臓器及び組織の保存方法
【課題】臓器又は組織を、有効量のカリクレイン・インヒビター及びそのような方法に有用な溶液と接触させることを含む、臓器又は組織を保存するための方法を提供する。
【解決手段】特定配列のポリペプチドを含むカリクレイン・インヒビターをおよび臓器保存液を含む、臓器又は組織を保存するための組成物。および、臓器の貯蔵及び保存溶液中に臓器を置くことを含む、術中及び／又は被験者からの臓器摘出後の臓器の再灌流障害を軽減するための方法。
【解決手段】特定配列のポリペプチドを含むカリクレイン・インヒビターをおよび臓器保存液を含む、臓器又は組織を保存するための組成物。および、臓器の貯蔵及び保存溶液中に臓器を置くことを含む、術中及び／又は被験者からの臓器摘出後の臓器の再灌流障害を軽減するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００２年８月２８日に出願した米国仮出願第６０／４０７，００４号の利益を主張する。
【０００２】
上記出願の全教示は本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００３】
臓器移植に関し、ドナー臓器の生存率の維持は重要な目的である。典型的には、移植される臓器は貯蔵され、将来のレシピエントへ輸送される必要がある。貯蔵及び輸送のあいだ臓器の細胞生存率を延長させるための能力は、移植手術を成功させる上で非常に重要である。保存液は臓器延命に重要な役割を果たす。臓器保存液としては、本明細書中にその内容全体が援用される、Ｂｅｒｄｙａｅｖら、米国特許第５，４３２，０５３号；Ｂｅｌｚｅｒら、米国特許第４，７９８，８２４号、第４，８７９，２８３号、及び第４，８７３，２３０号；Ｔａｙｌｏｒ、米国特許第５，４０５，７４２号；Ｄｏｈｉら、米国特許第５，５６５，３１７号；Ｓｔｅｒｎら、米国特許第５，３７０，９８９号及び第５，５５２，２６７号に記載されるものが挙げられる。しかしながら、臓器保存に関し、改善された方法及び溶液についての必要性が存在している。
【０００４】
プロテアーゼは広範な生物学的経路に関与する。特に、カリクレイン、プラスミン、エラスターゼ、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン・アクチベーター、トロンビン、ヒトリポタンパク質結合凝固インヒビター、並びに第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子及び第ＸＩＩａ因子などの凝固因子のようなセリンプロテアーゼは、例えば全身及び局所の虚血、腫瘍浸潤、フィブリン溶解、術中の失血、並びに炎症のような血流に影響する経路に関係がある。したがって、特定のセリンプロテアーゼのインヒビターは、さまざまな虚血性疾患に対する潜在的薬物標的として注目されている。
【０００５】
そのようなインヒビターの１つである、ウシ肺から得られたアプロチニン（ウシ膵トリプシン・インヒビター又はＢＰＴＩとも呼ばれる）は、術中の失血を軽減させる上での予防的使用のため、及び例えば冠動脈バイパス移植術処置の過程でＣＰＢを受ける患者の輸血の必要性のために米国で承認されている。アプロチニンはトラジロール（登録商標）の商品名で市販されており（バイエル社医薬部門、ウエストヘーブン、コネチカット）、膵炎の治療に用いるために以前に承認されている。アプロチニンの有効性は、血漿カリクレイン及びプラスミンを含む種々のセリンプロテアーゼを阻害する比較的非特異的な能力に関連している。これらのプロテアーゼは、接触活性化システム（ＣＡＳ）の多くの経路において重要である。
【０００６】
ＣＡＳは、全血が外来基質表面（例えばカオリン、ガラス、硫酸デキストラン、又は損傷を受けた骨表面）と接触したとき最初に活性化される。セリンプロテアーゼであるカリクレインは、好中球、プラスミン、凝固、及び種々のキニンの活性化をもたらすＣＡＳカスケードを開始する血漿酵素である。カリクレインは、接触活性化カスケードの初期においてタンパク質分解イベントにより活性化されるまで不活性分子として循環するチモーゲン（プレ−カリクレイン）として分泌される。
【０００７】
しかしながら、カリクレイン特異的インヒビターの臓器保存への使用は、成功裏に証明されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，４３２，０５３号
【特許文献２】米国特許第４，７９８，８２４号
【特許文献３】米国特許第４，８７９，２８３号
【特許文献４】米国特許第４，８７３，２３０号
【特許文献５】米国特許第５，４０５，７４２号
【特許文献６】米国特許第５，５６５，３１７号
【特許文献７】米国特許第５，３７０，９８９号
【特許文献８】米国特許第５，５５２，２６７号
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、保留臓器移植物の保存にうまく使用することができる、例えばカリクレインのようなセリンプロテアーゼを阻害するペプチドの発見に基づくものである。より詳細には、本発明は、臓器又は組織を保存するための方法におけるカリクレイン・インヒビターの使用方法、及びそのような使用のための組成物を提供する。また、本発明は、再灌流障害又は宿主から摘出されている臓器若しくは組織の損傷を軽減し、阻害し又は防止するための方法、及びそのような使用のための組成物に関するものである。好ましいカリクレインペプチドには、本明細書中にその内容全体が援用される、Ｍａｒｋｌａｎｄら、米国特許第６，３３３，４０２号及び第６，０５７，２８７号に記載されるものが挙げられる。
【００１０】
特に好ましい態様において、本発明は、アミノ酸配列：
Ｘａａ１ Ｘａａ２ Ｘａａ３ Ｘａａ４ Ｃｙｓ Ｘａａ６ Ｘａａ７ Ｘａａ８ Ｘａａ９ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１ Ｇｌｙ Ｘａａ１３ Ｃｙｓ Ｘａａ１５ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１ Ｘａａ２２ Ｘａａ２３ Ｘａａ２４ Ｘａａ２５ Ｘａａ２６ Ｘａａ２７ Ｘａａ２８ Ｘａａ２９ Ｃｙｓ Ｘａａ３１ Ｘａａ３２ Ｐｈｅ Ｘａａ３４ Ｘａａ３５ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｘａａ３９ Ｘａａ４０ Ｘａａ４１ Ｘａａ４２ Ｘａａ４３ Ｘａａ４４ Ｘａａ４５ Ｘａａ４６ Ｘａａ４７ Ｘａａ４８ Ｘａａ４９ Ｘａａ５０ Ｃｙｓ Ｘａａ５２ Ｘａａ５３ Ｘａａ５４ Ｃｙｓ Ｘａａ５６ Ｘａａ５７ Ｘａａ５８（配列番号１）を含み、
ここで、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５６、Ｘａａ５７又はＸａａ５８はそれぞれ個々に１つのアミノ酸であるか又は存在せず；Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、Ｘａａ２０、Ｘａａ２４、Ｘａａ２５、Ｘａａ２６、Ｘａａ２７、Ｘａａ２８、Ｘａａ２９、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４４、Ｘａａ４６、Ｘａａ４７、Ｘａａ４８、Ｘａａ４９、Ｘａａ５０、Ｘａａ５２、Ｘａａ５３及びＸａａ５４は如何なるアミノ酸でもよく；Ｘａａ１０は：Ａｓｐ及びＧｌｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１１は：Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１３は：Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１５は：Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１６は：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＡｓｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１７は：Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１８は：Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１９は：Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２１は：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２２は：Ｔｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２３は：Ｔｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３１は：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３２は：Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ及びＶａｌから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３４は：Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ及びＬｅｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３５は：Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３９は：Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＡｓｐから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ４０は：Ｇｌｙ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ４３は：Ａｓｎ及びＧｌｙから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ４５は：Ｐｈｅ及びＴｙｒから成る群より選択されるアミノ酸であり、そして、ポリペプチドはカリクレインを阻害する、ポリペプチドを含む組成物、及びそのような組成物の使用方法にかかるものである。
【００１１】
特定の態様において、特定のアミノ酸位置は以下であり得る：Ｘａａ６はＡｌａであり得、Ｘａａ７はＰｈｅであり得、Ｘａａ８はＬｙｓであり得、Ｘａａ９はＡｌａであり得、Ｘａａ１０はＡｓｐであり得、Ｘａａ１１はＡｓｐであり得、Ｘａａ１３はＰｒｏであり得、Ｘａａ１５はＡｒｇであり得、Ｘａａ１６はＡｌａであり得、Ｘａａ１７はＡｌａであり得、Ｘａａ１８はＨｉｓであり得、Ｘａａ１９はＰｒｏであり得、Ｘａａ２０はＡｒｇであり得、Ｘａａ２４はＡｓｎであり得、Ｘａａ２５はＩｌｅであり得、Ｘａａ２６はＰｈｅであり得、Ｘａａ２７はＴｈｒであり得、Ｘａａ２８はＡｒｇであり得、Ｘａａ２９はＧｌｎであり得、Ｘａａ３１はＧｌｕであり得、Ｘａａ３２はＧｌｕであり得、Ｘａａ３４はＩｌｅであり得、Ｘａａ３５はＴｙｒであり得、Ｘａａ３９はＧｌｕであり得、Ｘａａ４１はＡｓｎであり得、Ｘａａ４２はＡｒｇであり得、Ｘａａ４４はＡｒｇであり得、Ｘａａ４６はＧｌｕであり得、Ｘａａ４７はＳｅｒであり得、Ｘａａ４８はＬｅｕであり得、Ｘａａ４９はＧｌｕであり得、及び／又はＸａａ５０はＧｌｕであり得る；これらの位置にあるこれら特定のアミノ酸は、個々に又は他に記載されている１以上の位置にある１以上のアミノ酸と組み合わせて起こり得る。
【００１２】
特定の態様において、本発明は、２以上の下記のアミノ酸位置が下記のように定義される、配列番号１に記載されるようなポリペプチドを含む組成物、及びそのような組成物の使用方法にかかるものである：Ｘａａ１０はＡｓｐであり得；Ｘａａ１１はＡｓｐであり得；Ｘａａ１３はＰｒｏであり得；Ｘａａ１５はＡｒｇであり得；Ｘａａ１６はＡｌａであり得；Ｘａａ１７はＡｌａであり得；Ｘａａ１８はＨｉｓであり得；Ｘａａ１９はＰｒｏであり得；Ｘａａ２１はＴｒｐであり得；Ｘａａ２２はＰｈｅであり得；Ｘａａ２３はＰｈｅであり得；Ｘａａ３１はＧｌｕであり得；Ｘａａ３２はＧｌｕであり得；Ｘａａ３４はＩｌｅであり得；Ｘａａ３５はＴｙｒであり得；Ｘａａ３９はＧｌｕであり得；Ｘａａ４０はＧｌｙであり得；Ｘａａ４３はＡｓｎであり得；及びＸａａ４５はＰｈｅであり得る。他の態様において、５以上の下記のアミノ酸位置が下記のように定義される：Ｘａａ１０はＡｓｐであり得；Ｘａａ１１はＡｓｐであり得；Ｘａａ１３はＰｒｏであり得；Ｘａａ１５はＡｒｇであり得；Ｘａａ１６はＡｌａであり得；Ｘａａ１７はＡｌａであり得；Ｘａａ１８はＨｉｓであり得；Ｘａａ１９はＰｒｏであり得；Ｘａａ２１はＴｒｐであり得；Ｘａａ２２はＰｈｅであり得；Ｘａａ２３はＰｈｅであり得；Ｘａａ３１はＧｌｕであり得；Ｘａａ３２はＧｌｕであり得；Ｘａａ３４はＩｌｅであり得；Ｘａａ３５はＴｙｒであり得；Ｘａａ３９はＧｌｕであり得；Ｘａａ４０はＧｌｙであり得；Ｘａａ４３はＡｓｎであり得；及びＸａａ４５はＰｈｅであり得る。他の態様において、１０以上のアミノ酸が下記のように定義される：Ｘａａ１０はＡｓｐであり得；Ｘａａ１１はＡｓｐであり得；Ｘａａ１３はＰｒｏであり得；Ｘａａ１５はＡｒｇであり得；Ｘａａ１６はＡｌａであり得；Ｘａａ１７はＡｌａであり得；Ｘａａ１８はＨｉｓであり得；Ｘａａ１９はＰｒｏであり得；Ｘａａ２１はＴｒｐであり得；Ｘａａ２２はＰｈｅであり得；Ｘａａ２３はＰｈｅであり得；Ｘａａ３１はＧｌｕであり得；Ｘａａ３２はＧｌｕであり得；Ｘａａ３４はＩｌｅであり得；Ｘａａ３５はＴｙｒであり得；Ｘａａ３９はＧｌｕであり得；Ｘａａ４０はＧｌｙであり得；Ｘａａ４３はＡｓｎであり得；そしてＸａａ４５はＰｈｅであり得る。更に他の態様において、１５以上のアミノ酸が下記のように定義される：Ｘａａ１０はＡｓｐであり得；Ｘａａ１１はＡｓｐであり得；Ｘａａ１３はＰｒｏであり得；Ｘａａ１５はＡｒｇであり得；Ｘａａ１６はＡｌａであり得；Ｘａａ１７はＡｌａであり得；Ｘａａ１８はＨｉｓであり得；Ｘａａ１９はＰｒｏであり得；Ｘａａ２１はＴｒｐであり得；Ｘａａ２２はＰｈｅであり得；Ｘａａ２３はＰｈｅであり得；Ｘａａ３１はＧｌｕであり得；Ｘａａ３２はＧｌｕであり得；Ｘａａ３４はＩｌｅであり得；Ｘａａ３５はＴｙｒであり得；Ｘａａ３９はＧｌｕであり得；Ｘａａ４０はＧｌｙであり得；Ｘａａ４３はＡｓｎであり得；そしてＸａａ４５はＰｈｅであり得る。
【００１３】
特定の態様において、本発明は、存在する場合は、Ｘａａ３はＳｅｒであり、Ｘａａ２はＨｉｓであり、Ｘａａ１はＭｅｔであり、Ｘａａ５６はＴｈｒであり、Ｘａａ５７はＡｒｇであり、及び／又はＸａａ５８はＡｓｐである、配列番号１により定義されるようなポリペプチドを含む組成物、及びそのような組成物の使用方法にかかるものである。
【００１４】
他の態様において、本発明は、アミノ酸配列：
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇ１ｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２）、を含むポリペプチドを含む組成物、及びそのような組成物の使用方法にかかるものである。
【００１５】
特定の態様において、本発明は、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含む５３〜６０アミノ酸のカリクレイン結合ポリペプチドを含む組成物にかかるものであり、ここで、Ｋｕｎｉｔｚドメインは、位置５及び５５；１４及び３８；並びに３０及び５１（ウシ膵トリプシン・インヒビター（ＢＰＴＩ）に対応するアミノ酸位置による）にシステイン間のジスルフィド結合の可能性を含み、更に：
Ｈｉｓ及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１３；
Ａｌａ及びＧｌｙから選択されるアミノ酸番号１６；
Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＳｅｒから選択されるアミノ酸番号１７；
Ｈｉｓ及びＬｅｕから選択されるアミノ酸番号１８；及び
Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１９（配列番号２３）を含む。
【００１６】
特定の態様において、本発明は、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含む５３〜６０アミノ酸のカリクレイン結合ポリペプチドを含む組成物にかかるものであり、ここで、Ｋｕｎｉｔｚドメインは、位置５及び５５；１４及び３８；並びに３０及び５１（ウシ膵トリプシン・インヒビター（ＢＰＴＩ）に対応するアミノ酸位置による）にシステイン間のジスルフィド結合の可能性を含み、更に：
Ｈｉｓ及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１３；
Ｌｙｓ及びＡｒｇから選択されるアミノ酸番号１５；
Ａｌａ及びＧｌｙから選択されるアミノ酸番号１６；
Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＳｅｒから選択されるアミノ酸番号１７；
Ｈｉｓ及びＬｅｕから選択されるアミノ酸番号１８；及び
Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１９；
Ｇｌｕであるアミノ酸番号３１；
Ｇｌｕ及びＧｌｎから選択されるアミノ酸番号３２；
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＩｌｅから選択されるアミノ酸番号３４；及び
Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、及びＡｌａから選択されるアミノ酸番号３９（配列番号２４）を含む。
【００１７】
特定の態様において、本発明は、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含む５３〜６０アミノ酸のカリクレイン結合ポリペプチドを含む組成物にかかるものであり、ここで、Ｋｕｎｉｔｚドメインは、位置５及び５５；１４及び３８；並びに３０及び５１（ウシ膵トリプシン・インヒビター（ＢＰＴＩ）に対応するアミノ酸位置による）のそれぞれにシステインを含み、更に：
Ｈｉｓ及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１３；
Ｌｙｓ及びＡｒｇから選択されるアミノ酸番号１５；
Ａｌａ及びＧｌｙから選択されるアミノ酸番号１６；
Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＳｅｒから選択されるアミノ酸番号１７；
Ｈｉｓ及びＬｅｕから選択されるアミノ酸番号１８；及び
Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１９；
Ｇｌｕであるアミノ酸番号３１；
Ｇｌｕ及びＧｌｎから選択されるアミノ酸番号３２；
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＩｌｅから選択されるアミノ酸番号３４；及び
Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、及びＡｌａから選択されるアミノ酸番号３９（配列番号２４）、を含む。
【００１８】
特定の態様において、表１に記載されるように、Ｋｕｎｉｔｚドメインは以下から成る群より選択される：
ＫＫＩＩ／３ ＃１（配列番号２４）
ＫＫＩＩ／３ ＃２（配列番号２５）
ＫＫＩＩ／３ ＃３（配列番号２６）
ＫＫＩＩ／３ ＃４（配列番号２７）
ＫＫＩＩ／３ ＃５（配列番号２８）
ＫＫＩＩ／３ ＃６（配列番号２９）
ＫＫＩＩ／３ ＃７（配列番号３０）
ＫＫＩＩ／３ ＃８（配列番号３１）
ＫＫＩＩ／３ ＃９（配列番号３２）及び
ＫＫＩＩ／３ ＃１０（配列番号３３）。
【００１９】
本明細書に記載の各組成物は、本発明の方法に用いることができる。更に、本明細書に記載の化合物は、本明細書に記載の適応又は方法のための医薬又は組成物の製造に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）処置、特にＣＡＢＧ処置が心−肺バイパス（ＣＰＢ；バイパス装置）などの体外血液循環を包含する場合に関連するような、軟部組織及び骨組織の外傷を受けた患者に生じ得る接触活性化システム及び全身炎症反応（ＳＩＲ）に関与する主要な複数の経路及び関連イベントを単純化した図解である。矢印は、カスケードにおける１つの成分又はイベントから、他の成分又はイベントへの活性化を示す。両方向の矢印は、成分又はイベントの両方向への活性化作用を示す。破線矢印は、１つの成分又はイベントによる、他の成分又はイベントの活性化への起こり得る関与を示す。略語は以下の通りである：「ｔＰＡ」＝組織プラスミノーゲン・アクチベーター；「Ｃ５ａ」＝補体系のタンパク質成分；「ｆＸＩＩａ」＝活性カリクレインを形成するプレカリクレインのアクチベータータンパク質；「外因性」＝外因性凝固系；「内因性」＝内因性凝固系。
【図２】図２は、プラスミドｐＰＩＣ−Ｋ５０３中の本発明のカリクレイン・インヒビター（「ＫＩ」）ポリペプチドのＤＮＡ及び対応の推定アミノ酸の一部を示す。挿入ＤＮＡは、囲み領域でコードされるアミノ酸配列を有するＰＥＰ−１ ＫＩポリペプチドのアミノ末端に、インフレームで融合させたサッカロミセス・セレビジエのｍａｔαプレプロシグナルペプチド（下線）をコードする。囲み領域に示すＰＥＰ−１ ＫＩポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２であり、ＫＩポリペプチドの対応のヌクレオチドコード配列は配列番号３である。破線矢印は、配列決定用テンプレートの作製に用いられたＡＯＸ領域における２つのＰＣＲプライマー配列の位置及び方向を示す。図の全ヌクレオチド配列に対するＤＮＡ配列は、融合タンパク質の構造コード配列を含み、配列番号３５で表される。配列の２重下線部分は診断用プローブ配列を示す。ＢｓｔＢＩ及びＥｃｏＲＩは、配列中のそれぞれのパリンドローム性６量体制限酵素切断部位の位置を示す。アスタリスクは翻訳終止コドンである。
【図３】図３は、本発明の好ましい態様のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様について以下に説明する。
本発明は、例えば移植までのあいだ臓器及び組織を保存するための改善された方法及び対応する方法における使用を可能にする、血漿カリクレインを特異的に阻害するカリクレイン・インヒビター（ＫＩ）ポリペプチドの発見に基づくものである。また、本発明は、再灌流障害又は宿主から摘出されている臓器若しくは組織の損傷を軽減し、阻害し又は防止すること、及びそのための組成物に関する。
【００２２】
本発明に有用なポリペプチド
本発明に有用なＫＩポリペプチドはＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドを含む。１つの態様において、これらＫｕｎｉｔｚドメインは、ヒト・リポタンパク質結合凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）タンパク質のＫｕｎｉｔｚドメイン１のループ構造を含む変異体型である。ＬＡＣＩは、内部に３つの明確なペプチドループ構造を含有し、それらは系列的Ｋｕｎｉｔｚドメインである（Ｇｉｒａｒｄ，Ｔ．ら、１９８９．Ｎａｔｕｒｅ、３３８：５１８−５２０）。ＬＡＣＩの３つのＫｕｎｉｔｚドメインは、特に優れた親和性はないが、カリクレインに結合し且つ阻害する能力を付与する。本明細書に記載のＬＡＣＩのＫｕｎｉｔｚドメイン１の変異体は、スクリーニングされ、単離されており、向上した親和性及び特異性でカリクレインに結合する（例えば、本明細書中に援用される米国特許第５，７９５，８６５号及び第６，０５７，２８７号を参照されたい）。本発明に有用な好ましいポリペプチドの例は、配列番号２のアミノ酸３〜６０により定義されるアミノ酸配列を有する。
【００２３】
カリクレイン結合ポリペプチドを用いて、治療用又は診断用分子を例えば臓器組織、細胞、又は生物全体中におけるカリクレインへ標的化することができる。治療又は診断目的のこのような標的送達の方法は当業者に公知であろう。例えば、標的化カリクレイン結合ポリペプチドは、当業者により、カリクレインの作用で損傷を受けた臓器の同定に用いられるであろうし、又はカリクレインは、本発明のカリクレイン結合ポリペプチドを用いて、特定の治療剤の作用の標的にされ得る。
【００２４】
本発明に有用な全てのポリペプチドはカリクレインに結合する。好ましい態様において、ポリペプチドは、カリクレインの公知の結合アッセイ及び阻害アッセイを用いて測定されるようなカリクレイン・インヒビター（ＫＩ）である。本明細書に記載の変異体Ｋｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドのカリクレインに対する向上した親和性及び特異性は、ＣＰＢ及び特にＣＡＢＧ外科的処置での使用の根拠を提供し、そのような処置を受けている患者の術中の失血及び／又はＳＩＲを予防又は軽減させる。本発明に用いられるＫＩポリペプチドは、当初カリクレインへの結合能についてファージ・ディスプレイ・ライブラリーをスクリーニングして単離された変異体Ｋｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドのアミノ酸配列を有するか又は含むことができる。
