蛍光検出装置および蛍光検出方法
【課題】従来に比べて導入管が汚れ難く、洗浄回数を抑制することができる蛍光検出装置および蛍光検出方法を提供する。
【解決手段】蛍光検出装置は、測定対象物を測定点で照射するためにレーザ光を出射するレーザ光源部と、前記測定対象物が前記レーザ光の照射を受けることで発する蛍光を受光する受光部と、前記受光した蛍光の信号を処理し、処理結果に基づいて、蛍光情報を求める処理部と、前記測定対象物が前記測定点を通過するように前記測定対象物の流路を形成したフローセル体と、前記測定対象物が圧力により前記測定点に移動するように前記測定対象物を前記フローセル体に導入させる導入管と、を有する。前記導入管の先端開口部を覆うように、前記先端開口部に金属製網が設けられ、前記金属製網に負電位が与えられている。
【解決手段】蛍光検出装置は、測定対象物を測定点で照射するためにレーザ光を出射するレーザ光源部と、前記測定対象物が前記レーザ光の照射を受けることで発する蛍光を受光する受光部と、前記受光した蛍光の信号を処理し、処理結果に基づいて、蛍光情報を求める処理部と、前記測定対象物が前記測定点を通過するように前記測定対象物の流路を形成したフローセル体と、前記測定対象物が圧力により前記測定点に移動するように前記測定対象物を前記フローセル体に導入させる導入管と、を有する。前記導入管の先端開口部を覆うように、前記先端開口部に金属製網が設けられ、前記金属製網に負電位が与えられている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ光の照射を受けることにより、生体物質を含む測定対象物が発する蛍光を検出する蛍光検出装置および蛍光検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、医療、生物分野では、フローサイトメータが広く用いられている。このフローサイトメータは、レーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を光電子増倍管やアバランシェフォトダイオード等の光電変換器を用いて受光して、細胞や遺伝子等の生体物質の種類や頻度、さらには、測定対象物の特性を分析する。
【０００３】
具体的には、フローサイトメータは、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質等の分析対象物を蛍光試薬でラベル化して作った測定対象物を、圧力を与えて毎秒約１０ｍ以内の速度で管路内を流れるシース液に流してラミナーシースフローを形成する。このフロー中の測定対象物にレーザ光を照射することにより、フローサイトメータは、分析対象物に付着した蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光を分析対象物のラベルとして識別することで分析対象物を特定する。
【０００４】
フローサイトメータでは、例えば生体物質を含んだサンプル液を収容した試験管内に、フローサイトメータの導入管が挿入される。このとき、導入管の先端開口部は、サンプル液内に浸る。そして、サンプル液の接する気相を加圧することにより、生体物質等の測定対象物を含むサンプル液を導入管に移動させる。これにより、測定対象物は、導入管へ導入される。
この後、導入管の他方の先端から、高速で流れるシース液にサンプル液を流すことで、導入管に隣接して設けられたフローセル体において、測定対象物が１つずつ列状に並んで測定点を通過する。
【０００５】
このとき、導入管には生体物質等の測定対象物が流れるので、生体物質等が凝集した塊りが導入管の内面に付着する可能性がある。また、導入管の先端開口部はサンプル液に浸されるので、導入管の先端開口部には生体物質やサンプル液中の不純物が付着し易い。このため、別の種類のサンプル液を用いて新たな計測をする場合、導入管に以前の生体物質や不純物質が付着していると、付着した生体物質がフローセル体に流れ込み、誤った計測結果を算出する場合もある。このため、正確な計測を行う前に導入管等の洗浄が行われている。
しかし、洗浄のために導入管をフローサイトメータから取り外す場合、導入管はフローセル体に隣接して設けられているので、レーザ光の光軸に正確に位置合わせをしたフローセル体の設定が微妙に変化し、正しい計測ができなくなる場合がある。
また、サンプル液は計測後シース液と混ざるので、絶対量の少ないサンプル液を何度でも計測対象として用いることはできず、正確な計測を１回で行わなければならず、再計測はできない。
【０００６】
一方、群体を形成している微細な植物プランクトン等の生体を含む水に生体そのものが破壊されない程度の超音波を照射して生体を細胞単位にバラバラに分散し、この分散した細胞単位の生体の数をフローサイトメータで計測する方法が知られている（特許文献１）。この方法では、フローサイトメータで計測する際、フローセルの目詰まりを防ぐため目開き約５０μｍのメッシュで水をろ過する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−１９２４５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上述の方法のように、フローサイトメータに用いるサンプル液をメッシュでろ過しても、必ずしも導入管内表面や導入管開口部における生体物質や不純物の付着が防ぐことができず、導入管の洗浄が依然として必要であった。
【０００９】
そこで、本発明は、従来に比べて導入管が汚れ難く、洗浄回数を抑制することができる蛍光検出装置および蛍光検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様は、レーザ光の照射を受けることにより、生体物質を含む測定対象物が発する蛍光を検出する蛍光検出装置である。当該装置は、
測定対象物を測定点で照射するためにレーザ光を出射するレーザ光源部と、
前記測定対象物が前記レーザ光の照射を受けることで発する蛍光を受光する受光部と、
前記受光した蛍光の信号を処理し、処理結果に基づいて、蛍光情報を求める処理部と、
前記測定対象物が前記測定点を通過するように前記測定対象物の流路を形成したフローセル体と、
前記測定対象物が圧力により前記測定点に移動するように前記測定対象物を前記フローセル体に導入させる導入管と、を有する。
