蛍光コバラミンおよびその使用
【課題】蛍光コバラミンおよびこれらの化合物の使用する方法を提供する。
【解決手段】コバラミンに共有結合した蛍光、リン光、ルミネセントまたは光−発生化合物を含む蛍光コバラミン。これらの蛍光コバラミンは、（ａ）癌細胞を含むリンパ節の同定を含め、癌細胞および組織を健康な細胞および組織から区別し、および（ｂ）コバラミン−療法バイオコンジュゲートを用いる化学療法に個体が陽性的に応答するかを判断するために診断および予後マーカーとして用いることができる。
【解決手段】コバラミンに共有結合した蛍光、リン光、ルミネセントまたは光−発生化合物を含む蛍光コバラミン。これらの蛍光コバラミンは、（ａ）癌細胞を含むリンパ節の同定を含め、癌細胞および組織を健康な細胞および組織から区別し、および（ｂ）コバラミン−療法バイオコンジュゲートを用いる化学療法に個体が陽性的に応答するかを判断するために診断および予後マーカーとして用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，メリーランド州から与えられた補助金番号Ｒ０１ＣＡ７３００３およびＣＡ８７６８５下、部分的には政府の支援でなされた。合衆国政府は本発明においてある種の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は、（ここではＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒｓという場合もある）蛍光コバラミンおよびこれらの化合物の使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、コバラミンに共有結合した蛍光、リン光、ルミネセント、光−発生化合物よりなる蛍光コバラミンに関する。これらの蛍光コバラミンは、（ａ）癌細胞を含むリンパ節の同定を含め、健康な細胞および組織から癌細胞および組織を区別し、および（ｂ）コバラミン−ベースの治療バイオコンジュゲートを用いる化学療法に個体が陽性的に応答するかを判断するための診断および予後マーカーとして用いることができる。
【０００３】
発明の背景を明らかにし、特定の場合には、実施に関してさらに詳細を供するために本明細書中で用いる刊行物および他の資料は引用により本明細書の一部と見なし、便宜のため、以下の本文においては、著者および日付によって参照し、添付のビブリオグラフィーにおいて著者によりアルファベット順にリストする。
【０００４】
迅速に分裂する細胞は、ＤＮＡ複製に先立って一炭素代謝を支持するために酵素メチオニンシンターゼのための補因子としてコバラミンを必要とする。（Ｈｏｇｅｎｋａｍｐら、１９９９）。急性前骨髄球白血病においては、Ｂ１２結合蛋白質であるトランスコバラミンおよびハプトコリンの濃度の増加のため、血液の不飽和Ｂ１２結合能力の３ないし２６倍の増加が観察される（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９８７；Ｒａｃｈｉｍｅｌｗｉｔｚら，１９７１）。また、固体腫瘍を持つある患者は、トランスコバラミンおよびハプトコリンの循環レベルの有意な増加を呈する（Ｃａｒｍｅｌら．１９７５）。不飽和血清コバラミン結合能力の増加は、迅速に分裂する細胞によるコバラミンの取込増加に対応する。もし１１１Ｉｎのごときガンマ線放出放射性核種を八座キレーターであるジエチレントリアミン四酢酸（ＤＴＰＡ）を介してコバラミンに結合させると、腫瘍は、診断イメージング目的の十分なコバラミンでさえ、隔離する（ＨｏｇｅｎｋａｍｐおよびＣｏｌｌｉｎｓ，１９９７）。これは、移植された線維肉腫を持つマウスにおいて（ＨｏｇｅｎｋａｍｐおよびＣｏｌｌｉｎｓ，１９９７）ならびに乳癌を持つヒトにおいて（Ｃｏｌｌｉｎｓら，１９９９）、および前立腺、肺および脳の腫瘍において（Ｃｏｌｌｉｎｓら，２０００）示されている。
【０００５】
黒色腫および乳癌の外科処置のためのセンチネルリンパ節概念において、色素または放射性核種を腫瘍の周りの組織に注入して、腫瘍を排出する最初のリンパ節を同定する（Ｍｏｒｔｏｎら，１９９２；ＭｃＧｒｅｅｖｙ，１９９８）。この節はセンチネル節と呼ばれ、それは、初代腫瘍を超える転移の程度を測定するために診断テストで取り出される。この手法は議論を呼んでいる。というのも、それは患者の約１２％において転移性病気を検出しないからである（ＭｃＭａｓｔｅｒｓら，１９９９）。注入される色素または放射性核種は癌細胞に対して特異的ではないが、外科医は、腫瘍の領域を排出する初代リンパ節を同定するに過ぎない。癌細胞に特異的な蛍光マーカーを用いることによって高偽陰性率は劇的に改良されるはずである。
【０００６】
かくして、改良された結果を伴って、癌細胞または細胞の診断および予後で用いることができる剤に対する要望が存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、蛍光コバラミンおよびそれらの化合物の使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、コバラミンに共有結合した蛍光、リン光、ルミネセント、または光−発生化合物よりなる蛍光コバラミンに関する。これらの蛍光コバラミンは、（ａ）癌細胞を含むリンパ節の同定を含め、健康な細胞および組織から癌細胞および組織を区別するために、および（ｂ）コバラミン−治療バイオコンジュゲートを用いる化学療法に個体が陽性的に応答するかを判断するために、診断および予後マーカーとして用いることができる。本発明の蛍光コバラミンは、（１）癌細胞による迅速な輸送および貯蔵（最大取込は４ないし６時間において起こる）、（２）非常に低い濃度にて肉眼で検出できる明るいリン光、および（３）非毒性成分の必要な特性を供給する。
【０００８】
本発明の一つの態様において、蛍光、リン光、ルミネセントまたは光−発生化合物がコバラミン（ビタミンＢ１２）に共有結合した蛍光コバラミンが提供される。該蛍光、リン光または光−発生化合物は、コバルト原子、コリン環、またはコバラミンのリボース部位に共有結合することができる。該蛍光、リン光、ルミネセントまたは光−発生化合物はコリン環またはリボース部位に共有結合されるのが好ましい。いずれの蛍光、リン光、ルミネセントまたは光−発生化合物も蛍光コバラミンを調製するのに利用することができるが、可視光線または赤外線で励起できる蛍光、リン光、ルミネセントまたは光−発生化合物を利用するのが好ましい。好ましい蛍光化合物の例は限定されるものではないが、フルオレセイン、フルオレセイン−５ＥＸ、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ、Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、カスケードブルー、ダンシル、ジアルキルアミノクマリン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、２’，７’−ジクロロフルオレセイン、エオシン、エオシンＦ３Ｓ、エリスロシン、ヒドロキシクマリン、リサミンローダミンＢ、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、ＮＢＤ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ロドールグリーン、２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオレセイン、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テキサスレッド、Ｘ−ローダミン、Ｃｙ２色素、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、Ｃｙ５．５色素、または量子ドット構造体を含む。本発明の好ましい蛍光コバラミンは、コバラミンから蛍光またはリン光化合物を分離する必要性なくして可視光線または赤外光によって励起されると蛍光を発する。該光は適当なフィルターを備えたレーザーまたはファイバーオプティック光源によって供することができる。良好な組織への侵入のためには、赤色光が好ましい。
【０００９】
本発明の第２の態様において、蛍光コバラミンを用いて癌細胞を健康な細胞から区別する。本発明のこの態様の１つの具体例において、外科的処置に先立って、蛍光コバラミンを患者に投与する。初代腫瘍におけるか転移性部位におけるかを問わず、癌細胞における蛍光、リン光、ルミネセンスまたは発せられた光の存在は、外科医が組織を規定するのに用いられる。第２の具体例において、腫瘍の位置を排出するリンパ節による取込に適したように蛍光コバラミンは患者に投与される。蛍光、リン光、ルミネセンスまたは発せられた光の存在は、外科的処置の間に除去すべきリンパ節を同定する。この後者の具体例おいて、腹腔鏡検査、内視鏡および顕微鏡技術を用いて、癌細胞を持つリンパ節を同定することができる。これらの技術の使用は陽性リンパ節の同定および検索を容易とする。
【００１０】
本発明の第３の態様において、蛍光コバラミンを用いて、コバラミン−ベースの治療バイオコンジュケートを用いる化学療法に個体が陽性的に応答するかを判断する。この態様においては、蛍光コバラミンを用いて、コバラミンを輸送し、貯蔵する特定の細胞型の能力を定量的におよび定性的に評価する。大量のコバラミンを輸送し貯蔵する種々のタイプの癌は、コバラミン−ベースの治療バイオコンジュゲートでの療法のための良好な候補である。腫瘍細胞コバラミン結合、取込、輸送および貯蔵の定量は、エピ蛍光顕微鏡、蛍光腹腔鏡検査、蛍光内視鏡検査またはフルオロサイトメトによって、肉眼での観察下にて蛍光を測定することによって（例えば、組織スライド）行うことができる。
【００１１】
本発明の第４の態様において、蛍光コバラミンを用いて、血液、血漿、血清、脳脊髄液または尿中のコバラミンのレベルを測定し、または血液、血漿、血清または脳脊髄液における未結合コバラミン結合能力の量を測定する。
【００１２】
本発明の第５の態様において、腹腔鏡または内視鏡可視化用い、いずれの蛍光分子(癌−標的化または非標的化）も検出することができる。
【００１３】
発明の詳細な記載
本発明は、蛍光コバラミンおよびこれらの化合物の使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、コバラミン（ビタミンＢ１２）に共有結合した蛍光化合物（フルオロフォア）、リン光化合物（ホスホロフォア）、ルミネセント化合物（ケミルミネセントクロモフォア）または光−発生化合物を含む蛍光コバラミンに関する。これらの蛍光コバラミンは、（ａ）癌細胞を含むリンパ節の同定を含め、健康な細胞および組織から癌細胞および癌性組織を区別し、および（ｂ）コバラミン−治療バイオコンジュゲートを用いる化学療法に個体が陽性的に応答するかを決定するために診断および予後マーカーとして用いることができる。
本発明の蛍光コバラミンは、一般式：
【００１４】
【化１】
【００１５】
［Ｒ１はＣＮ、ＯＨ、ＯＨ２、ＣＨ３、５’−デオキシアデノシンまたは（ＣＨ２）ｐＮＨＣ（＝Ｓ）Ｙであり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立してＣＯＮＨ２またはＣＯ−ＸｍＹであり；Ｒ８はＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；Ｒ９はＯＨまたはＯ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；Ｘは式Ｎ（ＣＨ２）ｎＮＨＯ（Ｃ＝Ｏ）またはＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨを有するリンカーであり；Ｙはフルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子であり；ｍは０または１であり、ｎは０ないし５０であって、ｐは２ないし１０であり、但し、Ｒ１ないしＲ９の基のうちの少なくとも１つはＹを含み、さらに、
Ｒ１がＣＮ、ＯＨ、ＯＨ２、ＣＨ３、５’−デオキシアデノシンまたは（ＣＨ２）ｐＮＨＣ（＝Ｓ）Ｙであり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７が独立してＣＯＮＨ２またはＣＯ−ＸｍＹであり；Ｒ９がＯＨまたはＯ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；ｍが１であり；ＸがＮ（ＣＨ２）ｎＮＨＯ（Ｃ＝Ｏ）であって；Ｒ１ないしＲ７およびＲ９の基のうちの少なくとも１つがＹを含む場合、Ｒ８はＣＨ２ＯＨではなく；かつ
Ｒ１がＣＮ、ＯＨ、ＯＨ２、ＣＨ３、５’−デオキシアデノシンまたは（ＣＨ２）ｐＮＨＣ（＝Ｓ）Ｙであり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７が独立してＣＯＮＨ２またはＣＯ−ＸｍＹであり；Ｒ９がＯＨまたはＯ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；ｍが０であって；Ｒ１ないしＲ７およびＲ９の基のうちの少なくとも１つがＹを含む場合、Ｒ８はＣＨ２ＯＨではない］
によって表すことができる。少なくともＲ８はＹを含むことが好ましい。
【００１６】
本発明の蛍光コバラミンは、フルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子をコバラミンに共有結合させることによって調製される。該フルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子は、直接的にまたはリンカー分子を介して、コバルト原子、コリン環またはリボース糖に共有結合される。共有結合は、好ましくは、リンカー分子の使用で達成される。該フルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子がコバラミンのコバルト原子に結合すれば、コバルト原子のスピンによる消光を介して、蛍光、リン光または発せられた光はその強度が減少する。加えて、蛍光コバラミンが光に長く暴露されると、コバルト−炭素結合が切断され、フルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子がコバラミンから放出される（Ｈｏｗａｒｄら，１９９７）。かくして、フルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子をコバラミン分子のコリン環またはリボース部位に結合させるのが好ましい。これらの後者の蛍光コバラミンは、フルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子がコバルト原子に共有結合した蛍光コバラミンの不利な点を有しない。
【００１７】
フルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子のコリン環または５’−リボースヒドロキシ基上のカルボキシレートへの結合は、より低い感度および光不安定性の問題を回避する。一般に、コリン環カルボキシレート誘導体（ＣｏｌｌｉｎｓおよびＨｏｇｅｎｋａｍｐ，１９９７）は知られているが、蛍光マーカーを含む化合物は合成されていない。フルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子は、公表された方法に従ってコバラミンモノカルボキシレートを誘導体化することによって、コバルト原子よりはむしろ、コリン環に直接結合させることができる（ＣｏｌｌｉｎｓおよびＨｏｇｅｎｋａｍｐ，１９９７およびそこに引用された文献）。図１は、本発明による修飾で用いることができるコバラミン上の部位を示す。
【００１８】
いずれのフルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子も蛍光コバラミンを調製するのに利用することができるが、可視光または赤外光で励起することができるフルオロフォアを利用するのが好ましい。蛍光コバラミンのイン・ビボ使用では、可視光または赤外光を用いるのが好ましい。好ましいフルオロフォアの例は、限定されるものではないが、フルオレセイン、フルオレセイン−５ＥＸ、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、カスケードブルー、ダンシル、ジアルキルアミノクマリン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオセレイン、２’，７’−ジクロロフルオレセイン、エオシン、エオシンＦ３Ｓ、エリスロシン、ヒドロキシクマリン、リサミンローダミンＢ、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、ＮＢＤ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ロドールグリーン、２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオレセイン、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テキサスレッド、Ｘ−ローダミン、Ｃｙ２色素、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、Ｃｙ５．５色素、または量子ドット構造体を含む。本発明の好ましいフルオレセインは、フルオロフォアをバイオコンジュゲートから切断する必要性なくして、可視光または赤外光によって励起されると蛍光を発する。該光は、適当なフィルターを設けたレーザーまたはファイバーオプティック光源によって供することができる。良好な組織への侵入のためには赤色光が好ましい。
【００１９】
正常および白血病人骨髄において蛍光コバラミンアナログの異なる取込があることが判明した。正常骨髄細胞および白血病骨髄芽細胞（癌細胞）の間の差は特に注目すべきであり、正常細胞によって摂取されるコバラミンは検出できない。健康な個体からの骨髄細胞は蛍光標識を示さない。また、元来潜在的化学療法化合物として合成された、ドキソルビシン−コバラミンコンジュゲートの取込があることも判明した。該ドキソルビシン−コバラミンコンジュゲートの細胞取込は、Ｐ−３８８ネズミ白血病細胞ならびにＨＣＴ−１１６ヒト結腸腫瘍細胞で観察することができる。かくして、コバラミンの蛍光誘導体の取込は白血病および固体腫瘍細胞系で起こる。これらの結果は、全ての癌細胞がコバラミンの輸送および貯蔵を増加させるという知識と組み合わせると、癌細胞を正常な細胞から区別する蛍光コバラミンの使用の一般的適用性を証明する。
【００２０】
かくして、本発明の蛍光コバラミンは、
・蛍光顕微鏡、蛍光腹腔鏡検査、蛍光内視鏡検査またはフローサイトメトリーを介して肉眼で癌性組織を同定し；
・組織バイオプシーからの組織切片または試料中の癌性細胞を同定し；
・イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにおいて腫瘍の境界を画定し；
・イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて癌を診断し、検出し、予後し、予測しまたはモニターし；
・イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて転移性癌を同定し；
・癌の進行段階を判断し；
・経皮的に癌を同定し；
・転移性癌を経皮的に同定し；
・腹腔鏡検査または内視鏡検査のごとき最小限侵入的技術の使用を含め、センチネルリンパ節または複数リンパ節、または腋窩リンパ節また複数リンパ節を含めたリンパ節において癌を同定し；
・乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、上皮癌（腺癌）、肝臓癌、黒色腫およびリンパ腫のごとき癌の治療、検出、予測、予後またはモニタリングにおいて転移性病気を同定し；
