虚血性疾患治療剤の製造方法
【課題】 効果的な虚血性疾患治療剤の製造方法を提供すること。
【解決手段】 血管内皮前駆細胞の細胞集団におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を調べ、最も多くの細胞が示す活性よりも弱い活性を示す細胞を分取して使用することを特徴とする。
【解決手段】 血管内皮前駆細胞の細胞集団におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を調べ、最も多くの細胞が示す活性よりも弱い活性を示す細胞を分取して使用することを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血性疾患治療剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
閉塞性動脈硬化症、バージャー病、狭心症、心筋梗塞などの虚血性疾患は、血管の動脈硬化に起因する病態であり、今日、我が国においては、生活の欧米化などに伴って年々増加する傾向にある。従って、虚血性疾患の治療方法については、近年、様々な研究開発が精力的に行われており、中でも血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ：ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）を用いた再生治療が注目を集めている（例えば非特許文献１）。しかしながら、この治療方法は未だ確立されておらず、血管内皮前駆細胞の基礎的研究を含めてさらなる検討が必要とされている。
【非特許文献１】Ｊ Ｊｐｎ Ｃｏｌｌ Ａｎｇｉｏｌ，２００６，４６：２７３−２８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで本発明は、効果的な虚血性疾患治療剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、血管内皮前駆細胞の細胞集団を、細胞内のアルデヒドを酸化してカルボン酸やアシル基に変換するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の高い集団と低い集団に二分すると、虚血性疾患に対する治療効果は活性の低い集団にのみ見られることを突き止めた。
【０００５】
上記の知見に基づいてなされた本発明の虚血性疾患治療剤の製造方法は、請求項１記載の通り、血管内皮前駆細胞の細胞集団におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を調べ、最も多くの細胞が示す活性よりも弱い活性を示す細胞を分取して使用することを特徴とする。
また、請求項２記載の製造方法は、請求項１記載の製造方法において、細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼと反応することにより細胞内に留まる形態を呈する光学的に検出可能な基質を細胞集団に添加した後、細胞の発光強度を指標にしてそのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性量を測定することで活性の分布を調べることを特徴とする。
また、請求項３記載の製造方法は、請求項２記載の製造方法において、発光が蛍光であることを特徴とする。
また、請求項４記載の製造方法は、請求項３記載の製造方法において、基質としてＢＯＤＩＰＹ−アミノアセトアルデヒドを用いることを特徴とする。
また、本発明の虚血性疾患治療剤は、請求項５記載の通り、血管内皮前駆細胞の細胞集団におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を調べ、最も多くの細胞が示す活性よりも弱い活性を示す細胞を有効成分とすることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、効果的な虚血性疾患治療剤の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において、血管内皮前駆細胞とは、臍帯血、骨髄、末梢血に存在し、血管新生に関与する未分化な細胞であって、血管内皮細胞表面マーカーであるＣＤ３１，ＣＤ１０５，ＣＤ３４，ＣＤ１３３，Ｆｌｋ−１，Ｆｌｔ−１に陽性で、汎血球細胞マーカーであるＣＤ４５に陰性であり、増殖能が高い細胞を意味する。血管内皮前駆細胞については、臍帯血、骨髄、末梢血から血球細胞を除き、単核細胞を単離し、そこから蛍光励起細胞分取装置（ＦＡＣＳ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いて分取することができることや、ウシ胎児血清や線維芽細胞増殖因子などを添加したＩＭＤＭなどの培地を用いて培養することができることが当業者によって知られている（必要であれば非特許文献１やその参照文献などを参照のこと）。
【０００８】
