血液適合性に優れた免疫グロブリン吸着材、及び吸着器
【課題】全血処理を可能とする良好な血液適合性を有する免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着材を提供する。
【解決手段】分子量が１０００以上１００００００以下の多糖類と疎水性アミノ酸またはその誘導体を固定化した吸着材３は、全血処理を可能とする良好な血液適合性と、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に対する吸着性能を両立することが可能となる。血球成分の付着や非特異的な吸着が抑制・低減されるため、従来技術では困難とされた直接血液中から免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着することが可能となる。
【解決手段】分子量が１０００以上１００００００以下の多糖類と疎水性アミノ酸またはその誘導体を固定化した吸着材３は、全血処理を可能とする良好な血液適合性と、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に対する吸着性能を両立することが可能となる。血球成分の付着や非特異的な吸着が抑制・低減されるため、従来技術では困難とされた直接血液中から免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着することが可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は良好な血液適合性を有する免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着材に関する。
【背景技術】
【０００２】
拡張型心筋症（ＤＣＭ）は心室の筋肉の収縮が極めて悪くなり、心臓が拡張してしまう疾患で肥大型心筋症に比べると極めて予後が悪い。我が国では診断されてから５年後に生存している人は約５０％とされている。拡張型心筋症の治療は、心臓移植が根治療法として望まれるが待機数に対して提供数が不足しており、心不全に対する対症療法が主体となっている。また、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、β遮断薬の投与により心機能や予後が改善する症例が報告されているが、より有効な治療薬や治療法が望まれている。近年、ＤＣＭ患者の血液中に、自己に対して反応性を持つ免疫グロブリンや免疫グロブリン複合体が多種検出されており、これらがＤＣＭ発症の引き金となるデータが報告されている。
【０００３】
また慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病などの自己免疫疾患、あるいは糸球体腎炎、臓器移植の拒絶反応、腫瘍、感染症などの疾患において、血液中に存在する免疫グロブリンや免疫グロブリン複合体が、疾患および現象の原因または進行に密接な関係を有することが明らかになりつつある。
【０００４】
そこで、血液、血漿などの体液中から免疫グロブリンあるいは免疫グロブリン複合体を吸着除去することにより、上記疾患の進行を防止し、症状を軽減し、さらには治癒を促進することを期待して、いくつかの吸着除去材の利用が試みられてきている。例えば、特許文献１によれば、免疫グロブリンとの結合性を有するプロテインＡをマトリックス上に固定化した、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）や、その複合体に特異性が高い吸着材が知られている。また、特許文献２では、疎水性化合物を不溶性担体上に固定化した吸着材により、免疫グロブリンの一種である糖脂質抗体や、その複合体が吸着されることが知られている。
【０００５】
しかしながら、これまで試みられてきた吸着材、例えば特許文献１の吸着材では、リガンドであるプロテインＡが黄色ブドウ球菌由来の分子量約４．２万ダルトンの異種タンパク質であるため、体液に接触させて使用する際にプロテインＡの溶出によってその抗原性から生ずる副作用の危険性があること、滅菌時の安定性に問題があり滅菌方法が限定されること、固定化後の保存安定性に欠けることなどの欠点がある。またリガンドのプロテインＡが非常に高価であることから再利用することが前提になっており、使用が血漿処理に限定されること、安全性に対する懸念があることなど他にも多くの欠点がある。
【０００６】
また、特許文献３には、免疫吸着材として、イムノグロブリンやイムノグロブリン複合体の吸着材が記載されているものの、疎水性化合物を固定化していることから血液適合性が悪く血球成分を含む全血を処理できないという欠点がある。
【０００７】
このように従来知られている免疫グロブリンや免疫グロブリン複合体を吸着するための吸着材は、安全性、安定性、高価、血液適合性などの観点から、多くの問題が残されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０００−５００６４９号公報
【特許文献２】特開平９−７７７９０号公報
【特許文献３】特開昭５７-１２２８７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上の従来技術が有する課題に対し、本発明が解決しようとする課題は血液適合性が非常に優れた全血処理を可能とする、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の安価な吸着材、及び吸着器を提供することである。または、上記吸着材や吸着器を用いた免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の除去方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、元来困難であった全血処理を可能とする免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着材および吸着方法について鋭意検討を行った。その結果、驚くべきことに、分子量が１０００以上１００００００以下の多糖類と疎水性アミノ酸またはその誘導体を固定化した吸着材が非常に良好な血液適合性を有し、尚且つ、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を効率良く吸着しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、第一に水不溶性担体に分子量が１０００以上１００００００以下の多糖類と疎水性アミノ酸またはその誘導体を固定化した吸着材であって、疎水性アミノ酸の固定化量が膨潤体積の吸着材１ｍＬ当り１０μｍｏｌ以上５００μｍｏｌ以下である、非常に血液適合性に優れた全血処理可能な免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着材に関する。第二として、上記吸着材を免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を含む血球成分を含む液と接触させることを特徴とする免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の除去方法に関する。第三として上記吸着材が充填された免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着器に関する。
【００１２】
本発明は具体的には以下の発明を包含する。
(１) 水不溶性担体に分子量１０００以上１００００００以下の多糖類と、疎水性アミノ酸及びその誘導体が固定化された、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着材。
(２) 多糖類の分子量が５０００以上１００００００以下である、（１）記載の吸着材。
(３) 疎水性アミノ酸の固定化量が膨潤体積の吸着材１ｍＬ当り１０μｍｏｌ以上５００μｍｏｌ以下である、（１）または（２）に記載の吸着材。
(４) 疎水性アミノ酸及びその誘導体がトリプトファン、フェニルアラニンまたはそれらの誘導体であることを特徴とする、（１）から（３）に記載の吸着材。
(５) 疎水性アミノ酸がトリプトファンであることを特徴とする、（１）から（４）に記載の吸着材。
(６) 多糖類がアガロース、セルロース、デキストラン、デキストラン硫酸、およびそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、（１）から（５）に記載の吸着材。
(７) 多糖類がデキストランまたはデキストラン硫酸であることを特徴とする、（１）から（６）に記載の吸着材。
