自己動力供給式（ｓｅｌｆ−ｐｏｗｅｒｅｄ）バイオセンサー
【課題】本発明の目的は、液体中の有機物質の濃度および／または存在を決定するための酵素に基づくバイオセンサーを提供することである。
【解決手段】本発明は液体媒質中の検体を決定するシステムを提供する。システムは、自己動力供給式バイオセンサー、ならびに検体が酸化または還元されつつある間該バイオセンサーによって生成される電気シグナルを測定するための検出器を含んでなり、そしてバイオセンサーは、電極の１つがアノードであり、他方がカソードである１対の電極を含有し、両電極はそれらの表面に酸化還元酵素を担持している。検体の存在下で、電極の１つに担持される酵素は、検体がそれぞれ酸化または還元される酸化または還元反応を触媒することができ、そして該１対の電極の他方は、酸化剤または還元剤がそれぞれ還元または酸化される反応を触媒できる酵素をその表面に担持している。
【解決手段】本発明は液体媒質中の検体を決定するシステムを提供する。システムは、自己動力供給式バイオセンサー、ならびに検体が酸化または還元されつつある間該バイオセンサーによって生成される電気シグナルを測定するための検出器を含んでなり、そしてバイオセンサーは、電極の１つがアノードであり、他方がカソードである１対の電極を含有し、両電極はそれらの表面に酸化還元酵素を担持している。検体の存在下で、電極の１つに担持される酵素は、検体がそれぞれ酸化または還元される酸化または還元反応を触媒することができ、そして該１対の電極の他方は、酸化剤または還元剤がそれぞれ還元または酸化される反応を触媒できる酵素をその表面に担持している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物電子工学の分野にあり、そしてそれは一般に、液体媒質、例えば、環境、工業または臨床起源の媒質中の有機検体の濃度および／または存在を測定するために有用なバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物電子工学デバイスの基本的特徴は、伝導性または半伝導性支持体上への生物材料の固定化、ならびに生物学的基質に関連した生物学的機能の電子工学的変換（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）である。
【０００３】
バイオセンサーは、適当なトランスデューサーに直接連結されるかまたはそれを組み込まれるか、いずれかにより生物学的および化学的感知（ｓｅｎｓｉｎｇ）要素を組み入れている分析デバイスであり、特定の化学薬品の濃度の電子工学的シグナルへの変換を可能にする。従来製造された大多数のバイオセンサーは、生物学的感知要素として酵素を組み入れている（１）。また、酵素−基質相互作用の電子工学的変換は、それぞれの基質を検出するための分析手段を提供できる。伝導性または半伝導性支持体上に酵素を集合する化学的手段は、自己集合性の単分子層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）または薄膜、高分子層、メンブラン、カーボンペースト（ｃａｒｂｏｎ ｐａｓｔｅ）またはゾル−ゲル材料を用いて基質上にそれらを固定化することを含む。
【０００４】
分析生物化学法における使用のために提案された特定の酵素類は酸化還元酵素である。酸化還元反応は、還元反応において酵素から検体へ、または酸化反応において検体から酵素への電子の移動を必要とする。酵素分子の酸化還元中心と電極材料との間の電気的連絡が存在する場合、検体の存在の指示として働くことができる電荷の流れがあり、そして電荷の流れの程度が検体の濃度を測定するために役立つであろう。あるいはまた、決定は、非電気化学的手段、例えばＨＰＬＣによる反応の生成物の測定に基づいてもよい。
【０００５】
酸化還元中心は、タンパク質骨格によって立体的に隔離されているので、酵素の酸化還元中心と電極との間の直接の電子移動は制限される。その結果、酸化還元酵素と電極間の電気的連絡は、しばしばまた、「電子リレー」（２）と呼ばれる電子メディエーターグループによるか、または電気活性ポリマー（３）中に酸化還元タンパク質を固定化することによって達成することができる。
【０００６】
生物電気触媒性電極の魅力的な応用の１つは、生物燃料電池アセンブリーの開発である。生物燃料電池は、化学エネルギーの電気エネルギーへの変換のために生物触媒を利用する。多くの有機物質は酸素中での燃焼を受けるか、またはエネルギーの放出を伴って酸化される。メタノールおよびグルコースは、酸化を受ける生物燃料として使用できる豊富な原料であり、そして分子状酸素または過酸化水素が酸化剤として作用できる。
【０００７】
例えば、メタノールが燃料として使用される古典的な燃料電池では、アノードにおけるメタノールの電気−酸化は：
ＣＨ３ＯＨ＋Ｈ２Ｏ → ＣＯ２＋６Ｈ＋＋６ｅ−
によって表すことができ、そしてカソードにおける酸素の電気−還元は：
Ｏ２＋４Ｈ＋＋４ｅ− → ２Ｈ２Ｏ
によって表すことができる。
【０００８】
アノードにおいて生成したプロトンはカソードに輸送される。電流の流れは、電池をカソードとアノードの区画に別ける膜を通してのイオンの流れと、外部負荷を通しての電子の流れによって維持される。
【０００９】
Ｏ２によるグルコースの生物電気触媒酸化に基づく生物燃料電池アセンブリー（４）の例が、図１において図式的に示される。電池は２つの電極からなり、この場合アノードは、表面に再構成されたグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）単分子層によって機能化され、そしてカソードは、チトクロームｃ（Ｃｙｔｃ）とチトクロームオキシダーゼ（ＣＯｘ）からなる統合された生物触媒構築物により改変されている。ＧＯｘ単分子層で機能化した電極では、グルコン酸へのグルコースの生物電気触媒酸化が起き、一方Ｃｙｔｃ／ＣＯｘ重層電極では、水へのＯ２の還元が起きる。ＧＯｘ層は、ピロロキノリノキノン（ＰＱＱ）単分子層に共有結合したアミノ−ＦＡＤ上へのアポ−ＧＯｘ（ＦＡＤ補因子のないＧＯｘ）の再構成によって生成される。ＰＱＱユニットは、アノードと酵素の酸化還元中心との間を架橋する電子移動メディエーターとして働く。
【００１０】
生物燃料電池を組み立てるための異なるアプローチは、１，４−ジヒドロニコチンアミド補因子の生物電気触媒酸化に基づく。種々の基質、例えばアルコール、ヒドロキシ酸または糖が、ＮＡＤ（Ｐ）＋補因子に依存する酵素による生物触媒酸化を受ける（５）。
【００１１】
当該技術分野において既知である電気化学的、特に電流測定式バイオセンサーは外部動力源によって動力を供給される。この動力源は、電極に外部電圧を印加し、それにより電極を分極し、そして電子移動反応を提供するために使用される。
【００１２】
先行技術は、関心のある生物学的検体を正確に測定する道具として電流測定式バイオセンシングシステムの使用を教示している。しかしながら、これらのバイオセンサーの適用では、多くの問題、例えば感知デバイスの相対的な感度、選択性および安定性が生じる。特に、若干のシステムは、試験サンプル中に存在する妨害因子の存在により不正確になりやすい。例えば、グルコースの生物触媒酸化は検体の混入物としてのアスコルビン酸または尿酸によって妨害される。
【００１３】
かくして、高度に選択性で、感受性であり、そしてサンプル中に存在する他の化学物質によって妨害されにくいバイオセンサーのための当該技術分野におけるニーズが存在する。
【００１４】
（先行技術）
下記の説明において、引用は、以下の引用文献のリストにおいて示される数種の先行技術文献について作成されている。引用はリストからそれらの数字を括弧内に指示することによって作成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特表２００３‐５０４６２１号公報
【特許文献２】特表２００２‐５２００３２号公報
【特許文献３】特表２０００‐５００３８０号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｗｉｌｌｎｅｒ Ｉ．ａｎｄ Ｋａｔｚ Ｅ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０００，３９，１１８０−１２１８．