【００２５】
本発明の方法及び組成物に有用なＫＩポリペプチドは、アミノ酸配列：
Ｘａａ１ Ｘａａ２ Ｘａａ３ Ｘａａ４ Ｃｙｓ Ｘａａ６ Ｘａａ７ Ｘａａ８ Ｘａａ９ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１ Ｇｌｙ Ｘａａ１３ Ｃｙｓ Ｘａａ１５ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１ Ｘａａ２２ Ｘａａ２３ Ｘａａ２４ Ｘａａ２５ Ｘａａ２６ Ｘａａ２７ Ｘａａ２８ Ｘａａ２９ Ｃｙｓ Ｘａａ３１ Ｘａａ３２ Ｐｈｅ Ｘａａ３４ Ｘａａ３５ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｘａａ３９ Ｘａａ４０ Ｘａａ４１ Ｘａａ４２ Ｘａａ４３ Ｘａａ４４ Ｘａａ４５ Ｘａａ４６ Ｘａａ４７ Ｘａａ４８ Ｘａａ４９ Ｘａａ５０ Ｃｙｓ Ｘａａ５２ Ｘａａ５３ Ｘａａ５４ Ｃｙｓ Ｘａａ５６ Ｘａａ５７ Ｘａａ５８（配列番号１）、
を含むＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドを含む。
【００２６】
「Ｘａａ」はペプチド鎖における位置を表し、多くのさまざまなアミノ酸のいずれでもよい。例えば、本明細書に記載のＫＩペプチドに関し、Ｘａａ１０はＡｓｐ又はＧｌｕであり得る；Ｘａａ１１はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ又はＴｈｒであり得る；Ｘａａ１３はＰｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ又はＧｌｎであり得る；Ｘａａ１５はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ又はＧｌｎであり得る；Ｘａａ１６はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＡｓｎであり得る；Ｘａａ１７はＡｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ又はＴｈｒであり得る；Ｘａａ１８はＨｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ又はＡｌａであり得る；Ｘａａ１９はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ又はＩｌｅであり得る；Ｘａａ２１はＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ又はＩｌｅであり得る；Ｘａａ３１はＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＴｈｒであり得る；Ｘａａ３２はＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ又はＶａｌであり得る；Ｘａａ３４はＩｌｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ又はＬｅｕであり得る；Ｘａａ３５はＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅであり得る；Ｘａａ３９はＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＡｓｐであり得る。アミノ酸Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、Ｘａａ２０、Ｘａａ２４、Ｘａａ２５、Ｘａａ２６、Ｘａａ２７、Ｘａａ２８、Ｘａａ２９、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４４、Ｘａａ４６、Ｘａａ４７、Ｘａａ４８、Ｘａａ４９、Ｘａａ５０、Ｘａａ５２、Ｘａａ５３及びＸａａ５４は如何なるアミノ酸でもよい。更に、配列番号１の最初の４アミノ酸及び最後の３アミノ酸はそれぞれ任意に存在してもしなくてもよく、存在する場合は如何なるアミノ酸でもよい。
【００２７】
配列番号１により定義されるペプチドは、カリクレインに結合し、且つ阻害するポリペプチドのセットを形成する。ＫＩの多様性は、ペプチド配列中の可変位置数の増加に応じて、又は可変位置において可能なアミノ酸数の増加に応じて増加する。例えば、本発明の好ましい態様において、本発明の方法及び組成物に有用なＫＩポリペプチドは、以下の可変位置を有する：Ｘａａ１１はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ又はＶａｌであり得る；Ｘａａ１３はＰｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＡｓｎであり得る；Ｘａａ１５はＡｒｇ又はＬｙｓであり得る；Ｘａａ１６はＡｌａ又はＧｌｙであり得る；Ｘａａ１７はＡｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ又はＩｌｅであり得る；Ｘａａ１８はＨｉｓ、Ｌｅｕ又はＧｌｎであり得る；Ｘａａ１９はＰｒｏ、Ｇｌｎ又はＬｅｕであり得る；Ｘａａ２１はＴｒｐ又はＰｈｅであり得る；Ｘａａ３１はＧｌｕである；Ｘａａ３２はＧｌｕ又はＧｌｎであり得る；Ｘａａ３４はＩｌｅ、Ｔｈｒ又はＳｅｒであり得る；Ｘａａ３５はＴｙｒである；そしてＸａａ３９はＧｌｕ、Ｇｌｙ又はＡｌａであり得る。
【００２８】
請求している発明のより特定の態様は、以下の可変位置のアミノ酸で定義される：Ｘａａ１０はＡｓｐであり；Ｘａａ１１はＡｓｐであり；Ｘａａ１３はＰｒｏ又はＡｒｇであり得；Ｘａａ１５はＡｒｇであり；Ｘａａ１６はＡｌａ又はＧｌｙであり得；Ｘａａ１７はＡｌａであり；Ｘａａ１８はＨｉｓであり；Ｘａａ１９はＰｒｏであり；Ｘａａ２１はＴｒｐであり；Ｘａａ３１はＧｌｕであり；Ｘａａ３２はＧｌｕであり；Ｘａａ３４はＩｌｅ又はＳｅｒであり得；Ｘａａ３５はＴｙｒであり；そしてＸａａ３９はＧｌｙである。
【００２９】
また、本発明の範囲に包含されるのは、本明細書に記載のポリペプチドの部分を含むペプチドである。例えば、ポリペプチドは特定のカリクレイン・エピトープに対する結合ドメインを含むであろう。本明細書に記載のポリペプチドのそのような断片も包含されるであろう。
【００３０】
本明細書に記載の方法及び組成物に有用なＫＩポリペプチドはＫｕｎｉｔｚドメインを含む。配列番号１に包含される配列のサブセットが以下に記載される（示されていない場合、「Ｘａａ」は、配列番号１について認められるのと同一のアミノ酸セットを意味する）：
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１ Ｇｌｙ Ｘａａ１３ Ｃｙｓ Ｘａａ１５ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ａｒｇ Ｘａａ２１ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｘａａ３１ Ｘａａ３２ Ｐｈｅ Ｘａａ３４ Ｘａａ３５ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｘａａ３９ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号３６）。
【００３１】
本明細書に記載の本発明に有用なＫＩペプチドの具体的且つ特定の例は、以下の通りである：
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２のアミノ酸３〜６０）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号４）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号５）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号６）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号７）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号８）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号９）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１０）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１１）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１２）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１３）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１４）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１５）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１６）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１７）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１８）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１９）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２０）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２１）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２２）。
図３にこれら配列のアミノ酸配列アラインメントを提供する。
【００３２】
本発明に有用な他のＫＩポリペプチドには以下が含まれる：
Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ（配列番号２３）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２４）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２５）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２６）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２７）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２８）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２９）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号３０）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号３１）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号３２）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号３３）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号３４）。
【００３３】
これら配列を以下の表１にまとめる。
【００３４】
【表１】
【００３５】
本明細書に記載の方法及び組成物に有用なポリペプチドは、いずれの標準ポリペプチド合成プロトコール及び装置を用いて合成してもよい。例えば、本明細書に記載のＫＩポリペプチドの段階的合成は、アミノ（Ｎ）端保護基を開始（即ちカルボキシ端）アミノ酸から除去し、そこにポリペプチド配列中の次のアミノ酸のカルボキシ末端をカップリングさせることにより実施することができる。このアミノ酸もまた好適に保護される。カルボジイミド、対称性酸無水物、又はヒドロキシベンゾトリアゾールエステル若しくはペンタフルオロフェニルエステルなどの「活性エステル」基の形成のような反応基の形成により、次に来るアミノ酸のカルボキシル基を活性化させて、結合したアミノ酸のＮ端と反応させることができる。好ましい固相ペプチド合成法には、α−アミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを用いるＢＯＣ法、及び９−フルオレニルメチルオキシカルボニルを用いてアミノ酸残基のα−アミノを保護するＦＭＯＣ法が含まれる。両方法とも当業者に周知である（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．及びＹｏｕｎｇ，Ｊ．、固相ペプチド合成（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ社、サンフランシスコ、１９８９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．、１９６３．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９−２１５４；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．及びＢｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．、ペプチド合成の実践（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、１９８４）、これら文献の全教示は本明細書中に援用される）。所望により、更なるアミノ端アミノ酸及び／又はカルボキシ端アミノ酸をアミノ酸配列にデザインし、ポリペプチド合成中に付加することができる。
【００３６】
あるいは、本発明の組成物及び方法に有用なＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチド及びＫＩポリペプチドを、多くの細胞、及び細菌発現ベクター、酵母発現ベクター、バキュロウイルス発現ベクター、哺乳類ウイルス発現ベクター等を含むがこれらに限定されない対応する発現ベクターのいずれかを用いる組換え法により作製することができる。本発明の組成物及び方法に有用なＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチド及びＫＩポリペプチドは、本明細書に記載のＫｕｎｉｔｚドメイン又はＫＩポリペプチドのコード配列を含む核酸分子を用いて遺伝子組換えにより作製することもできる。ここで、核酸分子は、当該技術分野で利用可能な遺伝子導入法を用いて宿主動物ゲノムに統合され、そこから発現させることができる。Ｋｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチド又はＫｕｎｉｔｚドメインを含むＫＩポリペプチドのコード配列を発現ベクター中の他のコード配列に融合させて、宿主細胞で容易に発現する融合ポリペプチドを形成することが必須又は有益である場合もある。そのような融合ポリペプチドを発現する宿主細胞は融合ポリペプチドもプロセシングし、所望のアミノ酸配列のみを含有する本発明に有用なＫｕｎｉｔｚドメイン又はＫＩポリペプチドを産生することが好ましい。いずれかの他のアミノ酸が、発現したＫｕｎｉｔｚドメイン又はＫＩポリペプチドに付着したままである場合、このような付加的アミノ酸は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン又はＫＩポリペプチドのカリクレイン結合活性及び／又はカリクレイン阻害活性を減少させて本発明の方法又は組成物におけるポリペプチドの使用を排除すべきでないことは明らかである。
【００３７】
本明細書に記載の方法及び組成物に有用なＫＩポリペプチドを作製するのに好ましい組換え発現系は、ＫＩポリペプチド又はＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列が、同じリーディングフレームでサッカロミセス・セレビジエのｍａｔαプレプロリーダーペプチド配列をコードするヌクレオチド配列と連結されるのを可能にする酵母発現ベクターであり、これは作動可能な酵母プロモーターの制御下にある。次に、得られる組換え酵母発現プラスミドは、標準法により、適切な適合性酵母宿主細胞へ形質転換されることができ、この細胞は組換え酵母発現ベクターから組換えタンパク質を発現することが可能である。そのような組換え発現ベクターで形質転換された宿主酵母細胞は、融合タンパク質をプロセシングして、本発明の方法及び組成物に有用な活性ＫＩポリペプチドを提供することも可能であることが好ましい。そのようなＫｕｎｉｔｚドメインを含む組換えＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチド及びＫＩポリペプチドを作製するための好ましい酵母宿主はピキア・パストリスである。
【００３８】
上記のように、本明細書に記載の方法及び組成物に有用なＫＩポリペプチドは、本明細書に記載のＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドを含むことができる。ＫＩポリペプチドは、付加的なフランキング配列、好ましくは長さ１〜６アミノ酸を、このような付加的アミノ酸がカリクレイン結合親和性又はカリクレイン阻害活性を顕著に減少させて本明細書に記載の方法及び組成物における使用を排除することがないことを条件として、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端に有することができ場合もある。このような付加的アミノ酸を、ＫＩポリペプチドを特定の組換え宿主細胞中で発現させるために意図的に付加することができ、又は更なる機能を提供するため、例えば、ＫＩポリペプチドを他の分子へ連結させるために、若しくはポリペプチドの精製を容易にする親和性部分を提供するために付加することもできる。付加的アミノ酸は、Ｋｕｎｉｔｚドメインのジスルフィド結合を妨げるシステインを含まないことが好ましい。天然Ｋｕｎｉｔｚドメインの例は、ジスルフィド結合を生じ、例えばＢＰＴＩは、アミノ酸位置５及び５５；１４及び３８；並びに３０及び５１のシステイン残基間にジスルフィド結合を含有する。
本発明の方法及び組成物に有用な好ましいＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドの例は、配列番号２の残基３〜６０のアミノ酸配列を有する。酵母融合タンパク質発現系で（例えば統合発現プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２に基づいて）発現及びプロセシングさせる場合、このようなＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドは、付加的アミノ端Ｇｌｕ−Ａｌａジペプチドを、Ｓ．セレビジエのｍａｔαプレプロリーダーペプチド配列との融合から保つ。酵母宿主細胞から分泌される場合、リーダーペプチドの多くは融合タンパク質からプロセシングされて、配列番号２のアミノ酸配列（図２の囲み領域を参照されたい）を有する機能的ＫＩポリペプチド（「ＰＥＰ−１」又は「ＤＸ８８」ともいう）を生ずる。
【００３９】
本明細書に記載の方法及び組成物に有用な特に好ましいＫＩポリペプチドは、カリクレインに対し、現在失血を軽減させるためにＣＡＰＧ処置に使用することが認可されているアプロチニンよりも１０００倍高いオーダーで結合親和性を有する。本明細書に記載のこのようなＫＩポリペプチドの驚くほど高い結合親和性は、このようなＫＩポリペプチドが、他の分子標的（以下の表１を参照されたい）を除外して、カリクレインに対し高度に特異性を発揮することを示している。したがって、本発明のこのようなポリペプチドの使用は、可能な治療標的に関し多くの考察を軽減させる。例えばアプロチニンによって発揮されるより低度の特異性は、起こり得る多面的副作用をもたらし、治療メカニズムに関してあいまいである。
【００４０】
例えば配列番号１で定義されるポリペプチドは不変位置を含有し、例えば位置５、１４、３０、５１及び５５はＣｙｓのみであり得る。例えば位置６、７、８、９、２０、２４、２５、２６、２７、２８、２９、４１、４２、４４、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３及び５４のような他の位置は、如何なるアミノ酸でもよい（非天然アミノ酸を含む）。特に好ましい態様において、１以上のアミノ酸が天然配列に対応する（例えばＬＡＣＩ（配列番号３２〜３４））。好ましい態様において、少なくとも１つの可変位置が天然配列とは異なる。更に他の好ましい態様において、アミノ酸はそれぞれ個別に又は集団で保存的又は非保存的アミノ酸置換により置換されることができる。保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、類似化学構造を有する他のアミノ酸に置き換え、タンパク質機能に影響を与えない。非保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、非類似の化学構造を有する他のアミノ酸に置き換える。保存的アミノ酸置換の例には、例えば、Ａｓｎ→Ａｓｐ、Ａｒｇ→Ｌｙｓ及びＳｅｒ→Ｔｈｒが含まれる。好ましい態様において、これらアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０及び／又は２１は、個別に又は集団で、如何なる組合せでも、配列番号２の対応の位置に相当するよう選択されることができる。
【００４１】
他の位置、例えば位置１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、３１、３２、３４、３５、３９、４０、４３及び４５は、選択されるアミノ酸セットのいずれでもよい。したがって、配列番号１は可能な配列のセットを定義する。このセットの各メンバーは、例えば、位置５、１４、３０、５１及び５５にシステインを、そして位置１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２２１、２２、２３、３１、３２、３４、３５、３９、４０、４３及び４５にアミノ酸の特定のセットのいずれか１つを含有する。好ましい態様において、これらアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８及び／又は１９は、個別に又は集団で、如何なる組合せでも、配列番号２の対応の位置に相当するよう選択されることができる。このペプチドは、配列番号２に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一であることが好ましい。
【００４２】
方法及び組成物
本発明は、臓器又は組織を、本明細書に記載されるようなカリクレイン・インヒビターを含む保存溶液と接触させることを含む、臓器及び組織を保存するための方法にかかるものである。また、本発明は、臓器又は組織をカリクレイン・インヒビターと接触させることを含む、再灌流障害又は宿主から摘出されている臓器若しくは組織の損傷を軽減し、阻害し又は防止することに関するものである。本発明の保存液は、臓器又は組織をこの溶液に接触させる場合、臓器組織、又は臓器全体を保存し及び／又は保護するために用いることができる。本発明の特定の態様は、ヒト心臓、又はヒト心筋組織を保存するためのものである。本発明の他の態様は、ヒト肺又はヒト肺組織を保存するためのものである。本発明により保存され得る他の臓器、又はその一部には、腎臓、肝臓、内皮組織、腸管組織、血管組織（例えば大動脈移植片）、皮膚、及び膵臓が含まれる。本発明は、哺乳動物組織、臓器又はその一部を保存するためにこの溶液を使用することを意図するものである。更に、この溶液は、例えば、移植処置中に臓器又は組織を灌流することにより、臓器移植を容易にするために用いることができる。この溶液は、心臓手術中に心停止液として用いることもできる。臓器又はその一部は、常に、特に移植処置前、適切な溶液中に維持されることが好ましい。
【００４３】
本発明の溶液を用いて、貯蔵、移植又は他の外科手術のあいだ、臓器又は組織の生存率を維持することができる。本発明は、組織、臓器又はその一部を、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏ生存率が延長するように本発明の溶液に接触させることを含む、組織又は臓器の貯蔵方法を含む。この溶液は、心臓又は肺の組織の生存率を２４時間以上まで維持することを可能にする。本発明の溶液の使用により、臓器生存率が改善される。
【００４４】
あるいは又は更に、いったんドナーから切除されたら、臓器又は生組織を、インヒビターを含有する保存溶液中に置くことができる。更に、カリクレイン・インヒビターを、移植直前に又は移植中に、移植レシピエントに投与することも好ましい。全ての場合において、インヒビターは、本明細書に記載の及び／又は当該技術分野に公知の方法及び製剤を用いて、組織への注射のように、危険を冒して組織に直接投与することもでき、又は経口投与又は非経口投与により全身に提供してもよい。
