又はＩｇＧ＋Ｍ抗体の力価をＥＬＩＳＡアッセイで決定した（Ｒｕｄｉｎ ｅｔ ａｌ，１９９４）。
【００４９】
ホルマリンによる細菌の不活性化
細菌を死滅させるため、各株の培養物をＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳ中１０１０細菌／ｍｌの密度まで再懸濁させた。ホルマリンを０．１Ｍの最終濃度まで加え、該懸濁液を３７℃で２時間インキュベートして６０ｒｐｍで撹拌し、次いで該懸濁液を４℃にて３日間インキュベートした。その後、細菌を洗浄し、同体積のＰＢＳで再懸濁させ、その細菌懸濁液１００μｌを血液寒天培地上に広げて、３７℃にて最大で１週間までインキュベートし、増殖を調べた。
【００５０】
マウスの免疫化
メスのＢａｌｂ／ｃマウス（生後６〜８週）を経口経路の免疫化に用いた。誘発してホルマリンで死滅した参照株３２５５４２−３及び５８Ｒ９５７と組み換え株ＴＯＰ１０−ＣＦＡ／Ｉ−ＣＳ２の培養物を洗浄し、所望の細菌密度までＰＢＳ中に再懸濁させた。先に説明されるように、経口経路による免疫化のため、１０９の細菌を１０μｇのＣＴと一緒に用いた（Ｒｈａｇａｖａｎ ｅｔ ａｌ，２００）。全てのマウスに２つの同一の免疫化を２週間おいて行い、第一の投与の直前と、第二の投与の２週間後に出血を収集した。
【００５１】
統計的分析
全てのＥＬＩＳＡ実験及び阻害ＥＬＩＳＡ実験を二つ組で行い、異なる日に少なくとも３回繰り返した。特定のテストそれぞれについてのドットブロット実験を少なくとも２回繰り返した。学生のｔ−テストによって統計的分析を行い、Ｐ＜０．０５を有意性ありとみなした。
【実施例】
【００５２】
実施例１
ハイブリッド線毛の産生：我々は、ＣＦＡ／Ｉ及びＣＳ２双方の主要サブユニットからなるハイブリッド線毛を発現させる可能性について調べた。かかるハイブリッド線毛を発現する発現ベクターの構築は、材料及び方法において説明されており、図１において表現される。次いで、該ベクターをＴｏｐ１０株中で増殖し、ＣＦＡ／Ｉ及びＣＳ２双方の主要サブユニットからなる線毛を発現する組み換え株が得られた。透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）と、各主要サブユニットに対する特異的ＭＡｂｓ、即ち、α-ＣＦＡ／Ｉ ＭＡｂ（１：６）〜ヤギのα−マウスＩｇＧ ２０ｍｎ 金及びビオチン化α-ＣＳ２ ＭＡｂ（１０：３）〜ストレプトアビジン １０ｎｍ 金を用いて、発現を検証した。
【００５３】
ここで引用される参考文献の教示は、参照することによりこの明細書に組み込まれる。
【００５４】
【表１】
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００５５】
【非特許文献１】Ahren, C. M. Jertborn, and A.M. Svennerholm. 1998. Intestinal immune responses to an inactivated oral enterotoxigenic Escherichia coli vaccine and associated immunoglobulin A responses in blood. Infect. Immun. 66:3311-3316.
【非特許文献２】Binsztein, N., M.J. Jouve, G.I. Viboud, L.L. Moral, M. Rivas, I. Orskov, C. Ahren, and A-M. Svennerholm. 1991. Colonization factors of enterotoxigenic Escherichia coli isolated from children with diarrhea in Argentina. J. Clin. Microbiol. 29:1893-1898.
【非特許文献３】Gaastra, W., and A.M. Svennerholm. 1996. Colonization factors of human enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). Trends Microbiol. 4:444-452.
【非特許文献４】Jertborn, M., C. Ahren, J. Holmgren, A.M. Svennerholm. 1993. Safety and immunogenicity of an oral inactivated enterotoxigenic Escherichia coli vaccine. Vaccine 16: 255-60.
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【非特許文献６】Qadri F., A.M. Svennerholm, A. S. G. Faruque, and Sack R.B. 2005a. Enterotoxigenic Escherichia coli in developing countries: epidemiology, microbiology, clinical features, treatment, and prevention. Clin. Microbiol. Rev. 18:465-483.
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【非特許文献８】Rhagavan S, M. Hjulstroem, J. Holmgren and A.M. Svennerholm. 2002. Protection against experimental Helicobacter pylori infection after immunization with inactivated H. pylori whole cell vaccines. Infect. Immun. 70:6383-6388.
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【非特許文献１３】Savarino, S.J., E. Hall,. S. Bassily,. F.M. Brown, F. Youssef, T.F. Wierzba,. L. Peruski, N.A. El-Masry, M. Safwat, M. Rao, H. El Mohamady, R. Abu-Elyazeed, A. Naficy, A.M. Svennerholm, M. Jertborn, Y.J. Lee, and J.D. Clemens. 1999. Oral, inactivated, whole cell enterotoxigenic Escherichia coli plus cholera toxin B subunit vaccine: results of the initial evaluation in children. J. Infect. Dis. 179:107-14.
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【非特許文献１７】Svennerholm, A.-M., and S. J. Savarino. 2004. Oral inactivated whole cell B subunit combination vaccine against enterotoxigenic Escherichia coli. In New Generation Vaccines: 3rd ed. Eds: Levine M.M. et al., pp. 737-750, Marcel Decker, New York, NY.