【非特許文献２】（ａ）Ｓｃｈｕｈｍａｎｎ，Ｗ．；Ｏｈａｒａ，Ｔ．Ｊ．；Ｓｃｈｕｍｉｄｔ，Ｈ．Ｌ．；Ｈｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９１，１１３，１３９４−１３９７．（ｂ）Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．；Ｒｉｋｌｉｎ，Ａ．；Ｓｈｏｈａｍ，Ｂ．；Ｒｉｖｅｎｚｏｎ，Ｄ．；Ｋａｔｚ，Ｅ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，１９９３，５，９１２−９１５．
【非特許文献３】（ａ）Ｈｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９９２，９６，３５７９−３５８７．（ｂ）Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ；Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｂ．Ｒｅａｃｔ．Ｐｏｌｙｍ．１９９４，２２，２６７−２７９．
【非特許文献４】Ｋａｔｚ，Ｅ．，Ｗｉｌｌｎｅｒ Ｉ．，Ｋｏｔｌｙａｒ Ａ．Ｂ．，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．１９９９，４７９，６４−６８．
【非特許文献５】（ａ）Ｂａｒｄｅａ，Ａ．；Ｋａｔｚ，Ｅ．；Ｂ□ｃｋｍａｎ，Ａ．Ｆ．；Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９７，１１９，９１１４−９１１９．（ｂ）Ｋａｔｚ，Ｅ．；Ｈｅｌｅｇ−Ｓｈａｂｔａｉ，Ｖ．；Ｂａｒｄｅａ，Ａ．；Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．；Ｒａｕ Ｈ．Ｋ．；Ｈｅｃｈｎｅｌ，Ｗ．，Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１９９８，１３，７４１−７５６．
【非特許文献６】Ｅｕｇｅｎｉｉ Ｋａｔｚ 外２名，Ａ ｎｏｎ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｜ Ｏ２ ｂｉｏｆｕｅｌ ｃｅｌｌ ｂｙ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ｓｕｒｆａｃｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９年１２月１５日，Ｖｏｌ．４７９ Ｎｏ．１，第６４−６８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、液体中の有機物質の濃度および／または存在を決定するための酵素に基づくバイオセンサーを提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、液体媒質中の有機物質の濃度および／または存在を測定する方法であって、試験される被験者における体液内の検体の侵襲的（ｉｎｖａｓｉｖｅ）測定のためにまた応用可能である方法を提供することである。
【００１９】
検出器に電線によって連結された２つの酵素電極からなる生物燃料電池アセンブリーは、本アセンブリーにおいて生成した電圧および電流が試験される検体の定量および／または同定の指標となることから、分析用バイオセンサーとして使用されてもよいことが、本発明において見い出された。
【００２０】
かくして、生物触媒性酸化または還元を受けることが可能な少なくとも１種の物質を含有する流体によって自己動力供給されるバイオセンサーが、本発明において提供される。本発明のバイオセンサーは、環境、工業または臨床起源、例えば血液試験、生物触媒リアクター、ワイン発酵工程等々の流体中の検体の濃度および／または同定の決定において、移植した侵襲的デバイスとしてイン・ビボで、または非侵襲的デバイスとしてエクス・ビボで使用されてもよい。さらにまた、電極には電位が印加されないので、バイオセンサーの作動は特異的であり、そして混入物によって妨害されない。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
特に、本発明は、第１の態様によれば、自己動力供給式バイオセンサー、ならびに検体が酸化または還元されつつある間該バイオセンサーによって生成される電気シグナル（電圧または電流）を測定するための検出器を含んでなる、液体媒質中の検体を決定するシステムを提供する。検体は、それぞれ酸化剤または還元剤の存在下で生物触媒酸化または還元を受けることができる。バイオセンサーは、電極の１つがアノードであり、他方がカソードである１対の電極を含有し、両電極はそれらの表面に酸化還元酵素を担持しており、検体の存在下で電極の１つに担持される酵素は、検体がそれぞれ酸化または還元される酸化または還元反応を触媒することができ、そして該１対の電極の他方は、酸化剤または還元剤がそれぞれ還元または酸化される反応を触媒できる酵素をその表面に担持している。
【００２２】
用語「決定（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）」は、物質の濃度および／または存在を測定することを意味すると理解すべきである。
【００２３】
電極によって担持される酵素は酸化還元型の酵素である。酸化還元酵素は、例えば：フラビンアデニンジヌクレオチドリン酸（ＦＡＤ）、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、ヘム、鉄−硫黄クラスターおよびその他のような補因子に依存する。
【００２４】
本発明のセンサーによって検出できる検体は、生物触媒酸化または還元反応を受けることが可能なそれらのものである。好ましくは、検体は通常有機物質であり、そして本発明は、酸化可能な有機検体を参照しながら以下に記述されるであろう。そのような検体の例は、糖分子、例えばグルコース、フルクトース、マンノースなど；ヒドロキシまたはカルボキシ化合物、例えば乳酸塩、エタノール、メタノール、ギ酸；アミノ酸または酸化還元酵素の基質として役立つすべての他の有機材料である。
【００２５】
本発明のバイオセンサーにおける使用のために適当な電極は、伝導性または半伝導性材料、例えば金、白金、パラジウム、銀、炭素、銅、インジウム錫酸化物（ＩＴＯ）などから作られる。侵襲的分析では、電極は、生体適合性の非有害物質から構築され、そして侵襲的貫通に際して痛みを排除する細い針として製作されねばならない。
【００２６】
本発明のバイオセンサーは、通常、電極間の膜なしで使用され、そしてこれは、侵襲的適用において使用される場合には特に、バイオセンサーの大きな利点になる。それにもかかわらず、バイオセンサーは、必要な場合にはまた膜を用いて作動されてもよい。
【００２７】
バイオセンサーとして使用する電極を改変するために使用されるアプローチは、２群に分けることができる：（ａ）単分子層の沈着による電極表面の改変であって、単分子層は、例えば電子メディエーターおよび酵素の、１種類の電極表面における吸着か、または１種類の電極への共有結合かいずれかに基づく、および（ｂ）多分子層による改変であって、これは、電極の重合改変の使用によってもっともしばしば達成される。
【００２８】
アノード、すなわち作動電極は、酸化反応を触媒することができる酵素、ならびに好ましくはまたアノードと酵素との間の電子の移動を増強できる電子メディエーターグループ（ｇｒｏｕｐ）を含んでなる層をその表面に担持する。
【００２９】
酵素は、好ましくは、特定の検体を酸化するその能力にしたがって選ばれる。したがって、本発明のバイオセンサーはまた、特定の検体の存在を確認するために使用されてもよい。アノードの配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）において使用できる酵素は、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）（この場合検体はグルコースである）、乳酸をピルビン酸に転化する乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、フルクトースデヒドロゲナーゼ、コリンオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミノ酸オキシダーゼなどを含む。
