薬剤感受性試験方法および薬剤感受性試験装置
【解決手段】本発明は、薬剤感受性試験方法およびその装置に関し、その試験方法は、以下の各ステップを含む。濃縮された細菌または細胞の標本の中に、コロイド材料を含む培養液製の液状標本を添加し、凝固補助剤を添加して、前記標本を凝固させてゲル標本を形成する。その表面に薬剤のペーパーディスクを貼り、培養後に薬剤の阻止円を観察し、薬剤に対する感受性を確定する。前記薬剤感受性試験装置は、透明材料製の箱体を用い、かつそのキャビティの中に凝固補助剤を含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌または細胞の薬剤感受性試験方法および薬剤感受性試験装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤感受性試験は、細菌または細胞の薬剤耐性を検査する重要な試験である。従来の薬剤感受性試験方法で用いられている培地は、一般に、液体培地と固体培地の２種に分かれる。その試験方法は、一般にペーパーディスク試験法および濃度試験法がある。ペーパーディスク試験法で採用されるのは固体培地であり、濃度試験法で採用されるのは液体培地である。ペーパーディスク試験法は、固体培地表面に貼られたペーパーディスクによって形成される薬剤の阻止円を観察することによって、結核菌の薬剤に対する感受性を確定する。濃度試験法は、異なる薬剤および異なる薬剤濃度試験容器の中の細菌または細胞の成長状況を観察し検査することによって、細菌または細胞の薬剤に対する感受性を確定する。ペーパーディスク試験法であっても濃度試験法であっても、その薬剤感受性試験プロセス全体を、一般に、細菌または細胞の濃縮、増殖または分離培養および薬剤感受性試験の３段階に分けることができる。例えば、従来の技術を用いて結核菌に対して薬剤感受性試験を行う場合、一般に、ペーパーディスク試験法および濃度試験法があり、その試験プロセス全体を、一般に結核菌の濃縮、増殖または分離培養および薬剤感受性試験の３段階に分けることができる。従来のペーパーディスク試験法で、結核菌濃縮段階のステップは、以下のとおりである。(1)患者が提供した標本をピペットで吸い取り、試験容器の中に置く。(2)試験容器の中に消化液を添加し、標本粘液に対して消化を行い、標本中の粘液および不純物の中に包まれた細菌を充分に露出させる。(3)遠心分離し、上清液を捨て、結核菌標本を得る。結核菌標本が得られた後に、増殖または分離培養を行う。増殖または分離培養段階のステップは、以下のとおりである。(4)すでに濃縮した結核菌標本を少し取り、濃縮菌液を調製する。(5)濃縮菌液を、例えばレーベンシュタイン・イェンセン培地などの固体培地に接種して、増殖または分離培養を行う。一般に、３７℃のインキュベーターの中で１ヵ月程度培養し、１つの細菌を培養して細茵コロニーをなす。細菌コロニーを得た後、薬剤感受性試験段階に入る。薬剤感受性試験段階のステップは、以下のとおりである。(6)少量の細菌コロニーを取り、一般に、１〜３個の細菌コロニーを取り、溶解分散して濃縮菌液をなす。(7)濃縮菌液を、例えば寒天培地などの固体培地表面に接種する。(8)固体培地表面に薬剤のペーパーディスクを貼る。(9)３７℃のインキュベーターの中に入れて１ヵ月程度培養し、薬剤の阻止円を観察し、結核菌の薬剤に対する感受性を確定する。従来のペーパーディスク試験法の長所は、操作が便利で、設備が簡単で、投資が小さいことであるが、以下の欠点が存在する。（欠点１）：試験全体に必要な時間が長すぎる。増殖または分離培養段階に１ヵ月程度かかり、薬剤感受性試験段階に約１ヵ月程度かかり、試験プロセス全体で約２ヵ月程度かかる。薬剤感受性試験で結果が得られた後になってから薬剤を使用して治療すると、治療のタイミングに深刻な影響を及ぼすことがある。臨床上、薬剤感受性試験がない状況で薬剤を使用して治療した場合、結核菌薬剤耐性の重篤な結果をもたらすことがよくある。（欠点２）：安全でない。試験全体で２回の人による接種が必要である。結核菌は伝染性を有するため、操作員に安全上の危惧をもたらし、環境を汚染する虞がある。
【０００３】
従来の濃度試験法には、２種の方法がある。１種の濃度試験法は、増殖培養段階で固体培地を採用する。その結核菌濃縮および増殖または分離培養の２つの段階のステップは、従来のペーパーディスク試験法と同じであるが、薬剤感受性試験段階のステップは、従来のペーパーディスク試験法と異なる。具体的には、以下のとおりである。増殖または分離培養して得た細菌コロニーを固体培地から取る。一般に、１つまたは数個の細茵コロニーを取る。→→溶解分散して菌懸濁液をなす→→異なる薬剤および異なる濃度で調製してなした複数個の試験容器の中に菌懸濁液を入れ、比較試験標本をつくる。→→試験容器の中の細菌の成長状況を観察し、検査し、結核菌の薬剤に対する感受性を確定する。この種の試験方法の長所は、設備が簡単で，投資が小さいことであるが、以下の欠点が存在する。（欠点１）：所要時間が長い。増殖または分離培養段階の方法およびステップは、従来のペーパーディスク試験法の方法およびステップと同じであるため、増殖または分離培養段階だけでも所要時間が１ヵ月程度かかる。（欠点２）：操作が面倒であり、安全でなく、かつ誤った試験結果をもたらしやすい。複数個の試験容器を調製する必要があるため、調製プロセスが面倒であり、安全でなく、操作員に安全上の危惧をもたらし、環境を汚染する虞がある。複数個の試験容器調製プロセスにおいて、その他の細菌に比較的汚染されやすく、誤った試験結果をもたらす可能性がある。もう１種の濃度試験法は、増殖または分離培養段階で液体培地を採用する。この種の試験方法は、例えば、ＢＤ社が販売しているバクテック９０００ＭＢおよびバクテックＭＧＩＴ９６０全自動高速マイコバクテリウム培養薬剤感受性判定システムなど、一般に専用装置の試験を採用する。その長所は、操作が簡単で、試験プロセスの時間が短く、平均検出時間は１４．４日であり、最も速くて１０日程度である。しかしながら、存在する主な欠点は、装置設備の価格が高く、投資が大きいことである。使用コストの高さは、１つ目には装置設備の使用コストが高く、２つ目には複数個の比較試験標本が必要であり、試薬のコストが比較的高いことである。その費用は比較的大きく、一般の病院では負担が難しく、普及推進が難しくなっている。
【０００４】
Ｉｎ−Ｖｉｔｒｏ細胞に対して薬剤感受性試験を行う方法は比較的多く、よく用いられる方法としては、ＭＴＴ比色法、放射性同位体取込法などがあるが、いずれも操作が面倒で、誤った試験結果がもたらされやすいなどの欠点が存在する。その理由は、異なる薬剤および異なる濃度の複数個の試験容器の調製が必要であり、かつ各試験容器の中に細胞懸濁液を加えなければならず、調製および細胞懸濁液を加えるプロセスが面倒なためである。複数個の試験容器を調製するプロセスにおいて、比較的汚染されやすく、誤った試験結果をもたらす可能性がある。
【０００５】
上述した結核菌薬剤感受性試験を詳細に分析することによって、従来の細菌、細胞薬剤感受性試験方法、特に結核菌試験方法に以下の欠点が存在することが分かる。
（１）試験プロセス全体の所要時間が長い。
（２）操作が面倒である。
（３）安全でない。
（４）誤判定が出やすい。
（５）投資が大きく、普及推進が難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】（特になし）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、試験プロセスの時間が短い、細菌または細胞の薬剤感受性試験方法および薬剤感受性試験装置を提供することである。もう１つの目的は、投資を少なくし、使用コストを低くすることである。さらにもう１つの目的は、安全で便利に使用できるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を実現するために、本発明の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法は、以下のステップを含む。
（１）検査する細菌標本または細胞標本を濃縮する。
（２）検査する細菌標本または細胞標本の中に、栄養物質、コロイド材料を含む培養液を添加し、液状試験標本を作成する。
（３）液状試験標本の中に、コロイド材料と反応してゲル状を形成することが可能な凝固補助剤を添加し、ゲル試験標本を作成する。
（４）ゲル試験標本の表面に薬剤のペーパーディスクを貼る。
（５）それをインキュベーターの中に入れて培養する。
（６）薬剤の阻止円を観測し、薬剤に対する感受性を確定する。
【０００９】
前記細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、前記培養液が細菌細胞増殖指示薬を含む。
