自己免疫および１型糖尿病のリスクの早期予測ツールとしての生体流動の代謝体プロファイリング
本発明は、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性を診断する方法を提供する。本方法は、診断される小児における少なくとも１つの血清代謝体の収集物を測定する工程と、血清代謝体の収集物と、健康児からなる対照グループにおける同種の血清代謝体の収集物とを比較する工程とを含む。診断される小児と対照グループとの間における収集物の差異は、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性を表すためのバイオマーカとして使用される。本発明はまた、小児の糖尿病の発症を予防する方法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性の早期診断方法に関するものである。さらに、本発明は、１型糖尿病の発症に対する感受性が強いと診断された小児の１型糖尿病予防方法に関するものである。
【発明の背景】
【０００２】
本文では、様々な出版物およびその他の資料を、本発明の背景を説明するために引用している。特に、実施に関する詳細を補足する事例は、参考文献として加えている。
【０００３】
１型糖尿病は、自己の免疫系が膵臓のランゲルハンス島のβ細胞を攻撃してしまう自己免疫疾患である。破壊や損傷を受けたβ細胞は、インスリン分泌量が減少したり、インスリンが分泌できなくなったりしてしまう。
【０００４】
過去１０年から５０年の間において、１型糖尿病は、小児の最も一般的な内分泌代謝疾患として、理由は解明されていないが多くの西欧諸国でその発生率が増加している。β細胞に特異的な自己抗体は、膵臓のランゲルハンス島におけるインスリン分泌β細胞の特定の機能障害および深刻な破壊と共に発生すると考えられている。また自己抗体の発生は、一般に１型糖尿病の発症より数ヶ月から数年前に起ると考えられている。自己免疫の未知の発生因子と不明なメカニズムによって、β細胞の機能不全が進行していて、これらは、病気自体のリスク、および各個人の遺伝的な感受性による発症までの期間の推定を妨げるだけでなく、効果的な予防法の発見も妨げている。
【発明の目的と概要】
【０００５】
本発明は、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性の早期診断方法を提供することを目的とする。
【０００６】
特に、本発明は、臨床的な発病の数ヶ月から数年前に、望ましくは小児の血清中に自己抗体が出現する前に、小児の１型糖尿病の発症リスクを診断する方法を提供することを目的とする。本発明の目的の１つは、新生児に対する将来の１型糖尿病の発症リスクを診断する方法を提供することである。
【０００７】
さらに、本発明の目的の１つは、１型糖尿病の発症に対する感受性が強いと診断された小児の１型糖尿病を予防する方法を提供することである。
【０００８】
既に確立されている方法の問題点を解決するために、１９９４年のフィンランドで、我々は１型糖尿病の予測と予防の研究（ＤＩＰＰ）として、広範囲な出生群の調査１を開始した。１型糖尿病のリスクおよびＨＬＡ対立遺伝子に関連した防御反応は、両親へのインフォームドコンセントの後に、まず新生児の臍帯血中から分析した。遺伝的リスクが増大している保因者の小児に対して、いつ糖尿病に関連する自己抗体が出現するのか、またはいつ臨床的な糖尿病が発症するのか見極めるため、頻繁に検査を行った。１１年半の調査期間の間、１０万人以上の新生児をスクリーニングした。そのうちの４５０人以上に、病気のリスクが明らかに増大していることを示す、多様な自己抗体が発生していた。現在までに、調査に残ったうちの１３８人に臨床的な糖尿病が発症した。そして、病気の原因と予測の研究のための独特なサンプル系列が得られた。
【０００９】
血清の代謝体のパターンは、少なくともいくつかの組織系の恒常性を反映している。特定の代謝体グループにおける変化は、環境や遺伝的な変更または介入２に対する組織系の反応である。メタボロミクスのプラットフォームは、高いサンプルスループット性能を有していて、応答時間に従ってすべての種類の生体物質に適用できる。また代謝表現型は、栄養状態や腸内の微生物叢３、４等のような環境的要因の影響を受けていて、例えば１型糖尿病のような複雑な病気に対する特有の関連性を有し、遺伝的要因と環境要因５の両方の影響を受けているものと考えられている。今日の、分析的で膨大な量のデータを扱い得る情報技術によって、メタボロミクスアプローチはますます有益なものとなっている。従ってメタボロミクスは、例えば、選別された生理学的な反応および病理学的な反応６、７の複雑な表現型およびバイオマーカの特性評価として、有力なツールを提供可能である。
【００１０】
このように、最も広い見地から見れば、本発明は、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性の早期診断方法に関するものであり、その方法は以下の工程を含む。すなわち、
ｉ）診断される小児における少なくとも１つの血清代謝体の収集物を測定し、
ｉｉ）血清代謝体の収集物と、健康児からなる対照グループにおける同種の血清代謝体の収集物とを比較し、
ｉｉｉ）診断される小児と対照グループとの間における収集物の差異を、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性を表すためのバイオマーカとして使用する。
【００１１】
他の側面から見れば、本発明は、小児の１型糖尿病の発症を予防する方法に関するものであり、本発明に従って、１型糖尿病の発症に対して感受性が強いと診断された小児に対する、糖尿病の発症を防ぐ１または複数の手段から構成されている方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１ａ】メタボロミクス用のＤＩＰＰ研究とサンプルの選定を示す図であり、ＤＩＰＰ研究を示す図である。
【図１ｂ】９歳で発症した小児の自己抗体プロフィールである。
【図１ｃ】調査したサンプルである。
【図１ｄ】分析結果と本文で扱う主な問題を示す図である。
【図２】オウル市のバッチの全サンプルの２次元的なサモンマッピングを示す図であり、合計５１８個のサンプルを含み、うち１８６種の同定された脂質が変数として含まれている。４つの異なる潜在的な交絡因子のマッピングであり、（ａ）各個人のＩＤ、（ｂ）性別、（ｃ）年齢、（ｄ）サンプルの年代、である。
【図３】ＤＩＰＰによるトゥルク市のバッチから選択したエーテル結合型ホスファチジルコリン類のプロフィール。（ａ）ＧＰＣｈｏ（３６：２ｅ）の長期にわたるプロフィール。（ｂ）ＧＰＣｈｏ（４０：４ｅ）の長期にわたるプロフィール。（ｃ）１歳児のＧＰＣｈｏ（３６：２ｅ）レベル（１歳に最も近い小児１人につき１サンプル）。（ｄ）３歳児のＧＰＣｈｏ（３６：２ｅ）レベル。（ｅ）６歳児のＧＰＣｈｏ（３６：２ｅ）レベル。
【図４】臍帯血の脂質プロフィール。（ａ）出生時における発症者と大多数の非発症者との間の脂質プロフィールの差異を明らかにしたスコアプロット。（ｂ）リン脂質に属する各対象物の特性の差異。（ｃ）発症者と未発症者とで共通なエーテル結合型ホスホコリンＧＰＣｈｏ（３６：２ｅ）。（ｄ）すべてのエステル結合型グリセロホスホコリンの分子種の合計として算出された総ホスホコリンレベル。
【図５】血清転換の前後６ヶ月の間隔における脂質プロフィール。（ａ）ＰＬＳ／ＤＡ分析により検出された脂質プロフィールの変化。（ｂ）発症者において血清転換に先がけて（すなわち、自己抗体の出現前に）上方制御され、炎症に関連することが知られているリゾホスファチジルコリン分子種ＬｙｓｏＧＰＣｈｏ（１８：０）。（ｃ）発症者において血清転換の後に上方制御されるエーテル結合型ホスホエタノールアミン分子種ＧＰＥｔｈ（３８：ｌｅ）。
【図６】１型糖尿病の病原に関する記載の要約である。
【図７】ＤＨＡＰからのコリンプラスマローゲンの合成経路である。
【図８】パネルＡは、１歳半および５歳の発症者における、各１人につき１サンプルのエーテルホスファチジルコリンレベルの変化（１歳半および５歳に近い年齢も含む）である。なお、正確な脂肪酸ポジション（すなわち、ｓｎ１対ｓｎ２）、および二重結合位置は未確認である。パネルＢは、発症者と非発症者のＧＰＣｈｏ（Ｏ−１８：ｌ／１６：０）収集物を示すボックスプロット（データの５０％を含んでいる）である。ボックスの上部の角（ヒンジ）はデータの７５パーセントを示していて、下部のヒンジは２５パーセントを示している。発症者および未発症者による２つの長期にわたるプロフィールの実例も示す（パネルＣ）。パネルＤは、血清転換の９ヶ月前および血清転換の直後における発症者と非発症者のリゾホスファチジルコリンレベルの変化を示す表（未発症者のタイムポイントは、発症者のタイムポイントとほぼ同一）である。
【図９】早期年齢における発症者と非発症者の間での、エーテルホスファチジルコリンＧＰＣｈｏ（Ｏ−１８／１８：２）の差異である。パネルＡは、生後３１５日から４０５日（１歳）の小児のレベル。パネルＢは、生後６３０日から８１０日（２歳）の小児のレベル。パネルＣは、生後１９８０日から２３４０日（６歳）の小児のレベル。なお、各年齢の１人につき１サンプルを採取し、表示された年齢に近い者も含んでいる。パネルＤは、バッチ１での被験者のＧＰＣｈｏ（Ｏ−ｌ８：０／１８：２）の長期にわたるプロフィールである。
【図１０】早期年齢における発症者と未発症者の間でのエタノールアミンプラスマローゲンＧＰＥｔｎ（Ｏ−１８：ｌ（ｌＺ）／２０：４）の差異である。プラスマローゲンレベルは、生後３１５日から４０５日（パネルＡ）と、生後１９８０日から２３４０日（パネルＢ）のものを表示している。
【発明の詳細な説明】
【００１３】
我々は、自己免疫の発生前の血清代謝体プロフィールにおける異常によって、１型糖尿病の発症に対する本質的な経路を明らかにできるという仮説を立てた。我々は１１年半の間、１０万人以上の新生児に対して遺伝的糖尿病のリスクをスクリーニングし、また遺伝的糖尿病のリスクを有する小児を、厳格な追跡調査のために登録して仮説を検証してきた。調査を続けている８５００人以上の小児のうち、４５０人以上に多様な自己抗体が出現し、そして１３８人が１型糖尿病を発症した。我々は、４７人の小児からなる出生群において、生まれてから糖尿病を発症するまでの間、３〜１２ヶ月おきに採取した１０３９個の血清サンプルによる代謝体プロフィールと、健康で自己抗体に対して陰性な６０人の小児のプロフィールとを比較した。そして我々は、臍帯血における代謝体パターンと、その後のサンプルから、発症者と自己抗体に対して陰性な小児との間における明確な差異を観測した。発症例と対照例の間においては、酸化ストレスとそれに関する炎症を防ぐ代謝体の差異が、自己抗体に陽性の小児における血清転換よりも明らかに早期に現れた。この発見は、メタボロミクスによって幼少期や幼年期に糖尿病のリスクを効果的にスクリーニングできることを意味している。また、酸化損傷と炎症の予防が不十分であることが、糖尿病の病原としての重大な役割を担っていることを示唆している。
【００１４】
（好適な実施例）
バイオマーカとして利用される血清代謝体は、酸化ストレスおよび／または炎症を予防するための代謝体としてよい。本実施例では、健康な小児の対照グループと比較して、診断される小児にて減少している収集物により、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性を表している。
【００１５】
「減少している収集物」との表現は、リスクグループの小児のバイオマーカレベルが、健康な対照グループにおける同一のバイオマーカレベルに対して８０％以下であるということを意味している。しかし、一般にリスクグループにおけるレベルは、最高でも対照グループの７５％、または６５〜５０％である。
【００１６】
好適な実施例の１つとして、バイオマーカは、リン脂質類の合計とするか、１または複数のエステル結合型ホスホコリンとするか、あるいはエステル結合型ホスホコリン類の合計としてよい。これらすべての場合において、バイオマーカは新生児の時点で、例えば臍帯血分析によって測定するとよい。特に好適な実施例では、小児は新生児であって、エステル結合型ホスホコリン類の合計のレベルが対照グループの平均レベルの約８０％以下であることを、１型糖尿病を発症させ得る小児の感受性を表す指標としてよい。
【００１７】