・白血病またはリンパ腫を診断し、予測し、予後し、モニターしまたは特徴付けるために、骨髄吸引物または末梢血液試料のフローサイトメトリー実験を行い；
・コバラミン−療法バイオコンジュゲートの使用に基づく化学療法に患者が陽性的に応答するか否かを予測し；
・バイオプシーまたはランペクトミーにおいて腫瘍の微細境界の画定を改良し；
・バイオプシー、ランペクトミーまたは腫瘍摘除において癌細胞を残す確率を減少させ、それにより、残りの癌細胞を除去するために、補足的外科処置の必要性を減少させるのに用いることができる。
【００２１】
予測とは、腫瘍の生物学的挙動、腫瘍が療法に対してどのように（好都合にまたは不都合に）応答するかの理解をいう。予後とは、療法後の患者の予測される結果（すなわち、療法後の５年または１０年生存の可能性）をいう。モニタリングとは、治療後の残存する病気の療法および検出の成功の判断をいう。その例は、白血病の治療後に骨髄芽細胞の存在につき骨髄をテストするための蛍光コバラミンコンジュゲートの使用である。特徴付けとは、密接に関連したタイプの腫瘍を比較した、腫瘍のタイプの記載または定量的分類をいう。
【００２２】
本発明の蛍光コバラミンは、当該分野で知られた慣用的癌の診断、検出、予測、予後、モニタリングまたは特徴付けの方法に従って投与することができる。例えば、蛍光コバラミンは静脈内、鞘内、腫瘍内、筋肉内、リンパ内または経口投与することができる。典型的には、本発明の蛍光コバラミンは医薬上許容される担体と混合される。該担体は、投与で望まれる製剤の形態、例えば、経口、非経口、静脈内、鞘内、腫瘍内、腫瘍周辺および硬膜外に応じて、広く種々の形態をとることができる。該組成物は、抗酸化剤、安定化剤、保存剤等をさらに含むことができる。技術およびプロトコルの例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出すことができる。投与すべき蛍光コバラミンの量は、典型的には、１ないし５００ｍｇである。
【００２３】
本明細書中に示すごとく、コバラミンアナログは、ハプトコリン（ＴＣＩまたはＨＣ）、内生因子（ＩＦ）またはトランスコバラミン（ＴＣＩＩ）のごときコバラミン輸送蛋白質によって高い親和性でもって認識される。大きな分子のコバラミンへの結合は蛋白質結合に影響しないようである。
【００２４】
リンパ節における転移性病気を同定する外科医の能力の改良は、例えば、健康な組織を保存し、除去される腋窩リンパ節の数を最小化することによって、外科的療法を進歩させる。これは、患者の生活の質を改良し、罹患率および長期死亡率を改良する。リンパ節まで広がった癌細胞の正確な同定は、健康な腋窩節を容赦しつつ、病的管および節のみの除去を可能とする。本発明は極めて価値がある。例えば、毎年の乳癌の１８６，０００の新しい事例において、初代腫瘍を除去し、関連するリンパ節の状態を測定する外科的処置の数はかなりのものである。全ての腋窩リンパ節および管の形式的な除去は、局所的な浮腫および増大した罹患率に導く。転移性癌細胞を含む腋窩リンパ節および管の非−除去は、減少した生存および増加した長期の死亡率に導く。
【００２５】
センチネルリンパ節バイオプシーアプローチにおいて、青色色素および／または放射性トレーサーを腫瘍近くの乳房に注入する。腕の下で小さな切除を行って、色素の痕跡または放射能を探し、乳房の領域を排出し、その結果、転移性癌細胞を最も含みそうなリンパ節を同定する。本発明によると、蛍光コバラミンは、センチネルリンパ節バイオプシーで現在用いられる青色色素および放射性同位体トレーサーを置き換える。本発明の蛍光コバラミンの使用は、全てのタイプの癌へのセンチネルリンパ節バイオプシーアプローチの適用を可能とする。加えて、本発明の蛍光コバラミンは、癌の分析、特に、リンパ節における癌細胞の分析における、腹腔鏡、内視鏡および顕微鏡技術のごとき最小限に侵入的な技術の使用を可能とする。蛍光コバラミンの使用は、陽性リンパ節の同定および検索を容易とする。かくして、本発明によると、蛍光コバラミンは、以下の：乳房、皮膚（黒色腫）、婦人科（卵巣、前立腺、子宮、頚部、外陰部、陰茎、精巣）、頭部および首（唇、舌、口、咽頭）、消化器官（食道、胃、小腸、大腸、直腸、結腸、肝臓、すい臓）、骨、結合組織、泌尿器官（膀胱、腎臓）、眼、脳および中枢神経系、内分泌腺（胸腺）、リンパ組織、ホジキン病、非−ホジキン病、リンパ種、多発性骨髄腫の癌または複数癌で用いることができる。
【００２６】
加えて、本発明の蛍光コバラミンの使用は、癌細胞を含有し、かつ除去されなければならないリンパ節の同定に対して、腹腔鏡および内視鏡技術のごとき最小限に侵入的な技術の使用を可能とする。この提案された技術が、より正確で苦痛の少ない方法で、手術可能な乳癌を持つ患者において腋窩リンパ節を外科的に調べる２つの現在の方法を置き換えるように設計される。今日用いられている２つの手術は、大きな切除（ほぼ５インチ）を用い、低レベルのリンパ節（１０−１５）の全てを除去する標準的な腋窩節切開である。第２の現在の実験方法は、センチネルリンパ節バイオプシーである。この方法は、第１のリンパ節を同定して、乳房を排除するのに目に見える色素またはガンマエミッターいずれかを用いる。これは、同様に、大きな切除およびリンパ経路の技術的に挑戦される調査を必要とする。本発明のコバラミン分子は、癌を持つ節に対してフルオロフォアを採用する。リンパ節は、腹腔鏡装置を用いる３つの小さな切除（３−５ｍｍ）を介して直接的に調べる。密接な手術技術は、レーザー励起に対して暗い視野を提供する。腫瘍を担うリンパ節におけるコバラミン−フルオロフォアからの刺激された光の明るい発光は、陽性リンパ節の同定および検索を容易とするであろう。この方法の結果、切開はより小さく、苦痛はより少なく、かつ精度は良好となる。同様な原理は、内視鏡技術で癌細胞を検出する蛍光コバラミンの使用に適用される。
【００２７】
さらに、本発明の蛍光コバラミンは癌細胞によって異なって取り入れられるので、これらの蛍光コバラミンは、外科医が癌性組織を選択的に切除し、それにより、健康な組織を残すことができるのを可能とする改良されたマーカーである。
【００２８】
腹腔鏡または内視鏡により検出されるべき癌細胞に結合した蛍光コバラミンの能力は、蛍光分子を用いて、腹腔鏡または内視鏡によりセンチネルリンパ節を測定することができる。かくして、いずれの蛍光分子（癌−標的化または非−標的化）も、腹腔鏡または内視鏡可視化を用いてリンパ節で検出することができる。その例として、現在、センチネルリンパ節手法で行われているように、赤色フルオロフォアを腫瘍内に注入することができよう。腋窩の通気は、外科医が、蛍光節を（２つの小さな切除を介して）腹腔鏡により見出し、それにより、センチネル節の一般的位置を見出すのを助けるための放射性トレーサーの使用を回避することを可能とする。
【００２９】
本発明の蛍光コバラミンは、手術内マーカーとしていくつかの改良を提供する。これらの改良は、以下のものを含む：
・蛍光マーカーはいずれの節が周期的骨盤窩を排出しているかを単に示すよりはむしろ、リンパ管および節中の癌細胞に特異的である。また蛍光マーカーは癌細胞を健康な細胞から区別する。
・該マーカーは、蛍光検出によって供される内生感度のため、低濃度で用いることができる。現在用いられている青色色素は活性な節をあいまいとする傾向にあり、病理学者により組織の外科処置後の調査を複雑化する。また、青色色素は出血する血管をあいまいとする傾向にあり、それにより、節の外科的切除および引き続いての創傷の閉鎖を複雑化する。蛍光マーカーの使用はこれらの問題を回避するはずである。
・癌細胞に特異的な蛍光マーカーは、現在実施される手法で見られるような、５ないし１０％の偽陰性率を改良する。
・増大した偽陰性率は、患者および外科医によるこの技術の許容性を改良する。これは、外科医がこの手法を学ぶのに必要な訓練時間（典型的には、完全な軸方向の節の切開、３０以上のケース）を減少させる。
・蛍光マーカーは、癌細胞の可視化のための腹腔鏡、内視鏡および顕微鏡技術の使用を可能とする。また、これらの技術を用いて、初代腫瘍、転移性腫瘍、腋窩リンパ節、鼡径リンパ節および頚部リンパ節を可視化することができる。これらの技術は、癌の分析において、大きな切除およびリンパ経路の技術的に挑戦する調査の必要性を低減化する。これらの技術の結果、切開は小さくなり、苦痛が少なくなり、精度は良好となる。
【００３０】
本発明のさらなる具体例において、血液、血漿、血清または他の体液中の天然に生じるコバラミン（ヒドロキソコバラミン、メチルコバラミン、アデノシルコバラミンまたはシアノコバラミン）の濃度または量を測定するために競合的結合アッセイで用いることができる。このタイプのアッセイにおいて、蛍光コバラミンは、当業者によく知られた競合結合アッセイにおける放射性標識コバラミンの代わりに用いられる。コバラミンについての放射性アッセイは、とりわけ、ここに引用して、その各々を本明細書の一部とみなす米国特許第６，０９６，２９０号；第５，６１４，３９４号；第５，２２７，３１１号；第５，１８７，１０７号；第５，１０４，８１５号；第４，６８０，２７３号；第４，４６５，７７５号；第４，３５５，０１８号に記載されてきた。このアッセイ手法を用いて、血液、血漿、血清または体液中の不飽和コバラミン結合能力の量、ならびに蛋白質トランスコバラミン、ハプトコリンまたは内生因子に結合したコバラミンの濃度を測定することができる。蛍光コバラミンの使用は、臨床化学結合アッセイにおける放射性標識コバラミンよりも有意な利点を有する。なぜならば、それは、放射性−標識コバラミンに伴う特別な出荷、取り扱いおよび廃棄手法を必要としないからである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、コバラミン分子に対する修飾するための部位を示す。
【図２】図２は、本発明による１つの蛍光コバラミンの合成を示す。
【図３】図３は、コバラミンモノカルボン酸の合成を示す。
【図４】図４は、コバラミンカルボン酸と１，１２−ジアミノドデカンとのコンジュゲーションを示す。
【図５】図５は、フルオレセイン−５ＥＸ−ＮＨＳエステルとジアミノドデカンコバラミン誘導体とのコンジュゲーションを示す。
【図６】図６は、フルオレセイン−５ＥＸ−ｂ−コバラミン誘導体ＣＢＣ−１２３の蛍光発光スペクトルを示す。
【図７】図７は、ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙの合成を示す。
【図８】図８は、ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙ（Ｃｙ５ ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ）の蛍光発光スペクトルを示す。
【図９】図９は、ＣＭ５ ＢＩＡｃｏｒｅチップに対するコバラミンアナログの固定化を示す。
【図１０】図１０は、競合アッセイセンソルグラムを示す。
【図１１】図１１は、ＴＣＩＩ結合についてのコバラミンの競合を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、コバラミン、コバラミンアナログおよびＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒについてのＫｄ値を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、コバラミン、コバラミンアナログおよびＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒについてのＫｄ値を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、コバラミン、コバラミンアナログおよびＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒについてのＫｄ値を示す。
【図１３】図１３は、動物モデルにおける腫瘍イメージングを示す。
【図１４】図１４は、新形成乳房組織における腫瘍イメージングを示す。
【図１５】図１５は、新形成リンパ節組織における腫瘍イメージングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
実施例
以下に実施例を挙げて本発明をさらに記載するが、それは例示的として掲げるのであって、断じて本発明を限定する意図のものではない。当該分野でよく知られた標準的な技術および後に具体的に記載する技術を利用した。
【００３３】
実施例１
フルオロフォアのコバルトへの結合による蛍光コバラミンの合成
コバラミン局所化の目で見えるインジケーターとして、フルオレセインをコバラミンに共有結合させることによって、コバラミンの５つの蛍光アナログを調製した。緑色光の照射下で、フルオレセイン分子は黄色光を発し、これは０．１ｐｐｍよりも低い濃度までの暗く適合された目によって検出することができる。この発光は、エピ蛍光顕微鏡を介する、ならびに肉眼での観察による癌細胞の感度の良い検出を可能とする。５つの蛍光コバラミンの各々は、固有の蛍光を呈した。これらの化合物の全ては、公表された技術に従って、塩化アミノプロピルをコバ（Ｉ）ラミンと反応させて、アミノプロピルコバ（ＩＩＩ）ラミンを生じさせることによって合成した。引き続いての工程において、アミノプロピルコバ（ＩＩＩ）ラミンを種々のフルオロフォアイソチオシアネート（すなわち、フルオレセインイソチオシアナート「ＦＩＴＣ」）と反応させて、アミノプロビルリンカーを介してコバラミンに結合した対応するフルオロフォア（すなわち、フルオレセイン−アミノプロピル−コバ（ＩＩＩ）ラミン）を得た。この酵素の反応を、図２に示す。
同様にして、フルオロフォアがナフトフルオレセインまたはオレゴングリーンである蛍光コバラミンを調製した。全ての蛍光コバラミンは、組換えトランスコバラミン（ｒｈＴＣＩＩ）に対して高い親和性を保持し、かくして、天然に生じるコバラミンで観察されるのと同様な生物学的分布を可能とすることが判明した。
【００３４】
実施例２
癌細胞によるコバラミンアナログの取込
白血病骨髄芽細胞調製物は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）Ｍ１を有する６１歳の患者の骨髄から作成した（ＦＡＢ分類において、最小限に成熟した骨髄芽細胞）。実施例１に記載されたごとく調製した蛍光コバラミンで、細胞を収穫３日後に処理した。正常および白血病ヒト骨髄における、蛍光顕微鏡または蛍光フルオサイトメトリーによって測定した、蛍光コバラミンアナログの異なる取込が見出された。正常骨髄細胞および白血病骨髄芽細胞（癌細胞）の間の差は特に注目すべきであり、正常細胞によって取り込まれるコバラミンは検出できない。健康な個体からの骨髄試料は蛍光標識を示さなかった。もともと、優れた化学療法化合物として合成されたドキソルビシン−コバラミンコンジュゲートが、Ｔ−３８８ネズミ白血病細胞およびＨＴＣ−１１６ヒト結腸腫瘍細胞で観察された。これらの結果は、白血病および固体腫瘍細胞系におけるコバラミンの蛍光誘導体の取込を説明する。
【００３５】
実施例３
シアノコバラミンモノカルボン酸の調製
ｂ−、ｄ−およびｅ−モノカルボン酸はシアノコバラミンの酸触媒加水分解によって調製した。図３参照。簡単に述べれば、シアノコバラミン（５２７．０ｍｇ，０．３８９ミリモル）を１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、４０ｍｌの０．５Ｍ ＨＣｌに溶解させた。フラスコを５０℃の水浴に入れ、４時間攪拌した。表１に掲げたグラジエントを用い、反応をＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ， Ｉｎｃ． ３．９×３００ｍｍ ＤｅｌｔａＰａｋ １００ Ｃ−１８カラム）を介してモニターした。
【００３６】
【表１】
【００３７】
４時間後、反応を室温まで冷却した。ｐＨメーターを用い、ｐＨをＮａＯＨ（１０％）で７．０に調整した。まず、当該カラムを１０ｍｌのメタノール、続いて、１５ｍｌの脱イオン水ですすぐことによって、粗物質をＣ−１８ ＳｅｐＰａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ， Ｉｎｃ． Ｐ／Ｎ ＷＡＴＯ２３６３５）を用いて脱塩した粗物質をシリンジを介してカラムに適用し、１０ないし１５ｍｌの脱イオン水ですすぎ、続いて、１０ｍｌのメタノールで溶出した。回転蒸発を介してメタノールを除去し、赤色化合物が得られた（５０１６−１２−３３）。
【００３８】
粗反応混合物を最小量の脱イオン水で溶解させ、表２に計算されたグラジエントを用い、溶液の半分を半分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ， Ｉｎｃ． ２５．０×３００ｍｍ １００ Ｃ−１８カラム）に注入した。
【００３９】
【表２】
【００４０】
大きな試験管を用いて、２８．０分（ｂ−モノカルボン酸、ＣＢＣ１９５）、３０．１分（ｄ−モノカルボン酸、ＣＢＣ−２２６）および３４．６分（ｅ−モノカルボン酸）におけるピークを収集した。純粋な画分を脱イオン水で１：１希釈し、前記したのと同様に脱塩した。全ての場合、赤色固体が得られた。
【００４１】
ＣＢＣ−１９５（ｂ−モノカルボン酸）：２つの分取ランにおいて、７４．８ｍｇのｂ−モノカルボン酸（１４．４％）が単離された。予期されたごとく、Ｍ＋１ピーク（１３５６）およびＭ＋２２ピーク（１３７８）を示す陽イオン電子スプレー質量スペクトル（ＥＳ＋）が得られた。ｂ−モノカルボン酸（ＣＢＣ−１９５）は１４％の全収率で得られた。
【００４２】
ＣＢＣ−２２６（ｄ−モノカルボン酸）：２つの分取ランにおいて、３８．６ｍｇのｄ−モノカルボン酸（７．３％）が単離された。予測したごとく、Ｍ＋１ピーク（１３５６）および対応するＭ＋Ｎａピーク（１３７８）を示す陽イオン電子スプレー質量スペクトル（ＥＳ＋）が得られた。ｄ−モノカルボン酸（ＣＢＣ−２２６）は７％の全収率で得られた。
【００４３】
ｅ−モノカルボン酸は１４％の全収率にてほぼ７８ｍｇが単離された。
【００４４】
実施例４
ＣＮＣｂｌ酸と１，１２ジアミノデカンとのコンジュゲーション
ｂ−およびｄ−アミンは図４に示すごとく調製した。ＣＢＣ−１９５（５５．４ｍｇ，０．０４０８ミリモル）を小さなガラスバイアルに添加し、約２．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解させ、続いて、ＥＤＣＩ ＨＣｌ（１２ｍｇ．０．０６２６ミリモル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（２５ｍｇ，０．２１７ミリモル）を添加した。反応を室温にて一晩攪拌した。以前の試みにより、反応を駆動して完了させるには数当量のＥＤＣＩおよびＮＨＳ（合計６当量）が必要であった。２４時間後、さらに１当量のＥＤＣＩを添加し、合計２６時間以内に反応は完了した。表３のグラジエントを用いて、反応をＨＰＬＣを介してモニターした。ＣＢＣ−１９５は９．０７分の保持時間を有し、ＣＢＣ−１９５のＮＨＳ−エステルは１０．５５分の保持時間を有する。
【００４５】
【表３】
【００４６】
別のグラスバイアル中にて、１，１２−ジアミノドデカン（８１．８ｍｇ，０．４０８ミリモル）を約２ｍｌのＤＭＳＯに溶解させた。４．０ｍｌ／時間にてシリンジを用い、前記反応混合物を滴下して二量体化を最小化させた。生成物は直ちに形成され、１４．５６分の保持時間を有する。粗反応混合物を１００ｍｌの１：１ ＣＨ２Ｃｌ２：Ｅｔ２Ｏに添加し、赤色沈殿が形成された。ガラスフリットを用い、赤色化合物を濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２の２０ｍｌの２回分、アセトンの２０ｍｌの２回分、および最終的にＥｔ２Ｏの２０ｍｌの２回分で洗浄した。
【００４７】