【００１０】
前記細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、液状試験標本をインキュベーターの中に入れて、２〜４日間増殖培養する。
【００１１】
前記細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、前記培養液の中に静菌剤を含む。
【００１２】
前記細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、前記培養液の中の栄養物質と、コロイド材料との間の配合比が、栄養物質１００ｍｌにつきコロイド材料０．８ｇ〜２ｇを加え、栄養物質１００ｍｌにつき凝固補助剤０．１ｇ〜０．２ｇを配合する。
【００１３】
前記細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、前記培養液の中の栄養物質と、コロイド材料と、細菌細胞増殖指示薬との間の配合比が、栄養物質１００ｍｌにつきコロイド材料０．８ｇ〜２ｇを加え、細菌細胞増殖指示薬２ｍｇ〜２０ｍｇを加え、栄養物質１００ｍｌにつき凝固補助剤０．１ｇ〜０．２ｇを配合する。
【００１４】
前記細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、前記培養液の中の栄養物質と、コロイド材料と、細菌細胞増殖指示薬と、静菌剤との間の配合比が、栄養物質１００ｍｌにつきコロイド材料０．８ｇ〜２ｇを加え、細菌細胞増殖指示薬２ｍｇ〜２０ｍｇを加え、静菌剤適量を加え、栄養物質１００ｍｌごとに凝固補助剤０．１ｇ〜０．２ｇを配合する。
【００１５】
前記細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、培養液の１回に使用する量に小分けし、密封して保存する。
【００１６】
前記細菌、細胞の薬剤感受性試験方法の薬剤感受性試験装置は、周壁および底部が閉じられ、上端が開いた構造形式を有する箱体を含み、箱体のキャビティの中に凝固補助剤が置かれる。
【００１７】
前記薬剤感受性試験装置は、徐放体と、徐放体の中に付着した凝固補助剤とからなる凝固補助層が、箱体のキャビティの底部に設けられる。
【００１８】
前記薬剤感受性試験装置は、接着剤によって凝固補助剤と混合した後に箱体の底部に塗布する構造形式である凝固補助層が、箱体のキャビティの底部に設けられている。
【００１９】
前記薬剤感受性試験装置は、箱体の底部に目盛が設けられている。
【００２０】
前記薬剤感受性試験装置は、箱体の開いた端にそれと合わせた蓋が設けられる。
【００２１】
本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、その培養液の中の栄養物質が、栄養成分と、緩衝剤とを含む。その作用は、細菌または細胞の成長のために、栄養を提供し、培養液のＰＨを制御することである。異なる細菌または細胞に対して、異なる栄養物質の組成を選定することができる。例えば、結核菌は７Ｈ９培地を選定することができ、普通細菌または真菌は普通ブイヨン配合を選定することができ、腫瘍細胞は細胞培地配合を選定することができる。培養液の中のコロイド材料の作用は、培養液の中に凝固補助剤を添加する前に、コロイド材料がその中に溶解して、培養液が液状を呈するようにし、培養液の中に凝固補助剤を添加した後、コロイド材料が凝固補助剤と反応して、安定したゲルを培養液が一定時間内に形成するようにすることである。０．５〜１．５％アルギン酸ナトリウムまたは０．５〜２．０％ペクチン、０．５〜１．５％カラギーナンなどを選定することができる。培養液の中の細菌細胞増殖指示薬の作用は、細菌または細胞の増殖繁殖プロセスにおいてＭＴＴを分解して青色の点状の色団を形成することによって、短時間内に各細菌または細胞が肉眼で見える青色の粒子状の点を形成し、肉眼または低倍率の顕微鏡で点の性質および数量を正確に観察して細胞または細菌の成長状况を確定することができるようにすることである。３-（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（その商品名はＭＴＴ，英語名：３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を選定することができる。
【００２２】
培養液の中に静菌剤を加えるのは、主に結核マイコバクテリウム薬剤感受性試験に用いられ、その作用は、抗酸菌以外のその他の雑菌の成長を抑制することである。
【００２３】
本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法で用いる凝固補助剤の作用は、凝固補助剤が培養液の中のコロイド材料と反応して、安定したゲルを培養液が一定時間内に形成するようにすることである。カルシウムイオンまたはマグネシウムイオン、ホウ砂、クエン酸カリウムなどを選定することができる。
【００２４】
本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、その薬剤感受性試験装置が、周壁および底部が閉じられ、上端が開いた構造形式を有する箱体を含み、箱体の中に凝固補助剤が置かれ、培養液の中にコロイド材料が添加され、液状試験標本は培養液を用いてなるため、液状試験標本の中にコロイド材料を有し、液状試験標本を薬剤感受性試験装置内に入れる以前は液状を呈しており、薬剤感受性試験装置に入れた後、試験標本の中のコロイド材料が薬剤感受性試験装置の中の凝固補助剤と反応して、安定したゲル状を常温で急速に形成し、ゲル試験標本を形成することができる。こうすることによって、薬剤のペーパーディスクをゲル試験標本の表面に貼ることができるため、薬剤のペーパーディスクを用いて、細菌または細胞の薬剤に対する感受性を試験することができる。
【００２５】
本発明が、従来の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法に比べ、試験プロセス全体の時間が短い理由は、以下のとおりである。(1):患者から提供された標本の中の検査する細菌または細胞を充分に利用する。患者から提供された標本の中の細菌または細胞の大部分が濃縮されて試験標本の作成に用いられ、また試験標本はすべてが薬剤感受性試験に用いられるため、患者から提供された標本の中の検査する細菌または細胞が充分に利用される。(2):増殖もしくは分離培養段階を省略するか、または増殖もしくは分離培養時間を短くすることができる。一般の細菌または細胞に対して薬剤感受性試験を行う場合、同時に６個の薬剤のペーパーディスク試験を行えば要求を満たすことができるため、薬剤感受性試験装置のキャビティの面積は、同時に６個の薬剤のペーパーディスクの薬剤感受性試験を行うように設計することができる。薬剤感受性試験は、細菌または細胞の薬剤耐性を検査するため、薬剤感受性試験を行う前に、すべての患者に対して確定診断が行われている。すでに確定診断が行われた一般の患者にとって、本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、提供された標本の中の細菌または細胞を充分に利用するため、薬剤感受性試験を行うときに、薬剤感受性試験装置のキャビティの中の単位面積あたりの細菌または細胞の数が比較的大きく、薬剤感受性試験の細菌または細胞に対する数の要求を充分に満たし、増殖培養によって細菌または細胞の数をさらに増やす必要がない。確定診断時に、患者から提供された標本に含まれる検査する細菌の量が比較的少ないことが確認された場合には、作成された液状試験標本をインキュベーターの中に置いて増殖培養を行ってから、液状試験標本を薬剤感受性試験装置の中に入れ、薬剤感受性試験を行うべきである。本発明の増殖培養は、液状培地の中で行われるため、相対的に、細菌の液状培地中での増殖速度は、固体培地上での増殖速度に比べて速い。さらに、患者によって提供された標本の中の検査する細菌または細胞を充分利用し、増殖培養前の初期数量を比較的大きくする。そのため、増殖培養の時間が短くなる。例えば、結核菌に対して、中国疾病予防センターが編著し、中国協和医科大学出版社が２００４年７月１日に出版した『中国結核病予防治療計画 喀痰塗抹標本顕微鏡検査品質保証マニュアル』における規定により、チール・ネルゼン染色法を採用し、顕微鏡検査の結果、抗酸菌陽性（４＋）：１視野あたり１０本以上であった場合、増殖培養を行わずに、薬剤感受性試験段階に直接入ることができる。このようにして、本発明は、増殖培養段階を省略するため、試験全体の時間が節約される。顕微鏡検査の結果、抗酸菌陽性（３＋）：１視野あたり１〜９本以下であった場合、増殖培養を行うべきである。液状培地の中での増殖速度は速く、また初期菌量は大きく、従来の増殖培養の所要時間に比べ、所要時間が短いため、試験全体の時間が節約される。(3):薬剤感受性試験段階の時間が短い。初期数量が大きいため、薬剤の阻止円の形成が比較的容易である。従来のペーパーディスク試験法に比べて所要時間が短いため、試験全体の時間が節約される。さらに、細菌細胞増殖指示薬の呈色作用によって、細菌または細胞の繁殖成長状況および薬剤の阻止円をさらに良好に示すことができ、観察、検査にさらに便利であり、試験時間をさらに短くすることができる。発明者が繰り返し試験を行った結果、本発明の細菌、細胞薬剤感受性試験方法を用いて結核菌薬剤感受性試験を行うことによって、増殖培養段階を省略することができ、増殖培養が必要である場合でも、２〜４日しか必要でなく、薬剤感受性試験段階は５〜７日しか必要でなく、試験プロセス全体で１４日もかからないことが証明された。上述した内容を総合すると、本発明は試験プロセスの時間を短くする目的を実現（達成）している。