(８) 水不溶性担体が多孔質担体であることを特徴とする、（１）から（７）に記載の吸着材。
(９) 多孔質担体がビニルアルコールを基本単位として構成させるポリマー粒子である、（８）に記載の吸着材。
(１０)上記吸着材に血液を接触させることを特徴とする、血液中の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の除去方法。
(１１) 液の入口および出口を有しかつ、吸着材の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、上記吸着材を充填してなる、血液中の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着器。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、血球成分の付着や非特異的な吸着が抑制・低減されるため、従来技術では困難とされた直接血液中から免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着することが可能となり、血漿分離を必要としない。更にこの吸着材はリガンドとしてペプチドやタンパク質を必要としないため、非常に安価に製造することも可能である。従って、本発明は既存材料や既存方法とは一線を画す新規な材料・方法であり、医療分野へ深く貢献することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明における吸着材を詰めた吸着器の一実施例の概略断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に本発明の最良の形態について詳細に説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではない。
【００１６】
本発明における多糖類としては、具体的にはアガロース、セルロース、デキストラン、デキストラン硫酸、及びそれらの誘導体など親水性の高い多糖が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。本発明における上記多糖類の分子量は、１０００以上であり、１００００００以下である。分子量が１０００未満の多糖の場合、水不溶性担体の表面ではなく内部に多く固定化されてしまい、血液成分が接する水不溶性担体表面における上記多糖の固定化量が少なくなり、血液適合性向上を示さない。本発明においては、多糖の分子量が１０００以上であることにより、水不溶性担体の内部ではなく、血球成分が直接接する表面に多く固定化されるため、大幅な血液適合性改善につながる。さらに、血液適合性の観点から、分子量は５０００以上が好ましい。また多糖類は分子量が増加するにつれ粘度も上昇するため、吸着材を作製する上での作業性より、本発明における多糖類の分子量は１００００００以下が実質的である。なお、これらの多糖は単独で使用しても複数の併用でも構わない。
【００１７】
本発明における疎水性アミノ酸やその誘導体の例としては、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジンなどの環状側鎖を有するアミノ酸、またはトリプトファンエチルエステル、トリプトファンメチルエステルなどの疎水性アミノ酸エステル類やトリプトアミン、トリプトファノールなどのインドール環を有する疎水性アミノ酸誘導体等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるわけではない。またこれらの疎水性アミノ酸やその誘導体はＬ体、Ｄ体、ＤＬ体、これらの混合物であってもよい。さらに２種以上の混合物であっても良い。これらの疎水性アミノ酸あるいはその誘導体の中でも、１つ目に天然型アミノ酸であり安全性が高いこと、２つ目に免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に対して親和性が高いこと、以上の２点よりＬ−トリプトファンが好ましく用いられる。
【００１８】
本発明における疎水性アミノ酸またはその誘導体の固定化量は、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に対する親和性の観点から膨潤体積の吸着材１ｍＬ当り１０μｍｏｌ以上であることが好ましく、疎水性が高く血液に対する適合性が悪くなることから膨潤体積の吸着材１ｍＬ当り５００μｍｏｌ以下が好ましい。更に膨潤体積の吸着材１ｍＬ当り１５以上１００以下がより好ましい。吸着材における疎水性アミノ酸またはその誘導体の固定化量を測定する方法としては、具体的には、上記化合物が窒素を含む化合物である場合は窒素含有量による測定、化合物がアミノ基やカルボン酸などアニオン性やカチオン性である場合は滴定による測定、化合物がインドール環を含むものであれば強酸性条件下でｐ−メチルベンズアルデヒドなどのアルデヒドを化合物内に存在するインドール環に縮合させるときに発色する性質を利用した定量法、化合物の吸光や蛍光を利用して測定する方法などが挙げられる。
【００１９】
本発明における疎水性アミノ酸またはその誘導体の固定化量（Ａ）と、多糖類の固定化量（Ｂ）とのモル比（Ａ／Ｂ）が３０以上５００以下であることが好ましい。さらに、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に対する吸着性能と血液適合性の観点からモル比は４０以上４００以下がより好ましい。さらに好ましくは１００以上３５０以下である。
【００２０】
本発明における水不溶性担体とは、常温常圧で固体であり、水不溶性であることを意味する。本発明における水不溶性担体は、球状、粒状、糸状、中空状、平膜状等、形状は特に問わず、その大きさも特に限定されない。水不溶性担体は比表面積が大きいほど免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に対する性能が優れることから、球状または粒状が特に好ましく用いられる。球状または粒状の担体は適当な大きさの細孔を多数孔有する、すなわち、多孔構造を有する担体であることが好ましい。多孔構造を有する担体とは、基礎高分子母体が微小球の凝集により１個の球状粒子を形成する際に微小球の集塊によって形成される空間（マクロポアー）を有する担体のばあいは当然であるが、基礎高分子母体を構成する１個の微小球内の核と核との集塊の間に形成される細孔を有する担体の場合、あるいは三次元構造（高分子網目）を有する共重合体が親和性のある有機溶媒で膨潤された状態の時に存在する細孔（ミクロポアー）を有する担体の場合も含まれる。
【００２１】
また吸着材の単位体積あたりの吸着能から考えて、多孔構造を有する水不溶性担体は、表面多孔性よりも全多孔性が好ましく、また空孔容積および比表面積は、吸着性が損なわれない程度に大きいことが好ましい。
水不溶性担体が球状または粒状である場合、本発明の吸着材が全血処理である点を考えれば担体の平均粒径は大きいほど良いが、吸着効率の面では平均粒径は小さいほど良い。本発明における吸着材として、全血処理と良好な吸着性能が発揮できる吸着材の平均粒径は１００μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましく、良好な血球通過性と吸着性能が発揮できる点からさらに好ましくは２００μｍ以上８００μｍ以下であり、さらに好ましくは４００μｍ以上６００μｍ以下である。
【００２２】
本発明における水不溶性担体の材料は特に限定されないが、セルロース、酢酸セルロース、デキストリンなどの多糖類からなる有機担体、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリビニルアルコールなどの合成高分子が代表として挙げられる。また、これらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体等も好ましい。さらに、これらは架橋されているものであっても良い。本発明における水不溶性担体は非特異的吸着が少なく親水性が高いこと、活性基を導入するための官能基が必要なことから水酸基を有していることが望ましく、特にセルロースやポリビニルアルコールが好ましい。
【００２３】
