血管形成的に有効なＦＧＦ−２の単位用量および使用方法
【課題】冠状動脈疾患中および／または急性心筋梗塞を処置する方法を提供すること。
【解決手段】安全かつ血管形成的に有効な用量の組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを、冠状動脈疾患に対する処置を必要とするヒト患者の１つ以上の冠動脈管内または末梢静脈内に投与する工程を包含する、冠状動脈疾患についてヒト患者を処置するための方法。本発明の単回単位用量組成物は、再処置が必要とされる前に２ヶ月持続する、ヒトＣＡＤ患者での血管形成効果を提供する。別の局面において、本発明は、患者の安全を最適化する投与方法に関する。
【解決手段】安全かつ血管形成的に有効な用量の組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを、冠状動脈疾患に対する処置を必要とするヒト患者の１つ以上の冠動脈管内または末梢静脈内に投与する工程を包含する、冠状動脈疾患についてヒト患者を処置するための方法。本発明の単回単位用量組成物は、再処置が必要とされる前に２ヶ月持続する、ヒトＣＡＤ患者での血管形成効果を提供する。別の局面において、本発明は、患者の安全を最適化する投与方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、治療有効量のＦＧＦ−２もしくはその血管形成活性フラグメント（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）または血管形成活性ムテインを含む、ヒトにおいて心臓の血管新生を誘導するための単位用量の組成物に関する。本発明はまた、患者へ全身性のリスクを最小限にしながら、心臓の血管新生を誘導するために、ヒトへ１回の単位用量組成物を投与するための方法に関する。開示された単位用量の組成物およびその投与方法は血管形成術、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の処置に対する外科的介入への代案を与え、そしてさらにヒトにおける心筋梗塞（ＭＩ）後の損傷を減少させるための補助を与えるので、本発明は有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、少なくとも１８個の構造的に関連したポリペプチド（ＦＧＦ−１からＦＧＦ−１８と名づけられている）のファミリーであり、ヘパリンのようなプロテオグリカンに対する高い程度の親和性によって特徴付けられている。様々なＦＧＦ分子は、サイズが１５〜２３ｋＤの範囲であり、神経細胞の接着および分化［Ｓｃｈｕｂｅｒｔら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０４：６３５−６４３（１９８７）］、創傷の治癒［米国特許第５，４３９，８１８号（Ｆｉｄｄｅｓ）］を含む正常および悪性状況下において、多くの中胚葉細胞型および外胚葉細胞型への分裂促進剤として、栄養因子として、分化誘導因子または分化阻害因子として［Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１３１１−１３１６（１９９３）］、血管形成因子（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ）として［Ｈａｒａｄａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９４：６２３−６３０（１９９４）、広範囲にわたる生物学的活性を示す。従って、ＦＧＦファミリーは、様々な範囲の線維芽細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、神経細胞を刺激する多能性増殖因子のファミリーである。
【０００３】
ＦＧＦは、胎児の発育または創傷の治癒のように正常な組織から放出される場合、時間的および空間的な制御に供される。しかし、ＦＧＦファミリーのメンバーの多くはまた、癌遺伝子でもある。したがって、時間的および空間的な制御なしではＦＧＦファミリーのメンバーは血管新生を提供しながら、腫瘍の増殖を刺激する能力を有する。
【０００４】
冠状動脈疾患は、一つ以上の冠状動脈がプラークの蓄積によって徐々に閉塞していく（アテローム性動脈硬化）、ヒトにおける進行的な状態である。この疾患を有する患者の冠状動脈は、よくバルーン血管形成や部分的に閉塞した動脈を開くためのステントの挿入によって処置される。結局、これらの患者の多くは、多大な出費およびリスクをかけて冠状動脈バイパス手術を行う必要がある。バイパス手術を行う必要性を減らすために、冠状動脈の血流を増やす薬物をこのような患者に提供することが望まれる。
【０００５】
血塊などによって一つ以上の冠状動脈または小動脈が完全に閉塞するようになる心筋梗塞で患者が苦しむ場合、ヒトにおいてなおより重要な状況が生じている。閉塞した動脈または小動脈にさらされた心筋部分へ即座に循環を回復させる必要がある。失われた冠状循環が梗塞開始の数時間以内に回復されれば、閉塞より下流にある心筋に対する損傷のほとんどは防ぐことができる。組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼのような血塊溶解剤は、この場合に有益であることが立証されている。しかし、血塊溶解剤の補助物として、損傷を受けたか、または閉塞した心筋に血管新生によって副行循環を得ることも望ましい。
【０００６】
従って、冠状動脈疾患中および／または急性心筋梗塞の後に、心臓の血管形成をヒトの患者に与える薬剤および投与様式を提供することが、本発明の目的である。より詳細には、有害な効果を最小限にしながら、心臓の脈管新生の望ましい特性を与える、ＦＧＦの治療用量およびヒトへの投与様式を提供することが本発明のさらなる目的である。
【０００７】
様々なＦＧＦ分子の多くが単離され、そして変動しかつしばしば正反対の結果を有する様々な心筋虚血動物モデルへ投与されている。Ｂａｔｔｌｅｒらによると、「イヌの心筋虚血モデルは天然に存在する副行循環が豊富であるので、批評の余地がある。天然の副行循環が相対的に欠乏しており、そしてヒトの副行循環に類似している点で優っているブタのモデルとは正反対である」。Ｂａｔｔｌｅｒら‘Ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ
Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｉｎｆａｒｃｔｅｄ Ｓｗｉｎｅ Ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ’ＪＡＣＣ，２２（７）：２００１−６（Ｄｅｃ．１９９３）２００２頁、ｃｏｌ．１。しかし、ウシのｂＦＧＦ（すなわちＦＧＦ−２）を心筋梗塞モデルのブタに投与したＢａｔｔｌｅｒらは、一つの動物種から別の動物種で得られる様々な結果を考慮し、そして互いに異なる結果を明白に開示し「従って、このように異なった動物モデルからの結果に基づいて推定する際に注意しなければならないという忠告を強調している」（Ｂａｔｔｌｅｒら，２００５頁，ｃｏｌ．１）。さらに、Ｂａｔｔｌｅｒは、「投薬とｂＦＧＦ（すなわちウシのＦＧＦ−２）の投与様式は、達成される生物学的効果に対して深遠な含意を有し得る」（Ｂａｔｔｌｅｒ，ら，２００５頁，ｃｏｌ．１）と指摘している。従って、ヒトの患者においてＣＡＤの処置および／またはＭＩ創傷後の安全かつ効果的な処置を提供する線維芽細胞増殖因子の投薬量ならびに投与様式を発見することが、本発明のさらなる目的である。さらに一般的に、ヒトの心臓で血管新生を誘導する薬学的組成および方法を提供することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
冠血管形成を必要とするヒトの患者の一つ以上の冠脈管（ＩＣ）または，末梢静脈（ＩＶ）への約０．２μｇ／ｋｇ〜約４８μｇ／ｋｇの単回単位用量での、ｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性な（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ）フラグメントもしくはムテインの投与が、思いがけなくヒトの患者に、予想外に長期間（これを書いている現在で６ヶ月になる）持続した処置患者の運動耐性時間（ＥＴＴ）における予想外の大きな上昇（すなわち２ヶ月および６ヶ月の全グループでベースラインから平均的変化で９６秒および１００秒の上昇）を生じる、急速かつ治療的な冠血管形成を提供することを本願らは発見した。これらの変化は、標準的な血管再生手順の必要性の減少という結果になるはずである。本明細書中に使用される「冠血管形成」とは、冠循環において側副として作用する毛細血管から小動脈というサイズの範囲の、新しい血管の形成を意味する。比較のために血管形成は、プラセボと比較して３０秒より長い患者のＥＴＴにおける上昇を提供する場合、治療的に成功であると考えられている。
【０００９】
従って、一つの局面において本発明は、安全かつ治療有効量のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む、単位用量のｒＦＧＦ−２に関する。代表的に安全かつ治療的に有効な量は、理想的体重に基づいて、約０．２μｇ／ｋｇ〜約４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。他の実施形態において、単位用量の安全かつ治療的に有効な量は、０．２μｇ／ｋｇ〜２．０μｇ／ｋｇ、２．０μｇ／ｋｇより上〜２４μｇ／ｋｇ未満もしくは２４μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇ ＩＣのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む。別の実施形態において、単位用量の安全かつ治療
的に有効な量は１８μｇ／ｋｇから３６μｇ／ｋｇ ＩＶのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む。完全な用語で表現すれば、本発明の単位用量は０．００８ｍｇ〜７．２ｍｇ、より代表的には０．３ｍｇ〜３．５ｍｇのＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。適切なＦＧＦ−２は配列番号２のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインである。
【００１０】
別の局面において、本発明はＣＡＤについてヒト患者を処置する方法もしくはそこでの冠血管形成を誘導することに関する。その方法は安全かつ治療有効量の組み換えＦＧＦ−２（ｒＦＧＦ−２）またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを冠状動脈疾患の処置が必要な（または血管新生が必要な）ヒトの患者の一つ以上の冠脈管もしくは末梢静脈へ投与する工程を含む。代表的に安全かつ治療的に有効な量の部分が、二つの冠脈管の各々に投与される。安全かつ治療的に有効な量は、薬学的に受容可能なキャリアーにおいて約０．２μｇ／ｋｇ〜約４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。他の実施形態において、安全かつ治療的に有効な量は、薬学的に受容可能なキャリアーにおいて０．２μｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇより上〜２４μｇ／ｋｇ未満、または２４μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。完全な用語では、上記の方法で使われているｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの量は、０．００８ｍｇ〜７．２ｍｇ、より代表的には０．３ｍｇ〜３．５ｍｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。
【００１１】
ＦＧＦ−２はグリコサミノグリカン（例えばへパリン）結合タンパク質であり、そしてグリコサミノグリカンの存在は活性およびＡＵＣを最適化するので（図３および４を参照のこと）、本発明のＲＦＧＦ−２のＩＣ投薬量は代表的にへパリンのようなグリコサミノグリカン投与の０〜３０分前に投与される。へパリンはＩＣもしくはＩＶ、代表的にはＩＶ投与される。必要に応じて、へパリンは単位
用量組成物と組み合わされる。
【００１２】
ｒＦＧＦ−２が一酸化窒素、強力な血管拡張剤を放出するので、注入前（前方向的な）および注入の間の侵略的な流体治療技術は、患者の安全のために重要である。注入前の推定楔入圧１２ｍｍＨｇを確立するためのＩＶ流体（例えば５００〜１０００ｍＬの標準生理食塩水）の投与、および注入に関連した収縮期の血圧を下げる（例えば９０ｍｍＨｇ未満）ためにＩＶ流体（例えば２００ｍＬの標準生理食塩水）のボーラス投与は、ＩＣ注入またはＩＶ注入によるヒトの患者に対するｒＦＧＦ−２投与の安全性を最適化する。
【００１３】
ＥＤＴＡが正常な心筋収縮および心臓伝導に必要とされるカルシウムの強力なキレート剤なので、ＥＤＴＡ濃度を最小限にすることは患者の安全にとって重要である。単位用量組成物中１００μｇ／ｍｌ未満のＥＤＴＡ濃度は、ＩＣ注入またはＩＶ注入によるヒトの患者に対するｒＦＧＦ−２投与の安全性を最適化する。
【００１４】
急激なｒＦＧＦ−２のボーラス投与が動物において深い低血圧と関連しているので、注入の速度は、患者の安全に重要である。一分あたり０．５〜２ｍＬ、代表的には一分あたり１ｍＬでの投与は、ＩＣ注入またはＩＶ注入によるヒトの患者に対するｒＦＧＦ−２投与の安全性を最適化する。
【００１５】
ＥＴＴ、「シアトル アンギナ質問表（Ｓｅａｔｔｌｅ Ａｎｇｉｎａ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）」（ＳＡＱ）および心臓の標的領域のＭＲＩのような当該分野で認識された臨床的終点の測定によって決定されるように、単位用量組成物および投与方法によっ
て冠血管形成を必要とするヒトの患者に提供された治療効果の予想外の大きさおよび持続時間は、単回単位用量が投与された後２週間の早さでみられ、そして単回単位用量がＩＣまたはＩＶ投与された後６ヶ月間持続した。例えば、Ｓｐｅｒｔｕｓらの（１９９５）ＪＡＣＣ ２５：３３３−３４１を参照のこと。特に、５８人のヒトＣＡＤ患者のＥＴＴは、ベースラインでの単調な繰り返しによって評価されており、そしてＩＣまたはＩＶ経路による単回単位用量のｒＦＧＦ−２の投与後１ヶ月、２ヶ月、および６ヶ月で全ての投薬郡中の患者幾人かにおいて臨床的効果が観察された。表１を参照のこと。運動能力における増加は、１ヶ月と２ヶ月との間で現れている。平均的ＥＴＴは、２ヶ月および６ヶ月において６０秒より上に増加し、中用量群（６〜１２μｇ／ｋｇ）または低用量群（０．３３〜２．０μｇ／ｋｇ）より高用量群（２４〜４８μｇ／ｋｇ）においてより大きな効果が見られている。（表１を参照のこと）。特に、動物モデルによって予期せずかつ予想外であったのは、ＩＶによる単位用量のｒＦＧＦ−２を投与された患者について投薬後２ヶ月および６ヶ月で観察された、各々９３．４秒と８７．５秒のヒトの患者でのＥＴＴにおける平均的な上昇である。さらにプラセボ効果を想定しても、ＥＴＴ秒についてのベースラインからの平均的な変化はなお、血管形成に関する結果の予想外で有望な比較を可能にした。
【００１６】
４８人のヒトＣＡＤ患者の生活の質は、有効な疾病特異的質問表、シアトル アンギナ質問表（ＳＡＱ）によってベースラインにおいて（すなわち投薬前に）評価され、そしてＩＣまたはＩＶ経路によって本発明の単回単位用量のｒＦＧＦ−２を一回受けた後、２ヶ月および６ヶ月において評価された場合、ＳＡＱにより測定された５つのスケールに対するベースラインからの平均的変化は、ＩＣ投与であろうとＩＶ投与であろうと全ての投薬範囲に対して臨床的に著しい方法で上昇していた（表２〜６）。特にＳＡＱによって評価された５つのスケールは、労作性能力、アンギナ安定性、アンギナ頻度、処置満足感および疾患理解である。ベースラインと比較して、労作性能力に対する平均スコアは、２ヶ月で１０．９から２０．２まで；ならびに６ヶ月で１６．５から２４．１まで増加した。アンギナ安定度について、平均スコアは、２ヶ月で３２．１から４６．２まで；および６ヶ月で１６．７から２３．２まで増加した。アンギナ頻度について平均スコアは、２ヶ月で２０．０から３２．９まで；および６ヶ月で１１．４から３６．７まで増加した。処置満足感について、平均スコアは、２ヶ月で８．５から１９．８まで；および６ヶ月で６．３から１９．８まで増加した。疾病理解について、平均スコアは、２ヶ月で２０．２から２７．８まで；および６ヶ月で２３．８から３４．０まで増加した。一般的に、いずれのスケールでも８ポイントの変化は、臨床的に顕著であると考えられている。従って、８．５〜４６．２の観察された変化は評価された５つのスケールの各々に対して臨床的に有意である。１４ポイントのベースラインからの平均的変化によるプラセボ効果を想定したとしても臨床的に有意であると考えられ、その結果は、なお評価されたほとんど全てのスケールで予想外に優れた効果を提供する。
【００１７】
本研究の一部として、心臓駆出率、局所的心筋機能、および灌流（遅延到着帯）に対するｒＦＧＦ−２の単回単位用量を投与した効果を評価するために、ＭＲＩもＣＡＤと診断された３３人のヒトの患者に実行された。詳細には、患者は、配列番号２のｒＦＧＦ−２の単回単位用量０．３３μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇ ＩＣまたは１８μｇ／ｋｇ〜３６μｇ／ｋｇ ＩＶが投与された。３３人のヒトのＣＡＤ患者が、ベースライン（すなわち処置前に）ならびにＩＣまたはＩＶ経路による本発明のｒＦＧＦ−２の単回単位用量での処置後１ヶ月、２ヶ月および６ヶ月に、休止している心磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）によって評価された場合、増加した標的の壁肥厚、標的の壁運動および標的領域の副行範囲、ならびに減少した標的領域の遅延到着範囲によって客観的に測定されるように、それらの患者は、その処置方法に対してきわめて統計的に有意な応答を示した。まとめると１ヶ月、２ヶ月および６ヶ月において標的の壁肥厚は、ベースラインと比較してそれぞれ４．４％、６．３％および７．７％増加し；標的の壁運動は、ベースラインと比較してそれぞれ２
．７％、４．４％および６．４％増加し；標的領域の副行範囲は、ベースラインと比較してそれぞれ８．３％、１０．９％、および１１．２％増加した；そして標的領域の遅延到着範囲は、ベースラインと比較してそれぞれ−１０．０％、−８．３％ならびに−１０．０％減少した。
【００１８】
上記のデータは、本発明に従ってＩＣまたはＩＶ投与した場合の、ｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントの本単位用量組成物のヒトにおける臨床的効果を証明している。
上記に加えて、本発明は、以下を提供する：
（項目１）
ヒトにおいて血管新生を誘導するための単位用量組成物であって、該組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に、約０．００８ｍｇ〜約７．２ｍｇのＦＧＦ−２あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む、単位用量組成物。
（項目２）
０．３ｍｇ〜３．５ｍｇのＦＧＦ−２あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む、項目１に記載の単位用量組成物。
（項目３）
前記ＦＧＦ−２が、配列番号２のアミノ酸配列を有する、項目１に記載の単位用量組成物。
（項目４）
薬学的に受容可能なキャリア中に、０．３ｍｇ〜３．５ｍｇの配列番号２のＦＧＦ−２あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む、項目３に記載の単位用量組成物。
（項目５）
薬学的に受容可能なキャリア中に、約０．００８ｍｇ〜約７．２ｍｇの前記配列番号２のＦＧＦ−２の前記血管形成的に活性なムテインを含む、項目３に記載の単位用量組成物。（項目６）
薬学的に受容可能なキャリア中に、０．３ｍｇ〜３．５ｍｇの前記配列番号２のＦＧＦ−２の前記血管形成的に活性なムテインを含む、項目５に記載の単位用量組成物。
（項目７）
薬学的に受容可能なキャリア中に、約０．００８ｍｇ〜約７．２ｍｇの前記配列番号２のＦＧＦ−２の前記血管形成的に活性なフラグメントを含む、項目３に記載の単位用量組成物。
（項目８）
薬学的に受容可能なキャリア中に、０．３ｍｇ〜３．５ｍｇの前記配列番号２のＦＧＦ−２の前記血管形成的に活性なフラグメントを含む、項目７に記載の単位用量組成物。
（項目９）
薬学的に受容可能なキャリア中に、約０．００８ｍｇ〜約７．２ｍｇの前記配列番号２のＦＧＦ−２を含む、項目３に記載の単位用量組成物。
（項目１０）
冠状動脈疾患についてヒト患者を処置するための方法であって、該方法が、該冠状動脈疾患についての処置を必要とするヒト患者において、安全かつ治療有効量の組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを１つ以上の冠動脈管または末梢静脈に投与する工程を包含し、該治療有効量が患者の体重１ｋｇにつき約０．２μｇ〜４８μｇである、方法。
（項目１１）
前記組換えＦＧＦ−２が、配列番号２のアミノ酸配列を有する、項目１０に記載の方法。（項目１２）
前記方法がさらに、約１０Ｕ／ｋｇ〜８０Ｕ／ｋｇのヘパリンを前記患者に、前記配列番号２の組換えＦＧＦ−２、あるいはその前記血管形成的に活性なフラグメントまたはムテ
インを投与する前約０〜３０分以内に投与する工程を包含する、項目１１に記載の方法。（項目１３）
配列番号２の組換えＦＧＦ−２、あるいはその前記血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインの前記治療有効量が、１つ以上の冠動脈管に投与される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
配列番号２の組換えＦＧＦ−２、あるいはその前記血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインの前記治療有効量が、約２４μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
配列番号２の組換えＦＧＦ−２、あるいはその前記血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインの前記治療有効量が、末梢静脈に投与される、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
配列番号２の組換えＦＧＦ−２、あるいはその前記血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインの前記治療有効量が、約１８μｇ／ｋｇ〜３６μｇ／ｋｇである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
冠状動脈疾患についてヒト患者を処置するための方法であって、該方法は、単回単位用量の組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを、該冠状動脈疾患についての処置を必要とするヒト患者の１つ以上の冠動脈管または末梢静脈に投与する工程を包含し、該単位用量が約０．００８ｍｇ〜７．２ｍｇの組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む、方法。
（項目１８）
前記ＦＧＦ−２が、前記配列番号２のアミノ酸配列を有する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記単回単位用量が、前記ヒト患者において少なくとも４ヶ月間持続する治療利益を生ずる、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記単回単位用量が、前記ヒト患者において６ヶ月間持続する治療利益を生ずる、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記単回単位用量が、前記ヒト患者において、第２の単位用量の投与が約６ヶ月間必要とされないような規模と持続期間の治療利益を生ずる、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記単位用量が、１つ以上の冠状動脈に投与される、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記単位用量が、末梢静脈に投与される、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記単位用量が、０．３ｍｇ〜３．５ｍｇの配列番号２の組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記方法がさらに、１０Ｕ／ｋｇ〜８０Ｕ／ｋｇのヘパリンを前記患者にＩＶまたはＩＣで、前記単位用量を投与する約０〜３０分前に投与する工程を包含する、項目１９に記載の方法。
（項目２６）
ヒト患者の心臓での血管新生を誘導するための方法であって、該方法は、単回単位用量の組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを、冠状動脈疾患についての処置を必要とするヒト患者の１つ以上の冠動脈管または末梢静脈に投与する工程を包含し、該単位用量が約０．００８ｍｇ〜７．２ｍｇの組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む、方法。
（項目２７）
前記ＦＧＦ−２が、配列番号２のアミノ酸配列を有する、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記単回単位用量が、少なくとも４ヶ月間持続する、前記ヒト患者での１つ以上の臨床上の終点における改善を生ずる、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記単回単位用量が、６ヶ月間持続する、前記ヒト患者での１つ以上の臨床上の終点における改善を生ずる、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
心筋梗塞についてヒト患者を処置するための方法であって、該方法が、単回単位用量の組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを、該ヒト患者の１つ以上の冠動脈管または末梢静脈に投与する工程を包含し、該単位用量が、約０．００８ｍｇ〜７．２ｍｇの組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む、方法。
（項目３１）
前記方法がさらに、１０Ｕ／ｋｇ〜８０Ｕ／ｋｇのヘパリンを前記患者にＩＶまたはＩＣで、前記単位用量を投与する約０〜３０分前に投与する工程を包含する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記ＦＧＦ−２が、配列番号２のアミノ酸配列を有する、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記単位用量が、末梢静脈に投与される、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記単位用量が、前記患者の１つ以上の冠動脈管内に投与される、項目３０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１Ａは、２０分周期でＩＣ注入によりヒトに投与したｒＦＧＦ−２（配列番号２）の８つの異なった用量についての、平均ｒＦＧＦ−２血漿濃度対時間プロフィールのプロットである。図１Ａに示された８つの用量のｒＦＧＦ−２は痩せたボディーマス（ＬＢＭ）の０．３３、０．６５、２、６、１２、１４、３６および４８μｇ／ｋｇである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、２０分周期でＩＶ注入によりヒトに投与したｒＦＧＦ−２（配列番号２）の２つの異なった用量についての平均ＦＧＦ−２血漿濃度対時間プロフィールのプロットである。図１Ｂにおける２つのＩＶ用量のｒＦＧＦ−２は、１８μｇ／ｋｇおよび３６μｇ／ｋｇである。３６μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２のＩＣ投与に続く平均的な濃度−時間プロフィールを比較のために含まれる。
【図２】図２は、図１Ａと１Ｂに対応するｐｇ＊ｍｉｎ／ｍｌにおける曲線（ＡＵＣ）下での平均的なＦＧＦ−２面積のプロットである。このプロットは、ＩＣまたはＩＶ注入に続く全身的なｒＦＧＦ−２暴露の用量の直線化を示している。ＩＣ経路に対する全身的な暴露は、ＩＶ投与に続いて観察される暴露に類似している。
【図３】図３は、「ｒＦＧＦ−２注入前の分」におけるへパリン投与時間の関数としての、個々のヒトの患者ＦＧＦ−２血漿クリアランス（ＣＬ）値のプロットであり、ＦＧＦ−２血漿クリアランス（ＣＬ）に対するへパリン投与のタイミングの影響を示す。
【図４】図４は、「ｒＦＧＦ−２注入前の分」におけるへパリン投与時間の関数としての、曲線（ＡＵＣ）下での個々のヒトの患者ＦＧＦ−２用量正規化面積のプロットであり、ＦＧＦ−２ ＡＵＣに対するへパリン投与のタイミングの影響を示す。
【図５】図５は、第ＩＩ相臨床試験の分析計画を要約す。
【図６】図６は、第ＩＩ相臨床試験における、患者集団についての患者の特質を要約する。
【図７】図７は、第ＩＩ相臨床試験のコースにわたる患者の特性を示す。
【図８】図８は、第ＩＩ相臨床試験に対する患者集団の安全変数を示す。
【図９】図９は、プラセボ処置群と３つのＦＧＦ−２処置群に対する運動時間における変化を示す。
【図１０】図１０は、プラセボ処置群および３つの処置群における患者のアンギナ頻度スコアにおける変化を示す。
【図１１】図１１は、プラセボ処置群および３つの処置群における患者の、シアトル アンギナ質問表の他の領域における変化を示している。
【図１２】図１２は、短縮型−３６個の肉体構成要素の要約スコアにおける変化を示す。
【図１３】図１３は、ベースラインのＣＣＳクラス３または４によって分類されたＥＴＴおよびアンギナ頻度スコアにおける変化を示す。
【図１４】図１４は、４０以下のベースラインＡＦＳによって分類されたＥＴＴおよびアンギナ頻度スコアにおける変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本出願人は、単回用量のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインが、安全かつ治療的に有効な量で、ＣＡＤと診断されたヒト患者の１つ以上の冠状脈管内または末梢静脈内に投与された場合に、さらなる処置が必要とされる前に少なくとも４〜６ヶ月間、より代表的には少なくとも２ヶ月間持続する、患者の冠状動脈疾患に安全かつ治療的に有効な処置を患者に提供することを発見した。この効果の持続期間、ならびにＥＴＴ、ＳＡＱ、およびＭＲＩにおける改善の程度は、単回用量の医薬について予期外であった。
【００２１】
句「治療的に有効な量」または「安全かつ治療的に有効な量」とは、ｒＦＧＦ−２に関して本明細書中で使用される場合、本発明に従って投与された場合に医学的に管理し得ない主要な合併症がなく、そして最適な医学的管理にも関わらずＣＡＤの症状を有する患者において客観的な心臓の改善を提供する、ｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの量を意味する。従って、液体の投与によって管理され得る急性低血圧症は、本発明の目的に対して「安全」とみなされる。代表的に、ｒＦＧＦ−２の安全かつ治療的に有効な量は、約０．２μｇ／ｋｇ〜約４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。本発明における使用に適切なＦＧＦ−２は、配列番号２のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインである。
【００２２】
従って、本発明は複数の局面を有する。その第１の局面では、本発明は、ヒト患者における血管形成を誘導するための単位用量組成物に関する。この単位用量は、治療的に有効な（すなわち、血管形成に有効な）量のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラ
グメントもしくはムテインを含み、この量は、約０．２μｇ／ｋｇ〜約４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。
【００２３】
用語「単位用量組成物」とは、本明細書中で使用される場合、本発明の方法に従ってヒト患者に投与された場合に、少なくとも４〜６ヶ月間、代表的には６ヶ月間再処置を必要としないように、有意な効力の血管形成効果を血管形成の必要がある代表的なヒト患者に提供する組成物を意味する。本発明の単位用量組成物は、代表的に、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアと組み合わせて提供される。単位用量組成物の他の実施形態では、安全かつ治療的に有効な量は、約０．２μｇ／ｋｇ〜約２μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ〜約２４μｇ／ｋｇ、または約２４μｇ／ｋｇ〜約４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。
【００２４】
処置される患者の体重に依存しない、より絶対な用語で本発明の単位用量組成物を定義することは都合が良い。このように定義する場合、単位用量組成物は、０．００８ｍｇ〜７．２ｍｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。この実施形態では、単位用量組成物は、最小の患者（例えば、４０ｋｇ）の最低用量（約０．２μｇ／ｋｇ）から、より大きな患者（例えば、１５０ｋｇ）の最高用量（約４８μｇ／ｋｇ）までを範囲する、大多数のヒトＣＡＤ患者のいずれか一人に投薬することに適用させるために十分な量のＦＧＦ−２を含む。より代表的には、単位用量は、０．３ｍｇ〜３．５ｍｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。単位用量組成物を、代表的に、上記で参照した量のｒＦＧＦ−２、および本明細書中で後に記載されるような有効量の１つ以上の薬学的に受容可能な緩衝液、安定剤および／または他の賦形剤を含む、溶液形態または凍結乾燥形態で提供する。
【００２５】
上記された単位用量組成物における活性因子は、組換えＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインである。組換えＦＧＦ−２を作製する方法は、当該分野において周知である。配列番号２の組換えＦＧＦ−２は、１９９２年１０月１３日に発行された「Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ」と表題付けられた米国特許第５，１５５，２１４号（そしてこれは、その全体において、本明細書中で明確に参考として援用される）に記載のように作製される。さらに、この文章の前に出ようと後に出ようと、本明細書中で引用されるすべての他の参考文献は、その全体において、本明細書中で明確に参考として援用される。’２１４特許に開示されるように、配列番号１のＤＮＡ（これは、配列番号２のｂＦＧＦ（本明細書中以降「ＦＧＦ−２」）をコードする）は、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、Ｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲＩ、ＲＰ４、またはλ−ファージのようなクローニングベクター内に挿入され、そしてこのクローニングベクターは、真核生物細胞または原核生物細胞のいずれかを形質転換するために使用され、ここで、この形質転換細胞がＦＧＦ−２を発現する。１つの実施形態では、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母細胞である。結果として生じた、発現される全長ＦＧＦ−２は、配列番号２と一致して１４６個のアミノ酸を有する。配列番号２のＦＧＦ−２は４個のシステイン（すなわち、残基の２５位、６９位、８７位、および９２位）を有するが、内部ジスルフィド結合は存在しない。［’２１４、第６欄、第５９〜６１行］。しかし、酸化的条件の下で架橋が生じる場合には、２５位と６９位の残基の間で生じるようである。
【００２６】