本発明の虚血性疾患の製造方法は、血管内皮前駆細胞の細胞集団におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を調べ、最も多くの細胞が示す活性よりも弱い活性を示す細胞を分取して使用することを特徴とするものであるが、これは、要すれば、血管内皮前駆細胞の細胞集団をアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の高い集団と低い集団に二分した際の活性の低い集団に含まれる細胞を分取して使用することを意味する。当該細胞の分取方法は特段制限されるものではないが、好適な方法としては、細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼと反応することにより細胞内に留まる形態を呈する光学的に検出可能な基質を細胞集団に添加した後、細胞の発光強度を指標にしてそのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性量を測定することで活性の分布を調べ、所望の細胞を分取する方法が挙げられる。この方法は、例えば、下記の化学式で表されるＢＯＤＩＰＹ（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−５−プロピオン酸）−アミノアセトアルデヒド（ＢＡＡＡ）を基質とするＡｌｄｅｆｌｕｏｒ試薬（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）を用いた細胞染色と蛍光励起細胞分取装置を用いて行うことができる。具体的には、血管内皮前駆細胞をＢＡＡＡで染色し、細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼによってＢＡＡＡをＢＯＤＩＰＹ−アミノアセテート（ＢＡＡ）に変換させることでＢＡＡアニオンとして細胞内に留まらせ、細胞内のＢＡＡアニオンに基づく蛍光強度を指標にして細胞のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性量を測定し、それをヒストグラムに展開し（蛍光強度を横軸にして細胞数を縦軸にした凸状の分布）、最も多くの細胞が示す蛍光強度よりも弱い蛍光強度を示す細胞集団（即ち凸状の分布におけるピークの左側の領域）に含まれる細胞を分取することで行うことができる（必要であればＵＳ６９９１８９７Ｂ２やＢｌｏｏｄ．２００４；１０４：１６４８−１６５５を参照のこと）。
【０００９】
【化１】
【００１０】
以上のようにして分取した所望の細胞は、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などに懸濁させ、静脈内投与などの非経口的投与を行うことによって虚血性疾患に対して優れた治療効果を発揮する。この場合、虚血性疾患治療剤の有効成分とする細胞は、患者本人のものが望ましい。その投与量は患者の年齢や体重や性別や症状などに応じて適宜決定することが望ましいが、一例を挙げれば、数週間〜数ヶ月にわたって毎週または隔週、１×１０５〜１×１０１０個／日の割合で投与することにより、細胞が疾患部位に持続的に集積した状態が維持されるようにすることが望ましい。なお、使用する細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が異なる細胞からなる細胞集団であってもよいし、単一のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を示すクローン細胞であってもよい。いずれの細胞を使用しても虚血性疾患の効果的な治療を行うことができるので、その調製段階における臍帯血、骨髄、末梢血からの細胞の採取や、細胞の培養などについての負担軽減化を図ることができる。
【実施例】
【００１１】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。なお、以下の実施例では、血管内皮前駆細胞をＥＰＣと略称する。
【００１２】
（１）ＥＰＣの単離および培養
国立大学法人筑波大学倫理規則の厳守のもと、ヒト臍帯血より血球細胞を除き、単核細胞を単離し、ＩＭＤＭに１０％ＦＢＳおよびｂ−ＦＧＦ１０ｎｇ／ｍｌを添加した培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養し、蛍光励起細胞分取装置（ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて増殖性の高いＥＰＣを採取した（必要であれば非特許文献１やその参照文献などを参照のこと）。
【００１３】
（２）アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に従ったＥＰＣの分離