前記導入管の先端開口部を覆うように、前記先端開口部に金属製網が設けられ、前記金属製網に負電位が与えられている。
【００１１】
その際、前記導入管は、金属で形成され、前記導入管に負電位が与えられている、ことが好ましい。
【００１２】
また、前記導入管は、前記測定対象物を収容する容器内に挿入されており、さらに、前記導入管の前記先端開口部と対向するように、前記容器の壁を介して設けられる前記容器を固定支持する金属製支持部材を有し、前記金属製支持部材は接地されている、ことが好ましい。
【００１３】
さらに、前記導入管の外周を取り巻くように外管が設けられ、前記外管に負電位が与えられている。
【００１４】
前記金属製網は、前記外管の先端開口部を覆う、ことが好ましい。
【００１５】
さらに、前記金属製網は、前記導入管の先端開口部から着脱自在なキャップに設けられている、ことが好ましい。
【００１６】
さらに、本発明の他の態様は、レーザ光の照射を受けることにより、生体物質を含む測定対象物が発する蛍光を検出する蛍光検出方法である。当該方法は、
測定対象物を含む溶液を加圧することにより、測定対象物を、導入管の先端開口部を覆うように前記先端開口部に設けられた金属製網を通して前記導入管に導入させ、さらに、前記導入管からフローセル体内に測定対象物を流すステップと、
前記フローセル体の測定点を通過する測定対象物をレーザ光で照射するステップと、
前記測定対象物が前記レーザ光の照射を受けることで発する蛍光を受光するステップと、
前記受光した蛍光の信号を処理し、処理結果に基づいて蛍光情報を求めるステップと、を有する。
前記金属製網には、負電位が与えられている。
【発明の効果】
【００１７】
上述の蛍光検出装置および蛍光検出方法では、従来に比べて導入管が汚れ難く、洗浄回数を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の蛍光検出装置の一実施形態であるフローサイトメータの概略構成図である。
【図２】本実施形態に用いるレーザ光源部の構成の一例を示す図である。
【図３】本実施形態の受光部の一例の概略構成図である。
【図４】（ａ）は、本実施形態のフローサイトメータの導入管および外管に装着されるキャップの外観を示す図であり、（ｂ）は、導入管、外管およびキャップを詳細に説明する図である。
【００１９】
以下、本発明の蛍光検出装置および蛍光検出方法について詳細に説明する。
【００２０】
（蛍光検出装置）
図１は、本発明の蛍光検出装置の一実施形態であるフローサイトメータ１０の概略構成図である。
フローサイトメータ１０は、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質等を含んだ試験管内のサンプル液を導入管を用いてフローセル体に導き、フローセル体でレーザ光を照射することにより、測定対象物が発する蛍光を計測する装置である。
【００２１】
フローサイトメータ１０は、本体ユニット２０と、制御・処理部（コンピュータ）８０とを有する。本体ユニット２０は、レーザ光の照射を受けることにより蛍光を発する生体物質を付着し、バッファー液に懸濁した測定対象物１２にレーザ光を照射し、測定対象物１２中の蛍光色素の発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理をする。さらに、制御・処理部８０は、本体ユニット２０で得られた処理結果から検出した蛍光の蛍光強度及び蛍光緩和時間を算出し、この算出結果を用いて測定対象物１２の分析を行なう。
【００２２】
本体ユニット２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４，２６と、管路３０と、金属製支持部材５０と、を主に有する。
管路３０は、試験管３２内に収納されたサンプル液中に先端開口部が浸っている導入管３４と、導入管３４の周りを覆う外管３６と、接続管３７と、シース液導入部３８と、フローセル体４０と、フローセル上端部４２と、回収管４４と、を有する。導入管３４、外管３６、および金属製支持部材５０については、後述する。
【００２３】
接続管３７は、試験管３２と接続し、試験管３２内の気相を加圧する空気を導入する空気導入口３７ａと、外管３６と連通し、計測が終了して試験管３２を接続管３７から取り外すとき空気を吸引する空気吸引口３７ｂを有する。空気導入口３７ａは、図示されない加圧空気供給源と接続されている。空気吸引口３７ｂは、図示されない吸引ポンプと接続されている。外管３６は、計測終了後、サンプル液が導入管３４や外管３６の表面に付着したサンプル液を吸引して液垂れを防止する。
シース液導入部３８は、フローセル体４０に測定対象物１２を一列に流すためのフローを形成するために用いるシース液を管路３０に導入する。具体的には、図示されないシース液供給源に接続された導入口３８ａ，３８ｂからシース液は導入される。
【００２４】
フローセル体４０は、シース液導入部３８から供給されるシース液の流路を絞ってシース液を高速流にし、この高速流に測定対象物１２を一列に順次流す。フローセル体４０の流路の途中には、レーザ光が集束する測定点Ｍが設けられ、測定点Ｍを通過する測定対象物１２をレーザ光が照射し、蛍光の計測に供される。
回収管４４は、フローセル上端部４２においてフローセル体４０の流路を拡げてシース液およびサンプル液が混在した液を図示されない回収容器に誘導する。
【００２５】
レーザ光源部２２は、所定の波長のレーザ光、例えばλ＝４０５ｎｍ等のレーザ光を出射する部分である。図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
レーザ光源部２２は、強度変調したレーザ光を出射する。レーザ光源部２２は、例えば、青色のレーザ光をＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、このＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で変調する光源２２ａを有する。さらに、レーザ光源部２２は、レンズ系２２ｂと、レーザドライバ２２ｃと、を有する。レンズ系２２ｂは、レーザ光をフローセル体４０中の測定点Ｍに集束させる。レーザドライバ２２ｃは、光源２２ａを駆動する。レーザドライバ２２ｃには、レーザ光を強度変調するための変調信号が制御・処理部８０から供給される。