他の好適な実施例では、バイオマーカは１または複数のエーテル結合型ホスホコリン、例えばＧＰＣｈｏ（３６：２ｅ）、ＧＰＣｈｏ（３８：１ｅ）、ＧＰＣｈｏ（３８：５ｅ）、ＧＰＣｈｏ（４０：４ｅ）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１８：１／１６：０）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１８：１／１６：１）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１６：０／２０：４）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１８：１／２０：４）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１８：０／１８：２）などとしてよい（これらに限定するものではない）。エーテル結合型ホスホコリンによれば、新生児から６歳児までの年齢の範囲で測定が可能である（好ましくは１〜２歳）。
【００１８】
他の好適な実施例では、バイオマーカはＧＰＥｔｎ（Ｏ−１８：ｌ（ｌＺ）／２０：４）などのエタノールアミンプラスマローゲンとしてよい。このバイオマーカは新生児から６歳児までの年齢の範囲で測定が可能である。
【００１９】
またさらなる実施例では、バイオマーカは、酸またはそれらの誘導体である、ケトン、またはアルコールとしてよい。限定されない例として、バイオマーカは、トリプトファン、リビトール、ペンタン二酸、グリシン、エイコサン酸、１、２、３−プロパントリカルボン酸、ミリストレイン酸、マンニトール、クレアチニン、ブタン二酸、ヘプタン酸、２−ケトグルタル酸メトキシム等からなるグループとしてよい。これらの化合物のうち、トリプトファン、リビトール、ペンタン二酸、１、２、３−プロパントリカルボン酸、クレアチニンエノール、ブタン二酸、がより好ましいと考えられている。
【００２０】
血清代謝体の測定は、小児が所定の年齢になるまで追跡可能であり、その測定結果は、診断される小児と同年齢の対照グループと比較可能である。
【００２１】
また、所定の血清代謝体は診断される小児から測定でき、そのレベルは対照グループの代謝体のレベルと比較可能である。すべてのまたはいくつかの代謝体は、時間が経過しても監視できる。
【００２２】
前述した１または複数の血清代謝体の監視は、１型糖尿病の発症に対する遺伝的リスクの測定および／または小児における自己抗体の出現の監視と組み合わせることが可能である。
【００２３】
好ましくは、１型糖尿病の発症に対する遺伝的リスクおよび／または自己抗体の出現は、病気を発症する感受性を検出する代謝体マーカに従うとよい。
【００２４】
さらに好ましくは、減少したエーテル結合型ホスホコリンレベルと組み合わされた自己抗体マーカの出現を測定することにより、１型糖尿病の高いリスクを有する個人を識別するとよい。
【００２５】
リスクグループであると初期の段階で１度診断されたら、小児における１型糖尿病の発症は様々な方法で予防可能である。その予防方法は、例えば、栄養摂取による介入、抗酸化療法、または小児におけるコリンプラスマローゲンの生化学合成による刺激、またはこれらを組み合わせて行うことよい。
【００２６】
我々の成果に従った１型糖尿病の潜在的な予防手段は、安全であるとされている栄養摂取による介入としてよい。例えば：
‐母親へのコリンの補給。特に両親がリスク型遺伝子を保有している場合。
‐出生後の小児へのコリンの補給。特にホスホコリンレベルが低いと認められる場合。
‐小児へのコリンプラスマローゲンの補給。出生時にホスホコリンレベルが低いと認められる場合、または出生後にエーテル結合型ホスホコリンが低いと認められる場合。
【００２７】
潜在的な薬物療法として、抗酸化療法は１つの選択肢である。１つの案として、本実施例により下方制御が認められた内因性の抗酸化コリンプラスマローゲンの合成を刺激することが挙げられる。その経路は図７に示す。
【００２８】
以下本発明を、限定的でない実験的な例によって説明する。
【００２９】
（実験例）
我々は、調査した小児（発症者）における、出生から明確な糖尿病を発症するまでに採取したサンプル系列と、自己抗体または糖尿病の徴候を示さなかった小児（未発症者）から採取したサンプル系列とを、高いスループットのメタボロミクステクノロジーを適用して解析し、比較した。対照グループの年齢、性別、出生地は、遺伝的リスクグループに合わせた。血清脂質、水溶性成分、代謝体と結合した血清アルブミンのパターンは、臍帯血と、幼少期や幼年期の間に採取したサンプルとでは異なっていた。また、１型糖尿病の予測の基礎とされている自己抗体は、完全に変化していた。酸化ストレスや炎症を予防するための因子を伴う代謝体と外挿経路の識別は、病気の発症の抑制のために非常に重要であり、糖尿病の予防のための潜在的な目標物を備えている。
【００３０】
（被験者の選定）
ＤＩＰＰプロジェクトはフィンランドの３つの都市で実行し、これらの都市は合わせて年間１１，０００人の出生率を有し、これはフィンランドでの出生数のほぼ２０％に相当する。本プロジェクトは、１９９４年１１月にトゥルク市で開始した。オウル市は１年間調査に参加し、タンペレ市は３年後に参加した。ＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子*０２、*０３０１、*０３０２、*０６０２、および*０６０３は分けられ、ＤＱＢｌ*０２に陽性な男児は、さらにＤＱＡｌ対立遺伝子*０２０１および*０５に詳細に分類された。対立遺伝子に特有な溶液からＰＣＲ法により増幅された遺伝子配列は、ランタノイドキレートでラベルされたオリゴヌクレオチドプローブによりハイブリダイズされた。またそのハイブリダイゼーション産物は、時間分解蛍光測定（Ｖｉｃｔｏｒ、Ｗａｌｌａｃ社、トゥルク市）で検出された。２００６年６月６日までに、１０７，４８４人の新生児と、彼らの年上の兄弟がスクリーニングされ、遺伝的リスクを有する約８，０００人の小児に追跡調査が続けられた。
【００３１】
我々の試みには、多型性のインスリンプロモータ領域のスクリーニング解析を含めてあった。ＣＴＬＡ４およびＰＴＰＮ２２は、スクリーニング効果がわずかに良いものの、費用対効果が劣るために単純作業でのスクリーニングによる解析を強いられた。しかし我々は、選択した研究目的のためにその解析を続けた。
【００３２】
研究参加者のうち、１４４５人は少なくとも１度は、ランゲルハンス島の細胞、インスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素、またはＩＡ−２タンパク質に対する自己抗体に対して陽性であった。彼らのうち５１６人は、複数の型の自己抗体を有していて、糖尿病の発症の可能性が増大していた。最終的に、１３７人の小児が追跡調査中に１型糖尿病を発症した（図１ａ〜図１ｂ）。これら１３７人の小児の大多数に、最初の自己抗体としてＩＡＡが、単独で、またはＩＣＡとＧＡＤＡのどちらかと共に発生した（一般に、IＡ−２Ａ抗体は遅れて発生する）。生まれた歳に早くも糖尿病を発症する小児もいれば、明確な糖尿病を発症しないまま、酷似した自己抗体パターンを数年間も残存させていた小児もいた（例えば図１ｂ参照）。追跡調査の間、自己抗体の値は全体として顕著に変化したが、その値は、臨床的な糖尿病の発症の後にゆっくりと減少していった（図１ｂ参照）。
【００３３】
出生から発症（あるいはその後）までの間に３〜６ヶ月おきに収集した長期にわたる血清コレクションにより、病気の原因および潜在的な早期メカニズムに対する詳細な調査を行うことができた。自己抗体の出現と期間との関係は図１ｂに示す。
【００３４】
１型糖尿病を発症した被験者は、ＨＬＡ遺伝子型、性別、出生地と出生時期に応じて、ＤＩＰＰ試験から選び出された。選出された合計４１人の発症者と５４人の未発症者から、９５０サンプルを選出した（図１ｃ）。実験とデータ解析のために、サンプルは産まれた都市に基づいて２つのバッチにさらに分けた。すなわちトゥルク市（発症者１３人、非発症者２６人）、オウル市（発症者２８人、非発症者２８人）である。
【００３５】
遺伝的に定義されたＤＩＰＰ参加者のメタボロミクスの調査結果と、遺伝的に定義されていないグループの小児における生後７ヶ月から思春期までの間に予め収集しておいた利用可能なサンプル系列とを比較した。そして我々は、１型糖尿病を発症したすべての６歳児を、トゥルク出生群のリスク因子介入特別プロジェクト（ＳＴＲＩＰ）８から選び出した（合計８９サンプル）。彼らは、同じ調査における健康な対照グループと同じ性別の６歳児である。ＳＴＲＩＰ調査は、選抜した１０６２人の小児から構成され、そのうちの７００人以上に対して、１０歳半になるまで調査を継続した。糖尿病を発症したＨＬＡリスク対立遺伝子の保因者の小児は、臨床的に糖尿病を発症する前に、多様な自己抗体を有していた。
【００３６】
メタボロミクスデータの調査において、我々は１型糖尿病の記載の構成のうち、３つの観点による比較に特に注目した（図１ｄ）。すなわち、長期にわたるプロフィールの全体の差異、発症者と非発症者との年齢に基づく比較、自己抗体の出現に関連した代謝体プロフィールの変化である。
【００３７】
（リピドミク解析は主な交絡因子としての年齢を明らかにする）
我々は、ＵＰＬＣ−ＭＳプラットフォームを使って、選び出した１０３９個のサンプルすべてについてリピドミク解析を実行した。データ処理は、出力された膨大な数の未確認のピークについて行った。またデータ解析は、すべてのバッチにおいて識別された１８６種の脂質分子にわたって行った。データ構造の探査および脂質プロフィールに影響を与える主要な交絡因子の識別は、サモンの非線形マッピング９により実行した。サンプルのマップは、高次元（例えば１８６）のスペースから低次元のスペースにかけての非線形のもので、サンプル間の距離のプロフィール（例えばユークリッド距離）を維持させた。主成分解析１０などの一般的な線形法と比べて、サモン法は、高く相互依存した特性１１からの情報の抽出、および生データからプロフィールの類似点を直接的に視覚化する能力において優れている。
【００３８】
図２は、４つの潜在的な交絡因子として各個人のID、性別、年齢、サンプルの年代を表示する、オウル市のＤＩＰＰバッチのサモンマッピングの結果である。サンプルの年代と性別はいずれも、脂質プロフィールとの類似性に影響を与える主要なファクターではないことは明白であった。しかしながら、年齢のプロフィールの密集（図２ｃ）（すなわち、早期年齢の小児の脂質プロフィール）は、後の段階でのどのプロフィールよりも、互いに相似していた。これは、年齢によって異なるが低年齢であるほど均一になる規定食と、彼らの成長に起因する代謝の顕著な変化と、両方によって生じると考えられる。興味深いことに、各個人の間における差異も検出された（図２ｄ）。
【００３９】
（発症者と未発症者の間における、自己免疫の発生前の早期年齢での血清リピドームの差異）
早期年齢での病気の予測可能性を試験するために、特定の年齢層に部分最小二乗法による判別解析１２を用いた多変量解析を実行した。ＰＬＫ／ＤＡモデルは、３つのバッチの解析のために独自に開発した。
【００４０】
我々は、１歳の発症者と未発症者の間に既に明確な差異があることを見つけ、そしてそれらの差異は、３つのバッチすべてにわたる同一または関連した分子種に属するものであった。また我々は、ＶＩＰ解析に基づいて最も重要な脂質の分子種を選択するために、ＤＩＰＰのトゥルク市のバッチに適したモデルを開発して適用した。新しいＰＬＫ／ＤＡモデルは、選択した脂質分子種および適用する他の２つのバッチに基づいて開発した。そして我々は、このモデルが、糖尿病の徴候を正確に予測することを発見した。
【００４１】
我々の結果からは、事前の遺伝的スクリーニングと組み合わせることで、後に自己抗体および１型糖尿病を発症する小児を、事前に、より正確に定義できるというリピドミクスの方策が示された。
【００４２】
（発症例と対照例の間におけるプラスマローゲン分子種の一貫した差異）
血清脂質プロフィールにおいて発見された早期年齢での差異は、予測していたよりずっと早期に病気に関連した現象が起ることを示唆していた。各個人の脂質レベルの経時変化および観測した変化の一貫性を測定するため、我々は、識別した各脂質分子種の長期にわたるプロフィールを調査した。特に我々は、後に自己抗体と１型糖尿病を発症した小児は、早期年齢（すなわち、自己抗体の兆しが著しく発生する前（図３））において、多数のコリンプラスマローゲン分子種のレベルが低下していることを発見した。その差異は、後の年齢においても続いたが、病気自体の出現によるプラスマローゲンレベルへの影響は現れなかった（発症者の終点）。
【００４３】