【００２６】
本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法が、投資が少なく、使用コストが低い理由は以下のとおりである。本発明を実施するために必要な設備は、従来のペーパーディスク試験法と基本的に同じであり、遠心装置、薬剤感受性試験装置などと組み合わせるだけでよい。前記遠心装置、薬剤感受性試験装置などは、製造が簡単で生産コストが低いため、設備全体の投資が少ない。本発明を実施するには、ディスポーザルの試験容器および栄養物質、緩衝剤、コロイド材料、指示薬などの試薬を組み合わせて使用する必要があり、これらのディスポーザルの試験容器および試薬のコストが低く、かつ使用数量が少ない。また、本発明の装置設備の投資が少なく、使用コストが低く、本発明の使用コストをさらに減少させる。そのため、本発明は、投資が少なく、使用コストが低いという目的を有効に実現（達成）する。
【００２７】
本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法の使用が安全で便利な理由は、以下のとおりである。本発明は、検査する標本を濃縮し、結果の判定をディスポーザルの密閉容器内で行うことができ、その他器材を汚染することがなく、操作の完了後にまとめて消毒処理する。また、試験プロセス全体の手作業の手順が少なく、簡単であるため、細菌の作業員および環境に対する影響を最大限に減少させ、試験の生物学的安全性を大幅に向上させることができる。本発明は、ディスポーザルの培養液を密封瓶の中に注入し、使用時に、密封瓶を開け、培養液と濃縮した細菌または細胞とを均一に混ぜた後、薬剤感受性試験装置の中に入れるだけでよい。操作が簡単で便利であるため、本発明は、安全で便利に使用するという目的を有効に実現（達成）することができる。
【００２８】
次に、図面および実施例と合わせ、本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法および薬剤感受性試験装置について詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明における薬剤感受性試験装置の正面断面の概略図である。
【図２】図１に示す下面の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
図に示すように、箱体（１）は、周壁および底部が閉じられ、上端が開いた構造形式である。徐放体と、徐放体の中に付着した凝固補助剤とからなる凝固補助層（２）が、箱体（１）内に設けられている。箱体（１）の底部に目盛（４）が設けられ、箱体（１）の開いた端に合わせて蓋（３）を有する。
【００３１】
本発明の薬剤感受性試験装置の凝固補助層（２）における徐放体は、徐放膜とすることができる。培養液を箱体（１）の中に入れた後、この徐放膜が培養液の中に溶解することができ、凝固補助剤が徐放体の中に付着する。糖と凝固補助剤との混合を採用し、吹付塗布の方法を用いて箱体（１）の中に凝固補助層を形成することもできる。
【００３２】
次に、本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法および薬剤感受性試験装置を「結核菌薬剤感受性試験に用いた実施例」を示す。
【００３３】
チール・ネルゼン染色法を採用して確定診断を行い、顕微鏡検査の結果、抗酸菌陽性（４＋）：１視野あたり１０本以上であったものに対して、以下の薬剤感受性試験を行った。
１．患者の朝の喀痰標本を５ｍｌ取り、４％水酸化ナトリウムで消化（溶解）した。
２．遠心機の中に置き、４５００回転で１０分間遠心分離し、標本の中の結核菌を充分に沈殿させた。
３．上清液を捨てた。
４．培養液２０ｍｌを用いて沈殿物を溶離し、液体菌懸濁液形式の液状試験標本を作成した。
５．液状試験標本を均一に薬剤感受性試験装置の箱体の中に入れ、培養液の中のコロイド材料と箱体の中の凝固補助剤とを反応させ、３時間以内に凝固させて安定したゲルをなし、ゲル試験標本を形成した。
６．ゲル試験標本の表面の所定の位置に測定する薬剤のペーパーディスクを貼った。
７．蓋をして、３７℃のインキュベーターの中に置き、５〜７日間培養した。結核菌は増殖繁殖プロセスにおいてＭＴＴを分解して青色の点状の色団を形成するが、薬剤が結核菌に対して阻止作用を有している場合、薬剤のペーパーディスクが貼られたゲル試験標本の周囲に青い色団を形成することができないため、阻止円が形成された。
８．阻止円の大きさに基づき、薬剤の細菌に対する作用の効果を判断した。
【００３４】
本実施例における培養液２０ｍｌで採用した配合は、栄養物質が７Ｈ９配合２０ｍｌ、細菌細胞増殖指示薬が３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド０．４ｍｇ、コロイド材料が０．５〜１．５％アルギン酸ナトリウム０．１７ｇ、阻害剤が０．４ｍｇマラカイトグリーンであった。本実施例における凝固補助剤は、カルシウムイオン０．０２ｇであった。
【００３５】
本実施例における培養液２０ｍｌに採用する配合は、さらに、栄養物質が７Ｈ９配合２０ｍｌ、細菌細胞増殖指示薬が３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド０．５ｍｇ、コロイド材料が０．５〜１．５％アルギン酸ナトリウム０．３ｇ、阻害剤が０．４ｍｇマラカイトグリーン０．８ｍｌとし、本実施例における凝固補助剤を、カルシウムイオン０．０３ｇとすることも可能である。
【００３６】
本実施例における培養液３０ｍｌに採用する配合は、さらに、栄養物質が７Ｈ９配合２０ｍｌ、細菌細胞増殖指示薬が３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド４ｍｇ、コロイド材料０．４ｇ、阻害剤が０．４ｍｇマラカイトグリーンとし、本実施における凝固補助剤を、カルシウムイオン０．０４ｇとすることも可能である。
【００３７】
チール・ネルゼン染色法を採用して確定珍断を行い、顕微鏡検査の結果、抗酸菌陽性（３＋）：１視野あたり１〜９本以下であったものに対して、以下の薬剤感受性試験を行った。
１．患者の朝の喀痰標本を５ｍｌ取り、４％水酸化ナトリウムで消化（溶解）した。
２．遠心機の中に置き、４５００回転で１０分間遠心分離し、標本の中の結核菌を充分に沈殿させた。
３．上清液を捨てた。
４．培養液２０ｍｌを用いて沈殿物を溶離し、液体菌懸濁液形式の液状試験標本を作成した。
５．液状試験標本を３７℃のインキュベーターの中に置き、２〜４日間増菌培養し、液状試験標本が淡青色を呈する変化が観察された。
６．増菌後の液状試験標本を均一に薬剤感受性試験装置の箱体の中に入れ、培養液の中のコロイド材料と箱体の中の凝固補助剤とを反応させ、３時間以内に凝固させて安定したゲルをなし、ゲル試験標本を形成した。
７．ゲル試験標本の表面の所定の位置に測定する薬剤のペーパーディスクを貼った。
８．蓋をして、３７℃のインキュベーターの中に置き、５〜７日間培養した。結核菌は増殖繁殖プロセスにおいてＭＴＴを分解して青色の点状の色団を形成するが、薬剤が結核マイコバクテリウムに対して阻止作用を有している場合、結核マイコバクテリウムが正常に繁殖することができず、薬剤のペーパーディスクが貼られたゲル試験標本の周囲に青い色団を形成することができないため、阻止円が形成された。
９．阻止円の大きさに基づき、薬剤の細菌に対する作用の効果を判断した。
【００３８】
本実施例における培養液２０ｍｌで採用する配合は、さらに、栄養物質が７Ｈ９配合２０ｍｌ、細菌細胞増殖指示薬が３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）-２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド０．５ｍｇ、コロイド材料が０．５〜１．５％アルギン酸ナトリウム０．３ｇ、阻害剤が０．４ｍｇマラカイトグリーンとすることも可能である。本実施例における凝固補助剤は、カルシウムイオン０．０３ｇであった。