【００２６】
これらのレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。レーザ光は、例えば５〜１００ｍＷ程度の出力である。レーザ光源部２２から出射されるレーザ光は変調信号に基づいて強度変調され、強度を変調する周波数（変調周波数）は、その周期が蛍光緩和時定数に比べてやや長い、例えば１０〜５０ＭＨｚである。
【００２７】
光源２２ａは、レーザ光が蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光によって励起される蛍光色素は測定しようとする生体物質に付着されており、蛍光色素と生体物質で構成された測定対象物がフローセル体４０の測定点Ｍを通過する際、測定点Ｍでレーザ光の照射を受けて特定の波長で蛍光を発する。
【００２８】
受光部２４は、フローセル体４０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、光電変換器（例えば、フォトダイオード）を備える。光電変換器は、測定点Ｍを通過する測定対象物によってレーザ光が前方散乱することにより、測定対象物が測定点Ｍを通過する旨の検出信号を出力する。受光部２４から出力される検出信号は、制御・処理部８０に供給され、制御・処理部８０において測定対象物がフローセル体４０中の測定点Ｍを通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
【００２９】
受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつフローセル体４０中の測定対象物の移動方向に対して垂直方向に配置されている。受光部２６は、測定点Ｍにて照射された測定対象物が発する蛍光を受光する光電変換器を備える。図３は、受光部２６の一例の概略構成図である。本実施形態では、受光部２６は、蛍光を２つの波長に分離して２つの受光素子を用いて蛍光を受光するが、蛍光を受光する受光素子は１つであってもよい。
【００３０】
図３に示す受光部２６は、測定対象物１２中の生体物質が発する蛍光を集束させるレンズ系２６ａと、ハーフミラー２６ｂと、バンドパスフィルタ２６ｃ1，２６ｃ2と、光電子増倍管等の光電変換器２７ａ，２７ｂと、を有する。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射したレーザ光あるいは蛍光を光電変換器２７ａ、２７ｂの受光面に集束させる。
ハーフミラー２６ｂは、光の一部を反射させて、一部を透過させるミラーである。
【００３１】
バンドパスフィルタ２６ｃ1，２６ｃ2は、各光電変換器２７ａ，２７ｂの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の光のみが透過するフィルタである。透過する光の波長帯域は、蛍光色素の発する蛍光の波長帯域に対応して設定されている。バンドパスフィルタ２６ｃ1，２６ｃ2のフィルタリングにより、光電変換器２７ａ，２７ｂが所定の波長帯域の光を取り込めるように設定されている。
【００３２】
光電変換器２７ａ，２７ｂは、例えば光電子増倍管を備えたセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。ここで、受光するレーザ光あるいは蛍光は位相差情報を持った光信号として受光されるので、出力される電気信号は位相差情報を持った受光信号となる。この受光信号は、増幅器で増幅されて、制御・処理部８０に供給される。
【００３３】
制御・処理部８０は、フローサイトメータ１０全体の動作を制御、管理する他、レーザ光の強度を所定の周波数で変調（振幅変調）するための変調信号を生成する。さらに、制御・処理部８０は、光電変換器２７ａ，２７ｂから出力される蛍光信号を処理する。具体的には、制御・処理部８０は、蛍光信号をアンプで増幅し、増幅した蛍光信号を生成した上記変調信号とミキシングし、その後、ミキシングで得られた信号をローパスフィルタ処理を行うことにより、蛍光信号の変調信号に対する位相遅れを算出し、この位相遅れに基づいて蛍光の蛍光寿命（蛍光緩和時間）を蛍光の情報として算出する。また、制御・処理部８０は、蛍光信号を用いて蛍光強度を蛍光の情報として算出する。蛍光寿命および蛍光強度は、測定対象物１２に識別用ラベルとして付けられている蛍光物質に応じて定まっているので、蛍光寿命および蛍光強度を求めることにより、どの測定対象物が測定点Ｍを通過したか、情報を得ることができる。
【００３４】
図４（ａ）は、フローサイトメータ１０の導入管３４および外管３６に装着されるキャップ４６の外観を示す図である。図４（ｂ）は、導入管３４、外管３６およびキャップ４６を詳細に説明する図である。
キャップ４６は、金属からなり、導入管３４および外管３５の先端開口部に着脱自在に設けられている。外管３６の先端には、鍔が設けられ、この鍔が、キャップ４６の内周面に設けられた凹部と嵌合する構成となって、キャップ４６は外管３６の先端開口部に装着される。
【００３５】
キャップ４６が設けられた導入管３４は、測定対象物１２を収容する試験管３２内に挿入され、キャップ４６および導入管３４の先端はサンプル液内に浸っている。キャップ４６には、開口が設けられ、この開口に金属製網４８が設けられている。金属製網４８は、導入管３４の先端開口部および外管３６の先端開口部を覆う。金属製網４８は、メッシュ状に金属繊維が交差したものであり、複数の測定対象物１２が凝集した塊りは通過しないが、測定対象物１２単体は通過できるようなサイズの網が設けられている。例えば、測定対象物１２が１００μｍ程度の直径を有するのであれば、１５０〜２００μｍ程度の間隔の網になっている。また、金属製網４８は、電流が流れることにより、電気分解が生じるのを防ぐ目的で、サンプル液と接触する部分は絶縁体で被覆されている。外管３６および導入管３４は、いずれもキャップ４６あるいは金属製網４８と接触している。
また、接続管３７には、図示されないＤＣ電源の負極と接続された電極端子が設けられ、外管３６は負の電位が与えられている。さらに、外管３６は、キャップ４６の金属製網４８と接触しているので、キャップ４６も、外管３６と同様の負の電位が与えられている。さらに、導入管３４は、キャップ４６の金属製網４８と接触しているので、導入管３４も、外管３６と同様の負の電位が与えられている。