１４６個のアミノ酸残基を有する配列番号２のＦＧＦ−２は、天然に存在するヒトＦＧＦ−２とは、わずか２個のアミノ酸残基で異なる。詳細には、配列番号２のＦＧＦ−２の残基１１２位および１２８位のアミノ酸はそれぞれ、ＳｅｒおよびＰｒｏであるが、ヒトＦＧＦ−２では、それらはそれぞれＴｈｒおよびＳｅｒである。事実、対応するヒトＦＧＦ−２のように、ウシＦＧＦ−２は、最初に、１５５個のアミノ酸残基を有するポリペプチドとしてインビボで合成される。Ａｂｒａｈａｍら「Ｈｕｍａｎ Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂ
ｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ」、ＥＭＢＯ Ｊ．，５（１０）：２５２３−２５２８（１９８６）。配列番号２のＦＧＦ−２を、Ａｂｒａｈａｍの全長１５５残基のウシＦＧＦ−２と比較した場合、配列番号２のＦＧＦ−２は、対応する全長の分子のＮ末端で、最初の９個のアミノ酸残基のＭｅｔ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ（配列番号３）を欠失する。本発明の組成物および方法において使用される組換えＦＧＦ−２は、９０年９月１１日に発行された「Ｂｏｖｉｎｅ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ」と表題付けられた米国特許第４，９５６，４５５号（これは、その全体において、本明細書中で参考として援用される）に詳細に記載される技術を用いて、製薬用品質（９８％以上の純度）に精製された。特に、出願人の単位用量組成物の組換えＦＧＦ−２の精製において使用される最初の２つの工程は、「以前に記載されたような、従来のイオン交換精製工程および逆相ＨＰＬＣ精製工程」である。［米国特許第４，９５６，４５５号、これは、Ｂｏｌｅｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８１：５３６４−５３６８（１９８４）を引用する］。第３の工程（これを、’４５５特許では「鍵となる精製工程」という［’４５５、第７欄、第５〜６行］）は、ヘパリン−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）アフィニティクロマトグラフィーであり、ここではＦＧＦ−２の強力なヘパリン結合親和性は、約１．４Ｍおよび約１．９５ＭのＮａＣｌで溶出した場合に、数１０００倍の精製を達成するために使用される［’４５５、第９欄、第２０〜２５頁］。ポリペプチドの均質性は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって確認された。緩衝液の交換は、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ−２５（Ｍ）ゲル濾過クロマトグラフィーによって達成された。
【００２７】
配列番号２の１４６残基のｒＦＧＦ−２に加えて、本発明の単位用量における活性因子はまた、ＦＧＦ−２の「血管形成活性フラグメント（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」を含む。用語ＦＧＦ−２の「血管形成活性フラグメント」とは、配列番号２の１４６残基の約８０％を有し、かつ配列番号２のＦＧＦ−２の血管形成活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％を保持するＦＧＦ−２のフラグメントを意味する。
【００２８】
血管形成に活性であるために、ＦＧＦ−２フラグメントは、２つの細胞結合部位および２つのヘパリン結合部位のうちの少なくとも１つを有するべきである。類似体ヒトＦＧＦ−２の２つの推定細胞結合部位は、その残基３６位〜３９位および７７位〜８１位に存在する。Ｙｏｓｈｉｄａら「Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｓｔ，ａ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔ−２−Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８４：７３０５−７３０９（１９８７年１０月）の図３を参照のこと。ｈＦＧＦ−２の２つの推定ヘパリン結合部位は、その残基１８位〜２２位および１０７位〜１１１位に存在する。Ｙｏｓｈｉｄａ（１９８７）の図３を参照のこと。天然に存在するヒトＦＧＦ−２（ｈＦＧＦ−２）およびｒＦＧＦ−２（配列番号２）についてのアミノ酸配列の間の９８％より高い類似性を考慮すると、ｒＦＧＦ−２（配列番号２）の２つの細胞結合部位はまた、その残基の３６位〜３９位および７７位〜８１位であり、そして２つのヘパリン結合部位は、その残基の１８位〜２２位および１０７位〜１１１位であることが予期される。上記と一致して、配列番号２のＦＧＦ−２のＮ末端短縮物（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）は、ウシにおいてその活性を除去しないことが当該分野で周知である。特に、当該分野では、いくつかの天然に存在しかつ生物学的に活性なＦＧＦ−２のフラグメントを開示し、そのフラグメントは、配列番号２のＦＧＦ−２に対するＮ末端短縮物を有している。配列番号２の残基１２〜１４６を有する活性な短縮型ｂＦＧＦ−２はウシ肝臓において見出され、そして配列番号２の残基１６〜１４６を有する、別の活性な短縮型ｂＦＧＦ−２はウシの腎臓、副腎、および精巣において見出された。［米国特許第５，１５５，２１４号の第６欄、第４１〜
４６行（これは、Ｕｅｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１３８：５８０−５８８（１９８６）を引用する）を参照のこと］。同様に、ＦＧＦ活性を有することが公知である配列番号２のｂＦＧＦ−２の他のフラグメントは、ＦＧＦ−２（２４−１２０）−ＯＨおよびＦＧＦ−２（３０−１１０）−ＮＨ２である。［米国特許第５，１５５，２１４号の第６欄、第４８〜５２行］。これらの後者のフラグメントは、ＦＧＦ−２（配列番号２）の細胞結合部分の両方およびヘパリン結合セグメントのうちの１つ（残基１０７〜１１１）を保持する。従って、ＦＧＦ−２の血管形成活性フラグメントとは、代表的に、配列番号２のＦＧＦ−２の残基３０〜１１０に対応し、より代表的には配列番号２のＦＧＦ−２の残基１８〜１４６に対応する残基を少なくとも有する、ＦＧＦ−２のそれらの末端短縮型フラグメントを包含する。
【００２９】
本発明の単位用量はまた、配列番号２のｒＦＧＦ−２の「血管形成活性ムテイン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｍｕｔｅｉｎ）」を含む。用語「血管形成活性ムテイン」とは、本明細書中で使用される場合、以下の検索パラメーター：１２のギャップオープンペナルティおよび１のギャップ伸長ペナルティーを使用するアフィンギャップ検索を使用して、ＭＳＰＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズム（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）によって決定される場合に、任意の天然に存在するＦＧＦ−２に対して６５％の配列同一性（相同性）を有し、そして上記の少なくとも６５％の配列同一性を有する天然に存在するＦＧＦ−２の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％の血管形成活性を保持する、単離および精製された組換えタンパク質または組換えポリペプチドを意味する。好ましくは、血管形成活性ムテインは、天然に存在するＦＧＦ−２に対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、そして最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する。他の周知であり慣用的に使用される相同性／同一性の走査アルゴリズムのプログラムとしては、以下が挙げられる：ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８（１９８８）；ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：１４３５（１９８５）；Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４）；または、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）のＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、またはＢＬＡＳＴＸアルゴリズム。これらのアルゴリズムを使用するコンピュータープログラムもまた利用可能であり、そして以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（これらは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ、バージョン８、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ ＵＳＡから市販されている）；ならびに、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｅｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ ＣＡによるＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム中）。好ましくは、配列同一性のパーセンテージを、プログラムによって決定されたデフォルトのパラメーターを用いることによって決定する。
【００３０】
句「配列同一性」は、本明細書中で使用される場合、ムテインのアミノ酸配列の特定の連続的セグメントを、天然に存在するＦＧＦ−２のアミノ酸配列と整列および比較した場合に、ムテイン配列内に類似して位置付けられることが見出される同一のアミノ酸のパーセンテージをいうことが意図される。
【００３１】
ムテインにおけるアミノ酸配列同一性のパーセンテージを考慮する場合、タンパク質またはタンパク質機能の特性に作用しない保存的アミノ酸置換の結果として、いくつかのアミノ酸残基位置が、参照タンパク質とは異なり得る。これらの場合、配列同一性のパーセンテージは、保存的に置換されたアミノ酸における類似性を説明するために、上方に調整され得る。このような調整は、当該分野において周知である。例えば、ＭｅｙｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏ．Ｓｃｉ．，４：１１−１７
（１９８８）を参照のこと。
【００３２】
本発明の血管形成因子の「血管形成活性ムテイン」を調製するために、部位特異的変異誘発についての標準的な技術を使用し得る。これらの技術は、当該分野において公知であり、および／またはＧｉｌｍａｎら、Ｇｅｎｅ ８：８１（１９７９）またはＲｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１（１９８７）に教示される。部位特異的変異誘発技術のうちの１つを使用して、配列番号１のｃＤＮＡ配列内に１つ以上の点変異を導入し、１つ以上のアミノ酸置換または内部欠失を導入する。保存的アミノ酸置換とは、置換されるアミノ酸の全体的電荷、疎水性／親水性、および／また立体的かさ高さを保存した置換である。例示のために、以下のグループの間の置換は保存的である：Ｇｌｙ／Ａｌａ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｓｅｒ／Ｃｙｓ／Ｔｈｒ、およびＰｈｅ／Ｔｒｐ／Ｔｙｒ。結果として生じるタンパク質またはポリペプチドが、上記に特定される制限内で血管形成活性を保持する限り、天然に存在する血管形成ＦＧＦ−２の配列との有意な差異（３５％まで）が許容される。
【００３３】
システインを枯渇したムテインは、本発明の範囲内のムテインである。これらのムテインは、上記のような部位特異的変異誘発を使用するか、または「Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−Ｄｅｐｌｅｔｅｄ Ｍｕｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と表題付けられた米国特許第４，９５９，３１４号（「’３１４特許」）に記載の方法に従って構築される。’３１４特許は、生物学的活性および置換の効果を決定するための方法を開示する。システインの置換は、ジスルフィド形成に関与しない２つ以上のシステインを有するタンパク質において特に有用である。適切な置換としては、残基８７位および９２位のシステイン（これらは、ジスルフィド形成に関与しない）の１つまたは両方についてのセリンの置換が挙げられる。好ましくは、血管形成活性に関連しないＦＧＦ−２のＮ末端に置換を導入する。しかし、上記で考察されたように、保存的置換は、分子の全体にわたる導入に適切である。
【００３４】
本発明の単位用量組成物は、安全かつ血管形成に有効な用量のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテイン、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。代表的に、本発明の薬学的組成物の安全かつ血管形成に有効な用量は、ヒト患者への投与に適切な形態およびサイズにある。そしてこれは、以下を含有する：（ｉ）０．２μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテイン、（ｉｉ）および薬学的に受容可能なキャリア。他の実施形態では、安全かつ血管形成に活性な用量は、０．２μｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇより多い〜２４μｇ／ｋｇ未満、または２４μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇのＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテイン、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。大多数のヒトＣＡＤ患者について絶対的な用語で表現すると、本発明の単位用量は、０．００８ｍｇ〜７．２ｍｇ、より代表的には０．３ｍｇ〜３．５ｍｇのＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。
【００３５】
本発明の単位用量組成物の２番目に列挙される成分は、「薬学的に受容可能なキャリア」である。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、本明細書中で使用される場合、それ自体、その組成物を受容する患者に有害な抗体の産生を誘導せず、そして過度の毒性を伴わずに投与され得る、タンパク質様の医薬の安定化および／または投与のための当該分野において周知の任意のキャリアまたは希釈剤を意味する。薬学的に受容可能なキャリアの選択およびその後の加工は、本発明の単位用量組成物が、液状形態または固体形態のいずれかで提供されることを可能にする。
【００３６】
単位用量組成物が液状形態である場合、薬学的に受容可能なキャリアは、静脈内（「ＩＶ」）または歯冠内（「ＩＣ」）の注射または注入に適切な、安定なキャリアまたは希釈
剤を含む。注射可能溶液または注入可能溶液について適切なキャリアまたは希釈剤は、使用される投薬量および濃度でヒトレシピエントに非毒性であり、そしてこれは滅菌水、糖溶液、生理食塩水溶液、タンパク質溶液、またはこれらの組み合わせを含む。
【００３７】
代表的には、薬学的に受容可能なキャリアは、緩衝剤および１以上の安定化剤、還元剤、抗酸化剤および／または抗酸化キレート剤を含む。タンパク質ベースの組成物、特に薬学的組成物の調製における緩衝剤、安定化剤、還元剤、抗酸化剤およびキレート剤の使用は、当該分野において周知である。Ｗａｎｇら、「Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｐＨｓ ｆｏｒ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｕｓｅｄ
ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ」、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｄｒｕｇ Ａｓｓｎ．、３４（６）：４５２〜４６２（１９８０）；Ｗａｎｇら、「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ
Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ」、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．ａｎｄ Ｔｅｃｈ．、４２：Ｓ４〜Ｓ２６（補遺１９８８）；Ｌａｃｈｍａｎら、「Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ａｓ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ−Ｐａｒｔ Ｉ」Ｄｒｕｇ
ａｎｄ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、１０２（１）：３６〜３８、４０および１４６〜１４８（１９６８）；Ａｋｅｒｓ，Ｍ．Ｊ．、「Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．ａｎｄ Ｔｅｃｈ．３６（５）：２２２〜２２８（１９８８）；ならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第ＸＸＶ巻、ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＫａｐｌａｎ編、Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇによる「Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ」、１８５〜１８８頁を参照のこと。適切な緩衝剤には、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、酒石酸塩、および種々のアミノ酸の塩が挙げられる。Ｗａｎｇ（１９８０）４５５項を参照のこと。適切な安定化剤には、トレロース（ｔｈｒｅｌｏｓｅ）またはグリセロールのような糖類が挙げられる。還元されたシステインの還元を維持する適切な還元剤には、０．０１重量／重量％〜０．１重量／重量％のジチオスレイトール（クリランド試薬としても公知のＤＴＴ）またはジチオエリスリトール；０．１重量／重量％〜０．５重量／重量％のアセチルシステインまたはシステイン（ｐＨ２〜３）；ならびに０．１重量／重量％〜０．５重量／重量％のチオグリセロール（ｐＨ３．５〜７．０）およびグルタチオンが挙げられる。Ａｋｅｒｓ（１９８８）２２５〜２２６頁を参照のこと。適切な抗酸化剤には、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、およびアスコルビン酸が挙げられる。Ａｋｅｒｓ（１９８８）２２５頁を参照のこと。還元されたシステインの微量金属触媒酸化を防ぐために微量金属をキレート化する、適切なキレート剤には、クエン酸塩、酒石酸塩、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の二ナトリウム塩、四ナトリウム塩、およびカルシウム二ナトリウム塩、ならびにジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）が挙げられる。例えば、Ｗａｎｇ（１９８０）４５７〜４５８頁および４６０〜４６１頁、ならびにＡｋｅｒｓ（１９８８）２２４〜２２７頁を参照のこと。適切な糖には、グリセロール、トレハロース、グルコース、ガラクトース、およびマンニトール、ソルビトールが挙げられる。適切なタンパク質は、ヒト血清アルブミンである。
【００３８】
液体形態において、本発明の代表的な単位用量組成物は、薬学的に受容可能なキャリアに溶解された、約０．００１ｍｇ〜８ｍｇ、より代表的には０．０３ｍｇ〜５ｍｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。適切な薬学的に受容可能なキャリアは、１０ｍＭ チオグリセロール、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム、および１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５を含む。上記の単位用量組成物についての適切な希釈剤または流剤（ｆｌｕｓｈｉｎｇ ａｇｅｎｔ）は、上記の
キャリアのいずれかである。代表的には、この希釈剤は、キャリア溶液である。ｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインは、長期間については液体形態で不安定である。液体形態の安定性および有効期間を最大化するために、この単位用量組成物は、−６０℃で凍結して貯蔵されるべきである。融解された場合、この溶液は、冷蔵条件で６ヶ月間安定である。代表的な単位用量は、単位用量中に溶解された０．００８〜７．２ｍｇのｒＦＧＦ−２または血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを有する、約１〜４０ｍｌ、より代表的には１０〜４０ｍｌの上記の組成物を含む。単位用量における使用に適切なｒＦＧＦ−２は、配列番号２のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインである。
【００３９】
別の実施形態では、単位用量組成物は、凍結乾燥された（フリーズドライされた）形態で提供される。この形態では、ｒＦＧＦ−２の単位用量は、冷蔵温度にて、実質的に６ヶ月よりも長く、治療効力を損失することなく貯蔵され得る。凍結乾燥は、複数のバイアル（各々は、本発明の単位用量のｒＦＧＦ−２の上記の液体形態をその中に含む）の減圧下での、迅速なフリーズドライ（すなわち、水分を除去する）によって達成される。上記の凍結乾燥を行う凍結乾燥機は、市販されており、そして当業者により容易に作動される。凍結乾燥されたケーク（ｃａｋｅ）形態の、得られた凍結乾燥された単位用量組成物は、得られた凍結乾燥されたケーク内に、対応する液体処方物について上記の１以上の緩衝剤、安定化剤、抗酸化剤、還元剤、塩および／または糖を含むように処方される。全てのこのような他の成分を含む凍結乾燥された単位用量組成物は、滅菌水性希釈剤（例えば、滅菌水、滅菌糖溶液、または滅菌生理食塩水）で既知の容量または濃度に再構成されることのみを必要とする。あるいは、これは、上記のような滅菌緩衝溶液で再構成され得るが、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を欠く。凍結乾燥されたケークとして、この単位用量組成物は、冷蔵温度で６ヶ月から２年間安定である。従って、凍結乾燥形態のこの単位用量組成物の貯蔵は、従来の冷蔵装置を使用して容易に提供される。
【００４０】
本発明の単位用量組成物は、心臓カテーテルまたは他の注入デバイス（これは、デッドスペース（ｄｅａｄ ｓｐａｃｅ）を有する）を通じて投与されるので、この単位用量組成物を含むバイアルに処方して、その結果、これが、患者に投与されるよりも、約１０〜５０％多くのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含むことが都合がよい。例えば、投与されるｒＦＧＦ−２の単位用量が７．２ｍｇである場合に、このバイアルは、必要に応じて、５０％までの余分（例えば、全体で約１０．８ｍｇ）のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含むように処方される。この余分な溶液は、送達装置のデッドスペースを充填するために適切である。デッドスペースを許容しない代替的な実施形態では、薬学的組成物は、心臓カテーテル内に、薬学的に受容可能な緩衝剤、希釈剤またはキャリアの前にロードされ、次いで、この薬学的に受容可能な緩衝剤、希釈剤またはキャリアは、適切な量の１以上の投薬を、血管形成を必要としている心筋における１以上の部位に送達するために使用される。
【００４１】
上記で議論したように、上記の単位用量組成物について薬学的に受容可能なキャリアは、緩衝剤、ならびに１以上の安定化剤、還元剤、抗酸化剤および／または抗酸化キレート剤を含む。単位用量組成物がＦＧＦ−２および内皮細胞レセプターに結合して、その結果、ＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの血管形成効力を増強するに効果的な量のグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓｏａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）（「プロテオグリカン」または「ムコ多糖」としても公知）（例えば、ヘパリン）を含むことは、本発明の範囲内である。投与されるヘパリンの量は、患者の体重１ｋｇあたり約１０〜８０Ｕ（Ｕ／ｋｇ）、代表的には約４０Ｕ／ｋｇの量である。絶対的な用語で表されると、任意の１患者に投与されるヘパリンの総量は、５，０００Ｕを超えない。従って、再構成の際に、本発明の単位用量組成物は、血管形成に効果的な量のｒＦＧＦ−
２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含むのみならず、これはまた、約１０〜８０Ｕ／ｋｇ、代表的には約４０Ｕ／ｋｇのヘパリンを含む。希釈剤の代表的な容量は、約１〜４０ｍｌである。より多い容量の希釈剤が使用され得るが、このようなより多い容量は、代表的には、より長い投与時間を生じる。患者の体重ｋｇに依存して、０．２μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２、またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含有する単回用量が、患者への投与のために再構成された生成物としてバイアルから引き抜かれる。従って、２４μｇ／ｋｇを服用されている平均７０ｋｇの男性は、バイアルから引き抜かれた、（７０ｋｇ×３０μｇ／ｋｇ）２１００μｇ（すなわち、２．１ｍｇ）のＩＣ注射を受けるに十分な容量の再構成された生成物を有する。
【００４２】
その第２の局面では、本発明は、上記の単位用量組成物を使用する、ＣＡＤまたはＭＩについてヒト患者を処置するための方法に関する。特に、１つの実施形態では、本発明は、冠状動脈疾患についてヒト患者を処置するための方法に関し、この方法は、安全かつ治療的に有効な量の組換えＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを、冠状動脈疾患についての処置を必要とするヒト患者の、１以上の（代表的には２の）冠状血管または末梢静脈に投与する工程を包含する。冠状動脈疾患の処置を必要とするヒト患者は、代表的には、任意の医学管理にもかかわらずアンギナの症候のままである冠状動脈疾患を患うヒト患者である。好ましい冠状血管は、冠状動脈であるが、冠状血管形成術（ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）により提供されるように、移植された伏在静脈および移植された内胸動脈もまた、適切である。単位用量組成物を投与するために適切な末梢静脈には、流体および医薬品の投与のために、処置する医師および看護士によって慣用的に使用されるヒト身体の至る所に見出される末梢静脈を含む。このような静脈の例には、頭部、肘正中皮、および腕の尺側皮が挙げられる。
【００４３】
冠状内（ＩＣ）注入として投与される場合、単位用量のｒＦＧＦ−２またはその血管形成フラグメントもしくは血管形成活性ムテインは、代表的には、１時間以内、より代表的には約２０分の時間にわたって、患者の１以上（代表的には、２）の冠状静脈中に投与される。２０分の時間にわたって投与される場合、単位用量組成物は、代表的には、０．５〜２．０ｍｌ／分、より代表的には約１ｍｌ／分の速度で投与される。冠状静脈は、それらが閉塞されていない限り、ネイティブな血管または移植物であり得る。単位用量のｒＦＧＦ−２またはその血管形成フラグメントもしくは血管形成活性ムテインの容量は、代表的には１０〜４０ｍｌ；より代表的には２０ｍｌである。この単位用量の注入の時間の長さは、重要ではなく、そして注入の速度および容量に依存して短縮または延長され得る。
【００４４】
静脈（ＩＶ）内注射として投与される場合、単位用量のｒＦＧＦ−２またはその血管形成フラグメントもしくは血管形成活性ムテインは、代表的には１時間以内、より代表的には２０分の時間にわたって、従来のＩＶ設定を使用して末梢静脈中に投与される。２０分の時間にわたって投与される場合、単位用量組成物は、代表的には、１ｍｌ／分の速度で投与される。
【００４５】
ＣＡＤを処置するための上記の方法の第一相の臨床試験では、単回の単位用量組成物は、任意の医学管理にもかかわらずアンギナの症候のままであるＣＡＤを有するヒト患者にＩＣまたはＩＶで投与された。本発明の方法は、血管形成を誘導するので、本発明の方法は、ＣＡＤまたはＭＩにおける根本的な状態の処置を提供し、そして硝酸塩により提供されるような症状からの単なる一過性の解放ではない。代表的には、本発明の方法の安全かつ治療的に有効な量は、０．２μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを薬学的に受容可能なキャリア中に含む。他の実施形態において、この安全かつ治療的に有効な量は、０．２μｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇより多く〜２４μｇ／ｋｇ未満、または２４μｇ／ｋｇ〜４８μｇ
／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを薬学的に受容可能なキャリア中に含む。絶対的な用語では、この安全かつ治療的に有効な量は、約０．００８ｍｇ〜約７．２ｍｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテイン；より代表的には、０．３ｍｇ〜３．５ｍｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインである。適切なｒＦＧＦ−２は、配列番号２のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインである。
【００４６】
別の局面では、本発明はまた、ヒト患者の心臓における血管形成を誘導するための方法に関する。この方法は、組換えｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの単回の単位用量組成物を、冠状血管形成を必要とするヒト患者の１以上の冠状血管にまたは末梢静脈に投与する工程であって、上記の単位用量組成物は、約０．００８ｍｇ〜７．２ｍｇの組換えＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを薬学的に受容可能なキャリア中に含む、工程を包含する。より代表的には、この単位用量組成物は、約０．３〜３．５ｍｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを、薬学的に受容可能なキャリア中に含む。上記のように、治療的に有効な量のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む、単回の単位用量組成物は、既に公知でありかつ医薬品（例えば、血栓崩壊剤、ストレプトキナーゼ、または冠状動脈を可視化するために使用される放射性を透過しない（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）色素または磁気粒子）の冠状内投与について当該分野において使用される、標準的な心臓カテーテル技術を使用して、血管形成を必要とするヒト患者の少なくとも１つの冠状血管に投与される。例としては、冠状カテーテルは、処置を必要とする患者の動脈（例えば、大腿または鎖骨下）に挿入され、そしてこのカテーテルが、処置される患者の適切な冠状血管中に配置されるまで、見えるように前方に押し出される。明確な線を維持するために標準的な注意を使用して、溶液形態の薬学的組成物は、１０〜３０分の時間にわたって実質的に連続的に単位用量を注射することによって投与される。本発明の薬学的組成物は、より長い時間にわたって投与され得るが、本出願人らは、有益性も、そのようにすることによる血栓症の潜在的に増大した危険性も全く認知しない。代表的には、単位用量の一部（例えば、半分）は、第１の冠状血管に投与される。次いで、カテーテルは、第２の２次冠状血管に再び配置され、そしてこの単位用量の残留物は、このカテーテルを洗浄しながら投与される。上記の再配置手順を使用して、単位用量の一部は、その単位用量の全体が投与されるまで、複数の冠状血管に投与され得る。投与の後に、このカテーテルは、従来の当該分野で公知のプロトコルを使用して引き抜かれる。本明細書中に記載される第一相の臨床試験において、治療の有益性が、単回の単用量のＩＣ ｒＦＧＦ−２投与に従う２週間程度の早さで患者により報告された。臨床的に有意な改善が、本発明の単回の単位用量のＩＣまたはＩＶ投与の後、３０日程度の早さで、客観的な診断基準（ＥＴＴおよび／またはＳＡＱ）により実証され、そして服用後の２ヶ月間維持された。進行性ＣＡＤ疾患を患う特定の患者では、ｒＦＧＦ−２のさらなる単位用量を、最初の単位用量後の２または１２ヶ月の間隔で投与し、しばらくの（ｉｎｔｅｒｉｍ）期間、ＣＡＤの進行を克服するために必要または適切であり得る。非常に進行性のＣＡＤを患う数人の患者では、本発明の単位用量が、４ヶ月の間隔で再投与される。任意の例では、処置する担当医は、必要とされる場合、患者の臨床徴候の慣用的な評価に基づき再投与についての時間を決定し得る。
【００４７】
本発明の方法の有益性の１つは、心臓の血管新生である。従って、別の局面において、本発明は、ヒト患者の心臓における血管新生を誘導するための方法に関し、この方法は、血管神聖的に有効な量のｒＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントもしくはそのムテインを薬学的に受容可能なキャリア中に含む、単回単位用量組成物を、冠状血管新生を必要とするヒト患者の１以上の冠状血管（ＩＣ）中または末梢静脈（ＩＶ）中に投与する工程を包含する。上記の方法において、血管神聖的に有効な量は、約０．２μｇ／ｋｇ
〜約４８μｇ／ｋｇ（または絶対的な用語では、約０．００８ｍｇ〜約７．２ｍｇ）の組換えＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントもしくはそのムテインを含む。さらに代表的には、血管神聖的に有効な量は、約０．３ｍｇ〜約３．５ｍｇの組換えＦＧＦ−２またはその血管新生に活性なフラグメントもしくはそのムテインを含む。上記で同定された方法における使用に適切なｒＦＧＦ−２は、配列番号２のｒＦＧＦ−２またはその血管新生的に活性なフラグメントである。上記の方法の１つの実施形態では、単位用量組成物は、患者の冠状血管にＩＣで、または末梢静脈にＩＶで投与される。別の実施形態では、この単位用量組成物は、本明細書中に記載されるように、ヘパリンとともに投与される。
【００４８】
上記の冠動脈新血管新生を提供する方法はまた、１つ以上の冠動脈において心筋梗塞（ＭＩ）を経験したヒト患者において有益である。従って、別の局面において、本発明はまた、ＭＩについてヒト患者を処置するための方法に関し、この方法は、上記ヒト患者の１つ以上の冠動脈血管または末梢静脈に、治療有効量のｒＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントもしくはそのムテインを含む単回単位用量組成物を投与する工程を包含する。上記の方法において、代表的には、単位用量組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に約０．２μｇ／ｋｇ〜約４８μｇ／ｋｇ（または絶対的な用語では、約０．００８ｍｇ〜約７．２ｍｇ）の組換えＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントもしくはそのムテインを含む。上記同定された方法における使用に対して適切なｒＦＧＦ−２は、配列番号２のｒＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントである。
【００４９】