【００３９】
次に、本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法および薬剤感受性試験装置を「普通細菌または真菌薬剤感受性試験に用いた実施例」を示す。
【００４０】
１．分離培養後の標的コロニーを、培養液２０ｍｌを用いて、液体菌懸濁液形式の的液状試験標本を作成した。
２．液状試験標本を均一に薬剤感受性試験装置の箱体の中に入れ、培養液の中のコロイド材料と箱体の中の凝固補助剤とを反応させ、３時間以内に凝固させて安定したゲルをなし、ゲル試験標本を形成した。
３．ゲル試験標本の表面の所定の位置に測定する薬剤のペーパーディスクを貼った。
４．蓋をして、３７℃のインキュベーターの中に置き、１２〜２４時間培養した。普通細菌または真菌は増殖繁殖プロセスにおいてＭＴＴを分解して青色の点状の色団を形成するが、薬剤が細菌に対して阻止作用を有している場合、細菌が正常に繁殖することができず、薬剤のペーパーディスクが貼られたゲル試験標本の周囲に色団を形成することができないため、阻止円が形成された。
５．阻止円の大きさに基づき、薬剤の細菌に対する作用の効果を判断した。
【００４１】
本実施例における培養液２０ｍｌで採用した配合は、栄養物質が普通ブイヨン配合２０ｍｌ、細菌細胞増殖指示薬が３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド４ｍｇ、コロイド材料が０．５〜１．５％アルギン酸ナトリウム０．４ｇであった。本実施例における凝固補助剤は、カルシウムイオン０．０４ｇであった。
【００４２】
次に、本細菌、細胞の薬剤感受性試験方法および薬剤感受性試験装置を「腫瘍細胞薬剤感受性試験に用いた実施例」を示す。
【００４３】
１．すでに確定診断した腫瘍患者の手術切除物細胞を分離して培養し、一定の数量になった後に、専用容器の中に置いて保存し、使用に備えた。
２．腫瘍細胞を含む前記溶液１ｍｌを取り、本発明を含有する培養液２０ｍｌの中に添加し、均一に混ぜ、細胞懸濁液形式の液状試験標本を作成した。
３．液状試験標本を均一に薬剤感受性試験装置の箱体の中に入れ、培養液の中のコロイド材料と箱体の中に置かれた凝固補助剤とを結合させ、３時間以内に凝固させて安定したゲルをなし、ゲル試験標本を形成した。
４．ゲル試験標本の表面の所定の位置に測定する薬剤のペーパーディスクを貼った。
５．蓋をして、３７℃のインキュベーターの中に置き、２〜７日間培養した。腫瘍細胞は増殖繁殖プロセスにおいてＭＴＴを分解して青色の点状の色団を形成するが、薬剤が腫瘍細胞に対して阻止作用を有している場合、細胞が正常に繁殖することができず、薬剤のペーパーディスクが貼られたゲル試験標本の周囲に色団を形成することができないため、阻止円が形成された。
６．阻止円の大きさに基づき、薬剤の腫瘍細胞に対する作用の効果を判断した。
【００４４】
本実施例における培養液２０ｍｌで採用した配合は、栄養物質が細胞培地配合２０ｍｌ、細菌細胞増殖指示薬が３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド５ｍｇ、コロイド材料が０．５〜１．５％アルギン酸ナトリウム０．４ｍｇであった。本実施例における凝固補助剤は、カルシウムイオン０．０４ｍｇであった。
【符号の説明】
【００４５】
１ 箱体
２ 凝固補助層
３ 蓋
４ 目盛
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌または細胞の薬剤感受性試験方法および薬剤感受性試験装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤感受性試験は、細菌または細胞の薬剤耐性を検査する重要な試験である。従来の薬剤感受性試験方法で用いられている培地は、一般に、液体培地と固体培地の２種に分かれる。その試験方法は、一般にペーパーディスク試験法および濃度試験法がある。ペーパーディスク試験法で採用されるのは固体培地であり、濃度試験法で採用されるのは液体培地である。ペーパーディスク試験法は、固体培地表面に貼られたペーパーディスクによって形成される薬剤の阻止円を観察することによって、結核菌の薬剤に対する感受性を確定する。濃度試験法は、異なる薬剤および異なる薬剤濃度試験容器の中の細菌または細胞の成長状況を観察し検査することによって、細菌または細胞の薬剤に対する感受性を確定する。ペーパーディスク試験法であっても濃度試験法であっても、その薬剤感受性試験プロセス全体を、一般に、細菌または細胞の濃縮、増殖または分離培養および薬剤感受性試験の３段階に分けることができる。例えば、従来の技術を用いて結核菌に対して薬剤感受性試験を行う場合、一般に、ペーパーディスク試験法および濃度試験法があり、その試験プロセス全体を、一般に結核菌の濃縮、増殖または分離培養および薬剤感受性試験の３段階に分けることができる。従来のペーパーディスク試験法で、結核菌濃縮段階のステップは、以下のとおりである。(1)患者が提供した標本をピペットで吸い取り、試験容器の中に置く。(2)試験容器の中に消化液を添加し、標本粘液に対して消化を行い、標本中の粘液および不純物の中に包まれた細菌を充分に露出させる。(3)遠心分離し、上清液を捨て、結核菌標本を得る。結核菌標本が得られた後に、増殖または分離培養を行う。増殖または分離培養段階のステップは、以下のとおりである。(4)すでに濃縮した結核菌標本を少し取り、濃縮菌液を調製する。(5)濃縮菌液を、例えばレーベンシュタイン・イェンセン培地などの固体培地に接種して、増殖または分離培養を行う。一般に、３７℃のインキュベーターの中で１ヵ月程度培養し、１つの細菌を培養して細茵コロニーをなす。細菌コロニーを得た後、薬剤感受性試験段階に入る。薬剤感受性試験段階のステップは、以下のとおりである。(6)少量の細菌コロニーを取り、一般に、１〜３個の細菌コロニーを取り、溶解分散して濃縮菌液をなす。(7)濃縮菌液を、例えば寒天培地などの固体培地表面に接種する。(8)固体培地表面に薬剤のペーパーディスクを貼る。(9)３７℃のインキュベーターの中に入れて１ヵ月程度培養し、薬剤の阻止円を観察し、結核菌の薬剤に対する感受性を確定する。従来のペーパーディスク試験法の長所は、操作が便利で、設備が簡単で、投資が小さいことであるが、以下の欠点が存在する。（欠点１）：試験全体に必要な時間が長すぎる。増殖または分離培養段階に１ヵ月程度かかり、薬剤感受性試験段階に約１ヵ月程度かかり、試験プロセス全体で約２ヵ月程度かかる。薬剤感受性試験で結果が得られた後になってから薬剤を使用して治療すると、治療のタイミングに深刻な影響を及ぼすことがある。臨床上、薬剤感受性試験がない状況で薬剤を使用して治療した場合、結核菌薬剤耐性の重篤な結果をもたらすことがよくある。（欠点２）：安全でない。試験全体で２回の人による接種が必要である。結核菌は伝染性を有するため、操作員に安全上の危惧をもたらし、環境を汚染する虞がある。
【０００３】
従来の濃度試験法には、２種の方法がある。１種の濃度試験法は、増殖培養段階で固体培地を採用する。その結核菌濃縮および増殖または分離培養の２つの段階のステップは、従来のペーパーディスク試験法と同じであるが、薬剤感受性試験段階のステップは、従来のペーパーディスク試験法と異なる。具体的には、以下のとおりである。増殖または分離培養して得た細菌コロニーを固体培地から取る。一般に、１つまたは数個の細茵コロニーを取る。→→溶解分散して菌懸濁液をなす→→異なる薬剤および異なる濃度で調製してなした複数個の試験容器の中に菌懸濁液を入れ、比較試験標本をつくる。→→試験容器の中の細菌の成長状況を観察し、検査し、結核菌の薬剤に対する感受性を確定する。この種の試験方法の長所は、設備が簡単で，投資が小さいことであるが、以下の欠点が存在する。（欠点１）：所要時間が長い。増殖または分離培養段階の方法およびステップは、従来のペーパーディスク試験法の方法およびステップと同じであるため、増殖または分離培養段階だけでも所要時間が１ヵ月程度かかる。（欠点２）：操作が面倒であり、安全でなく、かつ誤った試験結果をもたらしやすい。複数個の試験容器を調製する必要があるため、調製プロセスが面倒であり、安全でなく、操作員に安全上の危惧をもたらし、環境を汚染する虞がある。複数個の試験容器調製プロセスにおいて、その他の細菌に比較的汚染されやすく、誤った試験結果をもたらす可能性がある。もう１種の濃度試験法は、増殖または分離培養段階で液体培地を採用する。この種の試験方法は、例えば、ＢＤ社が販売しているバクテック９０００ＭＢおよびバクテックＭＧＩＴ９６０全自動高速マイコバクテリウム培養薬剤感受性判定システムなど、一般に専用装置の試験を採用する。その長所は、操作が簡単で、試験プロセスの時間が短く、平均検出時間は１４．４日であり、最も速くて１０日程度である。しかしながら、存在する主な欠点は、装置設備の価格が高く、投資が大きいことである。使用コストの高さは、１つ目には装置設備の使用コストが高く、２つ目には複数個の比較試験標本が必要であり、試薬のコストが比較的高いことである。その費用は比較的大きく、一般の病院では負担が難しく、普及推進が難しくなっている。