【００３０】
酸化還元酵素の酸化還元中心の接近不可能な性質のため、電子連絡のメディエーターが、好ましくは、メディエーターと酵素とを物理的に混合することによるか、またはメディエーターを酵素に化学的に結合させることによるかいずれかでバイオセンサーに付加され、酵素を介した反応物または所望の検体から電極への電子移動を増強する。例えば、グルコースセンサーのためのメディエーターは、電子受容体、例えば、フェロセン誘導体、キノン、種々の有機染料、有機の酸化還元ポリマー、例えばポリアニリン、無機の酸化還元マトリックス、例えば紺青などである。
【００３１】
カソードは、酸化剤、好ましくは酸素の水への還元を触媒することができる酵素または酵素アセンブリー、ならびに場合によってはカソードと酵素間の電気的接触を増強するメディエーター、を含んでなる層をその表面上に担持する。そのような酵素または酵素アセンブリーの例は、ラッカーゼ、およびチトクロームｃ／チトクロームオキシダーゼ（ＣＯｘ）から形成される複合体である。例えば、ラッカーゼの場合には、電子は最終的に酸化剤、例えば分子状酸素（Ｏ２）に移動されて水を生成する。酵素は４個の電子を蓄え、そしてＯ２還元経路において中間体を放出しない。チトクロームｃ／チトクロームオキシダーゼ（ＣＯｘ）の場合には、チトクロームオキシダーゼへのチトクロームｃに媒介される電子の移動は、また、水への酸素の４電子還元をもたらす。
【００３２】
第２の態様によれば、本発明は、検体がそれぞれ酸化剤または還元剤の存在下で生物触媒酸化または還元反応を受けることができる、液体媒質中の該検体を決定するための方法であって、
（ｉ）本発明のシステムを提供し；
（ｉｉ）システムのバイオセンサーを液体媒質と接触させ；
（ｉｉｉ）電気シグナルが検体の存在および／または濃度の指標となるカソードとアノード間に生成した電気シグナルを測定し；
（ｉｖ）電気シグナルに基づいて検体を決定すること：
を含んでなる方法を提供する。
【００３３】
例えば、液体媒質が体液、例えば血液、リンパ液または脳脊髄液であり、そして方法が侵襲的方式で実施される場合、本方法は、体内にバイオセンサーを挿入し、そしてそれを体液と接触させ、そして体内の体液中の検体を決定することを含んでなる。あるいはまた、体液またはすべての他の検体が非侵襲的式に試験されてもよく、そのような場合には、本方法は媒質に酸化剤または還元剤を添加することを含む。
【００３４】
検体の例は、糖分子、例えばグルコース、フルクトース、マルトース；乳酸塩；ビリルビン；アルコールまたはアミノ酸である。
【００３５】
本発明を理解し、そしてそれが実際に如何にして実施できるかを知るために、好適な実施態様が、付随する図面に関して、限定されない例によってのみここに記述される：
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、Ｏ２によるグルコースの生物電気触媒酸化に基づく生物燃料電池アセンブリーの概要図による表示である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明によるバイオセンサーデバイスを図示によって具体的に説明する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明によるバイオセンサーデバイスを図示によって具体的に説明する。
【図３】図３は、アノードにおける酵素ＧＯｘおよびカソードにおけるＣｙｔｃ／ＣＯｘに基づくグルコースバイオセンサーのためのアノードおよびカソードの配置の概要図による表示である。
【図４】図４は、２つの校正曲線：ａ）グルコースについての校正曲線；ｂ）乳酸塩についての校正曲線を示すグラフである。
【図５】図５は、（ａ）空気を飽和した０．１Ｍリン酸バッファー、（ｂ）空気を飽和した５０ｍＭアスコルビン酸、（ｃ）空気を飽和した８ｍＭグルコース、（ｄ）Ｏ２を含まない（Ａｒ雰囲気下の）５０ｍＭグルコース：の注入において、ＰＱＱ−ＦＡＤ／ＧＯｘおよびＣｙｔｃ／ＣＯｘで機能化した電極からなる生物燃料電池に基づくバイオセンサーの開放回路電圧（Ｖｏｃ）を示すグラフである。矢印は注入時を示す。空気で平衡化したリン酸バッファー、０．１Ｍ，ｐＨ＝７．０が、別に記述されない限りバックグラウンド電解質として使用された；温度約３０℃。
【図６】図６は、それぞれアノードおよびカソードにおける酵素乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）およびＣｙｔｃ／ＣＯｘに基づく乳酸バイオセンサーのためのアノードおよびカソードの配置の概要図による表示である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＰＱＱ−ＦＡＤ／ＧＯｘアノードを用いる、流動セル中に注入したグルコースの可変濃度における開放回路電圧（Ｖｏｃ）を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＰＱＱ−ＮＡＤ＋／ＬＤＨアノードを用いる、流動セル中に注入した乳酸塩の可変濃度における解放回路電圧（Ｖｏｃ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
（実施例）
次に示す特定の実施態様は、本発明を具体的に説明することを意図しており、そしてその範囲を限定するものと考えるべきではない。
【００３８】
引用は、本発明のシステムにおいて使用されてもよいバイオセンサーの簡単な配置を概要図により示す図２Ａおよび２Ｂについてなされる。しかしながら、本発明の概念に基づく多くの他のアセンブリーが構成されてもよい。かくして、図２Ａは、アノード１２およびカソード１４として働く２つの酵素で機能化されたＡｕ電極（活性面積約０．１９ｃｍ２）からなる流動注入セルとして構成したバイオセンサー１０（全てのその部分をあわせて組み立てる前）を示す。両電極はガラス板１６および１８上に支持され、そしてゴムＯリング２０（厚さ約２ｍｍ）によって分離される。ゴムリング中に埋め込まれた針２２および２４は、ユニットを流動セルに転換し、ここを液体媒質が流速１ｍＬｍｉｎ−１で流動できる。カソードとアノード間の距離は約２ｍｍである。図２Ｂは、組み立てた形態における同デバイスを示す。
【００３９】
図２Ａおよび２Ｂにおいて示したデバイスが膜なしで作動することに注目すべきであり、そしてこの可能性がバイオセンサーの配置をはるかに簡単にするので、このことは、特に侵襲的適用のための本発明のバイオセンサーの有意な利点である。しかしながら、本発明のバイオセンサーは好ましくは電極間の膜なしで作動するけれども、それは、同時に、例えば非侵襲的適用において膜を用いてもまた作動することができる。
【００４０】
液体媒質は、試験される検体と酸化剤をその中に溶解した溶液を含有する。例えば、非侵襲的適用において、酸化剤が酸素である場合は、溶液は分析前に酸素により飽和される。バイオセンサーの作動中、酸化剤の濃度は一定に保たれるべきである。これに対して、検体の濃度の代わりに酸素の濃度を測定することが望まれる場合、その時は検体の濃度が一定に保たれねばならない。
【００４１】
図３は、グルコースの濃度を測定するバイオセンサーのためのアノードおよびカソードの配置を示す。グルコースオキシダーゼアノードは、ピロロキノリノキノン（ＰＱＱ，図３における化合物Ｉ）単分子層に共有結合されたアミノエチルフラビンアデニンジヌクレオチドリン酸（アミノ−ＦＡＤ、図３における化合物ＩＩ）上へのアポＧＯｘの再構成によって生成される。カソードは、Ａｕ電極上に集合されたグルタル酸ジアルデヒドで架橋されたＣｙｔｃ／ＣＯｘ単分子層からなる。
【００４２】
図４は、流動条件下で２電極セルへの可変グルコース濃度の注入において、図３に示したグルコース動力供給電池の開放回路電圧（Ｖｏｃ）を示す。校正曲線は、電極電位のネルンスト制御濃度依存性について期待されるような対数関係をたどる。グルコースは濃度範囲１ｍＭ−８０ｍＭにおいて感知される。グルコースの不在下では電圧出力はない（図５，注入（ａ））。自己動力供給式電池は、連続作動条件下では３０℃で５時間安定である。アノードおよびカソードは、０℃で乾燥状態での貯蔵では少なくとも２カ月間安定である。電圧電池はアスコルビン酸，５０ｍＭの添加では乱されない（図５，注入（ｂ））。また、電圧は、アルゴンの不活性雰囲気下でグルコース，５０ｍＭの添加では電池において発生しない（図５，注入（ｄ））。この後者の実験は、電池によるグルコースの感知が、それぞれアノードとカソードによる同時の酸化（グルコースの）と還元（水への酸素の）を必要とすることを明らかに示している。