血管形成を必要とする、不安定なアンギナまたは急性心筋梗塞の事象において、本明細書中に開示されている同じ用量のｒＦＧＦ−２またはその血管新生フラグメントまたはそのムテインは、それらの状態を処置する際の補助治療としても有用である。従って、別の局面において、本発明は、血管形成を必要とする、不安定なアンギナまたは急性心筋梗塞について患者を処置するための改善された方法に関し、この方法は、処置が必要な患者に血管形成を提供することを包含し；この改善は、前記ヒト患者の１つ以上の冠動脈血管または末梢静脈に、治療有効量のｒＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントもしくはそのムテインを含む単回単位用量組成物を投与することを包含する。上記の方法において、単位用量組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に約０．２μｇ／ｋｇ〜約４８μｇ／ｋｇ（または絶対的な用語では、約０．００８ｍｇ〜約７．２ｍｇ）の組換えＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントもしくはそのムテインを含む。上記同定された方法における使用に対する適切なｒＦＧＦ−２は、配列番号２のｒＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントである。
【００５０】
本発明の任意の上記方法において、ｒＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントもしくはそのムテインは、一酸化窒素（認知された平滑筋拡張薬）の放出に関連しており、患者に投与すると患者の血圧の急激な低下を引き起こす。従って、本発明の方法において、本発明の単位用量を投与する前に、ＩＶ液体を患者に補給をする（ｈｙｄｒａｔｅ）ことが好ましい。さらに、単位用量の安全性および許容性のために、ｒＦＧＦ−２投与中および投与後の積極的な液体管理もまた好まれる。結局、有効量のグリコサミノグリカン（「プロテオグリカン」または「ムコポリサッカライド」としても公知である）を投与する工程（例えば、本発明の単位用量組成物を投与する前に、ヘパリンを０〜３０分投与する工程）を包含することもまた、上記の方法の範囲内である。代表的には、投与されるグリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）の有効量は、約１０〜８０Ｕ／ｋｇであり、より代表的には、約４０Ｕ／ｋｇである。しかし、一般的には、投薬する直前に任意の一人の患者に投与されるヘパリンの総量は、５，０００Ｕを超えない。
【００５１】
ＥＤＴＡが、通常の心筋収縮および心臓伝導に必要なカルシウムの強力なキレーターであるという理由で、ＥＤＴＡの濃度を最小化することは、患者の安全に対して重大である
。１００μｇ／ｍｌ未満濃度のＥＤＴＡが、ヒト患者へのＩＣまたはＩＶ注入によりｒＦＧＦ−２の投与の安全性を最適化した。
【００５２】
ｒＦＧＦ−２の急激な大量瞬時投与は、動物における超低血圧（ｐｒｏｆｏｕｎｄ ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｏｎ）と関連するので、注入速度は患者の安全に対して重大である。０．５〜２ｍＬ／分での投与（代表的には、１ｍＬ／分）が、ヒト患者へのＩＣまたはＩＶ注入によるｒＦＧＦ−２の投与の安全性を最適化した。
【００５３】
本発明の単回単位用量組成物を投与することにより、ＣＡＤについてヒト患者を処置することに関するフェーズＩの臨床試験が実施され、本明細書中の実施例１〜３に記載される。その試験において、ＣＡＤと診断された６６人のヒト患者（本明細書中の実施例２の基準を満たす）が、本発明の方法に従って、単回単位用量のｒＦＧＦ−２を受けた。具体的には、５２人のヒト患者に約２０分間にわたって、ＩＣ注入により単位用量０．３３μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２が投与された。１４人のヒト患者に、約２０分間にわたって、ＩＶ注入により単位用量１８μｇ／ｋｇまたは３６μｇ／ｋｇのいずれかのｒＦＧＦ−２が投与された。次いで、６６人の処置された患者は、当該分野で認知された評価基準の３セット：１）患者らの運動許容時間（ＥＴＴ）の変化；２）シアトルアンギナ質問表（Ｓｅａｔｔｌｅ Ａｎｇｉｎａ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）（これは、客観的な基準と主観的な基準の混合された組み合わせに基づく評価を提供する）：および３）ＭＲＩにより評価されるような心臓における物理的変化の測定を使用して、ベースライン（すなわち、単回単位用量での処置の前）と比較して、そして単回単位用量での処置の１ヶ月後、２ヶ月後、そして６ヶ月後に再び評価された。
【００５４】
実施例１〜３のフェーズＩの臨床試験の６６人の患者のＥＴＴを、Ｂｒｕｃｅトレッドミルプロトコールを使用して、ベースライン時、（本発明の単回単位用量組成物の）投与後１ヶ月、２ヶ月、および６ヶ月に測定した。トレッドミルプロトコールがベースライン時に使用されたものと同じでない場合、その被験体はこの分析から除外された。従って、被験体の数は、時間が経つと変化した。さらに、緊急の血管再生を有するいずれの患者も、この分析から除外された。用量は、ベースラインからのＥＴＴの平均変化が６０秒よりも大きな値で増加した場合、有効であると考えられた。ＥＴＴ評価の結果は、表１に提供される。
【００５５】
【表１】
表１を参照すると、１ヶ月におけるベースラインからの平均変化は、すべての投与群について６０秒未満であった。しかし、アンギナによりトレッドミル試験を中止する患者の割合は、すべての群において時間とともに減少した。投与後２ヶ月および６ヶ月におけるベースラインからの平均変化は、用量の多いＩＣ群およびＩＶ群の患者において、用量が少ないかまたは中程度のＩＣ群よりも大きかった。用量の多いＩＣ群（２４〜４８：μｇ／ｋｇ）およびＩＶ群（１８および３８：μｇ／ｋｇ）における各々の６ヶ月の増加したＥＴＴの持続性（１３３．１秒および８７．５秒）は、予想外であった。ＥＴＴの最も大きな平均の増加は、それぞれ２ヶ月および６ヶ月の１０７．９秒および１３３．１秒であり、これらは、用量の多い（２４〜４８μｇ／ｋｇ）ＩＣ群において生じた。ＩＶ群は、それぞれ２ヶ月および６ヶ月にて９３．４秒および８７．５秒というＥＴＴの有意な平均増加を示し、このことは、本明細書中で使用したラットおよびブタの動物モデルによっては予想されなかった。全体としては、２ヶ月におけるこの効果（ＥＴＴの増加）の持続性およびＩＣ群とＩＶ群の両群のその大きさは、全く予想外であった。
【００５６】
本明細書中の実施例１〜３に記載されるフェーズＩの臨床試験の６６人のヒト患者はまた、Ｓｅａｔｔｌｅ Ａｎｇｉｎａ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＳＡＱ）を使用して、評価された。ＳＡＱは、認可され、疾患特異的な、クオリティーオブライフの手段であり、これは以下の５つのスケールを評価する：１）「労作耐容量（ｅｘｅｒｔｉｏｎａｌ
ｃａｐａｃｉｔｙ）」＝身体的活動の限界；２）「疾患認知」＝ＭＩの懸念；３）「処置の満足感（ｓａｔｉｓｆａｃｔｉｏｎ）」；４）「アンギナ頻度（ａｎｇｉｎａ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）」＝エピソード数およびニトログリセリンの舌下使用；および５）「アンギナ安定性」＝最も激しい身体的活動でのエピソード数。各々の５つのスケールの得点の可能な範囲は、０〜１００であり、より高い得点は、より良いクオリティーオブライフを示す。代表的には、平均ベースライン得点（すなわち処置前）と処置後の得点との間が８ポイント以上の平均変化は、「臨床的に有意」であると認識される。しかし、本分析に
おいて、ベースラインからの得点の平均変化が、１４ポイントより大きな値で増加した場合、用量は「有効」と考えられた。１４が選択された（８の代わりに）理由は、別の増殖因子（ＶＥＧＦ）の臨床試験の２ヶ月時のプラセボ群において見られた改善を考慮したためであった。
【００５７】
ＳＡＱ評価を実施する際に、ＥＴＴについて評価された同じ投与量の群に従って患者を分類した（すなわち、０．３３〜２．０μｇ／ｋｇＩＣ（低）；６．０〜１２．０μｇ／ｋｇＩＣ（中）；２４〜４８μｇ／ｋｇＩＣ（高）；ならびに１８および３６μｇ／ｋｇＩＶ）。このアンケート用紙を、ベースライン時（投与前）、ならびに本発明の方法に従ってｒＦＧＦ−２の単回単位用量組成物を投与された後の２ヶ月および６ヶ月に各投与量群毎に被験体に与えた。
【００５８】
第１のＳＡＱスケールは「労作能力（ｅｘｅｒｔｉｏｎａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ）」である。労作能力に関するデータを、本明細書中の表２に要約する。表２において反映されるように、
【００５９】
【表２】
平均得点のベースラインからの変化は、３つのＩＣ投与量群の各々について２ヶ月および６ヶ月に増加し、そして６ヶ月にはすべての投与量群（ＩＣおよびＩＶ）について増加した。すべての投与量レベルにおける全得点は、２ヶ月から６ヶ月の日を追うごとに増加し、投与後６ヶ月においてベースラインと比較して最も良い増加（２３．２、２４．１、２２．９および１６．５）が見られた。
【００６０】
評価されるべき第２のＳＡＱスケールは、「アンギナ安定性」であった。アンギナ安定性を要約するデータを、本明細書中の表３に示す。
【００６１】
【表３】
表３によると、アンギナ安定性についての得点の変化は、各群について２ヶ月および６ヶ月の両方でベースラインと比較して増加した。投与後２ヶ月において見られるアンギナ安定性の改善（４６．２、３２．１、３４．３、および３９．６）は、６ヶ月において見られる得点よりも有意に大きかった（２１．４、１６．７、１７．７、および２３．２）。しかし、投与後、２ヶ月および６ヶ月の両方で見られる得点は、アンギナ安定性の増加においてすべての投与量が有効（＞１４）であることが判明したことを示した。さらに、増加の大きさおよび６ヶ月間の持続は、予想外であった。
【００６２】
評価されるべき第３のＳＡＱスケールは、「アンギナ頻度」であった。アンギナの頻度を要約するデータを、本明細書中の表４に示す。
【００６３】
【表４】
表４によると、アンギナ頻度についての患者の平均得点（２７．９、３２．９、２８．９および２０．０）は、２ヶ月で、すべての投与量群について、そしてすべての投与方法（ＩＣまたはＩＶ）について有効量（＞１４）で増加した（ベースラインと比較して）。患者の平均得点は、中程度の用量（６．０〜１２．０μｇ／ｋｇ）群についてのみ６ヶ月で増加し続け、投与後２ヶ月のピーク効果を示唆する。しかし、中程度の用量（６．０〜１２．０μｇ／ｋｇ）群および大量の用量（２４．０〜４８．０μｇ／ｋｇ）群について、２ヶ月および６ヶ月の変化は類似しており、アンギナ頻度の６ヶ月における持続効果を示唆する。
【００６４】
評価されるべき第４のＳＡＱスケールは、「処置満足感」であった。処置満足を要約するデータを、本明細書中の表５に示す。
【００６５】
【表５】
表５によると、処置の満足についての得点は２ヶ月で、中程度および大量の用量のＩＣ群ならびにＩＶ群について有効量で増加した。投与後２ヶ月において、中程度の用量群ＩＣについての得点だけが１４よりも大きな得点を有し、２ヶ月の処置の満足についてのピーク効果を示唆する。
【００６６】
評価されるべき第５のＳＡＱスケールは、「疾患認知」であった。疾患認知を要約するデータを、本明細書中の表６に示す。表６によると、疾患認知についての得点は、２ヶ月でベースラインから２０．２〜２９．２という得点まで増加し、６ヶ月で２３．８〜３４．０まで増加した。これらの得点は、単回単位用量組成物を本発明の方法にしたがって投与することは、２ヶ月おいてと同じくらい６ヶ月において有効である（またはより有効）と考えられた。これらの得点は、単回単位用量組成物の投与後、６ヶ月以上までの、疾患認知に対する本発明の方法の効果の持続性を示唆する。
【００６７】
【表６】
本明細書中の実施例１〜３に記載されるフェーズＩ臨床試験のヒト患者の６０人まではまた、彼らの心臓を安静時（ｒｅｓｔｉｎｇ）磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャンを使用して評価された。安静時ＭＲＩスキャンが、患者に対して、ベースライン時に、ならびに本発明の単回単位用量組成物の投与後１ヶ月、２ヶ月、および６ヶ月に実施された。用量は、統計学的有意性（ｐ＜０．０５）に基づいて「有効」と考えられた。安静時ＭＲＩスキャンにより評価される客観的な基準は以下：（１）駆出率；（２）心筋梗塞の程度（％）；（３）通常の壁厚；（４）通常の壁運動（％）；（５）標的壁肥厚（％）；（６）標的壁の運動（％）；（７）標的壁領域側副程度（％）；および（８）標的領域の遅着の程度（％）である。
【００６８】
安静時ＭＲＩに基づくと、「駆出率」の変化は、すべての群について１ヶ月では観察されなかった。１ヶ月におけるすべての群（ｎ＝３３）についてのベースラインからの平均変化は、２．０％（ｐ＝０．０４２）の増加であった。２ヶ月においては、少用量のＩＣ群（ｎ＝１３）についてのベースラインからの平均変化は、８．１％（ｐ＝０．００７）の増加であった；そしてすべての群について（ｎ＝５４）、ベースラインからの平均変化は、３．８％の増加であった（ｐ＝０．００１）。６ヶ月において、大用量のＩＣ群（ｎ＝１９）についてのベースラインからの平均変化は、５．３％（ｐ＝０．０２３）であった；そしてＩＶ群（ｎ＝３）について、１１．１％（ｐ＝０．０８７）であった；そしてすべての群（ｎ＝３３）について、５．７％（ｐ＝０．００１）であった。
【００６９】
安静時ＭＲＩに基づくと、いずれの群、または投与後の１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月での組合せにおけるすべての群について「心筋梗塞の程度」％の統計学的に有意な変化は、存在しなかった。通常の壁運動（％）および通常の壁厚が評価された場合、いづれの一つの群についての１ヶ月、２ヶ月、または６ヶ月でのベースラインからの統計学的に有意な変化は、存在しなかった。しかし、標的壁運動において、１ヶ月（ｎ＝６０）、２ヶ月（ｎ＝５４）、または２ヶ月（ｎ＝３３）でのすべての群について、ベースラインからの統計学的に有意な変化は存在し、これはそれぞれ、２．７％（ｐ＝０．０１５）、４．４％（ｐ＝＜０．００１）および６．４％（ｐ＜０．００１）のベースラインからの平均増加として反映された。しかし、標的壁厚においてもまた、１ヶ月（ｎ＝６０）、２ヶ月（ｎ＝５４）、および２ヶ月（ｎ＝３３）でのすべての群について、ベースラインからの統計学的に有意な変化が存在し、これはそれぞれ、４．４％（ｐ＝０．０１５）、６．３％（ｐ＝
＜０．００１）および７．７％（ｐ＜０．００１）のベースラインからの平均増加として反映された。
【００７０】
ＭＲＩにより評価された次の基準は、「標的領域側副の程度」（％）であった。標的領域側副の程度におけるすべての群についてベースラインからの平均増加は、１ヶ月（ｎ＝３１）、２ヶ月（ｎ＝２７）および２ヶ月（ｎ＝１６）において高度な統計学有意があり、ここでその増加はそれぞれ８．３％（ｐ＝＜０．００１）、１０．９％（ｐ＝＜０．００１）および１１．２％（ｐ＝＜０．００１）であった。最も大きな側副の程度の増加は、少量および中程度のＩＣ用量に対して観察され、すなわち、１ヶ月で（それぞれ１０．４％および１８．３％）、２ヶ月で（それぞれ１４．７％および１８．０％）および２ヶ月で（それぞれ１６．０％および中程度の用量に対する値はなし）であり、これは全く予想外であった。投与後１ヶ月、２ヶ月および２ヶ月において、ＩＣ大用量群について観察された標的領域側副の程度における対応する割合の増加は、それぞれ６．３％、８．０％および９．０％であった。ＭＲＩにより評価された最後の基準は、「標的領域の遅着の程度」（％）であった。標的領域の遅着の程度におけるすべての群についてベースラインからの平均減少は、１ヶ月（ｎ＝６０）、２ヶ月（ｎ＝５４）および６ヶ月（ｎ＝３４）において高度に統計学的有意性であり、ここでその減少は、それぞ−５．８％（ｐ＝＜０．００１）、−８．３％（ｐ＝＜０．００１）および−１０．０％（ｐ＝＜０．００１）であった。最も大きな標的領域の遅延程度の減少は、少用量のＩＣ群に対して観察され、これは高度に予想外であった。
【００７１】
従って、本発明に従ってＣＡＤ患者にｒＦＧＦ−２の単一ＩＣまたはＩＶ注入を提供することは、その患者に、ＭＲＩおよび他の従来の基準により客観的に測定されるような統計学的に有意な身体的改善を提供した。
【００７２】
（薬物動態および代謝）
ＦＧＦ−２の分子構造は、細胞表面および血管の内壁でプロテオグリカン鎖（ヘパリンおよびヘパリン様構造）に結合することが公知である正に荷電したテールを含む。Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉら、「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ ａｎｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６３８：１７７〜１８１（１９８１）を参照のこと。
【００７３】
腎臓および肝臓は、ｒＦＧＦ−２の排泄のための主な器官である。特に、腎臓は、約６０ｋＤのタンパク質カットオフを有し、従って血清アルブミン（ＭＷ６０ｋＤ）を保持する。しかし、ＦＧＦ−２（１４６残基）は、約１６．５ｋＤの分子量を有する。従って、腎排泄が予期される。市販のウシＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ−２）の放射線標識した生体分布研究において、肝臓および腎臓の両方が、ＩＶ注射またはＩＣ注射後１時間で高い計数の放射線標識したｂＦＧＦ−２を含むことが示された。公表された研究において、ｂＦＧＦ−２の別の組換えヨウ素化形態がラットに与えられる場合、肝臓が排泄の主な器官であると同定された。Ｗｈａｌｅｎら、「Ｔｈｅ Ｆａｔｅ ｏｆ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｂＦＧＦ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｅｐａｒｉｎ」Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、１：１５７〜１６４（１９８９）。ＦＧＦ−２が、全身循環においてα２−マクログロブリンに結合すること、そしてこの複合体がクッパー細胞上のレセプターにより内部移行されることもまた公知である。Ｗｈａｌｅｎら（１９８９）およびＬａＭａｒｒｅら「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ａｌｐｈａ−２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６５：３〜１４（１９９１）。標識されたＦＧＦ−２フラグメントは、血漿中で見出されないが、それらは、尿中で見出され、そして細胞内分解産物に対するサイズに対応してい
た。
【００７４】
前臨床試験において、本発明者らは、家畜のヨークシャーブタへの静脈内（ＩＶ）投与および冠内（ＩＣ）投与後、およびＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（「ＳＤ」）ラットにおけるＩＶ投与後のｒＦＧＦ−２（配列番号２）の薬物動態を決定した。このブタモデルは、ＩＣおよびＩＶの線形の薬物動態を示した（０．６５μｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇ）。このブタモデルにおけるＦＧＦ−２の終末半減期は、３〜４時間であった。ラットモデルは、３０〜３００μｇ／ｋｇ ＩＶの範囲にわたる線形の薬物動態を示した。ラットモデルにおけるＦＧＦ−２の終末半減期は、１時間であった。両方の種が、２コンパートメントモデルを示唆する血漿濃度を示した。
【００７５】
同様に、ヒトにおいて、ＩＶおよび／またはＩＣ注入後のＦＧＦ−２血漿濃度は、最初の急激な曲線および最初の１時間の数対数スケールにわたるかなりの低下（分布相））を有する二次指数関数的な曲線を伴い、続いて、より穏やかな減少を伴った（排泄相）。図１Ａは、血漿濃度対時間の曲線を提供する。これは、以下の８つの用量のそれぞれの関数として、配列番号２のｒＦＧＦ−２のＩＣ投与後のヒトにおけるこれらの相を示す：除脂肪体重（ＬＢＭ）の０．３３μｇ／ｋｇ、０．６５μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、３６μｇ／ｋｇおよび４８μｇ／ｋｇ。図１Ａは、２０分間にわたるＩＣ注入により投与されるｒＦＧＦ−２の８つの用量についての血漿用量直線性を示す。図１Ａはまた、二相性の血漿レベル低下（すなわち、最初の１時間の速い分布相、その後の排泄相（５〜７時間のＴ１／２と評価））を示す。配列番号２のＦＧＦ−２の血漿濃度を、ヒトＦＧＦ−２の分析のために販売された市販のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）により決定した。このＥＬＩＳＡアッセイは、配列番号２のｒＦＧＦ−２と１００％の交差反応性を示した。ＦＧＦファミリーの他のメンバーおよび多くの他のサイトカインは、このアッセイでは検出されなかった。さらに、ヘパリンはこのアッセイを妨害しない。
【００７６】
図１Ｂは、ＩＣ投与した３６μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２と比較した、ＩＶ投与の１８μｇ／ｋｇおよび３６μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２についての時間の関数としての平均ＦＧＦ−２血漿濃度のプロットである。ＩＶ経路およびＩＣ経路による３６μｇ／ｋｇ用量について、図１Ｂにおける血漿濃度対時間のプロフィールは、非常に印象的である。しかし、ＩＣ経路で初回通過効果は、排除されない。
【００７７】
図２は、図１Ａおよび図１Ｂに対応するｐｇ＊分／ｍｌでの平均ＦＧＦ−２曲線下面積（ＡＵＣ）のプロットである。図２は、ＩＣまたはＩＶ注入後の全身性ｒＦＧＦ−２曝露（ＡＵＣ）の用量直線性を示す。特に、図２は、ＩＣ経路およびＩＶ経路での投与後のｒＦＧＦ−２に対する全身性曝露が、実質的に類似であることを示す。
【００７８】
図３は、「ｒＦＧＦ−２注入の直前」でのヘパリン投与の時間の関数としての個々のヒト患者血漿クリアランス（ＣＬ）値（ｍｌ／分／ｋｇ）のプロットである。図３は、ＦＧＦ−２血漿クリアランス（ＣＬ）へのヘパリン投与のタイミングの影響を示す。図３は、ｒＦＧＦ−２前１００分までのヘパリン投与がＦＧＦ−２クリアランスを減少することを示すが、ヘパリン投与のための好ましい時間は、ｒＦＧＦ−２投与前０〜３０分である。ここでＦＧＦ−２クリアランス減少へのヘパリンの効果は最大である。
【００７９】
図４は、「ｒＦＧＦ−２注入前の分単位で」のヘパリン投与の時間の関数としての個々のヒト患者のｒＦＧＦ−２用量の正規化曲線下面積（ＡＵＣ）のプロットであり、そしてｒＦＧＦ−２ ＡＵＣへのヘパリン投与のタイミングの影響を示す。図４は、最大のＡＵＣ／用量が、有効量のグリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）がＩＣ ｒＦＧＦ−２注入の３０分以内に、より好ましくはＩＣまたはＩＶ ｒＦＧＦ−２注入の２０分以内に
、前投与された場合に、達成されることを示す。代表的には、有効量のグリコサミノグリカンは、１０〜８０Ｕ／ｋｇのヘパリンである。
【００８０】
投与の投与量および様式の関数としてのヒトにおけるｒＦＧＦ−２についての平均薬物動態パラメーターは、本明細書中の表７に要約される。表７についていえば、ヒトにおけるＦＧＦ−２のＴ１／２は、低用量（０．３３〜２．０μｇ／ｋｇ）ＩＣでの２．２±３．７時間から１８〜３６μｇ／ｋｇ ＩＶの用量での７．０±３．５時間までの範囲に決定される；アッセイの限界を考慮して、終末半減期は、全ての群について５〜７時間と推定される。ＦＧＦ−２のクリアランスは、７０ｋｇ男性について１３．２〜１８．２Ｌ／時間にわたる範囲である。結局、定常状態容積（Ｖｓｓ）は、７０ｋｇの男性あたり１１．３±１０．４Ｌ〜１６．８±１０．７Ｌの範囲と決定された。
【００８１】
【表７】
ヘパリン様構造へのＦＧＦ−２の結合は強力である（解離定数約２×１０−９Ｍ）が、特定のチロシンキナーゼレセプターへのＦＧＦ−２の結合は、およそ２桁大きい（解離定数約２×１０−１１Ｍ）。Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉら（１９９１）。従って、どのような理論にも束縛されることなく、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）とのｒＦＧＦ−２の複合体化は、シグナル伝達および有糸分裂誘発を増加し得、そして／または酵素的分解からｒＦＧＦ−２を防御する。
【００８２】
本明細書中に開示されるようなＦＧＦ−２の投与についての本発明のさらなる局面としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＥＴＴトレッドミル分析によって測定されるような運動能力の改善；ＳＡＱの労作性能力ドメインによって測定されるような運動能力の改善；アンギナの頻度の減少；およびＭＲＩによって測定されるような灌流の増加。特に、運動能力は、鬱血性心不全を有する患者において有意に改善された。
【００８３】
以下の実施例は、例示のために提供され、限定のために提供されるのではない。
【実施例】
【００８４】
（実施例１）
（第Ｉ相臨床試験において使用される単位用量のｒＦＧＦ−２）
配列番号２のｒＦＧＦ−２を、単位用量として、かつ薬学的組成物として処方し、そしてラット、ブタおよび最終的には、本明細書に言及される第Ｉ相臨床試験でヒトに投与した。種々の処方物を以下に記載する。
【００８５】
ｒＦＧＦ−２単位用量を、積層した灰色のブチルゴムの栓および赤色のフリップオフ（ｆｌｉｐ−ｏｆｆ）オーバーシールを備える３ｃｃのＩ型ガラスバイアル中の液体として
提供した。ｒＦＧＦ−２の単位用量は、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭモノチオグリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物（分子量３７２．２）、１３５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ５．０）中に、１．２ｍｌの０．３ｍｇ／ｍｌの配列番号２のｒＦＧＦ−２を含んでいた。従って、絶対的な用語では、それぞれのバイアル（および単位用量）は、０．３６ｍｇのｒＦＧＦ−２を含んでいた。液体形態で単位用量を含有するバイアルを２℃〜８℃で保存した。
【００８６】
ｒＦＧＦ希釈剤を、積層した灰色のブチルゴム栓および赤色のフリップオフオーバーシールを備える５ｃｃＩ型バイアル中に供給した。ｒＦＧＦ−２希釈剤は、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭモノチオグリセロール、１３５ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ５．０）を含む。各バイアルは、５．２ｍｌのｒＦＧＦ−２希釈溶液を含み、これを２℃〜８℃で保存した。
【００８７】
注入されたｒＦＧＦ−２薬学的組成物を、注入容量が１０〜４０ｍｌになるように、ｒＦＧＦ−２単位用量をｒＦＧＦ希釈剤で希釈することによって調製した。ＥＤＴＡ濃度を１００μｇ／ｍｌのプリセット限界未満に維持するために、この全注入容量を、より高い体重を有する患者に対して、比例的より高い絶対量のＦＧＦ−２が投与される場合には、最大４０ｍｌに増加させた。
【００８８】
（実施例２）
（ｒＦＧＦ−２での処置についての、冠状動脈疾患を有する患者についての選択基準）
以下の選択基準を、冠状動脈疾患を有する第Ｉ相患者へ適用した。これらの患者の活動は、最適な医学的管理にもかかわらず冠状虚血によって制限され、そしてこれらの患者は、承認された脈管再生治療についての候補でなかった。
【００８９】
（包含基準：）被験体は、以下である場合に適格である：
・１８歳以上の男性または女性
・冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の診断
・承認された脈管再生治療手順（例えば、血管形成術、ステント、冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ））についての準最適な候補（またはこれらの介入を拒否する）
・改変されたＢｒｕｃｅプロトコルを使用して少なくとも３分間運動することが可能であり、そして冠状虚血によって制限される
・薬理学的に圧迫されたタリウムセスタミビ（ｓｅｓｔａｍｉｂｉ）スキャンに対する、少なくとも２０％の心筋の誘導性かつ可逆性の欠陥
・必要な心臓カテーテル法について臨床的に受容可能である範囲内のＣＢＣ、血小板、血清化学
・正常ＩＮＲ、またはＣｏｕｍａｄｉｎで抗凝固である場合、ＩＮＲ＜２．０
・全ての必要な研究手順および追跡訪問を含むこの研究に参加するための、意志および書面でのインフォームドコンセントを提供し得る。
【００９０】
（除外基準：）被験体は、以下である場合に適格でない：
・悪性腫瘍：治癒的に処置された基底細胞癌を除く過去十年内の悪性腫瘍の何らかの病歴、
・眼の状態：増殖性網膜症、重篤な非増殖性網膜症、網膜静脈閉塞、イールズ病、または斑状浮腫、あるいは眼科医による検眼鏡検査法：２ヶ月以内の眼内手術の病歴
・腎臓機能：年齢について調整される正常範囲未満のクレアチニンクリアランス；タンパク質＞２５０ｍｇまたはミクロアルブミン＞３０ｍｇ／２４時間 尿
・ＩＶクラス心不全（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）
・心エコー図、タリウムスキャン、ＭＲＩまたはゲートされプールされた血液スキャン（ｇａｔｅｄ ｐｏｏｌｅｄ ｂｌｏｏｄ ｓｃａｎ）（ＭＵＧＡ）により駆出率＜２０
％
・血流力学的関連不整脈（例えば、心室細動、持続性心室性頻脈）
・重篤な弁狭窄（大動脈領域＜１．０ｃｍ２、僧帽弁領域＜１．２ｃｍ２）、または重篤な弁不全
・３週間以内のアンギナまたは不安定アンギナの顕著な増加
・３ヶ月以内の心筋梗塞（ＭＩ）の病歴
・２ヶ月以内の一過性虚血発作（ＴＩＡ）または発作（ｓｔｒｏｋｅ）の病歴
・２ヶ月以内のＣＡＢＧ、血管形成術またはステントの病歴
・２ヶ月以内の経心筋レーザー脈管再生、ｒＦＧＦ−２、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）での処置の病歴
・妊娠の可能性または保育中の母の女性
・任意の病理学的線維症、例えば、肺の線維症、強皮症
・既知の脈管奇形、例えば、ＡＶ奇形、血管腫
・ＣＡＤの症状の評価を干渉し得る任意の疾患、例えば、心膜炎、肋軟骨炎、食道炎、全身性脈管炎、鎌状赤血球症の同時存在
・改変Ｂｒｕｃｅプロトコル運動ストレス試験の実行を制限する任意の疾患、例えば、下肢の麻痺または切断、下肢の重篤な関節炎、重篤な慢性閉塞性肺性疾患（ＣＯＰＤ）の同時存在
・３０日以内（または、研究薬物の６０日以内に計画される）の、調査薬剤、デバイスまたは手順の臨床試験への参加
・ｒＦＧＦ−２または関連化合物に対する既知の過敏症
・調査員の意見において、本研究における参加について不適切な被験体を生じる任意の条件、例えば、精神病、重篤な精神遅滞、研究員とコミュニケーションが取れないこと、薬物またはアルコール乱用。
【００９１】
（実施例３）
（ヒトへ投与される組換えＦＧＦ−２（配列番号２）についての第Ｉ相臨床試験）
本実施例の第Ｉ相ＣＡＤ試験は、安全性、耐容性および薬物動態についての、組換え線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）の、オープンラベル（ｏｐｅｎ ｌａｂｅｌ）の段階的用量研究である。この研究を以下の２つの場所で実施した：Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡのＢｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｈａｒｖａｒｄ）およびＡｔｌａｎｔａ、ＧＡのＥｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ。記録は完全である。被験体を、１日目にｒＦＧＦ−２の単回注入で処置し、３６０日間続けた；追跡は、幾人かの被験体においてはなお不完全である。
【００９２】
被験体集団は、冠状動脈虚血によって運動制限され、そして確立された血管再生手順（例えば、ＣＡＢＧ、血管形成術（ステントを用いるかまたは用いない））の１つについての準最適候補とみなされた（またはこの手順を受けたがらない）、進行したＣＡＤを有する患者からなる。主な除外基準は、悪性腫瘍、非代償性心不全もしくは２０％未満の左心室駆出率、腎不全もしくは蛋白尿、および種々の眼の状態（例えば、増殖性糖尿病性網膜症、重篤な非増殖性網膜症）の病歴または疑いであった。
【００９３】
６６人の被験体に、この試験において配列番号２のｒＦＧＦ−２を受けさせた：５２人にｒＦＧＦ−２をＩＣ注入として受けさせ、そして１４人にｒＦＧＦ−２をＩＶ注入として受けさせた。各被験体を、病院内で少なくとも２４時間観察し、次いで、追跡訪問で３６０日の間（１５、２９、５７、１８０および３６０日）、外来患者として追跡した。少なくとも４人の被験体を各用量で研究した；被験体が２日以内にプロトコールにより規定されたような用量制限毒性を経験しなかった場合、用量を増大した。薬物を、冠状動脈血液供給（ＩＣ）の２つの主要な供給源間に分割された単回の２０分間の注入として、（血管形成術で既に使用されているような）患者の冠状動脈中、または末梢静脈（ＩＶ）内に
カテーテルを配置するための標準的な技法を用いて投与した。ＩＣ投与したｒＦＧＦ−２の用量（μｇ／ｋｇ）（および患者の数）は、配列番号２のｒＦＧＦ−２の０．３３（ｎ＝４）、０．６５（ｎ＝４），２．０（ｎ＝８）、６．０（ｎ＝４）、１２．０（ｎ＝４）、２４（ｎ＝８）、３６（ｎ＝１０）および４８（ｎ＝１０）であった。ＩＶ投与したｒＦＧＦ−２の用量（μｇ／ｋｇ）（および患者の数）は、配列番号２のｒＦＧＦ−２の１８．０（ｎ＝４）および３６．０（ｎ＝１０）であった。
【００９４】
アンギナ頻度および生活の質は、ベースライン（ｒＦＧＦ−２投与前）、ならびにｒＦＧＦ−２投与の２ヶ月後および６ヶ月後にＳｅａｔｔｌｅ Ａｎｇｉｎａ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＳＡＱ）により評価した。運動許容時間（ＥＴＴ）は、１ヶ月目、２ヶ月目、および６ヶ月目にトレッドミル試験により評価した。休止／運動核灌流およびゲート化セスタミビ−決定安静（ｇａｔｅｄ ｓｅｓｔａｍｉｂｉ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｒｅｓｔ）駆出率（ＥＦ）、ならびに休止磁気共鳴造影（ＭＲＩ）を、ベースライン、ならびにｒＦＧＦ−２投与の１ヶ月後、２ヶ月後および６ヶ月後に評価した。心臓機能および灌流における変化を％で客観的に測定すると考えられたＭＲＩ測定は；（１）駆出率；（２）心筋梗塞程度（％）；（３）正常壁肥厚；（４）正常運動（％）；（５）標的壁肥厚（％）；（６）標的壁運動（％）；（７）標的壁領域側副程度（％）；および（８）標的領域遅延到達程度（％）を含めた。
【００９５】
４人の被験体のうち１人が、（プロトコールにより規定されるような）用量制限毒性を経験した場合、その用量で４人のさらなる被験体を調査し；誰もが毒性を経験しなかった場合、用量を増大させ、そして別の群を研究した。最大許容用量（ＭＴＤ）は、９／１０の被験体が許容したＩＣ用量、すなわち３６μｇ／ｋｇ ＩＣとして規定した。
【００９６】
注入前の注意深い流体管理を、Ｓｗａｎ−Ｇａｎｚカテーテルを用いて処方し、そして生命徴候を、投薬の間に頻繁にモニタリングした。ヘパリンを、すべての群においてｒＦＧＦ−２の注入の前にＩＶ投与した。ＥＤＴＡ濃度は、単位用量組成物中で１００μｇ／ｍｌより少なかった。投与した研究薬物の容量は、用量および被験体の体重で変化し、そして低用量で１０ｍｌから高用量で４０ｍｌの範囲であった。
【００９７】
（予備的結果）
本明細書に提示した結果は未検査であり、そして６６人の被験体（すべての群（１〜１０）について２ヶ月の追跡を伴う）についての第３回目の中間分析、およびＣｈｉｒｏｎ
Ｄｒｕｇ Ｓａｆｅｔｙからの１９９９年７月２９日の重症の有害事象（ＳＡＥ）レポートに基づく。最後の来院（３６０日目）のデータ収集および最終解析は進行中である。
【００９８】
０．３３μｇ／ｋｇ ＩＣの開始用量を、８つの系列の群にわたって４８μｇ／ｋｇ ＩＣまで増大させ、この用量で、１０人の被験体のうち２人が、プロトコールにより規定されたような用量制限毒性（低血圧症）を経験した。低血圧症は、すべての被験体において流体単独で管理可能であった（昇圧剤も補助デバイスもなし）。３６μｇ／ｋｇ ＩＣで、１０人の被験体のうち１人のみが、用量制限毒性を有し、このことは、この用量を最大許容用量（ＭＴＤ）として規定した。２つのさらなる群をＩＶ注入により試験した；４人の被験体はＭＴＤの半分（１８μｇ／ｋｇ）、そして１０人の被験体はＭＴＤ（３６μｇ／ｋｇ）。
【００９９】