エーテル結合型リン脂質類のサブクラスであるプラスマローゲン類は、従前から酸化損傷の予防に関係していることが知られている１３−１５。活性酸素種（ＲＯＳ）は、β細胞を破壊する重大な役割を果たすと提唱され、また、膵臓のランゲルハンス島をサイトカインにさらすと、ＲＯＳの生産が増加し、β細胞の酸化損傷を招くことが示されている１６。β細胞は特に、抗酸化酵素レベルが低いので酸化損傷を受け易い１７。
【００４４】
抗酸化療法は、糖尿病の予防が可能な方策を提供できるとされているが１８、これまでの結果からは不明瞭である１９。我々の結果によれば、１型糖尿病の病原において主要な役割を果たすのは酸化損傷を防ぐ能力であり、ＲＯＳの生成自体ではないことが示唆されている。
【００４５】
プラスマローゲン合成の最後の段階は、小胞体（ＥＲ）で行われていることが知られている２０。生体内の実験によって、ＥＲストレスが病気の原因について重大な役割を担っているということは、はっきりと証明された。
【００４６】
（臍帯血分析は、後に糖尿病を発症する小児のホスホコリンレベルの低下を明らかにする）
早期年齢での脂質表現型における差異は、後に糖尿病を発症する小児の代謝表現型が、出生の時点で既に異なっているという可能性を高めている。そのため、我々は３９人の小児の臍帯血を検査した（そのうちの１５人は、その後、１２歳になるまでに１型糖尿病を発症した）。しかし、トゥルク市で産まれた小児は、前述した調査結果とは異なっていた。
【００４７】
多変量解析は、サンプルのグループに影響している２つの主要な因子を識別した（図４）。トリアシルグリセロールレベルの増大は、発症者と非発症者の両方に影響した。しかしながら、２つのグループから大多数のサンプルを区別する他の主要な因子は、リン脂質レベルの変化であった（図４aと図４ｂ）。発症者の早期年齢において既に下方制御が認められているプラスマローゲン種ＧＰＣｈｏ（３６：２ｅ）は、グループ間における差異はほとんどなかった。しかしながら、エステル結合型ホスホコリンレベル（血清の中で最も豊富なリン脂質種）の合計は、発症者における出生時において既にかなり下方制御されていた（図４ｄ）。
【００４８】
（血清転換）
我々はまた、観察された脂質プロフィールの変化が自己免疫の出現と関連しているか否か検査した。そのために、我々は、血清転換の６ヶ月前の期間および血清転換の直後の脂質プロフィールを比較した。
【００４９】
発症者のコリンプラスマローゲンレベルは、既に図３で示したように、自己免疫の出現によっては変化しなかった。発症者における血清転換前の主要な因子は、上方制御されたリゾホスファチジルコリンであった（図５）。リゾホスファチジルコリン（ＬｙｓｏＰＣ）は炎症と関連していて２１、自己免疫に先がけた炎症を引き起こすといわれている。重要なことに、ＬｙｓｏＰＣはサイトカイン生産量を高めることが示されている２２。ＬｙｓｏＰＣに特有な上方制御は、短い期間に一時的にだけ表れる。
【００５０】
血清転換に続く変化は、主として、エタノールアミンプラスマローゲンレベルの増大である（図５）。これは、エーテル結合型リン脂質の増大が、酸化損傷の増大に対する正常な全身反応であることを示している。
【００５１】
要約すると、後に１型糖尿病を発症した小児の長期にわたる血清脂質プロフィールは、自己免疫と病気へつながる所定の現象を明らかにし（図６）、早期の病原において、リン脂質が重要な役割を担うことを提示した。
【００５２】
（早期年齢での１型糖尿病の予測可能性）
観察されたリピドームの変化は、血清転換に先がけた代謝プロファイリングを利用することで、病気の予測が可能であることを提示している。分類アルゴリズムは、６０％の発症者と非発症者からランダムに選出したサブセットから、拡張した脂質プロフィールに基づいて開発した。既知の長期にわたるプロフィールバリエーションおよび未知の混同ファクターへの依存に基づき、エーテルリン脂質類が潜在的バイオマーカであると考えられた。最良の病気の予測は、１歳半（範囲０．５−２．５年）において、ＧＰＣｈｏ（Ｏ−１８：ｌ／１６：０）から成る分子種（テーブル１）をバイオマーカにするという、早期年齢での観察である。発症者のための分類規則は、脂質収集物の濃度は４．０９μｍｏｌ／Ｌ未満という要件であった。
【００５３】
分類は、テスト結果が１型糖尿病と関連しないとする帰無仮説を試験することによって行った。バイアスを制御するために、テストセットとトレーニングセットは、ランダムに１０００回選択された。各選択において、脂質特有の分類閾はトレーニングセットで測定し、分類精度はテストセットで評価した。二項分布は、最も観測数の少ない真の陽性（ＴＰ）、または最も観測数の多い偽の陽性（ＦＰ）、ランダム分類（ＴＰ＝ＦＰ）に応じた確率により正確に計算したＰ−値を使用して計算した。要約した統計、中央値および各変数における８０％の信頼区間が報告された。
【００５４】
表１。シングルエーテルホスファチジルコリンＧＰＣｈｏ（Ｏ−１８：ｌ／１６：０）から成る分類。被験者が発症者であるか否かの分類は、エーテルホスファチジルコリン収集物が４．１μｍｏｌ／Ｌ未満であるか否かによって行った（９０％ＣＩ＝［４．０μｍｏｌ／Ｌ、４．７μｍｏｌ／Ｌ］）。自己抗体陽性サンプルは解析から除外した。ＴＰ、真の陽性の数；Ｐ、陽性の数（すなわち、発症者）；Ｐ（ＴＰ）、真の陽性の見込み数はＴＰより偶然に多く；ＦＰ、偽の陽性の数；Ｎ、陰性の数（すなわち、非発症者）；Ｐ（ＦＰ）、偽の陽性の見込み数はＦＰより偶然に少なかった。ランダムに選択された１０００のテストセットとトレーニングセットに基づく、ＴＰ、ＦＰ、およびオッズ比、による９０％の信頼区間は、括弧で示している。
【表１】
【００５５】
（方法）
血清収集物。静脈血液サンプルは１９９４年〜２００４年の間に小児から採取した。サンプルは、空腹時を除く様々な日時において採取した。血液サンプルは、針とBDVacutainer（登録商標）プラスチックチューブまたはVacutainerRプラス・プラスチックチューブを使用して、静脈回収によって採取した（BD VacutainerR SST?チューブは血清分離のためにスプレーコートシリコンとポリマーゲルを含んでいる）。チューブは、凝固させるために室温（ＲＴ）に３０〜６０分放置した。血清は、１３００ｒｃｆ、１０分、室温での遠心分離によって分離した。血清サンプルはスモールプラスチックチューブに−８０℃で保存した。
【００５６】
リピドミクス。等分（１０μｌ）した、１１の脂質クラスを含む内部標準混合物と、０．０５Ｍの塩化ナトリウム（１０μｌ）を血清サンプル（１０μｌ）に加え、脂質はクロロホルム/メタノール（２：１、１００μｌ）によって抽出した。ボルテックス（２分）の後に、直立させて放置し（１時間）、遠心分離（１００００ＲＰＭ、３分）を行い、下層は分離し、３つの標識した標準資質を含む標準混合物（１０μｌ）を抽出液に加えた。内部標準混合物は、エステル型脂肪酸としてヘプタン二酸（Ｃ１７：０）と、以下の脂質化合物（μｇ／ｍｌ）を含む。
【００５７】
Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン−１−ホスフェート（９．３μｇ／ｍｌ；Ｃｌ７ベース、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。
【００５８】
ｌ−ヘプタデカノイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（８．８μｇ／ｍｌ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。
【００５９】
１−モノヘプタデカノイン（ｒａｃ）（９．３μｇ／ｍｌ；Ｌａｒｏｄａｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【００６０】
１、２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（９．６μｇ／ｍｌ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。
【００６１】
Ｎ−ヘプタデカノイル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン（９．２μｇ／ｍｌ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。
【００６２】
１、２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（８．６μｇ／ｍｌ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。
【００６３】
１、２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（９．９μｇ／ｍｌ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。
【００６４】
１、２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（８．５μｇ／ｍｌ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。
【００６５】
１、２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（８．９μｇ／ｍｌ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。
【００６６】
１、２−ジヘプタデカノイン（ｒａｃ）（１０．２μｇ／ｍｌ；Ｌａｒｏｄａｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【００６７】
トリヘプタデカノイン（１０．４μｇ／ｍｌ；Ｌａｒｏｄａｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【００６８】
（標識した標準混合液の成分）
Ｌ−α−リゾホスファチジルコリン−パルミトイル−Ｄ３（９．３μｇ／ｍｌ；Ｌａｒｏｄａｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【００６９】
１、２−ジパルミトイル−Ｄ６−ｓｎ−グリセロホスファチジルコリン（１１．７μｇ／ｍｌ；Ｌａｒｏｄａｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【００７０】
トリパルミチン−１、１、１−１３Ｃ３（１０．０μｇ／ｍｌ；Ｌａｒｏｄａｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【００７１】
最初の２３２個のサンプル（バッチ１）の分析の際、標準混合物を構成する血清サンプル（１５μｌ）は、クロロホルム／メタノール（２：１、１００μｌ）による抽出の前に、トリヘプタデカノイン（０．８０４ｍｇ／ｍｌ；Ｌａｒｏｄａｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）および１、２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（０．３０４ｍｇ／ｍｌ；Ｌａｒｏｄａｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を加え、また1つの標準混合物（２５μｌ）のみを加えた。
【００７２】
脂質抽出物は、Ａｃｑｕｉｔｙ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬＣ?（ＵＰＬＣ）と組み合わせたＷａｔｅｒｓ Ｑ−ＴｏｆＰｒｅｍｉｅｒ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒにより分析した。カラムは、５０℃に保温した、１．７μｍの粒子のＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ?のＢＥＨ Ｃ１８ １０×５０ｍｍを使用した。２成分溶媒系には、Ａ．水（１％ １Ｍ ＮＨ４Ａｃ、０．１％ ＨＣＯＯＨ）、およびＢ．ＬＣ／ＭＳグレード（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）のアセトニトリル/イソプロパノール（５：２、１％ １Ｍ ＮＨ４Ａｃ、０．１％ ＨＣＯＯＨ）を用いた。グラジエントは、６５％Ａ／３５％Ｂから開始し、６分間でＢが１００％に達した後、７分その状態で放置した。５分の再平衡ステップを含み、全体のランタイムは１８分であった。流量は０．２００ｍｌ／分であり、注入量は０．７５μｌであった。サンプルオーガナイザーの温度は１０℃に設定した。脂質プロファイリングは、Ｗａｔｅｒｓ Ｑ−ＴｏｆＰｒｅｍｉｅｒ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒのＥＳＩ＋モードを使用して実行した。データは、ｍ／ｚ３００−１２００のマスレンジで、スキャン時間０．２ｓｅｃで収集した。最後のサンプルは、スキャン時間を０．０２ｓｅｃに変更した。ソース温度は１２０℃に設定し、脱溶媒ガス（８００Ｌ／ｈ）として、窒素を２５０℃で使用した。サンプリングコーンとキャピラリーの電圧は、それぞれ３９Ｖおよび３．２ｋＶであった。レセルピン（５０μｇ／Ｌ）はロック用リファレンススプレー（５μｌ／分；１０ｓｅｃ ｓｃａｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）として使用した。タンデム質量分析は選出した脂質分子種の識別のために使用した。ＭＳ／ＭＳは、ＥＳＩ＋モードで、１５から３０Ｖの衝突エネルギーランプ、およびｍ／ｚ１５０から開始するマスレンジを使用して実行した。他の条件は、上記で示す条件とした。
