蛍光試薬
【課題】蛍光試薬を提供する。
【解決手段】少なくとも２つの異なる被験サンプル中のペプチド又はタンパク質を、ＨＰＬＣにより同時検出・定量するための蛍光試薬であって、７−クロロ−４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−ｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）、又は４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＡＡＢＤ−Ｆ）、を有効成分とする蛍光試薬。
【効果】プロテオーム解析において、異なる被験サンプル中のペプチド又はタンパク質を、ＨＰＬＣにより同時検出・定量することが可能な新規蛍光試薬を提供することができる。
【解決手段】少なくとも２つの異なる被験サンプル中のペプチド又はタンパク質を、ＨＰＬＣにより同時検出・定量するための蛍光試薬であって、７−クロロ−４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−ｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）、又は４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＡＡＢＤ−Ｆ）、を有効成分とする蛍光試薬。
【効果】プロテオーム解析において、異なる被験サンプル中のペプチド又はタンパク質を、ＨＰＬＣにより同時検出・定量することが可能な新規蛍光試薬を提供することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも２つの被験サンプル中のペプチド又はタンパク質を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により同時検出・定量することを可能とする新規蛍光試薬に関するものであり、更に詳しくは、７−クロロ−４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−ｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）、４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＡＡＢＤ−Ｆ）、を有効成分とする新規蛍光試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
被験サンプル中のペプチド又はタンパク質を、ＨＰＬＣにより検出する蛍光試薬として、本発明者は、先に、ＳＢＤ−Ｆ、ＳＢＳｅＤ−Ｆ、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ、ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌを開発し（非特許文献１−２）、更に、ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＥＡＥＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＥＡＰＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ、ＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ、及びＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆを開発している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−３０９７０７号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３，７５，３７２５−３７３０
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５，１５，２８６５−２８７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでに、本発明者は、チオール基選択的水溶性ベンゾフラザン蛍光誘導体化試薬である７−Ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＳＢＤ−Ｆ）、及び４−（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ）を開発し、これらを用いてタンパク質を誘導体化し、ＨＰＬＣ−蛍光検出・定量法、及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータベース検索により同定するプロテオーム解析法（ＦＤ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）を開発した。
【０００６】
一方、本発明者は、異なる試料の同時分析を可能とするため、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌと異なる蛍光特性を持ち、ベンゾセレナジアゾール骨格をする７−Ｆｌｕｏｒｏ−Ｎ−［２−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ）の開発を行い、それぞれの誘導体の二波長同時検出法の開発を試みた。
【０００７】
本発明者は、更に、２種の化合物を合成し、それらを組み合わせた二波長同時検出法の構築に成功し、本発明を完成するに至った。本発明は、７−クロロ−４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−ｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）、又は４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＡＡＢＤ−Ｆ）、を有効成分とする新規蛍光試薬を提供することを目的とするものである。また、本発明は、プロテオーム解析において、異なる被験サンプル中のペプチド又はタンパク質を、ＨＰＬＣにより同時検出・定量することが可能な新規蛍光試薬を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）少なくとも２つの被験サンプル中のペプチド又はタンパク質を、ＨＰＬＣにより同時検出・定量するための蛍光試薬であって、
７−クロロ−４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−ｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）、又は４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＡＡＢＤ−Ｆ）、を有効成分とすることを特徴とする蛍光試薬。
【０００９】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
１．新規蛍光試薬の合成
本発明では、４−ｃｈｌｏｒｏ−７−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＣＢＤ−Ｃｌ）を、トリエチルアミン存在下で、Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−ｄ６と、０℃で反応させて、７−Ｃｈｌｏｒｏ−４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−ｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）を合成した（以下、化合物１と記載することがある）。
