薬物として用いる、筋力を回復する能力がある改変アグリン断片
少なくともヒトアグリンのドメインＬＧ２およびＬＧ３を、共有結合性に連結した形で含み、かつニューロトリプシンによって切断され得ないように改変された、薬物として用いる、インビボ活性を有する改変アグリン断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物として用いる改変アグリン断片について言及する。加えて、本発明は、種々の、特に、筋肉疾患または運動ニューロン疾患の処置だけでなく、さらなるニューロトリプシン関連疾患の処置にも用いる薬物の製造のための改変アグリン断片の使用に言及する。さらに、本発明は、種々の疾患の処置における改変アグリン断片の使用に言及する。最後に、本発明は、改変アグリン断片を含む薬学的組成物、および特定の改変アグリン断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
６０歳以上の高齢者は、除脂肪体重の容赦ない下降に直面する。これはごく普通のことであるため、長い間、その根本的な機構を調べることに価値があるとは考えられていなかった。現在、除脂肪体重の加齢性下降は、サルコペニアまたは虚弱（ｆｒａｉｌｔｙ）と呼ばれている。
【０００３】
サルコペニアおよび虚弱はどちらも、高齢者における機能性および自立度に関して、非常に関連性の深い実体である。サルコペニアは、その末期に虚弱および身体障害に至る、筋量および筋力における退行性加齢性下降とみなされている。サルコペニア患者の筋量の下降速度は、その疾患に罹っていない人々の下降速度より有意に速い。サルコペニアは静的な状態ではなく、加齢と共に悪化する。それのゆっくりとした発症のため、人々は通常、すでに進行期に達しているときまでサルコペニアに気づかない。
【０００４】
サルコペニアの筋量は、筋線維数の連続的な縮小によって特徴づけられる。線維サイズはより不均一であり、線維タイプの群化が観察される。線維タイプの群化は、繰り返される除神経／神経再生によって引き起こされると考えられる。加えて、老化した筋肉は、脂肪および結合組織の浸潤を特徴とする。これ全てが筋力および運動速度の下降の原因となる。多くの筋肉に観察される加齢性変化は、それらの筋肉線維の神経支配における加齢性変化によってある程度、引き起こされると考えられる。老化の間、機能する運動単位（ＭＵ）の概算数の有意かつ漸進的な低下が観察される。同様に、ＭＵの実質的損失と関連した明らかな筋力下降が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または重症度の低い型の脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）などの運動ニューロン疾患に苦しんでいる個体に観察される。
【０００５】
筋線維の除神経／神経再支配のサイクルはシナプス可塑性を必要とする。シナプス可塑性の過程はまだ詳細にはわかっていない。しかしながら、この数年で、神経筋接合部（ＮＭＪ）の形成および維持におけるいくつかの重要なプレーヤーが同定された（ＳｏｎｇおよびＢａｌｉｃｅ−Ｇｏｒｄｏｎ、２００８）。十分特徴づけられたタンパク質アグリン（ＢｅｚａｋｏｖａおよびＲｕｅｇｇ、２００３）は、発生中のＮＭＪのシナプス後装置の形成および維持を援助することによってシナプス形成において中心的役割を果たす。
【０００６】
アグリンは、４００〜６００ｋＤａの分子量を有する大きなヘパランプロテオグリカンである。（データベースアクセッション番号ＮＰ＿９４０９７８）。タンパク質コアは、約２０００個のアミノ酸からなり、その質量は約２２５ｋＤａである。それは、９個のＫ（クニッツ型）ドメイン、２個のＬＥ（ラミニン−ＥＧＦ様）ドメイン、１個のＳＥＡ（精子のタンパク質、エンテロキナーゼ、およびアグリン）ドメイン、４個のＥＧ（上皮増殖因子様）ドメイン、および３個のＬＧ（ラミニン球状）ドメインで構成される多ドメインタンパク質である（図１）。アグリンは、非常に重要なタンパク質であり、アグリン欠損マウスは、呼吸不全により出生時に死ぬ。これは、アグリンが筋線維の正常な神経支配に厳重に必要とされるという事実、およびこれらのマウスが正常なＮＭＪを構築することができないという事実によって引き起こされる。
【０００７】
アグリンは、いくつかのスプライスバリアントとして存在し、Ｎ末端のＮｔＡ（Ｎ末端アグリン）ドメインを含む分泌性タンパク質として発現することができ、その分泌性タンパク質がアグリンの最も豊富にある形であり、その優勢形は運動ニューロンに発現する。それは、そのニューロンの神経細胞体において産生され、軸索を下へと輸送され、運動神経の軸索終末からＮＭＪのシナプス間隙へ放出される。ここで、それは、ＬＲＰ４のアゴニストとして働き、基底層の成分になる場合もある。ＣＮＳにおいて、たいていのアグリンは、Ｎ末端のＮｔＡドメインを欠くＮ末端における選択的スプライシングによるＩＩ型膜貫通タンパク質として発現する（ＢｅｚａｋｏｖａおよびＲｕｅｇｇ、２００３）。
【０００８】
アグリンにおけるセリン／スレオニン（Ｓ／Ｔ）リッチなセグメントは、高度のグリコシル化に関与しており、いくつかのグリコシル化部位、および大質量のプロテオグルカンを生じるグルコサミノグリカン付着部位を含む。第１のＥＧドメインから始まるアグリンのＣ末端の７５ｋＤａの部分は、筋肉細胞においてアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）クラスター形成活性における完全活性に必要とされるが、最もＣ末端の２０ｋＤａの断片が、ＡＣｈＲ凝集を誘導するのに十分である（ＢｅｚａｋｏｖａおよびＲｕｅｇｇ、２００３）。α−ジストログリカン、ヘパリン、いくつかのインテグリン、およびＬＲＰ４を含むアグリンの相互作用パートナーについてのいくつかの結合部位は、Ｃ末端領域にマッピングされる。大きなヘパラン硫酸側鎖は、ヘパリン結合タンパク質、例えば、いくつかの増殖因子についての結合部位である。
【０００９】
ヒトアグリンのＣ末端部分において、２つの選択的スプライス部位、ｙおよびｚがある。ｙ部位には、０個、４個、１７個、または２１（４＋１７）個のアミノ酸の挿入断片が存在する場合があり、ｚ部位では、０個、８個、１１個、または１９（８＋１１）個のアミノ酸の挿入断片が存在する場合がある。ｙ部位におけるその４つの挿入アミノ酸の機能は、ヘパリン結合部位を形成することである。運動ニューロンは、主にｙ４アグリンを発現する。ＮＭＪ成熟に関して最も重要なアグリンのスプライス部位はｚ部位であり、それは、アグリンに、アセチルコリン受容体クラスター形成作用物質として活性がある能力を与える。スプライス部位ｙにおける４個のアミノ酸の挿入断片の存在下でｚ部位に８個のアミノ酸の挿入を含む完全長アグリン（ｙ４ｚ８）が、培養筋管クラスター形成アッセイにおいて３５ｐＭの最大半量ＡＣｈＲクラスター形成活性を有するアグリンバリアントを生じることはよく知られている。１１個のアミノ酸の挿入は、５ｎＭの最大半量ＡＣｈＲクラスター形成活性を生じるが、１９個のアミノ酸の挿入は結果として、１１０ｐＭの最大半量ＡＣｈＲクラスター形成活性を生じる。この部位において挿入がないアグリンは、インビトロ培養筋管上でアセチルコリン受容体をクラスター形成することに活性はない（ＢｅｚａｋｏｖａおよびＲｕｅｇｇ、２００３）。したがって、クラスター形成アッセイにおいて最も活性の高い形のアグリンは、ｙ４ｚ８バリアントであり、それは運動ニューロンによって発現する。
【００１０】
ＬＧ２、ＥＧ４、およびＬＧ３ドメインを含むアグリン（ｙ４ｚ８）の約４０ｋＤａのＣ末端断片は、ＡＣｈＲクラスター形成に活性があり、ＡｃｈＲクラスター形成活性において１３０ｐＭのＥＣ５０をもつことが見出されているが、より短い断片は、より低い活性を有するだけである。ｚ８挿入を含むＣ末端ＬＧ３ドメインは、１３ｎＭだけの最大半量ＡＣｈＲクラスター形成活性を示し、その活性は、４０ｋＤａの断片の１００分の１の率である（ＢｅｚａｋｏｖａおよびＲｕｅｇｇ、２００３）。
【００１１】
ＮＭＪの発生および成熟中、アグリンは、アセチルコリン受容体のクラスター形成に関与する重要なプレーヤー分子である。ＮＭＪが、神経伝達物質のアセチルコリンによって不安定化されるが、運動ニューロンによって分泌されるアグリンは、膜結合受容体型チロシンキナーゼであるＭｕＳＫのリン酸化を介して、ＡＣｈＲのクラスターを安定化し、増加させる。アグリンのＭｕＳＫとの相互作用は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）関連タンパク質であるＬＲＰ４を通して媒介されると仮定される。アグリン（ｙ４ｚ８）がアグリン（ｙ４ｚ０）より約１０倍高いＬＲＰ４への親和性を有し、そのことが、インビトロ培養筋管アッセイにおいて観察される種々のアグリンのスプライスバリアントの示差的なＡＣｈＲクラスター形成活性を生じることが見出された。アグリン結合によって、ＬＲＰ４は、ＭｕＳＫの自己リン酸化を引き起こし、それが、その後、アセチルコリン受容体の発現およびクラスター形成についてのシグナル伝達系を活性化する。
【００１２】
ニューロトリプシンは、脊髄抽出物に見出され、運動ニューロンによって産生される。ニューロトリプシンは、ＣＮＳニューロンによって、加えて運動ニューロンによっても産生される分泌性のトリプシン様セリンプロテアーゼである（Ｓｔｅｐｈａｎら、２００８）。ニューロトリプシンは、プロリンリッチ塩基性（ＰＢ）セグメントを含むＮ末端の非触媒性部分、クリングル（ＫＲ）ドメイン、４つのスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン、およびＣ末端のプロテアーゼドメインからなる（Ｇｓｃｈｗｅｎｄら、１９９７）。ヒトにおいて、エクソン７における４ｂｐの欠失は、重篤な非症候性精神遅滞をもたらす。その突然変異は、プロテアーゼドメインを欠く切断型ニューロトリプシンを生じ、したがって、酵素のタンパク質分解性機能を無能にする。
【００１３】
現在のところ、アグリンがニューロトリプシンの唯一の知られた標的である。ニューロトリプシンは、アグリンをα部位およびβ部位と呼ばれる２つの別個の部位で切断する（図１）。α部位は、アグリンのＳＥＡドメインからＮ末端側に位置し、β部位は、アグリンのＬＧ３ドメインの前に配置される。α部位での切断は、４〜１２％のビストリスＳＤＳゲルにおいて約１３０ｋＤａに流れる約１００ｋＤａのＣ末端アグリン断片を生じる。β部位での切断は、そのゲルにおいて約２２ｋＤａに流れるＣ末端ＬＧＳドメインを遊離させる（Ｍｏｌｉｎａｒｉら、２００２；Ｒｅｉｆら、２００７）。全てのＣ末端断片は、マウスの脳抽出物および脊髄抽出物に検出することができた（Ｓｔｅｐｈａｎら、２００８）。ニューロトリプシンのノックアウトマウスにおいて、その断片のいずれも検出することができなかった。結果として、ニューロトリプシンは、アグリンを有意な量でその２つの切断部位において切断する唯一のプロテアーゼであるように思われる。ニューロトリプシンによるアグリンの切断は、神経筋可塑性およびリモデリングに寄与する。
【００１４】
ニューロトリプシン（ＮＴ）過剰発現マウス、いわゆるサルコペニアマウス（ｍｕｓｌｉｋ、Ｍ４９１Ｓ）（Ｓｔｅｐｈａｎら、２００８）は、サルコペニアの早期発症を示す。サルコペニアマウスの体系的分析からの詳細な知見により、ヒトデータに対して良い相関が存在することが実証されている。米国特許出願第１２／００７，９２８号は、その動物モデルの記載を示している。簡単に述べれば、サルコペニアマウス（ｍｕｓｌｉｋ Ｍ４９１Ｓ）は以下を示す。
（ｉ）マウス横隔膜の神経線維は、個々の終板に向かって成長すること、
（ｉｉ）最終的には個々の終板の消失（すなわち、シナプス前部およびシナプス後部の喪失）をもたらす、横隔膜筋肉上の断片化された終板、
（ｉｉｉ）ニューロトリプシン過剰発現動物におけるマウスヒラメ筋の線維数の低下および線維サイズの均一性の減少。サルコペニアマウスは、線維数の低下（約３０％）および線維サイズの不均一性の増加がある。
【００１５】
国際公開第９７／２１８１１号において、筋肉を冒す疾患の処置方法においてアグリンまたはアグリン断片を用いることが提案されている。しかしながら、そのような試みは、今日まで成功したということは示されていない。
【発明の概要】
【００１６】
本発明の目的は、機能性ＮＭＪおよび／または運動単位（ＭＵ）の低下を含む種々の筋肉障害についての治療を提供することである。
【００１７】
一般的に、本発明は、ニューロトリプシンのタンパク質分解活性に抵抗性であり、かつサルコペニアまたはさらなるニューロトリプシン関連疾患を患っているヒトの処置のための生物学的治療試薬として働く、遺伝子工学的に操作されたヒトまたはマウスの新規アグリンタンパク質バリアントを提供する。ニューロトリプシンの活性に対する抵抗性は、例えば、アグリン断片の切断部位、特にβ切断部位を適宜、改変することによって、または断片から切断部位を除去することによって、達成することができる。
【００１８】
本出願人の調査により、アグリン断片のインビボ活性が、ＬＧ２およびＬＧ３の両方のドメインが一緒に存在することに主に依存することが示されている。ＷＯ９７／２１８１１は、ＬＧ３単独についてのＡＣｈＲクラスター形成のインビトロ活性を示した。しかしながら、ＬＧ３のインビボ活性は示すことができなかった。同様に、ＬＲＰ４単独の活性化は完全なインビボ活性を達成するのに十分ではない。
【００１９】
それゆえに、本発明の１つの重要な特徴は、ドメインＬＧ２およびＬＧ３が、インビボでニューロトリプシンの活性のせいで分離されないことである。そのような分離を避けるために、本発明に従って用いられるアグリン断片は、それが、ドメインＬＧ２とドメインＬＧ３の間に存在する天然のアグリンにおけるニューロトリプシンのβ切断部位をもはや含まないように改変されている。
【００２０】
本出願において用いられる場合、ＬＧ２およびＬＧ３という用語は、上記で述べられているように、これらのドメインの可能性のある全ての種々のスプライスバリエーションを含むものとする。例えば、配列番号１は、ｙ部位に４個のアミノ酸の挿入断片（配列番号５）を有するドメインＬＧ２のヒト配列を示し、一方、配列番号２は、ｚ部位に８個のアミノ酸の挿入断片（配列番号８）を有するドメインＬＧ３の配列を示す。配列番号１に示されているように、ドメインＬＧ２において、ｙ部位はプロリン１１５とバリン１２０の間にある。そのバリンの位置はｙスプライス部位における挿入断片の長さに依存して変化し得ることは理解されている。配列番号２に示されているように、ドメインＬＧ３において、ｚ部位は、セリン１９とグルタミン酸２８の間にある。ここでもまた、そのグルタミン酸の位置はｚスプライス部位における挿入断片の長さに依存して変化し得ることは明らかである。言及されたスプライス部位における挿入断片の配列についてのさらなる例は下記に示されている。
【００２１】
追加として、生物活性に影響しない配列のバリエーションは可能であるため、本発明は、ドメインＬＧ２およびＬＧ３の種々のスプライスバリアントの示された配列に限定するものではなく、少なくとも９０％、好ましくは９５％の同一性を有するそれらのバリアントもまた含むものとする。
【００２２】
本発明は、インビボ活性を有し、かつ同時にインビボでニューロトリプシンによって切断されないアグリン断片を提供する。
【００２３】
本出願に用いられる場合のインビボ活性は、サルコペニアマウス（ｍｕｓｌｉｋ Ｍ４９１Ｓ）における全体重減少および筋力低下の予防から全体重および筋力の回復まで及ぶ効果を含むものとする。
【００２４】
本出願に用いられる場合のアグリン断片という用語は、ニューロトリプシンについての少なくとも認識部位βにおける、および場合により部位αにおける塩基性アミノ酸のアルギニンおよび／またはリジンが、任意の他のアミノ酸へ突然変異して、少なくとも部分的にニューロトリプシン抵抗型のアグリンを生じている、分泌型または膜貫通型のアグリンを網羅する。それは、少なくともアグリンのＬＧ３およびＬＧ２ドメインを含む断片だけでなく、追加として、アグリンに天然で存在する少なくとも１つのさらなるドメイン、例えば、ＬＧ１およびＥＧ１〜４ドメインを含む断片も包含する。
【００２５】
または、アグリン断片は、ニューロトリプシンまたはニューロトリプシン様セリンプロテアーゼによるタンパク質分解性切断を阻止するように、化学的に改変することができる。
【００２６】
追加として、本発明に該当するアグリン断片は、スプライス部位ｙおよびｚにおいて任意の天然または非天然で挿入されるアミノ酸を含むものとする。
【００２７】