本発明における水不溶性担体へ多糖類や疎水性アミノ酸やその誘導体を固定化する方法としては、水不溶性担体へ活性基を導入し、導入した活性基に対して反応性を示す官能基を有する化合物を固定化する方法を用いることができる。導入する活性基としては、特に限定されないが、具体的には、エポキシド、ハロゲン化シアン、ハロゲン化トリアジン、ブロモアセチルブロミド、アルデヒド等が挙げられる。中でも、容易にその活性基を導入できること、温和な条件下でリガンドまたはリンカーを固定化できること、固定化されたリガンドまたはリンカーが安定であり溶出しにくいこと、工業的に大量に取扱うことが可能であること、目的に応じて活性基導入量を調整できること、から、活性基はエポキシドが好ましい。エポキシドは水酸基、アミノ基、チオール基と容易に反応し、副反応は少なく、定量的にエーテル結合、アルキルアミン結合、チオエーテル結合を形成する。また、エポキシ基は水溶液中で分解させるとグリコールとなり、毒性が低くなることも利点である。
【００２４】
このようなエポキシ基を導入するためのエポキシ化剤としてはエピクロロヒドリン、ビスエポキシド、ポリエポキシドが、エポキシ基を担体に導入しやすいこと、そして、上記エポキシ化剤によって導入されたエポキシ基とリガンドとの反応をコントロールしやすいこと、から好ましい。ここでいうビスエポキシド、ポリエポキシドとは、エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，４―ブタンジオールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、シクロヘキサンジメタノールジグリシジルエーテルなどの１分子内に２個または３個以上のエポキシ基を持つ化合物を指す。
【００２５】
活性基導入の反応温度は、例えばエピクロロヒドリンの場合は、低温では反応速度が遅く、高温では副反応の架橋が起こりやすくなるため、１０℃から６０℃の範囲が好ましい。反応の時間は、希望する活性基量を考慮し、数分から数時間程度の反応時間を選ぶことができる。ビスエポキシドの場合もエピクロロヒドリンの場合と同様の条件で、担体に活性基を導入可能であるが、反応系に促進剤として水素化ホウ素ナトリウムのような還元剤を少量加えることもよい。
【００２６】
本発明のエポキシ導入量は、次の方法によって求められる。エポキシ基を導入した担体をある一定量、例えば６ｍＬ測り取り、グラスフィルター上、減圧下で１５分、水分除去する。約１．５ｇ測り取り、そこに１．３Ｍチオ硫酸ナトリウム水溶液４．５ｍＬを加え、４５℃で３０分反応する。エポキシ基とチオ硫酸ナトリウムの反応によって生じるＯＨイオンを、フェノールフタレインを指示薬とし、０．０１Ｎ塩酸または０．１Ｎ塩酸でフェノールフタレインの着色がなくなるまで滴定を繰り返し、総滴定量によりエポキシ基の量を求める。
【００２７】
このようにエポキシ基を結合させた担体に、アミノ基、水酸基、チオール基などの活性水素を有する官能基を持つリガンドが結合できる。固定化条件はリガンドの化学的性質や固定化させる官能基に応じて、任意に選定できる。例えば、水溶液中、ｐＨ７〜１３程度の塩基性条件下で反応させる。炭酸、ホウ酸、リン酸などの緩衝液を用いてｐＨ調整を行うとよい。反応温度はリガンドの種類により任意に選べばよいが、通常は０℃〜８０℃程度であり、反応時間も１時間から４８時間が好ましい。リガンド固定化量はリガンドの種類により選ばれるが、一般的には反応中に残った未反応のリガンド濃度と仕込みリガンド濃度との差を分光光度計などにより定量して求める。他にもリガンドの種類により、滴定や元素分析により求めることもできる。過剰なエポキシは、グリシン、エタノールアミン、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタンなどの試薬によるブロッキング処理や、アルカリや酸で加水分解して処理することも可能である。
【００２８】
こうして得られるリガンドが固定化された担体は、非常に安定な共有結合により結合されており、熱的に安定である。リガンド自体が安定であれば、高圧蒸気滅菌が可能であり、滅菌後のリガンド溶出やそれに伴う求める性能低下も生じない。リガンドが熱滅菌に不適な場合でも、エチレンオキサイドガスによる滅菌が可能である。以上より、医療用途としても大変優れた性能を有している。
【００２９】
本発明における免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体とは例えば、自己免疫疾患における自己抗体および／または免疫複合体などが考えられる。さらに具体的にはリウマチ因子、抗核抗体、抗ＤＮＡ抗体、抗リンパ球抗体、抗赤血球抗体、抗血小板抗体、抗アセチルコリンレセプター抗体、血清脱随抗体、抗サイログロブリン抗体、抗マイクロゾーム抗体、抗大腸抗体、抗平滑筋抗体、抗表皮細胞間抗体、抗基底膜抗体、抗プロテオグリカン抗体、抗コラーゲン抗体、抗胃内因子抗体、抗甲状腺ミクロソーム抗体、抗動脈抗体、抗アドレノセプター抗体等の自己抗体および／またはその免疫複合体などである。
【００３０】
本発明の吸着材を用いて、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着する方法としては最も簡便な方法としては血液を取り出してバッグなどに貯留し、これに吸着材を混合して悪性物質を吸着した後、吸着材を濾別して悪性物質が除去された血液を得る方法がある。この方法は、血液を原材料として医薬品（例：血液製剤、ワクチン、遺伝子組換製剤）又は医療材料を製造する際にも、適用することができる。次の方法は血液の入口と出口を有し、出口には血液は通過するが吸着材は通過しないフィルターを装着した容器に吸着材を充填し、これに血液を流す方法がある。いずれの方法も用いることができるが、後者の方法は操作も簡便であり、また体外循環回路に組み込むことにより患者の血液から効率よくオンラインで悪性物質を除去することが可能である。特に本発明の吸着材は血液適合性が非常に高いことから、血漿分離を必要とせず血球成分を含む血液を直接処理することができるため、オンラインで処理する後者に利用するのが最適である。また体外循環回路では吸着材を単独で用いることもできるが、他の体外循環治療システムとの併用も可能である。併用の例としては、人工透析回路などがあげられ、透析療法との組み合わせに用いることもできる。
【００３１】
次に、オンラインで体外循環する際の一実施例を、概略断面図である図１に基づき説明する。図１中、１は液体の流入口、２は液体の流出口、３は本発明にける吸着材、４および５は液体および液体に含まれる成分は通過できるが４の吸着材は通過できないフィルター、６はカラム、７は吸着器である。しかしながら、体外循環としての吸着器はこのような具体例に限定されるものではなく、液の入口、出口を有し、かつ吸着材の容器外への流出防止具を備えた容器内に前記吸着材を充填したものであれば、どのようなものでもよい。
【００３２】
前記流出防止具には、メッシュ、不織布、綿栓などのフィルターがあげられる。また、容器の形状、材質、大きさにはとくに限定はないが、形状としては筒状容器が好ましい。容器の材質として好ましいのは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的にはシリコンコートされたガラス、ポリプロピレン、塩化ビニール、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリメチルペンテンなどがあげられる。容器の容量は５０ｍｌ以上、１５００ｍｌ以下で、直径は２ｃｍ以上、２０ｃｍ以下が好ましい。容器の容量が５０ｍｌより小さいと吸着量が充分でなく、１５００ｍｌより大きいと体外循環量が多くなるので好ましくない。容器の直径が２ｃｍより小さいと線速が大きくなるため圧力損失が大きくなり好ましくない。２０ｃｍより大きいと取り扱いにくくなるうえ線速が小さくなるため凝固の危険性があり好ましくない。効果的な吸着量があり、安全性に優れているという点から容量は１００ｍｌ以上、８００ｍｌ以下で、直径は３ｃｍ以上、１５ｃｍ以下がさらに好ましく、容量は１５０ｍｌ以上、４００ｍｌ以下で、直径は４ｃｍ以上、１０ｃｍ以下が特に好ましい。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例において本発明に関して詳細に述べるが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００３４】
（参考例１）
国際公開公報ＷＯ２００６−４６５８９と同様の方法にて、以下の手順によりポリビニルアルコール担体を得た。
【００３５】
攪拌翼を有する２Ｌセパラブルフラスコ（重合反応器）と、液適生成装置、単量体混合タンク、分散媒タンクから構成される重合装置を用いて、重合を行った。
【００３６】
重合反応器中に、水４３８．２ｇ、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウムの３重量％水溶液１．８７ｇ、微粒子状の第三リン酸カルシウムの１０重量％スラリー１２７．２ｇを仕込み、穏やかに撹拌させておいた。
【００３７】
