膜貫通抗体誘導型のアポトーシス阻害
細胞の自殺（アポトーシス）は病因と関係があり、例えばそれは、アルツハイマー病におけるニューロンの消失の主な原因である。カスパーゼ−３は、アポトーシスの経路と非常に関係がある。生細胞のアポトーシスを阻害するための努力において、超抗体（ＳＡＴ）−膜貫通技術を使用して、カスパーゼ酵素に対する抗体が生成されてきている。アポトーシス阻害剤として膜貫通抗体を使用する利点は、細胞中でのそれらの特異的な標的認識、及び従来のアポトーシス阻害剤と比較したそれらの低い毒性である。ＭＴＳ輸送ペプチド改変型モノクローナル抗カスパーゼ−３抗体は、生細胞のアクチノマイシンＤ誘導型アポトーシス及びスペクトリンの切断を減らすことが示されている。これらの結果は、膜輸送ペプチドと結合した抗体が、さまざまな疾患においてアポトーシスを阻害する治療的可能性を有することを示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は米国出願Ｎｏ．Ｘの一部継続出願であり、これは２００２年５月２９日に出願された国内段階の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１６６５１号であり、これは２００１年５月２９日に出願された米国特許出願第０９／８６５，２８１号の一部継続出願であり、これは１９９８年５月４日に出願された米国特許出願第０９／０７０，９０７号の一部継続出願、現在米国特許第６，２３８，６６７号である。本出願は、２００３年３月５日に出願された米国仮出願第６０／４５１，９８０号の特典も主張する。前述の特許及び特許出願のそれぞれの開示は、参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は完全な生物学的活性ペプチド及び抗体、又はそれらの断片を含む融合タンパク質に関する。具体的には、本発明の融合タンパク質は、抗体の分子認識と免疫賦活活性、膜輸送活性、及び同種親和活性などの生物学的活性を兼ね備えている。本発明はさらに、抗体の結合性を有し、生物学的活性があるペプチドの立体配座の柔軟性を制約しその生物学的標的に関する親和性を増大させるための、ループ形成配列又は他の立体配座を与える配列の側面に位置する生物学的活性があるペプチド配列を含む、融合タンパク質に関する。本発明は、プログラムされた細胞死、即ちアポトーシスの阻害における、抗体及びその結合体の使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
抗体は疾患と闘うための「特効薬」として称賛されている。しかしながら、抗体に関してなされた期待が、決して完全に実現されているわけではない。これは部分的には、抗体は免疫防御のわずか一部分であり、Ｔ細胞が免疫防御において他の戦略を与えるという事実によるものである。しかしながら、抗体は理想的な標的及び送達デバイスである。抗体は血液中での長期の生存に適合しており、血管及び組織浸透を助ける部位を有し、先天性免疫の幾つかの防御機構と機能的に関連がある。１つのこのような機構は補体系であり、これは病原体の破壊を手助けし、免疫応答の調節と関係がある。例えば補体断片Ｃ３ｄは、エプスタイン−バーウイルス用の結合部位でもある、Ｂ細胞上のＣＲ２受容体と結合する。エプスタイン−バーウイルスとＣＲ２が結合することによって、Ｂ細胞が活性化される。蓄積された証拠によって、ＣＲ２受容体（ＣＤ１９／Ｃｄ２０／ＣＤ８１複合体）は免疫賦活的役割を有し、Ｃ３ｄによって活性化されることが示されている。
【０００４】
多くの治療用途に、モノクローナル抗体が開発されてきている。例えば、モノクローナル抗体によって現在標的化されている疾患には、心臓病、癌、神経異常及び自己免疫性疾患がある。ほぼ全てのこれらの現在の治療用途は、特定のモノクローナル抗体、薬剤ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ及びＲＩＴＵＸＡＮなどの固有の治療有効性に頼るものである。大部分のモノクローナル抗体はこのような固有の治療活性を示さないので、タンパク質毒素又はそのサブユニットなどのさまざまな異なる毒性物質、癌の化学療法治療において現在使用されている薬剤、許容できないほど高い毒性のために臨床開発が進まなかった薬剤、又は放射性同位体を結合することによって、治療特性を加えることに開発は焦点を置いている。
【０００５】
このような結合体を有効にするために、このような毒性物質を送達するモノクローナル抗体は、その標的抗原と結合し、細胞中に内在化して毒性物質を内部に運ぶことができなければならず、内部では毒性物質は、標的細胞のＤＮＡの損傷或いはタンパク質合成又は他の代謝機能の阻害において有効である可能性がある。本来このような性質、非常に強力な免疫複合体を生み出す性質を示す抗体はわずかしかない。このように、スクリーニングアッセイが開発されてこのような抗体が試験されているが、この性質と適切な標的特異性を兼ね備える抗体はわずかしか同定されていない。
【０００６】
抗体中への内在化能力を浸透させるための、他の手法が存在している。活性サブユニットと細胞結合サブユニットを兼ね備える完全なタンパク質毒素は、抗体との結合時に内在化を増大させるのに有効であるが、抗体の選択性を低下させ、それによって潜在的な毒性をもたらすことが多い。親油性薬剤も内在化の増大及び結合形での細胞内送達のために使用されてきているが、毒素と同様に結合体の選択性を低下させる。他の方法が透過性を上昇させるために使用されてきており、或いはマイクロインジェクションによって細胞中へのより良い進入が可能となる。これらの方法はいずれも重大な欠点を有する。例えばサポニン、細菌毒素、リン酸カルシウム、エレクトロポレーションなどによる細胞の透過性の上昇は、ｅｘ ｖｉｖｏの方法用にのみ実際に使用することができ、これらの方法は細胞に対する障害を引き起こす。マイクロインジェクションは非常に熟練した技術者を必要とし（したがってその使用は研究室での設定に限られる）、マイクロインジェクションは細胞に物理的に障害を与え、限られた適用のみを有する。何故なら、マイクロインジェクションを使用して例えば細胞の塊又は完全な組織を治療することはできず、多数の細胞を実際に注射することはできないからである。
【０００７】
抗体を使用して免疫応答を増大させることができる方法の他の例は、Ｚａｎｅｔｔｉ及びＢｏｎａの研究（Ｚａｎｅｔｔｉ，Ｍ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５５：４６６〜４７７、１９９２；Ｚａｇｈｏｕａｎｉ Ｈ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｓ．Ａ．、Ｓｐｅｒｂｅｅｒ Ｋ．Ｅ．、Ｄａｉａｎ Ｃ．Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｒ．Ｃ．、Ｍａｙｅｒ Ｌ．及びＢｏｎａ Ｃ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ、９２：６３１〜６３５、１９９５）によって実証されている。これらの筆者は、分子生物学の方法を使用して、Ｉｇ重鎖のＣＤＲ３配列をＴ細胞及びＢ細胞抗原（エピトープ）に似た配列に置き換え、これらの改変型抗体が挿入されたものに特異的な強い免疫応答を誘導することを示している。
【０００８】
抗体の生物学的性質は、抗原の全体的なアビディティー、並びに細胞膜及び核膜を浸透する能力を高めることができる。ペンタマーＩｇＭ抗体中でのように抗体の結合価を増大させることによって、抗原の結合を高める。結合価及びアビディティーは、自己結合性又は同型である幾つかの抗体においても増大する（Ｋａｎｇ，Ｃ．Ｙ．、Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．Ｌ．、Ｒｕｄｉｋｏｆｆ，Ｓ．及びＫｏｈｌｅｒ，Ｈ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：１３３２、１９８７；Ｘｉｙｕｎ，Ａ．Ｎ．、Ｅｖａｎｓ，Ｓ．Ｖ．、Ｋａｍｉｎｋｉ，Ｍ．Ｊ．、Ｆｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｆ．Ｄ．、Ｒｅｓｉｆｅｌｄ，Ｒ．Ａ．、Ｎｏｕｇｈｔｏｎ，Ａ．Ｎ．及びＣｈａｐｍａｎ，Ｐ．Ｂ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：１５８２〜１５８８、１９９６）。自己結合を阻害した、重鎖可変領域中のペプチドが同定された（Ｋａｎｇ，Ｃ．Ｙ．Ｂｒｕｎｃｋ，Ｔ．Ｋ．、Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ，Ｔ．、Ｂｌａｌｏｃｋ，Ｊ．Ｅ．及びＫｏｈｌｅｒ，Ｈ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０３４〜１０３６、１９８８）。自己結合性ペプチド配列を抗体中に挿入することによって自己結合の性質を与え、抗原に関する結合価及び全体的なアビディティーを増大させる。
【０００９】
同様に、Ｒｏｊａｓ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：３７０〜３７５（１９９８）によって実証されたように、シグナルペプチドを抗体に加えることによって膜輸送が容易になる。Ｒｏｊａｓ他は１２量体ペプチドを含む融合タンパク質を作製しており、このタンパク質が細胞膜浸透性を有することを示している。
【００１０】
共通の疎水性モチーフを表すシグナルペプチド配列は、推定上のタンパク質チャンネルを介した哺乳動物小胞体（ＥＲ）及び原核生物原形質膜を通過する、大部分の細胞内分泌タンパク質の移動を仲介する。主要なモデルは、幾つかの膜タンパク質によって形成される親水性タンパク質チャンネルを介して膜を越えて、タンパク質が輸送されることを示す。真核生物では、細胞質中で新たに合成されるタンパク質は、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）及びそのＥＲ膜受容体により一般に認識されるシグナル配列によってＥＲ膜に向けられる。この標的化ステップに、ＥＲ膜を通過する、及び推定上のタンパク質チャンネルを介した細胞からのタンパク質の実際の移動が続く。シグナルペプチドは脂質と強く相互作用することもでき、細胞膜を通過する幾つかの分泌タンパク質の輸送は、タンパク質チャンネルの不在下で、脂質二重層を介して直接起こる可能性があるという提案が支持される。このようなシグナルペプチドを使用して、抗体又は他の生物学的活性がある分子の細胞への内在化を増大させることができ、これらは幾つかの特許（米国特許第５，８０７，７４６号、第６，０４３，３３９号及び第６，２３８，６６７号）の主題である。
【００１１】
毒素、薬剤及びサイトカインなどの幾つかの生物学的活性がある分子用の送達デバイスとして、抗体が使用されてきている。より優れた組織浸透性及び低い「粘性」のために、しばしば抗体の断片、Ｆａｂ又はｓｃＦｖが好ましい。
【００１２】
ペプチドなどの分子と抗体分子を結合させるために、２つの実際的な方法が存在する。１つの方法は化学的架橋を使用することであり、米国特許第０９／０７０，９０７号中に記載された親和性架橋法などである。他の方法は、抗体及びペプチドをコードするＤＮＡを含む融合遺伝子を設計すること、並びにその融合遺伝子を発現させることであり、この方法は本出願の主題である。
【００１３】
抗体融合タンパク質は典型的には、大きなタンパク質の遺伝子全体又はそのようなタンパク質の生物学的機能を与えるドメインを用いて工学処理される。以前の小さなペプチド−抗体融合タンパク質は典型的には、抗体の精製又は特徴付けを容易にする目的で主に作製されていた。
【００１４】
融合タンパク質を作製する方法は、例えば以下の米国特許中に記載されており、これらの関連する開示は参照として本明細書に組み込まれる：Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ他への米国特許第５，５６３，０４６号；Ｆｅｌｌ、Ｊｒ．への米国特許第５，６４５，８３５号；Ｍｕｒｐｈｙへの米国特許第５，６６８，２２５号；Ｎｅｍａｚｅｅへの米国特許第５，６９８，６７９号；Ｗｈｉｔｌｏｗ他への米国特許第５，７６３，７３３号；Ｑｕｅｒｔｅｒｍｏｕｓ他への米国特許第５，８１１，２６５号；Ｃｈａｎｇ他への米国特許第５，９０８，６２６号；Ｂｏｎａ他への米国特許第５，９６９，１０９号；Ｅｐｓｔｅｉｎ他への米国特許第６，００８，３１９号；Ｓｅｅｄへの米国特許第６，１１７，６５６号；Ｗｈｉｔｌｏｗ他への米国特許第６，１２１，４２４号；Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ他への米国特許第６，１３２，９９２号；Ｈｕｓｔｏｎ他への米国特許第６，２０７，８０４号；及びＳｅｇａｌへの米国特許第６，２２４，８７０号。Ｉｇ融合タンパク質を作製する方法は、例えば「抗体の工学処理（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、第２版：Ｃａｒｌ Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）中、及び「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：研究室マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９中に記載されており、これらの関連する開示は参照として本明細書に組み込まれる。
【００１５】
サイトカインなどのタンパク質、毒素、酵素などの活性ドメインを主に含んでいる免疫グロブリンとの融合タンパク質、ＣＤＲ（相補性決定領域）を含む免疫グロブリンの標的ドメイン、並びに抗原結合とは直接関与しないが二次的な相互作用によって高い結合親和性を与えることができる他の可変領域及びドメインとの融合タンパク質を含めた融合タンパク質は、例えば参照として本明細書に組み込まれている以下の刊行物中に記載されている：
Ｇｕｏ Ｌ；Ｗａｎｇ Ｊ；Ｑｉａｎ Ｓ；Ｙａｎ Ｘ；Ｃｈｅｎ Ｒ；Ｍｅｎｇ Ｇ、「タンパク質分解に耐性がある単鎖Ｆｖ−アスパラギナーゼ融合タンパク質の構築及び構造モデル化（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、２０００年１１月２０日；７０（４）：４５６〜６３；
Ｍｕｌｌｅｒ ＢＨ；Ｃｈｅｖｒｉｅｒ Ｄ；Ｂｏｕｌａｉｎ ＪＣ；Ｇｕｅｓｄｏｎ ＪＬ「分子ハイブリダイゼーションの１ステップの免疫検出法用の組換え単鎖Ｆｖ抗体断片−アルカリホスファターゼ結合体（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ−ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｏｒ ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９９年７月３０日；２２７（１〜２）：１７７〜８５；
Ｇｒｉｅｐ ＲＡ；ｖａｎ Ｔｗｉｓｋ Ｃ；Ｋｅｒｓｃｈｂａｕｍｅｒ ＲＪ；Ｈａｒｐｅｒ Ｋ；Ｔｏｒｒａｎｃｅ Ｌ；Ｈｉｍｍｌｅｒ Ｇ；ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｌｆ ＪＭ；Ｓｃｈｏｔｓ「ｐＳＫＡＰ／Ｓ：単鎖Ｆｖアルカリホスファターゼ融合タンパク質の生成用の発現ベクター（ｐＳＫＡＰ／Ｓ：Ａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１９９９年６月１６日（１）：６３〜９；
Ｖａｌｌｅｒａ ＤＡ；Ｐａｎｏｓｋａｌｔｓｉｓ−Ｍｏｒｔａｒｉ Ａ；１Ｃ；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ Ｓ；Ｅｉｄｅ ＣＲ；Ｋｒｅｉｔｍａｎ ＲＪ；Ｎｉｃｈｏｌｌｓ ＰＪ；Ｐｅｎｎｅｌｌ Ｃ；Ｂｌａｚａｒ ＢＲ「ＤＴ３９０抗ＣＤ３ｓＦｖ、Ｔ細胞受容体のＣＤ３ε部分を特異的に標的化する単鎖Ｆｖ融合免疫毒素の抗移植片対宿主疾患に対する影響（Ａｎｔｉ−ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＤＴ３９０−ａｎｔｉ−ＣＤ３ｓＦｖ，ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｆｕｓｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＣＤ３ ｅｐｓｉｌｏｎ ｍｏｉｅｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」Ｂｌｏｏｄ １９９６年９月１５日；８８（６）：２３４２〜５３；
Ｇｕｐｔａ Ｓ；Ｅａｓｔｍａｎ Ｊ；Ｓｉｌｓｋｉ Ｃ；Ｆｅｒｋｏｌ Ｔ；Ｄａｖｉｓ ＰＢ「単鎖Ｆｖ：受容体仲介の遺伝子送達におけるリガンド（Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ：ａ ｌｉｇａｎｄ ｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００１年４月；８（８）：５８６〜９２；及び
Ｇｏｅｌ Ａ；Ｃｏｌｃｈｅｒ Ｄ；Ｋｏｏ ＪＳ；Ｂｏｏｔｈ ＢＪ；Ｐａｖｌｉｎｋｏｖａ Ｇ；Ｂａｔｒａ「ヘキサヒスチジンタグの相対的な位置は、腫瘍関連単鎖Ｆｖ構築体の結合性に影響を与える。（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ．）」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２０００年９月１日；１５２３（１）：１３〜２０。
【００１６】
生物学的活性を有するように設計された融合タンパク質は、完全な生物学的活性があるタンパク質由来の鎖状ペプチド配列を使用して構築することができる。しかしながら、このようなペプチドは典型的には、完全なタンパク質より低い親和性を有する。ペプチドの融合タンパク質中への取り込みは、完全な機能性タンパク質の取り込みほど厄介ではないので、完全長タンパク質と同等に優れた結合親和性を有するペプチドを含む融合タンパク質が必要とされている。
【００１７】
本発明は、アポトーシスの阻害における抗体及びその断片の使用にも関する。細胞の自殺（アポトーシス）は、細胞分化、器官発生及び損傷細胞の除去中に、生きている生物によって有益に使用される機構である。しかしながらアポトーシスは、ある形態の病原形成と関係がある可能性もある。例えばアポトーシスは、アルツハイマー病におけるニューロンの消失及び心筋梗塞中の組織の消失の主な原因である。さらに、ＨＩＶ−１感染した個体由来のＴリンパ球は、同じ条件下で培養した非感染Ｔ細胞と比較して、刺激の不在下で自発的アポトーシスを経る。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の「自発的アポトーシス」は、ＨＩＶ−１関連、抗イディオタイプ抗体のｉｎ−ｖｉｔｒｏ添加によって加速されることが示されてきている。
【００１８】
カスパーゼ酵素、例えばカスパーゼ−３は、アポトーシスの経路と非常に関係がある。アポトーシスを阻害するための試みにおいて、カスパーゼ作用を阻害するための幾つかの物質及び方法が提案されてきている。例えば、米国特許第６，５６６，３３８号（Ｗｅｂｅｒ他）は、化学療法及び放射線療法中に非癌細胞死を治療、改善、及び予防するため、並びに癌の化学療法及び放射線療法の副作用を治療及び改善するために、カスパーゼ阻害剤を一般的に使用することを提案している。米国特許第６，５９６，６９３号（Ｋｅａｎａ他）は、幾つかのジペプチドがアポトーシスの強力な阻害剤である可能性があることを報告している。米国特許第６，６８９，７８４号（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ他）及び第６，６２０，７８２号（Ｃａｉ他）は、アポトーシスの阻害剤として、あるクラスのカルバメート及び置換２−アミノベンズアミドをそれぞれ提案している。さらに、米国特許第６，４２６，４１３号（Ｗａｎｎａｍａｋｅｒ他）は、インターロイキン−１β−転換酵素阻害剤と呼ばれるクラスのカスパーゼ阻害剤の代表的な提案である。さらに、米国特許第６，２２８，６０３号（Ｒｅｅｄ他）は、アポトーシスの阻害剤とカスパーゼ−３又はカスパーゼ−７などのカスパーゼの特異的結合を変える物質を同定するための、スクリーニングアッセイを提案している。
【００１９】
カスパーゼ酵素を阻害するためのさらに他の新規な手法は、いわゆる「超抗体技術（ＳＡＴ）」の使用に関する。例えば、「生物学的活性があるペプチドと抗体の融合タンパク質（Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という表題の、国際公開第０２／０９７０４１号を参照のこと（Ｉｍｍｐｈｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．及びＩｎｎｅｘｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに同時譲渡）。ＳＡＴの１つの提案されている適用例は、カスパーゼ酵素に対する抗体を使用して、生細胞のアポトーシスを阻害することである。例えば、本発明の一態様は、アポトーシスと関与する酵素に免疫特異的な抗体又は抗体断片の細胞内送達を企図するものである。アポトーシス阻害剤としての膜貫通抗体の幾つかの予想される利点は、細胞中でのそれらの特異的な標的認識、及び従来のアポトーシス阻害剤と比較したそれらの低い毒性である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、治療的効果のためにこのような膜浸透性抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、ペプチドドメインの生物学的活性が免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される、抗体ドメイン及びペプチドドメインを含む融合タンパク質を提供する。取り込まれるペプチドが抗体の抗原認識を低下させないように、ペプチドは抗体上の部位と共有結合している。本発明では、このことは、抗体をコードする核酸配列及びペプチドをコードする核酸配列を含む融合遺伝子を作製するステップであって、ペプチドをコードする核酸配列が抗体をコードする核酸配列内の、融合が発現されると、その結果作製された融合タンパク質は抗体及びペプチドを含み、ペプチドが抗体の抗原結合を害さない部位において抗体と結合する部位に位置するステップ、及び融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を作製するステップを含む方法によって実施する。詳細には、融合タンパク質は、抗体をコードする遺伝子を提供するステップであって、遺伝子は突然変異して制限部位を含んでおり、制限部位は抗体の抗原結合部位をコードする遺伝子のいかなる部分からも離れて位置しているステップと、免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される生物学的活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ配列を、抗体をコードする遺伝子の制限部位に挿入して融合遺伝子を作製するステップであって、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、それが抗体をコードする遺伝子とインフレームになるように挿入するステップと、及び融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を作製するステップによって作製することができる。
【００２２】
ペプチドの生物学的活性を増大させるために、ループ形成配列又は立体配座を与える配列の側面にペプチドを置くことができる。
【００２３】
本発明は、免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される生物学的活性を有するペプチドと抗体の融合タンパク質を含む、組成物及び医薬組成物も提供する。
【００２４】
生物学的活性があるペプチドと抗体の融合タンパク質を作製する本発明は、自己結合を含み、リンパ球を刺激し、生物膜を通過する輸送を可能にするペプチドを含む。
【００２５】
本発明の他の態様は、正常細胞又は感染細胞中の細胞機能を調節するための新規な化合物及び方法に関するものである。特に、このような化合物及び方法は、膜輸送ペプチドと結合した抗体又はその抗体断片の使用を伴う。抗体又はその断片は、好ましくは（ａ）カスパーゼ、キナーゼ、及びホスファターゼなどの細胞内のシグナルタンパク質、（ｂ）細胞内で構築される前の未成熟ウイルスタンパク質、（ｃ）細胞表面抗原又は細胞内腫瘍抗原、（ｄ）ＤＮＡ合成及び遺伝子発現の調節に関与する核タンパク質又は核小体タンパク質、又は（ｅ）細胞増殖又は細胞分裂停止に関与する細胞骨格タンパク質などのタンパク質標的に免疫特異的である、すなわち抗体又はその断片は、これらを認識し高い親和性で特異的に結合する。ポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用することができる。
【００２６】
本発明の好ましい態様では、前述の化合物はアポトーシスを阻害するのに有効であり、膜輸送ペプチドと結合した抗カスパーゼ抗体又はその断片を含む。特に好ましい抗体は抗カスパーゼ−３抗体である。
【００２７】
本発明の第二の好ましい態様では、前述の膜輸送ペプチドは転座配列（ＭＴＳ）ペプチド、例えばカポジ肉腫の線維芽細胞成長因子、ＨＩＶ−１のＴＡＴペプチド、アンテナペディアホメオドメイン由来ペプチド、ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２、又は輸送ペプチドに内在するペプチドなどである。特に好ましいＭＴＳペプチドは、アミノ酸残基配列ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号９）、ペプチド配列ＫＧＥＧＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＧ（配列番号８）などを含む。
【００２８】
ヒト細胞中のアポトーシスを阻害するのに有効である医薬組成物であって、したがってヒト疾患を治療するのに有効であるとして示され、膜輸送ペプチド、例えばＭＴＳペプチドと結合した抗カスパーゼ抗体又はその断片を含む医薬組成物も企図される。本発明の抗体−ペプチド結合体は、抗体又は抗体断片の細胞中への内在化を引き起こすことができる。
【００２９】
本発明の他の態様では、疾患を治療又は予防する方法は、膜輸送ペプチド又はその断片と結合した抗カスパーゼ抗体又はその断片を含む医薬組成物を薬理学的に有効な量、必要とする患者に投与することを含む。詳細に示すのは、化学的に誘導されるアポトーシスを減らす、膜輸送ペプチドと結合した改変型抗カスパーゼ抗体である。これらの結果は、このような抗体は、アルツハイマー病、ハンチングトン病、又はパーキンソン病などのさまざまな疾患においてアポトーシスを阻害するための治療的可能性を有することを示唆している。
【００３０】
本発明の前述の目的及び他の目的は、本発明の好ましい実施形態のみを示し記載する以下の詳細な説明及び図面から、当業者には容易に明らかとなるであろう。容易に理解されるように、本発明は、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、関連分野の技術内で変更形態が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される生物学的活性を有するペプチドと抗体の融合タンパク質を作製する方法を記載する。
【００３２】