ＢＡＡＡを基質とするＡｌｄｅｆｌｕｏｒ試薬（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）を用い、その取扱説明書に従ってＥＰＣを染色した後、蛍光励起細胞分取装置（同上）にかけ、図１に示すように、前方散乱光（ＦＳＣ）を横軸にして側方散乱光（ＳＳＣ）を縦軸にしたスキャッタグラムを作成し、ＥＰＣの細胞集団領域に対するゲート設定をＲ１のようにして行い、細胞の蛍光強度と細胞数の関係をヒストグラムに展開して細胞集団の蛍光強度の分布を調べ、蛍光強度を横軸（Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ）にして細胞数を縦軸（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ）にした凸状の分布からアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の高い細胞集団（Ａｌｄｅ−Ｈｉｇｈ）と低い細胞集団（Ａｌｄｅ−Ｌｏｗ）を分取した（図１におけるＡｌｄｅｆｌｕｏｒ ａｌｏｎｅで示される実線，Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ＋Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒで示される破線はアルデヒドデヒドロゲナーゼの特異的阻害剤であるジエチルアミノベンズアルデヒドを添加して行ったネガティブコントロール）。細胞数頻度はＡｌｄｅ−Ｈｉｇｈが２４．６±９．４％、Ａｌｄｅ−Ｌｏｗが３７．３±１．５％であった（ｎ＝３）。
【００１４】
（３）ＡＬＤＥ−ＨｉｇｈとＡＬＤＥ−Ｌｏｗの虚血性疾患に対する治療効果
Ｃ５７／ＢＬ６とＩＣＲが混合した遺伝的背景を持つ成体マウスに対し、試験開始の２日前から試験終了までシクロスポリンＡを２０ｍｇ／ｋｇ体重（溶媒はＰＢＳ）で１日１回腹腔内投与することで免疫抑制を行った。試験は、背部に３ｃｍ×２ｃｍの半島状の切り込みを入れたマウスに、ＧＦＰラベル化したＡｌｄｅ−ＨｉｇｈとＡｌｄｅ−Ｌｏｗ（いずれもＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰに感染させることによって調製）をそれぞれ５×１０５ｃｅｌｌｓ／マウス（溶媒はＰＢＳ）で尾静脈投与するとともに、対照群としてＰＢＳのみを尾静脈投与し、７日後の切り込み部（虚血性病変部）の回復状況を観察することで行った（必要であればＣｉｒｃ Ｒｅｓ．２００３；９３：ｅ５１−６２およびＮａｔ Ｍｅｄ．２００４；１０：８５８−８６４を参照のこと）。それぞれの投与群の試験結果を図２に示す（各群２頭ずつ）。図２から明らかなように、Ａｌｄｅ−Ｌｏｗ投与群では、Ａｌｄｅ−Ｈｉｇｈ投与群とＰＢＳ投与群に比較して顕著な切り込み部の回復効果が見られた。
また、７日後のそれぞれの投与群のマウスの切り込み部の壊死領域割合（Ｎｅｃｒｏｔｉｃ ａｒｅａ）を測定した結果を図３に示す（ｎ＝３）。図３から明らかなように、Ａｌｄｅ−Ｌｏｗ投与群は、Ａｌｄｅ−Ｈｉｇｈ投与群とＰＢＳ投与群に対して有意に壊死領域割合が減少した（＊＊Ｐ＜０．０１）。
さらに、Ａｌｄｅ−Ｌｏｗ投与群の７日後の切り込み部における血管新生状況を、ＧＦＰ陽性ＥＰＣの局在の蛍光観察とテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）結合レクチンを用いた染色による蛍光観察により評価した。また、Ａｌｄｅ−Ｈｉｇｈ投与群とＡｌｄｅ−Ｌｏｗ投与群の７日後の切り込み部に遊走したＧＦＰ陽性ＥＰＣの個数を測定した。結果を図４に示す。図４から明らかなように、Ａｌｄｅ−Ｌｏｗ投与群の７日後の切り込み部にはＧＦＰ陽性ＥＰＣの集積が見られ（図４左上：ＧＦＰ）、その局在部分の少なくとも一部はＴＲＩＴＣ陽性毛細血管に相当していた（同左下：ＧＦＰ／ＴＲＩＴＣ−Ｌｅｃｔｉｎ矢印部分，Ｂａｒは１００μｍを示す）。また、Ａｌｄｅ−Ｌｏｗ投与群は、Ａｌｄｅ−Ｈｉｇｈ投与群に対して有意に切り込み部に遊走したＧＦＰ陽性ＥＰＣの個数（Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＧＦＰ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ）が多かった（同右，＊Ｐ＜０．０５）。
Ａｌｄｅ−ＨｉｇｈとＡｌｄｅ−Ｌｏｗは、細胞表面マーカーの発現に差が見られないが（別途の試験にて確認）、唯一、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の違いにより大別され、Ａｌｄｅ−Ｌｏｗのみが虚血性病変部に遊走して血管新生を誘発し、虚血組織の回復に寄与することは驚くべき事実であった。
【産業上の利用可能性】
【００１５】
本発明は、効果的な虚血性疾患治療剤の製造方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例におけるＦＡＣＳによるＡｌｄｅ−ＨｉｇｈとＡｌｄｅ−Ｌｏｗの分離に関するチャートである。