液滴生成装置として、分散媒を満たしたカラムに単量体混合物を噴出するノズルを挿入し、ノズルの上端は孔径０．１７ｍｍの小孔を６個有するオリフィス板よりなり、下端には振動を伝達する振動板を設置し、振動板を加振器と接続したものを用いた。カラムには分散媒タンクより分散媒を供給する導入管を接続し、ノズルには単量体混合物タンクより単量体混合物を供給する導入管を接続した。単量体混合物の供給には定量性が高く脈動の少ない２連プランジャーポンプを使用した。
【００３８】
単量体混合物タンクより、酢酸ビニル１００重量部、トリアリルイソシアヌレート（ＴＡＩＣ）２０．７重量部、酢酸エチル１９２重量部、ヘプタン６４重量部、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−６５）４．９重量部よりなる単量体混合物５６６ｇを、２７．６ｍＬ／ｍｉｎの速度で液滴生成装置の導入管に供給し、液滴生成装置のノズルを経由して重合反応器に仕込んだ。それと同時に分散媒タンクより、分散媒として１．２重量％のポリビニルアルコールおよび５６ｐｐｍの亜硝酸ナトリウムを含む水溶液６６３ｇをカラムに供給し、液滴生成装置を経由して重合反応器に仕込んだ。
【００３９】
この際、単量体混合物には加振器により周波数４００Ｈｚ、強度０．４Ｇの機械的振動を与えた。ノズル孔より噴出する単量体混合物は、該機械的振動により分割されて実質的に均一な径の液滴群をカラム中に形成し、同時に供給される分散媒とともに重合反応器内へ送られた。
【００４０】
上記液滴生成装置で生成した液滴群を重合反応器内へ導入した後、重合反応器内の窒素置換を行い、内温を６５℃に５時間保持して重合させた。酢酸ビニルの重合転化率は５１％であった。次いでセパラブルフラスコの内容物に塩酸を加えてｐＨを２以下に調整し第三リン酸カルシウムを溶解させ、その後水で良く洗浄した。洗浄液のｐＨが中性付近になったことを確認した後、水をアセトンで置換し、重合によって得られた粒子をアセトンで十分に洗浄した。次いでアセトンを水で置換した後、酢酸ビニル単位に対して過剰量となるよう下式の量の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を水溶液として加えた。
【００４１】
ＮａＯＨ（固形分重量）＝粒子乾燥重量／８６．０９×４０×１．５
なお水に対するＮａＯＨ濃度が４重量％になるように水量を調整した。これを撹拌下、反応温度４０℃で６時間保持して鹸化を行った。その後、洗浄液のｐＨが中性付近になるまで水洗し、さらに８０℃の温水で十分に洗浄を行った。次いで１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理を行い、ポリビニルアルコール担体を得た。この担体の体積平均粒径は約４５０μｍであった。
【００４２】
（実施例１）
参考例１にて得られたポリビニールアルコール担体をグラスフィルター上に流し入れた後、減圧下で溶媒を除去し乾燥した。乾燥状態の担体１００ｇ、ジメチルスルホキシド４８０ｍＬ、エピクロロヒドリン４２０ｇ、５０％水酸化ナトリウム溶液４０ｇを混合し、４０℃で８時間反応させ、エポキシ化担体を得た。このエポキシ化担体のエポキシ導入量は１ｍＬ当たり１００μｍｏｌであった。
【００４３】
エポキシ化担体６０ｍＬにデキストラン硫酸（分子量５００，０００）２０ｇを加え、全量を１２０ｍＬに調整した後、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを９．５とした。この混合液を４０℃で３０時間反応させ、デキストラン硫酸固定化担体（以下、ＤＳ担体と略す）を得た。トルイジンブル―による測定や重量変化より、ＤＳ担体は１ｍＬ当たり１．６ｍｇのデキストラン硫酸が固定化されていた。
【００４４】
次に、ＤＳ担体３０ｍＬにＬ−トリプトファン２．５ｇを加え、ｐＨ１０の０．５Ｍ炭酸緩衝液中で５０℃、８時間反応させ、デキストラン硫酸とＬ−トリプトファン固定化担体（以下、ＤＳ−Ｔｒｐ担体と略す）を得た。非水滴定によると、このＤＳ−Ｔｒｐ担体は１ｍＬ当たり約１７ｍｇのＬ−トリプトファンが固定化されていた。
【００４５】
（実施例２）
デキストラン硫酸（分子量５００，０００）の代わりにデキストラン（分子量２００，０００）を使用すること以外は実施例１と同様にして、デキストランとＬ−トリプトファン固定化担体（以下、ＤＸ−Ｔｒｐ担体と略す）を得た。このＤＸ−Ｔｒｐ担体は１ｍＬ当たり１４ｍｇのＬ−トリプトファンが固定化されていた。
【００４６】
（比較例１）
デキストラン硫酸（分子量５００，０００）の固定化操作を実施しないこと以外は実施例１と同様にしてＬ−トリプトファン固定化担体（以下、Ｔｒｐ担体と略す）を得た。このＴｒｐ担体は担体１ｍＬ当たり１７ｍｇのＬ−トリプトファンが固定化されていた。
【００４７】
（比較例２）
デキストラン硫酸（分子量５００，０００）の代わりにデキストラン硫酸（分子量４，０００）９ｇを使用すること以外は実施例１と同様にして、デキストラン硫酸とＬ−トリプトファン固定化担体（以下、ＤＳ−Ｔｒｐ担体２と略す）を得た。このＤＳ−Ｔｒｐ担体２は１ｍＬ当たり０．５ｍｇのデキストラン硫酸、１０ｍｇのＬ−トリプトファンが固定化されていた。
【００４８】
（比較例３）
デキストラン硫酸（分子量５００，０００）の代わりにデキストラン硫酸（分子量４，０００）１４ｇを使用すること以外は実施例１と同様にして、デキストラン硫酸とＬ−トリプトファン固定化担体（以下、ＤＳ−Ｔｒｐ担体３と略す）を得た。このＤＳ−Ｔｒｐ担体３は１ｍＬ当たり０．８ｍｇのデキストラン硫酸、８ｍｇのＬ−トリプトファンが固定化されていた。
【００４９】
（評価）
上記の５種類の担体を、両端に目開き１５０μmのポリエチレンテレフタレート製メッシュを装着した内径１０ｍｍ、長さ９０ｍｍのアクリル製カラムに充填し、血液１ｍｌに対し５単位のヘパリンを添加し抗凝固した健常人血液４５ｍｌを、流速２．０ｍｌ／ｍｉｎ、６０分間循環で通血し、血液中の赤血球数、白血球数、および血小板数を各々測定した。各値は原血液中の血球濃度を１００とした場合の数値で示した。結果は表１、表２、表３に示した。
【００５０】
また、上記の５種類の担体０．５ｍＬを、クエン酸で抗凝固された血漿２．５ｍＬと、３７℃で２時間接触させた。回収した上清濃度のＩｇＧ濃度から、担体の代わりに同体積の生理食塩水を用いた場合をコントロールとして、以下の式の通りＩｇＧの吸着率を算出した。結果を表４に示した。
吸着率＝（コントロール中のＩｇＧ濃度―担体に接触させた溶液のＩｇＧ濃度）÷コントロール中のＩｇＧ濃度
【００５１】
【表１】
【００５２】
【表２】
【００５３】
【表３】
【００５４】
【表４】
【符号の説明】
【００５５】
１ 液体の流入口
２ 液体の流出口
３ 吸着材
４、５ 液体および液体に含まれる成分は通過できるが、吸着材は通過できないフィルター
６ カラム
７ 吸着器
【技術分野】
【０００１】
本発明は良好な血液適合性を有する免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着材に関する。
【背景技術】
【０００２】
拡張型心筋症（ＤＣＭ）は心室の筋肉の収縮が極めて悪くなり、心臓が拡張してしまう疾患で肥大型心筋症に比べると極めて予後が悪い。我が国では診断されてから５年後に生存している人は約５０％とされている。拡張型心筋症の治療は、心臓移植が根治療法として望まれるが待機数に対して提供数が不足しており、心不全に対する対症療法が主体となっている。また、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、β遮断薬の投与により心機能や予後が改善する症例が報告されているが、より有効な治療薬や治療法が望まれている。近年、ＤＣＭ患者の血液中に、自己に対して反応性を持つ免疫グロブリンや免疫グロブリン複合体が多種検出されており、これらがＤＣＭ発症の引き金となるデータが報告されている。
【０００３】
また慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病などの自己免疫疾患、あるいは糸球体腎炎、臓器移植の拒絶反応、腫瘍、感染症などの疾患において、血液中に存在する免疫グロブリンや免疫グロブリン複合体が、疾患および現象の原因または進行に密接な関係を有することが明らかになりつつある。
【０００４】
そこで、血液、血漿などの体液中から免疫グロブリンあるいは免疫グロブリン複合体を吸着除去することにより、上記疾患の進行を防止し、症状を軽減し、さらには治癒を促進することを期待して、いくつかの吸着除去材の利用が試みられてきている。例えば、特許文献１によれば、免疫グロブリンとの結合性を有するプロテインＡをマトリックス上に固定化した、ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）や、その複合体に特異性が高い吸着材が知られている。また、特許文献２では、疎水性化合物を不溶性担体上に固定化した吸着材により、免疫グロブリンの一種である糖脂質抗体や、その複合体が吸着されることが知られている。