一実施形態において、本発明は、少なくともニューロトリプシンβ切断部位を含むＣ末端アグリン断片であって、この切断部位が、ニューロトリプシンまたはニューロトリプシン様プロテアーゼがそれを切断できないように改変されている、Ｃ末端アグリン断片を対象とする。ニューロトリプシン抵抗性Ｃ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａと呼ばれる特に好ましい改変アグリン断片は、図２ｂに示された配列番号３によるアミノ酸配列を含む。略語Ｋ／Ａは、β切断部位におけるＫ（リジン）からＡ（アラニン）への突然変異を表す。Ｃ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ヒト）、Ｃ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（マウス）、Ｃ４４ｙ４ｚ０Ｋ／Ａ（ヒト）、およびＣ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａ（マウス）と呼ばれる、さらなる好ましい改変アグリン断片は、図７〜１０に示された配列番号１１〜１４によるアミノ酸配列を含む。
【００２８】
そのようなアグリン断片は、実施例においてアグリン断片Ｃ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａについて記載されているように、通常の組換え操作によって得ることができる。それらの実験について、本出願人らは、Ｎ末端に導入されたＨｉｓ８を用いることによって精製された断片を用いた。本文ではＣ４４Ｋ／Ａと呼ばれる断片は、配列番号４による配列を有する。
【００２９】
ニューロトリプシン抵抗性Ｃ４４ｙ４ｚ８Ｋ／ＡとＣ４４Ｋ／Ａの唯一の違いは、後者のタンパク質が追加として、断片を試験する前に除去されなかったＨｉｓ８−タグを含むことである。
【００３０】
実施例に示されているように、本発明による改変アグリン断片は、サルコペニアを患っているマウスにおいて筋肉発生を誘導することができる。それゆえに、本発明の１つの重要な態様は、特許請求されているアグリン断片の、薬物としての使用である。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、非限定的に、サルコペニア、筋衰弱、虚弱、筋萎縮症および筋ジストロフィー症、筋無力症、筋強直症、脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、ならびに原発性側索硬化症を含む、神経筋疾患、または神経、筋肉、および神経筋接合部の疾患の処置のための、またはそれらの処置用の薬物の製造のための改変アグリン断片の使用である。
【００３２】
言及された疾患は別として、改変アグリン断片は、一般的に、ニューロトリプシンレベルが、例えば過剰発現によって上昇している全ての疾患の処置に用いることができる。
【００３３】
さらなる態様は、長期の不動状態後に起こり得る、筋量および筋力の喪失を伴う筋肉の廃用性萎縮（筋萎縮症）の処置である。長期不動状態の例は、長期のベッドでの療養、または体の部分、例えば、手足にギブスをはめていること、または肺疾患を患う患者における機械的人工換気である。筋量の萎縮を引き起こす多くの疾患および状態もある。例えば、がんやＡＩＤＳなどの疾患は、「悪液質」と呼ばれる消耗症候群を誘発し、その消耗症候群は、重篤な筋萎縮が顕著に見られる。この型の萎縮は、その状態が重篤でない限り、運動で逆転させることができる。廃用性萎縮は、神経筋接合部におけるリモデリングを引き起こすことが知られている。観察される神経筋変化および可塑性は、老化した（サルコペニア性）ＮＭＪについてだけでなく、廃用性萎縮についての特徴でもある。
【００３４】
本発明は、サルコペニアおよび筋肉疾患を処置するための、薬学的に許容される媒体に本発明による改変アグリン断片を含む薬学的組成物を提供する。そのような処置は、積極的な運動トレーニングまたは栄養最適化を含む治療的アプローチと組み合わせてもよい。
【００３５】
１つの好ましい投与様式は皮下注射であることはわかっている。好ましくは、そのための薬学的組成物は、そのような注射を可能にする担体を含む。しかしながら、その断片を筋肉内に、または静脈内に、または髄腔内に、または経口で、または経皮的に、または経上皮的に、または肺内に、または鼻腔内に投与することも考えられる。以下の製剤または装置（マイクロカプセル化、マイクロプロジェクションリポソーム、アグリン断片のＰＥＧ化もしくはＰＥＧ化誘導体、またはナノ粒子）を用いてもよい。そのような薬学的組成物もまた本発明に網羅される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】アグリンのドメイン構造の概略図である。
【図２ａ】ニューロトリプシン抵抗性アグリンＣ４４の概略図である。
【図２ｂ】ニューロトリプシン抵抗性アグリンＣ４４ｙ４ｚ８のアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
【図３】ＩＭＡＣによるＣ４４Ｋ／Ａ（配列番号４）の精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを表示する図である。
【図４】Ｃ４４Ｋ／ＡおよびヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８のヒトニューロトリプシンでのタンパク質限定分解性消化を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを表示する図である。
【図５】Ｃ４４Ｋ／Ａまたは媒体で処理されたマウスの体重の進展を示すグラフである。
【図６ａ】Ｃ４４Ｋ／Ａまたは媒体で処理された野生型同腹仔マウスおよびサルコペニアマウスにおける実験の１３日目での前肢の握力を示す図である。
【図６ｂ】Ｃ４４Ｋ／Ａまたは媒体で処理された野生型同腹仔マウスおよびサルコペニアマウスにおける実験の１３日目での後肢の握力を示す図である。
【図７】ニューロトリプシン抵抗性アグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ｈ）のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す図である。
【図８】ニューロトリプシン抵抗性アグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ｍ）のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す図である。
【図９】ニューロトリプシン抵抗性アグリンＣ４４ｙ４ｚ０のアミノ酸配列（配列番号１３）を示す図である。
【図１０】ニューロトリプシン抵抗性アグリンＣ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａ（ｍ）のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す図である。
【図１１】Ｃ４４Ｋ／Ａ断片のタンパク質限定分解性消化を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを表示する図である。
【図１２】媒体（媒体）またはヒトＣ４４Ｋ／Ａ（０．８）またはマウスＣ４４Ｋ／Ａ（０．８）で処理されたサルコペニアマウス（４９１Ｓ）および媒体で処理された野生型同腹仔（野生型媒体）についての全体重の進展を示す図である。
【図１３ａ】媒体（媒体）またはヒトＣ４４Ｋ／Ａ（０．８）またはマウスＣ４４Ｋ／Ａ（０．８）で処理されたサルコペニアマウスおよび媒体で処理された野生型同腹仔（野生型媒体）についての前肢の握力を示す図である。
【図１３ｂ】媒体（媒体）またはヒトＣ４４Ｋ／Ａ（０．８）またはマウスＣ４４Ｋ／Ａ（０．８）で処理されたサルコペニアマウスおよび媒体で処理された野生型同腹仔（野生型媒体）についての後肢の握力を示す図である。
【００３７】
図１は、アグリンの概略図である。アグリンは、約２２５ｋＤａのコアタンパク質質量を有する。それは、９個のＫ（クニッツ型）ドメイン、２個のＬＥ（ラミニン−ＥＧＦ様）ドメイン、１個のＳＥＡ（精子のタンパク質、エンテロキナーゼ、およびアグリン）ドメイン、４個のＥＧ（上皮増殖因子様）ドメイン、および３個のＬＧ（ラミニン球状）ドメインで構成される多ドメインタンパク質である。ＳＥＡドメインの両側に、セリン／スレオニンリッチな（Ｓ／Ｔ）領域が見出される。アグリンはいくつかのアイソフォームとして存在する。分泌性アイソフォームは、切り離されるシグナル配列（ＳＳ）を含み、その後にＮ末端アグリンドメイン（ＮｔＡ）が続く。ＩＩ型膜貫通結合型は、膜貫通（ＴＭ）領域を含み、そのすぐ後に第１のクニッツ型ドメインが続く。第１のＥＧドメインで始まるアグリンのＣ末端の７５ｋＤａの部分は、筋肉細胞においてアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）クラスター形成活性における完全活性に必要とされるが、最もＣ末端側の２０ｋＤａの断片が、低い作用強度でＡＣｈＲ凝集を誘導するのには十分である。α−ジストログリカン、ヘパリン、いくつかのインテグリン、およびＬＲＰ４を含むアグリンの相互作用パートナーについてのいくつかの結合部位は、Ｃ末端領域にマッピングされる。大きなヘパラン硫酸側鎖（ロリポップ鎖）は、ヘパリン結合タンパク質、例えば、いくつかの増殖因子についての結合部位である。ロリポップはグリコシル化部位を示す。ｘ、ｙ、ｚは、アグリンのＣ末端領域における選択的スプライス部位を割り当てる。ｘ部位（ニワトリおよびカエルでは欠損する）において、挿入された０個、３個、または１２個のアミノ酸が存在し得、ｙ部位において、挿入された０個または４個のアミノ酸が存在し得、ｚ部位において、挿入された０個、８個、１１個、または１９（８＋１１）個のアミノ酸が存在し得る。「α切断およびβ切断」は、２つの保存されたニューロトリプシン切断部位を示す。ニューロトリプシン切断後のタンパク質分解性断片のおおまかなタンパク質コア質量は上記に示されている。
【００３８】
図１に用いられた略語は以下の意味をもつ。ＳＳ：シグナル配列；ＮｔＡ：Ｎ末端アグリンドメイン；ＴＭ：膜貫通セグメント；Ｋ：クニッツ型ドメイン；ＬＥ：ラミニンＥＧＦ様ドメイン；Ｓ／Ｔ：セリン／スレオニンリッチなセグメント；ＳＥＡ：精子タンパク質、エンテロキナーゼ、およびアグリンドメイン；ＥＧ：上皮増殖因子様ドメイン；ＬＧ：ラミニン球状ドメイン。
【００３９】
図２ａは、本発明に従って用いられる改変アグリン断片の概略図である。断片は、アグリンのＣ末端ドメインＬＧ２、ＥＧ４、およびＬＧ３を含む。ニューロトリプシンのβ切断部位は欠失している。
【００４０】
図２ｂは、アグリンのニューロトリプシン抵抗性Ｃ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａ断片のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。断片は、アグリンのＣ末端ドメインＬＧ２、ＥＧ４、およびＬＧ３を含む。ニューロトリプシンのβ切断部位は、リジンのアラニンへの突然変異によって欠失している。
【００４１】
図２に用いられた略語は以下の意味をもつ。ＬＧ：ラミニン球状ドメイン；ＥＧ：上皮増殖因子様ドメイン；ｙおよびｚは、アグリンのＣ末端部分の選択的スプライス部位を示す。線を引いて抹消されたβ切断：ニューロトリプシン抵抗性アグリン断片を与える、ニューロトリプシンについてのβ切断部位における突然変異。
【００４２】
図３は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにおけるＣ４４Ｋ／Ａの精製工程を示すＳｙｐｒｏルビー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。Ｃ４４Ｋ／Ａの遺伝子を含むｐＥＡＫ８ベクターでトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞由来の培養上清を、Ｎｉ２＋で標識された１０ｍｌのＩＭＡＣカラムに負荷した。適切な緩衝液でカラムを洗浄した後、結合したタンパク質を、５００ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液で溶出した（５〜９）。レーン１：Ｂｉｏｒａｄ Ｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎ ｐｌｕｓタンパク質マーカー；レーン２：濃縮された培養上清；レーン３：通過画分；レーン４：洗浄画分；レーン５〜９：溶出画分。
【００４３】
図４は、Ｃ４４Ｋ／ＡおよびヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８のヒトニューロトリプシンでのタンパク質分解性消化を実証するＳｙｐｒｏルビー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。Ｃ４４Ｋ／ＡまたはヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８を、ヒトニューロトリプシンと３７℃で３．５時間、インキュベートし（１＋３）、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。対照として、アグリン断片を、同じ条件で緩衝液とインキュベートした（２＋４）。β切断部位におけるＫからＡへの突然変異は、アグリン断片の切断を無効にした。レーン１：ヒトニューロトリプシンを添加したＣ４４Ｋ／Ａ；レーン２：ヒトニューロトリプシンを添加していないＣ４４Ｋ／Ａ；レーン３：ヒトニューロトリプシンを添加したヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８；レーン４：ヒトニューロトリプシンを添加していないヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８。
【００４４】
図５は、媒体またはＣ４４Ｋ／Ａで処理されたサルコペニアマウス（４９１Ｓ）および媒体で処理された野生型同腹仔（野生型媒体）についての全体重の進展を示す。マウスの体重は、２２日目まで実験の全期間を通して毎日決定された。マウスの体重は、媒体で処理された野生型同腹仔に対するパーセンテージとして表されている。処理は１日目から始まり、１３日目に終わった。握力は１３日目に測定された。
【００４５】
図６ａおよびｂは、媒体（媒体）またはＣ４４Ｋ／Ａ（Ｃ４４Ｋ／Ａ）で処理されたサルコペニアマウスについての前肢および後肢の握力を示す。握力は１３日目に測定される。種々の処理群の握力は、媒体で処理された野生型同腹仔マウスに対するパーセンテージとして示されている。標準偏差はエラーバーとして示されている（各群についてＮ＝５）。
【００４６】
図７は、ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ｈ）のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
【００４７】
図８は、ニューロトリプシン抵抗性マウスアグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ｍ）のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
【００４８】
図９は、ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ０Ｋ／Ａ（ｈ）のアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。
【００４９】
図１０は、ニューロトリプシン抵抗性マウスアグリンＣ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａ（ｍ）のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。
【００５０】
図７〜１０に示された全ての断片は、アグリンのＣ末端ドメインＬＧ２、ＥＧ４、およびＬＧ３を含む。ニュートリプシンのβ切断部位は、リジンからアラニンへの突然変異によって欠失している。
【００５１】
