自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法
【課題】自己免疫疾患の発症や進行に関与する分子を同定し、その分子メカニズムに基づいた自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法を提供することを目的とする。
【解決手段】ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を同定する方法。
【解決手段】ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法に関するものである。さらに、本発明は、リンパ球の幼若化抑制剤、インターロイキン２（Interleukin-2;IL-2）の産生阻害剤、腫瘍壊死因子α（Tumor necrosis factor-alpha; TNF-α）の産生阻害剤、免疫グロブリンＭ（Immunoglobulin M; IgM）の産生阻害剤を同定する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患は、自己に対する過剰な免疫応答によってもたらされる疾患の総称であり、例えば、関節リウマチ、クローン病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、全身性硬化症、喘息などが含まれる。何らかの遺伝的、環境的因子が作用して自己寛容が破綻すると自己免疫疾患になると考えられているが、その詳しいメカニズムは明らかにされていない。
【０００３】
多くの自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤が開発されており、例えば、特許文献１には抗リウマチ作用を示すベンズアミド化合物が開示されている。自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の開発ために簡便かつ高速な評価系が求められるが、自己免疫疾患の発症や進行に関与する分子が同定されていないこともあり、特許文献１に開示されているようなインビボ（in vivo）の評価系により化合物の評価が行われることが多い。抗リウマチ活性のインビトロ（in vitro）の評価系としてマイトジェン刺激によるＴ又はＢリンパ球幼若化の抑制試験が行われているが、細胞の調製や培養に時間がかかる等の問題点があり、ハイスループットスクリーニング（high-throughput screening; HTS）には適していない。
【０００４】
【特許文献１】特開平９−５９２３６
【非特許文献１】Hurlimann D et al., Circulation, 106(17): 2184-7 (2002), "Anti-tumornecrosis factor-alpha treatment improves endothelial function in patients withrheumatoid arthritis."
【非特許文献２】Elliott MJ et al., Lancet, 344(8930): 1105-10 (1994), "Randomiseddouble-blind comparison of chimeric monoclonal antibody to tumour necrosisfactor alpha (cA2) versus placebo in rheumatoid arthritis."
【非特許文献３】湊長博監修「免疫学―主要疾患発症のメカニズム」（メディカルサイエンスインターナショナル）1995年発行、176-181頁
【非特許文献４】Targan SR et al., N. Engl. J. Med., 337(15): 1029-35 (1997), "Ashort-term study of chimeric monoclonal antibody cA2 to tumor necrosis factoralpha for Crohn's disease. Crohn's Disease cA2 Study Group."
【非特許文献５】Stack WA et al., Lancet, 349(9051): 521-4 (1997), "Randomisedcontrolled trial of CDP571 antibody to tumour necrosis factor-alpha in Crohn'sdisease."
【非特許文献６】湊長博監修「免疫学―主要疾患発症のメカニズム」（メディカルサイエンスインターナショナル）1995年発行、169-176頁
【非特許文献７】湊長博監修「免疫学―主要疾患発症のメカニズム」（メディカルサイエンスインターナショナル）1995年発行、248-252頁
【非特許文献８】湊長博監修「免疫学―主要疾患発症のメカニズム」（メディカルサイエンスインターナショナル）1995年発行、189-195頁
【非特許文献９】湊長博監修「免疫学―主要疾患発症のメカニズム」（メディカルサイエンスインターナショナル）1995年発行、185-186頁
【非特許文献１０】Lassalle P et al., Clin. Exp. Immunol., 94(1): 105-10 (1993), "Modulationof adhesion molecule expression on endothelial cells during the late asthmaticreaction: role of macrophage-derived tumour necrosis factor-alpha."
【非特許文献１１】He XW et al., J Clin Invest. 89(2): 673-680 (1992), "Selectiveinduction of rheumatoid factors by superantigens and human helper Tcells."
【非特許文献１２】Simone Matuschka et al., Archives of biochemistry and biophysics.322(1): 135-142 (1995), "ATP Synthesis by Purified ATP-Synthase from BeefHeart Mitochondria after Coreconstitution with Bacteriorhodopsin."
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明は、自己免疫疾患の発症や進行に関与する分子を同定し、その分子メカニズムに基づいた自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、磁性ナノビーズを用いた研究を行ったところ、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)が自己免疫疾患に関与していることを発見した。ATP合成酵素は、ミトコンドリアの内膜などに存在し、FOとF1(F1-ATPaseと称される場合もある)の２つの部位からなり、細胞内では生体膜を介したプロトンの電気化学ポテンシャルを利用してADPと無機リン酸からATPを合成している。本発明に係る抗リウマチ化合物はF1のαサブユニットに結合し、ATP合成酵素の活性を阻害することを本発明者らは見出した。さらに、ATP合成酵素阻害剤は、Ｔ及びＢリンパ球の幼若化を抑制すること、炎症性サイトカインであるTNF-α及びIL-2並びにリウマトイド因子が属するIgMの産生を阻害することも見出した。
【０００７】
免疫細胞の幼若化、IgM産生、TNF-α産生、IL-2産生等と自己免疫疾患との関連については、以下に述べるように様々な論文で報告されている。
（１）関節リウマチ：非特許文献１には、TNF-αが関節リウマチの発症・増悪に関与することや抗TNF-α抗体療法が関節リウマチを改善することが開示されている。非特許文献２は、抗TNF-αキメラモノクローナル抗体が関節リウマチの臨床試験において治療効果を示したことを報告している。非特許文献３は、IL-1及びTNF-αが関節リウマチにおける関節破壊に関与している証拠を報告している（特に、１７７頁）。また、関節リウマチにおいて高率に検出されるリウマトイド因子（rheumatoid factor）（他の自己免疫疾患の患者由来の血清においても検出される）は、リウマチの重症度と相関する。リウマトイド因子は、IgG（免疫グロブリンＧ）のFcフラグメントに対する自己抗体であって、主としてIgM型に属する（非特許文献１１）。
（２）クローン病：非特許文献４は、抗TNF-αキメラモノクローナル抗体がクローン病の臨床試験において治療効果を示したことを報告している。非特許文献５は、TNF-αがクローン病発症に関して中心的な役割を果たしていると考えられることや、抗TNF-α抗体であるCDP571がクローン病の臨床試験において治療効果を示したことを報告している。
（３）全身性エリテマトーデス：非特許文献６は、全身性エリテマトーデスにおける広範なＢリンパ球機能異常を報告している（特に、１７０頁）。
（４）多発性硬化症：非特許文献７は、自己反応性（MBP反応性）CD4陽性ＴＨ１細胞が細胞傷害性CD8陽性Ｔリンパ球やマクロファージを刺激し、TNF-α等のサイトカインを介してオリゴデンドロサイトを傷害するという多発性硬化症のメカニズムを開示している（特に、２５０頁）。
（５）インシュリン依存性糖尿病：非特許文献８は、自己反応性CD4陽性ＴＨ１細胞が細胞傷害性CD8陽性Ｔリンパ球やマクロファージを刺激し、マクロファージから産生される細胞傷害性を有するIL-1がランゲルハンス島β細胞を攻撃するというインシュリン依存性糖尿病のメカニズムを開示している（特に、１９１頁）。
（６）全身性硬化症：非特許文献９は、活性化マクロファージが産生するTNF-αによって血管内皮細胞が損傷し、繊維化が進行することを報告している。
（７）喘息：非特許文献１０は、喘息において、マクロファージ由来のTNF-αは、血管内皮細胞に作用することでＩＣＡＭ−１やＥＬＡＭ−１の発現を増強し、好酸球や好中球の血管内皮細胞への接着に関与している可能性を示唆している。
【０００８】
本発明者らは、上記知見に基づき本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１１］を提供する：
［１］ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、インターロイキン２（Interleukin-2;IL-2）の産生阻害剤の同定方法。
［２］ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、腫瘍壊死因子α（Tumornecrosis factor-alpha; TNF-α）の産生阻害剤の同定方法。
［３］ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、免疫グロブリンＭ（ImmunoglobulinM; IgM）の産生阻害剤の同定方法。
［４］以下の工程を含む、インターロイキン２（Interleukin-2;IL-2）の産生阻害剤の同定方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
［５］以下の工程を含む、腫瘍壊死因子α（Tumor necrosis factor-alpha; TNF-α）の産生阻害剤の同定方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
［６］以下の工程を含む、免疫グロブリンＭ（Immunoglobulin M; IgM）の産生阻害剤の同定方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
［７］ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、リンパ球の幼若化抑制剤の同定方法。
［８］以下の工程を含む、リンパ球の幼若化抑制剤の同定方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
［９］ ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を同定する方法。
［１０］ 以下の工程を含む、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を同定する方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
［１１］ 自己免疫疾患が、関節リウマチ、クローン病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、全身性硬化症又は喘息である、［９］又は［１０］に記載の自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を同定する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、ATP合成酵素が自己免疫疾患に関与しているという新しい知見に基づくものであり、このメカニズムに基づく自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を提供することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１１】
本発明は、IL-2の産生阻害剤の同定方法、TNF-αの産生阻害剤の同定方法、IgMの産生阻害剤を同定方法、リンパ球の幼若化抑制剤の同定方法、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法を提供する。いずれの同定方法も、ATP合成酵素の阻害を指標とすることを特徴とする。
【００１２】
ATP合成酵素の阻害を指標とするとは、被験化合物によるATP合成酵素阻害の有無及び／又はその程度を同定の基準とすることを意味する。例えば、１）被験化合物がATP合成酵素を阻害する場合、及び／又は、２）被験化合物によるATP合成酵素阻害が陽性対照化合物によるATP合成酵素阻害と比較して同等又はより強い場合、被験化合物を、IL-2の産生阻害剤、TNF-αの産生阻害剤、IgMの産生阻害剤、リンパ球の幼若化抑制剤、又は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分と同定できる。陽性対照化合物として、被験化合物とは異なる他のATP合成酵素阻害剤を例示できる。ATP合成酵素阻害剤として、例えば、Oligomycin A及びAurovertin Bが挙げられる。
【００１３】
被験化合物は、特に制限されず、合成化合物でもよく、天然物抽出物中に存在する化合物であってもよい。被験化合物として、例えば、合成化合物、天然化合物、植物抽出物、動物抽出物、発酵生産物、市販の試薬、化合物ライブラリーから選抜された化合物などが挙げられる。被験化合物の分子種も特に制限されず、例えば、低分子化合物、ペプチド、蛋白質、糖、核酸を例示できる。
【００１４】
ATP合成酵素の阻害として、例えば、ATP合成酵素遺伝子の発現阻害、ATP合成酵素の分解及び／又はATP合成酵素の活性阻害を例示できる。ATP合成酵素は、その名の通り、ADPと無機リン酸からATPを合成する酵素であるが、その逆反応であるATP加水分解も行う。したがって、測定するATP合成酵素の活性は、ATP合成の活性であってもATP加水分解の活性であってもよい。ATP合成酵素の活性阻害として、ATP合成酵素のATP加水分解活性阻害を好ましく例示できる。
【００１５】
ATPの合成・分解反応を担っているのはF1部位であること、ATP合成酵素のF1部位のαサブユニットと結合する化合物が自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分等となる可能性が高いと考えられることから、使用するATP合成酵素はF1FOではなく、F1部位のみであってもよい。
【００１６】
ATP合成酵素の由来する生物種は、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ等が挙げられ、ヒトであることが好ましい。ATP合成酵素は精製された状態であってもよく、ミトコンドリア画分の状態であってもよい。ATP合成酵素の精製は、Aggeler R et al., J. Biol. Chem., 277(37): 33906-12 (2002), "Afunctionally active human F1FO ATPase can be purified byimmunocapture from heart tissue and fibroblast cell lines. Subunit structureand activity studies."及び非特許文献１２等に記載されている公知の方法に従って行うことができる。ミトコンドリア画分の調製は、Mitochondria Isolation Kit（製品コード：MITO-ISO1；シグマ社製）等の市販のキットを用いて行うことができる。
【００１７】
本同定方法は、ATP合成酵素の阻害を測定可能な試験系で実施される。ATP合成酵素の阻害を測定可能な試験系は、インビトロの試験系でよく、インビボの試験系でもよい。ATP合成酵素の阻害を測定可能な試験系として、例えば、ATP合成酵素遺伝子の発現阻害を測定可能な試験系、ATP合成酵素の活性阻害を測定可能な試験系を挙げることができる。
【００１８】
ATP合成酵素遺伝子の発現阻害を測定可能な試験系として、例えば、ATP合成酵素遺伝子を発現する細胞の試験系を例示できる。細胞の由来生物種は特に限定されないが、好ましく哺乳動物細胞、さらに好ましくヒト由来の細胞を例示できる。細胞は、初代培養でもよく、樹立した細胞株でもよい。ATP合成酵素遺伝子を発現する細胞として、例えば、脾細胞、単球、リンパ球（Ｔリンパ球、Ｂリンパ球）、ＴＨＰ−１細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞を例示できる。被験化合物存在下でこれらの細胞を培養し、培養後の該細胞の細胞溶解液に含まれるATP合成酵素遺伝子の転写産物（メッセンジャーRNA）及び／又は翻訳産物を、RT-PCR法、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法等により測定することによって、被験化合物によるATP合成酵素遺伝子の発現阻害の有無及び／又はその程度を確認可能である。本試験系に被験化合物を混在させる場合には、該細胞内に被験化合物を導入してもよく、該細胞の培養上清に添加してもよい。これらの導入又は添加は、該細胞の培養からATP合成酵素遺伝子の転写産物及び／又は翻訳産物の測定までの過程のいずれの時であってもよい。被験化合物が核酸の場合には、該細胞に導入することが好ましい。被験化合物が核酸の場合、自体公知の遺伝子導入方法（リン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法など）により、被験化合物を細胞に導入可能である。本試験系において、例えば、１）被験化合物存在下、ATP合成酵素遺伝子の発現量を測定し、２）１）で測定したATP合成酵素遺伝子の発現量と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素遺伝子の発現量を比較することにより、本同定方法を実施可能である。被験化合物存在下におけるATP合成酵素遺伝子の発現量が、被験化合物非存在下におけるATP合成酵素遺伝子の発現量と比較して、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上、最も好ましくは５０％以上低下している場合に、被験化合物はATP合成酵素を阻害すると判定できる。また、ATP合成酵素遺伝子の発現阻害を測定可能な試験系として、インビトロ転写／翻訳試験系及びインビトロ翻訳試験系を例示できる。これらの試験系を実施するための試薬が市販されている（TNT T7 Quick Coupled Transcription/Translation System等；プロメガ社製）。
【００１９】