【図２】同、Ａｌｄｅ−ＨｉｇｈとＡｌｄｅ−Ｌｏｗの虚血性疾患に対する治療効果を示すマウスの写真である。
【図３】同、Ａｌｄｅ−ＨｉｇｈとＡｌｄｅ−Ｌｏｗの虚血性疾患に対する治療効果の虚血性病変部の壊死領域割合に基づく評価結果を示すグラフである。
【図４】同、虚血性病変部への遊走特性に基づく評価結果を示す蛍光顕微鏡写真とグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血性疾患治療剤の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
閉塞性動脈硬化症、バージャー病、狭心症、心筋梗塞などの虚血性疾患は、血管の動脈硬化に起因する病態であり、今日、我が国においては、生活の欧米化などに伴って年々増加する傾向にある。従って、虚血性疾患の治療方法については、近年、様々な研究開発が精力的に行われており、中でも血管内皮前駆細胞（ＥＰＣ：ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）を用いた再生治療が注目を集めている（例えば非特許文献１）。しかしながら、この治療方法は未だ確立されておらず、血管内皮前駆細胞の基礎的研究を含めてさらなる検討が必要とされている。
【非特許文献１】Ｊ Ｊｐｎ Ｃｏｌｌ Ａｎｇｉｏｌ，２００６，４６：２７３−２８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
そこで本発明は、効果的な虚血性疾患治療剤の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、血管内皮前駆細胞の細胞集団を、細胞内のアルデヒドを酸化してカルボン酸やアシル基に変換するアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の高い集団と低い集団に二分すると、虚血性疾患に対する治療効果は活性の低い集団にのみ見られることを突き止めた。
【０００５】
上記の知見に基づいてなされた本発明の虚血性疾患治療剤の製造方法は、請求項１記載の通り、血管内皮前駆細胞の細胞集団におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を調べ、最も多くの細胞が示す活性よりも弱い活性を示す細胞を分取して使用することを特徴とする。
また、請求項２記載の製造方法は、請求項１記載の製造方法において、細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼと反応することにより細胞内に留まる形態を呈する光学的に検出可能な基質を細胞集団に添加した後、細胞の発光強度を指標にしてそのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性量を測定することで活性の分布を調べることを特徴とする。
また、請求項３記載の製造方法は、請求項２記載の製造方法において、発光が蛍光であることを特徴とする。
また、請求項４記載の製造方法は、請求項３記載の製造方法において、基質としてＢＯＤＩＰＹ−アミノアセトアルデヒドを用いることを特徴とする。
また、本発明の虚血性疾患治療剤は、請求項５記載の通り、血管内皮前駆細胞の細胞集団におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を調べ、最も多くの細胞が示す活性よりも弱い活性を示す細胞を有効成分とすることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００６】
本発明によれば、効果的な虚血性疾患治療剤の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明において、血管内皮前駆細胞とは、臍帯血、骨髄、末梢血に存在し、血管新生に関与する未分化な細胞であって、血管内皮細胞表面マーカーであるＣＤ３１，ＣＤ１０５，ＣＤ３４，ＣＤ１３３，Ｆｌｋ−１，Ｆｌｔ−１に陽性で、汎血球細胞マーカーであるＣＤ４５に陰性であり、増殖能が高い細胞を意味する。血管内皮前駆細胞については、臍帯血、骨髄、末梢血から血球細胞を除き、単核細胞を単離し、そこから蛍光励起細胞分取装置（ＦＡＣＳ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）を用いて分取することができることや、ウシ胎児血清や線維芽細胞増殖因子などを添加したＩＭＤＭなどの培地を用いて培養することができることが当業者によって知られている（必要であれば非特許文献１やその参照文献などを参照のこと）。
【０００８】
