血圧降下性ペプチドの吸着材、吸着方法および吸着装置
【課題】 液体中の血圧降下性ペプチドを効率よく選択的に吸着することが可能な吸着材、ならびに吸着材により液体中の血圧降下性ペプチドを除去する方法を提供する。また、液体中の血圧降下性ペプチドを除去するための吸着器を提供する。
【解決手段】 水不溶性担体にｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を固定してなる血圧降下性ペプチドの吸着材を得る。この血圧降下性ペプチド吸着材に血圧降下性ペプチドを含有する液体を接触させることにより液体中の血圧降下性ペプチドを効率よく選択的に吸着することができる。さらに、液の入口、出口を有し、かつ血圧降下性ペプチド吸着材の容器外への流出防止具を備えた容器内に前記吸着材を充填した吸着器により効率よく選択的に血圧降下性ペプチドを吸着することができる。
【解決手段】 水不溶性担体にｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を固定してなる血圧降下性ペプチドの吸着材を得る。この血圧降下性ペプチド吸着材に血圧降下性ペプチドを含有する液体を接触させることにより液体中の血圧降下性ペプチドを効率よく選択的に吸着することができる。さらに、液の入口、出口を有し、かつ血圧降下性ペプチド吸着材の容器外への流出防止具を備えた容器内に前記吸着材を充填した吸着器により効率よく選択的に血圧降下性ペプチドを吸着することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は体液より血圧降下性ペプチドを吸着するための吸着材、これを用いた血圧降下性ペプチドの吸着方法および吸着器に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の種々の器官では多くのホルモンや生理活性物質により、その生理的な機能の調整が行われている。血管拡張（血圧降下）作用を有する生理活性ペプチドにはアドレノメジュリン（以下、「ＡＭ」と略す）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（以下、「ＡＮＰ」と略す）、脳性ナトリウム利尿ペプチド、バソアクティブ腸管ペプチド、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド等が見出されており、生体機能の保持に重要な働きをしていることが示されている。
【０００３】
ＡＭはヒト褐色細胞種から単離・同定された、強い降圧活性をもつペプチドである。ＡＭの降圧作用には血管平滑筋に作用して弛緩させる直接的な作用と、血管内皮のＮＯ生産を誘導する間接的な作用があることが知られており、副腎髄質、心臓、肺、腎臓、血管など循環器系の主要臓器で産生され、循環調節に深く関わっていると考えられている。ところが一方では、ＡＭの産生異常が種々の疾患の原因であることも明らかになっている。その一つとして、最近、ＡＭがエンドトキシン血症性ショックの一因であるという興味深い報告が出されている。ＡＭはリポポリサッカライド（ＬＰＳ）およびインターロイキン−１ベータ及び腫瘍壊死因子−アルファなどの炎症性サイトカインによりＡＭ遺伝子がアップレギュレーションされることが分かり、ＡＭはエンドトキシン血症と強く関係していることが示唆されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。すなわち、培養平滑筋細胞をＬＰＳまたは炎症性サイトカインで刺激するとＡＭ遺伝子の発現が顕著に上昇し、ＬＰＳ注入により誘導したラットやイヌのエンドトキシン血症モデルについても、同様にＡＭ遺伝子の発現が亢進すると共に、血漿中でＡＭ濃度が著しく増大することが示された。また、ヒトにおいてもエンドトキシン血症患者の血漿中でＡＭ濃度が顕著に上昇し、さらにはエンドトキシン血症での病態と血中ＡＭ濃度に相関関係があることも示された。これより、ＡＭがエンドトキシン血症において血圧降下作用の原因物質であることが示唆されているだけでなく、種々の病態にカスケード的に関与していることが示唆されている（非特許文献４）。他にもＡＭは様々な器官のヒト癌細胞系列で発現し、腫瘍の増殖を引き起こす因子として働くこと、心筋梗塞・心不全・肺高血圧症といった疾患の時にもＡＭ産生が増加することが示されている（非特許文献５）。
【０００４】
このように、ＡＭは各種疾患の病態に深く関与しているにも関わらず、これらの疾患においてＡＭの作用を抑制する有効な方法、もしくは体液中からＡＭを除去する方法は確立されていないのが現状である。
【０００５】
ＡＮＰはヒト及びラットの心房組織から単離・同定されたアミノ酸２８個からなるペプチド性ホルモンである。ＡＮＰは主に心房で合成、貯蔵され、循環血液中に分泌される。腎臓に働き利尿を促進する、抹消血管を拡張し血圧降下を促すなどの各種生理活性が知られている。一方で、ＡＮＰは種々の疾患の原因であることも示唆されている。ＬＰＳ投与により誘導したラットのエンドトキシン血症モデル動物では、ＡＮＰ濃度が著しく増大することが示され、ＡＮＰとエンドトキシン血症の関連が示唆されている（非特許文献６）。実際にエンドトキシン血症性ショックの患者においてもＡＭの濃度に比例してＡＮＰの濃度も顕著に上昇することが示され、ＡＭと同様にＡＮＰもエンドトキシン血症時の血圧降下物質として働いていることが示唆されている（非特許文献７）。しかし従来の方法では体液中のＡＮＰの作用を抑制する有効な方法、もしくは体液中のＡＮＰを除去する方法は確立されていないのが現状である。
【非特許文献１】Ｓｕｇａら（１９９５）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ｖｏｌ．２０７、ｐ２５
【非特許文献２】Ｓｈｏｊｉら（１９９５）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ｖｏｌ．２１５、ｐ５３１
【非特許文献３】Ｏｎｏら（１９９８）、Ｓｈｏｃｋ ｖｏｌ．１０、ｐ２４３
【非特許文献４】Ｎｉｓｈｉｏら（１９９７）、Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ｖｏｌ．２５、ｐ９５３
【非特許文献５】Ｍａｒｔｉｎｅｚら（１９９５）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１３６、ｐ４０９９
【非特許文献６】Ａｉｕｒａら（１９９５）、Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ｖｏｌ．２３、ｐ１８９８
【非特許文献７】Ｗｉｔｔｈａｕｔら（２００３）、Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ｖｏｌ．２９、ｐ１６９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、体液中の血圧降下性ペプチドを効率よく選択的に吸着しうる吸着材、前記吸着材を用いた溶液中の血圧降下性ペプチドの吸着方法および吸着器を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、体液中の血圧降下性ペプチドを効率よく吸着しうる吸着材について鋭意検討した。その結果、水不溶性担体にｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を固定してなる吸着材が体液中の血圧降下性ペプチドを効率よく吸着しうることを見いだし、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は水不溶性担体にｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を固定してなる血圧降下性ペプチドの吸着材に関する。
【０００９】
好適な実施態様においては、前記水不溶性担体は水不溶性多孔質担体である。
【００１０】
また本発明は、水不溶性担体にｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を固定してなる、血圧降下性ペプチドの吸着材に体液を接触させることを特徴とする、体液中の血圧降下性ペプチドの除去方法に関する。
【００１１】
