膜タンパク質の可溶化
膜タンパク質の可溶化のための方法が提供される。この方法は、膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む細胞成分に適用される。スチレン対マレイン酸の比率が、１：２〜１０：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体は、細胞成分と混合され、共重合体、脂質、およびタンパク質をもたらし、可溶性の高分子集合体を形成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜タンパク質の可溶化に関する。このようなタンパク質は、通常、生細胞の膜に見出される。
【背景技術】
【０００２】
脂質二重膜は、分子細胞生物学において周知の構造である。これらの膜は、糖脂質およびリン脂質の二重膜から形成され、各リン脂質分子は、親水性の極性頭部と、疎水性のアシル基の尾部とを有し、二重膜中の前記分子は平行に並んでおり、親水性の極性頭部が、膜の内側表面と外側表面とを形成し、疎水性の尾部が膜の内部を形成する。ステロールのような他の脂質も、脂質二重膜において見出される。このような脂質二重膜は、原核生物および真核生物の両者の細胞膜、ならびに真核生物の多くの細胞内小器官の周囲の膜を含む。
【０００３】
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）と、イオンチャネルと、トランスポーターとを含む膜内在性タンパク質、すなわちそのような膜に、交差し、埋め込まれ、または組み入れられた全てのタンパク質での使用に特に適している。真核生物のタンパク質の約３分の１は、承認された薬の４０％の標的と同様に、このようにして膜に関連している。膜内在性タンパク質は、通常、疎水性であって膜二重層の疎水性内部に位置する１つ以上の領域と、親水性であって膜から外部に広がる１つ以上の領域とを有する。親水性領域は、膜の片側、または両側に位置してもよい。
【０００４】
ＧＰＣＲは、７回膜貫通αヘリックスを含むことによって特徴付けられるタンパク質の一群である。タンパク質は、クラス１（ロドプシン関連）、クラス２（セクレチン関連）、およびクラス３（代謝型グルタミン酸受容体関連）の３つの一般的クラスに分類される。縮れた（frizzled）および滑らかな（smoothened）ＧＰＣＲも存在する。ＧＰＣＲは、全ての哺乳類などで見出される。特に、ＧＰＣＲは、多くの生理的プロセスを制御し、多くの薬の標的となる。したがって、それらは薬理学上非常に重要であると考えられる。ＧＰＣＲは、アゴニストおよびアンタゴニストのような異なる薬理学上の分類のリガンドに関連する複数の特徴的な構造で存在し、機能するためにこれらの構造の間を循環していると考えられる（Kenakin T. (1997) Ann N Y Acad Sci, 812, 116-125）。
【０００５】
全てのタンパク質と同様に、膜内在性タンパク質の機能は、その三次元構造に依存する。この構造は、埋め込まれた領域と膜二重層の内部との疎水性相互作用、タンパク質の埋め込まれていない領域と極性のリン脂質頭部とのイオン相互作用、および周囲の水性媒体によって、ならびにタンパク質自体内部の相互作用（疎水性およびイオン性の両者）によって安定化する。膜タンパク質の代表的な機能は、イオンおよび小分子の細胞膜を横切る輸送、ならびに受容体によるリガンドの認識、ならびに膜を横切るシグナル伝達を含む。
【０００６】
界面活性剤の使用によって、膜タンパク質をそれらの天然の環境から取り出すことができる。界面活性剤は、親水性の極性頭部と疎水性尾部とを備える膜二重層のリン脂質の分子構造と同様の一般的な分子構造を有する。そのように、界面活性剤は、膜タンパク質の親水性および疎水性領域の両者に結合することができ、タンパク質を水に可溶化することができる。このことは、標準的なクロマトグラム法を用いて多くの異なるタンパク質を分離することを可能とし、タンパク質の特性評価（例えば、標準的なシークエンシング方法を用いる）の可能性を拡げる。そのようなタンパク質抽出方法は、米国特許第５，７６３，５８６号明細書に記載されている。
【０００７】
しかし、界面活性剤と脂質二重層との間の構造上の相違を考慮すると、界面活性剤がタンパク質の構造に影響を与えるであろうことが予測される。加えて、ＳＤＳのような界面活性剤中のタンパク質の変性は、多くの場合、分子量の評価および他の特性評価を実行するために望ましいものである。しかし、天然の構造のそのような損失の全ては、機能の消失をもたらすであろう。このように、界面活性剤中における可溶化は、天然タンパク質の機能を決定するための信頼性のある方法を提供するものではない。
【０００８】
特に、ＧＰＣＲは、単離すると一般的に不安定であり、ウシロドプシン（例外的に安定である）のように、結晶化に耐えられることが証明されたものはほとんどない。安定で活性のある膜タンパク質を可溶化し特性評価をするための一般的な方法の不足は、それらの機序を定義し、利用することを困難にしている。
【０００９】
天然の膜タンパク質の環境により近い環境中で膜タンパク質を可溶化する試みがなされてきたが、依然として、クロマトグラフィーの、分離および特性評価を可能とするのみである。
【００１０】
例えば、発行された英国特許出願ＧＢ２４４５０１３には、界面活性剤と脂質との高分子集合体が記載されており、前記集合体は、１００ｎｍ未満の直径であることが記載されている。これらの集合体は、二重層ディスクであると考えられる。前記集合体は、集合体（タンパク質を含まない）と、界面活性剤で安定化されたタンパク質溶液との透析によって、膜タンパク質の可溶化のために用いることができることが指摘されている。そして、タンパク質を含む集合体は、タンパク質との相互作用のための候補のスクリーニングに用いられてもよい。
【００１１】
同様に、発行された国際（ＰＣＴ）特許出願ＷＯ２００６／１２９１２７は、スチレンおよびマレイン酸（少なくとも１：１の比率）の共重合体の高分子集合体と、（合成）脂質との組み合わせを開示している。合成脂質中において安定化した精製タンパク質に重合体溶液を添加することによって、または重合体／脂質集合体に精製タンパク質を添加することによって、膜タンパク質を組み込む集合体を形成することも開示されている。
【００１２】
したがって、天然の膜環境の特性を保持する方法で膜タンパク質を可溶化する機序が必要である。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の第１の態様によれば、膜タンパク質を可溶化するための方法であって、膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む細胞成分を提供すること、スチレン対マレイン酸の比率が１：２〜１０：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供すること、ならびに共重合体を細胞成分と混合し、共重合体、脂質、およびタンパク質をもたらし、高分子集合体を形成することを含む方法が提供される。
【００１４】
本明細書において、「関連した膜脂質」は、膜タンパク質と同じ供給源に由来するべきであることが理解されるであろう。一実施形態では、細胞成分を提供することは、添加された脂質の存在しない細胞成分を提供することを含む。
【００１５】
驚くべきことに、膜タンパク質を、細胞成分から抽出することができ、タンパク質の初期精製の必要なしに高分子集合体に組み込むことが可能であることが発明者らによって見出された。理論によって束縛されることを望むものではないが、タンパク質の初期精製なしに、タンパク質の天然の環境に由来する脂質と共にタンパク質が組み込まれている、高分子集合体を形成することは、タンパク質がその天然の構造を保持する可能性を最大にすると考えられる。したがって、前記方法は、天然タンパク質の機能および特性のより正確な評価を可能にする。
【００１６】
一実施形態において、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することは、スチレンおよび無水マレイン酸の共重合体を提供することと、無水マレイン酸をマレイン酸に加水分解することとを含む。スチレンおよび無水マレイン酸の共重合体は、ＳＭＡ（登録商標）２０００およびＳＭＡ（登録商標）３０００の商品名で、Sartomer Company Inc., Exton PA, USAから購入することができる。適した加水分解法は、当分野において公知である。
【００１７】
一実施形態において、膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む細胞成分を提供することは、全細胞を提供することを含む。
【００１８】
タンパク質がその天然の構造を保持している、高分子集合体の形成を可能にすることによって、結合リガンドを保持するタンパク質の能力が増加する。そして、得られる高分子集合体は、タンパク質とリガンドとの間の相互作用についての知見を提供するために使用することができ、したがって、タンパク質の機能についての知見を提供するために使用することができる。
【００１９】
さらなる実施形態において、前記方法は、高分子集合体を処置し、他の細胞構成要素を消化、または除去することをさらに含む。
【００２０】