特に本発明は、取り込まれたペプチドが抗体の抗原認識を害さないように、ペプチドが抗体中の部位に位置する、免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される生物学的活性を有するペプチドと抗体を含む融合タンパク質を提供する。本発明では、このことを、抗体をコードする核酸配列及びペプチドをコードする核酸配列を含む融合遺伝子を作製するステップであって、ペプチドをコードする核酸配列が抗体をコードする核酸配列内の、融合が発現すると、その結果作製された融合タンパク質は抗体及びペプチドを含み、ペプチドが抗体の抗原結合を害さない部位において抗体と結合する部位に位置するステップ、及び融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を作製するステップを含む方法によって実施する。詳細には、融合タンパク質は、抗体をコードする遺伝子を提供するステップであって、遺伝子は突然変異して制限部位を含んでおり、制限部位は抗体の抗原結合部位をコードする遺伝子のいかなる部分からも離れて位置しているステップと、免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される生物学的活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ配列を、抗体をコードする遺伝子の制限部位に挿入して融合遺伝子を作製するステップであって、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、それが抗体をコードする遺伝子とインフレームになるように挿入するステップ、及び融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を作製するステップによって作製することができる。
【００３３】
本発明の他の実施形態では、生物学的活性を有するペプチドは、抗体のＣ末端と結合することができる。本発明の他の実施形態では、ペプチドの生物学的活性を増大させるために、ループ形成配列又は立体配座を与える配列の側面にペプチドを置くことができる。
【００３４】
本明細書で使用する、用語「標的部分」は、抗原結合部位を含む任意の天然又は合成タンパク質分子を指す。この用語は、完全長免疫グロブリン分子又は任意の機能的断片、完全長免疫グロブリン分子の可変ドメイン断片など、ＣＤＲ領域、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、或いは改変抗体擬似体又は単鎖ドメイン結合部分を含む。個々の標的部分は、膜構造上の細胞受容体などの所望の標的、例えばタンパク質、糖タンパク質、多糖又は炭水化物に従い選択する。標的部分を選択して、正常細胞又は腫瘍細胞上の細胞受容体と結合させることができる。
【００３５】
同様に、生物学的活性を有するペプチドは、融合タンパク質の所望の機能に従い、或いは言い換えれば、標的部分が正常細胞又は腫瘍細胞などの標的に結合した後の所望の結果に従い選択する。望ましい可能性があると考えられる生物学的活性には、免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性がある。
【００３６】
ループ形成配列又は立体配座を制約する配列は、生物学的活性を有するペプチドのいずれかの側に置くとペプチドの立体配座の柔軟性を抑制する任意のアミノ酸配列であってよい。例には、架橋してループを形成することができる、システイン対などのアミノ酸残基を含む配列がある。立体配座を制約するタンパク質の具体例はチオレドキシンである。立体配座を制約する部分又はループ形成部分の例は、例えば以下の米国特許：Ｂｒｅｎｔへの米国特許第６，２４２，１６３号及び第６，００４，７４６号、米国特許第６，２５８，５５０号；第６，１４７，１８９号；第６，１１１，０６９号；第６，１００，０４４号；第６，０８４，０６６号；第５，９５２，４６５号；第５，９４８，８８７号；及びＢｒｅｎｔ他への第５，９２８，８９６号、Ｄｏｖｅ他への米国特許第６，２００，７５９号及び第５，９２５，５２３号中、及び以下の刊行物中に見ることができる：
Ｆａｉｒｌｉｅ ＤＰ；Ｗｅｓｔ ＭＬ；Ｗｏｎｇ ＡＫ「タンパク質表面に対する擬似体（Ｔｏｗａｒｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １９９８年２月；５（１）：２９〜６２；
Ｖａｌｅｒｏ ＭＬ；Ｃａｍａｒｅｒｏ ＪＡ；Ｈａａｃｋ Ｔ；Ｍａｔｅｕ ＭＧ；Ｄｏｍｉｎｇｏ Ｅ；Ｇｉｒａｌｔ Ｅ；Ａｎｄｒｅｕ Ｄ「ウイルス抗原部位の原型に似た環状ペプチドモデル：剛性と柔軟性の間のバランスの発見（Ｎａｔｉｖｅ−ｌｉｋｅ ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ａ ｖｉｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｉｔｅ：ｆｉｎｄｉｎｇ ａ ｂａｌａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｉｇｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）」Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ ２０００年１〜２月；１３（１）：５〜１３；
Ｇｕｒｕｒａｊａ ＴＬ；Ｎａｒａｓｉｍｈａｍｕｒｔｈｙ Ｓ；Ｐａｙａｎ ＤＧ；「ペプチドの非共有的制約用の新規な人造のループ状足場構造（Ａ ｎｏｖｅｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｌｏｏｐ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０００年７月；７（７）：５１５〜２７；
Ｖｅｎｋａｔｅｓｈ Ｎ；ｉｍ ＳＨ；Ｂａｌａｓｓ Ｍ；Ｆｕｃｈｓ Ｓ；Ｋａｔｃｈａｌｓｋｉ−Ｋａｔｚｉｒ Ｅ「ファージライブラリー由来の環状ペプチドによる、受動的に伝播する実験的自己免疫性重症筋無力症の予防（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｓｓｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ ｂｙ ａ ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００年１月１８日；９７（２）：７６１〜６；
Ｓｔｏｔｔ Ｋ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ＪＭ；Ｂｕｔｌｅｒ ＰＪ；Ｐｅｒｕｔｚ Ｍ「グルタミン反復配列の取り込みによってタンパク質はオリゴマー化する：神経変性疾患との関係（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｒｅｐｅａｔｓ ｍａｋｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９５年７月３日；
前述の刊行物はいずれも、参照として本明細書に組み込まれる。
【００３７】
立体配座を制約する配列は、αヘリックス又はβプリーツシートを形成する配列も含むことができる。例えば、参照として本明細書に組み込まれる以下の刊行物を参照のこと：
Ｌｅｅ ＫＨ；Ｂｅｎｓｏｎ ＤＲ；Ｋｕｃｚｅｒａ Ｋ「合成ペプチドの分子の動的シミュレーションにおいて観察された、αヘリックスからｐｉヘリックスへの変化（Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ａｌｐｈａ ｔｏ ｐｉ ｈｅｌｉｘ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０００年１１月１４日；３９（４５）：１３７３７〜４７；
Ｄｅｔｔｉｎ Ｍ；Ｒｏｎｃｏｎ Ｒ；Ｓｉｍｏｎｅｔｔｉ Ｍ；Ｔｏｒｉｎｅｎｅ Ｓ；Ｆａｌｃｉｇｎｏ Ｌ；Ｐａｏｌｉｌｌｏ Ｌ；Ｄｉ Ｂｅｌｌｏ Ｃ「ＨＩＶ−１感染性を特異的に増大させるｇｐ１２０由来合成ペプチドの合成、特徴付け及び立体配座の分析（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｐ１２０−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｅｎｈａｎｃｅ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ．）」Ｊ Ｐｅｐｔ、Ｓｃｉ １９９７年１〜２月；３（１）：１５〜３０；
Ｃｈａｖａｌｉ ＧＢ；Ｎａｇｐａｌ Ｓ；Ｍａｊｕｍｄａｒ ＳＳ；Ｓｉｎｇｈ Ｏ；Ｓａｌｕｎｋｅ ＤＭ「ＧｎＲＨ結合ペプチド中のヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフは、プロラクチン分泌の負の調節に重要である（Ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ＧｎＲＨ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）」Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９７年１０月１０日；２７２（５）：７３１〜４０；及び
Ｍｉｃｅｌｉ Ｒ；Ｍｙｓｚｋａ Ｄ；Ｍａｏ ＬＩ；Ｓａｔｈｅ Ｇ；Ｃｈａｉｋｅｎ Ｉ「示される足場としてのコイルドコイルステムループ状ミニタンパク質（Ｔｈｅ ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ ｓｔｅｍ ｌｏｏｐ ｍｉｎｉｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ）」Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｉｓｃｏｖ．、１９９６年４月；１３（３〜４）：９５〜１０５。
【００３８】
Ｉｇ融合タンパク質の発現。Ｉｇ融合タンパク質は、特異性及び／又は抗体エフェクター機能を組み合わせた抗体と独特の性質に貢献する分子の接合という利点を有する。このタンパク質ファミリーを生成する能力は、ｃ−ｍｙｃを抗体分子のＦｃに置換したときに最初に実証されたが（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ Ｍ Ｓ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｇ Ｔ及びＦｏｘ Ｒ Ｏ．、Ｎａｔｕｒｅ、１２５：６０４、１９８４）、多くの例が現在存在している。Ａｂ融合タンパク質は、幾つかの異なる方法で得ることができる。１つの手法では、非Ｉｇ配列を可変領域に置換し；Ｖ領域が置換された分子によって、エフェクター機能などの性質に貢献する抗体を標的化する特異性、及び改善された薬物動態が与えられる。例にはＩＬ−２及びＣＤ４がある。或いは非Ｉｇ配列を定常領域に置換するか、或いはこれと結合させることができる。生成する分子は本来の抗体の結合特異性を保持しているが、結合するタンパク質から特性を得る。置換の位置に応じて、異なる抗体関連のエフェクター機能及び生物学的性質が保持されるであろう。例えば、「抗体の工学処理（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、第２版：Ｃａｒｌ Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）を参照のこと。
【００３９】
ＩｇＧ融合タンパク質を構築するためのベクター。一連のベクターが現在生成されており、これによって抗体分子内での異なる位置でのタンパク質の融合が可能であり、したがって異なる性質を有する融合タンパク質の構築が容易になる。これらのベクターを使用して、分子量、価電子が異なり、異なるサブセットの抗体分子の機能性を有する分子との融合タンパク質ファミリーを生成することができる。
【００４０】
融合遺伝子の構築を容易にする方法の具体例として、部位特異的突然変異導入法を使用して、ヒトＩｇＧ３重鎖遺伝子中に独特の制限酵素部位を作製した。この特定の例では、ＣＨ１エクソンの３’端、ＣＨ２エクソンの５’端のヒンジの直後、及びＣＨ３エクソンの３’端に、制限部位を生成した。このようにして生成した制限部位は、ＴｔｇＧＴｇをＴａｃＧＴａに置換したことによるＣＨ１の末端のＳｎａＢＩ、ＣＡｃＣＴＧをＣＡｇＣＴＧに置換したことによるＣＨ２の最初の部分のＰｖｕＩＩ、及びＡＡＴｇａｇをＡＡＴａｔｔに置換したことによるＣＨ３の端のＳｓｐＩであった。これらの操作によって、これらの位置に独特の平滑末端クローニング部位が与えられた。いずれの場合も、切断後にＩｇがコドンの最初の塩基に貢献するように、制限部位が位置していた。６２アミノ酸の拡大したヒンジ領域を有するヒトＩｇＧ３を、免疫グロブリンとして使用するために選択する。存在するとき、このヒンジ領域は空間及び柔軟性を与え、これによって同時の抗原と受容体の結合を容易にするはずである。ＥｃｏＲＩ部位もＩｇＧ３遺伝子の３’端に導入して、３’クローニング部位及びポリＡ付加シグナルを与えた。成長因子と共に使用するために最初は設計したが、これらの制限部位を使用して、抗体中の明確な位置に任意の新規の配列を置くことができる。さらに、これらのクローニングカセットを使用して、可変領域を容易に変えることができる。同様の技法を使用して、他の抗体遺伝子中に適切な制限部位を作製することができる。
【００４１】
融合遺伝子の生成。融合タンパク質の生成中の第一ステップとして、平滑末端制限部位を所望の位置、融合させる遺伝子の５’端に導入しなければならない。正しい読み取り枠を保つために、切断後それが２塩基、コドンに貢献するように、部位が位置しなければならない。目的が完全な分子を有する融合タンパク質を作製することである場合、制限部位は通常、リーダー配列の後の位置などの、任意の翻訳後プロセシングの位置に導入する。或いは、目的がタンパク質の一部分のみを使用することである場合、平滑末端部位を遺伝子の任意の位置に導入することができるが、正しい読み取り枠を保つために注意を常に払わなければならない。さらに、融合タンパク質のカルボキシル末端の翻訳後プロセシングが存在する場合、このプロセシング部位に停止コドンを導入するのが望ましいことが多い。
【００４２】
融合タンパク質生成時の重大な関心は、全ての要素の生物学的活性を保つことである。抗体との融合タンパク質の生成は、抗体のドメイン構造によって容易になり、全てのクローニング部位は完全なドメインの直後に位置している。この形状では、免疫グロブリンの正しい折り畳みが保証されるはずである。結合タンパク質の折り畳みは、その構造及びその融合場所に依存する。構造情報が利用可能であるときはいつでも、結合タンパク質の構造の完全性を保つ位置で、融合体を生成することが望ましい。
【００４３】
機能分析に充分な量のタンパク質を生成するために、培地中にタンパク質を分泌させることが望ましい。今日までに報告されている例では、構築する融合タンパク質を構築し分泌させているが、他の融合タンパク質を設計するとき、これは依然関心事である。
【００４４】
重鎖又は軽鎖遺伝子の一部分として生物学的活性があるペプチドを含む、融合遺伝子を設計するための方法は、確立された抗体の工学処理プロトコル「抗体の工学処理（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、第２版：Ｃａｒｌ Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５、第９章、２６７〜２９３ページ）を使用することができる。Ｈ又はＬ鎖のＮ末端残基又はＣ末端残基に、ペプチドを融合させることができる。このような融合遺伝子の発現は、典型的には哺乳動物細胞系中で行われるが、例えば細菌又は酵母菌発現系などの、他の発現系を使用することができる。
【００４５】
本発明のペプチドは、免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される生物学的活性を有する。例には免疫賦活又は免疫調節活性がある。ペプチドは例えば、サイトカインのホルモン、リガンド、又は細胞受容体の本来のリガンドに由来する結合部位であってよい。好ましい実施形態では、ペプチドはＣ３ｄ領域１２１７〜１２３２に由来し、約１０〜約１６量体の範囲である。他の実施形態ではペプチドは、Ｃ３ｄ領域１２１７〜１２３２に由来する１６量体ペプチドである。
【００４６】
ペプチドは、完全長免疫グロブリン分子又は抗体の可変ドメイン断片である抗体と、結合することができる。本明細書で使用する、用語「抗体」は、抗原結合部位を含む重鎖又は軽鎖免疫グロブリン分子、或いはその任意の機能的組合せ又は断片を一般的に指す。抗体は、タンパク質、糖タンパク質、多糖又は炭水化物などの膜構造体上、及び正常細胞又は腫瘍細胞上の細胞受容体に特異的であることが好ましい。
【００４７】
抗体中に取り込ませる免疫賦活性要素として、Ｃ３ｄのリガンド部位由来のペプチドを使用することには、分子アジュバントとしての予想外の有用性がある。Ｄ．Ｆｅａｒｏｎ他によって（Ｄｅｍｐｓｅｙ，Ｐ．Ｗ．、Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｄ．、Ａｋｋａｒａｊｕ，Ｓ．、Ｇｏｏｄｎｏｗ，Ｃ．Ｃ、及びＦｅａｒｏｎ，Ｄ．Ｔ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７１：３４８、１９９６）、Ｃ３ｄは分子アジュバントとして、メンドリ卵リソザイム（ＨＥＬ）との完全な融合タンパク質の一部として使用されてきている。これらの筆者は、ＨＥＬ−Ｃ３ｄ融合タンパク質が、遊離ＨＥＬより１０，０００倍まで免疫原性が高いことを示している（国際特許公開、国際公開第９６／１７６２５号を参照のこと）。
【００４８】
我々の最新の動物実験では、Ｃ３ｄ断片由来のペプチドを使用し化学的架橋したイディオタイプワクチンを用いて、免疫原性の同様の増大が観察されている（以下の実施例を参照のこと）。Ｃ３ｄペプチドをイディオタイプ及び抗イディオタイプワクチンと結合させることは、これらのワクチンの免疫原性を増大させ、フロイントアジュバンドなどの強力なアジュバンドと組み合わせた、ＦＤＡによってヒトに関する使用には認められていない、ＫＬＨなどの担体分子の結合の必要性の代わりとなると考えられる。
【００４９】
他の実施形態では、ペプチドは位置１２１７〜１２３２のヒトＣ３ｄ残基と相同的なヒト又は非ヒトＣ３ｄ領域に由来してよく、約１０〜約１６量体の範囲である。抗体ワクチンに対する、親和性架橋した生物学的活性があるペプチドの他の適用例には、サイトカイン由来の活性ペプチドがある。例えば、ＩＬ１−βサイトカイン由来のナノペプチドが記載されており（Ａｎｔｏｎｉ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７：３２０１〜０４、１９８６）、これは望ましくない副作用を誘導しない免疫賦活性を有する。本発明に従い抗体中に挿入することができる活性ペプチドの他の例には、シグナルペプチド、及び抗体の自己結合部位由来のペプチドがある。
【００５０】
サイトカインのホルモン、リガンド、又は細胞受容体の本来のリガンド由来の結合部位などの、生物学的活性を有するさまざまなペプチドが知られている。
【００５１】
以下の実施例１〜３は、親和性架橋によって作製されるＣ３ｄ／抗体複合体に関するものであるが、これらを提供して抗体と結合したＣ３ｄペプチドによって与えられる免疫応答に対する影響を示す。
【実施例１】
【００５２】
抗イディオタイプワクチンの向上。３Ｈ１は、ネズミ抗イディオタイプ抗体であり（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ−Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４５：２７５８〜６５、１９９０）、これは癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を模倣している。３Ｈ１は、フロイントの完全アジュバント中でＫＬＨ結合ワクチンとして使用すると、抗ＣＥＡ抗体を動物中で誘導する。３Ｈ１は臨床第Ｉ相試験においても試験されており、この場合３Ｈ１は、治療した癌患者のほぼ半分でＣＥＡと結合する抗体を誘導する。しかしながら、部分的には低い免疫原性のために、臨床的応答はこの試験では観察されなかった（Ｆｏｏｎ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｓｔ．、９６：３３４〜３４２、１９９５）。
【００５３】
３Ｈ１ｍＡｂは、Ｃ３ｄ領域１２１７〜１２３２由来の１３量体ペプチド（配列番号１）と親和性架橋させた。アミノ酸配列はＣｄ３ペプチドに由来し、以下の配列：ＫＮＲＷＥＤＰＧＫＱＬＹＮＶＥＡ（配列番号１）を有する。
【００５４】
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２５μｇのＣ３ｄ−３Ｈ１をリン酸−生理食塩水溶液に溶かしたものを筋肉内に２回免疫処置した。最後の免疫処置の７日後、マウスを失血させ、８０１９（Ａｂ１イディオタイプ）、及びＣＥＡ発現腫瘍系ＬＳＩ７４Ｔとの結合に関して血清を試験した。ＦＡＣＳにより測定すると、Ｃ３ｄ−３Ｈ１免疫マウス由来の血清はＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞と結合するが、一方で対照血清（正常なマウスの血清）は、バックグラウンド蛍光のみを示した。Ｃ３ｄ−３Ｈ１で免疫処置したマウス由来の血清は、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧで発色させるサンドウィッチアッセイにおいて、ＬＳ１７４Ｔ細胞のＦＡＣＳで使用した。対照は正常なマウスの血清であった。分析した細胞数は、ｌｏｇ１０単位の相対的な蛍光強度に対してプロットした。
【実施例２】
【００５５】
さらに、３Ｈ１（２５マイクログラム、生理食塩水中）又は３Ｈ１−Ｃ３ｄ−ペプチド（親和性架橋、２５マイクログラム、生理食塩水中）で３回免疫処置したマウス由来の血清も、Ａｂ３応答性に関して試験した。マウスを出血させ、ＥＬＩＳＡにおいて３Ｈ１のＦ（ａｂ）との結合に関して血清を試験した。マウス血清の希釈物と３Ｈ１Ｆ（ａｂ）の結合を測定することによって、裸の３Ｈ１はＡｂ３抗体を誘導しないが、３Ｈ１−ペプチドは誘導し、親和性架橋した３Ｈ１は免疫原性を増大させたことを示した。
【００５６】
本発明を実施する際に使用することができる他のＣ３ｄペプチドには、その全容が参照として本明細書に組み込まれている、Ｌａｍｂｒｉｓ他、「補体の第三の成分、Ｃ３の系統発生（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ、Ｃ３）」中、Ｅｒｆｉ、Ａ ｅｄ．「補体の構造及び機能の新たな側面（Ｎｅｗ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、Ａｕｓｔｉｎ，Ｒ．Ｄ．Ｌａｎｄｅｓ Ｃｏ．、１９９４ ｐ．１５〜３４中に総説されたペプチドがある。
【実施例３】
【００５７】
マウス腫瘍イディオタイプワクチン（３８Ｃ１３）の増強。３８Ｃ１３は、３８Ｃ１３ Ｂ−リンパ腫腫瘍細胞系によって発現されるイディオタイプである。Ｌｅｖｙのグループは、このイディオタイプ腫瘍ワクチンモデルを開発してきており、ＫＬＨ結合３８Ｃ１３Ｉｄを用いた事前免疫処置によって、マウス中での３８Ｃ１３腫瘍細胞による攻撃に対して防御することができることを示している（Ｋａｍｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｓ．、Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．、Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｄ．Ｇ．及びＬｅｖｙ，Ｒ．、Ｊ．Ｌｎｎｉｕｎｏｌ．、１３８：１２８９、１９８７）。Ｌｅｖｙと同僚（Ｔａｏ，Ｍ−Ｈ．及びＬｅｖｙ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：７５５〜７５８、１９９３）は、キメラ遺伝子から作製され哺乳動物細胞培養物の発酵において発現される、融合タンパク質（ＣＳＦ−３８Ｃ１３）を使用する腫瘍防御の誘導も報告している。３８Ｃ１３Ｉｄタンパク質は、Ｃ３Ｄ領域１２１７〜１２３２由来の１６量体アジド−ペプチドと親和性架橋させた。
【００５８】
１０匹のマウスに、５０ｕｇのＣ３ｄ−３８Ｃ１３結合体をリン酸−生理食塩水溶液に溶かしたものを腹腔内に３回免疫処置した。３回目のワクチン接種の後、マウスを３８Ｃ１３腫瘍細胞で攻撃した。対照群は、この腫瘍モデル中で「ゴールドスタンダード」とみなされるＱＳ−２１に溶かした３８Ｃ１３−ＫＬＨ（アジュバント）をワクチン接種したマウス、及びＱＳ−２１のみを注射したマウスを含んでいた。Ｃ３ｄ−３８Ｃ１３結合体をワクチン接種した１０匹のマウス中７匹が、腫瘍攻撃後第３５日まで生存し、ＱＳ−２１に溶かしたＫＬＨ−３８Ｃ１３をワクチン接種したマウスも同様であった。全ての対照マウスにはＱＳ−２１のみを注射し、第２２日までに死亡した。
【００５９】
Ｃ３Ｈマウスを、ＱＳ−２１に溶かした３８Ｃ１３−ＫＬＨ、又はＱＳ−２１無しの３８Ｃ１３−Ｃ３ｄペプチドで３回免疫処置した（５０μｇ、腹膜内）。対照マウスにはＱＳ−２１のみを注射した。免疫処置マウス及び対照マウスは、次いで３８Ｃ１３腫瘍細胞で攻撃し、生存を調べた。
【００６０】
実施例１〜３に記載した結果は、免疫賦活性ペプチドと腫瘍抗イディオタイプ及びイディオタイプワクチン抗体の親和性による架橋によって、腫瘍に対する免疫応答を有意に増大させ、腫瘍攻撃に対して防御することができることを示す。Ｃ３ｄ架橋ワクチンを用いるワクチン接種プロトコルは、フロイントのアジュバントなどの任意のアジュバント、又はＫＬＨ結合体を含んでおらず、この両者はヒトにおける使用に関してはＦＤＡによって認められていない。
【００６１】
前の実施例で使用した手順の幾つかは知られており、Ｃ３ｄ（補体断片）の活性結合ペプチドはＬａｍｂｒｉｓ他、（ＰＮＡＳ、８２：４２３５〜３９、１９８５）によって記載されており、これはその全容が参照として本明細書に組み込まれている。
【００６２】
以下の追加的な実施例を与えて、融合タンパク質を作製する一般的な技法を実証し、免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される生物学的活性を有する特定のペプチドを示す。
【実施例４】
【００６３】
膜移動ペプチド（ＭＴＳ−ペプチド）を含む融合非Ｉｇタンパク質。例えば、Ｒｏｊａｓ、Ｍ，Ｄｏｎａｈｕｅ、Ｊ Ｐ，Ｔａｎ，Ｔ．及びＬｉｎ，Ｙ−Ｚ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６：３７０、「グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−ＭＴＳペプチド（ＧＳＴ−ＭＴＳ）発現プラスミドの構築（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ＭＴＳ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＳＴ−ＭＴＳ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ）」１９９８を参照のこと。
【００６４】
２つの異なるＧＳＴ−ＭＴＳ発現プラスミドを、生物学的用途に応じて、アミノ末端又はカルボキシル末端伸長部として疎水性ＭＴＳを有する、標的タンパク質又はタンパク質ドメインを生成することができるように構築した。プラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＴＳＩ及びｐＧＥＸ３Ｘ−ＭＴＳ２を構築するために、以下の相補的オリゴヌクレオチドを合成した：
【００６５】