【非特許文献１８】Svennerholm, A.-M., and D. Steele. 2004. Progress in enteric vaccine development. In: Microbial-gut interactions in health and disease, Ed. M. Farthing. Best Pract. Res Clin. Gastroenterol. 18: 421-445.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管毒素原性大腸菌の定着因子（ＣＦ）抗原を発現するためのハイブリッドオペロンに関し、特には、異なる２つのＣＦｓを発現するための少なくとも２つの構造遺伝子を含む遺伝子を備える組み換えオペロンに関するものである。更に、本発明は、かかるオペロンを宿主細胞のゲノム上に又は宿主細胞に組み込まれたプラスミド中に備えた、大腸菌等の宿主細胞に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）は、旅行者下痢症、並びに世界各地の流行地域における小児の下痢罹患率及び下痢死亡率の主たる原因となる。該細菌の病原性は、腸管への細菌接着を媒介する線毛定着因子（ＣＦｓ）の発現と関連しており（Ｇａａｓｔｒａ ａｎｄ Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，１９９６）、また、腸内の電解質及び体液輸送過程に影響を与えることによって疾病の下痢症特性の原因となる熱不安定性（ＬＴ）及び／又は熱安定性（ＳＴ）毒素の分泌と関連している（Ｑａｄｒｉ ｅｔ ａｌ，２００５ａ；Ｓａｎｃｈｅｚ ａｎｄ Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，２００５）。
【０００３】
ＥＴＥＣの疾病からの保護は、ＣＦｓに対するＬＴ及び免疫応答の抗体媒介性の中和と関係している（Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ａｎｄ Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，１９９５；Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｖａｒｉｎｏ，２００４）。一般に、ワクチンの目的は、受容体の免疫応答を誘発することであり、実際の病原菌のその後の投与に対する保護を提供する。これは、弱毒化された生きている病原菌株、即ち、効果的な免疫応答を刺激しつつ疾病を引き起こさないように病原性が低減された株の接種によって、又は感染毒性株に対して効果的な防御免疫応答を誘発できる一つ若しくはそれ以上の死滅した病原性株の投与によって達成され得る。腸内感染症に対する免疫化のため、好ましくは腸粘膜において局所的に効果的な免疫応答を効率よく刺激する経口経路によってワクチンを与えるべきであるが、それのみならず、他の粘膜経路や非経口経路、更には経皮経路でさえ防御免疫を誘発するのに使用できる。
【０００４】
ＥＴＥＣによって引き起こされる疾病から保護する効果的なワクチンの開発は難しい。１００を超えた異なる血清型は、病原菌株に関連してきた。更に、それらの株は、腸内の感染の確立を促進する多数のＣＦｓ（各々は抗原性が異なる）のうち１つ又はそれ以上を保有することができる（Ｑａｄｒｉ ｅｔ ａｌ，２００５ａ）。
【０００５】
ＣＦｓに対して向けられる免疫応答が保護的である、及び腸内の粘膜免疫応答が保護のために特に重要であるというかなりの証拠がある（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ， １９８８，１９９０；Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ，１９９４；Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｖａｒｉｎｏ，２００４）。そのような応答を誘発するため、好ましくはＥＴＥＣワクチンを経口で投与すべきである。我々は、細胞全体が死滅した経口ＥＴＥＣワクチンを以前に開発しており、一般的なＥＴＥＣ血清型を表す五つの株を含有し、組み換えコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ，ＥＴＥＣ ＬＴのＢサブユニットと非常に相同である）と共に最も一般的に遭遇するＣＦｓ（幾つかの場合においては、通常、コリ表面［ＣＳ］タンパク質と呼ばれる）、即ちＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４及びＣＳ５のうち幾つかを発現する（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ａｎｄ Ｈｏｌｍｇｒｅｎ，１９９５；Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｖａｒｉｎｏ，２００４）。このワクチンの初期臨床試験は、ＣＴＢ及びワクチン内に存在する特異的ＣＦｓの両方に対して有意な免疫応答を起こし、これはスウェーデン人のボランティアにおいて見られたほか、続いてエジプト、バングラデシュの成人及び小児においても見られた（Ｊｅｒｔｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ，１９９３；Ａｈｒｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９８；Ｓａｖａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ，１９９８，１９９９，Ｑａｄｒｉ ｅｔ ａｌ，２００５ａ，２００５ｂ）。