【００１０】
また、２−Ｆｌｕｏｒｏ−６−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅを出発材料とし、パラジウム−活性炭触媒で、接触還元を行い、３−ｆｌｕｏｒｏ−ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅを得た。これを、ＳｅＯ２と反応させ、４−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅを得た。
【００１１】
これを、クロロスルホン酸と反応させ、４−ｃｈｌｒｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＣＢＤ−Ｆ）を得た。このＣＢＤ−Ｆを、トリエチルアミンの存在下で、Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅと反応させ、４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＤＡＡＢＤ−Ｆ）を合成した（以下、化合物２と記載することがある）。
【００１２】
２．誘導体の蛍光特性の検討
（ペプチド及びタンパク質との反応性）
２．５μＭオキシトシンと、０．３μＭ ＢＳＡの混合液１０μＬを、１２０μＬの５０ｍＭ ＣＨＡＰＳ・５ｍＭ ＴＣＥＰ・１０ｍＭ ＥＤＴＡ混合液、６０μＬの８Ｍ塩酸グアニジン溶液（ｐＨ８．５）、１０μＬの１４０ｍＭ化合物１、化合物２の各溶液を、それぞれ混合し、４０℃で、１０−８０分間反応させ、蛍光誘導体化反応を行った。化合物１、化合物２はそれぞれアセトニトリルに、オキシトシンは、純水に、それ以外の物質は、８Ｍ塩酸グアニジン溶液（ｐＨ８．５）に、それぞれ溶解させた。反応液の１０μＬを、蛍光検出器を接続したＨＰＬＣに注入し、蛍光強度を測定した。
【００１３】
（各誘導体の蛍光スペクトル測定）
１００μＭオキシトシンと、１０μＭ ＢＳＡの混合液１０μＬを、６０μＬの５０ｍＭ ＣＨＡＰＳ・５ｍＭ ＴＣＥＰ・１０ｍＭ ＥＤＴＡ混合液、２５μＬの８Ｍ塩酸グアニジン溶液（ｐＨ８．５）、５μＬの１４０ｍＭ化合物１、化合物２の各溶液を、それぞれ混合し、４０℃で、４０分間反応させ、蛍光誘導体化反応を行った。
【００１４】
化合物１、化合物２は、それぞれアセトニトリルに、オキシトシンは純水に、それ以外の物質は８Ｍ塩酸グアニジンを含むビシン緩衝溶液（ｐＨ８．５）に、それぞれ溶解させた。３μＬの１０％トリフルオロ酢酸を加えて反応を停止させた後、反応液の１０μＬを、蛍光検出器を接続したＨＰＬＣに注入し、オキシトシンとＢＳＡに相当する部分を分取した。各分画について、蛍光光度計で、励起・蛍光波長を測定した。
【００１５】
（各誘導体の保持時間の測定）
２．５μＭオキシトシン・５．０μＭソマトスタチン・２．５μＭカルシトニン・２．５μＭトリプシンインヒビター及び０．５μＭ ＢＳＡの混合液１０μＬを、［各誘導体の蛍光スペクトル測定］と同様の方法で、蛍光誘導体化反応を行った。反応液の２０μＬを、蛍光検出器を接続したＨＰＬＣに注入し、各誘導体の保持時間を測定した。
【００１６】
ＨＰＬＣ条件：
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｉｍｔａｋｔ ＷＰ−ＲＰ（２５０ｘ４．６ｍｍＩ．Ｄ．）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：（ａ）１０％ ＣＨ３ＣＮ ｗｉｔｈ ０．１％ ＴＦＡ、（ｂ）７０％ ＣＨ３ＣＮ ｗｉｔｈ ０．１％ ＴＦＡ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｔｉｍｅ：０→３６（ｍｉｎ），（ｂ）：０→６０％
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．７０ｍｌ／ｍｉｎ
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：６０℃
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：
３９５ｎｍ（Ｅｍ），５０５ｎｍ（Ｅｘ）ｆｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ １−４
４２２ｎｍ（Ｅｍ），５４２ｎｍ（Ｅｘ）ｆｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ５−８
【００１７】
３．二波長同時測定法の検討
５．０μＭオキシトシン及び０．５μＭ ＢＳＡの混合液１０μＬを、［各誘導体の蛍光スペクトル測定］と同様の方法で、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄｌ又はＤＡＡＢＤ−Ｆと、それぞれ蛍光標識化反応を行った。反応液を当量ずつ混合し、その２０μＬを、蛍光検出器２台を直列に接続したＨＰＬＣに注入し、二波長同時測定を行った。
【００１８】
ＨＰＬＣ条件：
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｉｍｔａｋｔ ＷＰ−ＲＰ（２５０ｘ４．６ｍｍＩ．Ｄ．）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：（ａ）１０％ ＣＨ３ＣＮ ｗｉｔｈ ０．１％ ＴＦＡ、（ｂ）７０％ ＣＨ３ＣＮ ｗｉｔｈ ０．１％ ＴＦＡ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ：Ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｔｉｍｅ：０→３６（ｍｉｎ），（ｂ）：０→６０％
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．７０ｍｌ／ｍｉｎ
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：６０℃
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：
４５０ｎｍ（Ｅｍ），５７０ｎｍ（Ｅｘ）ｆｏｒ １ｓｔ ｄｅｔｅｃｔｏｒ
３７５ｎｍ（Ｅｍ），４８０ｎｍ（Ｅｘ）ｆｏｒ ２ｎｄ ｄｅｔｅｃｔｏｒ
【００１９】
本発明で、ベンゾキサジアゾール骨格を持つ蛍光試薬２種を新たに合成し、各試薬の反応性を検討したところ、いずれも、反応時間４０分で、最大の蛍光強度を与えた。また、各試薬誘導体の励起・蛍光波長は、骨格に依存し、側鎖部分の変化は、蛍光特性に大きな影響は与えなかった。
【００２０】
ペプチド及びタンパク質で、各試薬誘導体の保持時間を測定したところ、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６とＤＡＡＢＤ−Ｆの組合せで、それぞれの誘導体が異なる蛍光特性と、ほぼ同じ保持時間を示し、二波長同時測定法への適用が可能であることが示唆された。
【００２１】
ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄｌとＤＡＡＢＤ−Ｆの組合せで、ペプチドとタンパク質を用いて、二波長同時検出法の検討を行った。その結果、それぞれの試薬に対して、特異的なクロマトグラムが類似した形で得ることができた。この試薬の組合せは、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆを用いた場合よりも、ピークの比較同定が容易であることから、二波長同時測定法を用いた変異タンパク質の発見など、プロテオーム解析への様々な応用が期待できる。