【００４５】
１つの態様において、市販の保存溶液を有利に用いることができる。このような溶液の例には、本明細書中に援用される米国特許第４，７９８，８２４号、第４，８７３，２３０号、第４，８７９，２８３号に記載の、ＶＩＡＳＰＡＮの商標で販売されるＢｅｌｚｅｒのＵＷ溶液が含まれる。
【００４６】
上記特許に記載の保存溶液及び灌流液組成物には、限定されるものではないが、以下が含まれる。
【００４７】
【表２】
【００４８】
この溶液を、ＮａＯＨを用いて室温でｐＨ７．４にする。最終濃度は、Ｎａ＝３０．±．５ｍＭ、Ｋ＋＝１２０±５ｍＭ、ｍＯｓｍ／リットル＝３２０±５である。バクトリウム＝トリメトプリム（１６ｍｇ／ｍＬ）及びスルファメトキサゾール（８０ｍｇ／ｍＬ）。ヒドロキシエチル・スターチは、約３〜約８％の範囲で存在し得る。
【００４９】
この溶液は、典型的には、膵臓を７２時間保存し、腎臓を４８時間保存し、そして肝臓を少なくとも２４時間保存する。本明細書中に援用される米国特許第５，１４５，７７１号は、「カロライナ液」として知られる臓器保存液について記載しおり、本発明にも有用である。上記特許に記載の洗浄溶液又は保存溶液組成物には、限定されるものではないが、成分がおよそ以下の表３に記載の濃度範囲で含まれる。
【００５０】
【表３】
【００５１】
１つの特定の態様は、以下の表４に記載の量の成分を用いて、以下に記載の指示に従い調製される。
【００５２】
【表４】
【００５３】
１つの態様において、この溶液は以下のように調製することができる：５００ｍＬ容量フラスコを用いて１０％（重量／容量）ヒドロキシエチル・スターチ溶液５００ｍＬを量り、１Ｌビーカーに注ぐ。再蒸留水４００ｍＬを加え、マグネチック・スターラー・バーを用いて激しく撹拌する。残りの成分を１つずつ加える。全成分を加えた後、１〜２ｍＬの５Ｎ ＮａＯＨでｐＨを６．５に調製する。この溶液は、少なくとも３０分間撹拌する必要がある。この溶液を１Ｌ容量フラスコに移し、最終容量を１Ｌにする。不溶粒子を除去するため、ろ過する。
【００５４】
更に他の態様を以下の表５に例示する。
【００５５】
【表５】
【００５６】
上記表５の組成物は、場合により、上記表３に特定される成分の１種、数種、又は全てを含んでいてもよい。組成物は、少なくとも１つの酸化防止剤を含むことが好ましい。したがって、組成物の１つの特定の態様を以下の表６に記載する。
【００５７】
【表６】
【００５８】
好ましい組成物は、１種以上の医薬的に許容可能なバッファー、担体、酸化防止剤、プロテアーゼ・インヒビター、又は他の抗虚血剤を更に含んでいてもよい。
本発明の方法に有用な組成物は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドまたは本明細書に記載のこのようなＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドを含むＫＩポリペプチドのいずれかを含む。特に好ましいのは、配列番号２のアミノ酸３〜６０の５８アミノ酸配列を有するＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドを含むＫＩポリペプチドである。本発明の方法及び組成物に有用な特に好ましいＫＩポリペプチドの例は、配列番号２の６０アミノ酸配列を有するＰＥＰ−１ ＫＩポリペプチドである。配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が配列番号３に提供される（例えば図２のヌクレオチド３０９〜４８８を参照されたい）。本発明は、公知の遺伝コードに基づいて、ヌクレオチド配列によってコードされるそれぞれのアミノ酸を１種以上の公知の縮重コドンで単に置き換えることにより、配列番号３のヌクレオチド配列の縮重型も提供することが理解される。配列番号３のヌクレオチド７〜１８０、及びその縮重型は、配列番号２のアミノ酸３〜６０の５８アミノ酸配列を有する非天然Ｋｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドをコードする。
【００５９】
ＫＩポリペプチドの濃度の検討
本発明の方法におけるＫＩポリペプチドを用いた投薬に関し、いくつかの考慮すべき事項は、配列番号２（分子量７，０５４ダルトン）のアミノ酸配列を有する本発明の代表的ＰＥＰ−１ ＫＩポリペプチドの例により具体的に示すことができる。
【００６０】
以下の表７は、カリクレイン及び他の１１の公知の血漿プロテアーゼに対するＰＥＰ−１ ＫＩポリペプチドの親和性（Ｋｉ，ａｐｐ）の比較を提供する。
【００６１】
【表７】
【００６２】
ＰＥＰ−１ ＫＩポリペプチドが、ヒト血漿カリクレインに対し高度に特異的であることは明らかである。更に、ＰＥＰ−１のカリクレインに対する親和性（Ｋｉ，ａｐｐ）は、アプロチニンのカリクレインに対する親和性よりも１０００倍高い：カリクレインに対するＰＥＰ−１のＫｉ，ａｐｐは約４４ｐＭ（表１）であるが、アプロチニンのカリクレインに対するＫｉ，ａｐｐは３０，０００ｐＭである。したがって、ＰＥＰ−１の用量は、モル当たりの基準で、アプロチニンに対して用いられるよりもおよそ１０００倍低いであろう。しかしながら、いくつかの他の因子についての検討が、実施に役立つＰＥＰ−１の用量について、より正確な評価を与えるかもしれない。このような因子には、特定の患者からの臓器摘出により活性化されるカリクレインの量が含まれ、当業者に認識されるであろう。
以下の非限定的実施例を参照して本発明を更に説明する。本明細書中に引用する全ての特許、特許出願、及び他の全ての出版物及びウェブサイトの教示は、本明細書中にその全体が援用される。
【実施例】
【００６３】
実施例１：代表的ＫＩポリペプチド
本発明の組成物及び方法に有用なＫｌポリペプチド（ＰＥＰ−１）を、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーの組換えファージに提示されたカリクレイン結合ポリペプチドとして同定した。ＰＥＰ−１は以下のアミノ酸配列を有する：Ｇｌｕ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２）。ＰＥＰ−１の分子量は７，０５４ダルトンである。
【００６４】
ＰＥＰ−１アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸３〜６０）をコードする組換えファージＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）を単離し、組換えファージＤＮＡから決定される標準的方法で配列決定した。ＰＥＰ−１は、酵母株ピキア・パストリスのＨｉｓ４−表現型宿主細胞中で、更なる特徴付けに有用な量で組換えタンパク質として産生した。
【００６５】
実施例２：ＫＩポリペプチドを発現させるための組換えプラスミドの構築
開始プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２はアンピシリン耐性であり、Ｐ．パストリスに由来する野生型アレルのＨｉｓ４を含有する。組換え発現プラスミドｐＰＩＣ−Ｋ５０３中にｍａｔαプレプロ−ＰＥＰ−１融合タンパク質のコード配列を含む最終ＤＮＡ配列を図２に示す。ｐＨＩＬ−Ｄ２のＤＮＡ配列を以下のように改変してｐＰＩＣ−Ｋ５０３を作製した。
【００６６】
１． ｐＨＩＬ−Ｄ２の３’ＡＯＸ１領域におけるＢｓｔＢＩ部位は、Ｈｉｓ４遺伝子の下流に位置するが、部分的制限消化、フィルイン、及びライゲーションにより除去し、配列をＴＴＣＧＡＡ（配列番号２３）からＴＴＣＧＣＧＡＡ（配列番号２４）へ改変した。この改変は、発現カセットのプラスミドへのクローニングを容易にし、管理するために行った。
【００６７】
２． Ｈｉｓ４の下流に位置するｂｌａ遺伝子を有するＡａｔＩＩ部位は、制限消化、フィルイン、及びライゲーションにより除去し、配列をＧＡＣＧＴＣ（配列番号２５）からＧＡＣＧＴＡＣＧＴＣ（配列番号２６）へ改変した。この改変は、ＡａｔＩＩ部位を有する発現カセットのプラスミドへのクローニングを容易にするために行った。オリジナルのカリクレイン結合ディスプレイ・ファージからのヌクレオチド配列に基づき、４５０塩基対（ｂｐ）から成る、ＰＥＰ−１をコードするＤＮＡを合成した。ｐＨＩＬ−Ｄ２プラスミド中の挿入物の最終ＤＮＡ配列は、５’ＡＯＸ１配列及び３’ＡＯＸ１配列（図２に示す部分）が側面にあり、ＰＥＰ−１ ＫＩポリペプチドの構造コード配列に融合したＳ．セレビジエのｍａｔαプレプロシグナルペプチドを含む融合タンパク質をコードする。酵母宿主細胞からのＰＥＰ−１の分泌を容易にするためにシグナルペプチドを付加した。挿入物を形成するためのオリゴヌクレオチドは、合成され、又は商業的に得た（Ｇｅｎｅｓｉｓ Ｌａｂｓ、ウッドランド、テキサス）。挿入物はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で作製した。次にｍａｔαプレプロ／ＰＥＰ−１融合タンパク質をコードする連結した合成ＤＮＡを、ライゲーションにより、改変ｐＨＩＬ−Ｄ２プラスミドのＢｓｔＢＩ部位とＥｃｏＲＩ部位のあいだに導入した。
【００６８】
連結産物を用いて大腸菌株ＸＬ１ Ｂｌｕｅを形質転換した。ＰＣＲアッセイを用い、所望のプラスミド構築物について大腸菌の形質転換体をスクリーニングした。細胞抽出物由来のＤＮＡを、５’ＡＯＸ１配列及び３’ＡＯＸ１配列（上記及び図２を参照されたい）を含有するプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。正確な塩基対数のＰＣＲ産物を配列決定した。更に、クローニング部位の両側およそ２０〜５０ｂｐについて配列決定し、推定配列を得た。ｐＨＩＬ−Ｄ２プラスミド中の挿入物の最終ＤＮＡ配列（プラスミドｐＰＩＣ−Ｋ５０３を産生するためのもの）を、５’及び３’ＡＯＸ１フランキング配列の一部、並びにＰＥＰ−１ ＫＩポリペプチドの構造コード配列に融合したＳ．セレビジエのｍａｔαプレプロシグナルペプチドを含む融合タンパク質の対応のアミノ酸配列とともに図２に示す。所望の発現プラスミド構築物による形質転換体であるプラスミドｐＰＩＣ−Ｋ５０３を、ＰＥＰ−１の日常的産生用酵母細胞株を調整するために選択した。
【００６９】
実施例３：組換え酵母細胞株からのＰＥＰ−１の製造
Ｈｉｓ４−表現型を有するＰ．パストリスＧＳ１１５のスフェロプラストを、ＳａｃＩ部位で直線化した後の発現プラスミドｐＰＩＣ−Ｋ５０３（上記）を用いて、このプラスミドＤＮＡを宿主５’ＡＯＸ１部位へ相同組換えすることにより、形質転換した。産生株の表現型はＨｉｓ４＋である。全プラスミドを酵母の５’ＡＯＸ１ゲノム配列へ挿入した。
【００７０】
形質転換からの単離物を、単一炭素源としてメタノールを用い、外来ヒスチジン非存在下での増殖によりスクリーニングした。形質転換体の９５％以上は、単一炭素源としてメタノールを用いて増殖する野生型の能力を保持しており、プラスミドがトランス置換ではなく相同組換えで宿主ゲノムに挿入されたことを示した。これらの形質転換体は増殖に外来ヒスチジンを必要とせず、プラスミドが宿主ゲノムに統合されたことを示した。選択したコロニーをクローニングした。小規模培養発現実験を行い、高レベルの活性ＰＥＰ−１を培地へ分泌するクローンを同定した。精製した培養上清溶液中のＰＥＰ−１分泌レベルを、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でＰＥＰ−１レベルについて定量し、カリクレイン阻害を評価した。サンプリングされた培養物間で高レベルのＰＥＰ−１発現に基づき、ＰＥＰ−１産生について酵母クローンを選択した。
【００７１】
ＰＥＰ−１を産生するＰ．パストリスのマスター細胞バンク及び作業用細胞バンクを商業的に準備した（ＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ボセル、ワシントン）。酵母におけるＰＥＰ−１の標準的産生は、以下の３工程を含む：（１）種培養の準備、（２）発酵、及び（３）培養物の回収。
【００７２】
種培養工程は、滅菌接種材料ブロス（酵母窒素塩基、リン酸カリウム、及びグリセロール、ｐＨ＝５）を含有する６つのフラスコ（それぞれ３００ｍＬ）に、ＰＥＰ−１産生Ｐ．パストリスの作業用細胞バンクのバイアル１本の内容物を植菌することから成る。フラスコに、オービタルシェーカー（３００ｒｐｍ）中、３０℃±２℃でおよそ１３時間植え付けた。
【００７３】
滅菌ブロスを充填した１００リットルの密封式ブラウン発酵槽中で発酵を行った。６つの種培養フラスコの内容物を発酵槽に移して各々の発酵を開始した。およそ２４時間後に発酵槽中のグリセロールが消耗し、追加のグリセロールを更におよそ８時間加えた。
【００７４】
次に、混合供給相を、これはおよそ８３時間続いたが、グリセロール及びメタノール原材料の添加により開始した。この時間の終了後、発酵を停止し、発酵槽の内容物を精製水で希釈した。ＰＥＰ−１の精製及び処理は以下の５工程から成る：（１）拡張ベッドクロマトグラフィ、（２）陽イオン交換クロマトグラフィ、（３）疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、（４）限外ろ過及びダイアフィルトレーション、並びに（５）最終ろ過及び包装。
【００７５】
最初の精製工程は拡張ベッドクロマトグラフィから成る。希釈した発酵培養物を、ストリームラインＳＰ樹脂（アマシャム・ファルマシア ストリームライン２００ クロマトグラフィカラム、アマシャム・ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー）を充填した平衡化カラムにかけた。次にカラムを上向きモードで洗浄し（５０ｍＭ酢酸、ｐＨ＝３．０〜３．５）、拡張ベッドからの酵母細胞を水で洗い流した。拡張ベッドが洗浄を促進するところまでトップアダプターを上げた。流れを止め、ベッドを静置させた。アダプターを、静置したベッドのわずかに上になるように下げた。流れを逆向きにした。溶出液を回収した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０を用いて、下向きモードで洗浄を継続した。溶出液を回収した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０を用いてＰＥＰ−１をカラムから溶出させた。溶出液を５０リットル容器に回収した。次に、溶出液を０．２２μフィルターに通して精製部位に位置する清潔な容器にろ過した。ＰＥＰ−１濃度を測定するために更にサンプルを回収した。次に、拡張ベッドカラムからろ過した溶出液を用いて陽イオン交換クロマトグラフィ工程を行った。１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、ｐＨ６．２でＰＥＰ−１をカラムから溶出させた。
【００７６】
付加的なタンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）でＰＥＰ−１調整品から除去した。ＨＩＣの前に、陽イオン交換カラムからの溶出液を硫酸アンモニウムで希釈した。溶出液をカラムにかけ、リン酸カリウム（１００ｍＭ）中の硫酸アンモニウム（０．５７２Ｍ）、ｐＨ７．０でＰＥＰ−１を溶出させた。溶出液をＡ２８０値に基づきフラクションに回収した。全画分を予め秤量した滅菌ＰＥＴＧボトルに回収した。
【００７７】
選択した画分を清潔な容器にプールした。このプールを限外ろ過で濃縮した。濃縮したＰＥＰ−１調整品を１０倍量のＰＢＳ、ｐＨ７．０で直ちにダイアフィルトレーションした。
【００７８】
バルクＰＥＰ−１の汚染微生物数を最小限にするため、最終ろ過工程は包装前に行った。バルク溶液を０．２２μフィルターでろ過し、予め秤量した滅菌ＰＥＴＧボトルに回収した。ロット放出試験のためにサンプルを取り出した。バルクの残りを滅菌ＰＥＴＧボトルに無菌的に分注し、−２０℃で保存した。
【００７９】
実施例４：カリクレイン阻害アッセイ
カイネティック試験を用いてＰＥＰ−１などのＫＩポリペプチドの阻害活性を測定した。このカイネティック・アッセイは、基質プロリルフェニルアラニルアルギニル アミノ メチル クマリンのカリクレインによる切断後に蛍光を測定する。既知量のカリクレインを、マイクロタイタープレート上の好適な反応バッファー中で、連続的に希釈したＫＩポリペプチド標準リファレンス又は連続的に希釈したＫＩポリペプチド試験サンプルとともにインキュベートした。各サンプルについて３回実行した。基質溶液を加え、励起波長３６０ｍｎ及び蛍光波長４６０ｎｍを用いて直ちにプレートを読んだ。標準リファレンス曲線及びサンプル曲線のそれぞれのうち少なくとも２つは、有効とみなされるＲ２値０．９５を有することが必要とされる。
【００８０】
実施例５：臓器保存
コンフルエントのＨＵＶＥＣをＰＢＳで洗浄し、４℃で２４〜４８時間、無血清培地（ＳＦＭ）中で更にインキュベートした。冷蔵保存後、細胞をＰＢＳで数回洗浄し、カリクレイン（０．１２５Ｕ）及びカリクレイン特異的基質Ｓ２３０２を細胞へ加えた。光学密度の変化を記録した。光学顕微鏡による細胞結合ＰＥＰ−１の評価のために、冷蔵保存後、ＨＵＶＥＣをＰＥＰ−１で処理し、ホルマリン固定し、ウサギ抗ＰＥＰ−１で処理し、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧで処理した。ＨＵＶＥＣのカリクレイン産生能についても３７℃に維持された細胞表面及び細胞上清で評価した。３７℃に維持されたＨＵＶＥＣ上清中のカリクレイン活性は３８０±１９Ａ．Ｕ．であり；同一細胞表面上では活性を測定できなかった。光学顕微鏡評価で、２４時間冷蔵処理されたＨＵＶＥＣ表面に対するＰＥＰ−１の有意な結合がみられた。ＰＥＰ−１存在下（５ｍｇ／ｍｌ）で細胞をインキュベートすることにより、最大結合を得た。細胞結合ＰＥＰ−１は、外来カリクレイン阻害能を保持していた。これらの結果は、ＰＥＰ−１がカリクレイン・インヒビター活性を維持しながら内皮細胞に結合することを示している。したがって、キニンが介在する血管表面上の損傷を検出し、調節するために用いることができる。
【００８１】
本発明を、好ましい態様を参照して具体的に示して説明するが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、形態的に及び細部に種々の改変がなされ得ることが当業者には理解されるであろう。
［態様１］
臓器又は組織を有効量のカリクレイン・インヒビターと接触させることを含む、臓器又は組織の保存方法。
［態様２］
ポリペプチドがＫｕｎｉｔｚドメインを含む、態様１に記載の方法。
［態様３］
カリクレイン・インヒビターが配列番号２を含むポリペプチドである、態様２に記載の方法。
［態様４］
カリクレイン・インヒビターが配列番号２のアミノ酸３〜６０を含むポリペプチドである、態様２に記載の方法。
［態様５］
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織又は皮膚である、態様１に記載の方法。
［態様６］
アミノ酸配列： Ｘａａ１ Ｘａａ２ Ｘａａ３ Ｘａａ４ Ｃｙｓ Ｘａａ６ Ｘａａ７ Ｘａａ８ Ｘａａ９ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１ Ｇｌｙ Ｘａａ１３ Ｃｙｓ Ｘａａ１５ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１ Ｘａａ２２ Ｘａａ２３ Ｘａａ２４ Ｘａａ２５ Ｘａａ２６ Ｘａａ２７ Ｘａａ２８ Ｘａａ２９ Ｃｙｓ Ｘａａ３１ Ｘａａ３２ Ｐｈｅ Ｘａａ３４ Ｘａａ３５ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｘａａ３９ Ｘａａ４０ Ｘａａ４１ Ｘａａ４２ Ｘａａ４３ Ｘａａ４４ Ｘａａ４５ Ｘａａ４６ Ｘａａ４７ Ｘａａ４８ Ｘａａ４９ Ｘａａ５０ Ｃｙｓ Ｘａａ５２ Ｘａａ５３ Ｘａａ５４ Ｃｙｓ Ｘａａ５６ Ｘａａ５７ Ｘａａ５８（配列番号１）を含むポリペプチドを含むカリクレイン・インヒビターの有効量と臓器又は組織とを接触させることを含む、臓器又は組織の保存方法であって、
Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５６、Ｘａａ５７又はＸａａ５８はそれぞれ個々に１つのアミノ酸であるか又は存在せず；
Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、Ｘａａ２０、Ｘａａ２４、Ｘａａ２５、Ｘａａ２６、Ｘａａ２７、Ｘａａ２８、Ｘａａ２９、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４４、Ｘａａ４６、Ｘａａ４７、Ｘａａ４８、Ｘａａ４９、Ｘａａ５０、Ｘａａ５２、Ｘａａ５３及びＸａａ５４は如何なるアミノ酸でもよく；
Ｘａａ１０は：Ａｓｐ及びＧｌｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１１は：Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１３は：Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１５は：Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１６は：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＡｓｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１７は：Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１８は：Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１９は：Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２１は：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２２は：Ｔｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２３は：Ｔｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３１は：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３２は：Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ及びＶａｌから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３４は：Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ及びＬｅｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３５は：Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３９は：Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＡｓｐから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４０は：Ｇｌｙ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４３は：Ａｓｎ及びＧｌｙから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４５は：Ｐｈｅ及びＴｙｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；そして
該ポリペプチドはカリクレインを阻害する、前記方法。
［態様７］
Ｘａａ６がＡｌａである、態様６に記載の方法。
［態様８］
Ｘａａ７がＰｈｅである、態様６に記載の方法。
［態様９］
Ｘａａ８がＬｙｓである、態様６に記載の方法。
［態様１０］
Ｘａａ９がＡｌａである、態様６に記載の方法。
［態様１１］
Ｘａａ１０がＡｓｐである、態様６に記載の方法。
［態様１２］
Ｘａａ１１がＡｓｐである、態様６に記載の方法。
［態様１３］
Ｘａａ１３がＰｒｏであり、Ｘａａ１５がＡｒｇであり、Ｘａａ１６がＡｌａであり、Ｘａａ１７がＡｌａであり、Ｘａａ１８がＨｉｓであり、そしてＸａａ１９がＰｒｏである、態様６に記載の方法。
［態様１４］
Ｘａａ２０がＡｒｇである、態様６に記載の方法。
［態様１５］
Ｘａａ２４がＡｓｎである、態様６に記載の方法。
［態様１６］
Ｘａａ２５がＩｌｅである、態様６に記載の方法。
［態様１７］
Ｘａａ２６がＰｈｅである、態様６に記載の方法。
［態様１８］
Ｘａａ２７がＴｈｒである、態様６に記載の方法。
［態様１９］
Ｘａａ２８がＡｒｇである、態様６に記載の方法。
［態様２０］
Ｘａａ２９がＧｌｎである、態様６に記載の方法。
［態様２１］
Ｘａａ３１がＧｌｕである、態様６に記載の方法。
［態様２２］
Ｘａａ３２がＧｌｕである、態様６に記載の方法。
［態様２３］
Ｘａａ３４がＩｌｅである、態様６に記載の方法。
［態様２４］
Ｘａａ３５がＴｙｒである、態様６に記載の方法。
［態様２５］
Ｘａａ３９がＧｌｕである、態様６に記載の方法。
［態様２６］
Ｘａａ４１がＡｓｎである、態様６に記載の方法。