また、該ワクチンは、メキシコ及びグアテマラへのアメリカ人旅行者の日常の活動を妨害する十分に深刻な下痢症に対して、有意な保護を提供した（Ｓａｃｋ ｅｔ ａｌ，２００２；Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓａｖａｒｉｎｏ ２００４）。しかしながら、エジプト人の生後６〜１８か月の乳児において、該ワクチンの保護効果が低いことが分かった（Ｓａｖａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ，によって発表される）。このことは、該ワクチンが旅行者のより深刻な疾病に対して効果的である一方で、流行地域に住む乳児を保護するのには十分に強力でないことを示唆した（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ａｎｄ Ｓｔｅｅｌｅ，２００４）。
【０００６】
前述のＥＴＥＣワクチンの有効性が乳児において低いことについては、この年齢層においてＣＦ抗原に対して見られる抗体応答が比較的弱いことが理由の一つとして考えられている（Ｓａｖａｒｉｎｏ ａｎｄ Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ，２００４）。この応答の低さは、異なるＣＦｓの用量を増やすことで改善されるであろうことから、ワクチン投与量中の該抗体の量を増加させることが、細胞全体が死滅したＥＴＥＣワクチンの今後の開発における優先事項である。不活性化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２プラシーボ調製物でさえ）を生後６〜１８か月の幼児に多量に与えると、おそらくエンドトキシン（ＬＰＳ）の量が多いことにより、嘔吐という形での拒絶反応が起きることが分かったことから、各ワクチン用量で投与されるＥＴＥＣ細菌の数をただ単に増やすことは適切ではない。それら有害作用は、細菌の用量を少なくした（４倍少なくした）場合、観察されなかった（Ｑａｄｒｉ ｅｔ ａｌ ２００５ｂ，Ｓａｖａｒｉｎｏ ｅｔ ａｌ，によって発表される）。
【０００７】
当該技術分野において周知のように、ＥＴＥＣのヒト病原性株に関連したＣＦｓには幾つかのタイプがあるが、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＦＡ／ＩＩ及びＣＦＡ／ＩＶが主なタイプであり、現在のところ、およそ４０〜８０％の臨床分離株と関連している。ＣＦＡ／Ｉは、単一の線毛抗原であり、一方、ＣＦＡ／ＩＩ及びＣＦＡ／ＩＶは、ＣＦ／ＣＳタンパク質の二つ以上のタイプから構成される場合がある。
【０００８】
野生型ＥＴＥＣにおけるＣＦの発現は、天然株のみが最大で２種又は３種のＣＦ抗原を特定の組み合わせで発現するように制限されていると考えられる。従って、天然のＣＦＡ／ＩＩ ＥＴＥＣ株は、一般にＣＳ１とＣＳ３、ＣＳ２とＣＳ３又はＣＳ３単独で発現する。同様に、天然のＣＦＡ／ＩＶ ＥＴＥＣ株は、一般にＣＳ４とＣＳ６、ＣＳ５とＣＳ６又はＣＳ６単独で発現する。しかしながら、例えば、ＣＳ１とＣＳ２は、同一の野生型株中で見つかったことがなく、同様に、ＣＳ４とＣＳ５は、自然発生の株において同時に発現されない。更に、ＣＳ４、ＣＳ５又はＣＳ６がＣＳ１、ＣＳ２又はＣＳ３と共に発現することは、野生型株について説明されていない。
【０００９】
ＥＴＥＣに対するワクチンに提案された最低限の必要条件は、ＣＦＡ／ＩとＣＦＡ／ＩＩ及びＣＦＡ／ＩＶの異なるサブ成分、即ちＣＳ１〜ＣＳ６とを発現するＥＴＥＣ株に対する保護を誘発する可能性を有することである。従って、野生型株に基づいたＥＴＥＣワクチンは、少なくとも５つの細菌株が最低限必要となり得、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１＋ＣＳ３、ＣＳ２＋ＣＳ３、ＣＳ４＋ＣＳ６及びＣＳ５＋ＣＳ６を発現する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この問題を解決するための一つの方策は、我々の係属中の国際特許出願ＰＣＴ／ＳＥ２００７／０５００５１において述べられており、そこでは、高濃度のＥＴＥＣ ＣＦｓを発現する大腸菌株が使用された。従って、ワクチン中の大腸菌の総数を増やすことなく、それら抗原の量をワクチン中で増加させることができる。この方策を、ＥＴＥＣ ＣＦを発現する少なくとも一つの組み換えプラスミドの他のＥＴＥＣ ＣＦを発現する細菌細胞中への挿入と組み合わせて、１つの細菌株から発現ＣＦｓの不自然な組み合わせを提供する。
【００１１】
本願は、抗下痢症ワクチンに用いるＥＴＥＣ線毛を多数発現する大腸菌株の構築上の問題に対する他の解決策を与える。
【００１２】
本発明は、一の態様において、遺伝子集合体を含む組み換えオペロンを提供するものであり、ここで、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に関連した定着因子抗原（ＣＦｓ）の少なくとも２つの主要サブユニットをコードする少なくとも２つの構造遺伝子が存在する。このため、このオペロンからＣＦｓの少なくとも２つの主要サブユニットをコードする少なくとも２つの構造遺伝子を発現することができ、ワクチン組成物中に必要とされる細菌細胞の数の低減を可能にする。
【００１３】
本発明の他の態様においては、宿主細胞が、上述の組み換えオペロンを含むように遺伝子操作されており、ここで、前記オペロンは、エピソームエレメント上に位置するか又は前記宿主細胞の染色体に組み込まれている。
【００１４】
本発明の第１の実施態様においては、上記宿主細胞中のエピソームエレメントがプラスミドである。
【００１５】