【００２２】
誘導体の蛍光特性を調べるために、誘導体の励起・蛍光スペクトルを測定し、新しく合成された試薬は、同時検出実験に利用可能であることが確認された。本発明では、誘導体は、ＨＰＬＣで分離され、スペクトルを直接測定した。ベンゾキサジアゾール試薬誘導体は、最大励起波長が、ペプチド（ｏｘｙｔｏｃｉｎ）で、３８６から３８９ｎｍ、及びタンパク質（ＢＳＡ）で、３８９から３９２ｎｍの範囲であり、また、最大発光波長は、５０３から５０５ｎｍ及び５０２から５０３ｎｍであった。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）プロテオーム解析において、異なる被験サンプル中のペプチド又はタンパク質を、ＨＰＬＣにより同時検出・定量することが可能な新規蛍光試薬を提供することができる。
（２）７−クロロ−４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−ｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）、又は４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＡＡＢＤ−Ｆ）、を有効成分とする新規蛍光試薬を提供することができる。
（３）ＨＰＬＣにおいて分取したペプチド又はタンパク質誘導体を、酵素消化し、ＨＰＬＣ−タンデム質量分析計に付し、同位体比より、ペプチド又はタンパク質の存在比を計算できる新規蛍光試薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＤＡＡＢＤ−Ｆ又はＤＡＡＢＤ−Ｃｌによる乳腺正常細胞株ＨＭＥＣ抽出タンパク質誘導体化クロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。
試薬
４−クロロ−７−クロロスルホニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾールは、市販品（東京化成工業）を購入し、それ以上精製しないで使用した。トリプシン阻害剤（ｓｏｙｂｅａｎ：ＭＷ２４０４９）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン、及びＮ，Ｎ−ジエチル−１，３−プロパンジアミンは、市販品（和光純薬工業）を購入し、それ以上精製しないで使用した。
【００２６】
トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン ハイドロクロライド（ＴＣＥＰ）、８Ｍグアニジン ハイドロクロライド（ｂｉｃｉｎｅ、ｐＨ８．５）、及び子牛血清アルブミン（ＢＳＡ，ＭＷ６６３８５）は、市販品（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を購入した。
【００２７】
オキシトシン（ＭＷ１００７）、及びカルシトニン（ヒト；ＭＷ３４１８）は、市販品（ペプチド工業）を購入した。
【００２８】
ソマトスタチン（ＭＷ１６３８）は、市販品（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を購入した。３−［（３−コルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、及びエチレンジアミンテトラアセチック アシド ジソジウム塩（Ｎａ２ＥＤＴＡ）は、市販品（Ｄｏｊｉｎｄｏ研究所）を購入した。
【００２９】
ＨＰＬＣ実験のために、アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）、及びトリフルオロアセチック アシド（アミノ酸配列グレード）は、市販品（和光純薬工業）を購入した。Ｑｕｉｋ Ｓｔａｒｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔは、市販品（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を購入した。その他の全ての試薬は、分析用又は保障付試薬を使用した。
【実施例１】
【００３０】
［Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン−ｄ６の合成］
ジメチルアンモニウム クロライド−ｄ６（２．４６ｇ）、及びプロモアセトニトリル（３．３７ｇ）を、ジエチルエーテル（２０ｍｌ）に溶解した。１０℃で、５０％ＮａＯＨ（４．５ｇ）を添加した後、混合物を、同温度で、２時間撹拌した。
【００３１】
エーテル相を分離し、水相を、エーテル（１０ｍｌ×３）で抽出した。これらを一緒にしたエーテル相を、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空で、エバポレーションして、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアセトニトリル−ｄ６水溶液（１０ｇ）を得て、ＬｉＡｌＨ４（１．２８ｇ）、スルホン酸（１．６９ｇ）の混合物に、テトラヒドロフラン（４０ｍｌ）中で、１０℃で、添加した。
【００３２】
反応混合物は、室温で、１３時間に亘って、撹拌した。これに、エーテル（３０ｍｌ）を添加した後、混合物を、ＮａＯＨ（４ｇを６ｍｌの水に溶解したもの）で処理した。エーテル相は、分離し、水層をエーテル（１０ｍｌ×２）で抽出した。これらを合わせたエーテル層を、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空中でエバポレーションして、残渣を５ｇまで減少させた。残渣を蒸留し、フラクション（７０−８０℃）を合わせて、１．７９ｇ（収率、５２．５％）のＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン−ｄ６（７７．４％ＴＨＦ溶液）を得た。
【００３３】
以下に、得られた化合物の確認データを示す。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１．８２−１．８８（１．５４Ｈ，ｍ ｆｏｒ ＴＨＦ，４Ｈ），２．３３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ），２．７７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．７２−３．７６（１．４８，ｍ ｆｏｒ ＴＨＦ，４Ｈ）
【実施例２】
【００３４】
［７−クロロ−４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾールｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）の合成］
４−クロロ−７−クロロスルホニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（３．２８ｇ）を、ＣＨ３ＣＮ（６０ｍｌ）中に溶解した。この溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン−ｄ６（１．０ｇ）、及びトリエチルアミン（１．９２ｍｌ）を、氷で冷却しながら、それぞれ加え、同温度に、１時間静置し、１．５時間、室温で、撹拌した。
【００３５】
