花托プロモーター
【課題】本発明の課題は、果実（偽果）を構成する花托において転写活性を有し、果実に目的とする遺伝子を発現させる花托プロモーター、および花托で組換えタンパク質を生産する組換え植物を作出する方法を提供するものである。
【解決手段】
偽果を構成する花托に高蓄積するタンパク質をコードする遺伝子および／または花托で高発現している遺伝子を同定し、該遺伝子の発現を制御する５’転写調節領域を解析し、プロモーター領域の塩基配列を決定する。一過性発現解析や遺伝子組換え植物を用いてレポーター遺伝子の活性を測定し、プロモーターの活性を調べ、花托プロモーターを取得する。
【解決手段】
偽果を構成する花托に高蓄積するタンパク質をコードする遺伝子および／または花托で高発現している遺伝子を同定し、該遺伝子の発現を制御する５’転写調節領域を解析し、プロモーター領域の塩基配列を決定する。一過性発現解析や遺伝子組換え植物を用いてレポーター遺伝子の活性を測定し、プロモーターの活性を調べ、花托プロモーターを取得する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、花托プロモーターに関するものであり、該プロモーターは遺伝子組換え技術を利用した植物の新品種の開発や組換えタンパク質を生産させる植物開発に利用される。
【背景技術】
【０００２】
既存の品種に外来遺伝子を発現させ、除草剤耐性や病害虫耐性などの形質を付加した遺伝子組換え技術による植物の品種改良が既に実用化されている。また、色素合成などの代謝系を導入した外来遺伝子で操作し、通常の交配育種では作出が不可能であった新品種の開発も行われている。さらには、有用タンパク質やペプチド（以下、単に「有用タンパク質」とする）を組換え植物で発現させる試みに注目が集まっている。組換え植物で発現させる有用タンパク質は、植物性のものに限らず、動物性タンパク質の生産も可能である。特にワクチン、抗体、サイトカイン類といった医療用タンパク質生産への応用が進んでいる。
【０００３】
組換え植物による有用タンパク質の生産では、微生物や培養細胞を用いた生産と比べ、生産コストが低いこと、栽培環境の調整で生産規模の管理が容易であること、ウイルス等の動物由来病原体の混入が無く安全性が高いといった多くの利点がある。また、植物の可食部に有用タンパク質を発現させれば、これを植物体から精製せず、可食部を直接摂取する経口投与が可能となる。精製コストの削減に加え、精製物の侵襲性投与によるストレスを回避することも期待できる。
【０００４】
植物種に応じて様々な可食部が存在するが、代表的なものとして、葉、果実、種子、根（塊根、球根）、茎（塊茎）などが挙げられる。経口投与に適した有用タンパク質を組換え植物で生産するには、可食部に適切な量の有用タンパク質を発現させることが必要である。さらには、タンパク質の熱変性を回避する観点から、生食可能な組織・器官に有用タンパク質を発現させることも求められる。
【０００５】
有用タンパク質を特定の組織・器官で生産するには、有用タンパク質をコードする遺伝子を目的の組織・器官で発現させることが必要である。その遺伝子発現制御において重要な役割を担うのがプロモーターである。プロモーターには発現制御の様式によって、構成的、誘導的、組織・器官特異的または時期的なものに大別することができる。なかでも生食可能な組織・器官において、組換え遺伝子を高発現制御する構成的なプロモーターや、組織・器官特異的に発現制御するプロモーターの利用が有効である。
【０００６】
ところで、植物の可食部のうち生食可能なものとして、葉、果実或いは種子が挙げられる。その中でも果実や種子は貯蔵性にも優れており、有用タンパク質の生産と蓄積に適した組織である。さらに、果実は生食可能なものが多いので、有用タンパク質の経口投与に最も適した組織・器官といえる。種子は花における有性生殖の結果形成され、被子植物においては種子を包む様々な器官が成熟して果実を形成する。果実は、雌しべの子房が成熟した真果と、子房以外の花托などが成熟・肥大化した偽果に大別することができる。真果に分類される果実には、トマト、ブドウ、カキ、カンキツ類やマメ類を挙げることができる。一方、偽果に分類される果実には、イチゴ、リンゴ、ナシなど主要な作物が含まれている。真果と偽果は、一般的には共に果実として扱われるが、植物組織学上ではそれぞれ異なる組織・器官である。
【０００７】
これまでに果実特異的若しくは種子特異的プロモーターは、多々報告されている。しかし、果実特異的プロモーターとされるものの多くは、真果特異的プロモーターに分類されるものである（特許文献１）。真果と偽果は、前述のとおり植物組織学上は異なる組織で構成されるため、真果特異的プロモーターを偽果に適用しても、所望する組織・器官において組換えタンパク質の蓄積は果せない。また、さらに種子特異的プロモーターでは、リンゴやナシ等のナシ状果のように種子が食用に適さない植物種の果実では、可食部に組換えタンパク質が蓄積しない。また、イチゴ等で特徴的な小粒状の種子が表面に存在するイチゴ状果のように、種子が食用可能であっても消化されにくいものでは、種子中のタンパク質を摂取することが困難もしくは極めて効率が悪い。そのため、偽果に分類される果実に組換えタンパク質を生産させるためには、偽果を構成する花托等で転写活性を有するプロモーターの利用が重要となる。
【０００８】
偽果の代表例ともいえるイチゴにおいて、果実もしくは花托特異的に発現する遺伝子や、これら遺伝子の発現を制御するプロモーターの解析が行われている。イチゴの花托と痩果で発現する遺伝子をマイクロアレイで網羅的に解析し、特に花托で高発現する遺伝子を同定した報告があるが、痩果発現遺伝子との比較解析にとどまる（非特許文献１）。イチゴｅｎｄ−β−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅが果実で高発現することから、当該遺伝子のプロモーター（ＦａＥＧ１、２）の発現解析について報告がある。しかし、汎用されているカリフラワーモザイクウイルス（以下ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターと同程度の転写活性であった（非特許文献２）。イチゴ果実由来のＤ−ｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅのプロモーター（ＧｇａｌＵＲ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が、果実特異的に機能することが報告されている。しかし、光要求性であることや、転写活性が対照のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと最大でも同程度しかないことが報告されている。加えて、トマト果実プロモーターの転写活性はイチゴ果実では極めて低いことも検証されている（非特許文献３）。また、ペチュニア由来の花托高発現プロモーターであるＦＢＰプロモーターのイチゴ果実における転写活性を評価した報告もあるが、形質転換イチゴ果実における当該プロモーターの転写活性は対照のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに劣る結果となっている（非特許文献４）。この報告は、花托高発現プロモーターであっても、花托が肥大化しない植物種に由来するものでは、イチゴ等の偽果を構成する植物種の花托には適用できない、もしくは適用できたとしても既存のプロモーター以上の転写活性は期待できないことを示唆する。そのため、花托を含む花の組織や器官で機能するプロモーターの先行技術にあって、肥大化して偽果を構成する花托における転写活性を検証していないものは、当該器官に適用しうるプロモーターを開示したことにはならない（特許文献２、３）。
【０００９】
このような技術背景をふまえ、本発明者らは、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ×ａｎａｎａｓｓａ）を対象に、その内在性遺伝子から花托にて高い転写活性を有するプロモーターを単離すべく検討を行った。まず、イチゴ花托のタンパク質をプロテオーム解析して、複数種のイチゴ花托高蓄積タンパク質を分離・同定するに至った。イチゴ花托高蓄積タンパク質をコードする遺伝子を同定し、当該遺伝子の５’転写調節を解析すれば、花托高発現プロモーターを単離することが期待できる。同定したイチゴ花托高蓄積タンパク質の一種は、カルコン合成酵素（Ｃｈａｌｃｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＣＨＳ）であることが判明した（非特許文献５）。これまでにイチゴ以外の植物種において、ＣＨＳおよびＣＨＳプロモーターの研究・開発は多岐にわたる。近年では、植物のエピジェネティクス研究におけるＣＨＳ遺伝子のコサプレッションなどが挙げられる（非特許文献６）。また、イチゴのＣＨＳに関しては、四季成品種からのＣＨＳ遺伝子の単離報告（非特許文献７）や、一過性発現系を利用した果実におけるイチゴＣＨＳのＲＮＡｉ報告などが挙げられる（非特許文献８）。また、イチゴＣＨＳは、イチゴ果実の色素合成に関与することから、特に果実の成熟後期に花托で高発現することが報告されているが、痩果の発現比較のみであることや、高発現する時期が限定されることが示唆されている（非特許文献１）。すなわち、これらの研究成果において、イチゴＣＨＳのプロモーター解析や、その花托における転写活性の評価などは検討されていない。そのため、本発明者は、イチゴＣＨＳプロモーターの花托プロモーターとしての評価検討を実施した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第３５３９９６１号公報
【特許文献２】特許第４１１３９５２号公報
【特許文献３】特許第４１３４２８１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ａｈａｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ，Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．３７７，ｐｐ．２０７３−２０８７「Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ａｃｈｅｎｅ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」
【非特許文献２】Ｓｐｏｌａｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ，Ｖｏｌ．５４，Ｎｏ．３８１，ｐｐ．２７１−２７７「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｗｏ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｎｄｏ−ｂ−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｎ−ｃｌｉｍａｃｔｅｒｉｃ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ」
【非特許文献３】Ａｇｉｕｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ，Ｖｏｌ．５６，Ｎｏ．４０９，ｐｐ．３７−４６「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｆｒｕｉｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」
【非特許文献４】Ｓｃｈａａｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，２１，ｐｐ３１３−３１９「Ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ（Ｆｒａｇａｒｉａ × ａｎａｎａｓｓａ）ｐｌａｎｔｓ」
【非特許文献５】古田ら（２００８）「イチゴ花托高発現遺伝子の単離と転写調節世領域の解析」、ＢＭＢ２００８（第３１回日本分子生物学会年会・第８１回日本生化学会大会合同大会）講演要旨集２Ｐ−１３５９
【非特許文献６】島本功ら監修（２００８）細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ２４「植物のエピジエネティクス」
【非特許文献７】Ｓａｋｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３），１８３−１８５「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｃｈａｌｃｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｆｒａｇａｒｉａ ａｎａｎａｓｓａ，ｃｖ Ｓｈｉｋｉｎａｒｉ」
【非特許文献８】Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ４８，８１８−８２６「ＲＮＡｉ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｆｒｕｉｔ（Ｆｒａｇａｒｉａ×ａｎａｎａｓｓａ）ｂｙ ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：ａ ｒａｐｉｄ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、偽果を構成する花托において転写活性を有し、偽果に目的とする遺伝子を発現させる花托プロモーター、および花托で組換えタンパク質を生産する組換え植物を作出する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を進め、イチゴＣＨＳプロモーターが花托において既存で汎用されているＣａＭＶ３５Ｓプロモーターより数倍高い転写活性を有することを見出し、本発明の完成に至った。
すなわち本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡからなる、花托プロモーター
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列において１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有する塩基配列からなり、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
に関するものである。
【００１４】
さらに本発明は、配列番号：２で示される塩基配列より選択される連続した部分配列であって、かつ配列番号：２の４５０９位〜４６４８位の塩基配列（配列番号：１）をコアプロモーター領域として含有することを特徴とするＤＮＡからなる花托プロモーターに関するものである。