本発明の第２の実施態様においては、上記定着因子抗原（ＣＦｓ）の少なくとも２つの主要サブユニットが、同じものであるか又は異なるものである。例えば、あるＣＦのオペロン１がＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを備え、ここで、Ｂが主要サブユニットであり、他のＣＦのオペロン２がＡ'、Ｂ'、Ｃ'及びＤ'を備え、ここで、Ｂ'が主要サブユニットである場合、そのときのオペロン１及び２をＡ、Ｂ、Ｂ'、Ｃ及びＤ又はＡ'、Ｂ'、Ｂ、Ｃ'及びＤ'に組み合わせることができる。いずれの場合においても、２つの異なる主要サブユニットが、同一のオペロンから発現されることになる。定着因子の２つの主要サブユニットが同一である場合、該オペロンは、例えば、Ｂが主要サブユニットである場合、Ａ、Ｂ、Ｂ、Ｃ、Ｄとなる。これは、より少量の細胞から主要サブユニットＢに対するより強い免疫応答を誘発することになり得る。遺伝子断片の順序の他の例は、Ｂ、Ａ、Ｃ、Ｄがあり得、主要サブユニットの２つの構造遺伝子を持つオペロンが、それぞれＢ、Ｂ、Ａ、Ｃ、Ｄ又はＢ'、Ｂ、Ａ、Ｃ、Ｄとなる。ＣＦｓの主要サブユニットをコードする幾つかの構造遺伝子が同一のオペロン中に含まれる場合、それらはＢ''、Ｂ'''等と名付けられる。この方法の一の例を後述すると、ＣＳ２の主要サブユニットをコードする構造遺伝子がＣＦＡ／Ｉオペロンに含まれる場合、ハイブリット線毛ＣＦＡ／Ｉ＋ＣＳ２の発現をもたらす。
【００１６】
本発明の第３の実施態様においては、上記ＣＦｓが、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ３、ＣＳ４、ＣＳ５、ＣＳ６、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９、及び推定定着因子Ｏ７１（ＰＣＦＯ７１）からなる群から選択される。これらのうちＣＦＡ／１、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ４、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９及び推定定着因子Ｏ７１（ＰＣＤＯ７１）は、同様に構築されるオペロンを有する。従って、それらを相互に組み合わせることが好ましい。
【００１７】
本発明の第４の実施態様においては、上記宿主細胞が、オペロン中でＣＦｓの少なくとも２つの主要サブユニットを発現する。
【００１８】
本発明の第５の実施態様においては、上記宿主細胞が、細菌及び単細胞真核生物からなる群から選択される生存可能な微生物である。該細菌は、コレラ菌、大腸菌等の種でよく、また、単細胞真核生物は、酵母等の種、特には出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母種でよい。
【００１９】
本発明の第６の実施態様においては、上記宿主細胞が、大腸菌細胞である。
【００２０】
本発明の第７の実施態様においては、上記宿主細胞が、毒素非産生性の大腸菌細胞である。
【００２１】
本発明の第８の実施態様においては、上記宿主細胞が、抗生物質耐性遺伝子を発現しない。
【００２２】
本発明の第９の実施態様においては、上記宿主細胞が、一つ又はそれ以上のプラスミドによって補完される一つ又はそれ以上の補完可能な染色体欠失又は染色体変異を保有する。該染色体欠失は、例えば、必須アミノ酸の産生に必要な遺伝子が位置している場所に位置し得る。
【００２３】
本発明の他の態様は、腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に関連した定着因子抗原（ＣＦｓ）の少なくとも２つの主要サブユニットを発現することが可能な組み換えプラスミドを少なくとも一つ保有する宿主細胞の製造方法に関するものであり、オペロン内にハイブリッドＥＴＥＣ ＣＦの発現に必要な遺伝子又は遺伝子断片を集合させる工程と、上記サブユニットの発現を制御するプロモーターを集合させる工程と、上記宿主細胞のゲノムに上記オペロンを組み込むか又は上記オペロン、プラスミドを維持するための選択マーカー及び複製開始点を備えるプラスミドで上記宿主細胞を形質転換させる工程とを含む。
【００２４】
本発明に従って産生される宿主細胞は、ＥＴＥＣ下痢症に対するワクチンの製造に使用されることができる。
【００２５】
従って、本発明の更に他の態様は、ワクチンの経口送達用に選択されるような、薬学的に容認される賦形剤、緩衝剤及び／又は希釈剤と共に、本発明に従う宿主細胞を少なくとも一つ含む抗下痢症ワクチンを対象とする。ワクチンに適した賦形剤、緩衝剤及び／又は希釈剤は、ヨーロッパ薬局方又はアメリカ薬局方で見つけることができる。
【００２６】
本発明の最後の態様においては、ワクチンの製造における本発明に従うオペロンの使用を提供するものである。
【００２７】
上記の方法は、自然に発生する特定の組み合わせにおいてＣＦ抗原の発現についての先の制限を回避するため、本発明は、わずか１〜２つの宿主株を備える抗下痢症ワクチンを提供する場合があり、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ４の主要サブユニット、即ちＣＦｓの少なくとも２つの主要サブユニットをそれぞれの株で一緒に発現する。従って、上記ワクチンは、合計で、より少ない株を含むことになり、おそらく、以前試験された死滅したＥＴＥＣワクチンの場合と比べてそれぞれの株をより少ない用量で使用することができるという追加の利点がある。
【００２８】
本発明に従うワクチンの製造のために意図され発現ＣＦｓは、哺乳類、特にはヒトの腸内感染症及び疾病を引き起こすＥＴＥＣと関連している。
【００２９】
好ましくは、本発明に従う細胞は、宿主細胞の表面上に、前記ＣＦｓを発現する。
【００３０】
本発明で得られる宿主細胞の表面上におけるＣＦｓの発現レベルは、免疫学的な方法により、例えば阻害ＥＬＩＳＡアッセイを適用することで検出できる。
【００３１】