【００３６】
これに対して、導入管３４の先端開口部と対向するように、試験管３２の壁を介して設けられる試験管３２を固定支持する金属製支持部材５０は接地されている。すなわち、ＤＣ電源の正極は金属製支持部材５０と接続され、この金属製支持部材５０が接地されることにより、金属製支持部材５０に対して、導入管３４、外管３６および金属製網４８が負電位となっている。
【００３７】
このように、導入管３４、外管３６および金属製網４８に負の電位を与えるのは、生体物質等の測定対象物は負の電荷を帯びているものが多い。試験管３２の気相の加圧によりサンプル液は、導入管３４に流れ込み、上昇しようとするとき、元来負の電荷を帯びているサンプル液内の単体の測定対象物１２は、網の隙間を通って導入管３４内に導かれる。このとき、凝集した複数の測定対象物の塊りは、金属製網４８を通過することはできない。したがって、導入管３４内に、単体の測定対象物が移動する。
さらに、導入管３４の表面は負の電位が与えられているので、負の電荷を有する測定対象物が導入管３４の表面に付着することは少ない。しかも、導入管３４内には、複数の測定対象物１２が凝集した塊りは存在しないので、ファンデルワールス力等によって導入管３４の表面に上記塊りが付着することも少ない。
したがって、本実施形態は、従来に比べて導入管３４が汚れ難く、洗浄回数を抑制することができる。
【００３８】
（蛍光検出方法）
このようなフローサイトメータ１０は、測定対象物１２を含むサンプル液の気相を加圧することにより、測定対象物１２を導入管３４の先端開口部を覆うように先端開口部に設けたキャップ４６の金属製網４８を通過させる。さらに、フローサイトメータ１０は、測定対象物１２を導入管３４に導入させ、さらに、導入管３４からフローセル体４０内にシース液を用いて測定対象物１２を流す。このとき、金属製網４８には、負電位が与えられる。
【００３９】
次に、レーザ光源部２２は、フローセル体４０の測定点Ｍを通過する測定対象物１２を照射するために、レーザ光を出射する。このとき、受光部２６は、測定対象物１２がレーザ光の照射を受けることで発する蛍光を受光する。
この後、制御・処理部８０は、受光した蛍光の信号を処理し、処理結果に基づいて、蛍光寿命および蛍光強度を含む蛍光情報を求める。
【００４０】
このように、測定対象物１２を含むサンプル液を導入管３４に導入するとき、金属製網４８を用いるので、凝集した測定対象物は導入管３４内に進入できない。また、金属製網４８には負電位が与えられているで、金属製膜４８に付着することなく、気相の加圧によって単体の測定対象物１２が導入管３４に移動する。このとき、サンプル液に浸っている外管３６、導入管３４も負電位となっているので、測定対象物１２が表面に付着することも少ない。
また、金属製網４８を測定対象物１２が通過するとき、負の電荷を持たない測定対象物１２であっても、金属製網４８の電位の影響を受けて負に帯電する。このため、導入管３４内に導入された測定対象物１２が凝集して、導入管３４の表面に付着することは少なくなる。このため、導入管３４の洗浄回数は少なくなる。
また、フローセル体４０において単体の測定対象物１２が測定点Ｍを通過するので、複数の測定対象物１２が凝集した塊りを測定する可能性は低くなる。
【００４１】
以上、本発明の蛍光検出装置および蛍光検出方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【符号の説明】
【００４２】
１０ フローサイトメータ
２０ 本体ユニット
２２ レーザ光源部
２２ａ 光源
２２ｂ，２６ａ レンズ系
２２ｃ レーザドライバ
２４，２６ 受光部
２６ｂ ハーフミラー
２６ｃ１，２６ｃ2 バンドパスフィルタ
２７ａ，２７ｂ 光電変換器
３０ 管路
３２ 試験管
３４ 導入管
３６ 外管
３７ 接続管
３７ａ 空気導入口
３７ｂ 空気吸引口
３８ シース液導入部
３８ａ，３８ｂ 導入口
４０ フローセル体
４２ フローセル上端部
４４ 回収管
４６ キャップ
４８ 金属製網
５０ 金属製支持部材
８０ 制御・処理部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レーザ光の照射を受けることにより、生体物質を含む測定対象物が発する蛍光を検出する蛍光検出装置および蛍光検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、医療、生物分野では、フローサイトメータが広く用いられている。このフローサイトメータは、レーザ光を照射することにより測定対象物が発する蛍光を光電子増倍管やアバランシェフォトダイオード等の光電変換器を用いて受光して、細胞や遺伝子等の生体物質の種類や頻度、さらには、測定対象物の特性を分析する。
【０００３】
具体的には、フローサイトメータは、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質等の分析対象物を蛍光試薬でラベル化して作った測定対象物を、圧力を与えて毎秒約１０ｍ以内の速度で管路内を流れるシース液に流してラミナーシースフローを形成する。このフロー中の測定対象物にレーザ光を照射することにより、フローサイトメータは、分析対象物に付着した蛍光色素が発する蛍光を受光し、この蛍光を分析対象物のラベルとして識別することで分析対象物を特定する。
【０００４】
フローサイトメータでは、例えば生体物質を含んだサンプル液を収容した試験管内に、フローサイトメータの導入管が挿入される。このとき、導入管の先端開口部は、サンプル液内に浸る。そして、サンプル液の接する気相を加圧することにより、生体物質等の測定対象物を含むサンプル液を導入管に移動させる。これにより、測定対象物は、導入管へ導入される。
この後、導入管の他方の先端から、高速で流れるシース液にサンプル液を流すことで、導入管に隣接して設けられたフローセル体において、測定対象物が１つずつ列状に並んで測定点を通過する。
【０００５】