低血圧症は、Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅブタにおける動物モデルにより予想されたように、ヒトにおける用量制限であった。しかし、３６．０μｇ／ｋｇ ｒＦＧＦ−２ ＩＣはヒトでは耐性であった；その一方ブタでは２０．０μｇ／ｋｇ ｒＦＧＦ−２ ＩＣは２匹の動物のうち１匹で意味深い低血圧症を引き起こした。ヒトにおけるより良好な耐容性は、積極的な流体管理および全身麻酔の不在に起因した。
【０１００】
１９９９年７月２９日付けで、３３の重篤な有害事象（ＳＡＥ）が２４／６６の被験体で生じたが、用量関連ではなかった。１５のＳＡＥは、少なくとも潜在的にはｒＦＧＦ−２に関連したと考えられた；調査者および医療管理者により指定された関連性の間に差異が存在したときは、より保守的な関係が指定された。ＳＡＥは５人の被験体で複数であった：０１１０３（０．３３μｇ／ｋｇ ＩＣ）、０１１０６（０．６５μｇ／ｋｇ ＩＣ）、０１１１３（２．０μｇ／ｋｇ ＩＣ）、０１１３７（３６．０μｇ／ｋｇ ＩＶ）、０２１０１（０．６５μｇ／ｋｇ ＩＣ）。
【０１０１】
１日目の最も頻繁な処置緊急有害事象（ＡＥ）は、一時的な収縮期低血圧症および一時的な徐脈であった。低血圧症は、用量依存性であり、そして２４μｇ／ｋｇ ＩＣ以上の用量でより頻繁に生じた；徐脈は用量依存性ではなかった。少なくとも関連する可能性があると思われ、そして用量に関連したようであった他の有害事象（ＡＥ）は、注入後最初の数日または１週間以内に生じ、そして胸の痛み、息切れ、不眠、不安、および悪心を含んだ。これらの事象は重篤度において軽度〜中程度であり、そしてほとんどは特定の介入を必要としなかった。
【０１０２】
ＩＣ投与されたとき、この薬物を、カテーテルを患者の冠状動脈中に配置するための（血管形成術ですでに使用されているような）標準的な技法を用い、冠状血液供給（ＩＣ）の２つの主要な供給源間に分割した単回注入として、約２０分間にわたって投与した。ＩＶ投与されるとき、この薬物は、末梢静脈中に２０分間にわたる注入として投与された。
【０１０３】
予備的な安全性結果は、重篤な事象は用量に関連しなかったことを示す。これまで、８つのＩＣ投薬群のうち低投薬群で３人が死亡し（すなわち、０．６５μｇ／ｋｇ（２３日）、２．０μｇ／ｋｇ（５７日）および６．０μｇ／ｋｇ（６３日））、そして最も高い用量群で１人が死亡（すなわち、４８．０μｇ／ｋｇ（投薬後約４ヶ月））した。死亡のうち３人は心臓；１人の死亡は、群４（６．０μｇ／ｋｇ）の患者で投薬の３週間後に診断された大Ｂ細胞リンパ腫に起因し、この患者は投薬の２ヶ月後に死亡した。
【０１０４】
急性心筋梗塞（ＭＩ）が４人の患者で生じた。すなわち、群１（０．３３μｇ／ｋｇ）、群３（２．０μｇ／ｋｇ）、群４（６．０μｇ／ｋｇ）および群７（３６．０μｇ／ｋｇ）の各々からの１人の患者である。複数のＭＩが２人の患者で生じた。すなわち、群１（０．３３μｇ／ｋｇ）から１人および群３（２．０μｇ／ｋｇ）から１人である。緊急血管再形成手順（ステントを用いるかまたは用いないＣＡＢＧまたは血管形成術）を、４人の患者で追跡の間に実施した：群１（０．３３μｇ／ｋｇ）、群３（２．０μｇ／ｋｇ）、群４（６．０μｇ／ｋｇ）および群７（３６．０μｇ／ｋｇ）の各々から１人である。
【０１０５】
注入の間または直後により高い用量で観察された急性低血圧症は、昇圧剤の必要なしに流体のＩＶ投与により管理された。ヒトにおける最大許容用量（ＭＴＤ）を、３６μｇ／ｋｇ ＩＣと規定した（対照的に、ブタでは、このＭＴＤは６．５μｇ／ｋｇ ＩＣであった）。４８μｇ／ｋｇ ＩＣまでのｒＦＧＦ−２の用量を、積極的な流体管理でヒト患者に投与したが、１０人の患者のうち２人の急性低血圧症および／または起立性低血圧症に起因して、プロトコールにより「許容されない」と規定した。注入したｒＦＧＦ−２の終末半減期は５〜７時間と推定された。
【０１０６】
本研究における配列番号２のｒＦＧＦ−２の単回ＩＣ注入または単回ＩＶ注入で処置されたヒト患者は、ＥＴＴにおいて１．５〜２分の平均増加を示した。表１を参照のこと。これは特に顕著である。なぜなら、ＥＴＴにおける３０秒より大きい増加は有意であり、そして血管形成術のような代替治療を評価するための基準と考えられているからである。
ＳＡＱにより測定されるような、アンギナ頻度および生活の質は、試験した６６人の患者（ｎ＝６６）に対する５つのサブスケールの全部において２ヶ月で有意な改善を示した。表２〜６を参照のこと。表２〜６中、１４より高い平均変化は、「臨床的に有意」と考えられた。３３人のヒトＣＡＤ患者を、ベースライン、ならびに本発明の単回単位用量組成物をＩＣまたはＩＶ経路により受けた１ヶ月後、２ヶ月後、および６ヶ月後、静止心臓磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により評価したとき、統計的に高度に有意な増加が、標的壁肥厚、標的壁運動および標的領域側副程度において観察され；統計的に高度に有意な減少が標的領域遅延到達程度において観察され；そして正常壁運動、正常壁肥厚または心筋梗塞程度において統計的に有意な変化は観察されなかった。
【０１０７】
上記の規準（すなわち、ＥＴＴ ＳＡＱ、ＭＲＩ）に加えて、血管形成効果が少なくとも２ヶ月継続する場合に、処置を、非常に成功したとみなす。現在の第Ｉ相研究では、予期せぬ優れた血管形成効果が、すべての投薬群において幾人かの患者で６ヶ月まで継続することが観察された。既に得られた結果に基づいて、この血管形成効果は、患者において、１２ヶ月以上続き得るが、少なくとも２ヶ月は続くことが予測され、必要であれば、その時点でこの手順が繰り返され得る。
【０１０８】
（実施例４）
（第ＩＩ相ヒト臨床試験についてのｒＦＧＦ−２の単位用量および薬学的組成物）
配列番号２のｒＦＧＦ−２を、本明細書で参照される第ＩＩ相臨床試験においてヒトへの投与のための単位用量の薬学的組成物として処方した。種々の処方物を以下に記載する。
【０１０９】
ｒＦＧＦ−２単位用量を、積層された灰色のブチルゴム栓および赤色のフリップオフオーバーシールを備えた５ｃｃのＩ型ガラスバイアル中の液体として調製した。このｒＦＧＦ−２処方物は、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭモノチオグリセロール、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物（分子量３７２．２）、１３５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０中に配列番号２のｒＦＧＦ−２の０．３ｍｇ／ｍｌを含む。各バイアルは、３．７ｍｌのｒＦＧＦ−２薬物産物溶液を含んだ（バイアルあたり１．１１ｍｇのｒＦＧＦ−２）。液体形態中の得られる単位用量を−６０℃未満で貯蔵する。上記に記載した単位用量を、「ｒＦＧＦ−２ プラセボ（ｐｌａｃｅｂｏ）」で希釈する。患者のサイズに依存して、いくつかのバイアルの内容物を組み合わせて、第ＩＩ相研究のための３６μｇ／ｋｇの単位用量を生成し得る。
【０１１０】
ｒＦＧＦ−２プラセボを、積層された灰色のブチルゴム栓および赤色のフリップオフオーバーシールを備えた５ｃｃのＩ型ガラスバイアル中の透明無色の液体として供給する。このｒＦＧＦ−２プラセボは、薬物製品と外見上識別不能であり、そして以下の処方を有する：１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭモノチオグリセロール、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物（分子量３７２．２）、１３５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０。各バイアルは、５．２ｍｌのｒＦＧＦ−２プラセボ溶液を含む。単位用量とは異なり、このｒＦＧＦ−２プラセボを、２℃〜８℃で貯蔵する。
【０１１１】
注入されるｒＦＧＦ−２薬学的組成物を、ｒＦＧＦ−２単位用量を、ｒＦＧＦ希釈剤で、注入容量が第ＩＩ相用に２０ｍｌであるように希釈することにより調製する。
【０１１２】
（実施例５）
（冠状動脈疾患を処置するためにヒトに投与されるｒＦＧＦ−２（配列番号２）に対する第ＩＩ相臨床試験）
冠状動脈疾患についてヒト患者を処置するためのｒＦＧＦ−２の第ＩＩ相臨床試験を、４つのアーム：プラセボ、０．３μｇ／ｋｇ、３．０μｇ／ｋｇ、および３０．０μｇ／
ｋｇの１回ＩＣ投与、を用いる二重盲式／プラセボコントロール研究として実施した。
【０１１３】
（第一の目的）
ベースライン（スクリーニング期間の間）から９０日までの運動許容試験（ＥＴＴ）時間における変化によって測定されるような、運動能力に対するｒＦＧＦ−２ 対 プラセボの単回ＩＣ注入の効果を比較すること。
【０１１４】
（第二の目的）
・ＡＥおよび実験室パラメータにおける変化によって測定されるような、ｒＦＧＦ−２の安全性を評価すること。
【０１１５】
・第Ｉ相研究から、ｒＦＧＦ−２の薬物動態（ＰＫ）を確認すること。
【０１１６】
・以下に対するｒＦＧＦ−２の効果を評価すること：
ベースラインから１８０日までのＥＴＴ時間の変化、
生活の質（ＱｏＬ）におけるベースラインからの変化：Ｓｅａｔｔｌｅ Ａｎｇｉｎａ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＳＡＱ）によって測定されるような認知されたアンギナ、ならびに９０日目および１８０日目でのＳｈｏｒｔ−Ｆｏｒｍ−３６（ＳＦ−３６）によって測定されるような、全身的な健康、
静止時でのベースラインからの、９０日目および１８０日目でのタリウム／ｓｅｓｔａｍｉｂｉ走査によるジピリダモールを用いた薬理学的ストレス時での虚血領域サイズにおける変化。
【０１１７】
・被験体のサブセットにおいて、ＥＦ、標的壁運動および壁厚、ならびに再灌流に対するｒＦＧＦ−２の影響を、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）走査によって評価すること。
【０１１８】
（調査計画）
（全体的な研究設計および計画）
この臨床試験を、ＣＡＤを有する３００人の被験体における、ｒＦＧＦ−２の２相、多施設、二重盲式、プラセボコントロール試験として設計した。全ての適格基準を満たした被験体を、プラセボを受ける群と、ｒＦＧＦ−２の３つの用量のうち１つを受ける群とにランダムに割り当てた（１アーム当たり約７５人の被験体）。用量は、実際の体重に基づいて、０μｇ／ｋｇ（プラセボ）、０．３μｇ／ｋｇ、３．０μｇ／ｋｇおよび３０．０μｇ／ｋｇであった。研究薬物は、心臓カテーテル法の間の、２０分間にわたる単回ＩＣ注入として投与された。被験体を、その場所での投与後、少なくとも６時間病院内でモニタリングし、次いで１８０日間にわたる特定の間隔で追跡した。長期の安全性を、さらなる６ヶ月間の電話による連絡およびアンケートを使用する、別個の延長プロトコールで評価した。
【０１１９】
（包含基準）
試験への参加のためには以下の包含基準を必要とした：
・１８歳以上の男性または女性。
・冠動脈造影による主冠状動脈の６０％を超える狭窄によって規定した場合の、ＣＡＤの診断。
・受け入れられている画像化技術（心室造影図（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｏｇｒａｍ）、ＭＲＩ、シングルフォトンエミッションＣＴ［ＳＰＥＣＴ］）スキャンでの最初の通過、心エコー図［ＥＣＨＯ］またはマルチゲート［ＭＵＧＡ］核評価（ｍｕｌｔｉｇａｔｅｄ［ＭＵＧＡ］ｎｕｃｌｅａｒ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ））による、３０％以上の駆出率。
・アンギナまたはアンギナ等価物の症状。
・医師の管理の下で、ＣＡＤに関する非侵襲性治療へと移すこと。
・医師が評価した場合に、標準的な手術による血管再生手順またはカテーテルベースの血管再生手順の候補でないこと
・１２ヶ月以内に乳房撮影による悪性疾患の証拠がないこと（女性）。
・全ての女性に関して、スクリーニングの１年以内の子宮頸部スミアを用いた骨盤検査。・５０歳以上の全ての被験体に関して、５年以内のＳ状結腸鏡検査。
・４０歳以上の被験体に関して、糞便グアヤクを用いた毎年の直腸検査。
・ベースライントレッドミル運動試験で少なくとも３分間にわたって運動できるが、改変Ｂｒｕｃｅプロトコルを用いて１３分間より長く運動できない、そして虚血の徴候または症状によって制限される。被験体は、ある程度のアンギナもしくはアンギナ同等物の病訴を有したかまたはＥＴＴの経過の間に１ｍｍ以上のＳＴセグメント低下を有する。二重のベースライン試験を、少なくとも２４時間の間隔を置いて、しかし２週間を超える間隔を置かずに行い、そして２つの試験の間の相違は、２つの試験の平均の２０％以下であるべきである。
・ランダム化前３０日以内に、安静時／負荷時のタリウム／セスタミビ（ｓｅｓｔａｍｉｂｉ）スキャンでの、１つの主要心筋領域（前壁、下壁、側壁または中隔）の少なくとも半分の面積を含む、中程度以上のサイズの誘導性かつ可逆性の虚血性欠損、または複数の領域における複数の誘導性かつ可逆性の虚血性欠損（この合計は、安静時／負荷時のタリウム／セスタミビスキャンでの、１つの主要領域の少なくとも半分の面積の等価物を含む）。
・ランダム化前３０日以内に、心臓カテーテル法に関して臨床的に受容可能な範囲内の、全血球算定（ＣＢＣ）、血小板、血清化学、プロトロンビン時間および尿検査。
・ランダム化前３０日以内に、尿サンプルについてタンパク質が陰性または微量。
・ランダム化前３０日以内に、血清クレアチニンが２．０ｍｇ／ｄＬ以下。
・この全ての必要な研究手順および追跡訪問を含め、試験における参加への書面によるインフォームドコンセントに同意し、そしてこれを与え得る。
・ランダム化前３０日以内に、以下の年齢特異的範囲に適合する、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）（男性）：
【０１２０】
【表８】
・ランダム化前３０日以内に、胸部Ｘ線で悪性疾患の証拠がないこと。
・完全な病歴および身体検査（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙのガイドラインに従って行われる）によって評価した場合、ランダム化の３０日以内に、悪性疾患の証拠も疑いもないこと。
・調査責任者または現場の別の調査医師の意見による、被験体の心臓血管の解剖学的構造が、侵襲性手順を用いた処置に適切でないとのことの、心臓カテーテル法による、研究１日目での確認。
【０１２１】
（除外基準）
・悪性疾患：過去１０年以内の悪性疾患の病歴または疑い（治癒的に処置された、基底細胞癌、太陽に露出した領域の皮膚の扁平上皮癌、または頸部癌を除く）。
・腎臓の状態：
−２．０ｍｇ／ｄＬより高い血清クレアチニンによって規定した場合の、腎臓機能不全。
−ディップスティックで１＋以上のタンパク質によって規定した場合の、蛋白尿。
・眼の状態：
−増殖性網膜症、中程度または重篤な非増殖性網膜症。
−網膜の静脈の閉塞。
−脈絡膜の新生血管形成を伴う、加齢性黄斑障害。
−眼科医による検眼鏡検査での黄斑水腫。
−４ヶ月以内の眼内手術。
・心臓血管状態：
−重篤な大動脈狭窄、すなわち、１．０ｃｍ２より小さい面積。
−３週間以内の不安定アンギナ（Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，１９８４）。
−ＣＡＢＧ、血管形成術、一過性虚血性発作または４ヶ月以内の発作。
−３ヶ月以内の心筋梗塞。
−スクリーニングの１年以内の経心筋レーザー血管再生を用いた処置。
−外部カウンターパルセイションを用いた現行の処置。
−その被験体が明らかにプラセボを受けたことを実証し得ない限り、何らかの調査薬剤を用いた何らかの治療的血管新生試験における過去の関与。
−原発性肺高血圧または拘束型もしくは閉塞型心筋症の診断。
・一般的医療状態：
−妊娠または授乳中の母親。
−任意の病理的線維症（例えば、肺線維症、強皮症）。
−既知の血管奇形（例えば、動静脈奇形、３ｍｍを超える血管腫）。
−追跡訪問が完了していない他の調査薬剤、ＩＣデバイスまたは手順の臨床試験における関与。
−臓器移植歴。
−被験体を、調査者の意見において、この研究における関与に関して不適切にする、任意の組合せ状態（例えば、平均余命を１２ヶ月未満に制限する、同時の医療的疾病、精神病、重度の精神遅延、検査官とコミュニケーションできないこと、薬物濫用またはアルコール濫用）。
【０１２２】
（治療または評価からの被験体の除外）
被験体は、権利を害することなくいつでも、研究に参加する同意を取り下げ得る。さらに、調査者は、臨床判断に従うと、取り下げることが被験体の最良の目的である場合、または被験体がプロトコルに従えない場合、被験体を取り下げ得る。
【０１２３】
全ての包含必要条件および除外必要条件を満たし、そして１日目に試験薬物を受けた被験体が、その後研究から取り下げられた場合、１８０日間の終了訪問に関して列挙された試験および評価を、可能な限りいつでも実行した。
【０１２４】
被験体が、研究薬物投与を中止するに充分重篤であると調査者が考えるＡＥを１０分間を超えて発症した場合、投薬を中断し、そしてこの被験体にはさらなる研究薬物処置を受けさせなかった。この被験体は、調査者によって決定された医療処置を受け、ＡＥが消散するかまたは安定するまで観察されたままであり、そして１８０日目を越えるまで追跡された。
【０１２５】
（施された処置）
被験体を、プラセボまたは０．３、３．０もしくは３０．０μｇ／ｋｇ ｒＦＧＦ−２を受けるようにランダムに割り当てた。研究薬物を、検定された精密注入ポンプを用いて、２本の開存性冠状血管または移植片の間で分割された、２０分間にわたる２０ｍＬの注入として投与した。
【０１２６】
（調査製品の正体）
この研究において用いたｒＦＧＦ−２は、遺伝子操作された酵母において発現された、１４６アミノ酸の非グリコシル化モノマーの、１６．５ｋＤａタンパク質であった。ｒＦＧＦ−２薬物製品は、灰色の積層ブチルストッパおよび赤色のフリップオフオーバーシールを伴った５ｍＬのＩ型ガラスバイアル中の透明な無色の液体として供給された。ｒＦＧＦ−２処方物は、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭモノチオグリセロール、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ ２ナトリウム二水和物（分子量３７２．２）、１３５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ５．０）中に０．３ｍｇ／ｍＬ ｒＦＧＦ−２を含んでいた。各バイアルは、３．７ｍＬのｒＦＧＦ−２薬物製品溶液を含んでいた（１バイアルあたり１．１１ｍｇ ｒＦＧＦ−２）。ｒＦＧＦ−２薬物製品バイアルを、−６０℃以下で保存した。ｒＦＧＦ−２を、被験体の実際の体重に従ってプラセボで希釈した。
【０１２７】
プラセボは、灰色の積層ブチルストッパおよび赤色のフリップオフオーバーシールを伴った５ｍＬのＩ型ガラスバイアル中に透明な無色の液体として供給された。プラセボは、外観からは薬物製品と区別できなかった；プラセボは、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭモノチオグリセロール、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ ２ナトリウム二水和物（分子量３７２．２）、１３５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ ５．０）を含んでいた。各バイアルは、５．２ｍＬのプラセボ溶液を含んでいた。このプラセボバイアルを、２℃〜８℃で保存した。
【０１２８】
（研究における用量の選択）
選択した用量は、前臨床データおよび早期臨床データによって、最良の効力の可能性が示唆された範囲の用量を一括した用量であった。最大用量（３０．０μｇ／ｋｇ）の安全性は、実施例３において報告された第一相試験の結果によって支持された。
【０１２９】
被験体は代表的に、カテーテルが適所にある持続時間に関連する血栓症の危険性を最小にするために試験薬物の注入の前に、１０分間と２０分間との間のヘパリンの１回のＩＶボーラスを受けた。
【０１３０】
（効力および安全性の変数）
（評価した効力および安全性の測定値、ならびにフローチャート）
効力の一次変数は、９０日目にＥＴＴ時間によって測定した場合の運動能力の変化であった。効力の二次変数は、以下を含んでいた：被験体のサブセットにおける、１８０日目でのＥＴＴ時間の変化；９０日目および１８０日目の、ＳＡＱのアンギナ頻度スコア（ＡＦＳ）、処置満足スコア（ＴＳＳ）、労作能力スコア（ＥＣＳ）および疾患認知スコア（ＤＰＳ）、ならびにＳＦ−３６の身体的要素および精神的構成要素によって測定した場合のＱｏＬの変化；９０日目および１８０日目でのタリウム／セスタミビスキャンによる安静時および薬理学的負荷時の虚血面積の変化；９０日目および１８０日目でのＭＲＩによる、ＥＦ、標的とされた壁の厚みおよび運動、ならびに灌流の変化。
【０１３１】
統計分析計画を実行した時点で追加した他の分析変数は、以下を含んでいた：アンギナの発症までの時間、１ｍｍのＳＴセグメント低下の発症までの時間、ならびに９０日目および１８０日目での、アンギナの発症時の速度−圧力の積、ピーク運動時の速度−圧力の積、および１ｍｍ ＳＴセグメントの低下時の速度−圧力の積におけるベースラインからの変化。Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）の分類およびＣａｎａｄｉａｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｌａｓｓ（ＣＣＣ）における変化を分析した。ＥＴＴ時間における６０秒間以上の増加を伴う被験体（「応答者」）およびＥＴＴ時間における６０秒間未満の増加を伴う被験体（「非応答者」）の百分率を各群について分析した。
【０１３２】
カナダ人の心臓血管クラス（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、クラス０〜クラスＩＶの範囲にわたる分類スキームに基づく。以下に分類される：クラス０、患者は、アンギナもアンギナに等価な症状も経験していない；クラスＩ、仕事時またはレクリエーション時に激しいか、迅速であるかまたは長期の労作に伴ってのみ生じる、通常の身体活動症状を伴う；クラスＩＩ、患者は、アンギナに起因して、通常活動の軽い制限を経験する；クラスＩＩＩ、患者は、アンギナに起因して、著しい活動の制限を経験する；およびクラスＩＶ、患者は、安静時または任意の身体活動時にアンギナを発症する。
【０１３３】
ＳＡＱは、５つのスケールを有する、承認された、疾患特異的自己管理式質問表である：アンギナ安定性スケール（ＡＳＳ）、アンギナ頻度スケール（ＡＦＳ）、運動能力スケール（ＥＣＳ）、処置満足スケール（ＴＳＳ）、および疾患認知スケール（ＤＰＳ）（Ｓｐｅｒｔｕｓ ＪＡら）。ＡＳＳは、評価期間に該当しない４週間の間隔を言及しているので、ＡＳＳはこの試験の分析には含まれなかった。各要素は、１〜１００のスケールを含む；より低いスコアは、より悪い症状に関連する；８点以上の変化は、臨床的に適切であるとみなされる。ＳＦ−３６は、１０のスケールを有し、そして２つのまとめの成分スケール（肉体的構成要素のまとめのスケール（ＰＣＳＳ）および精神的構成要素のまとめのスケール（ＭＣＳＳ））を有する、承認された、一般的生活の質（ＱｏＬ）器具である。
【０１３４】
核画像化の結果を、承認された半定量的グレード付けシステムを用いて、２０セグメント左心室モデル（Ｂｅｒｍａｎ ＤＳら）において分析した。各セグメントの灌流を、５点のスケールでグレード付けした：０＝正常、１＝わずかに減少、２＝中程度に減少、３＝大幅に減少、および４＝存在しない。負荷時の、割り当てられた異常領域のグレードが、安静時画像で減少または正常化した場合（可逆性スコア：負荷時スコア−安静時スコア＞１）、セグメントを、可逆的欠損を有すると決定し、そして負荷時の、割り当てられた局所グレードが異常であり、そして安静時画像化で同じままである場合、固定された欠損を有すると決定した。固定された欠損を、グレード付けされたスコアの重篤度に基づいてサブグループに分けた（すなわち、軽度から中程度（１、２および３のスコア）ならびに重篤（４のスコア））。灌流の異常性および虚血の全般的程度を、２０セグメントからの個々のスコアを合計することによって評価し、そしてそれぞれ、平均負荷および平均可逆性として表現した。
【０１３５】
安全性を、ＡＥ、実験室データおよび身体検査の結果を評価することによってモニタリングした。データおよび安全性モニタリングボード（Ｄａｔａ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｂｏａｒｄ：ＤＳＭＢ）によって、ほぼ６週間毎にＳＡＥおよび実験室試験の結果を検討した。急性心臓事象は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｖｅｎｔｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＣＥＣ）によって判断された。中心の研究室は、血管造影図、ＥＣＧ、眼科評価および核スキャンの結果を検討した。
【０１３６】
（人口統計学的および他の被験体特性）
表８は、この試験に参加した被験体の人口統計学的特徴をまとめる。これらの特徴は、４つの処置群の間で類似していた（表８）。
【０１３７】
【表９】
（分析）
（運動耐容性試験）
図９は、９０日目のベースラインでのＥＴＴ時間、および効力の一次変数である、ベースラインから９０日目までのＥＴＴ時間における変化を示す。この効力の変数および全ての効力の変数の作表において、血管再生を経験してきた被験体および評価のない被験体を、他に特定しない限り、分析から除外した。運動時間の平均増加は、プラセボ群に関して４４．１秒間であり、低用量群において４８．５秒間であり、中用量群において６５．０秒間であり、そして高用量群において４９．１秒間であった。
【０１３８】
図９はまた、１８０日目でのＥＴＴ時間およびベースラインから１８０日目までの、ＥＴＴ時間における変化を示す。運動時間における平均増加は、プラセボ群において５４．８秒間であり、低用量群において７５．３秒間であり、中用量群において７６．３秒間であり、そして高用量群において５１．３秒間であった。ＥＴＴにおける改善傾向は、３または４のベースラインＣＣＳおよび／または４０以下のＳＡＱアンギナ頻度を有する被験体において１８０日目に観察された。
【０１３９】
（シアトルアンギナ質問表）
図１０は、ＳＡＱの分析を示す。８点以上の変化は、臨床的に有意とみなされ、そしてより高いＳＡＱスコアは、より良好な臨床状態と関連する。９０日目でのＡＦＳ変化スコアに関して、Ｐ値は試験全体に基づいて０．０３５であり、そして全てのＦＧＦに対するプラセボの試験に基づいて０．００７であった。ベースラインからの平均変化は、プラセボ群について８．１であり、低用量群について１６．０であり、中用量群について２０．８であり、そして高用量群について１６．７である（一対（ｐａｉｒｗｉｓｅ）Ｐ値＝それぞれ、０．０８０、０．００４、０．０５４）。１８０日目でのＡＦＳ変化スコアに関して、平均変化は、プラセボ群について１５．３であり、低用量群について１８．７であり、中用量群について２２．６であり、そして高用量群について２０．２であった（一対Ｐ値＝それぞれ、０．４４、０．０８９、０．２５）。残りのＳＡＱスケール、労作耐容性、処置満足感および疾患認知を、図１１においてＦＧＦ処置群について示す。
【０１４０】
（簡易型３６）
図１２は、ＳＦ−３６肉体構成要素要約スケール（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｕｍｍａｒｙ Ｓｃａｌｅ）（ＰＣＳＳ）および精神的構成要素要約スケール（Ｍｅｎｔａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｕｍｍａｒｙ Ｓｃａｌｅ）（ＭＣＳＳ）についての分析を示す。９０日目でのＰＣＳＳに関して、全てのＦＧＦに対するプラセボの試験に基づくＰ値は、０．０３３であった。ベースラインからの平均変化は、プラセボ群において３．４であり、低用量群において６．０であり、中用量群において５．９であり、そして高用量群において５．９であった（一対Ｐ値＝それぞれ、０．０７２、０．０９１、０．０９５）。１８０日目でのＰＣＳＳに関して、ベースラインからの平均変化における差異は、プラセボ群とＦＧＦ群との間で２．２未満であった。処置効果は、ＳＦ−３６のＭＣＳＳ（精神的構成要素）において検出できなかった。
【０１４１】
（核画像化）
プラセボ群とＦＧＦ群との間で一貫した差異は検出できなかった。
【０１４２】
（亜群の検査）
（運動耐容性試験）
図１３（左パネル）は、３または４のベースラインＣＣＳを有する被験体についてのＥＴＴ時間を示す。３または４のベースラインＣＣＳを有する被験体についてベースラインから９０日目までの運動時間における平均変化は、プラセボ群について３６．１秒間であり、低用量群について４７．６秒間であり、中用量群について５７．１秒間であり、そして高用量群について４４．５秒間である（一対Ｐ値＝それぞれ、０．５９、０．３１、０．６９）。ベースラインから１８０日目までの運動時間における平均変化は、プラセボ群について３３．１秒間であり、低用量群について７０．７秒間であり、中用量群について７５．７秒間であり、そして高用量群について４１．５秒間である（一対Ｐ値＝それぞれ、０．１５、０．０８６、０．７４）。
【０１４３】
図１３（右のパネル）は、３または４のベースラインＣＣＳを有する被験体についてのＳＡＱスコアを示す。３または４のベースラインＣＣＳを有する被験体についてのベースラインから９０日目までのＡＦＳにおける平均変化は、プラセボ群について５．７であり、低用量群について１７．０であり、中用量群について１９．５であり、そして高用量群について２０．５であった（一対Ｐ値＝それぞれ、０．０５８、０．０１５、０．０１０）。１８０日目に、ＡＦＳにおける平均変化は、プラセボ群について１１．７であり、低用量群について１７．２であり、中用量群について２２．３であり、そして高用量群について２１．８であった（一対Ｐ値＝それぞれ、０．３４、０．０５９、０．０７６）。
【０１４４】
図１４（左パネル）は、シアトルアンギナ質問表（Ｓｅａｔｔｌｅ Ａｎｇｉｎａ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）（ＳＡＱ）を用いて測定した場合に４０以下のベースラインアンギナ頻度スコア（ＡＦＳ）を有する被験体についてのＥＴＴ時間を示す。４０以下（より低いスコアは、より高いアンギナ頻度を示す）のベースラインＡＦＳを有する被験体についてのベースラインから９０日目までの運動時間における平均変化は、プラセボ群について５０．３秒間であり、低用量群について８３．６秒間であり、中用量群について７２．１秒間であり、そして高用量群について４９．８秒間であった（一対Ｐ値＝それぞれ、０．１６、０．３２、０．９８）。ベースラインから１８０日目までの運動時間における平均変化は、プラセボ群について５６．５秒間であり、低用量群について９０．２秒間であり、中用量群について８４．６秒間であり、そして高用量群について５５．０秒間であった（一対Ｐ値＝それぞれ、０．２４、０．２９、０．９６）。これらのデータは、ベースライン時により高いアンギナ頻度を有し、かつプラセボを受けた被験体と比較して低用量または中用量のＦＧＦを受けた被験体についてのＥＴＴ時間における、より高い平均変化を示唆する。
【０１４５】
図１４（右のパネル）は、４０以下のベースラインＡＦＳを有する被験体についてのＡＦＳを示す。４０以下（より低いスコアは、より高いアンギナ頻度を示す）のベースラインＡＦＳを有する被験体についての、ベースラインから９０日目までのＡＦＳにおける平均変化は、プラセボ群について１２．２、低用量群について２７．７、中用量群について２９．７、そして高用量群について２２．０であった（一対Ｐ値＝それぞれ、０．０１７、０．００４、０．１０）。１８０日目に、ＡＦＳにおける平均変化は、プラセボ群について１６．３であり、低用量群について２７．４であり、中用量群について３０．７であり、そして高用量群について２４．６であった（一対Ｐ値＝それぞれ、０．０８９、０．０１９、０．１８）。ベースラインでより低いＡＦＳを有する被験体における、低用量群および中用量群とプラセボとの間のＡＦＳにおける差異の大きさは、臨床的に適切である
と考えられた。
【０１４６】
（機能分析）
（解剖学的構造）
９０日目で、３．０μｇ／ｋｇの投薬量群および３０μｇ／ｋｇの投薬量群での左心室拡張終期径（ＬＶＥＤＤ）において有意な低下があった（それぞれ、ｐ＝０．０３７および０．０３２）。０．３μｇ／ｋｇの投薬量群（ｐ＝０．１３）において、改善の傾向が見られた。コントロールにおいて、ＬＶＥＤＤは、僅かに増加した。これは、ＦＧＦ処置患者（３．０μｇ／ｋｇ用量群および３０μｇ／ｋｇ用量群）での虚血の軽減および機能の改善に一致する。９０日目で、０．３μｇ／ｋｇ用量の群（ｐ＝０．０４２）および３０μｇ／ｋｇ用量の群（ｐ＝０．０２４）での左心室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）において有意な低下が存在し、そして３．０μｇ／ｋｇ群において改善の傾向（ｐ＝０．１７）が存在した。これはまた、ＦＧＦ処置患者での虚血の軽減および機能の改善に一致する。コントロールは、（ＬＶＥＤＤにおける増加と一致する）ＬＶＥＳＤにおける増加を示した。この効果は、６ヶ月では確かではない。左心室（ＬＶ）の質量は、予想通り変化しなかった（なぜなら、血圧に影響はなかったので、ＬＶ質量に対する影響も予想されなかった）。
【０１４７】
（壁運動）
正常な壁運動は、期待範囲（３０〜４０％）内であり、そして変化しなかった。正常な壁厚は、期待範囲（４５〜５０％）内であり、そして変化しなかった。標的壁（すなわち、虚血心筋層の壁）の安静時の運動は、正常と同じであった。
【０１４８】
（心筋灌流）
遅延到着ゾーン（ｄｅｌａｙｅｄ ａｒｒｉｖａｌ ｚｏｎｅ）（ＤＡＺ）は、全ての群にわたりベースラインで同じであった（平均約１５％）。それは、運動誘導性の核灌流欠損（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔ）（約１８％）のサイズと相関する。このＤＡＺのサイズは、全ての群において減少した。最高の減少は、３．０μｇ／ｋｇ群において存在した。
【０１４９】
（要旨および結論）
第ＩＩ相試験からのデータは、被験体が、低用量（０．３μｇ／ｋｇ）および中用量（３．０μｇ／ｋｇ）のＦＧＦ−２を用いて、最も改善することを示唆する、全体的パターンを示した。
【０１５０】
全体的に、より症候性の患者が、最高の改善を示した。例えば、ＣＣＳが３もしくは４のベースラインおよび／またはＳＡＱアンギナ頻度が４０以下の被験体は、ＥＴＴにおいて１８０日目で改善に向かう傾向を示した。
【０１５１】
被験体群全てついて、アンギナ頻度の減少（ｐ＝０．０３５）が、９０日目で見られた。ＣＣＳが３もしくは４のベースラインおよび／またはＳＡＱアンギナ頻度が４０以下のこの被験体は、９０日目と１８０日目との両方で最高の改善を示した。さらに、ＣＣＳが３または４のベースラインを有する被験体は、ＳＦ−３６の肉体構成要素において、９０日目と１８０日目との両方で改善を示した。
【０１５２】
さらに、ＭＲＩデータは、低下したＬＶＥＤＤとＬＶＥＳＤとによって証明されるように、ＦＧＦ群における改善したＬＶ機能の証拠を提供した。灌流分析は、ＦＧＦ群において改善に向かう傾向を示した。
【０１５３】
ＳＡＱの効力の二次変数について、８以上の変化は、臨床的に適切であるとみなされる
。統計学的に有意な差異は、アンギナ頻度スコア（ａｎｇｉｎａ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｓｃｏｒｅ）（ＡＦＳ）の全体的分析で見られた。臨床的に適切かつ統計学的に有意な差異は、ＡＦＳにおいて、プラセボ群と中用量の群との間で、９０日目で見られた。
【０１５４】
ＳＦ−３６の効力の二次変数について、プラセボ処置群とＦＧＦで処置した全ての群との間の有意な差異は、肉体構成要素要約スケール（ＰＣＳＳ）において、９０日目で見られた（０．０３３）。
【０１５５】