【００７３】
メタボロミクスデータの処理と解析。データは、ＭＺｍｉｎｅソフトウェアバージョン０．６０２３、２４を使用して処理をした。代謝体は、インターナルスペクトルライブラリを使用して識別した。
【００７４】
部分的最小二乗法による判別解析（ＰＬＳ／ＤＡ）１２、２５は、このモデルを計算するために、ＳＩＭＰＬＳアルゴリズムを用いた監督用モデリング方法として利用した２６。ベネチアンブラインドクロスのバリデーション方法２７およびＱ２スコアは、このモデルの進展のために使用した。薬剤に特有な効果と関連した潜在的な変数に対するトップローディングが報告された。ＶＩＰ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）値２８は、特定のグループのクラスタリングに対して、最も重要な分子種を識別するために算出した。多変量解析は、Ｍａｔｌａｂバージョン７．２（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｉｎｃ）およびＰＬＳツールボックスバージョン４．０Ｍａｔｌａｂパッケージ（Ｅｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ）を使用して実行した。
【００７５】
臍帯血の中で発見された他の血清代謝体（すなわち、非リン脂質）
方法：
血清サンプルは以下の通りに調製した：血清サンプルに、４００μｌメタノールと、１０μl ２５０ｐｐｍのｄ３−パルミチン酸（内部標準）を加えた。サンプルには、３０秒間のボルテックスを行った。３０分後、サンプルは３分、１００００ｒｐｍで遠心分離した。上精はＧＣバイアルに移し、乾燥状態になるように窒素の下で蒸発させた。サンプルは、２０μｌ ＭＯＸ（４５°Ｃ、６０分）および２０μｌ ＭＳＴＦＡ（４５°Ｃ、６０分）によってシリル化した。サンプルには５μｌの保持指標溶液（６００ｐｐｍのＣ１１、Ｃ１５、Ｃ１７、Ｃ２１、およびＣ２５アルカン）を加えた。
【００７６】
機器：
使用した機器は、Ｌｅｃｏ Ｐｅｇａｓｕｓ ４Ｄ ＧＣｘＧＣ−ＴＯＦ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅrとＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０Ｎ ＧＣおよびＣｏｍｂｉ ＰＡＬ ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒを使用した。機器パラメータは以下のようにした。
１：２０の血清サンプル２μｌを分割噴射。
最初のカラム：ＲＴＸ−５、１０ｍｘ１８０μｍｘ０．２０μm
２番目のカラム：ＢＰＸ−５０、１．１０ｍｘ１００μｍｘ０．１０μm
常圧３５．３３ｐｓｉｇのヘリウム
【００７７】
温度プログラム：
プライマリーオーブン：初温５０℃、１分．−＞２８０°Ｃ、７°Ｃ／分、５分。
セコンドリーオーブン：上記のプライマリーオーブン温度＋１０℃。
２次元分離時間４ｓ。
ＭＳ測定４０−７００ａｍｕ、１００ｓｐｅｃｔｒａ／ｓ。
【００７８】
方法の特徴：
ＧＣｘＧＣ−ＴＯＦの性能特性は３つの純粋な非抽出の基準化合物と共にテストした。すべての化合物は、１０および３００００ｎｇ／サンプルの間において、８つの収集物レベルに調製した。
【００７９】
L−トレオニン：
リニアレンジ：７．４−２２００ｎｇ
相関係数（リニアレンジにおける）：０．９９９７５
相対的な標準偏差（８個のサンプル、７４４０ｎｇ）：７．６０％
最も低い濃度の収集物７．４ｎｇのＳ／Ｎ：５６．６
【００８０】
ラウリン酸：
リニアレンジ：１０−３００００ｎｇ
相関係数：０．９９７３７
相対的な標準偏差（７個のサンプル、１０１００ｎｇ）：２．６１％
最も低い濃度の収集物１０．１ｎｇのＳ／Ｎ：１１５．３
【００８１】
コレステロール：
リニアレンジ：１０−３００００ｎｇ
相関係数：０．９９９９９
相対的な標準偏差（７個のサンプル、１００００ｎｇ）：２．８９％
最も低い濃度の収集物１０．０ｎｇのＳ／Ｎ：６２．７
【００８２】
データ処理：
ＣｈｒｏｍａＴｏｆソフトウェアはサンプルのデータ処理のために使用した。自作のソフトウェアは、直線とピークが交差し合うサンプルのために使用した。ピークは、合計３６サンプルのプロフィールから検出されたピークの数（最小の１２ピークに設定）に基づき、またデータベース（類似インデックス閾＝８００）への特性の一致に基づき取り出した。
【００８３】
結果：結果は、以下の表２に示す。Ｆｏｌｄ（中央値）は、１型糖尿病を発症した小児、および追跡調査中に自己抗体に対して陰性のままだった小児（未発症者）の各代謝体レベルの中央値の比率を示している。ｐ（ウィルコクソン）は、２つのグループを比較したウィルコクソン順位和検定に基づくｐ値である。Ｆｏｌｄ（平均）は、１型糖尿病が進行した小児、および追跡調査中に自己抗体に対して陰性のままだった小児（未発症者）の各代謝体レベルの平均値の比率を示している。ｐ（ｔ−検定）は、２つのグループを比較した両側ｔ検定に基づくｐ値である。
【表２】
【００８４】
本発明にかかる方法は、ここにはわずかな実施例しか開示していないが、様々な実施例の形式を組み合わせることが可能であることが理解される。本発明の思想を逸脱することのない他の実施例が存在することは、当業者にとって明らかである。したがって、本文に記載された実施例は説明に役立つものの、本発明を制限するものではない。
【参考文献】
【００８５】
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【発明の分野】
【０００１】
本発明は、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性の早期診断方法に関するものである。さらに、本発明は、１型糖尿病の発症に対する感受性が強いと診断された小児の１型糖尿病予防方法に関するものである。
【発明の背景】
【０００２】
本文では、様々な出版物およびその他の資料を、本発明の背景を説明するために引用している。特に、実施に関する詳細を補足する事例は、参考文献として加えている。
【０００３】
１型糖尿病は、自己の免疫系が膵臓のランゲルハンス島のβ細胞を攻撃してしまう自己免疫疾患である。破壊や損傷を受けたβ細胞は、インスリン分泌量が減少したり、インスリンが分泌できなくなったりしてしまう。
【０００４】
過去１０年から５０年の間において、１型糖尿病は、小児の最も一般的な内分泌代謝疾患として、理由は解明されていないが多くの西欧諸国でその発生率が増加している。β細胞に特異的な自己抗体は、膵臓のランゲルハンス島におけるインスリン分泌β細胞の特定の機能障害および深刻な破壊と共に発生すると考えられている。また自己抗体の発生は、一般に１型糖尿病の発症より数ヶ月から数年前に起ると考えられている。自己免疫の未知の発生因子と不明なメカニズムによって、β細胞の機能不全が進行していて、これらは、病気自体のリスク、および各個人の遺伝的な感受性による発症までの期間の推定を妨げるだけでなく、効果的な予防法の発見も妨げている。
【発明の目的と概要】
【０００５】
本発明は、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性の早期診断方法を提供することを目的とする。
【０００６】
特に、本発明は、臨床的な発病の数ヶ月から数年前に、望ましくは小児の血清中に自己抗体が出現する前に、小児の１型糖尿病の発症リスクを診断する方法を提供することを目的とする。本発明の目的の１つは、新生児に対する将来の１型糖尿病の発症リスクを診断する方法を提供することである。
【０００７】
さらに、本発明の目的の１つは、１型糖尿病の発症に対する感受性が強いと診断された小児の１型糖尿病を予防する方法を提供することである。
【０００８】
既に確立されている方法の問題点を解決するために、１９９４年のフィンランドで、我々は１型糖尿病の予測と予防の研究（ＤＩＰＰ）として、広範囲な出生群の調査１を開始した。１型糖尿病のリスクおよびＨＬＡ対立遺伝子に関連した防御反応は、両親へのインフォームドコンセントの後に、まず新生児の臍帯血中から分析した。遺伝的リスクが増大している保因者の小児に対して、いつ糖尿病に関連する自己抗体が出現するのか、またはいつ臨床的な糖尿病が発症するのか見極めるため、頻繁に検査を行った。１１年半の調査期間の間、１０万人以上の新生児をスクリーニングした。そのうちの４５０人以上に、病気のリスクが明らかに増大していることを示す、多様な自己抗体が発生していた。現在までに、調査に残ったうちの１３８人に臨床的な糖尿病が発症した。そして、病気の原因と予測の研究のための独特なサンプル系列が得られた。
【０００９】
血清の代謝体のパターンは、少なくともいくつかの組織系の恒常性を反映している。特定の代謝体グループにおける変化は、環境や遺伝的な変更または介入２に対する組織系の反応である。メタボロミクスのプラットフォームは、高いサンプルスループット性能を有していて、応答時間に従ってすべての種類の生体物質に適用できる。また代謝表現型は、栄養状態や腸内の微生物叢３、４等のような環境的要因の影響を受けていて、例えば１型糖尿病のような複雑な病気に対する特有の関連性を有し、遺伝的要因と環境要因５の両方の影響を受けているものと考えられている。今日の、分析的で膨大な量のデータを扱い得る情報技術によって、メタボロミクスアプローチはますます有益なものとなっている。従ってメタボロミクスは、例えば、選別された生理学的な反応および病理学的な反応６、７の複雑な表現型およびバイオマーカの特性評価として、有力なツールを提供可能である。
【００１０】
このように、最も広い見地から見れば、本発明は、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性の早期診断方法に関するものであり、その方法は以下の工程を含む。すなわち、
ｉ）診断される小児における少なくとも１つの血清代謝体の収集物を測定し、
ｉｉ）血清代謝体の収集物と、健康児からなる対照グループにおける同種の血清代謝体の収集物とを比較し、
ｉｉｉ）診断される小児と対照グループとの間における収集物の差異を、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性を表すためのバイオマーカとして使用する。
【００１１】
他の側面から見れば、本発明は、小児の１型糖尿病の発症を予防する方法に関するものであり、本発明に従って、１型糖尿病の発症に対して感受性が強いと診断された小児に対する、糖尿病の発症を防ぐ１または複数の手段から構成されている方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１ａ】メタボロミクス用のＤＩＰＰ研究とサンプルの選定を示す図であり、ＤＩＰＰ研究を示す図である。
【図１ｂ】９歳で発症した小児の自己抗体プロフィールである。
【図１ｃ】調査したサンプルである。
【図１ｄ】分析結果と本文で扱う主な問題を示す図である。
【図２】オウル市のバッチの全サンプルの２次元的なサモンマッピングを示す図であり、合計５１８個のサンプルを含み、うち１８６種の同定された脂質が変数として含まれている。４つの異なる潜在的な交絡因子のマッピングであり、（ａ）各個人のＩＤ、（ｂ）性別、（ｃ）年齢、（ｄ）サンプルの年代、である。
【図３】ＤＩＰＰによるトゥルク市のバッチから選択したエーテル結合型ホスファチジルコリン類のプロフィール。（ａ）ＧＰＣｈｏ（３６：２ｅ）の長期にわたるプロフィール。（ｂ）ＧＰＣｈｏ（４０：４ｅ）の長期にわたるプロフィール。（ｃ）１歳児のＧＰＣｈｏ（３６：２ｅ）レベル（１歳に最も近い小児１人につき１サンプル）。（ｄ）３歳児のＧＰＣｈｏ（３６：２ｅ）レベル。（ｅ）６歳児のＧＰＣｈｏ（３６：２ｅ）レベル。