このとき、導入管には生体物質等の測定対象物が流れるので、生体物質等が凝集した塊りが導入管の内面に付着する可能性がある。また、導入管の先端開口部はサンプル液に浸されるので、導入管の先端開口部には生体物質やサンプル液中の不純物が付着し易い。このため、別の種類のサンプル液を用いて新たな計測をする場合、導入管に以前の生体物質や不純物質が付着していると、付着した生体物質がフローセル体に流れ込み、誤った計測結果を算出する場合もある。このため、正確な計測を行う前に導入管等の洗浄が行われている。
しかし、洗浄のために導入管をフローサイトメータから取り外す場合、導入管はフローセル体に隣接して設けられているので、レーザ光の光軸に正確に位置合わせをしたフローセル体の設定が微妙に変化し、正しい計測ができなくなる場合がある。
また、サンプル液は計測後シース液と混ざるので、絶対量の少ないサンプル液を何度でも計測対象として用いることはできず、正確な計測を１回で行わなければならず、再計測はできない。
【０００６】
一方、群体を形成している微細な植物プランクトン等の生体を含む水に生体そのものが破壊されない程度の超音波を照射して生体を細胞単位にバラバラに分散し、この分散した細胞単位の生体の数をフローサイトメータで計測する方法が知られている（特許文献１）。この方法では、フローサイトメータで計測する際、フローセルの目詰まりを防ぐため目開き約５０μｍのメッシュで水をろ過する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００９−１９２４５０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上述の方法のように、フローサイトメータに用いるサンプル液をメッシュでろ過しても、必ずしも導入管内表面や導入管開口部における生体物質や不純物の付着が防ぐことができず、導入管の洗浄が依然として必要であった。
【０００９】
そこで、本発明は、従来に比べて導入管が汚れ難く、洗浄回数を抑制することができる蛍光検出装置および蛍光検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一態様は、レーザ光の照射を受けることにより、生体物質を含む測定対象物が発する蛍光を検出する蛍光検出装置である。当該装置は、
測定対象物を測定点で照射するためにレーザ光を出射するレーザ光源部と、
前記測定対象物が前記レーザ光の照射を受けることで発する蛍光を受光する受光部と、
前記受光した蛍光の信号を処理し、処理結果に基づいて、蛍光情報を求める処理部と、
前記測定対象物が前記測定点を通過するように前記測定対象物の流路を形成したフローセル体と、
前記測定対象物が圧力により前記測定点に移動するように前記測定対象物を前記フローセル体に導入させる導入管と、を有する。
前記導入管の先端開口部を覆うように、前記先端開口部に金属製網が設けられ、前記金属製網に負電位が与えられている。
【００１１】
その際、前記導入管は、金属で形成され、前記導入管に負電位が与えられている、ことが好ましい。
【００１２】
また、前記導入管は、前記測定対象物を収容する容器内に挿入されており、さらに、前記導入管の前記先端開口部と対向するように、前記容器の壁を介して設けられる前記容器を固定支持する金属製支持部材を有し、前記金属製支持部材は接地されている、ことが好ましい。
【００１３】
さらに、前記導入管の外周を取り巻くように外管が設けられ、前記外管に負電位が与えられている。
【００１４】
前記金属製網は、前記外管の先端開口部を覆う、ことが好ましい。
【００１５】
さらに、前記金属製網は、前記導入管の先端開口部から着脱自在なキャップに設けられている、ことが好ましい。
【００１６】
さらに、本発明の他の態様は、レーザ光の照射を受けることにより、生体物質を含む測定対象物が発する蛍光を検出する蛍光検出方法である。当該方法は、
測定対象物を含む溶液を加圧することにより、測定対象物を、導入管の先端開口部を覆うように前記先端開口部に設けられた金属製網を通して前記導入管に導入させ、さらに、前記導入管からフローセル体内に測定対象物を流すステップと、
前記フローセル体の測定点を通過する測定対象物をレーザ光で照射するステップと、
前記測定対象物が前記レーザ光の照射を受けることで発する蛍光を受光するステップと、
前記受光した蛍光の信号を処理し、処理結果に基づいて蛍光情報を求めるステップと、を有する。
前記金属製網には、負電位が与えられている。
【発明の効果】
【００１７】
上述の蛍光検出装置および蛍光検出方法では、従来に比べて導入管が汚れ難く、洗浄回数を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の蛍光検出装置の一実施形態であるフローサイトメータの概略構成図である。
【図２】本実施形態に用いるレーザ光源部の構成の一例を示す図である。
【図３】本実施形態の受光部の一例の概略構成図である。
【図４】（ａ）は、本実施形態のフローサイトメータの導入管および外管に装着されるキャップの外観を示す図であり、（ｂ）は、導入管、外管およびキャップを詳細に説明する図である。
【００１９】
以下、本発明の蛍光検出装置および蛍光検出方法について詳細に説明する。
【００２０】
（蛍光検出装置）
図１は、本発明の蛍光検出装置の一実施形態であるフローサイトメータ１０の概略構成図である。
フローサイトメータ１０は、細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の生体物質等を含んだ試験管内のサンプル液を導入管を用いてフローセル体に導き、フローセル体でレーザ光を照射することにより、測定対象物が発する蛍光を計測する装置である。
【００２１】
フローサイトメータ１０は、本体ユニット２０と、制御・処理部（コンピュータ）８０とを有する。本体ユニット２０は、レーザ光の照射を受けることにより蛍光を発する生体物質を付着し、バッファー液に懸濁した測定対象物１２にレーザ光を照射し、測定対象物１２中の蛍光色素の発する蛍光の蛍光信号を検出して信号処理をする。さらに、制御・処理部８０は、本体ユニット２０で得られた処理結果から検出した蛍光の蛍光強度及び蛍光緩和時間を算出し、この算出結果を用いて測定対象物１２の分析を行なう。
【００２２】
本体ユニット２０は、レーザ光源部２２と、受光部２４，２６と、管路３０と、金属製支持部材５０と、を主に有する。