次いで、反応混合物を、真空下で、エバポレーションし、反応残渣を、ＡｃＯＥｔに溶解した。エチル酢酸溶液を、飽和ＮａＨＣＯ３、蒸留水、飽和ＮａＣｌ溶液で、それぞれ洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。ろ過した溶液を、真空で、エバポレーションし、反応残渣を、シリカゲエルカラムで、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（５０：１）で溶出して、精製した。溶出液を、エバポレーションにより乾燥し、残渣を、ＥｔＯＨ−ＡｃＯＥｔで再結晶して、１．３６ｇ（収率、４１．３％）を得た。化１に、合成した化合物の化学構造を示す。
【００３６】
【化１】
【００３７】
以下に、合成した化合物の確認データを示す。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），３．１３（２Ｈ，ｍ）、２．３３（２Ｈ，ｍ）．ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ/ｚ３１１（Ｍ＋Ｈ）＋，ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：１３４２及び１１６６．
【実施例３】
【００３８】
［４−（ジメチルアムルノエチルアルムノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾールの合成］
４−クロロスルホニル−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール１．０ｇを、アセトニトリル５０ｍｌに溶解した。Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン０．７５ｇ、及びトリエチルアミン３０４μｌを添加した後、混合物を、室温で、３０分撹拌した。
【００３９】
反応混合物を、減圧下で、エバポレーションにより、乾燥し、残渣を、ジクロロメタン／メタノール＝９／１を用いて、シリカゲル（Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ−２００，５０ｍｍ×８００ｍｍ）のクロマトグラフィーにかけて、黄色粉末のＤＡＡＢＤ−Ｆ０．１０ｇ（Ｒｆ＝０．４８，収率８．２％）を得た。化２に、合成した化合物の化学構造を示す。
【００４０】
【化２】
【００４１】
以下に、合成した化合物の確認データを示す。１Ｈ−ＮＭＲ δ８．１ｐｐｍ（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈｂ），６．１ｐｐｍ（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈａ），３．４ｐｐｍ（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，Ｈｃ）、２．７ｐｐｍ（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，Ｈｄ）、２．３ｐｐｍ（６Ｈ，ｓ，−ＣＨ３）、：ＭＳ ｍ/ｚ ２８９（Ｍ＋Ｈ）＋，ｍｐ９６．４−９８．６℃．
【００４２】
以下に、ＤＡＡＢＤ−Ｆ誘導体のトリフルオロ酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）塩の元素分析の結果を示す。また、化３に、本化合物の化学構造を示す。
組成式：Ｃ１２Ｈ１４Ｎ４Ｏ５ＳＦ４
Ｅｘａｃｔ Ｍａｓｓ：４０２．０６
分子量：４０２．３２
分析値：Ｃ％ ３５．５３、Ｈ％ ３．５７、Ｎ％ １３．８３、Ｆ％ １８．９１
論理値：Ｃ％ ３５．８２、Ｈ％ ３．５１、Ｎ％ １３．９３、Ｆ％ １８．８９
【００４３】
【化３】
【実施例４】
【００４４】
［ＤＡＡＢＤ−Ｆによる乳腺正常細胞株中ペプチド又はタンパク質のＨＰＬＣ検出］
本実施例では、ＤＡＡＢＤ−Ｆを用いて、乳腺正常細胞株中のペプチド及びタンパク質を、ＤＡＡＢＤ誘導体として、ＨＰＬＣ分離・検出を行った。そのときのクロマトグラムを図１（下）に示す。
【００４５】
同様に、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌを使用して、乳腺正常細胞株中のペプチド及びタンパク質を、ＤＡＡＢＤ誘導体として、ＨＰＬＣ分離・検出を行った。そのときのクロマトグラムを図１（上）に示す。両者で、ほとんど差の無いクロマトグラムが得られていることが確認された。
【００４６】
実験条件：ＤＡＡＢＤ−Ｆによる乳腺正常細胞株ＨＭＥＣ抽出タンパク質誘導体化とＨＰＬＣ
１．溶離液の組成
Ａ液；アセトニトリル：イソプロパノール：水：トリフルオロ酢酸＝９：１：９０：０．２
Ｂ液；アセトニトリル：イソプロパノール：水：トリフルオロ酢酸＝６９：１：３０：０．１５
＊注；Ａ液をＣポンプに、Ｂ液をＢポンプにセットした
【００４７】
２．カラム
Ｉｍｔａｋｔ ＷＸＲ ２５０×４．６ｍｍ Ｐｒｏ＃；ＺＣ０６９ Ｓｅｒ＃；ＦＧ２８Ａ８Ｂ
温度；６０℃
【００４８】
３．流速
０．５５ｍＬ／ｍｉｎ
【００４９】
４．検出条件
蛍光検出；励起波長；３９５ｎｍ、蛍光波長；５０５ｎｍ
【００５０】
５．ＨＰＬＣグラジェント条件
Ａ液をＣポンプに、Ｂ液をＢポンプに、それぞれセットし、以下のグラジェント条件により分析を行った。最初の１５分間５％Ｂで一定； 以後３０分まで３０％Ｂに上昇； ６５分まで３０％Ｂで一定； 以後７０分まで３５％Ｂに上昇； 以後１３０分まで３８％Ｂに上昇； 以後２５０分まで４４％Ｂに上昇； ２９０分まで４４％Ｂで一定； 以後３３０分まで４７％Ｂに上昇； 以後４８０分まで６０％Ｂに上昇； 以後５２０分まで７０％Ｂに上昇； 以後５７０分まで９０％Ｂに上昇； 以後６００分まで９０％Ｂで一定で、送液した。
【００５１】
６．システム
ポンプ；Ｌ−２１３０（ＨＩＴＡＣＨＩ）、カラムオーブン；Ｌ−２３００（ＨＩＴＡＣＨＩ）、蛍光検出器；Ｌ−２４８０（ＨＩＴＡＣＨＩ）の組み合わせのシステムを使用し、試料注入用のループは、２０μＬのものを使用した。
【００５２】
７．誘導体化反応
ＣＨＡＰＳ水溶液で抽出された２．７ｍｇ／ｍＬ ＨＭＥＣタンパク質溶液７．５μＬを、６Ｍグアニジン緩衝液（ｐＨ８．７）に溶解した１６．７ｍＭ ＣＨＡＰＳ／３．３３ｍＭ ＥＤＴＡ／０．８３ｍＭ ＴＣＥＰ混合溶液３０μＬ、６Ｍグアニジン緩衝液（ｐＨ８．７）１０μＬ、アセトニトリルに溶解した１２．５ｍＭ ＤＡＡＢＤ−Ｆ溶液２．５μＬと混和した。混和後、４０℃で、５分間反応させ、１０％トリフルオロ酢酸水溶液 １．５μＬを添加して、反応を停止させた。この反応液のうち、２０μＬを、ＨＰＬＣに注入し、分析を行なった。
【００５３】
蛍光標識試薬として、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌを用いる場合、反応液に添加するＤＡＡＢＤ−Ｃｌ濃度は、１４０ｍＭとし、反応は、４０℃で、１０分間、後の条件は、ＤＡＡＢＤ−Ｆの場合と同じとした。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
以上詳述したように、本発明は、蛍光試薬に係るものであり、本発明により、プロテオーム解析において、少なくとも２つの異なる被験サンプル中のペプチド又はタンパク質をＨＰＬＣにより同時検出・定量して、ペプチド又はタンパク質のプロファイルを高精度に解析することを可能とする新規蛍光試薬を提供することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも２つの被験サンプル中のペプチド又はタンパク質を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により同時検出・定量することを可能とする新規蛍光試薬に関するものであり、更に詳しくは、７−クロロ−４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−ｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）、４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＡＡＢＤ−Ｆ）、を有効成分とする新規蛍光試薬に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