【００４３】
図６は、乳酸濃度を測定するバイオセンサーの配置を示す。アノードの配置は、組み込んだ乳酸デヒドロゲナーゼ，ＬＤＨを重層した電極からなる。Ａｕ電極に結合したピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）単分子層に、アミノエチルで機能化したＮＡＤ＋（アミノ−ＮＡＤ＋，図６における化合物ＩＩＩ）がカップリングされた（３）。ＬＤＨとＰＱＱ−ＮＡＤ＋単分子層アセンブリー間に形成された親和力−複合体はグルタル酸ジアルデヒドにより架橋され、組み込まれた電気的に接触したＬＤＨ−機能化電極が得られた。ＬＤＨ−改変電極およびＣｙｔｃ／ＣＯｘ重層電極は、それぞれ、自己動力供給式乳酸感知電池のアノードとカソードとして用いられた。図４，曲線ｂは、流動条件下で電池への可変濃度の乳酸の注入における電池の開放回路電圧，Ｖｏｃを示す。図４ｂの校正曲線は、乳酸塩が濃度範囲１ｍＭ−８０ｍＭにおいて感知されることを示している。対照実験は、アスコルビン酸，５０ｍＭまたはグルコース，５０ｍＭの注入において、または乳酸塩，５０ｍＭがアルゴンの不活性雰囲気下で電池に注入される場合には、開放回路電位が電池に発生しないことを証明している。これらの対照実験は、乳酸の検出が生物燃料電池要素としてアノードおよびカソードの同時作動の結果であることを示している。自己燃料式乳酸感知デバイスは、連続作動条件下では７時間安定であり、そして組み込んだＬＤＨ−機能化電極は、０℃で乾燥状態での貯蔵では少なくとも２カ月間安定である。
【００４４】
図７は、（Ａ）ＰＱＱ−ＦＡＤ／ＧＯｘアノードを用いるグルコースの感知において、（Ｂ）ＰＱＱ−ＮＡＤ＋／ＬＤＨアノードを用いる乳酸の感知において、生物燃料電池に基づくセンサーデバイス中への基質の可変濃度における開放回路電圧（Ｖｏｃ）を示す。両システムでは、Ｃｙｔｃ／ＣＯｘ機能化電極がカソードとして適用された。矢印は、濃度それぞれ１ｍＭ，２ｍＭ，４ｍＭ，８ｍＭ，１５ｍＭ，２５ｍＭおよび５０ｍＭにおける基質を含む、ｐＨ７．０の１ｍＬリン酸バッファー、０．１Ｍからなるサンプルの注入を示す。全データは、空気飽和の０．１Ｍリン酸バッファー，ｐＨ７．０，３０℃において記録された。
【００４５】
結論として、本発明は、化学エネルギーから電気化学エネルギーへの変換に基づくバイオセンサーシステムの新規概念を導入した。これらの生物燃料電池は低効率において作動し、そしてエネルギー供給器としての応用は限定されるけれども、引き出しうる電力は感知する事象を証明するには十分である。事実、電池の低い電力出力は、それが電極における妨害物質の酸化還元変換を排除するので、感知工程では利点を有する。本感知デバイスは外部動力源なしに作動するので、それらを魅力的な侵襲的感知要素に変える。
【００４６】
本発明の自己動力供給式バイオセンサーの利点は数多く存在する、なかんずく；（ｉ）センサーは２つの電極のみからなり、そして電極に印加される外部電圧は存在しない；（ｉｉ）システムは生物学的流体によって自己で動力供給されるので、センサーは移植した侵襲的感知デバイスとして機能できる；（ｉｉｉ）電位が電極に印加されないので、本バイオセンサーデバイスの作動は特異的であり、そしてそれは混入物によって妨害されない；（ｉｖ）システムは基質の不在下では電圧を生じないので、基質の１濃度でもシステムを校正するのに十分である。
【符号の説明】
【００４７】
１０ バイオセンサー
１２ アノード
１４ カソード
１６、１８ ガラス板
２０ ゴムＯリング
２２、２４ 針
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物電子工学の分野にあり、そしてそれは一般に、液体媒質、例えば、環境、工業または臨床起源の媒質中の有機検体の濃度および／または存在を測定するために有用なバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物電子工学デバイスの基本的特徴は、伝導性または半伝導性支持体上への生物材料の固定化、ならびに生物学的基質に関連した生物学的機能の電子工学的変換（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）である。
【０００３】
バイオセンサーは、適当なトランスデューサーに直接連結されるかまたはそれを組み込まれるか、いずれかにより生物学的および化学的感知（ｓｅｎｓｉｎｇ）要素を組み入れている分析デバイスであり、特定の化学薬品の濃度の電子工学的シグナルへの変換を可能にする。従来製造された大多数のバイオセンサーは、生物学的感知要素として酵素を組み入れている（１）。また、酵素−基質相互作用の電子工学的変換は、それぞれの基質を検出するための分析手段を提供できる。伝導性または半伝導性支持体上に酵素を集合する化学的手段は、自己集合性の単分子層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）または薄膜、高分子層、メンブラン、カーボンペースト（ｃａｒｂｏｎ ｐａｓｔｅ）またはゾル−ゲル材料を用いて基質上にそれらを固定化することを含む。
【０００４】
分析生物化学法における使用のために提案された特定の酵素類は酸化還元酵素である。酸化還元反応は、還元反応において酵素から検体へ、または酸化反応において検体から酵素への電子の移動を必要とする。酵素分子の酸化還元中心と電極材料との間の電気的連絡が存在する場合、検体の存在の指示として働くことができる電荷の流れがあり、そして電荷の流れの程度が検体の濃度を測定するために役立つであろう。あるいはまた、決定は、非電気化学的手段、例えばＨＰＬＣによる反応の生成物の測定に基づいてもよい。
【０００５】
酸化還元中心は、タンパク質骨格によって立体的に隔離されているので、酵素の酸化還元中心と電極との間の直接の電子移動は制限される。その結果、酸化還元酵素と電極間の電気的連絡は、しばしばまた、「電子リレー」（２）と呼ばれる電子メディエーターグループによるか、または電気活性ポリマー（３）中に酸化還元タンパク質を固定化することによって達成することができる。
【０００６】
生物電気触媒性電極の魅力的な応用の１つは、生物燃料電池アセンブリーの開発である。生物燃料電池は、化学エネルギーの電気エネルギーへの変換のために生物触媒を利用する。多くの有機物質は酸素中での燃焼を受けるか、またはエネルギーの放出を伴って酸化される。メタノールおよびグルコースは、酸化を受ける生物燃料として使用できる豊富な原料であり、そして分子状酸素または過酸化水素が酸化剤として作用できる。
【０００７】
例えば、メタノールが燃料として使用される古典的な燃料電池では、アノードにおけるメタノールの電気−酸化は：
ＣＨ３ＯＨ＋Ｈ２Ｏ → ＣＯ２＋６Ｈ＋＋６ｅ−
によって表すことができ、そしてカソードにおける酸素の電気−還元は：
Ｏ２＋４Ｈ＋＋４ｅ− → ２Ｈ２Ｏ
によって表すことができる。
【０００８】
アノードにおいて生成したプロトンはカソードに輸送される。電流の流れは、電池をカソードとアノードの区画に別ける膜を通してのイオンの流れと、外部負荷を通しての電子の流れによって維持される。
【０００９】
Ｏ２によるグルコースの生物電気触媒酸化に基づく生物燃料電池アセンブリー（４）の例が、図１において図式的に示される。電池は２つの電極からなり、この場合アノードは、表面に再構成されたグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）単分子層によって機能化され、そしてカソードは、チトクロームｃ（Ｃｙｔｃ）とチトクロームオキシダーゼ（ＣＯｘ）からなる統合された生物触媒構築物により改変されている。ＧＯｘ単分子層で機能化した電極では、グルコン酸へのグルコースの生物電気触媒酸化が起き、一方Ｃｙｔｃ／ＣＯｘ重層電極では、水へのＯ２の還元が起きる。ＧＯｘ層は、ピロロキノリノキノン（ＰＱＱ）単分子層に共有結合したアミノ−ＦＡＤ上へのアポ−ＧＯｘ（ＦＡＤ補因子のないＧＯｘ）の再構成によって生成される。ＰＱＱユニットは、アノードと酵素の酸化還元中心との間を架橋する電子移動メディエーターとして働く。