管路３０は、試験管３２内に収納されたサンプル液中に先端開口部が浸っている導入管３４と、導入管３４の周りを覆う外管３６と、接続管３７と、シース液導入部３８と、フローセル体４０と、フローセル上端部４２と、回収管４４と、を有する。導入管３４、外管３６、および金属製支持部材５０については、後述する。
【００２３】
接続管３７は、試験管３２と接続し、試験管３２内の気相を加圧する空気を導入する空気導入口３７ａと、外管３６と連通し、計測が終了して試験管３２を接続管３７から取り外すとき空気を吸引する空気吸引口３７ｂを有する。空気導入口３７ａは、図示されない加圧空気供給源と接続されている。空気吸引口３７ｂは、図示されない吸引ポンプと接続されている。外管３６は、計測終了後、サンプル液が導入管３４や外管３６の表面に付着したサンプル液を吸引して液垂れを防止する。
シース液導入部３８は、フローセル体４０に測定対象物１２を一列に流すためのフローを形成するために用いるシース液を管路３０に導入する。具体的には、図示されないシース液供給源に接続された導入口３８ａ，３８ｂからシース液は導入される。
【００２４】
フローセル体４０は、シース液導入部３８から供給されるシース液の流路を絞ってシース液を高速流にし、この高速流に測定対象物１２を一列に順次流す。フローセル体４０の流路の途中には、レーザ光が集束する測定点Ｍが設けられ、測定点Ｍを通過する測定対象物１２をレーザ光が照射し、蛍光の計測に供される。
回収管４４は、フローセル上端部４２においてフローセル体４０の流路を拡げてシース液およびサンプル液が混在した液を図示されない回収容器に誘導する。
【００２５】
レーザ光源部２２は、所定の波長のレーザ光、例えばλ＝４０５ｎｍ等のレーザ光を出射する部分である。図２は、レーザ光源部２２の構成の一例を示す図である。
レーザ光源部２２は、強度変調したレーザ光を出射する。レーザ光源部２２は、例えば、青色のレーザ光をＣＷ（連続波）レーザ光として出射し、このＣＷレーザ光の強度を所定の周波数で変調する光源２２ａを有する。さらに、レーザ光源部２２は、レンズ系２２ｂと、レーザドライバ２２ｃと、を有する。レンズ系２２ｂは、レーザ光をフローセル体４０中の測定点Ｍに集束させる。レーザドライバ２２ｃは、光源２２ａを駆動する。レーザドライバ２２ｃには、レーザ光を強度変調するための変調信号が制御・処理部８０から供給される。
【００２６】
これらのレーザ光を出射する光源として例えば半導体レーザが用いられる。レーザ光は、例えば５〜１００ｍＷ程度の出力である。レーザ光源部２２から出射されるレーザ光は変調信号に基づいて強度変調され、強度を変調する周波数（変調周波数）は、その周期が蛍光緩和時定数に比べてやや長い、例えば１０〜５０ＭＨｚである。
【００２７】
光源２２ａは、レーザ光が蛍光色素を励起して特定の波長帯域の蛍光を発するように、予め定められた波長帯域で発振する。レーザ光によって励起される蛍光色素は測定しようとする生体物質に付着されており、蛍光色素と生体物質で構成された測定対象物がフローセル体４０の測定点Ｍを通過する際、測定点Ｍでレーザ光の照射を受けて特定の波長で蛍光を発する。
【００２８】
受光部２４は、フローセル体４０を挟んでレーザ光源部２２と対向するように配置されており、光電変換器（例えば、フォトダイオード）を備える。光電変換器は、測定点Ｍを通過する測定対象物によってレーザ光が前方散乱することにより、測定対象物が測定点Ｍを通過する旨の検出信号を出力する。受光部２４から出力される検出信号は、制御・処理部８０に供給され、制御・処理部８０において測定対象物がフローセル体４０中の測定点Ｍを通過するタイミングを知らせるトリガ信号として用いられる。
【００２９】
受光部２６は、レーザ光源部２２から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、かつフローセル体４０中の測定対象物の移動方向に対して垂直方向に配置されている。受光部２６は、測定点Ｍにて照射された測定対象物が発する蛍光を受光する光電変換器を備える。図３は、受光部２６の一例の概略構成図である。本実施形態では、受光部２６は、蛍光を２つの波長に分離して２つの受光素子を用いて蛍光を受光するが、蛍光を受光する受光素子は１つであってもよい。
【００３０】
図３に示す受光部２６は、測定対象物１２中の生体物質が発する蛍光を集束させるレンズ系２６ａと、ハーフミラー２６ｂと、バンドパスフィルタ２６ｃ1，２６ｃ2と、光電子増倍管等の光電変換器２７ａ，２７ｂと、を有する。
レンズ系２６ａは、受光部２６に入射したレーザ光あるいは蛍光を光電変換器２７ａ、２７ｂの受光面に集束させる。
ハーフミラー２６ｂは、光の一部を反射させて、一部を透過させるミラーである。
【００３１】
バンドパスフィルタ２６ｃ1，２６ｃ2は、各光電変換器２７ａ，２７ｂの受光面の前面に設けられ、所定の波長帯域の光のみが透過するフィルタである。透過する光の波長帯域は、蛍光色素の発する蛍光の波長帯域に対応して設定されている。バンドパスフィルタ２６ｃ1，２６ｃ2のフィルタリングにより、光電変換器２７ａ，２７ｂが所定の波長帯域の光を取り込めるように設定されている。
【００３２】
光電変換器２７ａ，２７ｂは、例えば光電子増倍管を備えたセンサを備え、光電面で受光した光を電気信号に変換するセンサである。ここで、受光するレーザ光あるいは蛍光は位相差情報を持った光信号として受光されるので、出力される電気信号は位相差情報を持った受光信号となる。この受光信号は、増幅器で増幅されて、制御・処理部８０に供給される。
【００３３】
制御・処理部８０は、フローサイトメータ１０全体の動作を制御、管理する他、レーザ光の強度を所定の周波数で変調（振幅変調）するための変調信号を生成する。さらに、制御・処理部８０は、光電変換器２７ａ，２７ｂから出力される蛍光信号を処理する。具体的には、制御・処理部８０は、蛍光信号をアンプで増幅し、増幅した蛍光信号を生成した上記変調信号とミキシングし、その後、ミキシングで得られた信号をローパスフィルタ処理を行うことにより、蛍光信号の変調信号に対する位相遅れを算出し、この位相遅れに基づいて蛍光の蛍光寿命（蛍光緩和時間）を蛍光の情報として算出する。また、制御・処理部８０は、蛍光信号を用いて蛍光強度を蛍光の情報として算出する。蛍光寿命および蛍光強度は、測定対象物１２に識別用ラベルとして付けられている蛍光物質に応じて定まっているので、蛍光寿命および蛍光強度を求めることにより、どの測定対象物が測定点Ｍを通過したか、情報を得ることができる。