また本発明は、液の入口および出口を有しかつ、吸着材の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、水不溶性体にｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を固定してなる、血圧降下性ペプチドの吸着材を充填してなる血圧降下性ペプチドの吸着器に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の水不溶性担体にｌｏｇＰ値２．０以上の化合物を固定化した吸着材により、血圧降下ペプチドを効率よく選択的に吸着することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明における体液とは、血液、血漿、血清、腹水、リンパ液、関節内液およびこれらからえられた分画成分、ならびにそのほかの生体由来の液体成分をいう。
【００１４】
本発明の吸着材は、ｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を水不溶性担体に固定化してなる。ｌｏｇＰ値は、以下のように求められる。まず、化合物をオクタノール（もしくは水）に溶解し、これに等量の水（もしくはオクタノール）を加え、グリッフィン・フラスク・シェイカー（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｆｌａｓｋ ｓｈａｋｅｒ）（グリッフィン・アンド・ジョージ・リミテッド（Ｇｒｉｆｆｉｎ ＆ Ｇｅｏｒｇｅ Ｌｔｄ．）製）で３０分間振盪する。そののち２０００ｒｐｍで１〜２時間遠心分離し、オクタノール層および水層中の化合物の各濃度を、室温、大気圧下において分光学的またはＧＬＣなどの種々の方法で測定することにより次式から求められる。
Ｐ＝Ｃｏｃｔ／Ｃｗ
Ｃｏｃｔ：オクタノール層中の化合物濃度
Ｃｗ ：水層中の化合物濃度
これまでに多くの研究者らにより種々の化合物のｌｏｇＰ値が実測されているが、それらの実測値はシー・ハンシュ（Ｃ．Ｈａｎｓｃｈ）らによって整理されている（「パーティション・コーフィシエンツ・アンド・ゼア・ユージズ；ケミカル・レビューズ（ＰＡＲＴＩＴＩＯＮ ＣＯＥＦＦＩＣＩＥＮＴＳ ＡＮＤ ＴＨＥＩＲ ＵＳＥＳ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）、７１巻、５２５頁、１９７１年」参照）。
【００１５】
また実測値の知られていない化合物についてはアール・エフ・レッカー（Ｒ．Ｆ．Ｒｅｋｋｅｒ）がその著書「ザ・ハイドロフォビック・フラグメンタル・コンスタント（ＴＨＥ ＨＹＤＲＯＰＨＯＢＩＣ ＦＲＡＧＭＥＮＴＡＬ ＣＯＮＳＴＡＮＴ）」，エルセビア・サイエンティフィック・パブリッシング・カンパニー・アムステルダム（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉ．Ｐｕｂ．Ｃｏｍ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）（１９７７）中に示している疎水性フラグメント定数ｆを用いて計算した値（Σｆ）が参考となる。疎水性フラグメント定数は数多くのｌｏｇＰ実測値をもとに、統計学的処理を行い決定された種々のフラグメントの疎水性を示す値であり、化合物を構成するおのおののフラグメントのｆ値の和はｌｏｇＰ値とほぼ一致すると報告されている。
【００１６】
血圧降下性ペプチドの吸着に有効な化合物の探索にあたり、２．０以上のｌｏｇＰ値を有する化合物を水不溶性担体に固定した結果、化合物としてヘキサデシルアミン（Σｆ＝７．２２）を水不溶性担体に固定した場合、吸着能は非常に高いことがわかった。この結果より、本発明の吸着材による血圧降下性ペプチド吸着は、ｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物の固定により担体上に導入された原子団と血圧降下性ペプチドとのあいだの疎水性相互作用によるものと考えられる。固定化された化合物のＬｏｇＰ値が高値である程良好な血圧降下ペプチド吸着能を示すことから、固定化する化合物のＬｏｇＰ値は２．０以上であることが好ましく、より好ましくは２．５、さらに好ましくは５．０以上である。
【００１７】
ＬｏｇＰ値の上限に特に制限はないが、ＬｏｇＰ値が大きいと血液適合性が悪化する場合がある。また、ＬｏｇＰ値が１０より大きい場合には、非特異吸着が増えることがある。このような観点から、ＬｏｇＰ値は１０以下であることが好ましい。
【００１８】
本発明において、水不溶性担体に固定化される化合物としては、ｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物であれば特別な制限なしに用いることができる。ただし、担体上に化合物を共有結合によって結合する場合には化合物の一部が脱離することが多いが、この脱離基が化合物の疎水性に大きく寄与している場合、すなわち脱離により担体上に固定される原子団の疎水性がΣｆ＝２．０より小さくなるような場合には本発明の主旨から考えて、本発明に用いる化合物としては不適当である。このように、担体上に固定化されることにより化合物の疎水性が大きく低減する例を一つあげると、安息香酸イソペンチルエステル（Σｆ＝４．１５）をエステル交換により水酸基を有する担体上に固定する場合があげられる。この場合実際に担体上に固定される原子団はＣ6Ｈ5ＣＯ−であり、この原子団のΣｆは１以下である。このような化合物が本発明で用いる化合物として適当かどうかは、脱離基の部分を水素に置き換えた化合物のｌｏｇＰ値が２．０以上かどうか、または、脱離により担体上に固定される原子団の疎水性がΣｆ＝２．０以上であるかにより判断すれば良い。
【００１９】
ｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物の中でも、不飽和炭化水素、アルコール、アミン、チオール、カルボン酸およびその誘導体、ハロゲン化物、アルデヒド、ヒドラジド、イソシアナート、グリシジルエーテルなどのオキシラン環含有化合物、ならびにハロゲン化シランなどのように担体への結合に利用できる官能基を有する化合物が好ましい。このような化合物の代表例としては、たとえばドデシルアミン、セチルアミン、オクタデシルアミン、２−アミノオクテン、ナフチルアミンなどのアミン類、ｎ−ドデシルアルコール、ヘキサデシルアルコール、１−オクテン−３−オールなどのアルコール類およびこれらのアルコールのグリシジルエーテル類、ドデカン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、などのカルボン酸類およびこれらの酸ハロゲン化物、エステル、アミドなどのカルボン酸誘導体、塩化デシル、塩化ドデシルなどのハロゲン化物、ドデカンチオールなどのチオール類、ｎ−オクチルトリクロロシラン、オクタデシルトリクロロシランなどのハロゲン化シラン類などがあげられる。
【００２０】
これらの他にも、前記の例示化合物の炭化水素部分の水素原子がハロゲン、窒素、酸素、イオウなどのヘテロ原子を含有する置換基、他のアルキル基などで置換された化合物のうち、ｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物、前述のシー・ハンシュ（Ｃ．Ｈａｎｓｃｈ）らの総説「パーティション・コーフィシエンツ・アンド・ゼア・ユージズ；ケミカル・レビューズ（ＰＡＲＴＩＴＩＯＮ ＣＯＥＦＦＩＣＩＥＮＴＳ ＡＮＤ ＴＨＥＩＲ ＵＳＥＳ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）、７１巻、５２５頁、１９７１年」中の５５５ページから６１３ページの表に示されているｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物などを用いることができるが、本発明においてはこれらのみに限定されるものではない。
【００２１】
なお、これらの化合物はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の２種類以上を組み合わせてもよく、さらにはｌｏｇＰ値が２．０未満の化合物との組み合わせで用いてもよい。
【００２２】
本発明の吸着材における水不溶性担体とは、常温常圧で固体であり水不溶性であることを意味する。また、本発明における水不溶性担体は粒状、板状、繊維状、中空糸状等があるが形状は問わず、その大きさもとくに限定されない。
【００２３】
たとえば、本発明の吸着材が粒状である場合、平均粒子径は５μｍ以上、１０００μｍ以下であることが好ましい。平均粒子径が５μｍより小さいと、体液に細胞が含まれる場合に充分に通過し得る間隔を得られない傾向にある。平均粒子径が１０００μｍをこえると、体積あたりの吸着能が充分得られない傾向にある。細胞がスムーズに通過できる点から平均粒径は２５μｍ以上、１０００μｍ以下がさらに好ましく、より細胞が通過しやすくまた吸着能が得られる点から４０μｍ以上、６００μｍ以下が特に好ましい。特に、体液が血液である場合には、血球が通過しやすい点から平均粒径は２００μｍ以上、１０００μｍ以下であることが好ましく、吸着能が得られる点から２００μｍ以上、６００μｍ以下がさらに好ましい。また、圧力損失の増大を引き起こさないなどの理由から、粒径分布は狭い方が好ましい。