【００１０】
生物燃料電池を組み立てるための異なるアプローチは、１，４−ジヒドロニコチンアミド補因子の生物電気触媒酸化に基づく。種々の基質、例えばアルコール、ヒドロキシ酸または糖が、ＮＡＤ（Ｐ）＋補因子に依存する酵素による生物触媒酸化を受ける（５）。
【００１１】
当該技術分野において既知である電気化学的、特に電流測定式バイオセンサーは外部動力源によって動力を供給される。この動力源は、電極に外部電圧を印加し、それにより電極を分極し、そして電子移動反応を提供するために使用される。
【００１２】
先行技術は、関心のある生物学的検体を正確に測定する道具として電流測定式バイオセンシングシステムの使用を教示している。しかしながら、これらのバイオセンサーの適用では、多くの問題、例えば感知デバイスの相対的な感度、選択性および安定性が生じる。特に、若干のシステムは、試験サンプル中に存在する妨害因子の存在により不正確になりやすい。例えば、グルコースの生物触媒酸化は検体の混入物としてのアスコルビン酸または尿酸によって妨害される。
【００１３】
かくして、高度に選択性で、感受性であり、そしてサンプル中に存在する他の化学物質によって妨害されにくいバイオセンサーのための当該技術分野におけるニーズが存在する。
【００１４】
（先行技術）
下記の説明において、引用は、以下の引用文献のリストにおいて示される数種の先行技術文献について作成されている。引用はリストからそれらの数字を括弧内に指示することによって作成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】特表２００３‐５０４６２１号公報
【特許文献２】特表２００２‐５２００３２号公報
【特許文献３】特表２０００‐５００３８０号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｗｉｌｌｎｅｒ Ｉ．ａｎｄ Ｋａｔｚ Ｅ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２０００，３９，１１８０−１２１８．
【非特許文献２】（ａ）Ｓｃｈｕｈｍａｎｎ，Ｗ．；Ｏｈａｒａ，Ｔ．Ｊ．；Ｓｃｈｕｍｉｄｔ，Ｈ．Ｌ．；Ｈｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９１，１１３，１３９４−１３９７．（ｂ）Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．；Ｒｉｋｌｉｎ，Ａ．；Ｓｈｏｈａｍ，Ｂ．；Ｒｉｖｅｎｚｏｎ，Ｄ．；Ｋａｔｚ，Ｅ．Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，１９９３，５，９１２−９１５．
【非特許文献３】（ａ）Ｈｅｌｌｅｒ，Ａ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９９２，９６，３５７９−３５８７．（ｂ）Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ；Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｂ．Ｒｅａｃｔ．Ｐｏｌｙｍ．１９９４，２２，２６７−２７９．
【非特許文献４】Ｋａｔｚ，Ｅ．，Ｗｉｌｌｎｅｒ Ｉ．，Ｋｏｔｌｙａｒ Ａ．Ｂ．，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．１９９９，４７９，６４−６８．
【非特許文献５】（ａ）Ｂａｒｄｅａ，Ａ．；Ｋａｔｚ，Ｅ．；Ｂ□ｃｋｍａｎ，Ａ．Ｆ．；Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９７，１１９，９１１４−９１１９．（ｂ）Ｋａｔｚ，Ｅ．；Ｈｅｌｅｇ−Ｓｈａｂｔａｉ，Ｖ．；Ｂａｒｄｅａ，Ａ．；Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．；Ｒａｕ Ｈ．Ｋ．；Ｈｅｃｈｎｅｌ，Ｗ．，Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．１９９８，１３，７４１−７５６．
【非特許文献６】Ｅｕｇｅｎｉｉ Ｋａｔｚ 外２名，Ａ ｎｏｎ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｜ Ｏ２ ｂｉｏｆｕｅｌ ｃｅｌｌ ｂｙ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ｓｕｒｆａｃｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９年１２月１５日，Ｖｏｌ．４７９ Ｎｏ．１，第６４−６８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の目的は、液体中の有機物質の濃度および／または存在を決定するための酵素に基づくバイオセンサーを提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、液体媒質中の有機物質の濃度および／または存在を測定する方法であって、試験される被験者における体液内の検体の侵襲的（ｉｎｖａｓｉｖｅ）測定のためにまた応用可能である方法を提供することである。
【００１９】
検出器に電線によって連結された２つの酵素電極からなる生物燃料電池アセンブリーは、本アセンブリーにおいて生成した電圧および電流が試験される検体の定量および／または同定の指標となることから、分析用バイオセンサーとして使用されてもよいことが、本発明において見い出された。
【００２０】
かくして、生物触媒性酸化または還元を受けることが可能な少なくとも１種の物質を含有する流体によって自己動力供給されるバイオセンサーが、本発明において提供される。本発明のバイオセンサーは、環境、工業または臨床起源、例えば血液試験、生物触媒リアクター、ワイン発酵工程等々の流体中の検体の濃度および／または同定の決定において、移植した侵襲的デバイスとしてイン・ビボで、または非侵襲的デバイスとしてエクス・ビボで使用されてもよい。さらにまた、電極には電位が印加されないので、バイオセンサーの作動は特異的であり、そして混入物によって妨害されない。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
特に、本発明は、第１の態様によれば、自己動力供給式バイオセンサー、ならびに検体が酸化または還元されつつある間該バイオセンサーによって生成される電気シグナル（電圧または電流）を測定するための検出器を含んでなる、液体媒質中の検体を決定するシステムを提供する。検体は、それぞれ酸化剤または還元剤の存在下で生物触媒酸化または還元を受けることができる。バイオセンサーは、電極の１つがアノードであり、他方がカソードである１対の電極を含有し、両電極はそれらの表面に酸化還元酵素を担持しており、検体の存在下で電極の１つに担持される酵素は、検体がそれぞれ酸化または還元される酸化または還元反応を触媒することができ、そして該１対の電極の他方は、酸化剤または還元剤がそれぞれ還元または酸化される反応を触媒できる酵素をその表面に担持している。
【００２２】
用語「決定（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）」は、物質の濃度および／または存在を測定することを意味すると理解すべきである。
【００２３】
電極によって担持される酵素は酸化還元型の酵素である。酸化還元酵素は、例えば：フラビンアデニンジヌクレオチドリン酸（ＦＡＤ）、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、ヘム、鉄−硫黄クラスターおよびその他のような補因子に依存する。
【００２４】
本発明のセンサーによって検出できる検体は、生物触媒酸化または還元反応を受けることが可能なそれらのものである。好ましくは、検体は通常有機物質であり、そして本発明は、酸化可能な有機検体を参照しながら以下に記述されるであろう。そのような検体の例は、糖分子、例えばグルコース、フルクトース、マンノースなど；ヒドロキシまたはカルボキシ化合物、例えば乳酸塩、エタノール、メタノール、ギ酸；アミノ酸または酸化還元酵素の基質として役立つすべての他の有機材料である。
