融合蛋白質
【課題】 自己抗体を特異的に抑制することができ、自己抗体性自己免疫疾患を効果的に予防または治療することができる融合蛋白質を提供する。
【解決手段】 自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体によって認識される部位を含む蛋白質（Ｘ）と抗体重鎖定常領域のフラグメントを含む蛋白質（Ａ）とからなることを特徴とする融合蛋白質。この融合蛋白質は、蛋白質（Ｘ）をコードするＤＮＡおよび蛋白質（Ａ）をコードするＤＮＡを相互に結合し、得られたＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して融合蛋白質を発現させることによって製造される。
【解決手段】 自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体によって認識される部位を含む蛋白質（Ｘ）と抗体重鎖定常領域のフラグメントを含む蛋白質（Ａ）とからなることを特徴とする融合蛋白質。この融合蛋白質は、蛋白質（Ｘ）をコードするＤＮＡおよび蛋白質（Ａ）をコードするＤＮＡを相互に結合し、得られたＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して融合蛋白質を発現させることによって製造される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己抗体を中和しかつ自己抗体の産生を阻害することによって、重症筋無力症などの自己抗体性自己免疫疾患を効果的に予防・治療することができる融合蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、本来、細菌やウイルスなどの自己と異なる異物を認識し排除するための役割を持つが、自分自身の正常な細胞や組織に対してまで過剰に反応し攻撃を加えてしまうことがある。自己免疫疾患は、このような状態によって生ずる疾患の総称であり、この中でも自己抗体（自分自身の細胞や組織を抗原として認識する抗体）が自己抗原（自分自身の細胞や組織）と反応することで生ずる疾患を自己抗体性自己免疫疾患と称している。自己抗体性自己免疫疾患としては、例えば、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性好中球減少症、抗ＴＳＨ抗体が原因の甲状腺機能亢進症、自己抗体性急性脳炎、橋本脳症、非ヘルペス性辺縁系脳炎等が挙げられる。
【０００３】
自己抗体性自己免疫疾患の治療方法としては、ステロイド剤や免疫抑制剤の投与が従来より行われているが、これらの薬剤はいずれも、自己抗体を特異的に抑制するものではなく、免疫反応を一般的に抑制するものであるため、特異性がなく、十分効果的な治療方法とは言えない。
【０００４】
自己免疫疾患の代表例の一つである重症筋無力症についても、それを根幹から治療するための既存の治療薬はなく、上述のステロイド剤や免疫抑制剤の他、コリンエステラーゼ阻害薬が主として使用されているに過ぎない（非特許文献１）。特に、コリンエステラーゼ阻害薬の使用については、その用量設定が難しいという問題がある。また、血漿交換療法も用いられているが、１回の治療に１００万円以上の多額の費用が発生する。一方、包括医療制度により重症筋無力症の治療費として補助される金額は６０万円程であり、医療現場での負担も大きい。しかも、血漿交換療法は、効果が１ヶ月程度しか持続しないという問題がある。また、胸腺摘出術も用いられ、一定の効果を上げているものの、摘出術に対する患者の不安感や、費用面の問題があり、さらには、免疫機構が未発達な小児や免疫不全患者などには適用できないという問題がある。
【０００５】
近年、重症筋無力症の治療方法として、ガンマグロブリン製剤の有効性が確認され、一部の製薬メーカーにおいては臨床試験も行っている（非特許文献２）。しかし、ガンマグロブリン製剤は、ヒト血漿由来の生物学的製剤であるため、未知のウイルスなどによる感染リスク等が考えられる。また、ガンマグロブリン製剤の投与量は大量であり、たとえ実現されたとしても、患者や医療現場における費用的・時間的負担は相当大きいものと予想される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】日本臨床 ６６巻６号 第１１５５頁〜第１１５７頁 重症筋無力症 治験研究動向
【非特許文献２】神経治療 Ｖｏｌ．２５ Ｎｏ．６ 第６８９頁〜第６９２頁 免疫グロブリン大量療法
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、自己抗体を特異的に抑制することができ、自己抗体性自己免疫疾患を効果的に予防または治療することができる融合蛋白質およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、自己抗体性自己免疫疾患の治療方法として、まず、自己抗体のみに反応する抗体を組換え蛋白質において作製し、この抗体を患者に投与し、患者の体内の自己抗体をこの抗体と結合させて分解することを想起した。しかしながら、自己抗体性自己免疫疾患の自己抗体は特定の一つの抗体ではなく、種々の抗体群から成り立っているため、これらの種々の抗体群の全てに対して反応するイディオタイプ抗体の作製は、極めて困難であり、この方法は実現可能性が低いと考えられた。
【０００９】
そこで、本発明者は、自己抗体性自己免疫疾患の治療方法として、自己抗体に反応する抗体を使用するのではなく、自己抗体によって認識される自己抗原を組換え蛋白質において作製し、この人工自己抗原を囮（デコイ）として患者に投与して、患者の体内の自己抗体をこの人工自己抗原と結合させることによって、自己抗体を中和し、自己抗体が患者自身の自己抗原とは反応しないようにすることができることを見出した。そして更に、この人工自己抗原を抗体重鎖定常領域と融合させておくことによって自己抗体の産生も特異的に阻害することができることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１０】
即ち、本発明によれば、自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体によって認識される部位を含む蛋白質（Ｘ）と抗体重鎖定常領域のフラグメントを含む蛋白質（Ａ）とからなることを特徴とする融合蛋白質が提供される。
【００１１】
また、本発明によれば、蛋白質（Ｘ）をコードするＤＮＡおよび蛋白質（Ａ）をコードするＤＮＡを相互に結合し、得られたＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して融合蛋白質を発現させることを特徴とする上記融合蛋白質の製造方法、および上記融合蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする自己抗体性自己免疫疾患の予防・治療用組成物が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の融合蛋白質は、自己抗体性自己免疫疾患の患者の体内に存在する自己抗体を中和し、かつ自己抗体の産生を阻害することによって、自己抗体を特異的に抑制することができる。従って、本発明の融合蛋白質を使用すれば、重症筋無力症を始めとする種々の自己抗体性自己免疫疾患を効果的に予防・治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例で作成した融合蛋白質（α１−Ｆｃ）を発現させるためのベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＡＣｈＲ−Ｆｃの模式図である。
【図２】図２は、精製した融合蛋白質（α１−Ｆｃ）の非還元状態および還元状態におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の銀染色像（左側）、およびウェスタンブロッティング像（右側）を示す。
【図３】図３は、ハイブリドーマＭａｂ３５への融合蛋白質α１−Ｆｃの結合を示す。融合蛋白質α１−Ｆｃ添加濃度（μｇ／ｍＬ）は、Ａが無添加、Ｂが０．１、Ｃが０．３６、Ｄが１、Ｅが３．６、Ｆが１０、Ｇが３６およびＨが１００である。
【図４】図４は、ハイブリドーマＭａｂ３５に対する融合蛋白質α１−ＦｃのＡＤＣＣ活性を示す。横軸にターゲット細胞であるハイブリドーマＭａｂ３５に対するエフェクター細胞であるＮＫ９２の割合を、縦軸に細胞障害活性（％）をそれぞれ示す。◆は抗体無添加時の細胞傷害活性を示し、■は融合蛋白質α１−Ｆｃの添加時の細胞傷害活性を示し、▲はアバスチンの添加時の細胞傷害活性を示し、×はエンブレルの添加時の細胞障害活性を示す。●は総細胞数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の融合蛋白質は、自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体によって認識される部位を含む蛋白質（Ｘ）と抗体重鎖定常領域のフラグメントを含む蛋白質（Ａ）とが融合されたものである。蛋白質（Ｘ）は、自己抗体に対する自己抗原、またはその一部に相当し、患者の自己抗原の代わりに自己抗体と結合する囮（デコイ）としての役割を有する。即ち、本発明の融合蛋白質が自己抗体性自己免疫疾患の患者に投与されると、患者の体内の自己抗体は、融合蛋白質のうち蛋白質（Ｘ）の部分を自己抗原として認識してこの部分に結合する。結合した自己抗体は、患者の体内に本来存在する自己抗原ともはや結合することができないので、この方法によって自己抗体を中和することができ、自己抗体と患者の自己抗原との結合による自己免疫疾患の症状の発生を抑制することができる。自己抗体は、特定の一つの抗体ではなく種々の抗体群から成り立っているが、いずれの抗体も自己抗原を認識する機能を有する点では共通する。従って、自己抗原の囮となる本発明の融合蛋白質を使用すれば、種々の抗体群に対して個別の融合蛋白質を作成しなくても、一つの融合蛋白質で種々の抗体群を中和することができる。