【００１５】
また、本発明は、前記塩基配列において、もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有し、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡからなる花托プロモーターに関するものである。加えて、前記塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡからなる花托プロモーターに関する。
【００１６】
また本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡからなる花托プロモーター
（ａ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列において１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有する塩基配列からなり、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
に関する。
【００１７】
さらに本発明は、前記プロモーターと、当該プロモーターの転写制御下にある任意の遺伝子とを含む、植物発現カセットに関する。また本発明は、前記植物発現カセットを含む植物発現ベクターに関する。さらに本発明は前記植物発現カセットを保持した形質転換植物細胞に関する。また本発明は、前記植物発現ベクターが導入された形質転換植物細胞に関する。さらに本発明は、前記細胞が保持された形質転換植物に関する。また、本発明は、前記形質転換植物の子孫またはクローンである、形質転換植物に関する。
【００１８】
さらに本発明は、下記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の工程を含む、任意の遺伝子を植物に導入して形質転換植物を作出する方法
（ａ）前記の植物発現カセットまたは前記の植物発現ベクターを植物細胞に導入する工程
（ｂ）該植物細胞から植物体を再生する工程
（ｃ）導入した任意の遺伝子が花托において発現している該植物体を選抜する工程
に関する。
【００１９】
さらに本発明は、細胞がイチゴからの細胞である前記の形質転換植物細胞に関する。また本発明は、植物がイチゴである前記の形質転換植物に関する。また本発明は、植物がイチゴである前記の方法に関する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、花托で転写活性を有するプロモーターを提供することができ、イチゴ等の偽果を構成する花托において組換え遺伝子を発現させることが可能となる。さらに、本発明の花托プロモーターと有用タンパク質の遺伝子を利用することで、植物に有用タンパク質を生産させることができる。
【００２１】
組換え植物による有用タンパク質生産では、微生物や培養細胞を用いた生産とくらべ生産コストが低く、栽培環境の調整で生産規模の管理を容易にすることができる。また、ウイルス等の動物由来の病原体の汚染を回避することができるため、安全性も確保できる。偽果など植物の可食部で有用タンパク質を生産することができるので、植物体からの精製を必要とせず、そのまま経口によって該有効タンパク質を摂取することを可能とする
【００２２】
従来は注射等による侵襲性投与が行われた有用タンパク質においては、非侵襲性の投与を可能とし、侵襲ストレスを回避も可能とする。加熱処理を必要としないイチゴ等の生食可能な植物種を選択することで、熱変性による有用タンパク質の失活を回避することもできる。
【００２３】
また、本発明によれば、花托に任意の遺伝子発現を可能とするため、花托や偽果における代謝工学を解析する有効なツールとしても活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】イチゴ花托タンパク質の二次元電気泳動像と、ＣＨＳのタンパク質スポットを示す。
【図２】花托プロモーターディレーションフラグメントを示す。
【図３】植物発現用ベクターの構成の概略を示す。
【図４】一過性発現解析によるイチゴ果実でのプロモーター活性の評価結果を示す。
【図５】花托プロモーター形質転換イチゴの果実におけるＧＵＳ染色像を示す。
【図６】花托プロモーター形質転換イチゴの果実におけるＧＵＳ染色像を示す。
【図７】花托プロモーター形質転換イチゴＦＡＣＰ２１系統の果実の生育段階毎のＧＵＳ活性を示す。
【図８】花托プロモーター形質転換イチゴの葉と果実におけるＧＵＳ活性の定量的解析結果を示す。
【図９】花托プロモーター形質転換イチゴの葉と果実におけるＧＵＳ活性の定量的解析結果を示す。
【図１０】花托プロモーター形質転換イチゴの果実におけるＧＵＳ活性の定量的解析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書において「植物」または「植物種」とは、植物界に属する生物全般をさし、代表的なものは顕花植物をいう。単子葉植物と双子葉植物のいずれも含む。好ましくは可食部を有する植物である。さらに好ましくは、可食部が生食可能な植物である。具体例としては、バラ科植物等を挙げることができる。そのほかに、イチゴ、リンゴ、ナシ、カンキツ、モモ、バナナ、パイナップル、イチジクなどが挙げられるが、これらに限定するものではない。
【００２６】
本明細書において「可食部」とは、主にヒトなどの動物がその植物を摂取する際に、食することが出来る部分をいい、植物種によって可食部は異なるが、代表的なものとして、葉、花（花托を含む）、果実、種子、根（塊根、球根を含む）、茎（塊茎を含む）などを挙げることができる。「生食可能」とは、植物の可食部を摂取する際に、加熱処理等を経ずに、そのまま摂取可能であることをいう。
【００２７】
本明細書において「プロモーター機能を有する」とは、プロモーターとして転写活性を有することをいう。プロモーターの転写活性は、プロモーターとレポーター遺伝子を融合し、植物体に導入して形質転換体を作出し、そのレポーターの活性等を検定することで、評価することができる。レポーター遺伝子としては、β−ｇｌｕｃｒｏｎｉｄａｓｅ（ＧＵＳ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子、Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）遺伝子等を利用することができ、各遺伝子に応じたレポーター活性の評価方法は、当該分野において周知である。
【００２８】
本明細書において「花托プロモーター」とは、植物における花の形成部位の一つである花托において、転写活性またはプロモーター機能を有するＤＮＡからなるプロモーターをいう。また、花托に高蓄積しているタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターや、花托高発現遺伝子の発現を制御するプロモーターであることが望ましい。なお、「花托に高蓄積しているタンパク質」は花托で発現しているタンパク質のプロテオーム解析等により、花托タンパク質の組成で高濃度に蓄積しているタンパク質より選ばれうるものであり、「花托高蓄積タンパク質」ともいう。また、花托高蓄積タンパク質をコードする遺伝子を「花托高発現遺伝子」といい、花托で発現しているｃＤＮＡより該花托高蓄積タンパク質ｃＤＮＡを取得し、その５’非転写領域等の解析より、さらに花托で発現頻度の高いものを選抜することで選ばれうるものをいう。
【００２９】
花托プロモーターには、花托特異的プロモーターのほか、花托以外にも活性を有する構成的なプロモーターも含まれる。構成的なプロモーターにあっては、例えば葉組織と比較して花托の転写活性が高いことや、既存の例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと比較して花托の転写活性が高いことが望ましい。また、花托は特に限定するものではないが、イチゴやリンゴといった植物種で観察されるような花が受粉後に肥大化などの発達を経て偽果を構成する花托において、転写活性を有することが特に望ましい。
【００３０】
本発明の花托プロモーターの一つの態様は、配列番号：１の塩基配列で示されるＤＮＡからなる花托プロモーターである。配列番号：１で示される塩基配列は、イチゴＣＨＳ遺伝子の５’上流領域に由来し、イチゴＣＨＳ遺伝子を制御する領域である。別の態様において、花托プロモーター機能を有する限り、配列番号：１に記載の塩基配列において、１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有するＤＮＡからなる花托プロモーターであってもよい。また、花托プロモーター機能を有する限り、配列番号：１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからなる花托プロモーターであってもよい。
【００３１】
また、別の態様において、本発明の花托プロモーターは、以下のＤＮＡからなる。すなわち、配列番号：２で示される塩基配列より選択される連続した部分配列であって、かつ
配列番号：２の４５０９位〜４６４８位の塩基配列（配列番号：１）をコアプロモーター領域として含有することを特徴とするＤＮＡからなる花托プロモーター
【００３２】
配列番号：２で示される塩基配列は、イチゴＣＨＳ遺伝子の５’上流領域に由来し、イチゴＣＨＳ遺伝子を制御する領域である。第４５０９位から第４６４８位までの配列からなるコアプロモーター領域は、配列番号：１に示した塩基配列と一致する。
【００３３】
また、配列番号：２で示される塩基配列より選択される連続した部分配列であって、かつ配列番号：２の４５０９位〜４６４８位の塩基配列（配列番号：１）をコアプロモーター領域として含有することを特徴とするＤＮＡにおいて、花托プロモーター機能を有する限り、１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有してもよい。また、同様に、花托プロモーター機能を有する限り、配列番号：２で示される塩基配列より選択される連続した部分配列であって、かつ配列番号：２の４５０９位〜４６４８位の塩基配列（配列番号：１）をコアプロモーター領域として含有することを特徴とする塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからなる領域であってもよい。
【００３４】
ここでいう「配列番号：２で示される塩基配列より選択される連続した部分配列」とは、配列番号：２から選択される連続した配列であり配列長は当業者によって自由に選択することができる塩基配列をいい、最大配列長は４７６７塩基である。コアプロモーター領域を含有し、鎖長を１４０塩基で選択した場合は、コアプロモーター領域のみを選択したものと同義である。
【００３５】
本発明のプロモーターにおける「コアプロモーター領域」とは、転写活性に必要な最小の領域であり、その領域中に必須のｃｉｓ−ｅｌｅｍｅｎｔとしてＴＡＴＡ−ｂｏｘを含む領域である。本発明の花托プロモーターのコアプロモーター領域は、具体的には配列番号：１または配列番号：２の第４５０９位から第４６４８位の塩基配列からなる領域である。当該領域において、１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換があってもプロモーター機能を有する限り、これら塩基配列もコアプロモーター領域に含まれる。
【００３６】
また、配列番号：１または配列番号：２の第４５０９位から第４６４８位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする領域も、プロモーター活性を有する限り、コアプロモーター領域に含まれる。
【００３７】
また、別の態様において、本発明の花托プロモーターは、以下のＤＮＡからなる。
すなわち、
配列番号：２で示される塩基配列より選択される連続した部分配列であって、かつ
配列番号：２の４５０９位〜４６４８位の塩基配列（配列番号：１）をコアプロモーター領域として含有することを特徴とする塩基配列において、１若しくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を湯有する塩基配列からなり、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ。
【００３８】
また、別の態様において、本発明の花托プロモーターは、以下のＤＮＡからなる。
すなわち、
配列番号：２で示される塩基配列より選択される連続した部分配列であって、かつ
配列番号：２の４５０９位〜４６４８位の塩基配列（配列番号：１）をコアプロモーター領域として含有することを特徴とする塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ。
【００３９】
さらに別の態様において、本発明の花托プロモーターは、以下のＤＮＡからなる。
すなわち、
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡからなる花托プロモーター
（ａ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列において１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有する塩基配列からなり、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ。
【００４０】
上記の塩基配列からなるＤＮＡは、例えば配列番号：１や配列番号：２の配列を基に合成オリゴヌクレオチドを合成し、これをＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ法のプライマーとして供し、例えばゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法にて獲得することができる。さらに、ポイントミューテーション法などにより、核酸の挿入、欠損または置換といった変異を導入することも可能である。また、配列番号：１および配列番号：２に基づき、化学合成によって、あるいは該配列を有する核酸断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、所望の植物のゲノムＤＮＡライブラリーから得ることもできる。
【００４１】
本発明におけるストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。かかる条件は、塩基配列の鎖長や塩基組成によって決定しうるもので、当業者であれば理解するものである。例えば、ハイブリダイズの温度条件が５０℃で、緩衝液（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳなど）による５０℃での洗浄処理にて、相補的な配列を有する核酸と検査対象の核酸とを反応させる条件をいう。