代替的な実施形態において、膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む細胞成分を提供することは、精製された膜成分を提供することを含む。そのような精製された膜成分は、部分的に、または少なくとも実質的に、例えば核酸のような他の細胞成分が存在しなくてもよい。例えば、精製された膜成分を提供することは、当該分野において公知である、溶解細胞の遠心を含んでもよい。
【００２１】
高分子集合体溶液中におけるＤＮＡの存在は、粘性を増加させ、精製における困難性をもたらし得ることが見出された。したがって、高分子の集合前に他の細胞構成要素から膜成分を分離することによって、または集合体を含む液体の処置によって、本発明の方法で製造される高分子集合体には、少なくとも実質的に核酸が存在しないことを確実にすることは有利である。
【００２２】
一実施形態において、膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む細胞成分を提供することは、膜タンパク質と、タンパク質に結合したリガンドと、関連した膜脂質とを含む細胞成分を提供することを含み、共重合体を細胞成分と混合し、共重合体、脂質、およびタンパク質をもたらし、高分子集合体を形成することは、共重合体を細胞成分と混合し、共重合体、脂質、タンパク質、およびリガンドをもたらし、高分子集合体を形成することを含む。
【００２３】
一実施形態において、スチレン対マレイン酸の比率が０．５：１〜１０：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することは、スチレン対マレイン酸の比率が１：１〜５：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することを含む。さらに他の実施形態において、スチレン対マレイン酸の比率は、１．５：１〜４：１の間、または２：１〜３：１の間である。
【００２４】
天然の重合過程のために、そのような単量体の比率はバルク平均であり、定義された単量体の配列を有する特定の分子構造の記述であると考えられない。それでも、一般的には、前記モノマー型が共重合体中に分布していると考えられる。
【００２５】
一実施形態において、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することは、３０００Ｄａ〜１２００００Ｄａの間の分子量を有する、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することを含む。さらに他の実施形態において、共重合体は、５０００Ｄａ〜１５０００Ｄａの間の分子量を有する。さらなる他の実施形態において、共重合体は７０００〜１００００Ｄａの間の分子量を有する。
【００２６】
一実施形態において、共重合体を細胞成分と混合し、共重合体、脂質、およびタンパク質をもたらし、高分子集合体を形成することは、ｐＨ６〜９の間で、共重合体を細胞成分と混合することを含む。さらに他の実施形態において、共重合体を細胞成分と混合し、共重合体、脂質、およびタンパク質をもたらし、高分子集合体を形成することは、ｐＨ６．５〜８．５の間で、共重合体を細胞成分と混合することを含む。さらなる他の実施形態において、共重合体を細胞成分と混合し、共重合体、脂質、およびタンパク質をもたらし、高分子集合体を形成することは、ｐＨ７〜８の間で、共重合体を細胞成分と混合することを含む。
【００２７】
一実施形態において、前記方法は、高分子集合体を精製することをさらに含む。例えば、前記方法は、高分子集合体のクロマトグラフィー精製を含んでもよい。精製タグ（例えば、複数のヒスチジン残基、またはグルタチオンＳトランスフェラーゼ酵素）を含むように遺伝子操作された特定の膜タンパク質の集合体を単離するために望まれる場合、前記高分子集合体を、例えばアフィニティクロマトグラフィーのような、特定の精製タグの使用に適した任意の方法によって精製することができる。当業者に容易に理解されるように、当該分野において周知である他のタンパク質精製方法も使用してもよい。
【００２８】
一実施形態において、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することは、識別のために標識されたスチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することを含む。好ましい標識は、例えば、蛍光物質およびラジオアイソトープを含む。
【００２９】
一実施形態において、共重合体と細胞成分との混合は、少なくとも１５℃、または少なくとも２０℃の温度で実行される。付加的に、または代替的に、共重合体を細胞成分と混合することが、細胞成分のゲル−液相転移温度よりも高い温度で実行されてもよい。
【００３０】
生化学的研究において、タンパク質を扱う場合（および特にタンパク質の天然の構造を維持することが望まれる場合）、全ての処理を低温で実行するべきであることが周知である。したがって、タンパク質の処理（例えば、抽出など）は、通常冷蔵室で実行される。低温で作業する目的は、変性および酸化を含む（しかし、これらに限定されない）タンパク質の全ての劣化を防ぐためである。しかし、そのような低温において、細胞成分は、ゲル様の構造を形成する傾向を有し、その結果、処理を達成することは困難であり、望まれるよりも時間がかかる。
【００３１】
驚くべきことに、本発明の方法は、高温で処理を実行することができるほど、タンパク質を安定化することが本発明者らによって見出された。特に、ゲル−液相転移温度またはそれよりも高い温度で処理を実行することができ、それによってタンパク質の安定性を犠牲にすることなく、（高分子集合体の形態で）タンパク質を可溶化するために必要な時間が減少する。
【００３２】
ゲル−液相転移温度は、当該分野において十分に理解され、リン脂質二重層におけるリン脂質のアクリル鎖の長さによって影響を受けることが知られている。バクテリアおよびヒトにおける多くの脂質は、炭素原子数１２〜１４個の間の鎖の長さを有し、２０〜４０℃の間の転移温度である。
【００３３】
さらに他の実施形態において、細胞成分を共重合体と混合することは、さらに混合物の超音波処理を含む。このことは、細胞成分と共重合体との混合を、細胞成分中の膜を壊すことによって促進する。
【００３４】
本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様の方法に係る生成可能な高分子集合体が提供される。
【００３５】
本発明の第３の態様によれば、スチレン対マレイン酸の比率が１：２〜１０：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体と、膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む高分子集合体が提供される。
【００３６】
本明細書において、「関連した膜脂質」は、天然の細胞において、膜タンパク質と同じ膜に見出される膜脂質であるべきことが理解されるであろう。
【００３７】
一実施形態において、関連した膜脂質は、天然の細胞において、膜タンパク質を取り囲む膜脂質であり、天然のタンパク質−脂質複合体を形成する。
【００３８】
一実施形態において、スチレンおよびマレイン酸の共重合体は、スチレン対マレイン酸の比率が１：１〜５：１の間である。さらに他の実施形態において、スチレン対マレイン酸の比率は、１．５：１〜４：１の間、または２：１〜３：１の間である。
【００３９】
天然の重合過程のために、そのような単量体の比率はバルク平均であり、定義された単量体の配列を有する特定の分子構造の記述であると考えられない。それでも、一般的には、前記モノマー型が共重合体中に分布していると考えられる。
【００４０】
一実施形態において、スチレンおよびマレイン酸の共重合体は、３０００Ｄａ〜１２０００Ｄａの間の分子量を有する。さらに他の実施形態において、前記共重合体は、５０００Ｄａ〜１５０００Ｄａの間の分子量を有する。さらなる他の実施形態において、前記共重合体は、７０００〜１００００Ｄａの間の分子量を有する。
【００４１】
一実施形態において、スチレンおよびマレイン酸の共重合体は、識別を促進するために標識される。適した標識は、例えば、蛍光物質およびラジオアイソトープを含む。
【００４２】
本発明の第２の態様および第３の態様の高分子集合体は、多くの応用ができると考えられる。天然の脂質環境中の膜タンパク質の、溶解およびクロマトグラフィー分離に加えて、そのようなタンパク質の天然に生じた無傷のオリゴマー（例えば、二量体など）を精製し、そのようなタンパク質のリガンド（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）への結合を調べ、質量分析によってその結合を観察するために前記集合体を使用することができる。特に、ＧＰＣＲを含む集合体は、そのような目的のために有用であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
本発明の態様の例を、添付の図を参照して以下に記載する。
【図１】図１は、加水分解の前（実線）と後（点線）におけるスチレンおよび無水マレイン（酸）の共重合体のＦＴＩＲスペクトルを示す。