粗反応生成物を再少量の脱イオン水に溶解させて表４に計算されたグラジエントをを用いて溶液を半分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．，２５．０×１００ｍｍ １００ Ｃ−１８カラム）に注入した。
【００４８】
【表４】
【００４９】
大き試験管を用い、８．７０分におけるピーク（ｂ−アミン、ＣＢＣ−２０８）を収集した。純粋な画分を蒸留水で１：１希釈し、まず、当該カラムを１０ｍｌのメタノールで、続いて、１５ｍｌ脱イオン水ですすぐことによって、Ｃ−１８ ＳｅｐＰａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ， Ｉｎｃ． Ｐ／Ｎ ＷＡＴＯ２３６３５）を用いて脱塩した。シリンジを介して純粋な物質をカラムに適用し、１０ないし１５ｍｌの脱イオン水ですすぎ、続いて、１０ｍｌのメタノールで溶出した。回転蒸発を介してメタノールを除去し、６ｍｇの赤色化合物が得られた。
【００５０】
ＣＢＣ−２０８（ｂ−アミン）：合計６．０ｍｇのアミンが単離されたと予測されるごとく、Ｍ＋１ピーク（１５３８）およびＭ＋２３ピーク（１５６０）を示す陽性イオン電子スプレー質量スペトクトル（ＥＳ＋）が得られた。ＣＢＣ−２０８は、精製の後、９．５％の収率で得られた。
【００５１】
ＣＢＣ−２２６（ｄ−アミン）：表３におけるのと同一のＨＰＬＣグラジエントを用い、ｄ−モノカルボン酸は、９．３２分のＨＰＬＣ保持時間を有し、ＮＨＳ−エステルは１０．９６分において移動し、ｄ−アミン（ＣＢＣ−２２６）は１４．９３分において移動する。予測されるごとく、Ｍ＋１ピーク（１５３８）および対応するＭ＋Ｎａピーク（１５６０）を示す粗物質の陽イオン電子スプレー質量スペクトル（ＥＳ＋）が得られた。
【００５２】
実施例５
ＣＢＣ−２０８およびフルオレセイン−５ＥＸ−ＮＨＳのコンジュゲーション
ＣＢＣ−２０８は、図５に従い、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能な）フルオレセイン誘導体のフルオレセイン−５ＥＸにカップリングされている。ＣＢＣ−２０８（６．０ｍｇ，３．８７μモル）を小さなグラスバイアルに添加し、約０．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解させ、続いて、フルオレセイン−５ＥＸ−ＮＨＳ（２．５ｍｇ，４．２３μモル）を添加した。反応物を室温にて一晩攪拌した。表５中の方法を用い、反応をＨＰＬＣを介してモニターした。
【００５３】
【表５】
【００５４】
反応は最初非常に迅速に進行し、１０分間の接触後に過ぎないのに所望の生成物を形成した。ＣＢＣ−２０８は１１．４７分の保持時間を有し、生成物（ＣＢＣ−１２３）は１４．２４分の保持時間を有する。さらに１当量のフルオレセイン化合物を添加すると、反応は完了し、粗混合物は８８％純度である。
【００５５】
出発物質フルオレセイン−５ＥＸ−ＮＨＳのＨＰＬＣ分析はそれが７５％純度に過ぎないことを示し、これは、反応を駆動させて完了させるのになぜさらなる当量が必要であるかを説明する。
【００５６】
ＣＢＣ−１２３（ｂ−フルオレセインコバラミン誘導体）：この化合物は合成からの粗単離物と同様にほぼ９０％純度であり、不純物の大部分は未反応のＣＢＣ−２０８である。Ｍ＋１ピーク（２０１３）および対応するＭ＋Ｎａピーク（２０３５）を示す粗物質の陽イオン電子スプレイ質量スペクトル（ＥＳ＋）が得られた。精製前収率は２２％である。
【００５７】
３５０ｎｍにおける励起での光分解の前および後に、本化合物の蛍光スペクトルを粗化合物から取った（図６参照）。光分解の前および後に蛍光の有意な変化はなく、これは、当該化合物が光安定であり、明らかに蛍光性であって、コバラミンの近くからの減少した蛍光を呈しないことを示唆する。
【００５８】
実施例６
顕微鏡を介する乳癌組織のエクス・ビボ調査
正常周辺組織が付着した乳癌を含む悪性および良性腫瘍の試料を患者から切り出す。これらの試料は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）およびＨｕｎｔｓｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＣＣＩＣ）の同意の下に採取する。生きた組織の試料を、前記で調製した蛍光コバラミン誘導体の１つと共に４ないし６時間インキュベートする。各試料の薄い組織片をクリオミクロトームで調製し、エピ蛍光顕微鏡によって、蛍光マーカーの量を正常および癌性組織で定量する。解剖病理学者による評価のため、対応する組織片をヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染料で染色する。正常および癌性細胞の間の界面を注意深く調べる。腫瘍内部からの細胞も蛍光マーカーの取込について調べる。というのは、腫瘍の低酸素領域内の細胞がしばしば代謝を低下させているからである。
【００５９】
より具体的には、最少必須培地、アルファ修飾（α−ＭＥＭ；７．５％新生ウシ血清、２．５％胎児ウシ血清、０．２％ナイスタチン、２．５％ペニシリン／ストレプトマイシン、ｐＨ７．２；Ｓｉｇｍａ）を調製し、滅菌された２５ｍＬのネジ頂部組織培養フラスコに一部を入れた（１０ｍＬ）。培地を３７℃とし、組織試料を、α−ＭＥＭ中の蛍光標識コバラミン（５０ｎＭ；実施例１のコバラミン−オレゴングリーンおよびコバラミン−ナフトフルオレセインコンジュゲートおよび実施例５のコバラミン−フルオレセインコンジュゲート）および組換えヒトＴＣＩＩ（５０ｐＭ）と共にインキュベートした。ヒト乳房組織試料はＩＲＭ−認可のプロトコルに従って獲得した。組織をフラスコから取り出し、ダルベッコウのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ）で洗浄し、凍結切片スライシング用のＯＣＴ化合物（Ｓｈａｎｄｏｎ）と共に−２０℃の真鍮プレート上に設置した。−２０℃にて、ＣＴＤ Ｈａｒｒｉｓクリオスタット中で組織をスライスした（４ないし６μｍ片）。薄い組織片を小さな美術用のブラシで後ろに引き、１００％エタノールで顕微鏡スライドグラスに固定した。標準ヘマトキシリン染色手法：９５％エタノール、２０秒；水、５秒；ヘマトキシリン（Ｆｉｓｈｅｒ）、４５秒；水、５秒；藍染料液（水道水）、１０秒；９５％エタノール、１０秒；１００％エタノール、１０秒；キシレン、１０秒；およびキシレン、１０秒を用いて、スライドを染色した。相コントラストおよびエピ蛍光顕微鏡によって、１０×、６０×および１００×倍率でスライドを評価した。
【００６０】
３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムチアゾリルブロマイド（ＭＴＴ；Ｓｉｇｍａ）を用いて、蛍光コバラミンでの３時間のインキュベーションの時間の後に組織の代謝能力を定量的に測定した。組織の一部を培地から取り出し、ＤＰＢＳで洗浄し、ＭＴＴ（２ｍＬ；２．５ｍｇ／ｍＬ）に浸漬した。３７℃の５％ＣＯ２雰囲気下にてこの組織を３時間インキュベートした。このインキュベーション期間の間に、コハク酸脱水素酵素活性によると、組織試料中の生きた細胞はＭＴＴ色素を紫色ホルマザンまで還元した（ＣｅｌｉｓおよびＣｅｌｉｓ，１９９８）。組織をＤＰＢＳで洗浄し、前記にて概説したクリオミクロトーム手法に従って調製して、組織の代謝能力を確実とした。
【００６１】
蛍光コバラミンバイオコンジュゲートは、新形成および健康乳房組織双方において幾分蓄積し、新形成乳房組織は、健康な乳房組織よりも多くの蛍光コバラミンを隔離した。健康な乳房組織によって隔離された蛍光コバラミンの量は予測したよりも大きいが、それは、健康な細胞による有意な内部化よりもむしろ結合組織内の構造への非特異的結合によるものと考えられる。
【００６２】
実施例７
リンパ節における癌細胞のエクス・ビボ調査
転移性病気を持つ切り出したリンパ節を患者から取り出し、前記調製の蛍光コバラミン誘導体のうちの１つと共に４ないし８時間インキュベートする。各リンパ節を切片化し、蛍光コバラミンの癌細胞への輸送につき顕微鏡で調べる。この実験は、イメージングおよび可視化のために十分な蛍光コバラミンを取り込むリンパ節内の転移性細胞の能力を示した。
【００６３】
実施例８
患者がコバラミン−ベースの治療バイオコンジュゲート化学療法に好都合に応答するか否かを判断するための蛍光コバラミンの使用
白血病を持つ患者からの骨髄吸引物および末梢血液試料を蛍光コバラミンコンジュゲートと共にインキュベートする。４ないし８時間後、骨髄吸引物または末梢血液試料を洗浄して、取り込まれなかった蛍光標識を除去し、エピ蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによる定性的または定量的蛍光分析に細胞試料を付す。有意な量の蛍光コバラミンを取り込んだ細胞はより明るい蛍光を呈する。有意な量の蛍光コバラミンの取り込みは、患者の白血病のタイプが、コバラミン−ベースの治療剤での治療に好都合に応答するであろうことを示す。蛍光コバラミンコンジュゲートでの処理の後に有意な蛍光を示さない骨髄吸引物または末梢血液試料は、当該患者がコバラミン−ベースの治療コンジュゲートに好都合に応答しないであろうことを示す。同様のアプローチを固体腫瘍に適用することができる。この場合、切り出した腫瘍組織の一部を蛍光コバラミンコンジュゲート共にインキュベートし、約４ないし８時間後、腫瘍組織中の蛍光を定量する。腫瘍組織によって呈される蛍光が大きくなれば、癌が、コバラミン−ベースの化学療法での治療に好都合に応答するであろう確率は大きくなる。
【００６４】
実施例９
ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙの合成
一般的脱塩手法。２カラム容量のメタノールおよび３カラム容量の脱イオン水でカートリッジをコンディショニングすることによって、全てのコバラミンを１０ｇのＣ−１８ ＳｅｐＰａｋ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．）で脱塩した。コバラミンをカラムに適用し、３カラム容量の脱イオン水で洗浄し、メタノール（１０ｍＬ）で溶出させた。回転蒸発を介してメタノールを除去し、生成物を凍結乾燥によって乾燥した。
【００６５】
シアノコバラミン−ｂ−モノカルボン酸の調製。シアノコバラミン−ｂ−モノカルボン酸は修飾された公表プロトコルに従って調製した（Ａｎｔｏｎら，１９８０）。簡単に述べると、ＣＮＣｂｌ（３．５ｇ，２．６ミリモル）を３５０ｍＬの１．０Ｍ ＨＣｌに溶解させた。反応を４時間で３７℃まで加熱し、逆相ＨＰＬＣを介してモニターした。粗物質を脱塩し、次いで、半分取ＨＰＬＣを介して精製した。しかしながら、粗反応混合物は４５％を超えるシアノコバラミンを含有したので（ＨＰＬＣによる）、イオン交換カラムを用いて未反応シアノコバラミンを分離した。粗物質をｄｄＨ２Ｏに溶解させ、２．５×３０ｃｍ Ｄｏｗｅｘ ＡＧ−Ｘ１（アセテート形態）カラムに適用した。ＣＮＣｂｌを脱イオン水でカラムから溶出させた。次いで、３つのモノカルボン酸を０．０４Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）で溶出させ、半分取ＨＰＬＣを介してさらに精製した。ｂ−モノカルボン酸は分析ＨＰＬＣによると９７％純度で単離された（１０％全収率）：ＥＳ＋ ＭＳ：（１：１ Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ） Ｍ＋Ｈ＝１３５６．３（Ｃ６３Ｈ８８ＣｏＮ１３Ｏ１５Ｐとして計算＝１３５６．５）、Ｍ＋Ｎａ＋＝１３７８．４（Ｃ６３Ｈ８８ＣｏＮ１３Ｏ１５ＰＮａとして計算＝１３７８．５）。また、ｄ−およびｅ−モノカルボン酸は、共に、各々、４％および７％の全収率で単離された。
【００６６】
シアノコバラミン−ｂ−モノカルボン酸についての分析ＨＰＬＣ方法：分析クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ−１８ ３００×３．９ｍｍのカラムを用い、２ｍＬ／分の液速で行った。９０％溶液Ａ（０．０５Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ３．０）および１０％溶液Ｂ（９：１アセトニトリルおよび水）の最初の２分間のイソクラティック流動の後、８３．７％のＡおよび１６．３％のＢまでの１６分間の直線グラジエントにより、保持時間が１５．７分の所望のｂ−モノカルボン酸誘導体が溶出された。ｄ−モノカルボン酸は１６．９分の保持時間を有し、ｅ−モノカルボン酸は１９．５分の保持時間を有した。
【００６７】
シアノコバラミン−ｂ−モノカルボン酸についての半分取ＨＰＬＣ：クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ−１８ ２．５×３０ｃｍの半分取カラムを用い、４０ｍＬ／分の液速で行った。９０％溶液Ａ（０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ３．０）および１０％溶液Ｂ（９：１アセトニトリルおよび水）の４．１分のイソクラティック流動の後、８３．７％のＡおよび１６．３％のＢまでの３２．９分の直線グラジエントにより、コバラミン誘導体が溶出した。３つのＣＮＣｂｌ−モノカルボン酸の保持時間は以下の通りであった：ｂ−モノカルボン酸は２３．１分に溶出し、ｄ−モノカルボン酸は２６．６分に溶出し、ｅ−モノカルボン酸は３２．１分に溶出した。
【００６８】
コバラミン−ｂ−（５−アミノペンチルアミド）の合成。シアノコバラミン−ｂ−モノカルボン酸１（５０ｍｇ，０．０３７ミリモル）を、ＥＤＣＩ（７１ｍｇ，０．３７ミリモル）およびＮＨＳ（２５ｍｇ，０．２２ミリモル）で、乾燥した１０ｍＬ丸底フラスコ中にて溶解させた。窒素を５分間フラッシュすることによって、該フラスコを脱気した。シリンジを介してジメチルスルホキシド（５ｍＬ）を添加し、反応混合物を６時間攪拌した。気密性シリンジを用い、この混合物を丸底フラスコから取り出し、１，５−ジアミノペンタン（４３μＬ，０．３７ミリモル）を該フラスコに入れた。Ｃｂｌ混合物を５分間にわたって１，５−ジアミノペンタンに滴下して、２：１アダクトの形成を最小化した。逆相ＨＰＬＣを用いて、反応をモニターした。出発物質が消費されると、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２：ジエチルエーテル（６０ｍＬ）の溶液からコバラミンが沈殿した。得られた固体を媒体フリットフィルターで濾過し、ジエチルエーテル（２×１０ｍＬ）で洗浄し、メタノールでフィルターから溶出させた。粗混合物を同等容量の水で希釈し、半分取カラムに注入して、シアノコバラミン−ｂ−（５−アミノペンチルアミド）２を精製した。所望の生成物を含有する画分を前記したごとくに脱塩し、回転蒸発によって乾燥した。シアノコバラミン−ｂ−（５−アミノペンチルアミド）が得られた：７０％収率；分析ＨＰＬＣにより９８％純度；ＥＳ＋ ＭＳ：（１：１ Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ） Ｍ＋Ｈ＝１４４０．５（Ｃ６８Ｈ１００ＣｏＮ１５Ｏ１４Ｐとして計算＝１４４０．７）、Ｍ＋Ｎａ＋＝１４６２．４（Ｃ６８Ｈ１００ＣｏＮ１５Ｏ１４ＰＮａとして計算＝１４６２．６）；ε３６２ｎｍ＝Ｈ２Ｏ中１９５００Ｍ−１ｃｍ−１
【００６９】
シアノコバラミン−ｂ−（５−アミノペンチルアミド）２についての分析ＨＰＬＣ方法：
分析クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ−１８ ３００×３．９ｍｍカラムにて、２ｍＬ／分の液速で行った。９５％溶液Ａ（０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ３．０）および５％溶液Ｂ（９：１アセトニトリルおよび水）の２分間のイソクラティック流動の後、７０％Ａおよび３０％Ｂまでの１６．４分間の直線グラジエントにより、１１．８分において注目する化合物が溶出した。
【００７０】
シアノコバラミン−ｂ−（５−アミノペンチルアミド）２についての半分取ＨＰＬＣ：半分取クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ−１８ ２５×３０ｃｍの半分取カラムを用いて、４０ｍＬ／分で行った。４．１分間の９５％溶液Ａ（０．０５Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ３．０）および５％溶液Ｂ（９：１アセトニトリルおよび水）のイソクラティック流動の後、７０％Ａおよび３０％Ｂへの１８分間の直線グラジエントにより所望の生成物を溶出した。
【００７１】
ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙの合成（Ｃｙ５−コバラミン＝Ｃｙ５−Ｃｂｌ＝Ｃｙ５ Ｃｏｂａｌａ Ｆｌｕｏｒ）。この合成を図７に示す。簡単に述べれば、シアノコバラミン−リボース−５’−Ｏ−（６−アミノヘキシルアミド）は、公表されたプロトコル（ＭｃＥｗａｎら，１９９９）に従い、シアノコバラミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用いて調製した。２：１ジエチルエーテル：塩化メチレン（５０ｍＬ）を用いコバラミンを沈殿させ、やはりこの溶媒混合液（２×１０ｍＬ）で洗浄した。反応をモニターし、逆相ＨＰＬＣを介して生成物を精製した。標準的な手法に従い、生成物を脱塩した。シアノコバラミン−リボース−５’−Ｏ−（６−アミノヘキシルアミド）（２０ｍｇ，０．０１３ミリモル）を乾燥した１０ｍＬの丸底フラスコに入れて、５分間窒素でフラッシュすることによって脱気した。ジメチルスルホキシド（１ｍＬ）をシリンジを介して添加してコバラミンを溶解させた。Ｃｙ５スクシンイミジルエステル（１０ｍｇ，０．０１３ミリモル；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびＤＩＰＥＡ（１５μｌ，０．１３）をフラスコに添加し、反応混合物を１時間攪拌した。逆相ＨＰＬＣを用いて、反応をモニターした。出発物質が消費されると、２：１ジエチルエーテル：ＣＨ２Ｃｌ２の溶液（５０ｍＬ）によりコバラミンが沈殿した。得られた固体を微細なフリットフィルターで濾過し、ジエチルエーテルおよびＣＨ２Ｃｌ２混合液（２×１０ｍＬ）で洗浄し、メタノールを用いてフィルターから溶出させた。組混合物を半分取カラムに注入して、ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙを精製し、標準的な手法に従って脱塩した。図８はＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙの蛍光発光スペクトルを示す。
【００７２】
シアノコバラミン−リボース−５’−Ｏ−（６−アミノヘキシルアミド）についての分析ＨＰＬＣ方法：分析クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌａｔａＰａｋ Ｃ−１８ ３００×３．９ｍｍカラムを用い、２ｍＬ／分の液速で行った。９５％溶液Ａ（０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ３．０）および５％溶液Ｂ（９：１アセトニトリルおよび水）の初期の２分間のイソクラティック流動の後、７０％Ａおよび３０％Ｂへの１８分間の直線グラジエントにより、所望のシアノコバラミン−リボース−５’−Ｏ−（６−アミノヘキシルアミド）を溶出させて、保持時間は１２．５分であった。
【００７３】