【００４２】
本発明の「発現カセット」は、少なくとも転写開始を制御するプロモーターとその転写制御下にある遺伝子および転写終結を制御するターミネーターで構成される。プロモーター、遺伝子、ターミネーターのほか、転写効率を上げるエンハンサーまたは転写された遺伝子の翻訳を促進する翻訳エンハンサーなどの領域を含んでいても良い。
【００４３】
本発明の「植物発現用ベクター」の構築には、ｐＢＩ系、ｐＵＣ系ベクターなど植物発現ベクターとして使用されているベクターが好適に利用できる。
【００４４】
植物発現カセットおよび植物発現ベクターには、形質転換体を効率よく選抜するために、選抜マーカーをコードする遺伝子とその発現を制御するプロモーターやターミネーターを含んでも良い。選抜マーカーとしては、上述したレポーター遺伝子のほか、薬剤耐性遺伝子が好適に用いられる。薬剤耐性遺伝子の具体例として、カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔ ＩＩ）遺伝子や、ハイグロマイシン耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）など挙げることができる。
【００４５】
本発明において植物発現カセットや植物発現ベクターにおいて、「転写制御下にある」とは、任意の遺伝子が、プロモーターの制御下で発現するように、プロモーターの下流側に連結された状態をいう。任意の遺伝子をプロモーターの下流側に連結する方法は、当該分野においては周知技術である。
【００４６】
また、本発明において、花托プロモーターの転写制御下にある任意の遺伝子は、公知の遺伝子であれば特に限定されるものではない。例えばタンパク質をコードする遺伝子のほか、そのアンチセンス鎖なども含まれる。有用タンパク質をコードする遺伝子としては、ワクチン遺伝子、抗体をコードする遺伝子、抗原ペプチドをコードする遺伝子、各種サイトカイン類をコードする遺伝子、各種アディポサイトカイン類をコードする遺伝子など、医薬品となるタンパク質をコードするものなどを挙げることができる。
【００４７】
本発明において、「形質転換細胞」とは、形質転換によって作出された形質転換体のうち細胞をいい、「形質転換植物」とは、形質転換によって作出された形質転換細胞を保持する植物である。「再生」とは、個体の一部分から個体の全体が復元されることをいう。植物体において、個体の一部分には細胞も含まれ、そのほかには葉、葉柄、根、カルス等の組織片も含まれる。再生の方法は、植物種によって最適条件は異なるが、当該分野においては周知の技術である。
【００４８】
形質転換植物を作出する方法や、植物細胞に植物発現カセットや植物発現ベクターを導入する方法は、特に限定されない。エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法などが挙げられるが、植物種や細胞に応じた各種形質転換法を選択することができ、これら方法は当該分野において周知である。
以下に本発明を実施例により、さらに詳細に説明するが、本発明は、これらの態様に限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
１．花托高蓄積タンパク質の単離と同定
イチゴ花托高蓄積タンパク質を単離するためプロテオーム解析を実施した。イチゴ品種‘エッチエス−１３８’を栽培して、開花から完熟までを６期に分けた生育ステージ毎にイチゴ果実を収穫した。収穫したイチゴ果実から蔕および痩果を除去し、花托よりタンパク質を抽出し、これを一次元目に等電点電気泳動を、二次元目にはＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う二次元電気泳動法にて分離した。泳動後のゲルを銀染色法で染色して、タンパク質スポットパターンを得た。タンパク質スポット解析は、解析ソフトＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて実施した。花托各生育ステージのタンパク質スポットのマッチング解析や、同時期に採取した葉および蔕のタンパク質の蓄積量の比較解析により、花托で高濃度に蓄積しているタンパク質を検出した（図１）。花托高蓄積タンパク質スポットを二次元電気泳動法にて分取し、Ｎ末端アミノ酸配列を解析したところ、カルコン合成酵素（Ｃｈａｌｃｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＣＨＳ）が同定された（配列番号：３）。
【００５０】
２．花托高蓄積タンパク質のｃＤＮＡクローニング
同定されたＣＨＳについて、決定したアミノ酸配列に基づき縮重プライマーを合成した（配列番号：４、配列番号：５）。イチゴ花托および葉から全ＲＮＡを抽出し、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、５’アダプター配列（配列番号：６）および３’アダプター配列（配列番号：７）を付加したｃＤＮＡ（Ｒａｃｅ−ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ）合成を行った。このｃＤＮＡを鋳型核酸として、縮重プライマー、３’ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：８）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および３’ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：９）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行い、３’ＲＡＣＥ法によって、ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ酵素はＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１に導入し、大腸菌（ＩＮＶαＦ’）のｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎはＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）記載の方法に従い実施し、獲得した形質転換体からＱＩＡｑｕｉｃｋ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドクローンのシークエンス反応を行い、花托および葉のＣＨＳｃＤＮＡの塩基配列を決定した。シークエンス反応は、蛍光色素（ＩＲＤ７００およびＩＲＤ８００）標識したＭ１３プライマーとＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｅｘｃｅｌ ＩＩ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を用いて行い、反応産物はＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＬＯＮＧＲＥＡＤＩＲ ４２００（ＬＩ−ＣＯＲ）にて解析を行った。
【００５１】
３．花托高発現遺伝子の同定
ＣＨＳ転写開始点の確定と、花托高発現ＣＨＳ遺伝子を同定するため、さらに、５’ＲＡＣＥによりＣＨＳｍＲＮＡの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の決定を試みた。３’ＲＡＣＥにて決定した塩基配列に基づき、５’ＲＡＣＥ用プライマーを設計した（配列番号：１０、１１）。花托および葉からＲＮＡ抽出し、これを鋳型としてＲａｃｅ−ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ合成した。このｃＤＮＡを鋳型核酸として、５’ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：１２）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、５’ｎｅｓｔｅｄ−ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：１３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および上記イチゴＣＨＳ由来の５’ＲＡＣＥ用プライマーを用いてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行い、５’ＲＡＣＥ法によって、ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ酵素はＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。５’ＲＡＣＥで得たＰＣＲ産物のＴＡクローニング＆シークエンスを実施した。花托および葉由来の総計８０種のｃＤＮＡクローンの塩基得配列を決定し、マルチプルアライメントによる比較解析を行い、花托で最も発現頻度の高いＣＨＳ ５’ＵＴＲ配列を決定した（配列番号：１４）。決定したＣＨＳ ５’ＵＴＲに基づきｃＤＮＡプローブを調整し、次のゲノミッククローン選抜に使用した。
【００５２】
４．イチゴゲノミックライブラリーの作製と、花托高発現遺伝子のクローン選抜
イチゴ（品種‘エッチエス−１３８’）の葉よりゲノムＤＮＡ抽出を行い、約１ｍｇのゲノムＤＮＡをλファージライブラリー作製に供した。ライブラリー作製は、Ｌａｍｂｄａ ＤＡＳＨ ＩＩ／ＢａｍＨＩ Ｖｅｃｔｏｒ ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＧＥＮＥ社）を用いて実施した。作製したライブラリー１μｌ用いて、宿主大腸菌としてＭＲＡ（Ｐ２）に接種し、タイターを測定した。その結果、８．８×１０２ｐｆｕ／μｌであり、ライブラリーの全タイターは１．２×１０６であった。また、独立した３６個のプラークからＬＡ−ＰＣＲ（ＴＡＫＡＲＡ社）を行い、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で確認した。３１クローンで増幅が認められ、平均インサートサイズは約１３Ｋｂであった。ゲノミックライブラリー（λファージ）を希釈して、約６×１０４ｐｆｕのファージを１０本調整し、これを宿主大腸菌と共に１４×１０ｃｍ角型シャーレ１０枚にて培養・プラーク形成を行い、スクリーニング用ファージプレートを作製した。各プレートにつき２枚のＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にプラークリフティングし、アルカリ変性処理の後８０℃・２時間の乾燥を行った。Ｇｅｎｅ Ｉｍａｇｅｓ ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてｃＤＮＡプローブを調整し、ハイブリダイゼーションを行った。シグナルは、ＶｅｒｓａＤｏｃ５０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて化学発光法にて検出した。シグナルが検出されたプラークを特定し、シングルプラークを単離し、花托高発現ＣＨＳゲノミッククローンを単離した。
【００５３】
５．花托高蓄積タンパク質の転写調節領域の解析とプロモーター領域の選抜
単離したＣＨＳゲノミッククローン（λファージ）をプレートライセート法にて増殖し、ＱＩＡＧＥＮ Ｌａｍｂｄａ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＤＮＡ抽出した。花托高発現ＣＨＳ遺伝子の５’側に設計したプライマーとＴ７（配列番号：１５）若しくはＴ３プライマー（配列番号：１６）にてＰＣＲを行い、５’上流領域のサブクローニングを行った。ＰＣＲ酵素はＡｃｃｕＰｒｉｍｅＴａｑ Ｈｉｇｈ−ｆｉｅｄｉｌｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用し、増幅断片はＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングを行った。獲得したサブクローンより５’上流領域の塩基配列を解析し、花托高発現ＣＨＳ遺伝子の５’ＵＴＲを含む５’転写調節領域４７６７ｎｔの配列を決定した（配列番号：２）。
【００５４】
５．花托高発現ＣＨＳプロモーターのディレーションフラグメントのクローニング
花托高発現ＣＨＳ遺伝子の５’転写調節領域の塩基配列に基づきプライマーを設計した（表１）。プライマーの５’末端には、それぞれ制限酵素認識部位を挿入した。花托高発現ＣＨＳ遺伝子ゲノミッククローン（λ−ＤＮＡ）を鋳型とし、ＰＣＲ法でプロモーター様配列のディレーションフラグメント（Ｆｒａｇａｒｉｎａ×ａｎａｎａｓｓａＣＨＳＰｒｏｍｏｔｅｒ：ＦＡＣＰ１２、１３、２１および６１）を増幅した（図２）。これらのフラグメントをＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてプラスミドベクターｐＣＲ２．１にクローニングし、それぞれのプラスミドクローンを獲得した（それぞれ、ｐＣＲ２．１−ＦＡＣＰ１２、１３、２１および６１とした）。
【表１】
【００５５】
６．β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）発現ベクターの作製