【０００４】
Ｉｎ−Ｖｉｔｒｏ細胞に対して薬剤感受性試験を行う方法は比較的多く、よく用いられる方法としては、ＭＴＴ比色法、放射性同位体取込法などがあるが、いずれも操作が面倒で、誤った試験結果がもたらされやすいなどの欠点が存在する。その理由は、異なる薬剤および異なる濃度の複数個の試験容器の調製が必要であり、かつ各試験容器の中に細胞懸濁液を加えなければならず、調製および細胞懸濁液を加えるプロセスが面倒なためである。複数個の試験容器を調製するプロセスにおいて、比較的汚染されやすく、誤った試験結果をもたらす可能性がある。
【０００５】
上述した結核菌薬剤感受性試験を詳細に分析することによって、従来の細菌、細胞薬剤感受性試験方法、特に結核菌試験方法に以下の欠点が存在することが分かる。
（１）試験プロセス全体の所要時間が長い。
（２）操作が面倒である。
（３）安全でない。
（４）誤判定が出やすい。
（５）投資が大きく、普及推進が難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】（特になし）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、試験プロセスの時間が短い、細菌または細胞の薬剤感受性試験方法および薬剤感受性試験装置を提供することである。もう１つの目的は、投資を少なくし、使用コストを低くすることである。さらにもう１つの目的は、安全で便利に使用できるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記目的を実現するために、本発明の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法は、以下のステップを含む。
（１）検査する細菌標本または細胞標本を濃縮する。
（２）検査する細菌標本または細胞標本の中に、栄養物質、コロイド材料を含む培養液を添加し、液状試験標本を作成する。
（３）液状試験標本の中に、コロイド材料と反応してゲル状を形成することが可能な凝固補助剤を添加し、ゲル試験標本を作成する。
（４）ゲル試験標本の表面に薬剤のペーパーディスクを貼る。
（５）それをインキュベーターの中に入れて培養する。
（６）薬剤の阻止円を観測し、薬剤に対する感受性を確定する。
【０００９】
前記細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、前記培養液が細菌細胞増殖指示薬を含む。
【００１０】
前記細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、液状試験標本をインキュベーターの中に入れて、２〜４日間増殖培養する。
【００１１】
前記細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、前記培養液の中に静菌剤を含む。
【００１２】
前記細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、前記培養液の中の栄養物質と、コロイド材料との間の配合比が、栄養物質１００ｍｌにつきコロイド材料０．８ｇ〜２ｇを加え、栄養物質１００ｍｌにつき凝固補助剤０．１ｇ〜０．２ｇを配合する。
【００１３】
前記細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、前記培養液の中の栄養物質と、コロイド材料と、細菌細胞増殖指示薬との間の配合比が、栄養物質１００ｍｌにつきコロイド材料０．８ｇ〜２ｇを加え、細菌細胞増殖指示薬２ｍｇ〜２０ｍｇを加え、栄養物質１００ｍｌにつき凝固補助剤０．１ｇ〜０．２ｇを配合する。
【００１４】
前記細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、前記培養液の中の栄養物質と、コロイド材料と、細菌細胞増殖指示薬と、静菌剤との間の配合比が、栄養物質１００ｍｌにつきコロイド材料０．８ｇ〜２ｇを加え、細菌細胞増殖指示薬２ｍｇ〜２０ｍｇを加え、静菌剤適量を加え、栄養物質１００ｍｌごとに凝固補助剤０．１ｇ〜０．２ｇを配合する。
【００１５】
前記細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、培養液の１回に使用する量に小分けし、密封して保存する。
【００１６】
前記細菌、細胞の薬剤感受性試験方法の薬剤感受性試験装置は、周壁および底部が閉じられ、上端が開いた構造形式を有する箱体を含み、箱体のキャビティの中に凝固補助剤が置かれる。
【００１７】
前記薬剤感受性試験装置は、徐放体と、徐放体の中に付着した凝固補助剤とからなる凝固補助層が、箱体のキャビティの底部に設けられる。
【００１８】
前記薬剤感受性試験装置は、接着剤によって凝固補助剤と混合した後に箱体の底部に塗布する構造形式である凝固補助層が、箱体のキャビティの底部に設けられている。
【００１９】
前記薬剤感受性試験装置は、箱体の底部に目盛が設けられている。
【００２０】
前記薬剤感受性試験装置は、箱体の開いた端にそれと合わせた蓋が設けられる。
【００２１】
本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、その培養液の中の栄養物質が、栄養成分と、緩衝剤とを含む。その作用は、細菌または細胞の成長のために、栄養を提供し、培養液のＰＨを制御することである。異なる細菌または細胞に対して、異なる栄養物質の組成を選定することができる。例えば、結核菌は７Ｈ９培地を選定することができ、普通細菌または真菌は普通ブイヨン配合を選定することができ、腫瘍細胞は細胞培地配合を選定することができる。培養液の中のコロイド材料の作用は、培養液の中に凝固補助剤を添加する前に、コロイド材料がその中に溶解して、培養液が液状を呈するようにし、培養液の中に凝固補助剤を添加した後、コロイド材料が凝固補助剤と反応して、安定したゲルを培養液が一定時間内に形成するようにすることである。０．５〜１．５％アルギン酸ナトリウムまたは０．５〜２．０％ペクチン、０．５〜１．５％カラギーナンなどを選定することができる。培養液の中の細菌細胞増殖指示薬の作用は、細菌または細胞の増殖繁殖プロセスにおいてＭＴＴを分解して青色の点状の色団を形成することによって、短時間内に各細菌または細胞が肉眼で見える青色の粒子状の点を形成し、肉眼または低倍率の顕微鏡で点の性質および数量を正確に観察して細胞または細菌の成長状况を確定することができるようにすることである。３-（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（その商品名はＭＴＴ，英語名：３−（４，５−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を選定することができる。
【００２２】
培養液の中に静菌剤を加えるのは、主に結核マイコバクテリウム薬剤感受性試験に用いられ、その作用は、抗酸菌以外のその他の雑菌の成長を抑制することである。
【００２３】
本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法で用いる凝固補助剤の作用は、凝固補助剤が培養液の中のコロイド材料と反応して、安定したゲルを培養液が一定時間内に形成するようにすることである。カルシウムイオンまたはマグネシウムイオン、ホウ砂、クエン酸カリウムなどを選定することができる。
【００２４】
本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、その薬剤感受性試験装置が、周壁および底部が閉じられ、上端が開いた構造形式を有する箱体を含み、箱体の中に凝固補助剤が置かれ、培養液の中にコロイド材料が添加され、液状試験標本は培養液を用いてなるため、液状試験標本の中にコロイド材料を有し、液状試験標本を薬剤感受性試験装置内に入れる以前は液状を呈しており、薬剤感受性試験装置に入れた後、試験標本の中のコロイド材料が薬剤感受性試験装置の中の凝固補助剤と反応して、安定したゲル状を常温で急速に形成し、ゲル試験標本を形成することができる。こうすることによって、薬剤のペーパーディスクをゲル試験標本の表面に貼ることができるため、薬剤のペーパーディスクを用いて、細菌または細胞の薬剤に対する感受性を試験することができる。