【図２】図２は、ピキア（Pichia）膜成分の濃度増加を用いる集合体形成のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【図３】図３は、樹脂精製の間における連続的な洗浄工程の後、精製されたヒトＡ２ａアデノシン受容体（ｈＡ２ａＲ）集合体のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【図４】異なる分子量の重合体を用いて形成された、精製されたＰａｇＰ集合体のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【実施例】
【００４４】
ＳＭＡ共重合体の調製−方法１
２：１の単量体比率を有する、低分子量スチレンおよび無水マレイン酸の共重合体（Sartomer Europe, Paris, FranceからＳＭＡ（登録商標）２０００Ｐとして市販されている）を、１．０Ｍ 水酸化ナトリウム中で可溶化し、２時間還流し、続いて４℃で４８時間インキュベートし、スチレンおよびマレイン酸の共重合体に対応する５％保存液を得た。反応の終了は、凍結乾燥物のフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光分析によって確認した（図１）。１７７８ｃｍ-１における無水物のカルボニル基のピークが、１５６８ｃｍ-１におけるカルボン酸のカルボニル基のピークによって置き換えられたことが見て取れた。続いて、前記試料を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）中で十分に透析し、水酸化ナトリウムを除去した。
【００４５】
ＳＭＡ共重合体の調製−方法２
１０％（ｗ／ｖ）粉末ＳＭＡ（登録商標）２０００Ｐ（方法１と同様）を、１Ｍ ＮａＯＨ中で２時間還流した。重合体を４℃に冷却し、続いて、ＩＲ分析によって加水分解が終了したと評価されるまで２日間保存した。続いて、重合体を、ＨＣｌの添加によって沈殿させ、ｐＨ３以下とした。得られた懸濁液を６０００×ｇで１０分間遠心し、上清を除去した。続いて、重合体を再懸濁し、Ｈ２Ｏで洗浄した。遠心、分離、および洗浄を２回繰り返し、続いて重合体をＨ２Ｏ中に再懸濁し、ｐＨ７を超えるように調製し、重合体を再度可溶化した。重合体溶液を、Ｈ２Ｏに対して２日間透析して、全てのさらなる混入物を除去し、続いて凍結し、凍結乾燥させた。
【００４６】
比較例：精製された重合体からの高分子集合体の形成
未標識のＰａｇＰタンパク質を、pETCrcAHΔSプラスミド（Bishop et al (2000) EMBO J 19:5071-5080）を用いて、細胞質内封入体として大腸菌（Escherichia coli）において発現させ、Hwang et al（2002） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(21):13560-5に記載されたように精製した。沈殿したＰａｇＰを、５％ ＳＤＳ中で溶解させ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）に対して５日間透析（３５００ｋＤａの分子量カットオフ）し、過剰のＳＤＳを除去した。得られた試料は０．５ｍＭ ＰａｇＰを含んでいた。続いて、固体のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコース（β−ＯＧ）を１００ｍＭの最終濃度となるようにゆっくりと溶解させ、エタノールを１％となるように加えた。ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）を最終濃度が２％（ｗ／ｖ）となるように添加し、完全に溶解するまで撹拌した。無極性ポリスチレン吸着体であるバイオビーズＳＭ−２を、製造者の仕様書に沿って２回添加してβ−ＯＧ界面活性剤を除去し、続いて４℃で混合しながら１６時間放置した。この処理を、多層状の小胞（ＭＬＶｓ）からなる不透明な脂質溶液が作製されるまで繰り返した。
【００４７】
この溶液を室温にして、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）中の５％スチレンおよびマレイン酸（ＳＭＡ）の共重合体溶液を１:１（ｖ／ｖ）となるように添加し、溶液が透明になるまで撹拌しながら放置した。続いて、過剰の共重合体／脂質を、標準的なHisTrap精製手順（GE Healthcare）を用いて除去した。
【００４８】
実施例１：E.Coli膜からの高分子集合体の形成
Ｎ末端シグナルペプチドを含むＰａｇＰのコンストラクトを、pET21b発現ベクター（Novagen）に組み込み、標準的な分子生物学的手法を用いて大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen）の外膜にＣ末端ヒスタグ融合タンパク質として強制発現させた。アンピシリン抵抗性（１００μｇ／ｍｌ）によって選別した細胞を、Ｌｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地でＯＤ６００が０．４となるまで３７℃で増殖させ、その時点で温度を１８℃に低下させた。６００ｎｍでの吸光度が０．６に到達したときに、１ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって発現を誘導した。１６時間後、細胞ペレットを６０００×ｇで１５分間遠心して収集した。細胞を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液（ｐＨ８）、１Ｍ ＮａＣｌ、およびコンプリートプロテアーゼインヒビター（Roche）中に再度懸濁させ、Emulsiflex C3（Avestin）によって溶解させた。細胞溶解液を５０００×ｇで遠心し、細胞片を除去し、続いて、上清を７５０００×ｇで１時間遠心して膜画分をペレット化した。
【００４９】
生膜を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１０％グリセロール（E.Coli培養２Ｌ当たり約２０ｍｌ）に４℃で再懸濁し、２８０ｎｍにおける吸光度によって評価されるように、２０〜４０ｍｇ／ｍｌの間の最終タンパク質濃度とした。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１０％グリセロール中の５％（ｗ／ｖ） 加水分解ＳＭＡ２０００Ｐ共重合体の等量を、１％（ｗ／ｖ）ＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）（Avanti Polar Lipids）と同様に、（２．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように）試料に添加した。この溶液を、固定台に置き、全てのＤＭＰＣが溶解するまで、２０℃で穏やかに撹拌した（約１〜２時間）。得られた溶液を４℃、７５０００×ｇで１時間遠心し、組み込まれていない成分を除去し、E.Coli膜タンパク質共重合体の集合体を溶液中に残した。
【００５０】
タンパク質共重合体集合体を、5ml Histrap（GE Healthcare）カラム、または5ml Co2+IPAP（GE Healthcare）カラムのいずれかを用いて、標準的な金属キレートクロマトグラフィー（Crowe et al (1994) Methods Mol. Biol. 31 371-387）によって精製した。生の集合溶液を、０．２ｍｌ／ｍｉｎの割合で添加し、結合を最大とした。カラムは、カラム体積の５倍洗浄し、非特異的に結合した混入物を除去し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）＋１Ｍ ＮａＣｌ＋５０ｍＭ ＥＤＴＡを用いて精製されたタンパク質共重合体集合体を１ｍｌ画分に溶出させた。
【００５１】
実施例２：ピキア膜からの高分子集合体の形成
ピキア・パストリス（Pischia Pastoris）形質転換体を、成長培地において一晩培養し、メタノールの添加によってタンパク質の生産を誘導した。試料を、誘導後に遠心によって収集し、上清をデカントし、細胞ペレットを凍結させた。ピキア膜を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）＋５０ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁し、続いてEmulsiflex C3 cell disrupter (Avestin)を用いて細胞を破壊し、１０００００×ｇで１時間遠心することによって細胞から調製した。
【００５２】
生膜を、６％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように、４℃で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）＋５０ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）＋５０ｍＭ ＮａＣｌ中の加水分解ＳＭＡ重合体（５％ ｗ／ｖ）の等量を、２．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように添加した。試料を２０℃で５分間振とうしながら放置し、集合体の形成を生じさせた。不溶性／組み込まれていない成分を、７５０００×ｇで３０分間遠心することによって除去し、生ピキア膜タンパク質共重合体の集合体を溶液中に残した。