【００２５】
本発明のバイオセンサーにおける使用のために適当な電極は、伝導性または半伝導性材料、例えば金、白金、パラジウム、銀、炭素、銅、インジウム錫酸化物（ＩＴＯ）などから作られる。侵襲的分析では、電極は、生体適合性の非有害物質から構築され、そして侵襲的貫通に際して痛みを排除する細い針として製作されねばならない。
【００２６】
本発明のバイオセンサーは、通常、電極間の膜なしで使用され、そしてこれは、侵襲的適用において使用される場合には特に、バイオセンサーの大きな利点になる。それにもかかわらず、バイオセンサーは、必要な場合にはまた膜を用いて作動されてもよい。
【００２７】
バイオセンサーとして使用する電極を改変するために使用されるアプローチは、２群に分けることができる：（ａ）単分子層の沈着による電極表面の改変であって、単分子層は、例えば電子メディエーターおよび酵素の、１種類の電極表面における吸着か、または１種類の電極への共有結合かいずれかに基づく、および（ｂ）多分子層による改変であって、これは、電極の重合改変の使用によってもっともしばしば達成される。
【００２８】
アノード、すなわち作動電極は、酸化反応を触媒することができる酵素、ならびに好ましくはまたアノードと酵素との間の電子の移動を増強できる電子メディエーターグループ（ｇｒｏｕｐ）を含んでなる層をその表面に担持する。
【００２９】
酵素は、好ましくは、特定の検体を酸化するその能力にしたがって選ばれる。したがって、本発明のバイオセンサーはまた、特定の検体の存在を確認するために使用されてもよい。アノードの配置（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）において使用できる酵素は、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）（この場合検体はグルコースである）、乳酸をピルビン酸に転化する乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、フルクトースデヒドロゲナーゼ、コリンオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミノ酸オキシダーゼなどを含む。
【００３０】
酸化還元酵素の酸化還元中心の接近不可能な性質のため、電子連絡のメディエーターが、好ましくは、メディエーターと酵素とを物理的に混合することによるか、またはメディエーターを酵素に化学的に結合させることによるかいずれかでバイオセンサーに付加され、酵素を介した反応物または所望の検体から電極への電子移動を増強する。例えば、グルコースセンサーのためのメディエーターは、電子受容体、例えば、フェロセン誘導体、キノン、種々の有機染料、有機の酸化還元ポリマー、例えばポリアニリン、無機の酸化還元マトリックス、例えば紺青などである。
【００３１】
カソードは、酸化剤、好ましくは酸素の水への還元を触媒することができる酵素または酵素アセンブリー、ならびに場合によってはカソードと酵素間の電気的接触を増強するメディエーター、を含んでなる層をその表面上に担持する。そのような酵素または酵素アセンブリーの例は、ラッカーゼ、およびチトクロームｃ／チトクロームオキシダーゼ（ＣＯｘ）から形成される複合体である。例えば、ラッカーゼの場合には、電子は最終的に酸化剤、例えば分子状酸素（Ｏ２）に移動されて水を生成する。酵素は４個の電子を蓄え、そしてＯ２還元経路において中間体を放出しない。チトクロームｃ／チトクロームオキシダーゼ（ＣＯｘ）の場合には、チトクロームオキシダーゼへのチトクロームｃに媒介される電子の移動は、また、水への酸素の４電子還元をもたらす。
【００３２】
第２の態様によれば、本発明は、検体がそれぞれ酸化剤または還元剤の存在下で生物触媒酸化または還元反応を受けることができる、液体媒質中の該検体を決定するための方法であって、
（ｉ）本発明のシステムを提供し；
（ｉｉ）システムのバイオセンサーを液体媒質と接触させ；
（ｉｉｉ）電気シグナルが検体の存在および／または濃度の指標となるカソードとアノード間に生成した電気シグナルを測定し；
（ｉｖ）電気シグナルに基づいて検体を決定すること：
を含んでなる方法を提供する。
【００３３】
例えば、液体媒質が体液、例えば血液、リンパ液または脳脊髄液であり、そして方法が侵襲的方式で実施される場合、本方法は、体内にバイオセンサーを挿入し、そしてそれを体液と接触させ、そして体内の体液中の検体を決定することを含んでなる。あるいはまた、体液またはすべての他の検体が非侵襲的式に試験されてもよく、そのような場合には、本方法は媒質に酸化剤または還元剤を添加することを含む。
【００３４】
検体の例は、糖分子、例えばグルコース、フルクトース、マルトース；乳酸塩；ビリルビン；アルコールまたはアミノ酸である。
【００３５】
本発明を理解し、そしてそれが実際に如何にして実施できるかを知るために、好適な実施態様が、付随する図面に関して、限定されない例によってのみここに記述される：
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、Ｏ２によるグルコースの生物電気触媒酸化に基づく生物燃料電池アセンブリーの概要図による表示である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明によるバイオセンサーデバイスを図示によって具体的に説明する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明によるバイオセンサーデバイスを図示によって具体的に説明する。
【図３】図３は、アノードにおける酵素ＧＯｘおよびカソードにおけるＣｙｔｃ／ＣＯｘに基づくグルコースバイオセンサーのためのアノードおよびカソードの配置の概要図による表示である。
【図４】図４は、２つの校正曲線：ａ）グルコースについての校正曲線；ｂ）乳酸塩についての校正曲線を示すグラフである。
【図５】図５は、（ａ）空気を飽和した０．１Ｍリン酸バッファー、（ｂ）空気を飽和した５０ｍＭアスコルビン酸、（ｃ）空気を飽和した８ｍＭグルコース、（ｄ）Ｏ２を含まない（Ａｒ雰囲気下の）５０ｍＭグルコース：の注入において、ＰＱＱ−ＦＡＤ／ＧＯｘおよびＣｙｔｃ／ＣＯｘで機能化した電極からなる生物燃料電池に基づくバイオセンサーの開放回路電圧（Ｖｏｃ）を示すグラフである。矢印は注入時を示す。空気で平衡化したリン酸バッファー、０．１Ｍ，ｐＨ＝７．０が、別に記述されない限りバックグラウンド電解質として使用された；温度約３０℃。
【図６】図６は、それぞれアノードおよびカソードにおける酵素乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）およびＣｙｔｃ／ＣＯｘに基づく乳酸バイオセンサーのためのアノードおよびカソードの配置の概要図による表示である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＰＱＱ−ＦＡＤ／ＧＯｘアノードを用いる、流動セル中に注入したグルコースの可変濃度における開放回路電圧（Ｖｏｃ）を示すグラフである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＰＱＱ−ＮＡＤ＋／ＬＤＨアノードを用いる、流動セル中に注入した乳酸塩の可変濃度における解放回路電圧（Ｖｏｃ）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
（実施例）
次に示す特定の実施態様は、本発明を具体的に説明することを意図しており、そしてその範囲を限定するものと考えるべきではない。
【００３８】
