血小板凝集阻害物質
【課題】 Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属を種菌とした発酵物を原料として得られる血小板凝集阻害物質を提供すること。
【解決手段】 常圧蒸留によって抽出された分画中に強い血小板凝集阻害活性が認められた。本物質は熱に安定な低分子分画で，無色でさわやかな香りがした。このような活性は納豆には全く見られないものである。また，この血小板凝集阻害物質はテンペ菌を振とう培養しても得られることが分かった。
【解決手段】 常圧蒸留によって抽出された分画中に強い血小板凝集阻害活性が認められた。本物質は熱に安定な低分子分画で，無色でさわやかな香りがした。このような活性は納豆には全く見られないものである。また，この血小板凝集阻害物質はテンペ菌を振とう培養しても得られることが分かった。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属を種菌とした発酵物を原料として得られる血小板凝集阻害物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明者等は、天然素材中に種々の血液循環関連物質を検索することに鋭意努力し，これまで日本の伝統食品である納豆を中心に血栓溶解酵素（非特許文献１），血小板凝集阻害物質（非特許文献２）などに関して報告してきた。
【０００３】
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属を種菌とした発酵食品の代表にテンペがある。テンペは大豆や米などの穀類を中心にＲｈｉｚｏｐｕｓ属を発酵させた食品であり，これまで，血栓溶解酵素（非特許文献３），スーパーオキシドジスムターゼ（特許文献１）などの有効成分が認められている。
【０００４】
納豆がＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ（菌）を種菌とするのに対し，テンペはＲｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｅ（黴）を種菌とする点で全く異なる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】 Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，４３，１１１０〜１１１１，１９８７
【非特許文献２】 日本醸造学会誌，９４巻，１２号，１０１６〜１０１８，１９９９
【非特許文献３】 生化学，６１巻，８３４，１９８９
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】 特開平１１−１９２０８６公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら，血小板凝集阻害物質についてはこれまで全く報告がなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属を種菌とした発酵物を原料として得られる抽出物中に熱安定性の極めて強力な血小板凝集阻害物質を見出したものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に関わる血小板凝集阻害物質は，テンペを常圧蒸留することで得られることから，熱安定性であり，大量生産が容易で，安価である。また，食品であるゆえ，食べたり飲んだりしても安全な血小板凝集阻害物質が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下，本発明の実施の形態について，市販品および市販品より純粋培養したテンペ菌による固体培養および振とう培養を行った際の実験結果を基に説明する。
【００１１】
実験材料・方法
１）供試材料
テンペは市販品２社，対照の納豆は市販品１社を使用した。
【００１２】
また，テンペ菌による大豆の固体培養および振とう培養に用いたテンペ菌は，秋田今野株式会社（秋田）有限会社ホットプランニング（静岡）の種菌を使用した市販品から主要な菌株を選び出し，Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｅの純粋培養（スラント培養）したものを使用した（以下，秋田今野：テンペ菌Ａ，ホットプランニング：テンペ菌Ｂ）。
【００１３】
２）固体培養
２％ポリペプトンＳ（日本製薬株式会社）２００ｍｌを１２１℃，１５分間滅菌し，純粋培養したテンペ菌Ａあるいはテンペ菌Ｂ（滅菌水１０ｍｌに０．０１ｇを懸濁）１００μｌを接種し，３７℃で４日間培養したものを遠心分離し（３，５００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，２５℃），その上清を試料とした。
【００１４】
３）振とう培養
固体培養と同様の培養液を用い，純粋培養したテンペ菌Ｂ（滅菌水１０ｍｌに０．０１ｇを懸濁）１００μｌを接種し，３７℃で０日目から７日目まで振とう培養（１００ｒｐｍ）でしたものを遠心分離し（３，５００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，２５℃），その上清を試料とした。