ATP合成酵素の活性阻害を測定可能な試験系として、例えば、インビトロにおけるATP合成酵素によるATP合成活性（酵素活性）を測定する試験系を例示できる。具体的には、ATP合成酵素、リン酸及びADPを含む適当な緩衝液中において、ATP合成酵素によるATP合成反応を実施する試験系である。本試験系において、例えば、１）被験化合物存在下、ATP合成酵素のATP合成活性を測定し、２）測定したATP合成活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP合成活性を比較することにより、本同定方法を実施可能である。本試験系に被験化合物を混在させる場合には、ATP合成酵素のATP合成反応の前に被験化合物を反応溶液に添加してもよく、本反応中に被験化合物を添加してもよい。本試験系において、例えば、被験化合物存在下におけるATP合成酵素のATP合成活性が、被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP合成活性と比較して、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上、最も好ましくは５０％以上低下している場合に、被験化合物はATP合成酵素を阻害すると判定できる。ATP合成酵素のATP合成活性の測定は、例えば、基質（リン酸及びADP）の低下や生成物（ATP）の増加を測定することにより実施可能である。ATPは、例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応系により測定可能である（非特許文献１２）。
【００２０】
また、ATP合成酵素の活性阻害を測定可能な試験系として、例えば、インビトロにおけるATP合成酵素によるATP加水分解活性（酵素活性）を測定する試験系を例示できる。具体的には、ATP合成酵素及びATPを含む適当な緩衝液中において、ATP合成酵素によるATPの加水分解反応を実施する試験系である。ここで用いるATP合成酵素は、ATP加水分解活性を有する限りにおいて、例えば、ATP合成酵素F1部位でもよく、ATP合成酵素F1部位とATP合成酵素FO部位又はその一部との複合体となっていてもよい。ATP加水分解活性の測定は、市販の試薬を用いて実施可能である（ATPASE ASSAY KIT (HIGH SENSITIVITY）； INNOVA Biosciences社製）。本試験系において、例えば、１）被験化合物存在下、ATP合成酵素のATP加水分解活性を測定し、２）測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較することにより、本同定方法を実施可能である。本試験系に被験化合物を混在させる場合には、ATP合成酵素のATP加水分解反応の前に被験化合物を反応溶液に添加してもよく、本反応中に被験化合物を添加してもよい。本試験系において、例えば、被験化合物存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性が、被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性と比較して、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上、最も好ましくは５０％以上低下している場合に、被験化合物はATP合成酵素を阻害すると判定できる。ATP合成酵素のATP加水分解活性の測定は、例えば、基質であるATP及び／又は生成物である遊離リン酸を測定することにより実施可能である。
【００２１】
IL-2の産生阻害剤及びTNF-αの産生阻害剤とは、それぞれ細胞に作用させた場合及び／又は動物に投与した場合に、それぞれ細胞が産生するIL-2及びTNF-αの量を、作用及び／又は投与しなかった場合に比べて低下させるものを意味する。細胞及び動物の由来・種類は特に限定されないが、哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることが特に好ましい。IL-2は主にＴリンパ球（CD4+及びCD8+）で産生されるため、IL-2の産生阻害剤とは好ましくはＴリンパ球におけるIL-2の産生量を低下させるものを意味する。TNF-αは、単球、マクロファージ、リンパ球（Ｔリンパ球、Ｂリンパ球）、アストロサイト、線維芽細胞、好塩基球、マスト細胞、NK細胞、クッパー細胞など広範な細胞で産生され、TNF-αの産生阻害剤は、これらの細胞におけるTNF-αの産生量を低下させるものを意味し、好ましくはマクロファージ及び／又はリンパ球におけるTNF-αの産生量を低下させるものを意味する。炎症性サイトカインであるTNF-αやＴリンパ球増殖に関与するIL-2は、リウマチの病態に深く関与することが報告されている。従って、IL-2の産生阻害剤及びTNF-αの産生阻害剤は、リウマチなどの自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤として有用である。
【００２２】
IgMの産生阻害剤とは、細胞に作用させた場合及び／又は動物に投与した場合に、その細胞が産生するIgMの量を、作用及び／又は投与しなかった場合に比べて低下させるものを意味する。細胞及び動物の由来・種類は特に限定されないが、哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることが特に好ましい。IgMは、Ｂリンパ球から産生される為、IgMの産生阻害剤とは好ましくはＢリンパ球から産生されるIgMの産生量を低下させるものを意味する。リウマトイド因子は主にIgMに属し、リウマチ等の自己免疫疾患の病態と関与することが報告されている。従って、IgMの産生阻害剤は、リウマチなどの自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤として有用である。
【００２３】
リンパ球の幼若化抑制剤とは、細胞に作用させた場合及び／又は動物に投与した場合に、リンパ球の幼若化（感作抗原による特異的な刺激又はマイトジェンによる抗原非特異的な刺激に応答して幼若な細胞に分化増殖すること）を、作用及び／又は投与しなかった場合に比べて抑えるものを意味する。細胞及び動物の由来・種類は特に限定されないが、哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることが特に好ましい。リンパ球はＴリンパ球及び／又はＢリンパ球であることが好ましい。
【００２４】
自己免疫疾患とは、生体の免疫系（本来は、外来抗原に対応した生体防御機構）が自己抗原にも免疫反応を起こし、その結果誘発される疾患を意味する。自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤は、哺乳動物に投与可能な自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤を含む。哺乳動物として、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、サル、ウシなどが例示される。自己免疫疾患は、特に限定されないが、IL-2及び／又はTNF-αがその疾患の発症や増悪に関与する自己免疫疾患が好ましく、例えば、関節リウマチ、クローン病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、全身性硬化症及び喘息が挙げられる。
【００２５】
一般的に、インビトロスクリーニングのみにより医薬又はその候補化合物が見出されるとは限らない。最近では、インビトロスクリーニングで多数の検体を高速で調べることのできる自動化されたハイスル−プットスクリーニング系が導入されているが、１）ハイスル−プットスクリーニングによって選択された化合物（例えば、ヒット化合物やシード化合物と呼ばれることもある）の中から、化学修飾により活性、薬物動態、及び安全性等の資質の改善が見込める化合物（例えば、リード化合物と呼ばれることもある）が選択され、２）その選択された化合物を化学修飾した化合物について、生物活性（インビトロ、インビボ）、物性、薬物動態、及び安全性などが評価され、３）その評価に基づいて化学修飾された化合物の中から好ましい化合物がさらに選択される。４）そして、このような化学修飾、評価、及び選択が繰り返され、最終的に医薬として資質が高いと考え得る化合物が臨床試験に供与される医薬の候補化合物となる。以上の１）〜４）の過程を経て、医薬品が創製される場合もある。
【００２６】
従って、例えば、ヒトに投与可能な自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の開発を最終目的とし、生物活性評価系としてATP合成酵素阻害のアッセイ系を導入した薬剤創製過程においてATP合成酵素阻害化合物を選抜する行為は、本同定方法の範囲に含まれる。例えば、ヒトに投与可能な自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の開発を最終目的とし、ATP合成酵素阻害を指標とするハイスル−プットスクリーニング系を構築し、そのスクリーニング系でヒット化合物やリード化合物をスクリーニングする行為、又は、それらの修飾化合物の中からATP合成酵素阻害化合物を選抜する行為も、本同定方法に含まれる。
【００２７】
本同定方法で同定されたIL-2の産生阻害剤、TNF-αの産生阻害剤、IgMの産生阻害剤、リンパ球の幼若化抑制剤、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分は、それぞれ、適当な医薬担体と組合せて自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤として用いられる。製剤化にあたっては、その剤形に応じて適切な製剤用添加物を用いることができる。このような製剤用添加物として、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、pH調節剤、安定化剤等を用いることができる。投与経路は、全身投与であってもよく、局所投与であってもよい。投与経路は、疾患や症状に応じて選択する。例えば、静脈投与、動脈投与、皮下、皮内、又は筋肉内投与を選択することができる。必要な用量範囲は、有効成分の有効性、疾患、患者の症状、投与経路、及び担当医師の判断等によるが、一般的には、患者の体重１ｋｇあたり０．１乃至１００μｇ程度である。経口投与に適する製剤の例として、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤を挙げることができる。非経口投与に適する製剤の例として、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリ−ム剤、貼付剤を例示できる。
【実施例】
【００２８】
（実施例１：抗リウマチ化合物を固定した磁性ナノビーズの製造）
以下の方法に従って、下記式（１）で示される抗リウマチ化合物（特開平９−５９２３６の実施例３０に記載の化合物、以下、化合物Ａと称する）を磁性ナノビーズに共有結合させることにより、抗リウマチ化合物を固定化した磁性ナノビーズを製造した。
【００２９】
【化１】
【００３０】
特開平９−５９２３６に開示されている方法に従って、化合物Ａを合成した。特願２００４−２８０６７９に開示されている方法に従って、カルボキシル化磁性ナノビーズを製造した。特開平１０−１９５０９９に開示されている方法に従って、両者を共有結合させるためのカルボキシル化スペーサーを合成し、カルボキシル化スペーサーとカルボキシル化磁性ナノビーズとを共有結合させた。なお、カルボキシル化磁性ナノビーズの代わりにスチレン−グリシジルメタクリレート重合体を用いることも可能であり、本重合体は、特開平１０−１９５０９９に開示されている方法に従って製造できる。
【００３１】
こうして得られたナノビーズに化合物Ａを以下の方法により共有結合させた。まず、ナノビーズ（５ｍｇ）を超純水（０．５ｍＬ）とメタノール（０．５ｍＬ）で洗浄した。ナノビーズをメタノール（０．１ｍＬ）に懸濁させ、脱水ジオキサン（０．５ｍＬ）を添加してナノビーズを洗浄した。さらに、脱水ジオキサン（０．５ｍＬ）を用いてナノビーズを２回洗浄した。ナノビーズを脱水ジオキサン（０．５ｍＬ）に懸濁し、ナノビーズ懸濁液を調製した。また、化合物Ａを脱水ジオキサンに溶解し、化合物Ａ溶液（２ｍＭ及び２０ｍＭ）を調製した。調製したナノビーズ懸濁液と化合物Ａ溶液とを、以下の表１に示す組成で混合し、最終液量を１ｍＬとした。
【００３２】
【表１】
【００３３】
各混合液に３８．４ｍｇの（１−エチル−［３−ジメチルアミノプロピル］）カルボジイミド・塩酸塩（EDC；ナカライテスク社製）を添加し、室温で１６時間撹拌し、化合物Ａとナノビーズの共有結合反応を行った。反応溶液を１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去し、残留物に０．５ｍＬのエタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．０）を添加し、ローテーターにより４℃で１６時間撹拌し、マスキング反応を行った。反応溶液を１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去し、残留物を超純水（０．５ｍＬ）で５回洗浄した後、超純水に再懸濁し、使用するまで４℃で保存した。
【００３４】
こうして得られた懸濁液に含まれる化合物Ａ固定化磁性ナノビーズ量を以下の方法に従って測定した。まず、懸濁液を遠心して得られた残留物を、定沸点塩酸（ナカライテスク社製）中、１１０℃で２４時間加水分解し、反応液を乾固させた。乾固物をトリエチルアミン−水−エタノール混合液（容積比２：９：９）に溶解し、この溶液の吸光度（２４５ｎｍ）を分光光度計（ＤＵ６４０；ベックマン社製）で測定し、遊離した化合物Ａの濃度を算出した。算出した結果、磁性ナノビーズに対して化合物Ａが固定化されていることを確認した。
【００３５】
（実施例２：質量分析法による化合物Ａ固定化磁性ナノビーズに結合するタンパク質の同定）
特開平９−５９２３６に開示されているように、化合物Ａは抗リウマチ活性を示す。しかし、化合物Ａがいかなる生理活性物質に作用し、抗リウマチ活性を示すのかは不明であった。そこで、実施例１で製造した化合物Ａ固定化磁性ナノビーズを用いて、化合物Ａが結合するタンパク質を精製し、同定した。
【００３６】
（１）マウス脾細胞の調製
ｄｄＹマウス（雄性、１０週齢；Ｓｌｃより購入）の頸椎を脱臼させた後、脾臓を摘出した。摘出した脾臓を１０ｍＭリン酸塩緩衝液−０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ＰＢＳ；Ｔａｋａｒａ社製）に懸濁し、スライドガラスを用いて単細胞懸濁液を調製した。この懸濁液をセルストレイナー（ベクトン・ディッキンソン社製）に通して、脾細胞を遠心チューブに集め、ＰＢＳ（４０ｍＬ）に懸濁し、この細胞懸濁液を遠心（２００ｇ、４℃、１０分間）した。遠心により得られた細胞を溶血試薬（５ｍＬ、IOTest3；ベックマン・コールター社製）に懸濁して、室温で１分間放置した。この懸濁液にＰＢＳ（２０ｍＬ）を添加して、再度同様の遠心処理を行い、得られた脾細胞をペレットとして洗浄した。この脾細胞ペレットをＰＢＳ（４０ｍＬ）に懸濁し、セルストレイナーを通して、細胞凝集塊を除去した。この懸濁液の細胞濃度を血球計算盤で測定し、懸濁液に含まれる総細胞数を求めた。この懸濁液に再度同様の遠心処理を行った後、上清をピペットで完全に除去した。得られた脾細胞ペレットは使用するまで−８０℃で保存した。
【００３７】
（２）マウス脾細胞の全細胞溶解液の調製
上記（１）で得られたマウス脾細胞に対して、その容積の５倍量の細胞溶解液（ＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍ；シグマ社製）を加え、得られた溶液をロータリーシェーカーで３０分撹拌した後、遠心（２０，４００ｇ、１５分間）した。上清をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（ＭＷＣＯ ３．５ｋＤａ；ピアース社製）を用いて透析バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．１％（ｖ／ｖ）プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）、ｐＨ７．５）に対して一晩透析した。透析後の溶液を遠心（２０，４００ｇ、３０分間）し、その上清を全細胞溶解液（以下、ＷＣＬと略する）とした。得られたＷＣＬは使用するまで−８０℃で保存した。
【００３８】
（３）化合物Ａ固定化磁性ナノビーズに結合するタンパク質の検出及び精製
上記（２）で得られたＷＣＬ（１ｍｇ）に結合バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．１％（ｖ／ｖ）プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）、ｐＨ７．５）を加え４５０μＬとした。そこへ実施例１で得られた化合物Ａ固定化磁性ナノビーズ（磁性ナノビーズ１ｍｇ当たり２２．６ｎｍｏｌの化合物Ａが固定されている）あるいは化合物Ａを固定していない磁性ナノビーズを２５、５０、１００又は２５０μｇ（結合バッファー５０μＬに懸濁）を添加し、混合し、４℃で２時間、結合反応を行った。この反応溶液を遠心（２０，４００ｇ、５分間）して得たビーズを結合バッファーで３回洗浄した。ビーズに１００μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）サンプルバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ、１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール、０．０２５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）を添加し、１００℃で５分間加熱してビーズに結合しているタンパク質を溶出した。溶出液を遠心した後、上清に３００μＬの冷却アセトンを添加して−８０℃で３０分間静置した。この溶液を遠心（２０，４００ｇ、３０分間）して得た沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（１０μＬ）に溶解し、１００℃で５分間加熱した。加熱後の溶液（以下、結合タンパク質電気泳動用サンプルと称する）８μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５−２０％グラジエントゲル（ＤＲＣ社製）、２００Ｖ定電圧、１時間）処理した。泳動後のゲルを銀染色（２Ｄ−銀染色試薬ＩＩ「第一」；第一化学薬品社製）し、タンパク質のバンドを検出した。
【００３９】
電気泳動の結果を図１に示す。電気泳動のバンドのパターンは、化合物Ａを固定した磁性ナノビーズと固定していない磁性ナノビーズとで似通っていたが、図１の矢印で示した約５２ｋＤａのバンドは、化合物Ａ固定化磁性ナノビーズでのみ検出されたことから、このタンパク質は化合物Ａ特異的に結合していることが示唆された。
【００４０】
（４）質量分析による化合物Ａ固定化磁性ナノビーズに結合するタンパク質の同定
このバンドは再現性よく検出されることが確認できたため、質量分析によりタンパク質の同定を行った。
【００４１】
上記（２）で得られたＷＣＬ（１ｍｇ）に結合バッファーを加え４５０μＬとした。そのＷＣＬ溶液を４℃、１時間のプレインキュベーション後、遠心処理（２０，４００ｇ、５分間）して得られた上清に化合物Ａ固定化磁性ナノビーズ（磁性ナノビーズ１ｍｇ当たり２２．６ｎｍｏｌの化合物Ａが固定されている）又は化合物Ａを固定していない磁性ナノビーズを１００μｇ（結合バッファー５０μＬに懸濁）添加し、混合し、４℃で２時間、結合反応を行った。この反応溶液を遠心（２０，４００ｇ、５分間）して得たビーズを結合バッファーで３回洗浄した。ビーズに１００μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加し、１００℃で５分間加熱してビーズに結合しているタンパク質を溶出した。溶出液を遠心した後、上清に３００μＬの冷却アセトンを添加して−８０℃で３０分間静置した。この溶液を遠心（２０，４００ｇ、３０分間）して得た沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（１０μＬ）に溶解し、１００℃で５分間加熱した。結合タンパク質電気泳動用サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５−２０％グラジエントゲル、２００Ｖ定電圧、１時間）に供した。泳動及び銀染色処理（ＷＡＫＯ社製キット）後、分子量が５２ｋＤａに相当するバンドを切り出した。