シアノコバラミン−リボース−５’−Ｏ−（６−アミノヘキシルアミド）についての半分取ＨＰＬＣ：クロマトグラフィーはＷａｔｅｒｓ ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ−１８ ２．５×３０ｃｍの半分取カラムを用いて、４０ｍ／分の液速で行った。９５％溶液Ａ（０．０５Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ３．０）および５％溶液Ｂ（９：１アセトニトリルおよび水）の４．１分間のイソクラティック流動の後、７０％Ａおよび３０％Ｂまでの直線グラジエントによりコバラミン誘導体を溶出させた。所望のシアノコバラミン−リボース−５’−Ｏ−（６−アミノヘキシルアミド）の保持時間は１５．５分であった。
【００７４】
ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙについての分析ＨＰＬＣ：分析クロマトグラフィーはＷａｔｅｒｓ ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ−１８３００×３．９ｍｍ）カラムにて、２ｍＬ／分の液速で行った。９５％溶液Ａ（０．０１Ｍ ＴＥＡ緩衝液，ｐＨ７．０）および５％溶液Ｂ（９：１アセトニトリルおよび水）の２分間のイソクラティック流動の後、４５％Ａおよび５５％Ｂまでの１６．４分間の直線グラジエントにより１３．６分においてＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙを溶出させた。
【００７５】
ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙについての半分取ＨＰＬＣ：半分取クロマトグラフィーはＷａｔｅｒｓ ＤｅｌｔＰａｃｋ Ｃ−１８ ２５×３０ｃｍの半分取カラムを用い、２０ｍＬ／分で行った。９５％溶液Ａ（０．０１Ｍ ＴＥＡ緩衝液，ｐＨ７．０）および５％溶液Ｂ（９：１アセトニトリルおよび水）の２分間のイソクラティック流動の後、７０％および３０％Ｂまでの２７．４分間の直線グラジエントにより１２．２分において所望の生成物を溶出させた。
【００７６】
実施例１０
競合アッセイ
材料。コバラミンのブタ非−内生因子（ＨＣ およびＩＦの５０：１混合物）、およびブタ内生因子はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入した。ＨＰＬＣトレースは、Ｗａｔｅｒｓ ２４８７デュアル波長吸光度ディテクターを備えたＷａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ ６００システムを用いて得た。ＢＩＡＣＯＲＥ２０００および３０００（ＢＩＡＣＯＲＥ ＡＢ）装置を表面プラズモン共鳴バイオセンサー分析のために用いた。
【００７７】
ＣＮＣｂｌ−ｂ−（５−アミノペンチルアミド）の固定化。全てのＳＰＲ実験は、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００オプティカルバイオセンサーで行った。標準ＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ ＡＢ）のフローセル中のカルボキシメチルデキストランの表面を、３７℃の０．１Ｍ ＥＤＣＩおよび０．０２５Ｍ ＮＨＳの混合物を２０μＬ／分において１５分間チップを通って流すことによって、活性化した。ｐＨ４．５の１０ｍＭ酢酸ナトリウム中に希釈したＣＮＣｂｌ−ｂ−（５−アミノペンチルアミド）２を、図９に示すごとくチップの３つのフローセルに固定化した。２μＬ／分の速度にて、Ｃｂｌアナログをフローセルに４０分間パルス状で与えることによって、高密度センサー表面（５００−７００ ＲＵ）を作り出した。全ての４つのフローセル中のチップの表面に残存する結合部位を、５μＬ／分にて１６分間１．０ＭエタノールアミンｐＨ８．５でブロックした。フローセル３を参照表面として用いて、非特異的結合および装置のノイズを差し引いた。
【００７８】
蛋白質標準曲線。３０℃にてＨＢＳランニング緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ， １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ７．５， ３．４ｍＭ ＥＤＴＡ， １ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ，および０．００５％ Ｐ２０界面活性剤）を用い、全ての標準曲線および競合アッセイを行った。ｒｈＴＣＩＩ、ＮＩＦおよびＩＦ結合ＣＮＣｂｌ−ｂ−５−（アミノペンチルアミド）についてもキャリブレーション曲線を以下のごとく作成した。ＨＢＳ緩衝液中に希釈した各蛋白質（１５．６−５００ｐＭ）のストック溶液を、２０μL／分にて１０分間フローセルを通じて注入して結合を分析した。結合した蛋白質を８Ｍ尿素、０．１２５％ＳＤＳ、およびランニング緩衝液で除去した。各蛋白質試料を二連で分析した。
【００７９】
見掛けの溶液平衡解離定数の測定。種々のコバラミンアナログへのｒｈＴＣＩＩ、ＮＩＦおよびＩＦの結合は、溶液競合結合アッセイによって分析した（Ｎｉｅｂａら，１９９６）。０．０１ないし１００ｎＭの範囲のアナログ濃度を、２００ｐＭのｒｈＴＣＩＩ、２００ｐＭのＮＩＦまたは５００ｐＭのＩＦを含む等容量中でインキュベートした。３０℃において、２０μＬ／分の速度にて競合するＣｂｌアナログおよび蛋白質のアリコットを注入することによって、結合データを作成し、８Ｍ尿素、０．１２５％ＳＤＳおよび緩衝液のパルスで表面を再生した。各コバラミンについての競合アッセイは、二連で行った。
【００８０】
データの解析。参照表面から観察された結合応答を差し引き、３つのブランク注入の平均を差し引くことによって、バイオセンサーデータを解析用に調製した（Ｍｙｓｚｋａ １９９９）。競合アッセイからのデータを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ ３．０ソフトエウェアを備えた非線形最小二乗回帰分析に適合させた。図１０は競合アッセイのセンソグラムを示す。図１１はＴＣＩＩ結合についてのコバラミンの競合を示す。結合データを図１２Ａないし図１２Ｃに示す。これらの結果は、コバラミンアナログが高い親和性をもってコバラミン輸送蛋白質（トランスコバラミン、ハプトコリンおよび内生因子）によって認識されることを示す。また、この認識は表面プラズモン共鳴によっても示された。コバラミンへの大きな分子の結合は、蛋白質結合に影響するようには見えない。
【００８１】
実施例１１
動物モデル実験
腫瘍を持つマウスにおけるイン・ビボ取込。メスマウスの右後足に１×１０６ ＲＤ９９５腫瘍細胞を皮下移植することによって、腫瘍をマウスに移植する。マウス腫瘍細胞系をイン・ビトロで増殖させた。細胞の移植から６週間後、１０ｍｍ腫瘍が目に見えた。この時点で、マウスに、滅菌生理食塩水に溶解させた２．２μｇのＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙの後眼窩静脈内注射を与えた。注射から６時間後、ハロタンを吸入させてマウスを沈静させた。腫瘍をスライスして開き、６３３ｎｍ ＨｅＮｅレーザを照射した。ＨｅＮｅレーザを用い、ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙの注射５４時間後にもマウスの腫瘍を分析した。マウスを切開し、内部器官および健康な組織を分析することができた。結果を図１３に示す。これは、蛍光標識コバラミンがマウスにおいて腫瘍組織に局在化することを示す。
【００８２】
実施例１２
組織取込実験
蛍光コバラミン取込。最小必須培地、アルファ修飾（α−ＭＥＭ；７．５％新生児ウシ血清、２．５％胎児ウシ血清、０．２％ナイスタチン、２．５％ペニシリン／ストレプトマイシン、ｐＨ７．２；Ｓｉｇｍａ）を調製し、滅菌した２５ｍＬのスクリュー頂部組織バイオフラスコに一部を入れた（１０ｍＬ）。培地を３７℃とし、組織試料（新形成乳房組織、健康な乳房組織、新形成リンパ節組織および健康なリンパ節組織）をα−ＭＥＭ中で蛍光標識したコバラミン（１０ｐＭ）、シアノコバラミン（１ｎＭ）と共に３時間インキュベートした。ヒト組織試料をＩＲＢ認可のプロトコルに従って獲得した。組織をフラスコから取り出し、ダルベッコウのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ）で洗浄し、−２０℃にて、凍結片スライシングのためにＯＣＴ化合物（Ｓｈａｎｄｏｎ）と共に真鍮プレート上に設置した。−２０℃にて、組織をＣＴＤ Ｈａｒｒｉｓクリスタット中でスライスした（４ないし６μｍの切片）。小さな美術用ブラシで組織片を引き戻し、１００％エタノールで顕微鏡スライドグラスに固定した。標準ヘマトキシリン染色手法：９５％エタノール、２０秒；水、５秒；ヘマトキシリン（Ｆｉｓｈｅｒ）、４５秒；水、５秒；藍染色溶液（水道水）、１０秒；９５％エタノール、１０秒；１００％エタノール、１０秒；キシレン、１０秒；およびキシレン、１０秒を用いてスライドグラスを染色した。スライドグラスを１０×、６０×および１００×の倍率にてエピ蛍光顕微鏡によって評価した。（ａ）新形成乳房組織における腫瘍イメージングを図１４に示し、（ｂ）新形成リンパ節組織を図１５に示す。
【００８３】
細胞の生存率および組織代謝活性アッセイ。３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムチアゾリルブロマイド（ＭＴＴ；Ｓｉｇｍａ）を用いて、蛍光コバラミンとの３時間のインキュベーション時間後に、組織の代謝能力を定量的に測定した。組織の一部を培地から取り出し、ＤＰＢＳで洗浄し、ＭＴＴ（２ｍＬ；２．５ｍｇ／ｍＬ）に浸漬した。３７℃の５％ＣＯ２雰囲気下でこの組織を３時間インキュベートした。このインキュベーション期間の間、組織細胞中の生きた細胞は、コハク酸脱水素酵素活性によって、ＭＴＴ色素を紫色ホルマザンまで還元した。組織をＤＰＢＳで洗浄し、前記にて概説したクリオミクロトーム手法に従って調製して、組織の代謝能力を確実とした。イン・ビトロにて、健康および新形成組織は共に蛍光コバラミンを取り込むことが判明した。
【００８４】
本発明の方法および組成物は種々の具体例の形態で取り込むことができ、その少数のみをここに開示したことは認識されるであろう。他の具体例が存在し、本発明の精神を逸脱しないことは当業者に明らかであろう。かくして、記載された具体例は例示的なものであって、限定するものと解釈されるべきではない。
【００８５】
参考文献
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Schneider, Z. および Stroinski, A. (1987). Comprehensive B12, de Gruyter, Berlin, pp. 358.
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，メリーランド州から与えられた補助金番号Ｒ０１ＣＡ７３００３およびＣＡ８７６８５下、部分的には政府の支援でなされた。合衆国政府は本発明においてある種の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は、（ここではＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒｓという場合もある）蛍光コバラミンおよびこれらの化合物の使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、コバラミンに共有結合した蛍光、リン光、ルミネセント、光−発生化合物よりなる蛍光コバラミンに関する。これらの蛍光コバラミンは、（ａ）癌細胞を含むリンパ節の同定を含め、健康な細胞および組織から癌細胞および組織を区別し、および（ｂ）コバラミン−ベースの治療バイオコンジュゲートを用いる化学療法に個体が陽性的に応答するかを判断するための診断および予後マーカーとして用いることができる。
【０００３】
発明の背景を明らかにし、特定の場合には、実施に関してさらに詳細を供するために本明細書中で用いる刊行物および他の資料は引用により本明細書の一部と見なし、便宜のため、以下の本文においては、著者および日付によって参照し、添付のビブリオグラフィーにおいて著者によりアルファベット順にリストする。
【０００４】
迅速に分裂する細胞は、ＤＮＡ複製に先立って一炭素代謝を支持するために酵素メチオニンシンターゼのための補因子としてコバラミンを必要とする。（Ｈｏｇｅｎｋａｍｐら、１９９９）。急性前骨髄球白血病においては、Ｂ１２結合蛋白質であるトランスコバラミンおよびハプトコリンの濃度の増加のため、血液の不飽和Ｂ１２結合能力の３ないし２６倍の増加が観察される（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９８７；Ｒａｃｈｉｍｅｌｗｉｔｚら，１９７１）。また、固体腫瘍を持つある患者は、トランスコバラミンおよびハプトコリンの循環レベルの有意な増加を呈する（Ｃａｒｍｅｌら．１９７５）。不飽和血清コバラミン結合能力の増加は、迅速に分裂する細胞によるコバラミンの取込増加に対応する。もし１１１Ｉｎのごときガンマ線放出放射性核種を八座キレーターであるジエチレントリアミン四酢酸（ＤＴＰＡ）を介してコバラミンに結合させると、腫瘍は、診断イメージング目的の十分なコバラミンでさえ、隔離する（ＨｏｇｅｎｋａｍｐおよびＣｏｌｌｉｎｓ，１９９７）。これは、移植された線維肉腫を持つマウスにおいて（ＨｏｇｅｎｋａｍｐおよびＣｏｌｌｉｎｓ，１９９７）ならびに乳癌を持つヒトにおいて（Ｃｏｌｌｉｎｓら，１９９９）、および前立腺、肺および脳の腫瘍において（Ｃｏｌｌｉｎｓら，２０００）示されている。
【０００５】
黒色腫および乳癌の外科処置のためのセンチネルリンパ節概念において、色素または放射性核種を腫瘍の周りの組織に注入して、腫瘍を排出する最初のリンパ節を同定する（Ｍｏｒｔｏｎら，１９９２；ＭｃＧｒｅｅｖｙ，１９９８）。この節はセンチネル節と呼ばれ、それは、初代腫瘍を超える転移の程度を測定するために診断テストで取り出される。この手法は議論を呼んでいる。というのも、それは患者の約１２％において転移性病気を検出しないからである（ＭｃＭａｓｔｅｒｓら，１９９９）。注入される色素または放射性核種は癌細胞に対して特異的ではないが、外科医は、腫瘍の領域を排出する初代リンパ節を同定するに過ぎない。癌細胞に特異的な蛍光マーカーを用いることによって高偽陰性率は劇的に改良されるはずである。
【０００６】
かくして、改良された結果を伴って、癌細胞または細胞の診断および予後で用いることができる剤に対する要望が存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、蛍光コバラミンおよびそれらの化合物の使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、コバラミンに共有結合した蛍光、リン光、ルミネセント、または光−発生化合物よりなる蛍光コバラミンに関する。これらの蛍光コバラミンは、（ａ）癌細胞を含むリンパ節の同定を含め、健康な細胞および組織から癌細胞および組織を区別するために、および（ｂ）コバラミン−治療バイオコンジュゲートを用いる化学療法に個体が陽性的に応答するかを判断するために、診断および予後マーカーとして用いることができる。本発明の蛍光コバラミンは、（１）癌細胞による迅速な輸送および貯蔵（最大取込は４ないし６時間において起こる）、（２）非常に低い濃度にて肉眼で検出できる明るいリン光、および（３）非毒性成分の必要な特性を供給する。
【０００８】
本発明の一つの態様において、蛍光、リン光、ルミネセントまたは光−発生化合物がコバラミン（ビタミンＢ１２）に共有結合した蛍光コバラミンが提供される。該蛍光、リン光または光−発生化合物は、コバルト原子、コリン環、またはコバラミンのリボース部位に共有結合することができる。該蛍光、リン光、ルミネセントまたは光−発生化合物はコリン環またはリボース部位に共有結合されるのが好ましい。いずれの蛍光、リン光、ルミネセントまたは光−発生化合物も蛍光コバラミンを調製するのに利用することができるが、可視光線または赤外線で励起できる蛍光、リン光、ルミネセントまたは光−発生化合物を利用するのが好ましい。好ましい蛍光化合物の例は限定されるものではないが、フルオレセイン、フルオレセイン−５ＥＸ、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ、Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、カスケードブルー、ダンシル、ジアルキルアミノクマリン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、２’，７’−ジクロロフルオレセイン、エオシン、エオシンＦ３Ｓ、エリスロシン、ヒドロキシクマリン、リサミンローダミンＢ、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、ＮＢＤ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ロドールグリーン、２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオレセイン、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テキサスレッド、Ｘ−ローダミン、Ｃｙ２色素、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、Ｃｙ５．５色素、または量子ドット構造体を含む。本発明の好ましい蛍光コバラミンは、コバラミンから蛍光またはリン光化合物を分離する必要性なくして可視光線または赤外光によって励起されると蛍光を発する。該光は適当なフィルターを備えたレーザーまたはファイバーオプティック光源によって供することができる。良好な組織への侵入のためには、赤色光が好ましい。
【０００９】
本発明の第２の態様において、蛍光コバラミンを用いて癌細胞を健康な細胞から区別する。本発明のこの態様の１つの具体例において、外科的処置に先立って、蛍光コバラミンを患者に投与する。初代腫瘍におけるか転移性部位におけるかを問わず、癌細胞における蛍光、リン光、ルミネセンスまたは発せられた光の存在は、外科医が組織を規定するのに用いられる。第２の具体例において、腫瘍の位置を排出するリンパ節による取込に適したように蛍光コバラミンは患者に投与される。蛍光、リン光、ルミネセンスまたは発せられた光の存在は、外科的処置の間に除去すべきリンパ節を同定する。この後者の具体例おいて、腹腔鏡検査、内視鏡および顕微鏡技術を用いて、癌細胞を持つリンパ節を同定することができる。これらの技術の使用は陽性リンパ節の同定および検索を容易とする。
【００１０】
本発明の第３の態様において、蛍光コバラミンを用いて、コバラミン−ベースの治療バイオコンジュケートを用いる化学療法に個体が陽性的に応答するかを判断する。この態様においては、蛍光コバラミンを用いて、コバラミンを輸送し、貯蔵する特定の細胞型の能力を定量的におよび定性的に評価する。大量のコバラミンを輸送し貯蔵する種々のタイプの癌は、コバラミン−ベースの治療バイオコンジュゲートでの療法のための良好な候補である。腫瘍細胞コバラミン結合、取込、輸送および貯蔵の定量は、エピ蛍光顕微鏡、蛍光腹腔鏡検査、蛍光内視鏡検査またはフルオロサイトメトによって、肉眼での観察下にて蛍光を測定することによって（例えば、組織スライド）行うことができる。
【００１１】
本発明の第４の態様において、蛍光コバラミンを用いて、血液、血漿、血清、脳脊髄液または尿中のコバラミンのレベルを測定し、または血液、血漿、血清または脳脊髄液における未結合コバラミン結合能力の量を測定する。
【００１２】
本発明の第５の態様において、腹腔鏡または内視鏡可視化用い、いずれの蛍光分子(癌−標的化または非標的化）も検出することができる。