引用は、本発明のシステムにおいて使用されてもよいバイオセンサーの簡単な配置を概要図により示す図２Ａおよび２Ｂについてなされる。しかしながら、本発明の概念に基づく多くの他のアセンブリーが構成されてもよい。かくして、図２Ａは、アノード１２およびカソード１４として働く２つの酵素で機能化されたＡｕ電極（活性面積約０．１９ｃｍ２）からなる流動注入セルとして構成したバイオセンサー１０（全てのその部分をあわせて組み立てる前）を示す。両電極はガラス板１６および１８上に支持され、そしてゴムＯリング２０（厚さ約２ｍｍ）によって分離される。ゴムリング中に埋め込まれた針２２および２４は、ユニットを流動セルに転換し、ここを液体媒質が流速１ｍＬｍｉｎ−１で流動できる。カソードとアノード間の距離は約２ｍｍである。図２Ｂは、組み立てた形態における同デバイスを示す。
【００３９】
図２Ａおよび２Ｂにおいて示したデバイスが膜なしで作動することに注目すべきであり、そしてこの可能性がバイオセンサーの配置をはるかに簡単にするので、このことは、特に侵襲的適用のための本発明のバイオセンサーの有意な利点である。しかしながら、本発明のバイオセンサーは好ましくは電極間の膜なしで作動するけれども、それは、同時に、例えば非侵襲的適用において膜を用いてもまた作動することができる。
【００４０】
液体媒質は、試験される検体と酸化剤をその中に溶解した溶液を含有する。例えば、非侵襲的適用において、酸化剤が酸素である場合は、溶液は分析前に酸素により飽和される。バイオセンサーの作動中、酸化剤の濃度は一定に保たれるべきである。これに対して、検体の濃度の代わりに酸素の濃度を測定することが望まれる場合、その時は検体の濃度が一定に保たれねばならない。
【００４１】
図３は、グルコースの濃度を測定するバイオセンサーのためのアノードおよびカソードの配置を示す。グルコースオキシダーゼアノードは、ピロロキノリノキノン（ＰＱＱ，図３における化合物Ｉ）単分子層に共有結合されたアミノエチルフラビンアデニンジヌクレオチドリン酸（アミノ−ＦＡＤ、図３における化合物ＩＩ）上へのアポＧＯｘの再構成によって生成される。カソードは、Ａｕ電極上に集合されたグルタル酸ジアルデヒドで架橋されたＣｙｔｃ／ＣＯｘ単分子層からなる。
【００４２】
図４は、流動条件下で２電極セルへの可変グルコース濃度の注入において、図３に示したグルコース動力供給電池の開放回路電圧（Ｖｏｃ）を示す。校正曲線は、電極電位のネルンスト制御濃度依存性について期待されるような対数関係をたどる。グルコースは濃度範囲１ｍＭ−８０ｍＭにおいて感知される。グルコースの不在下では電圧出力はない（図５，注入（ａ））。自己動力供給式電池は、連続作動条件下では３０℃で５時間安定である。アノードおよびカソードは、０℃で乾燥状態での貯蔵では少なくとも２カ月間安定である。電圧電池はアスコルビン酸，５０ｍＭの添加では乱されない（図５，注入（ｂ））。また、電圧は、アルゴンの不活性雰囲気下でグルコース，５０ｍＭの添加では電池において発生しない（図５，注入（ｄ））。この後者の実験は、電池によるグルコースの感知が、それぞれアノードとカソードによる同時の酸化（グルコースの）と還元（水への酸素の）を必要とすることを明らかに示している。
【００４３】
図６は、乳酸濃度を測定するバイオセンサーの配置を示す。アノードの配置は、組み込んだ乳酸デヒドロゲナーゼ，ＬＤＨを重層した電極からなる。Ａｕ電極に結合したピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）単分子層に、アミノエチルで機能化したＮＡＤ＋（アミノ−ＮＡＤ＋，図６における化合物ＩＩＩ）がカップリングされた（３）。ＬＤＨとＰＱＱ−ＮＡＤ＋単分子層アセンブリー間に形成された親和力−複合体はグルタル酸ジアルデヒドにより架橋され、組み込まれた電気的に接触したＬＤＨ−機能化電極が得られた。ＬＤＨ−改変電極およびＣｙｔｃ／ＣＯｘ重層電極は、それぞれ、自己動力供給式乳酸感知電池のアノードとカソードとして用いられた。図４，曲線ｂは、流動条件下で電池への可変濃度の乳酸の注入における電池の開放回路電圧，Ｖｏｃを示す。図４ｂの校正曲線は、乳酸塩が濃度範囲１ｍＭ−８０ｍＭにおいて感知されることを示している。対照実験は、アスコルビン酸，５０ｍＭまたはグルコース，５０ｍＭの注入において、または乳酸塩，５０ｍＭがアルゴンの不活性雰囲気下で電池に注入される場合には、開放回路電位が電池に発生しないことを証明している。これらの対照実験は、乳酸の検出が生物燃料電池要素としてアノードおよびカソードの同時作動の結果であることを示している。自己燃料式乳酸感知デバイスは、連続作動条件下では７時間安定であり、そして組み込んだＬＤＨ−機能化電極は、０℃で乾燥状態での貯蔵では少なくとも２カ月間安定である。
【００４４】
図７は、（Ａ）ＰＱＱ−ＦＡＤ／ＧＯｘアノードを用いるグルコースの感知において、（Ｂ）ＰＱＱ−ＮＡＤ＋／ＬＤＨアノードを用いる乳酸の感知において、生物燃料電池に基づくセンサーデバイス中への基質の可変濃度における開放回路電圧（Ｖｏｃ）を示す。両システムでは、Ｃｙｔｃ／ＣＯｘ機能化電極がカソードとして適用された。矢印は、濃度それぞれ１ｍＭ，２ｍＭ，４ｍＭ，８ｍＭ，１５ｍＭ，２５ｍＭおよび５０ｍＭにおける基質を含む、ｐＨ７．０の１ｍＬリン酸バッファー、０．１Ｍからなるサンプルの注入を示す。全データは、空気飽和の０．１Ｍリン酸バッファー，ｐＨ７．０，３０℃において記録された。
【００４５】
結論として、本発明は、化学エネルギーから電気化学エネルギーへの変換に基づくバイオセンサーシステムの新規概念を導入した。これらの生物燃料電池は低効率において作動し、そしてエネルギー供給器としての応用は限定されるけれども、引き出しうる電力は感知する事象を証明するには十分である。事実、電池の低い電力出力は、それが電極における妨害物質の酸化還元変換を排除するので、感知工程では利点を有する。本感知デバイスは外部動力源なしに作動するので、それらを魅力的な侵襲的感知要素に変える。
【００４６】
本発明の自己動力供給式バイオセンサーの利点は数多く存在する、なかんずく；（ｉ）センサーは２つの電極のみからなり、そして電極に印加される外部電圧は存在しない；（ｉｉ）システムは生物学的流体によって自己で動力供給されるので、センサーは移植した侵襲的感知デバイスとして機能できる；（ｉｉｉ）電位が電極に印加されないので、本バイオセンサーデバイスの作動は特異的であり、そしてそれは混入物によって妨害されない；（ｉｖ）システムは基質の不在下では電圧を生じないので、基質の１濃度でもシステムを校正するのに十分である。
【符号の説明】
【００４７】
１０ バイオセンサー
１２ アノード
１４ カソード
１６、１８ ガラス板
２０ ゴムＯリング
２２、２４ 針
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己動力供給式バイオセンサー、ならびに検体が酸化または還元されつつある間該バイオセンサーによって生成される電気シグナルを測定するための検出器を含んでなる、液体媒質中の検体を決定するシステムであって、検体は、それぞれ酸化剤または還元剤の存在下で生物触媒酸化または還元を受けることができ、該バイオセンサーは、電極の１つがアノードであり、他方がカソードである１対の電極を含有し、両電極はそれらの表面に酸化還元酵素を担持しており、検体の存在下で、電極の１つに担持される酵素は、検体がそれぞれ酸化または還元される酸化または還元反応を触媒することができ、そして該１対の電極の他方は、酸化剤または還元剤がそれぞれ還元または酸化される反応を触媒できる酵素をその表面に担持している、システム。
【請求項２】
該検体が有機検体である、請求項１のシステム。
【請求項３】
２つの電極の少なくとも１つが、酵素とアノードまたはカソードの基質との間で電子を移動できる電子メディエーターグループを担持している、請求項１のシステム。
【請求項４】
両電極が、それらの表面に電子メディエーターグループを担持している、請求項３のシステム。
【請求項５】
酸化剤が、水に還元される酸素である、請求項１〜４のいずれか１つのシステム。
【請求項６】
酸化還元酵素が補因子依存性酵素であり、そして補因子が、フラビンアデニンジヌクレオチドリン酸（ＦＡＤ）、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、ヘムおよび鉄−硫黄クラスターから選ばれる、請求項５のシステム。
【請求項７】
該有機検体が、糖分子、ヒドロキシ、カルボニルまたはカルボキシ化合物およびアミノ酸からなる群から選ばれる、請求項２〜５のいずれか１つのシステム。
【請求項８】