【００１５】
本発明の融合蛋白質は、自己抗原の囮となる蛋白質（Ｘ）に加えて、抗体重鎖定常領域のフラグメントを含む蛋白質（Ａ）も含む。この蛋白質（Ａ）は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を発揮する役割を有する。自己抗体は、血中のＢ細胞で産生されるが、このＢ細胞の表面には、自己抗体と同じ抗原結合部位を持つ細胞表面提示型の抗体がＢ細胞受容体として存在している。従って、本発明の融合蛋白質が患者に投与されると、そのうちのいくつかは患者の体内の自己抗体と上述のように結合するが、いくつかは、自己抗体を産生するＢ細胞の表面の抗体（Ｂ細胞受容体）に結合する。Ｂ細胞受容体に本発明の融合蛋白質が結合すると、ＮＫ細胞などのエフェクター細胞がそのＦｃ受容体を介して融合蛋白質中の蛋白質（Ａ）の部分に結合し、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を発揮し、融合蛋白質に結合したＢ細胞を攻撃して死滅させる。このように、本発明によれば、体内に存在する自己抗体を中和して自己抗体の自己抗原への結合を防止するのみならず、自己抗体の産生源である特定Ｂ細胞をも選択的に死滅させることができる。従って、本発明の融合蛋白質は、自己抗体の産生阻害、および産生された自己抗体の中和という二つの方法で、自己抗体性自己免疫疾患を予防または治療することができる。
なお、本発明の融合蛋白質と同様に囮（デコイ）を使用する考え方として、ガーショニ、ジョナサン・エムによる特表平２−５０２５３８号には分子状デコイアントが開示されている。この分子状デコイアントは、好ましくない作用を示す異物に対する天然の受容体の最小部分断片に相当し、外来性抗原とデコイアントの競合作用により、外来性抗原の生体受容体への結合を抑制しようとするものである。特表平２−５０２５３８号では、上記異物は、ウイルス、バクテリア、毒素などの外来性抗原であるとされており、自己抗体については何ら記載されていない。また、特表平２−５０２５３８号の分子状デコイアントは、単独で使用されており、抗体重鎖定常領域と結合されていない。
また、Ｂ細胞を死滅させる考え方として、アナンド・アイヤーらによる特表２００８−５１５９２６号には、Ｂ細胞表面抗原に対する抗体に細胞毒性物質を付加した複合体を自己免疫疾患の患者に投与することによってＢ細胞を死滅させることが開示されている。この複合体は、Ｂ細胞を死滅させることはできるが、産生された自己抗体を中和することはできず、自己抗体に対しては別途、抗サイトカイン剤を投与する必要があるとされている。
【００１６】
本発明の融合蛋白質中の蛋白質（Ｘ）は、予防または治療対象の自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体に対する自己抗原またはその一部に相当し、予防または治療対象の自己免疫疾患に応じて決まる。例えば、重症筋無力症の予防・治療の場合、重症筋無力症は、神経伝達物質であるアセチルコリンの筋肉側における受け皿であるニコチン性アセチルコリン受容体（自己抗原）に抗ニコチン性アセチルコリン受容体抗体（自己抗体）が結合してアセチルコリンによる神経・筋伝達を阻害することによって生じる疾患であるので、蛋白質（Ｘ）は、自己抗原のニコチン性アセチルコリン受容体であることができる。同様に、自己免疫性溶血性貧血の予防・治療の場合、蛋白質（Ｘ）は、赤血球表面マーカーであることができ、特発性血小板減少性紫斑病の予防・治療の場合、蛋白質（Ｘ）は、血小板表面マーカーであることができ、自己免疫性好中球減少症の予防・治療の場合、蛋白質（Ｘ）は、好中球表面マーカーであることができ、抗ＴＳＨ抗体が原因の甲状腺機能亢進症の予防・治療の場合、蛋白質（Ｘ）は、ＴＳＨであることができ、原発性甲状腺機能低下症（橋本病）の予防・治療の場合、蛋白質（Ｘ）は、甲状腺表面マーカーであることができ、自己抗体性脳炎・脳症の予防・治療の場合、蛋白質（Ｘ）は、ＮＭＤＡ受容体、ＡＭＰＡ受容体などであることができる。
【００１７】
蛋白質（Ｘ）は、これらの受容体やマーカー全体である必要はなく、自己抗体の認識部位を含んでさえいればその一部であってもよい。例えば、重症筋無力症の場合、上述のニコチン性アセチルコリン受容体は、いくつかのサブユニットからなる多量体蛋白質であり、自己抗体の認識部位は、その中でもα１サブユニットのアイソフォーム１（骨格筋でのみ発現されるアイソフォームであり、配列番号４で示される）、アイソフォーム２（骨格筋、脳、心臓、腎臓、肺臓で発現されるアイソフォームであり、配列番号５で示される）のＮ末端細胞外領域に存在する。従って、重症筋無力症の場合、蛋白質（Ｘ）は、ニコチン性アセチルコリン受容体α１（ｎＡＣｈＲα１）サブユニットまたはその一部であることができ、より具体的にはｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１および／またはアイソフォーム２、またはそれらの一部であることができ、さらに具体的にはｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１および／またはアイソフォーム２のＮ末端細胞外領域のアミノ酸配列からなることができる。
【００１８】
これらのアミノ酸配列には、その相同性が損なわれない範囲で、１個または数個（例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜７個）のアミノ酸が欠失、付加、および／または置換されていてもよい。その範囲としては、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の配列の同一性を有するものが挙げられる。アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用いて、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）で計算することができる。具体的には、このような欠失、付加、および／または置換が導入されたアミノ酸配列は、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキット（タカラバイオ製）や、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）等の市販キットを用いて対応するＤＮＡ配列を置換することにより容易に得ることができる。
【００１９】
本発明の融合蛋白質中の蛋白質（Ａ）は、抗体重鎖定常領域のフラグメントを含む蛋白質であり、例えば抗体重鎖のヒンジ領域以下（Ｆｃ領域）、抗体重鎖ＣＨ１領域またはそれらの一部であることができる。抗体重鎖のヒンジ領域以下（Ｆｃ領域）としては、具体的には、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を挙げることができる。配列番号１，２はいずれもヒトのＦｃ領域の配列であり、配列番号１は、アジア人に多いタイプ、配列番号２は、欧米人に多いタイプである。
【００２０】
本発明の融合蛋白質の具体例としては、例えば配列番号３のアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。この融合蛋白質は、蛋白質（Ｘ）がｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１のＮ末端細胞外領域のアミノ酸配列（配列番号４の第１位〜第２１０位のアミノ酸からなるアミノ酸配列）であり、蛋白質（Ａ）が配列番号１のアミノ酸配列である場合に相当する。このアミノ酸配列も、上述の通り、その相同性が損なわれない範囲で、１個または数個（例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜７個）のアミノ酸が欠失、付加、または／および置換されていてもよい。
【００２１】
本発明の融合蛋白質は、従来公知の遺伝子工学的手法によって製造することができ、例えば、蛋白質（Ｘ）をコードするＤＮＡおよび蛋白質（Ａ）をコードするＤＮＡを必要によりそれぞれ増幅しておき、これらのＤＮＡを相互に結合し、得られたＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して融合蛋白質を発現させることによって製造することができる。ＤＮＡの増幅は、例えばＰＣＲ法によって行うことができ、増幅したＤＮＡの結合は、例えばＯｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ法によって行うことができる。発現ベクターは、発現効率を向上させるためのＣＭＶやＳＶ４０等のプロモーターや、発現された融合蛋白質の回収を容易にするための抗体重鎖シグナル配列、膜蛋白質シグナル配列、抗体κ鎖シグナル配列などの分泌シグナル配列を備えていることが好ましい。宿主細胞としては、例えば酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などを使用することができ、その中でも動物細胞、特にＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが好ましい。発現させた融合蛋白質は、常法により回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム等を用いて精製すればよい。