【００１３】
発明の詳細な記載
本発明は、蛍光コバラミンおよびこれらの化合物の使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、コバラミン（ビタミンＢ１２）に共有結合した蛍光化合物（フルオロフォア）、リン光化合物（ホスホロフォア）、ルミネセント化合物（ケミルミネセントクロモフォア）または光−発生化合物を含む蛍光コバラミンに関する。これらの蛍光コバラミンは、（ａ）癌細胞を含むリンパ節の同定を含め、健康な細胞および組織から癌細胞および癌性組織を区別し、および（ｂ）コバラミン−治療バイオコンジュゲートを用いる化学療法に個体が陽性的に応答するかを決定するために診断および予後マーカーとして用いることができる。
本発明の蛍光コバラミンは、一般式：
【００１４】
【化１】
【００１５】
［Ｒ１はＣＮ、ＯＨ、ＯＨ２、ＣＨ３、５’−デオキシアデノシンまたは（ＣＨ２）ｐＮＨＣ（＝Ｓ）Ｙであり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は独立してＣＯＮＨ２またはＣＯ−ＸｍＹであり；Ｒ８はＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；Ｒ９はＯＨまたはＯ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；Ｘは式Ｎ（ＣＨ２）ｎＮＨＯ（Ｃ＝Ｏ）またはＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨを有するリンカーであり；Ｙはフルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子であり；ｍは０または１であり、ｎは０ないし５０であって、ｐは２ないし１０であり、但し、Ｒ１ないしＲ９の基のうちの少なくとも１つはＹを含み、さらに、
Ｒ１がＣＮ、ＯＨ、ＯＨ２、ＣＨ３、５’−デオキシアデノシンまたは（ＣＨ２）ｐＮＨＣ（＝Ｓ）Ｙであり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７が独立してＣＯＮＨ２またはＣＯ−ＸｍＹであり；Ｒ９がＯＨまたはＯ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；ｍが１であり；ＸがＮ（ＣＨ２）ｎＮＨＯ（Ｃ＝Ｏ）であって；Ｒ１ないしＲ７およびＲ９の基のうちの少なくとも１つがＹを含む場合、Ｒ８はＣＨ２ＯＨではなく；かつ
Ｒ１がＣＮ、ＯＨ、ＯＨ２、ＣＨ３、５’−デオキシアデノシンまたは（ＣＨ２）ｐＮＨＣ（＝Ｓ）Ｙであり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７が独立してＣＯＮＨ２またはＣＯ−ＸｍＹであり；Ｒ９がＯＨまたはＯ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；ｍが０であって；Ｒ１ないしＲ７およびＲ９の基のうちの少なくとも１つがＹを含む場合、Ｒ８はＣＨ２ＯＨではない］
によって表すことができる。少なくともＲ８はＹを含むことが好ましい。
【００１６】
本発明の蛍光コバラミンは、フルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子をコバラミンに共有結合させることによって調製される。該フルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子は、直接的にまたはリンカー分子を介して、コバルト原子、コリン環またはリボース糖に共有結合される。共有結合は、好ましくは、リンカー分子の使用で達成される。該フルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子がコバラミンのコバルト原子に結合すれば、コバルト原子のスピンによる消光を介して、蛍光、リン光または発せられた光はその強度が減少する。加えて、蛍光コバラミンが光に長く暴露されると、コバルト−炭素結合が切断され、フルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子がコバラミンから放出される（Ｈｏｗａｒｄら，１９９７）。かくして、フルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子をコバラミン分子のコリン環またはリボース部位に結合させるのが好ましい。これらの後者の蛍光コバラミンは、フルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子がコバルト原子に共有結合した蛍光コバラミンの不利な点を有しない。
【００１７】
フルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子のコリン環または５’−リボースヒドロキシ基上のカルボキシレートへの結合は、より低い感度および光不安定性の問題を回避する。一般に、コリン環カルボキシレート誘導体（ＣｏｌｌｉｎｓおよびＨｏｇｅｎｋａｍｐ，１９９７）は知られているが、蛍光マーカーを含む化合物は合成されていない。フルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子は、公表された方法に従ってコバラミンモノカルボキシレートを誘導体化することによって、コバルト原子よりはむしろ、コリン環に直接結合させることができる（ＣｏｌｌｉｎｓおよびＨｏｇｅｎｋａｍｐ，１９９７およびそこに引用された文献）。図１は、本発明による修飾で用いることができるコバラミン上の部位を示す。
【００１８】
いずれのフルオロフォア、ホスホロフォア、ケミルミネセントクロモフォアまたは光−発生分子も蛍光コバラミンを調製するのに利用することができるが、可視光または赤外光で励起することができるフルオロフォアを利用するのが好ましい。蛍光コバラミンのイン・ビボ使用では、可視光または赤外光を用いるのが好ましい。好ましいフルオロフォアの例は、限定されるものではないが、フルオレセイン、フルオレセイン−５ＥＸ、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、カスケードブルー、ダンシル、ジアルキルアミノクマリン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオセレイン、２’，７’−ジクロロフルオレセイン、エオシン、エオシンＦ３Ｓ、エリスロシン、ヒドロキシクマリン、リサミンローダミンＢ、メトキシクマリン、ナフトフルオレセイン、ＮＢＤ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、ＰｙＭＰＯ、ピレン、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、ロドールグリーン、２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホンフルオレセイン、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テキサスレッド、Ｘ−ローダミン、Ｃｙ２色素、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素、Ｃｙ５．５色素、または量子ドット構造体を含む。本発明の好ましいフルオレセインは、フルオロフォアをバイオコンジュゲートから切断する必要性なくして、可視光または赤外光によって励起されると蛍光を発する。該光は、適当なフィルターを設けたレーザーまたはファイバーオプティック光源によって供することができる。良好な組織への侵入のためには赤色光が好ましい。
【００１９】
正常および白血病人骨髄において蛍光コバラミンアナログの異なる取込があることが判明した。正常骨髄細胞および白血病骨髄芽細胞（癌細胞）の間の差は特に注目すべきであり、正常細胞によって摂取されるコバラミンは検出できない。健康な個体からの骨髄細胞は蛍光標識を示さない。また、元来潜在的化学療法化合物として合成された、ドキソルビシン−コバラミンコンジュゲートの取込があることも判明した。該ドキソルビシン−コバラミンコンジュゲートの細胞取込は、Ｐ−３８８ネズミ白血病細胞ならびにＨＣＴ−１１６ヒト結腸腫瘍細胞で観察することができる。かくして、コバラミンの蛍光誘導体の取込は白血病および固体腫瘍細胞系で起こる。これらの結果は、全ての癌細胞がコバラミンの輸送および貯蔵を増加させるという知識と組み合わせると、癌細胞を正常な細胞から区別する蛍光コバラミンの使用の一般的適用性を証明する。
【００２０】
かくして、本発明の蛍光コバラミンは、
・蛍光顕微鏡、蛍光腹腔鏡検査、蛍光内視鏡検査またはフローサイトメトリーを介して肉眼で癌性組織を同定し；
・組織バイオプシーからの組織切片または試料中の癌性細胞を同定し；
・イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにおいて腫瘍の境界を画定し；
・イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて癌を診断し、検出し、予後し、予測しまたはモニターし；
・イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて転移性癌を同定し；
・癌の進行段階を判断し；
・経皮的に癌を同定し；
・転移性癌を経皮的に同定し；
・腹腔鏡検査または内視鏡検査のごとき最小限侵入的技術の使用を含め、センチネルリンパ節または複数リンパ節、または腋窩リンパ節また複数リンパ節を含めたリンパ節において癌を同定し；
・乳癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、上皮癌（腺癌）、肝臓癌、黒色腫およびリンパ腫のごとき癌の治療、検出、予測、予後またはモニタリングにおいて転移性病気を同定し；
・白血病またはリンパ腫を診断し、予測し、予後し、モニターしまたは特徴付けるために、骨髄吸引物または末梢血液試料のフローサイトメトリー実験を行い；
・コバラミン−療法バイオコンジュゲートの使用に基づく化学療法に患者が陽性的に応答するか否かを予測し；
・バイオプシーまたはランペクトミーにおいて腫瘍の微細境界の画定を改良し；
・バイオプシー、ランペクトミーまたは腫瘍摘除において癌細胞を残す確率を減少させ、それにより、残りの癌細胞を除去するために、補足的外科処置の必要性を減少させるのに用いることができる。
【００２１】
予測とは、腫瘍の生物学的挙動、腫瘍が療法に対してどのように（好都合にまたは不都合に）応答するかの理解をいう。予後とは、療法後の患者の予測される結果（すなわち、療法後の５年または１０年生存の可能性）をいう。モニタリングとは、治療後の残存する病気の療法および検出の成功の判断をいう。その例は、白血病の治療後に骨髄芽細胞の存在につき骨髄をテストするための蛍光コバラミンコンジュゲートの使用である。特徴付けとは、密接に関連したタイプの腫瘍を比較した、腫瘍のタイプの記載または定量的分類をいう。
【００２２】
本発明の蛍光コバラミンは、当該分野で知られた慣用的癌の診断、検出、予測、予後、モニタリングまたは特徴付けの方法に従って投与することができる。例えば、蛍光コバラミンは静脈内、鞘内、腫瘍内、筋肉内、リンパ内または経口投与することができる。典型的には、本発明の蛍光コバラミンは医薬上許容される担体と混合される。該担体は、投与で望まれる製剤の形態、例えば、経口、非経口、静脈内、鞘内、腫瘍内、腫瘍周辺および硬膜外に応じて、広く種々の形態をとることができる。該組成物は、抗酸化剤、安定化剤、保存剤等をさらに含むことができる。技術およびプロトコルの例はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出すことができる。投与すべき蛍光コバラミンの量は、典型的には、１ないし５００ｍｇである。
【００２３】
本明細書中に示すごとく、コバラミンアナログは、ハプトコリン（ＴＣＩまたはＨＣ）、内生因子（ＩＦ）またはトランスコバラミン（ＴＣＩＩ）のごときコバラミン輸送蛋白質によって高い親和性でもって認識される。大きな分子のコバラミンへの結合は蛋白質結合に影響しないようである。
【００２４】
リンパ節における転移性病気を同定する外科医の能力の改良は、例えば、健康な組織を保存し、除去される腋窩リンパ節の数を最小化することによって、外科的療法を進歩させる。これは、患者の生活の質を改良し、罹患率および長期死亡率を改良する。リンパ節まで広がった癌細胞の正確な同定は、健康な腋窩節を容赦しつつ、病的管および節のみの除去を可能とする。本発明は極めて価値がある。例えば、毎年の乳癌の１８６，０００の新しい事例において、初代腫瘍を除去し、関連するリンパ節の状態を測定する外科的処置の数はかなりのものである。全ての腋窩リンパ節および管の形式的な除去は、局所的な浮腫および増大した罹患率に導く。転移性癌細胞を含む腋窩リンパ節および管の非−除去は、減少した生存および増加した長期の死亡率に導く。
【００２５】
センチネルリンパ節バイオプシーアプローチにおいて、青色色素および／または放射性トレーサーを腫瘍近くの乳房に注入する。腕の下で小さな切除を行って、色素の痕跡または放射能を探し、乳房の領域を排出し、その結果、転移性癌細胞を最も含みそうなリンパ節を同定する。本発明によると、蛍光コバラミンは、センチネルリンパ節バイオプシーで現在用いられる青色色素および放射性同位体トレーサーを置き換える。本発明の蛍光コバラミンの使用は、全てのタイプの癌へのセンチネルリンパ節バイオプシーアプローチの適用を可能とする。加えて、本発明の蛍光コバラミンは、癌の分析、特に、リンパ節における癌細胞の分析における、腹腔鏡、内視鏡および顕微鏡技術のごとき最小限に侵入的な技術の使用を可能とする。蛍光コバラミンの使用は、陽性リンパ節の同定および検索を容易とする。かくして、本発明によると、蛍光コバラミンは、以下の：乳房、皮膚（黒色腫）、婦人科（卵巣、前立腺、子宮、頚部、外陰部、陰茎、精巣）、頭部および首（唇、舌、口、咽頭）、消化器官（食道、胃、小腸、大腸、直腸、結腸、肝臓、すい臓）、骨、結合組織、泌尿器官（膀胱、腎臓）、眼、脳および中枢神経系、内分泌腺（胸腺）、リンパ組織、ホジキン病、非−ホジキン病、リンパ種、多発性骨髄腫の癌または複数癌で用いることができる。
【００２６】
加えて、本発明の蛍光コバラミンの使用は、癌細胞を含有し、かつ除去されなければならないリンパ節の同定に対して、腹腔鏡および内視鏡技術のごとき最小限に侵入的な技術の使用を可能とする。この提案された技術が、より正確で苦痛の少ない方法で、手術可能な乳癌を持つ患者において腋窩リンパ節を外科的に調べる２つの現在の方法を置き換えるように設計される。今日用いられている２つの手術は、大きな切除（ほぼ５インチ）を用い、低レベルのリンパ節（１０−１５）の全てを除去する標準的な腋窩節切開である。第２の現在の実験方法は、センチネルリンパ節バイオプシーである。この方法は、第１のリンパ節を同定して、乳房を排除するのに目に見える色素またはガンマエミッターいずれかを用いる。これは、同様に、大きな切除およびリンパ経路の技術的に挑戦される調査を必要とする。本発明のコバラミン分子は、癌を持つ節に対してフルオロフォアを採用する。リンパ節は、腹腔鏡装置を用いる３つの小さな切除（３−５ｍｍ）を介して直接的に調べる。密接な手術技術は、レーザー励起に対して暗い視野を提供する。腫瘍を担うリンパ節におけるコバラミン−フルオロフォアからの刺激された光の明るい発光は、陽性リンパ節の同定および検索を容易とするであろう。この方法の結果、切開はより小さく、苦痛はより少なく、かつ精度は良好となる。同様な原理は、内視鏡技術で癌細胞を検出する蛍光コバラミンの使用に適用される。
【００２７】
さらに、本発明の蛍光コバラミンは癌細胞によって異なって取り入れられるので、これらの蛍光コバラミンは、外科医が癌性組織を選択的に切除し、それにより、健康な組織を残すことができるのを可能とする改良されたマーカーである。
【００２８】
腹腔鏡または内視鏡により検出されるべき癌細胞に結合した蛍光コバラミンの能力は、蛍光分子を用いて、腹腔鏡または内視鏡によりセンチネルリンパ節を測定することができる。かくして、いずれの蛍光分子（癌−標的化または非−標的化）も、腹腔鏡または内視鏡可視化を用いてリンパ節で検出することができる。その例として、現在、センチネルリンパ節手法で行われているように、赤色フルオロフォアを腫瘍内に注入することができよう。腋窩の通気は、外科医が、蛍光節を（２つの小さな切除を介して）腹腔鏡により見出し、それにより、センチネル節の一般的位置を見出すのを助けるための放射性トレーサーの使用を回避することを可能とする。
【００２９】
本発明の蛍光コバラミンは、手術内マーカーとしていくつかの改良を提供する。これらの改良は、以下のものを含む：
・蛍光マーカーはいずれの節が周期的骨盤窩を排出しているかを単に示すよりはむしろ、リンパ管および節中の癌細胞に特異的である。また蛍光マーカーは癌細胞を健康な細胞から区別する。
・該マーカーは、蛍光検出によって供される内生感度のため、低濃度で用いることができる。現在用いられている青色色素は活性な節をあいまいとする傾向にあり、病理学者により組織の外科処置後の調査を複雑化する。また、青色色素は出血する血管をあいまいとする傾向にあり、それにより、節の外科的切除および引き続いての創傷の閉鎖を複雑化する。蛍光マーカーの使用はこれらの問題を回避するはずである。
・癌細胞に特異的な蛍光マーカーは、現在実施される手法で見られるような、５ないし１０％の偽陰性率を改良する。
・増大した偽陰性率は、患者および外科医によるこの技術の許容性を改良する。これは、外科医がこの手法を学ぶのに必要な訓練時間（典型的には、完全な軸方向の節の切開、３０以上のケース）を減少させる。
・蛍光マーカーは、癌細胞の可視化のための腹腔鏡、内視鏡および顕微鏡技術の使用を可能とする。また、これらの技術を用いて、初代腫瘍、転移性腫瘍、腋窩リンパ節、鼡径リンパ節および頚部リンパ節を可視化することができる。これらの技術は、癌の分析において、大きな切除およびリンパ経路の技術的に挑戦する調査の必要性を低減化する。これらの技術の結果、切開は小さくなり、苦痛が少なくなり、精度は良好となる。
【００３０】
本発明のさらなる具体例において、血液、血漿、血清または他の体液中の天然に生じるコバラミン（ヒドロキソコバラミン、メチルコバラミン、アデノシルコバラミンまたはシアノコバラミン）の濃度または量を測定するために競合的結合アッセイで用いることができる。このタイプのアッセイにおいて、蛍光コバラミンは、当業者によく知られた競合結合アッセイにおける放射性標識コバラミンの代わりに用いられる。コバラミンについての放射性アッセイは、とりわけ、ここに引用して、その各々を本明細書の一部とみなす米国特許第６，０９６，２９０号；第５，６１４，３９４号；第５，２２７，３１１号；第５，１８７，１０７号；第５，１０４，８１５号；第４，６８０，２７３号；第４，４６５，７７５号；第４，３５５，０１８号に記載されてきた。このアッセイ手法を用いて、血液、血漿、血清または体液中の不飽和コバラミン結合能力の量、ならびに蛋白質トランスコバラミン、ハプトコリンまたは内生因子に結合したコバラミンの濃度を測定することができる。蛍光コバラミンの使用は、臨床化学結合アッセイにおける放射性標識コバラミンよりも有意な利点を有する。なぜならば、それは、放射性−標識コバラミンに伴う特別な出荷、取り扱いおよび廃棄手法を必要としないからである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、コバラミン分子に対する修飾するための部位を示す。
【図２】図２は、本発明による１つの蛍光コバラミンの合成を示す。
【図３】図３は、コバラミンモノカルボン酸の合成を示す。
【図４】図４は、コバラミンカルボン酸と１，１２−ジアミノドデカンとのコンジュゲーションを示す。