電極が、各々独立して、金、白金、パラジウム、銀、炭素、銅およびインジウム錫酸化物から選ばれる材料から作られるか、またはそれによってコーティングされる、請求項１〜７のいずれか１つのシステム。
【請求項９】
アノード電極に担持される酵素が、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、フルクトースデヒドロゲナーゼ、コリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼから選ばれる、請求項１〜８のいずれか１つのシステム。
【請求項１０】
カソード電極に担持される酵素が、ラッカーゼ、およびチトクロームｃ／チトクロームオキシダーゼ（ＣＯｘ）から形成される複合体から選ばれる、請求項１〜９のいずれか１つのシステム。
【請求項１１】
アノードとカソードとの間に膜をさらに含んでなる、請求項１〜１０のいずれか１つのシステム。
【請求項１２】
バイオセンサーが、試験される被験者の体液中の検体の侵襲的測定のために適応される、請求項１記載の検体検出システム。
【請求項１３】
検体がそれぞれ酸化剤または還元剤の存在下で生物触媒酸化または還元を受けることができる、液体媒質中の該検体を決定するための方法であって、
（ｉ）請求項１〜１２のいずれか１つのシステムを提供し；
（ｉｉ）該システムのバイオセンサーを液体媒質と接触させ；
（ｉｉｉ）該検体の存在および／または濃度の指標となるカソードとアノード間に生成する電気シグナルを測定し；
（ｉｖ）該シグナルに基づいて該検体を決定すること：
を含んでなる方法。
【請求項１４】
該酸化剤が酸素である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
媒質に酸化剤または還元剤を添加することを含んでなる、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
該液体媒質が体液である請求項１３記載の方法であって、該バイオセンサーを体内に挿入し、そしてそれを体液と接触させ、そして体内の該体液中の該検体を決定することを含んでなる方法。
【請求項１７】
該液体媒質が体液である請求項１３記載の方法であって、該方法が非侵襲的方式において実施される方法。
【請求項１８】
該体液が、血液、リンパ液または脳脊髄液である、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
該検体が、糖分子、乳酸塩、ビリルビン、アルコールおよびアミノ酸から選ばれる、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項１】
自己動力供給式バイオセンサー、ならびに検体が酸化または還元されつつある間該バイオセンサーによって生成される電気シグナルを測定するための検出器を含んでなる、液体媒質中の検体を決定するシステムであって、検体は、それぞれ酸化剤または還元剤の存在下で生物触媒酸化または還元を受けることができ、該バイオセンサーは、電極の１つがアノードであり、他方がカソードである１対の電極を含有し、両電極はそれらの表面に酸化還元酵素を担持しており、検体の存在下で、電極の１つに担持される酵素は、検体がそれぞれ酸化または還元される酸化または還元反応を触媒することができ、そして該１対の電極の他方は、酸化剤または還元剤がそれぞれ還元または酸化される反応を触媒できる酵素をその表面に担持している、システム。
【請求項２】
該検体が有機検体である、請求項１のシステム。
【請求項３】
２つの電極の少なくとも１つが、酵素とアノードまたはカソードの基質との間で電子を移動できる電子メディエーターグループを担持している、請求項１のシステム。
【請求項４】
両電極が、それらの表面に電子メディエーターグループを担持している、請求項３のシステム。
【請求項５】
酸化剤が、水に還元される酸素である、請求項１〜４のいずれか１つのシステム。
【請求項６】
酸化還元酵素が補因子依存性酵素であり、そして補因子が、フラビンアデニンジヌクレオチドリン酸（ＦＡＤ）、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、ヘムおよび鉄−硫黄クラスターから選ばれる、請求項５のシステム。
【請求項７】
該有機検体が、糖分子、ヒドロキシ、カルボニルまたはカルボキシ化合物およびアミノ酸からなる群から選ばれる、請求項２〜５のいずれか１つのシステム。
【請求項８】
電極が、各々独立して、金、白金、パラジウム、銀、炭素、銅およびインジウム錫酸化物から選ばれる材料から作られるか、またはそれによってコーティングされる、請求項１〜７のいずれか１つのシステム。
【請求項９】
アノード電極に担持される酵素が、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、フルクトースデヒドロゲナーゼ、コリンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼから選ばれる、請求項１〜８のいずれか１つのシステム。
【請求項１０】
カソード電極に担持される酵素が、ラッカーゼ、およびチトクロームｃ／チトクロームオキシダーゼ（ＣＯｘ）から形成される複合体から選ばれる、請求項１〜９のいずれか１つのシステム。
【請求項１１】
アノードとカソードとの間に膜をさらに含んでなる、請求項１〜１０のいずれか１つのシステム。
【請求項１２】
バイオセンサーが、試験される被験者の体液中の検体の侵襲的測定のために適応される、請求項１記載の検体検出システム。
【請求項１３】
検体がそれぞれ酸化剤または還元剤の存在下で生物触媒酸化または還元を受けることができる、液体媒質中の該検体を決定するための方法であって、
（ｉ）請求項１〜１２のいずれか１つのシステムを提供し；
（ｉｉ）該システムのバイオセンサーを液体媒質と接触させ；
（ｉｉｉ）該検体の存在および／または濃度の指標となるカソードとアノード間に生成する電気シグナルを測定し；
（ｉｖ）該シグナルに基づいて該検体を決定すること：
を含んでなる方法。
【請求項１４】
該酸化剤が酸素である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
媒質に酸化剤または還元剤を添加することを含んでなる、請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
該液体媒質が体液である請求項１３記載の方法であって、該バイオセンサーを体内に挿入し、そしてそれを体液と接触させ、そして体内の該体液中の該検体を決定することを含んでなる方法。
【請求項１７】
該液体媒質が体液である請求項１３記載の方法であって、該方法が非侵襲的方式において実施される方法。
【請求項１８】
該体液が、血液、リンパ液または脳脊髄液である、請求項１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
該検体が、糖分子、乳酸塩、ビリルビン、アルコールおよびアミノ酸から選ばれる、請求項１６または１７記載の方法。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【公開番号】特開２００９−２３６９２３（Ｐ２００９−２３６９２３Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１６４９７１（Ｐ２００９−１６４９７１）
【出願日】平成２１年７月１３日（２００９．７．１３）
【分割の表示】特願２００３−５２３９８６（Ｐ２００３−５２３９８６）の分割
【原出願日】平成１４年８月１２日（２００２．８．１２）
【出願人】（５０３０８３１６６）イサム・リサーチ・デベロツプメント・カンパニー・オブ・ザ・ヘブルー・ユニバーシテイ・オブ・エルサレム (6)
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１３日（２００９．７．１３）
【分割の表示】特願２００３−５２３９８６（Ｐ２００３−５２３９８６）の分割
【原出願日】平成１４年８月１２日（２００２．８．１２）
【出願人】（５０３０８３１６６）イサム・リサーチ・デベロツプメント・カンパニー・オブ・ザ・ヘブルー・ユニバーシテイ・オブ・エルサレム (6)
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