【００４２】
切り出したゲルを脱色し、トリプシン溶液（トリスバッファー、ｐＨ８．０に溶解）を加え、３５℃で２０時間の消化処理を行った。消化した溶液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ装置に供与して、質量分析によるタンパク質の同定を行った。質量分析に用いた分析カラムはＭａｇｉｃＣ１８（Michrom BioResources社製）、溶出液はアセトニトリル（溶媒Ａ：２％、溶媒Ｂ９０％）とした。溶出液の流速を２５０〜３００ｎＬ／分に、グラジエントを５〜９５％Ｂとした。溶出されたペプチドを、Ｎａｎｏｆｌｏｗ−ＬＣ−ＥＳＩのＱ−Ｔｏｆ２（MicroMass社製）によって分析し、分析により得られたペプチドのアミノ酸配列をクエリーとして、ＮＣＢＩ（ｎｒ）データベースに対して検索処理を行い、タンパク質を同定した。
【００４３】
その結果、化合物Ａ固定化磁性ナノビーズに結合するタンパク質として、ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, alphasubunit, isoform 1（以下、ATP合成酵素サブユニットαと称する）が同定された。一方、化合物Ａを固定していない磁性ナノビーズ由来の試料を泳動したレーンにおいては、ATP合成酵素サブユニットαと同分子量位置のバンドから有意のスコアでヒットするタンパク質が検出されなかった。
【００４４】
（実施例３：ウエスタンブロット法による化合物Ａ固定化磁性ナノビーズに結合するタンパク質の確認）
実施例２で用いた結合タンパク質電気泳動用サンプルを５−２０％グラジエントゲルに負荷して、２００Ｖの定電圧で１時間、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。泳動後のゲルをＳｅｑｕｉ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ膜（バイオラッド社製）に１０Ｖで１時間転写した後、Ｂｌｏｃｋａｃｅ（大日本製薬社製）で一晩ブロッキング処理した。一次抗体としてＢｌｏｃｋａｃｅ：ＴＢＳ−Ｔ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）＝１：３の混合溶液で１，０００倍に希釈したanti-OxPhos Complex V subunit α, monoclonal 7H10（＃Ａ２１３５０、モレキュラープローブズ社製；抗ATP合成酵素サブユニットα抗体）を用いて室温で１時間インキュベート処理した。その後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、Ｂｌｏｃｋａｃｅ：ＴＢＳ−Ｔ＝１：３の混合溶液で１，０００倍希釈した二次抗体（Anti-mouse IgG-HRP（セルシグナリング社製；＃７０７６））を用いて室温で１時間インキュベート処理した。化学発光の基質にECL Plus western blotting detection reagents（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用い、FAS-1000Lumino Imaging Analyzer（ＴＯＹＯＢＯ社製）で化学発光を検出することにより、化合物Ａ固定化磁性ナノビーズに結合したタンパク質を検出した。
【００４５】
図２Ａに化合物Ａ固定化磁性ナノビーズに結合したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。また、図２Ｂにウエスタンブロッティングの結果を示す。実施例２と同様に、ATP合成酵素サブユニットαは、化合物Ａ固定化磁性ナノビーズへの結合タンパク質として検出された一方、化合物Ａを固定していない磁性ナノビーズでは検出されなかったことから、ATP合成酵素サブユニットαは化合物Ａに特異的に結合することが示唆された。
【００４６】
（実施例４：化合物固定化磁性ナノビーズを用いた特異性の確認）
化合物Ａ以外の３種類の化合物をそれぞれ磁性ナノビーズに固定した、化合物固定化磁性ナノビーズに対するATP合成酵素サブユニットαの結合性を調べ、ATP合成酵素サブユニットαが化合物Ａに特異的に結合するか否かを確認した。
（１）化合物固定化磁性ナノビーズの製造
【００４７】
使用した３種類の化合物は、下記式（２）で示される抗アレルギー化合物（以下、化合物Ｂと称する）及び２種類の抗糖尿病化合物（化合物Ｃ及びＤと称する）である。
【００４８】
【化２】
【００４９】
実施例１と同様の方法に従って、化合物Ｂを固定化した磁性ナノビーズを製造した。具体的には、実施例１で用いたカルボキシル化磁性ビーズを、脱水ジオキサン（５００μL）にて３回洗浄後、脱水ジオキサン（１ｍL）に懸濁した。この懸濁液にN-hydroxysuccinimide（１M、200μL；ペプチド研究所製）とEDC（38.4mg）をともに添加した後、室温で2時間インキュベーションした。その後、DMF（500μL）にて3回洗浄した磁性ビーズに化合物Ｂ溶液（DMFに溶解させたもの）を表２に示すように混合し、この混合溶液にトリエチルアミン（100mM、50μL）を添加した後、37℃で3時間ローテーターを用いて攪拌することによって、カルボキシル化磁性ビーズへの化合物Ｂの固定化反応を行った。
【００５０】
カルボキシル化磁性ビーズに固定化された化合物Ｂを定量するために、攪拌後の混合溶液を遠心処理してその上清を回収した。さらに、攪拌後の混合溶液から反応後のカルボキシル化磁性ビーズを回収し、回収したビーズに1M エタノールアミン（pH8.0）500μLを添加して、4℃で一晩ローテーターを用いて攪拌した。次いで、攪拌した溶液を遠心処理して、反応後のカルボキシル化磁性ビーズを回収し、回収した反応後のカルボキシル化磁性ビーズを水に懸濁して使用時まで4℃で保存した。
【００５１】
固定化化合物量の定量は以下のように行った。すなわち、上記で得た上清5μLをWaters社製HPLC（使用カラム：Symmetry C18 4.6×250mm：酢酸アンモニウム94‐20％グラジェント）にて分析し、遊離したスクシンイミドを標準品のピーク面積から作成した標準直線から定量して、ビーズに固定化した化合物量を求めた。
【００５２】
化合物Ｃ及びＤについても、化合物Ｂと同様に磁性ナノビーズに固定化した。
【００５３】
【表２】
【００５４】
（２）ATP合成酵素サブユニットαの化合物固定化磁性ナノビーズへの結合の有無の検討
実施例２で得られたＷＣＬ（１ｍｇ）に結合バッファーを加え４５０μＬとした。そのＷＣＬ溶液を４℃、１時間のプレインキュベーション後、遠心処理（２０，４００ｇ、５分間）して得られた上清に化合物（化合物Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤ）固定化磁性ナノビーズ（１ｍｇビーズ当たりの化合物Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの固定化量は、それぞれ２３．３、１８７、１５７．２及び２４８ｎｍoｌ）又は化合物を固定していない磁性ナノビーズを１００μｇ（結合バッファー５０μＬに懸濁）添加し、混合し、４℃で２時間、結合反応を行った。この反応溶液を遠心（２０，４００ｇ、５分間）して得たビーズを結合バッファーで３回洗浄した。ビーズに１００μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加し、１００℃で５分間加熱してビーズに結合しているタンパク質を溶出した。溶出液を遠心した後、上清に３００μＬの冷却アセトンを添加して−８０℃で３０分間静置した。この溶液を遠心（２０，４００ｇ、３０分間）して得た沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（１０μＬ）に溶解し、１００℃で５分間加熱した。化合物Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤを固定化した磁性ナノビーズを用いて得られた結合タンパク質電気泳動用サンプル（それぞれ５．０、０．６２、０．７４及び０．４７μＬ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５−２０％グラジエントゲル、２００Ｖ定電圧、１時間）に供した。泳動後のゲルを銀染色処理及びウエスタンブロッティング処理（実施例３と同様の処理）した。
【００５５】
４種類の化合物固定化磁性ナノビーズへのATP合成酵素サブユニットαの結合の有無を調べた結果を図３に示す。ビーズに結合する総タンパク質量は固定化された化合物によって異なっているが、ウエスタンブロット法による検出では、ATP合成酵素サブユニットα（矢印で示されるバンド）は化合物Ａ固定化磁性ナノビーズでのみ検出され、他の化合物（化合物Ｂ、Ｃ及びＤ）固定化磁性ナノビーズでは検出されていなかったことから、ATP合成酵素サブユニットαは化合物Ａと特異的に結合することが確認された。
【００５６】
（実施例５：化合物ＡによるATP合成酵素活性阻害）
実施例４においてATP合成酵素サブユニットαが化合物Ａに特異的に結合することが確認されたため、次に、化合物ＡがATP合成酵素活性を阻害するか否かを検討した。
【００５７】
（１）ATP合成酵素標品としてのミトコンドリア画分の調製
ミトコンドリア画分の調製は、Mitochondria Isolation Kit（製品コード：MITO-ISO1；シグマ社製）を用い、キット付属の手順書に準じて行った。
【００５８】
１００ｎＭビタミンＤ３（Ｗａｋｏ社製）及び１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清；Moregate社製）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ社製）にて大量培養して得たＴＨＰ−１細胞をＰＢＳにて２回洗浄した後に凍結保存した。この凍結保存したＴＨＰ−１細胞ペレット（３００μＬ）に１０倍量の冷却した１×抽出バッファーＡ（キット付属）とプロテアーゼインヒビターカクテル（終濃度１％；シグマ社製）を添加した。氷上で７ｍＬ容量のポッター型ホモジナイザーにて３０ストロークのホモジナイズ後に、遠心処理（６００ｇ、５分間；本処理を遠心処理１と称する）し、上清をさらに遠心処理（１１，０００ｇ、１０分間；本処理を遠心処理２と称する）し、沈殿物を回収した。得られた沈殿物を再度１０倍量の抽出バッファーＡで懸濁し、この懸濁液を遠心処理（６００ｇ、５分間）し、その上清を遠心処理（１１，０００ｇ、１０分間）した。得られた沈殿物をスクロースバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．２５Ｍ スクロース、０．１％（ｖ／ｖ）プロテアーゼインヒビターカクテル）に懸濁したものをミトコンドリア画分とした。
【００５９】
凍結保存ＴＨＰ−１細胞ペレットに５倍量のＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍを加え、この溶液をロータリーシェーカーで１５分撹拌した後に、遠心処理（２０，０００ｇ、１５分間）して得られた上清をＴＨＰ−１細胞溶解液（ＴＨＰ−１ ＷＣＬと称する）とした。
【００６０】
遠心処理１により得られた沈殿物に５倍量のＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍを加え、この溶液をロータリーシェーカーで１５分撹拌した後に、遠心処理（２０，０００ｇ、１５分間）して得られた上清をＣｆｇ（６００ｇ）ｐｐｔと称する。また、遠心処理２により得られた上清をＣｆｇ（１１，０００ｇ）ｓｕｐと称する。
【００６１】
ＴＨＰ−１ ＷＣＬ、Ｃｆｇ（６００ｇ）ｐｐｔ、Ｃｆｇ（１１，０００ｇ）ｓｕｐ及びミトコンドリア画分の純度を以下の方法に従って確認した。
【００６２】
各画分をBradford Protein Assay Reagent（バイオラッド社製）を用いてタンパク質定量した後、タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように各画分のサンプルを調整し、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに混合し、１００℃で５分間加熱した。サンプルを５−２０％グラジエントゲルに負荷し（銀染色用に０．５μｇ、ウエスタンブロット用に５μｇ）、２００Ｖの定電圧で１時間電気泳動した。泳動後のゲルを銀染色し、タンパク質のバンドを検出した。同様に泳動して得られたタンパク質をＳｅｑｕｉ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ膜に１０Ｖで１時間転写した後、Ｂｌｏｃｋａｃｅで一晩ブロッキングした。ATP合成酵素サブユニットαの検出は実施例３と同じ条件で行い、チトクロムＣの検出は、一次抗体にＢｌｏｃｋａｃｅ：ＴＢＳ−Ｔ＝１：３の混合溶液で５００倍に希釈したCytochrome C(A-8)（サンタクルーズバイオテクノロジー社製；カタログ番号ｓｃ−１３１５６）を、二次抗体にＢｌｏｃｋａｃｅ：ＴＢＳ−Ｔ＝１：３の混合溶液で１０００倍に希釈したAnti-mouse IgG-HRP（セルシグナリング社製；♯７０７６）を用いて行った。
【００６３】
銀染色及びウエスタンブロットによる分画状態の確認結果を図４に示す。ウエスタンブロット解析の結果、調製したミトコンドリア画分は、ミトコンドリアに存在することが知られているチトクロムＣが濃縮されていること、及びATP合成酵素サブユニットαのバンドが強く検出されたことから、ATP合成酵素サブユニットαを含むミトコンドリア画分を取得できたことが確認された。このミトコンドリア画分（以下、ATP合成酵素標品と称する）を被験化合物のATP合成酵素阻害活性の測定に用いた。
【００６４】
（２）化合物ＡによるATP合成酵素阻害活性の測定
化合物ＡのATP合成酵素阻害活性の測定をInnova Biosciences社のATPase assay kit (high sensitivity)を用いて、キット付属の指示書に従い実施した。
【００６５】
具体的には、キットに付属の基質溶液（SB mix）及び反応停止液（Gold mix）を調製した後、９６ウェルプレートに適宜希釈したATP合成酵素標品及び化合物Ａをスクロースバッファーと合わせて１００μＬとなるように添加し、２５℃、５分間プレインキュベーションを行った。その後、各ウェルに１００μＬのSB mixを添加し、２５℃、３０分間のインキュベーションにより酵素反応（ATP加水分解反応）を行い、各ウェルに５０μＬのGold mixを添加することにより酵素反応を停止させた。その２分後に２０μＬの安定化剤を加え、２５℃、３０分間インキュベートした後、６３０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（Benchmark、バイオラッド社製）により測定した。測定はｎ＝１とし、測定値はサンプル毎にブランク（基質添加前にGold mixを添加して反応を停止）をおいて各サンプル吸光度から差し引いた。基質添加時の酵素量は２μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯあるいは化合物は１％（２μＬ）となるように添加した。
【００６６】
化合物Ａのほかに、ATP合成酵素の特異的な阻害剤であるOligomycin A（フルカ社製）及びAurovertin B（シグマ社製）を陽性対照として用いた。さらに、化合物Ｂ並びに他のリウマチ化合物である式（３）で示される化合物（以下、化合物Ｅと称する；特開平９−５９２３６の実施例３２に開示されている方法に従って合成した）及び式（５）で示される化合物（以下、化合物Ｇと称する；後述の実施例において合成方法を示す）についても、ATP合成酵素阻害活性の有無を検討した。
【００６７】
【化３】
【００６８】
【化４】
【００６９】
反応溶液における化合物Ａ、Ｂ、Ｅ及びＧの終濃度が５０、２５０又は５００μＭとなるように、それぞれの化合物を反応溶液に添加した。反応溶液におけるOligomycin Aの終濃度は０．００１、０．０１又は０．１μＭとなるように、またAurovertin Bの終濃度は０．５、５又は５０μＭとなるように、それぞれの化合物を反応溶液に添加した。
【００７０】
各化合物がATP加水分解阻害活性を有するか否かを検討した結果を図５に示す。Oligomycin A及びAurovertin Bは、ATP合成酵素を阻害した。化合物Ａ、Ｇ及びＥについても同様にATP合成酵素阻害活性が認められ、阻害強度はＧ、Ａ、Ｅの順に強かった。一方、化合物Ｂには、ATP合成酵素阻害活性はほとんど認められなかった。
【００７１】
（実施例６：抗リウマチ化合物によるマイトジェン刺激マウス脾細胞幼若化抑制活性）
以上の実施例の結果から、抗リウマチ化合物はATP合成酵素サブユニットαに結合し、ATP合成酵素を阻害することにより、抗リウマチ活性を示すものと考えられた。
【００７２】
ある化合物が抗リウマチ活性を有するか否かを確認する実験として、マイトジェン（コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）、リポ多糖（ＬＰＳ））刺激によるＴ又はＢリンパ球幼若化の抑制試験が広く行われている。
【００７３】
そこで化合物Ａ及びＥ並びに他のリウマチ化合物である式（４）で示される化合物（以下、化合物Ｆと称する；後述の方法により合成）について、マウス脾細胞の幼若化抑制活性の有無を検討した。
【００７４】
【化５】
【００７５】
ｄｄＹマウス２匹（１０週齢、雄性；Ｓｌｃより購入）の脾臓を摘出し、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ギブコ社製）にて無菌処理後に、スライドガラスを用いて単細胞として１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（以下、ＲＰＭＩ−１０と称する）にて脾細胞懸濁液を調製した。この懸濁液を遠心処理（４℃、２００ｇ、１０分間）して得た細胞ペレットに２ｍＬのIOTest3溶液を加えて室温で１分間放置して溶血した。この溶液に８ｍＬのＲＰＭＩ−１０を添加して再度同様の遠心処理をして得た細胞を１０ｍＬのＲＰＭＩ−１０にて２回洗浄して得た細胞ペレットをＲＰＭＩ−１０（１０ｍＬ）に再懸濁した。血球計算盤を用いて細胞濃度を測定し、５×１０６個／ｍＬの脾細胞懸濁液を調製した。
【００７６】
４％ＤＭＳＯ含有ＲＰＭＩ−１０にて段階希釈して調製した抗リウマチ化合物溶液（化合物Ａ、Ｅ及びＦ）５０μＬを９６ウェルプレートに添加し（ｎ＝３）、これにＲＰＭＩ−１０に溶解したＣｏｎＡ（終濃度１μｇ／ｍＬ；シグマ社製）又はＬＰＳ（終濃度１００μｇ／ｍＬ；カルビオケム社製）５０μＬ、脾細胞懸濁液１００μＬを添加、混合して、５％ＣＯ２下、３７℃にてインキュベーションした。
【００７７】
３日後にCell Counting Kit-8（ＷＳＴ−８；同仁化学研究所社製）を各ウェルに１０μＬ添加して、添加時と１日後に吸光度（４５０−５９５ｎｍ）をマイクロプレートリーダーで測定することにより、幼若化を評価した。結果を図６に示す。図６から明らかなように、すべての化合物は、ＣｏｎＡ及びＬＰＳ刺激によるＴ及びＢリンパ球の幼若化を顕著に抑制することが判明した。
【００７８】
（実施例７：ATP合成酵素阻害剤によるマイトジェン刺激マウス脾細胞幼若化抑制活性）
特異的なATP合成阻害剤として周知のOligomycin A及びAurovertin Bについて、抗リウマチ活性を示すか否かを検討するため、実施例６と同様に、両化合物の脾細胞幼若化抑制活性の有無について検討した。
【００７９】
ｄｄＹマウス２匹（１２週齢、雄性）から得た脾臓を実施例６と同様に処理して、１×１０７個／ｍＬの脾細胞懸濁液を調製した。４％ＤＭＳＯ含有ＲＰＭＩ−１０に溶解したOligomycin A及びAurovertin Bを５０μＬ、ＲＰＭＩ−１０に溶解したＣｏｎＡ（終濃度１μｇ／ｍＬ）又はＬＰＳ（終濃度１００μｇ／ｍＬ）５０μＬ、細胞懸濁液１００μＬを、それぞれ９６ウェルプレートに添加、混合して、５％ＣＯ２下、３７℃にて３日間インキュベーションした。ＷＳＴ−８を各ウェルに１０μＬ添加して、添加時と５時間後に吸光度（４５０−５９５ｎｍ）をマイクロプレートリーダーで測定することにより、幼若化を評価した。結果を図７に示す。図７から明らかなように、Oligomycin A及びAurovertin Bは、ＣｏｎＡ及びＬＰＳ刺激によるＴ及びＢリンパ球の幼若化を顕著に抑制することが判明した。