本発明の虚血性疾患の製造方法は、血管内皮前駆細胞の細胞集団におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を調べ、最も多くの細胞が示す活性よりも弱い活性を示す細胞を分取して使用することを特徴とするものであるが、これは、要すれば、血管内皮前駆細胞の細胞集団をアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の高い集団と低い集団に二分した際の活性の低い集団に含まれる細胞を分取して使用することを意味する。当該細胞の分取方法は特段制限されるものではないが、好適な方法としては、細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼと反応することにより細胞内に留まる形態を呈する光学的に検出可能な基質を細胞集団に添加した後、細胞の発光強度を指標にしてそのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性量を測定することで活性の分布を調べ、所望の細胞を分取する方法が挙げられる。この方法は、例えば、下記の化学式で表されるＢＯＤＩＰＹ（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−５−プロピオン酸）−アミノアセトアルデヒド（ＢＡＡＡ）を基質とするＡｌｄｅｆｌｕｏｒ試薬（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）を用いた細胞染色と蛍光励起細胞分取装置を用いて行うことができる。具体的には、血管内皮前駆細胞をＢＡＡＡで染色し、細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼによってＢＡＡＡをＢＯＤＩＰＹ−アミノアセテート（ＢＡＡ）に変換させることでＢＡＡアニオンとして細胞内に留まらせ、細胞内のＢＡＡアニオンに基づく蛍光強度を指標にして細胞のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性量を測定し、それをヒストグラムに展開し（蛍光強度を横軸にして細胞数を縦軸にした凸状の分布）、最も多くの細胞が示す蛍光強度よりも弱い蛍光強度を示す細胞集団（即ち凸状の分布におけるピークの左側の領域）に含まれる細胞を分取することで行うことができる（必要であればＵＳ６９９１８９７Ｂ２やＢｌｏｏｄ．２００４；１０４：１６４８−１６５５を参照のこと）。
【０００９】
【化１】
【００１０】
以上のようにして分取した所望の細胞は、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などに懸濁させ、静脈内投与などの非経口的投与を行うことによって虚血性疾患に対して優れた治療効果を発揮する。この場合、虚血性疾患治療剤の有効成分とする細胞は、患者本人のものが望ましい。その投与量は患者の年齢や体重や性別や症状などに応じて適宜決定することが望ましいが、一例を挙げれば、数週間〜数ヶ月にわたって毎週または隔週、１×１０５〜１×１０１０個／日の割合で投与することにより、細胞が疾患部位に持続的に集積した状態が維持されるようにすることが望ましい。なお、使用する細胞は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性が異なる細胞からなる細胞集団であってもよいし、単一のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を示すクローン細胞であってもよい。いずれの細胞を使用しても虚血性疾患の効果的な治療を行うことができるので、その調製段階における臍帯血、骨髄、末梢血からの細胞の採取や、細胞の培養などについての負担軽減化を図ることができる。
【実施例】
【００１１】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。なお、以下の実施例では、血管内皮前駆細胞をＥＰＣと略称する。
【００１２】
（１）ＥＰＣの単離および培養
国立大学法人筑波大学倫理規則の厳守のもと、ヒト臍帯血より血球細胞を除き、単核細胞を単離し、ＩＭＤＭに１０％ＦＢＳおよびｂ−ＦＧＦ１０ｎｇ／ｍｌを添加した培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で培養し、蛍光励起細胞分取装置（ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて増殖性の高いＥＰＣを採取した（必要であれば非特許文献１やその参照文献などを参照のこと）。
【００１３】
（２）アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性に従ったＥＰＣの分離