【０００５】
しかしながら、これまで試みられてきた吸着材、例えば特許文献１の吸着材では、リガンドであるプロテインＡが黄色ブドウ球菌由来の分子量約４．２万ダルトンの異種タンパク質であるため、体液に接触させて使用する際にプロテインＡの溶出によってその抗原性から生ずる副作用の危険性があること、滅菌時の安定性に問題があり滅菌方法が限定されること、固定化後の保存安定性に欠けることなどの欠点がある。またリガンドのプロテインＡが非常に高価であることから再利用することが前提になっており、使用が血漿処理に限定されること、安全性に対する懸念があることなど他にも多くの欠点がある。
【０００６】
また、特許文献３には、免疫吸着材として、イムノグロブリンやイムノグロブリン複合体の吸着材が記載されているものの、疎水性化合物を固定化していることから血液適合性が悪く血球成分を含む全血を処理できないという欠点がある。
【０００７】
このように従来知られている免疫グロブリンや免疫グロブリン複合体を吸着するための吸着材は、安全性、安定性、高価、血液適合性などの観点から、多くの問題が残されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２０００−５００６４９号公報
【特許文献２】特開平９−７７７９０号公報
【特許文献３】特開昭５７-１２２８７５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以上の従来技術が有する課題に対し、本発明が解決しようとする課題は血液適合性が非常に優れた全血処理を可能とする、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の安価な吸着材、及び吸着器を提供することである。または、上記吸着材や吸着器を用いた免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の除去方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、元来困難であった全血処理を可能とする免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着材および吸着方法について鋭意検討を行った。その結果、驚くべきことに、分子量が１０００以上１００００００以下の多糖類と疎水性アミノ酸またはその誘導体を固定化した吸着材が非常に良好な血液適合性を有し、尚且つ、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を効率良く吸着しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、第一に水不溶性担体に分子量が１０００以上１００００００以下の多糖類と疎水性アミノ酸またはその誘導体を固定化した吸着材であって、疎水性アミノ酸の固定化量が膨潤体積の吸着材１ｍＬ当り１０μｍｏｌ以上５００μｍｏｌ以下である、非常に血液適合性に優れた全血処理可能な免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着材に関する。第二として、上記吸着材を免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を含む血球成分を含む液と接触させることを特徴とする免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の除去方法に関する。第三として上記吸着材が充填された免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着器に関する。
【００１２】
本発明は具体的には以下の発明を包含する。
(１) 水不溶性担体に分子量１０００以上１００００００以下の多糖類と、疎水性アミノ酸及びその誘導体が固定化された、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着材。
(２) 多糖類の分子量が５０００以上１００００００以下である、（１）記載の吸着材。
(３) 疎水性アミノ酸の固定化量が膨潤体積の吸着材１ｍＬ当り１０μｍｏｌ以上５００μｍｏｌ以下である、（１）または（２）に記載の吸着材。
(４) 疎水性アミノ酸及びその誘導体がトリプトファン、フェニルアラニンまたはそれらの誘導体であることを特徴とする、（１）から（３）に記載の吸着材。
(５) 疎水性アミノ酸がトリプトファンであることを特徴とする、（１）から（４）に記載の吸着材。
(６) 多糖類がアガロース、セルロース、デキストラン、デキストラン硫酸、およびそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、（１）から（５）に記載の吸着材。
(７) 多糖類がデキストランまたはデキストラン硫酸であることを特徴とする、（１）から（６）に記載の吸着材。
(８) 水不溶性担体が多孔質担体であることを特徴とする、（１）から（７）に記載の吸着材。
(９) 多孔質担体がビニルアルコールを基本単位として構成させるポリマー粒子である、（８）に記載の吸着材。
(１０)上記吸着材に血液を接触させることを特徴とする、血液中の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の除去方法。
(１１) 液の入口および出口を有しかつ、吸着材の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、上記吸着材を充填してなる、血液中の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着器。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、血球成分の付着や非特異的な吸着が抑制・低減されるため、従来技術では困難とされた直接血液中から免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着することが可能となり、血漿分離を必要としない。更にこの吸着材はリガンドとしてペプチドやタンパク質を必要としないため、非常に安価に製造することも可能である。従って、本発明は既存材料や既存方法とは一線を画す新規な材料・方法であり、医療分野へ深く貢献することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明における吸着材を詰めた吸着器の一実施例の概略断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に本発明の最良の形態について詳細に説明するが、本発明は以下の説明に限定されるものではない。
【００１６】
本発明における多糖類としては、具体的にはアガロース、セルロース、デキストラン、デキストラン硫酸、及びそれらの誘導体など親水性の高い多糖が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるものではない。本発明における上記多糖類の分子量は、１０００以上であり、１００００００以下である。分子量が１０００未満の多糖の場合、水不溶性担体の表面ではなく内部に多く固定化されてしまい、血液成分が接する水不溶性担体表面における上記多糖の固定化量が少なくなり、血液適合性向上を示さない。本発明においては、多糖の分子量が１０００以上であることにより、水不溶性担体の内部ではなく、血球成分が直接接する表面に多く固定化されるため、大幅な血液適合性改善につながる。さらに、血液適合性の観点から、分子量は５０００以上が好ましい。また多糖類は分子量が増加するにつれ粘度も上昇するため、吸着材を作製する上での作業性より、本発明における多糖類の分子量は１００００００以下が実質的である。なお、これらの多糖は単独で使用しても複数の併用でも構わない。
【００１７】