【００２４】
また、本発明の吸着材が繊維状でかつ中空である場合、その内径は１μｍ以上、５００μｍ以下であることが好ましい。内径が１μｍより小さいと、体液に細胞が含まれる場合に充分に通過しない傾向にある。内径が５００μｍをこえると、体積あたりの吸着能が充分得られない傾向にある。細胞がスムーズに通過できる点から内径が２μｍ以上、５００μｍ以下がさらに好ましく、より細胞が通過しやすくまた吸着能が得られる点から５μｍ以上、２００μｍ以下が最も好ましい。
【００２５】
本発明の吸着材における水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストリンなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによってえられる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが代表例としてあげられる。
【００２６】
なかでも、親水性担体が、非特異吸着が比較的少なく血圧降下性ペプチドの吸着選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水の接触角が６０度以下の担体を指す。水の接触角の測定方法は種々知られているが、たとえば池田がその著書（実験化学選書・コロイド化学，第４章，界面の熱力学，７５頁から１０４頁，裳華房（１９８６））に示しているごとく、化合物の平板上に水滴を置き測定する方法が最も一般的である。上記の方法で測定した水の接触角が６０度以下である化合物としては、セルロース、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラスなどからなる担体が代表例としてあげられる。
【００２７】
これらの水不溶性担体は、適当な大きさの細孔を多数有する、すなわち多孔構造を有する担体であることがより好ましい。多孔構造を有する担体とは、基礎高分子母体が微小球の凝集により１個の球状粒子を形成する際に微小球の集塊によって形成される空間（マクロポアー）を有する担体のばあいは当然であるが、基礎高分子母体を構成する１個の微小球内の核と核との集塊の間に形成される細孔を有する担体のばあい、あるいは三次元構造（高分子網目）を有する共重合体が親和性のある有機溶媒で膨潤された状態の時に存在する細孔（ミクロポアー）を有する担体のばあいも含まれる。
【００２８】
また吸着材の単位体積あたりの吸着能から考えて、多孔構造を有する水不溶性担体は、表面多孔性よりも全多孔性が好ましく、また空孔容積および比表面積は、吸着性が損なわれない程度に大きいことが好ましい。
【００２９】
これらの好ましい要件を満たす担体として、多孔質セルロース担体があげられる。多孔質セルロース担体は、（１）機械的強度が比較的高く、強靭であるため撹拌などの操作により破壊されたり微粉を生じたりすることが少なく、カラムに充填した場合体液を高速で流しても圧密化したりしないので高流速で流すことが可能となり、また多孔質構造が高圧蒸気滅菌などによって変化を受けにくい、（２）ゲルがセルロースで構成されているため親水性であり、リガンドの結合に利用しうる水酸基が多数存在し、非特異的吸着も少ない、（３）空孔容積を大きくしても比較的強度が高いため軟質ゲルに劣らない吸着容量がえられる、（４）安全性が合成高分子ゲル等に比べて高いなどの優れた点を有しており、本発明に用いる最も適した担体の１つである。しかしながら本発明においてはこれらのみに限定されるものではなく、さらに上述の担体はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の２種類以上を混合して用いてもよい。
【００３０】
またこのような多孔質構造を有する水不溶性担体は、吸着対象の物質はある程度大きな確率で細孔内に侵入できるが、他の蛋白質の侵入はできる限り起こらない特徴を有することがより好ましい。すなわち本発明の吸着材の吸着対象である血圧降下性ペプチドは分子量約２０００Ｄａ以上１００００Ｄａ未満の蛋白質であるため、これらの蛋白質を効率よく吸着するためには血圧降下性ペプチドはある程度大きな確率で細孔内に侵入できるが、他の蛋白質の侵入はできる限り起こらないことがより好ましい。多孔質内に侵入可能な物質の分子量の目安としては、排除限界分子量が一般に用いられている。排除限界分子量とは成書（たとえば、波多野博行、花井俊彦著、実験高速液体クロマトグラフ、化学同人）などに述べられているごとく、ゲル浸透クロマトグラフィーにおいて細孔内に侵入できない（排除される）分子の内最も小さい分子量をもつものの分子量をいう。排除限界分子量は一般に球状蛋白質、デキストラン、ポリエチレングリコールなどについてよく調べられているが、本発明に用いる担体の場合、球状蛋白質を用いてえられた値を用いるのが適当である。本発明に用いる水不溶性多孔質担体の排除限界分子量は血圧降下性ペプチドの細孔内への侵入しやすさのから２０００Ｄａ以上が好ましく、より好ましくは８０００Ｄａ以上であり、血圧降下性ペプチド以外の蛋白の侵入を防ぐことを考慮すれば、さらに好ましくは８０００Ｄａ以上１０００００Ｄａ未満である。
【００３１】
さらに、担体にはリガンドの固定化反応に用いうる官能基を有していることが好ましい。これらの官能基の代表例としては水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、ハロゲン基、スクシニルイミド基、酸無水物基などがあげられるが、これらに限定されるわけではない。
【００３２】
本発明に用いる担体としては硬質担体、軟質担体のいずれも用いることができるが、体外循環用の吸着材として使用する場合には、カラムに充填し、通液する際などに目詰まりを生じないことが重要であり、そのためには充分な機械的強度が要求される。したがって本発明に用いる担体は硬質担体であることがより好ましい。ここでいう硬質担体とは、たとえば粒状ゲルの場合、後記参考例に示すごとく、ゲルを円筒状カラムに均一に充填し、水性流体を流した際の圧力損失ΔＰと流量の関係が０．３ｋｇ／ｃｍ2までの直線関係にあるものをいう。
【００３３】
本発明の吸着材はｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を水不溶性多孔質担体に固定してえられるが、その固定化方法としては公知の種々の方法を特別な制限なしに用いることができる。しかしながら、本発明の吸着材を体外循環治療に供する場合には、滅菌時あるいは治療時においてのリガンドの脱離溶出を極力抑えることが安全上重要であり、そのためには共有結合法により固定化することが好ましい。
【００３４】
本発明による吸着材を用いて体液中より血圧降下性ペプチドを吸着する方法には種々の方法がある。最も簡便な方法としては体液を取り出してバッグなどに貯留し、これに吸着材を混合して血圧降下性ペプチドを吸着した後、吸着材を濾別して血圧降下性ペプチドが除去された体液をえる方法がある。この方法は、体液を原材料として医薬品（例：血液製剤、ワクチン、遺伝子組換製剤）又は医療材料を製造する際にも、適用することができる。次の方法は体液の入口と出口を有し、出口には体液は通過するが吸着材は通過しないフィルターを装着した容器に吸着材を充填し、これに体液を流す方法がある。いずれの方法も用いることができるが、後者の方法は操作も簡便であり、また体外循環回路に組み込むことにより患者の体液、とくに血液から効率よくオンラインで血圧降下性ペプチドを除去することが可能であり、本発明の吸着材はこの方法に適している。
【００３５】
ここでいう体外循環回路では本発明の吸着材を単独で用いることもできるが、他の体外循環治療システムとの併用も可能である。併用の例としては、人工透析回路などがあげられ、透析療法との組み合わせに用いることもできる。
【００３６】
つぎに、血圧降下性ペプチド吸着材を用いた本発明の血圧降下性ペプチド吸着器を、一実施例の概略断面図である図１に基づき説明する。図１中、１は液体の流入口、２は液体の流出口、３は本発明の血圧降下性ペプチド吸着材、４および５は液体および液体に含まれる成分は通過できるが血圧降下性ペプチド吸着材は通過できないフィルター、６はカラム、７は血圧降下性ペプチド吸着器である。しかしながら、血圧降下性ペプチド吸着器はこのような具体例に限定されるものではなく、液の入口、出口を有し、かつ血圧降下性ペプチド吸着材の容器外への流出防止具を備えた容器内に前記吸着材を充填したものであれば、どのようなものでもよい。