ｐＣＲ２．１−ＦＡＣＰ１２，１３、２１および６１をそれぞれのプライマー部位に付加した制限酵素認識部位に応じた酵素で処理し、ディレーションフラグメントを回収した。これを、各ディレーションフラグメントの末端と同じ制限酵素処理したｐＢＩ１０１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ｖｏｌ．６ ｎｏ１３．ｐｐ３９０１−３９０７）と混和してライゲーション反応を行い、植物発現用ＧＵＳ発現プラスミドベクターｐＢＩ−ＦＡＣＰ１２、１３、２１および６１を作製した（図３）。ｐＢＩ−ＦＡＣＰに挿入されている各ＣＨＳプロモーターのディレーションフラグメントは、ＧＵＳ遺伝子の５’上流に配置され、ｐＢＩ−ＦＡＣＰ１２は配列番号：１、ｐＢＩ−ＦＡＣＰ１３は配列番号：２５、ｐＢＩ−ＦＡＣＰ２１は配列番号：２６、またｐＢＩ−ＦＡＣＰ６１は配列番号：２７にそれぞれ示した塩基配列をプロモーター配列として有する。また、一過性発現用ベクターとして、ｐＢＩ−ＦＡＣＰ１２、１３、２１、および６１それぞれのＧＵＳ遺伝子内のＳｎａＢ Ｉサイトに、イチゴｑｕｉｎｏｎｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ由来のイントロン配列を挿入した。イントロン配列は、イチゴゲノムＤＮＡを鋳型としてイチゴｑｕｉｎｏｎｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＹ１５８８３６）に基づき合成したＦＷプライマー（配列番号：２３）とＲＶプライマー（配列番号：２４）プライマーのＰＣＲ法で増幅した。これは、Ａｇｏｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ法による一過性発現解析に際して、アグロバクテリウム内でのＧＵＳ遺伝子の発現を抑制させるためのものである。すなわち、イチゴ遺伝子由来のイントロン配列をＧＵＳ遺伝子内に挿入することで、植物のスプライシング機構を持たないアグロバクテリウムの菌体内で、ＧＵＳ遺伝子の成熟したｍＲＮＡ形成を阻害し、植物組織内の転写活性を測定可能とする（Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２０：２４５−２５０、Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ４８，８１８−８２６）。イントロン配列を挿入したｐＢＩ−ＦＡＣＰベクターは、それぞれｐＢＩ−ＦＡＣＰ１２ｉｎｔ、ｐＢＩ−ＦＡＣＰ１３ｉｎｔ、ｐＢＩ−ＦＡＣＰ２１ｉｎｔおよびｐＢＩ−ＦＡＣＰ６１ｉｎｔと表記した（図３）。
【００５６】
７．Ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ法による一過性発現解析
前記６で作製した一過性発現用ｐＢＩ−ＦＡＣＰｉｎｔベクター４種を、直接導入法にてアグロバクテリウム（菌株ＬＢＡ４４０４）に導入した。獲得したカナマイシン耐性株を用いて、Ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ法による果実の一過性発現解析を実施した。Ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｉｏｎ法は、Ｓｐｏｌａｏｒｅらの方法（Ｓｐｏｌａｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ，ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．３５７ｐｐ．８４５−８５０）に従い実施した。ｐＢＩ−ＦＡＣＰｉｎｔベクターを保持するアグロバクテリウムの菌液をイチゴに接種、２２℃１６時間の光条件で静置した。静置後のイチゴ果実より横断面の切片を切り出し、これをＧＵＳ染色液（（１ｍＭ Ｘ−Ｇｌｕｃ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ Ｋ３（ＣＮ）６、１０ｍＭＫ４（ＣＮ）６、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％メタノール）に浸漬して、３７℃で１２時間暗所に静置した。静置後は、染色液を７０％エタノールに置換し、発色反応を停止した。果実切片の染色の程度によりＧＵＳ活性を確認した。ＦＡＣＰ１２、１３、２１、６１のいずれからもＧＵＳ活性を示す発色が認められた。特にＦＡＣＰ１２では、対照として供試したＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを有するｐＢＩ１２１：ＧＵＳ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ｖｏｌ．６ ｎｏ１３．ｐｐ３９０１−３９０７）を導入したアグロバクテリウム接種区（一過性発現用にイチゴ遺伝子由来イントロン配列をＧＵＳ遺伝子内に挿入済み：ｐＢＩ１２１ｉｎｔ）より強い発色が認められた（図４）。この結果から、ＦＡＣＰ１２に含まれる１４０塩基の塩基配列に花托プロモーター活性があることが確認できた。
【００５７】
８．形質転換イチゴＦＡＣＰ系統の作製
前記６で作製したｐＢＩ−ＦＡＣＰベクター４種を、直接導入法にてアグロバクテリウム（菌株ＬＢＡ４４０４）に導入した。獲得したカナマイシン耐性株を用いて、イチゴ（品種’エッチエス−１３８’）を形質転換した。カナマイシン添加培地を用いてカルス誘導と再分化を行い、カナマイシン耐性の形質転換イチゴを得た。形質転換イチゴの葉からＤＮＡを抽出して、ＧＵＳ遺伝子の導入をＰＣＲで確認した。対照としてｐＢＩ１２１：ＧＵＳ（（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ｖｏｌ．６ ｎｏ１３．ｐｐ３９０１−３９０７）を導入した、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターで転写制御されたＧＵＳ発現形質転換イチゴも作製した。
【００５８】
９．形質転換イチゴ果実のＧＵＳ染色によるプロモーター活性の確認
前記７で得られたＦＡＣＰ各系統の培養苗を特定網室内にて馴化し、培養土に移植して果実栽培を行った。赤熟果を収穫の対象とし、ＦＡＣＰ２１およびＦＡＣＰ６１系統の果実を採取した。収穫した果実より切片を切り出し、ＧＵＳ染色液に浸漬し、３７℃で１２時間暗所に静置した。静置後は、染色液を７０％エタノールに置換し、発色反応を停止した。果実切片の染色の程度によりＧＵＳ活性を確認した。カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターとＧＵＳ遺伝子を導入した形質転換体（３５Ｓ：ＧＵＳ系統）より採取したイチゴ果実と非組換えイチゴ果実を比較対照として用いた。ＦＡＣＰ２１系統とＦＡＣＰ６１系統の果実で発色が認められた。なかでも、ＦＡＣＰ２１系統で強い発色が認められた。発色は皮層、維管束、髄、中心柱と花托組織全域に認められたが、特に維管束で強い発色をする傾向があった。なお、痩果表皮の一部にも発色が認められた。ＦＡＣＰ６１系統は３５Ｓ：ＧＵＳ系統と同程度の発色が認められた（図５）。
【００５９】
続いて、ＦＡＣＰ１２およびＦＡＣＰ１３系統の果実を採取し、前記と同様に果実のＧＵＳ染色を行った。両系統の果実で、ＦＡＣＰ２１系統と比べると発色程度は劣るが、ＧＵＳ活性を示す発色がみとめられた（図６）。
【００６０】
最も発色が強かったＦＡＣＰ２１系統について、赤熟果の他、果実成熟初期の緑色果と、成熟中期の白色果のＧＵＳ染色を行った。その結果、緑色果と白色果共にＧＵＳ染色が認められた。このことから花托高発現ＣＨＳプロモーターは、果実の成熟過程の全般にわたり花托において転写活性を有することがわかった（図７）。
【００６１】
１０．形質転換イチゴ果実の定量的ＧＵＳ活性の測定とプロモーター評価−１
花托におけるＧＵＳ活性を定量的に評価するため、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎらの方法（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ｖｏｌ．６ｎｏ１３．ｐｐ３９０１−３９０７）に従って４−ＭＵ生成反応を指標とした蛍光法による測定を行った。ＦＡＣＰ２１系統より採取したイチゴ果実より蔕を除去し（痩果を含む花托）、これを５倍量（ｗ／ｖ）のＧＵＳ抽出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％サルコシル、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｏｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ社））で、乳棒と乳鉢を用いて磨砕し、磨砕液を遠心分離し、上清を回収しタンパク質抽出液とした。上清１０μｌを分取し、蛍光基質溶液（１ｍＭ ＭＵＧ）５００ｕｌに添加・混和し、３７℃１５分間反応を行った。反応液は１００ｕｌを分取し、０．２Ｍ炭酸ナトリウム９００ｕｌに添加し反応を停止した。停止後の反応液に含まれる４−ＭＵの蛍光を測定し（３６５ｎｍ励起、４５５ｎｍ発光）、ＧＵＳ活性を算出した。また、タンパク質抽出液のタンパク質濃度をプロテインアッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）で定量した。ＦＡＣＰ２１系統と３５Ｓ：ＧＵＳ系統の果実におけるＧＵＳ活性の測定結果を図８に示す。３５Ｓ：ＧＵＳ系統の葉において、最も高いＧＵＳ活性が観察されたが、果実のＧＵＳ活性は葉と比べ著しく減少した。ＦＡＣＰ２１系統の果実では、３５Ｓ：ＧＵＳ系統の果実の５倍弱のＧＵＳ活性が認められた。３５Ｓ：ＧＵＳ系統では、果実より葉のＧＵＳ活性が高い結果となったが、ＦＡＣＰ２１系統では逆転して葉より果実の方が高いＧＵＳ活性が認められた。
【００６２】
同じ実験を、別途採取した試料を用いて行った。ＦＡＣＰ２１系統と３５Ｓ：ＧＵＳ系統の果実・葉におけるＧＵＳ活性の測定結果を図９に示す。前記の結果と同様の結果が得られた。ＦＡＣＰ２１系統では、葉より果実のＧＵＳ活性が高く、３５Ｓ：ＧＵＳ系統の果実の２倍弱の活性が認められた。以上から花托高発現ＣＨＳ由来のプロモーターは、花托において既存で汎用されている３５Ｓプロモーターより高い転写活性を有することがわかった。
【００６３】
１１．形質転換イチゴ果実の定量的ＧＵＳ活性の測定とプロモーター評価−２
果実色によりイチゴ果実の成熟段階を３つに分けて、各段階のＧＵＳ活性を測定してプロモーター活性の推移を評価した。果実成熟初期を緑色果「Ｇｒｅｅｎ］とし、成熟中期を白色果「Ｗｈｉｔｅ」とし、成熟後期を赤熟果「Ｒｅｄ」とした。ＧＵＳ活性の測定方法は前段の方法と同様。３５Ｓ：ＧＵＳ系統、ＦＡＣＰ２１系統およびＦＡＣＰ６１系統で比較をおこなった。結果を図１０に示す。３５Ｓ：ＧＵＳ系統とＦＡＣＰ２１系統で高いＧＵＳ活性が認められ、また成熟初期の活性が高かった。ＦＡＣＰ２１系統で、概ね３５Ｓ：ＧＵＳ系統よりも高い活性が認められたことから、高校発現ＣＨＳ由来のプロモーターは、花托において既存の３５Ｓプロモーターよりも高い転写活性を有することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明によれば、花托で転写活性を有するプロモーターを提供することができ、イチゴ等の偽果を構成する花托において組換え遺伝子を発現させることが可能となる。さらに、本発明の花托プロモーターと有用タンパク質の遺伝子を利用することで、植物に有用タンパク質を生産させることができる。組換え植物による有用タンパク質生産では、微生物や培養細胞を用いた生産とくらべ生産コストが低く、栽培環境の調整で生産規模の管理を容易にすることができる。また、ウイルス等動物由来の病原体の汚染を回避することができるため、安全性も確保できる。果実に有用タンパク質を生産することができるので、植物体からの精製を必要とせず、そのまま経口によって該有効タンパク質を摂取することを可能とする。従来は注射等による侵襲性投与が行われた有用タンパク質においては、非侵襲性の投与を可能とし、侵襲ストレスを回避も可能とする。加熱処理を必要としないイチゴ等の生食可能な植物種を選択することで、熱変性による有用タンパク質の失活を回避することもできる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、花托プロモーターに関するものであり、該プロモーターは遺伝子組換え技術を利用した植物の新品種の開発や組換えタンパク質を生産させる植物開発に利用される。
【背景技術】
【０００２】
既存の品種に外来遺伝子を発現させ、除草剤耐性や病害虫耐性などの形質を付加した遺伝子組換え技術による植物の品種改良が既に実用化されている。また、色素合成などの代謝系を導入した外来遺伝子で操作し、通常の交配育種では作出が不可能であった新品種の開発も行われている。さらには、有用タンパク質やペプチド（以下、単に「有用タンパク質」とする）を組換え植物で発現させる試みに注目が集まっている。組換え植物で発現させる有用タンパク質は、植物性のものに限らず、動物性タンパク質の生産も可能である。特にワクチン、抗体、サイトカイン類といった医療用タンパク質生産への応用が進んでいる。
【０００３】
組換え植物による有用タンパク質の生産では、微生物や培養細胞を用いた生産と比べ、生産コストが低いこと、栽培環境の調整で生産規模の管理が容易であること、ウイルス等の動物由来病原体の混入が無く安全性が高いといった多くの利点がある。また、植物の可食部に有用タンパク質を発現させれば、これを植物体から精製せず、可食部を直接摂取する経口投与が可能となる。精製コストの削減に加え、精製物の侵襲性投与によるストレスを回避することも期待できる。
【０００４】
植物種に応じて様々な可食部が存在するが、代表的なものとして、葉、果実、種子、根（塊根、球根）、茎（塊茎）などが挙げられる。経口投与に適した有用タンパク質を組換え植物で生産するには、可食部に適切な量の有用タンパク質を発現させることが必要である。さらには、タンパク質の熱変性を回避する観点から、生食可能な組織・器官に有用タンパク質を発現させることも求められる。
【０００５】
有用タンパク質を特定の組織・器官で生産するには、有用タンパク質をコードする遺伝子を目的の組織・器官で発現させることが必要である。その遺伝子発現制御において重要な役割を担うのがプロモーターである。プロモーターには発現制御の様式によって、構成的、誘導的、組織・器官特異的または時期的なものに大別することができる。なかでも生食可能な組織・器官において、組換え遺伝子を高発現制御する構成的なプロモーターや、組織・器官特異的に発現制御するプロモーターの利用が有効である。
【０００６】
ところで、植物の可食部のうち生食可能なものとして、葉、果実或いは種子が挙げられる。その中でも果実や種子は貯蔵性にも優れており、有用タンパク質の生産と蓄積に適した組織である。さらに、果実は生食可能なものが多いので、有用タンパク質の経口投与に最も適した組織・器官といえる。種子は花における有性生殖の結果形成され、被子植物においては種子を包む様々な器官が成熟して果実を形成する。果実は、雌しべの子房が成熟した真果と、子房以外の花托などが成熟・肥大化した偽果に大別することができる。真果に分類される果実には、トマト、ブドウ、カキ、カンキツ類やマメ類を挙げることができる。一方、偽果に分類される果実には、イチゴ、リンゴ、ナシなど主要な作物が含まれている。真果と偽果は、一般的には共に果実として扱われるが、植物組織学上ではそれぞれ異なる組織・器官である。
【０００７】