【００２５】
本発明が、従来の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法に比べ、試験プロセス全体の時間が短い理由は、以下のとおりである。(1):患者から提供された標本の中の検査する細菌または細胞を充分に利用する。患者から提供された標本の中の細菌または細胞の大部分が濃縮されて試験標本の作成に用いられ、また試験標本はすべてが薬剤感受性試験に用いられるため、患者から提供された標本の中の検査する細菌または細胞が充分に利用される。(2):増殖もしくは分離培養段階を省略するか、または増殖もしくは分離培養時間を短くすることができる。一般の細菌または細胞に対して薬剤感受性試験を行う場合、同時に６個の薬剤のペーパーディスク試験を行えば要求を満たすことができるため、薬剤感受性試験装置のキャビティの面積は、同時に６個の薬剤のペーパーディスクの薬剤感受性試験を行うように設計することができる。薬剤感受性試験は、細菌または細胞の薬剤耐性を検査するため、薬剤感受性試験を行う前に、すべての患者に対して確定診断が行われている。すでに確定診断が行われた一般の患者にとって、本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法は、提供された標本の中の細菌または細胞を充分に利用するため、薬剤感受性試験を行うときに、薬剤感受性試験装置のキャビティの中の単位面積あたりの細菌または細胞の数が比較的大きく、薬剤感受性試験の細菌または細胞に対する数の要求を充分に満たし、増殖培養によって細菌または細胞の数をさらに増やす必要がない。確定診断時に、患者から提供された標本に含まれる検査する細菌の量が比較的少ないことが確認された場合には、作成された液状試験標本をインキュベーターの中に置いて増殖培養を行ってから、液状試験標本を薬剤感受性試験装置の中に入れ、薬剤感受性試験を行うべきである。本発明の増殖培養は、液状培地の中で行われるため、相対的に、細菌の液状培地中での増殖速度は、固体培地上での増殖速度に比べて速い。さらに、患者によって提供された標本の中の検査する細菌または細胞を充分利用し、増殖培養前の初期数量を比較的大きくする。そのため、増殖培養の時間が短くなる。例えば、結核菌に対して、中国疾病予防センターが編著し、中国協和医科大学出版社が２００４年７月１日に出版した『中国結核病予防治療計画 喀痰塗抹標本顕微鏡検査品質保証マニュアル』における規定により、チール・ネルゼン染色法を採用し、顕微鏡検査の結果、抗酸菌陽性（４＋）：１視野あたり１０本以上であった場合、増殖培養を行わずに、薬剤感受性試験段階に直接入ることができる。このようにして、本発明は、増殖培養段階を省略するため、試験全体の時間が節約される。顕微鏡検査の結果、抗酸菌陽性（３＋）：１視野あたり１〜９本以下であった場合、増殖培養を行うべきである。液状培地の中での増殖速度は速く、また初期菌量は大きく、従来の増殖培養の所要時間に比べ、所要時間が短いため、試験全体の時間が節約される。(3):薬剤感受性試験段階の時間が短い。初期数量が大きいため、薬剤の阻止円の形成が比較的容易である。従来のペーパーディスク試験法に比べて所要時間が短いため、試験全体の時間が節約される。さらに、細菌細胞増殖指示薬の呈色作用によって、細菌または細胞の繁殖成長状況および薬剤の阻止円をさらに良好に示すことができ、観察、検査にさらに便利であり、試験時間をさらに短くすることができる。発明者が繰り返し試験を行った結果、本発明の細菌、細胞薬剤感受性試験方法を用いて結核菌薬剤感受性試験を行うことによって、増殖培養段階を省略することができ、増殖培養が必要である場合でも、２〜４日しか必要でなく、薬剤感受性試験段階は５〜７日しか必要でなく、試験プロセス全体で１４日もかからないことが証明された。上述した内容を総合すると、本発明は試験プロセスの時間を短くする目的を実現（達成）している。
【００２６】
本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法が、投資が少なく、使用コストが低い理由は以下のとおりである。本発明を実施するために必要な設備は、従来のペーパーディスク試験法と基本的に同じであり、遠心装置、薬剤感受性試験装置などと組み合わせるだけでよい。前記遠心装置、薬剤感受性試験装置などは、製造が簡単で生産コストが低いため、設備全体の投資が少ない。本発明を実施するには、ディスポーザルの試験容器および栄養物質、緩衝剤、コロイド材料、指示薬などの試薬を組み合わせて使用する必要があり、これらのディスポーザルの試験容器および試薬のコストが低く、かつ使用数量が少ない。また、本発明の装置設備の投資が少なく、使用コストが低く、本発明の使用コストをさらに減少させる。そのため、本発明は、投資が少なく、使用コストが低いという目的を有効に実現（達成）する。
【００２７】
本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法の使用が安全で便利な理由は、以下のとおりである。本発明は、検査する標本を濃縮し、結果の判定をディスポーザルの密閉容器内で行うことができ、その他器材を汚染することがなく、操作の完了後にまとめて消毒処理する。また、試験プロセス全体の手作業の手順が少なく、簡単であるため、細菌の作業員および環境に対する影響を最大限に減少させ、試験の生物学的安全性を大幅に向上させることができる。本発明は、ディスポーザルの培養液を密封瓶の中に注入し、使用時に、密封瓶を開け、培養液と濃縮した細菌または細胞とを均一に混ぜた後、薬剤感受性試験装置の中に入れるだけでよい。操作が簡単で便利であるため、本発明は、安全で便利に使用するという目的を有効に実現（達成）することができる。
【００２８】
次に、図面および実施例と合わせ、本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法および薬剤感受性試験装置について詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明における薬剤感受性試験装置の正面断面の概略図である。
【図２】図１に示す下面の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
図に示すように、箱体（１）は、周壁および底部が閉じられ、上端が開いた構造形式である。徐放体と、徐放体の中に付着した凝固補助剤とからなる凝固補助層（２）が、箱体（１）内に設けられている。箱体（１）の底部に目盛（４）が設けられ、箱体（１）の開いた端に合わせて蓋（３）を有する。
【００３１】
本発明の薬剤感受性試験装置の凝固補助層（２）における徐放体は、徐放膜とすることができる。培養液を箱体（１）の中に入れた後、この徐放膜が培養液の中に溶解することができ、凝固補助剤が徐放体の中に付着する。糖と凝固補助剤との混合を採用し、吹付塗布の方法を用いて箱体（１）の中に凝固補助層を形成することもできる。
【００３２】
次に、本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法および薬剤感受性試験装置を「結核菌薬剤感受性試験に用いた実施例」を示す。
【００３３】
チール・ネルゼン染色法を採用して確定診断を行い、顕微鏡検査の結果、抗酸菌陽性（４＋）：１視野あたり１０本以上であったものに対して、以下の薬剤感受性試験を行った。
１．患者の朝の喀痰標本を５ｍｌ取り、４％水酸化ナトリウムで消化（溶解）した。
２．遠心機の中に置き、４５００回転で１０分間遠心分離し、標本の中の結核菌を充分に沈殿させた。
３．上清液を捨てた。
４．培養液２０ｍｌを用いて沈殿物を溶離し、液体菌懸濁液形式の液状試験標本を作成した。
５．液状試験標本を均一に薬剤感受性試験装置の箱体の中に入れ、培養液の中のコロイド材料と箱体の中の凝固補助剤とを反応させ、３時間以内に凝固させて安定したゲルをなし、ゲル試験標本を形成した。
６．ゲル試験標本の表面の所定の位置に測定する薬剤のペーパーディスクを貼った。
７．蓋をして、３７℃のインキュベーターの中に置き、５〜７日間培養した。結核菌は増殖繁殖プロセスにおいてＭＴＴを分解して青色の点状の色団を形成するが、薬剤が結核菌に対して阻止作用を有している場合、薬剤のペーパーディスクが貼られたゲル試験標本の周囲に青い色団を形成することができないため、阻止円が形成された。
８．阻止円の大きさに基づき、薬剤の細菌に対する作用の効果を判断した。
【００３４】