【００８０】
（実施例８：ATP合成酵素阻害剤によるマウス脾細胞のサイトカイン産生阻害）
炎症性サイトカインであるTNF−αやＴリンパ球増殖に関与するＩＬ−２は、リウマチの病態に深く関与することが報告されている。そこで、ATP合成酵素の特異的な阻害剤であるOligomycin A及びAurovertin Bが、これらサイトカインの産生を阻害するか否かについて検討した。
【００８１】
（１）ATP合成酵素阻害剤によるマウス脾細胞のＩＬ−２産生阻害
実施例６と同様に、ｄｄＹマウスから脾細胞を調製し、５×１０６個／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ−１０に懸濁させた。マイトジェンとしてＣｏｎＡ（終濃度１μｇ／ｍＬ）を使用した。Oligomycin A及びAurovertin Bを４％ＤＭＳＯ／ＲＰＭＩ−１０にて段階希釈して被験溶液を作製した。Oligomycin A又はAurovertin Bを５０μＬ、脾細胞懸濁液１００μＬ及びＣｏｎＡ５０μＬを９６ウェルプレートに添加し、５％ＣＯ２下、３７℃にて１日培養した。培養後にＣｏｎＡ添加及び非添加のプレートから、培養上清を１５０μＬ回収した。培養終了の４時間前にＷＳＴ−８を各ウェルに１０μＬずつ添加し、添加時と上清回収時に吸光度（４５０−５９５ｎｍ）をマイクロプレートリーダーで測定した。回収した培養上清のＩＬ−２濃度をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社製）にてキット付属のプロトコール通りに行い定量した。結果を図８Ａに示す。図８Ａから明らかなように、Oligomycin A及びAurovertin Bは、ＣｏｎＡ刺激によるマウス脾細胞のＩＬ−２産生を抑制することが確認された。
【００８２】
（２）ATP合成酵素阻害剤によるＴＨＰ−１細胞のTNF−α産生阻害
１．０×１０５個／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ−１０に懸濁したＴＨＰ−１細胞を２個のＴ７５フラスコ（浮遊用；Sumilon；住友ベークライト社製）に５０ｍＬずつ入れ、ビタミンＤ３（１ｍｇ／ｍＬ メタノール溶液；和光純薬社製）を２μＬ添加し、５％ＣＯ２下、３７℃にて培養した。４日後に培養液７５ｍＬを遠心して得たＴＨＰ−１細胞を新しいＲＰＭＩ−１０（３７．５ｍＬ）に懸濁し、ビタミンＤ３溶液を１．５４μＬ添加し、Ｔ７５フラスコに入れて、５％ＣＯ２下、３７℃にて培養した。１日後に細胞を回収して、１．５×１０６個／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ−１０／２５ｍＭ ＨＥＰＥＳに懸濁した。４００μＭのATP合成酵素阻害剤（Oligomycin A又はAurovertin B）のＤＭＳＯ溶液をＲＰＭＩ−１０／２５ｍＭ ＨＥＰＥＳにて１０倍に希釈した。ＲＰＭＩ−１０にてATP合成酵素阻害剤を段階希釈して被験溶液を作製し、９６ウェルプレートに５０μＬずつ添加した（ｎ＝３）。陰性対照には４％ＤＭＳＯ／ＲＰＭＩ−１０を用いた。４μｇ／ｍＬとなるように４％ＤＭＳＯ／ＲＰＭＩ−１０／２５ｍＭ ＨＥＰＥＳで希釈したＬＰＳを５０μＬずつ添加した。その後、ＴＨＰ−１細胞懸濁液を１００μＬ添加して、５％ＣＯ２下、３７℃にて４時間培養した。培養開始時にＷＳＴ−８を各ウェルに１０μＬずつ添加し、添加時と培養終了時に吸光度（４５０−５９５ｎｍ）をマイクロプレートリーダーで測定した。回収した培養上清のTNF−αの濃度をＯｐｔｉＥＩＡ（BD Biosciences社製）を用いてキット付属のプロトコール通りに測定した。なお、酵素基質はSubstrate Reagent Pack（Ｒ＆Ｄ社製）を使用した。結果を図８Ｂに示す。図８Ｂから明らかなように、Oligomycin A及びAurovertin Bは、ＬＰＳ刺激によるＴＨＰ−１細胞のTNF−α産生を抑制することが確認された。
【００８３】
（実施例９：抗リウマチ化合物によるIgM産生抑制）
実施例６と同様に、ｄｄＹマウスから脾細胞を調製し、５×１０６個／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ−１０に懸濁させた。マイトジェンとしてＬＰＳ（終濃度１００μｇ／ｍＬ；カルビオケム社製）を使用した。Oligomycin A、Aurovertin B、化合物Ａ、化合物Ｅ、化合物Ｆ又は化合物Ｇを５０μＬ、脾細胞懸濁液１００μＬ及びＬＰＳ５０μＬを９６ウェルプレートに添加し、５％ＣＯ２下、３７℃にて培養した。３日後，９６ウェルプレートから、培養上清１５０μＬを回収した。培養上清のIgM濃度をIgM mouse Quantitation kit EIAキット(Bethyl社製)にて添付プロトコール通りに行って定量した。なお、培養上清試料はPBS‐0.05％Tween20にて４、８、１６、３２、６４、１２８倍希釈して、１００μL／ウェルで用いた。
【００８４】
結果を図９に示す。被験化合物全て（Oligomycin A、Aurovertin B、化合物Ａ、化合物Ｅ、化合物Ｆ及び化合物Ｇ）が、マウス脾細胞のIgM産生を抑制した。リウマトイド因子である自己抗体の多くがIgMに属する。従って、実施例９の結果に基づき、ATP合成酵素阻害化合物は、Ｂリンパ球から自己抗体の産生を抑制することによっても、リウマチ等の自己免疫疾患の予防及び／又は治療効果を示すものと考えられる。
【００８５】
（化合物Ｂの合成）
【００８６】
【化６】
【００８７】
（１）3-ヒドロキシ-4-メトキシシンナモイルアントラニル酸 メチルエステル (3) の合成
3-ヒドロキシ-4-メトキシ桂皮酸（化合物1, 5.83 g, 30.0 mmol）を塩化チオニル（SOCl2,50 mL）に溶解し、N,N-ジメチルホルムアミド（20 μL）を加えて1時間加熱還流した。反応液を濃縮後、残渣にアントラニル酸（化合物2, 5.44 g, 36.0 mmol）、トリエチルアミン（6.26 mL）及びテトラヒドロフラン（100 mL）を加え、4時間加熱還流した。反応混合物を氷水400 mLに注ぎ、クロロホルム（500mL）にて抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣クロロホルム−ヘキサンより再結晶し、標記化合物3（6.81 g, 69.3%）を単黄色結晶性粉末として得た。
MS (ESI) m/z:328 (M+H)+
1H-NMR (CDCl3) δ：3.94 (3H, s), 3.96 (3H, s), 5.64 (1H, s), 6.48 (1H, d, J=15.63Hz),6.86 (1H, d, J=8.30Hz), 7.06-7.11 (1H, m), 7.16-7.21 (2H, m), 7.27 (1H, s),7.56-7.60 (1H, m), 7.69 (1H, d, J=15.63Hz), 8.06 (1H, dd, J=8.06Hz, 1.47Hz),8.87 (1H, d, J=8.59Hz), 11.29 (1H, s).
【００８８】
（２）3-[3-(t-ブトキシカルボニルアミノ)プロピル]-4-メトキシシンナモイルアントラニル酸メチルエステル (5) の合成
化合物3（4.09 g, 12.5 mmol）、N-(3-ヒドロキシプロピル)カルバミン酸 t-ブチルエステル（化合物2, 2.41 g, 13.8 mmol）及びトリフェニルホスフィン（3.61 g, 13.8mmol）をテトラヒドロフラン（60 mL）に溶解し、0℃にてアゾジカルボン酸 ジエチルエステル（2.95 mL, 18.7 mmol）を加え、室温にて3時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル = 2:1）に付し、標記化合物5（5.05 g, 83.4%）を単黄色結晶性粉末として得た。
MS (ESI) m/z:485 (M+H)+
1H-NMR (CDCl3) δ：1.47 (9H, s),2.02-2.08 (2H, m), 3.30-3.41 (2H, m), 3.92 (3H, s), 3.96(3H, s), 4.17 (2H, t, J=5.86Hz), 5.64 (1H, s), 6.47 (1H, d, J=15.38Hz), 6.86(1H, d, J=8.30Hz), 7.08-7.12 (1H, m), 7.21 (1H, d, J=1.95Hz), 7.27 (1H, s),7.55-7.60 (1H, m), 7.66 (1H, d, J=15.63Hz), 8.04-8.07 (1H, m), 8.87 (1H, d,J=8.55Hz), 11.32 (1H, s).
【００８９】
（３）3-[3-(t-ブトキシカルボニルアミノ)プロピル]-4-メトキシシンナモイルアントラニル酸 (6) の合成
化合物5（2.42 g, 4.99 mmol）をテトラヒドロフラン（40 mL）に溶解し、0.25N水酸化ナトリウム水溶液（40 mL）を加えて室温にて12時間攪拌した。反応液を氷冷した希塩酸（pH 3, 300 mL）に注ぎ込み、析出した粘調な沈殿物をクロロホルムに溶解後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去して得られた残渣をクロロホルム−ヘキサンより再結晶し、標記化合物6（1.87 g, 79.6%）を無色結晶性粉末として得た。
MS (ESI) m/z:471 (M+H)+
1H-NMR (DMSO-d6) δ：1.37 (9H, s), 1.84-1.90 (2H, m), 2.96-3.02 (2H, m), 3.50 (3H, s),4.14 (2H, t, J=5.86Hz), 6.76 (1H, d, J=15.38Hz), 7.03 (1H, d, J=8.30Hz), 7.14 (1H,t, J=7.32Hz), 7.24 (1H, dd, J=8.30Hz, 1.71Hz), 7.35 (1H, d, J=1.95Hz), 7.54 (1H,d, J=15.63Hz), 7.58-7.62 (1H, m), 8.00 (1H, dd, J=8.06Hz, 1.71Hz), 8.61 (1H,dd, J=8.55Hz, 0.98Hz), 11.29 (1H, s).
【００９０】
（４）化合物Ｂ（N-(3-アミノプロピルオキシ)-4-メトキシシンナモイルアントラニル酸 (7)）の合成
化合物6（2.32 g, 1.30 mmol）をジクロロメタン（45 mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（5 mL）を加えて室温にて1時間攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣をクロロホルム−ヘキサンより結晶化し、標記化合物7のトリフルオロ酢酸塩（2.30 g, quant.）を単黄色結晶性粉末として得た。
MS (ESI) m/z:371 (M+H)+
1H-NMR (DMSO-d6) δ：1.99-2.06 (2H, m), 3.07-3.12 (2H, m), 3.80 (3H, s), 4.04 (2H, t,J=6.10Hz), 6.75 (1H, d, J=15.63Hz), 6.84-6.86 (1H, m), 6.99 (1H, d, J=8.30Hz),7.13-7.18 (1H, m), 7.29 (1H, dd, J=7.45Hz, 1.71Hz), 7.38 (1H, d, J=1.95Hz),7.56 (1H, d, J=15.63Hz), 7.59-7.61 (1H, m), 7.99-8.02 (1H, m), 8.62 (1H, d,J=8.30Hz), 11.29 (1H, s).
【００９１】
（化合物Ｆ及び化合物Ｇの合成）
【００９２】
【化７】
【００９３】
（１）t-ブチル {3-[4-(3-{[(4-クロロフェニル)アミノ]カルボニル}-2-ニトロフェニル)ピペラジン-1-イル]プロピル}カルバメート (2) の合成
特開平09-59236に記載された方法に従って調製したN-(4-クロロフェニル)-2-ニトロ-3-ピペラジン-1-イルベンズアミド (1) 541 mg (1.5 mmol), N-Boc-3-ブロモプロピルアミン 357 mg (1.5 mmol) 及び炭酸カリウム 318 mg (2.3 mmol) のDMF懸濁液 (10 ml) を室温で2時間、50℃で2時間撹拌した。反応液に水を加え析出結晶を濾取後、これをクロロホルムに溶かし硫酸マグネシウム（無水）で脱水した後に濃縮した。この残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付しCHCl3:MeOH=10:1留分を濃縮することにより標記化合物 (2) を479 mg (収率 62%) 得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 1.44 (9H, s), 1.63-1.71 (2H, m), 2.46 (2H, t, J = 6.7 Hz),2.54-2.58 (4H, m), 3.02-3.06 (4H, m), 3.16-3.23 (2H, m), 5.26-5.32 (1H, m),7.31 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.39 (2H, d, J = 7.8 Hz), 7.49-7.54 (3H, m), 7.77(1H, s).
ESI-MS: m/z518 (M+H)+.
【００９４】
（２）化合物Ｇ（3-[4-(3-アミノプロピル)ピペラジン-1-イル]-N-(4-クロロフェニル)-2-ニトロベンズアミド (3)）の合成
t-ブチル {3-[4-(3-{[(4-クロロフェニル)アミノ]カルボニル}-2-ニトロフェニル)ピペラジン-1-イル]プロピル}カルバメート (2) 466 mg (0.9 mmol) をジクロロメタン (5 ml) に溶解し、トリフルオロ酢酸 5mlを加えた後、室温で1時間撹拌した。反応液を濃縮し、残渣に1 mol/l 塩酸-エタノール溶液を5 ml加え濃縮した。析出結晶を濾取し乾燥することにより標記化合物Ｇ(3) を370 mg (収率 81%) 得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 2.02-2.12 (2H, m), 2.87-2.96 (2H, m), 2.98-3.10 (2H, m), 3.24-3.55(8H, m), 7.41 (2H, dt, J = 9.5, 2.5 Hz), 7.66-7.77 (5H, m), 8.17 (3H, br s),10.91 (1H, s), 11.48 (1H, br s).
Anal. Calcdfor C20H24N5O3Cl 2HCl, H2O:C, 47.21; H, 5.55; N, 13.76. Found: C, 46.73; H, 5.74; N, 13.26.
ESI-MS: m/z418 (M+H)+.
【００９５】
（３）化合物Ｆ（3-[4-(3-アセチルアミノプロピル)ピペラジン-1-イル]-N-(4-クロロフェニル)-2-ニトロベンズアミド (4)）の合成
3-[4-(3-アミノプロピル)ピペラジン-1-イル]-N-(4-クロロフェニル)-2-ニトロベンズアミド (3) 10 mg （0.02 mmol), トリエチルアミン (30 μl）をジクロロメタン (0.2 ml)に溶解し、アセチルクロリド (10 μl）を加えて一晩攪拌した。反応液を濃縮し、高速液体クロマトグラフィーで精製し、標記化合物Ｆ (4)を6.5 mg (71 %) 得た。
ESI-MS: m/z 460(M+H)+.
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】実施例２の電気泳動の結果を表す写真である。Ｃは化合物Ａを固定していない磁性ナノビーズを表し、Ａは化合物Ａ固定磁性ナノビーズを表す。矢印は、化合物Ａに特異的に結合する約５２ｋＤａのタンパク質のバンドを表す。
【図２】実施例３の電気泳動及びウエスタンブロットの結果を表す写真である。Ａは電気泳動の結果を表し、Ｂはウエスタンブロットの結果を表す。矢印は、化合物Ａに特異的に結合するATP合成酵素サブユニットαのバンドを表す。
【図３】実施例４の電気泳動及びウエスタンブロットの結果を表す写真である。
【図４】実施例５の各画分の純度確認のための電気泳動及びウエスタンブロットの結果を表す写真である。
【図５】実施例５の各化合物のATP合成酵素阻害活性を表すグラフである。縦軸は６３０ｎｍにおけるΔ吸光度を、横軸は化合物の種類及び濃度を表す。
【図６】実施例６の抗リウマチ化合物による幼若化抑制活性を表すグラフである。ＡはＣｏｎＡで刺激したときの結果を、ＢはＬＰＳで刺激したときの結果を表す。
【図７】実施例７のATP合成酵素阻害剤による幼若化抑制活性を表すグラフである。ＡはＣｏｎＡで刺激したときの結果を、ＢはＬＰＳで刺激したときの結果を表す。
【図８】実施例８のATP合成酵素阻害剤によるサイトカイン産生阻害活性を表すグラフである。ＡはＣｏｎＡ刺激によるIL-2産生を阻害する結果を、ＢはＬＰＳ刺激によるTNF-α産生を阻害する結果を表す。
【図９】実施例９の抗リウマチ化合物又はATP合成酵素阻害剤によるIgM産生阻害活性を表すグラフである。Ａは化合物Ａ、Ｅ、Ｆ及びＧによるATP合成酵素阻害の結果を、ＢはATP合成酵素阻害剤によるATP合成酵素阻害の結果をそれぞれ示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法に関するものである。さらに、本発明は、リンパ球の幼若化抑制剤、インターロイキン２（Interleukin-2;IL-2）の産生阻害剤、腫瘍壊死因子α（Tumor necrosis factor-alpha; TNF-α）の産生阻害剤、免疫グロブリンＭ（Immunoglobulin M; IgM）の産生阻害剤を同定する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患は、自己に対する過剰な免疫応答によってもたらされる疾患の総称であり、例えば、関節リウマチ、クローン病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、全身性硬化症、喘息などが含まれる。何らかの遺伝的、環境的因子が作用して自己寛容が破綻すると自己免疫疾患になると考えられているが、その詳しいメカニズムは明らかにされていない。
【０００３】
多くの自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤が開発されており、例えば、特許文献１には抗リウマチ作用を示すベンズアミド化合物が開示されている。自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の開発ために簡便かつ高速な評価系が求められるが、自己免疫疾患の発症や進行に関与する分子が同定されていないこともあり、特許文献１に開示されているようなインビボ（in vivo）の評価系により化合物の評価が行われることが多い。抗リウマチ活性のインビトロ（in vitro）の評価系としてマイトジェン刺激によるＴ又はＢリンパ球幼若化の抑制試験が行われているが、細胞の調製や培養に時間がかかる等の問題点があり、ハイスループットスクリーニング（high-throughput screening; HTS）には適していない。
【０００４】
【特許文献１】特開平９−５９２３６
【非特許文献１】Hurlimann D et al., Circulation, 106(17): 2184-7 (2002), "Anti-tumornecrosis factor-alpha treatment improves endothelial function in patients withrheumatoid arthritis."
【非特許文献２】Elliott MJ et al., Lancet, 344(8930): 1105-10 (1994), "Randomiseddouble-blind comparison of chimeric monoclonal antibody to tumour necrosisfactor alpha (cA2) versus placebo in rheumatoid arthritis."