アニーリング後、二本鎖ＭＴＳＩオリゴヌクレオチドとＭＴＳ２オリゴヌクレオチドを、ＢａｍＨＩで消化したｐＧＥＸ−３Ｘ中で連結させた（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．、「グルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合体として大腸菌中で発現されるポリペプチドの１ステップ精製（Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｓ ｆｕｓｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）」Ｇｅｎｅ、６７：３１、１９８８．）。ＤＮＡ配列分析によって、それぞれのプラスミドにおいて、ＭＴＳコード配列は正確であり、ＧＳＴコード配列とインフレームであったことを確認した。
【００６６】
ＧＳＴ−Ｇｒｂ２ＳＨ２、ＧＳＴ−Ｇｒｂ２ＳＨ２−ＭＴＳ、及びＧＳＴ−ＳｔａｔｌＳＨ２−ＭＴＳ発現プラスミドの構築。ヒトＧｒｂ２ＳＨ２ドメイン（アミノ酸残基５４〜１６４）（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．Ｊ．、Ｄａｌｙ，Ｒ．Ｊ．、Ｂａｔｚｅｒ，Ａ．Ｇ．、Ｕ，Ｗ．，Ｍａｒｇｏｌｉｓ，Ｂ．、Ｌａｍｍｅｒｓ，Ｒ他、「ＳＨ２及びＳＨ３ドメイン含有タンパク質Ｇｒｂ２は受容体チロシンキナーゼと結合してｒａｓシグナル化する（Ｔｈｅ ＳＨ２ ａｎｄ ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｒｂ２ ｌｉｎｋｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ ｔｏ ｒａｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）」、Ｃｅｌｌ、７０：４３１、１９９２）、又はヒトＳｔａｔｌＳＨ２ドメイン（残基５６７〜７１６）（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ，Ｃ．、Ｆｕ，Ｘ．−Ｙ、Ｉｍｐｎｏｔａ，Ｔ．、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．、及びＤａｒｎｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．Ｊｒ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：７８３６、１９９２）をコードするＤＮＡ断片を、Ｇｒｂ２のｃＤＮＡクローン又はＳｔａｔｌのｃＤＮＡクローンからＰＣＲにより合成した。それらの５’端にＢａｍＨＩ部位をそれぞれ含む、ＰＣＲ用に使用したプライマーは、以下のものであった：
【００６７】
ＰＣＲ産物はＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩで消化したｐＧＥＸ−３Ｘ又はｐＧＥＸ−３ＸＭＴＳ２中で連結させた。ベクター／挿入体接合部のＤＮＡ配列分析によって、ＧＳＴ−Ｇｒｂ２ＳＨ２、ＧＳＴ−Ｇｒｂ２ＳＨ２−ＭＴＳ、及びＧＳＴ−Ｓｔａｔ１ＳＨ２−ＭＴＳの翻訳読み取り枠が、それぞれの発現プラスミド中で保たれたことを確認した。
【００６８】
ＭＴＳ融合タンパク質の発現
ＧＳＴ融合タンパク質の発現及び精製。適切な発現プラスミド７４を含む大腸菌菌株ＤＨＳｏｒを、３７℃において１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢブロス中で増殖させた。ＧＳＴ融合タンパク質の発現は、イソプロピル、Ｂ−Ｄ−チオガラクトシド（０．５ｍＭの最終濃度）を加えることによって誘導し、３７℃でのインキュベーションを２〜３時間続けた。ＧＳＴ融合タンパク質は、グルタチオン−アガロース親和性クロマトグラフィーによって細菌細胞の溶解物から精製した（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．Ｇｅｎｅ、６７：３１、１９８８）、ただし超音波処理の後、グルタチオン−アガロースビーズと混合する前に、５分間２０００回転での遠心分離によって細胞溶解物を除去した。タンパク質調製物はＰＭＩＯ膜（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用する限外濾過によって濃縮し、すぐに使用するために４℃で、或いは長期の保存用に−７０℃で保存した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍにおいて分光光度計によって測定した。生物学的アッセイにおいてこれらを使用する直前に、知られている濃度の野生型ＧＳＴと比較したクーマシーブリリアントブルー染色強度を使用する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質濃度を確認した。ＧＳＴ−ＭＴＳタンパク質中のＭＴＳのアミノ酸含有量を確認するために、（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．、Ｇｅｎｅ６７：３１、１９８８）に記載されたのとほぼ同様に、プロテアーゼ因子Ｘａを用いてグルタチオン−アガロース結合ＧＳＴ−ＭＴＳＩから、ＭＴＳペプチドを切断した。切り離したＭＴＳ含有ペプチドはＣ逆相ＨＰＬＣによって精製し、（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．、Ｇｅｎｅ６７：３１、１９８８）に記載されたのと同様に、質量分光分析によって特徴付けした。切り離したＭＴＳ含有ペプチドはＣ１８逆相ＨＰＬＣによって精製し、（Ｌｉｎ，Ｙ−Ｚ．、Ｙａｏ，Ｓ．、Ｖｅａｃｈ，Ｒ．Ａ．、Ｔｏｒｇｅｒｓｏｎ，．Ｒ．、及びＨａｗｉｇｅｒ，Ｊ．、ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４２５５、１９９５）に記載されたのと同様に、質量分光分析によって特徴付けした。
【実施例５】
【００６９】
Ｃ３ｄ−ＨＥＬ融合タンパク質（Ｄｅｍｐｓｅｙ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７１：３４８、１９９６）。ＨＥＬ、Ｃ３ｄ（Ｈ．Ｄｏｍｄｅｙ他、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、７９：７６１９、１９８２）ｄｏｑプレ−プロ−インシュリンシグナル配列（Ｍ．Ｅ．Ｔａｙｌｏｒ及びＫ．Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２７４、５７５、１９９１）、及び（Ｇ４Ｓ）２連結基をコードする相補的ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させた。エピトープタグ及び停止コドンは、オリゴヌクレオチド連結基によってコードされていた。融合タンパク質カセットはタンデム：ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中で（Ｇ４Ｓ）２によって連結された、ｄｏｑプレ−プロ−インシュリンシグナル配列、ＨＥＬ、及び１〜３個のＣ３ｄのコピーで構築した。ＨＥＬ−Ｃ３ｄ３カセットは、Ａ７１ｄベクターにサブクローニングした。プラスミドｐＳＧ．ＨＥＬ、ｐＳＧ．ＨＥＬ．Ｃ３ｄ、及びｐＳＧ．ＨＥＬ．Ｃ３ｄ２を、ｐＳＶ２−ｎｅｏと共にＬ細胞及びＡ７１ｄにコトランスフェクトした。ＨＥＬ．Ｃ３ｄ３をＣＯＳ細胞中で一過的に発現させた。組換えタンパク質は、ＹＬ１／２抗体に関する親和性クロマトグラフィー（Ｈ．Ｓｋｉｎｎｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、６６：１４１６３、１９９１）、及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）での分画化によって精製した。
【００７０】
融合尾部は研究室規模で有用であり、経済的な回収法を使用して回収を高めるための能力を有し、これらは産業の下流プロセス用に容易にスケールアップされる。融合尾部を使用して標的タンパク質の分泌を促進することができ、酵素活性又は抗体結合に基づいて有用なアッセイタグを与えることもできる。多くの融合尾部は標的タンパク質の生物学的活性を害さず、幾つかの場合、それを安定化させることが示されてきている。それにもかかわらず、真正タンパク質の精製に関して、特異的に切断される部位が含まれることが多く、回収後に尾部の除去が可能になる。
【００７１】
組換えタンパク質を回収及び精製するための融合尾部。（例えば、Ｆｏｒｄ Ｃ．、Ｓｕｏｍｉｎｅｎ Ｉ．、Ｇｌａｔｚ Ｃ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２〜３：９５〜１０７、１９９１を参照のこと）。本発明の融合タンパク質は、粗製の細胞抽出物又は培養培地からの組換えタンパク質の効率の良い回収及び精製を促進するように開発された、融合尾部も含むことができる。これらの系では、標的タンパク質は遺伝的に改変されて、Ｃ末端又はＮ末端ポリペプチド尾部を含んでおり、これによって回収及び精製における特異性に関する生化学的基盤が与えられる。さまざまな特性を有する尾部が使用されてきている：
（１）固定された基質又は阻害剤に関する親和性を有する完全な酵素；
（２）免疫グロブリンＧ又はアルブミンとの親和性を有するペプチド結合タンパク質；
（３）炭水化物結合タンパク質又はドメイン；
（４）融合タンパク質とアビジン又はストレプトアビジンの親和性を促進するための、ｉｎ ｖｉｖｏビオチン化用のビオチン結合ドメイン；
（５）固定されたモノクローナル抗体との親和性を有する抗原エピトープ；
（６）固定金属の親和性クロマトグラフィーによる回収用のポリ（Ｈｉｓ）残基；及び
（７）アミノ酸側鎖の性質に基づく結合特異性を有する他のポリ（アミノ酸）。
【００７２】
融合尾部は研究室規模で有用であり、経済的な回収法を使用して回収を高めるための能力を有し、これらは産業の下流プロセス用に容易にスケールアップされる。融合尾部を使用して標的タンパク質の分泌を促進することができ、酵素活性又は抗体結合に基づいて有用なアッセイタグを与えることもできる。多くの融合尾部は標的タンパク質の生物学的活性を害さず、幾つかの場合、それを安定化させることが示されてきている。それにもかかわらず、真正タンパク質の精製に関して、特異的に切断される部位が含まれることが多く、回収後に尾部の除去が可能になる。
【００７３】
本発明は、対応する抗原に関する抗体の特異性を変えずに抗体の生物学的活性及び免疫活性を高める、抗体−ペプチド融合タンパク質の作製を記載する。この遺伝的に改変された融合タンパク質は、特許出願第０９／０７０，９０７号中に記載される化学的に改変されたキメラ抗体と似ている。詳細には本発明は、いずれも前に記載した、完全又は部分的な独立栄養性２４量体ペプチド、膜輸送ペプチド（ＭＴＳ）又はＣ３ｄペプチドを含む抗体融合タンパク質の作製を提供する。
【００７４】
本発明は、（１）抗体及び（２）免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される生物学的活性を有するペプチドであって、抗体の抗原結合を害さない部位で、抗体とペプチド結合によって結合したペプチドから構成される融合タンパク質を含む、組成物及び医薬組成物も提供する。
【００７５】
本発明のペプチド／抗体複合体中に、任意の抗体を使用することができる。好ましい抗体は抗イディオタイプ抗体である。例えば、抗イディオタイプ抗体３Ｈ１を使用することができる（「アジュバント治療剤として胎児性癌抗原（ＣＥＡ）を模倣した抗イディオタイプ抗体ワクチン（３Ｈ１）（Ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｃｃｉｎｅ （３Ｈ１）ｔｈａｔ Ｍｉｍｉｃｓ ｔｈｅ Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）ａｓ ａｎ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、Ｆｏｏｎ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｗｅｅｋｌｙ、Ｊｕｎ．２４、１９９６を参照のこと）。本発明で使用することができる他の抗イディオタイプ抗体には、例えばクラミジア糖脂質外抗原に対する抗イディオタイプ抗体（米国特許第５，６５６，２７１号）；メラノーマ及び小細胞癌腫の治療用の抗イディオタイプ抗体１Ａ７（米国特許第５，６１２，０３０号）；抗イディオタイプ抗体ＭＫ２−２３抗メラノーマ抗体（米国特許第５，４９３，００９号）；抗イディオタイプ淋菌抗体（米国特許第５，４７６，７８４号）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗イディオタイプ抗体（米国特許第５，２３３，０２４号）；ヒトＢ細胞腫瘍の表面Ｉｇに対する抗体（米国特許第４，５１３，０８８号）；及びモノクローナル抗体ＢＲ９６（米国特許第５，４９１，０８８号）がある。ペプチドの長さに関する任意の制限は、ペプチド合成に関する実際の制約であるが、本発明の方法の実施に関する制限ではない。
【００７６】
さらに、（その全容が参照として本明細書に組み込まれている、Ｋａｎｇ，Ｃ．Ｙ．Ｂｒｕｎｃｋ、Ｔ．Ｋ．，Ｋｉｅｖｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ、Ｔ．、Ｂｌａｌｉｃｋ，Ｊ．Ｅ．及びＫｏｈｌｅｒ，Ｈ．、「ＶＨ由来ペプチドによる自己結合タンパク質（自己抗体）の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｆ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ａｕｔｏ−ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）ｂｙ ａ ＶＨ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０３４〜１０３６、１９８８）中に開示されたペプチドなどの自己結合ペプチドを、本発明の方法で使用することができる。
【００７７】
さらに、その全容が参照として本明細書に組み込まれている、Ｒｏｊａｓ他、「細胞膜浸透性を有するタンパク質の遺伝的改変（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：３７０〜３７５（１９８８）及び「Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍシグナル変換カタログ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ）」１９９７／９８中に開示されたペプチドなどのシグナルペプチドを、本発明の方法で使用することができる。
【００７８】
米国特許第５，５２３，２０８号（その全容が参照として本明細書に組み込まれている）の開示に従い、逆水治療法性を有しペプチド内で相互親和性及び同種親和性（自己）結合を示す、ペプチドを設計することができる。
【００７９】
本発明は、正常細胞又は感染細胞中の細胞機能を調節するための新規な化合物及び方法を企図するものである。このような化合物は、そこに結合したペプチドの細胞浸透作用によって細胞内に内在化することができる、抗体又はその断片を含む。このようなペプチドを本明細書では、「膜輸送ペプチド」などと呼ぶ。知られている膜輸送ペプチド、又はそれらの活性断片は、結合ペプチドとして使用することができる。このような抗体又はその断片は、（ａ）カスパーゼ、キナーゼ、及びホスファターゼなどの細胞内のシグナルタンパク質、（ｂ）細胞内で構築される前の未成熟ビリオンタンパク質、（ｃ）細胞表面抗原又は細胞内腫瘍抗原、（ｄ）ＤＮＡ合成及び遺伝子発現の調節に関与する核タンパク質又は核小体タンパク質、又は（ｅ）細胞増殖又は細胞分裂停止に関与する細胞骨格タンパク質などのタンパク質標的に免疫特異的である。ポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用することができる。このような抗体又はそれらの断片は、１０−９Ｍ以上の親和性でそれらの抗原決定基と結合することが好ましい。
【００８０】
本発明の特に好ましい化合物は、膜輸送タンパク質、又はそのペプチド断片と結合した抗カスパーゼ抗体を含む化合物である。好ましい膜輸送断片は、膜転座配列（ＭＴＳ）ペプチドである。特に好ましい膜輸送ペプチドには、以下のものがある：
（１）ＫＧＥＧＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＧ（配列番号８）、カポジ肉腫の線維芽細胞成長因子［Ｋ−ＦＧＦ］由来（Ｒｏｊａｓ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：３７０〜３７５（１９８８）。
（２）ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号９）、前述のペプチドの切断型、Ｌｉｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：５３０５（１９９６）を参照のこと。
（３）ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１０）、アンテナペディアのホメオドメイン（Ａｎｔ）由来の「ペネトラチン」（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ｍ．他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０（１４）：３０５５〜３０６３（２００３）を参照のこと）。
（４）ＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１１）、ペネトラチンのＣ末端配列、例えばＦｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．他、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．、５５（２）：１６３〜１７２（２０００）を参照のこと。
（５）ＴＡＴペプチド、例えばＨＩＶ−Ｉ ＴＡＴ由来のａａ４７〜５７及び４８〜６０（例えばＳｃｈｗａｒｚｅ、Ｓ．他、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．、２１：４５、２０００；Ｌｉ Ｙ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９８（３）：４３９〜４４９、２００２；Ｈａｌｌｂｒｉｎｋ Ｍ．他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１５１５（２）：１０１〜１０９、２００１を参照のこと）。
（６）ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２（Ｅｌｌｉｏｔ，Ｇ．他、Ｃｅｌｌ、８８：２２３（１９９７））。
（７）ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１２）、「トランスポルタン」、２７量体ペプチド（Ｐｏｏｇａ、Ｍ．他、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１２：６７（１９９８）；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ｍ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４０：３１４１〜３１４９、２００１を参照のこと）。
（８）ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１３）、Ｎ末端６残基が欠失したトランスポルタン（Ｓｏｏｍｅｔｓ、Ｕ．他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４６７：１６５〜１７６、２０００を参照のこと）。
（９）ＭＡＰとも呼ばれる、Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（ＫＬＡＬ）（配列番号１４）（Ｈａｌｌｂｒｉｎｋ Ｍ．他、Ｂｌｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１５１５（２）：１０１〜１０９、２００１も参照のこと）。
【００８１】
本明細書で論じる、膜輸送タンパク質又はその断片と結合した抗カスパーゼ抗体を含む、アポトーシスを阻害するのに有効な医薬組成物も企図される。これらを作製するそのような融合タンパク質及び方法は、参照として本明細書に組み込まれている米国特許第０９／８６５，２８１号（Ｋｏｈｌｅｒ他）中に開示されている。
【００８２】
本発明の好ましい免疫複合体は、抗体のヌクレオチド又はトリプトファン部位仲介、又は抗体のＮ末端連結炭水化物仲介を含めた連結の幾つかの型の１つによって、ＭＴＳ配列と結合した二次抗体を含む。本明細書で使用する「二次抗体」は、一次抗体と特異的に高い親和性で結合する、抗体又はその断片を指す。本発明に有用な二次抗体には、ネズミ又はヒトＩｇＧに対するポリクローナル又はモノクローナル抗グロブリン、又は抗体に独立栄養性を与えるＴ１５配列（Ｋａｎｇ，ＣＹ、Ｂｒｕｎｃｋ，ＴＫ、Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ、Ｔ他、「ＶＨ由来ペプチドによる自己結合抗体（自己体）の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｆ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ａｕｔｏｂｏｄｉｅｓ）ｂｙ ａ ＶＨ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０３４〜６、１９８８）などの、新規且つ／或いは備え付けの配列を標的とする二次抗体がある。
【００８３】
細胞表面抗原を標的とするモノクローナル抗体又は免疫複合体を事前投与又は事前注射し、標的との結合及び組織からの除去に充分な時間を与え、ＭＴＳペプチドと共有結合した二次抗体の投与を続けることによって送達を行う。一次抗体は毒素、薬剤、酵素又はアイソトープなどの阻害剤と結合することができ、これによって阻害剤分子の細胞中への送達を高めることができる。ＭＴＳペプチドと結合した二次抗体は、一次抗体を認識しこれと結合し、ＭＴＳペプチド活性によって細胞に内在化する。このようにして、一次免疫複合体が細胞中に運ばれ、そこでその阻害作用が高まる。
【００８４】
一次抗体とＭＴＳと結合した二次抗体を混合させ、次いで細胞を露出させ、及び一次抗体を標的とする細胞活性の阻害に関して試験することによって、このような二次結合体を使用して、細胞内標的に対するモノクローナル抗体の有用性を評価することもできる。この迅速なスクリーニングでは、細胞内標的に対する多くの抗体を、アンタゴニスト又はアゴニストとしての有用性に関してスクリーニングすることができる。したがって活性を有する抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ使用のためにＭＴＳなどの膜輸送ペプチドと直接結合させることができる。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態は、二次抗体及び一次抗体のトリプトファン又はヌクレオチド結合部位と結合した、化学物質又はペプチド連結基又はキレート化合物によってスルフヒドリル、εアミノ酸又は炭水化物残基を介して結合した毒素、薬剤又はアイソトープと結合した、ＭＴＳペプチドを使用する。
【００８６】
本発明は概略的に、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体結合体の細胞内部への送達に関する。このような抗体は潜在的に中和、抗ウイルス抗体、抗調節タンパク質抗体、又は抗腫瘍抗体であってよい。例えば、ＭＴＳペプチドを含む抗体結合体、及び未成熟ウイルス又は病原体で最も発現されるウイルス又は他の細胞内病原体上の抗原決定基を対象とする抗体を、生きている生物に投与することによって、送達を行うことができる。このような結合体は、それが他の細胞を成熟させ感染させる機会を有する前に、高い親和性で結合し、ウイルス構築体を破壊し、ウイルスを中和する充分な機会を有する。
【００８７】
したがって本発明は、広範囲の抗体療法の一例としての、抗ウイルス（抗ＨＩＶ）療法を提供する。本発明において好ましい抗体は、以下の好ましい性質を有する：
（１）本発明の抗体は、主に細胞内で発現される抗原と結合する。これは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及びウイルス糖タンパク質を含む。前者は、ＣＥＡなどのＴＡＡを含む。個々の抗原決定基は細胞内形のタンパク質と主に結合することができ、一方他の抗原決定基は、主に表面上で発現される可能性がある。本発明より前に、細胞表面分子との反応性に関して、細胞内抗原を標的化する能力を有する、多くの有用な治療抗体が選択されており、選択基準は細胞内抗原との主な反応性を含むと思われる。
（２）細胞内標的はウイルス糖タンパク質を含む。例えば、大部分のモノクローナル抗体は、わずか数継代の細胞中を伝播するウイルスではなく多継代の細胞中を伝播するウイルスに対して産生されており；結果として、ウイルスに対する大部分のモノクローナル抗体は、新たな単離体よりも研究室用のウイルス菌株と良好に反応する。この結合の違いに関して提案されている説明は、大部分の抗体は、ＨＩＶに対する抗体と同様に、充分なグリコシル化及びウイルス糖タンパク質の折り畳みのために、わずか数継代のウイルス（及びおそらく新たに合成されたウイルス）由来のウイルス糖タンパク質上に隠れており且つ部分的に埋もれている、抗原決定基と反応するということである。これは、大部分の抗体は、過小グリコシル化又は不完全にグリコシル化した糖タンパク質を有する未成熟ビリオン又は不完全ビリオン、及び／又は完全に構築されていない未成熟ビリオン又は不完全ビリオンとより良く結合するはずであることを意味すると思われる。したがって、本来のウイルスとの限られた反応性のために、療法に有用であるとみなされない抗体は、細胞内の未成熟形への接触によって、標的化するのに有用であると思われる。
（３）本発明の抗体は、立体配座依存性の配列よりも、ＴＡＡ又はウイルス糖タンパク質上のアミノ酸の直線配列と結合する。このような抗体は、合成及び成熟の初期に細胞内抗原と結合する可能性がさらに高く、これは、細胞内に存在する未成熟ビリオン又は非構築、糖タンパク質前駆体を含むと思われる。
（４）これらの抗体は、１０−９Ｍ以上の親和性でそれらの抗原決定基と結合するはずである。
【００８８】
ＭＴＳ輸送ペプチド改変型モノクローナル抗カスパーゼ−３抗体は、生細胞中のアクチノマイシンＤ誘導型アポトーシス及びスペクトリンの切断を減らすことを、具体的な実施例によって、本明細書においてここで示す。これらの結果は、このような抗体が、さまざまな疾患においてアポトーシスを阻害する治療能力を有することを示唆する。
【実施例６】
【００８９】