【００３７】
前記流出防止具には、メッシュ、不織布、綿栓などのフィルターがあげられる。また、容器の形状、材質、大きさにはとくに限定はないが、形状としては筒状容器が好ましい。容器の材質として好ましいのは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的にはシリコンコートされたガラス、ポリプロピレン、塩化ビニール、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリメチルペンテンなどがあげられる。容器の容量は５０ｍｌ以上、１５００ｍｌ以下で、直径は２ｃｍ以上、２０ｃｍ以下が好ましい。容器の容量が５０ｍｌより小さいと吸着量が充分でなく、１５００ｍｌより大きいと体外循環量が多くなるので好ましくない。容器の直径が２ｃｍより小さいと線速が大きくなるため圧力損失が大きくなり好ましくない。２０ｃｍより大きいと取り扱いにくくなるうえ線速が小さくなるため凝固の危険性があり好ましくない。効果的な吸着量があり、安全性に優れているという点から容量は１００ｍｌ以上、８００ｍｌ以下で、直径は３ｃｍ以上、１５ｃｍ以下がさらに好ましく、容量は１５０ｍｌ以上、４００ｍｌ以下で、直径は４ｃｍ以上、１０ｃｍ以下が特に好ましい。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例において本発明についてさらに詳細に述べるが、本発明は以下の実施例
のみに限定されるものではない。
【００３９】
（参考例）
両端に孔径１５μｍのフィルターを装着したガラス製円筒カラム（内径９ｍｍ、カラム長１５０ｍｍ）にアガロース材料（バイオラッド（Ｂｉｏ−ｒａｄ）社製のＢｉｏｇｅｌＡ−５ｍ、粒径５０〜１００メッシュ）、ビニル系高分子材料（東ソー（株）製のトヨパールＨＷ−６５、粒径５０〜１００μｍ）およびセルロース材料（チッソ（株）製のセルロファインＧＣ−７００ｍ、粒径４５〜１０５μｍ）をそれぞれ均一に充
填し、ペリスタティックポンプにより水を流し、流量と圧力損失ΔＰとの関係を求めた。その結果を図２に示す。図２に示すごとく、トヨパールＨＷ−６５およびセルロファインＧＣ−７００ｍが圧力の増加にほぼ比例して流量が増加するのに対し、ＢｉｏｇｅｌＡ−５ｍは圧密化を引き起こし、圧力を増加させても流量が増加しないことがわかる。本発明においては前者のごとく、圧力損失ΔＰと流量の関係が０．３ｋｇ／ｃｍ2までの直線関係にあるものを硬質材料という。
【００４０】
（実施例１）
酢酸セルロースをジメチルスルホキシドとプロピレングリコールの混合溶剤に溶解し、この溶液を特開昭６３−１１７０３９号公報に記載された方法（振動法）により液滴化し、凝固させて、酢酸セルロースの球形のヒドロゲル粒子を得た。このヒドロゲル粒子を水酸化ナトリウム水溶液と混和し、加水分解反応を行い、セルロースのヒドロゲル粒子（平均粒子径４６０μｍ、球状蛋白質の排除限界分子量５万）を得た。この粒子１７０ｍｌに水を加えて全量３４０ｍｌとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０ｍｌを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン３１ｍｌを加え、４０℃で攪拌下２時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ化ゲルを得た。
【００４１】
このエポキシ化ゲル１０ｍｌにｎ−ヘキサデシルアミン（Σｆ＝７．２２）２００ｍｇを加え、エタノール中、４５℃で静置下、６日間反応させ、固定化した。反応終了後、エタノール、水の順に充分洗浄し、ｎ−ヘキサデシルアミン固定化ゲルを得た。この固定化ゲルを湿潤状態で３００μｌ計量し、これに対して健常人血清（大日本製薬（株）製）にヒトアドレノメジュリン（１−５２）（ＰＨＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ,ＩＮＣ社製）を加えて調製したＡＭ加血清９００μｌを加え、３７℃で２時間インキュベートし、上清のＡＭ濃度をＥＬＩＳＡ測定キット（ＰＨＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ,ＩＮＣ社製）を用いて測定し、吸着体の代わりに生理食塩液３００μｌを用いた生食コントロールと比較した。なおここでＡＭ吸着率は以下の式で求める。
【００４２】
吸着率（％）＝｛１−吸着後の濃度／生食コントロールにおける濃度｝×１００
結果を表１に示す。
【００４３】
（比較例１）
実施例１で用いた固定化前のセルロースのヒドロゲル粒子に対し、実施例１と同様にして吸着実験を行った。結果を表１に示す。
【００４４】
（実施例２）
ＧＣ１００ｍ（チッソ株式会社製のセルロース系多孔質硬質ゲル、球状蛋白の排除限界分子量６００００）へ実施例１と同様の手順で、ｎ−ドデシルアミン（Σｆ＝５．１０）を固定化した。このｎ−ドデシルアミン固定化ゲルに対し、実施例１と同様にして吸着実験を行った。結果を表１に示す。
【００４５】
（実施例３）
ｎ−ドデシルアミンをｎ−オクチルアミン（Σｆ＝２．９０）へ変えた他は実施例２と同様にして固定化ゲルを取得し、実施例１と同様にして吸着実験を行った。結果を表１に示す。
【００４６】
（実施例４）
ｎ−ドデシルアミンをｎ−ヘキシルアミン（Σｆ＝２．０６）へ変えた他は実施例２と同様にして固定化ゲルを取得し、実施例１と同様にして吸着実験を行った。結果を表１に示す。
【００４７】
（実施例５）
実施例１と同様の手順で得られたｎ−ヘキサデシルアミン（Σｆ＝７．２２）固定化ゲルを湿潤状態で３００μｌ計量し、これに対して健常人血清（大日本製薬（株）製）にヒトＡＮＰ（１−２８）（Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ社製）を加えて調製したＡＮＰ加血清９００μｌを加え、３７℃で２時間インキュベートし、上清のＡＮＰ濃度をＲＩＡ法（株式会社エスアールエルに委託）により測定し、吸着実験を行った。結果を表２に示す。
（比較例２）
実施例１で用いた固定化前のセルロースのヒドロゲル粒子に対し、実施例５と同様にして吸着実験を行った。結果を表２に示す。
【００４８】
（実施例６）
実施例２と同様の手順で得られたｎ−ドデシルアミン（Σｆ＝５．１０）固定化ゲルに対し、実施例５と同様にして吸着実験を行った。結果を表２に示す。
【００４９】
（実施例７）
実施例３と同様の手順で得られたｎ−オクチルアミン（Σｆ＝２．９０）固定化ゲルに対し、実施例５と同様にして吸着実験を行った。結果を表２に示す。
【００５０】
（実施例８）
実施例４と同様の手順で得られたｎ−ヘキシルアミン（Σｆ＝２．０６）固定化ゲルに対し、実施例５と同様にして吸着実験を行った。結果を表２に示す。
【００５１】
【表１】
【００５２】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明における血圧降下性ペプチド蛋白吸着器の一実施例の概略断面図である。
【図２】３種類の材料を用いて流速と圧力損失との関係を調べた結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００５４】
１ 液体の流入口
２ 液体の流出口
３ 血圧降下性ペプチド吸着材
４ 液体および液体に含まれる成分は通過できるが前記血圧降下性ペプチド吸着材は通過できないフィルター
５ 液体および液体に含まれる成分は通過できるが前記血圧降下性ペプチド吸着材は通過できないフィルター
６ カラム
７ 血圧降下性ペプチド吸着器
【技術分野】
【０００１】
本発明は体液より血圧降下性ペプチドを吸着するための吸着材、これを用いた血圧降下性ペプチドの吸着方法および吸着器に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の種々の器官では多くのホルモンや生理活性物質により、その生理的な機能の調整が行われている。血管拡張（血圧降下）作用を有する生理活性ペプチドにはアドレノメジュリン（以下、「ＡＭ」と略す）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（以下、「ＡＮＰ」と略す）、脳性ナトリウム利尿ペプチド、バソアクティブ腸管ペプチド、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド等が見出されており、生体機能の保持に重要な働きをしていることが示されている。
【０００３】