本発明の一の実施態様においては、本発明の細胞により発現されるＣＦｓの主要サブユニットが、腸内ＥＴＥＣ感染症の哺乳類の排泄物から元来単離されるＥＴＥＣ株からのＣＦｓの対応する主要サブユニットに対して産生される特異的抗体と反応することのできる形で発現される。
【００３２】
本発明の他の実施形態において、本発明の細胞により発現されるＣＦは、該細胞が哺乳類の免疫化に効果的な量で使用される場合に、腸内ＥＴＥＣ感染症の哺乳類の排泄物から元来単離されるＥＴＥＣ株からのＣＦｓの対応する主要サブユニットと反応できるＣＦｓの発現主要サブユニットに対する抗体の形成を導く形で発現される。
【００３３】
本発明の更に他の実施態様において、本発明の細胞により発現されるハイブリッドＣＦｓは、ホルマリン処理又は他の手段による細胞の不活性化後に、腸内ＥＴＥＣ感染症の哺乳類の排泄物から元来単離されるＥＴＥＣ株からのＣＦｓの対応する主要サブユニットに対して産生される特異的抗体と反応することのできる形で発現される。
【００３４】
本発明の更に他の実施態様において、本発明の細胞により発現されるＣＦｓは、ホルマリン処理又は他の手段による細胞の不活性化後、該細胞が哺乳類の免疫化に効果的な量で使用される場合に、腸内ＥＴＥＣ感染症の哺乳類の排泄物から元来単離されるＥＴＥＣ株からの対応するＣＦｓと反応できる発現ＣＦｓに対する抗体の形成を導く形で発現される。
【００３５】
本発明に従う宿主細胞は、前記ハイブリッドＣＦｓの発現を提供する液体培地において該細胞を生体外で培養するための方法によって培養される。
【００３６】
本発明の培養細胞は、ホルマリン若しくはフェノール又は他の手段による穏やかな処理を用いて該細胞の複製を防ぎ、不活性化前の細胞と実質的に同一の量（元の量の少なくとも５０％）で発現ハイブリッドＣＦｓを保有し、実質的に同一の抗体との反応性と、ほぼ同一の免疫原性とを持つ細胞をもたらすことによって不活性化できる。
【００３７】
本発明の宿主細胞の一つ又は幾つかは、哺乳類に下痢症のワクチン接種をする方法での使用に特に適しており、それは、本発明に従う細胞の株又は組み合わせを哺乳類に投与することを含む。
【００３８】
本発明の一の実施態様において、本発明の宿主細胞の一つ又は幾つかは、子豚、子牛、子羊又は馬、特にはヒト等、哺乳類のワクチン接種用のワクチンとして、単独で又は組み合わせて使用される。かかるワクチンは、経口経路で投与されるのが好ましい。
【００３９】
以下、図面の説明、図面、配列表、材料及び方法、実施例、並びに表によって、本発明を説明することになるが、該発明が開示されるいかなる詳細事項によっても限定されるものでないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】ハイブリッド発現ベクターｐＪＴ−ＣＦＡ／Ｉ−ＣＳ２（ＣｏｔＡ）の構築を示す。ＣｏｔＡ及びｐＪＴ−ＣＦＡ／Ｉ−Ａｍｐ全体を増幅するための特異的プライマーを用いることで、２つの断片を増幅させて連結した。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
材料及び方法
菌種及び培養条件
本願に記載の株を表１に収載する。線毛ファミリーのメンバーのうち２つの主要サブユニットを含むハイブリッドタンパク質を発現する組み換え細胞の構築は、ＣＦＡ／Ｉ及びＣＳ２双方の主要サブユニットを発現する株の構築によって例証される。
【００４２】
株は、使用するまでグリセロール含有凍結培地中−７０℃にて冷凍保存された。増殖及び純度を確認するために３７℃にて一晩寒天板を接種した後、細菌を３７℃で１６〜１８時間振とうしながらＣＦＡ培養液（リットル当たり、カザミノ酸１０ｇ、酵母抽出物１．５ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ １０２ｍｇ、ＭｎＣｌ２４Ｈ２Ｏ ８ｍｇ）中で増殖させた。必要な場合には、該培地をクロラムフェニコール（１２．５μｇ／ｍｌ）又はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）で補った。
【００４３】
発現ベクターにおけるＥＴＥＣ ＣＦｓオペロンのクローン化
ハイブリッド線毛としてのＣＦＡ／Ｉ＋ＣＳ２の産生
ＣＳ２の主要サブユニット、並びにアシャー、シャペロン、ＣＦＡ／Ｉのマイナーサブユニット及び主要サブユニットからなるハイブリッド線毛の産生は、幾つかの工程で行われた。Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲシステム（ロシュ・ダイアグノスティックス・ＧｍｂＨ）、プライマーＣＳ２−Ｆ−Ｈｙｂ及びＣＳ２−Ｒ−Ｈｙｂ（表１）を用い、またテンプレートとしてプラスミドｐＪＴ−ＣＳ２−Ｃｍ（係属中の特許出願ＰＣＴ／ＳＥ２００７／０５００５１参照）を用いたＰＣＲによって、ＣＳ２の主要サブユニットを含有する断片ＣｏｔＡを増幅した。加えて、プラスミドｐＪＴ−ＣＦＡ／Ｉ−Ａｍｐ（係属中の特許出願ＰＣＴ／ＳＥ２００７／０５００５１参照）に対して、プライマーＣＦＡ／Ｉ−Ｆ−Ｈｙｂ及びＣＦＡ／Ｉ−Ｒ−Ｈｙｂ（表１）を用いたリバースＰＣＲを行い、最初のプラスミドを含有する断片が得られた。Ｅｃｏ３１Ｉを持つ両断片の制限を受けて、両断片を連結し、ＣｆａＢの下流にＣＦＡ／Ｉ及びＣｏｔＡのオペロン全体を含有するプラスミドが得られた。
【００４４】
ＣＦｓの発現
各組み換えＴＯＰ１０株の一晩培養物を、アンピシリン又はクロラムフェニコールがそれぞれ１００又は１２．５μｇ／ｍｌで補われたＣＦＡ培養液（表１）中で１／１００に希釈し、３７℃及び１５０ｒｅｖ／ｍｉｎで２時間インキュベートし、次いで１ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを加えて、同一の条件で更に４時間インキュベートした。その後、細菌を収集し、ＰＢＳ中で再懸濁した。