細胞系及び抗体。ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞リンパ腫を、１０％ウシ胎児血清及び抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンフェテリシン）を補ったＲＰＭＩ １６４０中で増殖させた。ウサギポリクローナル抗活性カスパーゼ−３抗体、及び抗切断型フォドリン、即ちαＩＩスペクトリンを、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した。ウサギモノクローナル抗活性カスパーゼ−３抗体は、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。ウサギ抗スペクトリン抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した。マウスモノクローナル抗体３Ｈ１（抗ＣＥＡ）は、タンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーによって細胞培養物上清から精製した。抗マウス及び抗ウサギＨＲＰ結合二次抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。ＡｐｏＡｌｅｒｔカスパーゼ−３蛍光アッセイキットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入した。細胞死検出ＥＬＩＳＡは、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｉｃｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。カスパーゼ阻害剤は、Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ、ＣＡ）から購入した。
【実施例７】
【００９０】
抗体−ペプチド結合体の合成。ＭＴＳペプチド（ＫＧＥＧＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＧ）はシグナルペプチド系膜転座配列（１）であり、Ｇｅｎｅｍｅｄ合成（サンフランシスコ、ＣＡ）によって合成した。抗体をＰＢＳ（ｐＨ６．０）バッファーに対して透析し、１／１０体積の２００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＩＯ４を加え、暗所中で３０分間４℃においてインキュベートすることによって酸化した。３０ｍＭまでグリセロールを加えることによって酸化を停止させ、ＰＢＳ（ｐＨ６．０）バッファーに対して３０分間４℃でサンプルを透析した。５０倍を超えるＭＴＳペプチドを分子中に使用して、３７℃で１時間のインキュベーションによって抗体を結合させ、次いで抗体−ペプチドをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析した。
【実施例８】
【００９１】
ＭＴＳ結合抗活性カスパーゼ−３抗体の細胞増殖に対する影響。２．５×１０５個のＪｕｒｋａｔ細胞を、９６ウエルの培養プレートに接種した。０．５μｇのＭＴＳ抗体結合体と共に６、１２、１８及び２４時間インキュベートした後、等分試料を除去し、生存能力のある細胞は色素排除試験（トリパンブルー）を使用して計数した。
【実施例９】
【００９２】
ＥＬＩＳＡによる抗体内在化の試験。１ｍｌ培地で増殖させたＪｕｒｋａｔ細胞を、２μｇの裸又はＭＴＳ抗体結合体と共に、０、１、３、６、１２及び１８時間６ウエルの培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）中でインキュベートした。細胞をスピンダウンさせ、培養物上清を新しいチューブに移し、３０秒間Ｐｅｌｌｅｔ Ｐｅｓｔｌｅ Ｍｏｔｏｒ（Ｋｏｎｔｅｓ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）によって均質化する前に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で細胞ペレットを２回洗浄した。全ての細胞ホモジェネート及び同体積（１０μｌ）の培養物上清を、ヒツジ抗ウサギＩｇＧをコーティングしたＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｏｘｎａｒｄ、ＣＡ）に加え、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ軽鎖抗体を加え、ｏ−フェニレンジアミンを使用して抗体を目に見える状態にした。
【実施例１０】
【００９３】
ＤＮＡ断片化。Ｊｕｒｋａｔ細胞を抗体又はカスパーゼ−３阻害剤（ＤＥＶＤ−ｆｍｋ）で１時間予備処理し、遠心分離にかけ、アクチノマイシンＤ（１μｇ／ｍｌ）を含む新たな培地と共に４時間インキュベートした。処理後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで７００μｌのＨＬバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中に懸濁させ、室温で１５分間インキュベートした。粗製ＤＮＡ調製物を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２回抽出し、０．１体積の５Ｍ ＮａＣｌ及び１体積のイソプロパノールを用いて−２０℃で２４時間沈殿させた。回収したＤＮＡは、ＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０及び１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶かした。同じ量のＤＮＡを１．５％アガロースゲル上での電気泳動によって解像し、臭化エチジウムで染色した後にＵＶ蛍光によって可視化した。ＤＮＡ断片化は、細胞死検出ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）によっても検出し、わずかな改変で製造者の教示書に従いこれを行った：ＪＢ６細胞をｐ１００プレート中で増殖させ、処理後に細胞を回収し、２５μｌの完全な細胞溶解物をそれぞれのサンプルウエルに施した。
【実施例１１】
【００９４】
全細胞溶解物の調製。Ｊｕｒｋａｔ細胞は前項と同じ方法で処理した。処理後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、次いで３００μｌのＣＨＡＰＳバッファー（５０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．５、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＣＨＡＰＳ）中に懸濁させた。サンプルを１０秒間超音波処理し、４℃において１５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離にかけた。上清を新しいチューブに移し、「全細胞溶解物」と呼んだ。
【実施例１２】
【００９５】
カスパーゼ−３様切断活性アッセイ。Ｊｕｒｋａｔ細胞は前項と同じ方法で処理した。等しいタンパク質濃度の全細胞溶解物及びＡｐｏＡｌｅｒｔカスパーゼ−３蛍光アッセイキットを使用して、製造者の教示書に従いカスパーゼ−３活性を分析した。スペクトルＭＡＸ ＧＥＭＩＮＩリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、蛍光を測定した。
【実施例１３】
【００９６】
ウエスタンブロット分析。Ｊｕｒｋａｔ細胞は前項と同じ方法で処理した。１０μｇの全細胞溶解物を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離して、切断型スペクトリン（１：１０００希釈）に対する免疫反応性タンパク質を検出した。ポンソー染色を使用して、タンパク質のニトロセルロース膜上への移動の均一性を調べた。膜は蒸留水で洗浄して過剰な染色液を除去し、Ｂｌｏｔｔｏ（５％のミルク、１０ｍｍのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）中において２時間室温でブロッキングした。二次抗体を加える前に、膜をＴＢＳＴ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、次いでこの膜を、１：４０００希釈でホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共にインキュベートした。最終洗浄ステップは、ＴＢＳＴで３回（それぞれ５分間）、及びＴＢＳ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌ）で２回（それぞれ５分間）を含んでいた。高度な化学発光検出システム（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって、抗体のバンドを目に見える状態にした。
【００９７】
結果
ＭＴＳ結合抗活性カスパーゼ−３抗体は、細胞増殖の阻害をほとんど示さない。最初に試験したのは、細胞に対するＭＴＳ抗体結合体の潜在的な毒性であった。細胞の生存能力アッセイによって、ＭＴＳ抗体結合体は細胞増殖に対してほとんど影響を示さなかったことが示された（図１）。
【００９８】
ＭＴＳペプチドは、生細胞中への抗活性カスパーゼ−３抗体の迅速な浸透を促進する。サンドウィッチアッセイを使用し、ＥＬＩＳＡを設計してウサギＩｇを捕捉した。図２中に見られるように、ＭＴＳ結合体は、モノクローナル抗活性カスパーゼ−３抗体を、生細胞中へ内在化させるのを迅速に促進した。Ｉｇの移動は１時間以内に増大し、１８時間後に安定状態に達した。培養物中に残っていた抗体は１時間で減少し、１８時間で平衡状態に達したようであった。裸抗体の内在化は遅れ（３時間で）、ＭＴＳ結合抗カスパーゼ−３抗体と比較して低いレベルの状態であった。
【００９９】
ポリクローナルＭＴＳ抗活性カスパーゼ−３抗体は、ＤＮＡ断片化を阻害する。ＭＴＳ結合又は裸ポリクローナル抗カスパーゼ−３抗体（１μｇ／ｍｌの最終濃度−１：６４希釈相当）を６ｍｌの培養Ｊｕｒｋａｔ細胞に加え、１時間プレインキュベートした。抗体は遠心分離によって洗浄除去し、アクチノマイシンＤ（１μｇ／ｍｌ）のみを含み抗体は含まない新たな培地を加え、細胞は４時間インキュベートした。５ｍｌの培養物をＤＮＡ断片化用に回収した。裸（非結合）抗カスパーゼ−３ポリクローナル抗体が、アクチノマイシンＤ処理によるＤＮＡラダー化を妨げることはなかった。対照的に、ＭＴＳ結合抗カスパーゼ−３ポリクローナル抗体は、アクチノマイシンＤによって誘導されるＤＮＡ断片化（アポトーシス）を有意に阻害した（データ示さず）。
【０１００】
モノクローナルＭＴＳ抗活性カスパーゼ−３抗体は、ＤＮＡ断片化を妨げる。ＭＴＳ結合又は裸モノクローナル抗カスパーゼ−３抗体（１μｇ／ｍｌの最終濃度）を６ｍｌの培養Ｊｕｒｋａｔ細胞に加え、１時間プレインキュベートした。抗体は遠心分離によって洗浄除去し、アクチノマイシンＤ（１μｇ／ｍｌ）のみを含み抗体は含まない新たな培地を加え、細胞は４時間インキュベートした。５ｍｌの培養物をＤＮＡ断片化用に回収し、残りは細胞死ＥＬＩＳＡアッセイ用に保存した。ＭＴＳ結合抗体がＤＮＡラダー形成を抑制することを観察したが、一方裸（非結合）抗カスパーゼ−３モノクローナル抗体が、アクチノマイシンＤ処理によるＤＮＡラダー化を妨げることはなかった（データ示さず）。細胞死ＥＬＩＳＡアッセイ（図３）によって、ＭＴＳ結合抗体で細胞を予備処理すると、細胞アポトーシスの有意な減少を確認した。カスパーゼ−３阻害剤（ＤＥＶＤ−ｆｍｋ）と共にインキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞は１００％の生存能力を維持し、賦形剤（ＤＭＳＯ）処理した対照細胞は約８０％の生存能力を維持した。裸の抗カスパーゼ−３抗体処理群では、わずか３６％までの細胞が、４時間後に生存能力がある状態であった。しかしながら、７０％の細胞は生存能力がある状態であったので、ＭＴＳ抗カスパーゼ−３結合抗体処理によって、アクチノマイシンＤ誘導型アポトーシスに対しては劇的に保護された（表１参照）。
【表１】
【０１０１】
ＭＴＳ結合抗活性カスパーゼ−３抗体は、カスパーゼ−３活性を抑制する。Ｊｕｒｋａｔ細胞を前項と同様に処理し、ネズミ抗ＣＥＡ抗体を改変し対照として使用した。図４に示すように、カスパーゼ−３様切断活性はアクチノマイシンＤ処理によって増大し、ＭＴＳ結合モノクローナル抗活性カスパーゼ−３抗体はカスパーゼ−３様切断活性を低下させ、一方ＭＴＳ−３Ｈ１抗体は全く効果を示さなかった。細胞死ＥＬＩＳＡアッセイによって、ＭＴＳ結合モノクローナル抗カスパーゼ−３抗体が、有意に低いＤＮＡ断片化を示したことも確認した（データ示さず）。
【０１０２】
ＭＴＳ抗活性カスパーゼ−３抗体はスペクトリン切断を阻害する。カスパーゼ−３の下流標的として、スペクトリンのタンパク質レベルを調べた。スペクトリンの２つの切断断片を、アクチノマイシンＤ処理Ｊｕｒｋａｔ細胞において観察した（データ示さず）。３Ｈ１もＭＴＳ−３Ｈ１も、スペクトリンの切断を保護しなかった。裸のモノクローナル抗活性カスパーゼ抗体は、保護に対する影響をほとんど示さず；一方ＭＴＳ結合抗活性カスパーゼ−３抗体は、カスパーゼ−３阻害剤ＤＥＶＤ−ｆｍｋと同様に、１００ｋＤａ及び７５ｋＤａαＩＩスペクトリン断片の切断を完全に抑制した。１５０ｋＤａの切断バンドは、全ての抗体予備処理細胞サンプルにおいて明らかな変化は全く示さなかった。
【０１０３】
結論
前述の結果は、抗カスパーゼ−３抗体は、カスパーゼ−３活性、ＤＮＡ断片化、及びスペクトリン切断などのｉｎ−ｖｉｔｒｏアポトーシス関連事象を有意に阻害することができることを示す。したがって抗カスパーゼ−３抗体を使用して、さまざまな疾患におけるアポトーシスを阻害することができる。治療上使用される抗体と対照的に、げっ歯類動物モデルにおいて示されるように、従来のペプチドアポトーシス阻害剤は強い阻害を示すだけでなく、高い毒性などの悪い副作用も有する。したがって輸送膜結合抗体は、従来のアポトーシス阻害剤と比較して低い毒性を有する。したがって輸送膜（ＭＴＳ）結合抗体は、特にアルツハイマー病、ハンチングトン病及びパーキンソン病などの疾患の中枢神経系のアポトーシスを含めた、疾患を治療するための有望な新しい候補となる。
【０１０４】
本発明の組成物は、適量の活性成分を含む、単位剤形、滅菌溶液又は懸濁液、滅菌経口溶液又は懸濁液、経口溶液又は懸濁液、水中油型又は油中水型エマルジョンなどでの、ヒト及び動物への全身投与用の医薬組成物に有用である。局所施用は、軟膏、クリーム、ローション、ゼリー、スプレー、灌注剤などの形であってよい。本発明の組成物は、約１〜２０％、及び好ましくは約５〜１５％の組成の、活性成分及び担体又は賦形剤の医薬組成（重量％）で有用である。
【０１０５】
前述の非経口溶液又は懸濁液は経皮的に投与することができ、望むならば、さらに濃縮された徐放形を投与することができる。本発明の架橋ペプチドは、静脈内、筋肉内、腹膜内、又は局所に投与することができる。したがって、経皮投与用に徐放性物質中への活性化合物の取り込みを行うことができる。本発明の目的に認められる医薬担体は、薬剤、宿主、又は薬剤送達デバイスを含む物質に悪影響を与えない、当分野で知られている担体である。担体は、アジュバント、例えば防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤など、及び本発明の浸透性増大物質も含むことができる。哺乳動物に関する有効な用量は、治療される被験体の年齢、体重、活性レベル又は状態などの要因によって変わる可能性がある。典型的には、本発明の化合物の有効な用量は、少なくとも１日１回懸濁液によって投与するとき、約１０〜５００ｍｇ、好ましくは２〜１５ｍｇである。投与は適切な間隔で繰り返すことができる。
【０１０６】
前述の記載及び実施例の目的は、いかなる制限も示さずに本発明の幾つかの実施形態を例示することである。本発明の組成物及び方法のさまざまな変更形態及び変形を、本発明の精神又は範囲から逸脱せずに添付の特許請求の範囲内で実施することができることは、当業者には容易に明らかであろう。本明細書に引用した全ての特許及び刊行物は、それらの全容が参照として組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】ＭＴＳ抗活性カスパーゼ−３抗体結合体で処理したＪｕｒｋａｔ細胞の、検出による生存能力を示す図である。２．５×１０５個のＪｕｒｋａｔ細胞を、９６ウエルの培養プレートに接種した。０．５μｇのＭＴＳ抗体と共に６、１２、１８及び２４時間インキュベートした後、等分試料を除去し、生存能力のある細胞は色素排除試験（トリパンブルー）を使用して計数した。
【図２】サンドウィッチＥＬＩＳＡによる抗体内在化の検出を示す図である。ヒツジ抗ウサギ抗体を、ＥＬＩＳＡプレート（４００ｎｇ／ウエル）上にコーティングした。細胞のホモジェネート及び等体積の培養物上清を、ヒツジ抗ウサギＩｇＧコーティングＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｏｘｎａｒｄ、ＣＡ）に加え、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ軽鎖抗体を加え、ｏ−フェニレン−ジアミンを加えることによって抗体を目に見える状態にした。内在化した抗体と培養物中の抗体の比をプロットする。
【図３】細胞死のＥＬＩＳＡアッセイによって測定した、ＤＮＡ断片化の程度を示す図である。ＭＴＳ結合又は裸の抗カスパーゼ−３抗体（２μｇ／ｍｌ）を、６ｍｌの培養したＪｕｒｋａｔ細胞に加え、１時間プレインキュベートした。遠心分離によって抗体を洗浄し、アクチノマイシンＤ（１μｇ／ｍｌ）を含む新鮮な培地を加え、４時間インキュベートした。ラダー電気泳動によるＤＮＡ断片化の評価用に５ｍｌの培養物を回収し；残りはＥＬＩＳＡアッセイ用に回収した。ＡＤ＝アクチノマイシンＤ；裸抗体＝カスパーゼ−３抗体；ＭＴＳ−Ａｂ＝ＭＴＳ結合抗カスパーゼ−３抗体；カスパーゼ−３阻害剤＝ＤＥＶＤ−ｆｍｋ（１００μＭ）。＊、ｐ＜０．０１、対照と比較したもの；＃、ｐ＜０．０１、裸のカスパーゼ−３抗体と比較したもの。
【図４】カスパーゼ−３様切断活性アッセイを示す図である。全細胞溶解物の等量のタンパク質を、ＡｐｏＡｌｅｒｔカスパーゼ−３蛍光アッセイキットを使用することによってこのアッセイに施用した。＊、ｐ＜０．０１、対照と比較したもの；＃、ｐ＜０．０１、裸のカスパーゼ−３抗体と比較したもの。
【技術分野】
【０００１】
本出願は米国出願Ｎｏ．Ｘの一部継続出願であり、これは２００２年５月２９日に出願された国内段階の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１６６５１号であり、これは２００１年５月２９日に出願された米国特許出願第０９／８６５，２８１号の一部継続出願であり、これは１９９８年５月４日に出願された米国特許出願第０９／０７０，９０７号の一部継続出願、現在米国特許第６，２３８，６６７号である。本出願は、２００３年３月５日に出願された米国仮出願第６０／４５１，９８０号の特典も主張する。前述の特許及び特許出願のそれぞれの開示は、参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は完全な生物学的活性ペプチド及び抗体、又はそれらの断片を含む融合タンパク質に関する。具体的には、本発明の融合タンパク質は、抗体の分子認識と免疫賦活活性、膜輸送活性、及び同種親和活性などの生物学的活性を兼ね備えている。本発明はさらに、抗体の結合性を有し、生物学的活性があるペプチドの立体配座の柔軟性を制約しその生物学的標的に関する親和性を増大させるための、ループ形成配列又は他の立体配座を与える配列の側面に位置する生物学的活性があるペプチド配列を含む、融合タンパク質に関する。本発明は、プログラムされた細胞死、即ちアポトーシスの阻害における、抗体及びその結合体の使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
抗体は疾患と闘うための「特効薬」として称賛されている。しかしながら、抗体に関してなされた期待が、決して完全に実現されているわけではない。これは部分的には、抗体は免疫防御のわずか一部分であり、Ｔ細胞が免疫防御において他の戦略を与えるという事実によるものである。しかしながら、抗体は理想的な標的及び送達デバイスである。抗体は血液中での長期の生存に適合しており、血管及び組織浸透を助ける部位を有し、先天性免疫の幾つかの防御機構と機能的に関連がある。１つのこのような機構は補体系であり、これは病原体の破壊を手助けし、免疫応答の調節と関係がある。例えば補体断片Ｃ３ｄは、エプスタイン−バーウイルス用の結合部位でもある、Ｂ細胞上のＣＲ２受容体と結合する。エプスタイン−バーウイルスとＣＲ２が結合することによって、Ｂ細胞が活性化される。蓄積された証拠によって、ＣＲ２受容体（ＣＤ１９／Ｃｄ２０／ＣＤ８１複合体）は免疫賦活的役割を有し、Ｃ３ｄによって活性化されることが示されている。
【０００４】
多くの治療用途に、モノクローナル抗体が開発されてきている。例えば、モノクローナル抗体によって現在標的化されている疾患には、心臓病、癌、神経異常及び自己免疫性疾患がある。ほぼ全てのこれらの現在の治療用途は、特定のモノクローナル抗体、薬剤ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ及びＲＩＴＵＸＡＮなどの固有の治療有効性に頼るものである。大部分のモノクローナル抗体はこのような固有の治療活性を示さないので、タンパク質毒素又はそのサブユニットなどのさまざまな異なる毒性物質、癌の化学療法治療において現在使用されている薬剤、許容できないほど高い毒性のために臨床開発が進まなかった薬剤、又は放射性同位体を結合することによって、治療特性を加えることに開発は焦点を置いている。
【０００５】
このような結合体を有効にするために、このような毒性物質を送達するモノクローナル抗体は、その標的抗原と結合し、細胞中に内在化して毒性物質を内部に運ぶことができなければならず、内部では毒性物質は、標的細胞のＤＮＡの損傷或いはタンパク質合成又は他の代謝機能の阻害において有効である可能性がある。本来このような性質、非常に強力な免疫複合体を生み出す性質を示す抗体はわずかしかない。このように、スクリーニングアッセイが開発されてこのような抗体が試験されているが、この性質と適切な標的特異性を兼ね備える抗体はわずかしか同定されていない。
【０００６】
抗体中への内在化能力を浸透させるための、他の手法が存在している。活性サブユニットと細胞結合サブユニットを兼ね備える完全なタンパク質毒素は、抗体との結合時に内在化を増大させるのに有効であるが、抗体の選択性を低下させ、それによって潜在的な毒性をもたらすことが多い。親油性薬剤も内在化の増大及び結合形での細胞内送達のために使用されてきているが、毒素と同様に結合体の選択性を低下させる。他の方法が透過性を上昇させるために使用されてきており、或いはマイクロインジェクションによって細胞中へのより良い進入が可能となる。これらの方法はいずれも重大な欠点を有する。例えばサポニン、細菌毒素、リン酸カルシウム、エレクトロポレーションなどによる細胞の透過性の上昇は、ｅｘ ｖｉｖｏの方法用にのみ実際に使用することができ、これらの方法は細胞に対する障害を引き起こす。マイクロインジェクションは非常に熟練した技術者を必要とし（したがってその使用は研究室での設定に限られる）、マイクロインジェクションは細胞に物理的に障害を与え、限られた適用のみを有する。何故なら、マイクロインジェクションを使用して例えば細胞の塊又は完全な組織を治療することはできず、多数の細胞を実際に注射することはできないからである。
【０００７】
抗体を使用して免疫応答を増大させることができる方法の他の例は、Ｚａｎｅｔｔｉ及びＢｏｎａの研究（Ｚａｎｅｔｔｉ，Ｍ．、Ｎａｔｕｒｅ、３５５：４６６〜４７７、１９９２；Ｚａｇｈｏｕａｎｉ Ｈ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｓ．Ａ．、Ｓｐｅｒｂｅｅｒ Ｋ．Ｅ．、Ｄａｉａｎ Ｃ．Ｋｅｎｎｅｄｙ Ｒ．Ｃ．、Ｍａｙｅｒ Ｌ．及びＢｏｎａ Ｃ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ＵＳＡ、９２：６３１〜６３５、１９９５）によって実証されている。これらの筆者は、分子生物学の方法を使用して、Ｉｇ重鎖のＣＤＲ３配列をＴ細胞及びＢ細胞抗原（エピトープ）に似た配列に置き換え、これらの改変型抗体が挿入されたものに特異的な強い免疫応答を誘導することを示している。
【０００８】
抗体の生物学的性質は、抗原の全体的なアビディティー、並びに細胞膜及び核膜を浸透する能力を高めることができる。ペンタマーＩｇＭ抗体中でのように抗体の結合価を増大させることによって、抗原の結合を高める。結合価及びアビディティーは、自己結合性又は同型である幾つかの抗体においても増大する（Ｋａｎｇ，Ｃ．Ｙ．、Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．Ｌ．、Ｒｕｄｉｋｏｆｆ，Ｓ．及びＫｏｈｌｅｒ，Ｈ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：１３３２、１９８７；Ｘｉｙｕｎ，Ａ．Ｎ．、Ｅｖａｎｓ，Ｓ．Ｖ．、Ｋａｍｉｎｋｉ，Ｍ．Ｊ．、Ｆｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｆ．Ｄ．、Ｒｅｓｉｆｅｌｄ，Ｒ．Ａ．、Ｎｏｕｇｈｔｏｎ，Ａ．Ｎ．及びＣｈａｐｍａｎ，Ｐ．Ｂ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：１５８２〜１５８８、１９９６）。自己結合を阻害した、重鎖可変領域中のペプチドが同定された（Ｋａｎｇ，Ｃ．Ｙ．Ｂｒｕｎｃｋ，Ｔ．Ｋ．、Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ，Ｔ．、Ｂｌａｌｏｃｋ，Ｊ．Ｅ．及びＫｏｈｌｅｒ，Ｈ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０３４〜１０３６、１９８８）。自己結合性ペプチド配列を抗体中に挿入することによって自己結合の性質を与え、抗原に関する結合価及び全体的なアビディティーを増大させる。
【０００９】
同様に、Ｒｏｊａｓ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：３７０〜３７５（１９９８）によって実証されたように、シグナルペプチドを抗体に加えることによって膜輸送が容易になる。Ｒｏｊａｓ他は１２量体ペプチドを含む融合タンパク質を作製しており、このタンパク質が細胞膜浸透性を有することを示している。
【００１０】
共通の疎水性モチーフを表すシグナルペプチド配列は、推定上のタンパク質チャンネルを介した哺乳動物小胞体（ＥＲ）及び原核生物原形質膜を通過する、大部分の細胞内分泌タンパク質の移動を仲介する。主要なモデルは、幾つかの膜タンパク質によって形成される親水性タンパク質チャンネルを介して膜を越えて、タンパク質が輸送されることを示す。真核生物では、細胞質中で新たに合成されるタンパク質は、シグナル認識粒子（ＳＲＰ）及びそのＥＲ膜受容体により一般に認識されるシグナル配列によってＥＲ膜に向けられる。この標的化ステップに、ＥＲ膜を通過する、及び推定上のタンパク質チャンネルを介した細胞からのタンパク質の実際の移動が続く。シグナルペプチドは脂質と強く相互作用することもでき、細胞膜を通過する幾つかの分泌タンパク質の輸送は、タンパク質チャンネルの不在下で、脂質二重層を介して直接起こる可能性があるという提案が支持される。このようなシグナルペプチドを使用して、抗体又は他の生物学的活性がある分子の細胞への内在化を増大させることができ、これらは幾つかの特許（米国特許第５，８０７，７４６号、第６，０４３，３３９号及び第６，２３８，６６７号）の主題である。
【００１１】
毒素、薬剤及びサイトカインなどの幾つかの生物学的活性がある分子用の送達デバイスとして、抗体が使用されてきている。より優れた組織浸透性及び低い「粘性」のために、しばしば抗体の断片、Ｆａｂ又はｓｃＦｖが好ましい。
【００１２】
ペプチドなどの分子と抗体分子を結合させるために、２つの実際的な方法が存在する。１つの方法は化学的架橋を使用することであり、米国特許第０９／０７０，９０７号中に記載された親和性架橋法などである。他の方法は、抗体及びペプチドをコードするＤＮＡを含む融合遺伝子を設計すること、並びにその融合遺伝子を発現させることであり、この方法は本出願の主題である。