被験サンプル中のペプチド又はタンパク質を、ＨＰＬＣにより検出する蛍光試薬として、本発明者は、先に、ＳＢＤ−Ｆ、ＳＢＳｅＤ−Ｆ、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ、ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌを開発し（非特許文献１−２）、更に、ＤＡＰＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＥＡＥＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＥＡＰＡＢＤ−Ｃｌ、ＤＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆ、ＤＥＡＥＡＢＳｅＤ−Ｆ、及びＤＥＡＰＡＢＳｅＤ−Ｆを開発している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００７−３０９７０７号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００３，７５，３７２５−３７３０
【非特許文献２】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００５，１５，２８６５−２８７２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これまでに、本発明者は、チオール基選択的水溶性ベンゾフラザン蛍光誘導体化試薬である７−Ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＳＢＤ−Ｆ）、及び４−（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｃｈｌｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ）を開発し、これらを用いてタンパク質を誘導体化し、ＨＰＬＣ−蛍光検出・定量法、及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータベース検索により同定するプロテオーム解析法（ＦＤ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法）を開発した。
【０００６】
一方、本発明者は、異なる試料の同時分析を可能とするため、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌと異なる蛍光特性を持ち、ベンゾセレナジアゾール骨格をする７−Ｆｌｕｏｒｏ−Ｎ−［２−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅ−４−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆ）の開発を行い、それぞれの誘導体の二波長同時検出法の開発を試みた。
【０００７】
本発明者は、更に、２種の化合物を合成し、それらを組み合わせた二波長同時検出法の構築に成功し、本発明を完成するに至った。本発明は、７−クロロ−４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−ｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）、又は４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＡＡＢＤ−Ｆ）、を有効成分とする新規蛍光試薬を提供することを目的とするものである。また、本発明は、プロテオーム解析において、異なる被験サンプル中のペプチド又はタンパク質を、ＨＰＬＣにより同時検出・定量することが可能な新規蛍光試薬を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するための本発明は、以下の技術的手段から構成される。
（１）少なくとも２つの被験サンプル中のペプチド又はタンパク質を、ＨＰＬＣにより同時検出・定量するための蛍光試薬であって、
７−クロロ−４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−ｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）、又は４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＡＡＢＤ−Ｆ）、を有効成分とすることを特徴とする蛍光試薬。
【０００９】
次に、本発明について更に詳細に説明する。
１．新規蛍光試薬の合成
本発明では、４−ｃｈｌｏｒｏ−７−ｃｈｌｏｒｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＣＢＤ−Ｃｌ）を、トリエチルアミン存在下で、Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ−ｄ６と、０℃で反応させて、７−Ｃｈｌｏｒｏ−４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ−ｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）を合成した（以下、化合物１と記載することがある）。
【００１０】
また、２−Ｆｌｕｏｒｏ−６−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅを出発材料とし、パラジウム−活性炭触媒で、接触還元を行い、３−ｆｌｕｏｒｏ−ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅを得た。これを、ＳｅＯ２と反応させ、４−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｓｅｌｅｎａｄｉａｚｏｌｅを得た。
【００１１】
これを、クロロスルホン酸と反応させ、４−ｃｈｌｒｏｓｕｌｆｏｎｙｌ−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＣＢＤ−Ｆ）を得た。このＣＢＤ−Ｆを、トリエチルアミンの存在下で、Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅと反応させ、４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）−７−ｆｌｕｏｒｏ−２，１，３−ｂｅｎｚｏｘａｄｉａｚｏｌｅ（ＤＡＡＢＤ−Ｆ）を合成した（以下、化合物２と記載することがある）。
【００１２】
２．誘導体の蛍光特性の検討
（ペプチド及びタンパク質との反応性）