【００５３】
実施例３：ピキア膜の添加
ピキア膜を実施例２のように単離した。生膜を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）＋５０ｍＭ ＮａＣｌに４℃で再懸濁し、試料１ｍｌ当たり０〜４００ｍｇの濃度範囲（０〜４０％ ｗ／ｖ）とした。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）＋５０ｍＭ ＮａＣｌ中の加水分解ＳＭＡ重合体（５％ ｗ／ｖ）の等量を、各試料に添加し、２．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度とした。試料を、２０℃で５分間振とうしながら放置し、集合体形成を生じさせた。不溶性／組み込まれていない成分を７５０００×ｇで３０分間遠心することによって除去し、生ピキア膜タンパク質共重合体の集合体を溶液中に残した。結果を図２に示した。
【００５４】
実施例４：ピキア膜からの高分子集合体の形成と精製
ピキア膜を実施例２のように単離した。生膜を可溶化緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％グリセロール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％（ｗ/ｖ）加水分解ＳＭＡ重合体（ｈＳＭＡ）、１％ ＤＭＰＣ（Avanti））（ｐＨ８）中に再懸濁した。スラリーを、室温で１〜２時間撹拌し、続いてBeckman Type 70.1 Ti Rotor中において１５０，０００×ｇで４５分間遠心した。可溶化し、過剰発現したヒトＡ２ａアデノシン受容体（ｈＡ２ａＲ）を含む上清をさらなる使用のために確保した。
【００５５】
精製を０〜４℃で実行した。可溶化したｈＡ２ａＲを含む上清を、再懸濁緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％グリセロール、５００ｍＭ ＮａＣｌ）（ｐＨ８）中において、混合液が再懸濁緩衝液中において２０ｍＭ イミダゾールの最終濃度を有するように８０ｍＭ イミダゾールで希釈した。試料を、一晩ゆっくりと回転させながらＮｉ２＋−ＮＴＡ樹脂（Qiagen）とインキュベートした。例によって、樹脂の１．５ｍｌを、元の培養に由来する２０ｇの細胞ペレットについて使用した。樹脂の体積の洗浄緩衝液（再懸濁緩衝液に６０ｍＭ イミダゾールを加えたもの（ｐＨ８））で樹脂を５回洗浄し、樹脂の体積の２０倍を超えない溶出緩衝液（再懸濁緩衝液に２５０ｍＭ イミダゾールを加えたもの（ｐＨ８））を用いて受容体を溶出した。
【００５６】
ｈＡ２ａＲを含む画分を、Vivapin 20濃縮器（３０ｋＤａカットオフ、Sigma-Aldrich）を用いて濃縮し、AKTA（商標）purifier FPLC system（GE Healthcare）に取り付けられたSuperdex 200 10/300 GLカラムに注入する前に、ゲル濾過溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％ グリセロール、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）（ｐＨ８）で十分に洗浄した。画分を、ゲル濾過溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％ グリセロール、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）（ｐＨ８）で溶出した。結果を図３に示す。
【００５７】
実施例５：分子量の幅を有する重合体を用いる、E.Coli膜からの高分子集合体の形成
ＸＺ−０９−００６（６ｋＤａ）、ＸＺ−０９−００８（１０ｋＤａ）、ＳＺ３３０３０（３０ｋＤａ）、ＳＺ４２０１０（１０ｋＤａ）、ＳＺ２８０６５（６５ｋＤａ）、およびＳＺ２８１１０（１１０ｋＤａ）のスチレンおよび無水マレイン酸の共重合体（上述したように、単量体の比率が２：１である）（Polyscope Polymers, Hollandから市販されている）を用いた。重合体を、水の代わりに０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）に対して透析したことを除いて、方法２と同様に重合体を調製した。重合体は、Ｓａｒｔｏｍｅｒ ＳＭＡ（登録商標）２００Ｐから得られたものよりも高い精製度を有していることがわかった（希釈に続く透析によって測定した）。
【００５８】
ＰａｇＰを発現させ、分子集合体を実施例１に記載された手順に従って精製した。結果を図４に示す。高分子集合体の形成は、Ｓａｒｔｏｍｅｒ ＳＭＡ（登録商標）２０００Ｐから得られた重合体よりも遅くなった。特に、高分子集合体の形成は、より高い分子量の重合体で最も遅くなった。高分子集合体は、少なくとも室温で３日間安定であるとみられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜タンパク質の可溶化に関する。このようなタンパク質は、通常、生細胞の膜に見出される。
【背景技術】
【０００２】
脂質二重膜は、分子細胞生物学において周知の構造である。これらの膜は、糖脂質およびリン脂質の二重膜から形成され、各リン脂質分子は、親水性の極性頭部と、疎水性のアシル基の尾部とを有し、二重膜中の前記分子は平行に並んでおり、親水性の極性頭部が、膜の内側表面と外側表面とを形成し、疎水性の尾部が膜の内部を形成する。ステロールのような他の脂質も、脂質二重膜において見出される。このような脂質二重膜は、原核生物および真核生物の両者の細胞膜、ならびに真核生物の多くの細胞内小器官の周囲の膜を含む。
【０００３】
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）と、イオンチャネルと、トランスポーターとを含む膜内在性タンパク質、すなわちそのような膜に、交差し、埋め込まれ、または組み入れられた全てのタンパク質での使用に特に適している。真核生物のタンパク質の約３分の１は、承認された薬の４０％の標的と同様に、このようにして膜に関連している。膜内在性タンパク質は、通常、疎水性であって膜二重層の疎水性内部に位置する１つ以上の領域と、親水性であって膜から外部に広がる１つ以上の領域とを有する。親水性領域は、膜の片側、または両側に位置してもよい。
【０００４】
ＧＰＣＲは、７回膜貫通αヘリックスを含むことによって特徴付けられるタンパク質の一群である。タンパク質は、クラス１（ロドプシン関連）、クラス２（セクレチン関連）、およびクラス３（代謝型グルタミン酸受容体関連）の３つの一般的クラスに分類される。縮れた（frizzled）および滑らかな（smoothened）ＧＰＣＲも存在する。ＧＰＣＲは、全ての哺乳類などで見出される。特に、ＧＰＣＲは、多くの生理的プロセスを制御し、多くの薬の標的となる。したがって、それらは薬理学上非常に重要であると考えられる。ＧＰＣＲは、アゴニストおよびアンタゴニストのような異なる薬理学上の分類のリガンドに関連する複数の特徴的な構造で存在し、機能するためにこれらの構造の間を循環していると考えられる（Kenakin T. (1997) Ann N Y Acad Sci, 812, 116-125）。
【０００５】
全てのタンパク質と同様に、膜内在性タンパク質の機能は、その三次元構造に依存する。この構造は、埋め込まれた領域と膜二重層の内部との疎水性相互作用、タンパク質の埋め込まれていない領域と極性のリン脂質頭部とのイオン相互作用、および周囲の水性媒体によって、ならびにタンパク質自体内部の相互作用（疎水性およびイオン性の両者）によって安定化する。膜タンパク質の代表的な機能は、イオンおよび小分子の細胞膜を横切る輸送、ならびに受容体によるリガンドの認識、ならびに膜を横切るシグナル伝達を含む。
【０００６】
界面活性剤の使用によって、膜タンパク質をそれらの天然の環境から取り出すことができる。界面活性剤は、親水性の極性頭部と疎水性尾部とを備える膜二重層のリン脂質の分子構造と同様の一般的な分子構造を有する。そのように、界面活性剤は、膜タンパク質の親水性および疎水性領域の両者に結合することができ、タンパク質を水に可溶化することができる。このことは、標準的なクロマトグラム法を用いて多くの異なるタンパク質を分離することを可能とし、タンパク質の特性評価（例えば、標準的なシークエンシング方法を用いる）の可能性を拡げる。そのようなタンパク質抽出方法は、米国特許第５，７６３，５８６号明細書に記載されている。
【０００７】
しかし、界面活性剤と脂質二重層との間の構造上の相違を考慮すると、界面活性剤がタンパク質の構造に影響を与えるであろうことが予測される。加えて、ＳＤＳのような界面活性剤中のタンパク質の変性は、多くの場合、分子量の評価および他の特性評価を実行するために望ましいものである。しかし、天然の構造のそのような損失の全ては、機能の消失をもたらすであろう。このように、界面活性剤中における可溶化は、天然タンパク質の機能を決定するための信頼性のある方法を提供するものではない。
【０００８】