【００１３】
抗体融合タンパク質は典型的には、大きなタンパク質の遺伝子全体又はそのようなタンパク質の生物学的機能を与えるドメインを用いて工学処理される。以前の小さなペプチド−抗体融合タンパク質は典型的には、抗体の精製又は特徴付けを容易にする目的で主に作製されていた。
【００１４】
融合タンパク質を作製する方法は、例えば以下の米国特許中に記載されており、これらの関連する開示は参照として本明細書に組み込まれる：Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ他への米国特許第５，５６３，０４６号；Ｆｅｌｌ、Ｊｒ．への米国特許第５，６４５，８３５号；Ｍｕｒｐｈｙへの米国特許第５，６６８，２２５号；Ｎｅｍａｚｅｅへの米国特許第５，６９８，６７９号；Ｗｈｉｔｌｏｗ他への米国特許第５，７６３，７３３号；Ｑｕｅｒｔｅｒｍｏｕｓ他への米国特許第５，８１１，２６５号；Ｃｈａｎｇ他への米国特許第５，９０８，６２６号；Ｂｏｎａ他への米国特許第５，９６９，１０９号；Ｅｐｓｔｅｉｎ他への米国特許第６，００８，３１９号；Ｓｅｅｄへの米国特許第６，１１７，６５６号；Ｗｈｉｔｌｏｗ他への米国特許第６，１２１，４２４号；Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ他への米国特許第６，１３２，９９２号；Ｈｕｓｔｏｎ他への米国特許第６，２０７，８０４号；及びＳｅｇａｌへの米国特許第６，２２４，８７０号。Ｉｇ融合タンパク質を作製する方法は、例えば「抗体の工学処理（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、第２版：Ｃａｒｌ Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）中、及び「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：研究室マニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、１９８９中に記載されており、これらの関連する開示は参照として本明細書に組み込まれる。
【００１５】
サイトカインなどのタンパク質、毒素、酵素などの活性ドメインを主に含んでいる免疫グロブリンとの融合タンパク質、ＣＤＲ（相補性決定領域）を含む免疫グロブリンの標的ドメイン、並びに抗原結合とは直接関与しないが二次的な相互作用によって高い結合親和性を与えることができる他の可変領域及びドメインとの融合タンパク質を含めた融合タンパク質は、例えば参照として本明細書に組み込まれている以下の刊行物中に記載されている：
Ｇｕｏ Ｌ；Ｗａｎｇ Ｊ；Ｑｉａｎ Ｓ；Ｙａｎ Ｘ；Ｃｈｅｎ Ｒ；Ｍｅｎｇ Ｇ、「タンパク質分解に耐性がある単鎖Ｆｖ−アスパラギナーゼ融合タンパク質の構築及び構造モデル化（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ−ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、２０００年１１月２０日；７０（４）：４５６〜６３；
Ｍｕｌｌｅｒ ＢＨ；Ｃｈｅｖｒｉｅｒ Ｄ；Ｂｏｕｌａｉｎ ＪＣ；Ｇｕｅｓｄｏｎ ＪＬ「分子ハイブリダイゼーションの１ステップの免疫検出法用の組換え単鎖Ｆｖ抗体断片−アルカリホスファターゼ結合体（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ−ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｏｒ ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９９年７月３０日；２２７（１〜２）：１７７〜８５；
Ｇｒｉｅｐ ＲＡ；ｖａｎ Ｔｗｉｓｋ Ｃ；Ｋｅｒｓｃｈｂａｕｍｅｒ ＲＪ；Ｈａｒｐｅｒ Ｋ；Ｔｏｒｒａｎｃｅ Ｌ；Ｈｉｍｍｌｅｒ Ｇ；ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｌｆ ＪＭ；Ｓｃｈｏｔｓ「ｐＳＫＡＰ／Ｓ：単鎖Ｆｖアルカリホスファターゼ融合タンパク質の生成用の発現ベクター（ｐＳＫＡＰ／Ｓ：Ａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１９９９年６月１６日（１）：６３〜９；
Ｖａｌｌｅｒａ ＤＡ；Ｐａｎｏｓｋａｌｔｓｉｓ−Ｍｏｒｔａｒｉ Ａ；１Ｃ；Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ Ｓ；Ｅｉｄｅ ＣＲ；Ｋｒｅｉｔｍａｎ ＲＪ；Ｎｉｃｈｏｌｌｓ ＰＪ；Ｐｅｎｎｅｌｌ Ｃ；Ｂｌａｚａｒ ＢＲ「ＤＴ３９０抗ＣＤ３ｓＦｖ、Ｔ細胞受容体のＣＤ３ε部分を特異的に標的化する単鎖Ｆｖ融合免疫毒素の抗移植片対宿主疾患に対する影響（Ａｎｔｉ−ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＤＴ３９０−ａｎｔｉ−ＣＤ３ｓＦｖ，ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｆｕｓｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＣＤ３ ｅｐｓｉｌｏｎ ｍｏｉｅｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」Ｂｌｏｏｄ １９９６年９月１５日；８８（６）：２３４２〜５３；
Ｇｕｐｔａ Ｓ；Ｅａｓｔｍａｎ Ｊ；Ｓｉｌｓｋｉ Ｃ；Ｆｅｒｋｏｌ Ｔ；Ｄａｖｉｓ ＰＢ「単鎖Ｆｖ：受容体仲介の遺伝子送達におけるリガンド（Ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ：ａ ｌｉｇａｎｄ ｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００１年４月；８（８）：５８６〜９２；及び
Ｇｏｅｌ Ａ；Ｃｏｌｃｈｅｒ Ｄ；Ｋｏｏ ＪＳ；Ｂｏｏｔｈ ＢＪ；Ｐａｖｌｉｎｋｏｖａ Ｇ；Ｂａｔｒａ「ヘキサヒスチジンタグの相対的な位置は、腫瘍関連単鎖Ｆｖ構築体の結合性に影響を与える。（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ．）」Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２０００年９月１日；１５２３（１）：１３〜２０。
【００１６】
生物学的活性を有するように設計された融合タンパク質は、完全な生物学的活性があるタンパク質由来の鎖状ペプチド配列を使用して構築することができる。しかしながら、このようなペプチドは典型的には、完全なタンパク質より低い親和性を有する。ペプチドの融合タンパク質中への取り込みは、完全な機能性タンパク質の取り込みほど厄介ではないので、完全長タンパク質と同等に優れた結合親和性を有するペプチドを含む融合タンパク質が必要とされている。
【００１７】
本発明は、アポトーシスの阻害における抗体及びその断片の使用にも関する。細胞の自殺（アポトーシス）は、細胞分化、器官発生及び損傷細胞の除去中に、生きている生物によって有益に使用される機構である。しかしながらアポトーシスは、ある形態の病原形成と関係がある可能性もある。例えばアポトーシスは、アルツハイマー病におけるニューロンの消失及び心筋梗塞中の組織の消失の主な原因である。さらに、ＨＩＶ−１感染した個体由来のＴリンパ球は、同じ条件下で培養した非感染Ｔ細胞と比較して、刺激の不在下で自発的アポトーシスを経る。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の「自発的アポトーシス」は、ＨＩＶ−１関連、抗イディオタイプ抗体のｉｎ−ｖｉｔｒｏ添加によって加速されることが示されてきている。
【００１８】
カスパーゼ酵素、例えばカスパーゼ−３は、アポトーシスの経路と非常に関係がある。アポトーシスを阻害するための試みにおいて、カスパーゼ作用を阻害するための幾つかの物質及び方法が提案されてきている。例えば、米国特許第６，５６６，３３８号（Ｗｅｂｅｒ他）は、化学療法及び放射線療法中に非癌細胞死を治療、改善、及び予防するため、並びに癌の化学療法及び放射線療法の副作用を治療及び改善するために、カスパーゼ阻害剤を一般的に使用することを提案している。米国特許第６，５９６，６９３号（Ｋｅａｎａ他）は、幾つかのジペプチドがアポトーシスの強力な阻害剤である可能性があることを報告している。米国特許第６，６８９，７８４号（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ他）及び第６，６２０，７８２号（Ｃａｉ他）は、アポトーシスの阻害剤として、あるクラスのカルバメート及び置換２−アミノベンズアミドをそれぞれ提案している。さらに、米国特許第６，４２６，４１３号（Ｗａｎｎａｍａｋｅｒ他）は、インターロイキン−１β−転換酵素阻害剤と呼ばれるクラスのカスパーゼ阻害剤の代表的な提案である。さらに、米国特許第６，２２８，６０３号（Ｒｅｅｄ他）は、アポトーシスの阻害剤とカスパーゼ−３又はカスパーゼ−７などのカスパーゼの特異的結合を変える物質を同定するための、スクリーニングアッセイを提案している。
【００１９】
カスパーゼ酵素を阻害するためのさらに他の新規な手法は、いわゆる「超抗体技術（ＳＡＴ）」の使用に関する。例えば、「生物学的活性があるペプチドと抗体の融合タンパク質（Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という表題の、国際公開第０２／０９７０４１号を参照のこと（Ｉｍｍｐｈｅｒｏｎ，Ｉｎｃ．及びＩｎｎｅｘｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに同時譲渡）。ＳＡＴの１つの提案されている適用例は、カスパーゼ酵素に対する抗体を使用して、生細胞のアポトーシスを阻害することである。例えば、本発明の一態様は、アポトーシスと関与する酵素に免疫特異的な抗体又は抗体断片の細胞内送達を企図するものである。アポトーシス阻害剤としての膜貫通抗体の幾つかの予想される利点は、細胞中でのそれらの特異的な標的認識、及び従来のアポトーシス阻害剤と比較したそれらの低い毒性である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的は、治療的効果のためにこのような膜浸透性抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、ペプチドドメインの生物学的活性が免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される、抗体ドメイン及びペプチドドメインを含む融合タンパク質を提供する。取り込まれるペプチドが抗体の抗原認識を低下させないように、ペプチドは抗体上の部位と共有結合している。本発明では、このことは、抗体をコードする核酸配列及びペプチドをコードする核酸配列を含む融合遺伝子を作製するステップであって、ペプチドをコードする核酸配列が抗体をコードする核酸配列内の、融合が発現されると、その結果作製された融合タンパク質は抗体及びペプチドを含み、ペプチドが抗体の抗原結合を害さない部位において抗体と結合する部位に位置するステップ、及び融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を作製するステップを含む方法によって実施する。詳細には、融合タンパク質は、抗体をコードする遺伝子を提供するステップであって、遺伝子は突然変異して制限部位を含んでおり、制限部位は抗体の抗原結合部位をコードする遺伝子のいかなる部分からも離れて位置しているステップと、免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される生物学的活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ配列を、抗体をコードする遺伝子の制限部位に挿入して融合遺伝子を作製するステップであって、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、それが抗体をコードする遺伝子とインフレームになるように挿入するステップと、及び融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を作製するステップによって作製することができる。
【００２２】
ペプチドの生物学的活性を増大させるために、ループ形成配列又は立体配座を与える配列の側面にペプチドを置くことができる。
【００２３】
本発明は、免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される生物学的活性を有するペプチドと抗体の融合タンパク質を含む、組成物及び医薬組成物も提供する。
【００２４】
生物学的活性があるペプチドと抗体の融合タンパク質を作製する本発明は、自己結合を含み、リンパ球を刺激し、生物膜を通過する輸送を可能にするペプチドを含む。
【００２５】
本発明の他の態様は、正常細胞又は感染細胞中の細胞機能を調節するための新規な化合物及び方法に関するものである。特に、このような化合物及び方法は、膜輸送ペプチドと結合した抗体又はその抗体断片の使用を伴う。抗体又はその断片は、好ましくは（ａ）カスパーゼ、キナーゼ、及びホスファターゼなどの細胞内のシグナルタンパク質、（ｂ）細胞内で構築される前の未成熟ウイルスタンパク質、（ｃ）細胞表面抗原又は細胞内腫瘍抗原、（ｄ）ＤＮＡ合成及び遺伝子発現の調節に関与する核タンパク質又は核小体タンパク質、又は（ｅ）細胞増殖又は細胞分裂停止に関与する細胞骨格タンパク質などのタンパク質標的に免疫特異的である、すなわち抗体又はその断片は、これらを認識し高い親和性で特異的に結合する。ポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用することができる。
【００２６】
本発明の好ましい態様では、前述の化合物はアポトーシスを阻害するのに有効であり、膜輸送ペプチドと結合した抗カスパーゼ抗体又はその断片を含む。特に好ましい抗体は抗カスパーゼ−３抗体である。
【００２７】
本発明の第二の好ましい態様では、前述の膜輸送ペプチドは転座配列（ＭＴＳ）ペプチド、例えばカポジ肉腫の線維芽細胞成長因子、ＨＩＶ−１のＴＡＴペプチド、アンテナペディアホメオドメイン由来ペプチド、ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２、又は輸送ペプチドに内在するペプチドなどである。特に好ましいＭＴＳペプチドは、アミノ酸残基配列ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号９）、ペプチド配列ＫＧＥＧＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＧ（配列番号８）などを含む。
【００２８】
ヒト細胞中のアポトーシスを阻害するのに有効である医薬組成物であって、したがってヒト疾患を治療するのに有効であるとして示され、膜輸送ペプチド、例えばＭＴＳペプチドと結合した抗カスパーゼ抗体又はその断片を含む医薬組成物も企図される。本発明の抗体−ペプチド結合体は、抗体又は抗体断片の細胞中への内在化を引き起こすことができる。
【００２９】
本発明の他の態様では、疾患を治療又は予防する方法は、膜輸送ペプチド又はその断片と結合した抗カスパーゼ抗体又はその断片を含む医薬組成物を薬理学的に有効な量、必要とする患者に投与することを含む。詳細に示すのは、化学的に誘導されるアポトーシスを減らす、膜輸送ペプチドと結合した改変型抗カスパーゼ抗体である。これらの結果は、このような抗体は、アルツハイマー病、ハンチングトン病、又はパーキンソン病などのさまざまな疾患においてアポトーシスを阻害するための治療的可能性を有することを示唆している。
【００３０】
本発明の前述の目的及び他の目的は、本発明の好ましい実施形態のみを示し記載する以下の詳細な説明及び図面から、当業者には容易に明らかとなるであろう。容易に理解されるように、本発明は、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、関連分野の技術内で変更形態が可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明は、免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される生物学的活性を有するペプチドと抗体の融合タンパク質を作製する方法を記載する。
【００３２】
特に本発明は、取り込まれたペプチドが抗体の抗原認識を害さないように、ペプチドが抗体中の部位に位置する、免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される生物学的活性を有するペプチドと抗体を含む融合タンパク質を提供する。本発明では、このことを、抗体をコードする核酸配列及びペプチドをコードする核酸配列を含む融合遺伝子を作製するステップであって、ペプチドをコードする核酸配列が抗体をコードする核酸配列内の、融合が発現すると、その結果作製された融合タンパク質は抗体及びペプチドを含み、ペプチドが抗体の抗原結合を害さない部位において抗体と結合する部位に位置するステップ、及び融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を作製するステップを含む方法によって実施する。詳細には、融合タンパク質は、抗体をコードする遺伝子を提供するステップであって、遺伝子は突然変異して制限部位を含んでおり、制限部位は抗体の抗原結合部位をコードする遺伝子のいかなる部分からも離れて位置しているステップと、免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される生物学的活性を有するペプチドをコードするＤＮＡ配列を、抗体をコードする遺伝子の制限部位に挿入して融合遺伝子を作製するステップであって、ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、それが抗体をコードする遺伝子とインフレームになるように挿入するステップ、及び融合遺伝子を発現させて融合タンパク質を作製するステップによって作製することができる。
【００３３】
本発明の他の実施形態では、生物学的活性を有するペプチドは、抗体のＣ末端と結合することができる。本発明の他の実施形態では、ペプチドの生物学的活性を増大させるために、ループ形成配列又は立体配座を与える配列の側面にペプチドを置くことができる。
【００３４】
本明細書で使用する、用語「標的部分」は、抗原結合部位を含む任意の天然又は合成タンパク質分子を指す。この用語は、完全長免疫グロブリン分子又は任意の機能的断片、完全長免疫グロブリン分子の可変ドメイン断片など、ＣＤＲ領域、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、或いは改変抗体擬似体又は単鎖ドメイン結合部分を含む。個々の標的部分は、膜構造上の細胞受容体などの所望の標的、例えばタンパク質、糖タンパク質、多糖又は炭水化物に従い選択する。標的部分を選択して、正常細胞又は腫瘍細胞上の細胞受容体と結合させることができる。
【００３５】
同様に、生物学的活性を有するペプチドは、融合タンパク質の所望の機能に従い、或いは言い換えれば、標的部分が正常細胞又は腫瘍細胞などの標的に結合した後の所望の結果に従い選択する。望ましい可能性があると考えられる生物学的活性には、免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性がある。
【００３６】
ループ形成配列又は立体配座を制約する配列は、生物学的活性を有するペプチドのいずれかの側に置くとペプチドの立体配座の柔軟性を抑制する任意のアミノ酸配列であってよい。例には、架橋してループを形成することができる、システイン対などのアミノ酸残基を含む配列がある。立体配座を制約するタンパク質の具体例はチオレドキシンである。立体配座を制約する部分又はループ形成部分の例は、例えば以下の米国特許：Ｂｒｅｎｔへの米国特許第６，２４２，１６３号及び第６，００４，７４６号、米国特許第６，２５８，５５０号；第６，１４７，１８９号；第６，１１１，０６９号；第６，１００，０４４号；第６，０８４，０６６号；第５，９５２，４６５号；第５，９４８，８８７号；及びＢｒｅｎｔ他への第５，９２８，８９６号、Ｄｏｖｅ他への米国特許第６，２００，７５９号及び第５，９２５，５２３号中、及び以下の刊行物中に見ることができる：
Ｆａｉｒｌｉｅ ＤＰ；Ｗｅｓｔ ＭＬ；Ｗｏｎｇ ＡＫ「タンパク質表面に対する擬似体（Ｔｏｗａｒｄｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」Ｃｕｒｒ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １９９８年２月；５（１）：２９〜６２；
Ｖａｌｅｒｏ ＭＬ；Ｃａｍａｒｅｒｏ ＪＡ；Ｈａａｃｋ Ｔ；Ｍａｔｅｕ ＭＧ；Ｄｏｍｉｎｇｏ Ｅ；Ｇｉｒａｌｔ Ｅ；Ａｎｄｒｅｕ Ｄ「ウイルス抗原部位の原型に似た環状ペプチドモデル：剛性と柔軟性の間のバランスの発見（Ｎａｔｉｖｅ−ｌｉｋｅ ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ａ ｖｉｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｉｔｅ：ｆｉｎｄｉｎｇ ａ ｂａｌａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｉｇｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）」Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ ２０００年１〜２月；１３（１）：５〜１３；
Ｇｕｒｕｒａｊａ ＴＬ；Ｎａｒａｓｉｍｈａｍｕｒｔｈｙ Ｓ；Ｐａｙａｎ ＤＧ；「ペプチドの非共有的制約用の新規な人造のループ状足場構造（Ａ ｎｏｖｅｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｌｏｏｐ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０００年７月；７（７）：５１５〜２７；
Ｖｅｎｋａｔｅｓｈ Ｎ；ｉｍ ＳＨ；Ｂａｌａｓｓ Ｍ；Ｆｕｃｈｓ Ｓ；Ｋａｔｃｈａｌｓｋｉ−Ｋａｔｚｉｒ Ｅ「ファージライブラリー由来の環状ペプチドによる、受動的に伝播する実験的自己免疫性重症筋無力症の予防（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｓｓｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｍｙａｓｔｈｅｎｉａ ｇｒａｖｉｓ ｂｙ ａ ｐｈａｇｅ ｌｉｂｒａｒｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０００年１月１８日；９７（２）：７６１〜６；
Ｓｔｏｔｔ Ｋ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ＪＭ；Ｂｕｔｌｅｒ ＰＪ；Ｐｅｒｕｔｚ Ｍ「グルタミン反復配列の取り込みによってタンパク質はオリゴマー化する：神経変性疾患との関係（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ ｒｅｐｅａｔｓ ｍａｋｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９５年７月３日；
前述の刊行物はいずれも、参照として本明細書に組み込まれる。
【００３７】
立体配座を制約する配列は、αヘリックス又はβプリーツシートを形成する配列も含むことができる。例えば、参照として本明細書に組み込まれる以下の刊行物を参照のこと：
Ｌｅｅ ＫＨ；Ｂｅｎｓｏｎ ＤＲ；Ｋｕｃｚｅｒａ Ｋ「合成ペプチドの分子の動的シミュレーションにおいて観察された、αヘリックスからｐｉヘリックスへの変化（Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ ａｌｐｈａ ｔｏ ｐｉ ｈｅｌｉｘ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０００年１１月１４日；３９（４５）：１３７３７〜４７；
Ｄｅｔｔｉｎ Ｍ；Ｒｏｎｃｏｎ Ｒ；Ｓｉｍｏｎｅｔｔｉ Ｍ；Ｔｏｒｉｎｅｎｅ Ｓ；Ｆａｌｃｉｇｎｏ Ｌ；Ｐａｏｌｉｌｌｏ Ｌ；Ｄｉ Ｂｅｌｌｏ Ｃ「ＨＩＶ−１感染性を特異的に増大させるｇｐ１２０由来合成ペプチドの合成、特徴付け及び立体配座の分析（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｐ１２０−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｔｈａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｅｎｈａｎｃｅ ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ．）」Ｊ Ｐｅｐｔ、Ｓｃｉ １９９７年１〜２月；３（１）：１５〜３０；
Ｃｈａｖａｌｉ ＧＢ；Ｎａｇｐａｌ Ｓ；Ｍａｊｕｍｄａｒ ＳＳ；Ｓｉｎｇｈ Ｏ；Ｓａｌｕｎｋｅ ＤＭ「ＧｎＲＨ結合ペプチド中のヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフは、プロラクチン分泌の負の調節に重要である（Ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ ｍｏｔｉｆ ｉｎ ＧｎＲＨ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｌａｃｔｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）」Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９７年１０月１０日；２７２（５）：７３１〜４０；及び
Ｍｉｃｅｌｉ Ｒ；Ｍｙｓｚｋａ Ｄ；Ｍａｏ ＬＩ；Ｓａｔｈｅ Ｇ；Ｃｈａｉｋｅｎ Ｉ「示される足場としてのコイルドコイルステムループ状ミニタンパク質（Ｔｈｅ ｃｏｉｌｅｄ ｃｏｉｌ ｓｔｅｍ ｌｏｏｐ ｍｉｎｉｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ）」Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ Ｄｉｓｃｏｖ．、１９９６年４月；１３（３〜４）：９５〜１０５。
【００３８】
Ｉｇ融合タンパク質の発現。Ｉｇ融合タンパク質は、特異性及び／又は抗体エフェクター機能を組み合わせた抗体と独特の性質に貢献する分子の接合という利点を有する。このタンパク質ファミリーを生成する能力は、ｃ−ｍｙｃを抗体分子のＦｃに置換したときに最初に実証されたが（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ Ｍ Ｓ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｇ Ｔ及びＦｏｘ Ｒ Ｏ．、Ｎａｔｕｒｅ、１２５：６０４、１９８４）、多くの例が現在存在している。Ａｂ融合タンパク質は、幾つかの異なる方法で得ることができる。１つの手法では、非Ｉｇ配列を可変領域に置換し；Ｖ領域が置換された分子によって、エフェクター機能などの性質に貢献する抗体を標的化する特異性、及び改善された薬物動態が与えられる。例にはＩＬ−２及びＣＤ４がある。或いは非Ｉｇ配列を定常領域に置換するか、或いはこれと結合させることができる。生成する分子は本来の抗体の結合特異性を保持しているが、結合するタンパク質から特性を得る。置換の位置に応じて、異なる抗体関連のエフェクター機能及び生物学的性質が保持されるであろう。例えば、「抗体の工学処理（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、第２版：Ｃａｒｌ Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５）を参照のこと。