【００１５】
４）血小板凝集作用の測定
血小板凝集はＷｉｓｔｅｒ系雄性ラット尾静脈から採取したチトラート血を遠心分離（８，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，２５℃）で得られた多血小板血漿（ＰＲＰ）と遠心分離（３，５００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，２５℃）で得られた乏血小板血漿（ＰＰＰ）に分け，３０分静置しておく。ＰＲＰ５０μｌ，コントロール（蒸留水）あるいは試料１０〜５０μｌ，タイロード緩衝液（ｐＨ７．３５）１００〜１４０μｌを混合後，３７℃，５分間プレインキュベーションし，凝集惹起物質として３００μＭ ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ社）２２μｌを加えて３７℃で間血小板凝集率をアグリゴメーター（ＰＡＴ−４Ａ：メバニクス）で測定した。また，少数ながら凝集惹起物質として，コラーゲン（Ｈｏｒｍ ｏｎ Ｃｈｅｍｉｃ），トロンビン（持田製薬），エピネフリン（第一製薬）を使用した。ＰＰＰの血小板凝集率を１００％とし光透過率で血小板凝集を測定した。
【００１６】
実験結果
１）市販品の血小板凝集阻害活性
市販のテンペ５０ｇをリービッヒ蒸留装置に入れ，温度を徐々に上げていき，滴下が始まってから（９２〜９４℃），試験管に０．５ｍｌ（Ｆｒａｃｔ．１〜３）ずつ採取し，各分画の血小板凝集阻害活性を測定した。
【００１７】
ラットのＰＲＰはＡＤＰ（３０μＭ）で凝集するが，それに対する各エキスの阻害率は各々表１（図１）のようになった。即ち，Ｆｒａｃｔ．の１本目に強い活性が認められた。なお，この蒸留操作を行わなかった場合，活性は全く認められなかった。
【００１８】
【表１】
【００１９】
２）固体培養での血小板凝集阻害活性
ラットのＰＲＰはＡＤＰ（３０μＭ）で凝集するが，それに対する各エキスの阻害率は各々表２，３（図２，３）のようになった。いずれの蒸留操作がなければ見えない活性がＦｒａｃｔ．１〜３で確認された。
【００２０】
【表２】
【００２１】
【表３】
【００２２】
なお，納豆を同様に試験してみたが，蒸留分画に活性は見られなかった。また市販品Ｂの分画で活性のあるもの（表３）を水で透析（Ｍ．Ｗ．約１万）してみたが，活性は全く残らなかった。つまり，活性を有する物質は低分子（Ｍ．Ｗ．約１万以下）であることが分かった。
【００２３】
２）振とう培養での血小板凝集阻害活性
ラットＰＲＰはＡＤＰ（３０μＭ）で凝集するが，それに対し振とう培養では２日目の上清（図４）に強い血小板凝集阻害活性が認められた。なお，４日目，７日目では阻害活性は除々に消失していくことが分かった（表４）。一番強かった２日目の活性分画は，コラーゲン，トロンビン，エピネフリンの凝集に対しても阻害活性を示し，また常圧蒸留で初留の所に得られることを確認した。
【００２４】
【表４】
【００２５】
以上，Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｅ製テンペはリービッヒ蒸留管（常圧）で初留に当る分画に強い血小板凝集阻害活性のあることを知った。
【００２６】
発明者等は多くの発酵製品で血小板への影響をみてきたが，常圧蒸留によって血小板凝集阻害活性を有する物質が抽出されたのは初めてである。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明による抽出物は，熱安定性で低分子血小板凝集阻害剤および機能性食品に利用可能である。また，無色透明でありさわやかなバラ様の香りがするため，香料として添加した場合，食品の風味をよくするなどの効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図２は，市販品２社の蒸留分画中の血小板凝集阻害率を示すグラフであり，ＰＲＰ５０μｌ，試料５０μｌ，タイロード緩衝液１００μｌ，ＡＤＰ２２μｌで測定。
【図２】 図２は，テンペ菌Ａによる固体培養の蒸留分画中の血小板凝集阻害率を示すグラフであり，ＰＲＰ５０μｌ，試料２５μｌ，タイロード緩衝液１２５μｌ，ＡＤＰ２２μｌで測定。
【図３】 図３は，テンペ菌Ｂによる固体培養の蒸留分画中の血小板凝集阻害率を示すグラフであり，ＰＲＰ５０μｌ，試料２５μｌ，タイロード緩衝液１２５μｌ，ＡＤＰ２２μｌで測定。
【図４】 図４は，テンペ菌Ｂによる振とう培養の日数による血小板凝集阻害率を示すグラフであり，ＰＲＰ５０μｌ，試料１０μｌ，タイロード緩衝液１４０μｌ，ＡＤＰ２２μｌで測定。
【技術分野】
【０００１】
本発明は，Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属を種菌とした発酵物を原料として得られる血小板凝集阻害物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明者等は、天然素材中に種々の血液循環関連物質を検索することに鋭意努力し，これまで日本の伝統食品である納豆を中心に血栓溶解酵素（非特許文献１），血小板凝集阻害物質（非特許文献２）などに関して報告してきた。