これまでに果実特異的若しくは種子特異的プロモーターは、多々報告されている。しかし、果実特異的プロモーターとされるものの多くは、真果特異的プロモーターに分類されるものである（特許文献１）。真果と偽果は、前述のとおり植物組織学上は異なる組織で構成されるため、真果特異的プロモーターを偽果に適用しても、所望する組織・器官において組換えタンパク質の蓄積は果せない。また、さらに種子特異的プロモーターでは、リンゴやナシ等のナシ状果のように種子が食用に適さない植物種の果実では、可食部に組換えタンパク質が蓄積しない。また、イチゴ等で特徴的な小粒状の種子が表面に存在するイチゴ状果のように、種子が食用可能であっても消化されにくいものでは、種子中のタンパク質を摂取することが困難もしくは極めて効率が悪い。そのため、偽果に分類される果実に組換えタンパク質を生産させるためには、偽果を構成する花托等で転写活性を有するプロモーターの利用が重要となる。
【０００８】
偽果の代表例ともいえるイチゴにおいて、果実もしくは花托特異的に発現する遺伝子や、これら遺伝子の発現を制御するプロモーターの解析が行われている。イチゴの花托と痩果で発現する遺伝子をマイクロアレイで網羅的に解析し、特に花托で高発現する遺伝子を同定した報告があるが、痩果発現遺伝子との比較解析にとどまる（非特許文献１）。イチゴｅｎｄ−β−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅが果実で高発現することから、当該遺伝子のプロモーター（ＦａＥＧ１、２）の発現解析について報告がある。しかし、汎用されているカリフラワーモザイクウイルス（以下ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターと同程度の転写活性であった（非特許文献２）。イチゴ果実由来のＤ−ｇａｌａｃｔｕｒｏｎａｓｅのプロモーター（ＧｇａｌＵＲ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）が、果実特異的に機能することが報告されている。しかし、光要求性であることや、転写活性が対照のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと最大でも同程度しかないことが報告されている。加えて、トマト果実プロモーターの転写活性はイチゴ果実では極めて低いことも検証されている（非特許文献３）。また、ペチュニア由来の花托高発現プロモーターであるＦＢＰプロモーターのイチゴ果実における転写活性を評価した報告もあるが、形質転換イチゴ果実における当該プロモーターの転写活性は対照のＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに劣る結果となっている（非特許文献４）。この報告は、花托高発現プロモーターであっても、花托が肥大化しない植物種に由来するものでは、イチゴ等の偽果を構成する植物種の花托には適用できない、もしくは適用できたとしても既存のプロモーター以上の転写活性は期待できないことを示唆する。そのため、花托を含む花の組織や器官で機能するプロモーターの先行技術にあって、肥大化して偽果を構成する花托における転写活性を検証していないものは、当該器官に適用しうるプロモーターを開示したことにはならない（特許文献２、３）。
【０００９】
このような技術背景をふまえ、本発明者らは、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ×ａｎａｎａｓｓａ）を対象に、その内在性遺伝子から花托にて高い転写活性を有するプロモーターを単離すべく検討を行った。まず、イチゴ花托のタンパク質をプロテオーム解析して、複数種のイチゴ花托高蓄積タンパク質を分離・同定するに至った。イチゴ花托高蓄積タンパク質をコードする遺伝子を同定し、当該遺伝子の５’転写調節を解析すれば、花托高発現プロモーターを単離することが期待できる。同定したイチゴ花托高蓄積タンパク質の一種は、カルコン合成酵素（Ｃｈａｌｃｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＣＨＳ）であることが判明した（非特許文献５）。これまでにイチゴ以外の植物種において、ＣＨＳおよびＣＨＳプロモーターの研究・開発は多岐にわたる。近年では、植物のエピジェネティクス研究におけるＣＨＳ遺伝子のコサプレッションなどが挙げられる（非特許文献６）。また、イチゴのＣＨＳに関しては、四季成品種からのＣＨＳ遺伝子の単離報告（非特許文献７）や、一過性発現系を利用した果実におけるイチゴＣＨＳのＲＮＡｉ報告などが挙げられる（非特許文献８）。また、イチゴＣＨＳは、イチゴ果実の色素合成に関与することから、特に果実の成熟後期に花托で高発現することが報告されているが、痩果の発現比較のみであることや、高発現する時期が限定されることが示唆されている（非特許文献１）。すなわち、これらの研究成果において、イチゴＣＨＳのプロモーター解析や、その花托における転写活性の評価などは検討されていない。そのため、本発明者は、イチゴＣＨＳプロモーターの花托プロモーターとしての評価検討を実施した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特許第３５３９９６１号公報
【特許文献２】特許第４１１３９５２号公報
【特許文献３】特許第４１３４２８１号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ａｈａｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ，Ｖｏｌ．５３，Ｎｏ．３７７，ｐｐ．２０７３−２０８７「Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ａｃｈｅｎｅ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔａｃｌｅ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」
【非特許文献２】Ｓｐｏｌａｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ，Ｖｏｌ．５４，Ｎｏ．３８１，ｐｐ．２７１−２７７「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｗｏ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｎｄｏ−ｂ−１，４−ｇｌｕｃａｎａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｏｎ−ｃｌｉｍａｃｔｅｒｉｃ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ」
【非特許文献３】Ａｇｉｕｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ，Ｖｏｌ．５６，Ｎｏ．４０９，ｐｐ．３７−４６「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｆｒｕｉｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」
【非特許文献４】Ｓｃｈａａｒｔ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，２１，ｐｐ３１３−３１９「Ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ（Ｆｒａｇａｒｉａ × ａｎａｎａｓｓａ）ｐｌａｎｔｓ」
【非特許文献５】古田ら（２００８）「イチゴ花托高発現遺伝子の単離と転写調節世領域の解析」、ＢＭＢ２００８（第３１回日本分子生物学会年会・第８１回日本生化学会大会合同大会）講演要旨集２Ｐ−１３５９
【非特許文献６】島本功ら監修（２００８）細胞工学別冊植物細胞工学シリーズ２４「植物のエピジエネティクス」
【非特許文献７】Ｓａｋｕｒａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３），１８３−１８５「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｃｈａｌｃｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｆｒｏｍ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｆｒａｇａｒｉａ ａｎａｎａｓｓａ，ｃｖ Ｓｈｉｋｉｎａｒｉ」
【非特許文献８】Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ４８，８１８−８２６「ＲＮＡｉ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｆｒｕｉｔ（Ｆｒａｇａｒｉａ×ａｎａｎａｓｓａ）ｂｙ ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：ａ ｒａｐｉｄ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ」
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、偽果を構成する花托において転写活性を有し、偽果に目的とする遺伝子を発現させる花托プロモーター、および花托で組換えタンパク質を生産する組換え植物を作出する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を進め、イチゴＣＨＳプロモーターが花托において既存で汎用されているＣａＭＶ３５Ｓプロモーターより数倍高い転写活性を有することを見出し、本発明の完成に至った。
すなわち本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡからなる、花托プロモーター
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列において１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有する塩基配列からなり、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
に関するものである。
【００１４】
さらに本発明は、配列番号：２で示される塩基配列より選択される連続した部分配列であって、かつ配列番号：２の４５０９位〜４６４８位の塩基配列（配列番号：１）をコアプロモーター領域として含有することを特徴とするＤＮＡからなる花托プロモーターに関するものである。
【００１５】
また、本発明は、前記塩基配列において、もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有し、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡからなる花托プロモーターに関するものである。加えて、前記塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡからなる花托プロモーターに関する。
【００１６】
また本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡからなる花托プロモーター
（ａ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列において１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有する塩基配列からなり、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
に関する。
【００１７】
さらに本発明は、前記プロモーターと、当該プロモーターの転写制御下にある任意の遺伝子とを含む、植物発現カセットに関する。また本発明は、前記植物発現カセットを含む植物発現ベクターに関する。さらに本発明は前記植物発現カセットを保持した形質転換植物細胞に関する。また本発明は、前記植物発現ベクターが導入された形質転換植物細胞に関する。さらに本発明は、前記細胞が保持された形質転換植物に関する。また、本発明は、前記形質転換植物の子孫またはクローンである、形質転換植物に関する。
【００１８】
さらに本発明は、下記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の工程を含む、任意の遺伝子を植物に導入して形質転換植物を作出する方法
（ａ）前記の植物発現カセットまたは前記の植物発現ベクターを植物細胞に導入する工程
（ｂ）該植物細胞から植物体を再生する工程
（ｃ）導入した任意の遺伝子が花托において発現している該植物体を選抜する工程
に関する。
【００１９】
さらに本発明は、細胞がイチゴからの細胞である前記の形質転換植物細胞に関する。また本発明は、植物がイチゴである前記の形質転換植物に関する。また本発明は、植物がイチゴである前記の方法に関する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、花托で転写活性を有するプロモーターを提供することができ、イチゴ等の偽果を構成する花托において組換え遺伝子を発現させることが可能となる。さらに、本発明の花托プロモーターと有用タンパク質の遺伝子を利用することで、植物に有用タンパク質を生産させることができる。
【００２１】
組換え植物による有用タンパク質生産では、微生物や培養細胞を用いた生産とくらべ生産コストが低く、栽培環境の調整で生産規模の管理を容易にすることができる。また、ウイルス等の動物由来の病原体の汚染を回避することができるため、安全性も確保できる。偽果など植物の可食部で有用タンパク質を生産することができるので、植物体からの精製を必要とせず、そのまま経口によって該有効タンパク質を摂取することを可能とする
【００２２】
従来は注射等による侵襲性投与が行われた有用タンパク質においては、非侵襲性の投与を可能とし、侵襲ストレスを回避も可能とする。加熱処理を必要としないイチゴ等の生食可能な植物種を選択することで、熱変性による有用タンパク質の失活を回避することもできる。
【００２３】
また、本発明によれば、花托に任意の遺伝子発現を可能とするため、花托や偽果における代謝工学を解析する有効なツールとしても活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】イチゴ花托タンパク質の二次元電気泳動像と、ＣＨＳのタンパク質スポットを示す。
【図２】花托プロモーターディレーションフラグメントを示す。
【図３】植物発現用ベクターの構成の概略を示す。
【図４】一過性発現解析によるイチゴ果実でのプロモーター活性の評価結果を示す。
【図５】花托プロモーター形質転換イチゴの果実におけるＧＵＳ染色像を示す。
【図６】花托プロモーター形質転換イチゴの果実におけるＧＵＳ染色像を示す。
【図７】花托プロモーター形質転換イチゴＦＡＣＰ２１系統の果実の生育段階毎のＧＵＳ活性を示す。