［態様２７］
Ｘａａ４２がＡｒｇである、態様６に記載の方法。
［態様２８］
Ｘａａ４４がＡｒｇである、態様６に記載の方法。
［態様２９］
Ｘａａ４６がＧｌｕである、態様６に記載の方法。
［態様３０］
Ｘａａ４７がＳｅｒである、態様６に記載の方法。
［態様３１］
Ｘａａ４８がＬｅｕである、態様６に記載の方法。
［態様３２］
Ｘａａ４９がＧｌｕである、態様６に記載の方法。
［態様３３］
Ｘａａ５０がＧｌｕである、態様６に記載の方法。
［態様３４］
ポリペプチドが：Ｘａａ１０のＡｓｐ；Ｘａａ１１のＡｓｐ；Ｘａａ１３のＰｒｏ；Ｘａａ１５のＡｒｇ；Ｘａａ１６のＡｌａ；Ｘａａ１７のＡｌａ；Ｘａａ１８のＨｉｓ；Ｘａａ１９のＰｒｏ；Ｘａａ２１のＴｒｐ；Ｘａａ２２のＰｈｅ；Ｘａａ２３のＰｈｅ；Ｘａａ３１のＧｌｕ；Ｘａａ３２のＧｌｕ；Ｘａａ３４のＩｌｅ；Ｘａａ３５のＴｙｒ；Ｘａａ３９のＧｌｕ；Ｘａａ４０のＧｌｙ；Ｘａａ４３のＡｓｎ；及びＸａａ４５のＰｈｅから成る群より選択される２以上のアミノ酸を含む、態様６に記載の方法。
［態様３５］
ポリペプチドが：Ｘａａ１０のＡｓｐ；Ｘａａ１１のＡｓｐ；Ｘａａ１３のＰｒｏ；Ｘａａ１５のＡｒｇ；Ｘａａ１６のＡｌａ；Ｘａａ１７のＡｌａ；Ｘａａ１８のＨｉｓ；Ｘａａ１９のＰｒｏ；Ｘａａ２１のＴｒｐ；Ｘａａ２２のＰｈｅ；Ｘａａ２３のＰｈｅ；Ｘａａ３１のＧｌｕ；Ｘａａ３２のＧｌｕ；Ｘａａ３４のＩｌｅ；Ｘａａ３５のＴｙｒ；Ｘａａ３９のＧｌｕ；Ｘａａ４０のＧｌｙ；Ｘａａ４３のＡｓｎ；及びＸａａ４５のＰｈｅから成る群より選択される５以上のアミノ酸を含む、態様６に記載の方法。
［態様３６］
ポリペプチドが：Ｘａａ１０のＡｓｐ；Ｘａａ１１のＡｓｐ；Ｘａａ１３のＰｒｏ；Ｘａａ１５のＡｒｇ；Ｘａａ１６のＡｌａ；Ｘａａ１７のＡｌａ；Ｘａａ１８のＨｉｓ；Ｘａａ１９のＰｒｏ；Ｘａａ２１のＴｒｐ；Ｘａａ２２のＰｈｅ；Ｘａａ２３のＰｈｅ；Ｘａａ３１のＧｌｕ；Ｘａａ３２のＧｌｕ；Ｘａａ３４のＩｌｅ；Ｘａａ３５のＴｙｒ；Ｘａａ３９のＧｌｕ；Ｘａａ４０のＧｌｙ；Ｘａａ４３のＡｓｎ；及びＸａａ４５のＰｈｅから成る群より選択される１０以上のアミノ酸を含む、態様６に記載の方法。
［態様３７］
ポリペプチドが：Ｘａａ１０のＡｓｐ；Ｘａａ１１のＡｓｐ；Ｘａａ１３のＰｒｏ；Ｘａａ１５のＡｒｇ；Ｘａａ１６のＡｌａ；Ｘａａ１７のＡｌａ；Ｘａａ１８のＨｉｓ；Ｘａａ１９のＰｒｏ；Ｘａａ２１のＴｒｐ；Ｘａａ２２のＰｈｅ；Ｘａａ２３のＰｈｅ；Ｘａａ３１のＧｌｕ；Ｘａａ３２のＧｌｕ；Ｘａａ３４のＩｌｅ；Ｘａａ３５のＴｙｒ；Ｘａａ３９のＧｌｕ；Ｘａａ４０のＧｌｙ；Ｘａａ４３のＡｓｎ；及びＸａａ４５のＰｈｅから成る群より選択される１５以上のアミノ酸を含む、態様６に記載の方法。
［態様３８］
Ｘａａ３がＳｅｒである、態様６に記載の方法。
［態様３９］
Ｘａａ２がＨｉｓである、態様６に記載の方法。
［態様４０］
Ｘａａ１がＭｅｔである、態様６に記載の方法。
［態様４１］
Ｘａａ５６がＴｈｒである、態様６に記載の方法。
［態様４２］
Ｘａａ５７がＡｒｇである、態様６に記載の方法。
［態様４３］
Ｘａａ５８がＡｓｐである、態様６に記載の方法。
［態様４４］
カリクレイン・インヒビターが、配列番号２のアミノ酸３〜６０を含むポリペプチドである、態様６に記載の方法。
［態様４５］
カリクレイン・インヒビターが配列番号２を含むポリペプチドである、態様６に記載の方法。
［態様４６］
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織又は皮膚である、態様６に記載の方法。
［態様４７］
術中及び／又は被験者から臓器摘出後の臓器の再灌流障害を軽減する方法であって、臓器の貯蔵及び保存溶液中に臓器を置くことを含み、この溶液はカリクレイン・インヒビターを含む、前記方法。
［態様４８］
カリクレイン インヒビターが配列番号１を含むポリペプチドであり、ここで、
Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５６、Ｘａａ５７又はＸａａ５８はそれぞれ個々に１つのアミノ酸であるか又は存在せず;
Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、Ｘａａ２０、Ｘａａ２４、Ｘａａ２５、Ｘａａ２６、Ｘａａ２７、Ｘａａ２８、Ｘａａ２９、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４４、Ｘａａ４６、Ｘａａ４７、Ｘａａ４８、Ｘａａ４９、Ｘａａ５０、Ｘａａ５２、Ｘａａ５３及びＸａａ５４は如何なるアミノ酸でもよく；
Ｘａａ１０は：Ａｓｐ及びＧｌｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１１は：Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１３は：Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１５は：Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１６は：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＡｓｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１７は：Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１８は：Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１９は：Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２１は：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２２は：Ｔｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２３は：Ｔｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３１は：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３２は：Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ及びＶａｌから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３４は：Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ及びＬｅｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３５は：Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３９は：Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＡｓｐから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４０は：Ｇｌｙ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４３は：Ａｓｎ及びＧｌｙから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４５は：Ｐｈｅ及びＴｙｒから成る群より選択されるアミノ酸である、
態様４７に記載の方法。
［態様４９］
カリクレイン・インヒビターが配列番号２のアミノ酸３〜６０を含むポリペプチドである、態様４７に記載の方法。
［態様５０］
カリクレイン・インヒビターが配列番号２を含むポリペプチドである、態様４７に記載の方法。
［態様５１］
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織又は皮膚である、態様４７に記載の方法。
［態様５２］
アミノ酸配列：Ｘａａ１ Ｘａａ２ Ｘａａ３ Ｘａａ４ Ｃｙｓ Ｘａａ６ Ｘａａ７ Ｘａａ８ Ｘａａ９ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１ Ｇｌｙ Ｘａａ１３ Ｃｙｓ Ｘａａ１５ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１ Ｘａａ２２ Ｘａａ２３ Ｘａａ２４ Ｘａａ２５ Ｘａａ２６ Ｘａａ２７ Ｘａａ２８ Ｘａａ２９ Ｃｙｓ Ｘａａ３１ Ｘａａ３２ Ｐｈｅ Ｘａａ３４ Ｘａａ３５ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｘａａ３９ Ｘａａ４０ Ｘａａ４１ Ｘａａ４２ Ｘａａ４３ Ｘａａ４４ Ｘａａ４５ Ｘａａ４６ Ｘａａ４７ Ｘａａ４８ Ｘａａ４９ Ｘａａ５０ Ｃｙｓ Ｘａａ５２ Ｘａａ５３ Ｘａａ５４ Ｃｙｓ Ｘａａ５６ Ｘａａ５７ Ｘａａ５８（配列番号１）を含むポリペプチドを含有する生理的に許容可能なｅｘ ｖｉｖｏ臓器保存溶液含む、臓器の保存及び／又は貯蔵のための組成物であって、
Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５６、Ｘａａ５７又はＸａａ５８はそれぞれ個々に１つのアミノ酸であるか又は存在せず；
Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、Ｘａａ２０、Ｘａａ２４、Ｘａａ２５、Ｘａａ２６、Ｘａａ２７、Ｘａａ２８、Ｘａａ２９、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４４、Ｘａａ４６、Ｘａａ４７、Ｘａａ４８、Ｘａａ４９、Ｘａａ５０、Ｘａａ５２、Ｘａａ５３及びＸａａ５４は如何なるアミノ酸でもよく；
Ｘａａ１０は：Ａｓｐ及びＧｌｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１１は：Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１３は：Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１５は：Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１６は：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＡｓｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１７は：Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１８は：Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１９は：Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２１は：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２２は：Ｔｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２３は：Ｔｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３１は：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３２は：Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ及びＶａｌから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３４は：Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ及びＬｅｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３５は：Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３９は：Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＡｓｐから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４０は：Ｇｌｙ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４３は：Ａｓｎ及びＧｌｙから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４５は：Ｐｈｅ及びＴｙｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；そして
該ポリペプチドはカリクレインを阻害する、前記組成物。
［態様５３］
Ｘａａ６がＡｌａである、態様５２に記載の組成物。
［態様５４］
Ｘａａ７がＰｈｅである、態様５２に記載の組成物。
［態様５５］
Ｘａａ８がＬｙｓである、態様５２に記載の組成物。
［態様５６］
Ｘａａ９がＡｌａである、態様５２に記載の組成物。
［態様５７］
Ｘａａ１０がＡｓｐである、態様５２に記載の組成物。
［態様５８］
Ｘａａ１１がＡｓｐである、態様５２に記載の組成物。
［態様５９］
Ｘａａ１３がＰｒｏであり、Ｘａａ１５がＡｒｇであり、Ｘａａ１６がＡｌａであり、Ｘａａ１７がＡｌａであり、Ｘａａ１８がＨｉｓであり、そしてＸａａ１９がＰｒｏである、態様５２に記載の組成物。
［態様６０］
Ｘａａ２０がＡｒｇである、態様５２に記載の組成物。
［態様６１］
Ｘａａ２４がＡｓｎである、態様５２に記載の組成物。
［態様６２］
Ｘａａ２５がＩｌｅである、態様５２に記載の組成物。
［態様６３］
Ｘａａ２６がＰｈｅである、態様５２に記載の組成物。
［態様６４］
Ｘａａ２７がＴｈｒである、態様５２に記載の組成物。
［態様６５］
Ｘａａ２８がＡｒｇである、態様５２に記載の組成物。
［態様６６］
Ｘａａ２９がＧｌｎである、態様５２に記載の組成物。
［態様６７］
Ｘａａ３１がＧｌｕである、態様５２に記載の組成物。
［態様６８］
Ｘａａ３２がＧｌｕである、態様５２に記載の組成物。
［態様６９］
Ｘａａ３４がＩｌｅである、態様５２に記載の組成物。
［態様７０］
Ｘａａ３５がＴｙｒである、態様５２に記載の組成物。
［態様７１］
Ｘａａ３９がＧｌｕである、態様５２に記載の組成物。
［態様７２］
Ｘａａ４１がＡｓｎである、態様５２に記載の組成物。
［態様７３］
Ｘａａ４２がＡｒｇである、態様５２に記載の組成物。
［態様７４］
Ｘａａ４４がＡｒｇである、態様５２に記載の組成物。
［態様７５］
Ｘａａ４６がＧｌｕである、態様５２に記載の組成物。
［態様７６］
Ｘａａ４７がＳｅｒである、態様５２に記載の組成物。
［態様７７］
Ｘａａ４８がＬｅｕである、態様５２に記載の組成物。
［態様７８］
Ｘａａ４９がＧｌｕである、態様５２に記載の組成物。
［態様７９］
Ｘａａ５０がＧｌｕである、態様５２に記載の組成物。
［態様８０］
ポリペプチドが：Ｘａａ１０のＡｓｐ；Ｘａａ１１のＡｓｐ；Ｘａａ１３のＰｒｏ；Ｘａａ１５のＡｒｇ；Ｘａａ１６のＡｌａ；Ｘａａ１７のＡｌａ；Ｘａａ１８のＨｉｓ；Ｘａａ１９のＰｒｏ；Ｘａａ２１のＴｒｐ；Ｘａａ２２のＰｈｅ；Ｘａａ２３のＰｈｅ；Ｘａａ３１のＧｌｕ；Ｘａａ３２のＧｌｕ；Ｘａａ３４のＩｌｅ；Ｘａａ３５のＴｙｒ；Ｘａａ３９のＧｌｕ；Ｘａａ４０のＧｌｙ；Ｘａａ４３のＡｓｎ；及びＸａａ４５のＰｈｅから成る群より選択される２以上のアミノ酸を含む、態様５２に記載の組成物。
［態様８１］
ポリペプチドが：Ｘａａ１０のＡｓｐ；Ｘａａ１１のＡｓｐ；Ｘａａ１３のＰｒｏ；Ｘａａ１５のＡｒｇ；Ｘａａ１６のＡｌａ；Ｘａａ１７のＡｌａ；Ｘａａ１８のＨｉｓ；Ｘａａ１９のＰｒｏ；Ｘａａ２１のＴｒｐ；Ｘａａ２２のＰｈｅ；Ｘａａ２３のＰｈｅ；Ｘａａ３１のＧｌｕ；Ｘａａ３２のＧｌｕ；Ｘａａ３４のＩｌｅ；Ｘａａ３５のＴｙｒ；Ｘａａ３９のＧｌｕ；Ｘａａ４０のＧｌｙ；Ｘａａ４３のＡｓｎ；及びＸａａ４５のＰｈｅから成る群より選択される５以上のアミノ酸を含む、態様５２に記載の組成物。
［態様８２］
ポリペプチドが：Ｘａａ１０のＡｓｐ；Ｘａａ１１のＡｓｐ；Ｘａａ１３のＰｒｏ；Ｘａａ１５のＡｒｇ；Ｘａａ１６のＡｌａ；Ｘａａ１７のＡｌａ；Ｘａａ１８のＨｉｓ；Ｘａａ１９のＰｒｏ；Ｘａａ２１のＴｒｐ；Ｘａａ２２のＰｈｅ；Ｘａａ２３のＰｈｅ；Ｘａａ３１のＧｌｕ；Ｘａａ３２のＧｌｕ；Ｘａａ３４のＩｌｅ；Ｘａａ３５のＴｙｒ；Ｘａａ３９のＧｌｕ；Ｘａａ４０のＧｌｙ；Ｘａａ４３のＡｓｎ；及びＸａａ４５のＰｈｅから成る群より選択される１０以上のアミノ酸を含む、態様５２に記載の組成物。
［態様８３］
ポリペプチドが：Ｘａａ１０のＡｓｐ；Ｘａａ１１のＡｓｐ；Ｘａａ１３のＰｒｏ；Ｘａａ１５のＡｒｇ；Ｘａａ１６のＡｌａ；Ｘａａ１７のＡｌａ；Ｘａａ１８のＨｉｓ；Ｘａａ１９のＰｒｏ；Ｘａａ２１のＴｒｐ；Ｘａａ２２のＰｈｅ；Ｘａａ２３のＰｈｅ；Ｘａａ３１のＧｌｕ；Ｘａａ３２のＧｌｕ；Ｘａａ３４のＩｌｅ；Ｘａａ３５のＴｙｒ；Ｘａａ３９のＧｌｕ；Ｘａａ４０のＧｌｙ；Ｘａａ４３のＡｓｎ；及びＸａａ４５のＰｈｅから成る群より選択される１５以上のアミノ酸を含む、態様５２に記載の組成物。
［態様８４］
Ｘａａ３がＳｅｒである、態様５２に記載の組成物。
［態様８５］
Ｘａａ２がＨｉｓである、態様５２に記載の組成物。
［態様８６］
Ｘａａ１がＭｅｔである、態様５２に記載の組成物。
［態様８７］
Ｘａａ５６がＴｈｒである、態様５２に記載の組成物。
［態様８８］
Ｘａａ５７がＡｒｇである、態様５２に記載の組成物。
［態様８９］
Ｘａａ５８がＡｓｐである、態様５２に記載の組成物。
［態様９０］
ポリペプチドが配列番号２を含む、態様５２に記載の組成物。
［態様９１］
カリクレイン結合ポリペプチドを含有する生理的に許容可能なｅｘ ｖｉｖｏ臓器保存溶液に臓器又は組織を接触させることを含む、臓器又は組織を保存するための方法。
［態様９２］
カリクレイン結合ポリペプチドが配列番号２を含む、態様９１に記載の方法。
［態様９３］
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織又は皮膚である、態様９１に記載の方法。
［態様９４］
カリクレイン結合ポリペプチドがＫｕｎｉｔｚドメインを含む、態様９１に記載の方法。
［態様９５］
Ｋｕｎｉｔｚドメインが、５及び５５；１４及び３８；並びに３０及び５１のそれぞれの位置にシステインを含み、更に：
Ｈｉｓ及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１３；
Ａｌａ及びＧｌｙから選択されるアミノ酸番号１６；
Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＳｅｒから選択されるアミノ酸番号１７；
Ｈｉｓ及びＬｅｕから選択されるアミノ酸番号１８；そして
Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１９（配列番号２３）を含み、
ここで、アミノ酸の番号付けはウシ膵トリプシン・インヒビター（ＢＰＴＩ）のＫｕｎｉｔｚドメインのアミノ酸位置に対応する、態様９４に記載の方法。
［態様９６］
Ｋｕｎｉｔｚドメインが、５及び５５；１４及び３８；並びに３０及び５１のそれぞれの位置にシステインを含み、更に：
Ｈｉｓ及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１３；
Ｌｙｓ及びＡｒｇから選択されるアミノ酸番号１５；
Ａｌａ及びＧｌｙから選択されるアミノ酸番号１６；
Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＳｅｒから選択されるアミノ酸番号１７；
Ｈｉｓ及びＬｅｕから選択されるアミノ酸番号１８；そして
Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１９；
Ｇｌｕであるアミノ酸番号３１；
Ｇｌｕ及びＧｌｎから選択されるアミノ酸番号３２；
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＩｌｅから選択されるアミノ酸番号３４；そして
Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、及びＡｌａから選択されるアミノ酸番号３９（配列番号２４）を含み、
ここで、アミノ酸の番号付けはウシ膵トリプシン・インヒビター（ＢＰＴＩ）のＫｕｎｉｔｚドメインのアミノ酸位置に対応する、態様９４に記載の方法。
［態様９７］
Ｋｕｎｉｔｚドメインが、以下の：
ＫＫＩＩ／３ ＃１（配列番号２４）
ＫＫＩＩ／３ ＃２（配列番号２５）
ＫＫＩＩ／３ ＃３（配列番号２６）
ＫＫＩＩ／３ ＃４（配列番号２７）
ＫＫＩＩ／３ ＃５（配列番号２８）
ＫＫＩＩ／３ ＃６（配列番号２９）
ＫＫＩＩ／３ ＃７（配列番号３０）
ＫＫＩＩ／３ ＃８（配列番号３１）
ＫＫＩＩ／３ ＃９（配列番号３２）及び
ＫＫＩＩ／３ ＃１０（配列番号３３）から成る群より選択される、態様９４に記載の方法。
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００２年８月２８日に出願した米国仮出願第６０／４０７，００４号の利益を主張する。
【０００２】
上記出願の全教示は本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００３】
臓器移植に関し、ドナー臓器の生存率の維持は重要な目的である。典型的には、移植される臓器は貯蔵され、将来のレシピエントへ輸送される必要がある。貯蔵及び輸送のあいだ臓器の細胞生存率を延長させるための能力は、移植手術を成功させる上で非常に重要である。保存液は臓器延命に重要な役割を果たす。臓器保存液としては、本明細書中にその内容全体が援用される、Ｂｅｒｄｙａｅｖら、米国特許第５，４３２，０５３号；Ｂｅｌｚｅｒら、米国特許第４，７９８，８２４号、第４，８７９，２８３号、及び第４，８７３，２３０号；Ｔａｙｌｏｒ、米国特許第５，４０５，７４２号；Ｄｏｈｉら、米国特許第５，５６５，３１７号；Ｓｔｅｒｎら、米国特許第５，３７０，９８９号及び第５，５５２，２６７号に記載されるものが挙げられる。しかしながら、臓器保存に関し、改善された方法及び溶液についての必要性が存在している。
【０００４】
プロテアーゼは広範な生物学的経路に関与する。特に、カリクレイン、プラスミン、エラスターゼ、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン・アクチベーター、トロンビン、ヒトリポタンパク質結合凝固インヒビター、並びに第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子及び第ＸＩＩａ因子などの凝固因子のようなセリンプロテアーゼは、例えば全身及び局所の虚血、腫瘍浸潤、フィブリン溶解、術中の失血、並びに炎症のような血流に影響する経路に関係がある。したがって、特定のセリンプロテアーゼのインヒビターは、さまざまな虚血性疾患に対する潜在的薬物標的として注目されている。
【０００５】
そのようなインヒビターの１つである、ウシ肺から得られたアプロチニン（ウシ膵トリプシン・インヒビター又はＢＰＴＩとも呼ばれる）は、術中の失血を軽減させる上での予防的使用のため、及び例えば冠動脈バイパス移植術処置の過程でＣＰＢを受ける患者の輸血の必要性のために米国で承認されている。アプロチニンはトラジロール（登録商標）の商品名で市販されており（バイエル社医薬部門、ウエストヘーブン、コネチカット）、膵炎の治療に用いるために以前に承認されている。アプロチニンの有効性は、血漿カリクレイン及びプラスミンを含む種々のセリンプロテアーゼを阻害する比較的非特異的な能力に関連している。これらのプロテアーゼは、接触活性化システム（ＣＡＳ）の多くの経路において重要である。
【０００６】
ＣＡＳは、全血が外来基質表面（例えばカオリン、ガラス、硫酸デキストラン、又は損傷を受けた骨表面）と接触したとき最初に活性化される。セリンプロテアーゼであるカリクレインは、好中球、プラスミン、凝固、及び種々のキニンの活性化をもたらすＣＡＳカスケードを開始する血漿酵素である。カリクレインは、接触活性化カスケードの初期においてタンパク質分解イベントにより活性化されるまで不活性分子として循環するチモーゲン（プレ−カリクレイン）として分泌される。
【０００７】
しかしながら、カリクレイン特異的インヒビターの臓器保存への使用は、成功裏に証明されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，４３２，０５３号
【特許文献２】米国特許第４，７９８，８２４号
【特許文献３】米国特許第４，８７９，２８３号
【特許文献４】米国特許第４，８７３，２３０号
【特許文献５】米国特許第５，４０５，７４２号
【特許文献６】米国特許第５，５６５，３１７号
【特許文献７】米国特許第５，３７０，９８９号
【特許文献８】米国特許第５，５５２，２６７号