【図４】臍帯血の脂質プロフィール。（ａ）出生時における発症者と大多数の非発症者との間の脂質プロフィールの差異を明らかにしたスコアプロット。（ｂ）リン脂質に属する各対象物の特性の差異。（ｃ）発症者と未発症者とで共通なエーテル結合型ホスホコリンＧＰＣｈｏ（３６：２ｅ）。（ｄ）すべてのエステル結合型グリセロホスホコリンの分子種の合計として算出された総ホスホコリンレベル。
【図５】血清転換の前後６ヶ月の間隔における脂質プロフィール。（ａ）ＰＬＳ／ＤＡ分析により検出された脂質プロフィールの変化。（ｂ）発症者において血清転換に先がけて（すなわち、自己抗体の出現前に）上方制御され、炎症に関連することが知られているリゾホスファチジルコリン分子種ＬｙｓｏＧＰＣｈｏ（１８：０）。（ｃ）発症者において血清転換の後に上方制御されるエーテル結合型ホスホエタノールアミン分子種ＧＰＥｔｈ（３８：ｌｅ）。
【図６】１型糖尿病の病原に関する記載の要約である。
【図７】ＤＨＡＰからのコリンプラスマローゲンの合成経路である。
【図８】パネルＡは、１歳半および５歳の発症者における、各１人につき１サンプルのエーテルホスファチジルコリンレベルの変化（１歳半および５歳に近い年齢も含む）である。なお、正確な脂肪酸ポジション（すなわち、ｓｎ１対ｓｎ２）、および二重結合位置は未確認である。パネルＢは、発症者と非発症者のＧＰＣｈｏ（Ｏ−１８：ｌ／１６：０）収集物を示すボックスプロット（データの５０％を含んでいる）である。ボックスの上部の角（ヒンジ）はデータの７５パーセントを示していて、下部のヒンジは２５パーセントを示している。発症者および未発症者による２つの長期にわたるプロフィールの実例も示す（パネルＣ）。パネルＤは、血清転換の９ヶ月前および血清転換の直後における発症者と非発症者のリゾホスファチジルコリンレベルの変化を示す表（未発症者のタイムポイントは、発症者のタイムポイントとほぼ同一）である。
【図９】早期年齢における発症者と非発症者の間での、エーテルホスファチジルコリンＧＰＣｈｏ（Ｏ−１８／１８：２）の差異である。パネルＡは、生後３１５日から４０５日（１歳）の小児のレベル。パネルＢは、生後６３０日から８１０日（２歳）の小児のレベル。パネルＣは、生後１９８０日から２３４０日（６歳）の小児のレベル。なお、各年齢の１人につき１サンプルを採取し、表示された年齢に近い者も含んでいる。パネルＤは、バッチ１での被験者のＧＰＣｈｏ（Ｏ−ｌ８：０／１８：２）の長期にわたるプロフィールである。
【図１０】早期年齢における発症者と未発症者の間でのエタノールアミンプラスマローゲンＧＰＥｔｎ（Ｏ−１８：ｌ（ｌＺ）／２０：４）の差異である。プラスマローゲンレベルは、生後３１５日から４０５日（パネルＡ）と、生後１９８０日から２３４０日（パネルＢ）のものを表示している。
【発明の詳細な説明】
【００１３】
我々は、自己免疫の発生前の血清代謝体プロフィールにおける異常によって、１型糖尿病の発症に対する本質的な経路を明らかにできるという仮説を立てた。我々は１１年半の間、１０万人以上の新生児に対して遺伝的糖尿病のリスクをスクリーニングし、また遺伝的糖尿病のリスクを有する小児を、厳格な追跡調査のために登録して仮説を検証してきた。調査を続けている８５００人以上の小児のうち、４５０人以上に多様な自己抗体が出現し、そして１３８人が１型糖尿病を発症した。我々は、４７人の小児からなる出生群において、生まれてから糖尿病を発症するまでの間、３〜１２ヶ月おきに採取した１０３９個の血清サンプルによる代謝体プロフィールと、健康で自己抗体に対して陰性な６０人の小児のプロフィールとを比較した。そして我々は、臍帯血における代謝体パターンと、その後のサンプルから、発症者と自己抗体に対して陰性な小児との間における明確な差異を観測した。発症例と対照例の間においては、酸化ストレスとそれに関する炎症を防ぐ代謝体の差異が、自己抗体に陽性の小児における血清転換よりも明らかに早期に現れた。この発見は、メタボロミクスによって幼少期や幼年期に糖尿病のリスクを効果的にスクリーニングできることを意味している。また、酸化損傷と炎症の予防が不十分であることが、糖尿病の病原としての重大な役割を担っていることを示唆している。
【００１４】
（好適な実施例）
バイオマーカとして利用される血清代謝体は、酸化ストレスおよび／または炎症を予防するための代謝体としてよい。本実施例では、健康な小児の対照グループと比較して、診断される小児にて減少している収集物により、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性を表している。
【００１５】
「減少している収集物」との表現は、リスクグループの小児のバイオマーカレベルが、健康な対照グループにおける同一のバイオマーカレベルに対して８０％以下であるということを意味している。しかし、一般にリスクグループにおけるレベルは、最高でも対照グループの７５％、または６５〜５０％である。
【００１６】
好適な実施例の１つとして、バイオマーカは、リン脂質類の合計とするか、１または複数のエステル結合型ホスホコリンとするか、あるいはエステル結合型ホスホコリン類の合計としてよい。これらすべての場合において、バイオマーカは新生児の時点で、例えば臍帯血分析によって測定するとよい。特に好適な実施例では、小児は新生児であって、エステル結合型ホスホコリン類の合計のレベルが対照グループの平均レベルの約８０％以下であることを、１型糖尿病を発症させ得る小児の感受性を表す指標としてよい。
【００１７】
他の好適な実施例では、バイオマーカは１または複数のエーテル結合型ホスホコリン、例えばＧＰＣｈｏ（３６：２ｅ）、ＧＰＣｈｏ（３８：１ｅ）、ＧＰＣｈｏ（３８：５ｅ）、ＧＰＣｈｏ（４０：４ｅ）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１８：１／１６：０）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１８：１／１６：１）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１６：０／２０：４）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１８：１／２０：４）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１８：０／１８：２）などとしてよい（これらに限定するものではない）。エーテル結合型ホスホコリンによれば、新生児から６歳児までの年齢の範囲で測定が可能である（好ましくは１〜２歳）。
【００１８】
他の好適な実施例では、バイオマーカはＧＰＥｔｎ（Ｏ−１８：ｌ（ｌＺ）／２０：４）などのエタノールアミンプラスマローゲンとしてよい。このバイオマーカは新生児から６歳児までの年齢の範囲で測定が可能である。
【００１９】
またさらなる実施例では、バイオマーカは、酸またはそれらの誘導体である、ケトン、またはアルコールとしてよい。限定されない例として、バイオマーカは、トリプトファン、リビトール、ペンタン二酸、グリシン、エイコサン酸、１、２、３−プロパントリカルボン酸、ミリストレイン酸、マンニトール、クレアチニン、ブタン二酸、ヘプタン酸、２−ケトグルタル酸メトキシム等からなるグループとしてよい。これらの化合物のうち、トリプトファン、リビトール、ペンタン二酸、１、２、３−プロパントリカルボン酸、クレアチニンエノール、ブタン二酸、がより好ましいと考えられている。
【００２０】
血清代謝体の測定は、小児が所定の年齢になるまで追跡可能であり、その測定結果は、診断される小児と同年齢の対照グループと比較可能である。
【００２１】
また、所定の血清代謝体は診断される小児から測定でき、そのレベルは対照グループの代謝体のレベルと比較可能である。すべてのまたはいくつかの代謝体は、時間が経過しても監視できる。
【００２２】
前述した１または複数の血清代謝体の監視は、１型糖尿病の発症に対する遺伝的リスクの測定および／または小児における自己抗体の出現の監視と組み合わせることが可能である。
【００２３】
好ましくは、１型糖尿病の発症に対する遺伝的リスクおよび／または自己抗体の出現は、病気を発症する感受性を検出する代謝体マーカに従うとよい。
【００２４】
さらに好ましくは、減少したエーテル結合型ホスホコリンレベルと組み合わされた自己抗体マーカの出現を測定することにより、１型糖尿病の高いリスクを有する個人を識別するとよい。
【００２５】
リスクグループであると初期の段階で１度診断されたら、小児における１型糖尿病の発症は様々な方法で予防可能である。その予防方法は、例えば、栄養摂取による介入、抗酸化療法、または小児におけるコリンプラスマローゲンの生化学合成による刺激、またはこれらを組み合わせて行うことよい。
【００２６】
我々の成果に従った１型糖尿病の潜在的な予防手段は、安全であるとされている栄養摂取による介入としてよい。例えば：
‐母親へのコリンの補給。特に両親がリスク型遺伝子を保有している場合。
‐出生後の小児へのコリンの補給。特にホスホコリンレベルが低いと認められる場合。
‐小児へのコリンプラスマローゲンの補給。出生時にホスホコリンレベルが低いと認められる場合、または出生後にエーテル結合型ホスホコリンが低いと認められる場合。
【００２７】
潜在的な薬物療法として、抗酸化療法は１つの選択肢である。１つの案として、本実施例により下方制御が認められた内因性の抗酸化コリンプラスマローゲンの合成を刺激することが挙げられる。その経路は図７に示す。
【００２８】
以下本発明を、限定的でない実験的な例によって説明する。
【００２９】
（実験例）
我々は、調査した小児（発症者）における、出生から明確な糖尿病を発症するまでに採取したサンプル系列と、自己抗体または糖尿病の徴候を示さなかった小児（未発症者）から採取したサンプル系列とを、高いスループットのメタボロミクステクノロジーを適用して解析し、比較した。対照グループの年齢、性別、出生地は、遺伝的リスクグループに合わせた。血清脂質、水溶性成分、代謝体と結合した血清アルブミンのパターンは、臍帯血と、幼少期や幼年期の間に採取したサンプルとでは異なっていた。また、１型糖尿病の予測の基礎とされている自己抗体は、完全に変化していた。酸化ストレスや炎症を予防するための因子を伴う代謝体と外挿経路の識別は、病気の発症の抑制のために非常に重要であり、糖尿病の予防のための潜在的な目標物を備えている。
【００３０】
（被験者の選定）
ＤＩＰＰプロジェクトはフィンランドの３つの都市で実行し、これらの都市は合わせて年間１１，０００人の出生率を有し、これはフィンランドでの出生数のほぼ２０％に相当する。本プロジェクトは、１９９４年１１月にトゥルク市で開始した。オウル市は１年間調査に参加し、タンペレ市は３年後に参加した。ＨＬＡ−ＤＱＢ１対立遺伝子*０２、*０３０１、*０３０２、*０６０２、および*０６０３は分けられ、ＤＱＢｌ*０２に陽性な男児は、さらにＤＱＡｌ対立遺伝子*０２０１および*０５に詳細に分類された。対立遺伝子に特有な溶液からＰＣＲ法により増幅された遺伝子配列は、ランタノイドキレートでラベルされたオリゴヌクレオチドプローブによりハイブリダイズされた。またそのハイブリダイゼーション産物は、時間分解蛍光測定（Ｖｉｃｔｏｒ、Ｗａｌｌａｃ社、トゥルク市）で検出された。２００６年６月６日までに、１０７，４８４人の新生児と、彼らの年上の兄弟がスクリーニングされ、遺伝的リスクを有する約８，０００人の小児に追跡調査が続けられた。
【００３１】
我々の試みには、多型性のインスリンプロモータ領域のスクリーニング解析を含めてあった。ＣＴＬＡ４およびＰＴＰＮ２２は、スクリーニング効果がわずかに良いものの、費用対効果が劣るために単純作業でのスクリーニングによる解析を強いられた。しかし我々は、選択した研究目的のためにその解析を続けた。
【００３２】
研究参加者のうち、１４４５人は少なくとも１度は、ランゲルハンス島の細胞、インスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素、またはＩＡ−２タンパク質に対する自己抗体に対して陽性であった。彼らのうち５１６人は、複数の型の自己抗体を有していて、糖尿病の発症の可能性が増大していた。最終的に、１３７人の小児が追跡調査中に１型糖尿病を発症した（図１ａ〜図１ｂ）。これら１３７人の小児の大多数に、最初の自己抗体としてＩＡＡが、単独で、またはＩＣＡとＧＡＤＡのどちらかと共に発生した（一般に、IＡ−２Ａ抗体は遅れて発生する）。生まれた歳に早くも糖尿病を発症する小児もいれば、明確な糖尿病を発症しないまま、酷似した自己抗体パターンを数年間も残存させていた小児もいた（例えば図１ｂ参照）。追跡調査の間、自己抗体の値は全体として顕著に変化したが、その値は、臨床的な糖尿病の発症の後にゆっくりと減少していった（図１ｂ参照）。