本発明における疎水性アミノ酸やその誘導体の例としては、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ヒスチジンなどの環状側鎖を有するアミノ酸、またはトリプトファンエチルエステル、トリプトファンメチルエステルなどの疎水性アミノ酸エステル類やトリプトアミン、トリプトファノールなどのインドール環を有する疎水性アミノ酸誘導体等が挙げられるが、本発明はこれらに限定されるわけではない。またこれらの疎水性アミノ酸やその誘導体はＬ体、Ｄ体、ＤＬ体、これらの混合物であってもよい。さらに２種以上の混合物であっても良い。これらの疎水性アミノ酸あるいはその誘導体の中でも、１つ目に天然型アミノ酸であり安全性が高いこと、２つ目に免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に対して親和性が高いこと、以上の２点よりＬ−トリプトファンが好ましく用いられる。
【００１８】
本発明における疎水性アミノ酸またはその誘導体の固定化量は、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に対する親和性の観点から膨潤体積の吸着材１ｍＬ当り１０μｍｏｌ以上であることが好ましく、疎水性が高く血液に対する適合性が悪くなることから膨潤体積の吸着材１ｍＬ当り５００μｍｏｌ以下が好ましい。更に膨潤体積の吸着材１ｍＬ当り１５以上１００以下がより好ましい。吸着材における疎水性アミノ酸またはその誘導体の固定化量を測定する方法としては、具体的には、上記化合物が窒素を含む化合物である場合は窒素含有量による測定、化合物がアミノ基やカルボン酸などアニオン性やカチオン性である場合は滴定による測定、化合物がインドール環を含むものであれば強酸性条件下でｐ−メチルベンズアルデヒドなどのアルデヒドを化合物内に存在するインドール環に縮合させるときに発色する性質を利用した定量法、化合物の吸光や蛍光を利用して測定する方法などが挙げられる。
【００１９】
本発明における疎水性アミノ酸またはその誘導体の固定化量（Ａ）と、多糖類の固定化量（Ｂ）とのモル比（Ａ／Ｂ）が３０以上５００以下であることが好ましい。さらに、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に対する吸着性能と血液適合性の観点からモル比は４０以上４００以下がより好ましい。さらに好ましくは１００以上３５０以下である。
【００２０】
本発明における水不溶性担体とは、常温常圧で固体であり、水不溶性であることを意味する。本発明における水不溶性担体は、球状、粒状、糸状、中空状、平膜状等、形状は特に問わず、その大きさも特に限定されない。水不溶性担体は比表面積が大きいほど免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体に対する性能が優れることから、球状または粒状が特に好ましく用いられる。球状または粒状の担体は適当な大きさの細孔を多数孔有する、すなわち、多孔構造を有する担体であることが好ましい。多孔構造を有する担体とは、基礎高分子母体が微小球の凝集により１個の球状粒子を形成する際に微小球の集塊によって形成される空間（マクロポアー）を有する担体のばあいは当然であるが、基礎高分子母体を構成する１個の微小球内の核と核との集塊の間に形成される細孔を有する担体の場合、あるいは三次元構造（高分子網目）を有する共重合体が親和性のある有機溶媒で膨潤された状態の時に存在する細孔（ミクロポアー）を有する担体の場合も含まれる。
【００２１】
また吸着材の単位体積あたりの吸着能から考えて、多孔構造を有する水不溶性担体は、表面多孔性よりも全多孔性が好ましく、また空孔容積および比表面積は、吸着性が損なわれない程度に大きいことが好ましい。
水不溶性担体が球状または粒状である場合、本発明の吸着材が全血処理である点を考えれば担体の平均粒径は大きいほど良いが、吸着効率の面では平均粒径は小さいほど良い。本発明における吸着材として、全血処理と良好な吸着性能が発揮できる吸着材の平均粒径は１００μｍ以上１０００μｍ以下であることが好ましく、良好な血球通過性と吸着性能が発揮できる点からさらに好ましくは２００μｍ以上８００μｍ以下であり、さらに好ましくは４００μｍ以上６００μｍ以下である。
【００２２】
本発明における水不溶性担体の材料は特に限定されないが、セルロース、酢酸セルロース、デキストリンなどの多糖類からなる有機担体、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリビニルアルコールなどの合成高分子が代表として挙げられる。また、これらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体等も好ましい。さらに、これらは架橋されているものであっても良い。本発明における水不溶性担体は非特異的吸着が少なく親水性が高いこと、活性基を導入するための官能基が必要なことから水酸基を有していることが望ましく、特にセルロースやポリビニルアルコールが好ましい。
【００２３】
本発明における水不溶性担体へ多糖類や疎水性アミノ酸やその誘導体を固定化する方法としては、水不溶性担体へ活性基を導入し、導入した活性基に対して反応性を示す官能基を有する化合物を固定化する方法を用いることができる。導入する活性基としては、特に限定されないが、具体的には、エポキシド、ハロゲン化シアン、ハロゲン化トリアジン、ブロモアセチルブロミド、アルデヒド等が挙げられる。中でも、容易にその活性基を導入できること、温和な条件下でリガンドまたはリンカーを固定化できること、固定化されたリガンドまたはリンカーが安定であり溶出しにくいこと、工業的に大量に取扱うことが可能であること、目的に応じて活性基導入量を調整できること、から、活性基はエポキシドが好ましい。エポキシドは水酸基、アミノ基、チオール基と容易に反応し、副反応は少なく、定量的にエーテル結合、アルキルアミン結合、チオエーテル結合を形成する。また、エポキシ基は水溶液中で分解させるとグリコールとなり、毒性が低くなることも利点である。
【００２４】
このようなエポキシ基を導入するためのエポキシ化剤としてはエピクロロヒドリン、ビスエポキシド、ポリエポキシドが、エポキシ基を担体に導入しやすいこと、そして、上記エポキシ化剤によって導入されたエポキシ基とリガンドとの反応をコントロールしやすいこと、から好ましい。ここでいうビスエポキシド、ポリエポキシドとは、エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，４―ブタンジオールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、シクロヘキサンジメタノールジグリシジルエーテルなどの１分子内に２個または３個以上のエポキシ基を持つ化合物を指す。
【００２５】
活性基導入の反応温度は、例えばエピクロロヒドリンの場合は、低温では反応速度が遅く、高温では副反応の架橋が起こりやすくなるため、１０℃から６０℃の範囲が好ましい。反応の時間は、希望する活性基量を考慮し、数分から数時間程度の反応時間を選ぶことができる。ビスエポキシドの場合もエピクロロヒドリンの場合と同様の条件で、担体に活性基を導入可能であるが、反応系に促進剤として水素化ホウ素ナトリウムのような還元剤を少量加えることもよい。
【００２６】
本発明のエポキシ導入量は、次の方法によって求められる。エポキシ基を導入した担体をある一定量、例えば６ｍＬ測り取り、グラスフィルター上、減圧下で１５分、水分除去する。約１．５ｇ測り取り、そこに１．３Ｍチオ硫酸ナトリウム水溶液４．５ｍＬを加え、４５℃で３０分反応する。エポキシ基とチオ硫酸ナトリウムの反応によって生じるＯＨイオンを、フェノールフタレインを指示薬とし、０．０１Ｎ塩酸または０．１Ｎ塩酸でフェノールフタレインの着色がなくなるまで滴定を繰り返し、総滴定量によりエポキシ基の量を求める。
【００２７】
このようにエポキシ基を結合させた担体に、アミノ基、水酸基、チオール基などの活性水素を有する官能基を持つリガンドが結合できる。固定化条件はリガンドの化学的性質や固定化させる官能基に応じて、任意に選定できる。例えば、水溶液中、ｐＨ７〜１３程度の塩基性条件下で反応させる。炭酸、ホウ酸、リン酸などの緩衝液を用いてｐＨ調整を行うとよい。反応温度はリガンドの種類により任意に選べばよいが、通常は０℃〜８０℃程度であり、反応時間も１時間から４８時間が好ましい。リガンド固定化量はリガンドの種類により選ばれるが、一般的には反応中に残った未反応のリガンド濃度と仕込みリガンド濃度との差を分光光度計などにより定量して求める。他にもリガンドの種類により、滴定や元素分析により求めることもできる。過剰なエポキシは、グリシン、エタノールアミン、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタンなどの試薬によるブロッキング処理や、アルカリや酸で加水分解して処理することも可能である。
【００２８】