図１１は、ニューロトリプシンアッセイにおいてさらなるＣ４４断片のタンパク質分解性消化を実証するＳｙｐｒｏルビー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。図７〜１０に示された種々のＣ４４断片およびヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａ（図２ｂ）をアッセイにおいてヒトニューロトリプシンと共に（ｈＮＴ＋）、およびそれを含まずに（ｈＮＴ−）、３７℃で３．５時間、インキュベートし、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。対照として、ｐｒｅｃｉｓｓｉｏｎマーカーおよびβ切断部位に突然変異をもたないヒトアグリンＣ４４ｙ０ｚ０を同じ条件でインキュベートした。この場合もやはり、β切断部位におけるＫからＡへの突然変異が、その突然変異型アグリン断片のニューロトリプシンによる切断を効率的に無効にすることは明らかである。レーン１：ｐｒｅｃｉｓｓｉｏｎマーカー；レーン２：突然変異を含まないＣ４４ｙ０ｚ０（ｈＮＴ−）；レーン３：突然変異を含まないＣ４４ｙ０ｚ０（ｈＮＴ＋）；レーン４：ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ０Ｋ／Ａ（ｈＮＴ−）；レーン５：ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ０Ｋ／Ａ（ｈＮＴ＋）；レーン６：ヒトアグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ｈＮＴ−）；レーン７：ヒトアグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ｈＮＴ＋）；レーン８：マウスアグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ｈＮＴ−）；レーン９：マウスアグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ｈＮＴ＋）；レーン１０：ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８（ｈＮＴ−）；レーン１１：ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８（ｈＮＴ＋）；レーン１２：マウスアグリンＣ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａ（ｈＮＴ−）；レーン１３：マウスアグリンＣ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａ（ｈＮＴ＋）。
【００５２】
図１２は、媒体（媒体）またはヒトＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／ＡまたはマウスＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａで処理されたサルコペニアマウス（４９１Ｓ）および媒体で処理された野生型同腹仔（野生型媒体）についての全体重の進展を示す。マウスの体重は、２２日目まで実験の全期間を通して毎日決定された。マウスの体重は、媒体で処理された野生型同腹仔に対するパーセンテージとして表されている。処理は１日目から始まり、１３日目に終わった。
【００５３】
図１３ａおよびｂは、媒体（媒体）またはヒトＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／ＡまたはマウスＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａで処理されたサルコペニアマウスおよび媒体で処理された野生型同腹仔（野生型媒体）についての前肢および後肢の握力を示す。握力は１３日目に測定される。種々の処理群の握力は、媒体で処理された野生型同腹仔マウスに対するパーセンテージとして示されている。標準偏差はエラーバーとして示されている（各群についてＮ＝５）。
【００５４】
本出願人らは初めて、サルコペニアマウスが、既知の欠乏に加えて、健康な野生型マウスと比較して除脂肪体重の下降（図５）および握力の低下（図６）も生じることを示した。
【００５５】
この事実から始まって、本出願人らは、例えば、図２ａに示されているようで、かつ図２ｂに示されているような配列を含むニューロトリプシン抵抗性アグリンＣ４４Ｋ／Ａが、図５、６ａ、６ｂに示されているように、サルコペニアマウス、すなわち、ニューロトリプシン過剰発現マウスの体重および握力を増加させ得ることを示すことができた。
【００５６】
回復効果は、Ｃ４４Ｋ／Ａ断片の皮下投与後に達成される。効果は、注射部位へ局所的に限定されず、全体重および筋力に有益な効果を生じる。処理されたサルコペニアマウスは、より強くなり、前肢および後肢の両方における握力が増加している。
【００５７】
Ｃ４４Ｋ／Ａの投与はまた、異所性ＡＣｈＲクラスターにおいて筋線維の神経再支配を促進し、新しく形成されたＮＭＪの安定化および成熟をもたらすであろう。したがって、Ｃ４４Ｋ／Ａの投与はまた、筋線維または筋肉の神経再支配が必要とされるリハビリテーション過程において有益であろう。
【００５８】
本明細書で特許請求されているニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンと対照的に、（ＷＯ９７／２１８１１に記載されているような）ニューロトリプシンについての無傷の切断部位を有するアグリン断片は、それらがニューロトリプシンによって迅速に分解され、それらのＡＣｈＲクラスター形成活性を喪失するであろうため、有益ではないであろう。
【００５９】
アグリンは、２つの部位でニューロトリプシンによって切断される（図１）。α切断部位は、アルギニン１１０２（Ｒ１１０２）とアラニン１１０３（Ａ１１０３）の間に位置する。β切断部位は、リジン１８５９（Ｋ１８５９）とセリン１８６０（Ｓ１８６０；番号付けはヒトアグリンＮＰ＿９４０９７８に対応する）の間に位置する。β部位におけるニューロトリプシンによるアグリン切断は、Ｓ１８６０からＣ末端までの範囲である約２０ｋＤａの断片（アグリンＣ２２）を生じる。
【００６０】
本発明に従って用いられるニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンは、アグリンのＬＧ２、ＥＧ４、およびＬＧ３ドメインからなるＣ末端アグリン断片であり、ニューロトリプシンの不活性化されたβ切断部位を内在する。そのＰ１リジン残基（Ｋ１８５９）は、アラニンに突然変異されており、そのことが、ニューロトリプシンがこの部位でアグリンをもはや切断することができないことの原因となっている（図３）。
【００６１】
本発明において定義されているようなニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８は、配列番号３の４４ｋＤａのＣ末端アグリン断片であり、その塩基性アミノ酸リジン１８５９（ＮＰ＿９４０９７８）（または配列番号３におけるリジン２２７）がアラニンに突然変異されて、ニューロトリプシンによって切断されないアグリン断片を生じる。この断片はさらに、アミノ酸Ｐ１７５１とＶ１７５２（ＮＰ＿９４０９７８）の間に位置するｙ部位において挿入を含まなくてもよく、またはアミノ酸Ｓ１８８４とＥ１８８５（ＮＰ＿９４０９７８）の間に位置するｚ部位において挿入を含まなくてもよいし、８個、１１個、もしくは１９個のアミノ酸の挿入を含んでもよく、またはそれらの組み合わせでもよい。ｙ部位における挿入される配列は、ＫＳＲＫ（ｙ４、配列番号５）、ＶＬＳＡＳＨＰＬＴＶＳＧＡＳＴＰＲ（ｙ１７、配列番号６）、およびＫＳＲＫＶＬＳＡＳＨＰＬＴＶＳＧＡＳＴＰＲ（ｙ２１、配列番号７）、ならびにｚ部位において、ＥＬＡＮＥＩＰＶ（ｚ８、配列番号８）、ＰＥＴＬＤＳＧＡＬＨＳ（ｚ１１、配列番号９）、またはＥＬＡＮＥＩＰＶＰＥＴＬＤＳＧＡＬＨＳ（ｚ１９、配列番号１０、配列番号８と配列番号９の組み合わせ）であってもよい。
【００６２】
本出願において、ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８に言及される場合には、そのようなアグリン断片は、配列番号３に示された断片に対応するものとし、ただし、示された配列の位置２２７のアラニンがヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８におけるリジンによって置き換えられているという唯一の違いをもつ。
【００６３】
本発明において、用語「ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８」もまた、ｙ部位に挿入が導入されておらず、もしくはｚ部位に挿入が導入されておらず、または８個のアミノ酸挿入の代わりに、配列番号９および配列番号１０に対応する１１個もしくは１９個のアミノ酸挿入がｚ部位に挿入されている、配列番号３によって定義されるタンパク質のアグリンバリアントを含む。これはまた、ｙ部位およびｚ部位に可能なアミノ酸を導入することによって生じる全ての可能なバリアントの組み合わせを含む。
【００６４】
用語「ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８」はまた、Ｎ末端またはＣ末端に追加のアミノ酸を含む配列番号３のアグリン断片を含む。Ｎ末端におけるそのような追加のアミノ酸は、例えば、組換え合成および適切な細胞における発現による調製方法により存在する。「ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８」の定義に該当するそのようなタンパク質の例は、実施例１により調製されたタンパク質Ｃ４４Ｋ／Ａ配列番号４であり、それは、精製を単純化するためにｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断部位と共にＨｉｓ８タグを含む（図４）。
【００６５】
アグリンの天然Ｎ末端に至るまでの、アグリンの１つまたは複数のドメインによるＮ末端における伸長を含む、ニューロトリプシンによって切断され得ないタンパク質や、加えて、ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンのグリコシル化された、または他の様式で、翻訳後に、酵素的に、もしくは化学的に改変されたタンパク質バリアントも含まれる。
【００６６】
実施例に示されているように、ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８は、ニューロトリプシンの過剰発現によって引き起こされたサルコペニア表現型を回復する能力を有する。
【００６７】
運動神経によるニューロトリプシンの不自然な高分泌は、ＬＲＰ４と複合体化されたアグリンの過剰消化を引き起こすため、ＭｕＳＫを介してＡＣｈＲクラスター形成を誘導する適切なシグナル伝達が消失する。これは、ＮＭＪの損失、その後、対応する筋線維の損失、およびサルコペニアをもたらす。ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８は、ＬＲＰ４のアゴニストとして働くことができ、ＭｕＳＫ経路を刺激する。ニューロトリプシンによる切断が起こり得ないため、その複合体は安定したままであり、シグナル伝達は長期間、維持される。これは、ＡＣｈＲの発現およびＮＭＪの維持をもたらす。ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８は、ニューロトリプシンのアクセスによって引き起こされるサルコペニアの処置に役立ち、ＮＭＪの一般的な不安定化が認められる疾患においても助けとなる可能性がある。
【００６８】
サルコペニアの処置のためのニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８の効果の根底にある新しい機構は、神経由来不適応の治療であり、筋線維または筋肉全体の代謝に影響を及ぼそうとする試みではない。
【００６９】
本発明はまた、脊髄損傷後のリハビリテーション処置のための、例えば、使用依存性治療の増強のためのニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンの使用に関する。そのような治療は、ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８により、ＡＣｈＲクラスター形成を促進するその能力のおかげで増強することができ、無傷ＮＭＪを維持し、または筋線維上の前もって形成された異所性ＡＣｈＲクラスターへの成長中の神経終末の付着を促し、運動に必要とされる新しいＮＭＪの生成を促進する。
【００７０】
さらにニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８の産生が記載され、ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８をコードするＤＮＡが適切な発現系において発現し、その後、生じたタンパク質が精製される。いくつかの原核生物および真核生物の発現系がニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８の産生および分泌に適している。原核生物発現系には、大腸菌における発現が挙げられるが、それに限定されない。真核生物発現系には、マウス骨髄腫細胞における発現、昆虫細胞におけるバキュロウイルス媒介性発現、加えて、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞における発現、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における一過性発現、およびピキア・パストリスにおける安定発現が挙げられる。これらの系は、上清における混入タンパク質の量を低下させるための無血清条件に容易に適応でき、かつラージスケール産生に適応できるという利点をもつ。加えて、様々な細胞系を用いてもよく、それらには、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｈ９細胞、ジャーカット細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＶ１細胞、ＣＡＰ細胞、またはＳＦ細胞が挙げられる。
【００７１】
ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８の精製について、標準タンパク質精製テクノロジーが適用される。Ｈｉｓタグ付きタンパク質は、ＩＭＡＣを用いて精製することができるが、イオン交換クロマトグラフィーまたはヘパリンカラムを用いるアフィニティー精製も同様に用いることができる。アグリンのＣ末端部分に対して産生された抗体による精製もまた用いることができる。その後、溶出されたタンパク質はさらに、ヒドロキシアパタイトカラムを用いて、またはゲル濾過により精製することができる。
【００７２】
以下の実施例は、本発明を例証するが、それに限定されない。これらの実施例を読む当業者は、他の関連した条件を適用することができるであろうし、これらもまた本発明の範囲内にある。
【実施例１】
【００７３】
＜ニューロトリプシン抵抗性の４４ｋｄのヒトアグリンＣ末端断片（Ｃ４４Ｋ／Ａ）のクローニング＞
初めに、Ｎ末端ＮｔＡドメインを欠くこと以外は完全長ヒトアグリンｙ０ｚ０（ヒトアグリンｙ０ｚ０デルタＮＴＡはアクセッション番号ＮＰ＿９４０９７８のタンパク質配列における位置Ｋ１５６から始まる）を、ＰＣＲによって、ヒトカルシンテニン−１の分泌シグナルのコード配列を含むｐＥＡＫ８ベクター中に適切な制限部位およびプライマーを介してクローン化した（Ｒｅｉｆら、２００７）。ヒトアグリンについての鋳型として、ベクターｐＣＭＶ−ＸＬ５−Ａｇｒｉｎ（Ｏｒｉｇｅｎｅ ＵＳＡから購入）を用いた。
【００７４】
その後に続く２ステップにおいて、ｙ４ｚ８挿入に必要とされる対応するコドンを、標準技術を用いる部位特異的突然変異誘発により導入し、その結果として、完全長ヒトアグリンｙ４ｚ８デルタＮｔＡを含むｐＥＡＫ８ベクターが生じた。
【００７５】
このベクターを鋳型として用い、４４ｋｄのヒトアグリンＣ末端断片をコードする遺伝子を増幅し、その翻訳されたタンパク質のＮ末端にＨｉｓ８タグのコード領域およびｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断部位を導入した。
【００７６】
アグリンの切断部位βにおいてリジンのコドンの場所にアラニンのコドンを導入する、プライマーを用いる急速交換（ｑｕｉｃｋ ｃｈａｎｇｅ）突然変異誘発段階において、ニューロトリプシン抵抗型のヒトアグリンＣ４４Ｋ／Ａが生成された。
【００７７】
このプラスミドは、トランスフェクションされた細胞の培養上清において、（シグナル配列を含まずに）アグリン部分のアミノ酸がロイシン２１から始まる、配列番号４の配列を有するタンパク質を産生する。
【実施例２】
【００７８】
＜ヒトアグリンＣ４４およびニューロトリプシン抵抗性Ｃ４４Ｋ／Ａの発現および精製＞
Ｅｘｃｅｌｌ２９３培地で１×１０６細胞／ｍｌの密度まで増殖した５００ｍｌのＨＥＫ２９３細胞を、Ｓｏｒｖａｌｌ−ＲＣ５Ｃ遠心機における１００×ｇで３０分間の遠心分離によってペレット化した。３７℃に予熱された５００ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地中に細胞を再懸濁した。ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８の発現のための１．２５ｍｇの挿入断片含有ｐＥＡＫ８を、２５ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に希釈した。２５ｋＤａの３．７５ｍｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を２５ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に希釈した。両方の溶液をプールし、室温で１０分間、インキュベートした。後で、１０００ｍｌのスピナーフラスコに移された細胞懸濁液に、この溶液を加えた。細胞懸濁液を、加湿雰囲気下の５％ＣＯ２および３７℃でのインキュベーター内に置かれた撹拌プラットフォームにおいて７５ｒｐｍで７日間、インキュベートした。