【図５】図５は、フルオレセイン−５ＥＸ−ＮＨＳエステルとジアミノドデカンコバラミン誘導体とのコンジュゲーションを示す。
【図６】図６は、フルオレセイン−５ＥＸ−ｂ−コバラミン誘導体ＣＢＣ−１２３の蛍光発光スペクトルを示す。
【図７】図７は、ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙの合成を示す。
【図８】図８は、ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙ（Ｃｙ５ ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ）の蛍光発光スペクトルを示す。
【図９】図９は、ＣＭ５ ＢＩＡｃｏｒｅチップに対するコバラミンアナログの固定化を示す。
【図１０】図１０は、競合アッセイセンソルグラムを示す。
【図１１】図１１は、ＴＣＩＩ結合についてのコバラミンの競合を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａは、コバラミン、コバラミンアナログおよびＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒについてのＫｄ値を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、コバラミン、コバラミンアナログおよびＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒについてのＫｄ値を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、コバラミン、コバラミンアナログおよびＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒについてのＫｄ値を示す。
【図１３】図１３は、動物モデルにおける腫瘍イメージングを示す。
【図１４】図１４は、新形成乳房組織における腫瘍イメージングを示す。
【図１５】図１５は、新形成リンパ節組織における腫瘍イメージングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
実施例
以下に実施例を挙げて本発明をさらに記載するが、それは例示的として掲げるのであって、断じて本発明を限定する意図のものではない。当該分野でよく知られた標準的な技術および後に具体的に記載する技術を利用した。
【００３３】
実施例１
フルオロフォアのコバルトへの結合による蛍光コバラミンの合成
コバラミン局所化の目で見えるインジケーターとして、フルオレセインをコバラミンに共有結合させることによって、コバラミンの５つの蛍光アナログを調製した。緑色光の照射下で、フルオレセイン分子は黄色光を発し、これは０．１ｐｐｍよりも低い濃度までの暗く適合された目によって検出することができる。この発光は、エピ蛍光顕微鏡を介する、ならびに肉眼での観察による癌細胞の感度の良い検出を可能とする。５つの蛍光コバラミンの各々は、固有の蛍光を呈した。これらの化合物の全ては、公表された技術に従って、塩化アミノプロピルをコバ（Ｉ）ラミンと反応させて、アミノプロピルコバ（ＩＩＩ）ラミンを生じさせることによって合成した。引き続いての工程において、アミノプロピルコバ（ＩＩＩ）ラミンを種々のフルオロフォアイソチオシアネート（すなわち、フルオレセインイソチオシアナート「ＦＩＴＣ」）と反応させて、アミノプロビルリンカーを介してコバラミンに結合した対応するフルオロフォア（すなわち、フルオレセイン−アミノプロピル−コバ（ＩＩＩ）ラミン）を得た。この酵素の反応を、図２に示す。
同様にして、フルオロフォアがナフトフルオレセインまたはオレゴングリーンである蛍光コバラミンを調製した。全ての蛍光コバラミンは、組換えトランスコバラミン（ｒｈＴＣＩＩ）に対して高い親和性を保持し、かくして、天然に生じるコバラミンで観察されるのと同様な生物学的分布を可能とすることが判明した。
【００３４】
実施例２
癌細胞によるコバラミンアナログの取込
白血病骨髄芽細胞調製物は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）Ｍ１を有する６１歳の患者の骨髄から作成した（ＦＡＢ分類において、最小限に成熟した骨髄芽細胞）。実施例１に記載されたごとく調製した蛍光コバラミンで、細胞を収穫３日後に処理した。正常および白血病ヒト骨髄における、蛍光顕微鏡または蛍光フルオサイトメトリーによって測定した、蛍光コバラミンアナログの異なる取込が見出された。正常骨髄細胞および白血病骨髄芽細胞（癌細胞）の間の差は特に注目すべきであり、正常細胞によって取り込まれるコバラミンは検出できない。健康な個体からの骨髄試料は蛍光標識を示さなかった。もともと、優れた化学療法化合物として合成されたドキソルビシン−コバラミンコンジュゲートが、Ｔ−３８８ネズミ白血病細胞およびＨＴＣ−１１６ヒト結腸腫瘍細胞で観察された。これらの結果は、白血病および固体腫瘍細胞系におけるコバラミンの蛍光誘導体の取込を説明する。
【００３５】
実施例３
シアノコバラミンモノカルボン酸の調製
ｂ−、ｄ−およびｅ−モノカルボン酸はシアノコバラミンの酸触媒加水分解によって調製した。図３参照。簡単に述べれば、シアノコバラミン（５２７．０ｍｇ，０．３８９ミリモル）を１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、４０ｍｌの０．５Ｍ ＨＣｌに溶解させた。フラスコを５０℃の水浴に入れ、４時間攪拌した。表１に掲げたグラジエントを用い、反応をＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ， Ｉｎｃ． ３．９×３００ｍｍ ＤｅｌｔａＰａｋ １００ Ｃ−１８カラム）を介してモニターした。
【００３６】
【表１】
【００３７】
４時間後、反応を室温まで冷却した。ｐＨメーターを用い、ｐＨをＮａＯＨ（１０％）で７．０に調整した。まず、当該カラムを１０ｍｌのメタノール、続いて、１５ｍｌの脱イオン水ですすぐことによって、粗物質をＣ−１８ ＳｅｐＰａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ， Ｉｎｃ． Ｐ／Ｎ ＷＡＴＯ２３６３５）を用いて脱塩した粗物質をシリンジを介してカラムに適用し、１０ないし１５ｍｌの脱イオン水ですすぎ、続いて、１０ｍｌのメタノールで溶出した。回転蒸発を介してメタノールを除去し、赤色化合物が得られた（５０１６−１２−３３）。
【００３８】
粗反応混合物を最小量の脱イオン水で溶解させ、表２に計算されたグラジエントを用い、溶液の半分を半分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ， Ｉｎｃ． ２５．０×３００ｍｍ １００ Ｃ−１８カラム）に注入した。
【００３９】
【表２】
【００４０】
大きな試験管を用いて、２８．０分（ｂ−モノカルボン酸、ＣＢＣ１９５）、３０．１分（ｄ−モノカルボン酸、ＣＢＣ−２２６）および３４．６分（ｅ−モノカルボン酸）におけるピークを収集した。純粋な画分を脱イオン水で１：１希釈し、前記したのと同様に脱塩した。全ての場合、赤色固体が得られた。
【００４１】
ＣＢＣ−１９５（ｂ−モノカルボン酸）：２つの分取ランにおいて、７４．８ｍｇのｂ−モノカルボン酸（１４．４％）が単離された。予期されたごとく、Ｍ＋１ピーク（１３５６）およびＭ＋２２ピーク（１３７８）を示す陽イオン電子スプレー質量スペクトル（ＥＳ＋）が得られた。ｂ−モノカルボン酸（ＣＢＣ−１９５）は１４％の全収率で得られた。
【００４２】
ＣＢＣ−２２６（ｄ−モノカルボン酸）：２つの分取ランにおいて、３８．６ｍｇのｄ−モノカルボン酸（７．３％）が単離された。予測したごとく、Ｍ＋１ピーク（１３５６）および対応するＭ＋Ｎａピーク（１３７８）を示す陽イオン電子スプレー質量スペクトル（ＥＳ＋）が得られた。ｄ−モノカルボン酸（ＣＢＣ−２２６）は７％の全収率で得られた。
【００４３】
ｅ−モノカルボン酸は１４％の全収率にてほぼ７８ｍｇが単離された。
【００４４】
実施例４
ＣＮＣｂｌ酸と１，１２ジアミノデカンとのコンジュゲーション
ｂ−およびｄ−アミンは図４に示すごとく調製した。ＣＢＣ−１９５（５５．４ｍｇ，０．０４０８ミリモル）を小さなガラスバイアルに添加し、約２．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解させ、続いて、ＥＤＣＩ ＨＣｌ（１２ｍｇ．０．０６２６ミリモル）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（２５ｍｇ，０．２１７ミリモル）を添加した。反応を室温にて一晩攪拌した。以前の試みにより、反応を駆動して完了させるには数当量のＥＤＣＩおよびＮＨＳ（合計６当量）が必要であった。２４時間後、さらに１当量のＥＤＣＩを添加し、合計２６時間以内に反応は完了した。表３のグラジエントを用いて、反応をＨＰＬＣを介してモニターした。ＣＢＣ−１９５は９．０７分の保持時間を有し、ＣＢＣ−１９５のＮＨＳ−エステルは１０．５５分の保持時間を有する。
【００４５】
【表３】
【００４６】
別のグラスバイアル中にて、１，１２−ジアミノドデカン（８１．８ｍｇ，０．４０８ミリモル）を約２ｍｌのＤＭＳＯに溶解させた。４．０ｍｌ／時間にてシリンジを用い、前記反応混合物を滴下して二量体化を最小化させた。生成物は直ちに形成され、１４．５６分の保持時間を有する。粗反応混合物を１００ｍｌの１：１ ＣＨ２Ｃｌ２：Ｅｔ２Ｏに添加し、赤色沈殿が形成された。ガラスフリットを用い、赤色化合物を濾過し、ＣＨ２Ｃｌ２の２０ｍｌの２回分、アセトンの２０ｍｌの２回分、および最終的にＥｔ２Ｏの２０ｍｌの２回分で洗浄した。
【００４７】
粗反応生成物を再少量の脱イオン水に溶解させて表４に計算されたグラジエントをを用いて溶液を半分取ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．，２５．０×１００ｍｍ １００ Ｃ−１８カラム）に注入した。
【００４８】
【表４】
【００４９】
大き試験管を用い、８．７０分におけるピーク（ｂ−アミン、ＣＢＣ−２０８）を収集した。純粋な画分を蒸留水で１：１希釈し、まず、当該カラムを１０ｍｌのメタノールで、続いて、１５ｍｌ脱イオン水ですすぐことによって、Ｃ−１８ ＳｅｐＰａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ， Ｉｎｃ． Ｐ／Ｎ ＷＡＴＯ２３６３５）を用いて脱塩した。シリンジを介して純粋な物質をカラムに適用し、１０ないし１５ｍｌの脱イオン水ですすぎ、続いて、１０ｍｌのメタノールで溶出した。回転蒸発を介してメタノールを除去し、６ｍｇの赤色化合物が得られた。
【００５０】
ＣＢＣ−２０８（ｂ−アミン）：合計６．０ｍｇのアミンが単離されたと予測されるごとく、Ｍ＋１ピーク（１５３８）およびＭ＋２３ピーク（１５６０）を示す陽性イオン電子スプレー質量スペトクトル（ＥＳ＋）が得られた。ＣＢＣ−２０８は、精製の後、９．５％の収率で得られた。
【００５１】
ＣＢＣ−２２６（ｄ−アミン）：表３におけるのと同一のＨＰＬＣグラジエントを用い、ｄ−モノカルボン酸は、９．３２分のＨＰＬＣ保持時間を有し、ＮＨＳ−エステルは１０．９６分において移動し、ｄ−アミン（ＣＢＣ−２２６）は１４．９３分において移動する。予測されるごとく、Ｍ＋１ピーク（１５３８）および対応するＭ＋Ｎａピーク（１５６０）を示す粗物質の陽イオン電子スプレー質量スペクトル（ＥＳ＋）が得られた。
【００５２】
実施例５
ＣＢＣ−２０８およびフルオレセイン−５ＥＸ−ＮＨＳのコンジュゲーション
ＣＢＣ−２０８は、図５に従い、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．から入手可能な）フルオレセイン誘導体のフルオレセイン−５ＥＸにカップリングされている。ＣＢＣ−２０８（６．０ｍｇ，３．８７μモル）を小さなグラスバイアルに添加し、約０．５ｍｌのＤＭＳＯに溶解させ、続いて、フルオレセイン−５ＥＸ−ＮＨＳ（２．５ｍｇ，４．２３μモル）を添加した。反応物を室温にて一晩攪拌した。表５中の方法を用い、反応をＨＰＬＣを介してモニターした。
【００５３】
【表５】
【００５４】
反応は最初非常に迅速に進行し、１０分間の接触後に過ぎないのに所望の生成物を形成した。ＣＢＣ−２０８は１１．４７分の保持時間を有し、生成物（ＣＢＣ−１２３）は１４．２４分の保持時間を有する。さらに１当量のフルオレセイン化合物を添加すると、反応は完了し、粗混合物は８８％純度である。
【００５５】
出発物質フルオレセイン−５ＥＸ−ＮＨＳのＨＰＬＣ分析はそれが７５％純度に過ぎないことを示し、これは、反応を駆動させて完了させるのになぜさらなる当量が必要であるかを説明する。
【００５６】
ＣＢＣ−１２３（ｂ−フルオレセインコバラミン誘導体）：この化合物は合成からの粗単離物と同様にほぼ９０％純度であり、不純物の大部分は未反応のＣＢＣ−２０８である。Ｍ＋１ピーク（２０１３）および対応するＭ＋Ｎａピーク（２０３５）を示す粗物質の陽イオン電子スプレイ質量スペクトル（ＥＳ＋）が得られた。精製前収率は２２％である。
【００５７】
３５０ｎｍにおける励起での光分解の前および後に、本化合物の蛍光スペクトルを粗化合物から取った（図６参照）。光分解の前および後に蛍光の有意な変化はなく、これは、当該化合物が光安定であり、明らかに蛍光性であって、コバラミンの近くからの減少した蛍光を呈しないことを示唆する。
【００５８】
実施例６
顕微鏡を介する乳癌組織のエクス・ビボ調査
正常周辺組織が付着した乳癌を含む悪性および良性腫瘍の試料を患者から切り出す。これらの試料は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）およびＨｕｎｔｓｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＣＣＩＣ）の同意の下に採取する。生きた組織の試料を、前記で調製した蛍光コバラミン誘導体の１つと共に４ないし６時間インキュベートする。各試料の薄い組織片をクリオミクロトームで調製し、エピ蛍光顕微鏡によって、蛍光マーカーの量を正常および癌性組織で定量する。解剖病理学者による評価のため、対応する組織片をヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染料で染色する。正常および癌性細胞の間の界面を注意深く調べる。腫瘍内部からの細胞も蛍光マーカーの取込について調べる。というのは、腫瘍の低酸素領域内の細胞がしばしば代謝を低下させているからである。
【００５９】
より具体的には、最少必須培地、アルファ修飾（α−ＭＥＭ；７．５％新生ウシ血清、２．５％胎児ウシ血清、０．２％ナイスタチン、２．５％ペニシリン／ストレプトマイシン、ｐＨ７．２；Ｓｉｇｍａ）を調製し、滅菌された２５ｍＬのネジ頂部組織培養フラスコに一部を入れた（１０ｍＬ）。培地を３７℃とし、組織試料を、α−ＭＥＭ中の蛍光標識コバラミン（５０ｎＭ；実施例１のコバラミン−オレゴングリーンおよびコバラミン−ナフトフルオレセインコンジュゲートおよび実施例５のコバラミン−フルオレセインコンジュゲート）および組換えヒトＴＣＩＩ（５０ｐＭ）と共にインキュベートした。ヒト乳房組織試料はＩＲＭ−認可のプロトコルに従って獲得した。組織をフラスコから取り出し、ダルベッコウのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ）で洗浄し、凍結切片スライシング用のＯＣＴ化合物（Ｓｈａｎｄｏｎ）と共に−２０℃の真鍮プレート上に設置した。−２０℃にて、ＣＴＤ Ｈａｒｒｉｓクリオスタット中で組織をスライスした（４ないし６μｍ片）。薄い組織片を小さな美術用のブラシで後ろに引き、１００％エタノールで顕微鏡スライドグラスに固定した。標準ヘマトキシリン染色手法：９５％エタノール、２０秒；水、５秒；ヘマトキシリン（Ｆｉｓｈｅｒ）、４５秒；水、５秒；藍染料液（水道水）、１０秒；９５％エタノール、１０秒；１００％エタノール、１０秒；キシレン、１０秒；およびキシレン、１０秒を用いて、スライドを染色した。相コントラストおよびエピ蛍光顕微鏡によって、１０×、６０×および１００×倍率でスライドを評価した。
【００６０】
３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムチアゾリルブロマイド（ＭＴＴ；Ｓｉｇｍａ）を用いて、蛍光コバラミンでの３時間のインキュベーションの時間の後に組織の代謝能力を定量的に測定した。組織の一部を培地から取り出し、ＤＰＢＳで洗浄し、ＭＴＴ（２ｍＬ；２．５ｍｇ／ｍＬ）に浸漬した。３７℃の５％ＣＯ２雰囲気下にてこの組織を３時間インキュベートした。このインキュベーション期間の間に、コハク酸脱水素酵素活性によると、組織試料中の生きた細胞はＭＴＴ色素を紫色ホルマザンまで還元した（ＣｅｌｉｓおよびＣｅｌｉｓ，１９９８）。組織をＤＰＢＳで洗浄し、前記にて概説したクリオミクロトーム手法に従って調製して、組織の代謝能力を確実とした。
【００６１】
蛍光コバラミンバイオコンジュゲートは、新形成および健康乳房組織双方において幾分蓄積し、新形成乳房組織は、健康な乳房組織よりも多くの蛍光コバラミンを隔離した。健康な乳房組織によって隔離された蛍光コバラミンの量は予測したよりも大きいが、それは、健康な細胞による有意な内部化よりもむしろ結合組織内の構造への非特異的結合によるものと考えられる。
【００６２】
実施例７
リンパ節における癌細胞のエクス・ビボ調査
転移性病気を持つ切り出したリンパ節を患者から取り出し、前記調製の蛍光コバラミン誘導体のうちの１つと共に４ないし８時間インキュベートする。各リンパ節を切片化し、蛍光コバラミンの癌細胞への輸送につき顕微鏡で調べる。この実験は、イメージングおよび可視化のために十分な蛍光コバラミンを取り込むリンパ節内の転移性細胞の能力を示した。
【００６３】
実施例８
患者がコバラミン−ベースの治療バイオコンジュゲート化学療法に好都合に応答するか否かを判断するための蛍光コバラミンの使用
白血病を持つ患者からの骨髄吸引物および末梢血液試料を蛍光コバラミンコンジュゲートと共にインキュベートする。４ないし８時間後、骨髄吸引物または末梢血液試料を洗浄して、取り込まれなかった蛍光標識を除去し、エピ蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによる定性的または定量的蛍光分析に細胞試料を付す。有意な量の蛍光コバラミンを取り込んだ細胞はより明るい蛍光を呈する。有意な量の蛍光コバラミンの取り込みは、患者の白血病のタイプが、コバラミン−ベースの治療剤での治療に好都合に応答するであろうことを示す。蛍光コバラミンコンジュゲートでの処理の後に有意な蛍光を示さない骨髄吸引物または末梢血液試料は、当該患者がコバラミン−ベースの治療コンジュゲートに好都合に応答しないであろうことを示す。同様のアプローチを固体腫瘍に適用することができる。この場合、切り出した腫瘍組織の一部を蛍光コバラミンコンジュゲート共にインキュベートし、約４ないし８時間後、腫瘍組織中の蛍光を定量する。腫瘍組織によって呈される蛍光が大きくなれば、癌が、コバラミン−ベースの化学療法での治療に好都合に応答するであろう確率は大きくなる。
【００６４】
実施例９
ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙの合成
一般的脱塩手法。２カラム容量のメタノールおよび３カラム容量の脱イオン水でカートリッジをコンディショニングすることによって、全てのコバラミンを１０ｇのＣ−１８ ＳｅｐＰａｋ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．）で脱塩した。コバラミンをカラムに適用し、３カラム容量の脱イオン水で洗浄し、メタノール（１０ｍＬ）で溶出させた。回転蒸発を介してメタノールを除去し、生成物を凍結乾燥によって乾燥した。