【００４５】
ドットブロットテスト
先に説明されるように、特異的モノクローナル抗ＣＦＡｓ抗体を用いて、クローン化株における各ＣＦＡｓの発現を評価した（Ｂｉｎｓｚｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ １９９１）。簡潔に述べると、ＰＢＳで洗浄し、ＣＦＡ／Ｉ発現のためにＩＰＴＧで誘発した細菌培養物（ＰＢＳ中１０９細菌／ｍｌ）２μｌをニトロセルロース濾紙に塗布し、ＭＡｂｓと、次いでＨＲＰに抱合されたヤギの抗マウスＩｇＧと共にそれぞれ１．５時間インキュベートした。最後の展開をＴＢＳ中の４−クロロ−１−ナフトール−Ｈ２Ｏ２によって最大で１５分間行った。
【００４６】
血球凝集
ヒト又はウシの新鮮な赤血球を０．８５％のＮａＣｌ中で２度洗浄し、１％マンノースの生理食塩水中で３％に懸濁させた。この混合液１０μｌと、ＣＦＡｓの発現のために導入されＰＢＳで洗浄した、同体積の被験細菌のＰＢＳ懸濁液（１０９細菌／ｍｌ）とを混合し、２分後、室温にて血球凝集を観察した。
【００４７】
電子顕微鏡検査
ＰＢＳで一度洗浄した各細菌の懸濁液（ＰＢＳ中１０１０細菌／ｍｌ）１０μｌをパラフィルム上に塗布した。フォルムバール被覆グリッドを２分間懸濁液に置いた。次いで、該グリッドを、パラフィルム上のＰＢＳ−１％ＢＳＡ ２５μｌに適用することで、１０秒ずつ２回洗浄し、次いでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０５％−ＢＳＡ０．１％中に希釈された特異的モノクローナル抗体２５μｌと共に１５分間該グリッドをインキュベートした。該グリッドを上記のＰＢＳ−１％ＢＳＡで６回洗浄し、次いでＰＢＳ−０．１％ＢＳＡ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ中の抗マウスＩｇＧ−金抱合体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）と共に１５分間インキュベートした。その後、グリッドをＰＢＳ−０．１％ＢＳＡで３回、蒸留水で３回洗浄した。該グリッドを１％モリブデン酸アンモニウム（ｐＨ７．０）２５μｌに５０〜６０秒間適用して、ネガティブ染色を行い、次いでグリッドを濾紙上で５分間空気乾燥させた。電子顕微鏡検査を行うまで、グリッドを４℃で貯蔵した。
【００４８】
ＥＬＩＳＡ
先に説明されるように、細菌表面上のＣＦＡ／Ｉ又はＣＳ２の量を阻害ＥＬＩＳＡアッセイで定量化し（Ｌｏｐｅｚ−Ｖｉｄａｌ ｅｔ ａｌ １９９８）、血清中のＩｇＡ又はＩｇＧ＋Ｍ抗体の力価をＥＬＩＳＡアッセイで決定した（Ｒｕｄｉｎ ｅｔ ａｌ，１９９４）。
【００４９】
ホルマリンによる細菌の不活性化
細菌を死滅させるため、各株の培養物をＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳ中１０１０細菌／ｍｌの密度まで再懸濁させた。ホルマリンを０．１Ｍの最終濃度まで加え、該懸濁液を３７℃で２時間インキュベートして６０ｒｐｍで撹拌し、次いで該懸濁液を４℃にて３日間インキュベートした。その後、細菌を洗浄し、同体積のＰＢＳで再懸濁させ、その細菌懸濁液１００μｌを血液寒天培地上に広げて、３７℃にて最大で１週間までインキュベートし、増殖を調べた。
【００５０】
マウスの免疫化
メスのＢａｌｂ／ｃマウス（生後６〜８週）を経口経路の免疫化に用いた。誘発してホルマリンで死滅した参照株３２５５４２−３及び５８Ｒ９５７と組み換え株ＴＯＰ１０−ＣＦＡ／Ｉ−ＣＳ２の培養物を洗浄し、所望の細菌密度までＰＢＳ中に再懸濁させた。先に説明されるように、経口経路による免疫化のため、１０９の細菌を１０μｇのＣＴと一緒に用いた（Ｒｈａｇａｖａｎ ｅｔ ａｌ，２００）。全てのマウスに２つの同一の免疫化を２週間おいて行い、第一の投与の直前と、第二の投与の２週間後に出血を収集した。
【００５１】
統計的分析
全てのＥＬＩＳＡ実験及び阻害ＥＬＩＳＡ実験を二つ組で行い、異なる日に少なくとも３回繰り返した。特定のテストそれぞれについてのドットブロット実験を少なくとも２回繰り返した。学生のｔ−テストによって統計的分析を行い、Ｐ＜０．０５を有意性ありとみなした。
【実施例】
【００５２】
実施例１
ハイブリッド線毛の産生：我々は、ＣＦＡ／Ｉ及びＣＳ２双方の主要サブユニットからなるハイブリッド線毛を発現させる可能性について調べた。かかるハイブリッド線毛を発現する発現ベクターの構築は、材料及び方法において説明されており、図１において表現される。次いで、該ベクターをＴｏｐ１０株中で増殖し、ＣＦＡ／Ｉ及びＣＳ２双方の主要サブユニットからなる線毛を発現する組み換え株が得られた。透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）と、各主要サブユニットに対する特異的ＭＡｂｓ、即ち、α-ＣＦＡ／Ｉ ＭＡｂ（１：６）〜ヤギのα−マウスＩｇＧ ２０ｍｎ 金及びビオチン化α-ＣＳ２ ＭＡｂ（１０：３）〜ストレプトアビジン １０ｎｍ 金を用いて、発現を検証した。
【００５３】
ここで引用される参考文献の教示は、参照することによりこの明細書に組み込まれる。
【００５４】
【表１】
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００５５】
【非特許文献１】Ahren, C. M. Jertborn, and A.M. Svennerholm. 1998. Intestinal immune responses to an inactivated oral enterotoxigenic Escherichia coli vaccine and associated immunoglobulin A responses in blood. Infect. Immun. 66:3311-3316.