さらに、うっ血性心不全を有する患者のサブセットにおいて、任意の用量のＦＧＦを用いて改善が見られた。従って、ＦＧＦは、うっ血性心不全を有する患者において、より有益であり得る。第ＩＩ相研究において、プラセボを受けた患者は、それぞれ、６４．６および８１．３の変化を示した低域用量および中域用量を受けた患者と比較した場合、総運動時間について、ベースラインから２３．２秒の変化（最小二乗平均）を９０日目で示した。１８０日目で、プラセボは、総運動時間において、低域用量群および中域用量群についての７５．４秒および７２．８秒と比較した場合、２７．３秒の変化を示した。この結果は、９０日目での中投薬量群および低投薬量群における統計学的傾向を確立する。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、治療有効量のＦＧＦ−２もしくはその血管形成活性フラグメント（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）または血管形成活性ムテインを含む、ヒトにおいて心臓の血管新生を誘導するための単位用量の組成物に関する。本発明はまた、患者へ全身性のリスクを最小限にしながら、心臓の血管新生を誘導するために、ヒトへ１回の単位用量組成物を投与するための方法に関する。開示された単位用量の組成物およびその投与方法は血管形成術、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の処置に対する外科的介入への代案を与え、そしてさらにヒトにおける心筋梗塞（ＭＩ）後の損傷を減少させるための補助を与えるので、本発明は有用である。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、少なくとも１８個の構造的に関連したポリペプチド（ＦＧＦ−１からＦＧＦ−１８と名づけられている）のファミリーであり、ヘパリンのようなプロテオグリカンに対する高い程度の親和性によって特徴付けられている。様々なＦＧＦ分子は、サイズが１５〜２３ｋＤの範囲であり、神経細胞の接着および分化［Ｓｃｈｕｂｅｒｔら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０４：６３５−６４３（１９８７）］、創傷の治癒［米国特許第５，４３９，８１８号（Ｆｉｄｄｅｓ）］を含む正常および悪性状況下において、多くの中胚葉細胞型および外胚葉細胞型への分裂促進剤として、栄養因子として、分化誘導因子または分化阻害因子として［Ｃｌｅｍｅｎｔｓ，ら，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１３１１−１３１６（１９９３）］、血管形成因子（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｆａｃｔｏｒ）として［Ｈａｒａｄａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９４：６２３−６３０（１９９４）、広範囲にわたる生物学的活性を示す。従って、ＦＧＦファミリーは、様々な範囲の線維芽細胞、平滑筋細胞、上皮細胞、神経細胞を刺激する多能性増殖因子のファミリーである。
【０００３】
ＦＧＦは、胎児の発育または創傷の治癒のように正常な組織から放出される場合、時間的および空間的な制御に供される。しかし、ＦＧＦファミリーのメンバーの多くはまた、癌遺伝子でもある。したがって、時間的および空間的な制御なしではＦＧＦファミリーのメンバーは血管新生を提供しながら、腫瘍の増殖を刺激する能力を有する。
【０００４】
冠状動脈疾患は、一つ以上の冠状動脈がプラークの蓄積によって徐々に閉塞していく（アテローム性動脈硬化）、ヒトにおける進行的な状態である。この疾患を有する患者の冠状動脈は、よくバルーン血管形成や部分的に閉塞した動脈を開くためのステントの挿入によって処置される。結局、これらの患者の多くは、多大な出費およびリスクをかけて冠状動脈バイパス手術を行う必要がある。バイパス手術を行う必要性を減らすために、冠状動脈の血流を増やす薬物をこのような患者に提供することが望まれる。
【０００５】
血塊などによって一つ以上の冠状動脈または小動脈が完全に閉塞するようになる心筋梗塞で患者が苦しむ場合、ヒトにおいてなおより重要な状況が生じている。閉塞した動脈または小動脈にさらされた心筋部分へ即座に循環を回復させる必要がある。失われた冠状循環が梗塞開始の数時間以内に回復されれば、閉塞より下流にある心筋に対する損傷のほとんどは防ぐことができる。組織プラスミノゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼのような血塊溶解剤は、この場合に有益であることが立証されている。しかし、血塊溶解剤の補助物として、損傷を受けたか、または閉塞した心筋に血管新生によって副行循環を得ることも望ましい。
【０００６】
従って、冠状動脈疾患中および／または急性心筋梗塞の後に、心臓の血管形成をヒトの患者に与える薬剤および投与様式を提供することが、本発明の目的である。より詳細には、有害な効果を最小限にしながら、心臓の脈管新生の望ましい特性を与える、ＦＧＦの治療用量およびヒトへの投与様式を提供することが本発明のさらなる目的である。
【０００７】
様々なＦＧＦ分子の多くが単離され、そして変動しかつしばしば正反対の結果を有する様々な心筋虚血動物モデルへ投与されている。Ｂａｔｔｌｅｒらによると、「イヌの心筋虚血モデルは天然に存在する副行循環が豊富であるので、批評の余地がある。天然の副行循環が相対的に欠乏しており、そしてヒトの副行循環に類似している点で優っているブタのモデルとは正反対である」。Ｂａｔｔｌｅｒら‘Ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ
Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｉｎｆａｒｃｔｅｄ Ｓｗｉｎｅ Ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ’ＪＡＣＣ，２２（７）：２００１−６（Ｄｅｃ．１９９３）２００２頁、ｃｏｌ．１。しかし、ウシのｂＦＧＦ（すなわちＦＧＦ−２）を心筋梗塞モデルのブタに投与したＢａｔｔｌｅｒらは、一つの動物種から別の動物種で得られる様々な結果を考慮し、そして互いに異なる結果を明白に開示し「従って、このように異なった動物モデルからの結果に基づいて推定する際に注意しなければならないという忠告を強調している」（Ｂａｔｔｌｅｒら，２００５頁，ｃｏｌ．１）。さらに、Ｂａｔｔｌｅｒは、「投薬とｂＦＧＦ（すなわちウシのＦＧＦ−２）の投与様式は、達成される生物学的効果に対して深遠な含意を有し得る」（Ｂａｔｔｌｅｒ，ら，２００５頁，ｃｏｌ．１）と指摘している。従って、ヒトの患者においてＣＡＤの処置および／またはＭＩ創傷後の安全かつ効果的な処置を提供する線維芽細胞増殖因子の投薬量ならびに投与様式を発見することが、本発明のさらなる目的である。さらに一般的に、ヒトの心臓で血管新生を誘導する薬学的組成および方法を提供することが本発明の目的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
冠血管形成を必要とするヒトの患者の一つ以上の冠脈管（ＩＣ）または，末梢静脈（ＩＶ）への約０．２μｇ／ｋｇ〜約４８μｇ／ｋｇの単回単位用量での、ｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性な（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ）フラグメントもしくはムテインの投与が、思いがけなくヒトの患者に、予想外に長期間（これを書いている現在で６ヶ月になる）持続した処置患者の運動耐性時間（ＥＴＴ）における予想外の大きな上昇（すなわち２ヶ月および６ヶ月の全グループでベースラインから平均的変化で９６秒および１００秒の上昇）を生じる、急速かつ治療的な冠血管形成を提供することを本願らは発見した。これらの変化は、標準的な血管再生手順の必要性の減少という結果になるはずである。本明細書中に使用される「冠血管形成」とは、冠循環において側副として作用する毛細血管から小動脈というサイズの範囲の、新しい血管の形成を意味する。比較のために血管形成は、プラセボと比較して３０秒より長い患者のＥＴＴにおける上昇を提供する場合、治療的に成功であると考えられている。
【０００９】
従って、一つの局面において本発明は、安全かつ治療有効量のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む、単位用量のｒＦＧＦ−２に関する。代表的に安全かつ治療的に有効な量は、理想的体重に基づいて、約０．２μｇ／ｋｇ〜約４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。他の実施形態において、単位用量の安全かつ治療的に有効な量は、０．２μｇ／ｋｇ〜２．０μｇ／ｋｇ、２．０μｇ／ｋｇより上〜２４μｇ／ｋｇ未満もしくは２４μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇ ＩＣのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む。別の実施形態において、単位用量の安全かつ治療
的に有効な量は１８μｇ／ｋｇから３６μｇ／ｋｇ ＩＶのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む。完全な用語で表現すれば、本発明の単位用量は０．００８ｍｇ〜７．２ｍｇ、より代表的には０．３ｍｇ〜３．５ｍｇのＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。適切なＦＧＦ−２は配列番号２のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインである。
【００１０】
別の局面において、本発明はＣＡＤについてヒト患者を処置する方法もしくはそこでの冠血管形成を誘導することに関する。その方法は安全かつ治療有効量の組み換えＦＧＦ−２（ｒＦＧＦ−２）またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを冠状動脈疾患の処置が必要な（または血管新生が必要な）ヒトの患者の一つ以上の冠脈管もしくは末梢静脈へ投与する工程を含む。代表的に安全かつ治療的に有効な量の部分が、二つの冠脈管の各々に投与される。安全かつ治療的に有効な量は、薬学的に受容可能なキャリアーにおいて約０．２μｇ／ｋｇ〜約４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。他の実施形態において、安全かつ治療的に有効な量は、薬学的に受容可能なキャリアーにおいて０．２μｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇより上〜２４μｇ／ｋｇ未満、または２４μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。完全な用語では、上記の方法で使われているｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの量は、０．００８ｍｇ〜７．２ｍｇ、より代表的には０．３ｍｇ〜３．５ｍｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。
【００１１】
ＦＧＦ−２はグリコサミノグリカン（例えばへパリン）結合タンパク質であり、そしてグリコサミノグリカンの存在は活性およびＡＵＣを最適化するので（図３および４を参照のこと）、本発明のＲＦＧＦ−２のＩＣ投薬量は代表的にへパリンのようなグリコサミノグリカン投与の０〜３０分前に投与される。へパリンはＩＣもしくはＩＶ、代表的にはＩＶ投与される。必要に応じて、へパリンは単位
用量組成物と組み合わされる。
【００１２】
ｒＦＧＦ−２が一酸化窒素、強力な血管拡張剤を放出するので、注入前（前方向的な）および注入の間の侵略的な流体治療技術は、患者の安全のために重要である。注入前の推定楔入圧１２ｍｍＨｇを確立するためのＩＶ流体（例えば５００〜１０００ｍＬの標準生理食塩水）の投与、および注入に関連した収縮期の血圧を下げる（例えば９０ｍｍＨｇ未満）ためにＩＶ流体（例えば２００ｍＬの標準生理食塩水）のボーラス投与は、ＩＣ注入またはＩＶ注入によるヒトの患者に対するｒＦＧＦ−２投与の安全性を最適化する。
【００１３】
ＥＤＴＡが正常な心筋収縮および心臓伝導に必要とされるカルシウムの強力なキレート剤なので、ＥＤＴＡ濃度を最小限にすることは患者の安全にとって重要である。単位用量組成物中１００μｇ／ｍｌ未満のＥＤＴＡ濃度は、ＩＣ注入またはＩＶ注入によるヒトの患者に対するｒＦＧＦ−２投与の安全性を最適化する。
【００１４】
急激なｒＦＧＦ−２のボーラス投与が動物において深い低血圧と関連しているので、注入の速度は、患者の安全に重要である。一分あたり０．５〜２ｍＬ、代表的には一分あたり１ｍＬでの投与は、ＩＣ注入またはＩＶ注入によるヒトの患者に対するｒＦＧＦ−２投与の安全性を最適化する。
【００１５】
ＥＴＴ、「シアトル アンギナ質問表（Ｓｅａｔｔｌｅ Ａｎｇｉｎａ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）」（ＳＡＱ）および心臓の標的領域のＭＲＩのような当該分野で認識された臨床的終点の測定によって決定されるように、単位用量組成物および投与方法によっ
て冠血管形成を必要とするヒトの患者に提供された治療効果の予想外の大きさおよび持続時間は、単回単位用量が投与された後２週間の早さでみられ、そして単回単位用量がＩＣまたはＩＶ投与された後６ヶ月間持続した。例えば、Ｓｐｅｒｔｕｓらの（１９９５）ＪＡＣＣ ２５：３３３−３４１を参照のこと。特に、５８人のヒトＣＡＤ患者のＥＴＴは、ベースラインでの単調な繰り返しによって評価されており、そしてＩＣまたはＩＶ経路による単回単位用量のｒＦＧＦ−２の投与後１ヶ月、２ヶ月、および６ヶ月で全ての投薬郡中の患者幾人かにおいて臨床的効果が観察された。表１を参照のこと。運動能力における増加は、１ヶ月と２ヶ月との間で現れている。平均的ＥＴＴは、２ヶ月および６ヶ月において６０秒より上に増加し、中用量群（６〜１２μｇ／ｋｇ）または低用量群（０．３３〜２．０μｇ／ｋｇ）より高用量群（２４〜４８μｇ／ｋｇ）においてより大きな効果が見られている。（表１を参照のこと）。特に、動物モデルによって予期せずかつ予想外であったのは、ＩＶによる単位用量のｒＦＧＦ−２を投与された患者について投薬後２ヶ月および６ヶ月で観察された、各々９３．４秒と８７．５秒のヒトの患者でのＥＴＴにおける平均的な上昇である。さらにプラセボ効果を想定しても、ＥＴＴ秒についてのベースラインからの平均的な変化はなお、血管形成に関する結果の予想外で有望な比較を可能にした。
【００１６】
４８人のヒトＣＡＤ患者の生活の質は、有効な疾病特異的質問表、シアトル アンギナ質問表（ＳＡＱ）によってベースラインにおいて（すなわち投薬前に）評価され、そしてＩＣまたはＩＶ経路によって本発明の単回単位用量のｒＦＧＦ−２を一回受けた後、２ヶ月および６ヶ月において評価された場合、ＳＡＱにより測定された５つのスケールに対するベースラインからの平均的変化は、ＩＣ投与であろうとＩＶ投与であろうと全ての投薬範囲に対して臨床的に著しい方法で上昇していた（表２〜６）。特にＳＡＱによって評価された５つのスケールは、労作性能力、アンギナ安定性、アンギナ頻度、処置満足感および疾患理解である。ベースラインと比較して、労作性能力に対する平均スコアは、２ヶ月で１０．９から２０．２まで；ならびに６ヶ月で１６．５から２４．１まで増加した。アンギナ安定度について、平均スコアは、２ヶ月で３２．１から４６．２まで；および６ヶ月で１６．７から２３．２まで増加した。アンギナ頻度について平均スコアは、２ヶ月で２０．０から３２．９まで；および６ヶ月で１１．４から３６．７まで増加した。処置満足感について、平均スコアは、２ヶ月で８．５から１９．８まで；および６ヶ月で６．３から１９．８まで増加した。疾病理解について、平均スコアは、２ヶ月で２０．２から２７．８まで；および６ヶ月で２３．８から３４．０まで増加した。一般的に、いずれのスケールでも８ポイントの変化は、臨床的に顕著であると考えられている。従って、８．５〜４６．２の観察された変化は評価された５つのスケールの各々に対して臨床的に有意である。１４ポイントのベースラインからの平均的変化によるプラセボ効果を想定したとしても臨床的に有意であると考えられ、その結果は、なお評価されたほとんど全てのスケールで予想外に優れた効果を提供する。
【００１７】
本研究の一部として、心臓駆出率、局所的心筋機能、および灌流（遅延到着帯）に対するｒＦＧＦ−２の単回単位用量を投与した効果を評価するために、ＭＲＩもＣＡＤと診断された３３人のヒトの患者に実行された。詳細には、患者は、配列番号２のｒＦＧＦ−２の単回単位用量０．３３μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇ ＩＣまたは１８μｇ／ｋｇ〜３６μｇ／ｋｇ ＩＶが投与された。３３人のヒトのＣＡＤ患者が、ベースライン（すなわち処置前に）ならびにＩＣまたはＩＶ経路による本発明のｒＦＧＦ−２の単回単位用量での処置後１ヶ月、２ヶ月および６ヶ月に、休止している心磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）によって評価された場合、増加した標的の壁肥厚、標的の壁運動および標的領域の副行範囲、ならびに減少した標的領域の遅延到着範囲によって客観的に測定されるように、それらの患者は、その処置方法に対してきわめて統計的に有意な応答を示した。まとめると１ヶ月、２ヶ月および６ヶ月において標的の壁肥厚は、ベースラインと比較してそれぞれ４．４％、６．３％および７．７％増加し；標的の壁運動は、ベースラインと比較してそれぞれ２
．７％、４．４％および６．４％増加し；標的領域の副行範囲は、ベースラインと比較してそれぞれ８．３％、１０．９％、および１１．２％増加した；そして標的領域の遅延到着範囲は、ベースラインと比較してそれぞれ−１０．０％、−８．３％ならびに−１０．０％減少した。
【００１８】
上記のデータは、本発明に従ってＩＣまたはＩＶ投与した場合の、ｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントの本単位用量組成物のヒトにおける臨床的効果を証明している。
上記に加えて、本発明は、以下を提供する：
（項目１）
ヒトにおいて血管新生を誘導するための単位用量組成物であって、該組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に、約０．００８ｍｇ〜約７．２ｍｇのＦＧＦ−２あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む、単位用量組成物。
（項目２）
０．３ｍｇ〜３．５ｍｇのＦＧＦ−２あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む、項目１に記載の単位用量組成物。
（項目３）
前記ＦＧＦ−２が、配列番号２のアミノ酸配列を有する、項目１に記載の単位用量組成物。
（項目４）
薬学的に受容可能なキャリア中に、０．３ｍｇ〜３．５ｍｇの配列番号２のＦＧＦ−２あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む、項目３に記載の単位用量組成物。
（項目５）
薬学的に受容可能なキャリア中に、約０．００８ｍｇ〜約７．２ｍｇの前記配列番号２のＦＧＦ−２の前記血管形成的に活性なムテインを含む、項目３に記載の単位用量組成物。（項目６）
薬学的に受容可能なキャリア中に、０．３ｍｇ〜３．５ｍｇの前記配列番号２のＦＧＦ−２の前記血管形成的に活性なムテインを含む、項目５に記載の単位用量組成物。
（項目７）
薬学的に受容可能なキャリア中に、約０．００８ｍｇ〜約７．２ｍｇの前記配列番号２のＦＧＦ−２の前記血管形成的に活性なフラグメントを含む、項目３に記載の単位用量組成物。
（項目８）
薬学的に受容可能なキャリア中に、０．３ｍｇ〜３．５ｍｇの前記配列番号２のＦＧＦ−２の前記血管形成的に活性なフラグメントを含む、項目７に記載の単位用量組成物。
（項目９）
薬学的に受容可能なキャリア中に、約０．００８ｍｇ〜約７．２ｍｇの前記配列番号２のＦＧＦ−２を含む、項目３に記載の単位用量組成物。
（項目１０）
冠状動脈疾患についてヒト患者を処置するための方法であって、該方法が、該冠状動脈疾患についての処置を必要とするヒト患者において、安全かつ治療有効量の組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを１つ以上の冠動脈管または末梢静脈に投与する工程を包含し、該治療有効量が患者の体重１ｋｇにつき約０．２μｇ〜４８μｇである、方法。
（項目１１）
前記組換えＦＧＦ−２が、配列番号２のアミノ酸配列を有する、項目１０に記載の方法。（項目１２）
前記方法がさらに、約１０Ｕ／ｋｇ〜８０Ｕ／ｋｇのヘパリンを前記患者に、前記配列番号２の組換えＦＧＦ−２、あるいはその前記血管形成的に活性なフラグメントまたはムテ
インを投与する前約０〜３０分以内に投与する工程を包含する、項目１１に記載の方法。（項目１３）
配列番号２の組換えＦＧＦ−２、あるいはその前記血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインの前記治療有効量が、１つ以上の冠動脈管に投与される、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
配列番号２の組換えＦＧＦ−２、あるいはその前記血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインの前記治療有効量が、約２４μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇである、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
配列番号２の組換えＦＧＦ−２、あるいはその前記血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインの前記治療有効量が、末梢静脈に投与される、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
配列番号２の組換えＦＧＦ−２、あるいはその前記血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインの前記治療有効量が、約１８μｇ／ｋｇ〜３６μｇ／ｋｇである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
冠状動脈疾患についてヒト患者を処置するための方法であって、該方法は、単回単位用量の組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを、該冠状動脈疾患についての処置を必要とするヒト患者の１つ以上の冠動脈管または末梢静脈に投与する工程を包含し、該単位用量が約０．００８ｍｇ〜７．２ｍｇの組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む、方法。
（項目１８）
前記ＦＧＦ−２が、前記配列番号２のアミノ酸配列を有する、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記単回単位用量が、前記ヒト患者において少なくとも４ヶ月間持続する治療利益を生ずる、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記単回単位用量が、前記ヒト患者において６ヶ月間持続する治療利益を生ずる、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記単回単位用量が、前記ヒト患者において、第２の単位用量の投与が約６ヶ月間必要とされないような規模と持続期間の治療利益を生ずる、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記単位用量が、１つ以上の冠状動脈に投与される、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記単位用量が、末梢静脈に投与される、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記単位用量が、０．３ｍｇ〜３．５ｍｇの配列番号２の組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記方法がさらに、１０Ｕ／ｋｇ〜８０Ｕ／ｋｇのヘパリンを前記患者にＩＶまたはＩＣで、前記単位用量を投与する約０〜３０分前に投与する工程を包含する、項目１９に記載の方法。
（項目２６）
ヒト患者の心臓での血管新生を誘導するための方法であって、該方法は、単回単位用量の組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを、冠状動脈疾患についての処置を必要とするヒト患者の１つ以上の冠動脈管または末梢静脈に投与する工程を包含し、該単位用量が約０．００８ｍｇ〜７．２ｍｇの組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む、方法。
（項目２７）
前記ＦＧＦ−２が、配列番号２のアミノ酸配列を有する、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記単回単位用量が、少なくとも４ヶ月間持続する、前記ヒト患者での１つ以上の臨床上の終点における改善を生ずる、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記単回単位用量が、６ヶ月間持続する、前記ヒト患者での１つ以上の臨床上の終点における改善を生ずる、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
心筋梗塞についてヒト患者を処置するための方法であって、該方法が、単回単位用量の組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを、該ヒト患者の１つ以上の冠動脈管または末梢静脈に投与する工程を包含し、該単位用量が、約０．００８ｍｇ〜７．２ｍｇの組換えＦＧＦ−２、あるいはその血管形成的に活性なフラグメントまたはムテインを含む、方法。
（項目３１）
前記方法がさらに、１０Ｕ／ｋｇ〜８０Ｕ／ｋｇのヘパリンを前記患者にＩＶまたはＩＣで、前記単位用量を投与する約０〜３０分前に投与する工程を包含する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記ＦＧＦ−２が、配列番号２のアミノ酸配列を有する、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記単位用量が、末梢静脈に投与される、項目３０に記載の方法。
（項目３４）
前記単位用量が、前記患者の１つ以上の冠動脈管内に投与される、項目３０に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１Ａは、２０分周期でＩＣ注入によりヒトに投与したｒＦＧＦ−２（配列番号２）の８つの異なった用量についての、平均ｒＦＧＦ−２血漿濃度対時間プロフィールのプロットである。図１Ａに示された８つの用量のｒＦＧＦ−２は痩せたボディーマス（ＬＢＭ）の０．３３、０．６５、２、６、１２、１４、３６および４８μｇ／ｋｇである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、２０分周期でＩＶ注入によりヒトに投与したｒＦＧＦ−２（配列番号２）の２つの異なった用量についての平均ＦＧＦ−２血漿濃度対時間プロフィールのプロットである。図１Ｂにおける２つのＩＶ用量のｒＦＧＦ−２は、１８μｇ／ｋｇおよび３６μｇ／ｋｇである。３６μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２のＩＣ投与に続く平均的な濃度−時間プロフィールを比較のために含まれる。
【図２】図２は、図１Ａと１Ｂに対応するｐｇ＊ｍｉｎ／ｍｌにおける曲線（ＡＵＣ）下での平均的なＦＧＦ−２面積のプロットである。このプロットは、ＩＣまたはＩＶ注入に続く全身的なｒＦＧＦ−２暴露の用量の直線化を示している。ＩＣ経路に対する全身的な暴露は、ＩＶ投与に続いて観察される暴露に類似している。
【図３】図３は、「ｒＦＧＦ−２注入前の分」におけるへパリン投与時間の関数としての、個々のヒトの患者ＦＧＦ−２血漿クリアランス（ＣＬ）値のプロットであり、ＦＧＦ−２血漿クリアランス（ＣＬ）に対するへパリン投与のタイミングの影響を示す。
【図４】図４は、「ｒＦＧＦ−２注入前の分」におけるへパリン投与時間の関数としての、曲線（ＡＵＣ）下での個々のヒトの患者ＦＧＦ−２用量正規化面積のプロットであり、ＦＧＦ−２ ＡＵＣに対するへパリン投与のタイミングの影響を示す。
【図５】図５は、第ＩＩ相臨床試験の分析計画を要約す。
【図６】図６は、第ＩＩ相臨床試験における、患者集団についての患者の特質を要約する。
【図７】図７は、第ＩＩ相臨床試験のコースにわたる患者の特性を示す。
【図８】図８は、第ＩＩ相臨床試験に対する患者集団の安全変数を示す。
【図９】図９は、プラセボ処置群と３つのＦＧＦ−２処置群に対する運動時間における変化を示す。
【図１０】図１０は、プラセボ処置群および３つの処置群における患者のアンギナ頻度スコアにおける変化を示す。
【図１１】図１１は、プラセボ処置群および３つの処置群における患者の、シアトル アンギナ質問表の他の領域における変化を示している。
【図１２】図１２は、短縮型−３６個の肉体構成要素の要約スコアにおける変化を示す。
【図１３】図１３は、ベースラインのＣＣＳクラス３または４によって分類されたＥＴＴおよびアンギナ頻度スコアにおける変化を示す。
【図１４】図１４は、４０以下のベースラインＡＦＳによって分類されたＥＴＴおよびアンギナ頻度スコアにおける変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本出願人は、単回用量のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインが、安全かつ治療的に有効な量で、ＣＡＤと診断されたヒト患者の１つ以上の冠状脈管内または末梢静脈内に投与された場合に、さらなる処置が必要とされる前に少なくとも４〜６ヶ月間、より代表的には少なくとも２ヶ月間持続する、患者の冠状動脈疾患に安全かつ治療的に有効な処置を患者に提供することを発見した。この効果の持続期間、ならびにＥＴＴ、ＳＡＱ、およびＭＲＩにおける改善の程度は、単回用量の医薬について予期外であった。
【００２１】
句「治療的に有効な量」または「安全かつ治療的に有効な量」とは、ｒＦＧＦ−２に関して本明細書中で使用される場合、本発明に従って投与された場合に医学的に管理し得ない主要な合併症がなく、そして最適な医学的管理にも関わらずＣＡＤの症状を有する患者において客観的な心臓の改善を提供する、ｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの量を意味する。従って、液体の投与によって管理され得る急性低血圧症は、本発明の目的に対して「安全」とみなされる。代表的に、ｒＦＧＦ−２の安全かつ治療的に有効な量は、約０．２μｇ／ｋｇ〜約４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。本発明における使用に適切なＦＧＦ−２は、配列番号２のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインである。
【００２２】
従って、本発明は複数の局面を有する。その第１の局面では、本発明は、ヒト患者における血管形成を誘導するための単位用量組成物に関する。この単位用量は、治療的に有効な（すなわち、血管形成に有効な）量のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラ
グメントもしくはムテインを含み、この量は、約０．２μｇ／ｋｇ〜約４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。
【００２３】
用語「単位用量組成物」とは、本明細書中で使用される場合、本発明の方法に従ってヒト患者に投与された場合に、少なくとも４〜６ヶ月間、代表的には６ヶ月間再処置を必要としないように、有意な効力の血管形成効果を血管形成の必要がある代表的なヒト患者に提供する組成物を意味する。本発明の単位用量組成物は、代表的に、１つ以上の薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアと組み合わせて提供される。単位用量組成物の他の実施形態では、安全かつ治療的に有効な量は、約０．２μｇ／ｋｇ〜約２μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ〜約２４μｇ／ｋｇ、または約２４μｇ／ｋｇ〜約４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。
【００２４】
処置される患者の体重に依存しない、より絶対な用語で本発明の単位用量組成物を定義することは都合が良い。このように定義する場合、単位用量組成物は、０．００８ｍｇ〜７．２ｍｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。この実施形態では、単位用量組成物は、最小の患者（例えば、４０ｋｇ）の最低用量（約０．２μｇ／ｋｇ）から、より大きな患者（例えば、１５０ｋｇ）の最高用量（約４８μｇ／ｋｇ）までを範囲する、大多数のヒトＣＡＤ患者のいずれか一人に投薬することに適用させるために十分な量のＦＧＦ−２を含む。より代表的には、単位用量は、０．３ｍｇ〜３．５ｍｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。単位用量組成物を、代表的に、上記で参照した量のｒＦＧＦ−２、および本明細書中で後に記載されるような有効量の１つ以上の薬学的に受容可能な緩衝液、安定剤および／または他の賦形剤を含む、溶液形態または凍結乾燥形態で提供する。
【００２５】
上記された単位用量組成物における活性因子は、組換えＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインである。組換えＦＧＦ−２を作製する方法は、当該分野において周知である。配列番号２の組換えＦＧＦ−２は、１９９２年１０月１３日に発行された「Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ」と表題付けられた米国特許第５，１５５，２１４号（そしてこれは、その全体において、本明細書中で明確に参考として援用される）に記載のように作製される。さらに、この文章の前に出ようと後に出ようと、本明細書中で引用されるすべての他の参考文献は、その全体において、本明細書中で明確に参考として援用される。’２１４特許に開示されるように、配列番号１のＤＮＡ（これは、配列番号２のｂＦＧＦ（本明細書中以降「ＦＧＦ−２」）をコードする）は、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、Ｃｏｌ Ｅ１、ｐＣＲＩ、ＲＰ４、またはλ−ファージのようなクローニングベクター内に挿入され、そしてこのクローニングベクターは、真核生物細胞または原核生物細胞のいずれかを形質転換するために使用され、ここで、この形質転換細胞がＦＧＦ−２を発現する。１つの実施形態では、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母細胞である。結果として生じた、発現される全長ＦＧＦ−２は、配列番号２と一致して１４６個のアミノ酸を有する。配列番号２のＦＧＦ−２は４個のシステイン（すなわち、残基の２５位、６９位、８７位、および９２位）を有するが、内部ジスルフィド結合は存在しない。［’２１４、第６欄、第５９〜６１行］。しかし、酸化的条件の下で架橋が生じる場合には、２５位と６９位の残基の間で生じるようである。
【００２６】
１４６個のアミノ酸残基を有する配列番号２のＦＧＦ−２は、天然に存在するヒトＦＧＦ−２とは、わずか２個のアミノ酸残基で異なる。詳細には、配列番号２のＦＧＦ−２の残基１１２位および１２８位のアミノ酸はそれぞれ、ＳｅｒおよびＰｒｏであるが、ヒトＦＧＦ−２では、それらはそれぞれＴｈｒおよびＳｅｒである。事実、対応するヒトＦＧＦ−２のように、ウシＦＧＦ−２は、最初に、１５５個のアミノ酸残基を有するポリペプチドとしてインビボで合成される。Ａｂｒａｈａｍら「Ｈｕｍａｎ Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂ
ｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ」、ＥＭＢＯ Ｊ．，５（１０）：２５２３−２５２８（１９８６）。配列番号２のＦＧＦ−２を、Ａｂｒａｈａｍの全長１５５残基のウシＦＧＦ−２と比較した場合、配列番号２のＦＧＦ−２は、対応する全長の分子のＮ末端で、最初の９個のアミノ酸残基のＭｅｔ Ａｌａ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ（配列番号３）を欠失する。本発明の組成物および方法において使用される組換えＦＧＦ−２は、９０年９月１１日に発行された「Ｂｏｖｉｎｅ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ」と表題付けられた米国特許第４，９５６，４５５号（これは、その全体において、本明細書中で参考として援用される）に詳細に記載される技術を用いて、製薬用品質（９８％以上の純度）に精製された。特に、出願人の単位用量組成物の組換えＦＧＦ−２の精製において使用される最初の２つの工程は、「以前に記載されたような、従来のイオン交換精製工程および逆相ＨＰＬＣ精製工程」である。［米国特許第４，９５６，４５５号、これは、Ｂｏｌｅｎら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８１：５３６４−５３６８（１９８４）を引用する］。第３の工程（これを、’４５５特許では「鍵となる精製工程」という［’４５５、第７欄、第５〜６行］）は、ヘパリン−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）アフィニティクロマトグラフィーであり、ここではＦＧＦ−２の強力なヘパリン結合親和性は、約１．４Ｍおよび約１．９５ＭのＮａＣｌで溶出した場合に、数１０００倍の精製を達成するために使用される［’４５５、第９欄、第２０〜２５頁］。ポリペプチドの均質性は、逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって確認された。緩衝液の交換は、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ−２５（Ｍ）ゲル濾過クロマトグラフィーによって達成された。