【００７９】
７日後、培養上清を、Ｓｏｒｖａｌｌ−ＲＣ５Ｃ遠心機における５００ｒｐｍでの遠心分離によって回収した。残存する粒子を、０．２２ｕｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ滅菌濾過装置による濾過によって除去した。濾過された培養上清を、ＰｅｌｌｉｃｏｎのＰＬＣＧＣ−１０ｋＤａカットオフ接線流カートリッジを用いて１０回、濃縮し、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ８．５）、４００ｍＭのＮａＣｌに対して少なくとも１：１０００で透析した。Ｎｉ２＋で標識された１０ｍｌの卓上Ｈｉｓ選択カラムを用いてＨｉｓ８タグを利用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に供した。濃縮および透析された細胞培養上清の負荷後、カラムを１００ｍｌの透析緩衝液で洗浄し、結合したタンパク質を５００ｍＭのイミダゾールを含む１０ｍｌの透析緩衝液で５回、溶出した。精製の成功の後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図Ｄ）。陽性画分をプールし、Ｓｉｇｍａ−４Ｋ１５遠心機において３０００×ｇでＡＭＩＣＯＮの３０ｋＤａカットオフ濾過装置を用いて１０回、濃縮し、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ８．５）、２００ｍＭのＮａＣｌに対して１：１００００で透析した。精製されたＣ４４Ｋ／Ａの濃度を、０．７２５ｃｍ２／ｍｇの吸光係数を用いるＵＶ分光分析法によって決定した。
【実施例３】
【００８０】
＜ｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断によるＨｉｓ８タグの除去＞
Ｈｉｓ８タグが除去されるべきである場合、０．５ｍｌのタンパク質溶液の緩衝液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡに、その緩衝液であらかじめ平衡化したＮＡＰ−５カラムを用いて交換した。タンパク質溶液を、１ｍｌの同じ緩衝液中に溶出した。１μｌの１Ｍ ＤＴＴをタンパク質溶液に加え、チューブを数回、指ではじくことによって混合した。２０μｌのｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（１Ｕ／μｌ）を加え、チューブを、数回、指ではじくことによって混合した。反応を、４℃で一晩、行った。０．５ｍｌの重力流グルタチオンセファロースカラムを、１ｍＭのＤＴＴを追加した５ｍｌのＰＢＳで平衡させた。消化されたタンパク質溶液を負荷し、通過画分を収集した。カラムを、１ｍＭのＤＴＴを追加した１ｍｌのＰＢＳで３回、洗浄し、その通過画分を、前の通過画分と同じチューブに収集した。収集された通過画分を、ＤＴＴおよびＥＤＴＡを除去するために、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ８．５）、４００ｍＭのＮａＣｌの５ｌに対して２時間を２回、透析した。
【００８１】
切断されたＨｉｓ８タグを除去するために、２回目のＩＭＡＣを実施した。Ｎｉ２＋イオンであらかじめ標識された１ｍｌのキレート化セファロースＦＦカラムを、５ｍｌの２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ８．５）、４００ｍＭのＮａＣｌで平衡させた。透析されたタンパク質溶液をそのカラムにアプライし、通過画分を収集した。カラムを１ｍｌの２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ８．５）、４００ｍＭのＮａＣｌで３回洗浄し、通過画分を同じチューブに収集した。プールされた画分を、ＡＭＩＣＯＮの３０ｋＤａカットオフ濃縮器で０．５ｍｌに濃縮し、緩衝液を、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ８．５）、２００ｍＭのＮａＣｌであらかじめ平衡化したＮＡＰ−５カラムを用いて交換した。濃度を、０．７２５ｃｍ２／ｍｇの吸光係数を用いるＵＶ分光分析法によって決定した。タンパク質を、さらなる実験のために新鮮な状態で用い、または使用まで−８０℃で保存した。対応するタンパク質のタンパク質配列は、グリシン１９から始まる配列番号３の部分に対応する。
【実施例４】
【００８２】
＜ヒトニューロトリプシンによるＣ４４およびＣ４４Ｋ／Ａのインビトロ消化＞
ａ）ニューロトリプシンがニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａを消化することができないことを実証するために、そのタンパク質をニューロトリプシンアッセイに供した。対照として、ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８を用いた。アッセイにおいて、アグリンＣ４４基質を１μＭの濃度で用い、ヒトニューロトリプシンを加えた。反応を、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ ８．３）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％ＰＥＧ６０００中で実施した。消化を３７℃で６時間、行った。そのセットアップを４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルに負荷し、Ｓｙｐｒｏルビーで染色した（図４）。
【００８３】
ｂ）ａ）と類似したさらなるアッセイにおいて、図２ｂおよび７〜１０に示されているようなＣ４４Ｋ／Ａ断片がニューロトリプシンによって消化されないことが示された（図１１）。
【実施例５】
【００８４】
＜マウスにおけるニューロトリプシン抵抗性ヒトＣ４４Ｋ／Ａの投与＞
実験に用いられるサルコペニアマウスモデルは、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣＲＬバックグラウンドにおけるｔｈｙ−１作動性ニューロトリプシン過剰発現体（Ｓｔｅｐｈａｎら、２００８）およびそれらの野生型同腹仔である。雄および雌の両方の動物が含まれ、この年齢での若いマウスにおいて性別間で体重および筋力に違いがないためである。マウスはＰ８（生後８日目）で実験に入った。
【００８５】
群あたり３匹のマウスで、以下の３群を用いた。１．媒体処理される野生型マウス、２．Ｃ４４Ｋ／Ａで処理されるサルコペニアマウス（Ｍ４９１Ｓ）、３．媒体処理されるサルコペニアマウス。
【００８６】
マウスに、Ｃ４４Ｋ／Ａまたは媒体を６．４ｍｇ／ｋｇ／日の総用量で皮下注射する。投薬は１日目に始まり、１３日目まで続いた。実験における全てのマウスについて、体重を毎日１回、測定した。体重は、各処理群について平均され、実験日ごとにプロットされる（図５）。実験の開始時点で、サルコペニアマウスにおいて体重のわずかな低下がすでに見られる。サルコペニアのＣ４４Ｋ／Ａでの処理は、媒体処理マウスと比較して体重の有意な増加をもたらした。Ｃ４４Ｋ／Ａで処理されたサルコペニアマウスは完全に回復し、さらに野生型同腹仔に観察されたのと同じ発育であった。ヒトにおいて、虚弱患者は、１年あたり５ｋｇを超える体重減少に悩まされている（ＢａｕｅｒおよびＳｉｅｂｅｒ、２００８；Ｌａｕｒｅｔａｎｉら、２００３）。これは、全体重の約７％の損失に相当する。媒体対照で処理されたサルコペニアマウスは、著しい体重低下を示した。実験中、サルコペニアマウスは体重が約５％減少した。
【実施例６】
【００８７】
＜握力の測定＞
実施例５に記載された実験の１３日目において、前肢および後肢の握力を、精密フォースゲージにより、加えられたピークフォースを保持するデジタルフォースメーター（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ ＯＨ）で測定した。フォースメーターは頑丈な土台に固定され、フォーストランスデューサと共に、約１ｍｍの直径の三角形の引っ張り棒に接続される。データは、コンピュータとのＲＳ２３２接続を通してオンラインで収集され、Ｇｒｉｐ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｍｅｔｅｒソフトウェア（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により．ｄａｔファイルで保存され、データ管理および統計解析のためにｅｘｃｅｌに転送された。最大フォースの測定についての単位としてグラム（ｇ）が用いられた。測定前、マウスを実験室に移動させ、１０分間慣れさせた。各マウスを、約３ｍｍの直径の金属棒をその前足で握るようにさせた。その後、マウスを、フォースメーターから顔を背けるように、引っ張り棒に接近させ、それの前足または後足で引っ張り棒のワイヤーを握るようにさせた。マウスを、その尾で引っ張り棒と平行にフォースメーターの方へ、約１０ｃｍ／秒の速度で引っ張った。
【００８８】
引っ張りは、マウスの前肢、それぞれ、後肢が放すまで一定の速度に保たれた。実験セッションは、後肢握力についての５回の試行からなった。試行と試行の間に、マウスに約１分間の休息時間を許した。実際の実験セッションの少なくとも１日前に、マウスを記載された手順で訓練した。各実験セッションを、望ましくない実験的バイアスを避けるために盲検方式で行った。
【００８９】
データを、以下の方法で解析した。各マウスについて、最高値および最低値を除外し、残りの３つの値を平均した。その後、データを、各処理群について平均し、媒体処理された野生型群に対して標準化した。
【００９０】
１３日目に、媒体処理されたサルコペニアマウスは、野生型と比較して約２０％の筋力を失っているが、Ｃ４４Ｋ／Ａ処理されたマウスは、媒体処理された野生型と類似した握力を有する。
【００９１】
ヒトについて、約２０歳の成人が約７０歳の個体と比較された場合、筋力の減少は約２０〜４０％であり、それは９０代の個体と比較した場合、５０％より上まで増加し得る（ＢａｕｅｒおよびＳｉｅｂｅｒ、２００８；Ｌａｕｒｅｔａｎｉら、２００３）。この実験において、本出願人らは、握力の２０％の低下が約１４日間、阻止されることを実証している。
【００９２】
アグリンの断片がインビボで活性があることが示されているのはこれが最初である。皮下投与後、タンパク質Ｃ４４Ｋ／Ａは、身体に分布し、サルコペニア様症状を患っているマウスに有益な効果を発揮した。
【実施例７】
【００９３】
＜マウスにおけるニューロトリプシン抵抗性ヒトＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａおよび（マウスアグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ）の投与＞
実験に用いられるサルコペニアマウスモデルは再び（実施例５においてのように）、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣＲＬバックグラウンドにおけるＴｈｙ−１作動性ニューロトリプシン過剰発現体（Ｓｔｅｐｈａｎら、２００８）およびそれらの野生型同腹仔である。雄および雌の両方の動物が含まれ、この年齢での若いマウスにおいて性別間で体重および筋力に違いがないためである。マウスはＰ８（生後８日目）で実験に入った。
【００９４】
群あたり４匹のマウスで、以下の４群を用いた。１．媒体処理される野生型マウス；２．Ｃ４４Ｋ／Ａ（０，８）で処理されるサルコペニアマウス（Ｍ４９１Ｓ）；３．マウスアグリンＣ４４（０，８）Ｋ／Ａで処理されるサルコペニアマウス（Ｍ４９１Ｓ）；４．媒体処理されるサルコペニアマウス。
【００９５】
マウスに、２０ｍｇ／ｋｇ／日の総用量で皮下注射する。投薬は１日目に始まり、１３日目まで続いた。実験における全てのマウスについて、体重を毎日１回、測定した。体重は、各処理群について平均され、実験日ごとにプロットされる。媒体処理された野生型と比較したパーセンテージでの相対的体重は、各処理群について示されている（図１２）。サルコペニアマウスのヒトＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／ＡまたはマウスＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａでの処理は、媒体処理されたサルコペニアマウスと比較して体重の有意な増加をもたらした。Ｃ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａで処理されたサルコペニアマウスは完全に回復し、さらに野生型同腹仔に観察されたのと同じ発育であった。ヒトにおいて、虚弱患者は、１年あたり５ｋｇを超える体重減少に悩まされている（ＢａｕｅｒおよびＳｉｅｂｅｒ、２００８；Ｌａｕｒｅｔａｎｉら、２００３）。これは、全体重の約７％の損失に相当する。媒体対照で処理されたサルコペニアマウスは、著しい体重低下を示した。実験中、サルコペニアマウスは体重が約５％減少した。
【実施例８】
【００９６】
＜握力の測定＞
測定を、実施例６に記載されているように、行った。
【００９７】
図１３ａおよび１３ｂは、媒体（媒体）またはヒトＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／ＡまたはマウスＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａで処理されたサルコペニアマウス、および媒体で処理された野生型同腹仔（野生型媒体）についての前肢および後肢の握力を示す。握力を１３日目に測定する。異なる処理群の握力は、媒体処理された野生型同腹仔マウスに対するパーセンテージとして示されている。標準偏差はエラーバーとして示されている（各群についてＮ＝５）。
【００９８】
［文献リスト］
【表１】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物として用いる改変アグリン断片について言及する。加えて、本発明は、種々の、特に、筋肉疾患または運動ニューロン疾患の処置だけでなく、さらなるニューロトリプシン関連疾患の処置にも用いる薬物の製造のための改変アグリン断片の使用に言及する。さらに、本発明は、種々の疾患の処置における改変アグリン断片の使用に言及する。最後に、本発明は、改変アグリン断片を含む薬学的組成物、および特定の改変アグリン断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
６０歳以上の高齢者は、除脂肪体重の容赦ない下降に直面する。これはごく普通のことであるため、長い間、その根本的な機構を調べることに価値があるとは考えられていなかった。現在、除脂肪体重の加齢性下降は、サルコペニアまたは虚弱（ｆｒａｉｌｔｙ）と呼ばれている。
【０００３】
サルコペニアおよび虚弱はどちらも、高齢者における機能性および自立度に関して、非常に関連性の深い実体である。サルコペニアは、その末期に虚弱および身体障害に至る、筋量および筋力における退行性加齢性下降とみなされている。サルコペニア患者の筋量の下降速度は、その疾患に罹っていない人々の下降速度より有意に速い。サルコペニアは静的な状態ではなく、加齢と共に悪化する。それのゆっくりとした発症のため、人々は通常、すでに進行期に達しているときまでサルコペニアに気づかない。
【０００４】
サルコペニアの筋量は、筋線維数の連続的な縮小によって特徴づけられる。線維サイズはより不均一であり、線維タイプの群化が観察される。線維タイプの群化は、繰り返される除神経／神経再生によって引き起こされると考えられる。加えて、老化した筋肉は、脂肪および結合組織の浸潤を特徴とする。これ全てが筋力および運動速度の下降の原因となる。多くの筋肉に観察される加齢性変化は、それらの筋肉線維の神経支配における加齢性変化によってある程度、引き起こされると考えられる。老化の間、機能する運動単位（ＭＵ）の概算数の有意かつ漸進的な低下が観察される。同様に、ＭＵの実質的損失と関連した明らかな筋力下降が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）または重症度の低い型の脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）などの運動ニューロン疾患に苦しんでいる個体に観察される。
【０００５】
筋線維の除神経／神経再支配のサイクルはシナプス可塑性を必要とする。シナプス可塑性の過程はまだ詳細にはわかっていない。しかしながら、この数年で、神経筋接合部（ＮＭＪ）の形成および維持におけるいくつかの重要なプレーヤーが同定された（ＳｏｎｇおよびＢａｌｉｃｅ−Ｇｏｒｄｏｎ、２００８）。十分特徴づけられたタンパク質アグリン（ＢｅｚａｋｏｖａおよびＲｕｅｇｇ、２００３）は、発生中のＮＭＪのシナプス後装置の形成および維持を援助することによってシナプス形成において中心的役割を果たす。