【００２２】
次に、本発明の融合蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする自己抗体性自己免疫疾患の予防・治療用組成物について説明する。かかる組成物の具体的な製剤形態としては、注射剤、坐剤等を挙げることができる。注射剤の場合は、上述のようにして得られた本発明の融合蛋白質に糖類、ポリオール、アルブミン、界面活性剤等の安定化剤、塩類等の等張化剤等を添加し、凍結乾燥して保存しておき、使用時に注射用水に溶解して投与すればよい。凍結乾燥品中の本発明の融合蛋白質の含有量は特に限定されないが、例えば０．０１〜２００ｍｇ／ｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｇである。また、溶解された注射剤中の本発明の融合蛋白質の含有量は特に限定されないが、例えば０．０１〜２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍＬである。注射剤の場合の投与方法としては、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等が挙げられる。坐剤の場合は、例えば、本発明の融合蛋白質を通常の坐剤用基剤に混合して製剤化し、直腸より投与すればよい。坐剤中の本発明の融合蛋白質の含有量は特に限定されないが、例えば０．１〜３００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５〜１００ｍｇ／ｍＬである。本発明の組成物の投与量は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人一日当たり１０μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである。
【００２３】
本発明の組成物が自己抗体性自己免疫疾患の患者に投与されると、組成物中の本発明の融合蛋白質が体液流に乗って体内に分配される。そして、融合蛋白質が自己抗体と出会うと、自己抗体は融合蛋白質の蛋白質（Ｘ）の部分（自己抗体によって認識される部位）に結合するので、この自己抗体はもはや患者自身の自己抗原とは反応できなくなる。また、本発明の融合蛋白質が、自己抗体を産生するＢ細胞に出会うと、融合蛋白質はこのＢ細胞の表面の抗体（Ｂ細胞受容体）に結合される。この結合が生じると、融合蛋白質の蛋白質（Ａ）の部分（抗体重鎖定常領域のフラグメント）にＮＫ細胞などのエフェクター細胞が結合し、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を発揮し、融合蛋白質に結合されたＢ細胞を攻撃して死滅させる。このように、本発明によれば、自己抗体を中和して自己抗体の自己抗原への結合を防止するのみならず、自己抗体の産生源である特定Ｂ細胞をも選択的に死滅させることができる。従って、本発明の融合蛋白質、およびかかる融合蛋白質を含む組成物は、例えば重症筋無力症等の自己抗体性自己免疫疾患の予防・治療薬として効果を発揮すると期待できる。
【実施例】
【００２４】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２５】
（１）融合蛋白質の製造
ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）のｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号８および配列番号９のＤＮＡ配列をプライマーとし、東洋紡績（株）の遺伝子増幅キット「ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２」（カタログ番号：ＫＯＤ−２１１）を用いて、ヒト抗体重鎖シグナル配列（分泌シグナル配列）の遺伝子を増幅した。
【００２６】
増幅した遺伝子について、インビトロジェン社のクローニングキット「Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」（カタログ番号：Ｋ２８９５−２０）を用いてクローニングを行い、遺伝子配列の解析を行った。その後、インビトロジェン社の発現ベクター「ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター」（カタログ番号：Ｖ７９０−２０）をＮＥＢ社の制限酵素ＮｈｅＩ（カタログ番号：Ｒ０１３１）、ＥｃｏＲＩ（カタログ番号：Ｒ０１０１）で処理し、増幅した抗体重鎖シグナル配列（分泌シグナル配列）を発現ベクターに挿入した。
【００２７】
次に、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から取り寄せたヒトｎＡＣｈＲα１サブユニットのｃＤＮＡ（カタログ番号：ＭＨＳ１０１１−６１５９８）を鋳型とし、配列番号１０および配列番号１１のＤＮＡ配列をプライマーとし、東洋紡績（株）の「ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２」を用いて、ヒトｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１のＮ末端細胞外領域の遺伝子を増幅した。増幅された遺伝子は、配列番号４のアミノ酸配列の第１位〜第２１０位に相当する。このアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００２８】
一方、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）のｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２および配列番号１３のＤＮＡ配列をプライマーとし、ＰＣＲによって、ヒト抗体重鎖Ｆｃ領域の遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子について、インビトロジェン社の「Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ Ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」を用いてクローニングを行い、遺伝子配列の解析を行った。その結果、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列をコードする二種類のヒト抗体重鎖Ｆｃ領域の遺伝子が得られたことが判明した。
【００２９】
このようにして得られたヒトｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１のＮ末端細胞外領域の遺伝子およびヒト抗体重鎖Ｆｃ領域の遺伝子を混ぜ合わせ、配列番号１０および配列番号１３のＤＮＡ配列をプライマーとし、Ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ法によって遺伝子を増幅し、ヒトｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１のＮ末端細胞外領域とヒト抗体重鎖Ｆｃ領域とを一本鎖でコードする遺伝子配列を作製した。作製された遺伝子配列に相当するアミノ酸配列を配列番号３および７に示す。配列番号３は、ヒト抗体重鎖Ｆｃ領域が配列番号１のアミノ酸であるものに相当し、配列番号７は、ヒト抗体重鎖Ｆｃ領域が配列番号２のアミノ酸であるものに相当する。
【００３０】
作製した遺伝子配列についてインビトロジェン社の「Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」を用いてクローニングを行い、遺伝子配列の解析を行った。その後、予め分泌シグナル配列を挿入しておいたｐｃＤＮＡ３．１ベクターをＮＥＢ社の制限酵素ＰｐｕＭＩ（カタログ番号：Ｒ０５０６）、ＰｍｅＩ（カタログ番号：Ｒ０５６０）で処理して、作製した遺伝子配列を挿入し、ヒトｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１のＮ末端細胞外領域とヒト抗体重鎖Ｆｃ領域とからなる融合蛋白質（α１−Ｆｃ）を発現させるためのベクターを得た。得られたベクターの模式図を図１に示す。
【００３１】
次に、インビトロジェン社の発現系「Ｆｒｅｅ Ｓｔｙｌｅ ＭＡＸ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」（カタログ番号：Ｋ９０００−１０）を用いて、得られたベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入して融合蛋白質α１−Ｆｃを発現させ、ＧＥヘルスケア社の精製カラム「ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎ」（カタログ番号：１７−０４０２−０１）を用いて精製し、融合蛋白質α１−Ｆｃを得た。
【００３２】