特に、ＧＰＣＲは、単離すると一般的に不安定であり、ウシロドプシン（例外的に安定である）のように、結晶化に耐えられることが証明されたものはほとんどない。安定で活性のある膜タンパク質を可溶化し特性評価をするための一般的な方法の不足は、それらの機序を定義し、利用することを困難にしている。
【０００９】
天然の膜タンパク質の環境により近い環境中で膜タンパク質を可溶化する試みがなされてきたが、依然として、クロマトグラフィーの、分離および特性評価を可能とするのみである。
【００１０】
例えば、発行された英国特許出願ＧＢ２４４５０１３には、界面活性剤と脂質との高分子集合体が記載されており、前記集合体は、１００ｎｍ未満の直径であることが記載されている。これらの集合体は、二重層ディスクであると考えられる。前記集合体は、集合体（タンパク質を含まない）と、界面活性剤で安定化されたタンパク質溶液との透析によって、膜タンパク質の可溶化のために用いることができることが指摘されている。そして、タンパク質を含む集合体は、タンパク質との相互作用のための候補のスクリーニングに用いられてもよい。
【００１１】
同様に、発行された国際（ＰＣＴ）特許出願ＷＯ２００６／１２９１２７は、スチレンおよびマレイン酸（少なくとも１：１の比率）の共重合体の高分子集合体と、（合成）脂質との組み合わせを開示している。合成脂質中において安定化した精製タンパク質に重合体溶液を添加することによって、または重合体／脂質集合体に精製タンパク質を添加することによって、膜タンパク質を組み込む集合体を形成することも開示されている。
【００１２】
したがって、天然の膜環境の特性を保持する方法で膜タンパク質を可溶化する機序が必要である。
【発明の概要】
【００１３】
本発明の第１の態様によれば、膜タンパク質を可溶化するための方法であって、膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む細胞成分を提供すること、スチレン対マレイン酸の比率が１：２〜１０：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供すること、ならびに共重合体を細胞成分と混合し、共重合体、脂質、およびタンパク質をもたらし、高分子集合体を形成することを含む方法が提供される。
【００１４】
本明細書において、「関連した膜脂質」は、膜タンパク質と同じ供給源に由来するべきであることが理解されるであろう。一実施形態では、細胞成分を提供することは、添加された脂質の存在しない細胞成分を提供することを含む。
【００１５】
驚くべきことに、膜タンパク質を、細胞成分から抽出することができ、タンパク質の初期精製の必要なしに高分子集合体に組み込むことが可能であることが発明者らによって見出された。理論によって束縛されることを望むものではないが、タンパク質の初期精製なしに、タンパク質の天然の環境に由来する脂質と共にタンパク質が組み込まれている、高分子集合体を形成することは、タンパク質がその天然の構造を保持する可能性を最大にすると考えられる。したがって、前記方法は、天然タンパク質の機能および特性のより正確な評価を可能にする。
【００１６】
一実施形態において、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することは、スチレンおよび無水マレイン酸の共重合体を提供することと、無水マレイン酸をマレイン酸に加水分解することとを含む。スチレンおよび無水マレイン酸の共重合体は、ＳＭＡ（登録商標）２０００およびＳＭＡ（登録商標）３０００の商品名で、Sartomer Company Inc., Exton PA, USAから購入することができる。適した加水分解法は、当分野において公知である。
【００１７】
一実施形態において、膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む細胞成分を提供することは、全細胞を提供することを含む。
【００１８】
タンパク質がその天然の構造を保持している、高分子集合体の形成を可能にすることによって、結合リガンドを保持するタンパク質の能力が増加する。そして、得られる高分子集合体は、タンパク質とリガンドとの間の相互作用についての知見を提供するために使用することができ、したがって、タンパク質の機能についての知見を提供するために使用することができる。
【００１９】
さらなる実施形態において、前記方法は、高分子集合体を処置し、他の細胞構成要素を消化、または除去することをさらに含む。
【００２０】
代替的な実施形態において、膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む細胞成分を提供することは、精製された膜成分を提供することを含む。そのような精製された膜成分は、部分的に、または少なくとも実質的に、例えば核酸のような他の細胞成分が存在しなくてもよい。例えば、精製された膜成分を提供することは、当該分野において公知である、溶解細胞の遠心を含んでもよい。
【００２１】
高分子集合体溶液中におけるＤＮＡの存在は、粘性を増加させ、精製における困難性をもたらし得ることが見出された。したがって、高分子の集合前に他の細胞構成要素から膜成分を分離することによって、または集合体を含む液体の処置によって、本発明の方法で製造される高分子集合体には、少なくとも実質的に核酸が存在しないことを確実にすることは有利である。
【００２２】
一実施形態において、膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む細胞成分を提供することは、膜タンパク質と、タンパク質に結合したリガンドと、関連した膜脂質とを含む細胞成分を提供することを含み、共重合体を細胞成分と混合し、共重合体、脂質、およびタンパク質をもたらし、高分子集合体を形成することは、共重合体を細胞成分と混合し、共重合体、脂質、タンパク質、およびリガンドをもたらし、高分子集合体を形成することを含む。
【００２３】
一実施形態において、スチレン対マレイン酸の比率が０．５：１〜１０：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することは、スチレン対マレイン酸の比率が１：１〜５：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することを含む。さらに他の実施形態において、スチレン対マレイン酸の比率は、１．５：１〜４：１の間、または２：１〜３：１の間である。
【００２４】
天然の重合過程のために、そのような単量体の比率はバルク平均であり、定義された単量体の配列を有する特定の分子構造の記述であると考えられない。それでも、一般的には、前記モノマー型が共重合体中に分布していると考えられる。
【００２５】
一実施形態において、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することは、３０００Ｄａ〜１２００００Ｄａの間の分子量を有する、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することを含む。さらに他の実施形態において、共重合体は、５０００Ｄａ〜１５０００Ｄａの間の分子量を有する。さらなる他の実施形態において、共重合体は７０００〜１００００Ｄａの間の分子量を有する。
【００２６】
一実施形態において、共重合体を細胞成分と混合し、共重合体、脂質、およびタンパク質をもたらし、高分子集合体を形成することは、ｐＨ６〜９の間で、共重合体を細胞成分と混合することを含む。さらに他の実施形態において、共重合体を細胞成分と混合し、共重合体、脂質、およびタンパク質をもたらし、高分子集合体を形成することは、ｐＨ６．５〜８．５の間で、共重合体を細胞成分と混合することを含む。さらなる他の実施形態において、共重合体を細胞成分と混合し、共重合体、脂質、およびタンパク質をもたらし、高分子集合体を形成することは、ｐＨ７〜８の間で、共重合体を細胞成分と混合することを含む。
【００２７】
一実施形態において、前記方法は、高分子集合体を精製することをさらに含む。例えば、前記方法は、高分子集合体のクロマトグラフィー精製を含んでもよい。精製タグ（例えば、複数のヒスチジン残基、またはグルタチオンＳトランスフェラーゼ酵素）を含むように遺伝子操作された特定の膜タンパク質の集合体を単離するために望まれる場合、前記高分子集合体を、例えばアフィニティクロマトグラフィーのような、特定の精製タグの使用に適した任意の方法によって精製することができる。当業者に容易に理解されるように、当該分野において周知である他のタンパク質精製方法も使用してもよい。
【００２８】
一実施形態において、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することは、識別のために標識されたスチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することを含む。好ましい標識は、例えば、蛍光物質およびラジオアイソトープを含む。
【００２９】
一実施形態において、共重合体と細胞成分との混合は、少なくとも１５℃、または少なくとも２０℃の温度で実行される。付加的に、または代替的に、共重合体を細胞成分と混合することが、細胞成分のゲル−液相転移温度よりも高い温度で実行されてもよい。
【００３０】