【０００６】
アグリンは、４００〜６００ｋＤａの分子量を有する大きなヘパランプロテオグリカンである。（データベースアクセッション番号ＮＰ＿９４０９７８）。タンパク質コアは、約２０００個のアミノ酸からなり、その質量は約２２５ｋＤａである。それは、９個のＫ（クニッツ型）ドメイン、２個のＬＥ（ラミニン−ＥＧＦ様）ドメイン、１個のＳＥＡ（精子のタンパク質、エンテロキナーゼ、およびアグリン）ドメイン、４個のＥＧ（上皮増殖因子様）ドメイン、および３個のＬＧ（ラミニン球状）ドメインで構成される多ドメインタンパク質である（図１）。アグリンは、非常に重要なタンパク質であり、アグリン欠損マウスは、呼吸不全により出生時に死ぬ。これは、アグリンが筋線維の正常な神経支配に厳重に必要とされるという事実、およびこれらのマウスが正常なＮＭＪを構築することができないという事実によって引き起こされる。
【０００７】
アグリンは、いくつかのスプライスバリアントとして存在し、Ｎ末端のＮｔＡ（Ｎ末端アグリン）ドメインを含む分泌性タンパク質として発現することができ、その分泌性タンパク質がアグリンの最も豊富にある形であり、その優勢形は運動ニューロンに発現する。それは、そのニューロンの神経細胞体において産生され、軸索を下へと輸送され、運動神経の軸索終末からＮＭＪのシナプス間隙へ放出される。ここで、それは、ＬＲＰ４のアゴニストとして働き、基底層の成分になる場合もある。ＣＮＳにおいて、たいていのアグリンは、Ｎ末端のＮｔＡドメインを欠くＮ末端における選択的スプライシングによるＩＩ型膜貫通タンパク質として発現する（ＢｅｚａｋｏｖａおよびＲｕｅｇｇ、２００３）。
【０００８】
アグリンにおけるセリン／スレオニン（Ｓ／Ｔ）リッチなセグメントは、高度のグリコシル化に関与しており、いくつかのグリコシル化部位、および大質量のプロテオグルカンを生じるグルコサミノグリカン付着部位を含む。第１のＥＧドメインから始まるアグリンのＣ末端の７５ｋＤａの部分は、筋肉細胞においてアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）クラスター形成活性における完全活性に必要とされるが、最もＣ末端の２０ｋＤａの断片が、ＡＣｈＲ凝集を誘導するのに十分である（ＢｅｚａｋｏｖａおよびＲｕｅｇｇ、２００３）。α−ジストログリカン、ヘパリン、いくつかのインテグリン、およびＬＲＰ４を含むアグリンの相互作用パートナーについてのいくつかの結合部位は、Ｃ末端領域にマッピングされる。大きなヘパラン硫酸側鎖は、ヘパリン結合タンパク質、例えば、いくつかの増殖因子についての結合部位である。
【０００９】
ヒトアグリンのＣ末端部分において、２つの選択的スプライス部位、ｙおよびｚがある。ｙ部位には、０個、４個、１７個、または２１（４＋１７）個のアミノ酸の挿入断片が存在する場合があり、ｚ部位では、０個、８個、１１個、または１９（８＋１１）個のアミノ酸の挿入断片が存在する場合がある。ｙ部位におけるその４つの挿入アミノ酸の機能は、ヘパリン結合部位を形成することである。運動ニューロンは、主にｙ４アグリンを発現する。ＮＭＪ成熟に関して最も重要なアグリンのスプライス部位はｚ部位であり、それは、アグリンに、アセチルコリン受容体クラスター形成作用物質として活性がある能力を与える。スプライス部位ｙにおける４個のアミノ酸の挿入断片の存在下でｚ部位に８個のアミノ酸の挿入を含む完全長アグリン（ｙ４ｚ８）が、培養筋管クラスター形成アッセイにおいて３５ｐＭの最大半量ＡＣｈＲクラスター形成活性を有するアグリンバリアントを生じることはよく知られている。１１個のアミノ酸の挿入は、５ｎＭの最大半量ＡＣｈＲクラスター形成活性を生じるが、１９個のアミノ酸の挿入は結果として、１１０ｐＭの最大半量ＡＣｈＲクラスター形成活性を生じる。この部位において挿入がないアグリンは、インビトロ培養筋管上でアセチルコリン受容体をクラスター形成することに活性はない（ＢｅｚａｋｏｖａおよびＲｕｅｇｇ、２００３）。したがって、クラスター形成アッセイにおいて最も活性の高い形のアグリンは、ｙ４ｚ８バリアントであり、それは運動ニューロンによって発現する。
【００１０】
ＬＧ２、ＥＧ４、およびＬＧ３ドメインを含むアグリン（ｙ４ｚ８）の約４０ｋＤａのＣ末端断片は、ＡＣｈＲクラスター形成に活性があり、ＡｃｈＲクラスター形成活性において１３０ｐＭのＥＣ５０をもつことが見出されているが、より短い断片は、より低い活性を有するだけである。ｚ８挿入を含むＣ末端ＬＧ３ドメインは、１３ｎＭだけの最大半量ＡＣｈＲクラスター形成活性を示し、その活性は、４０ｋＤａの断片の１００分の１の率である（ＢｅｚａｋｏｖａおよびＲｕｅｇｇ、２００３）。
【００１１】
ＮＭＪの発生および成熟中、アグリンは、アセチルコリン受容体のクラスター形成に関与する重要なプレーヤー分子である。ＮＭＪが、神経伝達物質のアセチルコリンによって不安定化されるが、運動ニューロンによって分泌されるアグリンは、膜結合受容体型チロシンキナーゼであるＭｕＳＫのリン酸化を介して、ＡＣｈＲのクラスターを安定化し、増加させる。アグリンのＭｕＳＫとの相互作用は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）関連タンパク質であるＬＲＰ４を通して媒介されると仮定される。アグリン（ｙ４ｚ８）がアグリン（ｙ４ｚ０）より約１０倍高いＬＲＰ４への親和性を有し、そのことが、インビトロ培養筋管アッセイにおいて観察される種々のアグリンのスプライスバリアントの示差的なＡＣｈＲクラスター形成活性を生じることが見出された。アグリン結合によって、ＬＲＰ４は、ＭｕＳＫの自己リン酸化を引き起こし、それが、その後、アセチルコリン受容体の発現およびクラスター形成についてのシグナル伝達系を活性化する。
【００１２】
ニューロトリプシンは、脊髄抽出物に見出され、運動ニューロンによって産生される。ニューロトリプシンは、ＣＮＳニューロンによって、加えて運動ニューロンによっても産生される分泌性のトリプシン様セリンプロテアーゼである（Ｓｔｅｐｈａｎら、２００８）。ニューロトリプシンは、プロリンリッチ塩基性（ＰＢ）セグメントを含むＮ末端の非触媒性部分、クリングル（ＫＲ）ドメイン、４つのスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン、およびＣ末端のプロテアーゼドメインからなる（Ｇｓｃｈｗｅｎｄら、１９９７）。ヒトにおいて、エクソン７における４ｂｐの欠失は、重篤な非症候性精神遅滞をもたらす。その突然変異は、プロテアーゼドメインを欠く切断型ニューロトリプシンを生じ、したがって、酵素のタンパク質分解性機能を無能にする。
【００１３】
現在のところ、アグリンがニューロトリプシンの唯一の知られた標的である。ニューロトリプシンは、アグリンをα部位およびβ部位と呼ばれる２つの別個の部位で切断する（図１）。α部位は、アグリンのＳＥＡドメインからＮ末端側に位置し、β部位は、アグリンのＬＧ３ドメインの前に配置される。α部位での切断は、４〜１２％のビストリスＳＤＳゲルにおいて約１３０ｋＤａに流れる約１００ｋＤａのＣ末端アグリン断片を生じる。β部位での切断は、そのゲルにおいて約２２ｋＤａに流れるＣ末端ＬＧＳドメインを遊離させる（Ｍｏｌｉｎａｒｉら、２００２；Ｒｅｉｆら、２００７）。全てのＣ末端断片は、マウスの脳抽出物および脊髄抽出物に検出することができた（Ｓｔｅｐｈａｎら、２００８）。ニューロトリプシンのノックアウトマウスにおいて、その断片のいずれも検出することができなかった。結果として、ニューロトリプシンは、アグリンを有意な量でその２つの切断部位において切断する唯一のプロテアーゼであるように思われる。ニューロトリプシンによるアグリンの切断は、神経筋可塑性およびリモデリングに寄与する。
【００１４】
ニューロトリプシン（ＮＴ）過剰発現マウス、いわゆるサルコペニアマウス（ｍｕｓｌｉｋ、Ｍ４９１Ｓ）（Ｓｔｅｐｈａｎら、２００８）は、サルコペニアの早期発症を示す。サルコペニアマウスの体系的分析からの詳細な知見により、ヒトデータに対して良い相関が存在することが実証されている。米国特許出願第１２／００７，９２８号は、その動物モデルの記載を示している。簡単に述べれば、サルコペニアマウス（ｍｕｓｌｉｋ Ｍ４９１Ｓ）は以下を示す。
（ｉ）マウス横隔膜の神経線維は、個々の終板に向かって成長すること、
（ｉｉ）最終的には個々の終板の消失（すなわち、シナプス前部およびシナプス後部の喪失）をもたらす、横隔膜筋肉上の断片化された終板、
（ｉｉｉ）ニューロトリプシン過剰発現動物におけるマウスヒラメ筋の線維数の低下および線維サイズの均一性の減少。サルコペニアマウスは、線維数の低下（約３０％）および線維サイズの不均一性の増加がある。
【００１５】
国際公開第９７／２１８１１号において、筋肉を冒す疾患の処置方法においてアグリンまたはアグリン断片を用いることが提案されている。しかしながら、そのような試みは、今日まで成功したということは示されていない。
【発明の概要】
【００１６】
本発明の目的は、機能性ＮＭＪおよび／または運動単位（ＭＵ）の低下を含む種々の筋肉障害についての治療を提供することである。
【００１７】
一般的に、本発明は、ニューロトリプシンのタンパク質分解活性に抵抗性であり、かつサルコペニアまたはさらなるニューロトリプシン関連疾患を患っているヒトの処置のための生物学的治療試薬として働く、遺伝子工学的に操作されたヒトまたはマウスの新規アグリンタンパク質バリアントを提供する。ニューロトリプシンの活性に対する抵抗性は、例えば、アグリン断片の切断部位、特にβ切断部位を適宜、改変することによって、または断片から切断部位を除去することによって、達成することができる。
【００１８】
本出願人の調査により、アグリン断片のインビボ活性が、ＬＧ２およびＬＧ３の両方のドメインが一緒に存在することに主に依存することが示されている。ＷＯ９７／２１８１１は、ＬＧ３単独についてのＡＣｈＲクラスター形成のインビトロ活性を示した。しかしながら、ＬＧ３のインビボ活性は示すことができなかった。同様に、ＬＲＰ４単独の活性化は完全なインビボ活性を達成するのに十分ではない。
【００１９】
それゆえに、本発明の１つの重要な特徴は、ドメインＬＧ２およびＬＧ３が、インビボでニューロトリプシンの活性のせいで分離されないことである。そのような分離を避けるために、本発明に従って用いられるアグリン断片は、それが、ドメインＬＧ２とドメインＬＧ３の間に存在する天然のアグリンにおけるニューロトリプシンのβ切断部位をもはや含まないように改変されている。
【００２０】
本出願において用いられる場合、ＬＧ２およびＬＧ３という用語は、上記で述べられているように、これらのドメインの可能性のある全ての種々のスプライスバリエーションを含むものとする。例えば、配列番号１は、ｙ部位に４個のアミノ酸の挿入断片（配列番号５）を有するドメインＬＧ２のヒト配列を示し、一方、配列番号２は、ｚ部位に８個のアミノ酸の挿入断片（配列番号８）を有するドメインＬＧ３の配列を示す。配列番号１に示されているように、ドメインＬＧ２において、ｙ部位はプロリン１１５とバリン１２０の間にある。そのバリンの位置はｙスプライス部位における挿入断片の長さに依存して変化し得ることは理解されている。配列番号２に示されているように、ドメインＬＧ３において、ｚ部位は、セリン１９とグルタミン酸２８の間にある。ここでもまた、そのグルタミン酸の位置はｚスプライス部位における挿入断片の長さに依存して変化し得ることは明らかである。言及されたスプライス部位における挿入断片の配列についてのさらなる例は下記に示されている。
【００２１】
追加として、生物活性に影響しない配列のバリエーションは可能であるため、本発明は、ドメインＬＧ２およびＬＧ３の種々のスプライスバリアントの示された配列に限定するものではなく、少なくとも９０％、好ましくは９５％の同一性を有するそれらのバリアントもまた含むものとする。
【００２２】
本発明は、インビボ活性を有し、かつ同時にインビボでニューロトリプシンによって切断されないアグリン断片を提供する。
【００２３】
本出願に用いられる場合のインビボ活性は、サルコペニアマウス（ｍｕｓｌｉｋ Ｍ４９１Ｓ）における全体重減少および筋力低下の予防から全体重および筋力の回復まで及ぶ効果を含むものとする。
【００２４】
本出願に用いられる場合のアグリン断片という用語は、ニューロトリプシンについての少なくとも認識部位βにおける、および場合により部位αにおける塩基性アミノ酸のアルギニンおよび／またはリジンが、任意の他のアミノ酸へ突然変異して、少なくとも部分的にニューロトリプシン抵抗型のアグリンを生じている、分泌型または膜貫通型のアグリンを網羅する。それは、少なくともアグリンのＬＧ３およびＬＧ２ドメインを含む断片だけでなく、追加として、アグリンに天然で存在する少なくとも１つのさらなるドメイン、例えば、ＬＧ１およびＥＧ１〜４ドメインを含む断片も包含する。
【００２５】
または、アグリン断片は、ニューロトリプシンまたはニューロトリプシン様セリンプロテアーゼによるタンパク質分解性切断を阻止するように、化学的に改変することができる。
【００２６】
追加として、本発明に該当するアグリン断片は、スプライス部位ｙおよびｚにおいて任意の天然または非天然で挿入されるアミノ酸を含むものとする。
【００２７】
一実施形態において、本発明は、少なくともニューロトリプシンβ切断部位を含むＣ末端アグリン断片であって、この切断部位が、ニューロトリプシンまたはニューロトリプシン様プロテアーゼがそれを切断できないように改変されている、Ｃ末端アグリン断片を対象とする。ニューロトリプシン抵抗性Ｃ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａと呼ばれる特に好ましい改変アグリン断片は、図２ｂに示された配列番号３によるアミノ酸配列を含む。略語Ｋ／Ａは、β切断部位におけるＫ（リジン）からＡ（アラニン）への突然変異を表す。Ｃ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ヒト）、Ｃ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（マウス）、Ｃ４４ｙ４ｚ０Ｋ／Ａ（ヒト）、およびＣ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａ（マウス）と呼ばれる、さらなる好ましい改変アグリン断片は、図７〜１０に示された配列番号１１〜１４によるアミノ酸配列を含む。
【００２８】
そのようなアグリン断片は、実施例においてアグリン断片Ｃ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａについて記載されているように、通常の組換え操作によって得ることができる。それらの実験について、本出願人らは、Ｎ末端に導入されたＨｉｓ８を用いることによって精製された断片を用いた。本文ではＣ４４Ｋ／Ａと呼ばれる断片は、配列番号４による配列を有する。
【００２９】
ニューロトリプシン抵抗性Ｃ４４ｙ４ｚ８Ｋ／ＡとＣ４４Ｋ／Ａの唯一の違いは、後者のタンパク質が追加として、断片を試験する前に除去されなかったＨｉｓ８−タグを含むことである。
【００３０】
実施例に示されているように、本発明による改変アグリン断片は、サルコペニアを患っているマウスにおいて筋肉発生を誘導することができる。それゆえに、本発明の１つの重要な態様は、特許請求されているアグリン断片の、薬物としての使用である。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、非限定的に、サルコペニア、筋衰弱、虚弱、筋萎縮症および筋ジストロフィー症、筋無力症、筋強直症、脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、ならびに原発性側索硬化症を含む、神経筋疾患、または神経、筋肉、および神経筋接合部の疾患の処置のための、またはそれらの処置用の薬物の製造のための改変アグリン断片の使用である。
【００３２】
言及された疾患は別として、改変アグリン断片は、一般的に、ニューロトリプシンレベルが、例えば過剰発現によって上昇している全ての疾患の処置に用いることができる。
【００３３】
さらなる態様は、長期の不動状態後に起こり得る、筋量および筋力の喪失を伴う筋肉の廃用性萎縮（筋萎縮症）の処置である。長期不動状態の例は、長期のベッドでの療養、または体の部分、例えば、手足にギブスをはめていること、または肺疾患を患う患者における機械的人工換気である。筋量の萎縮を引き起こす多くの疾患および状態もある。例えば、がんやＡＩＤＳなどの疾患は、「悪液質」と呼ばれる消耗症候群を誘発し、その消耗症候群は、重篤な筋萎縮が顕著に見られる。この型の萎縮は、その状態が重篤でない限り、運動で逆転させることができる。廃用性萎縮は、神経筋接合部におけるリモデリングを引き起こすことが知られている。観察される神経筋変化および可塑性は、老化した（サルコペニア性）ＮＭＪについてだけでなく、廃用性萎縮についての特徴でもある。
【００３４】