【非特許文献３】湊長博監修「免疫学―主要疾患発症のメカニズム」（メディカルサイエンスインターナショナル）1995年発行、176-181頁
【非特許文献４】Targan SR et al., N. Engl. J. Med., 337(15): 1029-35 (1997), "Ashort-term study of chimeric monoclonal antibody cA2 to tumor necrosis factoralpha for Crohn's disease. Crohn's Disease cA2 Study Group."
【非特許文献５】Stack WA et al., Lancet, 349(9051): 521-4 (1997), "Randomisedcontrolled trial of CDP571 antibody to tumour necrosis factor-alpha in Crohn'sdisease."
【非特許文献６】湊長博監修「免疫学―主要疾患発症のメカニズム」（メディカルサイエンスインターナショナル）1995年発行、169-176頁
【非特許文献７】湊長博監修「免疫学―主要疾患発症のメカニズム」（メディカルサイエンスインターナショナル）1995年発行、248-252頁
【非特許文献８】湊長博監修「免疫学―主要疾患発症のメカニズム」（メディカルサイエンスインターナショナル）1995年発行、189-195頁
【非特許文献９】湊長博監修「免疫学―主要疾患発症のメカニズム」（メディカルサイエンスインターナショナル）1995年発行、185-186頁
【非特許文献１０】Lassalle P et al., Clin. Exp. Immunol., 94(1): 105-10 (1993), "Modulationof adhesion molecule expression on endothelial cells during the late asthmaticreaction: role of macrophage-derived tumour necrosis factor-alpha."
【非特許文献１１】He XW et al., J Clin Invest. 89(2): 673-680 (1992), "Selectiveinduction of rheumatoid factors by superantigens and human helper Tcells."
【非特許文献１２】Simone Matuschka et al., Archives of biochemistry and biophysics.322(1): 135-142 (1995), "ATP Synthesis by Purified ATP-Synthase from BeefHeart Mitochondria after Coreconstitution with Bacteriorhodopsin."
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本発明は、自己免疫疾患の発症や進行に関与する分子を同定し、その分子メカニズムに基づいた自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、磁性ナノビーズを用いた研究を行ったところ、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)が自己免疫疾患に関与していることを発見した。ATP合成酵素は、ミトコンドリアの内膜などに存在し、FOとF1(F1-ATPaseと称される場合もある)の２つの部位からなり、細胞内では生体膜を介したプロトンの電気化学ポテンシャルを利用してADPと無機リン酸からATPを合成している。本発明に係る抗リウマチ化合物はF1のαサブユニットに結合し、ATP合成酵素の活性を阻害することを本発明者らは見出した。さらに、ATP合成酵素阻害剤は、Ｔ及びＢリンパ球の幼若化を抑制すること、炎症性サイトカインであるTNF-α及びIL-2並びにリウマトイド因子が属するIgMの産生を阻害することも見出した。
【０００７】
免疫細胞の幼若化、IgM産生、TNF-α産生、IL-2産生等と自己免疫疾患との関連については、以下に述べるように様々な論文で報告されている。
（１）関節リウマチ：非特許文献１には、TNF-αが関節リウマチの発症・増悪に関与することや抗TNF-α抗体療法が関節リウマチを改善することが開示されている。非特許文献２は、抗TNF-αキメラモノクローナル抗体が関節リウマチの臨床試験において治療効果を示したことを報告している。非特許文献３は、IL-1及びTNF-αが関節リウマチにおける関節破壊に関与している証拠を報告している（特に、１７７頁）。また、関節リウマチにおいて高率に検出されるリウマトイド因子（rheumatoid factor）（他の自己免疫疾患の患者由来の血清においても検出される）は、リウマチの重症度と相関する。リウマトイド因子は、IgG（免疫グロブリンＧ）のFcフラグメントに対する自己抗体であって、主としてIgM型に属する（非特許文献１１）。
（２）クローン病：非特許文献４は、抗TNF-αキメラモノクローナル抗体がクローン病の臨床試験において治療効果を示したことを報告している。非特許文献５は、TNF-αがクローン病発症に関して中心的な役割を果たしていると考えられることや、抗TNF-α抗体であるCDP571がクローン病の臨床試験において治療効果を示したことを報告している。
（３）全身性エリテマトーデス：非特許文献６は、全身性エリテマトーデスにおける広範なＢリンパ球機能異常を報告している（特に、１７０頁）。
（４）多発性硬化症：非特許文献７は、自己反応性（MBP反応性）CD4陽性ＴＨ１細胞が細胞傷害性CD8陽性Ｔリンパ球やマクロファージを刺激し、TNF-α等のサイトカインを介してオリゴデンドロサイトを傷害するという多発性硬化症のメカニズムを開示している（特に、２５０頁）。
（５）インシュリン依存性糖尿病：非特許文献８は、自己反応性CD4陽性ＴＨ１細胞が細胞傷害性CD8陽性Ｔリンパ球やマクロファージを刺激し、マクロファージから産生される細胞傷害性を有するIL-1がランゲルハンス島β細胞を攻撃するというインシュリン依存性糖尿病のメカニズムを開示している（特に、１９１頁）。
（６）全身性硬化症：非特許文献９は、活性化マクロファージが産生するTNF-αによって血管内皮細胞が損傷し、繊維化が進行することを報告している。
（７）喘息：非特許文献１０は、喘息において、マクロファージ由来のTNF-αは、血管内皮細胞に作用することでＩＣＡＭ−１やＥＬＡＭ−１の発現を増強し、好酸球や好中球の血管内皮細胞への接着に関与している可能性を示唆している。
【０００８】
本発明者らは、上記知見に基づき本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の［１］〜［１１］を提供する：
［１］ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、インターロイキン２（Interleukin-2;IL-2）の産生阻害剤の同定方法。
［２］ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、腫瘍壊死因子α（Tumornecrosis factor-alpha; TNF-α）の産生阻害剤の同定方法。
［３］ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、免疫グロブリンＭ（ImmunoglobulinM; IgM）の産生阻害剤の同定方法。
［４］以下の工程を含む、インターロイキン２（Interleukin-2;IL-2）の産生阻害剤の同定方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
［５］以下の工程を含む、腫瘍壊死因子α（Tumor necrosis factor-alpha; TNF-α）の産生阻害剤の同定方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
［６］以下の工程を含む、免疫グロブリンＭ（Immunoglobulin M; IgM）の産生阻害剤の同定方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
［７］ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、リンパ球の幼若化抑制剤の同定方法。
［８］以下の工程を含む、リンパ球の幼若化抑制剤の同定方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
［９］ ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を同定する方法。
［１０］ 以下の工程を含む、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を同定する方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
［１１］ 自己免疫疾患が、関節リウマチ、クローン病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、全身性硬化症又は喘息である、［９］又は［１０］に記載の自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を同定する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、ATP合成酵素が自己免疫疾患に関与しているという新しい知見に基づくものであり、このメカニズムに基づく自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を提供することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
【００１１】
本発明は、IL-2の産生阻害剤の同定方法、TNF-αの産生阻害剤の同定方法、IgMの産生阻害剤を同定方法、リンパ球の幼若化抑制剤の同定方法、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分の同定方法を提供する。いずれの同定方法も、ATP合成酵素の阻害を指標とすることを特徴とする。
【００１２】
ATP合成酵素の阻害を指標とするとは、被験化合物によるATP合成酵素阻害の有無及び／又はその程度を同定の基準とすることを意味する。例えば、１）被験化合物がATP合成酵素を阻害する場合、及び／又は、２）被験化合物によるATP合成酵素阻害が陽性対照化合物によるATP合成酵素阻害と比較して同等又はより強い場合、被験化合物を、IL-2の産生阻害剤、TNF-αの産生阻害剤、IgMの産生阻害剤、リンパ球の幼若化抑制剤、又は、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分と同定できる。陽性対照化合物として、被験化合物とは異なる他のATP合成酵素阻害剤を例示できる。ATP合成酵素阻害剤として、例えば、Oligomycin A及びAurovertin Bが挙げられる。
【００１３】
被験化合物は、特に制限されず、合成化合物でもよく、天然物抽出物中に存在する化合物であってもよい。被験化合物として、例えば、合成化合物、天然化合物、植物抽出物、動物抽出物、発酵生産物、市販の試薬、化合物ライブラリーから選抜された化合物などが挙げられる。被験化合物の分子種も特に制限されず、例えば、低分子化合物、ペプチド、蛋白質、糖、核酸を例示できる。
【００１４】
ATP合成酵素の阻害として、例えば、ATP合成酵素遺伝子の発現阻害、ATP合成酵素の分解及び／又はATP合成酵素の活性阻害を例示できる。ATP合成酵素は、その名の通り、ADPと無機リン酸からATPを合成する酵素であるが、その逆反応であるATP加水分解も行う。したがって、測定するATP合成酵素の活性は、ATP合成の活性であってもATP加水分解の活性であってもよい。ATP合成酵素の活性阻害として、ATP合成酵素のATP加水分解活性阻害を好ましく例示できる。
【００１５】
ATPの合成・分解反応を担っているのはF1部位であること、ATP合成酵素のF1部位のαサブユニットと結合する化合物が自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分等となる可能性が高いと考えられることから、使用するATP合成酵素はF1FOではなく、F1部位のみであってもよい。
【００１６】
ATP合成酵素の由来する生物種は、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ブタ、ウシ等が挙げられ、ヒトであることが好ましい。ATP合成酵素は精製された状態であってもよく、ミトコンドリア画分の状態であってもよい。ATP合成酵素の精製は、Aggeler R et al., J. Biol. Chem., 277(37): 33906-12 (2002), "Afunctionally active human F1FO ATPase can be purified byimmunocapture from heart tissue and fibroblast cell lines. Subunit structureand activity studies."及び非特許文献１２等に記載されている公知の方法に従って行うことができる。ミトコンドリア画分の調製は、Mitochondria Isolation Kit（製品コード：MITO-ISO1；シグマ社製）等の市販のキットを用いて行うことができる。
【００１７】
本同定方法は、ATP合成酵素の阻害を測定可能な試験系で実施される。ATP合成酵素の阻害を測定可能な試験系は、インビトロの試験系でよく、インビボの試験系でもよい。ATP合成酵素の阻害を測定可能な試験系として、例えば、ATP合成酵素遺伝子の発現阻害を測定可能な試験系、ATP合成酵素の活性阻害を測定可能な試験系を挙げることができる。
【００１８】
ATP合成酵素遺伝子の発現阻害を測定可能な試験系として、例えば、ATP合成酵素遺伝子を発現する細胞の試験系を例示できる。細胞の由来生物種は特に限定されないが、好ましく哺乳動物細胞、さらに好ましくヒト由来の細胞を例示できる。細胞は、初代培養でもよく、樹立した細胞株でもよい。ATP合成酵素遺伝子を発現する細胞として、例えば、脾細胞、単球、リンパ球（Ｔリンパ球、Ｂリンパ球）、ＴＨＰ−１細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞を例示できる。被験化合物存在下でこれらの細胞を培養し、培養後の該細胞の細胞溶解液に含まれるATP合成酵素遺伝子の転写産物（メッセンジャーRNA）及び／又は翻訳産物を、RT-PCR法、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法等により測定することによって、被験化合物によるATP合成酵素遺伝子の発現阻害の有無及び／又はその程度を確認可能である。本試験系に被験化合物を混在させる場合には、該細胞内に被験化合物を導入してもよく、該細胞の培養上清に添加してもよい。これらの導入又は添加は、該細胞の培養からATP合成酵素遺伝子の転写産物及び／又は翻訳産物の測定までの過程のいずれの時であってもよい。被験化合物が核酸の場合には、該細胞に導入することが好ましい。被験化合物が核酸の場合、自体公知の遺伝子導入方法（リン酸カルシウム法、リポフェクション法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法など）により、被験化合物を細胞に導入可能である。本試験系において、例えば、１）被験化合物存在下、ATP合成酵素遺伝子の発現量を測定し、２）１）で測定したATP合成酵素遺伝子の発現量と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素遺伝子の発現量を比較することにより、本同定方法を実施可能である。被験化合物存在下におけるATP合成酵素遺伝子の発現量が、被験化合物非存在下におけるATP合成酵素遺伝子の発現量と比較して、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上、最も好ましくは５０％以上低下している場合に、被験化合物はATP合成酵素を阻害すると判定できる。また、ATP合成酵素遺伝子の発現阻害を測定可能な試験系として、インビトロ転写／翻訳試験系及びインビトロ翻訳試験系を例示できる。これらの試験系を実施するための試薬が市販されている（TNT T7 Quick Coupled Transcription/Translation System等；プロメガ社製）。
【００１９】
ATP合成酵素の活性阻害を測定可能な試験系として、例えば、インビトロにおけるATP合成酵素によるATP合成活性（酵素活性）を測定する試験系を例示できる。具体的には、ATP合成酵素、リン酸及びADPを含む適当な緩衝液中において、ATP合成酵素によるATP合成反応を実施する試験系である。本試験系において、例えば、１）被験化合物存在下、ATP合成酵素のATP合成活性を測定し、２）測定したATP合成活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP合成活性を比較することにより、本同定方法を実施可能である。本試験系に被験化合物を混在させる場合には、ATP合成酵素のATP合成反応の前に被験化合物を反応溶液に添加してもよく、本反応中に被験化合物を添加してもよい。本試験系において、例えば、被験化合物存在下におけるATP合成酵素のATP合成活性が、被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP合成活性と比較して、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上、最も好ましくは５０％以上低下している場合に、被験化合物はATP合成酵素を阻害すると判定できる。ATP合成酵素のATP合成活性の測定は、例えば、基質（リン酸及びADP）の低下や生成物（ATP）の増加を測定することにより実施可能である。ATPは、例えば、ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応系により測定可能である（非特許文献１２）。
【００２０】
また、ATP合成酵素の活性阻害を測定可能な試験系として、例えば、インビトロにおけるATP合成酵素によるATP加水分解活性（酵素活性）を測定する試験系を例示できる。具体的には、ATP合成酵素及びATPを含む適当な緩衝液中において、ATP合成酵素によるATPの加水分解反応を実施する試験系である。ここで用いるATP合成酵素は、ATP加水分解活性を有する限りにおいて、例えば、ATP合成酵素F1部位でもよく、ATP合成酵素F1部位とATP合成酵素FO部位又はその一部との複合体となっていてもよい。ATP加水分解活性の測定は、市販の試薬を用いて実施可能である（ATPASE ASSAY KIT (HIGH SENSITIVITY）； INNOVA Biosciences社製）。本試験系において、例えば、１）被験化合物存在下、ATP合成酵素のATP加水分解活性を測定し、２）測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較することにより、本同定方法を実施可能である。本試験系に被験化合物を混在させる場合には、ATP合成酵素のATP加水分解反応の前に被験化合物を反応溶液に添加してもよく、本反応中に被験化合物を添加してもよい。本試験系において、例えば、被験化合物存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性が、被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性と比較して、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上、最も好ましくは５０％以上低下している場合に、被験化合物はATP合成酵素を阻害すると判定できる。ATP合成酵素のATP加水分解活性の測定は、例えば、基質であるATP及び／又は生成物である遊離リン酸を測定することにより実施可能である。
【００２１】
IL-2の産生阻害剤及びTNF-αの産生阻害剤とは、それぞれ細胞に作用させた場合及び／又は動物に投与した場合に、それぞれ細胞が産生するIL-2及びTNF-αの量を、作用及び／又は投与しなかった場合に比べて低下させるものを意味する。細胞及び動物の由来・種類は特に限定されないが、哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることが特に好ましい。IL-2は主にＴリンパ球（CD4+及びCD8+）で産生されるため、IL-2の産生阻害剤とは好ましくはＴリンパ球におけるIL-2の産生量を低下させるものを意味する。TNF-αは、単球、マクロファージ、リンパ球（Ｔリンパ球、Ｂリンパ球）、アストロサイト、線維芽細胞、好塩基球、マスト細胞、NK細胞、クッパー細胞など広範な細胞で産生され、TNF-αの産生阻害剤は、これらの細胞におけるTNF-αの産生量を低下させるものを意味し、好ましくはマクロファージ及び／又はリンパ球におけるTNF-αの産生量を低下させるものを意味する。炎症性サイトカインであるTNF-αやＴリンパ球増殖に関与するIL-2は、リウマチの病態に深く関与することが報告されている。従って、IL-2の産生阻害剤及びTNF-αの産生阻害剤は、リウマチなどの自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤として有用である。