【００３３】
出生から発症（あるいはその後）までの間に３〜６ヶ月おきに収集した長期にわたる血清コレクションにより、病気の原因および潜在的な早期メカニズムに対する詳細な調査を行うことができた。自己抗体の出現と期間との関係は図１ｂに示す。
【００３４】
１型糖尿病を発症した被験者は、ＨＬＡ遺伝子型、性別、出生地と出生時期に応じて、ＤＩＰＰ試験から選び出された。選出された合計４１人の発症者と５４人の未発症者から、９５０サンプルを選出した（図１ｃ）。実験とデータ解析のために、サンプルは産まれた都市に基づいて２つのバッチにさらに分けた。すなわちトゥルク市（発症者１３人、非発症者２６人）、オウル市（発症者２８人、非発症者２８人）である。
【００３５】
遺伝的に定義されたＤＩＰＰ参加者のメタボロミクスの調査結果と、遺伝的に定義されていないグループの小児における生後７ヶ月から思春期までの間に予め収集しておいた利用可能なサンプル系列とを比較した。そして我々は、１型糖尿病を発症したすべての６歳児を、トゥルク出生群のリスク因子介入特別プロジェクト（ＳＴＲＩＰ）８から選び出した（合計８９サンプル）。彼らは、同じ調査における健康な対照グループと同じ性別の６歳児である。ＳＴＲＩＰ調査は、選抜した１０６２人の小児から構成され、そのうちの７００人以上に対して、１０歳半になるまで調査を継続した。糖尿病を発症したＨＬＡリスク対立遺伝子の保因者の小児は、臨床的に糖尿病を発症する前に、多様な自己抗体を有していた。
【００３６】
メタボロミクスデータの調査において、我々は１型糖尿病の記載の構成のうち、３つの観点による比較に特に注目した（図１ｄ）。すなわち、長期にわたるプロフィールの全体の差異、発症者と非発症者との年齢に基づく比較、自己抗体の出現に関連した代謝体プロフィールの変化である。
【００３７】
（リピドミク解析は主な交絡因子としての年齢を明らかにする）
我々は、ＵＰＬＣ−ＭＳプラットフォームを使って、選び出した１０３９個のサンプルすべてについてリピドミク解析を実行した。データ処理は、出力された膨大な数の未確認のピークについて行った。またデータ解析は、すべてのバッチにおいて識別された１８６種の脂質分子にわたって行った。データ構造の探査および脂質プロフィールに影響を与える主要な交絡因子の識別は、サモンの非線形マッピング９により実行した。サンプルのマップは、高次元（例えば１８６）のスペースから低次元のスペースにかけての非線形のもので、サンプル間の距離のプロフィール（例えばユークリッド距離）を維持させた。主成分解析１０などの一般的な線形法と比べて、サモン法は、高く相互依存した特性１１からの情報の抽出、および生データからプロフィールの類似点を直接的に視覚化する能力において優れている。
【００３８】
図２は、４つの潜在的な交絡因子として各個人のID、性別、年齢、サンプルの年代を表示する、オウル市のＤＩＰＰバッチのサモンマッピングの結果である。サンプルの年代と性別はいずれも、脂質プロフィールとの類似性に影響を与える主要なファクターではないことは明白であった。しかしながら、年齢のプロフィールの密集（図２ｃ）（すなわち、早期年齢の小児の脂質プロフィール）は、後の段階でのどのプロフィールよりも、互いに相似していた。これは、年齢によって異なるが低年齢であるほど均一になる規定食と、彼らの成長に起因する代謝の顕著な変化と、両方によって生じると考えられる。興味深いことに、各個人の間における差異も検出された（図２ｄ）。
【００３９】
（発症者と未発症者の間における、自己免疫の発生前の早期年齢での血清リピドームの差異）
早期年齢での病気の予測可能性を試験するために、特定の年齢層に部分最小二乗法による判別解析１２を用いた多変量解析を実行した。ＰＬＫ／ＤＡモデルは、３つのバッチの解析のために独自に開発した。
【００４０】
我々は、１歳の発症者と未発症者の間に既に明確な差異があることを見つけ、そしてそれらの差異は、３つのバッチすべてにわたる同一または関連した分子種に属するものであった。また我々は、ＶＩＰ解析に基づいて最も重要な脂質の分子種を選択するために、ＤＩＰＰのトゥルク市のバッチに適したモデルを開発して適用した。新しいＰＬＫ／ＤＡモデルは、選択した脂質分子種および適用する他の２つのバッチに基づいて開発した。そして我々は、このモデルが、糖尿病の徴候を正確に予測することを発見した。
【００４１】
我々の結果からは、事前の遺伝的スクリーニングと組み合わせることで、後に自己抗体および１型糖尿病を発症する小児を、事前に、より正確に定義できるというリピドミクスの方策が示された。
【００４２】
（発症例と対照例の間におけるプラスマローゲン分子種の一貫した差異）
血清脂質プロフィールにおいて発見された早期年齢での差異は、予測していたよりずっと早期に病気に関連した現象が起ることを示唆していた。各個人の脂質レベルの経時変化および観測した変化の一貫性を測定するため、我々は、識別した各脂質分子種の長期にわたるプロフィールを調査した。特に我々は、後に自己抗体と１型糖尿病を発症した小児は、早期年齢（すなわち、自己抗体の兆しが著しく発生する前（図３））において、多数のコリンプラスマローゲン分子種のレベルが低下していることを発見した。その差異は、後の年齢においても続いたが、病気自体の出現によるプラスマローゲンレベルへの影響は現れなかった（発症者の終点）。
【００４３】
エーテル結合型リン脂質類のサブクラスであるプラスマローゲン類は、従前から酸化損傷の予防に関係していることが知られている１３−１５。活性酸素種（ＲＯＳ）は、β細胞を破壊する重大な役割を果たすと提唱され、また、膵臓のランゲルハンス島をサイトカインにさらすと、ＲＯＳの生産が増加し、β細胞の酸化損傷を招くことが示されている１６。β細胞は特に、抗酸化酵素レベルが低いので酸化損傷を受け易い１７。
【００４４】
抗酸化療法は、糖尿病の予防が可能な方策を提供できるとされているが１８、これまでの結果からは不明瞭である１９。我々の結果によれば、１型糖尿病の病原において主要な役割を果たすのは酸化損傷を防ぐ能力であり、ＲＯＳの生成自体ではないことが示唆されている。
【００４５】
プラスマローゲン合成の最後の段階は、小胞体（ＥＲ）で行われていることが知られている２０。生体内の実験によって、ＥＲストレスが病気の原因について重大な役割を担っているということは、はっきりと証明された。
【００４６】
（臍帯血分析は、後に糖尿病を発症する小児のホスホコリンレベルの低下を明らかにする）
早期年齢での脂質表現型における差異は、後に糖尿病を発症する小児の代謝表現型が、出生の時点で既に異なっているという可能性を高めている。そのため、我々は３９人の小児の臍帯血を検査した（そのうちの１５人は、その後、１２歳になるまでに１型糖尿病を発症した）。しかし、トゥルク市で産まれた小児は、前述した調査結果とは異なっていた。
【００４７】
多変量解析は、サンプルのグループに影響している２つの主要な因子を識別した（図４）。トリアシルグリセロールレベルの増大は、発症者と非発症者の両方に影響した。しかしながら、２つのグループから大多数のサンプルを区別する他の主要な因子は、リン脂質レベルの変化であった（図４aと図４ｂ）。発症者の早期年齢において既に下方制御が認められているプラスマローゲン種ＧＰＣｈｏ（３６：２ｅ）は、グループ間における差異はほとんどなかった。しかしながら、エステル結合型ホスホコリンレベル（血清の中で最も豊富なリン脂質種）の合計は、発症者における出生時において既にかなり下方制御されていた（図４ｄ）。
【００４８】
（血清転換）
我々はまた、観察された脂質プロフィールの変化が自己免疫の出現と関連しているか否か検査した。そのために、我々は、血清転換の６ヶ月前の期間および血清転換の直後の脂質プロフィールを比較した。
【００４９】
発症者のコリンプラスマローゲンレベルは、既に図３で示したように、自己免疫の出現によっては変化しなかった。発症者における血清転換前の主要な因子は、上方制御されたリゾホスファチジルコリンであった（図５）。リゾホスファチジルコリン（ＬｙｓｏＰＣ）は炎症と関連していて２１、自己免疫に先がけた炎症を引き起こすといわれている。重要なことに、ＬｙｓｏＰＣはサイトカイン生産量を高めることが示されている２２。ＬｙｓｏＰＣに特有な上方制御は、短い期間に一時的にだけ表れる。
【００５０】
血清転換に続く変化は、主として、エタノールアミンプラスマローゲンレベルの増大である（図５）。これは、エーテル結合型リン脂質の増大が、酸化損傷の増大に対する正常な全身反応であることを示している。
【００５１】
要約すると、後に１型糖尿病を発症した小児の長期にわたる血清脂質プロフィールは、自己免疫と病気へつながる所定の現象を明らかにし（図６）、早期の病原において、リン脂質が重要な役割を担うことを提示した。
【００５２】
（早期年齢での１型糖尿病の予測可能性）
観察されたリピドームの変化は、血清転換に先がけた代謝プロファイリングを利用することで、病気の予測が可能であることを提示している。分類アルゴリズムは、６０％の発症者と非発症者からランダムに選出したサブセットから、拡張した脂質プロフィールに基づいて開発した。既知の長期にわたるプロフィールバリエーションおよび未知の混同ファクターへの依存に基づき、エーテルリン脂質類が潜在的バイオマーカであると考えられた。最良の病気の予測は、１歳半（範囲０．５−２．５年）において、ＧＰＣｈｏ（Ｏ−１８：ｌ／１６：０）から成る分子種（テーブル１）をバイオマーカにするという、早期年齢での観察である。発症者のための分類規則は、脂質収集物の濃度は４．０９μｍｏｌ／Ｌ未満という要件であった。
【００５３】
分類は、テスト結果が１型糖尿病と関連しないとする帰無仮説を試験することによって行った。バイアスを制御するために、テストセットとトレーニングセットは、ランダムに１０００回選択された。各選択において、脂質特有の分類閾はトレーニングセットで測定し、分類精度はテストセットで評価した。二項分布は、最も観測数の少ない真の陽性（ＴＰ）、または最も観測数の多い偽の陽性（ＦＰ）、ランダム分類（ＴＰ＝ＦＰ）に応じた確率により正確に計算したＰ−値を使用して計算した。要約した統計、中央値および各変数における８０％の信頼区間が報告された。
【００５４】
表１。シングルエーテルホスファチジルコリンＧＰＣｈｏ（Ｏ−１８：ｌ／１６：０）から成る分類。被験者が発症者であるか否かの分類は、エーテルホスファチジルコリン収集物が４．１μｍｏｌ／Ｌ未満であるか否かによって行った（９０％ＣＩ＝［４．０μｍｏｌ／Ｌ、４．７μｍｏｌ／Ｌ］）。自己抗体陽性サンプルは解析から除外した。ＴＰ、真の陽性の数；Ｐ、陽性の数（すなわち、発症者）；Ｐ（ＴＰ）、真の陽性の見込み数はＴＰより偶然に多く；ＦＰ、偽の陽性の数；Ｎ、陰性の数（すなわち、非発症者）；Ｐ（ＦＰ）、偽の陽性の見込み数はＦＰより偶然に少なかった。ランダムに選択された１０００のテストセットとトレーニングセットに基づく、ＴＰ、ＦＰ、およびオッズ比、による９０％の信頼区間は、括弧で示している。
【表１】
【００５５】
（方法）
血清収集物。静脈血液サンプルは１９９４年〜２００４年の間に小児から採取した。サンプルは、空腹時を除く様々な日時において採取した。血液サンプルは、針とBDVacutainer（登録商標）プラスチックチューブまたはVacutainerRプラス・プラスチックチューブを使用して、静脈回収によって採取した（BD VacutainerR SST?チューブは血清分離のためにスプレーコートシリコンとポリマーゲルを含んでいる）。チューブは、凝固させるために室温（ＲＴ）に３０〜６０分放置した。血清は、１３００ｒｃｆ、１０分、室温での遠心分離によって分離した。血清サンプルはスモールプラスチックチューブに−８０℃で保存した。
【００５６】
リピドミクス。等分（１０μｌ）した、１１の脂質クラスを含む内部標準混合物と、０．０５Ｍの塩化ナトリウム（１０μｌ）を血清サンプル（１０μｌ）に加え、脂質はクロロホルム/メタノール（２：１、１００μｌ）によって抽出した。ボルテックス（２分）の後に、直立させて放置し（１時間）、遠心分離（１００００ＲＰＭ、３分）を行い、下層は分離し、３つの標識した標準資質を含む標準混合物（１０μｌ）を抽出液に加えた。内部標準混合物は、エステル型脂肪酸としてヘプタン二酸（Ｃ１７：０）と、以下の脂質化合物（μｇ／ｍｌ）を含む。