融合蛋白質の発現確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、銀染色並びにウェスタンブロッティングにより行った。ウェスタンブロッティングにはＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた。その結果を図２に示す。図２中の矢印で示されるバンドが、融合蛋白質α１−Ｆｃに相当する。
【００３３】
（２）融合蛋白質の自己抗体に対する反応性の確認
ラットｎＡＣｈＲに対する自己抗体である抗ｎＡＣｈＲ自己抗体ｍＡｂ３５を産生するハイブリドーマＭａｂ３５（ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ−１７５）を培養し、その培養上清からＧＥヘルスケア社の精製カラム「ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ ｃｏｌｕｍｎ」（カタログ番号：１７−０４０４−０１）を用いて抗ｎＡＣｈＲ自己抗体ｍＡｂ３５を精製した。この抗体は、ラットのみならず、マウスおよびヒトに対しても交差反応性を示す抗体であることがＴｚａｒｔｏｓらによって報告されている（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ，１９８７；１５，１８５−９４））。
【００３４】
次に、精製した抗ｎＡＣｈＲ自己抗体を様々な濃度でＥＬＩＳＡプレートに固相化し、ブロッキングを行った。その後、（１）で作製した融合蛋白質α１−Ｆｃを反応させ、フナコシ社のＥＬＩＳＡ定量キット「ＩｇＧ（Ｆｃ），Ｈｕｍａｎ，ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（カタログ番号：Ｅ８０−１０４）に付属のＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ抗体で処理し、フナコシ社の基質溶液「ＴＭＢ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（カタログ番号：Ｎ３０１）を基質として反応させて、１％硫酸で反応を停止させた。その後、波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００３５】
その結果を以下の表１に示す。表１から明らかなように、自己抗体の濃度が増大するにつれて吸光度が増大しており、自己抗体の濃度に依存して融合蛋白質が自己抗体と反応していることが確認された。
【００３６】
【００３７】
（３）ハイブリドーマＭａｂ３５への融合蛋白質α１−Ｆｃの結合の確認
自己抗体は生体内ではＢ細胞で産生され、自己抗体を産生するＢ細胞の細胞表面には、自己抗体と同じ抗体が細胞膜上にＢ細胞受容体として提示されている。（２）で使用したハイブリドーマＭａｂ３５は抗ｎＡＣｈＲ自己抗体を産生するため、ハイブリドーマＭａｂ３５においてもＢ細胞と同様に細胞表面上に自己抗体を提示していると考えられる。そこで、融合蛋白質α１−ＦｃがハイブリドーマＭａｂ３５へ結合するかどうかを確認した。
【００３８】
ＨＢＳＳ／ＢＳＡで洗浄した１×１０５個のハイブリドーマＭａｂ３５に、（１）で作製した融合蛋白質α１−Ｆｃを様々な濃度で添加した。次にＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社のＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（カタログ番号：１０９−１１６−１７０）を添加し、ＨＢＳＳ／ＢＳＡで洗浄し、融合蛋白質とハイブリドーマとの結合をフローサイトメーターで測定した。
【００３９】
その結果を図３に示す。図３から、融合蛋白質α１−Ｆｃが濃度依存的にハイブリドーマＭａｂ３５と結合していることが明らかである。この結果は、重症筋無力症患者の体内で、融合蛋白質α１−Ｆｃが抗ｎＡＣｈＲ自己抗体産生Ｂ細胞と結合する可能性を示している。
【００４０】
（４）ハイブリドーマＭａｂ３５に対する融合蛋白質α１−ＦｃのＡＤＣＣ活性の確認
１×１０６個のハイブリドーマＭａｂ３５をＨＢＳＳ／ＢＳＡで洗浄した後、同仁社の蛍光色素「Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ」（カタログ番号：Ｃ３２６）を１０μＭとなるように添加したＨＢＳＳ／ＢＳＡで３７℃で３０分間インキュベーションを行い、ハイブリドーマ細胞内にＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを取り込ませた。次に、これらのハイブリドーマ細胞を９６穴プレートに１００００個／ウェルとなるように分注し、（１）で作製した融合蛋白質α１−Ｆｃまたはコントロール抗体（アバスチンまたはエンブレル）と、エフェクター細胞のＮＫ９２細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２４０７）を様々な濃度で添加し、３７℃で４時間インキュベーションを行った。インキュベーション後、×３００ｇで５分間遠心分離して細胞を沈殿させ、上清の蛍光を測定した（Ｅｘ＝４８５ｎｍ、Ｅｍ＝５４０ｎｍ）。
【００４１】
その結果を図４に示す。図４から明らかなように、ＮＫ９２細胞のみを添加した群（抗体等無添加）においても極く弱い濃度依存的な細胞障害活性（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｉｎｇ）が認められたものの、融合蛋白質α１−Ｆｃ投与群においては、最大で５０％の強い細胞障害活性がＮＫ９２細胞数依存的に認められた。一方、コントロール抗体群においては強い細胞障害活性は認められなかった。
【００４２】
以上の結果から、融合蛋白質α１−ＦｃはハイブリドーマＭａｂ３５と結合し、融合蛋白質α１−Ｆｃ中の蛋白質（Ａ）の部分（Ｆｃγ受容体）を介してエフェクター細胞のＮＫ９２による細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）を発揮することが明らかである。この結果は、重症筋無力症患者の体内で、融合蛋白質α１−Ｆｃが抗ｎＡＣｈＲ自己抗体産生Ｂ細胞と結合し、ＡＤＣＣ活性によって、自己抗体産生Ｂ細胞を攻撃して死滅させる可能性を示している。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の融合蛋白質は、自己抗体の産生阻害、および産生された自己抗体の中和という二つの方法で、自己抗体性自己免疫疾患を予防または治療することができる。従って、本発明の融合蛋白質は、重症筋無力症を始めとする種々の自己抗体性自己免疫疾患を効果的に予防または治療するために広く利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００４４】
配列番号８〜１３は、プライマーの配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己抗体を中和しかつ自己抗体の産生を阻害することによって、重症筋無力症などの自己抗体性自己免疫疾患を効果的に予防・治療することができる融合蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系は、本来、細菌やウイルスなどの自己と異なる異物を認識し排除するための役割を持つが、自分自身の正常な細胞や組織に対してまで過剰に反応し攻撃を加えてしまうことがある。自己免疫疾患は、このような状態によって生ずる疾患の総称であり、この中でも自己抗体（自分自身の細胞や組織を抗原として認識する抗体）が自己抗原（自分自身の細胞や組織）と反応することで生ずる疾患を自己抗体性自己免疫疾患と称している。自己抗体性自己免疫疾患としては、例えば、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性好中球減少症、抗ＴＳＨ抗体が原因の甲状腺機能亢進症、自己抗体性急性脳炎、橋本脳症、非ヘルペス性辺縁系脳炎等が挙げられる。
【０００３】
自己抗体性自己免疫疾患の治療方法としては、ステロイド剤や免疫抑制剤の投与が従来より行われているが、これらの薬剤はいずれも、自己抗体を特異的に抑制するものではなく、免疫反応を一般的に抑制するものであるため、特異性がなく、十分効果的な治療方法とは言えない。
【０００４】
自己免疫疾患の代表例の一つである重症筋無力症についても、それを根幹から治療するための既存の治療薬はなく、上述のステロイド剤や免疫抑制剤の他、コリンエステラーゼ阻害薬が主として使用されているに過ぎない（非特許文献１）。特に、コリンエステラーゼ阻害薬の使用については、その用量設定が難しいという問題がある。また、血漿交換療法も用いられているが、１回の治療に１００万円以上の多額の費用が発生する。一方、包括医療制度により重症筋無力症の治療費として補助される金額は６０万円程であり、医療現場での負担も大きい。しかも、血漿交換療法は、効果が１ヶ月程度しか持続しないという問題がある。また、胸腺摘出術も用いられ、一定の効果を上げているものの、摘出術に対する患者の不安感や、費用面の問題があり、さらには、免疫機構が未発達な小児や免疫不全患者などには適用できないという問題がある。
【０００５】
近年、重症筋無力症の治療方法として、ガンマグロブリン製剤の有効性が確認され、一部の製薬メーカーにおいては臨床試験も行っている（非特許文献２）。しかし、ガンマグロブリン製剤は、ヒト血漿由来の生物学的製剤であるため、未知のウイルスなどによる感染リスク等が考えられる。また、ガンマグロブリン製剤の投与量は大量であり、たとえ実現されたとしても、患者や医療現場における費用的・時間的負担は相当大きいものと予想される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】日本臨床 ６６巻６号 第１１５５頁〜第１１５７頁 重症筋無力症 治験研究動向