【図８】花托プロモーター形質転換イチゴの葉と果実におけるＧＵＳ活性の定量的解析結果を示す。
【図９】花托プロモーター形質転換イチゴの葉と果実におけるＧＵＳ活性の定量的解析結果を示す。
【図１０】花托プロモーター形質転換イチゴの果実におけるＧＵＳ活性の定量的解析結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書において「植物」または「植物種」とは、植物界に属する生物全般をさし、代表的なものは顕花植物をいう。単子葉植物と双子葉植物のいずれも含む。好ましくは可食部を有する植物である。さらに好ましくは、可食部が生食可能な植物である。具体例としては、バラ科植物等を挙げることができる。そのほかに、イチゴ、リンゴ、ナシ、カンキツ、モモ、バナナ、パイナップル、イチジクなどが挙げられるが、これらに限定するものではない。
【００２６】
本明細書において「可食部」とは、主にヒトなどの動物がその植物を摂取する際に、食することが出来る部分をいい、植物種によって可食部は異なるが、代表的なものとして、葉、花（花托を含む）、果実、種子、根（塊根、球根を含む）、茎（塊茎を含む）などを挙げることができる。「生食可能」とは、植物の可食部を摂取する際に、加熱処理等を経ずに、そのまま摂取可能であることをいう。
【００２７】
本明細書において「プロモーター機能を有する」とは、プロモーターとして転写活性を有することをいう。プロモーターの転写活性は、プロモーターとレポーター遺伝子を融合し、植物体に導入して形質転換体を作出し、そのレポーターの活性等を検定することで、評価することができる。レポーター遺伝子としては、β−ｇｌｕｃｒｏｎｉｄａｓｅ（ＧＵＳ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子、Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）遺伝子等を利用することができ、各遺伝子に応じたレポーター活性の評価方法は、当該分野において周知である。
【００２８】
本明細書において「花托プロモーター」とは、植物における花の形成部位の一つである花托において、転写活性またはプロモーター機能を有するＤＮＡからなるプロモーターをいう。また、花托に高蓄積しているタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するプロモーターや、花托高発現遺伝子の発現を制御するプロモーターであることが望ましい。なお、「花托に高蓄積しているタンパク質」は花托で発現しているタンパク質のプロテオーム解析等により、花托タンパク質の組成で高濃度に蓄積しているタンパク質より選ばれうるものであり、「花托高蓄積タンパク質」ともいう。また、花托高蓄積タンパク質をコードする遺伝子を「花托高発現遺伝子」といい、花托で発現しているｃＤＮＡより該花托高蓄積タンパク質ｃＤＮＡを取得し、その５’非転写領域等の解析より、さらに花托で発現頻度の高いものを選抜することで選ばれうるものをいう。
【００２９】
花托プロモーターには、花托特異的プロモーターのほか、花托以外にも活性を有する構成的なプロモーターも含まれる。構成的なプロモーターにあっては、例えば葉組織と比較して花托の転写活性が高いことや、既存の例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと比較して花托の転写活性が高いことが望ましい。また、花托は特に限定するものではないが、イチゴやリンゴといった植物種で観察されるような花が受粉後に肥大化などの発達を経て偽果を構成する花托において、転写活性を有することが特に望ましい。
【００３０】
本発明の花托プロモーターの一つの態様は、配列番号：１の塩基配列で示されるＤＮＡからなる花托プロモーターである。配列番号：１で示される塩基配列は、イチゴＣＨＳ遺伝子の５’上流領域に由来し、イチゴＣＨＳ遺伝子を制御する領域である。別の態様において、花托プロモーター機能を有する限り、配列番号：１に記載の塩基配列において、１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有するＤＮＡからなる花托プロモーターであってもよい。また、花托プロモーター機能を有する限り、配列番号：１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからなる花托プロモーターであってもよい。
【００３１】
また、別の態様において、本発明の花托プロモーターは、以下のＤＮＡからなる。すなわち、配列番号：２で示される塩基配列より選択される連続した部分配列であって、かつ
配列番号：２の４５０９位〜４６４８位の塩基配列（配列番号：１）をコアプロモーター領域として含有することを特徴とするＤＮＡからなる花托プロモーター
【００３２】
配列番号：２で示される塩基配列は、イチゴＣＨＳ遺伝子の５’上流領域に由来し、イチゴＣＨＳ遺伝子を制御する領域である。第４５０９位から第４６４８位までの配列からなるコアプロモーター領域は、配列番号：１に示した塩基配列と一致する。
【００３３】
また、配列番号：２で示される塩基配列より選択される連続した部分配列であって、かつ配列番号：２の４５０９位〜４６４８位の塩基配列（配列番号：１）をコアプロモーター領域として含有することを特徴とするＤＮＡにおいて、花托プロモーター機能を有する限り、１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有してもよい。また、同様に、花托プロモーター機能を有する限り、配列番号：２で示される塩基配列より選択される連続した部分配列であって、かつ配列番号：２の４５０９位〜４６４８位の塩基配列（配列番号：１）をコアプロモーター領域として含有することを特徴とする塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡからなる領域であってもよい。
【００３４】
ここでいう「配列番号：２で示される塩基配列より選択される連続した部分配列」とは、配列番号：２から選択される連続した配列であり配列長は当業者によって自由に選択することができる塩基配列をいい、最大配列長は４７６７塩基である。コアプロモーター領域を含有し、鎖長を１４０塩基で選択した場合は、コアプロモーター領域のみを選択したものと同義である。
【００３５】
本発明のプロモーターにおける「コアプロモーター領域」とは、転写活性に必要な最小の領域であり、その領域中に必須のｃｉｓ−ｅｌｅｍｅｎｔとしてＴＡＴＡ−ｂｏｘを含む領域である。本発明の花托プロモーターのコアプロモーター領域は、具体的には配列番号：１または配列番号：２の第４５０９位から第４６４８位の塩基配列からなる領域である。当該領域において、１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換があってもプロモーター機能を有する限り、これら塩基配列もコアプロモーター領域に含まれる。
【００３６】
また、配列番号：１または配列番号：２の第４５０９位から第４６４８位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする領域も、プロモーター活性を有する限り、コアプロモーター領域に含まれる。
【００３７】
また、別の態様において、本発明の花托プロモーターは、以下のＤＮＡからなる。
すなわち、
配列番号：２で示される塩基配列より選択される連続した部分配列であって、かつ
配列番号：２の４５０９位〜４６４８位の塩基配列（配列番号：１）をコアプロモーター領域として含有することを特徴とする塩基配列において、１若しくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を湯有する塩基配列からなり、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ。
【００３８】
また、別の態様において、本発明の花托プロモーターは、以下のＤＮＡからなる。
すなわち、
配列番号：２で示される塩基配列より選択される連続した部分配列であって、かつ
配列番号：２の４５０９位〜４６４８位の塩基配列（配列番号：１）をコアプロモーター領域として含有することを特徴とする塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ。
【００３９】
さらに別の態様において、本発明の花托プロモーターは、以下のＤＮＡからなる。
すなわち、
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡからなる花托プロモーター
（ａ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列において１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有する塩基配列からなり、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ。
【００４０】
上記の塩基配列からなるＤＮＡは、例えば配列番号：１や配列番号：２の配列を基に合成オリゴヌクレオチドを合成し、これをＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ法のプライマーとして供し、例えばゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法にて獲得することができる。さらに、ポイントミューテーション法などにより、核酸の挿入、欠損または置換といった変異を導入することも可能である。また、配列番号：１および配列番号：２に基づき、化学合成によって、あるいは該配列を有する核酸断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、所望の植物のゲノムＤＮＡライブラリーから得ることもできる。
【００４１】
本発明におけるストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。かかる条件は、塩基配列の鎖長や塩基組成によって決定しうるもので、当業者であれば理解するものである。例えば、ハイブリダイズの温度条件が５０℃で、緩衝液（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳなど）による５０℃での洗浄処理にて、相補的な配列を有する核酸と検査対象の核酸とを反応させる条件をいう。
【００４２】
本発明の「発現カセット」は、少なくとも転写開始を制御するプロモーターとその転写制御下にある遺伝子および転写終結を制御するターミネーターで構成される。プロモーター、遺伝子、ターミネーターのほか、転写効率を上げるエンハンサーまたは転写された遺伝子の翻訳を促進する翻訳エンハンサーなどの領域を含んでいても良い。
【００４３】
本発明の「植物発現用ベクター」の構築には、ｐＢＩ系、ｐＵＣ系ベクターなど植物発現ベクターとして使用されているベクターが好適に利用できる。
【００４４】
植物発現カセットおよび植物発現ベクターには、形質転換体を効率よく選抜するために、選抜マーカーをコードする遺伝子とその発現を制御するプロモーターやターミネーターを含んでも良い。選抜マーカーとしては、上述したレポーター遺伝子のほか、薬剤耐性遺伝子が好適に用いられる。薬剤耐性遺伝子の具体例として、カナマイシン耐性を付与するためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔ ＩＩ）遺伝子や、ハイグロマイシン耐性を付与するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）など挙げることができる。
【００４５】
本発明において植物発現カセットや植物発現ベクターにおいて、「転写制御下にある」とは、任意の遺伝子が、プロモーターの制御下で発現するように、プロモーターの下流側に連結された状態をいう。任意の遺伝子をプロモーターの下流側に連結する方法は、当該分野においては周知技術である。
【００４６】
また、本発明において、花托プロモーターの転写制御下にある任意の遺伝子は、公知の遺伝子であれば特に限定されるものではない。例えばタンパク質をコードする遺伝子のほか、そのアンチセンス鎖なども含まれる。有用タンパク質をコードする遺伝子としては、ワクチン遺伝子、抗体をコードする遺伝子、抗原ペプチドをコードする遺伝子、各種サイトカイン類をコードする遺伝子、各種アディポサイトカイン類をコードする遺伝子など、医薬品となるタンパク質をコードするものなどを挙げることができる。
【００４７】
本発明において、「形質転換細胞」とは、形質転換によって作出された形質転換体のうち細胞をいい、「形質転換植物」とは、形質転換によって作出された形質転換細胞を保持する植物である。「再生」とは、個体の一部分から個体の全体が復元されることをいう。植物体において、個体の一部分には細胞も含まれ、そのほかには葉、葉柄、根、カルス等の組織片も含まれる。再生の方法は、植物種によって最適条件は異なるが、当該分野においては周知の技術である。
【００４８】
形質転換植物を作出する方法や、植物細胞に植物発現カセットや植物発現ベクターを導入する方法は、特に限定されない。エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法などが挙げられるが、植物種や細胞に応じた各種形質転換法を選択することができ、これら方法は当該分野において周知である。
以下に本発明を実施例により、さらに詳細に説明するが、本発明は、これらの態様に限定されるものではない。
【実施例】
【００４９】
１．花托高蓄積タンパク質の単離と同定
イチゴ花托高蓄積タンパク質を単離するためプロテオーム解析を実施した。イチゴ品種‘エッチエス−１３８’を栽培して、開花から完熟までを６期に分けた生育ステージ毎にイチゴ果実を収穫した。収穫したイチゴ果実から蔕および痩果を除去し、花托よりタンパク質を抽出し、これを一次元目に等電点電気泳動を、二次元目にはＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う二次元電気泳動法にて分離した。泳動後のゲルを銀染色法で染色して、タンパク質スポットパターンを得た。タンパク質スポット解析は、解析ソフトＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて実施した。花托各生育ステージのタンパク質スポットのマッチング解析や、同時期に採取した葉および蔕のタンパク質の蓄積量の比較解析により、花托で高濃度に蓄積しているタンパク質を検出した（図１）。花托高蓄積タンパク質スポットを二次元電気泳動法にて分取し、Ｎ末端アミノ酸配列を解析したところ、カルコン合成酵素（Ｃｈａｌｃｏｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、ＣＨＳ）が同定された（配列番号：３）。