【００２２】
IgMの産生阻害剤とは、細胞に作用させた場合及び／又は動物に投与した場合に、その細胞が産生するIgMの量を、作用及び／又は投与しなかった場合に比べて低下させるものを意味する。細胞及び動物の由来・種類は特に限定されないが、哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることが特に好ましい。IgMは、Ｂリンパ球から産生される為、IgMの産生阻害剤とは好ましくはＢリンパ球から産生されるIgMの産生量を低下させるものを意味する。リウマトイド因子は主にIgMに属し、リウマチ等の自己免疫疾患の病態と関与することが報告されている。従って、IgMの産生阻害剤は、リウマチなどの自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤として有用である。
【００２３】
リンパ球の幼若化抑制剤とは、細胞に作用させた場合及び／又は動物に投与した場合に、リンパ球の幼若化（感作抗原による特異的な刺激又はマイトジェンによる抗原非特異的な刺激に応答して幼若な細胞に分化増殖すること）を、作用及び／又は投与しなかった場合に比べて抑えるものを意味する。細胞及び動物の由来・種類は特に限定されないが、哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることが特に好ましい。リンパ球はＴリンパ球及び／又はＢリンパ球であることが好ましい。
【００２４】
自己免疫疾患とは、生体の免疫系（本来は、外来抗原に対応した生体防御機構）が自己抗原にも免疫反応を起こし、その結果誘発される疾患を意味する。自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤は、哺乳動物に投与可能な自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤を含む。哺乳動物として、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、サル、ウシなどが例示される。自己免疫疾患は、特に限定されないが、IL-2及び／又はTNF-αがその疾患の発症や増悪に関与する自己免疫疾患が好ましく、例えば、関節リウマチ、クローン病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、全身性硬化症及び喘息が挙げられる。
【００２５】
一般的に、インビトロスクリーニングのみにより医薬又はその候補化合物が見出されるとは限らない。最近では、インビトロスクリーニングで多数の検体を高速で調べることのできる自動化されたハイスル−プットスクリーニング系が導入されているが、１）ハイスル−プットスクリーニングによって選択された化合物（例えば、ヒット化合物やシード化合物と呼ばれることもある）の中から、化学修飾により活性、薬物動態、及び安全性等の資質の改善が見込める化合物（例えば、リード化合物と呼ばれることもある）が選択され、２）その選択された化合物を化学修飾した化合物について、生物活性（インビトロ、インビボ）、物性、薬物動態、及び安全性などが評価され、３）その評価に基づいて化学修飾された化合物の中から好ましい化合物がさらに選択される。４）そして、このような化学修飾、評価、及び選択が繰り返され、最終的に医薬として資質が高いと考え得る化合物が臨床試験に供与される医薬の候補化合物となる。以上の１）〜４）の過程を経て、医薬品が創製される場合もある。
【００２６】
従って、例えば、ヒトに投与可能な自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の開発を最終目的とし、生物活性評価系としてATP合成酵素阻害のアッセイ系を導入した薬剤創製過程においてATP合成酵素阻害化合物を選抜する行為は、本同定方法の範囲に含まれる。例えば、ヒトに投与可能な自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の開発を最終目的とし、ATP合成酵素阻害を指標とするハイスル−プットスクリーニング系を構築し、そのスクリーニング系でヒット化合物やリード化合物をスクリーニングする行為、又は、それらの修飾化合物の中からATP合成酵素阻害化合物を選抜する行為も、本同定方法に含まれる。
【００２７】
本同定方法で同定されたIL-2の産生阻害剤、TNF-αの産生阻害剤、IgMの産生阻害剤、リンパ球の幼若化抑制剤、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分は、それぞれ、適当な医薬担体と組合せて自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤として用いられる。製剤化にあたっては、その剤形に応じて適切な製剤用添加物を用いることができる。このような製剤用添加物として、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、pH調節剤、安定化剤等を用いることができる。投与経路は、全身投与であってもよく、局所投与であってもよい。投与経路は、疾患や症状に応じて選択する。例えば、静脈投与、動脈投与、皮下、皮内、又は筋肉内投与を選択することができる。必要な用量範囲は、有効成分の有効性、疾患、患者の症状、投与経路、及び担当医師の判断等によるが、一般的には、患者の体重１ｋｇあたり０．１乃至１００μｇ程度である。経口投与に適する製剤の例として、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、シロップ剤を挙げることができる。非経口投与に適する製剤の例として、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリ−ム剤、貼付剤を例示できる。
【実施例】
【００２８】
（実施例１：抗リウマチ化合物を固定した磁性ナノビーズの製造）
以下の方法に従って、下記式（１）で示される抗リウマチ化合物（特開平９−５９２３６の実施例３０に記載の化合物、以下、化合物Ａと称する）を磁性ナノビーズに共有結合させることにより、抗リウマチ化合物を固定化した磁性ナノビーズを製造した。
【００２９】
【化１】
【００３０】
特開平９−５９２３６に開示されている方法に従って、化合物Ａを合成した。特願２００４−２８０６７９に開示されている方法に従って、カルボキシル化磁性ナノビーズを製造した。特開平１０−１９５０９９に開示されている方法に従って、両者を共有結合させるためのカルボキシル化スペーサーを合成し、カルボキシル化スペーサーとカルボキシル化磁性ナノビーズとを共有結合させた。なお、カルボキシル化磁性ナノビーズの代わりにスチレン−グリシジルメタクリレート重合体を用いることも可能であり、本重合体は、特開平１０−１９５０９９に開示されている方法に従って製造できる。
【００３１】
こうして得られたナノビーズに化合物Ａを以下の方法により共有結合させた。まず、ナノビーズ（５ｍｇ）を超純水（０．５ｍＬ）とメタノール（０．５ｍＬ）で洗浄した。ナノビーズをメタノール（０．１ｍＬ）に懸濁させ、脱水ジオキサン（０．５ｍＬ）を添加してナノビーズを洗浄した。さらに、脱水ジオキサン（０．５ｍＬ）を用いてナノビーズを２回洗浄した。ナノビーズを脱水ジオキサン（０．５ｍＬ）に懸濁し、ナノビーズ懸濁液を調製した。また、化合物Ａを脱水ジオキサンに溶解し、化合物Ａ溶液（２ｍＭ及び２０ｍＭ）を調製した。調製したナノビーズ懸濁液と化合物Ａ溶液とを、以下の表１に示す組成で混合し、最終液量を１ｍＬとした。
【００３２】
【表１】
【００３３】
各混合液に３８．４ｍｇの（１−エチル−［３−ジメチルアミノプロピル］）カルボジイミド・塩酸塩（EDC；ナカライテスク社製）を添加し、室温で１６時間撹拌し、化合物Ａとナノビーズの共有結合反応を行った。反応溶液を１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去し、残留物に０．５ｍＬのエタノールアミン（１Ｍ、ｐＨ８．０）を添加し、ローテーターにより４℃で１６時間撹拌し、マスキング反応を行った。反応溶液を１５，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を除去し、残留物を超純水（０．５ｍＬ）で５回洗浄した後、超純水に再懸濁し、使用するまで４℃で保存した。
【００３４】
こうして得られた懸濁液に含まれる化合物Ａ固定化磁性ナノビーズ量を以下の方法に従って測定した。まず、懸濁液を遠心して得られた残留物を、定沸点塩酸（ナカライテスク社製）中、１１０℃で２４時間加水分解し、反応液を乾固させた。乾固物をトリエチルアミン−水−エタノール混合液（容積比２：９：９）に溶解し、この溶液の吸光度（２４５ｎｍ）を分光光度計（ＤＵ６４０；ベックマン社製）で測定し、遊離した化合物Ａの濃度を算出した。算出した結果、磁性ナノビーズに対して化合物Ａが固定化されていることを確認した。
【００３５】
（実施例２：質量分析法による化合物Ａ固定化磁性ナノビーズに結合するタンパク質の同定）
特開平９−５９２３６に開示されているように、化合物Ａは抗リウマチ活性を示す。しかし、化合物Ａがいかなる生理活性物質に作用し、抗リウマチ活性を示すのかは不明であった。そこで、実施例１で製造した化合物Ａ固定化磁性ナノビーズを用いて、化合物Ａが結合するタンパク質を精製し、同定した。
【００３６】
（１）マウス脾細胞の調製
ｄｄＹマウス（雄性、１０週齢；Ｓｌｃより購入）の頸椎を脱臼させた後、脾臓を摘出した。摘出した脾臓を１０ｍＭリン酸塩緩衝液−０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ＰＢＳ；Ｔａｋａｒａ社製）に懸濁し、スライドガラスを用いて単細胞懸濁液を調製した。この懸濁液をセルストレイナー（ベクトン・ディッキンソン社製）に通して、脾細胞を遠心チューブに集め、ＰＢＳ（４０ｍＬ）に懸濁し、この細胞懸濁液を遠心（２００ｇ、４℃、１０分間）した。遠心により得られた細胞を溶血試薬（５ｍＬ、IOTest3；ベックマン・コールター社製）に懸濁して、室温で１分間放置した。この懸濁液にＰＢＳ（２０ｍＬ）を添加して、再度同様の遠心処理を行い、得られた脾細胞をペレットとして洗浄した。この脾細胞ペレットをＰＢＳ（４０ｍＬ）に懸濁し、セルストレイナーを通して、細胞凝集塊を除去した。この懸濁液の細胞濃度を血球計算盤で測定し、懸濁液に含まれる総細胞数を求めた。この懸濁液に再度同様の遠心処理を行った後、上清をピペットで完全に除去した。得られた脾細胞ペレットは使用するまで−８０℃で保存した。
【００３７】
（２）マウス脾細胞の全細胞溶解液の調製
上記（１）で得られたマウス脾細胞に対して、その容積の５倍量の細胞溶解液（ＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍ；シグマ社製）を加え、得られた溶液をロータリーシェーカーで３０分撹拌した後、遠心（２０，４００ｇ、１５分間）した。上清をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（ＭＷＣＯ ３．５ｋＤａ；ピアース社製）を用いて透析バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．１％（ｖ／ｖ）プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）、ｐＨ７．５）に対して一晩透析した。透析後の溶液を遠心（２０，４００ｇ、３０分間）し、その上清を全細胞溶解液（以下、ＷＣＬと略する）とした。得られたＷＣＬは使用するまで−８０℃で保存した。
【００３８】
（３）化合物Ａ固定化磁性ナノビーズに結合するタンパク質の検出及び精製
上記（２）で得られたＷＣＬ（１ｍｇ）に結合バッファー（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．１％（ｖ／ｖ）プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ社製）、ｐＨ７．５）を加え４５０μＬとした。そこへ実施例１で得られた化合物Ａ固定化磁性ナノビーズ（磁性ナノビーズ１ｍｇ当たり２２．６ｎｍｏｌの化合物Ａが固定されている）あるいは化合物Ａを固定していない磁性ナノビーズを２５、５０、１００又は２５０μｇ（結合バッファー５０μＬに懸濁）を添加し、混合し、４℃で２時間、結合反応を行った。この反応溶液を遠心（２０，４００ｇ、５分間）して得たビーズを結合バッファーで３回洗浄した。ビーズに１００μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）サンプルバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ、１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール、０．０２５％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）を添加し、１００℃で５分間加熱してビーズに結合しているタンパク質を溶出した。溶出液を遠心した後、上清に３００μＬの冷却アセトンを添加して−８０℃で３０分間静置した。この溶液を遠心（２０，４００ｇ、３０分間）して得た沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（１０μＬ）に溶解し、１００℃で５分間加熱した。加熱後の溶液（以下、結合タンパク質電気泳動用サンプルと称する）８μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５−２０％グラジエントゲル（ＤＲＣ社製）、２００Ｖ定電圧、１時間）処理した。泳動後のゲルを銀染色（２Ｄ−銀染色試薬ＩＩ「第一」；第一化学薬品社製）し、タンパク質のバンドを検出した。
【００３９】
電気泳動の結果を図１に示す。電気泳動のバンドのパターンは、化合物Ａを固定した磁性ナノビーズと固定していない磁性ナノビーズとで似通っていたが、図１の矢印で示した約５２ｋＤａのバンドは、化合物Ａ固定化磁性ナノビーズでのみ検出されたことから、このタンパク質は化合物Ａ特異的に結合していることが示唆された。
【００４０】
（４）質量分析による化合物Ａ固定化磁性ナノビーズに結合するタンパク質の同定
このバンドは再現性よく検出されることが確認できたため、質量分析によりタンパク質の同定を行った。
【００４１】
上記（２）で得られたＷＣＬ（１ｍｇ）に結合バッファーを加え４５０μＬとした。そのＷＣＬ溶液を４℃、１時間のプレインキュベーション後、遠心処理（２０，４００ｇ、５分間）して得られた上清に化合物Ａ固定化磁性ナノビーズ（磁性ナノビーズ１ｍｇ当たり２２．６ｎｍｏｌの化合物Ａが固定されている）又は化合物Ａを固定していない磁性ナノビーズを１００μｇ（結合バッファー５０μＬに懸濁）添加し、混合し、４℃で２時間、結合反応を行った。この反応溶液を遠心（２０，４００ｇ、５分間）して得たビーズを結合バッファーで３回洗浄した。ビーズに１００μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加し、１００℃で５分間加熱してビーズに結合しているタンパク質を溶出した。溶出液を遠心した後、上清に３００μＬの冷却アセトンを添加して−８０℃で３０分間静置した。この溶液を遠心（２０，４００ｇ、３０分間）して得た沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（１０μＬ）に溶解し、１００℃で５分間加熱した。結合タンパク質電気泳動用サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５−２０％グラジエントゲル、２００Ｖ定電圧、１時間）に供した。泳動及び銀染色処理（ＷＡＫＯ社製キット）後、分子量が５２ｋＤａに相当するバンドを切り出した。
【００４２】
切り出したゲルを脱色し、トリプシン溶液（トリスバッファー、ｐＨ８．０に溶解）を加え、３５℃で２０時間の消化処理を行った。消化した溶液をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ装置に供与して、質量分析によるタンパク質の同定を行った。質量分析に用いた分析カラムはＭａｇｉｃＣ１８（Michrom BioResources社製）、溶出液はアセトニトリル（溶媒Ａ：２％、溶媒Ｂ９０％）とした。溶出液の流速を２５０〜３００ｎＬ／分に、グラジエントを５〜９５％Ｂとした。溶出されたペプチドを、Ｎａｎｏｆｌｏｗ−ＬＣ−ＥＳＩのＱ−Ｔｏｆ２（MicroMass社製）によって分析し、分析により得られたペプチドのアミノ酸配列をクエリーとして、ＮＣＢＩ（ｎｒ）データベースに対して検索処理を行い、タンパク質を同定した。
【００４３】
その結果、化合物Ａ固定化磁性ナノビーズに結合するタンパク質として、ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, alphasubunit, isoform 1（以下、ATP合成酵素サブユニットαと称する）が同定された。一方、化合物Ａを固定していない磁性ナノビーズ由来の試料を泳動したレーンにおいては、ATP合成酵素サブユニットαと同分子量位置のバンドから有意のスコアでヒットするタンパク質が検出されなかった。
【００４４】
（実施例３：ウエスタンブロット法による化合物Ａ固定化磁性ナノビーズに結合するタンパク質の確認）
実施例２で用いた結合タンパク質電気泳動用サンプルを５−２０％グラジエントゲルに負荷して、２００Ｖの定電圧で１時間、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。泳動後のゲルをＳｅｑｕｉ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ膜（バイオラッド社製）に１０Ｖで１時間転写した後、Ｂｌｏｃｋａｃｅ（大日本製薬社製）で一晩ブロッキング処理した。一次抗体としてＢｌｏｃｋａｃｅ：ＴＢＳ−Ｔ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）＝１：３の混合溶液で１，０００倍に希釈したanti-OxPhos Complex V subunit α, monoclonal 7H10（＃Ａ２１３５０、モレキュラープローブズ社製；抗ATP合成酵素サブユニットα抗体）を用いて室温で１時間インキュベート処理した。その後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔで洗浄した後、Ｂｌｏｃｋａｃｅ：ＴＢＳ−Ｔ＝１：３の混合溶液で１，０００倍希釈した二次抗体（Anti-mouse IgG-HRP（セルシグナリング社製；＃７０７６））を用いて室温で１時間インキュベート処理した。化学発光の基質にECL Plus western blotting detection reagents（アマシャム・バイオサイエンス社製）を用い、FAS-1000Lumino Imaging Analyzer（ＴＯＹＯＢＯ社製）で化学発光を検出することにより、化合物Ａ固定化磁性ナノビーズに結合したタンパク質を検出した。
【００４５】
図２Ａに化合物Ａ固定化磁性ナノビーズに結合したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。また、図２Ｂにウエスタンブロッティングの結果を示す。実施例２と同様に、ATP合成酵素サブユニットαは、化合物Ａ固定化磁性ナノビーズへの結合タンパク質として検出された一方、化合物Ａを固定していない磁性ナノビーズでは検出されなかったことから、ATP合成酵素サブユニットαは化合物Ａに特異的に結合することが示唆された。
【００４６】
（実施例４：化合物固定化磁性ナノビーズを用いた特異性の確認）
化合物Ａ以外の３種類の化合物をそれぞれ磁性ナノビーズに固定した、化合物固定化磁性ナノビーズに対するATP合成酵素サブユニットαの結合性を調べ、ATP合成酵素サブユニットαが化合物Ａに特異的に結合するか否かを確認した。
（１）化合物固定化磁性ナノビーズの製造
【００４７】
使用した３種類の化合物は、下記式（２）で示される抗アレルギー化合物（以下、化合物Ｂと称する）及び２種類の抗糖尿病化合物（化合物Ｃ及びＤと称する）である。
【００４８】
【化２】
【００４９】
実施例１と同様の方法に従って、化合物Ｂを固定化した磁性ナノビーズを製造した。具体的には、実施例１で用いたカルボキシル化磁性ビーズを、脱水ジオキサン（５００μL）にて３回洗浄後、脱水ジオキサン（１ｍL）に懸濁した。この懸濁液にN-hydroxysuccinimide（１M、200μL；ペプチド研究所製）とEDC（38.4mg）をともに添加した後、室温で2時間インキュベーションした。その後、DMF（500μL）にて3回洗浄した磁性ビーズに化合物Ｂ溶液（DMFに溶解させたもの）を表２に示すように混合し、この混合溶液にトリエチルアミン（100mM、50μL）を添加した後、37℃で3時間ローテーターを用いて攪拌することによって、カルボキシル化磁性ビーズへの化合物Ｂの固定化反応を行った。
【００５０】
カルボキシル化磁性ビーズに固定化された化合物Ｂを定量するために、攪拌後の混合溶液を遠心処理してその上清を回収した。さらに、攪拌後の混合溶液から反応後のカルボキシル化磁性ビーズを回収し、回収したビーズに1M エタノールアミン（pH8.0）500μLを添加して、4℃で一晩ローテーターを用いて攪拌した。次いで、攪拌した溶液を遠心処理して、反応後のカルボキシル化磁性ビーズを回収し、回収した反応後のカルボキシル化磁性ビーズを水に懸濁して使用時まで4℃で保存した。