本発明は、サルコペニアおよび筋肉疾患を処置するための、薬学的に許容される媒体に本発明による改変アグリン断片を含む薬学的組成物を提供する。そのような処置は、積極的な運動トレーニングまたは栄養最適化を含む治療的アプローチと組み合わせてもよい。
【００３５】
１つの好ましい投与様式は皮下注射であることはわかっている。好ましくは、そのための薬学的組成物は、そのような注射を可能にする担体を含む。しかしながら、その断片を筋肉内に、または静脈内に、または髄腔内に、または経口で、または経皮的に、または経上皮的に、または肺内に、または鼻腔内に投与することも考えられる。以下の製剤または装置（マイクロカプセル化、マイクロプロジェクションリポソーム、アグリン断片のＰＥＧ化もしくはＰＥＧ化誘導体、またはナノ粒子）を用いてもよい。そのような薬学的組成物もまた本発明に網羅される。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】アグリンのドメイン構造の概略図である。
【図２ａ】ニューロトリプシン抵抗性アグリンＣ４４の概略図である。
【図２ｂ】ニューロトリプシン抵抗性アグリンＣ４４ｙ４ｚ８のアミノ酸配列（配列番号３）を示す図である。
【図３】ＩＭＡＣによるＣ４４Ｋ／Ａ（配列番号４）の精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを表示する図である。
【図４】Ｃ４４Ｋ／ＡおよびヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８のヒトニューロトリプシンでのタンパク質限定分解性消化を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを表示する図である。
【図５】Ｃ４４Ｋ／Ａまたは媒体で処理されたマウスの体重の進展を示すグラフである。
【図６ａ】Ｃ４４Ｋ／Ａまたは媒体で処理された野生型同腹仔マウスおよびサルコペニアマウスにおける実験の１３日目での前肢の握力を示す図である。
【図６ｂ】Ｃ４４Ｋ／Ａまたは媒体で処理された野生型同腹仔マウスおよびサルコペニアマウスにおける実験の１３日目での後肢の握力を示す図である。
【図７】ニューロトリプシン抵抗性アグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ｈ）のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す図である。
【図８】ニューロトリプシン抵抗性アグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ｍ）のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す図である。
【図９】ニューロトリプシン抵抗性アグリンＣ４４ｙ４ｚ０のアミノ酸配列（配列番号１３）を示す図である。
【図１０】ニューロトリプシン抵抗性アグリンＣ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａ（ｍ）のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す図である。
【図１１】Ｃ４４Ｋ／Ａ断片のタンパク質限定分解性消化を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを表示する図である。
【図１２】媒体（媒体）またはヒトＣ４４Ｋ／Ａ（０．８）またはマウスＣ４４Ｋ／Ａ（０．８）で処理されたサルコペニアマウス（４９１Ｓ）および媒体で処理された野生型同腹仔（野生型媒体）についての全体重の進展を示す図である。
【図１３ａ】媒体（媒体）またはヒトＣ４４Ｋ／Ａ（０．８）またはマウスＣ４４Ｋ／Ａ（０．８）で処理されたサルコペニアマウスおよび媒体で処理された野生型同腹仔（野生型媒体）についての前肢の握力を示す図である。
【図１３ｂ】媒体（媒体）またはヒトＣ４４Ｋ／Ａ（０．８）またはマウスＣ４４Ｋ／Ａ（０．８）で処理されたサルコペニアマウスおよび媒体で処理された野生型同腹仔（野生型媒体）についての後肢の握力を示す図である。
【００３７】
図１は、アグリンの概略図である。アグリンは、約２２５ｋＤａのコアタンパク質質量を有する。それは、９個のＫ（クニッツ型）ドメイン、２個のＬＥ（ラミニン−ＥＧＦ様）ドメイン、１個のＳＥＡ（精子のタンパク質、エンテロキナーゼ、およびアグリン）ドメイン、４個のＥＧ（上皮増殖因子様）ドメイン、および３個のＬＧ（ラミニン球状）ドメインで構成される多ドメインタンパク質である。ＳＥＡドメインの両側に、セリン／スレオニンリッチな（Ｓ／Ｔ）領域が見出される。アグリンはいくつかのアイソフォームとして存在する。分泌性アイソフォームは、切り離されるシグナル配列（ＳＳ）を含み、その後にＮ末端アグリンドメイン（ＮｔＡ）が続く。ＩＩ型膜貫通結合型は、膜貫通（ＴＭ）領域を含み、そのすぐ後に第１のクニッツ型ドメインが続く。第１のＥＧドメインで始まるアグリンのＣ末端の７５ｋＤａの部分は、筋肉細胞においてアセチルコリン受容体（ＡＣｈＲ）クラスター形成活性における完全活性に必要とされるが、最もＣ末端側の２０ｋＤａの断片が、低い作用強度でＡＣｈＲ凝集を誘導するのには十分である。α−ジストログリカン、ヘパリン、いくつかのインテグリン、およびＬＲＰ４を含むアグリンの相互作用パートナーについてのいくつかの結合部位は、Ｃ末端領域にマッピングされる。大きなヘパラン硫酸側鎖（ロリポップ鎖）は、ヘパリン結合タンパク質、例えば、いくつかの増殖因子についての結合部位である。ロリポップはグリコシル化部位を示す。ｘ、ｙ、ｚは、アグリンのＣ末端領域における選択的スプライス部位を割り当てる。ｘ部位（ニワトリおよびカエルでは欠損する）において、挿入された０個、３個、または１２個のアミノ酸が存在し得、ｙ部位において、挿入された０個または４個のアミノ酸が存在し得、ｚ部位において、挿入された０個、８個、１１個、または１９（８＋１１）個のアミノ酸が存在し得る。「α切断およびβ切断」は、２つの保存されたニューロトリプシン切断部位を示す。ニューロトリプシン切断後のタンパク質分解性断片のおおまかなタンパク質コア質量は上記に示されている。
【００３８】
図１に用いられた略語は以下の意味をもつ。ＳＳ：シグナル配列；ＮｔＡ：Ｎ末端アグリンドメイン；ＴＭ：膜貫通セグメント；Ｋ：クニッツ型ドメイン；ＬＥ：ラミニンＥＧＦ様ドメイン；Ｓ／Ｔ：セリン／スレオニンリッチなセグメント；ＳＥＡ：精子タンパク質、エンテロキナーゼ、およびアグリンドメイン；ＥＧ：上皮増殖因子様ドメイン；ＬＧ：ラミニン球状ドメイン。
【００３９】
図２ａは、本発明に従って用いられる改変アグリン断片の概略図である。断片は、アグリンのＣ末端ドメインＬＧ２、ＥＧ４、およびＬＧ３を含む。ニューロトリプシンのβ切断部位は欠失している。
【００４０】
図２ｂは、アグリンのニューロトリプシン抵抗性Ｃ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａ断片のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。断片は、アグリンのＣ末端ドメインＬＧ２、ＥＧ４、およびＬＧ３を含む。ニューロトリプシンのβ切断部位は、リジンのアラニンへの突然変異によって欠失している。
【００４１】
図２に用いられた略語は以下の意味をもつ。ＬＧ：ラミニン球状ドメイン；ＥＧ：上皮増殖因子様ドメイン；ｙおよびｚは、アグリンのＣ末端部分の選択的スプライス部位を示す。線を引いて抹消されたβ切断：ニューロトリプシン抵抗性アグリン断片を与える、ニューロトリプシンについてのβ切断部位における突然変異。
【００４２】
図３は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにおけるＣ４４Ｋ／Ａの精製工程を示すＳｙｐｒｏルビー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。Ｃ４４Ｋ／Ａの遺伝子を含むｐＥＡＫ８ベクターでトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞由来の培養上清を、Ｎｉ２＋で標識された１０ｍｌのＩＭＡＣカラムに負荷した。適切な緩衝液でカラムを洗浄した後、結合したタンパク質を、５００ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液で溶出した（５〜９）。レーン１：Ｂｉｏｒａｄ Ｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎ ｐｌｕｓタンパク質マーカー；レーン２：濃縮された培養上清；レーン３：通過画分；レーン４：洗浄画分；レーン５〜９：溶出画分。
【００４３】
図４は、Ｃ４４Ｋ／ＡおよびヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８のヒトニューロトリプシンでのタンパク質分解性消化を実証するＳｙｐｒｏルビー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。Ｃ４４Ｋ／ＡまたはヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８を、ヒトニューロトリプシンと３７℃で３．５時間、インキュベートし（１＋３）、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。対照として、アグリン断片を、同じ条件で緩衝液とインキュベートした（２＋４）。β切断部位におけるＫからＡへの突然変異は、アグリン断片の切断を無効にした。レーン１：ヒトニューロトリプシンを添加したＣ４４Ｋ／Ａ；レーン２：ヒトニューロトリプシンを添加していないＣ４４Ｋ／Ａ；レーン３：ヒトニューロトリプシンを添加したヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８；レーン４：ヒトニューロトリプシンを添加していないヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８。
【００４４】
図５は、媒体またはＣ４４Ｋ／Ａで処理されたサルコペニアマウス（４９１Ｓ）および媒体で処理された野生型同腹仔（野生型媒体）についての全体重の進展を示す。マウスの体重は、２２日目まで実験の全期間を通して毎日決定された。マウスの体重は、媒体で処理された野生型同腹仔に対するパーセンテージとして表されている。処理は１日目から始まり、１３日目に終わった。握力は１３日目に測定された。
【００４５】
図６ａおよびｂは、媒体（媒体）またはＣ４４Ｋ／Ａ（Ｃ４４Ｋ／Ａ）で処理されたサルコペニアマウスについての前肢および後肢の握力を示す。握力は１３日目に測定される。種々の処理群の握力は、媒体で処理された野生型同腹仔マウスに対するパーセンテージとして示されている。標準偏差はエラーバーとして示されている（各群についてＮ＝５）。
【００４６】
図７は、ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ｈ）のアミノ酸配列（配列番号１１）を示す。
【００４７】
図８は、ニューロトリプシン抵抗性マウスアグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ｍ）のアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。
【００４８】
図９は、ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ０Ｋ／Ａ（ｈ）のアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。
【００４９】
図１０は、ニューロトリプシン抵抗性マウスアグリンＣ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａ（ｍ）のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。
【００５０】
図７〜１０に示された全ての断片は、アグリンのＣ末端ドメインＬＧ２、ＥＧ４、およびＬＧ３を含む。ニュートリプシンのβ切断部位は、リジンからアラニンへの突然変異によって欠失している。
【００５１】
図１１は、ニューロトリプシンアッセイにおいてさらなるＣ４４断片のタンパク質分解性消化を実証するＳｙｐｒｏルビー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。図７〜１０に示された種々のＣ４４断片およびヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａ（図２ｂ）をアッセイにおいてヒトニューロトリプシンと共に（ｈＮＴ＋）、およびそれを含まずに（ｈＮＴ−）、３７℃で３．５時間、インキュベートし、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。対照として、ｐｒｅｃｉｓｓｉｏｎマーカーおよびβ切断部位に突然変異をもたないヒトアグリンＣ４４ｙ０ｚ０を同じ条件でインキュベートした。この場合もやはり、β切断部位におけるＫからＡへの突然変異が、その突然変異型アグリン断片のニューロトリプシンによる切断を効率的に無効にすることは明らかである。レーン１：ｐｒｅｃｉｓｓｉｏｎマーカー；レーン２：突然変異を含まないＣ４４ｙ０ｚ０（ｈＮＴ−）；レーン３：突然変異を含まないＣ４４ｙ０ｚ０（ｈＮＴ＋）；レーン４：ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ０Ｋ／Ａ（ｈＮＴ−）；レーン５：ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ０Ｋ／Ａ（ｈＮＴ＋）；レーン６：ヒトアグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ｈＮＴ−）；レーン７：ヒトアグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ｈＮＴ＋）；レーン８：マウスアグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ｈＮＴ−）；レーン９：マウスアグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ（ｈＮＴ＋）；レーン１０：ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８（ｈＮＴ−）；レーン１１：ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８（ｈＮＴ＋）；レーン１２：マウスアグリンＣ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａ（ｈＮＴ−）；レーン１３：マウスアグリンＣ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａ（ｈＮＴ＋）。
【００５２】
図１２は、媒体（媒体）またはヒトＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／ＡまたはマウスＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａで処理されたサルコペニアマウス（４９１Ｓ）および媒体で処理された野生型同腹仔（野生型媒体）についての全体重の進展を示す。マウスの体重は、２２日目まで実験の全期間を通して毎日決定された。マウスの体重は、媒体で処理された野生型同腹仔に対するパーセンテージとして表されている。処理は１日目から始まり、１３日目に終わった。
【００５３】
図１３ａおよびｂは、媒体（媒体）またはヒトＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／ＡまたはマウスＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａで処理されたサルコペニアマウスおよび媒体で処理された野生型同腹仔（野生型媒体）についての前肢および後肢の握力を示す。握力は１３日目に測定される。種々の処理群の握力は、媒体で処理された野生型同腹仔マウスに対するパーセンテージとして示されている。標準偏差はエラーバーとして示されている（各群についてＮ＝５）。
【００５４】
本出願人らは初めて、サルコペニアマウスが、既知の欠乏に加えて、健康な野生型マウスと比較して除脂肪体重の下降（図５）および握力の低下（図６）も生じることを示した。
【００５５】
この事実から始まって、本出願人らは、例えば、図２ａに示されているようで、かつ図２ｂに示されているような配列を含むニューロトリプシン抵抗性アグリンＣ４４Ｋ／Ａが、図５、６ａ、６ｂに示されているように、サルコペニアマウス、すなわち、ニューロトリプシン過剰発現マウスの体重および握力を増加させ得ることを示すことができた。
【００５６】
回復効果は、Ｃ４４Ｋ／Ａ断片の皮下投与後に達成される。効果は、注射部位へ局所的に限定されず、全体重および筋力に有益な効果を生じる。処理されたサルコペニアマウスは、より強くなり、前肢および後肢の両方における握力が増加している。