【非特許文献２】Binsztein, N., M.J. Jouve, G.I. Viboud, L.L. Moral, M. Rivas, I. Orskov, C. Ahren, and A-M. Svennerholm. 1991. Colonization factors of enterotoxigenic Escherichia coli isolated from children with diarrhea in Argentina. J. Clin. Microbiol. 29:1893-1898.
【非特許文献３】Gaastra, W., and A.M. Svennerholm. 1996. Colonization factors of human enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). Trends Microbiol. 4:444-452.
【非特許文献４】Jertborn, M., C. Ahren, J. Holmgren, A.M. Svennerholm. 1993. Safety and immunogenicity of an oral inactivated enterotoxigenic Escherichia coli vaccine. Vaccine 16: 255-60.
【非特許文献５】Levine, M.M., J.A. Giron, and F. Noriega. 1994. Fimbrial vaccines,. In Fimbriae: adhesion, biogenics, genetics and vaccines, P. Klemm (ed.), pp.255-270. CRC Press, Boca Raton, Fla.
【非特許文献６】Qadri F., A.M. Svennerholm, A. S. G. Faruque, and Sack R.B. 2005a. Enterotoxigenic Escherichia coli in developing countries: epidemiology, microbiology, clinical features, treatment, and prevention. Clin. Microbiol. Rev. 18:465-483.
【非特許文献７】Qadri, F., T. Ahmed, F. Ahmed, Y.A. Begum, D.A. Sack, A.M. Svennerholm and the PTE Study Group. 2005b. Reduced doses of oral killed enterotoxigenic Escherichia coli plus cholera toxin B subunit vaccine is safe and immunogenic in Bangladeshi infants 6-17 months of age: Dosing studies in different age groups. Vaccine 24:1726-1733.
【非特許文献８】Rhagavan S, M. Hjulstroem, J. Holmgren and A.M. Svennerholm. 2002. Protection against experimental Helicobacter pylori infection after immunization with inactivated H. pylori whole cell vaccines. Infect. Immun. 70:6383-6388.
【非特許文献９】Rudin, A., M.M. McConnell, A.M. Svennerholm. 1994. Monoclonal antibodies against enterotoxigenic Escherichia coli colonization factor antigen I (CFA/I) that cross-react immunologically with heterologous CFAs. Infect. Immun. 62:4339-4346.
【非特許文献１０】Sack, D.A., J. Shimko, O. Torres et al. 2002. Safety and efficacy of a killed oral vaccine for enterotoxigenic E. coli diarrhea in adult travelers to Guatemala and Mexico. 42nd Interscience Conference on Antimcrobial Agents and Chemotherapy. San Diego, CA. Abstract.
【非特許文献１１】Sanchez J., and Holmgren. 2005. Virulence factors, pathogenesis and vaccine protection in cholera and ETEC diarrhea. Curr. Opin. Immunol. 17:388-98.
【非特許文献１２】Savarino, S.J., F.M. Brown, E. Hall, S. Bassily, F. Youssef, T. Wierzba, L. Peruski, N.A. El-Masry, M. Safwat, M. Rao, M. Jertborn, A.M. Svennerholm, Y.J. Lee, and J.D. Clemens. 1998. Safety and immunogenicity of an oral, killed enterotoxigenic Escherichia coli-cholera toxin B subunit vaccine in Egyptian adults. J. Infect. Dis. 177:796-799.
【非特許文献１３】Savarino, S.J., E. Hall,. S. Bassily,. F.M. Brown, F. Youssef, T.F. Wierzba,. L. Peruski, N.A. El-Masry, M. Safwat, M. Rao, H. El Mohamady, R. Abu-Elyazeed, A. Naficy, A.M. Svennerholm, M. Jertborn, Y.J. Lee, and J.D. Clemens. 1999. Oral, inactivated, whole cell enterotoxigenic Escherichia coli plus cholera toxin B subunit vaccine: results of the initial evaluation in children. J. Infect. Dis. 179:107-14.
【非特許文献１４】Svennerholm, A.-M., Y.L. Vidal, J. Holmgren, M.M. McConnell, and B. Rowe. 1988. Role of PCF8775 antigen and its coli surface subcomponents for colonization, disease, and protective immunogenicity of enterotoxigenic Escherichia coli in rabbits. Infect. Immun. 56:523-528.
【非特許文献１５】Svennerholm, A.-M., C. Wenneras, J. Holmgren, M.M. McConnell, and B. Rowe. 1990. Roles of different coli surface antigens of colonization factor antigen II in colonization by and protective immunogenicity of enterotoxigenic Escherichia coli in rabbits. Infect. Immun. 58:341-346.
【非特許文献１６】Svennerholm, A.-M., and J. Holmgren. 1995. Oral vaccines against cholera and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea. Adv. Exp. Med. Biol. 371B:1623-1628.
【非特許文献１７】Svennerholm, A.-M., and S. J. Savarino. 2004. Oral inactivated whole cell B subunit combination vaccine against enterotoxigenic Escherichia coli. In New Generation Vaccines: 3rd ed. Eds: Levine M.M. et al., pp. 737-750, Marcel Decker, New York, NY.