ＢＡＡＡを基質とするＡｌｄｅｆｌｕｏｒ試薬（ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ）を用い、その取扱説明書に従ってＥＰＣを染色した後、蛍光励起細胞分取装置（同上）にかけ、図１に示すように、前方散乱光（ＦＳＣ）を横軸にして側方散乱光（ＳＳＣ）を縦軸にしたスキャッタグラムを作成し、ＥＰＣの細胞集団領域に対するゲート設定をＲ１のようにして行い、細胞の蛍光強度と細胞数の関係をヒストグラムに展開して細胞集団の蛍光強度の分布を調べ、蛍光強度を横軸（Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ）にして細胞数を縦軸（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ）にした凸状の分布からアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の高い細胞集団（Ａｌｄｅ−Ｈｉｇｈ）と低い細胞集団（Ａｌｄｅ−Ｌｏｗ）を分取した（図１におけるＡｌｄｅｆｌｕｏｒ ａｌｏｎｅで示される実線，Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ＋Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒで示される破線はアルデヒドデヒドロゲナーゼの特異的阻害剤であるジエチルアミノベンズアルデヒドを添加して行ったネガティブコントロール）。細胞数頻度はＡｌｄｅ−Ｈｉｇｈが２４．６±９．４％、Ａｌｄｅ−Ｌｏｗが３７．３±１．５％であった（ｎ＝３）。
【００１４】
（３）ＡＬＤＥ−ＨｉｇｈとＡＬＤＥ−Ｌｏｗの虚血性疾患に対する治療効果
Ｃ５７／ＢＬ６とＩＣＲが混合した遺伝的背景を持つ成体マウスに対し、試験開始の２日前から試験終了までシクロスポリンＡを２０ｍｇ／ｋｇ体重（溶媒はＰＢＳ）で１日１回腹腔内投与することで免疫抑制を行った。試験は、背部に３ｃｍ×２ｃｍの半島状の切り込みを入れたマウスに、ＧＦＰラベル化したＡｌｄｅ−ＨｉｇｈとＡｌｄｅ−Ｌｏｗ（いずれもＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰに感染させることによって調製）をそれぞれ５×１０５ｃｅｌｌｓ／マウス（溶媒はＰＢＳ）で尾静脈投与するとともに、対照群としてＰＢＳのみを尾静脈投与し、７日後の切り込み部（虚血性病変部）の回復状況を観察することで行った（必要であればＣｉｒｃ Ｒｅｓ．２００３；９３：ｅ５１−６２およびＮａｔ Ｍｅｄ．２００４；１０：８５８−８６４を参照のこと）。それぞれの投与群の試験結果を図２に示す（各群２頭ずつ）。図２から明らかなように、Ａｌｄｅ−Ｌｏｗ投与群では、Ａｌｄｅ−Ｈｉｇｈ投与群とＰＢＳ投与群に比較して顕著な切り込み部の回復効果が見られた。
また、７日後のそれぞれの投与群のマウスの切り込み部の壊死領域割合（Ｎｅｃｒｏｔｉｃ ａｒｅａ）を測定した結果を図３に示す（ｎ＝３）。図３から明らかなように、Ａｌｄｅ−Ｌｏｗ投与群は、Ａｌｄｅ−Ｈｉｇｈ投与群とＰＢＳ投与群に対して有意に壊死領域割合が減少した（＊＊Ｐ＜０．０１）。
さらに、Ａｌｄｅ−Ｌｏｗ投与群の７日後の切り込み部における血管新生状況を、ＧＦＰ陽性ＥＰＣの局在の蛍光観察とテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）結合レクチンを用いた染色による蛍光観察により評価した。また、Ａｌｄｅ−Ｈｉｇｈ投与群とＡｌｄｅ−Ｌｏｗ投与群の７日後の切り込み部に遊走したＧＦＰ陽性ＥＰＣの個数を測定した。結果を図４に示す。図４から明らかなように、Ａｌｄｅ−Ｌｏｗ投与群の７日後の切り込み部にはＧＦＰ陽性ＥＰＣの集積が見られ（図４左上：ＧＦＰ）、その局在部分の少なくとも一部はＴＲＩＴＣ陽性毛細血管に相当していた（同左下：ＧＦＰ／ＴＲＩＴＣ−Ｌｅｃｔｉｎ矢印部分，Ｂａｒは１００μｍを示す）。また、Ａｌｄｅ−Ｌｏｗ投与群は、Ａｌｄｅ−Ｈｉｇｈ投与群に対して有意に切り込み部に遊走したＧＦＰ陽性ＥＰＣの個数（Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＧＦＰ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌｓ）が多かった（同右，＊Ｐ＜０．０５）。
Ａｌｄｅ−ＨｉｇｈとＡｌｄｅ−Ｌｏｗは、細胞表面マーカーの発現に差が見られないが（別途の試験にて確認）、唯一、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の違いにより大別され、Ａｌｄｅ−Ｌｏｗのみが虚血性病変部に遊走して血管新生を誘発し、虚血組織の回復に寄与することは驚くべき事実であった。
【産業上の利用可能性】
【００１５】
本発明は、効果的な虚血性疾患治療剤の製造方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】実施例におけるＦＡＣＳによるＡｌｄｅ−ＨｉｇｈとＡｌｄｅ−Ｌｏｗの分離に関するチャートである。
【図２】同、Ａｌｄｅ−ＨｉｇｈとＡｌｄｅ−Ｌｏｗの虚血性疾患に対する治療効果を示すマウスの写真である。
【図３】同、Ａｌｄｅ−ＨｉｇｈとＡｌｄｅ−Ｌｏｗの虚血性疾患に対する治療効果の虚血性病変部の壊死領域割合に基づく評価結果を示すグラフである。