【００６５】
シアノコバラミン−ｂ−モノカルボン酸の調製。シアノコバラミン−ｂ−モノカルボン酸は修飾された公表プロトコルに従って調製した（Ａｎｔｏｎら，１９８０）。簡単に述べると、ＣＮＣｂｌ（３．５ｇ，２．６ミリモル）を３５０ｍＬの１．０Ｍ ＨＣｌに溶解させた。反応を４時間で３７℃まで加熱し、逆相ＨＰＬＣを介してモニターした。粗物質を脱塩し、次いで、半分取ＨＰＬＣを介して精製した。しかしながら、粗反応混合物は４５％を超えるシアノコバラミンを含有したので（ＨＰＬＣによる）、イオン交換カラムを用いて未反応シアノコバラミンを分離した。粗物質をｄｄＨ２Ｏに溶解させ、２．５×３０ｃｍ Ｄｏｗｅｘ ＡＧ−Ｘ１（アセテート形態）カラムに適用した。ＣＮＣｂｌを脱イオン水でカラムから溶出させた。次いで、３つのモノカルボン酸を０．０４Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）で溶出させ、半分取ＨＰＬＣを介してさらに精製した。ｂ−モノカルボン酸は分析ＨＰＬＣによると９７％純度で単離された（１０％全収率）：ＥＳ＋ ＭＳ：（１：１ Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ） Ｍ＋Ｈ＝１３５６．３（Ｃ６３Ｈ８８ＣｏＮ１３Ｏ１５Ｐとして計算＝１３５６．５）、Ｍ＋Ｎａ＋＝１３７８．４（Ｃ６３Ｈ８８ＣｏＮ１３Ｏ１５ＰＮａとして計算＝１３７８．５）。また、ｄ−およびｅ−モノカルボン酸は、共に、各々、４％および７％の全収率で単離された。
【００６６】
シアノコバラミン−ｂ−モノカルボン酸についての分析ＨＰＬＣ方法：分析クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ−１８ ３００×３．９ｍｍのカラムを用い、２ｍＬ／分の液速で行った。９０％溶液Ａ（０．０５Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ３．０）および１０％溶液Ｂ（９：１アセトニトリルおよび水）の最初の２分間のイソクラティック流動の後、８３．７％のＡおよび１６．３％のＢまでの１６分間の直線グラジエントにより、保持時間が１５．７分の所望のｂ−モノカルボン酸誘導体が溶出された。ｄ−モノカルボン酸は１６．９分の保持時間を有し、ｅ−モノカルボン酸は１９．５分の保持時間を有した。
【００６７】
シアノコバラミン−ｂ−モノカルボン酸についての半分取ＨＰＬＣ：クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ−１８ ２．５×３０ｃｍの半分取カラムを用い、４０ｍＬ／分の液速で行った。９０％溶液Ａ（０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ３．０）および１０％溶液Ｂ（９：１アセトニトリルおよび水）の４．１分のイソクラティック流動の後、８３．７％のＡおよび１６．３％のＢまでの３２．９分の直線グラジエントにより、コバラミン誘導体が溶出した。３つのＣＮＣｂｌ−モノカルボン酸の保持時間は以下の通りであった：ｂ−モノカルボン酸は２３．１分に溶出し、ｄ−モノカルボン酸は２６．６分に溶出し、ｅ−モノカルボン酸は３２．１分に溶出した。
【００６８】
コバラミン−ｂ−（５−アミノペンチルアミド）の合成。シアノコバラミン−ｂ−モノカルボン酸１（５０ｍｇ，０．０３７ミリモル）を、ＥＤＣＩ（７１ｍｇ，０．３７ミリモル）およびＮＨＳ（２５ｍｇ，０．２２ミリモル）で、乾燥した１０ｍＬ丸底フラスコ中にて溶解させた。窒素を５分間フラッシュすることによって、該フラスコを脱気した。シリンジを介してジメチルスルホキシド（５ｍＬ）を添加し、反応混合物を６時間攪拌した。気密性シリンジを用い、この混合物を丸底フラスコから取り出し、１，５−ジアミノペンタン（４３μＬ，０．３７ミリモル）を該フラスコに入れた。Ｃｂｌ混合物を５分間にわたって１，５−ジアミノペンタンに滴下して、２：１アダクトの形成を最小化した。逆相ＨＰＬＣを用いて、反応をモニターした。出発物質が消費されると、１：１ ＣＨ２Ｃｌ２：ジエチルエーテル（６０ｍＬ）の溶液からコバラミンが沈殿した。得られた固体を媒体フリットフィルターで濾過し、ジエチルエーテル（２×１０ｍＬ）で洗浄し、メタノールでフィルターから溶出させた。粗混合物を同等容量の水で希釈し、半分取カラムに注入して、シアノコバラミン−ｂ−（５−アミノペンチルアミド）２を精製した。所望の生成物を含有する画分を前記したごとくに脱塩し、回転蒸発によって乾燥した。シアノコバラミン−ｂ−（５−アミノペンチルアミド）が得られた：７０％収率；分析ＨＰＬＣにより９８％純度；ＥＳ＋ ＭＳ：（１：１ Ｈ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ） Ｍ＋Ｈ＝１４４０．５（Ｃ６８Ｈ１００ＣｏＮ１５Ｏ１４Ｐとして計算＝１４４０．７）、Ｍ＋Ｎａ＋＝１４６２．４（Ｃ６８Ｈ１００ＣｏＮ１５Ｏ１４ＰＮａとして計算＝１４６２．６）；ε３６２ｎｍ＝Ｈ２Ｏ中１９５００Ｍ−１ｃｍ−１
【００６９】
シアノコバラミン−ｂ−（５−アミノペンチルアミド）２についての分析ＨＰＬＣ方法：
分析クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ−１８ ３００×３．９ｍｍカラムにて、２ｍＬ／分の液速で行った。９５％溶液Ａ（０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ３．０）および５％溶液Ｂ（９：１アセトニトリルおよび水）の２分間のイソクラティック流動の後、７０％Ａおよび３０％Ｂまでの１６．４分間の直線グラジエントにより、１１．８分において注目する化合物が溶出した。
【００７０】
シアノコバラミン−ｂ−（５−アミノペンチルアミド）２についての半分取ＨＰＬＣ：半分取クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ−１８ ２５×３０ｃｍの半分取カラムを用いて、４０ｍＬ／分で行った。４．１分間の９５％溶液Ａ（０．０５Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ３．０）および５％溶液Ｂ（９：１アセトニトリルおよび水）のイソクラティック流動の後、７０％Ａおよび３０％Ｂへの１８分間の直線グラジエントにより所望の生成物を溶出した。
【００７１】
ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙの合成（Ｃｙ５−コバラミン＝Ｃｙ５−Ｃｂｌ＝Ｃｙ５ Ｃｏｂａｌａ Ｆｌｕｏｒ）。この合成を図７に示す。簡単に述べれば、シアノコバラミン−リボース−５’−Ｏ−（６−アミノヘキシルアミド）は、公表されたプロトコル（ＭｃＥｗａｎら，１９９９）に従い、シアノコバラミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を用いて調製した。２：１ジエチルエーテル：塩化メチレン（５０ｍＬ）を用いコバラミンを沈殿させ、やはりこの溶媒混合液（２×１０ｍＬ）で洗浄した。反応をモニターし、逆相ＨＰＬＣを介して生成物を精製した。標準的な手法に従い、生成物を脱塩した。シアノコバラミン−リボース−５’−Ｏ−（６−アミノヘキシルアミド）（２０ｍｇ，０．０１３ミリモル）を乾燥した１０ｍＬの丸底フラスコに入れて、５分間窒素でフラッシュすることによって脱気した。ジメチルスルホキシド（１ｍＬ）をシリンジを介して添加してコバラミンを溶解させた。Ｃｙ５スクシンイミジルエステル（１０ｍｇ，０．０１３ミリモル；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびＤＩＰＥＡ（１５μｌ，０．１３）をフラスコに添加し、反応混合物を１時間攪拌した。逆相ＨＰＬＣを用いて、反応をモニターした。出発物質が消費されると、２：１ジエチルエーテル：ＣＨ２Ｃｌ２の溶液（５０ｍＬ）によりコバラミンが沈殿した。得られた固体を微細なフリットフィルターで濾過し、ジエチルエーテルおよびＣＨ２Ｃｌ２混合液（２×１０ｍＬ）で洗浄し、メタノールを用いてフィルターから溶出させた。組混合物を半分取カラムに注入して、ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙを精製し、標準的な手法に従って脱塩した。図８はＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙの蛍光発光スペクトルを示す。
【００７２】
シアノコバラミン−リボース−５’−Ｏ−（６−アミノヘキシルアミド）についての分析ＨＰＬＣ方法：分析クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ ＤｅｌａｔａＰａｋ Ｃ−１８ ３００×３．９ｍｍカラムを用い、２ｍＬ／分の液速で行った。９５％溶液Ａ（０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ３．０）および５％溶液Ｂ（９：１アセトニトリルおよび水）の初期の２分間のイソクラティック流動の後、７０％Ａおよび３０％Ｂへの１８分間の直線グラジエントにより、所望のシアノコバラミン−リボース−５’−Ｏ−（６−アミノヘキシルアミド）を溶出させて、保持時間は１２．５分であった。
【００７３】
シアノコバラミン−リボース−５’−Ｏ−（６−アミノヘキシルアミド）についての半分取ＨＰＬＣ：クロマトグラフィーはＷａｔｅｒｓ ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ−１８ ２．５×３０ｃｍの半分取カラムを用いて、４０ｍ／分の液速で行った。９５％溶液Ａ（０．０５Ｍリン酸緩衝液 ｐＨ３．０）および５％溶液Ｂ（９：１アセトニトリルおよび水）の４．１分間のイソクラティック流動の後、７０％Ａおよび３０％Ｂまでの直線グラジエントによりコバラミン誘導体を溶出させた。所望のシアノコバラミン−リボース−５’−Ｏ−（６−アミノヘキシルアミド）の保持時間は１５．５分であった。
【００７４】
ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙについての分析ＨＰＬＣ：分析クロマトグラフィーはＷａｔｅｒｓ ＤｅｌｔａＰａｋ Ｃ−１８３００×３．９ｍｍ）カラムにて、２ｍＬ／分の液速で行った。９５％溶液Ａ（０．０１Ｍ ＴＥＡ緩衝液，ｐＨ７．０）および５％溶液Ｂ（９：１アセトニトリルおよび水）の２分間のイソクラティック流動の後、４５％Ａおよび５５％Ｂまでの１６．４分間の直線グラジエントにより１３．６分においてＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙを溶出させた。
【００７５】
ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙについての半分取ＨＰＬＣ：半分取クロマトグラフィーはＷａｔｅｒｓ ＤｅｌｔＰａｃｋ Ｃ−１８ ２５×３０ｃｍの半分取カラムを用い、２０ｍＬ／分で行った。９５％溶液Ａ（０．０１Ｍ ＴＥＡ緩衝液，ｐＨ７．０）および５％溶液Ｂ（９：１アセトニトリルおよび水）の２分間のイソクラティック流動の後、７０％および３０％Ｂまでの２７．４分間の直線グラジエントにより１２．２分において所望の生成物を溶出させた。
【００７６】
実施例１０
競合アッセイ
材料。コバラミンのブタ非−内生因子（ＨＣ およびＩＦの５０：１混合物）、およびブタ内生因子はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．から購入した。ＨＰＬＣトレースは、Ｗａｔｅｒｓ ２４８７デュアル波長吸光度ディテクターを備えたＷａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ ６００システムを用いて得た。ＢＩＡＣＯＲＥ２０００および３０００（ＢＩＡＣＯＲＥ ＡＢ）装置を表面プラズモン共鳴バイオセンサー分析のために用いた。
【００７７】
ＣＮＣｂｌ−ｂ−（５−アミノペンチルアミド）の固定化。全てのＳＰＲ実験は、ＢＩＡＣＯＲＥ２０００オプティカルバイオセンサーで行った。標準ＣＭ５センサーチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ ＡＢ）のフローセル中のカルボキシメチルデキストランの表面を、３７℃の０．１Ｍ ＥＤＣＩおよび０．０２５Ｍ ＮＨＳの混合物を２０μＬ／分において１５分間チップを通って流すことによって、活性化した。ｐＨ４．５の１０ｍＭ酢酸ナトリウム中に希釈したＣＮＣｂｌ−ｂ−（５−アミノペンチルアミド）２を、図９に示すごとくチップの３つのフローセルに固定化した。２μＬ／分の速度にて、Ｃｂｌアナログをフローセルに４０分間パルス状で与えることによって、高密度センサー表面（５００−７００ ＲＵ）を作り出した。全ての４つのフローセル中のチップの表面に残存する結合部位を、５μＬ／分にて１６分間１．０ＭエタノールアミンｐＨ８．５でブロックした。フローセル３を参照表面として用いて、非特異的結合および装置のノイズを差し引いた。
【００７８】
蛋白質標準曲線。３０℃にてＨＢＳランニング緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ， １０ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ７．５， ３．４ｍＭ ＥＤＴＡ， １ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ，および０．００５％ Ｐ２０界面活性剤）を用い、全ての標準曲線および競合アッセイを行った。ｒｈＴＣＩＩ、ＮＩＦおよびＩＦ結合ＣＮＣｂｌ−ｂ−５−（アミノペンチルアミド）についてもキャリブレーション曲線を以下のごとく作成した。ＨＢＳ緩衝液中に希釈した各蛋白質（１５．６−５００ｐＭ）のストック溶液を、２０μL／分にて１０分間フローセルを通じて注入して結合を分析した。結合した蛋白質を８Ｍ尿素、０．１２５％ＳＤＳ、およびランニング緩衝液で除去した。各蛋白質試料を二連で分析した。
【００７９】
見掛けの溶液平衡解離定数の測定。種々のコバラミンアナログへのｒｈＴＣＩＩ、ＮＩＦおよびＩＦの結合は、溶液競合結合アッセイによって分析した（Ｎｉｅｂａら，１９９６）。０．０１ないし１００ｎＭの範囲のアナログ濃度を、２００ｐＭのｒｈＴＣＩＩ、２００ｐＭのＮＩＦまたは５００ｐＭのＩＦを含む等容量中でインキュベートした。３０℃において、２０μＬ／分の速度にて競合するＣｂｌアナログおよび蛋白質のアリコットを注入することによって、結合データを作成し、８Ｍ尿素、０．１２５％ＳＤＳおよび緩衝液のパルスで表面を再生した。各コバラミンについての競合アッセイは、二連で行った。
【００８０】
データの解析。参照表面から観察された結合応答を差し引き、３つのブランク注入の平均を差し引くことによって、バイオセンサーデータを解析用に調製した（Ｍｙｓｚｋａ １９９９）。競合アッセイからのデータを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ ３．０ソフトエウェアを備えた非線形最小二乗回帰分析に適合させた。図１０は競合アッセイのセンソグラムを示す。図１１はＴＣＩＩ結合についてのコバラミンの競合を示す。結合データを図１２Ａないし図１２Ｃに示す。これらの結果は、コバラミンアナログが高い親和性をもってコバラミン輸送蛋白質（トランスコバラミン、ハプトコリンおよび内生因子）によって認識されることを示す。また、この認識は表面プラズモン共鳴によっても示された。コバラミンへの大きな分子の結合は、蛋白質結合に影響するようには見えない。
【００８１】
実施例１１
動物モデル実験
腫瘍を持つマウスにおけるイン・ビボ取込。メスマウスの右後足に１×１０６ ＲＤ９９５腫瘍細胞を皮下移植することによって、腫瘍をマウスに移植する。マウス腫瘍細胞系をイン・ビトロで増殖させた。細胞の移植から６週間後、１０ｍｍ腫瘍が目に見えた。この時点で、マウスに、滅菌生理食塩水に溶解させた２．２μｇのＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙの後眼窩静脈内注射を与えた。注射から６時間後、ハロタンを吸入させてマウスを沈静させた。腫瘍をスライスして開き、６３３ｎｍ ＨｅＮｅレーザを照射した。ＨｅＮｅレーザを用い、ＣｏｂａｌａＦｌｕｏｒ Ｙの注射５４時間後にもマウスの腫瘍を分析した。マウスを切開し、内部器官および健康な組織を分析することができた。結果を図１３に示す。これは、蛍光標識コバラミンがマウスにおいて腫瘍組織に局在化することを示す。
【００８２】
実施例１２
組織取込実験
蛍光コバラミン取込。最小必須培地、アルファ修飾（α−ＭＥＭ；７．５％新生児ウシ血清、２．５％胎児ウシ血清、０．２％ナイスタチン、２．５％ペニシリン／ストレプトマイシン、ｐＨ７．２；Ｓｉｇｍａ）を調製し、滅菌した２５ｍＬのスクリュー頂部組織バイオフラスコに一部を入れた（１０ｍＬ）。培地を３７℃とし、組織試料（新形成乳房組織、健康な乳房組織、新形成リンパ節組織および健康なリンパ節組織）をα−ＭＥＭ中で蛍光標識したコバラミン（１０ｐＭ）、シアノコバラミン（１ｎＭ）と共に３時間インキュベートした。ヒト組織試料をＩＲＢ認可のプロトコルに従って獲得した。組織をフラスコから取り出し、ダルベッコウのリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ）で洗浄し、−２０℃にて、凍結片スライシングのためにＯＣＴ化合物（Ｓｈａｎｄｏｎ）と共に真鍮プレート上に設置した。−２０℃にて、組織をＣＴＤ Ｈａｒｒｉｓクリスタット中でスライスした（４ないし６μｍの切片）。小さな美術用ブラシで組織片を引き戻し、１００％エタノールで顕微鏡スライドグラスに固定した。標準ヘマトキシリン染色手法：９５％エタノール、２０秒；水、５秒；ヘマトキシリン（Ｆｉｓｈｅｒ）、４５秒；水、５秒；藍染色溶液（水道水）、１０秒；９５％エタノール、１０秒；１００％エタノール、１０秒；キシレン、１０秒；およびキシレン、１０秒を用いてスライドグラスを染色した。スライドグラスを１０×、６０×および１００×の倍率にてエピ蛍光顕微鏡によって評価した。（ａ）新形成乳房組織における腫瘍イメージングを図１４に示し、（ｂ）新形成リンパ節組織を図１５に示す。
【００８３】
細胞の生存率および組織代謝活性アッセイ。３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムチアゾリルブロマイド（ＭＴＴ；Ｓｉｇｍａ）を用いて、蛍光コバラミンとの３時間のインキュベーション時間後に、組織の代謝能力を定量的に測定した。組織の一部を培地から取り出し、ＤＰＢＳで洗浄し、ＭＴＴ（２ｍＬ；２．５ｍｇ／ｍＬ）に浸漬した。３７℃の５％ＣＯ２雰囲気下でこの組織を３時間インキュベートした。このインキュベーション期間の間、組織細胞中の生きた細胞は、コハク酸脱水素酵素活性によって、ＭＴＴ色素を紫色ホルマザンまで還元した。組織をＤＰＢＳで洗浄し、前記にて概説したクリオミクロトーム手法に従って調製して、組織の代謝能力を確実とした。イン・ビトロにて、健康および新形成組織は共に蛍光コバラミンを取り込むことが判明した。
【００８４】
本発明の方法および組成物は種々の具体例の形態で取り込むことができ、その少数のみをここに開示したことは認識されるであろう。他の具体例が存在し、本発明の精神を逸脱しないことは当業者に明らかであろう。かくして、記載された具体例は例示的なものであって、限定するものと解釈されるべきではない。
【００８５】
参考文献
Carmel, R. (1975). "Extreme Elevation of Serum Transcobalamin I in Patients with Metastatic Cancer."New Engl J Med 292:282-284.