【００５０】
２．花托高蓄積タンパク質のｃＤＮＡクローニング
同定されたＣＨＳについて、決定したアミノ酸配列に基づき縮重プライマーを合成した（配列番号：４、配列番号：５）。イチゴ花托および葉から全ＲＮＡを抽出し、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、５’アダプター配列（配列番号：６）および３’アダプター配列（配列番号：７）を付加したｃＤＮＡ（Ｒａｃｅ−ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ）合成を行った。このｃＤＮＡを鋳型核酸として、縮重プライマー、３’ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：８）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および３’ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：９）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行い、３’ＲＡＣＥ法によって、ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ酵素はＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。ＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用してＰＣＲ産物をプラスミドベクターｐＣＲ２．１に導入し、大腸菌（ＩＮＶαＦ’）のｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎはＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）記載の方法に従い実施し、獲得した形質転換体からＱＩＡｑｕｉｃｋ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミド抽出を行った。得られたプラスミドクローンのシークエンス反応を行い、花托および葉のＣＨＳｃＤＮＡの塩基配列を決定した。シークエンス反応は、蛍光色素（ＩＲＤ７００およびＩＲＤ８００）標識したＭ１３プライマーとＳｅｑｕｉＴｈｅｒｍ Ｅｘｃｅｌ ＩＩ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ）を用いて行い、反応産物はＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＬＯＮＧＲＥＡＤＩＲ ４２００（ＬＩ−ＣＯＲ）にて解析を行った。
【００５１】
３．花托高発現遺伝子の同定
ＣＨＳ転写開始点の確定と、花托高発現ＣＨＳ遺伝子を同定するため、さらに、５’ＲＡＣＥによりＣＨＳｍＲＮＡの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の決定を試みた。３’ＲＡＣＥにて決定した塩基配列に基づき、５’ＲＡＣＥ用プライマーを設計した（配列番号：１０、１１）。花托および葉からＲＮＡ抽出し、これを鋳型としてＲａｃｅ−ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ合成した。このｃＤＮＡを鋳型核酸として、５’ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：１２）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、５’ｎｅｓｔｅｄ−ｐｒｉｍｅｒ（配列番号：１３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）および上記イチゴＣＨＳ由来の５’ＲＡＣＥ用プライマーを用いてｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行い、５’ＲＡＣＥ法によって、ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ酵素はＡｃｃｕＰｒｉｍｅ Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用した。５’ＲＡＣＥで得たＰＣＲ産物のＴＡクローニング＆シークエンスを実施した。花托および葉由来の総計８０種のｃＤＮＡクローンの塩基得配列を決定し、マルチプルアライメントによる比較解析を行い、花托で最も発現頻度の高いＣＨＳ ５’ＵＴＲ配列を決定した（配列番号：１４）。決定したＣＨＳ ５’ＵＴＲに基づきｃＤＮＡプローブを調整し、次のゲノミッククローン選抜に使用した。
【００５２】
４．イチゴゲノミックライブラリーの作製と、花托高発現遺伝子のクローン選抜
イチゴ（品種‘エッチエス−１３８’）の葉よりゲノムＤＮＡ抽出を行い、約１ｍｇのゲノムＤＮＡをλファージライブラリー作製に供した。ライブラリー作製は、Ｌａｍｂｄａ ＤＡＳＨ ＩＩ／ＢａｍＨＩ Ｖｅｃｔｏｒ ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＧＥＮＥ社）を用いて実施した。作製したライブラリー１μｌ用いて、宿主大腸菌としてＭＲＡ（Ｐ２）に接種し、タイターを測定した。その結果、８．８×１０２ｐｆｕ／μｌであり、ライブラリーの全タイターは１．２×１０６であった。また、独立した３６個のプラークからＬＡ−ＰＣＲ（ＴＡＫＡＲＡ社）を行い、ＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で確認した。３１クローンで増幅が認められ、平均インサートサイズは約１３Ｋｂであった。ゲノミックライブラリー（λファージ）を希釈して、約６×１０４ｐｆｕのファージを１０本調整し、これを宿主大腸菌と共に１４×１０ｃｍ角型シャーレ１０枚にて培養・プラーク形成を行い、スクリーニング用ファージプレートを作製した。各プレートにつき２枚のＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）にプラークリフティングし、アルカリ変性処理の後８０℃・２時間の乾燥を行った。Ｇｅｎｅ Ｉｍａｇｅｓ ＡｌｋＰｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いてｃＤＮＡプローブを調整し、ハイブリダイゼーションを行った。シグナルは、ＶｅｒｓａＤｏｃ５０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて化学発光法にて検出した。シグナルが検出されたプラークを特定し、シングルプラークを単離し、花托高発現ＣＨＳゲノミッククローンを単離した。
【００５３】
５．花托高蓄積タンパク質の転写調節領域の解析とプロモーター領域の選抜
単離したＣＨＳゲノミッククローン（λファージ）をプレートライセート法にて増殖し、ＱＩＡＧＥＮ Ｌａｍｂｄａ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＤＮＡ抽出した。花托高発現ＣＨＳ遺伝子の５’側に設計したプライマーとＴ７（配列番号：１５）若しくはＴ３プライマー（配列番号：１６）にてＰＣＲを行い、５’上流領域のサブクローニングを行った。ＰＣＲ酵素はＡｃｃｕＰｒｉｍｅＴａｑ Ｈｉｇｈ−ｆｉｅｄｉｌｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用し、増幅断片はＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニングを行った。獲得したサブクローンより５’上流領域の塩基配列を解析し、花托高発現ＣＨＳ遺伝子の５’ＵＴＲを含む５’転写調節領域４７６７ｎｔの配列を決定した（配列番号：２）。
【００５４】
５．花托高発現ＣＨＳプロモーターのディレーションフラグメントのクローニング
花托高発現ＣＨＳ遺伝子の５’転写調節領域の塩基配列に基づきプライマーを設計した（表１）。プライマーの５’末端には、それぞれ制限酵素認識部位を挿入した。花托高発現ＣＨＳ遺伝子ゲノミッククローン（λ−ＤＮＡ）を鋳型とし、ＰＣＲ法でプロモーター様配列のディレーションフラグメント（Ｆｒａｇａｒｉｎａ×ａｎａｎａｓｓａＣＨＳＰｒｏｍｏｔｅｒ：ＦＡＣＰ１２、１３、２１および６１）を増幅した（図２）。これらのフラグメントをＴＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてプラスミドベクターｐＣＲ２．１にクローニングし、それぞれのプラスミドクローンを獲得した（それぞれ、ｐＣＲ２．１−ＦＡＣＰ１２、１３、２１および６１とした）。
【表１】
【００５５】
６．β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）発現ベクターの作製
ｐＣＲ２．１−ＦＡＣＰ１２，１３、２１および６１をそれぞれのプライマー部位に付加した制限酵素認識部位に応じた酵素で処理し、ディレーションフラグメントを回収した。これを、各ディレーションフラグメントの末端と同じ制限酵素処理したｐＢＩ１０１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ｖｏｌ．６ ｎｏ１３．ｐｐ３９０１−３９０７）と混和してライゲーション反応を行い、植物発現用ＧＵＳ発現プラスミドベクターｐＢＩ−ＦＡＣＰ１２、１３、２１および６１を作製した（図３）。ｐＢＩ−ＦＡＣＰに挿入されている各ＣＨＳプロモーターのディレーションフラグメントは、ＧＵＳ遺伝子の５’上流に配置され、ｐＢＩ−ＦＡＣＰ１２は配列番号：１、ｐＢＩ−ＦＡＣＰ１３は配列番号：２５、ｐＢＩ−ＦＡＣＰ２１は配列番号：２６、またｐＢＩ−ＦＡＣＰ６１は配列番号：２７にそれぞれ示した塩基配列をプロモーター配列として有する。また、一過性発現用ベクターとして、ｐＢＩ−ＦＡＣＰ１２、１３、２１、および６１それぞれのＧＵＳ遺伝子内のＳｎａＢ Ｉサイトに、イチゴｑｕｉｎｏｎｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ由来のイントロン配列を挿入した。イントロン配列は、イチゴゲノムＤＮＡを鋳型としてイチゴｑｕｉｎｏｎｅ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＹ１５８８３６）に基づき合成したＦＷプライマー（配列番号：２３）とＲＶプライマー（配列番号：２４）プライマーのＰＣＲ法で増幅した。これは、Ａｇｏｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ法による一過性発現解析に際して、アグロバクテリウム内でのＧＵＳ遺伝子の発現を抑制させるためのものである。すなわち、イチゴ遺伝子由来のイントロン配列をＧＵＳ遺伝子内に挿入することで、植物のスプライシング機構を持たないアグロバクテリウムの菌体内で、ＧＵＳ遺伝子の成熟したｍＲＮＡ形成を阻害し、植物組織内の転写活性を測定可能とする（Ｖａｎｃａｎｎｅｙｔ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ ２２０：２４５−２５０、Ｈｏｆｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ４８，８１８−８２６）。イントロン配列を挿入したｐＢＩ−ＦＡＣＰベクターは、それぞれｐＢＩ−ＦＡＣＰ１２ｉｎｔ、ｐＢＩ−ＦＡＣＰ１３ｉｎｔ、ｐＢＩ−ＦＡＣＰ２１ｉｎｔおよびｐＢＩ−ＦＡＣＰ６１ｉｎｔと表記した（図３）。
【００５６】
７．Ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ法による一過性発現解析
前記６で作製した一過性発現用ｐＢＩ−ＦＡＣＰｉｎｔベクター４種を、直接導入法にてアグロバクテリウム（菌株ＬＢＡ４４０４）に導入した。獲得したカナマイシン耐性株を用いて、Ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ法による果実の一過性発現解析を実施した。Ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｉｏｎ法は、Ｓｐｏｌａｏｒｅらの方法（Ｓｐｏｌａｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ，ｖｏｌ．５２，Ｎｏ．３５７ｐｐ．８４５−８５０）に従い実施した。ｐＢＩ−ＦＡＣＰｉｎｔベクターを保持するアグロバクテリウムの菌液をイチゴに接種、２２℃１６時間の光条件で静置した。静置後のイチゴ果実より横断面の切片を切り出し、これをＧＵＳ染色液（（１ｍＭ Ｘ−Ｇｌｕｃ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１０ｍＭ Ｋ３（ＣＮ）６、１０ｍＭＫ４（ＣＮ）６、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％メタノール）に浸漬して、３７℃で１２時間暗所に静置した。静置後は、染色液を７０％エタノールに置換し、発色反応を停止した。果実切片の染色の程度によりＧＵＳ活性を確認した。ＦＡＣＰ１２、１３、２１、６１のいずれからもＧＵＳ活性を示す発色が認められた。特にＦＡＣＰ１２では、対照として供試したＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを有するｐＢＩ１２１：ＧＵＳ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ｖｏｌ．６ ｎｏ１３．ｐｐ３９０１−３９０７）を導入したアグロバクテリウム接種区（一過性発現用にイチゴ遺伝子由来イントロン配列をＧＵＳ遺伝子内に挿入済み：ｐＢＩ１２１ｉｎｔ）より強い発色が認められた（図４）。この結果から、ＦＡＣＰ１２に含まれる１４０塩基の塩基配列に花托プロモーター活性があることが確認できた。
【００５７】
８．形質転換イチゴＦＡＣＰ系統の作製
前記６で作製したｐＢＩ−ＦＡＣＰベクター４種を、直接導入法にてアグロバクテリウム（菌株ＬＢＡ４４０４）に導入した。獲得したカナマイシン耐性株を用いて、イチゴ（品種’エッチエス−１３８’）を形質転換した。カナマイシン添加培地を用いてカルス誘導と再分化を行い、カナマイシン耐性の形質転換イチゴを得た。形質転換イチゴの葉からＤＮＡを抽出して、ＧＵＳ遺伝子の導入をＰＣＲで確認した。対照としてｐＢＩ１２１：ＧＵＳ（（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ｖｏｌ．６ ｎｏ１３．ｐｐ３９０１−３９０７）を導入した、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターで転写制御されたＧＵＳ発現形質転換イチゴも作製した。