【図４】同、虚血性病変部への遊走特性に基づく評価結果を示す蛍光顕微鏡写真とグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管内皮前駆細胞の細胞集団におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を調べ、最も多くの細胞が示す活性よりも弱い活性を示す細胞を分取して使用することを特徴とする虚血性疾患治療剤の製造方法。
【請求項２】
細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼと反応することにより細胞内に留まる形態を呈する光学的に検出可能な基質を細胞集団に添加した後、細胞の発光強度を指標にしてそのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性量を測定することで活性の分布を調べることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
発光が蛍光であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
基質としてＢＯＤＩＰＹ−アミノアセトアルデヒドを用いることを特徴とする請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
血管内皮前駆細胞の細胞集団におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を調べ、最も多くの細胞が示す活性よりも弱い活性を示す細胞を有効成分とすることを特徴とする虚血性疾患治療剤。
【請求項１】
血管内皮前駆細胞の細胞集団におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を調べ、最も多くの細胞が示す活性よりも弱い活性を示す細胞を分取して使用することを特徴とする虚血性疾患治療剤の製造方法。
【請求項２】
細胞内のアルデヒドデヒドロゲナーゼと反応することにより細胞内に留まる形態を呈する光学的に検出可能な基質を細胞集団に添加した後、細胞の発光強度を指標にしてそのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性量を測定することで活性の分布を調べることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
発光が蛍光であることを特徴とする請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
基質としてＢＯＤＩＰＹ−アミノアセトアルデヒドを用いることを特徴とする請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
血管内皮前駆細胞の細胞集団におけるアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の分布を調べ、最も多くの細胞が示す活性よりも弱い活性を示す細胞を有効成分とすることを特徴とする虚血性疾患治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−２９０９６１（Ｐ２００８−２９０９６１Ａ）
【公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１３７０９１（Ｐ２００７−１３７０９１）
【出願日】平成１９年５月２３日（２００７．５．２３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００７年３月２２日 ｈｔｔｐ：／／ｂｌｏｏｄｊｏｕｒｎａｌ．ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙｌｉｂｒａｒｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ａｂｓｔｒａｃｔ／ｂｌｏｏｄｊｏｕｒｎａｌ；ｂｌｏｏｄ−２００６−１０−０４７０９２を通じて発表
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月２３日（２００７．５．２３）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００７年３月２２日 ｈｔｔｐ：／／ｂｌｏｏｄｊｏｕｒｎａｌ．ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙｌｉｂｒａｒｙ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ａｂｓｔｒａｃｔ／ｂｌｏｏｄｊｏｕｒｎａｌ；ｂｌｏｏｄ−２００６−１０−０４７０９２を通じて発表
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【Ｆターム（参考）】
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