【非特許文献２】神経治療 Ｖｏｌ．２５ Ｎｏ．６ 第６８９頁〜第６９２頁 免疫グロブリン大量療法
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、自己抗体を特異的に抑制することができ、自己抗体性自己免疫疾患を効果的に予防または治療することができる融合蛋白質およびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、自己抗体性自己免疫疾患の治療方法として、まず、自己抗体のみに反応する抗体を組換え蛋白質において作製し、この抗体を患者に投与し、患者の体内の自己抗体をこの抗体と結合させて分解することを想起した。しかしながら、自己抗体性自己免疫疾患の自己抗体は特定の一つの抗体ではなく、種々の抗体群から成り立っているため、これらの種々の抗体群の全てに対して反応するイディオタイプ抗体の作製は、極めて困難であり、この方法は実現可能性が低いと考えられた。
【０００９】
そこで、本発明者は、自己抗体性自己免疫疾患の治療方法として、自己抗体に反応する抗体を使用するのではなく、自己抗体によって認識される自己抗原を組換え蛋白質において作製し、この人工自己抗原を囮（デコイ）として患者に投与して、患者の体内の自己抗体をこの人工自己抗原と結合させることによって、自己抗体を中和し、自己抗体が患者自身の自己抗原とは反応しないようにすることができることを見出した。そして更に、この人工自己抗原を抗体重鎖定常領域と融合させておくことによって自己抗体の産生も特異的に阻害することができることを見出し、本発明の完成に至った。
【００１０】
即ち、本発明によれば、自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体によって認識される部位を含む蛋白質（Ｘ）と抗体重鎖定常領域のフラグメントを含む蛋白質（Ａ）とからなることを特徴とする融合蛋白質が提供される。
【００１１】
また、本発明によれば、蛋白質（Ｘ）をコードするＤＮＡおよび蛋白質（Ａ）をコードするＤＮＡを相互に結合し、得られたＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して融合蛋白質を発現させることを特徴とする上記融合蛋白質の製造方法、および上記融合蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする自己抗体性自己免疫疾患の予防・治療用組成物が提供される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の融合蛋白質は、自己抗体性自己免疫疾患の患者の体内に存在する自己抗体を中和し、かつ自己抗体の産生を阻害することによって、自己抗体を特異的に抑制することができる。従って、本発明の融合蛋白質を使用すれば、重症筋無力症を始めとする種々の自己抗体性自己免疫疾患を効果的に予防・治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施例で作成した融合蛋白質（α１−Ｆｃ）を発現させるためのベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＡＣｈＲ−Ｆｃの模式図である。
【図２】図２は、精製した融合蛋白質（α１−Ｆｃ）の非還元状態および還元状態におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の銀染色像（左側）、およびウェスタンブロッティング像（右側）を示す。
【図３】図３は、ハイブリドーマＭａｂ３５への融合蛋白質α１−Ｆｃの結合を示す。融合蛋白質α１−Ｆｃ添加濃度（μｇ／ｍＬ）は、Ａが無添加、Ｂが０．１、Ｃが０．３６、Ｄが１、Ｅが３．６、Ｆが１０、Ｇが３６およびＨが１００である。
【図４】図４は、ハイブリドーマＭａｂ３５に対する融合蛋白質α１−ＦｃのＡＤＣＣ活性を示す。横軸にターゲット細胞であるハイブリドーマＭａｂ３５に対するエフェクター細胞であるＮＫ９２の割合を、縦軸に細胞障害活性（％）をそれぞれ示す。◆は抗体無添加時の細胞傷害活性を示し、■は融合蛋白質α１−Ｆｃの添加時の細胞傷害活性を示し、▲はアバスチンの添加時の細胞傷害活性を示し、×はエンブレルの添加時の細胞障害活性を示す。●は総細胞数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の融合蛋白質は、自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体によって認識される部位を含む蛋白質（Ｘ）と抗体重鎖定常領域のフラグメントを含む蛋白質（Ａ）とが融合されたものである。蛋白質（Ｘ）は、自己抗体に対する自己抗原、またはその一部に相当し、患者の自己抗原の代わりに自己抗体と結合する囮（デコイ）としての役割を有する。即ち、本発明の融合蛋白質が自己抗体性自己免疫疾患の患者に投与されると、患者の体内の自己抗体は、融合蛋白質のうち蛋白質（Ｘ）の部分を自己抗原として認識してこの部分に結合する。結合した自己抗体は、患者の体内に本来存在する自己抗原ともはや結合することができないので、この方法によって自己抗体を中和することができ、自己抗体と患者の自己抗原との結合による自己免疫疾患の症状の発生を抑制することができる。自己抗体は、特定の一つの抗体ではなく種々の抗体群から成り立っているが、いずれの抗体も自己抗原を認識する機能を有する点では共通する。従って、自己抗原の囮となる本発明の融合蛋白質を使用すれば、種々の抗体群に対して個別の融合蛋白質を作成しなくても、一つの融合蛋白質で種々の抗体群を中和することができる。
【００１５】
本発明の融合蛋白質は、自己抗原の囮となる蛋白質（Ｘ）に加えて、抗体重鎖定常領域のフラグメントを含む蛋白質（Ａ）も含む。この蛋白質（Ａ）は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を発揮する役割を有する。自己抗体は、血中のＢ細胞で産生されるが、このＢ細胞の表面には、自己抗体と同じ抗原結合部位を持つ細胞表面提示型の抗体がＢ細胞受容体として存在している。従って、本発明の融合蛋白質が患者に投与されると、そのうちのいくつかは患者の体内の自己抗体と上述のように結合するが、いくつかは、自己抗体を産生するＢ細胞の表面の抗体（Ｂ細胞受容体）に結合する。Ｂ細胞受容体に本発明の融合蛋白質が結合すると、ＮＫ細胞などのエフェクター細胞がそのＦｃ受容体を介して融合蛋白質中の蛋白質（Ａ）の部分に結合し、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を発揮し、融合蛋白質に結合したＢ細胞を攻撃して死滅させる。このように、本発明によれば、体内に存在する自己抗体を中和して自己抗体の自己抗原への結合を防止するのみならず、自己抗体の産生源である特定Ｂ細胞をも選択的に死滅させることができる。従って、本発明の融合蛋白質は、自己抗体の産生阻害、および産生された自己抗体の中和という二つの方法で、自己抗体性自己免疫疾患を予防または治療することができる。
なお、本発明の融合蛋白質と同様に囮（デコイ）を使用する考え方として、ガーショニ、ジョナサン・エムによる特表平２−５０２５３８号には分子状デコイアントが開示されている。この分子状デコイアントは、好ましくない作用を示す異物に対する天然の受容体の最小部分断片に相当し、外来性抗原とデコイアントの競合作用により、外来性抗原の生体受容体への結合を抑制しようとするものである。特表平２−５０２５３８号では、上記異物は、ウイルス、バクテリア、毒素などの外来性抗原であるとされており、自己抗体については何ら記載されていない。また、特表平２−５０２５３８号の分子状デコイアントは、単独で使用されており、抗体重鎖定常領域と結合されていない。
また、Ｂ細胞を死滅させる考え方として、アナンド・アイヤーらによる特表２００８−５１５９２６号には、Ｂ細胞表面抗原に対する抗体に細胞毒性物質を付加した複合体を自己免疫疾患の患者に投与することによってＢ細胞を死滅させることが開示されている。この複合体は、Ｂ細胞を死滅させることはできるが、産生された自己抗体を中和することはできず、自己抗体に対しては別途、抗サイトカイン剤を投与する必要があるとされている。
【００１６】
本発明の融合蛋白質中の蛋白質（Ｘ）は、予防または治療対象の自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体に対する自己抗原またはその一部に相当し、予防または治療対象の自己免疫疾患に応じて決まる。例えば、重症筋無力症の予防・治療の場合、重症筋無力症は、神経伝達物質であるアセチルコリンの筋肉側における受け皿であるニコチン性アセチルコリン受容体（自己抗原）に抗ニコチン性アセチルコリン受容体抗体（自己抗体）が結合してアセチルコリンによる神経・筋伝達を阻害することによって生じる疾患であるので、蛋白質（Ｘ）は、自己抗原のニコチン性アセチルコリン受容体であることができる。同様に、自己免疫性溶血性貧血の予防・治療の場合、蛋白質（Ｘ）は、赤血球表面マーカーであることができ、特発性血小板減少性紫斑病の予防・治療の場合、蛋白質（Ｘ）は、血小板表面マーカーであることができ、自己免疫性好中球減少症の予防・治療の場合、蛋白質（Ｘ）は、好中球表面マーカーであることができ、抗ＴＳＨ抗体が原因の甲状腺機能亢進症の予防・治療の場合、蛋白質（Ｘ）は、ＴＳＨであることができ、原発性甲状腺機能低下症（橋本病）の予防・治療の場合、蛋白質（Ｘ）は、甲状腺表面マーカーであることができ、自己抗体性脳炎・脳症の予防・治療の場合、蛋白質（Ｘ）は、ＮＭＤＡ受容体、ＡＭＰＡ受容体などであることができる。