生化学的研究において、タンパク質を扱う場合（および特にタンパク質の天然の構造を維持することが望まれる場合）、全ての処理を低温で実行するべきであることが周知である。したがって、タンパク質の処理（例えば、抽出など）は、通常冷蔵室で実行される。低温で作業する目的は、変性および酸化を含む（しかし、これらに限定されない）タンパク質の全ての劣化を防ぐためである。しかし、そのような低温において、細胞成分は、ゲル様の構造を形成する傾向を有し、その結果、処理を達成することは困難であり、望まれるよりも時間がかかる。
【００３１】
驚くべきことに、本発明の方法は、高温で処理を実行することができるほど、タンパク質を安定化することが本発明者らによって見出された。特に、ゲル−液相転移温度またはそれよりも高い温度で処理を実行することができ、それによってタンパク質の安定性を犠牲にすることなく、（高分子集合体の形態で）タンパク質を可溶化するために必要な時間が減少する。
【００３２】
ゲル−液相転移温度は、当該分野において十分に理解され、リン脂質二重層におけるリン脂質のアクリル鎖の長さによって影響を受けることが知られている。バクテリアおよびヒトにおける多くの脂質は、炭素原子数１２〜１４個の間の鎖の長さを有し、２０〜４０℃の間の転移温度である。
【００３３】
さらに他の実施形態において、細胞成分を共重合体と混合することは、さらに混合物の超音波処理を含む。このことは、細胞成分と共重合体との混合を、細胞成分中の膜を壊すことによって促進する。
【００３４】
本発明の第２の態様によれば、本発明の第１の態様の方法に係る生成可能な高分子集合体が提供される。
【００３５】
本発明の第３の態様によれば、スチレン対マレイン酸の比率が１：２〜１０：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体と、膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む高分子集合体が提供される。
【００３６】
本明細書において、「関連した膜脂質」は、天然の細胞において、膜タンパク質と同じ膜に見出される膜脂質であるべきことが理解されるであろう。
【００３７】
一実施形態において、関連した膜脂質は、天然の細胞において、膜タンパク質を取り囲む膜脂質であり、天然のタンパク質−脂質複合体を形成する。
【００３８】
一実施形態において、スチレンおよびマレイン酸の共重合体は、スチレン対マレイン酸の比率が１：１〜５：１の間である。さらに他の実施形態において、スチレン対マレイン酸の比率は、１．５：１〜４：１の間、または２：１〜３：１の間である。
【００３９】
天然の重合過程のために、そのような単量体の比率はバルク平均であり、定義された単量体の配列を有する特定の分子構造の記述であると考えられない。それでも、一般的には、前記モノマー型が共重合体中に分布していると考えられる。
【００４０】
一実施形態において、スチレンおよびマレイン酸の共重合体は、３０００Ｄａ〜１２０００Ｄａの間の分子量を有する。さらに他の実施形態において、前記共重合体は、５０００Ｄａ〜１５０００Ｄａの間の分子量を有する。さらなる他の実施形態において、前記共重合体は、７０００〜１００００Ｄａの間の分子量を有する。
【００４１】
一実施形態において、スチレンおよびマレイン酸の共重合体は、識別を促進するために標識される。適した標識は、例えば、蛍光物質およびラジオアイソトープを含む。
【００４２】
本発明の第２の態様および第３の態様の高分子集合体は、多くの応用ができると考えられる。天然の脂質環境中の膜タンパク質の、溶解およびクロマトグラフィー分離に加えて、そのようなタンパク質の天然に生じた無傷のオリゴマー（例えば、二量体など）を精製し、そのようなタンパク質のリガンド（アゴニストおよびアンタゴニストを含む）への結合を調べ、質量分析によってその結合を観察するために前記集合体を使用することができる。特に、ＧＰＣＲを含む集合体は、そのような目的のために有用であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
本発明の態様の例を、添付の図を参照して以下に記載する。
【図１】図１は、加水分解の前（実線）と後（点線）におけるスチレンおよび無水マレイン（酸）の共重合体のＦＴＩＲスペクトルを示す。
【図２】図２は、ピキア（Pichia）膜成分の濃度増加を用いる集合体形成のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【図３】図３は、樹脂精製の間における連続的な洗浄工程の後、精製されたヒトＡ２ａアデノシン受容体（ｈＡ２ａＲ）集合体のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【図４】異なる分子量の重合体を用いて形成された、精製されたＰａｇＰ集合体のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。
【実施例】
【００４４】
ＳＭＡ共重合体の調製−方法１
２：１の単量体比率を有する、低分子量スチレンおよび無水マレイン酸の共重合体（Sartomer Europe, Paris, FranceからＳＭＡ（登録商標）２０００Ｐとして市販されている）を、１．０Ｍ 水酸化ナトリウム中で可溶化し、２時間還流し、続いて４℃で４８時間インキュベートし、スチレンおよびマレイン酸の共重合体に対応する５％保存液を得た。反応の終了は、凍結乾燥物のフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光分析によって確認した（図１）。１７７８ｃｍ-１における無水物のカルボニル基のピークが、１５６８ｃｍ-１におけるカルボン酸のカルボニル基のピークによって置き換えられたことが見て取れた。続いて、前記試料を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）中で十分に透析し、水酸化ナトリウムを除去した。
【００４５】
ＳＭＡ共重合体の調製−方法２
１０％（ｗ／ｖ）粉末ＳＭＡ（登録商標）２０００Ｐ（方法１と同様）を、１Ｍ ＮａＯＨ中で２時間還流した。重合体を４℃に冷却し、続いて、ＩＲ分析によって加水分解が終了したと評価されるまで２日間保存した。続いて、重合体を、ＨＣｌの添加によって沈殿させ、ｐＨ３以下とした。得られた懸濁液を６０００×ｇで１０分間遠心し、上清を除去した。続いて、重合体を再懸濁し、Ｈ２Ｏで洗浄した。遠心、分離、および洗浄を２回繰り返し、続いて重合体をＨ２Ｏ中に再懸濁し、ｐＨ７を超えるように調製し、重合体を再度可溶化した。重合体溶液を、Ｈ２Ｏに対して２日間透析して、全てのさらなる混入物を除去し、続いて凍結し、凍結乾燥させた。
【００４６】
比較例：精製された重合体からの高分子集合体の形成
未標識のＰａｇＰタンパク質を、pETCrcAHΔSプラスミド（Bishop et al (2000) EMBO J 19:5071-5080）を用いて、細胞質内封入体として大腸菌（Escherichia coli）において発現させ、Hwang et al（2002） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(21):13560-5に記載されたように精製した。沈殿したＰａｇＰを、５％ ＳＤＳ中で溶解させ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）に対して５日間透析（３５００ｋＤａの分子量カットオフ）し、過剰のＳＤＳを除去した。得られた試料は０．５ｍＭ ＰａｇＰを含んでいた。続いて、固体のｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコース（β−ＯＧ）を１００ｍＭの最終濃度となるようにゆっくりと溶解させ、エタノールを１％となるように加えた。ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）を最終濃度が２％（ｗ／ｖ）となるように添加し、完全に溶解するまで撹拌した。無極性ポリスチレン吸着体であるバイオビーズＳＭ−２を、製造者の仕様書に沿って２回添加してβ−ＯＧ界面活性剤を除去し、続いて４℃で混合しながら１６時間放置した。この処理を、多層状の小胞（ＭＬＶｓ）からなる不透明な脂質溶液が作製されるまで繰り返した。
【００４７】
この溶液を室温にして、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）中の５％スチレンおよびマレイン酸（ＳＭＡ）の共重合体溶液を１:１（ｖ／ｖ）となるように添加し、溶液が透明になるまで撹拌しながら放置した。続いて、過剰の共重合体／脂質を、標準的なHisTrap精製手順（GE Healthcare）を用いて除去した。
【００４８】
実施例１：E.Coli膜からの高分子集合体の形成