こうして得られるリガンドが固定化された担体は、非常に安定な共有結合により結合されており、熱的に安定である。リガンド自体が安定であれば、高圧蒸気滅菌が可能であり、滅菌後のリガンド溶出やそれに伴う求める性能低下も生じない。リガンドが熱滅菌に不適な場合でも、エチレンオキサイドガスによる滅菌が可能である。以上より、医療用途としても大変優れた性能を有している。
【００２９】
本発明における免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体とは例えば、自己免疫疾患における自己抗体および／または免疫複合体などが考えられる。さらに具体的にはリウマチ因子、抗核抗体、抗ＤＮＡ抗体、抗リンパ球抗体、抗赤血球抗体、抗血小板抗体、抗アセチルコリンレセプター抗体、血清脱随抗体、抗サイログロブリン抗体、抗マイクロゾーム抗体、抗大腸抗体、抗平滑筋抗体、抗表皮細胞間抗体、抗基底膜抗体、抗プロテオグリカン抗体、抗コラーゲン抗体、抗胃内因子抗体、抗甲状腺ミクロソーム抗体、抗動脈抗体、抗アドレノセプター抗体等の自己抗体および／またはその免疫複合体などである。
【００３０】
本発明の吸着材を用いて、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体を吸着する方法としては最も簡便な方法としては血液を取り出してバッグなどに貯留し、これに吸着材を混合して悪性物質を吸着した後、吸着材を濾別して悪性物質が除去された血液を得る方法がある。この方法は、血液を原材料として医薬品（例：血液製剤、ワクチン、遺伝子組換製剤）又は医療材料を製造する際にも、適用することができる。次の方法は血液の入口と出口を有し、出口には血液は通過するが吸着材は通過しないフィルターを装着した容器に吸着材を充填し、これに血液を流す方法がある。いずれの方法も用いることができるが、後者の方法は操作も簡便であり、また体外循環回路に組み込むことにより患者の血液から効率よくオンラインで悪性物質を除去することが可能である。特に本発明の吸着材は血液適合性が非常に高いことから、血漿分離を必要とせず血球成分を含む血液を直接処理することができるため、オンラインで処理する後者に利用するのが最適である。また体外循環回路では吸着材を単独で用いることもできるが、他の体外循環治療システムとの併用も可能である。併用の例としては、人工透析回路などがあげられ、透析療法との組み合わせに用いることもできる。
【００３１】
次に、オンラインで体外循環する際の一実施例を、概略断面図である図１に基づき説明する。図１中、１は液体の流入口、２は液体の流出口、３は本発明にける吸着材、４および５は液体および液体に含まれる成分は通過できるが４の吸着材は通過できないフィルター、６はカラム、７は吸着器である。しかしながら、体外循環としての吸着器はこのような具体例に限定されるものではなく、液の入口、出口を有し、かつ吸着材の容器外への流出防止具を備えた容器内に前記吸着材を充填したものであれば、どのようなものでもよい。
【００３２】
前記流出防止具には、メッシュ、不織布、綿栓などのフィルターがあげられる。また、容器の形状、材質、大きさにはとくに限定はないが、形状としては筒状容器が好ましい。容器の材質として好ましいのは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的にはシリコンコートされたガラス、ポリプロピレン、塩化ビニール、ポリカーボネート、ポリサルフォン、ポリメチルペンテンなどがあげられる。容器の容量は５０ｍｌ以上、１５００ｍｌ以下で、直径は２ｃｍ以上、２０ｃｍ以下が好ましい。容器の容量が５０ｍｌより小さいと吸着量が充分でなく、１５００ｍｌより大きいと体外循環量が多くなるので好ましくない。容器の直径が２ｃｍより小さいと線速が大きくなるため圧力損失が大きくなり好ましくない。２０ｃｍより大きいと取り扱いにくくなるうえ線速が小さくなるため凝固の危険性があり好ましくない。効果的な吸着量があり、安全性に優れているという点から容量は１００ｍｌ以上、８００ｍｌ以下で、直径は３ｃｍ以上、１５ｃｍ以下がさらに好ましく、容量は１５０ｍｌ以上、４００ｍｌ以下で、直径は４ｃｍ以上、１０ｃｍ以下が特に好ましい。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例において本発明に関して詳細に述べるが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００３４】
（参考例１）
国際公開公報ＷＯ２００６−４６５８９と同様の方法にて、以下の手順によりポリビニルアルコール担体を得た。
【００３５】
攪拌翼を有する２Ｌセパラブルフラスコ（重合反応器）と、液適生成装置、単量体混合タンク、分散媒タンクから構成される重合装置を用いて、重合を行った。
【００３６】
重合反応器中に、水４３８．２ｇ、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウムの３重量％水溶液１．８７ｇ、微粒子状の第三リン酸カルシウムの１０重量％スラリー１２７．２ｇを仕込み、穏やかに撹拌させておいた。
【００３７】
液滴生成装置として、分散媒を満たしたカラムに単量体混合物を噴出するノズルを挿入し、ノズルの上端は孔径０．１７ｍｍの小孔を６個有するオリフィス板よりなり、下端には振動を伝達する振動板を設置し、振動板を加振器と接続したものを用いた。カラムには分散媒タンクより分散媒を供給する導入管を接続し、ノズルには単量体混合物タンクより単量体混合物を供給する導入管を接続した。単量体混合物の供給には定量性が高く脈動の少ない２連プランジャーポンプを使用した。
【００３８】
単量体混合物タンクより、酢酸ビニル１００重量部、トリアリルイソシアヌレート（ＴＡＩＣ）２０．７重量部、酢酸エチル１９２重量部、ヘプタン６４重量部、２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−６５）４．９重量部よりなる単量体混合物５６６ｇを、２７．６ｍＬ／ｍｉｎの速度で液滴生成装置の導入管に供給し、液滴生成装置のノズルを経由して重合反応器に仕込んだ。それと同時に分散媒タンクより、分散媒として１．２重量％のポリビニルアルコールおよび５６ｐｐｍの亜硝酸ナトリウムを含む水溶液６６３ｇをカラムに供給し、液滴生成装置を経由して重合反応器に仕込んだ。
【００３９】
この際、単量体混合物には加振器により周波数４００Ｈｚ、強度０．４Ｇの機械的振動を与えた。ノズル孔より噴出する単量体混合物は、該機械的振動により分割されて実質的に均一な径の液滴群をカラム中に形成し、同時に供給される分散媒とともに重合反応器内へ送られた。
【００４０】
上記液滴生成装置で生成した液滴群を重合反応器内へ導入した後、重合反応器内の窒素置換を行い、内温を６５℃に５時間保持して重合させた。酢酸ビニルの重合転化率は５１％であった。次いでセパラブルフラスコの内容物に塩酸を加えてｐＨを２以下に調整し第三リン酸カルシウムを溶解させ、その後水で良く洗浄した。洗浄液のｐＨが中性付近になったことを確認した後、水をアセトンで置換し、重合によって得られた粒子をアセトンで十分に洗浄した。次いでアセトンを水で置換した後、酢酸ビニル単位に対して過剰量となるよう下式の量の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を水溶液として加えた。
【００４１】
ＮａＯＨ（固形分重量）＝粒子乾燥重量／８６．０９×４０×１．５
なお水に対するＮａＯＨ濃度が４重量％になるように水量を調整した。これを撹拌下、反応温度４０℃で６時間保持して鹸化を行った。その後、洗浄液のｐＨが中性付近になるまで水洗し、さらに８０℃の温水で十分に洗浄を行った。次いで１２１℃、２０分間のオートクレーブ処理を行い、ポリビニルアルコール担体を得た。この担体の体積平均粒径は約４５０μｍであった。
【００４２】
（実施例１）
参考例１にて得られたポリビニールアルコール担体をグラスフィルター上に流し入れた後、減圧下で溶媒を除去し乾燥した。乾燥状態の担体１００ｇ、ジメチルスルホキシド４８０ｍＬ、エピクロロヒドリン４２０ｇ、５０％水酸化ナトリウム溶液４０ｇを混合し、４０℃で８時間反応させ、エポキシ化担体を得た。このエポキシ化担体のエポキシ導入量は１ｍＬ当たり１００μｍｏｌであった。
【００４３】
エポキシ化担体６０ｍＬにデキストラン硫酸（分子量５００，０００）２０ｇを加え、全量を１２０ｍＬに調整した後、水酸化ナトリウム溶液でｐＨを９．５とした。この混合液を４０℃で３０時間反応させ、デキストラン硫酸固定化担体（以下、ＤＳ担体と略す）を得た。トルイジンブル―による測定や重量変化より、ＤＳ担体は１ｍＬ当たり１．６ｍｇのデキストラン硫酸が固定化されていた。
【００４４】