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Schneider, Z. および Stroinski, A. (1987). Comprehensive B12, de Gruyter, Berlin, pp. 358.
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式：
【化１】
［Ｒ１はＣＮ、ＯＨ、ＯＨ２、ＣＨ３、５’−デオキシアデノシルまたは（ＣＨ２）ｐＮＨＣ（＝Ｓ）Ｙであり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はＣＯＮＨ２であり；Ｒ８はＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；Ｒ９はＯＨまたはＯ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；Ｘは式ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＯ（Ｃ＝Ｏ）またはＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨを有するリンカーであり；Ｙはフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、フルオレセイン−５ＥＸ、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、２’，７’−ジクロロフルオレセイン、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、Ｃｙ５、Ｃｙ２、Ｃｙ３およびＣｙ５．５よりなる群から選択されるフルオロフォアであり；ｍは０または１であり、ｎは０ないし５０であって、ｐは２ないし１０であり、但し、Ｒ１、Ｒ８およびＲ９の基のうちの少なくとも１つはＹを含み、さらに、
Ｒ１がＣＮ、ＯＨ、ＯＨ２、ＣＨ３、５’−デオキシアデノシルまたは（ＣＨ２）ｐＮＨＣ（＝Ｓ）Ｙであり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７がＣＯＮＨ２であり；Ｒ９がＯＨまたはＯ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；ｍが１であり；ＸがＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＯ（Ｃ＝Ｏ）であって；Ｒ１およびＲ９の基のうちの少なくとも１つがＹを含む場合、Ｒ８はＣＨ２ＯＨではなく；かつ
Ｒ１がＣＮ、ＯＨ、ＯＨ２、ＣＨ３、５’−デオキシアデノシルまたは（ＣＨ２）ｐＮＨＣ（＝Ｓ）Ｙであり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７がＣＯＮＨ２であり；Ｒ９がＯＨまたはＯ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；ｍが０であって；Ｒ１およびＲ９の基のうちの少なくとも１つがＹを含む場合、Ｒ８はＣＨ２ＯＨではない］を有するコバラミンであって、該コバラミンからＹが切断されることなく、可視光を照射すると、蛍光を発する該コバラミン。
【請求項２】
Ｒ８が、フルオロフォアを含む請求項１記載のコバラミン。
【請求項３】
Ｒ１が、フルオロフォアを含む請求項１記載のコバラミン。
【請求項４】
Ｒ９が、フルオロフォアを含む請求項１記載のコバラミン。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンおよび医薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項６】
癌性組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、癌性であるか、または癌性細胞を含むことが疑われる組織において、癌組織または癌性細胞を含む組織を同定するための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項７】
癌性組織が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、癌性組織と健康な組織を目視により区別するための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項８】
腫瘍組織が蛍光を発し、および腫瘍の境界を明らかにすることを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて腫瘍の境界を明らかにするための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項９】
転移性癌組織または細胞が、蛍光を発することを特徴とする、該転移性癌組織または細胞を同定するための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項１０】
癌組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて癌を診断、検出またはモニターするための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項１１】
癌組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、個体の癌の治療、診断、検出またはモニタリングにおいて転移性病気を同定するための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項１２】
非−癌性細胞に比較して癌細胞のより大きな蛍光が、癌細胞が治療に都合よく応答することを示すことを特徴とする、治療に対する癌細胞の応答を予測するための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項１３】
該治療が、コバラミン−化学療法またはホルモン療法である請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
コバラミン−ベースの療法に対する癌細胞の応答が、非−癌性細胞と比較して、該癌細胞の蛍光に直接比例することを特徴とする、癌の進行段階を決定するための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項１５】
健康な組織または細胞の蛍光より大きい該癌組織または細胞の蛍光が、該療法に対する都合よい治療の応答または患者の結果を示すことを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて癌の療法後の治療の応答または患者の結果を予測するための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、癌性組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、癌性であるか、または癌性細胞を含むことが疑われる組織において、癌組織または癌性細胞を含む組織を同定するための剤。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、癌性組織が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、癌性組織と健康な組織を目視により区別するための剤。
【請求項１８】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、腫瘍組織が蛍光を発し、および腫瘍の境界を明らかにすることを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて腫瘍の境界を明らかにするための剤。
【請求項１９】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、転移性癌組織または細胞が、蛍光を発することを特徴とする、該転移性癌組織または細胞を同定するための剤。
【請求項２０】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、癌組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて癌を診断、検出またはモニターするための剤。
【請求項２１】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、癌組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、個体の癌の治療、診断、検出またはモニタリングにおける転移性病気を同定するための剤。
【請求項２２】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、非−癌性細胞に比較して癌細胞のより大きな蛍光が、癌細胞が治療に都合よく応答することを示すことを特徴とする、治療に対する癌細胞の応答を予測するための剤。
【請求項２３】
該治療が、コバラミン−化学療法またはホルモン療法である請求項２２記載の剤。
【請求項２４】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、コバラミン−ベースの療法に対する癌細胞の応答が、非−癌性細胞と比較して、該癌細胞の蛍光に直接比例することを特徴とする、癌の進行段階を決定するための剤。
【請求項２５】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、健康な組織または細胞の蛍光より大きい癌組織または細胞の蛍光が、療法に都合よい治療の応答または患者の結果を示すことを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて癌の療法後の治療の応答または患者の結果を予測するための剤。
【請求項２６】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを用いて、試料に対して競合結合アッセイを行い、次いで、該試料中に存在するコバラミンの量を測定することを特徴とする試料中のコバラミンの量をアッセイする方法。
【請求項２７】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミン用いて、試料から単離されたコバラミン結合蛋白質に対して競合結合アッセイを行い、次いで、該試料中の不飽和コバラミン結合能力の量を測定することを特徴とする該試料中のコバラミン結合蛋白質の不飽和コバラミン結合能力の量をアッセイする方法。
【請求項２８】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを用いて、試料から単離されたコバラミン結合蛋白質から分離されたコバラミンの競合結合アッセイを行い、次いで、該試料中の該蛋白質に結合したコバラミンの量を測定することを特徴とする該試料中のコバラミン結合蛋白質に結合したコバラミンの量をアッセイする方法。
【請求項１】
一般式：
【化１】
［Ｒ１はＣＮ、ＯＨ、ＯＨ２、ＣＨ３、５’−デオキシアデノシルまたは（ＣＨ２）ｐＮＨＣ（＝Ｓ）Ｙであり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７はＣＯＮＨ２であり；Ｒ８はＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；Ｒ９はＯＨまたはＯ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；Ｘは式ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＯ（Ｃ＝Ｏ）またはＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨを有するリンカーであり；Ｙはフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、フルオレセイン−５ＥＸ、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、２’，７’−ジクロロフルオレセイン、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、Ｃｙ５、Ｃｙ２、Ｃｙ３およびＣｙ５．５よりなる群から選択されるフルオロフォアであり；ｍは０または１であり、ｎは０ないし５０であって、ｐは２ないし１０であり、但し、Ｒ１、Ｒ８およびＲ９の基のうちの少なくとも１つはＹを含み、さらに、
Ｒ１がＣＮ、ＯＨ、ＯＨ２、ＣＨ３、５’−デオキシアデノシルまたは（ＣＨ２）ｐＮＨＣ（＝Ｓ）Ｙであり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７がＣＯＮＨ２であり；Ｒ９がＯＨまたはＯ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；ｍが１であり；ＸがＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＯ（Ｃ＝Ｏ）であって；Ｒ１およびＲ９の基のうちの少なくとも１つがＹを含む場合、Ｒ８はＣＨ２ＯＨではなく；かつ
Ｒ１がＣＮ、ＯＨ、ＯＨ２、ＣＨ３、５’−デオキシアデノシルまたは（ＣＨ２）ｐＮＨＣ（＝Ｓ）Ｙであり；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７がＣＯＮＨ２であり；Ｒ９がＯＨまたはＯ（Ｃ＝Ｏ）ＸｍＹであり；ｍが０であって；Ｒ１およびＲ９の基のうちの少なくとも１つがＹを含む場合、Ｒ８はＣＨ２ＯＨではない］を有するコバラミンであって、該コバラミンからＹが切断されることなく、可視光を照射すると、蛍光を発する該コバラミン。
【請求項２】
Ｒ８が、フルオロフォアを含む請求項１記載のコバラミン。
【請求項３】
Ｒ１が、フルオロフォアを含む請求項１記載のコバラミン。
【請求項４】
Ｒ９が、フルオロフォアを含む請求項１記載のコバラミン。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンおよび医薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項６】
癌性組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、癌性であるか、または癌性細胞を含むことが疑われる組織において、癌組織または癌性細胞を含む組織を同定するための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項７】
癌性組織が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、癌性組織と健康な組織を目視により区別するための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項８】
腫瘍組織が蛍光を発し、および腫瘍の境界を明らかにすることを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて腫瘍の境界を明らかにするための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項９】
転移性癌組織または細胞が、蛍光を発することを特徴とする、該転移性癌組織または細胞を同定するための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項１０】
癌組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて癌を診断、検出またはモニターするための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項１１】
癌組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、個体の癌の治療、診断、検出またはモニタリングにおいて転移性病気を同定するための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項１２】
非−癌性細胞に比較して癌細胞のより大きな蛍光が、癌細胞が治療に都合よく応答することを示すことを特徴とする、治療に対する癌細胞の応答を予測するための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項１３】
該治療が、コバラミン−化学療法またはホルモン療法である請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
コバラミン−ベースの療法に対する癌細胞の応答が、非−癌性細胞と比較して、該癌細胞の蛍光に直接比例することを特徴とする、癌の進行段階を決定するための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項１５】
健康な組織または細胞の蛍光より大きい該癌組織または細胞の蛍光が、該療法に対する都合よい治療の応答または患者の結果を示すことを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて癌の療法後の治療の応答または患者の結果を予測するための組成物の製造における請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンの使用。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、癌性組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、癌性であるか、または癌性細胞を含むことが疑われる組織において、癌組織または癌性細胞を含む組織を同定するための剤。
【請求項１７】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、癌性組織が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、癌性組織と健康な組織を目視により区別するための剤。
【請求項１８】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、腫瘍組織が蛍光を発し、および腫瘍の境界を明らかにすることを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて腫瘍の境界を明らかにするための剤。
【請求項１９】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、転移性癌組織または細胞が、蛍光を発することを特徴とする、該転移性癌組織または細胞を同定するための剤。
【請求項２０】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、癌組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて癌を診断、検出またはモニターするための剤。
【請求項２１】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、癌組織または細胞が、蛍光を発し、健康な組織が、より少ない蛍光を呈することを特徴とする、個体の癌の治療、診断、検出またはモニタリングにおける転移性病気を同定するための剤。
【請求項２２】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、非−癌性細胞に比較して癌細胞のより大きな蛍光が、癌細胞が治療に都合よく応答することを示すことを特徴とする、治療に対する癌細胞の応答を予測するための剤。
【請求項２３】
該治療が、コバラミン−化学療法またはホルモン療法である請求項２２記載の剤。
【請求項２４】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、コバラミン−ベースの療法に対する癌細胞の応答が、非−癌性細胞と比較して、該癌細胞の蛍光に直接比例することを特徴とする、癌の進行段階を決定するための剤。
【請求項２５】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを含み、健康な組織または細胞の蛍光より大きい癌組織または細胞の蛍光が、療法に都合よい治療の応答または患者の結果を示すことを特徴とする、イン・ビボ、エクス・ビボまたはイン・サイチュにて癌の療法後の治療の応答または患者の結果を予測するための剤。
【請求項２６】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを用いて、試料に対して競合結合アッセイを行い、次いで、該試料中に存在するコバラミンの量を測定することを特徴とする試料中のコバラミンの量をアッセイする方法。
【請求項２７】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミン用いて、試料から単離されたコバラミン結合蛋白質に対して競合結合アッセイを行い、次いで、該試料中の不飽和コバラミン結合能力の量を測定することを特徴とする該試料中のコバラミン結合蛋白質の不飽和コバラミン結合能力の量をアッセイする方法。
【請求項２８】
請求項１〜４のいずれか１記載のコバラミンを用いて、試料から単離されたコバラミン結合蛋白質から分離されたコバラミンの競合結合アッセイを行い、次いで、該試料中の該蛋白質に結合したコバラミンの量を測定することを特徴とする該試料中のコバラミン結合蛋白質に結合したコバラミンの量をアッセイする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２０１１−５２００３（Ｐ２０１１−５２００３Ａ）
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−２４３９４８（Ｐ２０１０−２４３９４８）
【出願日】平成２２年１０月２９日（２０１０．１０．２９）
【分割の表示】特願２００２−５７２８８５（Ｐ２００２−５７２８８５）の分割
【原出願日】平成１４年３月１５日（２００２．３．１５）
【出願人】（５００１８９２３０）ユニバーシティ・オブ・ユタ・リサーチ・ファウンデーション (11)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１７日（２０１１．３．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２４３９４８（Ｐ２０１０−２４３９４８）
【出願日】平成２２年１０月２９日（２０１０．１０．２９）
【分割の表示】特願２００２−５７２８８５（Ｐ２００２−５７２８８５）の分割
【原出願日】平成１４年３月１５日（２００２．３．１５）
【出願人】（５００１８９２３０）ユニバーシティ・オブ・ユタ・リサーチ・ファウンデーション (11)
【Ｆターム（参考）】
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