【００３９】
ＩｇＧ融合タンパク質を構築するためのベクター。一連のベクターが現在生成されており、これによって抗体分子内での異なる位置でのタンパク質の融合が可能であり、したがって異なる性質を有する融合タンパク質の構築が容易になる。これらのベクターを使用して、分子量、価電子が異なり、異なるサブセットの抗体分子の機能性を有する分子との融合タンパク質ファミリーを生成することができる。
【００４０】
融合遺伝子の構築を容易にする方法の具体例として、部位特異的突然変異導入法を使用して、ヒトＩｇＧ３重鎖遺伝子中に独特の制限酵素部位を作製した。この特定の例では、ＣＨ１エクソンの３’端、ＣＨ２エクソンの５’端のヒンジの直後、及びＣＨ３エクソンの３’端に、制限部位を生成した。このようにして生成した制限部位は、ＴｔｇＧＴｇをＴａｃＧＴａに置換したことによるＣＨ１の末端のＳｎａＢＩ、ＣＡｃＣＴＧをＣＡｇＣＴＧに置換したことによるＣＨ２の最初の部分のＰｖｕＩＩ、及びＡＡＴｇａｇをＡＡＴａｔｔに置換したことによるＣＨ３の端のＳｓｐＩであった。これらの操作によって、これらの位置に独特の平滑末端クローニング部位が与えられた。いずれの場合も、切断後にＩｇがコドンの最初の塩基に貢献するように、制限部位が位置していた。６２アミノ酸の拡大したヒンジ領域を有するヒトＩｇＧ３を、免疫グロブリンとして使用するために選択する。存在するとき、このヒンジ領域は空間及び柔軟性を与え、これによって同時の抗原と受容体の結合を容易にするはずである。ＥｃｏＲＩ部位もＩｇＧ３遺伝子の３’端に導入して、３’クローニング部位及びポリＡ付加シグナルを与えた。成長因子と共に使用するために最初は設計したが、これらの制限部位を使用して、抗体中の明確な位置に任意の新規の配列を置くことができる。さらに、これらのクローニングカセットを使用して、可変領域を容易に変えることができる。同様の技法を使用して、他の抗体遺伝子中に適切な制限部位を作製することができる。
【００４１】
融合遺伝子の生成。融合タンパク質の生成中の第一ステップとして、平滑末端制限部位を所望の位置、融合させる遺伝子の５’端に導入しなければならない。正しい読み取り枠を保つために、切断後それが２塩基、コドンに貢献するように、部位が位置しなければならない。目的が完全な分子を有する融合タンパク質を作製することである場合、制限部位は通常、リーダー配列の後の位置などの、任意の翻訳後プロセシングの位置に導入する。或いは、目的がタンパク質の一部分のみを使用することである場合、平滑末端部位を遺伝子の任意の位置に導入することができるが、正しい読み取り枠を保つために注意を常に払わなければならない。さらに、融合タンパク質のカルボキシル末端の翻訳後プロセシングが存在する場合、このプロセシング部位に停止コドンを導入するのが望ましいことが多い。
【００４２】
融合タンパク質生成時の重大な関心は、全ての要素の生物学的活性を保つことである。抗体との融合タンパク質の生成は、抗体のドメイン構造によって容易になり、全てのクローニング部位は完全なドメインの直後に位置している。この形状では、免疫グロブリンの正しい折り畳みが保証されるはずである。結合タンパク質の折り畳みは、その構造及びその融合場所に依存する。構造情報が利用可能であるときはいつでも、結合タンパク質の構造の完全性を保つ位置で、融合体を生成することが望ましい。
【００４３】
機能分析に充分な量のタンパク質を生成するために、培地中にタンパク質を分泌させることが望ましい。今日までに報告されている例では、構築する融合タンパク質を構築し分泌させているが、他の融合タンパク質を設計するとき、これは依然関心事である。
【００４４】
重鎖又は軽鎖遺伝子の一部分として生物学的活性があるペプチドを含む、融合遺伝子を設計するための方法は、確立された抗体の工学処理プロトコル「抗体の工学処理（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」、第２版：Ｃａｒｌ Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９５、第９章、２６７〜２９３ページ）を使用することができる。Ｈ又はＬ鎖のＮ末端残基又はＣ末端残基に、ペプチドを融合させることができる。このような融合遺伝子の発現は、典型的には哺乳動物細胞系中で行われるが、例えば細菌又は酵母菌発現系などの、他の発現系を使用することができる。
【００４５】
本発明のペプチドは、免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される生物学的活性を有する。例には免疫賦活又は免疫調節活性がある。ペプチドは例えば、サイトカインのホルモン、リガンド、又は細胞受容体の本来のリガンドに由来する結合部位であってよい。好ましい実施形態では、ペプチドはＣ３ｄ領域１２１７〜１２３２に由来し、約１０〜約１６量体の範囲である。他の実施形態ではペプチドは、Ｃ３ｄ領域１２１７〜１２３２に由来する１６量体ペプチドである。
【００４６】
ペプチドは、完全長免疫グロブリン分子又は抗体の可変ドメイン断片である抗体と、結合することができる。本明細書で使用する、用語「抗体」は、抗原結合部位を含む重鎖又は軽鎖免疫グロブリン分子、或いはその任意の機能的組合せ又は断片を一般的に指す。抗体は、タンパク質、糖タンパク質、多糖又は炭水化物などの膜構造体上、及び正常細胞又は腫瘍細胞上の細胞受容体に特異的であることが好ましい。
【００４７】
抗体中に取り込ませる免疫賦活性要素として、Ｃ３ｄのリガンド部位由来のペプチドを使用することには、分子アジュバントとしての予想外の有用性がある。Ｄ．Ｆｅａｒｏｎ他によって（Ｄｅｍｐｓｅｙ，Ｐ．Ｗ．、Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｄ．、Ａｋｋａｒａｊｕ，Ｓ．、Ｇｏｏｄｎｏｗ，Ｃ．Ｃ、及びＦｅａｒｏｎ，Ｄ．Ｔ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７１：３４８、１９９６）、Ｃ３ｄは分子アジュバントとして、メンドリ卵リソザイム（ＨＥＬ）との完全な融合タンパク質の一部として使用されてきている。これらの筆者は、ＨＥＬ−Ｃ３ｄ融合タンパク質が、遊離ＨＥＬより１０，０００倍まで免疫原性が高いことを示している（国際特許公開、国際公開第９６／１７６２５号を参照のこと）。
【００４８】
我々の最新の動物実験では、Ｃ３ｄ断片由来のペプチドを使用し化学的架橋したイディオタイプワクチンを用いて、免疫原性の同様の増大が観察されている（以下の実施例を参照のこと）。Ｃ３ｄペプチドをイディオタイプ及び抗イディオタイプワクチンと結合させることは、これらのワクチンの免疫原性を増大させ、フロイントアジュバンドなどの強力なアジュバンドと組み合わせた、ＦＤＡによってヒトに関する使用には認められていない、ＫＬＨなどの担体分子の結合の必要性の代わりとなると考えられる。
【００４９】
他の実施形態では、ペプチドは位置１２１７〜１２３２のヒトＣ３ｄ残基と相同的なヒト又は非ヒトＣ３ｄ領域に由来してよく、約１０〜約１６量体の範囲である。抗体ワクチンに対する、親和性架橋した生物学的活性があるペプチドの他の適用例には、サイトカイン由来の活性ペプチドがある。例えば、ＩＬ１−βサイトカイン由来のナノペプチドが記載されており（Ａｎｔｏｎｉ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７：３２０１〜０４、１９８６）、これは望ましくない副作用を誘導しない免疫賦活性を有する。本発明に従い抗体中に挿入することができる活性ペプチドの他の例には、シグナルペプチド、及び抗体の自己結合部位由来のペプチドがある。
【００５０】
サイトカインのホルモン、リガンド、又は細胞受容体の本来のリガンド由来の結合部位などの、生物学的活性を有するさまざまなペプチドが知られている。
【００５１】
以下の実施例１〜３は、親和性架橋によって作製されるＣ３ｄ／抗体複合体に関するものであるが、これらを提供して抗体と結合したＣ３ｄペプチドによって与えられる免疫応答に対する影響を示す。
【実施例１】
【００５２】
抗イディオタイプワクチンの向上。３Ｈ１は、ネズミ抗イディオタイプ抗体であり（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ−Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４５：２７５８〜６５、１９９０）、これは癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を模倣している。３Ｈ１は、フロイントの完全アジュバント中でＫＬＨ結合ワクチンとして使用すると、抗ＣＥＡ抗体を動物中で誘導する。３Ｈ１は臨床第Ｉ相試験においても試験されており、この場合３Ｈ１は、治療した癌患者のほぼ半分でＣＥＡと結合する抗体を誘導する。しかしながら、部分的には低い免疫原性のために、臨床的応答はこの試験では観察されなかった（Ｆｏｏｎ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｓｔ．、９６：３３４〜３４２、１９９５）。
【００５３】
３Ｈ１ｍＡｂは、Ｃ３ｄ領域１２１７〜１２３２由来の１３量体ペプチド（配列番号１）と親和性架橋させた。アミノ酸配列はＣｄ３ペプチドに由来し、以下の配列：ＫＮＲＷＥＤＰＧＫＱＬＹＮＶＥＡ（配列番号１）を有する。
【００５４】
ＢＡＬＢ／ｃマウスに、２５μｇのＣ３ｄ−３Ｈ１をリン酸−生理食塩水溶液に溶かしたものを筋肉内に２回免疫処置した。最後の免疫処置の７日後、マウスを失血させ、８０１９（Ａｂ１イディオタイプ）、及びＣＥＡ発現腫瘍系ＬＳＩ７４Ｔとの結合に関して血清を試験した。ＦＡＣＳにより測定すると、Ｃ３ｄ−３Ｈ１免疫マウス由来の血清はＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞と結合するが、一方で対照血清（正常なマウスの血清）は、バックグラウンド蛍光のみを示した。Ｃ３ｄ−３Ｈ１で免疫処置したマウス由来の血清は、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧで発色させるサンドウィッチアッセイにおいて、ＬＳ１７４Ｔ細胞のＦＡＣＳで使用した。対照は正常なマウスの血清であった。分析した細胞数は、ｌｏｇ１０単位の相対的な蛍光強度に対してプロットした。
【実施例２】
【００５５】
さらに、３Ｈ１（２５マイクログラム、生理食塩水中）又は３Ｈ１−Ｃ３ｄ−ペプチド（親和性架橋、２５マイクログラム、生理食塩水中）で３回免疫処置したマウス由来の血清も、Ａｂ３応答性に関して試験した。マウスを出血させ、ＥＬＩＳＡにおいて３Ｈ１のＦ（ａｂ）との結合に関して血清を試験した。マウス血清の希釈物と３Ｈ１Ｆ（ａｂ）の結合を測定することによって、裸の３Ｈ１はＡｂ３抗体を誘導しないが、３Ｈ１−ペプチドは誘導し、親和性架橋した３Ｈ１は免疫原性を増大させたことを示した。
【００５６】
本発明を実施する際に使用することができる他のＣ３ｄペプチドには、その全容が参照として本明細書に組み込まれている、Ｌａｍｂｒｉｓ他、「補体の第三の成分、Ｃ３の系統発生（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ、Ｃ３）」中、Ｅｒｆｉ、Ａ ｅｄ．「補体の構造及び機能の新たな側面（Ｎｅｗ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」、Ａｕｓｔｉｎ，Ｒ．Ｄ．Ｌａｎｄｅｓ Ｃｏ．、１９９４ ｐ．１５〜３４中に総説されたペプチドがある。
【実施例３】
【００５７】
マウス腫瘍イディオタイプワクチン（３８Ｃ１３）の増強。３８Ｃ１３は、３８Ｃ１３ Ｂ−リンパ腫腫瘍細胞系によって発現されるイディオタイプである。Ｌｅｖｙのグループは、このイディオタイプ腫瘍ワクチンモデルを開発してきており、ＫＬＨ結合３８Ｃ１３Ｉｄを用いた事前免疫処置によって、マウス中での３８Ｃ１３腫瘍細胞による攻撃に対して防御することができることを示している（Ｋａｍｉｎｓｋｉ，Ｍ．Ｓ．、Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｋ．、Ｍａｌｏｎｅｙ，Ｄ．Ｇ．及びＬｅｖｙ，Ｒ．、Ｊ．Ｌｎｎｉｕｎｏｌ．、１３８：１２８９、１９８７）。Ｌｅｖｙと同僚（Ｔａｏ，Ｍ−Ｈ．及びＬｅｖｙ，Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：７５５〜７５８、１９９３）は、キメラ遺伝子から作製され哺乳動物細胞培養物の発酵において発現される、融合タンパク質（ＣＳＦ−３８Ｃ１３）を使用する腫瘍防御の誘導も報告している。３８Ｃ１３Ｉｄタンパク質は、Ｃ３Ｄ領域１２１７〜１２３２由来の１６量体アジド−ペプチドと親和性架橋させた。
【００５８】
１０匹のマウスに、５０ｕｇのＣ３ｄ−３８Ｃ１３結合体をリン酸−生理食塩水溶液に溶かしたものを腹腔内に３回免疫処置した。３回目のワクチン接種の後、マウスを３８Ｃ１３腫瘍細胞で攻撃した。対照群は、この腫瘍モデル中で「ゴールドスタンダード」とみなされるＱＳ−２１に溶かした３８Ｃ１３−ＫＬＨ（アジュバント）をワクチン接種したマウス、及びＱＳ−２１のみを注射したマウスを含んでいた。Ｃ３ｄ−３８Ｃ１３結合体をワクチン接種した１０匹のマウス中７匹が、腫瘍攻撃後第３５日まで生存し、ＱＳ−２１に溶かしたＫＬＨ−３８Ｃ１３をワクチン接種したマウスも同様であった。全ての対照マウスにはＱＳ−２１のみを注射し、第２２日までに死亡した。
【００５９】
Ｃ３Ｈマウスを、ＱＳ−２１に溶かした３８Ｃ１３−ＫＬＨ、又はＱＳ−２１無しの３８Ｃ１３−Ｃ３ｄペプチドで３回免疫処置した（５０μｇ、腹膜内）。対照マウスにはＱＳ−２１のみを注射した。免疫処置マウス及び対照マウスは、次いで３８Ｃ１３腫瘍細胞で攻撃し、生存を調べた。
【００６０】
実施例１〜３に記載した結果は、免疫賦活性ペプチドと腫瘍抗イディオタイプ及びイディオタイプワクチン抗体の親和性による架橋によって、腫瘍に対する免疫応答を有意に増大させ、腫瘍攻撃に対して防御することができることを示す。Ｃ３ｄ架橋ワクチンを用いるワクチン接種プロトコルは、フロイントのアジュバントなどの任意のアジュバント、又はＫＬＨ結合体を含んでおらず、この両者はヒトにおける使用に関してはＦＤＡによって認められていない。
【００６１】
前の実施例で使用した手順の幾つかは知られており、Ｃ３ｄ（補体断片）の活性結合ペプチドはＬａｍｂｒｉｓ他、（ＰＮＡＳ、８２：４２３５〜３９、１９８５）によって記載されており、これはその全容が参照として本明細書に組み込まれている。
【００６２】
以下の追加的な実施例を与えて、融合タンパク質を作製する一般的な技法を実証し、免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される生物学的活性を有する特定のペプチドを示す。
【実施例４】
【００６３】
膜移動ペプチド（ＭＴＳ−ペプチド）を含む融合非Ｉｇタンパク質。例えば、Ｒｏｊａｓ、Ｍ，Ｄｏｎａｈｕｅ、Ｊ Ｐ，Ｔａｎ，Ｔ．及びＬｉｎ，Ｙ−Ｚ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６：３７０、「グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−ＭＴＳペプチド（ＧＳＴ−ＭＴＳ）発現プラスミドの構築（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ＭＴＳ ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＳＴ−ＭＴＳ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ）」１９９８を参照のこと。
【００６４】
２つの異なるＧＳＴ−ＭＴＳ発現プラスミドを、生物学的用途に応じて、アミノ末端又はカルボキシル末端伸長部として疎水性ＭＴＳを有する、標的タンパク質又はタンパク質ドメインを生成することができるように構築した。プラスミドｐＧＥＸ−３Ｘ−ＭＴＳＩ及びｐＧＥＸ３Ｘ−ＭＴＳ２を構築するために、以下の相補的オリゴヌクレオチドを合成した：
【００６５】
アニーリング後、二本鎖ＭＴＳＩオリゴヌクレオチドとＭＴＳ２オリゴヌクレオチドを、ＢａｍＨＩで消化したｐＧＥＸ−３Ｘ中で連結させた（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．、「グルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合体として大腸菌中で発現されるポリペプチドの１ステップ精製（Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｓ ｆｕｓｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）」Ｇｅｎｅ、６７：３１、１９８８．）。ＤＮＡ配列分析によって、それぞれのプラスミドにおいて、ＭＴＳコード配列は正確であり、ＧＳＴコード配列とインフレームであったことを確認した。
【００６６】
ＧＳＴ−Ｇｒｂ２ＳＨ２、ＧＳＴ−Ｇｒｂ２ＳＨ２−ＭＴＳ、及びＧＳＴ−ＳｔａｔｌＳＨ２−ＭＴＳ発現プラスミドの構築。ヒトＧｒｂ２ＳＨ２ドメイン（アミノ酸残基５４〜１６４）（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．Ｊ．、Ｄａｌｙ，Ｒ．Ｊ．、Ｂａｔｚｅｒ，Ａ．Ｇ．、Ｕ，Ｗ．，Ｍａｒｇｏｌｉｓ，Ｂ．、Ｌａｍｍｅｒｓ，Ｒ他、「ＳＨ２及びＳＨ３ドメイン含有タンパク質Ｇｒｂ２は受容体チロシンキナーゼと結合してｒａｓシグナル化する（Ｔｈｅ ＳＨ２ ａｎｄ ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｒｂ２ ｌｉｎｋｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ ｔｏ ｒａｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）」、Ｃｅｌｌ、７０：４３１、１９９２）、又はヒトＳｔａｔｌＳＨ２ドメイン（残基５６７〜７１６）（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ，Ｃ．、Ｆｕ，Ｘ．−Ｙ、Ｉｍｐｎｏｔａ，Ｔ．、Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｒ．、及びＤａｒｎｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．Ｊｒ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：７８３６、１９９２）をコードするＤＮＡ断片を、Ｇｒｂ２のｃＤＮＡクローン又はＳｔａｔｌのｃＤＮＡクローンからＰＣＲにより合成した。それらの５’端にＢａｍＨＩ部位をそれぞれ含む、ＰＣＲ用に使用したプライマーは、以下のものであった：
【００６７】
ＰＣＲ産物はＢａｍＨＩで消化し、ＢａｍＨＩで消化したｐＧＥＸ−３Ｘ又はｐＧＥＸ−３ＸＭＴＳ２中で連結させた。ベクター／挿入体接合部のＤＮＡ配列分析によって、ＧＳＴ−Ｇｒｂ２ＳＨ２、ＧＳＴ−Ｇｒｂ２ＳＨ２−ＭＴＳ、及びＧＳＴ−Ｓｔａｔ１ＳＨ２−ＭＴＳの翻訳読み取り枠が、それぞれの発現プラスミド中で保たれたことを確認した。
【００６８】
ＭＴＳ融合タンパク質の発現
ＧＳＴ融合タンパク質の発現及び精製。適切な発現プラスミド７４を含む大腸菌菌株ＤＨＳｏｒを、３７℃において１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢブロス中で増殖させた。ＧＳＴ融合タンパク質の発現は、イソプロピル、Ｂ−Ｄ−チオガラクトシド（０．５ｍＭの最終濃度）を加えることによって誘導し、３７℃でのインキュベーションを２〜３時間続けた。ＧＳＴ融合タンパク質は、グルタチオン−アガロース親和性クロマトグラフィーによって細菌細胞の溶解物から精製した（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．Ｇｅｎｅ、６７：３１、１９８８）、ただし超音波処理の後、グルタチオン−アガロースビーズと混合する前に、５分間２０００回転での遠心分離によって細胞溶解物を除去した。タンパク質調製物はＰＭＩＯ膜（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用する限外濾過によって濃縮し、すぐに使用するために４℃で、或いは長期の保存用に−７０℃で保存した。タンパク質濃度は、２８０ｎｍにおいて分光光度計によって測定した。生物学的アッセイにおいてこれらを使用する直前に、知られている濃度の野生型ＧＳＴと比較したクーマシーブリリアントブルー染色強度を使用する、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質濃度を確認した。ＧＳＴ−ＭＴＳタンパク質中のＭＴＳのアミノ酸含有量を確認するために、（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．、Ｇｅｎｅ６７：３１、１９８８）に記載されたのとほぼ同様に、プロテアーゼ因子Ｘａを用いてグルタチオン−アガロース結合ＧＳＴ−ＭＴＳＩから、ＭＴＳペプチドを切断した。切り離したＭＴＳ含有ペプチドはＣ逆相ＨＰＬＣによって精製し、（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．、Ｇｅｎｅ６７：３１、１９８８）に記載されたのと同様に、質量分光分析によって特徴付けした。切り離したＭＴＳ含有ペプチドはＣ１８逆相ＨＰＬＣによって精製し、（Ｌｉｎ，Ｙ−Ｚ．、Ｙａｏ，Ｓ．、Ｖｅａｃｈ，Ｒ．Ａ．、Ｔｏｒｇｅｒｓｏｎ，．Ｒ．、及びＨａｗｉｇｅｒ，Ｊ．、ＪＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４２５５、１９９５）に記載されたのと同様に、質量分光分析によって特徴付けした。
【実施例５】
【００６９】
Ｃ３ｄ−ＨＥＬ融合タンパク質（Ｄｅｍｐｓｅｙ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７１：３４８、１９９６）。ＨＥＬ、Ｃ３ｄ（Ｈ．Ｄｏｍｄｅｙ他、Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、７９：７６１９、１９８２）ｄｏｑプレ−プロ−インシュリンシグナル配列（Ｍ．Ｅ．Ｔａｙｌｏｒ及びＫ．Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２７４、５７５、１９９１）、及び（Ｇ４Ｓ）２連結基をコードする相補的ＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させた。エピトープタグ及び停止コドンは、オリゴヌクレオチド連結基によってコードされていた。融合タンパク質カセットはタンデム：ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中で（Ｇ４Ｓ）２によって連結された、ｄｏｑプレ−プロ−インシュリンシグナル配列、ＨＥＬ、及び１〜３個のＣ３ｄのコピーで構築した。ＨＥＬ−Ｃ３ｄ３カセットは、Ａ７１ｄベクターにサブクローニングした。プラスミドｐＳＧ．ＨＥＬ、ｐＳＧ．ＨＥＬ．Ｃ３ｄ、及びｐＳＧ．ＨＥＬ．Ｃ３ｄ２を、ｐＳＶ２−ｎｅｏと共にＬ細胞及びＡ７１ｄにコトランスフェクトした。ＨＥＬ．Ｃ３ｄ３をＣＯＳ細胞中で一過的に発現させた。組換えタンパク質は、ＹＬ１／２抗体に関する親和性クロマトグラフィー（Ｈ．Ｓｋｉｎｎｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、６６：１４１６３、１９９１）、及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）での分画化によって精製した。
【００７０】
融合尾部は研究室規模で有用であり、経済的な回収法を使用して回収を高めるための能力を有し、これらは産業の下流プロセス用に容易にスケールアップされる。融合尾部を使用して標的タンパク質の分泌を促進することができ、酵素活性又は抗体結合に基づいて有用なアッセイタグを与えることもできる。多くの融合尾部は標的タンパク質の生物学的活性を害さず、幾つかの場合、それを安定化させることが示されてきている。それにもかかわらず、真正タンパク質の精製に関して、特異的に切断される部位が含まれることが多く、回収後に尾部の除去が可能になる。
【００７１】
組換えタンパク質を回収及び精製するための融合尾部。（例えば、Ｆｏｒｄ Ｃ．、Ｓｕｏｍｉｎｅｎ Ｉ．、Ｇｌａｔｚ Ｃ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．２〜３：９５〜１０７、１９９１を参照のこと）。本発明の融合タンパク質は、粗製の細胞抽出物又は培養培地からの組換えタンパク質の効率の良い回収及び精製を促進するように開発された、融合尾部も含むことができる。これらの系では、標的タンパク質は遺伝的に改変されて、Ｃ末端又はＮ末端ポリペプチド尾部を含んでおり、これによって回収及び精製における特異性に関する生化学的基盤が与えられる。さまざまな特性を有する尾部が使用されてきている：
（１）固定された基質又は阻害剤に関する親和性を有する完全な酵素；
（２）免疫グロブリンＧ又はアルブミンとの親和性を有するペプチド結合タンパク質；
（３）炭水化物結合タンパク質又はドメイン；
（４）融合タンパク質とアビジン又はストレプトアビジンの親和性を促進するための、ｉｎ ｖｉｖｏビオチン化用のビオチン結合ドメイン；
（５）固定されたモノクローナル抗体との親和性を有する抗原エピトープ；
（６）固定金属の親和性クロマトグラフィーによる回収用のポリ（Ｈｉｓ）残基；及び
（７）アミノ酸側鎖の性質に基づく結合特異性を有する他のポリ（アミノ酸）。
【００７２】
融合尾部は研究室規模で有用であり、経済的な回収法を使用して回収を高めるための能力を有し、これらは産業の下流プロセス用に容易にスケールアップされる。融合尾部を使用して標的タンパク質の分泌を促進することができ、酵素活性又は抗体結合に基づいて有用なアッセイタグを与えることもできる。多くの融合尾部は標的タンパク質の生物学的活性を害さず、幾つかの場合、それを安定化させることが示されてきている。それにもかかわらず、真正タンパク質の精製に関して、特異的に切断される部位が含まれることが多く、回収後に尾部の除去が可能になる。
【００７３】
本発明は、対応する抗原に関する抗体の特異性を変えずに抗体の生物学的活性及び免疫活性を高める、抗体−ペプチド融合タンパク質の作製を記載する。この遺伝的に改変された融合タンパク質は、特許出願第０９／０７０，９０７号中に記載される化学的に改変されたキメラ抗体と似ている。詳細には本発明は、いずれも前に記載した、完全又は部分的な独立栄養性２４量体ペプチド、膜輸送ペプチド（ＭＴＳ）又はＣ３ｄペプチドを含む抗体融合タンパク質の作製を提供する。
【００７４】
本発明は、（１）抗体及び（２）免疫賦活、膜輸送及び同種親和活性からなる群から選択される生物学的活性を有するペプチドであって、抗体の抗原結合を害さない部位で、抗体とペプチド結合によって結合したペプチドから構成される融合タンパク質を含む、組成物及び医薬組成物も提供する。
【００７５】