【００５７】
Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン−１−ホスフェート（９．３μｇ／ｍｌ；Ｃｌ７ベース、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。
【００５８】
ｌ−ヘプタデカノイル−２−ヒドロキシ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（８．８μｇ／ｍｌ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。
【００５９】
１−モノヘプタデカノイン（ｒａｃ）（９．３μｇ／ｍｌ；Ｌａｒｏｄａｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【００６０】
１、２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（９．６μｇ／ｍｌ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。
【００６１】
Ｎ−ヘプタデカノイル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン（９．２μｇ／ｍｌ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。
【００６２】
１、２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−Ｌ−セリン］（８．６μｇ／ｍｌ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。
【００６３】
１、２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（９．９μｇ／ｍｌ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。
【００６４】
１、２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート（８．５μｇ／ｍｌ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。
【００６５】
１、２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（８．９μｇ／ｍｌ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）。
【００６６】
１、２−ジヘプタデカノイン（ｒａｃ）（１０．２μｇ／ｍｌ；Ｌａｒｏｄａｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【００６７】
トリヘプタデカノイン（１０．４μｇ／ｍｌ；Ｌａｒｏｄａｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【００６８】
（標識した標準混合液の成分）
Ｌ−α−リゾホスファチジルコリン−パルミトイル−Ｄ３（９．３μｇ／ｍｌ；Ｌａｒｏｄａｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【００６９】
１、２−ジパルミトイル−Ｄ６−ｓｎ−グリセロホスファチジルコリン（１１．７μｇ／ｍｌ；Ｌａｒｏｄａｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【００７０】
トリパルミチン−１、１、１−１３Ｃ３（１０．０μｇ／ｍｌ；Ｌａｒｏｄａｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。
【００７１】
最初の２３２個のサンプル（バッチ１）の分析の際、標準混合物を構成する血清サンプル（１５μｌ）は、クロロホルム／メタノール（２：１、１００μｌ）による抽出の前に、トリヘプタデカノイン（０．８０４ｍｇ／ｍｌ；Ｌａｒｏｄａｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）および１、２−ジヘプタデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（０．３０４ｍｇ／ｍｌ；Ｌａｒｏｄａｎ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を加え、また1つの標準混合物（２５μｌ）のみを加えた。
【００７２】
脂質抽出物は、Ａｃｑｕｉｔｙ Ｕｌｔｒａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＬＣ?（ＵＰＬＣ）と組み合わせたＷａｔｅｒｓ Ｑ−ＴｏｆＰｒｅｍｉｅｒ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒにより分析した。カラムは、５０℃に保温した、１．７μｍの粒子のＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ?のＢＥＨ Ｃ１８ １０×５０ｍｍを使用した。２成分溶媒系には、Ａ．水（１％ １Ｍ ＮＨ４Ａｃ、０．１％ ＨＣＯＯＨ）、およびＢ．ＬＣ／ＭＳグレード（Ｒａｔｈｂｕｒｎ）のアセトニトリル/イソプロパノール（５：２、１％ １Ｍ ＮＨ４Ａｃ、０．１％ ＨＣＯＯＨ）を用いた。グラジエントは、６５％Ａ／３５％Ｂから開始し、６分間でＢが１００％に達した後、７分その状態で放置した。５分の再平衡ステップを含み、全体のランタイムは１８分であった。流量は０．２００ｍｌ／分であり、注入量は０．７５μｌであった。サンプルオーガナイザーの温度は１０℃に設定した。脂質プロファイリングは、Ｗａｔｅｒｓ Ｑ−ＴｏｆＰｒｅｍｉｅｒ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒのＥＳＩ＋モードを使用して実行した。データは、ｍ／ｚ３００−１２００のマスレンジで、スキャン時間０．２ｓｅｃで収集した。最後のサンプルは、スキャン時間を０．０２ｓｅｃに変更した。ソース温度は１２０℃に設定し、脱溶媒ガス（８００Ｌ／ｈ）として、窒素を２５０℃で使用した。サンプリングコーンとキャピラリーの電圧は、それぞれ３９Ｖおよび３．２ｋＶであった。レセルピン（５０μｇ／Ｌ）はロック用リファレンススプレー（５μｌ／分；１０ｓｅｃ ｓｃａｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）として使用した。タンデム質量分析は選出した脂質分子種の識別のために使用した。ＭＳ／ＭＳは、ＥＳＩ＋モードで、１５から３０Ｖの衝突エネルギーランプ、およびｍ／ｚ１５０から開始するマスレンジを使用して実行した。他の条件は、上記で示す条件とした。
【００７３】
メタボロミクスデータの処理と解析。データは、ＭＺｍｉｎｅソフトウェアバージョン０．６０２３、２４を使用して処理をした。代謝体は、インターナルスペクトルライブラリを使用して識別した。
【００７４】
部分的最小二乗法による判別解析（ＰＬＳ／ＤＡ）１２、２５は、このモデルを計算するために、ＳＩＭＰＬＳアルゴリズムを用いた監督用モデリング方法として利用した２６。ベネチアンブラインドクロスのバリデーション方法２７およびＱ２スコアは、このモデルの進展のために使用した。薬剤に特有な効果と関連した潜在的な変数に対するトップローディングが報告された。ＶＩＰ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）値２８は、特定のグループのクラスタリングに対して、最も重要な分子種を識別するために算出した。多変量解析は、Ｍａｔｌａｂバージョン７．２（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｉｎｃ）およびＰＬＳツールボックスバージョン４．０Ｍａｔｌａｂパッケージ（Ｅｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ）を使用して実行した。
【００７５】
臍帯血の中で発見された他の血清代謝体（すなわち、非リン脂質）
方法：
血清サンプルは以下の通りに調製した：血清サンプルに、４００μｌメタノールと、１０μl ２５０ｐｐｍのｄ３−パルミチン酸（内部標準）を加えた。サンプルには、３０秒間のボルテックスを行った。３０分後、サンプルは３分、１００００ｒｐｍで遠心分離した。上精はＧＣバイアルに移し、乾燥状態になるように窒素の下で蒸発させた。サンプルは、２０μｌ ＭＯＸ（４５°Ｃ、６０分）および２０μｌ ＭＳＴＦＡ（４５°Ｃ、６０分）によってシリル化した。サンプルには５μｌの保持指標溶液（６００ｐｐｍのＣ１１、Ｃ１５、Ｃ１７、Ｃ２１、およびＣ２５アルカン）を加えた。
【００７６】
機器：
使用した機器は、Ｌｅｃｏ Ｐｅｇａｓｕｓ ４Ｄ ＧＣｘＧＣ−ＴＯＦ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅrとＡｇｉｌｅｎｔ ６８９０Ｎ ＧＣおよびＣｏｍｂｉ ＰＡＬ ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒを使用した。機器パラメータは以下のようにした。
１：２０の血清サンプル２μｌを分割噴射。
最初のカラム：ＲＴＸ−５、１０ｍｘ１８０μｍｘ０．２０μm
２番目のカラム：ＢＰＸ−５０、１．１０ｍｘ１００μｍｘ０．１０μm
常圧３５．３３ｐｓｉｇのヘリウム
【００７７】
温度プログラム：
プライマリーオーブン：初温５０℃、１分．−＞２８０°Ｃ、７°Ｃ／分、５分。
セコンドリーオーブン：上記のプライマリーオーブン温度＋１０℃。
２次元分離時間４ｓ。
ＭＳ測定４０−７００ａｍｕ、１００ｓｐｅｃｔｒａ／ｓ。
【００７８】
方法の特徴：
ＧＣｘＧＣ−ＴＯＦの性能特性は３つの純粋な非抽出の基準化合物と共にテストした。すべての化合物は、１０および３００００ｎｇ／サンプルの間において、８つの収集物レベルに調製した。
【００７９】
L−トレオニン：
リニアレンジ：７．４−２２００ｎｇ
相関係数（リニアレンジにおける）：０．９９９７５
相対的な標準偏差（８個のサンプル、７４４０ｎｇ）：７．６０％
最も低い濃度の収集物７．４ｎｇのＳ／Ｎ：５６．６
【００８０】
ラウリン酸：
リニアレンジ：１０−３００００ｎｇ
相関係数：０．９９７３７
相対的な標準偏差（７個のサンプル、１０１００ｎｇ）：２．６１％
最も低い濃度の収集物１０．１ｎｇのＳ／Ｎ：１１５．３
【００８１】
コレステロール：
リニアレンジ：１０−３００００ｎｇ
相関係数：０．９９９９９
相対的な標準偏差（７個のサンプル、１００００ｎｇ）：２．８９％
最も低い濃度の収集物１０．０ｎｇのＳ／Ｎ：６２．７
【００８２】
データ処理：
ＣｈｒｏｍａＴｏｆソフトウェアはサンプルのデータ処理のために使用した。自作のソフトウェアは、直線とピークが交差し合うサンプルのために使用した。ピークは、合計３６サンプルのプロフィールから検出されたピークの数（最小の１２ピークに設定）に基づき、またデータベース（類似インデックス閾＝８００）への特性の一致に基づき取り出した。
【００８３】
結果：結果は、以下の表２に示す。Ｆｏｌｄ（中央値）は、１型糖尿病を発症した小児、および追跡調査中に自己抗体に対して陰性のままだった小児（未発症者）の各代謝体レベルの中央値の比率を示している。ｐ（ウィルコクソン）は、２つのグループを比較したウィルコクソン順位和検定に基づくｐ値である。Ｆｏｌｄ（平均）は、１型糖尿病が進行した小児、および追跡調査中に自己抗体に対して陰性のままだった小児（未発症者）の各代謝体レベルの平均値の比率を示している。ｐ（ｔ−検定）は、２つのグループを比較した両側ｔ検定に基づくｐ値である。
【表２】
【００８４】
本発明にかかる方法は、ここにはわずかな実施例しか開示していないが、様々な実施例の形式を組み合わせることが可能であることが理解される。本発明の思想を逸脱することのない他の実施例が存在することは、当業者にとって明らかである。したがって、本文に記載された実施例は説明に役立つものの、本発明を制限するものではない。
【参考文献】
【００８５】
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２４．Katajamaa, M., Miettinen, J. & Oresic, M.ＭＺｍｉｎｅ：分子プロフィールデータに基づく質量解析の処理と視覚化のためのツールボックス.Bioinformatics 22, 634-636 （2006）.