本実施例における培養液２０ｍｌで採用した配合は、栄養物質が７Ｈ９配合２０ｍｌ、細菌細胞増殖指示薬が３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド０．４ｍｇ、コロイド材料が０．５〜１．５％アルギン酸ナトリウム０．１７ｇ、阻害剤が０．４ｍｇマラカイトグリーンであった。本実施例における凝固補助剤は、カルシウムイオン０．０２ｇであった。
【００３５】
本実施例における培養液２０ｍｌに採用する配合は、さらに、栄養物質が７Ｈ９配合２０ｍｌ、細菌細胞増殖指示薬が３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド０．５ｍｇ、コロイド材料が０．５〜１．５％アルギン酸ナトリウム０．３ｇ、阻害剤が０．４ｍｇマラカイトグリーン０．８ｍｌとし、本実施例における凝固補助剤を、カルシウムイオン０．０３ｇとすることも可能である。
【００３６】
本実施例における培養液３０ｍｌに採用する配合は、さらに、栄養物質が７Ｈ９配合２０ｍｌ、細菌細胞増殖指示薬が３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド４ｍｇ、コロイド材料０．４ｇ、阻害剤が０．４ｍｇマラカイトグリーンとし、本実施における凝固補助剤を、カルシウムイオン０．０４ｇとすることも可能である。
【００３７】
チール・ネルゼン染色法を採用して確定珍断を行い、顕微鏡検査の結果、抗酸菌陽性（３＋）：１視野あたり１〜９本以下であったものに対して、以下の薬剤感受性試験を行った。
１．患者の朝の喀痰標本を５ｍｌ取り、４％水酸化ナトリウムで消化（溶解）した。
２．遠心機の中に置き、４５００回転で１０分間遠心分離し、標本の中の結核菌を充分に沈殿させた。
３．上清液を捨てた。
４．培養液２０ｍｌを用いて沈殿物を溶離し、液体菌懸濁液形式の液状試験標本を作成した。
５．液状試験標本を３７℃のインキュベーターの中に置き、２〜４日間増菌培養し、液状試験標本が淡青色を呈する変化が観察された。
６．増菌後の液状試験標本を均一に薬剤感受性試験装置の箱体の中に入れ、培養液の中のコロイド材料と箱体の中の凝固補助剤とを反応させ、３時間以内に凝固させて安定したゲルをなし、ゲル試験標本を形成した。
７．ゲル試験標本の表面の所定の位置に測定する薬剤のペーパーディスクを貼った。
８．蓋をして、３７℃のインキュベーターの中に置き、５〜７日間培養した。結核菌は増殖繁殖プロセスにおいてＭＴＴを分解して青色の点状の色団を形成するが、薬剤が結核マイコバクテリウムに対して阻止作用を有している場合、結核マイコバクテリウムが正常に繁殖することができず、薬剤のペーパーディスクが貼られたゲル試験標本の周囲に青い色団を形成することができないため、阻止円が形成された。
９．阻止円の大きさに基づき、薬剤の細菌に対する作用の効果を判断した。
【００３８】
本実施例における培養液２０ｍｌで採用する配合は、さらに、栄養物質が７Ｈ９配合２０ｍｌ、細菌細胞増殖指示薬が３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）-２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド０．５ｍｇ、コロイド材料が０．５〜１．５％アルギン酸ナトリウム０．３ｇ、阻害剤が０．４ｍｇマラカイトグリーンとすることも可能である。本実施例における凝固補助剤は、カルシウムイオン０．０３ｇであった。
【００３９】
次に、本発明の細菌、細胞の薬剤感受性試験方法および薬剤感受性試験装置を「普通細菌または真菌薬剤感受性試験に用いた実施例」を示す。
【００４０】
１．分離培養後の標的コロニーを、培養液２０ｍｌを用いて、液体菌懸濁液形式の的液状試験標本を作成した。
２．液状試験標本を均一に薬剤感受性試験装置の箱体の中に入れ、培養液の中のコロイド材料と箱体の中の凝固補助剤とを反応させ、３時間以内に凝固させて安定したゲルをなし、ゲル試験標本を形成した。
３．ゲル試験標本の表面の所定の位置に測定する薬剤のペーパーディスクを貼った。
４．蓋をして、３７℃のインキュベーターの中に置き、１２〜２４時間培養した。普通細菌または真菌は増殖繁殖プロセスにおいてＭＴＴを分解して青色の点状の色団を形成するが、薬剤が細菌に対して阻止作用を有している場合、細菌が正常に繁殖することができず、薬剤のペーパーディスクが貼られたゲル試験標本の周囲に色団を形成することができないため、阻止円が形成された。
５．阻止円の大きさに基づき、薬剤の細菌に対する作用の効果を判断した。
【００４１】
本実施例における培養液２０ｍｌで採用した配合は、栄養物質が普通ブイヨン配合２０ｍｌ、細菌細胞増殖指示薬が３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド４ｍｇ、コロイド材料が０．５〜１．５％アルギン酸ナトリウム０．４ｇであった。本実施例における凝固補助剤は、カルシウムイオン０．０４ｇであった。
【００４２】
次に、本細菌、細胞の薬剤感受性試験方法および薬剤感受性試験装置を「腫瘍細胞薬剤感受性試験に用いた実施例」を示す。
【００４３】
１．すでに確定診断した腫瘍患者の手術切除物細胞を分離して培養し、一定の数量になった後に、専用容器の中に置いて保存し、使用に備えた。
２．腫瘍細胞を含む前記溶液１ｍｌを取り、本発明を含有する培養液２０ｍｌの中に添加し、均一に混ぜ、細胞懸濁液形式の液状試験標本を作成した。
３．液状試験標本を均一に薬剤感受性試験装置の箱体の中に入れ、培養液の中のコロイド材料と箱体の中に置かれた凝固補助剤とを結合させ、３時間以内に凝固させて安定したゲルをなし、ゲル試験標本を形成した。
４．ゲル試験標本の表面の所定の位置に測定する薬剤のペーパーディスクを貼った。
５．蓋をして、３７℃のインキュベーターの中に置き、２〜７日間培養した。腫瘍細胞は増殖繁殖プロセスにおいてＭＴＴを分解して青色の点状の色団を形成するが、薬剤が腫瘍細胞に対して阻止作用を有している場合、細胞が正常に繁殖することができず、薬剤のペーパーディスクが貼られたゲル試験標本の周囲に色団を形成することができないため、阻止円が形成された。
６．阻止円の大きさに基づき、薬剤の腫瘍細胞に対する作用の効果を判断した。
【００４４】
本実施例における培養液２０ｍｌで採用した配合は、栄養物質が細胞培地配合２０ｍｌ、細菌細胞増殖指示薬が３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド５ｍｇ、コロイド材料が０．５〜１．５％アルギン酸ナトリウム０．４ｍｇであった。本実施例における凝固補助剤は、カルシウムイオン０．０４ｍｇであった。
【符号の説明】
【００４５】
１ 箱体
２ 凝固補助層
３ 蓋
４ 目盛
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）検査する細菌標本または細胞標本を濃縮するステップと、
（２）検査する細菌標本または細胞標本の中に、栄養物質、コロイド材料を含む培養液を添加し、液状試験標本を作成するステップと、
（３）液状試験標本の中に、コロイド材料と反応してゲル状を形成することが可能な凝固補助剤を添加し、ゲル試験標本を作成するステップと、
（４）ゲル試験標本の表面に薬剤のペーパーディスクを貼るステップと、
（５）それをインキュベーターの中に入れて培養するステップと、
（６）薬剤の阻止円を観測し、薬剤に対する感受性を確定するステップと、
を含んでなることを特徴とする、細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項２】
前記培養液が細菌細胞増殖指示薬を含むことを特徴とする、請求項１に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項３】
液状試験標本をインキュベーターの中に入れて、２〜４日間増殖培養することを特徴とする、請求項１に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項４】
液状試験標本をインキュベーターの中に入れて、２〜４日間増殖培養することを特徴とする、請求項２に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項５】
前記培養液の中に静菌剤を含むことを特徴とする、請求項１、２、３又は４に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項６】
前記培養液の中の栄養物質と、コロイド材料との間の配合比が、栄養物質１００ｍｌにつきコロイド材料０．８ｇ〜２ｇを加え、栄養物質１００ｍｌにつき凝固補助剤０．１ｇ〜０．２ｇを配合することを特徴とする、請求項１に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項７】