【００５７】
Ｃ４４Ｋ／Ａの投与はまた、異所性ＡＣｈＲクラスターにおいて筋線維の神経再支配を促進し、新しく形成されたＮＭＪの安定化および成熟をもたらすであろう。したがって、Ｃ４４Ｋ／Ａの投与はまた、筋線維または筋肉の神経再支配が必要とされるリハビリテーション過程において有益であろう。
【００５８】
本明細書で特許請求されているニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンと対照的に、（ＷＯ９７／２１８１１に記載されているような）ニューロトリプシンについての無傷の切断部位を有するアグリン断片は、それらがニューロトリプシンによって迅速に分解され、それらのＡＣｈＲクラスター形成活性を喪失するであろうため、有益ではないであろう。
【００５９】
アグリンは、２つの部位でニューロトリプシンによって切断される（図１）。α切断部位は、アルギニン１１０２（Ｒ１１０２）とアラニン１１０３（Ａ１１０３）の間に位置する。β切断部位は、リジン１８５９（Ｋ１８５９）とセリン１８６０（Ｓ１８６０；番号付けはヒトアグリンＮＰ＿９４０９７８に対応する）の間に位置する。β部位におけるニューロトリプシンによるアグリン切断は、Ｓ１８６０からＣ末端までの範囲である約２０ｋＤａの断片（アグリンＣ２２）を生じる。
【００６０】
本発明に従って用いられるニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンは、アグリンのＬＧ２、ＥＧ４、およびＬＧ３ドメインからなるＣ末端アグリン断片であり、ニューロトリプシンの不活性化されたβ切断部位を内在する。そのＰ１リジン残基（Ｋ１８５９）は、アラニンに突然変異されており、そのことが、ニューロトリプシンがこの部位でアグリンをもはや切断することができないことの原因となっている（図３）。
【００６１】
本発明において定義されているようなニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８は、配列番号３の４４ｋＤａのＣ末端アグリン断片であり、その塩基性アミノ酸リジン１８５９（ＮＰ＿９４０９７８）（または配列番号３におけるリジン２２７）がアラニンに突然変異されて、ニューロトリプシンによって切断されないアグリン断片を生じる。この断片はさらに、アミノ酸Ｐ１７５１とＶ１７５２（ＮＰ＿９４０９７８）の間に位置するｙ部位において挿入を含まなくてもよく、またはアミノ酸Ｓ１８８４とＥ１８８５（ＮＰ＿９４０９７８）の間に位置するｚ部位において挿入を含まなくてもよいし、８個、１１個、もしくは１９個のアミノ酸の挿入を含んでもよく、またはそれらの組み合わせでもよい。ｙ部位における挿入される配列は、ＫＳＲＫ（ｙ４、配列番号５）、ＶＬＳＡＳＨＰＬＴＶＳＧＡＳＴＰＲ（ｙ１７、配列番号６）、およびＫＳＲＫＶＬＳＡＳＨＰＬＴＶＳＧＡＳＴＰＲ（ｙ２１、配列番号７）、ならびにｚ部位において、ＥＬＡＮＥＩＰＶ（ｚ８、配列番号８）、ＰＥＴＬＤＳＧＡＬＨＳ（ｚ１１、配列番号９）、またはＥＬＡＮＥＩＰＶＰＥＴＬＤＳＧＡＬＨＳ（ｚ１９、配列番号１０、配列番号８と配列番号９の組み合わせ）であってもよい。
【００６２】
本出願において、ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８に言及される場合には、そのようなアグリン断片は、配列番号３に示された断片に対応するものとし、ただし、示された配列の位置２２７のアラニンがヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８におけるリジンによって置き換えられているという唯一の違いをもつ。
【００６３】
本発明において、用語「ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８」もまた、ｙ部位に挿入が導入されておらず、もしくはｚ部位に挿入が導入されておらず、または８個のアミノ酸挿入の代わりに、配列番号９および配列番号１０に対応する１１個もしくは１９個のアミノ酸挿入がｚ部位に挿入されている、配列番号３によって定義されるタンパク質のアグリンバリアントを含む。これはまた、ｙ部位およびｚ部位に可能なアミノ酸を導入することによって生じる全ての可能なバリアントの組み合わせを含む。
【００６４】
用語「ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８」はまた、Ｎ末端またはＣ末端に追加のアミノ酸を含む配列番号３のアグリン断片を含む。Ｎ末端におけるそのような追加のアミノ酸は、例えば、組換え合成および適切な細胞における発現による調製方法により存在する。「ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８」の定義に該当するそのようなタンパク質の例は、実施例１により調製されたタンパク質Ｃ４４Ｋ／Ａ配列番号４であり、それは、精製を単純化するためにｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断部位と共にＨｉｓ８タグを含む（図４）。
【００６５】
アグリンの天然Ｎ末端に至るまでの、アグリンの１つまたは複数のドメインによるＮ末端における伸長を含む、ニューロトリプシンによって切断され得ないタンパク質や、加えて、ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンのグリコシル化された、または他の様式で、翻訳後に、酵素的に、もしくは化学的に改変されたタンパク質バリアントも含まれる。
【００６６】
実施例に示されているように、ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８は、ニューロトリプシンの過剰発現によって引き起こされたサルコペニア表現型を回復する能力を有する。
【００６７】
運動神経によるニューロトリプシンの不自然な高分泌は、ＬＲＰ４と複合体化されたアグリンの過剰消化を引き起こすため、ＭｕＳＫを介してＡＣｈＲクラスター形成を誘導する適切なシグナル伝達が消失する。これは、ＮＭＪの損失、その後、対応する筋線維の損失、およびサルコペニアをもたらす。ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８は、ＬＲＰ４のアゴニストとして働くことができ、ＭｕＳＫ経路を刺激する。ニューロトリプシンによる切断が起こり得ないため、その複合体は安定したままであり、シグナル伝達は長期間、維持される。これは、ＡＣｈＲの発現およびＮＭＪの維持をもたらす。ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８は、ニューロトリプシンのアクセスによって引き起こされるサルコペニアの処置に役立ち、ＮＭＪの一般的な不安定化が認められる疾患においても助けとなる可能性がある。
【００６８】
サルコペニアの処置のためのニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８の効果の根底にある新しい機構は、神経由来不適応の治療であり、筋線維または筋肉全体の代謝に影響を及ぼそうとする試みではない。
【００６９】
本発明はまた、脊髄損傷後のリハビリテーション処置のための、例えば、使用依存性治療の増強のためのニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンの使用に関する。そのような治療は、ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８により、ＡＣｈＲクラスター形成を促進するその能力のおかげで増強することができ、無傷ＮＭＪを維持し、または筋線維上の前もって形成された異所性ＡＣｈＲクラスターへの成長中の神経終末の付着を促し、運動に必要とされる新しいＮＭＪの生成を促進する。
【００７０】
さらにニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８の産生が記載され、ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８をコードするＤＮＡが適切な発現系において発現し、その後、生じたタンパク質が精製される。いくつかの原核生物および真核生物の発現系がニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８の産生および分泌に適している。原核生物発現系には、大腸菌における発現が挙げられるが、それに限定されない。真核生物発現系には、マウス骨髄腫細胞における発現、昆虫細胞におけるバキュロウイルス媒介性発現、加えて、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞における発現、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞における一過性発現、およびピキア・パストリスにおける安定発現が挙げられる。これらの系は、上清における混入タンパク質の量を低下させるための無血清条件に容易に適応でき、かつラージスケール産生に適応できるという利点をもつ。加えて、様々な細胞系を用いてもよく、それらには、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｈ９細胞、ジャーカット細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＶ１細胞、ＣＡＰ細胞、またはＳＦ細胞が挙げられる。
【００７１】
ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８の精製について、標準タンパク質精製テクノロジーが適用される。Ｈｉｓタグ付きタンパク質は、ＩＭＡＣを用いて精製することができるが、イオン交換クロマトグラフィーまたはヘパリンカラムを用いるアフィニティー精製も同様に用いることができる。アグリンのＣ末端部分に対して産生された抗体による精製もまた用いることができる。その後、溶出されたタンパク質はさらに、ヒドロキシアパタイトカラムを用いて、またはゲル濾過により精製することができる。
【００７２】
以下の実施例は、本発明を例証するが、それに限定されない。これらの実施例を読む当業者は、他の関連した条件を適用することができるであろうし、これらもまた本発明の範囲内にある。
【実施例１】
【００７３】
＜ニューロトリプシン抵抗性の４４ｋｄのヒトアグリンＣ末端断片（Ｃ４４Ｋ／Ａ）のクローニング＞
初めに、Ｎ末端ＮｔＡドメインを欠くこと以外は完全長ヒトアグリンｙ０ｚ０（ヒトアグリンｙ０ｚ０デルタＮＴＡはアクセッション番号ＮＰ＿９４０９７８のタンパク質配列における位置Ｋ１５６から始まる）を、ＰＣＲによって、ヒトカルシンテニン−１の分泌シグナルのコード配列を含むｐＥＡＫ８ベクター中に適切な制限部位およびプライマーを介してクローン化した（Ｒｅｉｆら、２００７）。ヒトアグリンについての鋳型として、ベクターｐＣＭＶ−ＸＬ５−Ａｇｒｉｎ（Ｏｒｉｇｅｎｅ ＵＳＡから購入）を用いた。
【００７４】
その後に続く２ステップにおいて、ｙ４ｚ８挿入に必要とされる対応するコドンを、標準技術を用いる部位特異的突然変異誘発により導入し、その結果として、完全長ヒトアグリンｙ４ｚ８デルタＮｔＡを含むｐＥＡＫ８ベクターが生じた。
【００７５】
このベクターを鋳型として用い、４４ｋｄのヒトアグリンＣ末端断片をコードする遺伝子を増幅し、その翻訳されたタンパク質のＮ末端にＨｉｓ８タグのコード領域およびｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断部位を導入した。
【００７６】
アグリンの切断部位βにおいてリジンのコドンの場所にアラニンのコドンを導入する、プライマーを用いる急速交換（ｑｕｉｃｋ ｃｈａｎｇｅ）突然変異誘発段階において、ニューロトリプシン抵抗型のヒトアグリンＣ４４Ｋ／Ａが生成された。
【００７７】
このプラスミドは、トランスフェクションされた細胞の培養上清において、（シグナル配列を含まずに）アグリン部分のアミノ酸がロイシン２１から始まる、配列番号４の配列を有するタンパク質を産生する。
【実施例２】
【００７８】
＜ヒトアグリンＣ４４およびニューロトリプシン抵抗性Ｃ４４Ｋ／Ａの発現および精製＞
Ｅｘｃｅｌｌ２９３培地で１×１０６細胞／ｍｌの密度まで増殖した５００ｍｌのＨＥＫ２９３細胞を、Ｓｏｒｖａｌｌ−ＲＣ５Ｃ遠心機における１００×ｇで３０分間の遠心分離によってペレット化した。３７℃に予熱された５００ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地中に細胞を再懸濁した。ニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８の発現のための１．２５ｍｇの挿入断片含有ｐＥＡＫ８を、２５ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に希釈した。２５ｋＤａの３．７５ｍｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を２５ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に希釈した。両方の溶液をプールし、室温で１０分間、インキュベートした。後で、１０００ｍｌのスピナーフラスコに移された細胞懸濁液に、この溶液を加えた。細胞懸濁液を、加湿雰囲気下の５％ＣＯ２および３７℃でのインキュベーター内に置かれた撹拌プラットフォームにおいて７５ｒｐｍで７日間、インキュベートした。
【００７９】
７日後、培養上清を、Ｓｏｒｖａｌｌ−ＲＣ５Ｃ遠心機における５００ｒｐｍでの遠心分離によって回収した。残存する粒子を、０．２２ｕｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ滅菌濾過装置による濾過によって除去した。濾過された培養上清を、ＰｅｌｌｉｃｏｎのＰＬＣＧＣ−１０ｋＤａカットオフ接線流カートリッジを用いて１０回、濃縮し、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ８．５）、４００ｍＭのＮａＣｌに対して少なくとも１：１０００で透析した。Ｎｉ２＋で標識された１０ｍｌの卓上Ｈｉｓ選択カラムを用いてＨｉｓ８タグを利用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に供した。濃縮および透析された細胞培養上清の負荷後、カラムを１００ｍｌの透析緩衝液で洗浄し、結合したタンパク質を５００ｍＭのイミダゾールを含む１０ｍｌの透析緩衝液で５回、溶出した。精製の成功の後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図Ｄ）。陽性画分をプールし、Ｓｉｇｍａ−４Ｋ１５遠心機において３０００×ｇでＡＭＩＣＯＮの３０ｋＤａカットオフ濾過装置を用いて１０回、濃縮し、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ８．５）、２００ｍＭのＮａＣｌに対して１：１００００で透析した。精製されたＣ４４Ｋ／Ａの濃度を、０．７２５ｃｍ２／ｍｇの吸光係数を用いるＵＶ分光分析法によって決定した。
【実施例３】
【００８０】
＜ｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断によるＨｉｓ８タグの除去＞
Ｈｉｓ８タグが除去されるべきである場合、０．５ｍｌのタンパク質溶液の緩衝液を５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡに、その緩衝液であらかじめ平衡化したＮＡＰ−５カラムを用いて交換した。タンパク質溶液を、１ｍｌの同じ緩衝液中に溶出した。１μｌの１Ｍ ＤＴＴをタンパク質溶液に加え、チューブを数回、指ではじくことによって混合した。２０μｌのｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（１Ｕ／μｌ）を加え、チューブを、数回、指ではじくことによって混合した。反応を、４℃で一晩、行った。０．５ｍｌの重力流グルタチオンセファロースカラムを、１ｍＭのＤＴＴを追加した５ｍｌのＰＢＳで平衡させた。消化されたタンパク質溶液を負荷し、通過画分を収集した。カラムを、１ｍＭのＤＴＴを追加した１ｍｌのＰＢＳで３回、洗浄し、その通過画分を、前の通過画分と同じチューブに収集した。収集された通過画分を、ＤＴＴおよびＥＤＴＡを除去するために、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ８．５）、４００ｍＭのＮａＣｌの５ｌに対して２時間を２回、透析した。
【００８１】