２．５μＭオキシトシンと、０．３μＭ ＢＳＡの混合液１０μＬを、１２０μＬの５０ｍＭ ＣＨＡＰＳ・５ｍＭ ＴＣＥＰ・１０ｍＭ ＥＤＴＡ混合液、６０μＬの８Ｍ塩酸グアニジン溶液（ｐＨ８．５）、１０μＬの１４０ｍＭ化合物１、化合物２の各溶液を、それぞれ混合し、４０℃で、１０−８０分間反応させ、蛍光誘導体化反応を行った。化合物１、化合物２はそれぞれアセトニトリルに、オキシトシンは、純水に、それ以外の物質は、８Ｍ塩酸グアニジン溶液（ｐＨ８．５）に、それぞれ溶解させた。反応液の１０μＬを、蛍光検出器を接続したＨＰＬＣに注入し、蛍光強度を測定した。
【００１３】
（各誘導体の蛍光スペクトル測定）
１００μＭオキシトシンと、１０μＭ ＢＳＡの混合液１０μＬを、６０μＬの５０ｍＭ ＣＨＡＰＳ・５ｍＭ ＴＣＥＰ・１０ｍＭ ＥＤＴＡ混合液、２５μＬの８Ｍ塩酸グアニジン溶液（ｐＨ８．５）、５μＬの１４０ｍＭ化合物１、化合物２の各溶液を、それぞれ混合し、４０℃で、４０分間反応させ、蛍光誘導体化反応を行った。
【００１４】
化合物１、化合物２は、それぞれアセトニトリルに、オキシトシンは純水に、それ以外の物質は８Ｍ塩酸グアニジンを含むビシン緩衝溶液（ｐＨ８．５）に、それぞれ溶解させた。３μＬの１０％トリフルオロ酢酸を加えて反応を停止させた後、反応液の１０μＬを、蛍光検出器を接続したＨＰＬＣに注入し、オキシトシンとＢＳＡに相当する部分を分取した。各分画について、蛍光光度計で、励起・蛍光波長を測定した。
【００１５】
（各誘導体の保持時間の測定）
２．５μＭオキシトシン・５．０μＭソマトスタチン・２．５μＭカルシトニン・２．５μＭトリプシンインヒビター及び０．５μＭ ＢＳＡの混合液１０μＬを、［各誘導体の蛍光スペクトル測定］と同様の方法で、蛍光誘導体化反応を行った。反応液の２０μＬを、蛍光検出器を接続したＨＰＬＣに注入し、各誘導体の保持時間を測定した。
【００１６】
ＨＰＬＣ条件：
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｉｍｔａｋｔ ＷＰ−ＲＰ（２５０ｘ４．６ｍｍＩ．Ｄ．）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：（ａ）１０％ ＣＨ３ＣＮ ｗｉｔｈ ０．１％ ＴＦＡ、（ｂ）７０％ ＣＨ３ＣＮ ｗｉｔｈ ０．１％ ＴＦＡ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｔｉｍｅ：０→３６（ｍｉｎ），（ｂ）：０→６０％
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．７０ｍｌ／ｍｉｎ
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：６０℃
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：
３９５ｎｍ（Ｅｍ），５０５ｎｍ（Ｅｘ）ｆｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ １−４
４２２ｎｍ（Ｅｍ），５４２ｎｍ（Ｅｘ）ｆｏｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ５−８
【００１７】
３．二波長同時測定法の検討
５．０μＭオキシトシン及び０．５μＭ ＢＳＡの混合液１０μＬを、［各誘導体の蛍光スペクトル測定］と同様の方法で、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄｌ又はＤＡＡＢＤ−Ｆと、それぞれ蛍光標識化反応を行った。反応液を当量ずつ混合し、その２０μＬを、蛍光検出器２台を直列に接続したＨＰＬＣに注入し、二波長同時測定を行った。
【００１８】
ＨＰＬＣ条件：
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｉｍｔａｋｔ ＷＰ−ＲＰ（２５０ｘ４．６ｍｍＩ．Ｄ．）
Ｓｏｌｖｅｎｔ：（ａ）１０％ ＣＨ３ＣＮ ｗｉｔｈ ０．１％ ＴＦＡ、（ｂ）７０％ ＣＨ３ＣＮ ｗｉｔｈ ０．１％ ＴＦＡ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ：Ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｔｉｍｅ：０→３６（ｍｉｎ），（ｂ）：０→６０％
Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：０．７０ｍｌ／ｍｉｎ
Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：６０℃
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：
４５０ｎｍ（Ｅｍ），５７０ｎｍ（Ｅｘ）ｆｏｒ １ｓｔ ｄｅｔｅｃｔｏｒ
３７５ｎｍ（Ｅｍ），４８０ｎｍ（Ｅｘ）ｆｏｒ ２ｎｄ ｄｅｔｅｃｔｏｒ
【００１９】
本発明で、ベンゾキサジアゾール骨格を持つ蛍光試薬２種を新たに合成し、各試薬の反応性を検討したところ、いずれも、反応時間４０分で、最大の蛍光強度を与えた。また、各試薬誘導体の励起・蛍光波長は、骨格に依存し、側鎖部分の変化は、蛍光特性に大きな影響は与えなかった。
【００２０】
ペプチド及びタンパク質で、各試薬誘導体の保持時間を測定したところ、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６とＤＡＡＢＤ−Ｆの組合せで、それぞれの誘導体が異なる蛍光特性と、ほぼ同じ保持時間を示し、二波長同時測定法への適用が可能であることが示唆された。
【００２１】
ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄｌとＤＡＡＢＤ−Ｆの組合せで、ペプチドとタンパク質を用いて、二波長同時検出法の検討を行った。その結果、それぞれの試薬に対して、特異的なクロマトグラムが類似した形で得ることができた。この試薬の組合せは、ＤＡＡＢＳｅＤ−Ｆを用いた場合よりも、ピークの比較同定が容易であることから、二波長同時測定法を用いた変異タンパク質の発見など、プロテオーム解析への様々な応用が期待できる。
【００２２】
誘導体の蛍光特性を調べるために、誘導体の励起・蛍光スペクトルを測定し、新しく合成された試薬は、同時検出実験に利用可能であることが確認された。本発明では、誘導体は、ＨＰＬＣで分離され、スペクトルを直接測定した。ベンゾキサジアゾール試薬誘導体は、最大励起波長が、ペプチド（ｏｘｙｔｏｃｉｎ）で、３８６から３８９ｎｍ、及びタンパク質（ＢＳＡ）で、３８９から３９２ｎｍの範囲であり、また、最大発光波長は、５０３から５０５ｎｍ及び５０２から５０３ｎｍであった。
【発明の効果】
【００２３】
本発明により、次のような効果が奏される。
（１）プロテオーム解析において、異なる被験サンプル中のペプチド又はタンパク質を、ＨＰＬＣにより同時検出・定量することが可能な新規蛍光試薬を提供することができる。
（２）７−クロロ−４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−ｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）、又は４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＡＡＢＤ−Ｆ）、を有効成分とする新規蛍光試薬を提供することができる。
（３）ＨＰＬＣにおいて分取したペプチド又はタンパク質誘導体を、酵素消化し、ＨＰＬＣ−タンデム質量分析計に付し、同位体比より、ペプチド又はタンパク質の存在比を計算できる新規蛍光試薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＤＡＡＢＤ−Ｆ又はＤＡＡＢＤ−Ｃｌによる乳腺正常細胞株ＨＭＥＣ抽出タンパク質誘導体化クロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