ＡＭはヒト褐色細胞種から単離・同定された、強い降圧活性をもつペプチドである。ＡＭの降圧作用には血管平滑筋に作用して弛緩させる直接的な作用と、血管内皮のＮＯ生産を誘導する間接的な作用があることが知られており、副腎髄質、心臓、肺、腎臓、血管など循環器系の主要臓器で産生され、循環調節に深く関わっていると考えられている。ところが一方では、ＡＭの産生異常が種々の疾患の原因であることも明らかになっている。その一つとして、最近、ＡＭがエンドトキシン血症性ショックの一因であるという興味深い報告が出されている。ＡＭはリポポリサッカライド（ＬＰＳ）およびインターロイキン−１ベータ及び腫瘍壊死因子−アルファなどの炎症性サイトカインによりＡＭ遺伝子がアップレギュレーションされることが分かり、ＡＭはエンドトキシン血症と強く関係していることが示唆されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。すなわち、培養平滑筋細胞をＬＰＳまたは炎症性サイトカインで刺激するとＡＭ遺伝子の発現が顕著に上昇し、ＬＰＳ注入により誘導したラットやイヌのエンドトキシン血症モデルについても、同様にＡＭ遺伝子の発現が亢進すると共に、血漿中でＡＭ濃度が著しく増大することが示された。また、ヒトにおいてもエンドトキシン血症患者の血漿中でＡＭ濃度が顕著に上昇し、さらにはエンドトキシン血症での病態と血中ＡＭ濃度に相関関係があることも示された。これより、ＡＭがエンドトキシン血症において血圧降下作用の原因物質であることが示唆されているだけでなく、種々の病態にカスケード的に関与していることが示唆されている（非特許文献４）。他にもＡＭは様々な器官のヒト癌細胞系列で発現し、腫瘍の増殖を引き起こす因子として働くこと、心筋梗塞・心不全・肺高血圧症といった疾患の時にもＡＭ産生が増加することが示されている（非特許文献５）。
【０００４】
このように、ＡＭは各種疾患の病態に深く関与しているにも関わらず、これらの疾患においてＡＭの作用を抑制する有効な方法、もしくは体液中からＡＭを除去する方法は確立されていないのが現状である。
【０００５】
ＡＮＰはヒト及びラットの心房組織から単離・同定されたアミノ酸２８個からなるペプチド性ホルモンである。ＡＮＰは主に心房で合成、貯蔵され、循環血液中に分泌される。腎臓に働き利尿を促進する、抹消血管を拡張し血圧降下を促すなどの各種生理活性が知られている。一方で、ＡＮＰは種々の疾患の原因であることも示唆されている。ＬＰＳ投与により誘導したラットのエンドトキシン血症モデル動物では、ＡＮＰ濃度が著しく増大することが示され、ＡＮＰとエンドトキシン血症の関連が示唆されている（非特許文献６）。実際にエンドトキシン血症性ショックの患者においてもＡＭの濃度に比例してＡＮＰの濃度も顕著に上昇することが示され、ＡＭと同様にＡＮＰもエンドトキシン血症時の血圧降下物質として働いていることが示唆されている（非特許文献７）。しかし従来の方法では体液中のＡＮＰの作用を抑制する有効な方法、もしくは体液中のＡＮＰを除去する方法は確立されていないのが現状である。
【非特許文献１】Ｓｕｇａら（１９９５）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ｖｏｌ．２０７、ｐ２５
【非特許文献２】Ｓｈｏｊｉら（１９９５）、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ｖｏｌ．２１５、ｐ５３１
【非特許文献３】Ｏｎｏら（１９９８）、Ｓｈｏｃｋ ｖｏｌ．１０、ｐ２４３
【非特許文献４】Ｎｉｓｈｉｏら（１９９７）、Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ｖｏｌ．２５、ｐ９５３
【非特許文献５】Ｍａｒｔｉｎｅｚら（１９９５）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１３６、ｐ４０９９
【非特許文献６】Ａｉｕｒａら（１９９５）、Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ｖｏｌ．２３、ｐ１８９８
【非特許文献７】Ｗｉｔｔｈａｕｔら（２００３）、Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ ｖｏｌ．２９、ｐ１６９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、体液中の血圧降下性ペプチドを効率よく選択的に吸着しうる吸着材、前記吸着材を用いた溶液中の血圧降下性ペプチドの吸着方法および吸着器を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、体液中の血圧降下性ペプチドを効率よく吸着しうる吸着材について鋭意検討した。その結果、水不溶性担体にｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を固定してなる吸着材が体液中の血圧降下性ペプチドを効率よく吸着しうることを見いだし、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は水不溶性担体にｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を固定してなる血圧降下性ペプチドの吸着材に関する。
【０００９】
好適な実施態様においては、前記水不溶性担体は水不溶性多孔質担体である。
【００１０】
また本発明は、水不溶性担体にｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を固定してなる、血圧降下性ペプチドの吸着材に体液を接触させることを特徴とする、体液中の血圧降下性ペプチドの除去方法に関する。
【００１１】
また本発明は、液の入口および出口を有しかつ、吸着材の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、水不溶性体にｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を固定してなる、血圧降下性ペプチドの吸着材を充填してなる血圧降下性ペプチドの吸着器に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の水不溶性担体にｌｏｇＰ値２．０以上の化合物を固定化した吸着材により、血圧降下ペプチドを効率よく選択的に吸着することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明における体液とは、血液、血漿、血清、腹水、リンパ液、関節内液およびこれらからえられた分画成分、ならびにそのほかの生体由来の液体成分をいう。
【００１４】
本発明の吸着材は、ｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を水不溶性担体に固定化してなる。ｌｏｇＰ値は、以下のように求められる。まず、化合物をオクタノール（もしくは水）に溶解し、これに等量の水（もしくはオクタノール）を加え、グリッフィン・フラスク・シェイカー（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｆｌａｓｋ ｓｈａｋｅｒ）（グリッフィン・アンド・ジョージ・リミテッド（Ｇｒｉｆｆｉｎ ＆ Ｇｅｏｒｇｅ Ｌｔｄ．）製）で３０分間振盪する。そののち２０００ｒｐｍで１〜２時間遠心分離し、オクタノール層および水層中の化合物の各濃度を、室温、大気圧下において分光学的またはＧＬＣなどの種々の方法で測定することにより次式から求められる。
Ｐ＝Ｃｏｃｔ／Ｃｗ
Ｃｏｃｔ：オクタノール層中の化合物濃度
Ｃｗ ：水層中の化合物濃度
これまでに多くの研究者らにより種々の化合物のｌｏｇＰ値が実測されているが、それらの実測値はシー・ハンシュ（Ｃ．Ｈａｎｓｃｈ）らによって整理されている（「パーティション・コーフィシエンツ・アンド・ゼア・ユージズ；ケミカル・レビューズ（ＰＡＲＴＩＴＩＯＮ ＣＯＥＦＦＩＣＩＥＮＴＳ ＡＮＤ ＴＨＥＩＲ ＵＳＥＳ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）、７１巻、５２５頁、１９７１年」参照）。
【００１５】
また実測値の知られていない化合物についてはアール・エフ・レッカー（Ｒ．Ｆ．Ｒｅｋｋｅｒ）がその著書「ザ・ハイドロフォビック・フラグメンタル・コンスタント（ＴＨＥ ＨＹＤＲＯＰＨＯＢＩＣ ＦＲＡＧＭＥＮＴＡＬ ＣＯＮＳＴＡＮＴ）」，エルセビア・サイエンティフィック・パブリッシング・カンパニー・アムステルダム（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉ．Ｐｕｂ．Ｃｏｍ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）（１９７７）中に示している疎水性フラグメント定数ｆを用いて計算した値（Σｆ）が参考となる。疎水性フラグメント定数は数多くのｌｏｇＰ実測値をもとに、統計学的処理を行い決定された種々のフラグメントの疎水性を示す値であり、化合物を構成するおのおののフラグメントのｆ値の和はｌｏｇＰ値とほぼ一致すると報告されている。