【００３４】
図４（ａ）は、フローサイトメータ１０の導入管３４および外管３６に装着されるキャップ４６の外観を示す図である。図４（ｂ）は、導入管３４、外管３６およびキャップ４６を詳細に説明する図である。
キャップ４６は、金属からなり、導入管３４および外管３５の先端開口部に着脱自在に設けられている。外管３６の先端には、鍔が設けられ、この鍔が、キャップ４６の内周面に設けられた凹部と嵌合する構成となって、キャップ４６は外管３６の先端開口部に装着される。
【００３５】
キャップ４６が設けられた導入管３４は、測定対象物１２を収容する試験管３２内に挿入され、キャップ４６および導入管３４の先端はサンプル液内に浸っている。キャップ４６には、開口が設けられ、この開口に金属製網４８が設けられている。金属製網４８は、導入管３４の先端開口部および外管３６の先端開口部を覆う。金属製網４８は、メッシュ状に金属繊維が交差したものであり、複数の測定対象物１２が凝集した塊りは通過しないが、測定対象物１２単体は通過できるようなサイズの網が設けられている。例えば、測定対象物１２が１００μｍ程度の直径を有するのであれば、１５０〜２００μｍ程度の間隔の網になっている。また、金属製網４８は、電流が流れることにより、電気分解が生じるのを防ぐ目的で、サンプル液と接触する部分は絶縁体で被覆されている。外管３６および導入管３４は、いずれもキャップ４６あるいは金属製網４８と接触している。
また、接続管３７には、図示されないＤＣ電源の負極と接続された電極端子が設けられ、外管３６は負の電位が与えられている。さらに、外管３６は、キャップ４６の金属製網４８と接触しているので、キャップ４６も、外管３６と同様の負の電位が与えられている。さらに、導入管３４は、キャップ４６の金属製網４８と接触しているので、導入管３４も、外管３６と同様の負の電位が与えられている。
【００３６】
これに対して、導入管３４の先端開口部と対向するように、試験管３２の壁を介して設けられる試験管３２を固定支持する金属製支持部材５０は接地されている。すなわち、ＤＣ電源の正極は金属製支持部材５０と接続され、この金属製支持部材５０が接地されることにより、金属製支持部材５０に対して、導入管３４、外管３６および金属製網４８が負電位となっている。
【００３７】
このように、導入管３４、外管３６および金属製網４８に負の電位を与えるのは、生体物質等の測定対象物は負の電荷を帯びているものが多い。試験管３２の気相の加圧によりサンプル液は、導入管３４に流れ込み、上昇しようとするとき、元来負の電荷を帯びているサンプル液内の単体の測定対象物１２は、網の隙間を通って導入管３４内に導かれる。このとき、凝集した複数の測定対象物の塊りは、金属製網４８を通過することはできない。したがって、導入管３４内に、単体の測定対象物が移動する。
さらに、導入管３４の表面は負の電位が与えられているので、負の電荷を有する測定対象物が導入管３４の表面に付着することは少ない。しかも、導入管３４内には、複数の測定対象物１２が凝集した塊りは存在しないので、ファンデルワールス力等によって導入管３４の表面に上記塊りが付着することも少ない。
したがって、本実施形態は、従来に比べて導入管３４が汚れ難く、洗浄回数を抑制することができる。
【００３８】
（蛍光検出方法）
このようなフローサイトメータ１０は、測定対象物１２を含むサンプル液の気相を加圧することにより、測定対象物１２を導入管３４の先端開口部を覆うように先端開口部に設けたキャップ４６の金属製網４８を通過させる。さらに、フローサイトメータ１０は、測定対象物１２を導入管３４に導入させ、さらに、導入管３４からフローセル体４０内にシース液を用いて測定対象物１２を流す。このとき、金属製網４８には、負電位が与えられる。
【００３９】
次に、レーザ光源部２２は、フローセル体４０の測定点Ｍを通過する測定対象物１２を照射するために、レーザ光を出射する。このとき、受光部２６は、測定対象物１２がレーザ光の照射を受けることで発する蛍光を受光する。
この後、制御・処理部８０は、受光した蛍光の信号を処理し、処理結果に基づいて、蛍光寿命および蛍光強度を含む蛍光情報を求める。
【００４０】
このように、測定対象物１２を含むサンプル液を導入管３４に導入するとき、金属製網４８を用いるので、凝集した測定対象物は導入管３４内に進入できない。また、金属製網４８には負電位が与えられているで、金属製膜４８に付着することなく、気相の加圧によって単体の測定対象物１２が導入管３４に移動する。このとき、サンプル液に浸っている外管３６、導入管３４も負電位となっているので、測定対象物１２が表面に付着することも少ない。
また、金属製網４８を測定対象物１２が通過するとき、負の電荷を持たない測定対象物１２であっても、金属製網４８の電位の影響を受けて負に帯電する。このため、導入管３４内に導入された測定対象物１２が凝集して、導入管３４の表面に付着することは少なくなる。このため、導入管３４の洗浄回数は少なくなる。
また、フローセル体４０において単体の測定対象物１２が測定点Ｍを通過するので、複数の測定対象物１２が凝集した塊りを測定する可能性は低くなる。
【００４１】
以上、本発明の蛍光検出装置および蛍光検出方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【符号の説明】
【００４２】
１０ フローサイトメータ
２０ 本体ユニット
２２ レーザ光源部
２２ａ 光源
２２ｂ，２６ａ レンズ系
２２ｃ レーザドライバ
２４，２６ 受光部
２６ｂ ハーフミラー
２６ｃ１，２６ｃ2 バンドパスフィルタ
２７ａ，２７ｂ 光電変換器
３０ 管路
３２ 試験管
３４ 導入管
３６ 外管
３７ 接続管
３７ａ 空気導入口
３７ｂ 空気吸引口
３８ シース液導入部
３８ａ，３８ｂ 導入口
４０ フローセル体
４２ フローセル上端部
４４ 回収管
４６ キャップ
４８ 金属製網
５０ 金属製支持部材
８０ 制御・処理部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光の照射を受けることにより、生体物質を含む測定対象物が発する蛍光を検出する蛍光検出装置であって、
測定対象物を測定点で照射するためにレーザ光を出射するレーザ光源部と、