次に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明する。
試薬
４−クロロ−７−クロロスルホニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾールは、市販品（東京化成工業）を購入し、それ以上精製しないで使用した。トリプシン阻害剤（ｓｏｙｂｅａｎ：ＭＷ２４０４９）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，３−プロパンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジエチルエチレンジアミン、及びＮ，Ｎ−ジエチル−１，３−プロパンジアミンは、市販品（和光純薬工業）を購入し、それ以上精製しないで使用した。
【００２６】
トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン ハイドロクロライド（ＴＣＥＰ）、８Ｍグアニジン ハイドロクロライド（ｂｉｃｉｎｅ、ｐＨ８．５）、及び子牛血清アルブミン（ＢＳＡ，ＭＷ６６３８５）は、市販品（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を購入した。
【００２７】
オキシトシン（ＭＷ１００７）、及びカルシトニン（ヒト；ＭＷ３４１８）は、市販品（ペプチド工業）を購入した。
【００２８】
ソマトスタチン（ＭＷ１６３８）は、市販品（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を購入した。３−［（３−コルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、及びエチレンジアミンテトラアセチック アシド ジソジウム塩（Ｎａ２ＥＤＴＡ）は、市販品（Ｄｏｊｉｎｄｏ研究所）を購入した。
【００２９】
ＨＰＬＣ実験のために、アセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）、及びトリフルオロアセチック アシド（アミノ酸配列グレード）は、市販品（和光純薬工業）を購入した。Ｑｕｉｋ Ｓｔａｒｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔは、市販品（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を購入した。その他の全ての試薬は、分析用又は保障付試薬を使用した。
【実施例１】
【００３０】
［Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン−ｄ６の合成］
ジメチルアンモニウム クロライド−ｄ６（２．４６ｇ）、及びプロモアセトニトリル（３．３７ｇ）を、ジエチルエーテル（２０ｍｌ）に溶解した。１０℃で、５０％ＮａＯＨ（４．５ｇ）を添加した後、混合物を、同温度で、２時間撹拌した。
【００３１】
エーテル相を分離し、水相を、エーテル（１０ｍｌ×３）で抽出した。これらを一緒にしたエーテル相を、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空で、エバポレーションして、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアセトニトリル−ｄ６水溶液（１０ｇ）を得て、ＬｉＡｌＨ４（１．２８ｇ）、スルホン酸（１．６９ｇ）の混合物に、テトラヒドロフラン（４０ｍｌ）中で、１０℃で、添加した。
【００３２】
反応混合物は、室温で、１３時間に亘って、撹拌した。これに、エーテル（３０ｍｌ）を添加した後、混合物を、ＮａＯＨ（４ｇを６ｍｌの水に溶解したもの）で処理した。エーテル相は、分離し、水層をエーテル（１０ｍｌ×２）で抽出した。これらを合わせたエーテル層を、ＭｇＳＯ４で乾燥し、真空中でエバポレーションして、残渣を５ｇまで減少させた。残渣を蒸留し、フラクション（７０−８０℃）を合わせて、１．７９ｇ（収率、５２．５％）のＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン−ｄ６（７７．４％ＴＨＦ溶液）を得た。
【００３３】
以下に、得られた化合物の確認データを示す。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１．８２−１．８８（１．５４Ｈ，ｍ ｆｏｒ ＴＨＦ，４Ｈ），２．３３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ），２．７７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ），３．７２−３．７６（１．４８，ｍ ｆｏｒ ＴＨＦ，４Ｈ）
【実施例２】
【００３４】
［７−クロロ−４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾールｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）の合成］
４−クロロ−７−クロロスルホニル−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（３．２８ｇ）を、ＣＨ３ＣＮ（６０ｍｌ）中に溶解した。この溶液に、Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン−ｄ６（１．０ｇ）、及びトリエチルアミン（１．９２ｍｌ）を、氷で冷却しながら、それぞれ加え、同温度に、１時間静置し、１．５時間、室温で、撹拌した。
【００３５】
次いで、反応混合物を、真空下で、エバポレーションし、反応残渣を、ＡｃＯＥｔに溶解した。エチル酢酸溶液を、飽和ＮａＨＣＯ３、蒸留水、飽和ＮａＣｌ溶液で、それぞれ洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。ろ過した溶液を、真空で、エバポレーションし、反応残渣を、シリカゲエルカラムで、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ（５０：１）で溶出して、精製した。溶出液を、エバポレーションにより乾燥し、残渣を、ＥｔＯＨ−ＡｃＯＥｔで再結晶して、１．３６ｇ（収率、４１．３％）を得た。化１に、合成した化合物の化学構造を示す。
【００３６】
【化１】
【００３７】
以下に、合成した化合物の確認データを示す。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ７．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），３．１３（２Ｈ，ｍ）、２．３３（２Ｈ，ｍ）．ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ/ｚ３１１（Ｍ＋Ｈ）＋，ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−１：１３４２及び１１６６．
【実施例３】
【００３８】
［４−（ジメチルアムルノエチルアルムノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾールの合成］