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、保留臓器移植物の保存にうまく使用することができる、例えばカリクレインのようなセリンプロテアーゼを阻害するペプチドの発見に基づくものである。より詳細には、本発明は、臓器又は組織を保存するための方法におけるカリクレイン・インヒビターの使用方法、及びそのような使用のための組成物を提供する。また、本発明は、再灌流障害又は宿主から摘出されている臓器若しくは組織の損傷を軽減し、阻害し又は防止するための方法、及びそのような使用のための組成物に関するものである。好ましいカリクレインペプチドには、本明細書中にその内容全体が援用される、Ｍａｒｋｌａｎｄら、米国特許第６，３３３，４０２号及び第６，０５７，２８７号に記載されるものが挙げられる。
【００１０】
特に好ましい態様において、本発明は、アミノ酸配列：
Ｘａａ１ Ｘａａ２ Ｘａａ３ Ｘａａ４ Ｃｙｓ Ｘａａ６ Ｘａａ７ Ｘａａ８ Ｘａａ９ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１ Ｇｌｙ Ｘａａ１３ Ｃｙｓ Ｘａａ１５ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１ Ｘａａ２２ Ｘａａ２３ Ｘａａ２４ Ｘａａ２５ Ｘａａ２６ Ｘａａ２７ Ｘａａ２８ Ｘａａ２９ Ｃｙｓ Ｘａａ３１ Ｘａａ３２ Ｐｈｅ Ｘａａ３４ Ｘａａ３５ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｘａａ３９ Ｘａａ４０ Ｘａａ４１ Ｘａａ４２ Ｘａａ４３ Ｘａａ４４ Ｘａａ４５ Ｘａａ４６ Ｘａａ４７ Ｘａａ４８ Ｘａａ４９ Ｘａａ５０ Ｃｙｓ Ｘａａ５２ Ｘａａ５３ Ｘａａ５４ Ｃｙｓ Ｘａａ５６ Ｘａａ５７ Ｘａａ５８（配列番号１）を含み、
ここで、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５６、Ｘａａ５７又はＸａａ５８はそれぞれ個々に１つのアミノ酸であるか又は存在せず；Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、Ｘａａ２０、Ｘａａ２４、Ｘａａ２５、Ｘａａ２６、Ｘａａ２７、Ｘａａ２８、Ｘａａ２９、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４４、Ｘａａ４６、Ｘａａ４７、Ｘａａ４８、Ｘａａ４９、Ｘａａ５０、Ｘａａ５２、Ｘａａ５３及びＸａａ５４は如何なるアミノ酸でもよく；Ｘａａ１０は：Ａｓｐ及びＧｌｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１１は：Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１３は：Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１５は：Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１６は：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＡｓｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１７は：Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１８は：Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ１９は：Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２１は：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２２は：Ｔｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ２３は：Ｔｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３１は：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３２は：Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ及びＶａｌから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３４は：Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ及びＬｅｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３５は：Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ３９は：Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＡｓｐから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ４０は：Ｇｌｙ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ４３は：Ａｓｎ及びＧｌｙから成る群より選択されるアミノ酸であり；Ｘａａ４５は：Ｐｈｅ及びＴｙｒから成る群より選択されるアミノ酸であり、そして、ポリペプチドはカリクレインを阻害する、ポリペプチドを含む組成物、及びそのような組成物の使用方法にかかるものである。
【００１１】
特定の態様において、特定のアミノ酸位置は以下であり得る：Ｘａａ６はＡｌａであり得、Ｘａａ７はＰｈｅであり得、Ｘａａ８はＬｙｓであり得、Ｘａａ９はＡｌａであり得、Ｘａａ１０はＡｓｐであり得、Ｘａａ１１はＡｓｐであり得、Ｘａａ１３はＰｒｏであり得、Ｘａａ１５はＡｒｇであり得、Ｘａａ１６はＡｌａであり得、Ｘａａ１７はＡｌａであり得、Ｘａａ１８はＨｉｓであり得、Ｘａａ１９はＰｒｏであり得、Ｘａａ２０はＡｒｇであり得、Ｘａａ２４はＡｓｎであり得、Ｘａａ２５はＩｌｅであり得、Ｘａａ２６はＰｈｅであり得、Ｘａａ２７はＴｈｒであり得、Ｘａａ２８はＡｒｇであり得、Ｘａａ２９はＧｌｎであり得、Ｘａａ３１はＧｌｕであり得、Ｘａａ３２はＧｌｕであり得、Ｘａａ３４はＩｌｅであり得、Ｘａａ３５はＴｙｒであり得、Ｘａａ３９はＧｌｕであり得、Ｘａａ４１はＡｓｎであり得、Ｘａａ４２はＡｒｇであり得、Ｘａａ４４はＡｒｇであり得、Ｘａａ４６はＧｌｕであり得、Ｘａａ４７はＳｅｒであり得、Ｘａａ４８はＬｅｕであり得、Ｘａａ４９はＧｌｕであり得、及び／又はＸａａ５０はＧｌｕであり得る；これらの位置にあるこれら特定のアミノ酸は、個々に又は他に記載されている１以上の位置にある１以上のアミノ酸と組み合わせて起こり得る。
【００１２】
特定の態様において、本発明は、２以上の下記のアミノ酸位置が下記のように定義される、配列番号１に記載されるようなポリペプチドを含む組成物、及びそのような組成物の使用方法にかかるものである：Ｘａａ１０はＡｓｐであり得；Ｘａａ１１はＡｓｐであり得；Ｘａａ１３はＰｒｏであり得；Ｘａａ１５はＡｒｇであり得；Ｘａａ１６はＡｌａであり得；Ｘａａ１７はＡｌａであり得；Ｘａａ１８はＨｉｓであり得；Ｘａａ１９はＰｒｏであり得；Ｘａａ２１はＴｒｐであり得；Ｘａａ２２はＰｈｅであり得；Ｘａａ２３はＰｈｅであり得；Ｘａａ３１はＧｌｕであり得；Ｘａａ３２はＧｌｕであり得；Ｘａａ３４はＩｌｅであり得；Ｘａａ３５はＴｙｒであり得；Ｘａａ３９はＧｌｕであり得；Ｘａａ４０はＧｌｙであり得；Ｘａａ４３はＡｓｎであり得；及びＸａａ４５はＰｈｅであり得る。他の態様において、５以上の下記のアミノ酸位置が下記のように定義される：Ｘａａ１０はＡｓｐであり得；Ｘａａ１１はＡｓｐであり得；Ｘａａ１３はＰｒｏであり得；Ｘａａ１５はＡｒｇであり得；Ｘａａ１６はＡｌａであり得；Ｘａａ１７はＡｌａであり得；Ｘａａ１８はＨｉｓであり得；Ｘａａ１９はＰｒｏであり得；Ｘａａ２１はＴｒｐであり得；Ｘａａ２２はＰｈｅであり得；Ｘａａ２３はＰｈｅであり得；Ｘａａ３１はＧｌｕであり得；Ｘａａ３２はＧｌｕであり得；Ｘａａ３４はＩｌｅであり得；Ｘａａ３５はＴｙｒであり得；Ｘａａ３９はＧｌｕであり得；Ｘａａ４０はＧｌｙであり得；Ｘａａ４３はＡｓｎであり得；及びＸａａ４５はＰｈｅであり得る。他の態様において、１０以上のアミノ酸が下記のように定義される：Ｘａａ１０はＡｓｐであり得；Ｘａａ１１はＡｓｐであり得；Ｘａａ１３はＰｒｏであり得；Ｘａａ１５はＡｒｇであり得；Ｘａａ１６はＡｌａであり得；Ｘａａ１７はＡｌａであり得；Ｘａａ１８はＨｉｓであり得；Ｘａａ１９はＰｒｏであり得；Ｘａａ２１はＴｒｐであり得；Ｘａａ２２はＰｈｅであり得；Ｘａａ２３はＰｈｅであり得；Ｘａａ３１はＧｌｕであり得；Ｘａａ３２はＧｌｕであり得；Ｘａａ３４はＩｌｅであり得；Ｘａａ３５はＴｙｒであり得；Ｘａａ３９はＧｌｕであり得；Ｘａａ４０はＧｌｙであり得；Ｘａａ４３はＡｓｎであり得；そしてＸａａ４５はＰｈｅであり得る。更に他の態様において、１５以上のアミノ酸が下記のように定義される：Ｘａａ１０はＡｓｐであり得；Ｘａａ１１はＡｓｐであり得；Ｘａａ１３はＰｒｏであり得；Ｘａａ１５はＡｒｇであり得；Ｘａａ１６はＡｌａであり得；Ｘａａ１７はＡｌａであり得；Ｘａａ１８はＨｉｓであり得；Ｘａａ１９はＰｒｏであり得；Ｘａａ２１はＴｒｐであり得；Ｘａａ２２はＰｈｅであり得；Ｘａａ２３はＰｈｅであり得；Ｘａａ３１はＧｌｕであり得；Ｘａａ３２はＧｌｕであり得；Ｘａａ３４はＩｌｅであり得；Ｘａａ３５はＴｙｒであり得；Ｘａａ３９はＧｌｕであり得；Ｘａａ４０はＧｌｙであり得；Ｘａａ４３はＡｓｎであり得；そしてＸａａ４５はＰｈｅであり得る。
【００１３】
特定の態様において、本発明は、存在する場合は、Ｘａａ３はＳｅｒであり、Ｘａａ２はＨｉｓであり、Ｘａａ１はＭｅｔであり、Ｘａａ５６はＴｈｒであり、Ｘａａ５７はＡｒｇであり、及び／又はＸａａ５８はＡｓｐである、配列番号１により定義されるようなポリペプチドを含む組成物、及びそのような組成物の使用方法にかかるものである。
【００１４】
他の態様において、本発明は、アミノ酸配列：
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇ１ｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２）、を含むポリペプチドを含む組成物、及びそのような組成物の使用方法にかかるものである。
【００１５】
特定の態様において、本発明は、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含む５３〜６０アミノ酸のカリクレイン結合ポリペプチドを含む組成物にかかるものであり、ここで、Ｋｕｎｉｔｚドメインは、位置５及び５５；１４及び３８；並びに３０及び５１（ウシ膵トリプシン・インヒビター（ＢＰＴＩ）に対応するアミノ酸位置による）にシステイン間のジスルフィド結合の可能性を含み、更に：
Ｈｉｓ及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１３；
Ａｌａ及びＧｌｙから選択されるアミノ酸番号１６；
Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＳｅｒから選択されるアミノ酸番号１７；
Ｈｉｓ及びＬｅｕから選択されるアミノ酸番号１８；及び
Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１９（配列番号２３）を含む。
【００１６】
特定の態様において、本発明は、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含む５３〜６０アミノ酸のカリクレイン結合ポリペプチドを含む組成物にかかるものであり、ここで、Ｋｕｎｉｔｚドメインは、位置５及び５５；１４及び３８；並びに３０及び５１（ウシ膵トリプシン・インヒビター（ＢＰＴＩ）に対応するアミノ酸位置による）にシステイン間のジスルフィド結合の可能性を含み、更に：
Ｈｉｓ及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１３；
Ｌｙｓ及びＡｒｇから選択されるアミノ酸番号１５；
Ａｌａ及びＧｌｙから選択されるアミノ酸番号１６；
Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＳｅｒから選択されるアミノ酸番号１７；
Ｈｉｓ及びＬｅｕから選択されるアミノ酸番号１８；及び
Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１９；
Ｇｌｕであるアミノ酸番号３１；
Ｇｌｕ及びＧｌｎから選択されるアミノ酸番号３２；
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＩｌｅから選択されるアミノ酸番号３４；及び
Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、及びＡｌａから選択されるアミノ酸番号３９（配列番号２４）を含む。
【００１７】
特定の態様において、本発明は、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含む５３〜６０アミノ酸のカリクレイン結合ポリペプチドを含む組成物にかかるものであり、ここで、Ｋｕｎｉｔｚドメインは、位置５及び５５；１４及び３８；並びに３０及び５１（ウシ膵トリプシン・インヒビター（ＢＰＴＩ）に対応するアミノ酸位置による）のそれぞれにシステインを含み、更に：
Ｈｉｓ及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１３；
Ｌｙｓ及びＡｒｇから選択されるアミノ酸番号１５；
Ａｌａ及びＧｌｙから選択されるアミノ酸番号１６；
Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＳｅｒから選択されるアミノ酸番号１７；
Ｈｉｓ及びＬｅｕから選択されるアミノ酸番号１８；及び
Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１９；
Ｇｌｕであるアミノ酸番号３１；
Ｇｌｕ及びＧｌｎから選択されるアミノ酸番号３２；
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＩｌｅから選択されるアミノ酸番号３４；及び
Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、及びＡｌａから選択されるアミノ酸番号３９（配列番号２４）、を含む。
【００１８】
特定の態様において、表１に記載されるように、Ｋｕｎｉｔｚドメインは以下から成る群より選択される：
ＫＫＩＩ／３ ＃１（配列番号２４）
ＫＫＩＩ／３ ＃２（配列番号２５）
ＫＫＩＩ／３ ＃３（配列番号２６）
ＫＫＩＩ／３ ＃４（配列番号２７）
ＫＫＩＩ／３ ＃５（配列番号２８）
ＫＫＩＩ／３ ＃６（配列番号２９）
ＫＫＩＩ／３ ＃７（配列番号３０）
ＫＫＩＩ／３ ＃８（配列番号３１）
ＫＫＩＩ／３ ＃９（配列番号３２）及び
ＫＫＩＩ／３ ＃１０（配列番号３３）。
【００１９】
本明細書に記載の各組成物は、本発明の方法に用いることができる。更に、本明細書に記載の化合物は、本明細書に記載の適応又は方法のための医薬又は組成物の製造に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、冠動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）処置、特にＣＡＢＧ処置が心−肺バイパス（ＣＰＢ；バイパス装置）などの体外血液循環を包含する場合に関連するような、軟部組織及び骨組織の外傷を受けた患者に生じ得る接触活性化システム及び全身炎症反応（ＳＩＲ）に関与する主要な複数の経路及び関連イベントを単純化した図解である。矢印は、カスケードにおける１つの成分又はイベントから、他の成分又はイベントへの活性化を示す。両方向の矢印は、成分又はイベントの両方向への活性化作用を示す。破線矢印は、１つの成分又はイベントによる、他の成分又はイベントの活性化への起こり得る関与を示す。略語は以下の通りである：「ｔＰＡ」＝組織プラスミノーゲン・アクチベーター；「Ｃ５ａ」＝補体系のタンパク質成分；「ｆＸＩＩａ」＝活性カリクレインを形成するプレカリクレインのアクチベータータンパク質；「外因性」＝外因性凝固系；「内因性」＝内因性凝固系。
【図２】図２は、プラスミドｐＰＩＣ−Ｋ５０３中の本発明のカリクレイン・インヒビター（「ＫＩ」）ポリペプチドのＤＮＡ及び対応の推定アミノ酸の一部を示す。挿入ＤＮＡは、囲み領域でコードされるアミノ酸配列を有するＰＥＰ−１ ＫＩポリペプチドのアミノ末端に、インフレームで融合させたサッカロミセス・セレビジエのｍａｔαプレプロシグナルペプチド（下線）をコードする。囲み領域に示すＰＥＰ−１ ＫＩポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２であり、ＫＩポリペプチドの対応のヌクレオチドコード配列は配列番号３である。破線矢印は、配列決定用テンプレートの作製に用いられたＡＯＸ領域における２つのＰＣＲプライマー配列の位置及び方向を示す。図の全ヌクレオチド配列に対するＤＮＡ配列は、融合タンパク質の構造コード配列を含み、配列番号３５で表される。配列の２重下線部分は診断用プローブ配列を示す。ＢｓｔＢＩ及びＥｃｏＲＩは、配列中のそれぞれのパリンドローム性６量体制限酵素切断部位の位置を示す。アスタリスクは翻訳終止コドンである。
【図３】図３は、本発明の好ましい態様のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様について以下に説明する。
本発明は、例えば移植までのあいだ臓器及び組織を保存するための改善された方法及び対応する方法における使用を可能にする、血漿カリクレインを特異的に阻害するカリクレイン・インヒビター（ＫＩ）ポリペプチドの発見に基づくものである。また、本発明は、再灌流障害又は宿主から摘出されている臓器若しくは組織の損傷を軽減し、阻害し又は防止すること、及びそのための組成物に関する。
【００２２】
本発明に有用なポリペプチド
本発明に有用なＫＩポリペプチドはＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドを含む。１つの態様において、これらＫｕｎｉｔｚドメインは、ヒト・リポタンパク質結合凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）タンパク質のＫｕｎｉｔｚドメイン１のループ構造を含む変異体型である。ＬＡＣＩは、内部に３つの明確なペプチドループ構造を含有し、それらは系列的Ｋｕｎｉｔｚドメインである（Ｇｉｒａｒｄ，Ｔ．ら、１９８９．Ｎａｔｕｒｅ、３３８：５１８−５２０）。ＬＡＣＩの３つのＫｕｎｉｔｚドメインは、特に優れた親和性はないが、カリクレインに結合し且つ阻害する能力を付与する。本明細書に記載のＬＡＣＩのＫｕｎｉｔｚドメイン１の変異体は、スクリーニングされ、単離されており、向上した親和性及び特異性でカリクレインに結合する（例えば、本明細書中に援用される米国特許第５，７９５，８６５号及び第６，０５７，２８７号を参照されたい）。本発明に有用な好ましいポリペプチドの例は、配列番号２のアミノ酸３〜６０により定義されるアミノ酸配列を有する。
【００２３】
カリクレイン結合ポリペプチドを用いて、治療用又は診断用分子を例えば臓器組織、細胞、又は生物全体中におけるカリクレインへ標的化することができる。治療又は診断目的のこのような標的送達の方法は当業者に公知であろう。例えば、標的化カリクレイン結合ポリペプチドは、当業者により、カリクレインの作用で損傷を受けた臓器の同定に用いられるであろうし、又はカリクレインは、本発明のカリクレイン結合ポリペプチドを用いて、特定の治療剤の作用の標的にされ得る。
【００２４】
本発明に有用な全てのポリペプチドはカリクレインに結合する。好ましい態様において、ポリペプチドは、カリクレインの公知の結合アッセイ及び阻害アッセイを用いて測定されるようなカリクレイン・インヒビター（ＫＩ）である。本明細書に記載の変異体Ｋｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドのカリクレインに対する向上した親和性及び特異性は、ＣＰＢ及び特にＣＡＢＧ外科的処置での使用の根拠を提供し、そのような処置を受けている患者の術中の失血及び／又はＳＩＲを予防又は軽減させる。本発明に用いられるＫＩポリペプチドは、当初カリクレインへの結合能についてファージ・ディスプレイ・ライブラリーをスクリーニングして単離された変異体Ｋｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドのアミノ酸配列を有するか又は含むことができる。
【００２５】
本発明の方法及び組成物に有用なＫＩポリペプチドは、アミノ酸配列：
Ｘａａ１ Ｘａａ２ Ｘａａ３ Ｘａａ４ Ｃｙｓ Ｘａａ６ Ｘａａ７ Ｘａａ８ Ｘａａ９ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１ Ｇｌｙ Ｘａａ１３ Ｃｙｓ Ｘａａ１５ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１ Ｘａａ２２ Ｘａａ２３ Ｘａａ２４ Ｘａａ２５ Ｘａａ２６ Ｘａａ２７ Ｘａａ２８ Ｘａａ２９ Ｃｙｓ Ｘａａ３１ Ｘａａ３２ Ｐｈｅ Ｘａａ３４ Ｘａａ３５ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｘａａ３９ Ｘａａ４０ Ｘａａ４１ Ｘａａ４２ Ｘａａ４３ Ｘａａ４４ Ｘａａ４５ Ｘａａ４６ Ｘａａ４７ Ｘａａ４８ Ｘａａ４９ Ｘａａ５０ Ｃｙｓ Ｘａａ５２ Ｘａａ５３ Ｘａａ５４ Ｃｙｓ Ｘａａ５６ Ｘａａ５７ Ｘａａ５８（配列番号１）、
を含むＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドを含む。
【００２６】
「Ｘａａ」はペプチド鎖における位置を表し、多くのさまざまなアミノ酸のいずれでもよい。例えば、本明細書に記載のＫＩペプチドに関し、Ｘａａ１０はＡｓｐ又はＧｌｕであり得る；Ｘａａ１１はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ又はＴｈｒであり得る；Ｘａａ１３はＰｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ又はＧｌｎであり得る；Ｘａａ１５はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ又はＧｌｎであり得る；Ｘａａ１６はＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ又はＡｓｎであり得る；Ｘａａ１７はＡｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ又はＴｈｒであり得る；Ｘａａ１８はＨｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ又はＡｌａであり得る；Ｘａａ１９はＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ又はＩｌｅであり得る；Ｘａａ２１はＴｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ又はＩｌｅであり得る；Ｘａａ３１はＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ又はＴｈｒであり得る；Ｘａａ３２はＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ又はＶａｌであり得る；Ｘａａ３４はＩｌｅ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ又はＬｅｕであり得る；Ｘａａ３５はＴｙｒ、Ｔｒｐ又はＰｈｅであり得る；Ｘａａ３９はＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＡｓｐであり得る。アミノ酸Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、Ｘａａ２０、Ｘａａ２４、Ｘａａ２５、Ｘａａ２６、Ｘａａ２７、Ｘａａ２８、Ｘａａ２９、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４４、Ｘａａ４６、Ｘａａ４７、Ｘａａ４８、Ｘａａ４９、Ｘａａ５０、Ｘａａ５２、Ｘａａ５３及びＸａａ５４は如何なるアミノ酸でもよい。更に、配列番号１の最初の４アミノ酸及び最後の３アミノ酸はそれぞれ任意に存在してもしなくてもよく、存在する場合は如何なるアミノ酸でもよい。
【００２７】
配列番号１により定義されるペプチドは、カリクレインに結合し、且つ阻害するポリペプチドのセットを形成する。ＫＩの多様性は、ペプチド配列中の可変位置数の増加に応じて、又は可変位置において可能なアミノ酸数の増加に応じて増加する。例えば、本発明の好ましい態様において、本発明の方法及び組成物に有用なＫＩポリペプチドは、以下の可変位置を有する：Ｘａａ１１はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ又はＶａｌであり得る；Ｘａａ１３はＰｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ又はＡｓｎであり得る；Ｘａａ１５はＡｒｇ又はＬｙｓであり得る；Ｘａａ１６はＡｌａ又はＧｌｙであり得る；Ｘａａ１７はＡｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ又はＩｌｅであり得る；Ｘａａ１８はＨｉｓ、Ｌｅｕ又はＧｌｎであり得る；Ｘａａ１９はＰｒｏ、Ｇｌｎ又はＬｅｕであり得る；Ｘａａ２１はＴｒｐ又はＰｈｅであり得る；Ｘａａ３１はＧｌｕである；Ｘａａ３２はＧｌｕ又はＧｌｎであり得る；Ｘａａ３４はＩｌｅ、Ｔｈｒ又はＳｅｒであり得る；Ｘａａ３５はＴｙｒである；そしてＸａａ３９はＧｌｕ、Ｇｌｙ又はＡｌａであり得る。