Ｎ末端シグナルペプチドを含むＰａｇＰのコンストラクトを、pET21b発現ベクター（Novagen）に組み込み、標準的な分子生物学的手法を用いて大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen）の外膜にＣ末端ヒスタグ融合タンパク質として強制発現させた。アンピシリン抵抗性（１００μｇ／ｍｌ）によって選別した細胞を、Ｌｕｒｉａ ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地でＯＤ６００が０．４となるまで３７℃で増殖させ、その時点で温度を１８℃に低下させた。６００ｎｍでの吸光度が０．６に到達したときに、１ｍＭ ＩＰＴＧの添加によって発現を誘導した。１６時間後、細胞ペレットを６０００×ｇで１５分間遠心して収集した。細胞を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液（ｐＨ８）、１Ｍ ＮａＣｌ、およびコンプリートプロテアーゼインヒビター（Roche）中に再度懸濁させ、Emulsiflex C3（Avestin）によって溶解させた。細胞溶解液を５０００×ｇで遠心し、細胞片を除去し、続いて、上清を７５０００×ｇで１時間遠心して膜画分をペレット化した。
【００４９】
生膜を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１０％グリセロール（E.Coli培養２Ｌ当たり約２０ｍｌ）に４℃で再懸濁し、２８０ｎｍにおける吸光度によって評価されるように、２０〜４０ｍｇ／ｍｌの間の最終タンパク質濃度とした。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）＋１Ｍ ＮａＣｌ＋１０％グリセロール中の５％（ｗ／ｖ） 加水分解ＳＭＡ２０００Ｐ共重合体の等量を、１％（ｗ／ｖ）ＤＭＰＣ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）（Avanti Polar Lipids）と同様に、（２．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように）試料に添加した。この溶液を、固定台に置き、全てのＤＭＰＣが溶解するまで、２０℃で穏やかに撹拌した（約１〜２時間）。得られた溶液を４℃、７５０００×ｇで１時間遠心し、組み込まれていない成分を除去し、E.Coli膜タンパク質共重合体の集合体を溶液中に残した。
【００５０】
タンパク質共重合体集合体を、5ml Histrap（GE Healthcare）カラム、または5ml Co2+IPAP（GE Healthcare）カラムのいずれかを用いて、標準的な金属キレートクロマトグラフィー（Crowe et al (1994) Methods Mol. Biol. 31 371-387）によって精製した。生の集合溶液を、０．２ｍｌ／ｍｉｎの割合で添加し、結合を最大とした。カラムは、カラム体積の５倍洗浄し、非特異的に結合した混入物を除去し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）＋１Ｍ ＮａＣｌ＋５０ｍＭ ＥＤＴＡを用いて精製されたタンパク質共重合体集合体を１ｍｌ画分に溶出させた。
【００５１】
実施例２：ピキア膜からの高分子集合体の形成
ピキア・パストリス（Pischia Pastoris）形質転換体を、成長培地において一晩培養し、メタノールの添加によってタンパク質の生産を誘導した。試料を、誘導後に遠心によって収集し、上清をデカントし、細胞ペレットを凍結させた。ピキア膜を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）＋５０ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁し、続いてEmulsiflex C3 cell disrupter (Avestin)を用いて細胞を破壊し、１０００００×ｇで１時間遠心することによって細胞から調製した。
【００５２】
生膜を、６％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように、４℃で５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）＋５０ｍＭ ＮａＣｌ中に再懸濁した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）＋５０ｍＭ ＮａＣｌ中の加水分解ＳＭＡ重合体（５％ ｗ／ｖ）の等量を、２．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度となるように添加した。試料を２０℃で５分間振とうしながら放置し、集合体の形成を生じさせた。不溶性／組み込まれていない成分を、７５０００×ｇで３０分間遠心することによって除去し、生ピキア膜タンパク質共重合体の集合体を溶液中に残した。
【００５３】
実施例３：ピキア膜の添加
ピキア膜を実施例２のように単離した。生膜を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）＋５０ｍＭ ＮａＣｌに４℃で再懸濁し、試料１ｍｌ当たり０〜４００ｍｇの濃度範囲（０〜４０％ ｗ／ｖ）とした。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）＋５０ｍＭ ＮａＣｌ中の加水分解ＳＭＡ重合体（５％ ｗ／ｖ）の等量を、各試料に添加し、２．５％（ｗ／ｖ）の最終濃度とした。試料を、２０℃で５分間振とうしながら放置し、集合体形成を生じさせた。不溶性／組み込まれていない成分を７５０００×ｇで３０分間遠心することによって除去し、生ピキア膜タンパク質共重合体の集合体を溶液中に残した。結果を図２に示した。
【００５４】
実施例４：ピキア膜からの高分子集合体の形成と精製
ピキア膜を実施例２のように単離した。生膜を可溶化緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％グリセロール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％（ｗ/ｖ）加水分解ＳＭＡ重合体（ｈＳＭＡ）、１％ ＤＭＰＣ（Avanti））（ｐＨ８）中に再懸濁した。スラリーを、室温で１〜２時間撹拌し、続いてBeckman Type 70.1 Ti Rotor中において１５０，０００×ｇで４５分間遠心した。可溶化し、過剰発現したヒトＡ２ａアデノシン受容体（ｈＡ２ａＲ）を含む上清をさらなる使用のために確保した。
【００５５】
精製を０〜４℃で実行した。可溶化したｈＡ２ａＲを含む上清を、再懸濁緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％グリセロール、５００ｍＭ ＮａＣｌ）（ｐＨ８）中において、混合液が再懸濁緩衝液中において２０ｍＭ イミダゾールの最終濃度を有するように８０ｍＭ イミダゾールで希釈した。試料を、一晩ゆっくりと回転させながらＮｉ２＋−ＮＴＡ樹脂（Qiagen）とインキュベートした。例によって、樹脂の１．５ｍｌを、元の培養に由来する２０ｇの細胞ペレットについて使用した。樹脂の体積の洗浄緩衝液（再懸濁緩衝液に６０ｍＭ イミダゾールを加えたもの（ｐＨ８））で樹脂を５回洗浄し、樹脂の体積の２０倍を超えない溶出緩衝液（再懸濁緩衝液に２５０ｍＭ イミダゾールを加えたもの（ｐＨ８））を用いて受容体を溶出した。
【００５６】
ｈＡ２ａＲを含む画分を、Vivapin 20濃縮器（３０ｋＤａカットオフ、Sigma-Aldrich）を用いて濃縮し、AKTA（商標）purifier FPLC system（GE Healthcare）に取り付けられたSuperdex 200 10/300 GLカラムに注入する前に、ゲル濾過溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％ グリセロール、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）（ｐＨ８）で十分に洗浄した。画分を、ゲル濾過溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％ グリセロール、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）（ｐＨ８）で溶出した。結果を図３に示す。
【００５７】
実施例５：分子量の幅を有する重合体を用いる、E.Coli膜からの高分子集合体の形成
ＸＺ−０９−００６（６ｋＤａ）、ＸＺ−０９−００８（１０ｋＤａ）、ＳＺ３３０３０（３０ｋＤａ）、ＳＺ４２０１０（１０ｋＤａ）、ＳＺ２８０６５（６５ｋＤａ）、およびＳＺ２８１１０（１１０ｋＤａ）のスチレンおよび無水マレイン酸の共重合体（上述したように、単量体の比率が２：１である）（Polyscope Polymers, Hollandから市販されている）を用いた。重合体を、水の代わりに０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）に対して透析したことを除いて、方法２と同様に重合体を調製した。重合体は、Ｓａｒｔｏｍｅｒ ＳＭＡ（登録商標）２００Ｐから得られたものよりも高い精製度を有していることがわかった（希釈に続く透析によって測定した）。
【００５８】
ＰａｇＰを発現させ、分子集合体を実施例１に記載された手順に従って精製した。結果を図４に示す。高分子集合体の形成は、Ｓａｒｔｏｍｅｒ ＳＭＡ（登録商標）２０００Ｐから得られた重合体よりも遅くなった。特に、高分子集合体の形成は、より高い分子量の重合体で最も遅くなった。高分子集合体は、少なくとも室温で３日間安定であるとみられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜タンパク質を可溶化するための方法であって、
膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む細胞成分を提供することと、
スチレン対マレイン酸の比率が１：２〜１０：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することと、
共重合体を細胞成分と混合し、共重合体、脂質、およびタンパク質をもたらし、可溶性の高分子集合体を形成することとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
細胞成分を提供することが、添加された脂質の存在しない細胞成分を提供することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することが、スチレンおよび無水マレイン酸の共重合体を提供することと、無水マレイン酸をマレイン酸に加水分解することとを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む細胞成分を提供することが、全細胞を提供することを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
高分子集合体の溶液を処置し、他の細胞構成要素を消化または除去することを、さらに含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む細胞成分を提供することが、精製された膜成分を提供することを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
スチレン対マレイン酸の比率が０．５：１〜１０：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することは、スチレン対マレイン酸の比率が１：１〜５：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することを含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
スチレン対マレイン酸の比率が０．５：１〜１０：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することは、スチレン対マレイン酸の比率が２：１〜３：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することを含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することが、３０００Ｄａ〜１２００００Ｄａの間の分子量を有するスチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
高分子集合体を精製することを、さらに含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の、生成可能な高分子集合体。
【請求項１２】
スチレン対マレイン酸の比率が１：２〜１０：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体と、膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む高分子集合体。
【請求項１３】
スチレンおよびマレイン酸の共重合体が、２：１〜３：１の間のスチレン対マレイン酸の比率を有することを特徴とする請求項１２に記載の高分子集合体。
【請求項１４】
スチレンおよびマレイン酸の共重合体が、３０００Ｄａ〜１２００００Ｄａの間の分子量を有することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の高分子集合体。
【請求項１】
膜タンパク質を可溶化するための方法であって、
膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む細胞成分を提供することと、
スチレン対マレイン酸の比率が１：２〜１０：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することと、
共重合体を細胞成分と混合し、共重合体、脂質、およびタンパク質をもたらし、可溶性の高分子集合体を形成することとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
細胞成分を提供することが、添加された脂質の存在しない細胞成分を提供することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することが、スチレンおよび無水マレイン酸の共重合体を提供することと、無水マレイン酸をマレイン酸に加水分解することとを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む細胞成分を提供することが、全細胞を提供することを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
高分子集合体の溶液を処置し、他の細胞構成要素を消化または除去することを、さらに含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む細胞成分を提供することが、精製された膜成分を提供することを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
スチレン対マレイン酸の比率が０．５：１〜１０：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することは、スチレン対マレイン酸の比率が１：１〜５：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することを含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
スチレン対マレイン酸の比率が０．５：１〜１０：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することは、スチレン対マレイン酸の比率が２：１〜３：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することを含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
スチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することが、３０００Ｄａ〜１２００００Ｄａの間の分子量を有するスチレンおよびマレイン酸の共重合体を提供することを含むことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
高分子集合体を精製することを、さらに含むことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の、生成可能な高分子集合体。
【請求項１２】
スチレン対マレイン酸の比率が１：２〜１０：１の間である、スチレンおよびマレイン酸の共重合体と、膜タンパク質と、関連した膜脂質とを含む高分子集合体。
【請求項１３】
スチレンおよびマレイン酸の共重合体が、２：１〜３：１の間のスチレン対マレイン酸の比率を有することを特徴とする請求項１２に記載の高分子集合体。
【請求項１４】
スチレンおよびマレイン酸の共重合体が、３０００Ｄａ〜１２００００Ｄａの間の分子量を有することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の高分子集合体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１２−５３２８５３（Ｐ２０１２−５３２８５３Ａ）
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１９０５４（Ｐ２０１２−５１９０５４）
【出願日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１３０９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００４１５８
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（３０５０３１５６７）ザ ユニバーシティ オブ バーミンガム (12)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月２０日（２０１２．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月８日（２０１０．７．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／００１３０９
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００４１５８
【国際公開日】平成２３年１月１３日（２０１１．１．１３）
【出願人】（３０５０３１５６７）ザ ユニバーシティ オブ バーミンガム (12)
【Ｆターム（参考）】
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