【００２７】
配列番号２の１４６残基のｒＦＧＦ−２に加えて、本発明の単位用量における活性因子はまた、ＦＧＦ−２の「血管形成活性フラグメント（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」を含む。用語ＦＧＦ−２の「血管形成活性フラグメント」とは、配列番号２の１４６残基の約８０％を有し、かつ配列番号２のＦＧＦ−２の血管形成活性の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％を保持するＦＧＦ−２のフラグメントを意味する。
【００２８】
血管形成に活性であるために、ＦＧＦ−２フラグメントは、２つの細胞結合部位および２つのヘパリン結合部位のうちの少なくとも１つを有するべきである。類似体ヒトＦＧＦ−２の２つの推定細胞結合部位は、その残基３６位〜３９位および７７位〜８１位に存在する。Ｙｏｓｈｉｄａら「Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｓｔ，ａ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔ−２−Ｅｎｃｏｄｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８４：７３０５−７３０９（１９８７年１０月）の図３を参照のこと。ｈＦＧＦ−２の２つの推定ヘパリン結合部位は、その残基１８位〜２２位および１０７位〜１１１位に存在する。Ｙｏｓｈｉｄａ（１９８７）の図３を参照のこと。天然に存在するヒトＦＧＦ−２（ｈＦＧＦ−２）およびｒＦＧＦ−２（配列番号２）についてのアミノ酸配列の間の９８％より高い類似性を考慮すると、ｒＦＧＦ−２（配列番号２）の２つの細胞結合部位はまた、その残基の３６位〜３９位および７７位〜８１位であり、そして２つのヘパリン結合部位は、その残基の１８位〜２２位および１０７位〜１１１位であることが予期される。上記と一致して、配列番号２のＦＧＦ−２のＮ末端短縮物（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）は、ウシにおいてその活性を除去しないことが当該分野で周知である。特に、当該分野では、いくつかの天然に存在しかつ生物学的に活性なＦＧＦ−２のフラグメントを開示し、そのフラグメントは、配列番号２のＦＧＦ−２に対するＮ末端短縮物を有している。配列番号２の残基１２〜１４６を有する活性な短縮型ｂＦＧＦ−２はウシ肝臓において見出され、そして配列番号２の残基１６〜１４６を有する、別の活性な短縮型ｂＦＧＦ−２はウシの腎臓、副腎、および精巣において見出された。［米国特許第５，１５５，２１４号の第６欄、第４１〜
４６行（これは、Ｕｅｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１３８：５８０−５８８（１９８６）を引用する）を参照のこと］。同様に、ＦＧＦ活性を有することが公知である配列番号２のｂＦＧＦ−２の他のフラグメントは、ＦＧＦ−２（２４−１２０）−ＯＨおよびＦＧＦ−２（３０−１１０）−ＮＨ２である。［米国特許第５，１５５，２１４号の第６欄、第４８〜５２行］。これらの後者のフラグメントは、ＦＧＦ−２（配列番号２）の細胞結合部分の両方およびヘパリン結合セグメントのうちの１つ（残基１０７〜１１１）を保持する。従って、ＦＧＦ−２の血管形成活性フラグメントとは、代表的に、配列番号２のＦＧＦ−２の残基３０〜１１０に対応し、より代表的には配列番号２のＦＧＦ−２の残基１８〜１４６に対応する残基を少なくとも有する、ＦＧＦ−２のそれらの末端短縮型フラグメントを包含する。
【００２９】
本発明の単位用量はまた、配列番号２のｒＦＧＦ−２の「血管形成活性ムテイン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｍｕｔｅｉｎ）」を含む。用語「血管形成活性ムテイン」とは、本明細書中で使用される場合、以下の検索パラメーター：１２のギャップオープンペナルティおよび１のギャップ伸長ペナルティーを使用するアフィンギャップ検索を使用して、ＭＳＰＲＣＨプログラム（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）で実行されるようなＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズム（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）によって決定される場合に、任意の天然に存在するＦＧＦ−２に対して６５％の配列同一性（相同性）を有し、そして上記の少なくとも６５％の配列同一性を有する天然に存在するＦＧＦ−２の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも８０％の血管形成活性を保持する、単離および精製された組換えタンパク質または組換えポリペプチドを意味する。好ましくは、血管形成活性ムテインは、天然に存在するＦＧＦ−２に対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、そして最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する。他の周知であり慣用的に使用される相同性／同一性の走査アルゴリズムのプログラムとしては、以下が挙げられる：ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８（１９８８）；ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：１４３５（１９８５）；Ｄｅｖｅｒｅａｕｘら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５（１９８４）；または、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）のＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、またはＢＬＡＳＴＸアルゴリズム。これらのアルゴリズムを使用するコンピュータープログラムもまた利用可能であり、そして以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（これらは、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ、バージョン８、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ ＵＳＡから市販されている）；ならびに、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｉｎｔｅｌｌｅｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ ＣＡによるＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム中）。好ましくは、配列同一性のパーセンテージを、プログラムによって決定されたデフォルトのパラメーターを用いることによって決定する。
【００３０】
句「配列同一性」は、本明細書中で使用される場合、ムテインのアミノ酸配列の特定の連続的セグメントを、天然に存在するＦＧＦ−２のアミノ酸配列と整列および比較した場合に、ムテイン配列内に類似して位置付けられることが見出される同一のアミノ酸のパーセンテージをいうことが意図される。
【００３１】
ムテインにおけるアミノ酸配列同一性のパーセンテージを考慮する場合、タンパク質またはタンパク質機能の特性に作用しない保存的アミノ酸置換の結果として、いくつかのアミノ酸残基位置が、参照タンパク質とは異なり得る。これらの場合、配列同一性のパーセンテージは、保存的に置換されたアミノ酸における類似性を説明するために、上方に調整され得る。このような調整は、当該分野において周知である。例えば、ＭｅｙｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏ．Ｓｃｉ．，４：１１−１７
（１９８８）を参照のこと。
【００３２】
本発明の血管形成因子の「血管形成活性ムテイン」を調製するために、部位特異的変異誘発についての標準的な技術を使用し得る。これらの技術は、当該分野において公知であり、および／またはＧｉｌｍａｎら、Ｇｅｎｅ ８：８１（１９７９）またはＲｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２８：７３１（１９８７）に教示される。部位特異的変異誘発技術のうちの１つを使用して、配列番号１のｃＤＮＡ配列内に１つ以上の点変異を導入し、１つ以上のアミノ酸置換または内部欠失を導入する。保存的アミノ酸置換とは、置換されるアミノ酸の全体的電荷、疎水性／親水性、および／また立体的かさ高さを保存した置換である。例示のために、以下のグループの間の置換は保存的である：Ｇｌｙ／Ａｌａ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ／Ｌｅｕ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｓｅｒ／Ｃｙｓ／Ｔｈｒ、およびＰｈｅ／Ｔｒｐ／Ｔｙｒ。結果として生じるタンパク質またはポリペプチドが、上記に特定される制限内で血管形成活性を保持する限り、天然に存在する血管形成ＦＧＦ−２の配列との有意な差異（３５％まで）が許容される。
【００３３】
システインを枯渇したムテインは、本発明の範囲内のムテインである。これらのムテインは、上記のような部位特異的変異誘発を使用するか、または「Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−Ｄｅｐｌｅｔｅｄ Ｍｕｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と表題付けられた米国特許第４，９５９，３１４号（「’３１４特許」）に記載の方法に従って構築される。’３１４特許は、生物学的活性および置換の効果を決定するための方法を開示する。システインの置換は、ジスルフィド形成に関与しない２つ以上のシステインを有するタンパク質において特に有用である。適切な置換としては、残基８７位および９２位のシステイン（これらは、ジスルフィド形成に関与しない）の１つまたは両方についてのセリンの置換が挙げられる。好ましくは、血管形成活性に関連しないＦＧＦ−２のＮ末端に置換を導入する。しかし、上記で考察されたように、保存的置換は、分子の全体にわたる導入に適切である。
【００３４】
本発明の単位用量組成物は、安全かつ血管形成に有効な用量のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテイン、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。代表的に、本発明の薬学的組成物の安全かつ血管形成に有効な用量は、ヒト患者への投与に適切な形態およびサイズにある。そしてこれは、以下を含有する：（ｉ）０．２μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテイン、（ｉｉ）および薬学的に受容可能なキャリア。他の実施形態では、安全かつ血管形成に活性な用量は、０．２μｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇより多い〜２４μｇ／ｋｇ未満、または２４μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇのＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテイン、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。大多数のヒトＣＡＤ患者について絶対的な用語で表現すると、本発明の単位用量は、０．００８ｍｇ〜７．２ｍｇ、より代表的には０．３ｍｇ〜３．５ｍｇのＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。
【００３５】
本発明の単位用量組成物の２番目に列挙される成分は、「薬学的に受容可能なキャリア」である。用語「薬学的に受容可能なキャリア」とは、本明細書中で使用される場合、それ自体、その組成物を受容する患者に有害な抗体の産生を誘導せず、そして過度の毒性を伴わずに投与され得る、タンパク質様の医薬の安定化および／または投与のための当該分野において周知の任意のキャリアまたは希釈剤を意味する。薬学的に受容可能なキャリアの選択およびその後の加工は、本発明の単位用量組成物が、液状形態または固体形態のいずれかで提供されることを可能にする。
【００３６】
単位用量組成物が液状形態である場合、薬学的に受容可能なキャリアは、静脈内（「ＩＶ」）または歯冠内（「ＩＣ」）の注射または注入に適切な、安定なキャリアまたは希釈
剤を含む。注射可能溶液または注入可能溶液について適切なキャリアまたは希釈剤は、使用される投薬量および濃度でヒトレシピエントに非毒性であり、そしてこれは滅菌水、糖溶液、生理食塩水溶液、タンパク質溶液、またはこれらの組み合わせを含む。
【００３７】
代表的には、薬学的に受容可能なキャリアは、緩衝剤および１以上の安定化剤、還元剤、抗酸化剤および／または抗酸化キレート剤を含む。タンパク質ベースの組成物、特に薬学的組成物の調製における緩衝剤、安定化剤、還元剤、抗酸化剤およびキレート剤の使用は、当該分野において周知である。Ｗａｎｇら、「Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｐＨｓ ｆｏｒ Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｕｓｅｄ
ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ」、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｄｒｕｇ Ａｓｓｎ．、３４（６）：４５２〜４６２（１９８０）；Ｗａｎｇら、「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ
Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ」、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．ａｎｄ Ｔｅｃｈ．、４２：Ｓ４〜Ｓ２６（補遺１９８８）；Ｌａｃｈｍａｎら、「Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ ａｓ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒｓ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ−Ｐａｒｔ Ｉ」Ｄｒｕｇ
ａｎｄ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、１０２（１）：３６〜３８、４０および１４６〜１４８（１９６８）；Ａｋｅｒｓ，Ｍ．Ｊ．、「Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．ａｎｄ Ｔｅｃｈ．３６（５）：２２２〜２２８（１９８８）；ならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第ＸＸＶ巻、ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＫａｐｌａｎ編、Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇによる「Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｂｏｎｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ」、１８５〜１８８頁を参照のこと。適切な緩衝剤には、酢酸塩、アジピン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、リン酸塩、酒石酸塩、および種々のアミノ酸の塩が挙げられる。Ｗａｎｇ（１９８０）４５５項を参照のこと。適切な安定化剤には、トレロース（ｔｈｒｅｌｏｓｅ）またはグリセロールのような糖類が挙げられる。還元されたシステインの還元を維持する適切な還元剤には、０．０１重量／重量％〜０．１重量／重量％のジチオスレイトール（クリランド試薬としても公知のＤＴＴ）またはジチオエリスリトール；０．１重量／重量％〜０．５重量／重量％のアセチルシステインまたはシステイン（ｐＨ２〜３）；ならびに０．１重量／重量％〜０．５重量／重量％のチオグリセロール（ｐＨ３．５〜７．０）およびグルタチオンが挙げられる。Ａｋｅｒｓ（１９８８）２２５〜２２６頁を参照のこと。適切な抗酸化剤には、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、およびアスコルビン酸が挙げられる。Ａｋｅｒｓ（１９８８）２２５頁を参照のこと。還元されたシステインの微量金属触媒酸化を防ぐために微量金属をキレート化する、適切なキレート剤には、クエン酸塩、酒石酸塩、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の二ナトリウム塩、四ナトリウム塩、およびカルシウム二ナトリウム塩、ならびにジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）が挙げられる。例えば、Ｗａｎｇ（１９８０）４５７〜４５８頁および４６０〜４６１頁、ならびにＡｋｅｒｓ（１９８８）２２４〜２２７頁を参照のこと。適切な糖には、グリセロール、トレハロース、グルコース、ガラクトース、およびマンニトール、ソルビトールが挙げられる。適切なタンパク質は、ヒト血清アルブミンである。
【００３８】
液体形態において、本発明の代表的な単位用量組成物は、薬学的に受容可能なキャリアに溶解された、約０．００１ｍｇ〜８ｍｇ、より代表的には０．０３ｍｇ〜５ｍｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む。適切な薬学的に受容可能なキャリアは、１０ｍＭ チオグリセロール、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ クエン酸ナトリウム、および１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５を含む。上記の単位用量組成物についての適切な希釈剤または流剤（ｆｌｕｓｈｉｎｇ ａｇｅｎｔ）は、上記の
キャリアのいずれかである。代表的には、この希釈剤は、キャリア溶液である。ｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインは、長期間については液体形態で不安定である。液体形態の安定性および有効期間を最大化するために、この単位用量組成物は、−６０℃で凍結して貯蔵されるべきである。融解された場合、この溶液は、冷蔵条件で６ヶ月間安定である。代表的な単位用量は、単位用量中に溶解された０．００８〜７．２ｍｇのｒＦＧＦ−２または血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを有する、約１〜４０ｍｌ、より代表的には１０〜４０ｍｌの上記の組成物を含む。単位用量における使用に適切なｒＦＧＦ−２は、配列番号２のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインである。
【００３９】
別の実施形態では、単位用量組成物は、凍結乾燥された（フリーズドライされた）形態で提供される。この形態では、ｒＦＧＦ−２の単位用量は、冷蔵温度にて、実質的に６ヶ月よりも長く、治療効力を損失することなく貯蔵され得る。凍結乾燥は、複数のバイアル（各々は、本発明の単位用量のｒＦＧＦ−２の上記の液体形態をその中に含む）の減圧下での、迅速なフリーズドライ（すなわち、水分を除去する）によって達成される。上記の凍結乾燥を行う凍結乾燥機は、市販されており、そして当業者により容易に作動される。凍結乾燥されたケーク（ｃａｋｅ）形態の、得られた凍結乾燥された単位用量組成物は、得られた凍結乾燥されたケーク内に、対応する液体処方物について上記の１以上の緩衝剤、安定化剤、抗酸化剤、還元剤、塩および／または糖を含むように処方される。全てのこのような他の成分を含む凍結乾燥された単位用量組成物は、滅菌水性希釈剤（例えば、滅菌水、滅菌糖溶液、または滅菌生理食塩水）で既知の容量または濃度に再構成されることのみを必要とする。あるいは、これは、上記のような滅菌緩衝溶液で再構成され得るが、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を欠く。凍結乾燥されたケークとして、この単位用量組成物は、冷蔵温度で６ヶ月から２年間安定である。従って、凍結乾燥形態のこの単位用量組成物の貯蔵は、従来の冷蔵装置を使用して容易に提供される。
【００４０】
本発明の単位用量組成物は、心臓カテーテルまたは他の注入デバイス（これは、デッドスペース（ｄｅａｄ ｓｐａｃｅ）を有する）を通じて投与されるので、この単位用量組成物を含むバイアルに処方して、その結果、これが、患者に投与されるよりも、約１０〜５０％多くのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含むことが都合がよい。例えば、投与されるｒＦＧＦ−２の単位用量が７．２ｍｇである場合に、このバイアルは、必要に応じて、５０％までの余分（例えば、全体で約１０．８ｍｇ）のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含むように処方される。この余分な溶液は、送達装置のデッドスペースを充填するために適切である。デッドスペースを許容しない代替的な実施形態では、薬学的組成物は、心臓カテーテル内に、薬学的に受容可能な緩衝剤、希釈剤またはキャリアの前にロードされ、次いで、この薬学的に受容可能な緩衝剤、希釈剤またはキャリアは、適切な量の１以上の投薬を、血管形成を必要としている心筋における１以上の部位に送達するために使用される。
【００４１】
上記で議論したように、上記の単位用量組成物について薬学的に受容可能なキャリアは、緩衝剤、ならびに１以上の安定化剤、還元剤、抗酸化剤および／または抗酸化キレート剤を含む。単位用量組成物がＦＧＦ−２および内皮細胞レセプターに結合して、その結果、ＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの血管形成効力を増強するに効果的な量のグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓｏａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）（「プロテオグリカン」または「ムコ多糖」としても公知）（例えば、ヘパリン）を含むことは、本発明の範囲内である。投与されるヘパリンの量は、患者の体重１ｋｇあたり約１０〜８０Ｕ（Ｕ／ｋｇ）、代表的には約４０Ｕ／ｋｇの量である。絶対的な用語で表されると、任意の１患者に投与されるヘパリンの総量は、５，０００Ｕを超えない。従って、再構成の際に、本発明の単位用量組成物は、血管形成に効果的な量のｒＦＧＦ−
２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含むのみならず、これはまた、約１０〜８０Ｕ／ｋｇ、代表的には約４０Ｕ／ｋｇのヘパリンを含む。希釈剤の代表的な容量は、約１〜４０ｍｌである。より多い容量の希釈剤が使用され得るが、このようなより多い容量は、代表的には、より長い投与時間を生じる。患者の体重ｋｇに依存して、０．２μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２、またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含有する単回用量が、患者への投与のために再構成された生成物としてバイアルから引き抜かれる。従って、２４μｇ／ｋｇを服用されている平均７０ｋｇの男性は、バイアルから引き抜かれた、（７０ｋｇ×３０μｇ／ｋｇ）２１００μｇ（すなわち、２．１ｍｇ）のＩＣ注射を受けるに十分な容量の再構成された生成物を有する。
【００４２】
その第２の局面では、本発明は、上記の単位用量組成物を使用する、ＣＡＤまたはＭＩについてヒト患者を処置するための方法に関する。特に、１つの実施形態では、本発明は、冠状動脈疾患についてヒト患者を処置するための方法に関し、この方法は、安全かつ治療的に有効な量の組換えＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを、冠状動脈疾患についての処置を必要とするヒト患者の、１以上の（代表的には２の）冠状血管または末梢静脈に投与する工程を包含する。冠状動脈疾患の処置を必要とするヒト患者は、代表的には、任意の医学管理にもかかわらずアンギナの症候のままである冠状動脈疾患を患うヒト患者である。好ましい冠状血管は、冠状動脈であるが、冠状血管形成術（ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ）により提供されるように、移植された伏在静脈および移植された内胸動脈もまた、適切である。単位用量組成物を投与するために適切な末梢静脈には、流体および医薬品の投与のために、処置する医師および看護士によって慣用的に使用されるヒト身体の至る所に見出される末梢静脈を含む。このような静脈の例には、頭部、肘正中皮、および腕の尺側皮が挙げられる。
【００４３】
冠状内（ＩＣ）注入として投与される場合、単位用量のｒＦＧＦ−２またはその血管形成フラグメントもしくは血管形成活性ムテインは、代表的には、１時間以内、より代表的には約２０分の時間にわたって、患者の１以上（代表的には、２）の冠状静脈中に投与される。２０分の時間にわたって投与される場合、単位用量組成物は、代表的には、０．５〜２．０ｍｌ／分、より代表的には約１ｍｌ／分の速度で投与される。冠状静脈は、それらが閉塞されていない限り、ネイティブな血管または移植物であり得る。単位用量のｒＦＧＦ−２またはその血管形成フラグメントもしくは血管形成活性ムテインの容量は、代表的には１０〜４０ｍｌ；より代表的には２０ｍｌである。この単位用量の注入の時間の長さは、重要ではなく、そして注入の速度および容量に依存して短縮または延長され得る。
【００４４】
静脈（ＩＶ）内注射として投与される場合、単位用量のｒＦＧＦ−２またはその血管形成フラグメントもしくは血管形成活性ムテインは、代表的には１時間以内、より代表的には２０分の時間にわたって、従来のＩＶ設定を使用して末梢静脈中に投与される。２０分の時間にわたって投与される場合、単位用量組成物は、代表的には、１ｍｌ／分の速度で投与される。
【００４５】
ＣＡＤを処置するための上記の方法の第一相の臨床試験では、単回の単位用量組成物は、任意の医学管理にもかかわらずアンギナの症候のままであるＣＡＤを有するヒト患者にＩＣまたはＩＶで投与された。本発明の方法は、血管形成を誘導するので、本発明の方法は、ＣＡＤまたはＭＩにおける根本的な状態の処置を提供し、そして硝酸塩により提供されるような症状からの単なる一過性の解放ではない。代表的には、本発明の方法の安全かつ治療的に有効な量は、０．２μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを薬学的に受容可能なキャリア中に含む。他の実施形態において、この安全かつ治療的に有効な量は、０．２μｇ／ｋｇ〜２μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇより多く〜２４μｇ／ｋｇ未満、または２４μｇ／ｋｇ〜４８μｇ
／ｋｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを薬学的に受容可能なキャリア中に含む。絶対的な用語では、この安全かつ治療的に有効な量は、約０．００８ｍｇ〜約７．２ｍｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテイン；より代表的には、０．３ｍｇ〜３．５ｍｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインである。適切なｒＦＧＦ−２は、配列番号２のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインである。
【００４６】
別の局面では、本発明はまた、ヒト患者の心臓における血管形成を誘導するための方法に関する。この方法は、組換えｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインの単回の単位用量組成物を、冠状血管形成を必要とするヒト患者の１以上の冠状血管にまたは末梢静脈に投与する工程であって、上記の単位用量組成物は、約０．００８ｍｇ〜７．２ｍｇの組換えＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを薬学的に受容可能なキャリア中に含む、工程を包含する。より代表的には、この単位用量組成物は、約０．３〜３．５ｍｇのｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを、薬学的に受容可能なキャリア中に含む。上記のように、治療的に有効な量のｒＦＧＦ−２またはその血管形成的に活性なフラグメントもしくはムテインを含む、単回の単位用量組成物は、既に公知でありかつ医薬品（例えば、血栓崩壊剤、ストレプトキナーゼ、または冠状動脈を可視化するために使用される放射性を透過しない（ｒａｄｉｏ−ｏｐａｑｕｅ）色素または磁気粒子）の冠状内投与について当該分野において使用される、標準的な心臓カテーテル技術を使用して、血管形成を必要とするヒト患者の少なくとも１つの冠状血管に投与される。例としては、冠状カテーテルは、処置を必要とする患者の動脈（例えば、大腿または鎖骨下）に挿入され、そしてこのカテーテルが、処置される患者の適切な冠状血管中に配置されるまで、見えるように前方に押し出される。明確な線を維持するために標準的な注意を使用して、溶液形態の薬学的組成物は、１０〜３０分の時間にわたって実質的に連続的に単位用量を注射することによって投与される。本発明の薬学的組成物は、より長い時間にわたって投与され得るが、本出願人らは、有益性も、そのようにすることによる血栓症の潜在的に増大した危険性も全く認知しない。代表的には、単位用量の一部（例えば、半分）は、第１の冠状血管に投与される。次いで、カテーテルは、第２の２次冠状血管に再び配置され、そしてこの単位用量の残留物は、このカテーテルを洗浄しながら投与される。上記の再配置手順を使用して、単位用量の一部は、その単位用量の全体が投与されるまで、複数の冠状血管に投与され得る。投与の後に、このカテーテルは、従来の当該分野で公知のプロトコルを使用して引き抜かれる。本明細書中に記載される第一相の臨床試験において、治療の有益性が、単回の単用量のＩＣ ｒＦＧＦ−２投与に従う２週間程度の早さで患者により報告された。臨床的に有意な改善が、本発明の単回の単位用量のＩＣまたはＩＶ投与の後、３０日程度の早さで、客観的な診断基準（ＥＴＴおよび／またはＳＡＱ）により実証され、そして服用後の２ヶ月間維持された。進行性ＣＡＤ疾患を患う特定の患者では、ｒＦＧＦ−２のさらなる単位用量を、最初の単位用量後の２または１２ヶ月の間隔で投与し、しばらくの（ｉｎｔｅｒｉｍ）期間、ＣＡＤの進行を克服するために必要または適切であり得る。非常に進行性のＣＡＤを患う数人の患者では、本発明の単位用量が、４ヶ月の間隔で再投与される。任意の例では、処置する担当医は、必要とされる場合、患者の臨床徴候の慣用的な評価に基づき再投与についての時間を決定し得る。
【００４７】
本発明の方法の有益性の１つは、心臓の血管新生である。従って、別の局面において、本発明は、ヒト患者の心臓における血管新生を誘導するための方法に関し、この方法は、血管神聖的に有効な量のｒＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントもしくはそのムテインを薬学的に受容可能なキャリア中に含む、単回単位用量組成物を、冠状血管新生を必要とするヒト患者の１以上の冠状血管（ＩＣ）中または末梢静脈（ＩＶ）中に投与する工程を包含する。上記の方法において、血管神聖的に有効な量は、約０．２μｇ／ｋｇ
〜約４８μｇ／ｋｇ（または絶対的な用語では、約０．００８ｍｇ〜約７．２ｍｇ）の組換えＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントもしくはそのムテインを含む。さらに代表的には、血管神聖的に有効な量は、約０．３ｍｇ〜約３．５ｍｇの組換えＦＧＦ−２またはその血管新生に活性なフラグメントもしくはそのムテインを含む。上記で同定された方法における使用に適切なｒＦＧＦ−２は、配列番号２のｒＦＧＦ−２またはその血管新生的に活性なフラグメントである。上記の方法の１つの実施形態では、単位用量組成物は、患者の冠状血管にＩＣで、または末梢静脈にＩＶで投与される。別の実施形態では、この単位用量組成物は、本明細書中に記載されるように、ヘパリンとともに投与される。
【００４８】
上記の冠動脈新血管新生を提供する方法はまた、１つ以上の冠動脈において心筋梗塞（ＭＩ）を経験したヒト患者において有益である。従って、別の局面において、本発明はまた、ＭＩについてヒト患者を処置するための方法に関し、この方法は、上記ヒト患者の１つ以上の冠動脈血管または末梢静脈に、治療有効量のｒＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントもしくはそのムテインを含む単回単位用量組成物を投与する工程を包含する。上記の方法において、代表的には、単位用量組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に約０．２μｇ／ｋｇ〜約４８μｇ／ｋｇ（または絶対的な用語では、約０．００８ｍｇ〜約７．２ｍｇ）の組換えＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントもしくはそのムテインを含む。上記同定された方法における使用に対して適切なｒＦＧＦ−２は、配列番号２のｒＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントである。
【００４９】
血管形成を必要とする、不安定なアンギナまたは急性心筋梗塞の事象において、本明細書中に開示されている同じ用量のｒＦＧＦ−２またはその血管新生フラグメントまたはそのムテインは、それらの状態を処置する際の補助治療としても有用である。従って、別の局面において、本発明は、血管形成を必要とする、不安定なアンギナまたは急性心筋梗塞について患者を処置するための改善された方法に関し、この方法は、処置が必要な患者に血管形成を提供することを包含し；この改善は、前記ヒト患者の１つ以上の冠動脈血管または末梢静脈に、治療有効量のｒＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントもしくはそのムテインを含む単回単位用量組成物を投与することを包含する。上記の方法において、単位用量組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に約０．２μｇ／ｋｇ〜約４８μｇ／ｋｇ（または絶対的な用語では、約０．００８ｍｇ〜約７．２ｍｇ）の組換えＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントもしくはそのムテインを含む。上記同定された方法における使用に対する適切なｒＦＧＦ−２は、配列番号２のｒＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントである。
【００５０】