【００１６】
血圧降下性ペプチドの吸着に有効な化合物の探索にあたり、２．０以上のｌｏｇＰ値を有する化合物を水不溶性担体に固定した結果、化合物としてヘキサデシルアミン（Σｆ＝７．２２）を水不溶性担体に固定した場合、吸着能は非常に高いことがわかった。この結果より、本発明の吸着材による血圧降下性ペプチド吸着は、ｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物の固定により担体上に導入された原子団と血圧降下性ペプチドとのあいだの疎水性相互作用によるものと考えられる。固定化された化合物のＬｏｇＰ値が高値である程良好な血圧降下ペプチド吸着能を示すことから、固定化する化合物のＬｏｇＰ値は２．０以上であることが好ましく、より好ましくは２．５、さらに好ましくは５．０以上である。
【００１７】
ＬｏｇＰ値の上限に特に制限はないが、ＬｏｇＰ値が大きいと血液適合性が悪化する場合がある。また、ＬｏｇＰ値が１０より大きい場合には、非特異吸着が増えることがある。このような観点から、ＬｏｇＰ値は１０以下であることが好ましい。
【００１８】
本発明において、水不溶性担体に固定化される化合物としては、ｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物であれば特別な制限なしに用いることができる。ただし、担体上に化合物を共有結合によって結合する場合には化合物の一部が脱離することが多いが、この脱離基が化合物の疎水性に大きく寄与している場合、すなわち脱離により担体上に固定される原子団の疎水性がΣｆ＝２．０より小さくなるような場合には本発明の主旨から考えて、本発明に用いる化合物としては不適当である。このように、担体上に固定化されることにより化合物の疎水性が大きく低減する例を一つあげると、安息香酸イソペンチルエステル（Σｆ＝４．１５）をエステル交換により水酸基を有する担体上に固定する場合があげられる。この場合実際に担体上に固定される原子団はＣ6Ｈ5ＣＯ−であり、この原子団のΣｆは１以下である。このような化合物が本発明で用いる化合物として適当かどうかは、脱離基の部分を水素に置き換えた化合物のｌｏｇＰ値が２．０以上かどうか、または、脱離により担体上に固定される原子団の疎水性がΣｆ＝２．０以上であるかにより判断すれば良い。
【００１９】
ｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物の中でも、不飽和炭化水素、アルコール、アミン、チオール、カルボン酸およびその誘導体、ハロゲン化物、アルデヒド、ヒドラジド、イソシアナート、グリシジルエーテルなどのオキシラン環含有化合物、ならびにハロゲン化シランなどのように担体への結合に利用できる官能基を有する化合物が好ましい。このような化合物の代表例としては、たとえばドデシルアミン、セチルアミン、オクタデシルアミン、２−アミノオクテン、ナフチルアミンなどのアミン類、ｎ−ドデシルアルコール、ヘキサデシルアルコール、１−オクテン−３−オールなどのアルコール類およびこれらのアルコールのグリシジルエーテル類、ドデカン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、オレイン酸、などのカルボン酸類およびこれらの酸ハロゲン化物、エステル、アミドなどのカルボン酸誘導体、塩化デシル、塩化ドデシルなどのハロゲン化物、ドデカンチオールなどのチオール類、ｎ−オクチルトリクロロシラン、オクタデシルトリクロロシランなどのハロゲン化シラン類などがあげられる。
【００２０】
これらの他にも、前記の例示化合物の炭化水素部分の水素原子がハロゲン、窒素、酸素、イオウなどのヘテロ原子を含有する置換基、他のアルキル基などで置換された化合物のうち、ｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物、前述のシー・ハンシュ（Ｃ．Ｈａｎｓｃｈ）らの総説「パーティション・コーフィシエンツ・アンド・ゼア・ユージズ；ケミカル・レビューズ（ＰＡＲＴＩＴＩＯＮ ＣＯＥＦＦＩＣＩＥＮＴＳ ＡＮＤ ＴＨＥＩＲ ＵＳＥＳ；Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ）、７１巻、５２５頁、１９７１年」中の５５５ページから６１３ページの表に示されているｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物などを用いることができるが、本発明においてはこれらのみに限定されるものではない。
【００２１】
なお、これらの化合物はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の２種類以上を組み合わせてもよく、さらにはｌｏｇＰ値が２．０未満の化合物との組み合わせで用いてもよい。
【００２２】
本発明の吸着材における水不溶性担体とは、常温常圧で固体であり水不溶性であることを意味する。また、本発明における水不溶性担体は粒状、板状、繊維状、中空糸状等があるが形状は問わず、その大きさもとくに限定されない。
【００２３】
たとえば、本発明の吸着材が粒状である場合、平均粒子径は５μｍ以上、１０００μｍ以下であることが好ましい。平均粒子径が５μｍより小さいと、体液に細胞が含まれる場合に充分に通過し得る間隔を得られない傾向にある。平均粒子径が１０００μｍをこえると、体積あたりの吸着能が充分得られない傾向にある。細胞がスムーズに通過できる点から平均粒径は２５μｍ以上、１０００μｍ以下がさらに好ましく、より細胞が通過しやすくまた吸着能が得られる点から４０μｍ以上、６００μｍ以下が特に好ましい。特に、体液が血液である場合には、血球が通過しやすい点から平均粒径は２００μｍ以上、１０００μｍ以下であることが好ましく、吸着能が得られる点から２００μｍ以上、６００μｍ以下がさらに好ましい。また、圧力損失の増大を引き起こさないなどの理由から、粒径分布は狭い方が好ましい。
【００２４】
また、本発明の吸着材が繊維状でかつ中空である場合、その内径は１μｍ以上、５００μｍ以下であることが好ましい。内径が１μｍより小さいと、体液に細胞が含まれる場合に充分に通過しない傾向にある。内径が５００μｍをこえると、体積あたりの吸着能が充分得られない傾向にある。細胞がスムーズに通過できる点から内径が２μｍ以上、５００μｍ以下がさらに好ましく、より細胞が通過しやすくまた吸着能が得られる点から５μｍ以上、２００μｍ以下が最も好ましい。
【００２５】
本発明の吸着材における水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストリンなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによってえられる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが代表例としてあげられる。
【００２６】
なかでも、親水性担体が、非特異吸着が比較的少なく血圧降下性ペプチドの吸着選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水の接触角が６０度以下の担体を指す。水の接触角の測定方法は種々知られているが、たとえば池田がその著書（実験化学選書・コロイド化学，第４章，界面の熱力学，７５頁から１０４頁，裳華房（１９８６））に示しているごとく、化合物の平板上に水滴を置き測定する方法が最も一般的である。上記の方法で測定した水の接触角が６０度以下である化合物としては、セルロース、ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビニル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラスなどからなる担体が代表例としてあげられる。
【００２７】
これらの水不溶性担体は、適当な大きさの細孔を多数有する、すなわち多孔構造を有する担体であることがより好ましい。多孔構造を有する担体とは、基礎高分子母体が微小球の凝集により１個の球状粒子を形成する際に微小球の集塊によって形成される空間（マクロポアー）を有する担体のばあいは当然であるが、基礎高分子母体を構成する１個の微小球内の核と核との集塊の間に形成される細孔を有する担体のばあい、あるいは三次元構造（高分子網目）を有する共重合体が親和性のある有機溶媒で膨潤された状態の時に存在する細孔（ミクロポアー）を有する担体のばあいも含まれる。