【００１７】
蛋白質（Ｘ）は、これらの受容体やマーカー全体である必要はなく、自己抗体の認識部位を含んでさえいればその一部であってもよい。例えば、重症筋無力症の場合、上述のニコチン性アセチルコリン受容体は、いくつかのサブユニットからなる多量体蛋白質であり、自己抗体の認識部位は、その中でもα１サブユニットのアイソフォーム１（骨格筋でのみ発現されるアイソフォームであり、配列番号４で示される）、アイソフォーム２（骨格筋、脳、心臓、腎臓、肺臓で発現されるアイソフォームであり、配列番号５で示される）のＮ末端細胞外領域に存在する。従って、重症筋無力症の場合、蛋白質（Ｘ）は、ニコチン性アセチルコリン受容体α１（ｎＡＣｈＲα１）サブユニットまたはその一部であることができ、より具体的にはｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１および／またはアイソフォーム２、またはそれらの一部であることができ、さらに具体的にはｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１および／またはアイソフォーム２のＮ末端細胞外領域のアミノ酸配列からなることができる。
【００１８】
これらのアミノ酸配列には、その相同性が損なわれない範囲で、１個または数個（例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜７個）のアミノ酸が欠失、付加、および／または置換されていてもよい。その範囲としては、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の配列の同一性を有するものが挙げられる。アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用いて、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）で計算することができる。具体的には、このような欠失、付加、および／または置換が導入されたアミノ酸配列は、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキット（タカラバイオ製）や、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ製）等の市販キットを用いて対応するＤＮＡ配列を置換することにより容易に得ることができる。
【００１９】
本発明の融合蛋白質中の蛋白質（Ａ）は、抗体重鎖定常領域のフラグメントを含む蛋白質であり、例えば抗体重鎖のヒンジ領域以下（Ｆｃ領域）、抗体重鎖ＣＨ１領域またはそれらの一部であることができる。抗体重鎖のヒンジ領域以下（Ｆｃ領域）としては、具体的には、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を挙げることができる。配列番号１，２はいずれもヒトのＦｃ領域の配列であり、配列番号１は、アジア人に多いタイプ、配列番号２は、欧米人に多いタイプである。
【００２０】
本発明の融合蛋白質の具体例としては、例えば配列番号３のアミノ酸配列からなる蛋白質が挙げられる。この融合蛋白質は、蛋白質（Ｘ）がｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１のＮ末端細胞外領域のアミノ酸配列（配列番号４の第１位〜第２１０位のアミノ酸からなるアミノ酸配列）であり、蛋白質（Ａ）が配列番号１のアミノ酸配列である場合に相当する。このアミノ酸配列も、上述の通り、その相同性が損なわれない範囲で、１個または数個（例えば１〜２０個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜７個）のアミノ酸が欠失、付加、または／および置換されていてもよい。
【００２１】
本発明の融合蛋白質は、従来公知の遺伝子工学的手法によって製造することができ、例えば、蛋白質（Ｘ）をコードするＤＮＡおよび蛋白質（Ａ）をコードするＤＮＡを必要によりそれぞれ増幅しておき、これらのＤＮＡを相互に結合し、得られたＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して融合蛋白質を発現させることによって製造することができる。ＤＮＡの増幅は、例えばＰＣＲ法によって行うことができ、増幅したＤＮＡの結合は、例えばＯｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ法によって行うことができる。発現ベクターは、発現効率を向上させるためのＣＭＶやＳＶ４０等のプロモーターや、発現された融合蛋白質の回収を容易にするための抗体重鎖シグナル配列、膜蛋白質シグナル配列、抗体κ鎖シグナル配列などの分泌シグナル配列を備えていることが好ましい。宿主細胞としては、例えば酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞などを使用することができ、その中でも動物細胞、特にＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが好ましい。発現させた融合蛋白質は、常法により回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム等を用いて精製すればよい。
【００２２】
次に、本発明の融合蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする自己抗体性自己免疫疾患の予防・治療用組成物について説明する。かかる組成物の具体的な製剤形態としては、注射剤、坐剤等を挙げることができる。注射剤の場合は、上述のようにして得られた本発明の融合蛋白質に糖類、ポリオール、アルブミン、界面活性剤等の安定化剤、塩類等の等張化剤等を添加し、凍結乾燥して保存しておき、使用時に注射用水に溶解して投与すればよい。凍結乾燥品中の本発明の融合蛋白質の含有量は特に限定されないが、例えば０．０１〜２００ｍｇ／ｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｇである。また、溶解された注射剤中の本発明の融合蛋白質の含有量は特に限定されないが、例えば０．０１〜２００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｍＬである。注射剤の場合の投与方法としては、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等が挙げられる。坐剤の場合は、例えば、本発明の融合蛋白質を通常の坐剤用基剤に混合して製剤化し、直腸より投与すればよい。坐剤中の本発明の融合蛋白質の含有量は特に限定されないが、例えば０．１〜３００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．５〜１００ｍｇ／ｍＬである。本発明の組成物の投与量は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人一日当たり１０μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである。
【００２３】
本発明の組成物が自己抗体性自己免疫疾患の患者に投与されると、組成物中の本発明の融合蛋白質が体液流に乗って体内に分配される。そして、融合蛋白質が自己抗体と出会うと、自己抗体は融合蛋白質の蛋白質（Ｘ）の部分（自己抗体によって認識される部位）に結合するので、この自己抗体はもはや患者自身の自己抗原とは反応できなくなる。また、本発明の融合蛋白質が、自己抗体を産生するＢ細胞に出会うと、融合蛋白質はこのＢ細胞の表面の抗体（Ｂ細胞受容体）に結合される。この結合が生じると、融合蛋白質の蛋白質（Ａ）の部分（抗体重鎖定常領域のフラグメント）にＮＫ細胞などのエフェクター細胞が結合し、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を発揮し、融合蛋白質に結合されたＢ細胞を攻撃して死滅させる。このように、本発明によれば、自己抗体を中和して自己抗体の自己抗原への結合を防止するのみならず、自己抗体の産生源である特定Ｂ細胞をも選択的に死滅させることができる。従って、本発明の融合蛋白質、およびかかる融合蛋白質を含む組成物は、例えば重症筋無力症等の自己抗体性自己免疫疾患の予防・治療薬として効果を発揮すると期待できる。
【実施例】
【００２４】
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２５】
（１）融合蛋白質の製造
ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）のｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号８および配列番号９のＤＮＡ配列をプライマーとし、東洋紡績（株）の遺伝子増幅キット「ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２」（カタログ番号：ＫＯＤ−２１１）を用いて、ヒト抗体重鎖シグナル配列（分泌シグナル配列）の遺伝子を増幅した。
【００２６】