次に、ＤＳ担体３０ｍＬにＬ−トリプトファン２．５ｇを加え、ｐＨ１０の０．５Ｍ炭酸緩衝液中で５０℃、８時間反応させ、デキストラン硫酸とＬ−トリプトファン固定化担体（以下、ＤＳ−Ｔｒｐ担体と略す）を得た。非水滴定によると、このＤＳ−Ｔｒｐ担体は１ｍＬ当たり約１７ｍｇのＬ−トリプトファンが固定化されていた。
【００４５】
（実施例２）
デキストラン硫酸（分子量５００，０００）の代わりにデキストラン（分子量２００，０００）を使用すること以外は実施例１と同様にして、デキストランとＬ−トリプトファン固定化担体（以下、ＤＸ−Ｔｒｐ担体と略す）を得た。このＤＸ−Ｔｒｐ担体は１ｍＬ当たり１４ｍｇのＬ−トリプトファンが固定化されていた。
【００４６】
（比較例１）
デキストラン硫酸（分子量５００，０００）の固定化操作を実施しないこと以外は実施例１と同様にしてＬ−トリプトファン固定化担体（以下、Ｔｒｐ担体と略す）を得た。このＴｒｐ担体は担体１ｍＬ当たり１７ｍｇのＬ−トリプトファンが固定化されていた。
【００４７】
（比較例２）
デキストラン硫酸（分子量５００，０００）の代わりにデキストラン硫酸（分子量４，０００）９ｇを使用すること以外は実施例１と同様にして、デキストラン硫酸とＬ−トリプトファン固定化担体（以下、ＤＳ−Ｔｒｐ担体２と略す）を得た。このＤＳ−Ｔｒｐ担体２は１ｍＬ当たり０．５ｍｇのデキストラン硫酸、１０ｍｇのＬ−トリプトファンが固定化されていた。
【００４８】
（比較例３）
デキストラン硫酸（分子量５００，０００）の代わりにデキストラン硫酸（分子量４，０００）１４ｇを使用すること以外は実施例１と同様にして、デキストラン硫酸とＬ−トリプトファン固定化担体（以下、ＤＳ−Ｔｒｐ担体３と略す）を得た。このＤＳ−Ｔｒｐ担体３は１ｍＬ当たり０．８ｍｇのデキストラン硫酸、８ｍｇのＬ−トリプトファンが固定化されていた。
【００４９】
（評価）
上記の５種類の担体を、両端に目開き１５０μmのポリエチレンテレフタレート製メッシュを装着した内径１０ｍｍ、長さ９０ｍｍのアクリル製カラムに充填し、血液１ｍｌに対し５単位のヘパリンを添加し抗凝固した健常人血液４５ｍｌを、流速２．０ｍｌ／ｍｉｎ、６０分間循環で通血し、血液中の赤血球数、白血球数、および血小板数を各々測定した。各値は原血液中の血球濃度を１００とした場合の数値で示した。結果は表１、表２、表３に示した。
【００５０】
また、上記の５種類の担体０．５ｍＬを、クエン酸で抗凝固された血漿２．５ｍＬと、３７℃で２時間接触させた。回収した上清濃度のＩｇＧ濃度から、担体の代わりに同体積の生理食塩水を用いた場合をコントロールとして、以下の式の通りＩｇＧの吸着率を算出した。結果を表４に示した。
吸着率＝（コントロール中のＩｇＧ濃度―担体に接触させた溶液のＩｇＧ濃度）÷コントロール中のＩｇＧ濃度
【００５１】
【表１】
【００５２】
【表２】
【００５３】
【表３】
【００５４】
【表４】
【符号の説明】
【００５５】
１ 液体の流入口
２ 液体の流出口
３ 吸着材
４、５ 液体および液体に含まれる成分は通過できるが、吸着材は通過できないフィルター
６ カラム
７ 吸着器
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水不溶性担体に分子量１０００以上１００００００以下の多糖類と、疎水性アミノ酸またはその誘導体が固定化された、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着材。
【請求項２】
多糖類の分子量が５０００以上１００００００以下である請求項１記載の吸着材。
【請求項３】
疎水性アミノ酸またはその誘導体の固定化量が膨潤体積の吸着材１ｍＬ当り１０μｍｏｌ以上５００μｍｏｌ以下である請求項１または請求項２記載の吸着材。
【請求項４】
疎水性アミノ酸またはその誘導体がトリプトファン、フェニルアラニンまたはそれらの誘導体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の吸着材。
【請求項５】
疎水性アミノ酸がトリプトファンであることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の吸着材。
【請求項６】
多糖類がアガロース、セルロース、デキストラン、デキストラン硫酸、およびそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の吸着材。
【請求項７】
多糖類がデキストランまたはデキストラン硫酸であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の吸着材。
【請求項８】
水不溶性担体が多孔質担体であることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の吸着材。
【請求項９】
多孔質担体がビニルアルコールを基本単位として構成させるポリマー粒子である請求項８記載の吸着材。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の吸着材に血液を接触させることを特徴とする、血液中の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の除去方法。
【請求項１１】
液の入口および出口を有しかつ、吸着材の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、請求項１から９のいずれかに記載の吸着材を充填してなる、血液中の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着器。
【請求項１】
水不溶性担体に分子量１０００以上１００００００以下の多糖類と、疎水性アミノ酸またはその誘導体が固定化された、免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着材。
【請求項２】
多糖類の分子量が５０００以上１００００００以下である請求項１記載の吸着材。
【請求項３】
疎水性アミノ酸またはその誘導体の固定化量が膨潤体積の吸着材１ｍＬ当り１０μｍｏｌ以上５００μｍｏｌ以下である請求項１または請求項２記載の吸着材。
【請求項４】
疎水性アミノ酸またはその誘導体がトリプトファン、フェニルアラニンまたはそれらの誘導体であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の吸着材。
【請求項５】
疎水性アミノ酸がトリプトファンであることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の吸着材。
【請求項６】
多糖類がアガロース、セルロース、デキストラン、デキストラン硫酸、およびそれらの誘導体からなる群から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の吸着材。
【請求項７】
多糖類がデキストランまたはデキストラン硫酸であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の吸着材。
【請求項８】
水不溶性担体が多孔質担体であることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の吸着材。
【請求項９】
多孔質担体がビニルアルコールを基本単位として構成させるポリマー粒子である請求項８記載の吸着材。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の吸着材に血液を接触させることを特徴とする、血液中の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の除去方法。
【請求項１１】
液の入口および出口を有しかつ、吸着材の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、請求項１から９のいずれかに記載の吸着材を充填してなる、血液中の免疫グロブリンおよび／または免疫グロブリン複合体の吸着器。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−１５８３９４（Ｐ２０１０−１５８３９４Ａ）
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２６３６（Ｐ２００９−２６３６）
【出願日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月８日（２００９．１．８）
【出願人】（００００００９４１）株式会社カネカ (3,932)
【Ｆターム（参考）】
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