【００５１】
固定化化合物量の定量は以下のように行った。すなわち、上記で得た上清5μLをWaters社製HPLC（使用カラム：Symmetry C18 4.6×250mm：酢酸アンモニウム94‐20％グラジェント）にて分析し、遊離したスクシンイミドを標準品のピーク面積から作成した標準直線から定量して、ビーズに固定化した化合物量を求めた。
【００５２】
化合物Ｃ及びＤについても、化合物Ｂと同様に磁性ナノビーズに固定化した。
【００５３】
【表２】
【００５４】
（２）ATP合成酵素サブユニットαの化合物固定化磁性ナノビーズへの結合の有無の検討
実施例２で得られたＷＣＬ（１ｍｇ）に結合バッファーを加え４５０μＬとした。そのＷＣＬ溶液を４℃、１時間のプレインキュベーション後、遠心処理（２０，４００ｇ、５分間）して得られた上清に化合物（化合物Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤ）固定化磁性ナノビーズ（１ｍｇビーズ当たりの化合物Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの固定化量は、それぞれ２３．３、１８７、１５７．２及び２４８ｎｍoｌ）又は化合物を固定していない磁性ナノビーズを１００μｇ（結合バッファー５０μＬに懸濁）添加し、混合し、４℃で２時間、結合反応を行った。この反応溶液を遠心（２０，４００ｇ、５分間）して得たビーズを結合バッファーで３回洗浄した。ビーズに１００μＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加し、１００℃で５分間加熱してビーズに結合しているタンパク質を溶出した。溶出液を遠心した後、上清に３００μＬの冷却アセトンを添加して−８０℃で３０分間静置した。この溶液を遠心（２０，４００ｇ、３０分間）して得た沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（１０μＬ）に溶解し、１００℃で５分間加熱した。化合物Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤを固定化した磁性ナノビーズを用いて得られた結合タンパク質電気泳動用サンプル（それぞれ５．０、０．６２、０．７４及び０．４７μＬ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（５−２０％グラジエントゲル、２００Ｖ定電圧、１時間）に供した。泳動後のゲルを銀染色処理及びウエスタンブロッティング処理（実施例３と同様の処理）した。
【００５５】
４種類の化合物固定化磁性ナノビーズへのATP合成酵素サブユニットαの結合の有無を調べた結果を図３に示す。ビーズに結合する総タンパク質量は固定化された化合物によって異なっているが、ウエスタンブロット法による検出では、ATP合成酵素サブユニットα（矢印で示されるバンド）は化合物Ａ固定化磁性ナノビーズでのみ検出され、他の化合物（化合物Ｂ、Ｃ及びＤ）固定化磁性ナノビーズでは検出されていなかったことから、ATP合成酵素サブユニットαは化合物Ａと特異的に結合することが確認された。
【００５６】
（実施例５：化合物ＡによるATP合成酵素活性阻害）
実施例４においてATP合成酵素サブユニットαが化合物Ａに特異的に結合することが確認されたため、次に、化合物ＡがATP合成酵素活性を阻害するか否かを検討した。
【００５７】
（１）ATP合成酵素標品としてのミトコンドリア画分の調製
ミトコンドリア画分の調製は、Mitochondria Isolation Kit（製品コード：MITO-ISO1；シグマ社製）を用い、キット付属の手順書に準じて行った。
【００５８】
１００ｎＭビタミンＤ３（Ｗａｋｏ社製）及び１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清；Moregate社製）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（ギブコ社製）にて大量培養して得たＴＨＰ−１細胞をＰＢＳにて２回洗浄した後に凍結保存した。この凍結保存したＴＨＰ−１細胞ペレット（３００μＬ）に１０倍量の冷却した１×抽出バッファーＡ（キット付属）とプロテアーゼインヒビターカクテル（終濃度１％；シグマ社製）を添加した。氷上で７ｍＬ容量のポッター型ホモジナイザーにて３０ストロークのホモジナイズ後に、遠心処理（６００ｇ、５分間；本処理を遠心処理１と称する）し、上清をさらに遠心処理（１１，０００ｇ、１０分間；本処理を遠心処理２と称する）し、沈殿物を回収した。得られた沈殿物を再度１０倍量の抽出バッファーＡで懸濁し、この懸濁液を遠心処理（６００ｇ、５分間）し、その上清を遠心処理（１１，０００ｇ、１０分間）した。得られた沈殿物をスクロースバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．２５Ｍ スクロース、０．１％（ｖ／ｖ）プロテアーゼインヒビターカクテル）に懸濁したものをミトコンドリア画分とした。
【００５９】
凍結保存ＴＨＰ−１細胞ペレットに５倍量のＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍを加え、この溶液をロータリーシェーカーで１５分撹拌した後に、遠心処理（２０，０００ｇ、１５分間）して得られた上清をＴＨＰ−１細胞溶解液（ＴＨＰ−１ ＷＣＬと称する）とした。
【００６０】
遠心処理１により得られた沈殿物に５倍量のＣｅｌＬｙｔｉｃ−Ｍを加え、この溶液をロータリーシェーカーで１５分撹拌した後に、遠心処理（２０，０００ｇ、１５分間）して得られた上清をＣｆｇ（６００ｇ）ｐｐｔと称する。また、遠心処理２により得られた上清をＣｆｇ（１１，０００ｇ）ｓｕｐと称する。
【００６１】
ＴＨＰ−１ ＷＣＬ、Ｃｆｇ（６００ｇ）ｐｐｔ、Ｃｆｇ（１１，０００ｇ）ｓｕｐ及びミトコンドリア画分の純度を以下の方法に従って確認した。
【００６２】
各画分をBradford Protein Assay Reagent（バイオラッド社製）を用いてタンパク質定量した後、タンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬとなるように各画分のサンプルを調整し、サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに混合し、１００℃で５分間加熱した。サンプルを５−２０％グラジエントゲルに負荷し（銀染色用に０．５μｇ、ウエスタンブロット用に５μｇ）、２００Ｖの定電圧で１時間電気泳動した。泳動後のゲルを銀染色し、タンパク質のバンドを検出した。同様に泳動して得られたタンパク質をＳｅｑｕｉ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ膜に１０Ｖで１時間転写した後、Ｂｌｏｃｋａｃｅで一晩ブロッキングした。ATP合成酵素サブユニットαの検出は実施例３と同じ条件で行い、チトクロムＣの検出は、一次抗体にＢｌｏｃｋａｃｅ：ＴＢＳ−Ｔ＝１：３の混合溶液で５００倍に希釈したCytochrome C(A-8)（サンタクルーズバイオテクノロジー社製；カタログ番号ｓｃ−１３１５６）を、二次抗体にＢｌｏｃｋａｃｅ：ＴＢＳ−Ｔ＝１：３の混合溶液で１０００倍に希釈したAnti-mouse IgG-HRP（セルシグナリング社製；♯７０７６）を用いて行った。
【００６３】
銀染色及びウエスタンブロットによる分画状態の確認結果を図４に示す。ウエスタンブロット解析の結果、調製したミトコンドリア画分は、ミトコンドリアに存在することが知られているチトクロムＣが濃縮されていること、及びATP合成酵素サブユニットαのバンドが強く検出されたことから、ATP合成酵素サブユニットαを含むミトコンドリア画分を取得できたことが確認された。このミトコンドリア画分（以下、ATP合成酵素標品と称する）を被験化合物のATP合成酵素阻害活性の測定に用いた。
【００６４】
（２）化合物ＡによるATP合成酵素阻害活性の測定
化合物ＡのATP合成酵素阻害活性の測定をInnova Biosciences社のATPase assay kit (high sensitivity)を用いて、キット付属の指示書に従い実施した。
【００６５】
具体的には、キットに付属の基質溶液（SB mix）及び反応停止液（Gold mix）を調製した後、９６ウェルプレートに適宜希釈したATP合成酵素標品及び化合物Ａをスクロースバッファーと合わせて１００μＬとなるように添加し、２５℃、５分間プレインキュベーションを行った。その後、各ウェルに１００μＬのSB mixを添加し、２５℃、３０分間のインキュベーションにより酵素反応（ATP加水分解反応）を行い、各ウェルに５０μＬのGold mixを添加することにより酵素反応を停止させた。その２分後に２０μＬの安定化剤を加え、２５℃、３０分間インキュベートした後、６３０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（Benchmark、バイオラッド社製）により測定した。測定はｎ＝１とし、測定値はサンプル毎にブランク（基質添加前にGold mixを添加して反応を停止）をおいて各サンプル吸光度から差し引いた。基質添加時の酵素量は２μｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯあるいは化合物は１％（２μＬ）となるように添加した。
【００６６】
化合物Ａのほかに、ATP合成酵素の特異的な阻害剤であるOligomycin A（フルカ社製）及びAurovertin B（シグマ社製）を陽性対照として用いた。さらに、化合物Ｂ並びに他のリウマチ化合物である式（３）で示される化合物（以下、化合物Ｅと称する；特開平９−５９２３６の実施例３２に開示されている方法に従って合成した）及び式（５）で示される化合物（以下、化合物Ｇと称する；後述の実施例において合成方法を示す）についても、ATP合成酵素阻害活性の有無を検討した。
【００６７】
【化３】
【００６８】
【化４】
【００６９】
反応溶液における化合物Ａ、Ｂ、Ｅ及びＧの終濃度が５０、２５０又は５００μＭとなるように、それぞれの化合物を反応溶液に添加した。反応溶液におけるOligomycin Aの終濃度は０．００１、０．０１又は０．１μＭとなるように、またAurovertin Bの終濃度は０．５、５又は５０μＭとなるように、それぞれの化合物を反応溶液に添加した。
【００７０】
各化合物がATP加水分解阻害活性を有するか否かを検討した結果を図５に示す。Oligomycin A及びAurovertin Bは、ATP合成酵素を阻害した。化合物Ａ、Ｇ及びＥについても同様にATP合成酵素阻害活性が認められ、阻害強度はＧ、Ａ、Ｅの順に強かった。一方、化合物Ｂには、ATP合成酵素阻害活性はほとんど認められなかった。
【００７１】
（実施例６：抗リウマチ化合物によるマイトジェン刺激マウス脾細胞幼若化抑制活性）
以上の実施例の結果から、抗リウマチ化合物はATP合成酵素サブユニットαに結合し、ATP合成酵素を阻害することにより、抗リウマチ活性を示すものと考えられた。
【００７２】
ある化合物が抗リウマチ活性を有するか否かを確認する実験として、マイトジェン（コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）、リポ多糖（ＬＰＳ））刺激によるＴ又はＢリンパ球幼若化の抑制試験が広く行われている。
【００７３】
そこで化合物Ａ及びＥ並びに他のリウマチ化合物である式（４）で示される化合物（以下、化合物Ｆと称する；後述の方法により合成）について、マウス脾細胞の幼若化抑制活性の有無を検討した。
【００７４】
【化５】
【００７５】
ｄｄＹマウス２匹（１０週齢、雄性；Ｓｌｃより購入）の脾臓を摘出し、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（ギブコ社製）にて無菌処理後に、スライドガラスを用いて単細胞として１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地（以下、ＲＰＭＩ−１０と称する）にて脾細胞懸濁液を調製した。この懸濁液を遠心処理（４℃、２００ｇ、１０分間）して得た細胞ペレットに２ｍＬのIOTest3溶液を加えて室温で１分間放置して溶血した。この溶液に８ｍＬのＲＰＭＩ−１０を添加して再度同様の遠心処理をして得た細胞を１０ｍＬのＲＰＭＩ−１０にて２回洗浄して得た細胞ペレットをＲＰＭＩ−１０（１０ｍＬ）に再懸濁した。血球計算盤を用いて細胞濃度を測定し、５×１０６個／ｍＬの脾細胞懸濁液を調製した。
【００７６】
４％ＤＭＳＯ含有ＲＰＭＩ−１０にて段階希釈して調製した抗リウマチ化合物溶液（化合物Ａ、Ｅ及びＦ）５０μＬを９６ウェルプレートに添加し（ｎ＝３）、これにＲＰＭＩ−１０に溶解したＣｏｎＡ（終濃度１μｇ／ｍＬ；シグマ社製）又はＬＰＳ（終濃度１００μｇ／ｍＬ；カルビオケム社製）５０μＬ、脾細胞懸濁液１００μＬを添加、混合して、５％ＣＯ２下、３７℃にてインキュベーションした。
【００７７】
３日後にCell Counting Kit-8（ＷＳＴ−８；同仁化学研究所社製）を各ウェルに１０μＬ添加して、添加時と１日後に吸光度（４５０−５９５ｎｍ）をマイクロプレートリーダーで測定することにより、幼若化を評価した。結果を図６に示す。図６から明らかなように、すべての化合物は、ＣｏｎＡ及びＬＰＳ刺激によるＴ及びＢリンパ球の幼若化を顕著に抑制することが判明した。
【００７８】
（実施例７：ATP合成酵素阻害剤によるマイトジェン刺激マウス脾細胞幼若化抑制活性）
特異的なATP合成阻害剤として周知のOligomycin A及びAurovertin Bについて、抗リウマチ活性を示すか否かを検討するため、実施例６と同様に、両化合物の脾細胞幼若化抑制活性の有無について検討した。
【００７９】
ｄｄＹマウス２匹（１２週齢、雄性）から得た脾臓を実施例６と同様に処理して、１×１０７個／ｍＬの脾細胞懸濁液を調製した。４％ＤＭＳＯ含有ＲＰＭＩ−１０に溶解したOligomycin A及びAurovertin Bを５０μＬ、ＲＰＭＩ−１０に溶解したＣｏｎＡ（終濃度１μｇ／ｍＬ）又はＬＰＳ（終濃度１００μｇ／ｍＬ）５０μＬ、細胞懸濁液１００μＬを、それぞれ９６ウェルプレートに添加、混合して、５％ＣＯ２下、３７℃にて３日間インキュベーションした。ＷＳＴ−８を各ウェルに１０μＬ添加して、添加時と５時間後に吸光度（４５０−５９５ｎｍ）をマイクロプレートリーダーで測定することにより、幼若化を評価した。結果を図７に示す。図７から明らかなように、Oligomycin A及びAurovertin Bは、ＣｏｎＡ及びＬＰＳ刺激によるＴ及びＢリンパ球の幼若化を顕著に抑制することが判明した。
【００８０】
（実施例８：ATP合成酵素阻害剤によるマウス脾細胞のサイトカイン産生阻害）
炎症性サイトカインであるTNF−αやＴリンパ球増殖に関与するＩＬ−２は、リウマチの病態に深く関与することが報告されている。そこで、ATP合成酵素の特異的な阻害剤であるOligomycin A及びAurovertin Bが、これらサイトカインの産生を阻害するか否かについて検討した。
【００８１】
（１）ATP合成酵素阻害剤によるマウス脾細胞のＩＬ−２産生阻害
実施例６と同様に、ｄｄＹマウスから脾細胞を調製し、５×１０６個／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ−１０に懸濁させた。マイトジェンとしてＣｏｎＡ（終濃度１μｇ／ｍＬ）を使用した。Oligomycin A及びAurovertin Bを４％ＤＭＳＯ／ＲＰＭＩ−１０にて段階希釈して被験溶液を作製した。Oligomycin A又はAurovertin Bを５０μＬ、脾細胞懸濁液１００μＬ及びＣｏｎＡ５０μＬを９６ウェルプレートに添加し、５％ＣＯ２下、３７℃にて１日培養した。培養後にＣｏｎＡ添加及び非添加のプレートから、培養上清を１５０μＬ回収した。培養終了の４時間前にＷＳＴ−８を各ウェルに１０μＬずつ添加し、添加時と上清回収時に吸光度（４５０−５９５ｎｍ）をマイクロプレートリーダーで測定した。回収した培養上清のＩＬ−２濃度をＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社製）にてキット付属のプロトコール通りに行い定量した。結果を図８Ａに示す。図８Ａから明らかなように、Oligomycin A及びAurovertin Bは、ＣｏｎＡ刺激によるマウス脾細胞のＩＬ−２産生を抑制することが確認された。
【００８２】
（２）ATP合成酵素阻害剤によるＴＨＰ−１細胞のTNF−α産生阻害
１．０×１０５個／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ−１０に懸濁したＴＨＰ−１細胞を２個のＴ７５フラスコ（浮遊用；Sumilon；住友ベークライト社製）に５０ｍＬずつ入れ、ビタミンＤ３（１ｍｇ／ｍＬ メタノール溶液；和光純薬社製）を２μＬ添加し、５％ＣＯ２下、３７℃にて培養した。４日後に培養液７５ｍＬを遠心して得たＴＨＰ−１細胞を新しいＲＰＭＩ−１０（３７．５ｍＬ）に懸濁し、ビタミンＤ３溶液を１．５４μＬ添加し、Ｔ７５フラスコに入れて、５％ＣＯ２下、３７℃にて培養した。１日後に細胞を回収して、１．５×１０６個／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ−１０／２５ｍＭ ＨＥＰＥＳに懸濁した。４００μＭのATP合成酵素阻害剤（Oligomycin A又はAurovertin B）のＤＭＳＯ溶液をＲＰＭＩ−１０／２５ｍＭ ＨＥＰＥＳにて１０倍に希釈した。ＲＰＭＩ−１０にてATP合成酵素阻害剤を段階希釈して被験溶液を作製し、９６ウェルプレートに５０μＬずつ添加した（ｎ＝３）。陰性対照には４％ＤＭＳＯ／ＲＰＭＩ−１０を用いた。４μｇ／ｍＬとなるように４％ＤＭＳＯ／ＲＰＭＩ−１０／２５ｍＭ ＨＥＰＥＳで希釈したＬＰＳを５０μＬずつ添加した。その後、ＴＨＰ−１細胞懸濁液を１００μＬ添加して、５％ＣＯ２下、３７℃にて４時間培養した。培養開始時にＷＳＴ−８を各ウェルに１０μＬずつ添加し、添加時と培養終了時に吸光度（４５０−５９５ｎｍ）をマイクロプレートリーダーで測定した。回収した培養上清のTNF−αの濃度をＯｐｔｉＥＩＡ（BD Biosciences社製）を用いてキット付属のプロトコール通りに測定した。なお、酵素基質はSubstrate Reagent Pack（Ｒ＆Ｄ社製）を使用した。結果を図８Ｂに示す。図８Ｂから明らかなように、Oligomycin A及びAurovertin Bは、ＬＰＳ刺激によるＴＨＰ−１細胞のTNF−α産生を抑制することが確認された。
【００８３】
（実施例９：抗リウマチ化合物によるIgM産生抑制）
実施例６と同様に、ｄｄＹマウスから脾細胞を調製し、５×１０６個／ｍＬとなるようにＲＰＭＩ−１０に懸濁させた。マイトジェンとしてＬＰＳ（終濃度１００μｇ／ｍＬ；カルビオケム社製）を使用した。Oligomycin A、Aurovertin B、化合物Ａ、化合物Ｅ、化合物Ｆ又は化合物Ｇを５０μＬ、脾細胞懸濁液１００μＬ及びＬＰＳ５０μＬを９６ウェルプレートに添加し、５％ＣＯ２下、３７℃にて培養した。３日後，９６ウェルプレートから、培養上清１５０μＬを回収した。培養上清のIgM濃度をIgM mouse Quantitation kit EIAキット(Bethyl社製)にて添付プロトコール通りに行って定量した。なお、培養上清試料はPBS‐0.05％Tween20にて４、８、１６、３２、６４、１２８倍希釈して、１００μL／ウェルで用いた。
【００８４】
結果を図９に示す。被験化合物全て（Oligomycin A、Aurovertin B、化合物Ａ、化合物Ｅ、化合物Ｆ及び化合物Ｇ）が、マウス脾細胞のIgM産生を抑制した。リウマトイド因子である自己抗体の多くがIgMに属する。従って、実施例９の結果に基づき、ATP合成酵素阻害化合物は、Ｂリンパ球から自己抗体の産生を抑制することによっても、リウマチ等の自己免疫疾患の予防及び／又は治療効果を示すものと考えられる。
【００８５】
（化合物Ｂの合成）
【００８６】
【化６】
【００８７】
（１）3-ヒドロキシ-4-メトキシシンナモイルアントラニル酸 メチルエステル (3) の合成
3-ヒドロキシ-4-メトキシ桂皮酸（化合物1, 5.83 g, 30.0 mmol）を塩化チオニル（SOCl2,50 mL）に溶解し、N,N-ジメチルホルムアミド（20 μL）を加えて1時間加熱還流した。反応液を濃縮後、残渣にアントラニル酸（化合物2, 5.44 g, 36.0 mmol）、トリエチルアミン（6.26 mL）及びテトラヒドロフラン（100 mL）を加え、4時間加熱還流した。反応混合物を氷水400 mLに注ぎ、クロロホルム（500mL）にて抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮した。残渣クロロホルム−ヘキサンより再結晶し、標記化合物3（6.81 g, 69.3%）を単黄色結晶性粉末として得た。
MS (ESI) m/z:328 (M+H)+
1H-NMR (CDCl3) δ：3.94 (3H, s), 3.96 (3H, s), 5.64 (1H, s), 6.48 (1H, d, J=15.63Hz),6.86 (1H, d, J=8.30Hz), 7.06-7.11 (1H, m), 7.16-7.21 (2H, m), 7.27 (1H, s),7.56-7.60 (1H, m), 7.69 (1H, d, J=15.63Hz), 8.06 (1H, dd, J=8.06Hz, 1.47Hz),8.87 (1H, d, J=8.59Hz), 11.29 (1H, s).