２５．Geladi, P. & Kowalski, B. R.部分最小二乗法解析：チュートリアル.Anal. CMm. Acta 185, 1-17 （1986）.
２６．de Jong, S.ＳＩＭＰＬＳ：部分最小二乗法への代替アプローチ. Chemometr. Intell. Lab. Syst. 18, 251-263 （1993）.
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１型糖尿病の発症に対する小児の感受性を診断する方法であって、
ｉ）診断される小児における少なくとも１つの血清代謝体の収集物を測定し、
ｉｉ）前記血清代謝体の収集物と、健康児からなる対照グループにおける同種の血清代謝体の収集物とを比較し、
ｉｉｉ）前記診断される小児と前記対照グループとの間における収集物の差異を、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性を表すためのバイオマーカとして使用することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記診断される小児の年齢は、前記対照グループと同じ、またはほぼ同じ年齢であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記バイオマーカは、前記健康児からなる対照グループと比較して前記診断される小児の収集物に減少している、酸化ストレスおよび／または炎症から保護するための代謝体であり、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性を表すことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記バイオマーカは、リン脂質、酸またはそれらの誘導体である、ケトン、またはアルコールであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記バイオマーカは、リン脂質類の合計であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法において、前記バイオマーカは、１または複数のエステル結合型リン脂質であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法において、前記バイオマーカは、エステル結合型リン脂質類の合計であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項５から７のいずれか１項に記載の方法において、前記バイオマーカは、新生児から測定することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法において、前記小児は新生児であって、小児のエステル結合型リン脂質類の合計のレベルが、対照グループの平均レベルの約８０％以下であるか否かにより、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性を表すことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項４に記載の方法において、前記バイオマーカは、１または複数のエーテル結合型リン脂質、またはエタノールアミンプラスマローゲンであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、エーテル結合型ホスファチジルコリンは、ＧＰＣｈｏ（３６：２ｅ）、ＧＰＣｈｏ（３８：ｌｅ）、ＧＰＣｈｏ（３８：５ｅ）、ＧＰＣｈｏ（４０：４ｅ）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１８：１／１６：０）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１８：１／１６：１）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１６：０／２０：４）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１８：１／２０：４）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１８：０／１８：２）からなるグループから選出され、その測定は、新生児から６歳児までの年齢の範囲で行われることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法において、前記エタノールアミンプラスマローゲンは、ＧＰＥｔｎ（Ｏ−１８：１（１Ｚ）／２０：４）であり、かつその測定は、新生児から６歳児までの年齢の範囲で行われることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項４に記載の方法において、前記バイオマーカは、トリプトファン、リビトール、ペンタン二酸、グリシン、エイコサン酸、１、２、３-プロパントリカルボン酸、ミリストレイン酸、マンニトール、クレアチニン、ブタン二酸、ヘプタン酸、２−ケトグルタル酸メトキシムからなるグループから選出されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法において、前記血清代謝体の測定は、所定の年齢の小児に対して行い、
前記血清代謝体の測定結果は、前記診断される小児と同じ年齢の前記対照グループの測定結果と比較することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、所定の前記血清代謝体は、前記診断される小児のために測定され、
前記血清代謝体のレベルは、前記対照グループにおける代謝体のレベルと比較することを特徴とする請求項１４に記載の診断方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において、前記１型糖尿病の発症および／または自己免疫の出現に対する遺伝的リスクを測定することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、前記１型糖尿病の発症および／または前記自己免疫の出現に対する遺伝的リスクは、病気を発症する感受性を検出する代謝体マーカに従って測定することを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１０に記載の方法において、減少したエーテル結合型ホスホコリンレベルと組み合わせた自己抗体マーカの出現を測定することにより、１型糖尿病を発症する高いリスクを有する個人を識別することを特徴とする方法。
【請求項１９】
小児の糖尿病の発症を予防する方法であって、１型糖尿病の発症に対して感受性が強いとして請求項１から１８のいずれか１項により診断された小児に対する、１または複数の手段から構成されることを特徴とする１型糖尿病の発症を予防する方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、予防手段は、栄養摂取による介入、抗酸化療法、または小児におけるコリンプラスマローゲンの生化学合成による刺激、またはこれらを組み合わせて行うことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、前記栄養摂取による介入は、規定食による母親へのコリンの補給、規定食による小児へのコリンの補給または規定食による小児へのコリンプラスマローゲンの補給であることを特徴とする方法。
【請求項１】
１型糖尿病の発症に対する小児の感受性を診断する方法であって、
ｉ）診断される小児における少なくとも１つの血清代謝体の収集物を測定し、
ｉｉ）前記血清代謝体の収集物と、健康児からなる対照グループにおける同種の血清代謝体の収集物とを比較し、
ｉｉｉ）前記診断される小児と前記対照グループとの間における収集物の差異を、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性を表すためのバイオマーカとして使用することを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記診断される小児の年齢は、前記対照グループと同じ、またはほぼ同じ年齢であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、前記バイオマーカは、前記健康児からなる対照グループと比較して前記診断される小児の収集物に減少している、酸化ストレスおよび／または炎症から保護するための代謝体であり、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性を表すことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記バイオマーカは、リン脂質、酸またはそれらの誘導体である、ケトン、またはアルコールであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記バイオマーカは、リン脂質類の合計であることを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法において、前記バイオマーカは、１または複数のエステル結合型リン脂質であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法において、前記バイオマーカは、エステル結合型リン脂質類の合計であることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項５から７のいずれか１項に記載の方法において、前記バイオマーカは、新生児から測定することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法において、前記小児は新生児であって、小児のエステル結合型リン脂質類の合計のレベルが、対照グループの平均レベルの約８０％以下であるか否かにより、１型糖尿病の発症に対する小児の感受性を表すことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項４に記載の方法において、前記バイオマーカは、１または複数のエーテル結合型リン脂質、またはエタノールアミンプラスマローゲンであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、エーテル結合型ホスファチジルコリンは、ＧＰＣｈｏ（３６：２ｅ）、ＧＰＣｈｏ（３８：ｌｅ）、ＧＰＣｈｏ（３８：５ｅ）、ＧＰＣｈｏ（４０：４ｅ）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１８：１／１６：０）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１８：１／１６：１）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１６：０／２０：４）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１８：１／２０：４）、ＣＰＣｈｏ（Ｏ−１８：０／１８：２）からなるグループから選出され、その測定は、新生児から６歳児までの年齢の範囲で行われることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法において、前記エタノールアミンプラスマローゲンは、ＧＰＥｔｎ（Ｏ−１８：１（１Ｚ）／２０：４）であり、かつその測定は、新生児から６歳児までの年齢の範囲で行われることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項４に記載の方法において、前記バイオマーカは、トリプトファン、リビトール、ペンタン二酸、グリシン、エイコサン酸、１、２、３-プロパントリカルボン酸、ミリストレイン酸、マンニトール、クレアチニン、ブタン二酸、ヘプタン酸、２−ケトグルタル酸メトキシムからなるグループから選出されることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法において、前記血清代謝体の測定は、所定の年齢の小児に対して行い、
前記血清代謝体の測定結果は、前記診断される小児と同じ年齢の前記対照グループの測定結果と比較することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法において、所定の前記血清代謝体は、前記診断される小児のために測定され、
前記血清代謝体のレベルは、前記対照グループにおける代謝体のレベルと比較することを特徴とする請求項１４に記載の診断方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において、前記１型糖尿病の発症および／または自己免疫の出現に対する遺伝的リスクを測定することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、前記１型糖尿病の発症および／または前記自己免疫の出現に対する遺伝的リスクは、病気を発症する感受性を検出する代謝体マーカに従って測定することを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１０に記載の方法において、減少したエーテル結合型ホスホコリンレベルと組み合わせた自己抗体マーカの出現を測定することにより、１型糖尿病を発症する高いリスクを有する個人を識別することを特徴とする方法。
【請求項１９】
小児の糖尿病の発症を予防する方法であって、１型糖尿病の発症に対して感受性が強いとして請求項１から１８のいずれか１項により診断された小児に対する、１または複数の手段から構成されることを特徴とする１型糖尿病の発症を予防する方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、予防手段は、栄養摂取による介入、抗酸化療法、または小児におけるコリンプラスマローゲンの生化学合成による刺激、またはこれらを組み合わせて行うことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法において、前記栄養摂取による介入は、規定食による母親へのコリンの補給、規定食による小児へのコリンの補給または規定食による小児へのコリンプラスマローゲンの補給であることを特徴とする方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１０−５０３８４０（Ｐ２０１０−５０３８４０Ａ）
【公表日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２７８５１（Ｐ２００９−５２７８５１）
【出願日】平成１９年９月１０日（２００７．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００７／０００２２７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３１９１７
【国際公開日】平成２０年３月２０日（２００８．３．２０）
【出願人】（５０８３６６９５０）
【氏名又は名称原語表記】ＺＯＲＡ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＯＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月４日（２０１０．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月１０日（２００７．９．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＩ２００７／０００２２７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０３１９１７
【国際公開日】平成２０年３月２０日（２００８．３．２０）
【出願人】（５０８３６６９５０）
【氏名又は名称原語表記】ＺＯＲＡ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＯＹ
【Ｆターム（参考）】
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