【００２８】
請求している発明のより特定の態様は、以下の可変位置のアミノ酸で定義される：Ｘａａ１０はＡｓｐであり；Ｘａａ１１はＡｓｐであり；Ｘａａ１３はＰｒｏ又はＡｒｇであり得；Ｘａａ１５はＡｒｇであり；Ｘａａ１６はＡｌａ又はＧｌｙであり得；Ｘａａ１７はＡｌａであり；Ｘａａ１８はＨｉｓであり；Ｘａａ１９はＰｒｏであり；Ｘａａ２１はＴｒｐであり；Ｘａａ３１はＧｌｕであり；Ｘａａ３２はＧｌｕであり；Ｘａａ３４はＩｌｅ又はＳｅｒであり得；Ｘａａ３５はＴｙｒであり；そしてＸａａ３９はＧｌｙである。
【００２９】
また、本発明の範囲に包含されるのは、本明細書に記載のポリペプチドの部分を含むペプチドである。例えば、ポリペプチドは特定のカリクレイン・エピトープに対する結合ドメインを含むであろう。本明細書に記載のポリペプチドのそのような断片も包含されるであろう。
【００３０】
本明細書に記載の方法及び組成物に有用なＫＩポリペプチドはＫｕｎｉｔｚドメインを含む。配列番号１に包含される配列のサブセットが以下に記載される（示されていない場合、「Ｘａａ」は、配列番号１について認められるのと同一のアミノ酸セットを意味する）：
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１ Ｇｌｙ Ｘａａ１３ Ｃｙｓ Ｘａａ１５ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ａｒｇ Ｘａａ２１ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｘａａ３１ Ｘａａ３２ Ｐｈｅ Ｘａａ３４ Ｘａａ３５ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｘａａ３９ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号３６）。
【００３１】
本明細書に記載の本発明に有用なＫＩペプチドの具体的且つ特定の例は、以下の通りである：
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２のアミノ酸３〜６０）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号４）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号５）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号６）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号７）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号８）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号９）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１０）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１１）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１２）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１３）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１４）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１５）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１６）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１７）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１８）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号１９）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２０）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２１）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２２）。
図３にこれら配列のアミノ酸配列アラインメントを提供する。
【００３２】
本発明に有用な他のＫＩポリペプチドには以下が含まれる：
Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ（配列番号２３）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２４）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２５）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２６）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２７）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２８）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２９）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号３０）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号３１）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号３２）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号３３）、
Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号３４）。
【００３３】
これら配列を以下の表１にまとめる。
【００３４】
【表１】
【００３５】
本明細書に記載の方法及び組成物に有用なポリペプチドは、いずれの標準ポリペプチド合成プロトコール及び装置を用いて合成してもよい。例えば、本明細書に記載のＫＩポリペプチドの段階的合成は、アミノ（Ｎ）端保護基を開始（即ちカルボキシ端）アミノ酸から除去し、そこにポリペプチド配列中の次のアミノ酸のカルボキシ末端をカップリングさせることにより実施することができる。このアミノ酸もまた好適に保護される。カルボジイミド、対称性酸無水物、又はヒドロキシベンゾトリアゾールエステル若しくはペンタフルオロフェニルエステルなどの「活性エステル」基の形成のような反応基の形成により、次に来るアミノ酸のカルボキシル基を活性化させて、結合したアミノ酸のＮ端と反応させることができる。好ましい固相ペプチド合成法には、α−アミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルを用いるＢＯＣ法、及び９−フルオレニルメチルオキシカルボニルを用いてアミノ酸残基のα−アミノを保護するＦＭＯＣ法が含まれる。両方法とも当業者に周知である（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．及びＹｏｕｎｇ，Ｊ．、固相ペプチド合成（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ社、サンフランシスコ、１９８９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．、１９６３．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９−２１５４；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．及びＢｏｄａｎｓｚｋｙ，Ａ．、ペプチド合成の実践（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、１９８４）、これら文献の全教示は本明細書中に援用される）。所望により、更なるアミノ端アミノ酸及び／又はカルボキシ端アミノ酸をアミノ酸配列にデザインし、ポリペプチド合成中に付加することができる。
【００３６】
あるいは、本発明の組成物及び方法に有用なＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチド及びＫＩポリペプチドを、多くの細胞、及び細菌発現ベクター、酵母発現ベクター、バキュロウイルス発現ベクター、哺乳類ウイルス発現ベクター等を含むがこれらに限定されない対応する発現ベクターのいずれかを用いる組換え法により作製することができる。本発明の組成物及び方法に有用なＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチド及びＫＩポリペプチドは、本明細書に記載のＫｕｎｉｔｚドメイン又はＫＩポリペプチドのコード配列を含む核酸分子を用いて遺伝子組換えにより作製することもできる。ここで、核酸分子は、当該技術分野で利用可能な遺伝子導入法を用いて宿主動物ゲノムに統合され、そこから発現させることができる。Ｋｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチド又はＫｕｎｉｔｚドメインを含むＫＩポリペプチドのコード配列を発現ベクター中の他のコード配列に融合させて、宿主細胞で容易に発現する融合ポリペプチドを形成することが必須又は有益である場合もある。そのような融合ポリペプチドを発現する宿主細胞は融合ポリペプチドもプロセシングし、所望のアミノ酸配列のみを含有する本発明に有用なＫｕｎｉｔｚドメイン又はＫＩポリペプチドを産生することが好ましい。いずれかの他のアミノ酸が、発現したＫｕｎｉｔｚドメイン又はＫＩポリペプチドに付着したままである場合、このような付加的アミノ酸は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン又はＫＩポリペプチドのカリクレイン結合活性及び／又はカリクレイン阻害活性を減少させて本発明の方法又は組成物におけるポリペプチドの使用を排除すべきでないことは明らかである。
【００３７】
本明細書に記載の方法及び組成物に有用なＫＩポリペプチドを作製するのに好ましい組換え発現系は、ＫＩポリペプチド又はＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列が、同じリーディングフレームでサッカロミセス・セレビジエのｍａｔαプレプロリーダーペプチド配列をコードするヌクレオチド配列と連結されるのを可能にする酵母発現ベクターであり、これは作動可能な酵母プロモーターの制御下にある。次に、得られる組換え酵母発現プラスミドは、標準法により、適切な適合性酵母宿主細胞へ形質転換されることができ、この細胞は組換え酵母発現ベクターから組換えタンパク質を発現することが可能である。そのような組換え発現ベクターで形質転換された宿主酵母細胞は、融合タンパク質をプロセシングして、本発明の方法及び組成物に有用な活性ＫＩポリペプチドを提供することも可能であることが好ましい。そのようなＫｕｎｉｔｚドメインを含む組換えＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチド及びＫＩポリペプチドを作製するための好ましい酵母宿主はピキア・パストリスである。
【００３８】
上記のように、本明細書に記載の方法及び組成物に有用なＫＩポリペプチドは、本明細書に記載のＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドを含むことができる。ＫＩポリペプチドは、付加的なフランキング配列、好ましくは長さ１〜６アミノ酸を、このような付加的アミノ酸がカリクレイン結合親和性又はカリクレイン阻害活性を顕著に減少させて本明細書に記載の方法及び組成物における使用を排除することがないことを条件として、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端に有することができ場合もある。このような付加的アミノ酸を、ＫＩポリペプチドを特定の組換え宿主細胞中で発現させるために意図的に付加することができ、又は更なる機能を提供するため、例えば、ＫＩポリペプチドを他の分子へ連結させるために、若しくはポリペプチドの精製を容易にする親和性部分を提供するために付加することもできる。付加的アミノ酸は、Ｋｕｎｉｔｚドメインのジスルフィド結合を妨げるシステインを含まないことが好ましい。天然Ｋｕｎｉｔｚドメインの例は、ジスルフィド結合を生じ、例えばＢＰＴＩは、アミノ酸位置５及び５５；１４及び３８；並びに３０及び５１のシステイン残基間にジスルフィド結合を含有する。
本発明の方法及び組成物に有用な好ましいＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドの例は、配列番号２の残基３〜６０のアミノ酸配列を有する。酵母融合タンパク質発現系で（例えば統合発現プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２に基づいて）発現及びプロセシングさせる場合、このようなＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドは、付加的アミノ端Ｇｌｕ−Ａｌａジペプチドを、Ｓ．セレビジエのｍａｔαプレプロリーダーペプチド配列との融合から保つ。酵母宿主細胞から分泌される場合、リーダーペプチドの多くは融合タンパク質からプロセシングされて、配列番号２のアミノ酸配列（図２の囲み領域を参照されたい）を有する機能的ＫＩポリペプチド（「ＰＥＰ−１」又は「ＤＸ８８」ともいう）を生ずる。
【００３９】
本明細書に記載の方法及び組成物に有用な特に好ましいＫＩポリペプチドは、カリクレインに対し、現在失血を軽減させるためにＣＡＰＧ処置に使用することが認可されているアプロチニンよりも１０００倍高いオーダーで結合親和性を有する。本明細書に記載のこのようなＫＩポリペプチドの驚くほど高い結合親和性は、このようなＫＩポリペプチドが、他の分子標的（以下の表１を参照されたい）を除外して、カリクレインに対し高度に特異性を発揮することを示している。したがって、本発明のこのようなポリペプチドの使用は、可能な治療標的に関し多くの考察を軽減させる。例えばアプロチニンによって発揮されるより低度の特異性は、起こり得る多面的副作用をもたらし、治療メカニズムに関してあいまいである。
【００４０】
例えば配列番号１で定義されるポリペプチドは不変位置を含有し、例えば位置５、１４、３０、５１及び５５はＣｙｓのみであり得る。例えば位置６、７、８、９、２０、２４、２５、２６、２７、２８、２９、４１、４２、４４、４６、４７、４８、４９、５０、５２、５３及び５４のような他の位置は、如何なるアミノ酸でもよい（非天然アミノ酸を含む）。特に好ましい態様において、１以上のアミノ酸が天然配列に対応する（例えばＬＡＣＩ（配列番号３２〜３４））。好ましい態様において、少なくとも１つの可変位置が天然配列とは異なる。更に他の好ましい態様において、アミノ酸はそれぞれ個別に又は集団で保存的又は非保存的アミノ酸置換により置換されることができる。保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、類似化学構造を有する他のアミノ酸に置き換え、タンパク質機能に影響を与えない。非保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、非類似の化学構造を有する他のアミノ酸に置き換える。保存的アミノ酸置換の例には、例えば、Ａｓｎ→Ａｓｐ、Ａｒｇ→Ｌｙｓ及びＳｅｒ→Ｔｈｒが含まれる。好ましい態様において、これらアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０及び／又は２１は、個別に又は集団で、如何なる組合せでも、配列番号２の対応の位置に相当するよう選択されることができる。
【００４１】
他の位置、例えば位置１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、３１、３２、３４、３５、３９、４０、４３及び４５は、選択されるアミノ酸セットのいずれでもよい。したがって、配列番号１は可能な配列のセットを定義する。このセットの各メンバーは、例えば、位置５、１４、３０、５１及び５５にシステインを、そして位置１０、１１、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２２１、２２、２３、３１、３２、３４、３５、３９、４０、４３及び４５にアミノ酸の特定のセットのいずれか１つを含有する。好ましい態様において、これらアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８及び／又は１９は、個別に又は集団で、如何なる組合せでも、配列番号２の対応の位置に相当するよう選択されることができる。このペプチドは、配列番号２に対し、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％同一であることが好ましい。
【００４２】
方法及び組成物
本発明は、臓器又は組織を、本明細書に記載されるようなカリクレイン・インヒビターを含む保存溶液と接触させることを含む、臓器及び組織を保存するための方法にかかるものである。また、本発明は、臓器又は組織をカリクレイン・インヒビターと接触させることを含む、再灌流障害又は宿主から摘出されている臓器若しくは組織の損傷を軽減し、阻害し又は防止することに関するものである。本発明の保存液は、臓器又は組織をこの溶液に接触させる場合、臓器組織、又は臓器全体を保存し及び／又は保護するために用いることができる。本発明の特定の態様は、ヒト心臓、又はヒト心筋組織を保存するためのものである。本発明の他の態様は、ヒト肺又はヒト肺組織を保存するためのものである。本発明により保存され得る他の臓器、又はその一部には、腎臓、肝臓、内皮組織、腸管組織、血管組織（例えば大動脈移植片）、皮膚、及び膵臓が含まれる。本発明は、哺乳動物組織、臓器又はその一部を保存するためにこの溶液を使用することを意図するものである。更に、この溶液は、例えば、移植処置中に臓器又は組織を灌流することにより、臓器移植を容易にするために用いることができる。この溶液は、心臓手術中に心停止液として用いることもできる。臓器又はその一部は、常に、特に移植処置前、適切な溶液中に維持されることが好ましい。
【００４３】
本発明の溶液を用いて、貯蔵、移植又は他の外科手術のあいだ、臓器又は組織の生存率を維持することができる。本発明は、組織、臓器又はその一部を、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｔｒｏ生存率が延長するように本発明の溶液に接触させることを含む、組織又は臓器の貯蔵方法を含む。この溶液は、心臓又は肺の組織の生存率を２４時間以上まで維持することを可能にする。本発明の溶液の使用により、臓器生存率が改善される。
【００４４】
あるいは又は更に、いったんドナーから切除されたら、臓器又は生組織を、インヒビターを含有する保存溶液中に置くことができる。更に、カリクレイン・インヒビターを、移植直前に又は移植中に、移植レシピエントに投与することも好ましい。全ての場合において、インヒビターは、本明細書に記載の及び／又は当該技術分野に公知の方法及び製剤を用いて、組織への注射のように、危険を冒して組織に直接投与することもでき、又は経口投与又は非経口投与により全身に提供してもよい。
【００４５】
１つの態様において、市販の保存溶液を有利に用いることができる。このような溶液の例には、本明細書中に援用される米国特許第４，７９８，８２４号、第４，８７３，２３０号、第４，８７９，２８３号に記載の、ＶＩＡＳＰＡＮの商標で販売されるＢｅｌｚｅｒのＵＷ溶液が含まれる。
【００４６】
上記特許に記載の保存溶液及び灌流液組成物には、限定されるものではないが、以下が含まれる。
【００４７】
【表２】
【００４８】
この溶液を、ＮａＯＨを用いて室温でｐＨ７．４にする。最終濃度は、Ｎａ＝３０．±．５ｍＭ、Ｋ＋＝１２０±５ｍＭ、ｍＯｓｍ／リットル＝３２０±５である。バクトリウム＝トリメトプリム（１６ｍｇ／ｍＬ）及びスルファメトキサゾール（８０ｍｇ／ｍＬ）。ヒドロキシエチル・スターチは、約３〜約８％の範囲で存在し得る。
【００４９】
この溶液は、典型的には、膵臓を７２時間保存し、腎臓を４８時間保存し、そして肝臓を少なくとも２４時間保存する。本明細書中に援用される米国特許第５，１４５，７７１号は、「カロライナ液」として知られる臓器保存液について記載しおり、本発明にも有用である。上記特許に記載の洗浄溶液又は保存溶液組成物には、限定されるものではないが、成分がおよそ以下の表３に記載の濃度範囲で含まれる。
【００５０】
【表３】
【００５１】
１つの特定の態様は、以下の表４に記載の量の成分を用いて、以下に記載の指示に従い調製される。
【００５２】
【表４】
【００５３】
１つの態様において、この溶液は以下のように調製することができる：５００ｍＬ容量フラスコを用いて１０％（重量／容量）ヒドロキシエチル・スターチ溶液５００ｍＬを量り、１Ｌビーカーに注ぐ。再蒸留水４００ｍＬを加え、マグネチック・スターラー・バーを用いて激しく撹拌する。残りの成分を１つずつ加える。全成分を加えた後、１〜２ｍＬの５Ｎ ＮａＯＨでｐＨを６．５に調製する。この溶液は、少なくとも３０分間撹拌する必要がある。この溶液を１Ｌ容量フラスコに移し、最終容量を１Ｌにする。不溶粒子を除去するため、ろ過する。
【００５４】
更に他の態様を以下の表５に例示する。
【００５５】
【表５】
【００５６】
上記表５の組成物は、場合により、上記表３に特定される成分の１種、数種、又は全てを含んでいてもよい。組成物は、少なくとも１つの酸化防止剤を含むことが好ましい。したがって、組成物の１つの特定の態様を以下の表６に記載する。
【００５７】
【表６】
【００５８】
好ましい組成物は、１種以上の医薬的に許容可能なバッファー、担体、酸化防止剤、プロテアーゼ・インヒビター、又は他の抗虚血剤を更に含んでいてもよい。
本発明の方法に有用な組成物は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドまたは本明細書に記載のこのようなＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドを含むＫＩポリペプチドのいずれかを含む。特に好ましいのは、配列番号２のアミノ酸３〜６０の５８アミノ酸配列を有するＫｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドを含むＫＩポリペプチドである。本発明の方法及び組成物に有用な特に好ましいＫＩポリペプチドの例は、配列番号２の６０アミノ酸配列を有するＰＥＰ−１ ＫＩポリペプチドである。配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が配列番号３に提供される（例えば図２のヌクレオチド３０９〜４８８を参照されたい）。本発明は、公知の遺伝コードに基づいて、ヌクレオチド配列によってコードされるそれぞれのアミノ酸を１種以上の公知の縮重コドンで単に置き換えることにより、配列番号３のヌクレオチド配列の縮重型も提供することが理解される。配列番号３のヌクレオチド７〜１８０、及びその縮重型は、配列番号２のアミノ酸３〜６０の５８アミノ酸配列を有する非天然Ｋｕｎｉｔｚドメイン・ポリペプチドをコードする。
【００５９】
ＫＩポリペプチドの濃度の検討
本発明の方法におけるＫＩポリペプチドを用いた投薬に関し、いくつかの考慮すべき事項は、配列番号２（分子量７，０５４ダルトン）のアミノ酸配列を有する本発明の代表的ＰＥＰ−１ ＫＩポリペプチドの例により具体的に示すことができる。
【００６０】
以下の表７は、カリクレイン及び他の１１の公知の血漿プロテアーゼに対するＰＥＰ−１ ＫＩポリペプチドの親和性（Ｋｉ，ａｐｐ）の比較を提供する。
【００６１】
【表７】
【００６２】
ＰＥＰ−１ ＫＩポリペプチドが、ヒト血漿カリクレインに対し高度に特異的であることは明らかである。更に、ＰＥＰ−１のカリクレインに対する親和性（Ｋｉ，ａｐｐ）は、アプロチニンのカリクレインに対する親和性よりも１０００倍高い：カリクレインに対するＰＥＰ−１のＫｉ，ａｐｐは約４４ｐＭ（表１）であるが、アプロチニンのカリクレインに対するＫｉ，ａｐｐは３０，０００ｐＭである。したがって、ＰＥＰ−１の用量は、モル当たりの基準で、アプロチニンに対して用いられるよりもおよそ１０００倍低いであろう。しかしながら、いくつかの他の因子についての検討が、実施に役立つＰＥＰ−１の用量について、より正確な評価を与えるかもしれない。このような因子には、特定の患者からの臓器摘出により活性化されるカリクレインの量が含まれ、当業者に認識されるであろう。