【０００３】
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属を種菌とした発酵食品の代表にテンペがある。テンペは大豆や米などの穀類を中心にＲｈｉｚｏｐｕｓ属を発酵させた食品であり，これまで，血栓溶解酵素（非特許文献３），スーパーオキシドジスムターゼ（特許文献１）などの有効成分が認められている。
【０００４】
納豆がＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ（菌）を種菌とするのに対し，テンペはＲｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｅ（黴）を種菌とする点で全く異なる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】 Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，４３，１１１０〜１１１１，１９８７
【非特許文献２】 日本醸造学会誌，９４巻，１２号，１０１６〜１０１８，１９９９
【非特許文献３】 生化学，６１巻，８３４，１９８９
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】 特開平１１−１９２０８６公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら，血小板凝集阻害物質についてはこれまで全く報告がなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属を種菌とした発酵物を原料として得られる抽出物中に熱安定性の極めて強力な血小板凝集阻害物質を見出したものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に関わる血小板凝集阻害物質は，テンペを常圧蒸留することで得られることから，熱安定性であり，大量生産が容易で，安価である。また，食品であるゆえ，食べたり飲んだりしても安全な血小板凝集阻害物質が提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下，本発明の実施の形態について，市販品および市販品より純粋培養したテンペ菌による固体培養および振とう培養を行った際の実験結果を基に説明する。
【００１１】
実験材料・方法
１）供試材料
テンペは市販品２社，対照の納豆は市販品１社を使用した。
【００１２】
また，テンペ菌による大豆の固体培養および振とう培養に用いたテンペ菌は，秋田今野株式会社（秋田）有限会社ホットプランニング（静岡）の種菌を使用した市販品から主要な菌株を選び出し，Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｅの純粋培養（スラント培養）したものを使用した（以下，秋田今野：テンペ菌Ａ，ホットプランニング：テンペ菌Ｂ）。
【００１３】
２）固体培養
２％ポリペプトンＳ（日本製薬株式会社）２００ｍｌを１２１℃，１５分間滅菌し，純粋培養したテンペ菌Ａあるいはテンペ菌Ｂ（滅菌水１０ｍｌに０．０１ｇを懸濁）１００μｌを接種し，３７℃で４日間培養したものを遠心分離し（３，５００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，２５℃），その上清を試料とした。
【００１４】
３）振とう培養
固体培養と同様の培養液を用い，純粋培養したテンペ菌Ｂ（滅菌水１０ｍｌに０．０１ｇを懸濁）１００μｌを接種し，３７℃で０日目から７日目まで振とう培養（１００ｒｐｍ）でしたものを遠心分離し（３，５００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，２５℃），その上清を試料とした。
【００１５】
４）血小板凝集作用の測定
血小板凝集はＷｉｓｔｅｒ系雄性ラット尾静脈から採取したチトラート血を遠心分離（８，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，２５℃）で得られた多血小板血漿（ＰＲＰ）と遠心分離（３，５００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，２５℃）で得られた乏血小板血漿（ＰＰＰ）に分け，３０分静置しておく。ＰＲＰ５０μｌ，コントロール（蒸留水）あるいは試料１０〜５０μｌ，タイロード緩衝液（ｐＨ７．３５）１００〜１４０μｌを混合後，３７℃，５分間プレインキュベーションし，凝集惹起物質として３００μＭ ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ社）２２μｌを加えて３７℃で間血小板凝集率をアグリゴメーター（ＰＡＴ−４Ａ：メバニクス）で測定した。また，少数ながら凝集惹起物質として，コラーゲン（Ｈｏｒｍ ｏｎ Ｃｈｅｍｉｃ），トロンビン（持田製薬），エピネフリン（第一製薬）を使用した。ＰＰＰの血小板凝集率を１００％とし光透過率で血小板凝集を測定した。