【非特許文献１８】Svennerholm, A.-M., and D. Steele. 2004. Progress in enteric vaccine development. In: Microbial-gut interactions in health and disease, Ed. M. Farthing. Best Pract. Res Clin. Gastroenterol. 18: 421-445.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に関連した定着因子抗原（ＣＦｓ）の少なくとも２つの主要サブユニットをコードする少なくとも２つの構造遺伝子が存在することを特徴とする遺伝子集合体を含む組み換えオペロン。
【請求項２】
請求項１に記載の組み換えオペロンを含むように遺伝子操作された宿主細胞であって、前記オペロンがエピソームエレメント上に位置するか又は前記宿主細胞の染色体に組み込まれていることを特徴とする宿主細胞。
【請求項３】
前記エピソームエレメントがプラスミドであることを特徴とする請求項１又は２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記定着因子抗原（ＣＦｓ）の少なくとも２つの主要サブユニットが同じものであるか又は異なるものであることを特徴とする請求項２又は３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
前記ＣＦｓが、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ４、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９及び推定定着因子Ｏ７１（ＰＣＦＯ７１）からなる群から選択されることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記細胞が、前記ＣＦｓの少なくとも２つの主要サブユニットを発現することを特徴とする請求項２〜５のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞が、細菌及び単細胞真核生物からなる群から選択される生存可能な微生物であることを特徴とする請求項２〜６のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞が、大腸菌細胞であることを特徴とする請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記大腸菌細胞が、毒素非産生性の大腸菌細胞であることを特徴とする請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、抗生物質耐性遺伝子を発現しないことを特徴とする請求項２〜９のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、一つ又はそれ以上のプラスミドによって補完される一つ又はそれ以上の補完可能な染色体欠失又は染色体変異を保有することを特徴とする請求項２〜１０のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項１２】
腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に関連した定着因子抗原（ＣＦｓ）の少なくとも２つの主要サブユニットを発現することが可能な宿主細胞の製造方法であって、
オペロン内にハイブリッドＥＴＥＣ ＣＦの発現に必要な遺伝子又は遺伝子断片を集合させる工程と、前記サブユニットの発現を制御するＥＴＥＣプロモーターを集合させる工程と、前記宿主細胞のゲノムに前記オペロンを組み込むか又は前記オペロン、プラスミドを維持するための選択マーカー及び複製開始点を備えるプラスミドで前記宿主細胞を形質転換させる工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
薬学的に容認される賦形剤、緩衝剤及び／又は希釈剤と共に、請求項２〜１１のいずれかに記載の宿主細胞を少なくとも一つ含むことを特徴とする抗下痢症ワクチン組成物。
【請求項１４】
薬学的に容認される賦形剤、緩衝剤及び／又は希釈剤が、ワクチンの経口送達用に選択されることを特徴とする請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
ワクチンの製造における請求項１に記載のオペロンの使用。
【請求項１】
腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に関連した定着因子抗原（ＣＦｓ）の少なくとも２つの主要サブユニットをコードする少なくとも２つの構造遺伝子が存在することを特徴とする遺伝子集合体を含む組み換えオペロン。
【請求項２】
請求項１に記載の組み換えオペロンを含むように遺伝子操作された宿主細胞であって、前記オペロンがエピソームエレメント上に位置するか又は前記宿主細胞の染色体に組み込まれていることを特徴とする宿主細胞。
【請求項３】
前記エピソームエレメントがプラスミドであることを特徴とする請求項１又は２に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記定着因子抗原（ＣＦｓ）の少なくとも２つの主要サブユニットが同じものであるか又は異なるものであることを特徴とする請求項２又は３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
前記ＣＦｓが、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ４、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９及び推定定着因子Ｏ７１（ＰＣＦＯ７１）からなる群から選択されることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記細胞が、前記ＣＦｓの少なくとも２つの主要サブユニットを発現することを特徴とする請求項２〜５のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞が、細菌及び単細胞真核生物からなる群から選択される生存可能な微生物であることを特徴とする請求項２〜６のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞が、大腸菌細胞であることを特徴とする請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記大腸菌細胞が、毒素非産生性の大腸菌細胞であることを特徴とする請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、抗生物質耐性遺伝子を発現しないことを特徴とする請求項２〜９のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、一つ又はそれ以上のプラスミドによって補完される一つ又はそれ以上の補完可能な染色体欠失又は染色体変異を保有することを特徴とする請求項２〜１０のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項１２】
腸管毒素原性大腸菌（ＥＴＥＣ）に関連した定着因子抗原（ＣＦｓ）の少なくとも２つの主要サブユニットを発現することが可能な宿主細胞の製造方法であって、
オペロン内にハイブリッドＥＴＥＣ ＣＦの発現に必要な遺伝子又は遺伝子断片を集合させる工程と、前記サブユニットの発現を制御するＥＴＥＣプロモーターを集合させる工程と、前記宿主細胞のゲノムに前記オペロンを組み込むか又は前記オペロン、プラスミドを維持するための選択マーカー及び複製開始点を備えるプラスミドで前記宿主細胞を形質転換させる工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１３】
薬学的に容認される賦形剤、緩衝剤及び／又は希釈剤と共に、請求項２〜１１のいずれかに記載の宿主細胞を少なくとも一つ含むことを特徴とする抗下痢症ワクチン組成物。
【請求項１４】
薬学的に容認される賦形剤、緩衝剤及び／又は希釈剤が、ワクチンの経口送達用に選択されることを特徴とする請求項１３に記載のワクチン。
【請求項１５】
ワクチンの製造における請求項１に記載のオペロンの使用。
【図１】
【公表番号】特表２０１０−５３１６５３（Ｐ２０１０−５３１６５３Ａ）
【公表日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１３９６７（Ｐ２０１０−５１３９６７）
【出願日】平成２０年７月１日（２００８．７．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５８４３８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００４００２
【国際公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（５１０００３６６７）クルセル スウェーデン アーベー (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１日（２００８．７．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０５８４３８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／００４００２
【国際公開日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（５１０００３６６７）クルセル スウェーデン アーベー (1)
【Ｆターム（参考）】
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