【００２８】
また吸着材の単位体積あたりの吸着能から考えて、多孔構造を有する水不溶性担体は、表面多孔性よりも全多孔性が好ましく、また空孔容積および比表面積は、吸着性が損なわれない程度に大きいことが好ましい。
【００２９】
これらの好ましい要件を満たす担体として、多孔質セルロース担体があげられる。多孔質セルロース担体は、（１）機械的強度が比較的高く、強靭であるため撹拌などの操作により破壊されたり微粉を生じたりすることが少なく、カラムに充填した場合体液を高速で流しても圧密化したりしないので高流速で流すことが可能となり、また多孔質構造が高圧蒸気滅菌などによって変化を受けにくい、（２）ゲルがセルロースで構成されているため親水性であり、リガンドの結合に利用しうる水酸基が多数存在し、非特異的吸着も少ない、（３）空孔容積を大きくしても比較的強度が高いため軟質ゲルに劣らない吸着容量がえられる、（４）安全性が合成高分子ゲル等に比べて高いなどの優れた点を有しており、本発明に用いる最も適した担体の１つである。しかしながら本発明においてはこれらのみに限定されるものではなく、さらに上述の担体はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の２種類以上を混合して用いてもよい。
【００３０】
またこのような多孔質構造を有する水不溶性担体は、吸着対象の物質はある程度大きな確率で細孔内に侵入できるが、他の蛋白質の侵入はできる限り起こらない特徴を有することがより好ましい。すなわち本発明の吸着材の吸着対象である血圧降下性ペプチドは分子量約２０００Ｄａ以上１００００Ｄａ未満の蛋白質であるため、これらの蛋白質を効率よく吸着するためには血圧降下性ペプチドはある程度大きな確率で細孔内に侵入できるが、他の蛋白質の侵入はできる限り起こらないことがより好ましい。多孔質内に侵入可能な物質の分子量の目安としては、排除限界分子量が一般に用いられている。排除限界分子量とは成書（たとえば、波多野博行、花井俊彦著、実験高速液体クロマトグラフ、化学同人）などに述べられているごとく、ゲル浸透クロマトグラフィーにおいて細孔内に侵入できない（排除される）分子の内最も小さい分子量をもつものの分子量をいう。排除限界分子量は一般に球状蛋白質、デキストラン、ポリエチレングリコールなどについてよく調べられているが、本発明に用いる担体の場合、球状蛋白質を用いてえられた値を用いるのが適当である。本発明に用いる水不溶性多孔質担体の排除限界分子量は血圧降下性ペプチドの細孔内への侵入しやすさのから２０００Ｄａ以上が好ましく、より好ましくは８０００Ｄａ以上であり、血圧降下性ペプチド以外の蛋白の侵入を防ぐことを考慮すれば、さらに好ましくは８０００Ｄａ以上１０００００Ｄａ未満である。
【００３１】
さらに、担体にはリガンドの固定化反応に用いうる官能基を有していることが好ましい。これらの官能基の代表例としては水酸基、アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、エポキシ基、ハロゲン基、スクシニルイミド基、酸無水物基などがあげられるが、これらに限定されるわけではない。
【００３２】
本発明に用いる担体としては硬質担体、軟質担体のいずれも用いることができるが、体外循環用の吸着材として使用する場合には、カラムに充填し、通液する際などに目詰まりを生じないことが重要であり、そのためには充分な機械的強度が要求される。したがって本発明に用いる担体は硬質担体であることがより好ましい。ここでいう硬質担体とは、たとえば粒状ゲルの場合、後記参考例に示すごとく、ゲルを円筒状カラムに均一に充填し、水性流体を流した際の圧力損失ΔＰと流量の関係が０．３ｋｇ／ｃｍ2までの直線関係にあるものをいう。
【００３３】
本発明の吸着材はｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を水不溶性多孔質担体に固定してえられるが、その固定化方法としては公知の種々の方法を特別な制限なしに用いることができる。しかしながら、本発明の吸着材を体外循環治療に供する場合には、滅菌時あるいは治療時においてのリガンドの脱離溶出を極力抑えることが安全上重要であり、そのためには共有結合法により固定化することが好ましい。
【００３４】
本発明による吸着材を用いて体液中より血圧降下性ペプチドを吸着する方法には種々の方法がある。最も簡便な方法としては体液を取り出してバッグなどに貯留し、これに吸着材を混合して血圧降下性ペプチドを吸着した後、吸着材を濾別して血圧降下性ペプチドが除去された体液をえる方法がある。この方法は、体液を原材料として医薬品（例：血液製剤、ワクチン、遺伝子組換製剤）又は医療材料を製造する際にも、適用することができる。次の方法は体液の入口と出口を有し、出口には体液は通過するが吸着材は通過しないフィルターを装着した容器に吸着材を充填し、これに体液を流す方法がある。いずれの方法も用いることができるが、後者の方法は操作も簡便であり、また体外循環回路に組み込むことにより患者の体液、とくに血液から効率よくオンラインで血圧降下性ペプチドを除去することが可能であり、本発明の吸着材はこの方法に適している。
【００３５】
ここでいう体外循環回路では本発明の吸着材を単独で用いることもできるが、他の体外循環治療システムとの併用も可能である。併用の例としては、人工透析回路などがあげられ、透析療法との組み合わせに用いることもできる。
【００３６】
つぎに、血圧降下性ペプチド吸着材を用いた本発明の血圧降下性ペプチド吸着器を、一実施例の概略断面図である図１に基づき説明する。図１中、１は液体の流入口、２は液体の流出口、３は本発明の血圧降下性ペプチド吸着材、４および５は液体および液体に含まれる成分は通過できるが血圧降下性ペプチド吸着材は通過できないフィルター、６はカラム、７は血圧降下性ペプチド吸着器である。しかしながら、血圧降下性ペプチド吸着器はこのような具体例に限定されるものではなく、液の入口、出口を有し、かつ血圧降下性ペプチド吸着材の容器外への流出防止具を備えた容器内に前記吸着材を充填したものであれば、どのようなものでもよい。
【００３７】
前記流出防止具には、メッシュ、不織布、綿栓などのフィルターがあげられる。また、容器の形状、材質、大きさにはとくに限定はないが、形状としては筒状容器が好ましい。容器の材質として好ましいのは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的にはシリコンコートされたガラス、ポリプロピレン、塩化ビニール、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリメチルペンテンなどがあげられる。容器の容量は５０ｍｌ以上、１５００ｍｌ以下で、直径は２ｃｍ以上、２０ｃｍ以下が好ましい。容器の容量が５０ｍｌより小さいと吸着量が充分でなく、１５００ｍｌより大きいと体外循環量が多くなるので好ましくない。容器の直径が２ｃｍより小さいと線速が大きくなるため圧力損失が大きくなり好ましくない。２０ｃｍより大きいと取り扱いにくくなるうえ線速が小さくなるため凝固の危険性があり好ましくない。効果的な吸着量があり、安全性に優れているという点から容量は１００ｍｌ以上、８００ｍｌ以下で、直径は３ｃｍ以上、１５ｃｍ以下がさらに好ましく、容量は１５０ｍｌ以上、４００ｍｌ以下で、直径は４ｃｍ以上、１０ｃｍ以下が特に好ましい。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例において本発明についてさらに詳細に述べるが、本発明は以下の実施例
のみに限定されるものではない。
【００３９】
（参考例）
両端に孔径１５μｍのフィルターを装着したガラス製円筒カラム（内径９ｍｍ、カラム長１５０ｍｍ）にアガロース材料（バイオラッド（Ｂｉｏ−ｒａｄ）社製のＢｉｏｇｅｌＡ−５ｍ、粒径５０〜１００メッシュ）、ビニル系高分子材料（東ソー（株）製のトヨパールＨＷ−６５、粒径５０〜１００μｍ）およびセルロース材料（チッソ（株）製のセルロファインＧＣ−７００ｍ、粒径４５〜１０５μｍ）をそれぞれ均一に充
填し、ペリスタティックポンプにより水を流し、流量と圧力損失ΔＰとの関係を求めた。その結果を図２に示す。図２に示すごとく、トヨパールＨＷ−６５およびセルロファインＧＣ−７００ｍが圧力の増加にほぼ比例して流量が増加するのに対し、ＢｉｏｇｅｌＡ−５ｍは圧密化を引き起こし、圧力を増加させても流量が増加しないことがわかる。本発明においては前者のごとく、圧力損失ΔＰと流量の関係が０．３ｋｇ／ｃｍ2までの直線関係にあるものを硬質材料という。
【００４０】
（実施例１）