４−クロロスルホニル−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール１．０ｇを、アセトニトリル５０ｍｌに溶解した。Ｎ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン０．７５ｇ、及びトリエチルアミン３０４μｌを添加した後、混合物を、室温で、３０分撹拌した。
【００３９】
反応混合物を、減圧下で、エバポレーションにより、乾燥し、残渣を、ジクロロメタン／メタノール＝９／１を用いて、シリカゲル（Ｗａｋｏｇｅｌ Ｃ−２００，５０ｍｍ×８００ｍｍ）のクロマトグラフィーにかけて、黄色粉末のＤＡＡＢＤ−Ｆ０．１０ｇ（Ｒｆ＝０．４８，収率８．２％）を得た。化２に、合成した化合物の化学構造を示す。
【００４０】
【化２】
【００４１】
以下に、合成した化合物の確認データを示す。１Ｈ−ＮＭＲ δ８．１ｐｐｍ（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈｂ），６．１ｐｐｍ（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｈａ），３．４ｐｐｍ（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，Ｈｃ）、２．７ｐｐｍ（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，Ｈｄ）、２．３ｐｐｍ（６Ｈ，ｓ，−ＣＨ３）、：ＭＳ ｍ/ｚ ２８９（Ｍ＋Ｈ）＋，ｍｐ９６．４−９８．６℃．
【００４２】
以下に、ＤＡＡＢＤ−Ｆ誘導体のトリフルオロ酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）塩の元素分析の結果を示す。また、化３に、本化合物の化学構造を示す。
組成式：Ｃ１２Ｈ１４Ｎ４Ｏ５ＳＦ４
Ｅｘａｃｔ Ｍａｓｓ：４０２．０６
分子量：４０２．３２
分析値：Ｃ％ ３５．５３、Ｈ％ ３．５７、Ｎ％ １３．８３、Ｆ％ １８．９１
論理値：Ｃ％ ３５．８２、Ｈ％ ３．５１、Ｎ％ １３．９３、Ｆ％ １８．８９
【００４３】
【化３】
【実施例４】
【００４４】
［ＤＡＡＢＤ−Ｆによる乳腺正常細胞株中ペプチド又はタンパク質のＨＰＬＣ検出］
本実施例では、ＤＡＡＢＤ−Ｆを用いて、乳腺正常細胞株中のペプチド及びタンパク質を、ＤＡＡＢＤ誘導体として、ＨＰＬＣ分離・検出を行った。そのときのクロマトグラムを図１（下）に示す。
【００４５】
同様に、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌを使用して、乳腺正常細胞株中のペプチド及びタンパク質を、ＤＡＡＢＤ誘導体として、ＨＰＬＣ分離・検出を行った。そのときのクロマトグラムを図１（上）に示す。両者で、ほとんど差の無いクロマトグラムが得られていることが確認された。
【００４６】
実験条件：ＤＡＡＢＤ−Ｆによる乳腺正常細胞株ＨＭＥＣ抽出タンパク質誘導体化とＨＰＬＣ
１．溶離液の組成
Ａ液；アセトニトリル：イソプロパノール：水：トリフルオロ酢酸＝９：１：９０：０．２
Ｂ液；アセトニトリル：イソプロパノール：水：トリフルオロ酢酸＝６９：１：３０：０．１５
＊注；Ａ液をＣポンプに、Ｂ液をＢポンプにセットした
【００４７】
２．カラム
Ｉｍｔａｋｔ ＷＸＲ ２５０×４．６ｍｍ Ｐｒｏ＃；ＺＣ０６９ Ｓｅｒ＃；ＦＧ２８Ａ８Ｂ
温度；６０℃
【００４８】
３．流速
０．５５ｍＬ／ｍｉｎ
【００４９】
４．検出条件
蛍光検出；励起波長；３９５ｎｍ、蛍光波長；５０５ｎｍ
【００５０】
５．ＨＰＬＣグラジェント条件
Ａ液をＣポンプに、Ｂ液をＢポンプに、それぞれセットし、以下のグラジェント条件により分析を行った。最初の１５分間５％Ｂで一定； 以後３０分まで３０％Ｂに上昇； ６５分まで３０％Ｂで一定； 以後７０分まで３５％Ｂに上昇； 以後１３０分まで３８％Ｂに上昇； 以後２５０分まで４４％Ｂに上昇； ２９０分まで４４％Ｂで一定； 以後３３０分まで４７％Ｂに上昇； 以後４８０分まで６０％Ｂに上昇； 以後５２０分まで７０％Ｂに上昇； 以後５７０分まで９０％Ｂに上昇； 以後６００分まで９０％Ｂで一定で、送液した。
【００５１】
６．システム
ポンプ；Ｌ−２１３０（ＨＩＴＡＣＨＩ）、カラムオーブン；Ｌ−２３００（ＨＩＴＡＣＨＩ）、蛍光検出器；Ｌ−２４８０（ＨＩＴＡＣＨＩ）の組み合わせのシステムを使用し、試料注入用のループは、２０μＬのものを使用した。
【００５２】
７．誘導体化反応
ＣＨＡＰＳ水溶液で抽出された２．７ｍｇ／ｍＬ ＨＭＥＣタンパク質溶液７．５μＬを、６Ｍグアニジン緩衝液（ｐＨ８．７）に溶解した１６．７ｍＭ ＣＨＡＰＳ／３．３３ｍＭ ＥＤＴＡ／０．８３ｍＭ ＴＣＥＰ混合溶液３０μＬ、６Ｍグアニジン緩衝液（ｐＨ８．７）１０μＬ、アセトニトリルに溶解した１２．５ｍＭ ＤＡＡＢＤ−Ｆ溶液２．５μＬと混和した。混和後、４０℃で、５分間反応させ、１０％トリフルオロ酢酸水溶液 １．５μＬを添加して、反応を停止させた。この反応液のうち、２０μＬを、ＨＰＬＣに注入し、分析を行なった。
【００５３】
蛍光標識試薬として、ＤＡＡＢＤ−Ｃｌを用いる場合、反応液に添加するＤＡＡＢＤ−Ｃｌ濃度は、１４０ｍＭとし、反応は、４０℃で、１０分間、後の条件は、ＤＡＡＢＤ−Ｆの場合と同じとした。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
以上詳述したように、本発明は、蛍光試薬に係るものであり、本発明により、プロテオーム解析において、少なくとも２つの異なる被験サンプル中のペプチド又はタンパク質をＨＰＬＣにより同時検出・定量して、ペプチド又はタンパク質のプロファイルを高精度に解析することを可能とする新規蛍光試薬を提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの被験サンプル中のペプチド又はタンパク質を、ＨＰＬＣにより同時検出・定量するための蛍光試薬であって、
７−クロロ−４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−ｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）、又は４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＡＡＢＤ−Ｆ）、を有効成分とすることを特徴とする蛍光試薬。
【請求項１】
少なくとも２つの被験サンプル中のペプチド又はタンパク質を、ＨＰＬＣにより同時検出・定量するための蛍光試薬であって、
７−クロロ−４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−ｄ６（ＤＡＡＢＤ−Ｃｌ−ｄ６）、又は４−（ジメチルアミノエチルアミノスルホニル）−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール（ＤＡＡＢＤ−Ｆ）、を有効成分とすることを特徴とする蛍光試薬。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−７１９８６（Ｐ２０１０−７１９８６Ａ）
【公開日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９１３６８（Ｐ２００９−１９１３６８）
【出願日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【出願人】（５９２１９１７９３）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【出願人】（５９２１９１７９３）
【Ｆターム（参考）】
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