本発明の任意の上記方法において、ｒＦＧＦ−２またはその血管新生活性フラグメントもしくはそのムテインは、一酸化窒素（認知された平滑筋拡張薬）の放出に関連しており、患者に投与すると患者の血圧の急激な低下を引き起こす。従って、本発明の方法において、本発明の単位用量を投与する前に、ＩＶ液体を患者に補給をする（ｈｙｄｒａｔｅ）ことが好ましい。さらに、単位用量の安全性および許容性のために、ｒＦＧＦ−２投与中および投与後の積極的な液体管理もまた好まれる。結局、有効量のグリコサミノグリカン（「プロテオグリカン」または「ムコポリサッカライド」としても公知である）を投与する工程（例えば、本発明の単位用量組成物を投与する前に、ヘパリンを０〜３０分投与する工程）を包含することもまた、上記の方法の範囲内である。代表的には、投与されるグリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）の有効量は、約１０〜８０Ｕ／ｋｇであり、より代表的には、約４０Ｕ／ｋｇである。しかし、一般的には、投薬する直前に任意の一人の患者に投与されるヘパリンの総量は、５，０００Ｕを超えない。
【００５１】
ＥＤＴＡが、通常の心筋収縮および心臓伝導に必要なカルシウムの強力なキレーターであるという理由で、ＥＤＴＡの濃度を最小化することは、患者の安全に対して重大である
。１００μｇ／ｍｌ未満濃度のＥＤＴＡが、ヒト患者へのＩＣまたはＩＶ注入によりｒＦＧＦ−２の投与の安全性を最適化した。
【００５２】
ｒＦＧＦ−２の急激な大量瞬時投与は、動物における超低血圧（ｐｒｏｆｏｕｎｄ ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｏｎ）と関連するので、注入速度は患者の安全に対して重大である。０．５〜２ｍＬ／分での投与（代表的には、１ｍＬ／分）が、ヒト患者へのＩＣまたはＩＶ注入によるｒＦＧＦ−２の投与の安全性を最適化した。
【００５３】
本発明の単回単位用量組成物を投与することにより、ＣＡＤについてヒト患者を処置することに関するフェーズＩの臨床試験が実施され、本明細書中の実施例１〜３に記載される。その試験において、ＣＡＤと診断された６６人のヒト患者（本明細書中の実施例２の基準を満たす）が、本発明の方法に従って、単回単位用量のｒＦＧＦ−２を受けた。具体的には、５２人のヒト患者に約２０分間にわたって、ＩＣ注入により単位用量０．３３μｇ／ｋｇ〜４８μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２が投与された。１４人のヒト患者に、約２０分間にわたって、ＩＶ注入により単位用量１８μｇ／ｋｇまたは３６μｇ／ｋｇのいずれかのｒＦＧＦ−２が投与された。次いで、６６人の処置された患者は、当該分野で認知された評価基準の３セット：１）患者らの運動許容時間（ＥＴＴ）の変化；２）シアトルアンギナ質問表（Ｓｅａｔｔｌｅ Ａｎｇｉｎａ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）（これは、客観的な基準と主観的な基準の混合された組み合わせに基づく評価を提供する）：および３）ＭＲＩにより評価されるような心臓における物理的変化の測定を使用して、ベースライン（すなわち、単回単位用量での処置の前）と比較して、そして単回単位用量での処置の１ヶ月後、２ヶ月後、そして６ヶ月後に再び評価された。
【００５４】
実施例１〜３のフェーズＩの臨床試験の６６人の患者のＥＴＴを、Ｂｒｕｃｅトレッドミルプロトコールを使用して、ベースライン時、（本発明の単回単位用量組成物の）投与後１ヶ月、２ヶ月、および６ヶ月に測定した。トレッドミルプロトコールがベースライン時に使用されたものと同じでない場合、その被験体はこの分析から除外された。従って、被験体の数は、時間が経つと変化した。さらに、緊急の血管再生を有するいずれの患者も、この分析から除外された。用量は、ベースラインからのＥＴＴの平均変化が６０秒よりも大きな値で増加した場合、有効であると考えられた。ＥＴＴ評価の結果は、表１に提供される。
【００５５】
【表１】
表１を参照すると、１ヶ月におけるベースラインからの平均変化は、すべての投与群について６０秒未満であった。しかし、アンギナによりトレッドミル試験を中止する患者の割合は、すべての群において時間とともに減少した。投与後２ヶ月および６ヶ月におけるベースラインからの平均変化は、用量の多いＩＣ群およびＩＶ群の患者において、用量が少ないかまたは中程度のＩＣ群よりも大きかった。用量の多いＩＣ群（２４〜４８：μｇ／ｋｇ）およびＩＶ群（１８および３８：μｇ／ｋｇ）における各々の６ヶ月の増加したＥＴＴの持続性（１３３．１秒および８７．５秒）は、予想外であった。ＥＴＴの最も大きな平均の増加は、それぞれ２ヶ月および６ヶ月の１０７．９秒および１３３．１秒であり、これらは、用量の多い（２４〜４８μｇ／ｋｇ）ＩＣ群において生じた。ＩＶ群は、それぞれ２ヶ月および６ヶ月にて９３．４秒および８７．５秒というＥＴＴの有意な平均増加を示し、このことは、本明細書中で使用したラットおよびブタの動物モデルによっては予想されなかった。全体としては、２ヶ月におけるこの効果（ＥＴＴの増加）の持続性およびＩＣ群とＩＶ群の両群のその大きさは、全く予想外であった。
【００５６】
本明細書中の実施例１〜３に記載されるフェーズＩの臨床試験の６６人のヒト患者はまた、Ｓｅａｔｔｌｅ Ａｎｇｉｎａ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＳＡＱ）を使用して、評価された。ＳＡＱは、認可され、疾患特異的な、クオリティーオブライフの手段であり、これは以下の５つのスケールを評価する：１）「労作耐容量（ｅｘｅｒｔｉｏｎａｌ
ｃａｐａｃｉｔｙ）」＝身体的活動の限界；２）「疾患認知」＝ＭＩの懸念；３）「処置の満足感（ｓａｔｉｓｆａｃｔｉｏｎ）」；４）「アンギナ頻度（ａｎｇｉｎａ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）」＝エピソード数およびニトログリセリンの舌下使用；および５）「アンギナ安定性」＝最も激しい身体的活動でのエピソード数。各々の５つのスケールの得点の可能な範囲は、０〜１００であり、より高い得点は、より良いクオリティーオブライフを示す。代表的には、平均ベースライン得点（すなわち処置前）と処置後の得点との間が８ポイント以上の平均変化は、「臨床的に有意」であると認識される。しかし、本分析に
おいて、ベースラインからの得点の平均変化が、１４ポイントより大きな値で増加した場合、用量は「有効」と考えられた。１４が選択された（８の代わりに）理由は、別の増殖因子（ＶＥＧＦ）の臨床試験の２ヶ月時のプラセボ群において見られた改善を考慮したためであった。
【００５７】
ＳＡＱ評価を実施する際に、ＥＴＴについて評価された同じ投与量の群に従って患者を分類した（すなわち、０．３３〜２．０μｇ／ｋｇＩＣ（低）；６．０〜１２．０μｇ／ｋｇＩＣ（中）；２４〜４８μｇ／ｋｇＩＣ（高）；ならびに１８および３６μｇ／ｋｇＩＶ）。このアンケート用紙を、ベースライン時（投与前）、ならびに本発明の方法に従ってｒＦＧＦ−２の単回単位用量組成物を投与された後の２ヶ月および６ヶ月に各投与量群毎に被験体に与えた。
【００５８】
第１のＳＡＱスケールは「労作能力（ｅｘｅｒｔｉｏｎａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ）」である。労作能力に関するデータを、本明細書中の表２に要約する。表２において反映されるように、
【００５９】
【表２】
平均得点のベースラインからの変化は、３つのＩＣ投与量群の各々について２ヶ月および６ヶ月に増加し、そして６ヶ月にはすべての投与量群（ＩＣおよびＩＶ）について増加した。すべての投与量レベルにおける全得点は、２ヶ月から６ヶ月の日を追うごとに増加し、投与後６ヶ月においてベースラインと比較して最も良い増加（２３．２、２４．１、２２．９および１６．５）が見られた。
【００６０】
評価されるべき第２のＳＡＱスケールは、「アンギナ安定性」であった。アンギナ安定性を要約するデータを、本明細書中の表３に示す。
【００６１】
【表３】
表３によると、アンギナ安定性についての得点の変化は、各群について２ヶ月および６ヶ月の両方でベースラインと比較して増加した。投与後２ヶ月において見られるアンギナ安定性の改善（４６．２、３２．１、３４．３、および３９．６）は、６ヶ月において見られる得点よりも有意に大きかった（２１．４、１６．７、１７．７、および２３．２）。しかし、投与後、２ヶ月および６ヶ月の両方で見られる得点は、アンギナ安定性の増加においてすべての投与量が有効（＞１４）であることが判明したことを示した。さらに、増加の大きさおよび６ヶ月間の持続は、予想外であった。
【００６２】
評価されるべき第３のＳＡＱスケールは、「アンギナ頻度」であった。アンギナの頻度を要約するデータを、本明細書中の表４に示す。
【００６３】
【表４】
表４によると、アンギナ頻度についての患者の平均得点（２７．９、３２．９、２８．９および２０．０）は、２ヶ月で、すべての投与量群について、そしてすべての投与方法（ＩＣまたはＩＶ）について有効量（＞１４）で増加した（ベースラインと比較して）。患者の平均得点は、中程度の用量（６．０〜１２．０μｇ／ｋｇ）群についてのみ６ヶ月で増加し続け、投与後２ヶ月のピーク効果を示唆する。しかし、中程度の用量（６．０〜１２．０μｇ／ｋｇ）群および大量の用量（２４．０〜４８．０μｇ／ｋｇ）群について、２ヶ月および６ヶ月の変化は類似しており、アンギナ頻度の６ヶ月における持続効果を示唆する。
【００６４】
評価されるべき第４のＳＡＱスケールは、「処置満足感」であった。処置満足を要約するデータを、本明細書中の表５に示す。
【００６５】
【表５】
表５によると、処置の満足についての得点は２ヶ月で、中程度および大量の用量のＩＣ群ならびにＩＶ群について有効量で増加した。投与後２ヶ月において、中程度の用量群ＩＣについての得点だけが１４よりも大きな得点を有し、２ヶ月の処置の満足についてのピーク効果を示唆する。
【００６６】
評価されるべき第５のＳＡＱスケールは、「疾患認知」であった。疾患認知を要約するデータを、本明細書中の表６に示す。表６によると、疾患認知についての得点は、２ヶ月でベースラインから２０．２〜２９．２という得点まで増加し、６ヶ月で２３．８〜３４．０まで増加した。これらの得点は、単回単位用量組成物を本発明の方法にしたがって投与することは、２ヶ月おいてと同じくらい６ヶ月において有効である（またはより有効）と考えられた。これらの得点は、単回単位用量組成物の投与後、６ヶ月以上までの、疾患認知に対する本発明の方法の効果の持続性を示唆する。
【００６７】
【表６】
本明細書中の実施例１〜３に記載されるフェーズＩ臨床試験のヒト患者の６０人まではまた、彼らの心臓を安静時（ｒｅｓｔｉｎｇ）磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャンを使用して評価された。安静時ＭＲＩスキャンが、患者に対して、ベースライン時に、ならびに本発明の単回単位用量組成物の投与後１ヶ月、２ヶ月、および６ヶ月に実施された。用量は、統計学的有意性（ｐ＜０．０５）に基づいて「有効」と考えられた。安静時ＭＲＩスキャンにより評価される客観的な基準は以下：（１）駆出率；（２）心筋梗塞の程度（％）；（３）通常の壁厚；（４）通常の壁運動（％）；（５）標的壁肥厚（％）；（６）標的壁の運動（％）；（７）標的壁領域側副程度（％）；および（８）標的領域の遅着の程度（％）である。
【００６８】
安静時ＭＲＩに基づくと、「駆出率」の変化は、すべての群について１ヶ月では観察されなかった。１ヶ月におけるすべての群（ｎ＝３３）についてのベースラインからの平均変化は、２．０％（ｐ＝０．０４２）の増加であった。２ヶ月においては、少用量のＩＣ群（ｎ＝１３）についてのベースラインからの平均変化は、８．１％（ｐ＝０．００７）の増加であった；そしてすべての群について（ｎ＝５４）、ベースラインからの平均変化は、３．８％の増加であった（ｐ＝０．００１）。６ヶ月において、大用量のＩＣ群（ｎ＝１９）についてのベースラインからの平均変化は、５．３％（ｐ＝０．０２３）であった；そしてＩＶ群（ｎ＝３）について、１１．１％（ｐ＝０．０８７）であった；そしてすべての群（ｎ＝３３）について、５．７％（ｐ＝０．００１）であった。
【００６９】
安静時ＭＲＩに基づくと、いずれの群、または投与後の１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月での組合せにおけるすべての群について「心筋梗塞の程度」％の統計学的に有意な変化は、存在しなかった。通常の壁運動（％）および通常の壁厚が評価された場合、いづれの一つの群についての１ヶ月、２ヶ月、または６ヶ月でのベースラインからの統計学的に有意な変化は、存在しなかった。しかし、標的壁運動において、１ヶ月（ｎ＝６０）、２ヶ月（ｎ＝５４）、または２ヶ月（ｎ＝３３）でのすべての群について、ベースラインからの統計学的に有意な変化は存在し、これはそれぞれ、２．７％（ｐ＝０．０１５）、４．４％（ｐ＝＜０．００１）および６．４％（ｐ＜０．００１）のベースラインからの平均増加として反映された。しかし、標的壁厚においてもまた、１ヶ月（ｎ＝６０）、２ヶ月（ｎ＝５４）、および２ヶ月（ｎ＝３３）でのすべての群について、ベースラインからの統計学的に有意な変化が存在し、これはそれぞれ、４．４％（ｐ＝０．０１５）、６．３％（ｐ＝
＜０．００１）および７．７％（ｐ＜０．００１）のベースラインからの平均増加として反映された。
【００７０】
ＭＲＩにより評価された次の基準は、「標的領域側副の程度」（％）であった。標的領域側副の程度におけるすべての群についてベースラインからの平均増加は、１ヶ月（ｎ＝３１）、２ヶ月（ｎ＝２７）および２ヶ月（ｎ＝１６）において高度な統計学有意があり、ここでその増加はそれぞれ８．３％（ｐ＝＜０．００１）、１０．９％（ｐ＝＜０．００１）および１１．２％（ｐ＝＜０．００１）であった。最も大きな側副の程度の増加は、少量および中程度のＩＣ用量に対して観察され、すなわち、１ヶ月で（それぞれ１０．４％および１８．３％）、２ヶ月で（それぞれ１４．７％および１８．０％）および２ヶ月で（それぞれ１６．０％および中程度の用量に対する値はなし）であり、これは全く予想外であった。投与後１ヶ月、２ヶ月および２ヶ月において、ＩＣ大用量群について観察された標的領域側副の程度における対応する割合の増加は、それぞれ６．３％、８．０％および９．０％であった。ＭＲＩにより評価された最後の基準は、「標的領域の遅着の程度」（％）であった。標的領域の遅着の程度におけるすべての群についてベースラインからの平均減少は、１ヶ月（ｎ＝６０）、２ヶ月（ｎ＝５４）および６ヶ月（ｎ＝３４）において高度に統計学的有意性であり、ここでその減少は、それぞ−５．８％（ｐ＝＜０．００１）、−８．３％（ｐ＝＜０．００１）および−１０．０％（ｐ＝＜０．００１）であった。最も大きな標的領域の遅延程度の減少は、少用量のＩＣ群に対して観察され、これは高度に予想外であった。
【００７１】
従って、本発明に従ってＣＡＤ患者にｒＦＧＦ−２の単一ＩＣまたはＩＶ注入を提供することは、その患者に、ＭＲＩおよび他の従来の基準により客観的に測定されるような統計学的に有意な身体的改善を提供した。
【００７２】
（薬物動態および代謝）
ＦＧＦ−２の分子構造は、細胞表面および血管の内壁でプロテオグリカン鎖（ヘパリンおよびヘパリン様構造）に結合することが公知である正に荷電したテールを含む。Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉら、「Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ ａｎｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ」Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６３８：１７７〜１８１（１９８１）を参照のこと。
【００７３】
腎臓および肝臓は、ｒＦＧＦ−２の排泄のための主な器官である。特に、腎臓は、約６０ｋＤのタンパク質カットオフを有し、従って血清アルブミン（ＭＷ６０ｋＤ）を保持する。しかし、ＦＧＦ−２（１４６残基）は、約１６．５ｋＤの分子量を有する。従って、腎排泄が予期される。市販のウシＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ−２）の放射線標識した生体分布研究において、肝臓および腎臓の両方が、ＩＶ注射またはＩＣ注射後１時間で高い計数の放射線標識したｂＦＧＦ−２を含むことが示された。公表された研究において、ｂＦＧＦ−２の別の組換えヨウ素化形態がラットに与えられる場合、肝臓が排泄の主な器官であると同定された。Ｗｈａｌｅｎら、「Ｔｈｅ Ｆａｔｅ ｏｆ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓｌｙ Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｂＦＧＦ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｈｅｐａｒｉｎ」Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、１：１５７〜１６４（１９８９）。ＦＧＦ−２が、全身循環においてα２−マクログロブリンに結合すること、そしてこの複合体がクッパー細胞上のレセプターにより内部移行されることもまた公知である。Ｗｈａｌｅｎら（１９８９）およびＬａＭａｒｒｅら「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ａｌｐｈａ−２−Ｍａｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，６５：３〜１４（１９９１）。標識されたＦＧＦ−２フラグメントは、血漿中で見出されないが、それらは、尿中で見出され、そして細胞内分解産物に対するサイズに対応してい
た。
【００７４】
前臨床試験において、本発明者らは、家畜のヨークシャーブタへの静脈内（ＩＶ）投与および冠内（ＩＣ）投与後、およびＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（「ＳＤ」）ラットにおけるＩＶ投与後のｒＦＧＦ−２（配列番号２）の薬物動態を決定した。このブタモデルは、ＩＣおよびＩＶの線形の薬物動態を示した（０．６５μｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇ）。このブタモデルにおけるＦＧＦ−２の終末半減期は、３〜４時間であった。ラットモデルは、３０〜３００μｇ／ｋｇ ＩＶの範囲にわたる線形の薬物動態を示した。ラットモデルにおけるＦＧＦ−２の終末半減期は、１時間であった。両方の種が、２コンパートメントモデルを示唆する血漿濃度を示した。
【００７５】
同様に、ヒトにおいて、ＩＶおよび／またはＩＣ注入後のＦＧＦ−２血漿濃度は、最初の急激な曲線および最初の１時間の数対数スケールにわたるかなりの低下（分布相））を有する二次指数関数的な曲線を伴い、続いて、より穏やかな減少を伴った（排泄相）。図１Ａは、血漿濃度対時間の曲線を提供する。これは、以下の８つの用量のそれぞれの関数として、配列番号２のｒＦＧＦ−２のＩＣ投与後のヒトにおけるこれらの相を示す：除脂肪体重（ＬＢＭ）の０．３３μｇ／ｋｇ、０．６５μｇ／ｋｇ、２μｇ／ｋｇ、６μｇ／ｋｇ、１２μｇ／ｋｇ、２４μｇ／ｋｇ、３６μｇ／ｋｇおよび４８μｇ／ｋｇ。図１Ａは、２０分間にわたるＩＣ注入により投与されるｒＦＧＦ−２の８つの用量についての血漿用量直線性を示す。図１Ａはまた、二相性の血漿レベル低下（すなわち、最初の１時間の速い分布相、その後の排泄相（５〜７時間のＴ１／２と評価））を示す。配列番号２のＦＧＦ−２の血漿濃度を、ヒトＦＧＦ−２の分析のために販売された市販のＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ ＭＮ）により決定した。このＥＬＩＳＡアッセイは、配列番号２のｒＦＧＦ−２と１００％の交差反応性を示した。ＦＧＦファミリーの他のメンバーおよび多くの他のサイトカインは、このアッセイでは検出されなかった。さらに、ヘパリンはこのアッセイを妨害しない。
【００７６】
図１Ｂは、ＩＣ投与した３６μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２と比較した、ＩＶ投与の１８μｇ／ｋｇおよび３６μｇ／ｋｇのｒＦＧＦ−２についての時間の関数としての平均ＦＧＦ−２血漿濃度のプロットである。ＩＶ経路およびＩＣ経路による３６μｇ／ｋｇ用量について、図１Ｂにおける血漿濃度対時間のプロフィールは、非常に印象的である。しかし、ＩＣ経路で初回通過効果は、排除されない。
【００７７】
図２は、図１Ａおよび図１Ｂに対応するｐｇ＊分／ｍｌでの平均ＦＧＦ−２曲線下面積（ＡＵＣ）のプロットである。図２は、ＩＣまたはＩＶ注入後の全身性ｒＦＧＦ−２曝露（ＡＵＣ）の用量直線性を示す。特に、図２は、ＩＣ経路およびＩＶ経路での投与後のｒＦＧＦ−２に対する全身性曝露が、実質的に類似であることを示す。
【００７８】
図３は、「ｒＦＧＦ−２注入の直前」でのヘパリン投与の時間の関数としての個々のヒト患者血漿クリアランス（ＣＬ）値（ｍｌ／分／ｋｇ）のプロットである。図３は、ＦＧＦ−２血漿クリアランス（ＣＬ）へのヘパリン投与のタイミングの影響を示す。図３は、ｒＦＧＦ−２前１００分までのヘパリン投与がＦＧＦ−２クリアランスを減少することを示すが、ヘパリン投与のための好ましい時間は、ｒＦＧＦ−２投与前０〜３０分である。ここでＦＧＦ−２クリアランス減少へのヘパリンの効果は最大である。
【００７９】
図４は、「ｒＦＧＦ−２注入前の分単位で」のヘパリン投与の時間の関数としての個々のヒト患者のｒＦＧＦ−２用量の正規化曲線下面積（ＡＵＣ）のプロットであり、そしてｒＦＧＦ−２ ＡＵＣへのヘパリン投与のタイミングの影響を示す。図４は、最大のＡＵＣ／用量が、有効量のグリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）がＩＣ ｒＦＧＦ−２注入の３０分以内に、より好ましくはＩＣまたはＩＶ ｒＦＧＦ−２注入の２０分以内に
、前投与された場合に、達成されることを示す。代表的には、有効量のグリコサミノグリカンは、１０〜８０Ｕ／ｋｇのヘパリンである。
【００８０】
投与の投与量および様式の関数としてのヒトにおけるｒＦＧＦ−２についての平均薬物動態パラメーターは、本明細書中の表７に要約される。表７についていえば、ヒトにおけるＦＧＦ−２のＴ１／２は、低用量（０．３３〜２．０μｇ／ｋｇ）ＩＣでの２．２±３．７時間から１８〜３６μｇ／ｋｇ ＩＶの用量での７．０±３．５時間までの範囲に決定される；アッセイの限界を考慮して、終末半減期は、全ての群について５〜７時間と推定される。ＦＧＦ−２のクリアランスは、７０ｋｇ男性について１３．２〜１８．２Ｌ／時間にわたる範囲である。結局、定常状態容積（Ｖｓｓ）は、７０ｋｇの男性あたり１１．３±１０．４Ｌ〜１６．８±１０．７Ｌの範囲と決定された。
【００８１】
【表７】
ヘパリン様構造へのＦＧＦ−２の結合は強力である（解離定数約２×１０−９Ｍ）が、特定のチロシンキナーゼレセプターへのＦＧＦ−２の結合は、およそ２桁大きい（解離定数約２×１０−１１Ｍ）。Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｉら（１９９１）。従って、どのような理論にも束縛されることなく、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン）とのｒＦＧＦ−２の複合体化は、シグナル伝達および有糸分裂誘発を増加し得、そして／または酵素的分解からｒＦＧＦ−２を防御する。
【００８２】
本明細書中に開示されるようなＦＧＦ−２の投与についての本発明のさらなる局面としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＥＴＴトレッドミル分析によって測定されるような運動能力の改善；ＳＡＱの労作性能力ドメインによって測定されるような運動能力の改善；アンギナの頻度の減少；およびＭＲＩによって測定されるような灌流の増加。特に、運動能力は、鬱血性心不全を有する患者において有意に改善された。
【００８３】
以下の実施例は、例示のために提供され、限定のために提供されるのではない。
【実施例】
【００８４】
（実施例１）
（第Ｉ相臨床試験において使用される単位用量のｒＦＧＦ−２）
配列番号２のｒＦＧＦ−２を、単位用量として、かつ薬学的組成物として処方し、そしてラット、ブタおよび最終的には、本明細書に言及される第Ｉ相臨床試験でヒトに投与した。種々の処方物を以下に記載する。
【００８５】
ｒＦＧＦ−２単位用量を、積層した灰色のブチルゴムの栓および赤色のフリップオフ（ｆｌｉｐ−ｏｆｆ）オーバーシールを備える３ｃｃのＩ型ガラスバイアル中の液体として
提供した。ｒＦＧＦ−２の単位用量は、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭモノチオグリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物（分子量３７２．２）、１３５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ５．０）中に、１．２ｍｌの０．３ｍｇ／ｍｌの配列番号２のｒＦＧＦ−２を含んでいた。従って、絶対的な用語では、それぞれのバイアル（および単位用量）は、０．３６ｍｇのｒＦＧＦ−２を含んでいた。液体形態で単位用量を含有するバイアルを２℃〜８℃で保存した。
【００８６】
ｒＦＧＦ希釈剤を、積層した灰色のブチルゴム栓および赤色のフリップオフオーバーシールを備える５ｃｃＩ型バイアル中に供給した。ｒＦＧＦ−２希釈剤は、１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭモノチオグリセロール、１３５ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ５．０）を含む。各バイアルは、５．２ｍｌのｒＦＧＦ−２希釈溶液を含み、これを２℃〜８℃で保存した。
【００８７】
注入されたｒＦＧＦ−２薬学的組成物を、注入容量が１０〜４０ｍｌになるように、ｒＦＧＦ−２単位用量をｒＦＧＦ希釈剤で希釈することによって調製した。ＥＤＴＡ濃度を１００μｇ／ｍｌのプリセット限界未満に維持するために、この全注入容量を、より高い体重を有する患者に対して、比例的より高い絶対量のＦＧＦ−２が投与される場合には、最大４０ｍｌに増加させた。
【００８８】
（実施例２）
（ｒＦＧＦ−２での処置についての、冠状動脈疾患を有する患者についての選択基準）
以下の選択基準を、冠状動脈疾患を有する第Ｉ相患者へ適用した。これらの患者の活動は、最適な医学的管理にもかかわらず冠状虚血によって制限され、そしてこれらの患者は、承認された脈管再生治療についての候補でなかった。
【００８９】
（包含基準：）被験体は、以下である場合に適格である：
・１８歳以上の男性または女性
・冠状動脈疾患（ＣＡＤ）の診断
・承認された脈管再生治療手順（例えば、血管形成術、ステント、冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ））についての準最適な候補（またはこれらの介入を拒否する）
・改変されたＢｒｕｃｅプロトコルを使用して少なくとも３分間運動することが可能であり、そして冠状虚血によって制限される
・薬理学的に圧迫されたタリウムセスタミビ（ｓｅｓｔａｍｉｂｉ）スキャンに対する、少なくとも２０％の心筋の誘導性かつ可逆性の欠陥
・必要な心臓カテーテル法について臨床的に受容可能である範囲内のＣＢＣ、血小板、血清化学
・正常ＩＮＲ、またはＣｏｕｍａｄｉｎで抗凝固である場合、ＩＮＲ＜２．０
・全ての必要な研究手順および追跡訪問を含むこの研究に参加するための、意志および書面でのインフォームドコンセントを提供し得る。
【００９０】
（除外基準：）被験体は、以下である場合に適格でない：
・悪性腫瘍：治癒的に処置された基底細胞癌を除く過去十年内の悪性腫瘍の何らかの病歴、
・眼の状態：増殖性網膜症、重篤な非増殖性網膜症、網膜静脈閉塞、イールズ病、または斑状浮腫、あるいは眼科医による検眼鏡検査法：２ヶ月以内の眼内手術の病歴
・腎臓機能：年齢について調整される正常範囲未満のクレアチニンクリアランス；タンパク質＞２５０ｍｇまたはミクロアルブミン＞３０ｍｇ／２４時間 尿
・ＩＶクラス心不全（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）
・心エコー図、タリウムスキャン、ＭＲＩまたはゲートされプールされた血液スキャン（ｇａｔｅｄ ｐｏｏｌｅｄ ｂｌｏｏｄ ｓｃａｎ）（ＭＵＧＡ）により駆出率＜２０
％
・血流力学的関連不整脈（例えば、心室細動、持続性心室性頻脈）
・重篤な弁狭窄（大動脈領域＜１．０ｃｍ２、僧帽弁領域＜１．２ｃｍ２）、または重篤な弁不全
・３週間以内のアンギナまたは不安定アンギナの顕著な増加
・３ヶ月以内の心筋梗塞（ＭＩ）の病歴
・２ヶ月以内の一過性虚血発作（ＴＩＡ）または発作（ｓｔｒｏｋｅ）の病歴
・２ヶ月以内のＣＡＢＧ、血管形成術またはステントの病歴
・２ヶ月以内の経心筋レーザー脈管再生、ｒＦＧＦ−２、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）での処置の病歴
・妊娠の可能性または保育中の母の女性
・任意の病理学的線維症、例えば、肺の線維症、強皮症
・既知の脈管奇形、例えば、ＡＶ奇形、血管腫
・ＣＡＤの症状の評価を干渉し得る任意の疾患、例えば、心膜炎、肋軟骨炎、食道炎、全身性脈管炎、鎌状赤血球症の同時存在
・改変Ｂｒｕｃｅプロトコル運動ストレス試験の実行を制限する任意の疾患、例えば、下肢の麻痺または切断、下肢の重篤な関節炎、重篤な慢性閉塞性肺性疾患（ＣＯＰＤ）の同時存在
・３０日以内（または、研究薬物の６０日以内に計画される）の、調査薬剤、デバイスまたは手順の臨床試験への参加
・ｒＦＧＦ−２または関連化合物に対する既知の過敏症
・調査員の意見において、本研究における参加について不適切な被験体を生じる任意の条件、例えば、精神病、重篤な精神遅滞、研究員とコミュニケーションが取れないこと、薬物またはアルコール乱用。
【００９１】
（実施例３）
（ヒトへ投与される組換えＦＧＦ−２（配列番号２）についての第Ｉ相臨床試験）
本実施例の第Ｉ相ＣＡＤ試験は、安全性、耐容性および薬物動態についての、組換え線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ−２）の、オープンラベル（ｏｐｅｎ ｌａｂｅｌ）の段階的用量研究である。この研究を以下の２つの場所で実施した：Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡのＢｅｔｈ Ｉｓｒａｅｌ Ｄｅａｃｏｎｅｓｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｈａｒｖａｒｄ）およびＡｔｌａｎｔａ、ＧＡのＥｍｏｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ。記録は完全である。被験体を、１日目にｒＦＧＦ−２の単回注入で処置し、３６０日間続けた；追跡は、幾人かの被験体においてはなお不完全である。
【００９２】
被験体集団は、冠状動脈虚血によって運動制限され、そして確立された血管再生手順（例えば、ＣＡＢＧ、血管形成術（ステントを用いるかまたは用いない））の１つについての準最適候補とみなされた（またはこの手順を受けたがらない）、進行したＣＡＤを有する患者からなる。主な除外基準は、悪性腫瘍、非代償性心不全もしくは２０％未満の左心室駆出率、腎不全もしくは蛋白尿、および種々の眼の状態（例えば、増殖性糖尿病性網膜症、重篤な非増殖性網膜症）の病歴または疑いであった。
【００９３】
６６人の被験体に、この試験において配列番号２のｒＦＧＦ−２を受けさせた：５２人にｒＦＧＦ−２をＩＣ注入として受けさせ、そして１４人にｒＦＧＦ−２をＩＶ注入として受けさせた。各被験体を、病院内で少なくとも２４時間観察し、次いで、追跡訪問で３６０日の間（１５、２９、５７、１８０および３６０日）、外来患者として追跡した。少なくとも４人の被験体を各用量で研究した；被験体が２日以内にプロトコールにより規定されたような用量制限毒性を経験しなかった場合、用量を増大した。薬物を、冠状動脈血液供給（ＩＣ）の２つの主要な供給源間に分割された単回の２０分間の注入として、（血管形成術で既に使用されているような）患者の冠状動脈中、または末梢静脈（ＩＶ）内に
カテーテルを配置するための標準的な技法を用いて投与した。ＩＣ投与したｒＦＧＦ−２の用量（μｇ／ｋｇ）（および患者の数）は、配列番号２のｒＦＧＦ−２の０．３３（ｎ＝４）、０．６５（ｎ＝４），２．０（ｎ＝８）、６．０（ｎ＝４）、１２．０（ｎ＝４）、２４（ｎ＝８）、３６（ｎ＝１０）および４８（ｎ＝１０）であった。ＩＶ投与したｒＦＧＦ−２の用量（μｇ／ｋｇ）（および患者の数）は、配列番号２のｒＦＧＦ−２の１８．０（ｎ＝４）および３６．０（ｎ＝１０）であった。
【００９４】
アンギナ頻度および生活の質は、ベースライン（ｒＦＧＦ−２投与前）、ならびにｒＦＧＦ−２投与の２ヶ月後および６ヶ月後にＳｅａｔｔｌｅ Ａｎｇｉｎａ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＳＡＱ）により評価した。運動許容時間（ＥＴＴ）は、１ヶ月目、２ヶ月目、および６ヶ月目にトレッドミル試験により評価した。休止／運動核灌流およびゲート化セスタミビ−決定安静（ｇａｔｅｄ ｓｅｓｔａｍｉｂｉ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｒｅｓｔ）駆出率（ＥＦ）、ならびに休止磁気共鳴造影（ＭＲＩ）を、ベースライン、ならびにｒＦＧＦ−２投与の１ヶ月後、２ヶ月後および６ヶ月後に評価した。心臓機能および灌流における変化を％で客観的に測定すると考えられたＭＲＩ測定は；（１）駆出率；（２）心筋梗塞程度（％）；（３）正常壁肥厚；（４）正常運動（％）；（５）標的壁肥厚（％）；（６）標的壁運動（％）；（７）標的壁領域側副程度（％）；および（８）標的領域遅延到達程度（％）を含めた。
【００９５】
４人の被験体のうち１人が、（プロトコールにより規定されるような）用量制限毒性を経験した場合、その用量で４人のさらなる被験体を調査し；誰もが毒性を経験しなかった場合、用量を増大させ、そして別の群を研究した。最大許容用量（ＭＴＤ）は、９／１０の被験体が許容したＩＣ用量、すなわち３６μｇ／ｋｇ ＩＣとして規定した。
【００９６】
注入前の注意深い流体管理を、Ｓｗａｎ−Ｇａｎｚカテーテルを用いて処方し、そして生命徴候を、投薬の間に頻繁にモニタリングした。ヘパリンを、すべての群においてｒＦＧＦ−２の注入の前にＩＶ投与した。ＥＤＴＡ濃度は、単位用量組成物中で１００μｇ／ｍｌより少なかった。投与した研究薬物の容量は、用量および被験体の体重で変化し、そして低用量で１０ｍｌから高用量で４０ｍｌの範囲であった。
【００９７】
（予備的結果）
本明細書に提示した結果は未検査であり、そして６６人の被験体（すべての群（１〜１０）について２ヶ月の追跡を伴う）についての第３回目の中間分析、およびＣｈｉｒｏｎ
Ｄｒｕｇ Ｓａｆｅｔｙからの１９９９年７月２９日の重症の有害事象（ＳＡＥ）レポートに基づく。最後の来院（３６０日目）のデータ収集および最終解析は進行中である。
【００９８】
０．３３μｇ／ｋｇ ＩＣの開始用量を、８つの系列の群にわたって４８μｇ／ｋｇ ＩＣまで増大させ、この用量で、１０人の被験体のうち２人が、プロトコールにより規定されたような用量制限毒性（低血圧症）を経験した。低血圧症は、すべての被験体において流体単独で管理可能であった（昇圧剤も補助デバイスもなし）。３６μｇ／ｋｇ ＩＣで、１０人の被験体のうち１人のみが、用量制限毒性を有し、このことは、この用量を最大許容用量（ＭＴＤ）として規定した。２つのさらなる群をＩＶ注入により試験した；４人の被験体はＭＴＤの半分（１８μｇ／ｋｇ）、そして１０人の被験体はＭＴＤ（３６μｇ／ｋｇ）。
【００９９】
低血圧症は、Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅブタにおける動物モデルにより予想されたように、ヒトにおける用量制限であった。しかし、３６．０μｇ／ｋｇ ｒＦＧＦ−２ ＩＣはヒトでは耐性であった；その一方ブタでは２０．０μｇ／ｋｇ ｒＦＧＦ−２ ＩＣは２匹の動物のうち１匹で意味深い低血圧症を引き起こした。ヒトにおけるより良好な耐容性は、積極的な流体管理および全身麻酔の不在に起因した。
【０１００】
１９９９年７月２９日付けで、３３の重篤な有害事象（ＳＡＥ）が２４／６６の被験体で生じたが、用量関連ではなかった。１５のＳＡＥは、少なくとも潜在的にはｒＦＧＦ−２に関連したと考えられた；調査者および医療管理者により指定された関連性の間に差異が存在したときは、より保守的な関係が指定された。ＳＡＥは５人の被験体で複数であった：０１１０３（０．３３μｇ／ｋｇ ＩＣ）、０１１０６（０．６５μｇ／ｋｇ ＩＣ）、０１１１３（２．０μｇ／ｋｇ ＩＣ）、０１１３７（３６．０μｇ／ｋｇ ＩＶ）、０２１０１（０．６５μｇ／ｋｇ ＩＣ）。