増幅した遺伝子について、インビトロジェン社のクローニングキット「Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」（カタログ番号：Ｋ２８９５−２０）を用いてクローニングを行い、遺伝子配列の解析を行った。その後、インビトロジェン社の発現ベクター「ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター」（カタログ番号：Ｖ７９０−２０）をＮＥＢ社の制限酵素ＮｈｅＩ（カタログ番号：Ｒ０１３１）、ＥｃｏＲＩ（カタログ番号：Ｒ０１０１）で処理し、増幅した抗体重鎖シグナル配列（分泌シグナル配列）を発現ベクターに挿入した。
【００２７】
次に、Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から取り寄せたヒトｎＡＣｈＲα１サブユニットのｃＤＮＡ（カタログ番号：ＭＨＳ１０１１−６１５９８）を鋳型とし、配列番号１０および配列番号１１のＤＮＡ配列をプライマーとし、東洋紡績（株）の「ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２」を用いて、ヒトｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１のＮ末端細胞外領域の遺伝子を増幅した。増幅された遺伝子は、配列番号４のアミノ酸配列の第１位〜第２１０位に相当する。このアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００２８】
一方、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）のｃＤＮＡを鋳型とし、配列番号１２および配列番号１３のＤＮＡ配列をプライマーとし、ＰＣＲによって、ヒト抗体重鎖Ｆｃ領域の遺伝子を増幅した。増幅した遺伝子について、インビトロジェン社の「Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ Ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」を用いてクローニングを行い、遺伝子配列の解析を行った。その結果、配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列をコードする二種類のヒト抗体重鎖Ｆｃ領域の遺伝子が得られたことが判明した。
【００２９】
このようにして得られたヒトｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１のＮ末端細胞外領域の遺伝子およびヒト抗体重鎖Ｆｃ領域の遺伝子を混ぜ合わせ、配列番号１０および配列番号１３のＤＮＡ配列をプライマーとし、Ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ＰＣＲ法によって遺伝子を増幅し、ヒトｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１のＮ末端細胞外領域とヒト抗体重鎖Ｆｃ領域とを一本鎖でコードする遺伝子配列を作製した。作製された遺伝子配列に相当するアミノ酸配列を配列番号３および７に示す。配列番号３は、ヒト抗体重鎖Ｆｃ領域が配列番号１のアミノ酸であるものに相当し、配列番号７は、ヒト抗体重鎖Ｆｃ領域が配列番号２のアミノ酸であるものに相当する。
【００３０】
作製した遺伝子配列についてインビトロジェン社の「Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」を用いてクローニングを行い、遺伝子配列の解析を行った。その後、予め分泌シグナル配列を挿入しておいたｐｃＤＮＡ３．１ベクターをＮＥＢ社の制限酵素ＰｐｕＭＩ（カタログ番号：Ｒ０５０６）、ＰｍｅＩ（カタログ番号：Ｒ０５６０）で処理して、作製した遺伝子配列を挿入し、ヒトｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１のＮ末端細胞外領域とヒト抗体重鎖Ｆｃ領域とからなる融合蛋白質（α１−Ｆｃ）を発現させるためのベクターを得た。得られたベクターの模式図を図１に示す。
【００３１】
次に、インビトロジェン社の発現系「Ｆｒｅｅ Ｓｔｙｌｅ ＭＡＸ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」（カタログ番号：Ｋ９０００−１０）を用いて、得られたベクターをＨＥＫ２９３細胞に導入して融合蛋白質α１−Ｆｃを発現させ、ＧＥヘルスケア社の精製カラム「ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰ Ｃｏｌｕｍｎ」（カタログ番号：１７−０４０２−０１）を用いて精製し、融合蛋白質α１−Ｆｃを得た。
【００３２】
融合蛋白質の発現確認は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、銀染色並びにウェスタンブロッティングにより行った。ウェスタンブロッティングにはＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた。その結果を図２に示す。図２中の矢印で示されるバンドが、融合蛋白質α１−Ｆｃに相当する。
【００３３】
（２）融合蛋白質の自己抗体に対する反応性の確認
ラットｎＡＣｈＲに対する自己抗体である抗ｎＡＣｈＲ自己抗体ｍＡｂ３５を産生するハイブリドーマＭａｂ３５（ＡＴＣＣ番号：ＴＩＢ−１７５）を培養し、その培養上清からＧＥヘルスケア社の精製カラム「ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＨＰ ｃｏｌｕｍｎ」（カタログ番号：１７−０４０４−０１）を用いて抗ｎＡＣｈＲ自己抗体ｍＡｂ３５を精製した。この抗体は、ラットのみならず、マウスおよびヒトに対しても交差反応性を示す抗体であることがＴｚａｒｔｏｓらによって報告されている（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ，１９８７；１５，１８５−９４））。
【００３４】
次に、精製した抗ｎＡＣｈＲ自己抗体を様々な濃度でＥＬＩＳＡプレートに固相化し、ブロッキングを行った。その後、（１）で作製した融合蛋白質α１−Ｆｃを反応させ、フナコシ社のＥＬＩＳＡ定量キット「ＩｇＧ（Ｆｃ），Ｈｕｍａｎ，ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」（カタログ番号：Ｅ８０−１０４）に付属のＨＲＰ標識抗ヒトＦｃ抗体で処理し、フナコシ社の基質溶液「ＴＭＢ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」（カタログ番号：Ｎ３０１）を基質として反応させて、１％硫酸で反応を停止させた。その後、波長４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００３５】
その結果を以下の表１に示す。表１から明らかなように、自己抗体の濃度が増大するにつれて吸光度が増大しており、自己抗体の濃度に依存して融合蛋白質が自己抗体と反応していることが確認された。
【００３６】
【００３７】
（３）ハイブリドーマＭａｂ３５への融合蛋白質α１−Ｆｃの結合の確認
自己抗体は生体内ではＢ細胞で産生され、自己抗体を産生するＢ細胞の細胞表面には、自己抗体と同じ抗体が細胞膜上にＢ細胞受容体として提示されている。（２）で使用したハイブリドーマＭａｂ３５は抗ｎＡＣｈＲ自己抗体を産生するため、ハイブリドーマＭａｂ３５においてもＢ細胞と同様に細胞表面上に自己抗体を提示していると考えられる。そこで、融合蛋白質α１−ＦｃがハイブリドーマＭａｂ３５へ結合するかどうかを確認した。
【００３８】
ＨＢＳＳ／ＢＳＡで洗浄した１×１０５個のハイブリドーマＭａｂ３５に、（１）で作製した融合蛋白質α１−Ｆｃを様々な濃度で添加した。次にＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ社のＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（カタログ番号：１０９−１１６−１７０）を添加し、ＨＢＳＳ／ＢＳＡで洗浄し、融合蛋白質とハイブリドーマとの結合をフローサイトメーターで測定した。
【００３９】
その結果を図３に示す。図３から、融合蛋白質α１−Ｆｃが濃度依存的にハイブリドーマＭａｂ３５と結合していることが明らかである。この結果は、重症筋無力症患者の体内で、融合蛋白質α１−Ｆｃが抗ｎＡＣｈＲ自己抗体産生Ｂ細胞と結合する可能性を示している。
【００４０】
（４）ハイブリドーマＭａｂ３５に対する融合蛋白質α１−ＦｃのＡＤＣＣ活性の確認
１×１０６個のハイブリドーマＭａｂ３５をＨＢＳＳ／ＢＳＡで洗浄した後、同仁社の蛍光色素「Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ」（カタログ番号：Ｃ３２６）を１０μＭとなるように添加したＨＢＳＳ／ＢＳＡで３７℃で３０分間インキュベーションを行い、ハイブリドーマ細胞内にＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭを取り込ませた。次に、これらのハイブリドーマ細胞を９６穴プレートに１００００個／ウェルとなるように分注し、（１）で作製した融合蛋白質α１−Ｆｃまたはコントロール抗体（アバスチンまたはエンブレル）と、エフェクター細胞のＮＫ９２細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−２４０７）を様々な濃度で添加し、３７℃で４時間インキュベーションを行った。インキュベーション後、×３００ｇで５分間遠心分離して細胞を沈殿させ、上清の蛍光を測定した（Ｅｘ＝４８５ｎｍ、Ｅｍ＝５４０ｎｍ）。