前記測定対象物が前記レーザ光の照射を受けることで発する蛍光を受光する受光部と、
前記受光した蛍光の信号を処理し、処理結果に基づいて、蛍光情報を求める処理部と、
前記測定対象物が前記測定点を通過するように前記測定対象物の流路を形成したフローセル体と、
前記測定対象物が圧力により前記測定点に移動するように前記測定対象物を前記フローセル体に導入させる導入管と、を有し、
前記導入管の先端開口部を覆うように、前記先端開口部に金属製網が設けられ、前記金属製網に負電位が与えられている、ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
前記導入管は、金属で形成され、前記導入管に負電位が与えられている、請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
前記導入管は、前記測定対象物を収容する容器内に挿入されており、
さらに、前記導入管の前記先端開口部と対向するように、前記容器の壁を介して設けられる前記容器を固定支持する金属製支持部材を有し、前記金属製支持部材は接地されている、請求項１または２に記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
さらに、前記導入管の外周を取り巻くように外管が設けられ、前記外管に負電位が与えられている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記金属製網は、前記外管の先端開口部を覆う、請求項４に記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
前記金属製網は、前記導入管の先端開口部から着脱自在なキャップに設けられている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項７】
レーザ光の照射を受けることにより、生体物質を含む測定対象物が発する蛍光を検出する蛍光検出方法であって、
測定対象物を含む溶液を加圧することにより、測定対象物を、導入管の先端開口部を覆うように前記先端開口部に設けられた金属製網を通して前記導入管に導入させ、さらに、前記導入管からフローセル体内に測定対象物を流すステップと、
前記フローセル体の測定点を通過する測定対象物をレーザ光で照射するステップと、
前記測定対象物が前記レーザ光の照射を受けることで発する蛍光を受光するステップと、
前記受光した蛍光の信号を処理し、処理結果に基づいて、蛍光情報を求めるステップと、を有し、
前記金属製網には負電位が与えられている、ことを特徴とする蛍光検出方法。
【請求項１】
レーザ光の照射を受けることにより、生体物質を含む測定対象物が発する蛍光を検出する蛍光検出装置であって、
測定対象物を測定点で照射するためにレーザ光を出射するレーザ光源部と、
前記測定対象物が前記レーザ光の照射を受けることで発する蛍光を受光する受光部と、
前記受光した蛍光の信号を処理し、処理結果に基づいて、蛍光情報を求める処理部と、
前記測定対象物が前記測定点を通過するように前記測定対象物の流路を形成したフローセル体と、
前記測定対象物が圧力により前記測定点に移動するように前記測定対象物を前記フローセル体に導入させる導入管と、を有し、
前記導入管の先端開口部を覆うように、前記先端開口部に金属製網が設けられ、前記金属製網に負電位が与えられている、ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
前記導入管は、金属で形成され、前記導入管に負電位が与えられている、請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
前記導入管は、前記測定対象物を収容する容器内に挿入されており、
さらに、前記導入管の前記先端開口部と対向するように、前記容器の壁を介して設けられる前記容器を固定支持する金属製支持部材を有し、前記金属製支持部材は接地されている、請求項１または２に記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
さらに、前記導入管の外周を取り巻くように外管が設けられ、前記外管に負電位が与えられている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記金属製網は、前記外管の先端開口部を覆う、請求項４に記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
前記金属製網は、前記導入管の先端開口部から着脱自在なキャップに設けられている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項７】
レーザ光の照射を受けることにより、生体物質を含む測定対象物が発する蛍光を検出する蛍光検出方法であって、
測定対象物を含む溶液を加圧することにより、測定対象物を、導入管の先端開口部を覆うように前記先端開口部に設けられた金属製網を通して前記導入管に導入させ、さらに、前記導入管からフローセル体内に測定対象物を流すステップと、
前記フローセル体の測定点を通過する測定対象物をレーザ光で照射するステップと、
前記測定対象物が前記レーザ光の照射を受けることで発する蛍光を受光するステップと、
前記受光した蛍光の信号を処理し、処理結果に基づいて、蛍光情報を求めるステップと、を有し、
前記金属製網には負電位が与えられている、ことを特徴とする蛍光検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１２−１９８１６９（Ｐ２０１２−１９８１６９Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−６３７９１（Ｐ２０１１−６３７９１）
【出願日】平成２３年３月２３日（２０１１．３．２３）
【出願人】（０００００５９０２）三井造船株式会社 (1,723)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２３日（２０１１．３．２３）
【出願人】（０００００５９０２）三井造船株式会社 (1,723)
【Ｆターム（参考）】
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