【０１０１】
１日目の最も頻繁な処置緊急有害事象（ＡＥ）は、一時的な収縮期低血圧症および一時的な徐脈であった。低血圧症は、用量依存性であり、そして２４μｇ／ｋｇ ＩＣ以上の用量でより頻繁に生じた；徐脈は用量依存性ではなかった。少なくとも関連する可能性があると思われ、そして用量に関連したようであった他の有害事象（ＡＥ）は、注入後最初の数日または１週間以内に生じ、そして胸の痛み、息切れ、不眠、不安、および悪心を含んだ。これらの事象は重篤度において軽度〜中程度であり、そしてほとんどは特定の介入を必要としなかった。
【０１０２】
ＩＣ投与されたとき、この薬物を、カテーテルを患者の冠状動脈中に配置するための（血管形成術ですでに使用されているような）標準的な技法を用い、冠状血液供給（ＩＣ）の２つの主要な供給源間に分割した単回注入として、約２０分間にわたって投与した。ＩＶ投与されるとき、この薬物は、末梢静脈中に２０分間にわたる注入として投与された。
【０１０３】
予備的な安全性結果は、重篤な事象は用量に関連しなかったことを示す。これまで、８つのＩＣ投薬群のうち低投薬群で３人が死亡し（すなわち、０．６５μｇ／ｋｇ（２３日）、２．０μｇ／ｋｇ（５７日）および６．０μｇ／ｋｇ（６３日））、そして最も高い用量群で１人が死亡（すなわち、４８．０μｇ／ｋｇ（投薬後約４ヶ月））した。死亡のうち３人は心臓；１人の死亡は、群４（６．０μｇ／ｋｇ）の患者で投薬の３週間後に診断された大Ｂ細胞リンパ腫に起因し、この患者は投薬の２ヶ月後に死亡した。
【０１０４】
急性心筋梗塞（ＭＩ）が４人の患者で生じた。すなわち、群１（０．３３μｇ／ｋｇ）、群３（２．０μｇ／ｋｇ）、群４（６．０μｇ／ｋｇ）および群７（３６．０μｇ／ｋｇ）の各々からの１人の患者である。複数のＭＩが２人の患者で生じた。すなわち、群１（０．３３μｇ／ｋｇ）から１人および群３（２．０μｇ／ｋｇ）から１人である。緊急血管再形成手順（ステントを用いるかまたは用いないＣＡＢＧまたは血管形成術）を、４人の患者で追跡の間に実施した：群１（０．３３μｇ／ｋｇ）、群３（２．０μｇ／ｋｇ）、群４（６．０μｇ／ｋｇ）および群７（３６．０μｇ／ｋｇ）の各々から１人である。
【０１０５】
注入の間または直後により高い用量で観察された急性低血圧症は、昇圧剤の必要なしに流体のＩＶ投与により管理された。ヒトにおける最大許容用量（ＭＴＤ）を、３６μｇ／ｋｇ ＩＣと規定した（対照的に、ブタでは、このＭＴＤは６．５μｇ／ｋｇ ＩＣであった）。４８μｇ／ｋｇ ＩＣまでのｒＦＧＦ−２の用量を、積極的な流体管理でヒト患者に投与したが、１０人の患者のうち２人の急性低血圧症および／または起立性低血圧症に起因して、プロトコールにより「許容されない」と規定した。注入したｒＦＧＦ−２の終末半減期は５〜７時間と推定された。
【０１０６】
本研究における配列番号２のｒＦＧＦ−２の単回ＩＣ注入または単回ＩＶ注入で処置されたヒト患者は、ＥＴＴにおいて１．５〜２分の平均増加を示した。表１を参照のこと。これは特に顕著である。なぜなら、ＥＴＴにおける３０秒より大きい増加は有意であり、そして血管形成術のような代替治療を評価するための基準と考えられているからである。
ＳＡＱにより測定されるような、アンギナ頻度および生活の質は、試験した６６人の患者（ｎ＝６６）に対する５つのサブスケールの全部において２ヶ月で有意な改善を示した。表２〜６を参照のこと。表２〜６中、１４より高い平均変化は、「臨床的に有意」と考えられた。３３人のヒトＣＡＤ患者を、ベースライン、ならびに本発明の単回単位用量組成物をＩＣまたはＩＶ経路により受けた１ヶ月後、２ヶ月後、および６ヶ月後、静止心臓磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により評価したとき、統計的に高度に有意な増加が、標的壁肥厚、標的壁運動および標的領域側副程度において観察され；統計的に高度に有意な減少が標的領域遅延到達程度において観察され；そして正常壁運動、正常壁肥厚または心筋梗塞程度において統計的に有意な変化は観察されなかった。
【０１０７】
上記の規準（すなわち、ＥＴＴ ＳＡＱ、ＭＲＩ）に加えて、血管形成効果が少なくとも２ヶ月継続する場合に、処置を、非常に成功したとみなす。現在の第Ｉ相研究では、予期せぬ優れた血管形成効果が、すべての投薬群において幾人かの患者で６ヶ月まで継続することが観察された。既に得られた結果に基づいて、この血管形成効果は、患者において、１２ヶ月以上続き得るが、少なくとも２ヶ月は続くことが予測され、必要であれば、その時点でこの手順が繰り返され得る。
【０１０８】
（実施例４）
（第ＩＩ相ヒト臨床試験についてのｒＦＧＦ−２の単位用量および薬学的組成物）
配列番号２のｒＦＧＦ−２を、本明細書で参照される第ＩＩ相臨床試験においてヒトへの投与のための単位用量の薬学的組成物として処方した。種々の処方物を以下に記載する。
【０１０９】
ｒＦＧＦ−２単位用量を、積層された灰色のブチルゴム栓および赤色のフリップオフオーバーシールを備えた５ｃｃのＩ型ガラスバイアル中の液体として調製した。このｒＦＧＦ−２処方物は、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭモノチオグリセロール、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物（分子量３７２．２）、１３５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０中に配列番号２のｒＦＧＦ−２の０．３ｍｇ／ｍｌを含む。各バイアルは、３．７ｍｌのｒＦＧＦ−２薬物産物溶液を含んだ（バイアルあたり１．１１ｍｇのｒＦＧＦ−２）。液体形態中の得られる単位用量を−６０℃未満で貯蔵する。上記に記載した単位用量を、「ｒＦＧＦ−２ プラセボ（ｐｌａｃｅｂｏ）」で希釈する。患者のサイズに依存して、いくつかのバイアルの内容物を組み合わせて、第ＩＩ相研究のための３６μｇ／ｋｇの単位用量を生成し得る。
【０１１０】
ｒＦＧＦ−２プラセボを、積層された灰色のブチルゴム栓および赤色のフリップオフオーバーシールを備えた５ｃｃのＩ型ガラスバイアル中の透明無色の液体として供給する。このｒＦＧＦ−２プラセボは、薬物製品と外見上識別不能であり、そして以下の処方を有する：１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭモノチオグリセロール、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物（分子量３７２．２）、１３５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ５．０。各バイアルは、５．２ｍｌのｒＦＧＦ−２プラセボ溶液を含む。単位用量とは異なり、このｒＦＧＦ−２プラセボを、２℃〜８℃で貯蔵する。
【０１１１】
注入されるｒＦＧＦ−２薬学的組成物を、ｒＦＧＦ−２単位用量を、ｒＦＧＦ希釈剤で、注入容量が第ＩＩ相用に２０ｍｌであるように希釈することにより調製する。
【０１１２】
（実施例５）
（冠状動脈疾患を処置するためにヒトに投与されるｒＦＧＦ−２（配列番号２）に対する第ＩＩ相臨床試験）
冠状動脈疾患についてヒト患者を処置するためのｒＦＧＦ−２の第ＩＩ相臨床試験を、４つのアーム：プラセボ、０．３μｇ／ｋｇ、３．０μｇ／ｋｇ、および３０．０μｇ／
ｋｇの１回ＩＣ投与、を用いる二重盲式／プラセボコントロール研究として実施した。
【０１１３】
（第一の目的）
ベースライン（スクリーニング期間の間）から９０日までの運動許容試験（ＥＴＴ）時間における変化によって測定されるような、運動能力に対するｒＦＧＦ−２ 対 プラセボの単回ＩＣ注入の効果を比較すること。
【０１１４】
（第二の目的）
・ＡＥおよび実験室パラメータにおける変化によって測定されるような、ｒＦＧＦ−２の安全性を評価すること。
【０１１５】
・第Ｉ相研究から、ｒＦＧＦ−２の薬物動態（ＰＫ）を確認すること。
【０１１６】
・以下に対するｒＦＧＦ−２の効果を評価すること：
ベースラインから１８０日までのＥＴＴ時間の変化、
生活の質（ＱｏＬ）におけるベースラインからの変化：Ｓｅａｔｔｌｅ Ａｎｇｉｎａ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ（ＳＡＱ）によって測定されるような認知されたアンギナ、ならびに９０日目および１８０日目でのＳｈｏｒｔ−Ｆｏｒｍ−３６（ＳＦ−３６）によって測定されるような、全身的な健康、
静止時でのベースラインからの、９０日目および１８０日目でのタリウム／ｓｅｓｔａｍｉｂｉ走査によるジピリダモールを用いた薬理学的ストレス時での虚血領域サイズにおける変化。
【０１１７】
・被験体のサブセットにおいて、ＥＦ、標的壁運動および壁厚、ならびに再灌流に対するｒＦＧＦ−２の影響を、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）走査によって評価すること。
【０１１８】
（調査計画）
（全体的な研究設計および計画）
この臨床試験を、ＣＡＤを有する３００人の被験体における、ｒＦＧＦ−２の２相、多施設、二重盲式、プラセボコントロール試験として設計した。全ての適格基準を満たした被験体を、プラセボを受ける群と、ｒＦＧＦ−２の３つの用量のうち１つを受ける群とにランダムに割り当てた（１アーム当たり約７５人の被験体）。用量は、実際の体重に基づいて、０μｇ／ｋｇ（プラセボ）、０．３μｇ／ｋｇ、３．０μｇ／ｋｇおよび３０．０μｇ／ｋｇであった。研究薬物は、心臓カテーテル法の間の、２０分間にわたる単回ＩＣ注入として投与された。被験体を、その場所での投与後、少なくとも６時間病院内でモニタリングし、次いで１８０日間にわたる特定の間隔で追跡した。長期の安全性を、さらなる６ヶ月間の電話による連絡およびアンケートを使用する、別個の延長プロトコールで評価した。
【０１１９】
（包含基準）
試験への参加のためには以下の包含基準を必要とした：
・１８歳以上の男性または女性。
・冠動脈造影による主冠状動脈の６０％を超える狭窄によって規定した場合の、ＣＡＤの診断。
・受け入れられている画像化技術（心室造影図（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌｏｇｒａｍ）、ＭＲＩ、シングルフォトンエミッションＣＴ［ＳＰＥＣＴ］）スキャンでの最初の通過、心エコー図［ＥＣＨＯ］またはマルチゲート［ＭＵＧＡ］核評価（ｍｕｌｔｉｇａｔｅｄ［ＭＵＧＡ］ｎｕｃｌｅａｒ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ））による、３０％以上の駆出率。
・アンギナまたはアンギナ等価物の症状。
・医師の管理の下で、ＣＡＤに関する非侵襲性治療へと移すこと。
・医師が評価した場合に、標準的な手術による血管再生手順またはカテーテルベースの血管再生手順の候補でないこと
・１２ヶ月以内に乳房撮影による悪性疾患の証拠がないこと（女性）。
・全ての女性に関して、スクリーニングの１年以内の子宮頸部スミアを用いた骨盤検査。・５０歳以上の全ての被験体に関して、５年以内のＳ状結腸鏡検査。
・４０歳以上の被験体に関して、糞便グアヤクを用いた毎年の直腸検査。
・ベースライントレッドミル運動試験で少なくとも３分間にわたって運動できるが、改変Ｂｒｕｃｅプロトコルを用いて１３分間より長く運動できない、そして虚血の徴候または症状によって制限される。被験体は、ある程度のアンギナもしくはアンギナ同等物の病訴を有したかまたはＥＴＴの経過の間に１ｍｍ以上のＳＴセグメント低下を有する。二重のベースライン試験を、少なくとも２４時間の間隔を置いて、しかし２週間を超える間隔を置かずに行い、そして２つの試験の間の相違は、２つの試験の平均の２０％以下であるべきである。
・ランダム化前３０日以内に、安静時／負荷時のタリウム／セスタミビ（ｓｅｓｔａｍｉｂｉ）スキャンでの、１つの主要心筋領域（前壁、下壁、側壁または中隔）の少なくとも半分の面積を含む、中程度以上のサイズの誘導性かつ可逆性の虚血性欠損、または複数の領域における複数の誘導性かつ可逆性の虚血性欠損（この合計は、安静時／負荷時のタリウム／セスタミビスキャンでの、１つの主要領域の少なくとも半分の面積の等価物を含む）。
・ランダム化前３０日以内に、心臓カテーテル法に関して臨床的に受容可能な範囲内の、全血球算定（ＣＢＣ）、血小板、血清化学、プロトロンビン時間および尿検査。
・ランダム化前３０日以内に、尿サンプルについてタンパク質が陰性または微量。
・ランダム化前３０日以内に、血清クレアチニンが２．０ｍｇ／ｄＬ以下。
・この全ての必要な研究手順および追跡訪問を含め、試験における参加への書面によるインフォームドコンセントに同意し、そしてこれを与え得る。
・ランダム化前３０日以内に、以下の年齢特異的範囲に適合する、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）（男性）：
【０１２０】
【表８】
・ランダム化前３０日以内に、胸部Ｘ線で悪性疾患の証拠がないこと。
・完全な病歴および身体検査（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙのガイドラインに従って行われる）によって評価した場合、ランダム化の３０日以内に、悪性疾患の証拠も疑いもないこと。
・調査責任者または現場の別の調査医師の意見による、被験体の心臓血管の解剖学的構造が、侵襲性手順を用いた処置に適切でないとのことの、心臓カテーテル法による、研究１日目での確認。
【０１２１】
（除外基準）
・悪性疾患：過去１０年以内の悪性疾患の病歴または疑い（治癒的に処置された、基底細胞癌、太陽に露出した領域の皮膚の扁平上皮癌、または頸部癌を除く）。
・腎臓の状態：
−２．０ｍｇ／ｄＬより高い血清クレアチニンによって規定した場合の、腎臓機能不全。
−ディップスティックで１＋以上のタンパク質によって規定した場合の、蛋白尿。
・眼の状態：
−増殖性網膜症、中程度または重篤な非増殖性網膜症。
−網膜の静脈の閉塞。
−脈絡膜の新生血管形成を伴う、加齢性黄斑障害。
−眼科医による検眼鏡検査での黄斑水腫。
−４ヶ月以内の眼内手術。
・心臓血管状態：
−重篤な大動脈狭窄、すなわち、１．０ｃｍ２より小さい面積。
−３週間以内の不安定アンギナ（Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，１９８４）。
−ＣＡＢＧ、血管形成術、一過性虚血性発作または４ヶ月以内の発作。
−３ヶ月以内の心筋梗塞。
−スクリーニングの１年以内の経心筋レーザー血管再生を用いた処置。
−外部カウンターパルセイションを用いた現行の処置。
−その被験体が明らかにプラセボを受けたことを実証し得ない限り、何らかの調査薬剤を用いた何らかの治療的血管新生試験における過去の関与。
−原発性肺高血圧または拘束型もしくは閉塞型心筋症の診断。
・一般的医療状態：
−妊娠または授乳中の母親。
−任意の病理的線維症（例えば、肺線維症、強皮症）。
−既知の血管奇形（例えば、動静脈奇形、３ｍｍを超える血管腫）。
−追跡訪問が完了していない他の調査薬剤、ＩＣデバイスまたは手順の臨床試験における関与。
−臓器移植歴。
−被験体を、調査者の意見において、この研究における関与に関して不適切にする、任意の組合せ状態（例えば、平均余命を１２ヶ月未満に制限する、同時の医療的疾病、精神病、重度の精神遅延、検査官とコミュニケーションできないこと、薬物濫用またはアルコール濫用）。
【０１２２】
（治療または評価からの被験体の除外）
被験体は、権利を害することなくいつでも、研究に参加する同意を取り下げ得る。さらに、調査者は、臨床判断に従うと、取り下げることが被験体の最良の目的である場合、または被験体がプロトコルに従えない場合、被験体を取り下げ得る。
【０１２３】
全ての包含必要条件および除外必要条件を満たし、そして１日目に試験薬物を受けた被験体が、その後研究から取り下げられた場合、１８０日間の終了訪問に関して列挙された試験および評価を、可能な限りいつでも実行した。
【０１２４】
被験体が、研究薬物投与を中止するに充分重篤であると調査者が考えるＡＥを１０分間を超えて発症した場合、投薬を中断し、そしてこの被験体にはさらなる研究薬物処置を受けさせなかった。この被験体は、調査者によって決定された医療処置を受け、ＡＥが消散するかまたは安定するまで観察されたままであり、そして１８０日目を越えるまで追跡された。
【０１２５】
（施された処置）
被験体を、プラセボまたは０．３、３．０もしくは３０．０μｇ／ｋｇ ｒＦＧＦ−２を受けるようにランダムに割り当てた。研究薬物を、検定された精密注入ポンプを用いて、２本の開存性冠状血管または移植片の間で分割された、２０分間にわたる２０ｍＬの注入として投与した。
【０１２６】
（調査製品の正体）
この研究において用いたｒＦＧＦ−２は、遺伝子操作された酵母において発現された、１４６アミノ酸の非グリコシル化モノマーの、１６．５ｋＤａタンパク質であった。ｒＦＧＦ−２薬物製品は、灰色の積層ブチルストッパおよび赤色のフリップオフオーバーシールを伴った５ｍＬのＩ型ガラスバイアル中の透明な無色の液体として供給された。ｒＦＧＦ−２処方物は、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭモノチオグリセロール、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ ２ナトリウム二水和物（分子量３７２．２）、１３５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ５．０）中に０．３ｍｇ／ｍＬ ｒＦＧＦ−２を含んでいた。各バイアルは、３．７ｍＬのｒＦＧＦ−２薬物製品溶液を含んでいた（１バイアルあたり１．１１ｍｇ ｒＦＧＦ−２）。ｒＦＧＦ−２薬物製品バイアルを、−６０℃以下で保存した。ｒＦＧＦ−２を、被験体の実際の体重に従ってプラセボで希釈した。
【０１２７】
プラセボは、灰色の積層ブチルストッパおよび赤色のフリップオフオーバーシールを伴った５ｍＬのＩ型ガラスバイアル中に透明な無色の液体として供給された。プラセボは、外観からは薬物製品と区別できなかった；プラセボは、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１０ｍＭモノチオグリセロール、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ ２ナトリウム二水和物（分子量３７２．２）、１３５ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ ５．０）を含んでいた。各バイアルは、５．２ｍＬのプラセボ溶液を含んでいた。このプラセボバイアルを、２℃〜８℃で保存した。
【０１２８】
（研究における用量の選択）
選択した用量は、前臨床データおよび早期臨床データによって、最良の効力の可能性が示唆された範囲の用量を一括した用量であった。最大用量（３０．０μｇ／ｋｇ）の安全性は、実施例３において報告された第一相試験の結果によって支持された。
【０１２９】
被験体は代表的に、カテーテルが適所にある持続時間に関連する血栓症の危険性を最小にするために試験薬物の注入の前に、１０分間と２０分間との間のヘパリンの１回のＩＶボーラスを受けた。
【０１３０】
（効力および安全性の変数）
（評価した効力および安全性の測定値、ならびにフローチャート）
効力の一次変数は、９０日目にＥＴＴ時間によって測定した場合の運動能力の変化であった。効力の二次変数は、以下を含んでいた：被験体のサブセットにおける、１８０日目でのＥＴＴ時間の変化；９０日目および１８０日目の、ＳＡＱのアンギナ頻度スコア（ＡＦＳ）、処置満足スコア（ＴＳＳ）、労作能力スコア（ＥＣＳ）および疾患認知スコア（ＤＰＳ）、ならびにＳＦ−３６の身体的要素および精神的構成要素によって測定した場合のＱｏＬの変化；９０日目および１８０日目でのタリウム／セスタミビスキャンによる安静時および薬理学的負荷時の虚血面積の変化；９０日目および１８０日目でのＭＲＩによる、ＥＦ、標的とされた壁の厚みおよび運動、ならびに灌流の変化。
【０１３１】
統計分析計画を実行した時点で追加した他の分析変数は、以下を含んでいた：アンギナの発症までの時間、１ｍｍのＳＴセグメント低下の発症までの時間、ならびに９０日目および１８０日目での、アンギナの発症時の速度−圧力の積、ピーク運動時の速度−圧力の積、および１ｍｍ ＳＴセグメントの低下時の速度−圧力の積におけるベースラインからの変化。Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＹＨＡ）の分類およびＣａｎａｄｉａｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｌａｓｓ（ＣＣＣ）における変化を分析した。ＥＴＴ時間における６０秒間以上の増加を伴う被験体（「応答者」）およびＥＴＴ時間における６０秒間未満の増加を伴う被験体（「非応答者」）の百分率を各群について分析した。
【０１３２】
カナダ人の心臓血管クラス（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、クラス０〜クラスＩＶの範囲にわたる分類スキームに基づく。以下に分類される：クラス０、患者は、アンギナもアンギナに等価な症状も経験していない；クラスＩ、仕事時またはレクリエーション時に激しいか、迅速であるかまたは長期の労作に伴ってのみ生じる、通常の身体活動症状を伴う；クラスＩＩ、患者は、アンギナに起因して、通常活動の軽い制限を経験する；クラスＩＩＩ、患者は、アンギナに起因して、著しい活動の制限を経験する；およびクラスＩＶ、患者は、安静時または任意の身体活動時にアンギナを発症する。
【０１３３】
ＳＡＱは、５つのスケールを有する、承認された、疾患特異的自己管理式質問表である：アンギナ安定性スケール（ＡＳＳ）、アンギナ頻度スケール（ＡＦＳ）、運動能力スケール（ＥＣＳ）、処置満足スケール（ＴＳＳ）、および疾患認知スケール（ＤＰＳ）（Ｓｐｅｒｔｕｓ ＪＡら）。ＡＳＳは、評価期間に該当しない４週間の間隔を言及しているので、ＡＳＳはこの試験の分析には含まれなかった。各要素は、１〜１００のスケールを含む；より低いスコアは、より悪い症状に関連する；８点以上の変化は、臨床的に適切であるとみなされる。ＳＦ−３６は、１０のスケールを有し、そして２つのまとめの成分スケール（肉体的構成要素のまとめのスケール（ＰＣＳＳ）および精神的構成要素のまとめのスケール（ＭＣＳＳ））を有する、承認された、一般的生活の質（ＱｏＬ）器具である。
【０１３４】
核画像化の結果を、承認された半定量的グレード付けシステムを用いて、２０セグメント左心室モデル（Ｂｅｒｍａｎ ＤＳら）において分析した。各セグメントの灌流を、５点のスケールでグレード付けした：０＝正常、１＝わずかに減少、２＝中程度に減少、３＝大幅に減少、および４＝存在しない。負荷時の、割り当てられた異常領域のグレードが、安静時画像で減少または正常化した場合（可逆性スコア：負荷時スコア−安静時スコア＞１）、セグメントを、可逆的欠損を有すると決定し、そして負荷時の、割り当てられた局所グレードが異常であり、そして安静時画像化で同じままである場合、固定された欠損を有すると決定した。固定された欠損を、グレード付けされたスコアの重篤度に基づいてサブグループに分けた（すなわち、軽度から中程度（１、２および３のスコア）ならびに重篤（４のスコア））。灌流の異常性および虚血の全般的程度を、２０セグメントからの個々のスコアを合計することによって評価し、そしてそれぞれ、平均負荷および平均可逆性として表現した。
【０１３５】
安全性を、ＡＥ、実験室データおよび身体検査の結果を評価することによってモニタリングした。データおよび安全性モニタリングボード（Ｄａｔａ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｂｏａｒｄ：ＤＳＭＢ）によって、ほぼ６週間毎にＳＡＥおよび実験室試験の結果を検討した。急性心臓事象は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｅｖｅｎｔｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＣＥＣ）によって判断された。中心の研究室は、血管造影図、ＥＣＧ、眼科評価および核スキャンの結果を検討した。
【０１３６】
（人口統計学的および他の被験体特性）
表８は、この試験に参加した被験体の人口統計学的特徴をまとめる。これらの特徴は、４つの処置群の間で類似していた（表８）。
【０１３７】
【表９】
（分析）
（運動耐容性試験）
図９は、９０日目のベースラインでのＥＴＴ時間、および効力の一次変数である、ベースラインから９０日目までのＥＴＴ時間における変化を示す。この効力の変数および全ての効力の変数の作表において、血管再生を経験してきた被験体および評価のない被験体を、他に特定しない限り、分析から除外した。運動時間の平均増加は、プラセボ群に関して４４．１秒間であり、低用量群において４８．５秒間であり、中用量群において６５．０秒間であり、そして高用量群において４９．１秒間であった。
【０１３８】
図９はまた、１８０日目でのＥＴＴ時間およびベースラインから１８０日目までの、ＥＴＴ時間における変化を示す。運動時間における平均増加は、プラセボ群において５４．８秒間であり、低用量群において７５．３秒間であり、中用量群において７６．３秒間であり、そして高用量群において５１．３秒間であった。ＥＴＴにおける改善傾向は、３または４のベースラインＣＣＳおよび／または４０以下のＳＡＱアンギナ頻度を有する被験体において１８０日目に観察された。
【０１３９】
（シアトルアンギナ質問表）
図１０は、ＳＡＱの分析を示す。８点以上の変化は、臨床的に有意とみなされ、そしてより高いＳＡＱスコアは、より良好な臨床状態と関連する。９０日目でのＡＦＳ変化スコアに関して、Ｐ値は試験全体に基づいて０．０３５であり、そして全てのＦＧＦに対するプラセボの試験に基づいて０．００７であった。ベースラインからの平均変化は、プラセボ群について８．１であり、低用量群について１６．０であり、中用量群について２０．８であり、そして高用量群について１６．７である（一対（ｐａｉｒｗｉｓｅ）Ｐ値＝それぞれ、０．０８０、０．００４、０．０５４）。１８０日目でのＡＦＳ変化スコアに関して、平均変化は、プラセボ群について１５．３であり、低用量群について１８．７であり、中用量群について２２．６であり、そして高用量群について２０．２であった（一対Ｐ値＝それぞれ、０．４４、０．０８９、０．２５）。残りのＳＡＱスケール、労作耐容性、処置満足感および疾患認知を、図１１においてＦＧＦ処置群について示す。
【０１４０】
（簡易型３６）
図１２は、ＳＦ−３６肉体構成要素要約スケール（Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｕｍｍａｒｙ Ｓｃａｌｅ）（ＰＣＳＳ）および精神的構成要素要約スケール（Ｍｅｎｔａｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｕｍｍａｒｙ Ｓｃａｌｅ）（ＭＣＳＳ）についての分析を示す。９０日目でのＰＣＳＳに関して、全てのＦＧＦに対するプラセボの試験に基づくＰ値は、０．０３３であった。ベースラインからの平均変化は、プラセボ群において３．４であり、低用量群において６．０であり、中用量群において５．９であり、そして高用量群において５．９であった（一対Ｐ値＝それぞれ、０．０７２、０．０９１、０．０９５）。１８０日目でのＰＣＳＳに関して、ベースラインからの平均変化における差異は、プラセボ群とＦＧＦ群との間で２．２未満であった。処置効果は、ＳＦ−３６のＭＣＳＳ（精神的構成要素）において検出できなかった。
【０１４１】
（核画像化）
プラセボ群とＦＧＦ群との間で一貫した差異は検出できなかった。
【０１４２】
（亜群の検査）
（運動耐容性試験）
図１３（左パネル）は、３または４のベースラインＣＣＳを有する被験体についてのＥＴＴ時間を示す。３または４のベースラインＣＣＳを有する被験体についてベースラインから９０日目までの運動時間における平均変化は、プラセボ群について３６．１秒間であり、低用量群について４７．６秒間であり、中用量群について５７．１秒間であり、そして高用量群について４４．５秒間である（一対Ｐ値＝それぞれ、０．５９、０．３１、０．６９）。ベースラインから１８０日目までの運動時間における平均変化は、プラセボ群について３３．１秒間であり、低用量群について７０．７秒間であり、中用量群について７５．７秒間であり、そして高用量群について４１．５秒間である（一対Ｐ値＝それぞれ、０．１５、０．０８６、０．７４）。
【０１４３】
図１３（右のパネル）は、３または４のベースラインＣＣＳを有する被験体についてのＳＡＱスコアを示す。３または４のベースラインＣＣＳを有する被験体についてのベースラインから９０日目までのＡＦＳにおける平均変化は、プラセボ群について５．７であり、低用量群について１７．０であり、中用量群について１９．５であり、そして高用量群について２０．５であった（一対Ｐ値＝それぞれ、０．０５８、０．０１５、０．０１０）。１８０日目に、ＡＦＳにおける平均変化は、プラセボ群について１１．７であり、低用量群について１７．２であり、中用量群について２２．３であり、そして高用量群について２１．８であった（一対Ｐ値＝それぞれ、０．３４、０．０５９、０．０７６）。
【０１４４】
図１４（左パネル）は、シアトルアンギナ質問表（Ｓｅａｔｔｌｅ Ａｎｇｉｎａ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）（ＳＡＱ）を用いて測定した場合に４０以下のベースラインアンギナ頻度スコア（ＡＦＳ）を有する被験体についてのＥＴＴ時間を示す。４０以下（より低いスコアは、より高いアンギナ頻度を示す）のベースラインＡＦＳを有する被験体についてのベースラインから９０日目までの運動時間における平均変化は、プラセボ群について５０．３秒間であり、低用量群について８３．６秒間であり、中用量群について７２．１秒間であり、そして高用量群について４９．８秒間であった（一対Ｐ値＝それぞれ、０．１６、０．３２、０．９８）。ベースラインから１８０日目までの運動時間における平均変化は、プラセボ群について５６．５秒間であり、低用量群について９０．２秒間であり、中用量群について８４．６秒間であり、そして高用量群について５５．０秒間であった（一対Ｐ値＝それぞれ、０．２４、０．２９、０．９６）。これらのデータは、ベースライン時により高いアンギナ頻度を有し、かつプラセボを受けた被験体と比較して低用量または中用量のＦＧＦを受けた被験体についてのＥＴＴ時間における、より高い平均変化を示唆する。
【０１４５】
図１４（右のパネル）は、４０以下のベースラインＡＦＳを有する被験体についてのＡＦＳを示す。４０以下（より低いスコアは、より高いアンギナ頻度を示す）のベースラインＡＦＳを有する被験体についての、ベースラインから９０日目までのＡＦＳにおける平均変化は、プラセボ群について１２．２、低用量群について２７．７、中用量群について２９．７、そして高用量群について２２．０であった（一対Ｐ値＝それぞれ、０．０１７、０．００４、０．１０）。１８０日目に、ＡＦＳにおける平均変化は、プラセボ群について１６．３であり、低用量群について２７．４であり、中用量群について３０．７であり、そして高用量群について２４．６であった（一対Ｐ値＝それぞれ、０．０８９、０．０１９、０．１８）。ベースラインでより低いＡＦＳを有する被験体における、低用量群および中用量群とプラセボとの間のＡＦＳにおける差異の大きさは、臨床的に適切である
と考えられた。
【０１４６】
（機能分析）
（解剖学的構造）
９０日目で、３．０μｇ／ｋｇの投薬量群および３０μｇ／ｋｇの投薬量群での左心室拡張終期径（ＬＶＥＤＤ）において有意な低下があった（それぞれ、ｐ＝０．０３７および０．０３２）。０．３μｇ／ｋｇの投薬量群（ｐ＝０．１３）において、改善の傾向が見られた。コントロールにおいて、ＬＶＥＤＤは、僅かに増加した。これは、ＦＧＦ処置患者（３．０μｇ／ｋｇ用量群および３０μｇ／ｋｇ用量群）での虚血の軽減および機能の改善に一致する。９０日目で、０．３μｇ／ｋｇ用量の群（ｐ＝０．０４２）および３０μｇ／ｋｇ用量の群（ｐ＝０．０２４）での左心室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）において有意な低下が存在し、そして３．０μｇ／ｋｇ群において改善の傾向（ｐ＝０．１７）が存在した。これはまた、ＦＧＦ処置患者での虚血の軽減および機能の改善に一致する。コントロールは、（ＬＶＥＤＤにおける増加と一致する）ＬＶＥＳＤにおける増加を示した。この効果は、６ヶ月では確かではない。左心室（ＬＶ）の質量は、予想通り変化しなかった（なぜなら、血圧に影響はなかったので、ＬＶ質量に対する影響も予想されなかった）。
【０１４７】
（壁運動）
正常な壁運動は、期待範囲（３０〜４０％）内であり、そして変化しなかった。正常な壁厚は、期待範囲（４５〜５０％）内であり、そして変化しなかった。標的壁（すなわち、虚血心筋層の壁）の安静時の運動は、正常と同じであった。
【０１４８】
（心筋灌流）
遅延到着ゾーン（ｄｅｌａｙｅｄ ａｒｒｉｖａｌ ｚｏｎｅ）（ＤＡＺ）は、全ての群にわたりベースラインで同じであった（平均約１５％）。それは、運動誘導性の核灌流欠損（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｄｅｆｅｃｔ）（約１８％）のサイズと相関する。このＤＡＺのサイズは、全ての群において減少した。最高の減少は、３．０μｇ／ｋｇ群において存在した。
【０１４９】
（要旨および結論）
第ＩＩ相試験からのデータは、被験体が、低用量（０．３μｇ／ｋｇ）および中用量（３．０μｇ／ｋｇ）のＦＧＦ−２を用いて、最も改善することを示唆する、全体的パターンを示した。
【０１５０】
全体的に、より症候性の患者が、最高の改善を示した。例えば、ＣＣＳが３もしくは４のベースラインおよび／またはＳＡＱアンギナ頻度が４０以下の被験体は、ＥＴＴにおいて１８０日目で改善に向かう傾向を示した。
【０１５１】
被験体群全てついて、アンギナ頻度の減少（ｐ＝０．０３５）が、９０日目で見られた。ＣＣＳが３もしくは４のベースラインおよび／またはＳＡＱアンギナ頻度が４０以下のこの被験体は、９０日目と１８０日目との両方で最高の改善を示した。さらに、ＣＣＳが３または４のベースラインを有する被験体は、ＳＦ−３６の肉体構成要素において、９０日目と１８０日目との両方で改善を示した。
【０１５２】
さらに、ＭＲＩデータは、低下したＬＶＥＤＤとＬＶＥＳＤとによって証明されるように、ＦＧＦ群における改善したＬＶ機能の証拠を提供した。灌流分析は、ＦＧＦ群において改善に向かう傾向を示した。
【０１５３】
ＳＡＱの効力の二次変数について、８以上の変化は、臨床的に適切であるとみなされる
。統計学的に有意な差異は、アンギナ頻度スコア（ａｎｇｉｎａ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｓｃｏｒｅ）（ＡＦＳ）の全体的分析で見られた。臨床的に適切かつ統計学的に有意な差異は、ＡＦＳにおいて、プラセボ群と中用量の群との間で、９０日目で見られた。
【０１５４】
ＳＦ−３６の効力の二次変数について、プラセボ処置群とＦＧＦで処置した全ての群との間の有意な差異は、肉体構成要素要約スケール（ＰＣＳＳ）において、９０日目で見られた（０．０３３）。
【０１５５】
さらに、うっ血性心不全を有する患者のサブセットにおいて、任意の用量のＦＧＦを用いて改善が見られた。従って、ＦＧＦは、うっ血性心不全を有する患者において、より有益であり得る。第ＩＩ相研究において、プラセボを受けた患者は、それぞれ、６４．６および８１．３の変化を示した低域用量および中域用量を受けた患者と比較した場合、総運動時間について、ベースラインから２３．２秒の変化（最小二乗平均）を９０日目で示した。１８０日目で、プラセボは、総運動時間において、低域用量群および中域用量群についての７５．４秒および７２．８秒と比較した場合、２７．３秒の変化を示した。この結果は、９０日目での中投薬量群および低投薬量群における統計学的傾向を確立する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２０１０−５３１４５（Ｐ２０１０−５３１４５Ａ）
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２７７０９１（Ｐ２００９−２７７０９１）
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【分割の表示】特願２００２−５５９０５４（Ｐ２００２−５５９０５４）の分割
【原出願日】平成１４年１月２５日（２００２．１．２５）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月４日（２００９．１２．４）
【分割の表示】特願２００２−５５９０５４（Ｐ２００２−５５９０５４）の分割
【原出願日】平成１４年１月２５日（２００２．１．２５）
【出願人】（５９１０７６８１１）ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド (265)
【Ｆターム（参考）】
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