【００５８】
９．形質転換イチゴ果実のＧＵＳ染色によるプロモーター活性の確認
前記７で得られたＦＡＣＰ各系統の培養苗を特定網室内にて馴化し、培養土に移植して果実栽培を行った。赤熟果を収穫の対象とし、ＦＡＣＰ２１およびＦＡＣＰ６１系統の果実を採取した。収穫した果実より切片を切り出し、ＧＵＳ染色液に浸漬し、３７℃で１２時間暗所に静置した。静置後は、染色液を７０％エタノールに置換し、発色反応を停止した。果実切片の染色の程度によりＧＵＳ活性を確認した。カリフラワーモザイクウイルス３５ＳプロモーターとＧＵＳ遺伝子を導入した形質転換体（３５Ｓ：ＧＵＳ系統）より採取したイチゴ果実と非組換えイチゴ果実を比較対照として用いた。ＦＡＣＰ２１系統とＦＡＣＰ６１系統の果実で発色が認められた。なかでも、ＦＡＣＰ２１系統で強い発色が認められた。発色は皮層、維管束、髄、中心柱と花托組織全域に認められたが、特に維管束で強い発色をする傾向があった。なお、痩果表皮の一部にも発色が認められた。ＦＡＣＰ６１系統は３５Ｓ：ＧＵＳ系統と同程度の発色が認められた（図５）。
【００５９】
続いて、ＦＡＣＰ１２およびＦＡＣＰ１３系統の果実を採取し、前記と同様に果実のＧＵＳ染色を行った。両系統の果実で、ＦＡＣＰ２１系統と比べると発色程度は劣るが、ＧＵＳ活性を示す発色がみとめられた（図６）。
【００６０】
最も発色が強かったＦＡＣＰ２１系統について、赤熟果の他、果実成熟初期の緑色果と、成熟中期の白色果のＧＵＳ染色を行った。その結果、緑色果と白色果共にＧＵＳ染色が認められた。このことから花托高発現ＣＨＳプロモーターは、果実の成熟過程の全般にわたり花托において転写活性を有することがわかった（図７）。
【００６１】
１０．形質転換イチゴ果実の定量的ＧＵＳ活性の測定とプロモーター評価−１
花托におけるＧＵＳ活性を定量的に評価するため、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎらの方法（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ｖｏｌ．６ｎｏ１３．ｐｐ３９０１−３９０７）に従って４−ＭＵ生成反応を指標とした蛍光法による測定を行った。ＦＡＣＰ２１系統より採取したイチゴ果実より蔕を除去し（痩果を含む花托）、これを５倍量（ｗ／ｖ）のＧＵＳ抽出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．１％サルコシル、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｏｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ社））で、乳棒と乳鉢を用いて磨砕し、磨砕液を遠心分離し、上清を回収しタンパク質抽出液とした。上清１０μｌを分取し、蛍光基質溶液（１ｍＭ ＭＵＧ）５００ｕｌに添加・混和し、３７℃１５分間反応を行った。反応液は１００ｕｌを分取し、０．２Ｍ炭酸ナトリウム９００ｕｌに添加し反応を停止した。停止後の反応液に含まれる４−ＭＵの蛍光を測定し（３６５ｎｍ励起、４５５ｎｍ発光）、ＧＵＳ活性を算出した。また、タンパク質抽出液のタンパク質濃度をプロテインアッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）で定量した。ＦＡＣＰ２１系統と３５Ｓ：ＧＵＳ系統の果実におけるＧＵＳ活性の測定結果を図８に示す。３５Ｓ：ＧＵＳ系統の葉において、最も高いＧＵＳ活性が観察されたが、果実のＧＵＳ活性は葉と比べ著しく減少した。ＦＡＣＰ２１系統の果実では、３５Ｓ：ＧＵＳ系統の果実の５倍弱のＧＵＳ活性が認められた。３５Ｓ：ＧＵＳ系統では、果実より葉のＧＵＳ活性が高い結果となったが、ＦＡＣＰ２１系統では逆転して葉より果実の方が高いＧＵＳ活性が認められた。
【００６２】
同じ実験を、別途採取した試料を用いて行った。ＦＡＣＰ２１系統と３５Ｓ：ＧＵＳ系統の果実・葉におけるＧＵＳ活性の測定結果を図９に示す。前記の結果と同様の結果が得られた。ＦＡＣＰ２１系統では、葉より果実のＧＵＳ活性が高く、３５Ｓ：ＧＵＳ系統の果実の２倍弱の活性が認められた。以上から花托高発現ＣＨＳ由来のプロモーターは、花托において既存で汎用されている３５Ｓプロモーターより高い転写活性を有することがわかった。
【００６３】
１１．形質転換イチゴ果実の定量的ＧＵＳ活性の測定とプロモーター評価−２
果実色によりイチゴ果実の成熟段階を３つに分けて、各段階のＧＵＳ活性を測定してプロモーター活性の推移を評価した。果実成熟初期を緑色果「Ｇｒｅｅｎ］とし、成熟中期を白色果「Ｗｈｉｔｅ」とし、成熟後期を赤熟果「Ｒｅｄ」とした。ＧＵＳ活性の測定方法は前段の方法と同様。３５Ｓ：ＧＵＳ系統、ＦＡＣＰ２１系統およびＦＡＣＰ６１系統で比較をおこなった。結果を図１０に示す。３５Ｓ：ＧＵＳ系統とＦＡＣＰ２１系統で高いＧＵＳ活性が認められ、また成熟初期の活性が高かった。ＦＡＣＰ２１系統で、概ね３５Ｓ：ＧＵＳ系統よりも高い活性が認められたことから、高校発現ＣＨＳ由来のプロモーターは、花托において既存の３５Ｓプロモーターよりも高い転写活性を有することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明によれば、花托で転写活性を有するプロモーターを提供することができ、イチゴ等の偽果を構成する花托において組換え遺伝子を発現させることが可能となる。さらに、本発明の花托プロモーターと有用タンパク質の遺伝子を利用することで、植物に有用タンパク質を生産させることができる。組換え植物による有用タンパク質生産では、微生物や培養細胞を用いた生産とくらべ生産コストが低く、栽培環境の調整で生産規模の管理を容易にすることができる。また、ウイルス等動物由来の病原体の汚染を回避することができるため、安全性も確保できる。果実に有用タンパク質を生産することができるので、植物体からの精製を必要とせず、そのまま経口によって該有効タンパク質を摂取することを可能とする。従来は注射等による侵襲性投与が行われた有用タンパク質においては、非侵襲性の投与を可能とし、侵襲ストレスを回避も可能とする。加熱処理を必要としないイチゴ等の生食可能な植物種を選択することで、熱変性による有用タンパク質の失活を回避することもできる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡからなる、花托プロモーター
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列において１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有する塩基配列からなり、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
【請求項２】
配列番号：２で示される塩基配列より選択される連続した部分配列であって、かつ
配列番号：２の４５０９位〜４６４８位の塩基配列（配列番号：１）をコアプロモーター領域として含有することを特徴とするＤＮＡからなる花托プロモーター
【請求項３】
請求項２に記載の塩基配列において、１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有し、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡからなる花托プロモーター
【請求項４】
請求項２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡからなる花托プロモーター
【請求項５】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡからなる花托プロモーター
（ａ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列において１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有する塩基配列からなり、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
【請求項６】
請求項１、２、３、４、または５に記載の花托プロモーターと、当該プロモーターの転写制御下にある任意の遺伝子とを含む、植物発現カセット
【請求項７】
請求項６に記載の植物発現カセットを含む植物発現ベクター。
【請求項８】
請求項６に記載の植物発現カセットを保持した形質転換植物細胞。
【請求項９】
請求項７に記載の植物発現ベクターが導入された形質転換植物細胞。
【請求項１０】
請求項８または請求項９に記載の細胞が保持された形質転換植物。
【請求項１１】
請求項１０に記載された形質転換植物の子孫またはクローンである、形質転換植物。
【請求項１２】
下記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の工程を含む、任意の遺伝子を植物に導入して形質転換植物を作出する方法。
（ａ）請求項６に記載の植物発現カセットまたは請求項７に記載の植物発現ベクターを植物細胞に導入する工程
（ｂ）該植物細胞から植物体を再生する工程
（ｃ）導入した任意の遺伝子が花托において発現している該植物体を選抜する工程
【請求項１３】
細胞がイチゴからの細胞である請求項８または請求項９に記載の形質転換植物細胞
【請求項１４】
植物がイチゴである請求項１０または請求項１１に記載の形質転換植物
【請求項１５】
植物がイチゴである請求項１２に記載の方法
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡからなる、花托プロモーター
（ａ）配列番号：１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列において１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有する塩基配列からなり、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
【請求項２】
配列番号：２で示される塩基配列より選択される連続した部分配列であって、かつ
配列番号：２の４５０９位〜４６４８位の塩基配列（配列番号：１）をコアプロモーター領域として含有することを特徴とするＤＮＡからなる花托プロモーター
【請求項３】
請求項２に記載の塩基配列において、１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有し、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡからなる花托プロモーター
【請求項４】
請求項２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡからなる花托プロモーター
【請求項５】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載のＤＮＡからなる花托プロモーター
（ａ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列において１もしくは数個の核酸の挿入、欠損または置換を有する塩基配列からなり、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
（ｃ）配列番号：２５から２７のいずれかに記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ花托プロモーター機能を有するＤＮＡ
【請求項６】
請求項１、２、３、４、または５に記載の花托プロモーターと、当該プロモーターの転写制御下にある任意の遺伝子とを含む、植物発現カセット
【請求項７】
請求項６に記載の植物発現カセットを含む植物発現ベクター。
【請求項８】
請求項６に記載の植物発現カセットを保持した形質転換植物細胞。
【請求項９】
請求項７に記載の植物発現ベクターが導入された形質転換植物細胞。
【請求項１０】
請求項８または請求項９に記載の細胞が保持された形質転換植物。
【請求項１１】
請求項１０に記載された形質転換植物の子孫またはクローンである、形質転換植物。
【請求項１２】
下記の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の工程を含む、任意の遺伝子を植物に導入して形質転換植物を作出する方法。
（ａ）請求項６に記載の植物発現カセットまたは請求項７に記載の植物発現ベクターを植物細胞に導入する工程
（ｂ）該植物細胞から植物体を再生する工程
（ｃ）導入した任意の遺伝子が花托において発現している該植物体を選抜する工程
【請求項１３】
細胞がイチゴからの細胞である請求項８または請求項９に記載の形質転換植物細胞
【請求項１４】
植物がイチゴである請求項１０または請求項１１に記載の形質転換植物
【請求項１５】
植物がイチゴである請求項１２に記載の方法
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−１１５１６４（Ｐ２０１１−１１５１６４Ａ）
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２５９４７６（Ｐ２０１０−２５９４７６）
【出願日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度経済産業省 戦略的技術開発委託費「植物機能を活用した高度モノ作り基盤技術開発／植物利用高付加価値物質製造基盤技術開発」に係る委託事業の成果であり、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３９１０１１０７６）ホクサン株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年６月１６日（２０１１．６．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１９年度経済産業省 戦略的技術開発委託費「植物機能を活用した高度モノ作り基盤技術開発／植物利用高付加価値物質製造基盤技術開発」に係る委託事業の成果であり、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（３９１０１１０７６）ホクサン株式会社 (6)
【Ｆターム（参考）】
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