切断されたＨｉｓ８タグを除去するために、２回目のＩＭＡＣを実施した。Ｎｉ２＋イオンであらかじめ標識された１ｍｌのキレート化セファロースＦＦカラムを、５ｍｌの２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ８．５）、４００ｍＭのＮａＣｌで平衡させた。透析されたタンパク質溶液をそのカラムにアプライし、通過画分を収集した。カラムを１ｍｌの２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ８．５）、４００ｍＭのＮａＣｌで３回洗浄し、通過画分を同じチューブに収集した。プールされた画分を、ＡＭＩＣＯＮの３０ｋＤａカットオフ濃縮器で０．５ｍｌに濃縮し、緩衝液を、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ８．５）、２００ｍＭのＮａＣｌであらかじめ平衡化したＮＡＰ−５カラムを用いて交換した。濃度を、０．７２５ｃｍ２／ｍｇの吸光係数を用いるＵＶ分光分析法によって決定した。タンパク質を、さらなる実験のために新鮮な状態で用い、または使用まで−８０℃で保存した。対応するタンパク質のタンパク質配列は、グリシン１９から始まる配列番号３の部分に対応する。
【実施例４】
【００８２】
＜ヒトニューロトリプシンによるＣ４４およびＣ４４Ｋ／Ａのインビトロ消化＞
ａ）ニューロトリプシンがニューロトリプシン抵抗性ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８Ｋ／Ａを消化することができないことを実証するために、そのタンパク質をニューロトリプシンアッセイに供した。対照として、ヒトアグリンＣ４４ｙ４ｚ８を用いた。アッセイにおいて、アグリンＣ４４基質を１μＭの濃度で用い、ヒトニューロトリプシンを加えた。反応を、２０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ ８．３）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％ＰＥＧ６０００中で実施した。消化を３７℃で６時間、行った。そのセットアップを４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ−ＳＤＳゲルに負荷し、Ｓｙｐｒｏルビーで染色した（図４）。
【００８３】
ｂ）ａ）と類似したさらなるアッセイにおいて、図２ｂおよび７〜１０に示されているようなＣ４４Ｋ／Ａ断片がニューロトリプシンによって消化されないことが示された（図１１）。
【実施例５】
【００８４】
＜マウスにおけるニューロトリプシン抵抗性ヒトＣ４４Ｋ／Ａの投与＞
実験に用いられるサルコペニアマウスモデルは、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣＲＬバックグラウンドにおけるｔｈｙ−１作動性ニューロトリプシン過剰発現体（Ｓｔｅｐｈａｎら、２００８）およびそれらの野生型同腹仔である。雄および雌の両方の動物が含まれ、この年齢での若いマウスにおいて性別間で体重および筋力に違いがないためである。マウスはＰ８（生後８日目）で実験に入った。
【００８５】
群あたり３匹のマウスで、以下の３群を用いた。１．媒体処理される野生型マウス、２．Ｃ４４Ｋ／Ａで処理されるサルコペニアマウス（Ｍ４９１Ｓ）、３．媒体処理されるサルコペニアマウス。
【００８６】
マウスに、Ｃ４４Ｋ／Ａまたは媒体を６．４ｍｇ／ｋｇ／日の総用量で皮下注射する。投薬は１日目に始まり、１３日目まで続いた。実験における全てのマウスについて、体重を毎日１回、測定した。体重は、各処理群について平均され、実験日ごとにプロットされる（図５）。実験の開始時点で、サルコペニアマウスにおいて体重のわずかな低下がすでに見られる。サルコペニアのＣ４４Ｋ／Ａでの処理は、媒体処理マウスと比較して体重の有意な増加をもたらした。Ｃ４４Ｋ／Ａで処理されたサルコペニアマウスは完全に回復し、さらに野生型同腹仔に観察されたのと同じ発育であった。ヒトにおいて、虚弱患者は、１年あたり５ｋｇを超える体重減少に悩まされている（ＢａｕｅｒおよびＳｉｅｂｅｒ、２００８；Ｌａｕｒｅｔａｎｉら、２００３）。これは、全体重の約７％の損失に相当する。媒体対照で処理されたサルコペニアマウスは、著しい体重低下を示した。実験中、サルコペニアマウスは体重が約５％減少した。
【実施例６】
【００８７】
＜握力の測定＞
実施例５に記載された実験の１３日目において、前肢および後肢の握力を、精密フォースゲージにより、加えられたピークフォースを保持するデジタルフォースメーター（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ ＯＨ）で測定した。フォースメーターは頑丈な土台に固定され、フォーストランスデューサと共に、約１ｍｍの直径の三角形の引っ張り棒に接続される。データは、コンピュータとのＲＳ２３２接続を通してオンラインで収集され、Ｇｒｉｐ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ Ｍｅｔｅｒソフトウェア（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により．ｄａｔファイルで保存され、データ管理および統計解析のためにｅｘｃｅｌに転送された。最大フォースの測定についての単位としてグラム（ｇ）が用いられた。測定前、マウスを実験室に移動させ、１０分間慣れさせた。各マウスを、約３ｍｍの直径の金属棒をその前足で握るようにさせた。その後、マウスを、フォースメーターから顔を背けるように、引っ張り棒に接近させ、それの前足または後足で引っ張り棒のワイヤーを握るようにさせた。マウスを、その尾で引っ張り棒と平行にフォースメーターの方へ、約１０ｃｍ／秒の速度で引っ張った。
【００８８】
引っ張りは、マウスの前肢、それぞれ、後肢が放すまで一定の速度に保たれた。実験セッションは、後肢握力についての５回の試行からなった。試行と試行の間に、マウスに約１分間の休息時間を許した。実際の実験セッションの少なくとも１日前に、マウスを記載された手順で訓練した。各実験セッションを、望ましくない実験的バイアスを避けるために盲検方式で行った。
【００８９】
データを、以下の方法で解析した。各マウスについて、最高値および最低値を除外し、残りの３つの値を平均した。その後、データを、各処理群について平均し、媒体処理された野生型群に対して標準化した。
【００９０】
１３日目に、媒体処理されたサルコペニアマウスは、野生型と比較して約２０％の筋力を失っているが、Ｃ４４Ｋ／Ａ処理されたマウスは、媒体処理された野生型と類似した握力を有する。
【００９１】
ヒトについて、約２０歳の成人が約７０歳の個体と比較された場合、筋力の減少は約２０〜４０％であり、それは９０代の個体と比較した場合、５０％より上まで増加し得る（ＢａｕｅｒおよびＳｉｅｂｅｒ、２００８；Ｌａｕｒｅｔａｎｉら、２００３）。この実験において、本出願人らは、握力の２０％の低下が約１４日間、阻止されることを実証している。
【００９２】
アグリンの断片がインビボで活性があることが示されているのはこれが最初である。皮下投与後、タンパク質Ｃ４４Ｋ／Ａは、身体に分布し、サルコペニア様症状を患っているマウスに有益な効果を発揮した。
【実施例７】
【００９３】
＜マウスにおけるニューロトリプシン抵抗性ヒトＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａおよび（マウスアグリンＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａ）の投与＞
実験に用いられるサルコペニアマウスモデルは再び（実施例５においてのように）、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣＲＬバックグラウンドにおけるＴｈｙ−１作動性ニューロトリプシン過剰発現体（Ｓｔｅｐｈａｎら、２００８）およびそれらの野生型同腹仔である。雄および雌の両方の動物が含まれ、この年齢での若いマウスにおいて性別間で体重および筋力に違いがないためである。マウスはＰ８（生後８日目）で実験に入った。
【００９４】
群あたり４匹のマウスで、以下の４群を用いた。１．媒体処理される野生型マウス；２．Ｃ４４Ｋ／Ａ（０，８）で処理されるサルコペニアマウス（Ｍ４９１Ｓ）；３．マウスアグリンＣ４４（０，８）Ｋ／Ａで処理されるサルコペニアマウス（Ｍ４９１Ｓ）；４．媒体処理されるサルコペニアマウス。
【００９５】
マウスに、２０ｍｇ／ｋｇ／日の総用量で皮下注射する。投薬は１日目に始まり、１３日目まで続いた。実験における全てのマウスについて、体重を毎日１回、測定した。体重は、各処理群について平均され、実験日ごとにプロットされる。媒体処理された野生型と比較したパーセンテージでの相対的体重は、各処理群について示されている（図１２）。サルコペニアマウスのヒトＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／ＡまたはマウスＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａでの処理は、媒体処理されたサルコペニアマウスと比較して体重の有意な増加をもたらした。Ｃ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａで処理されたサルコペニアマウスは完全に回復し、さらに野生型同腹仔に観察されたのと同じ発育であった。ヒトにおいて、虚弱患者は、１年あたり５ｋｇを超える体重減少に悩まされている（ＢａｕｅｒおよびＳｉｅｂｅｒ、２００８；Ｌａｕｒｅｔａｎｉら、２００３）。これは、全体重の約７％の損失に相当する。媒体対照で処理されたサルコペニアマウスは、著しい体重低下を示した。実験中、サルコペニアマウスは体重が約５％減少した。
【実施例８】
【００９６】
＜握力の測定＞
測定を、実施例６に記載されているように、行った。
【００９７】
図１３ａおよび１３ｂは、媒体（媒体）またはヒトＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／ＡまたはマウスＣ４４ｙ０ｚ８Ｋ／Ａで処理されたサルコペニアマウス、および媒体で処理された野生型同腹仔（野生型媒体）についての前肢および後肢の握力を示す。握力を１３日目に測定する。異なる処理群の握力は、媒体処理された野生型同腹仔マウスに対するパーセンテージとして示されている。標準偏差はエラーバーとして示されている（各群についてＮ＝５）。
【００９８】
［文献リスト］
【表１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたはマウスのアグリンの少なくともドメインＬＧ２およびＬＧ３を、共有結合性に連結した形で含み、かつニューロトリプシンによって切断され得ないように改変された、薬物として用いるための、インビボ活性を有する改変アグリン断片。
【請求項２】
β切断部位が欠失し、または改変されていることを特徴とする、請求項１に記載の改変アグリン断片。
【請求項３】
配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の改変アグリン断片。
【請求項４】
筋肉に影響を及ぼす神経筋疾患、または神経、筋肉および神経筋接合部の疾患の処置のための医薬の製造のための、請求項１に記載のアグリン断片の使用。
【請求項５】
前記筋肉に影響を及ぼす神経筋疾患、または神経、筋肉、および神経筋接合部の疾患が、サルコペニア、筋衰弱、虚弱、筋萎縮症および筋ジストロフィー症、筋無力症、筋強直症、脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、ならびに原発性側索硬化症を含むことを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ニューロトリプシン関連疾患、特にニューロトリプシンレベルの上昇を伴う疾患の処置に用いるための、請求項１に記載の改変アグリン断片。
【請求項７】
神経筋疾患、または神経、筋肉、および神経筋接合部の疾患の処置に用いる、請求項１または６に記載の改変アグリン断片。
【請求項８】
前記神経筋疾患、または神経、筋肉、および神経筋接合部の疾患が、サルコペニア、筋衰弱、虚弱、筋萎縮症および筋ジストロフィー症、筋無力症、筋強直症、脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、ならびに原発性側索硬化症を含むことを特徴とする、請求項７に記載の改変アグリン断片。
【請求項９】
廃用性筋萎縮症または身体消耗症候群の処置に用いるための、請求項１に記載の改変アグリン断片。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のアグリン断片と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項１１】
ヒトアグリンの少なくともドメインＬＧ２およびＬＧ３を、共有結合性に連結した形で含み、かつニューロトリプシンによって切断され得ないように改変された、インビボ活性を有する改変アグリン断片。
【請求項１】
ヒトまたはマウスのアグリンの少なくともドメインＬＧ２およびＬＧ３を、共有結合性に連結した形で含み、かつニューロトリプシンによって切断され得ないように改変された、薬物として用いるための、インビボ活性を有する改変アグリン断片。
【請求項２】
β切断部位が欠失し、または改変されていることを特徴とする、請求項１に記載の改変アグリン断片。
【請求項３】
配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の改変アグリン断片。
【請求項４】
筋肉に影響を及ぼす神経筋疾患、または神経、筋肉および神経筋接合部の疾患の処置のための医薬の製造のための、請求項１に記載のアグリン断片の使用。
【請求項５】
前記筋肉に影響を及ぼす神経筋疾患、または神経、筋肉、および神経筋接合部の疾患が、サルコペニア、筋衰弱、虚弱、筋萎縮症および筋ジストロフィー症、筋無力症、筋強直症、脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、ならびに原発性側索硬化症を含むことを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ニューロトリプシン関連疾患、特にニューロトリプシンレベルの上昇を伴う疾患の処置に用いるための、請求項１に記載の改変アグリン断片。
【請求項７】
神経筋疾患、または神経、筋肉、および神経筋接合部の疾患の処置に用いる、請求項１または６に記載の改変アグリン断片。
【請求項８】
前記神経筋疾患、または神経、筋肉、および神経筋接合部の疾患が、サルコペニア、筋衰弱、虚弱、筋萎縮症および筋ジストロフィー症、筋無力症、筋強直症、脊髄性筋萎縮症、筋萎縮性側索硬化症、ならびに原発性側索硬化症を含むことを特徴とする、請求項７に記載の改変アグリン断片。
【請求項９】
廃用性筋萎縮症または身体消耗症候群の処置に用いるための、請求項１に記載の改変アグリン断片。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のアグリン断片と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項１１】
ヒトアグリンの少なくともドメインＬＧ２およびＬＧ３を、共有結合性に連結した形で含み、かつニューロトリプシンによって切断され得ないように改変された、インビボ活性を有する改変アグリン断片。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３ａ】
【図１３ｂ】
【公表番号】特表２０１３−５０３８２５（Ｐ２０１３−５０３８２５Ａ）
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２７２３３（Ｐ２０１２−５２７２３３）
【出願日】平成２２年９月１日（２０１０．９．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００５３７２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２６６１５
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５０９３０９５８１）ニューロチューン・アクチエンゲゼルシャフト (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１日（２０１０．９．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／００５３７２
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０２６６１５
【国際公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【出願人】（５０９３０９５８１）ニューロチューン・アクチエンゲゼルシャフト (2)
【Ｆターム（参考）】
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