前記培養液の中の栄養物質と、コロイド材料と、細菌細胞増殖指示薬との間の配合比が、栄養物質１００ｍｌにつきコロイド材料０．８ｇ〜２ｇを加え、細菌細胞増殖指示薬２ｍｇ〜２０ｍｇを加え、栄養物質１００ｍｌにつき凝固補助剤０．１ｇ〜０．２ｇを配合することを特徴とする、請求項２、３又は４に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項８】
前記培養液の中の栄養物質と、コロイド材料と、細菌細胞増殖指示薬と、静菌剤との間の配合比が、栄養物質１００ｍｌにつきコロイド材料０．８ｇ〜２ｇを加え、細菌細胞増殖指示薬２ｍｇ〜２０ｍｇを加え、静菌剤適量を加え、栄養物質１００ｍｌごとに凝固補助剤０．１ｇ〜０．２ｇを配合することを特徴とする、請求項５に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項９】
培養液を１回に使用する量に小分けし、密封して保存することを特徴とする、
請求項１、２、３、４又は６に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項１０】
培養液を１回に使用する量に小分けし、密封して保存することを特徴とする、請求項５に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項１１】
培養液を１回に使用する量に小分けし、密封して保存することを特徴とする、請求項７に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項１２】
培養液を１回に使用する量に小分けし、密封して保存することを特徴とする、請求項８に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法に用いられる薬剤感受性試験装置であって、周壁および底部が閉じられると共に上端が開いた構造を有する箱体（１）を備え、その箱体（１）のキャビティの中に凝固補助剤が置かれることを特徴とする、薬剤感受性試験装置。
【請求項１４】
徐放体と、徐放体の中に付着した凝固補助剤とからなる凝固補助層（２）が、箱体（１）のキャビティの底部に設けられていることを特徴とする、請求項１３に記載の薬剤感受性試験装置。
【請求項１５】
接着剤と凝固補助剤とを混合した後に箱体（１）の底部に塗布する構造形式である凝固補助層（２）が、箱体（１）のキャビティの底部に設けられていることを特徴とする、請求項１３に記載の薬剤感受性試験装置。
【請求項１】
（１）検査する細菌標本または細胞標本を濃縮するステップと、
（２）検査する細菌標本または細胞標本の中に、栄養物質、コロイド材料を含む培養液を添加し、液状試験標本を作成するステップと、
（３）液状試験標本の中に、コロイド材料と反応してゲル状を形成することが可能な凝固補助剤を添加し、ゲル試験標本を作成するステップと、
（４）ゲル試験標本の表面に薬剤のペーパーディスクを貼るステップと、
（５）それをインキュベーターの中に入れて培養するステップと、
（６）薬剤の阻止円を観測し、薬剤に対する感受性を確定するステップと、
を含んでなることを特徴とする、細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項２】
前記培養液が細菌細胞増殖指示薬を含むことを特徴とする、請求項１に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項３】
液状試験標本をインキュベーターの中に入れて、２〜４日間増殖培養することを特徴とする、請求項１に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項４】
液状試験標本をインキュベーターの中に入れて、２〜４日間増殖培養することを特徴とする、請求項２に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項５】
前記培養液の中に静菌剤を含むことを特徴とする、請求項１、２、３又は４に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項６】
前記培養液の中の栄養物質と、コロイド材料との間の配合比が、栄養物質１００ｍｌにつきコロイド材料０．８ｇ〜２ｇを加え、栄養物質１００ｍｌにつき凝固補助剤０．１ｇ〜０．２ｇを配合することを特徴とする、請求項１に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項７】
前記培養液の中の栄養物質と、コロイド材料と、細菌細胞増殖指示薬との間の配合比が、栄養物質１００ｍｌにつきコロイド材料０．８ｇ〜２ｇを加え、細菌細胞増殖指示薬２ｍｇ〜２０ｍｇを加え、栄養物質１００ｍｌにつき凝固補助剤０．１ｇ〜０．２ｇを配合することを特徴とする、請求項２、３又は４に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項８】
前記培養液の中の栄養物質と、コロイド材料と、細菌細胞増殖指示薬と、静菌剤との間の配合比が、栄養物質１００ｍｌにつきコロイド材料０．８ｇ〜２ｇを加え、細菌細胞増殖指示薬２ｍｇ〜２０ｍｇを加え、静菌剤適量を加え、栄養物質１００ｍｌごとに凝固補助剤０．１ｇ〜０．２ｇを配合することを特徴とする、請求項５に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項９】
培養液を１回に使用する量に小分けし、密封して保存することを特徴とする、
請求項１、２、３、４又は６に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項１０】
培養液を１回に使用する量に小分けし、密封して保存することを特徴とする、請求項５に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項１１】
培養液を１回に使用する量に小分けし、密封して保存することを特徴とする、請求項７に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項１２】
培養液を１回に使用する量に小分けし、密封して保存することを特徴とする、請求項８に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の細菌または細胞の薬剤感受性試験方法に用いられる薬剤感受性試験装置であって、周壁および底部が閉じられると共に上端が開いた構造を有する箱体（１）を備え、その箱体（１）のキャビティの中に凝固補助剤が置かれることを特徴とする、薬剤感受性試験装置。
【請求項１４】
徐放体と、徐放体の中に付着した凝固補助剤とからなる凝固補助層（２）が、箱体（１）のキャビティの底部に設けられていることを特徴とする、請求項１３に記載の薬剤感受性試験装置。
【請求項１５】
接着剤と凝固補助剤とを混合した後に箱体（１）の底部に塗布する構造形式である凝固補助層（２）が、箱体（１）のキャビティの底部に設けられていることを特徴とする、請求項１３に記載の薬剤感受性試験装置。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１２−５０３９７５（Ｐ２０１２−５０３９７５Ａ）
【公表日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２８１７６（Ｐ２０１１−５２８１７６）
【出願日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／００００６４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１８８３
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５１１０５６７２５）湖南省天騎医学新技▲術▼有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年２月１６日（２０１２．２．１６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＮ２０１０／００００６４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１８８３
【国際公開日】平成２２年１０月７日（２０１０．１０．７）
【出願人】（５１１０５６７２５）湖南省天騎医学新技▲術▼有限公司 (1)
【Ｆターム（参考）】
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