以下の非限定的実施例を参照して本発明を更に説明する。本明細書中に引用する全ての特許、特許出願、及び他の全ての出版物及びウェブサイトの教示は、本明細書中にその全体が援用される。
【実施例】
【００６３】
実施例１：代表的ＫＩポリペプチド
本発明の組成物及び方法に有用なＫｌポリペプチド（ＰＥＰ−１）を、ファージ・ディスプレイ・ライブラリーの組換えファージに提示されたカリクレイン結合ポリペプチドとして同定した。ＰＥＰ−１は以下のアミノ酸配列を有する：Ｇｌｕ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ（配列番号２）。ＰＥＰ−１の分子量は７，０５４ダルトンである。
【００６４】
ＰＥＰ−１アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸３〜６０）をコードする組換えファージＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号３）を単離し、組換えファージＤＮＡから決定される標準的方法で配列決定した。ＰＥＰ−１は、酵母株ピキア・パストリスのＨｉｓ４−表現型宿主細胞中で、更なる特徴付けに有用な量で組換えタンパク質として産生した。
【００６５】
実施例２：ＫＩポリペプチドを発現させるための組換えプラスミドの構築
開始プラスミドｐＨＩＬ−Ｄ２はアンピシリン耐性であり、Ｐ．パストリスに由来する野生型アレルのＨｉｓ４を含有する。組換え発現プラスミドｐＰＩＣ−Ｋ５０３中にｍａｔαプレプロ−ＰＥＰ−１融合タンパク質のコード配列を含む最終ＤＮＡ配列を図２に示す。ｐＨＩＬ−Ｄ２のＤＮＡ配列を以下のように改変してｐＰＩＣ−Ｋ５０３を作製した。
【００６６】
１． ｐＨＩＬ−Ｄ２の３’ＡＯＸ１領域におけるＢｓｔＢＩ部位は、Ｈｉｓ４遺伝子の下流に位置するが、部分的制限消化、フィルイン、及びライゲーションにより除去し、配列をＴＴＣＧＡＡ（配列番号２３）からＴＴＣＧＣＧＡＡ（配列番号２４）へ改変した。この改変は、発現カセットのプラスミドへのクローニングを容易にし、管理するために行った。
【００６７】
２． Ｈｉｓ４の下流に位置するｂｌａ遺伝子を有するＡａｔＩＩ部位は、制限消化、フィルイン、及びライゲーションにより除去し、配列をＧＡＣＧＴＣ（配列番号２５）からＧＡＣＧＴＡＣＧＴＣ（配列番号２６）へ改変した。この改変は、ＡａｔＩＩ部位を有する発現カセットのプラスミドへのクローニングを容易にするために行った。オリジナルのカリクレイン結合ディスプレイ・ファージからのヌクレオチド配列に基づき、４５０塩基対（ｂｐ）から成る、ＰＥＰ−１をコードするＤＮＡを合成した。ｐＨＩＬ−Ｄ２プラスミド中の挿入物の最終ＤＮＡ配列は、５’ＡＯＸ１配列及び３’ＡＯＸ１配列（図２に示す部分）が側面にあり、ＰＥＰ−１ ＫＩポリペプチドの構造コード配列に融合したＳ．セレビジエのｍａｔαプレプロシグナルペプチドを含む融合タンパク質をコードする。酵母宿主細胞からのＰＥＰ−１の分泌を容易にするためにシグナルペプチドを付加した。挿入物を形成するためのオリゴヌクレオチドは、合成され、又は商業的に得た（Ｇｅｎｅｓｉｓ Ｌａｂｓ、ウッドランド、テキサス）。挿入物はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で作製した。次にｍａｔαプレプロ／ＰＥＰ−１融合タンパク質をコードする連結した合成ＤＮＡを、ライゲーションにより、改変ｐＨＩＬ−Ｄ２プラスミドのＢｓｔＢＩ部位とＥｃｏＲＩ部位のあいだに導入した。
【００６８】
連結産物を用いて大腸菌株ＸＬ１ Ｂｌｕｅを形質転換した。ＰＣＲアッセイを用い、所望のプラスミド構築物について大腸菌の形質転換体をスクリーニングした。細胞抽出物由来のＤＮＡを、５’ＡＯＸ１配列及び３’ＡＯＸ１配列（上記及び図２を参照されたい）を含有するプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。正確な塩基対数のＰＣＲ産物を配列決定した。更に、クローニング部位の両側およそ２０〜５０ｂｐについて配列決定し、推定配列を得た。ｐＨＩＬ−Ｄ２プラスミド中の挿入物の最終ＤＮＡ配列（プラスミドｐＰＩＣ−Ｋ５０３を産生するためのもの）を、５’及び３’ＡＯＸ１フランキング配列の一部、並びにＰＥＰ−１ ＫＩポリペプチドの構造コード配列に融合したＳ．セレビジエのｍａｔαプレプロシグナルペプチドを含む融合タンパク質の対応のアミノ酸配列とともに図２に示す。所望の発現プラスミド構築物による形質転換体であるプラスミドｐＰＩＣ−Ｋ５０３を、ＰＥＰ−１の日常的産生用酵母細胞株を調整するために選択した。
【００６９】
実施例３：組換え酵母細胞株からのＰＥＰ−１の製造
Ｈｉｓ４−表現型を有するＰ．パストリスＧＳ１１５のスフェロプラストを、ＳａｃＩ部位で直線化した後の発現プラスミドｐＰＩＣ−Ｋ５０３（上記）を用いて、このプラスミドＤＮＡを宿主５’ＡＯＸ１部位へ相同組換えすることにより、形質転換した。産生株の表現型はＨｉｓ４＋である。全プラスミドを酵母の５’ＡＯＸ１ゲノム配列へ挿入した。
【００７０】
形質転換からの単離物を、単一炭素源としてメタノールを用い、外来ヒスチジン非存在下での増殖によりスクリーニングした。形質転換体の９５％以上は、単一炭素源としてメタノールを用いて増殖する野生型の能力を保持しており、プラスミドがトランス置換ではなく相同組換えで宿主ゲノムに挿入されたことを示した。これらの形質転換体は増殖に外来ヒスチジンを必要とせず、プラスミドが宿主ゲノムに統合されたことを示した。選択したコロニーをクローニングした。小規模培養発現実験を行い、高レベルの活性ＰＥＰ−１を培地へ分泌するクローンを同定した。精製した培養上清溶液中のＰＥＰ−１分泌レベルを、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）でＰＥＰ−１レベルについて定量し、カリクレイン阻害を評価した。サンプリングされた培養物間で高レベルのＰＥＰ−１発現に基づき、ＰＥＰ−１産生について酵母クローンを選択した。
【００７１】
ＰＥＰ−１を産生するＰ．パストリスのマスター細胞バンク及び作業用細胞バンクを商業的に準備した（ＭＤＳ Ｐｈａｒｍａ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ボセル、ワシントン）。酵母におけるＰＥＰ−１の標準的産生は、以下の３工程を含む：（１）種培養の準備、（２）発酵、及び（３）培養物の回収。
【００７２】
種培養工程は、滅菌接種材料ブロス（酵母窒素塩基、リン酸カリウム、及びグリセロール、ｐＨ＝５）を含有する６つのフラスコ（それぞれ３００ｍＬ）に、ＰＥＰ−１産生Ｐ．パストリスの作業用細胞バンクのバイアル１本の内容物を植菌することから成る。フラスコに、オービタルシェーカー（３００ｒｐｍ）中、３０℃±２℃でおよそ１３時間植え付けた。
【００７３】
滅菌ブロスを充填した１００リットルの密封式ブラウン発酵槽中で発酵を行った。６つの種培養フラスコの内容物を発酵槽に移して各々の発酵を開始した。およそ２４時間後に発酵槽中のグリセロールが消耗し、追加のグリセロールを更におよそ８時間加えた。
【００７４】
次に、混合供給相を、これはおよそ８３時間続いたが、グリセロール及びメタノール原材料の添加により開始した。この時間の終了後、発酵を停止し、発酵槽の内容物を精製水で希釈した。ＰＥＰ−１の精製及び処理は以下の５工程から成る：（１）拡張ベッドクロマトグラフィ、（２）陽イオン交換クロマトグラフィ、（３）疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）、（４）限外ろ過及びダイアフィルトレーション、並びに（５）最終ろ過及び包装。
【００７５】
最初の精製工程は拡張ベッドクロマトグラフィから成る。希釈した発酵培養物を、ストリームラインＳＰ樹脂（アマシャム・ファルマシア ストリームライン２００ クロマトグラフィカラム、アマシャム・ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージー）を充填した平衡化カラムにかけた。次にカラムを上向きモードで洗浄し（５０ｍＭ酢酸、ｐＨ＝３．０〜３．５）、拡張ベッドからの酵母細胞を水で洗い流した。拡張ベッドが洗浄を促進するところまでトップアダプターを上げた。流れを止め、ベッドを静置させた。アダプターを、静置したベッドのわずかに上になるように下げた。流れを逆向きにした。溶出液を回収した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０を用いて、下向きモードで洗浄を継続した。溶出液を回収した。５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０を用いてＰＥＰ−１をカラムから溶出させた。溶出液を５０リットル容器に回収した。次に、溶出液を０．２２μフィルターに通して精製部位に位置する清潔な容器にろ過した。ＰＥＰ−１濃度を測定するために更にサンプルを回収した。次に、拡張ベッドカラムからろ過した溶出液を用いて陽イオン交換クロマトグラフィ工程を行った。１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、ｐＨ６．２でＰＥＰ−１をカラムから溶出させた。
【００７６】
付加的なタンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）でＰＥＰ−１調整品から除去した。ＨＩＣの前に、陽イオン交換カラムからの溶出液を硫酸アンモニウムで希釈した。溶出液をカラムにかけ、リン酸カリウム（１００ｍＭ）中の硫酸アンモニウム（０．５７２Ｍ）、ｐＨ７．０でＰＥＰ−１を溶出させた。溶出液をＡ２８０値に基づきフラクションに回収した。全画分を予め秤量した滅菌ＰＥＴＧボトルに回収した。
【００７７】
選択した画分を清潔な容器にプールした。このプールを限外ろ過で濃縮した。濃縮したＰＥＰ−１調整品を１０倍量のＰＢＳ、ｐＨ７．０で直ちにダイアフィルトレーションした。
【００７８】
バルクＰＥＰ−１の汚染微生物数を最小限にするため、最終ろ過工程は包装前に行った。バルク溶液を０．２２μフィルターでろ過し、予め秤量した滅菌ＰＥＴＧボトルに回収した。ロット放出試験のためにサンプルを取り出した。バルクの残りを滅菌ＰＥＴＧボトルに無菌的に分注し、−２０℃で保存した。
【００７９】
実施例４：カリクレイン阻害アッセイ
カイネティック試験を用いてＰＥＰ−１などのＫＩポリペプチドの阻害活性を測定した。このカイネティック・アッセイは、基質プロリルフェニルアラニルアルギニル アミノ メチル クマリンのカリクレインによる切断後に蛍光を測定する。既知量のカリクレインを、マイクロタイタープレート上の好適な反応バッファー中で、連続的に希釈したＫＩポリペプチド標準リファレンス又は連続的に希釈したＫＩポリペプチド試験サンプルとともにインキュベートした。各サンプルについて３回実行した。基質溶液を加え、励起波長３６０ｍｎ及び蛍光波長４６０ｎｍを用いて直ちにプレートを読んだ。標準リファレンス曲線及びサンプル曲線のそれぞれのうち少なくとも２つは、有効とみなされるＲ２値０．９５を有することが必要とされる。
【００８０】
実施例５：臓器保存
コンフルエントのＨＵＶＥＣをＰＢＳで洗浄し、４℃で２４〜４８時間、無血清培地（ＳＦＭ）中で更にインキュベートした。冷蔵保存後、細胞をＰＢＳで数回洗浄し、カリクレイン（０．１２５Ｕ）及びカリクレイン特異的基質Ｓ２３０２を細胞へ加えた。光学密度の変化を記録した。光学顕微鏡による細胞結合ＰＥＰ−１の評価のために、冷蔵保存後、ＨＵＶＥＣをＰＥＰ−１で処理し、ホルマリン固定し、ウサギ抗ＰＥＰ−１で処理し、ペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧで処理した。ＨＵＶＥＣのカリクレイン産生能についても３７℃に維持された細胞表面及び細胞上清で評価した。３７℃に維持されたＨＵＶＥＣ上清中のカリクレイン活性は３８０±１９Ａ．Ｕ．であり；同一細胞表面上では活性を測定できなかった。光学顕微鏡評価で、２４時間冷蔵処理されたＨＵＶＥＣ表面に対するＰＥＰ−１の有意な結合がみられた。ＰＥＰ−１存在下（５ｍｇ／ｍｌ）で細胞をインキュベートすることにより、最大結合を得た。細胞結合ＰＥＰ−１は、外来カリクレイン阻害能を保持していた。これらの結果は、ＰＥＰ−１がカリクレイン・インヒビター活性を維持しながら内皮細胞に結合することを示している。したがって、キニンが介在する血管表面上の損傷を検出し、調節するために用いることができる。
【００８１】
本発明を、好ましい態様を参照して具体的に示して説明するが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、形態的に及び細部に種々の改変がなされ得ることが当業者には理解されるであろう。
［態様１］
臓器又は組織を有効量のカリクレイン・インヒビターと接触させることを含む、臓器又は組織の保存方法。
［態様２］
ポリペプチドがＫｕｎｉｔｚドメインを含む、態様１に記載の方法。
［態様３］
カリクレイン・インヒビターが配列番号２を含むポリペプチドである、態様２に記載の方法。
［態様４］
カリクレイン・インヒビターが配列番号２のアミノ酸３〜６０を含むポリペプチドである、態様２に記載の方法。
［態様５］
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織又は皮膚である、態様１に記載の方法。
［態様６］
アミノ酸配列： Ｘａａ１ Ｘａａ２ Ｘａａ３ Ｘａａ４ Ｃｙｓ Ｘａａ６ Ｘａａ７ Ｘａａ８ Ｘａａ９ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１ Ｇｌｙ Ｘａａ１３ Ｃｙｓ Ｘａａ１５ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１ Ｘａａ２２ Ｘａａ２３ Ｘａａ２４ Ｘａａ２５ Ｘａａ２６ Ｘａａ２７ Ｘａａ２８ Ｘａａ２９ Ｃｙｓ Ｘａａ３１ Ｘａａ３２ Ｐｈｅ Ｘａａ３４ Ｘａａ３５ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｘａａ３９ Ｘａａ４０ Ｘａａ４１ Ｘａａ４２ Ｘａａ４３ Ｘａａ４４ Ｘａａ４５ Ｘａａ４６ Ｘａａ４７ Ｘａａ４８ Ｘａａ４９ Ｘａａ５０ Ｃｙｓ Ｘａａ５２ Ｘａａ５３ Ｘａａ５４ Ｃｙｓ Ｘａａ５６ Ｘａａ５７ Ｘａａ５８（配列番号１）を含むポリペプチドを含むカリクレイン・インヒビターの有効量と臓器又は組織とを接触させることを含む、臓器又は組織の保存方法であって、
Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５６、Ｘａａ５７又はＸａａ５８はそれぞれ個々に１つのアミノ酸であるか又は存在せず；
Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、Ｘａａ２０、Ｘａａ２４、Ｘａａ２５、Ｘａａ２６、Ｘａａ２７、Ｘａａ２８、Ｘａａ２９、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４４、Ｘａａ４６、Ｘａａ４７、Ｘａａ４８、Ｘａａ４９、Ｘａａ５０、Ｘａａ５２、Ｘａａ５３及びＸａａ５４は如何なるアミノ酸でもよく；
Ｘａａ１０は：Ａｓｐ及びＧｌｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１１は：Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１３は：Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１５は：Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１６は：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＡｓｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１７は：Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１８は：Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１９は：Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２１は：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２２は：Ｔｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２３は：Ｔｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３１は：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３２は：Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ及びＶａｌから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３４は：Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ及びＬｅｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３５は：Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３９は：Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＡｓｐから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４０は：Ｇｌｙ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４３は：Ａｓｎ及びＧｌｙから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４５は：Ｐｈｅ及びＴｙｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；そして
該ポリペプチドはカリクレインを阻害する、前記方法。
［態様７］
Ｘａａ６がＡｌａである、態様６に記載の方法。
［態様８］
Ｘａａ７がＰｈｅである、態様６に記載の方法。
［態様９］
Ｘａａ８がＬｙｓである、態様６に記載の方法。
［態様１０］
Ｘａａ９がＡｌａである、態様６に記載の方法。
［態様１１］
Ｘａａ１０がＡｓｐである、態様６に記載の方法。
［態様１２］
Ｘａａ１１がＡｓｐである、態様６に記載の方法。
［態様１３］
Ｘａａ１３がＰｒｏであり、Ｘａａ１５がＡｒｇであり、Ｘａａ１６がＡｌａであり、Ｘａａ１７がＡｌａであり、Ｘａａ１８がＨｉｓであり、そしてＸａａ１９がＰｒｏである、態様６に記載の方法。
［態様１４］
Ｘａａ２０がＡｒｇである、態様６に記載の方法。
［態様１５］
Ｘａａ２４がＡｓｎである、態様６に記載の方法。
［態様１６］
Ｘａａ２５がＩｌｅである、態様６に記載の方法。
［態様１７］
Ｘａａ２６がＰｈｅである、態様６に記載の方法。
［態様１８］
Ｘａａ２７がＴｈｒである、態様６に記載の方法。
［態様１９］
Ｘａａ２８がＡｒｇである、態様６に記載の方法。
［態様２０］
Ｘａａ２９がＧｌｎである、態様６に記載の方法。
［態様２１］
Ｘａａ３１がＧｌｕである、態様６に記載の方法。
［態様２２］
Ｘａａ３２がＧｌｕである、態様６に記載の方法。
［態様２３］
Ｘａａ３４がＩｌｅである、態様６に記載の方法。
［態様２４］
Ｘａａ３５がＴｙｒである、態様６に記載の方法。
［態様２５］
Ｘａａ３９がＧｌｕである、態様６に記載の方法。
［態様２６］
Ｘａａ４１がＡｓｎである、態様６に記載の方法。
［態様２７］
Ｘａａ４２がＡｒｇである、態様６に記載の方法。
［態様２８］
Ｘａａ４４がＡｒｇである、態様６に記載の方法。
［態様２９］
Ｘａａ４６がＧｌｕである、態様６に記載の方法。
［態様３０］
Ｘａａ４７がＳｅｒである、態様６に記載の方法。
［態様３１］
Ｘａａ４８がＬｅｕである、態様６に記載の方法。
［態様３２］
Ｘａａ４９がＧｌｕである、態様６に記載の方法。
［態様３３］
Ｘａａ５０がＧｌｕである、態様６に記載の方法。
［態様３４］
ポリペプチドが：Ｘａａ１０のＡｓｐ；Ｘａａ１１のＡｓｐ；Ｘａａ１３のＰｒｏ；Ｘａａ１５のＡｒｇ；Ｘａａ１６のＡｌａ；Ｘａａ１７のＡｌａ；Ｘａａ１８のＨｉｓ；Ｘａａ１９のＰｒｏ；Ｘａａ２１のＴｒｐ；Ｘａａ２２のＰｈｅ；Ｘａａ２３のＰｈｅ；Ｘａａ３１のＧｌｕ；Ｘａａ３２のＧｌｕ；Ｘａａ３４のＩｌｅ；Ｘａａ３５のＴｙｒ；Ｘａａ３９のＧｌｕ；Ｘａａ４０のＧｌｙ；Ｘａａ４３のＡｓｎ；及びＸａａ４５のＰｈｅから成る群より選択される２以上のアミノ酸を含む、態様６に記載の方法。
［態様３５］
ポリペプチドが：Ｘａａ１０のＡｓｐ；Ｘａａ１１のＡｓｐ；Ｘａａ１３のＰｒｏ；Ｘａａ１５のＡｒｇ；Ｘａａ１６のＡｌａ；Ｘａａ１７のＡｌａ；Ｘａａ１８のＨｉｓ；Ｘａａ１９のＰｒｏ；Ｘａａ２１のＴｒｐ；Ｘａａ２２のＰｈｅ；Ｘａａ２３のＰｈｅ；Ｘａａ３１のＧｌｕ；Ｘａａ３２のＧｌｕ；Ｘａａ３４のＩｌｅ；Ｘａａ３５のＴｙｒ；Ｘａａ３９のＧｌｕ；Ｘａａ４０のＧｌｙ；Ｘａａ４３のＡｓｎ；及びＸａａ４５のＰｈｅから成る群より選択される５以上のアミノ酸を含む、態様６に記載の方法。
［態様３６］
ポリペプチドが：Ｘａａ１０のＡｓｐ；Ｘａａ１１のＡｓｐ；Ｘａａ１３のＰｒｏ；Ｘａａ１５のＡｒｇ；Ｘａａ１６のＡｌａ；Ｘａａ１７のＡｌａ；Ｘａａ１８のＨｉｓ；Ｘａａ１９のＰｒｏ；Ｘａａ２１のＴｒｐ；Ｘａａ２２のＰｈｅ；Ｘａａ２３のＰｈｅ；Ｘａａ３１のＧｌｕ；Ｘａａ３２のＧｌｕ；Ｘａａ３４のＩｌｅ；Ｘａａ３５のＴｙｒ；Ｘａａ３９のＧｌｕ；Ｘａａ４０のＧｌｙ；Ｘａａ４３のＡｓｎ；及びＸａａ４５のＰｈｅから成る群より選択される１０以上のアミノ酸を含む、態様６に記載の方法。
［態様３７］
ポリペプチドが：Ｘａａ１０のＡｓｐ；Ｘａａ１１のＡｓｐ；Ｘａａ１３のＰｒｏ；Ｘａａ１５のＡｒｇ；Ｘａａ１６のＡｌａ；Ｘａａ１７のＡｌａ；Ｘａａ１８のＨｉｓ；Ｘａａ１９のＰｒｏ；Ｘａａ２１のＴｒｐ；Ｘａａ２２のＰｈｅ；Ｘａａ２３のＰｈｅ；Ｘａａ３１のＧｌｕ；Ｘａａ３２のＧｌｕ；Ｘａａ３４のＩｌｅ；Ｘａａ３５のＴｙｒ；Ｘａａ３９のＧｌｕ；Ｘａａ４０のＧｌｙ；Ｘａａ４３のＡｓｎ；及びＸａａ４５のＰｈｅから成る群より選択される１５以上のアミノ酸を含む、態様６に記載の方法。
［態様３８］
Ｘａａ３がＳｅｒである、態様６に記載の方法。
［態様３９］
Ｘａａ２がＨｉｓである、態様６に記載の方法。
［態様４０］
Ｘａａ１がＭｅｔである、態様６に記載の方法。
［態様４１］
Ｘａａ５６がＴｈｒである、態様６に記載の方法。
［態様４２］
Ｘａａ５７がＡｒｇである、態様６に記載の方法。
［態様４３］
Ｘａａ５８がＡｓｐである、態様６に記載の方法。
［態様４４］
カリクレイン・インヒビターが、配列番号２のアミノ酸３〜６０を含むポリペプチドである、態様６に記載の方法。
［態様４５］
カリクレイン・インヒビターが配列番号２を含むポリペプチドである、態様６に記載の方法。
［態様４６］
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織又は皮膚である、態様６に記載の方法。
［態様４７］
術中及び／又は被験者から臓器摘出後の臓器の再灌流障害を軽減する方法であって、臓器の貯蔵及び保存溶液中に臓器を置くことを含み、この溶液はカリクレイン・インヒビターを含む、前記方法。
［態様４８］
カリクレイン インヒビターが配列番号１を含むポリペプチドであり、ここで、
Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５６、Ｘａａ５７又はＸａａ５８はそれぞれ個々に１つのアミノ酸であるか又は存在せず;
Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、Ｘａａ２０、Ｘａａ２４、Ｘａａ２５、Ｘａａ２６、Ｘａａ２７、Ｘａａ２８、Ｘａａ２９、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４４、Ｘａａ４６、Ｘａａ４７、Ｘａａ４８、Ｘａａ４９、Ｘａａ５０、Ｘａａ５２、Ｘａａ５３及びＸａａ５４は如何なるアミノ酸でもよく；