本発明のペプチド／抗体複合体中に、任意の抗体を使用することができる。好ましい抗体は抗イディオタイプ抗体である。例えば、抗イディオタイプ抗体３Ｈ１を使用することができる（「アジュバント治療剤として胎児性癌抗原（ＣＥＡ）を模倣した抗イディオタイプ抗体ワクチン（３Ｈ１）（Ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｃｃｉｎｅ （３Ｈ１）ｔｈａｔ Ｍｉｍｉｃｓ ｔｈｅ Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）ａｓ ａｎ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、Ｆｏｏｎ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｗｅｅｋｌｙ、Ｊｕｎ．２４、１９９６を参照のこと）。本発明で使用することができる他の抗イディオタイプ抗体には、例えばクラミジア糖脂質外抗原に対する抗イディオタイプ抗体（米国特許第５，６５６，２７１号）；メラノーマ及び小細胞癌腫の治療用の抗イディオタイプ抗体１Ａ７（米国特許第５，６１２，０３０号）；抗イディオタイプ抗体ＭＫ２−２３抗メラノーマ抗体（米国特許第５，４９３，００９号）；抗イディオタイプ淋菌抗体（米国特許第５，４７６，７８４号）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗イディオタイプ抗体（米国特許第５，２３３，０２４号）；ヒトＢ細胞腫瘍の表面Ｉｇに対する抗体（米国特許第４，５１３，０８８号）；及びモノクローナル抗体ＢＲ９６（米国特許第５，４９１，０８８号）がある。ペプチドの長さに関する任意の制限は、ペプチド合成に関する実際の制約であるが、本発明の方法の実施に関する制限ではない。
【００７６】
さらに、（その全容が参照として本明細書に組み込まれている、Ｋａｎｇ，Ｃ．Ｙ．Ｂｒｕｎｃｋ、Ｔ．Ｋ．，Ｋｉｅｖｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ、Ｔ．、Ｂｌａｌｉｃｋ，Ｊ．Ｅ．及びＫｏｈｌｅｒ，Ｈ．、「ＶＨ由来ペプチドによる自己結合タンパク質（自己抗体）の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｆ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ａｕｔｏ−ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）ｂｙ ａ ＶＨ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０３４〜１０３６、１９８８）中に開示されたペプチドなどの自己結合ペプチドを、本発明の方法で使用することができる。
【００７７】
さらに、その全容が参照として本明細書に組み込まれている、Ｒｏｊａｓ他、「細胞膜浸透性を有するタンパク質の遺伝的改変（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：３７０〜３７５（１９８８）及び「Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍシグナル変換カタログ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ）」１９９７／９８中に開示されたペプチドなどのシグナルペプチドを、本発明の方法で使用することができる。
【００７８】
米国特許第５，５２３，２０８号（その全容が参照として本明細書に組み込まれている）の開示に従い、逆水治療法性を有しペプチド内で相互親和性及び同種親和性（自己）結合を示す、ペプチドを設計することができる。
【００７９】
本発明は、正常細胞又は感染細胞中の細胞機能を調節するための新規な化合物及び方法を企図するものである。このような化合物は、そこに結合したペプチドの細胞浸透作用によって細胞内に内在化することができる、抗体又はその断片を含む。このようなペプチドを本明細書では、「膜輸送ペプチド」などと呼ぶ。知られている膜輸送ペプチド、又はそれらの活性断片は、結合ペプチドとして使用することができる。このような抗体又はその断片は、（ａ）カスパーゼ、キナーゼ、及びホスファターゼなどの細胞内のシグナルタンパク質、（ｂ）細胞内で構築される前の未成熟ビリオンタンパク質、（ｃ）細胞表面抗原又は細胞内腫瘍抗原、（ｄ）ＤＮＡ合成及び遺伝子発現の調節に関与する核タンパク質又は核小体タンパク質、又は（ｅ）細胞増殖又は細胞分裂停止に関与する細胞骨格タンパク質などのタンパク質標的に免疫特異的である。ポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用することができる。このような抗体又はそれらの断片は、１０−９Ｍ以上の親和性でそれらの抗原決定基と結合することが好ましい。
【００８０】
本発明の特に好ましい化合物は、膜輸送タンパク質、又はそのペプチド断片と結合した抗カスパーゼ抗体を含む化合物である。好ましい膜輸送断片は、膜転座配列（ＭＴＳ）ペプチドである。特に好ましい膜輸送ペプチドには、以下のものがある：
（１）ＫＧＥＧＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＧ（配列番号８）、カポジ肉腫の線維芽細胞成長因子［Ｋ−ＦＧＦ］由来（Ｒｏｊａｓ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６：３７０〜３７５（１９８８）。
（２）ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号９）、前述のペプチドの切断型、Ｌｉｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：５３０５（１９９６）を参照のこと。
（３）ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１０）、アンテナペディアのホメオドメイン（Ａｎｔ）由来の「ペネトラチン」（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ｍ．他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７０（１４）：３０５５〜３０６３（２００３）を参照のこと）。
（４）ＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１１）、ペネトラチンのＣ末端配列、例えばＦｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．他、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．、５５（２）：１６３〜１７２（２０００）を参照のこと。
（５）ＴＡＴペプチド、例えばＨＩＶ−Ｉ ＴＡＴ由来のａａ４７〜５７及び４８〜６０（例えばＳｃｈｗａｒｚｅ、Ｓ．他、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．、２１：４５、２０００；Ｌｉ Ｙ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２９８（３）：４３９〜４４９、２００２；Ｈａｌｌｂｒｉｎｋ Ｍ．他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１５１５（２）：１０１〜１０９、２００１を参照のこと）。
（６）ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２（Ｅｌｌｉｏｔ，Ｇ．他、Ｃｅｌｌ、８８：２２３（１９９７））。
（７）ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１２）、「トランスポルタン」、２７量体ペプチド（Ｐｏｏｇａ、Ｍ．他、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、１２：６７（１９９８）；Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ｍ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、４０：３１４１〜３１４９、２００１を参照のこと）。
（８）ＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号１３）、Ｎ末端６残基が欠失したトランスポルタン（Ｓｏｏｍｅｔｓ、Ｕ．他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４６７：１６５〜１７６、２０００を参照のこと）。
（９）ＭＡＰとも呼ばれる、Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（ＫＬＡＬ）（配列番号１４）（Ｈａｌｌｂｒｉｎｋ Ｍ．他、Ｂｌｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１５１５（２）：１０１〜１０９、２００１も参照のこと）。
【００８１】
本明細書で論じる、膜輸送タンパク質又はその断片と結合した抗カスパーゼ抗体を含む、アポトーシスを阻害するのに有効な医薬組成物も企図される。これらを作製するそのような融合タンパク質及び方法は、参照として本明細書に組み込まれている米国特許第０９／８６５，２８１号（Ｋｏｈｌｅｒ他）中に開示されている。
【００８２】
本発明の好ましい免疫複合体は、抗体のヌクレオチド又はトリプトファン部位仲介、又は抗体のＮ末端連結炭水化物仲介を含めた連結の幾つかの型の１つによって、ＭＴＳ配列と結合した二次抗体を含む。本明細書で使用する「二次抗体」は、一次抗体と特異的に高い親和性で結合する、抗体又はその断片を指す。本発明に有用な二次抗体には、ネズミ又はヒトＩｇＧに対するポリクローナル又はモノクローナル抗グロブリン、又は抗体に独立栄養性を与えるＴ１５配列（Ｋａｎｇ，ＣＹ、Ｂｒｕｎｃｋ，ＴＫ、Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ、Ｔ他、「ＶＨ由来ペプチドによる自己結合抗体（自己体）の阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｆ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（ａｕｔｏｂｏｄｉｅｓ）ｂｙ ａ ＶＨ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０３４〜６、１９８８）などの、新規且つ／或いは備え付けの配列を標的とする二次抗体がある。
【００８３】
細胞表面抗原を標的とするモノクローナル抗体又は免疫複合体を事前投与又は事前注射し、標的との結合及び組織からの除去に充分な時間を与え、ＭＴＳペプチドと共有結合した二次抗体の投与を続けることによって送達を行う。一次抗体は毒素、薬剤、酵素又はアイソトープなどの阻害剤と結合することができ、これによって阻害剤分子の細胞中への送達を高めることができる。ＭＴＳペプチドと結合した二次抗体は、一次抗体を認識しこれと結合し、ＭＴＳペプチド活性によって細胞に内在化する。このようにして、一次免疫複合体が細胞中に運ばれ、そこでその阻害作用が高まる。
【００８４】
一次抗体とＭＴＳと結合した二次抗体を混合させ、次いで細胞を露出させ、及び一次抗体を標的とする細胞活性の阻害に関して試験することによって、このような二次結合体を使用して、細胞内標的に対するモノクローナル抗体の有用性を評価することもできる。この迅速なスクリーニングでは、細胞内標的に対する多くの抗体を、アンタゴニスト又はアゴニストとしての有用性に関してスクリーニングすることができる。したがって活性を有する抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏ使用のためにＭＴＳなどの膜輸送ペプチドと直接結合させることができる。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態は、二次抗体及び一次抗体のトリプトファン又はヌクレオチド結合部位と結合した、化学物質又はペプチド連結基又はキレート化合物によってスルフヒドリル、εアミノ酸又は炭水化物残基を介して結合した毒素、薬剤又はアイソトープと結合した、ＭＴＳペプチドを使用する。
【００８６】
本発明は概略的に、ｉｎ ｖｉｖｏにおける抗体結合体の細胞内部への送達に関する。このような抗体は潜在的に中和、抗ウイルス抗体、抗調節タンパク質抗体、又は抗腫瘍抗体であってよい。例えば、ＭＴＳペプチドを含む抗体結合体、及び未成熟ウイルス又は病原体で最も発現されるウイルス又は他の細胞内病原体上の抗原決定基を対象とする抗体を、生きている生物に投与することによって、送達を行うことができる。このような結合体は、それが他の細胞を成熟させ感染させる機会を有する前に、高い親和性で結合し、ウイルス構築体を破壊し、ウイルスを中和する充分な機会を有する。
【００８７】
したがって本発明は、広範囲の抗体療法の一例としての、抗ウイルス（抗ＨＩＶ）療法を提供する。本発明において好ましい抗体は、以下の好ましい性質を有する：
（１）本発明の抗体は、主に細胞内で発現される抗原と結合する。これは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）及びウイルス糖タンパク質を含む。前者は、ＣＥＡなどのＴＡＡを含む。個々の抗原決定基は細胞内形のタンパク質と主に結合することができ、一方他の抗原決定基は、主に表面上で発現される可能性がある。本発明より前に、細胞表面分子との反応性に関して、細胞内抗原を標的化する能力を有する、多くの有用な治療抗体が選択されており、選択基準は細胞内抗原との主な反応性を含むと思われる。
（２）細胞内標的はウイルス糖タンパク質を含む。例えば、大部分のモノクローナル抗体は、わずか数継代の細胞中を伝播するウイルスではなく多継代の細胞中を伝播するウイルスに対して産生されており；結果として、ウイルスに対する大部分のモノクローナル抗体は、新たな単離体よりも研究室用のウイルス菌株と良好に反応する。この結合の違いに関して提案されている説明は、大部分の抗体は、ＨＩＶに対する抗体と同様に、充分なグリコシル化及びウイルス糖タンパク質の折り畳みのために、わずか数継代のウイルス（及びおそらく新たに合成されたウイルス）由来のウイルス糖タンパク質上に隠れており且つ部分的に埋もれている、抗原決定基と反応するということである。これは、大部分の抗体は、過小グリコシル化又は不完全にグリコシル化した糖タンパク質を有する未成熟ビリオン又は不完全ビリオン、及び／又は完全に構築されていない未成熟ビリオン又は不完全ビリオンとより良く結合するはずであることを意味すると思われる。したがって、本来のウイルスとの限られた反応性のために、療法に有用であるとみなされない抗体は、細胞内の未成熟形への接触によって、標的化するのに有用であると思われる。
（３）本発明の抗体は、立体配座依存性の配列よりも、ＴＡＡ又はウイルス糖タンパク質上のアミノ酸の直線配列と結合する。このような抗体は、合成及び成熟の初期に細胞内抗原と結合する可能性がさらに高く、これは、細胞内に存在する未成熟ビリオン又は非構築、糖タンパク質前駆体を含むと思われる。
（４）これらの抗体は、１０−９Ｍ以上の親和性でそれらの抗原決定基と結合するはずである。
【００８８】
ＭＴＳ輸送ペプチド改変型モノクローナル抗カスパーゼ−３抗体は、生細胞中のアクチノマイシンＤ誘導型アポトーシス及びスペクトリンの切断を減らすことを、具体的な実施例によって、本明細書においてここで示す。これらの結果は、このような抗体が、さまざまな疾患においてアポトーシスを阻害する治療能力を有することを示唆する。
【実施例６】
【００８９】
細胞系及び抗体。ヒトＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞リンパ腫を、１０％ウシ胎児血清及び抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン及びアンフェテリシン）を補ったＲＰＭＩ １６４０中で増殖させた。ウサギポリクローナル抗活性カスパーゼ−３抗体、及び抗切断型フォドリン、即ちαＩＩスペクトリンを、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した。ウサギモノクローナル抗活性カスパーゼ−３抗体は、ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。ウサギ抗スペクトリン抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入した。マウスモノクローナル抗体３Ｈ１（抗ＣＥＡ）は、タンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーによって細胞培養物上清から精製した。抗マウス及び抗ウサギＨＲＰ結合二次抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。ＡｐｏＡｌｅｒｔカスパーゼ−３蛍光アッセイキットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入した。細胞死検出ＥＬＩＳＡは、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｉｃｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。カスパーゼ阻害剤は、Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ、ＣＡ）から購入した。
【実施例７】
【００９０】
抗体−ペプチド結合体の合成。ＭＴＳペプチド（ＫＧＥＧＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＧ）はシグナルペプチド系膜転座配列（１）であり、Ｇｅｎｅｍｅｄ合成（サンフランシスコ、ＣＡ）によって合成した。抗体をＰＢＳ（ｐＨ６．０）バッファーに対して透析し、１／１０体積の２００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＩＯ４を加え、暗所中で３０分間４℃においてインキュベートすることによって酸化した。３０ｍＭまでグリセロールを加えることによって酸化を停止させ、ＰＢＳ（ｐＨ６．０）バッファーに対して３０分間４℃でサンプルを透析した。５０倍を超えるＭＴＳペプチドを分子中に使用して、３７℃で１時間のインキュベーションによって抗体を結合させ、次いで抗体−ペプチドをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して透析した。
【実施例８】
【００９１】
ＭＴＳ結合抗活性カスパーゼ−３抗体の細胞増殖に対する影響。２．５×１０５個のＪｕｒｋａｔ細胞を、９６ウエルの培養プレートに接種した。０．５μｇのＭＴＳ抗体結合体と共に６、１２、１８及び２４時間インキュベートした後、等分試料を除去し、生存能力のある細胞は色素排除試験（トリパンブルー）を使用して計数した。
【実施例９】
【００９２】
ＥＬＩＳＡによる抗体内在化の試験。１ｍｌ培地で増殖させたＪｕｒｋａｔ細胞を、２μｇの裸又はＭＴＳ抗体結合体と共に、０、１、３、６、１２及び１８時間６ウエルの培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）中でインキュベートした。細胞をスピンダウンさせ、培養物上清を新しいチューブに移し、３０秒間Ｐｅｌｌｅｔ Ｐｅｓｔｌｅ Ｍｏｔｏｒ（Ｋｏｎｔｅｓ、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）によって均質化する前に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で細胞ペレットを２回洗浄した。全ての細胞ホモジェネート及び同体積（１０μｌ）の培養物上清を、ヒツジ抗ウサギＩｇＧをコーティングしたＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｏｘｎａｒｄ、ＣＡ）に加え、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ軽鎖抗体を加え、ｏ−フェニレンジアミンを使用して抗体を目に見える状態にした。
【実施例１０】
【００９３】
ＤＮＡ断片化。Ｊｕｒｋａｔ細胞を抗体又はカスパーゼ−３阻害剤（ＤＥＶＤ−ｆｍｋ）で１時間予備処理し、遠心分離にかけ、アクチノマイシンＤ（１μｇ／ｍｌ）を含む新たな培地と共に４時間インキュベートした。処理後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで７００μｌのＨＬバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中に懸濁させ、室温で１５分間インキュベートした。粗製ＤＮＡ調製物を、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２回抽出し、０．１体積の５Ｍ ＮａＣｌ及び１体積のイソプロパノールを用いて−２０℃で２４時間沈殿させた。回収したＤＮＡは、ＴＥバッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０及び１ｍＭのＥＤＴＡ）に溶かした。同じ量のＤＮＡを１．５％アガロースゲル上での電気泳動によって解像し、臭化エチジウムで染色した後にＵＶ蛍光によって可視化した。ＤＮＡ断片化は、細胞死検出ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）によっても検出し、わずかな改変で製造者の教示書に従いこれを行った：ＪＢ６細胞をｐ１００プレート中で増殖させ、処理後に細胞を回収し、２５μｌの完全な細胞溶解物をそれぞれのサンプルウエルに施した。
【実施例１１】
【００９４】
全細胞溶解物の調製。Ｊｕｒｋａｔ細胞は前項と同じ方法で処理した。処理後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を回収し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、次いで３００μｌのＣＨＡＰＳバッファー（５０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．５、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＣＨＡＰＳ）中に懸濁させた。サンプルを１０秒間超音波処理し、４℃において１５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離にかけた。上清を新しいチューブに移し、「全細胞溶解物」と呼んだ。
【実施例１２】
【００９５】
カスパーゼ−３様切断活性アッセイ。Ｊｕｒｋａｔ細胞は前項と同じ方法で処理した。等しいタンパク質濃度の全細胞溶解物及びＡｐｏＡｌｅｒｔカスパーゼ−３蛍光アッセイキットを使用して、製造者の教示書に従いカスパーゼ−３活性を分析した。スペクトルＭＡＸ ＧＥＭＩＮＩリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、蛍光を測定した。
【実施例１３】
【００９６】
ウエスタンブロット分析。Ｊｕｒｋａｔ細胞は前項と同じ方法で処理した。１０μｇの全細胞溶解物を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離して、切断型スペクトリン（１：１０００希釈）に対する免疫反応性タンパク質を検出した。ポンソー染色を使用して、タンパク質のニトロセルロース膜上への移動の均一性を調べた。膜は蒸留水で洗浄して過剰な染色液を除去し、Ｂｌｏｔｔｏ（５％のミルク、１０ｍｍのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ８．０］、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）中において２時間室温でブロッキングした。二次抗体を加える前に、膜をＴＢＳＴ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、次いでこの膜を、１：４０００希釈でホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共にインキュベートした。最終洗浄ステップは、ＴＢＳＴで３回（それぞれ５分間）、及びＴＢＳ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌ）で２回（それぞれ５分間）を含んでいた。高度な化学発光検出システム（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって、抗体のバンドを目に見える状態にした。
【００９７】
結果
ＭＴＳ結合抗活性カスパーゼ−３抗体は、細胞増殖の阻害をほとんど示さない。最初に試験したのは、細胞に対するＭＴＳ抗体結合体の潜在的な毒性であった。細胞の生存能力アッセイによって、ＭＴＳ抗体結合体は細胞増殖に対してほとんど影響を示さなかったことが示された（図１）。
【００９８】
ＭＴＳペプチドは、生細胞中への抗活性カスパーゼ−３抗体の迅速な浸透を促進する。サンドウィッチアッセイを使用し、ＥＬＩＳＡを設計してウサギＩｇを捕捉した。図２中に見られるように、ＭＴＳ結合体は、モノクローナル抗活性カスパーゼ−３抗体を、生細胞中へ内在化させるのを迅速に促進した。Ｉｇの移動は１時間以内に増大し、１８時間後に安定状態に達した。培養物中に残っていた抗体は１時間で減少し、１８時間で平衡状態に達したようであった。裸抗体の内在化は遅れ（３時間で）、ＭＴＳ結合抗カスパーゼ−３抗体と比較して低いレベルの状態であった。
【００９９】
ポリクローナルＭＴＳ抗活性カスパーゼ−３抗体は、ＤＮＡ断片化を阻害する。ＭＴＳ結合又は裸ポリクローナル抗カスパーゼ−３抗体（１μｇ／ｍｌの最終濃度−１：６４希釈相当）を６ｍｌの培養Ｊｕｒｋａｔ細胞に加え、１時間プレインキュベートした。抗体は遠心分離によって洗浄除去し、アクチノマイシンＤ（１μｇ／ｍｌ）のみを含み抗体は含まない新たな培地を加え、細胞は４時間インキュベートした。５ｍｌの培養物をＤＮＡ断片化用に回収した。裸（非結合）抗カスパーゼ−３ポリクローナル抗体が、アクチノマイシンＤ処理によるＤＮＡラダー化を妨げることはなかった。対照的に、ＭＴＳ結合抗カスパーゼ−３ポリクローナル抗体は、アクチノマイシンＤによって誘導されるＤＮＡ断片化（アポトーシス）を有意に阻害した（データ示さず）。
【０１００】
モノクローナルＭＴＳ抗活性カスパーゼ−３抗体は、ＤＮＡ断片化を妨げる。ＭＴＳ結合又は裸モノクローナル抗カスパーゼ−３抗体（１μｇ／ｍｌの最終濃度）を６ｍｌの培養Ｊｕｒｋａｔ細胞に加え、１時間プレインキュベートした。抗体は遠心分離によって洗浄除去し、アクチノマイシンＤ（１μｇ／ｍｌ）のみを含み抗体は含まない新たな培地を加え、細胞は４時間インキュベートした。５ｍｌの培養物をＤＮＡ断片化用に回収し、残りは細胞死ＥＬＩＳＡアッセイ用に保存した。ＭＴＳ結合抗体がＤＮＡラダー形成を抑制することを観察したが、一方裸（非結合）抗カスパーゼ−３モノクローナル抗体が、アクチノマイシンＤ処理によるＤＮＡラダー化を妨げることはなかった（データ示さず）。細胞死ＥＬＩＳＡアッセイ（図３）によって、ＭＴＳ結合抗体で細胞を予備処理すると、細胞アポトーシスの有意な減少を確認した。カスパーゼ−３阻害剤（ＤＥＶＤ−ｆｍｋ）と共にインキュベートしたＪｕｒｋａｔ細胞は１００％の生存能力を維持し、賦形剤（ＤＭＳＯ）処理した対照細胞は約８０％の生存能力を維持した。裸の抗カスパーゼ−３抗体処理群では、わずか３６％までの細胞が、４時間後に生存能力がある状態であった。しかしながら、７０％の細胞は生存能力がある状態であったので、ＭＴＳ抗カスパーゼ−３結合抗体処理によって、アクチノマイシンＤ誘導型アポトーシスに対しては劇的に保護された（表１参照）。