【００８８】
（２）3-[3-(t-ブトキシカルボニルアミノ)プロピル]-4-メトキシシンナモイルアントラニル酸メチルエステル (5) の合成
化合物3（4.09 g, 12.5 mmol）、N-(3-ヒドロキシプロピル)カルバミン酸 t-ブチルエステル（化合物2, 2.41 g, 13.8 mmol）及びトリフェニルホスフィン（3.61 g, 13.8mmol）をテトラヒドロフラン（60 mL）に溶解し、0℃にてアゾジカルボン酸 ジエチルエステル（2.95 mL, 18.7 mmol）を加え、室温にて3時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン/酢酸エチル = 2:1）に付し、標記化合物5（5.05 g, 83.4%）を単黄色結晶性粉末として得た。
MS (ESI) m/z:485 (M+H)+
1H-NMR (CDCl3) δ：1.47 (9H, s),2.02-2.08 (2H, m), 3.30-3.41 (2H, m), 3.92 (3H, s), 3.96(3H, s), 4.17 (2H, t, J=5.86Hz), 5.64 (1H, s), 6.47 (1H, d, J=15.38Hz), 6.86(1H, d, J=8.30Hz), 7.08-7.12 (1H, m), 7.21 (1H, d, J=1.95Hz), 7.27 (1H, s),7.55-7.60 (1H, m), 7.66 (1H, d, J=15.63Hz), 8.04-8.07 (1H, m), 8.87 (1H, d,J=8.55Hz), 11.32 (1H, s).
【００８９】
（３）3-[3-(t-ブトキシカルボニルアミノ)プロピル]-4-メトキシシンナモイルアントラニル酸 (6) の合成
化合物5（2.42 g, 4.99 mmol）をテトラヒドロフラン（40 mL）に溶解し、0.25N水酸化ナトリウム水溶液（40 mL）を加えて室温にて12時間攪拌した。反応液を氷冷した希塩酸（pH 3, 300 mL）に注ぎ込み、析出した粘調な沈殿物をクロロホルムに溶解後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶媒を留去して得られた残渣をクロロホルム−ヘキサンより再結晶し、標記化合物6（1.87 g, 79.6%）を無色結晶性粉末として得た。
MS (ESI) m/z:471 (M+H)+
1H-NMR (DMSO-d6) δ：1.37 (9H, s), 1.84-1.90 (2H, m), 2.96-3.02 (2H, m), 3.50 (3H, s),4.14 (2H, t, J=5.86Hz), 6.76 (1H, d, J=15.38Hz), 7.03 (1H, d, J=8.30Hz), 7.14 (1H,t, J=7.32Hz), 7.24 (1H, dd, J=8.30Hz, 1.71Hz), 7.35 (1H, d, J=1.95Hz), 7.54 (1H,d, J=15.63Hz), 7.58-7.62 (1H, m), 8.00 (1H, dd, J=8.06Hz, 1.71Hz), 8.61 (1H,dd, J=8.55Hz, 0.98Hz), 11.29 (1H, s).
【００９０】
（４）化合物Ｂ（N-(3-アミノプロピルオキシ)-4-メトキシシンナモイルアントラニル酸 (7)）の合成
化合物6（2.32 g, 1.30 mmol）をジクロロメタン（45 mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（5 mL）を加えて室温にて1時間攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣をクロロホルム−ヘキサンより結晶化し、標記化合物7のトリフルオロ酢酸塩（2.30 g, quant.）を単黄色結晶性粉末として得た。
MS (ESI) m/z:371 (M+H)+
1H-NMR (DMSO-d6) δ：1.99-2.06 (2H, m), 3.07-3.12 (2H, m), 3.80 (3H, s), 4.04 (2H, t,J=6.10Hz), 6.75 (1H, d, J=15.63Hz), 6.84-6.86 (1H, m), 6.99 (1H, d, J=8.30Hz),7.13-7.18 (1H, m), 7.29 (1H, dd, J=7.45Hz, 1.71Hz), 7.38 (1H, d, J=1.95Hz),7.56 (1H, d, J=15.63Hz), 7.59-7.61 (1H, m), 7.99-8.02 (1H, m), 8.62 (1H, d,J=8.30Hz), 11.29 (1H, s).
【００９１】
（化合物Ｆ及び化合物Ｇの合成）
【００９２】
【化７】
【００９３】
（１）t-ブチル {3-[4-(3-{[(4-クロロフェニル)アミノ]カルボニル}-2-ニトロフェニル)ピペラジン-1-イル]プロピル}カルバメート (2) の合成
特開平09-59236に記載された方法に従って調製したN-(4-クロロフェニル)-2-ニトロ-3-ピペラジン-1-イルベンズアミド (1) 541 mg (1.5 mmol), N-Boc-3-ブロモプロピルアミン 357 mg (1.5 mmol) 及び炭酸カリウム 318 mg (2.3 mmol) のDMF懸濁液 (10 ml) を室温で2時間、50℃で2時間撹拌した。反応液に水を加え析出結晶を濾取後、これをクロロホルムに溶かし硫酸マグネシウム（無水）で脱水した後に濃縮した。この残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付しCHCl3:MeOH=10:1留分を濃縮することにより標記化合物 (2) を479 mg (収率 62%) 得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 1.44 (9H, s), 1.63-1.71 (2H, m), 2.46 (2H, t, J = 6.7 Hz),2.54-2.58 (4H, m), 3.02-3.06 (4H, m), 3.16-3.23 (2H, m), 5.26-5.32 (1H, m),7.31 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.39 (2H, d, J = 7.8 Hz), 7.49-7.54 (3H, m), 7.77(1H, s).
ESI-MS: m/z518 (M+H)+.
【００９４】
（２）化合物Ｇ（3-[4-(3-アミノプロピル)ピペラジン-1-イル]-N-(4-クロロフェニル)-2-ニトロベンズアミド (3)）の合成
t-ブチル {3-[4-(3-{[(4-クロロフェニル)アミノ]カルボニル}-2-ニトロフェニル)ピペラジン-1-イル]プロピル}カルバメート (2) 466 mg (0.9 mmol) をジクロロメタン (5 ml) に溶解し、トリフルオロ酢酸 5mlを加えた後、室温で1時間撹拌した。反応液を濃縮し、残渣に1 mol/l 塩酸-エタノール溶液を5 ml加え濃縮した。析出結晶を濾取し乾燥することにより標記化合物Ｇ(3) を370 mg (収率 81%) 得た。
1H-NMR (DMSO-d6) δ: 2.02-2.12 (2H, m), 2.87-2.96 (2H, m), 2.98-3.10 (2H, m), 3.24-3.55(8H, m), 7.41 (2H, dt, J = 9.5, 2.5 Hz), 7.66-7.77 (5H, m), 8.17 (3H, br s),10.91 (1H, s), 11.48 (1H, br s).
Anal. Calcdfor C20H24N5O3Cl 2HCl, H2O:C, 47.21; H, 5.55; N, 13.76. Found: C, 46.73; H, 5.74; N, 13.26.
ESI-MS: m/z418 (M+H)+.
【００９５】
（３）化合物Ｆ（3-[4-(3-アセチルアミノプロピル)ピペラジン-1-イル]-N-(4-クロロフェニル)-2-ニトロベンズアミド (4)）の合成
3-[4-(3-アミノプロピル)ピペラジン-1-イル]-N-(4-クロロフェニル)-2-ニトロベンズアミド (3) 10 mg （0.02 mmol), トリエチルアミン (30 μl）をジクロロメタン (0.2 ml)に溶解し、アセチルクロリド (10 μl）を加えて一晩攪拌した。反応液を濃縮し、高速液体クロマトグラフィーで精製し、標記化合物Ｆ (4)を6.5 mg (71 %) 得た。
ESI-MS: m/z 460(M+H)+.
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】実施例２の電気泳動の結果を表す写真である。Ｃは化合物Ａを固定していない磁性ナノビーズを表し、Ａは化合物Ａ固定磁性ナノビーズを表す。矢印は、化合物Ａに特異的に結合する約５２ｋＤａのタンパク質のバンドを表す。
【図２】実施例３の電気泳動及びウエスタンブロットの結果を表す写真である。Ａは電気泳動の結果を表し、Ｂはウエスタンブロットの結果を表す。矢印は、化合物Ａに特異的に結合するATP合成酵素サブユニットαのバンドを表す。
【図３】実施例４の電気泳動及びウエスタンブロットの結果を表す写真である。
【図４】実施例５の各画分の純度確認のための電気泳動及びウエスタンブロットの結果を表す写真である。
【図５】実施例５の各化合物のATP合成酵素阻害活性を表すグラフである。縦軸は６３０ｎｍにおけるΔ吸光度を、横軸は化合物の種類及び濃度を表す。
【図６】実施例６の抗リウマチ化合物による幼若化抑制活性を表すグラフである。ＡはＣｏｎＡで刺激したときの結果を、ＢはＬＰＳで刺激したときの結果を表す。
【図７】実施例７のATP合成酵素阻害剤による幼若化抑制活性を表すグラフである。ＡはＣｏｎＡで刺激したときの結果を、ＢはＬＰＳで刺激したときの結果を表す。
【図８】実施例８のATP合成酵素阻害剤によるサイトカイン産生阻害活性を表すグラフである。ＡはＣｏｎＡ刺激によるIL-2産生を阻害する結果を、ＢはＬＰＳ刺激によるTNF-α産生を阻害する結果を表す。
【図９】実施例９の抗リウマチ化合物又はATP合成酵素阻害剤によるIgM産生阻害活性を表すグラフである。Ａは化合物Ａ、Ｅ、Ｆ及びＧによるATP合成酵素阻害の結果を、ＢはATP合成酵素阻害剤によるATP合成酵素阻害の結果をそれぞれ示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、インターロイキン２（Interleukin-2;IL-2）の産生阻害剤の同定方法。
【請求項２】
ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、腫瘍壊死因子α（Tumornecrosis factor-alpha; TNF-α）の産生阻害剤の同定方法。
【請求項３】
ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、免疫グロブリンＭ（ImmunoglobulinM; IgM）の産生阻害剤の同定方法。
【請求項４】
以下の工程を含む、インターロイキン２（Interleukin-2;IL-2）の産生阻害剤の同定方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
【請求項５】
以下の工程を含む、腫瘍壊死因子α（Tumor necrosis factor-alpha; TNF-α）の産生阻害剤の同定方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
【請求項６】
以下の工程を含む、免疫グロブリンＭ（Immunoglobulin M; IgM）の産生阻害剤の同定方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
【請求項７】
ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、リンパ球の幼若化抑制剤の同定方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、リンパ球の幼若化抑制剤の同定方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
【請求項９】
ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を同定する方法。
【請求項１０】
以下の工程を含む、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を同定する方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
【請求項１１】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、クローン病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、全身性硬化症又は喘息である、請求項９又は１０に記載の自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を同定する方法。
【請求項１】
ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、インターロイキン２（Interleukin-2;IL-2）の産生阻害剤の同定方法。
【請求項２】
ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、腫瘍壊死因子α（Tumornecrosis factor-alpha; TNF-α）の産生阻害剤の同定方法。
【請求項３】
ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、免疫グロブリンＭ（ImmunoglobulinM; IgM）の産生阻害剤の同定方法。
【請求項４】
以下の工程を含む、インターロイキン２（Interleukin-2;IL-2）の産生阻害剤の同定方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
【請求項５】
以下の工程を含む、腫瘍壊死因子α（Tumor necrosis factor-alpha; TNF-α）の産生阻害剤の同定方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
【請求項６】
以下の工程を含む、免疫グロブリンＭ（Immunoglobulin M; IgM）の産生阻害剤の同定方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
【請求項７】
ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、リンパ球の幼若化抑制剤の同定方法。
【請求項８】
以下の工程を含む、リンパ球の幼若化抑制剤の同定方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
【請求項９】
ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)の阻害を指標とする、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を同定する方法。
【請求項１０】
以下の工程を含む、自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を同定する方法；
（１） 被験化合物存在下、ATP合成酵素(FOF1-ATP synthase)のATP加水分解活性を測定する工程、及び、
（２） （１）で測定したATP加水分解活性と被験化合物非存在下におけるATP合成酵素のATP加水分解活性を比較する工程。
【請求項１１】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、クローン病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、インシュリン依存性糖尿病、全身性硬化症又は喘息である、請求項９又は１０に記載の自己免疫疾患の予防及び／又は治療剤の有効成分を同定する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００７−２２８８０８（Ｐ２００７−２２８８０８Ａ）
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０８５１（Ｐ２００６−５０８５１）
【出願日】平成１８年２月２７日（２００６．２．２７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１５年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「健康安心プログラム／ナノ微粒子利用スクリーニングプロジェクト」委託研究、産業活力再生特別措置法３０条の適用を受ける特許出願）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月１３日（２００７．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月２７日（２００６．２．２７）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１５年度独立行政法人新エネルギー・産業技術総合開発機構「健康安心プログラム／ナノ微粒子利用スクリーニングプロジェクト」委託研究、産業活力再生特別措置法３０条の適用を受ける特許出願）
【出願人】（３０４０２１４１７）国立大学法人東京工業大学 (1,821)
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
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