【００４１】
その結果を図４に示す。図４から明らかなように、ＮＫ９２細胞のみを添加した群（抗体等無添加）においても極く弱い濃度依存的な細胞障害活性（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｉｎｇ）が認められたものの、融合蛋白質α１−Ｆｃ投与群においては、最大で５０％の強い細胞障害活性がＮＫ９２細胞数依存的に認められた。一方、コントロール抗体群においては強い細胞障害活性は認められなかった。
【００４２】
以上の結果から、融合蛋白質α１−ＦｃはハイブリドーマＭａｂ３５と結合し、融合蛋白質α１−Ｆｃ中の蛋白質（Ａ）の部分（Ｆｃγ受容体）を介してエフェクター細胞のＮＫ９２による細胞障害活性（ＡＤＣＣ活性）を発揮することが明らかである。この結果は、重症筋無力症患者の体内で、融合蛋白質α１−Ｆｃが抗ｎＡＣｈＲ自己抗体産生Ｂ細胞と結合し、ＡＤＣＣ活性によって、自己抗体産生Ｂ細胞を攻撃して死滅させる可能性を示している。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明の融合蛋白質は、自己抗体の産生阻害、および産生された自己抗体の中和という二つの方法で、自己抗体性自己免疫疾患を予防または治療することができる。従って、本発明の融合蛋白質は、重症筋無力症を始めとする種々の自己抗体性自己免疫疾患を効果的に予防または治療するために広く利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００４４】
配列番号８〜１３は、プライマーの配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体によって認識される部位を含む蛋白質（Ｘ）と抗体重鎖定常領域のフラグメントを含む蛋白質（Ａ）とからなることを特徴とする融合蛋白質。
【請求項２】
蛋白質（Ａ）が、抗体重鎖のヒンジ領域以下、抗体重鎖ＣＨ１領域、またはそれらの一部を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項３】
蛋白質（Ａ）が、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１または２に記載の融合蛋白質。
【請求項４】
蛋白質（Ｘ）が、ニコチン性アセチルコリン受容体α１（ｎＡＣｈＲα１）サブユニットまたはその一部であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項５】
蛋白質（Ｘ）が、ｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１および／またはアイソフォーム２であるか、またはそれらの一部であることを特徴とする請求項４に記載の融合蛋白質。
【請求項６】
アイソフォーム１が、配列番号４のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項５に記載の融合蛋白質。
【請求項７】
アイソフォーム２が、配列番号５のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項５に記載の融合蛋白質。
【請求項８】
蛋白質（Ｘ）が、ｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１および／またはアイソフォーム２のＮ末端細胞外領域のアミノ酸配列からなるか、またはこのアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加および／もしくは置換されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項５に記載の融合蛋白質。
【請求項９】
配列番号３のアミノ酸配列からなるか、または配列番号３のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加および／もしくは置換されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項４に記載の融合蛋白質。
【請求項１０】
蛋白質（Ｘ）をコードするＤＮＡおよび蛋白質（Ａ）をコードするＤＮＡを相互に結合し、得られたＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して融合蛋白質を発現させることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合蛋白質の製造方法。
【請求項１１】
発現ベクターが、分泌シグナル配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする自己抗体性自己免疫疾患の予防・治療用組成物。
【請求項１３】
組成物が注射剤または坐薬の形態であることを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１】
自己抗体性自己免疫疾患の原因となる自己抗体によって認識される部位を含む蛋白質（Ｘ）と抗体重鎖定常領域のフラグメントを含む蛋白質（Ａ）とからなることを特徴とする融合蛋白質。
【請求項２】
蛋白質（Ａ）が、抗体重鎖のヒンジ領域以下、抗体重鎖ＣＨ１領域、またはそれらの一部を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項３】
蛋白質（Ａ）が、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１または２に記載の融合蛋白質。
【請求項４】
蛋白質（Ｘ）が、ニコチン性アセチルコリン受容体α１（ｎＡＣｈＲα１）サブユニットまたはその一部であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項５】
蛋白質（Ｘ）が、ｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１および／またはアイソフォーム２であるか、またはそれらの一部であることを特徴とする請求項４に記載の融合蛋白質。
【請求項６】
アイソフォーム１が、配列番号４のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項５に記載の融合蛋白質。
【請求項７】
アイソフォーム２が、配列番号５のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項５に記載の融合蛋白質。
【請求項８】
蛋白質（Ｘ）が、ｎＡＣｈＲα１サブユニットのアイソフォーム１および／またはアイソフォーム２のＮ末端細胞外領域のアミノ酸配列からなるか、またはこのアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加および／もしくは置換されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項５に記載の融合蛋白質。
【請求項９】
配列番号３のアミノ酸配列からなるか、または配列番号３のアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、付加および／もしくは置換されたアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項４に記載の融合蛋白質。
【請求項１０】
蛋白質（Ｘ）をコードするＤＮＡおよび蛋白質（Ａ）をコードするＤＮＡを相互に結合し、得られたＤＮＡを発現ベクターに挿入し、このベクターを宿主細胞に導入して融合蛋白質を発現させることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合蛋白質の製造方法。
【請求項１１】
発現ベクターが、分泌シグナル配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合蛋白質を有効成分として含有することを特徴とする自己抗体性自己免疫疾患の予防・治療用組成物。
【請求項１３】
組成物が注射剤または坐薬の形態であることを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−３２１８８（Ｐ２０１１−３２１８８Ａ）
【公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７８１２０（Ｐ２００９−１７８１２０）
【出願日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【特許番号】特許第４４９５７７６号（Ｐ４４９５７７６）
【特許公報発行日】平成２２年７月７日（２０１０．７．７）
【出願人】（０００２３１６４８）日本製薬株式会社 (17)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月３０日（２００９．７．３０）
【特許番号】特許第４４９５７７６号（Ｐ４４９５７７６）
【特許公報発行日】平成２２年７月７日（２０１０．７．７）
【出願人】（０００２３１６４８）日本製薬株式会社 (17)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]