Ｘａａ１０は：Ａｓｐ及びＧｌｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１１は：Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１３は：Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１５は：Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１６は：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＡｓｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１７は：Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１８は：Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１９は：Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２１は：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２２は：Ｔｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２３は：Ｔｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３１は：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３２は：Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ及びＶａｌから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３４は：Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ及びＬｅｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３５は：Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３９は：Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＡｓｐから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４０は：Ｇｌｙ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４３は：Ａｓｎ及びＧｌｙから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４５は：Ｐｈｅ及びＴｙｒから成る群より選択されるアミノ酸である、
態様４７に記載の方法。
［態様４９］
カリクレイン・インヒビターが配列番号２のアミノ酸３〜６０を含むポリペプチドである、態様４７に記載の方法。
［態様５０］
カリクレイン・インヒビターが配列番号２を含むポリペプチドである、態様４７に記載の方法。
［態様５１］
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織又は皮膚である、態様４７に記載の方法。
［態様５２］
アミノ酸配列：Ｘａａ１ Ｘａａ２ Ｘａａ３ Ｘａａ４ Ｃｙｓ Ｘａａ６ Ｘａａ７ Ｘａａ８ Ｘａａ９ Ｘａａ１０ Ｘａａ１１ Ｇｌｙ Ｘａａ１３ Ｃｙｓ Ｘａａ１５ Ｘａａ１６ Ｘａａ１７ Ｘａａ１８ Ｘａａ１９ Ｘａａ２０ Ｘａａ２１ Ｘａａ２２ Ｘａａ２３ Ｘａａ２４ Ｘａａ２５ Ｘａａ２６ Ｘａａ２７ Ｘａａ２８ Ｘａａ２９ Ｃｙｓ Ｘａａ３１ Ｘａａ３２ Ｐｈｅ Ｘａａ３４ Ｘａａ３５ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｘａａ３９ Ｘａａ４０ Ｘａａ４１ Ｘａａ４２ Ｘａａ４３ Ｘａａ４４ Ｘａａ４５ Ｘａａ４６ Ｘａａ４７ Ｘａａ４８ Ｘａａ４９ Ｘａａ５０ Ｃｙｓ Ｘａａ５２ Ｘａａ５３ Ｘａａ５４ Ｃｙｓ Ｘａａ５６ Ｘａａ５７ Ｘａａ５８（配列番号１）を含むポリペプチドを含有する生理的に許容可能なｅｘ ｖｉｖｏ臓器保存溶液含む、臓器の保存及び／又は貯蔵のための組成物であって、
Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ４、Ｘａａ５６、Ｘａａ５７又はＸａａ５８はそれぞれ個々に１つのアミノ酸であるか又は存在せず；
Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ９、Ｘａａ２０、Ｘａａ２４、Ｘａａ２５、Ｘａａ２６、Ｘａａ２７、Ｘａａ２８、Ｘａａ２９、Ｘａａ４１、Ｘａａ４２、Ｘａａ４４、Ｘａａ４６、Ｘａａ４７、Ｘａａ４８、Ｘａａ４９、Ｘａａ５０、Ｘａａ５２、Ｘａａ５３及びＸａａ５４は如何なるアミノ酸でもよく；
Ｘａａ１０は：Ａｓｐ及びＧｌｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１１は：Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｌａ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１３は：Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１５は：Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ及びＧｌｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１６は：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ及びＡｓｎから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１７は：Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１８は：Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ１９は：Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２１は：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ及びＩｌｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２２は：Ｔｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ２３は：Ｔｙｒ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３１は：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＴｈｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３２は：Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ及びＶａｌから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３４は：Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ及びＬｅｕから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３５は：Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及びＰｈｅから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ３９は：Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＡｓｐから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４０は：Ｇｌｙ及びＡｌａから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４３は：Ａｓｎ及びＧｌｙから成る群より選択されるアミノ酸であり；
Ｘａａ４５は：Ｐｈｅ及びＴｙｒから成る群より選択されるアミノ酸であり；そして
該ポリペプチドはカリクレインを阻害する、前記組成物。
［態様５３］
Ｘａａ６がＡｌａである、態様５２に記載の組成物。
［態様５４］
Ｘａａ７がＰｈｅである、態様５２に記載の組成物。
［態様５５］
Ｘａａ８がＬｙｓである、態様５２に記載の組成物。
［態様５６］
Ｘａａ９がＡｌａである、態様５２に記載の組成物。
［態様５７］
Ｘａａ１０がＡｓｐである、態様５２に記載の組成物。
［態様５８］
Ｘａａ１１がＡｓｐである、態様５２に記載の組成物。
［態様５９］
Ｘａａ１３がＰｒｏであり、Ｘａａ１５がＡｒｇであり、Ｘａａ１６がＡｌａであり、Ｘａａ１７がＡｌａであり、Ｘａａ１８がＨｉｓであり、そしてＸａａ１９がＰｒｏである、態様５２に記載の組成物。
［態様６０］
Ｘａａ２０がＡｒｇである、態様５２に記載の組成物。
［態様６１］
Ｘａａ２４がＡｓｎである、態様５２に記載の組成物。
［態様６２］
Ｘａａ２５がＩｌｅである、態様５２に記載の組成物。
［態様６３］
Ｘａａ２６がＰｈｅである、態様５２に記載の組成物。
［態様６４］
Ｘａａ２７がＴｈｒである、態様５２に記載の組成物。
［態様６５］
Ｘａａ２８がＡｒｇである、態様５２に記載の組成物。
［態様６６］
Ｘａａ２９がＧｌｎである、態様５２に記載の組成物。
［態様６７］
Ｘａａ３１がＧｌｕである、態様５２に記載の組成物。
［態様６８］
Ｘａａ３２がＧｌｕである、態様５２に記載の組成物。
［態様６９］
Ｘａａ３４がＩｌｅである、態様５２に記載の組成物。
［態様７０］
Ｘａａ３５がＴｙｒである、態様５２に記載の組成物。
［態様７１］
Ｘａａ３９がＧｌｕである、態様５２に記載の組成物。
［態様７２］
Ｘａａ４１がＡｓｎである、態様５２に記載の組成物。
［態様７３］
Ｘａａ４２がＡｒｇである、態様５２に記載の組成物。
［態様７４］
Ｘａａ４４がＡｒｇである、態様５２に記載の組成物。
［態様７５］
Ｘａａ４６がＧｌｕである、態様５２に記載の組成物。
［態様７６］
Ｘａａ４７がＳｅｒである、態様５２に記載の組成物。
［態様７７］
Ｘａａ４８がＬｅｕである、態様５２に記載の組成物。
［態様７８］
Ｘａａ４９がＧｌｕである、態様５２に記載の組成物。
［態様７９］
Ｘａａ５０がＧｌｕである、態様５２に記載の組成物。
［態様８０］
ポリペプチドが：Ｘａａ１０のＡｓｐ；Ｘａａ１１のＡｓｐ；Ｘａａ１３のＰｒｏ；Ｘａａ１５のＡｒｇ；Ｘａａ１６のＡｌａ；Ｘａａ１７のＡｌａ；Ｘａａ１８のＨｉｓ；Ｘａａ１９のＰｒｏ；Ｘａａ２１のＴｒｐ；Ｘａａ２２のＰｈｅ；Ｘａａ２３のＰｈｅ；Ｘａａ３１のＧｌｕ；Ｘａａ３２のＧｌｕ；Ｘａａ３４のＩｌｅ；Ｘａａ３５のＴｙｒ；Ｘａａ３９のＧｌｕ；Ｘａａ４０のＧｌｙ；Ｘａａ４３のＡｓｎ；及びＸａａ４５のＰｈｅから成る群より選択される２以上のアミノ酸を含む、態様５２に記載の組成物。
［態様８１］
ポリペプチドが：Ｘａａ１０のＡｓｐ；Ｘａａ１１のＡｓｐ；Ｘａａ１３のＰｒｏ；Ｘａａ１５のＡｒｇ；Ｘａａ１６のＡｌａ；Ｘａａ１７のＡｌａ；Ｘａａ１８のＨｉｓ；Ｘａａ１９のＰｒｏ；Ｘａａ２１のＴｒｐ；Ｘａａ２２のＰｈｅ；Ｘａａ２３のＰｈｅ；Ｘａａ３１のＧｌｕ；Ｘａａ３２のＧｌｕ；Ｘａａ３４のＩｌｅ；Ｘａａ３５のＴｙｒ；Ｘａａ３９のＧｌｕ；Ｘａａ４０のＧｌｙ；Ｘａａ４３のＡｓｎ；及びＸａａ４５のＰｈｅから成る群より選択される５以上のアミノ酸を含む、態様５２に記載の組成物。
［態様８２］
ポリペプチドが：Ｘａａ１０のＡｓｐ；Ｘａａ１１のＡｓｐ；Ｘａａ１３のＰｒｏ；Ｘａａ１５のＡｒｇ；Ｘａａ１６のＡｌａ；Ｘａａ１７のＡｌａ；Ｘａａ１８のＨｉｓ；Ｘａａ１９のＰｒｏ；Ｘａａ２１のＴｒｐ；Ｘａａ２２のＰｈｅ；Ｘａａ２３のＰｈｅ；Ｘａａ３１のＧｌｕ；Ｘａａ３２のＧｌｕ；Ｘａａ３４のＩｌｅ；Ｘａａ３５のＴｙｒ；Ｘａａ３９のＧｌｕ；Ｘａａ４０のＧｌｙ；Ｘａａ４３のＡｓｎ；及びＸａａ４５のＰｈｅから成る群より選択される１０以上のアミノ酸を含む、態様５２に記載の組成物。
［態様８３］
ポリペプチドが：Ｘａａ１０のＡｓｐ；Ｘａａ１１のＡｓｐ；Ｘａａ１３のＰｒｏ；Ｘａａ１５のＡｒｇ；Ｘａａ１６のＡｌａ；Ｘａａ１７のＡｌａ；Ｘａａ１８のＨｉｓ；Ｘａａ１９のＰｒｏ；Ｘａａ２１のＴｒｐ；Ｘａａ２２のＰｈｅ；Ｘａａ２３のＰｈｅ；Ｘａａ３１のＧｌｕ；Ｘａａ３２のＧｌｕ；Ｘａａ３４のＩｌｅ；Ｘａａ３５のＴｙｒ；Ｘａａ３９のＧｌｕ；Ｘａａ４０のＧｌｙ；Ｘａａ４３のＡｓｎ；及びＸａａ４５のＰｈｅから成る群より選択される１５以上のアミノ酸を含む、態様５２に記載の組成物。
［態様８４］
Ｘａａ３がＳｅｒである、態様５２に記載の組成物。
［態様８５］
Ｘａａ２がＨｉｓである、態様５２に記載の組成物。
［態様８６］
Ｘａａ１がＭｅｔである、態様５２に記載の組成物。
［態様８７］
Ｘａａ５６がＴｈｒである、態様５２に記載の組成物。
［態様８８］
Ｘａａ５７がＡｒｇである、態様５２に記載の組成物。
［態様８９］
Ｘａａ５８がＡｓｐである、態様５２に記載の組成物。
［態様９０］
ポリペプチドが配列番号２を含む、態様５２に記載の組成物。
［態様９１］
カリクレイン結合ポリペプチドを含有する生理的に許容可能なｅｘ ｖｉｖｏ臓器保存溶液に臓器又は組織を接触させることを含む、臓器又は組織を保存するための方法。
［態様９２］
カリクレイン結合ポリペプチドが配列番号２を含む、態様９１に記載の方法。
［態様９３］
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織又は皮膚である、態様９１に記載の方法。
［態様９４］
カリクレイン結合ポリペプチドがＫｕｎｉｔｚドメインを含む、態様９１に記載の方法。
［態様９５］
Ｋｕｎｉｔｚドメインが、５及び５５；１４及び３８；並びに３０及び５１のそれぞれの位置にシステインを含み、更に：
Ｈｉｓ及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１３；
Ａｌａ及びＧｌｙから選択されるアミノ酸番号１６；
Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＳｅｒから選択されるアミノ酸番号１７；
Ｈｉｓ及びＬｅｕから選択されるアミノ酸番号１８；そして
Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１９（配列番号２３）を含み、
ここで、アミノ酸の番号付けはウシ膵トリプシン・インヒビター（ＢＰＴＩ）のＫｕｎｉｔｚドメインのアミノ酸位置に対応する、態様９４に記載の方法。
［態様９６］
Ｋｕｎｉｔｚドメインが、５及び５５；１４及び３８；並びに３０及び５１のそれぞれの位置にシステインを含み、更に：
Ｈｉｓ及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１３；
Ｌｙｓ及びＡｒｇから選択されるアミノ酸番号１５；
Ａｌａ及びＧｌｙから選択されるアミノ酸番号１６；
Ａｌａ、Ａｓｎ、及びＳｅｒから選択されるアミノ酸番号１７；
Ｈｉｓ及びＬｅｕから選択されるアミノ酸番号１８；そして
Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、及びＰｒｏから選択されるアミノ酸番号１９；
Ｇｌｕであるアミノ酸番号３１；
Ｇｌｕ及びＧｌｎから選択されるアミノ酸番号３２；
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、及びＩｌｅから選択されるアミノ酸番号３４；そして
Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、及びＡｌａから選択されるアミノ酸番号３９（配列番号２４）を含み、
ここで、アミノ酸の番号付けはウシ膵トリプシン・インヒビター（ＢＰＴＩ）のＫｕｎｉｔｚドメインのアミノ酸位置に対応する、態様９４に記載の方法。
［態様９７］
Ｋｕｎｉｔｚドメインが、以下の：
ＫＫＩＩ／３ ＃１（配列番号２４）
ＫＫＩＩ／３ ＃２（配列番号２５）
ＫＫＩＩ／３ ＃３（配列番号２６）
ＫＫＩＩ／３ ＃４（配列番号２７）
ＫＫＩＩ／３ ＃５（配列番号２８）
ＫＫＩＩ／３ ＃６（配列番号２９）
ＫＫＩＩ／３ ＃７（配列番号３０）
ＫＫＩＩ／３ ＃８（配列番号３１）
ＫＫＩＩ／３ ＃９（配列番号３２）及び
ＫＫＩＩ／３ ＃１０（配列番号３３）から成る群より選択される、態様９４に記載の方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸３〜６０又は配列番号２から成るポリペプチドを含むカリクレイン・インヒビター及び臓器保存液を含む、臓器又は組織の保存に使用するための組成物。
【請求項２】
ポリペプチドがさらに、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端における付加的なフランキング配列であって、特定の宿主細胞中においてそのポリペプチドの発現を可能にするもの及び／又は精製を容易にする親和性部分であるものから成る、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織、及び皮膚から成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸３〜６０又は配列番号２から成るポリペプチドを含むカリクレイン・インヒビター及び臓器保存液を含む、術中及び／又は被験者から臓器摘出後の臓器の再灌流障害を軽減するための臓器の貯蔵及び保存溶液。
【請求項５】
ポリペプチドがさらに、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端における付加的なフランキング配列であって、特定の宿主細胞中においてそのポリペプチドの発現を可能にするもの及び／又は精製を容易にする親和性部分であるものから成る、請求項４に記載の溶液。
【請求項６】
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織、及び皮膚から成る群から選択される、請求項４に記載の溶液。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸３〜６０又は配列番号２から成るポリペプチドを含むカリクレイン・インヒビター及び臓器保存液を含む生理的に許容可能なｅｘ ｖｉｖｏ臓器又は組織保存溶液を含む、臓器の保存及び／又は貯蔵に使用するための組成物。
【請求項８】
ポリペプチドがさらに、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端における付加的なフランキング配列であって、特定の宿主細胞中においてそのポリペプチドの発現を可能にするもの及び／又は精製を容易にする親和性部分であるものから成る、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織、及び皮膚から成る群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸３〜６０又は配列番号２を含むポリペプチドを含むカリクレイン・インヒビター及び臓器保存液を含む、移植のあいだの臓器又は組織の保存のための組成物。
【請求項１１】
ポリペプチドがさらに、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端における付加的なフランキング配列であって、特定の宿主細胞中においてそのポリペプチドの発現を可能にするもの及び／又は精製を容易にする親和性部分であるものから成る、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織、及び皮膚から成る群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
配列番号２のアミノ酸３〜６０又は配列番号２を含むポリペプチド及び臓器保存液を含む、貯蔵のあいだの臓器又は組織の保存のための組成物。
【請求項１４】
ポリペプチドがさらに、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端における付加的なフランキング配列であって、特定の宿主細胞中においてそのポリペプチドの発現を可能にするもの及び／又は精製を容易にする親和性部分であるものから成る、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織、及び皮膚から成る群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸３〜６０又は配列番号２から成るポリペプチドを含むカリクレイン・インヒビター及び臓器保存液を含む、臓器又は組織の保存に使用するための組成物。
【請求項２】
ポリペプチドがさらに、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端における付加的なフランキング配列であって、特定の宿主細胞中においてそのポリペプチドの発現を可能にするもの及び／又は精製を容易にする親和性部分であるものから成る、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織、及び皮膚から成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸３〜６０又は配列番号２から成るポリペプチドを含むカリクレイン・インヒビター及び臓器保存液を含む、術中及び／又は被験者から臓器摘出後の臓器の再灌流障害を軽減するための臓器の貯蔵及び保存溶液。
【請求項５】
ポリペプチドがさらに、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端における付加的なフランキング配列であって、特定の宿主細胞中においてそのポリペプチドの発現を可能にするもの及び／又は精製を容易にする親和性部分であるものから成る、請求項４に記載の溶液。
【請求項６】
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織、及び皮膚から成る群から選択される、請求項４に記載の溶液。
【請求項７】
配列番号２のアミノ酸３〜６０又は配列番号２から成るポリペプチドを含むカリクレイン・インヒビター及び臓器保存液を含む生理的に許容可能なｅｘ ｖｉｖｏ臓器又は組織保存溶液を含む、臓器の保存及び／又は貯蔵に使用するための組成物。
【請求項８】
ポリペプチドがさらに、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端における付加的なフランキング配列であって、特定の宿主細胞中においてそのポリペプチドの発現を可能にするもの及び／又は精製を容易にする親和性部分であるものから成る、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織、及び皮膚から成る群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸３〜６０又は配列番号２を含むポリペプチドを含むカリクレイン・インヒビター及び臓器保存液を含む、移植のあいだの臓器又は組織の保存のための組成物。
【請求項１１】
ポリペプチドがさらに、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端における付加的なフランキング配列であって、特定の宿主細胞中においてそのポリペプチドの発現を可能にするもの及び／又は精製を容易にする親和性部分であるものから成る、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織、及び皮膚から成る群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
配列番号２のアミノ酸３〜６０又は配列番号２を含むポリペプチド及び臓器保存液を含む、貯蔵のあいだの臓器又は組織の保存のための組成物。
【請求項１４】
ポリペプチドがさらに、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端における付加的なフランキング配列であって、特定の宿主細胞中においてそのポリペプチドの発現を可能にするもの及び／又は精製を容易にする親和性部分であるものから成る、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
臓器又は組織が、心臓、肺、腎臓、膵臓、肝臓、小腸、内皮組織、血管組織、及び皮膚から成る群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−７８４１７（Ｐ２０１１−７８４１７Ａ）
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２４６４５２（Ｐ２０１０−２４６４５２）
【出願日】平成２２年１１月２日（２０１０．１１．２）
【分割の表示】特願２００４−５３２５７６（Ｐ２００４−５３２５７６）の分割
【原出願日】平成１５年６月６日（２００３．６．６）
【出願人】（５０２３５２５１９）ダイアックス、コープ (16)
【氏名又は名称原語表記】ＤＹＡＸ ＣＯＲＰ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年４月２１日（２０１１．４．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月２日（２０１０．１１．２）
【分割の表示】特願２００４−５３２５７６（Ｐ２００４−５３２５７６）の分割
【原出願日】平成１５年６月６日（２００３．６．６）
【出願人】（５０２３５２５１９）ダイアックス、コープ (16)
【氏名又は名称原語表記】ＤＹＡＸ ＣＯＲＰ．
【Ｆターム（参考）】
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