【表１】
【０１０１】
ＭＴＳ結合抗活性カスパーゼ−３抗体は、カスパーゼ−３活性を抑制する。Ｊｕｒｋａｔ細胞を前項と同様に処理し、ネズミ抗ＣＥＡ抗体を改変し対照として使用した。図４に示すように、カスパーゼ−３様切断活性はアクチノマイシンＤ処理によって増大し、ＭＴＳ結合モノクローナル抗活性カスパーゼ−３抗体はカスパーゼ−３様切断活性を低下させ、一方ＭＴＳ−３Ｈ１抗体は全く効果を示さなかった。細胞死ＥＬＩＳＡアッセイによって、ＭＴＳ結合モノクローナル抗カスパーゼ−３抗体が、有意に低いＤＮＡ断片化を示したことも確認した（データ示さず）。
【０１０２】
ＭＴＳ抗活性カスパーゼ−３抗体はスペクトリン切断を阻害する。カスパーゼ−３の下流標的として、スペクトリンのタンパク質レベルを調べた。スペクトリンの２つの切断断片を、アクチノマイシンＤ処理Ｊｕｒｋａｔ細胞において観察した（データ示さず）。３Ｈ１もＭＴＳ−３Ｈ１も、スペクトリンの切断を保護しなかった。裸のモノクローナル抗活性カスパーゼ抗体は、保護に対する影響をほとんど示さず；一方ＭＴＳ結合抗活性カスパーゼ−３抗体は、カスパーゼ−３阻害剤ＤＥＶＤ−ｆｍｋと同様に、１００ｋＤａ及び７５ｋＤａαＩＩスペクトリン断片の切断を完全に抑制した。１５０ｋＤａの切断バンドは、全ての抗体予備処理細胞サンプルにおいて明らかな変化は全く示さなかった。
【０１０３】
結論
前述の結果は、抗カスパーゼ−３抗体は、カスパーゼ−３活性、ＤＮＡ断片化、及びスペクトリン切断などのｉｎ−ｖｉｔｒｏアポトーシス関連事象を有意に阻害することができることを示す。したがって抗カスパーゼ−３抗体を使用して、さまざまな疾患におけるアポトーシスを阻害することができる。治療上使用される抗体と対照的に、げっ歯類動物モデルにおいて示されるように、従来のペプチドアポトーシス阻害剤は強い阻害を示すだけでなく、高い毒性などの悪い副作用も有する。したがって輸送膜結合抗体は、従来のアポトーシス阻害剤と比較して低い毒性を有する。したがって輸送膜（ＭＴＳ）結合抗体は、特にアルツハイマー病、ハンチングトン病及びパーキンソン病などの疾患の中枢神経系のアポトーシスを含めた、疾患を治療するための有望な新しい候補となる。
【０１０４】
本発明の組成物は、適量の活性成分を含む、単位剤形、滅菌溶液又は懸濁液、滅菌経口溶液又は懸濁液、経口溶液又は懸濁液、水中油型又は油中水型エマルジョンなどでの、ヒト及び動物への全身投与用の医薬組成物に有用である。局所施用は、軟膏、クリーム、ローション、ゼリー、スプレー、灌注剤などの形であってよい。本発明の組成物は、約１〜２０％、及び好ましくは約５〜１５％の組成の、活性成分及び担体又は賦形剤の医薬組成（重量％）で有用である。
【０１０５】
前述の非経口溶液又は懸濁液は経皮的に投与することができ、望むならば、さらに濃縮された徐放形を投与することができる。本発明の架橋ペプチドは、静脈内、筋肉内、腹膜内、又は局所に投与することができる。したがって、経皮投与用に徐放性物質中への活性化合物の取り込みを行うことができる。本発明の目的に認められる医薬担体は、薬剤、宿主、又は薬剤送達デバイスを含む物質に悪影響を与えない、当分野で知られている担体である。担体は、アジュバント、例えば防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤など、及び本発明の浸透性増大物質も含むことができる。哺乳動物に関する有効な用量は、治療される被験体の年齢、体重、活性レベル又は状態などの要因によって変わる可能性がある。典型的には、本発明の化合物の有効な用量は、少なくとも１日１回懸濁液によって投与するとき、約１０〜５００ｍｇ、好ましくは２〜１５ｍｇである。投与は適切な間隔で繰り返すことができる。
【０１０６】
前述の記載及び実施例の目的は、いかなる制限も示さずに本発明の幾つかの実施形態を例示することである。本発明の組成物及び方法のさまざまな変更形態及び変形を、本発明の精神又は範囲から逸脱せずに添付の特許請求の範囲内で実施することができることは、当業者には容易に明らかであろう。本明細書に引用した全ての特許及び刊行物は、それらの全容が参照として組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】ＭＴＳ抗活性カスパーゼ−３抗体結合体で処理したＪｕｒｋａｔ細胞の、検出による生存能力を示す図である。２．５×１０５個のＪｕｒｋａｔ細胞を、９６ウエルの培養プレートに接種した。０．５μｇのＭＴＳ抗体と共に６、１２、１８及び２４時間インキュベートした後、等分試料を除去し、生存能力のある細胞は色素排除試験（トリパンブルー）を使用して計数した。
【図２】サンドウィッチＥＬＩＳＡによる抗体内在化の検出を示す図である。ヒツジ抗ウサギ抗体を、ＥＬＩＳＡプレート（４００ｎｇ／ウエル）上にコーティングした。細胞のホモジェネート及び等体積の培養物上清を、ヒツジ抗ウサギＩｇＧコーティングＥＬＩＳＡプレート（Ｆａｌｃｏｎ、Ｏｘｎａｒｄ、ＣＡ）に加え、室温で２時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギ軽鎖抗体を加え、ｏ−フェニレン−ジアミンを加えることによって抗体を目に見える状態にした。内在化した抗体と培養物中の抗体の比をプロットする。
【図３】細胞死のＥＬＩＳＡアッセイによって測定した、ＤＮＡ断片化の程度を示す図である。ＭＴＳ結合又は裸の抗カスパーゼ−３抗体（２μｇ／ｍｌ）を、６ｍｌの培養したＪｕｒｋａｔ細胞に加え、１時間プレインキュベートした。遠心分離によって抗体を洗浄し、アクチノマイシンＤ（１μｇ／ｍｌ）を含む新鮮な培地を加え、４時間インキュベートした。ラダー電気泳動によるＤＮＡ断片化の評価用に５ｍｌの培養物を回収し；残りはＥＬＩＳＡアッセイ用に回収した。ＡＤ＝アクチノマイシンＤ；裸抗体＝カスパーゼ−３抗体；ＭＴＳ−Ａｂ＝ＭＴＳ結合抗カスパーゼ−３抗体；カスパーゼ−３阻害剤＝ＤＥＶＤ−ｆｍｋ（１００μＭ）。＊、ｐ＜０．０１、対照と比較したもの；＃、ｐ＜０．０１、裸のカスパーゼ−３抗体と比較したもの。
【図４】カスパーゼ−３様切断活性アッセイを示す図である。全細胞溶解物の等量のタンパク質を、ＡｐｏＡｌｅｒｔカスパーゼ−３蛍光アッセイキットを使用することによってこのアッセイに施用した。＊、ｐ＜０．０１、対照と比較したもの；＃、ｐ＜０．０１、裸のカスパーゼ−３抗体と比較したもの。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常細胞又は感染細胞の機能を調節するのに有効な化合物であって、膜輸送ペプチドと結合した抗体又はその断片を含み、前記抗体又はその断片が、（ａ）カスパーゼ、キナーゼ、及びホスファターゼからなる群から選択される細胞内のシグナルタンパク質、（ｂ）未成熟ウイルスタンパク質、（ｃ）細胞表面抗原又は細胞内腫瘍抗原、（ｄ）ＤＮＡ合成及び遺伝子発現の調節に関与する核タンパク質又は核小体タンパク質、又は（ｅ）細胞増殖又は細胞分裂停止に関与する細胞骨格タンパク質に免疫特異的である化合物。
【請求項２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
アポトーシスを阻害するのに有効であり、膜輸送ペプチドと結合した抗カスパーゼ抗体又はその断片を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記抗体が抗カスパーゼ−３抗体である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
前記膜輸送ペプチドが転座配列（ＭＴＳ）ペプチドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記ＭＴＳペプチドがカポジ肉腫の線維芽細胞成長因子、ＨＩＶ−１のＴＡＴペプチド、アンテナペディアホメオドメイン由来のペプチド、ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２、又は輸送ペプチドに内在する、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記ＭＴＳペプチドがアミノ酸残基配列ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号９）を含む、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記ＭＴＳペプチドがアミノ酸残基配列ＫＧＥＧＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＧ（配列番号８）を含む、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記膜輸送ペプチドが、アミノ酸残基配列：ＫＧＥＧＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＧ（配列番号８）を含む第二のペプチドと比べて低い疎水性を有し、前記膜輸送ペプチドが、前記第二のペプチドと比べて大きな内在化の増強と免疫結合力を与える、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
ヒトでのアポトーシスを阻害するのに有効である医薬組成物であって、膜輸送ペプチドと結合した抗カスパーゼ抗体又はその断片を含む医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体が抗カスパーゼ−３抗体である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記膜輸送ペプチドが膜の転座配列（ＭＴＳ）ペプチドである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＭＴＳペプチドがアミノ酸残基配列ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号９）を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＭＴＳペプチドがアミノ酸残基配列ＫＧＥＧＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＧ（配列番号８）を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ヒトの疾患を治療又は予防する方法であって、膜輸送ペプチドと結合した抗カスパーゼ抗体又はその断片を含む組成物の薬理学的に有効な量を、必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項１７】
前記疾患がアルツハイマー病、ハンチングトン病、又はパーキンソン病である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
二次抗体と結合した膜輸送ペプチド又はその断片を含む、免疫複合体。
【請求項１９】
前記二次抗体がポリクローナル又はモノクローナル免疫グロブリンである、請求項１８に記載の免疫複合体。
【請求項２０】
前記膜輸送ペプチド又はその断片がＭＴＳ配列である、請求項１８に記載の免疫複合体。
【請求項２１】
前記膜輸送ペプチド又はその断片が、前記二次抗体のトリプトファン残基又はヌクレオチド結合部位と共有結合している、請求項１８に記載の免疫複合体。
【請求項２２】
前記二次抗体が、前記抗体のスルフヒドリル、εアミノ酸又は炭水化物基を介して阻害物質と共有結合している、請求項１８に記載の免疫複合体。
【請求項２３】
ヒトの疾患を治療又は予防する方法であって、
細胞表面の標的に免疫特異的である一次抗体を必要とする患者に事前投与すること、
前記一次抗体の前記標的への結合及び正常組織からの除去に充分な時間を与えること、及び
膜輸送ペプチド又はその断片と共有結合した二次抗体であって前記一次抗体に免疫特異的である該二次抗体を投与することを含む方法。
【請求項２４】
前記一次抗体が毒素、薬剤又は放射性同位体と結合している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記毒素が（ａ）リシン、アブリン、ジフテリア及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素からなる群から選択されるホロタンパク質毒素、（ｂ）完全タンパク質毒素サブユニット、又は（ｂ）リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素Ａ鎖、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ及びゲロニンからなる群から選択される天然のＡ鎖毒素サブユニットである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記薬剤が、ヒトの疾患を治療するのに適した化学療法剤、又は高い効力を有するがヒトにおける使用に関して許容できないほど高い毒性を有している化学療法剤である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記放射性同位体が、キレート化合物を介して抗体と結合しているα、β又はオージェ放射性同位体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記二次抗体が、光活性化によって前記膜輸送ペプチド又はその断片と共有結合している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記二次抗体が毒素、薬剤又は放射性同位体と結合している、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記毒素が（ａ）リシン、アブリン、ジフテリア及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素からなる群から選択されるホロタンパク質毒素、（ｂ）完全タンパク質毒素サブユニット、又は（ｂ）リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素Ａ鎖、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ及びゲロニンからなる群から選択される天然に存在するＡ鎖毒素サブユニットである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬剤が、ヒトの疾患を治療するのに適した化学療法剤、又は高い効力を有するがヒトにおける使用に関して許容できないほど高い毒性を有している化学療法剤である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記放射性同位体が、キレート化合物を介して抗体と結合しているα、β又はオージェ放射性同位体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記二次抗体が、前記抗体のスルフヒドリル、εアミノ酸又は炭水化物基を介して阻害物質と共有結合している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記患者が癌、ＨＩＶ又は他のウイルスベクター、又は細菌物質に罹患している、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
ｉｎ−ｖｉｔｒｏのスクリーニングアッセイであって、
細胞受容体又は細胞内標的に免疫特異的である一次抗体と複数の細胞を接触させるステップであって、前記一次抗体が膜輸送ペプチド又はその断片と結合しているステップ、及び
前記一次抗体の内在化による細胞活性のアンタゴニズム又はアゴニズムの可能性を評価するステップを含むアッセイ。
【請求項３６】
ｉｎ−ｖｉｔｒｏのスクリーニングアッセイであって、
細胞受容体又は細胞内標的に免疫特異的である一次抗体と複数の細胞を接触させるステップ、
膜輸送ペプチド又はその断片と結合した二次抗体を前記一次抗体と混合させるステップであって、前記二次抗体が前記一次抗体に免疫特異的であるステップ、及び
前記一次抗体の内在化による細胞活性のアンタゴニズム又はアゴニズムの可能性を評価するステップを含むアッセイ。
【請求項１】
正常細胞又は感染細胞の機能を調節するのに有効な化合物であって、膜輸送ペプチドと結合した抗体又はその断片を含み、前記抗体又はその断片が、（ａ）カスパーゼ、キナーゼ、及びホスファターゼからなる群から選択される細胞内のシグナルタンパク質、（ｂ）未成熟ウイルスタンパク質、（ｃ）細胞表面抗原又は細胞内腫瘍抗原、（ｄ）ＤＮＡ合成及び遺伝子発現の調節に関与する核タンパク質又は核小体タンパク質、又は（ｅ）細胞増殖又は細胞分裂停止に関与する細胞骨格タンパク質に免疫特異的である化合物。
【請求項２】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
アポトーシスを阻害するのに有効であり、膜輸送ペプチドと結合した抗カスパーゼ抗体又はその断片を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記抗体が抗カスパーゼ−３抗体である、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
前記膜輸送ペプチドが転座配列（ＭＴＳ）ペプチドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
前記ＭＴＳペプチドがカポジ肉腫の線維芽細胞成長因子、ＨＩＶ−１のＴＡＴペプチド、アンテナペディアホメオドメイン由来のペプチド、ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２、又は輸送ペプチドに内在する、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記ＭＴＳペプチドがアミノ酸残基配列ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号９）を含む、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記ＭＴＳペプチドがアミノ酸残基配列ＫＧＥＧＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＧ（配列番号８）を含む、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記膜輸送ペプチドが、アミノ酸残基配列：ＫＧＥＧＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＧ（配列番号８）を含む第二のペプチドと比べて低い疎水性を有し、前記膜輸送ペプチドが、前記第二のペプチドと比べて大きな内在化の増強と免疫結合力を与える、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
ヒトでのアポトーシスを阻害するのに有効である医薬組成物であって、膜輸送ペプチドと結合した抗カスパーゼ抗体又はその断片を含む医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体が抗カスパーゼ−３抗体である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記膜輸送ペプチドが膜の転座配列（ＭＴＳ）ペプチドである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＭＴＳペプチドがアミノ酸残基配列ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号９）を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＭＴＳペプチドがアミノ酸残基配列ＫＧＥＧＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰＧ（配列番号８）を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ヒトの疾患を治療又は予防する方法であって、膜輸送ペプチドと結合した抗カスパーゼ抗体又はその断片を含む組成物の薬理学的に有効な量を、必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項１７】
前記疾患がアルツハイマー病、ハンチングトン病、又はパーキンソン病である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
二次抗体と結合した膜輸送ペプチド又はその断片を含む、免疫複合体。
【請求項１９】
前記二次抗体がポリクローナル又はモノクローナル免疫グロブリンである、請求項１８に記載の免疫複合体。
【請求項２０】
前記膜輸送ペプチド又はその断片がＭＴＳ配列である、請求項１８に記載の免疫複合体。
【請求項２１】
前記膜輸送ペプチド又はその断片が、前記二次抗体のトリプトファン残基又はヌクレオチド結合部位と共有結合している、請求項１８に記載の免疫複合体。
【請求項２２】
前記二次抗体が、前記抗体のスルフヒドリル、εアミノ酸又は炭水化物基を介して阻害物質と共有結合している、請求項１８に記載の免疫複合体。
【請求項２３】
ヒトの疾患を治療又は予防する方法であって、
細胞表面の標的に免疫特異的である一次抗体を必要とする患者に事前投与すること、
前記一次抗体の前記標的への結合及び正常組織からの除去に充分な時間を与えること、及び
膜輸送ペプチド又はその断片と共有結合した二次抗体であって前記一次抗体に免疫特異的である該二次抗体を投与することを含む方法。
【請求項２４】
前記一次抗体が毒素、薬剤又は放射性同位体と結合している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記毒素が（ａ）リシン、アブリン、ジフテリア及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素からなる群から選択されるホロタンパク質毒素、（ｂ）完全タンパク質毒素サブユニット、又は（ｂ）リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素Ａ鎖、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ及びゲロニンからなる群から選択される天然のＡ鎖毒素サブユニットである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記薬剤が、ヒトの疾患を治療するのに適した化学療法剤、又は高い効力を有するがヒトにおける使用に関して許容できないほど高い毒性を有している化学療法剤である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記放射性同位体が、キレート化合物を介して抗体と結合しているα、β又はオージェ放射性同位体である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記二次抗体が、光活性化によって前記膜輸送ペプチド又はその断片と共有結合している、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記二次抗体が毒素、薬剤又は放射性同位体と結合している、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記毒素が（ａ）リシン、アブリン、ジフテリア及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素からなる群から選択されるホロタンパク質毒素、（ｂ）完全タンパク質毒素サブユニット、又は（ｂ）リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、ジフテリア毒素Ａ鎖、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ及びゲロニンからなる群から選択される天然に存在するＡ鎖毒素サブユニットである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬剤が、ヒトの疾患を治療するのに適した化学療法剤、又は高い効力を有するがヒトにおける使用に関して許容できないほど高い毒性を有している化学療法剤である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記放射性同位体が、キレート化合物を介して抗体と結合しているα、β又はオージェ放射性同位体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記二次抗体が、前記抗体のスルフヒドリル、εアミノ酸又は炭水化物基を介して阻害物質と共有結合している、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記患者が癌、ＨＩＶ又は他のウイルスベクター、又は細菌物質に罹患している、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
ｉｎ−ｖｉｔｒｏのスクリーニングアッセイであって、
細胞受容体又は細胞内標的に免疫特異的である一次抗体と複数の細胞を接触させるステップであって、前記一次抗体が膜輸送ペプチド又はその断片と結合しているステップ、及び
前記一次抗体の内在化による細胞活性のアンタゴニズム又はアゴニズムの可能性を評価するステップを含むアッセイ。
【請求項３６】
ｉｎ−ｖｉｔｒｏのスクリーニングアッセイであって、
細胞受容体又は細胞内標的に免疫特異的である一次抗体と複数の細胞を接触させるステップ、
膜輸送ペプチド又はその断片と結合した二次抗体を前記一次抗体と混合させるステップであって、前記二次抗体が前記一次抗体に免疫特異的であるステップ、及び
前記一次抗体の内在化による細胞活性のアンタゴニズム又はアゴニズムの可能性を評価するステップを含むアッセイ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００６−５２２１２２（Ｐ２００６−５２２１２２Ａ）
【公表日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０９２１１（Ｐ２００６−５０９２１１）
【出願日】平成１６年３月５日（２００４．３．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００６９１１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７８１４６
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【出願人】（５０５３３４７１０）インネクサス バイオテクノロジー インコーポレイテッド (1)
【出願人】（５０５３３４１１２）イムフェロン インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月５日（２００４．３．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００６９１１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７８１４６
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【出願人】（５０５３３４７１０）インネクサス バイオテクノロジー インコーポレイテッド (1)
【出願人】（５０５３３４１１２）イムフェロン インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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