【００１６】
実験結果
１）市販品の血小板凝集阻害活性
市販のテンペ５０ｇをリービッヒ蒸留装置に入れ，温度を徐々に上げていき，滴下が始まってから（９２〜９４℃），試験管に０．５ｍｌ（Ｆｒａｃｔ．１〜３）ずつ採取し，各分画の血小板凝集阻害活性を測定した。
【００１７】
ラットのＰＲＰはＡＤＰ（３０μＭ）で凝集するが，それに対する各エキスの阻害率は各々表１（図１）のようになった。即ち，Ｆｒａｃｔ．の１本目に強い活性が認められた。なお，この蒸留操作を行わなかった場合，活性は全く認められなかった。
【００１８】
【表１】
【００１９】
２）固体培養での血小板凝集阻害活性
ラットのＰＲＰはＡＤＰ（３０μＭ）で凝集するが，それに対する各エキスの阻害率は各々表２，３（図２，３）のようになった。いずれの蒸留操作がなければ見えない活性がＦｒａｃｔ．１〜３で確認された。
【００２０】
【表２】
【００２１】
【表３】
【００２２】
なお，納豆を同様に試験してみたが，蒸留分画に活性は見られなかった。また市販品Ｂの分画で活性のあるもの（表３）を水で透析（Ｍ．Ｗ．約１万）してみたが，活性は全く残らなかった。つまり，活性を有する物質は低分子（Ｍ．Ｗ．約１万以下）であることが分かった。
【００２３】
２）振とう培養での血小板凝集阻害活性
ラットＰＲＰはＡＤＰ（３０μＭ）で凝集するが，それに対し振とう培養では２日目の上清（図４）に強い血小板凝集阻害活性が認められた。なお，４日目，７日目では阻害活性は除々に消失していくことが分かった（表４）。一番強かった２日目の活性分画は，コラーゲン，トロンビン，エピネフリンの凝集に対しても阻害活性を示し，また常圧蒸留で初留の所に得られることを確認した。
【００２４】
【表４】
【００２５】
以上，Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｌｉｇｏｓｐｏｒｅ製テンペはリービッヒ蒸留管（常圧）で初留に当る分画に強い血小板凝集阻害活性のあることを知った。
【００２６】
発明者等は多くの発酵製品で血小板への影響をみてきたが，常圧蒸留によって血小板凝集阻害活性を有する物質が抽出されたのは初めてである。
【産業上の利用可能性】
【００２７】
本発明による抽出物は，熱安定性で低分子血小板凝集阻害剤および機能性食品に利用可能である。また，無色透明でありさわやかなバラ様の香りがするため，香料として添加した場合，食品の風味をよくするなどの効果が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図２は，市販品２社の蒸留分画中の血小板凝集阻害率を示すグラフであり，ＰＲＰ５０μｌ，試料５０μｌ，タイロード緩衝液１００μｌ，ＡＤＰ２２μｌで測定。
【図２】 図２は，テンペ菌Ａによる固体培養の蒸留分画中の血小板凝集阻害率を示すグラフであり，ＰＲＰ５０μｌ，試料２５μｌ，タイロード緩衝液１２５μｌ，ＡＤＰ２２μｌで測定。
【図３】 図３は，テンペ菌Ｂによる固体培養の蒸留分画中の血小板凝集阻害率を示すグラフであり，ＰＲＰ５０μｌ，試料２５μｌ，タイロード緩衝液１２５μｌ，ＡＤＰ２２μｌで測定。
【図４】 図４は，テンペ菌Ｂによる振とう培養の日数による血小板凝集阻害率を示すグラフであり，ＰＲＰ５０μｌ，試料１０μｌ，タイロード緩衝液１４０μｌ，ＡＤＰ２２μｌで測定。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属を種菌とした発酵物を原料として得られる血小板凝集阻害物質。
【請求項１】
Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属を種菌とした発酵物を原料として得られる血小板凝集阻害物質。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−２４８１６３（Ｐ２０１０−２４８１６３Ａ）
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１１３０５５（Ｐ２００９−１１３０５５）
【出願日】平成２１年４月１０日（２００９．４．１０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 第５５回社団法人日本家政学会中国・四国支部研究発表会要旨集
【出願人】（５９２１９７０６１）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月１０日（２００９．４．１０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 第５５回社団法人日本家政学会中国・四国支部研究発表会要旨集
【出願人】（５９２１９７０６１）
【Ｆターム（参考）】
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