酢酸セルロースをジメチルスルホキシドとプロピレングリコールの混合溶剤に溶解し、この溶液を特開昭６３−１１７０３９号公報に記載された方法（振動法）により液滴化し、凝固させて、酢酸セルロースの球形のヒドロゲル粒子を得た。このヒドロゲル粒子を水酸化ナトリウム水溶液と混和し、加水分解反応を行い、セルロースのヒドロゲル粒子（平均粒子径４６０μｍ、球状蛋白質の排除限界分子量５万）を得た。この粒子１７０ｍｌに水を加えて全量３４０ｍｌとしたのち、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９０ｍｌを加え４０℃とした。これにエピクロルヒドリン３１ｍｌを加え、４０℃で攪拌下２時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ化ゲルを得た。
【００４１】
このエポキシ化ゲル１０ｍｌにｎ−ヘキサデシルアミン（Σｆ＝７．２２）２００ｍｇを加え、エタノール中、４５℃で静置下、６日間反応させ、固定化した。反応終了後、エタノール、水の順に充分洗浄し、ｎ−ヘキサデシルアミン固定化ゲルを得た。この固定化ゲルを湿潤状態で３００μｌ計量し、これに対して健常人血清（大日本製薬（株）製）にヒトアドレノメジュリン（１−５２）（ＰＨＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ,ＩＮＣ社製）を加えて調製したＡＭ加血清９００μｌを加え、３７℃で２時間インキュベートし、上清のＡＭ濃度をＥＬＩＳＡ測定キット（ＰＨＥＮＩＸ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ,ＩＮＣ社製）を用いて測定し、吸着体の代わりに生理食塩液３００μｌを用いた生食コントロールと比較した。なおここでＡＭ吸着率は以下の式で求める。
【００４２】
吸着率（％）＝｛１−吸着後の濃度／生食コントロールにおける濃度｝×１００
結果を表１に示す。
【００４３】
（比較例１）
実施例１で用いた固定化前のセルロースのヒドロゲル粒子に対し、実施例１と同様にして吸着実験を行った。結果を表１に示す。
【００４４】
（実施例２）
ＧＣ１００ｍ（チッソ株式会社製のセルロース系多孔質硬質ゲル、球状蛋白の排除限界分子量６００００）へ実施例１と同様の手順で、ｎ−ドデシルアミン（Σｆ＝５．１０）を固定化した。このｎ−ドデシルアミン固定化ゲルに対し、実施例１と同様にして吸着実験を行った。結果を表１に示す。
【００４５】
（実施例３）
ｎ−ドデシルアミンをｎ−オクチルアミン（Σｆ＝２．９０）へ変えた他は実施例２と同様にして固定化ゲルを取得し、実施例１と同様にして吸着実験を行った。結果を表１に示す。
【００４６】
（実施例４）
ｎ−ドデシルアミンをｎ−ヘキシルアミン（Σｆ＝２．０６）へ変えた他は実施例２と同様にして固定化ゲルを取得し、実施例１と同様にして吸着実験を行った。結果を表１に示す。
【００４７】
（実施例５）
実施例１と同様の手順で得られたｎ−ヘキサデシルアミン（Σｆ＝７．２２）固定化ゲルを湿潤状態で３００μｌ計量し、これに対して健常人血清（大日本製薬（株）製）にヒトＡＮＰ（１−２８）（Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ社製）を加えて調製したＡＮＰ加血清９００μｌを加え、３７℃で２時間インキュベートし、上清のＡＮＰ濃度をＲＩＡ法（株式会社エスアールエルに委託）により測定し、吸着実験を行った。結果を表２に示す。
（比較例２）
実施例１で用いた固定化前のセルロースのヒドロゲル粒子に対し、実施例５と同様にして吸着実験を行った。結果を表２に示す。
【００４８】
（実施例６）
実施例２と同様の手順で得られたｎ−ドデシルアミン（Σｆ＝５．１０）固定化ゲルに対し、実施例５と同様にして吸着実験を行った。結果を表２に示す。
【００４９】
（実施例７）
実施例３と同様の手順で得られたｎ−オクチルアミン（Σｆ＝２．９０）固定化ゲルに対し、実施例５と同様にして吸着実験を行った。結果を表２に示す。
【００５０】
（実施例８）
実施例４と同様の手順で得られたｎ−ヘキシルアミン（Σｆ＝２．０６）固定化ゲルに対し、実施例５と同様にして吸着実験を行った。結果を表２に示す。
【００５１】
【表１】
【００５２】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明における血圧降下性ペプチド蛋白吸着器の一実施例の概略断面図である。
【図２】３種類の材料を用いて流速と圧力損失との関係を調べた結果を示すグラフである。
【符号の説明】
【００５４】
１ 液体の流入口
２ 液体の流出口
３ 血圧降下性ペプチド吸着材
４ 液体および液体に含まれる成分は通過できるが前記血圧降下性ペプチド吸着材は通過できないフィルター
５ 液体および液体に含まれる成分は通過できるが前記血圧降下性ペプチド吸着材は通過できないフィルター
６ カラム
７ 血圧降下性ペプチド吸着器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水不溶性担体にｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．０以上の化合物を固定してなる、血圧降下性ペプチドの吸着材。
【請求項２】
ｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を固定化する方法が共有結合であることを特徴とする請求項１記載の吸着材。
【請求項３】
血圧降下性ペプチドがアドレノメジュリンまたは心房性ナトリウム利尿ペプチドである請求項１または２記載の吸着材。
【請求項４】
該水不溶性担体が水不溶性多孔質担体であることを特徴とする請求項１乃至３記載の吸着材。
【請求項５】
該水不溶性多孔質担体の排除限界分子量が２０００Ｄａ以上である請求項４記載の吸着材。
【請求項６】
水不溶性担体にｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を固定してなる血圧降下性ペプチドの吸着材に体液を接触させることを特徴とする、体液中の血圧降下性ペプチドの除去方法。
【請求項７】
液の入口および出口を有しかつ、吸着材の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、水不溶性体にｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を固定してなる、血圧降下性ペプチドの吸着材を充填してなる血圧降下性ペプチドの吸着器。
【請求項１】
水不溶性担体にｌｏｇＰ（Ｐはオクタノール−水系での分配係数）値が２．０以上の化合物を固定してなる、血圧降下性ペプチドの吸着材。
【請求項２】
ｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を固定化する方法が共有結合であることを特徴とする請求項１記載の吸着材。
【請求項３】
血圧降下性ペプチドがアドレノメジュリンまたは心房性ナトリウム利尿ペプチドである請求項１または２記載の吸着材。
【請求項４】
該水不溶性担体が水不溶性多孔質担体であることを特徴とする請求項１乃至３記載の吸着材。
【請求項５】
該水不溶性多孔質担体の排除限界分子量が２０００Ｄａ以上である請求項４記載の吸着材。
【請求項６】
水不溶性担体にｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を固定してなる血圧降下性ペプチドの吸着材に体液を接触させることを特徴とする、体液中の血圧降下性ペプチドの除去方法。
【請求項７】
液の入口および出口を有しかつ、吸着材の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、水不溶性体にｌｏｇＰ値が２．０以上の化合物を固定してなる、血圧降下性ペプチドの吸着材を充填してなる血圧降下性ペプチドの吸着器。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００７−２９６１１８（Ｐ２００７−２９６１１８Ａ）
【公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１２６６６８（Ｐ２００６−１２６６６８）
【出願日】平成１８年４月２８日（２００６．４．２８）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月２８日（２００６．４．２８）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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