製薬学的活性化合物のｉｎｖｉｖｏでの迅速同定のための動物モデル
第一の態様において、本発明は、腫瘍細胞株がヒト以外の動物に移植若しくは注入される場合に腫瘍を形成することが可能であることを特徴とする、腫瘍退縮、腫瘍増殖の安定化若しくは転移性増殖の阻害と関連するタンパク質の発現もまた制御するプロモーターに機能しうるように連結されたレポーター遺伝子、好ましくは蛍光タンパク質を含有する発現ベクターで安定にトランスフェクトされた腫瘍細胞株を提供する。伝統的なｉｎ ｖｉｖｏモデルに比較して、本発明は、レポーター遺伝子が構成的に発現されないがしかし腫瘍退縮、腫瘍増殖の安定化若しくは転移性増殖の阻害と関連するタンパク質若しくは酵素の発現をもたらす試験化合物への曝露後にのみ発現されるために異なる。試験されるべき化合物が循環に入りかつ腫瘍に浸潤した場合にのみ、それはレポーターシグナルを発生させうるが、但し、それが腫瘍退縮と関連するタンパク質の発現を促進し、そして前記タンパク質のプロモーターはレポーター遺伝子に機能しうるように連結されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍性増殖、とりわけ癌性増殖のための動物モデルに関する。具体的には、該動物モデルは、製薬学的活性化合物のｉｎ ｖｉｖｏでの同定を可能にし、腫瘍退縮、腫瘍増殖の安定化若しくは転移の阻害と関連するタンパク質の発現もまた制御するプロモーターに機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含んでなる発現ベクターで安定にトランスフェクトされた腫瘍細胞の使用を含んでなる。
【背景技術】
【０００２】
長期の異種移植片研究を実施する必要を伴わずに、提案された新たな抗腫瘍薬の有効性を試験するための代表的な動物モデルに対する必要性が長い間存在している。潜在的な抗腫瘍薬が試験されている現在のｉｎ ｖｉｖｏモデルは、腫瘍細胞をヒト以外の動物に移植すること、該動物を提案された新たな抗腫瘍薬で処置すること、およびその後該動物をモニターして腫瘍の増殖に対する処置の効果を決定することを必要とする。宿主細胞の背景に対する腫瘍細胞の可視化を補助するために、多くのｉｎ ｖｉｖｏモデルは、生物発光分子のルシフェラーゼ族およびエクオリン族のようなレポーター遺伝子で安定にトランスフェクトされた腫瘍細胞を使用する。
【０００３】
抗腫瘍薬の開発におけるこれらのｉｎ ｖｉｖｏモデルの主要な欠点は制限された処理量である。すなわち、多数の動物および大量の提案された抗腫瘍性化合物が必要とされる。さらに、これらのｉｎ ｖｉｖｏモデルは、移植した腫瘍が動物中で増殖するのに十分な時間を必要とするために時間がかかる。従って、改良されたモデルが最近、特許文献１にてＬａｓｓｏｔａ Ｐ．により提案された。このモデルにおいて、抗腫瘍薬により活性化されるレポーター遺伝子をもつ腫瘍細胞を、ヒト以外の動物に移植されかつ試験されるべき化合物への該動物の曝露後に除去される生物適合性の半透性被包化装置中で増殖させる。しかしながら、該腫瘍細胞の人工的環境を鑑みれば、該腫瘍細胞の応答が、循環に入り、腫瘍組織に浸潤しそしてその生物学的効果を発揮することを化合物が必要とするｉｎ ｖｉｖｏの状況を正確に模倣するかどうかは疑問である。
【０００４】
これゆえに、上で挙げられた欠点を伴わないヒトの腫瘍性疾患の動物モデルに対する必要性を実現させるために、本発明は、提案された抗腫瘍性化合物の薬理学的活性をｉｎ ｖｉｖｏで正確に模倣する能力を有する新規動物モデルを開示する。化合物の抗腫瘍活性をモニターすることを可能にしかつ腫瘍退縮と関連するタンパク質の発現もまた制御するプロモーターに機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含有する発現ベクターでトランスフェクトされた安定に形質転換された腫瘍細胞の使用を含んでなるモデル。所望の動物モデルを提供するために、細胞は；
−動物に移植若しくは注入される場合に腫瘍を形成する能力を保持する；
−腫瘍退縮と関連するタンパク質の内因性応答と一致するシグナルを発生する；
−ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物物質の速度効果のリアルタイム分析を可能にするような良好なＳ／Ｎ比をもつシグナルを発生する；
−動物間の低い変動性を提供するような良好な再現性を伴うシグナルを発生する；および−誘導された応答の非侵襲的画像化を可能にするシグナルを発生する
べきである。
【特許文献１】２００２年７月１８日に第ＷＯ ０２／０５５７４２号明細書として公開された国際特許出願（第ＰＣＴ／ＥＰ０２／００１０６号明細書）
【発明の開示】
【０００５】
［発明の要約］
第一の態様において、本発明は、ヒト以外の動物に移植若しくは注入される場合に腫瘍を形成することが可能であることを特徴とする、腫瘍退縮と関連するタンパク質の発現もまた制御するプロモーターに機能しうるように連結されたレポーター遺伝子、好ましくは蛍光タンパク質を含有する発現ベクターで安定にトランスフェクトされた腫瘍細胞株を提供する。
【０００６】
伝統的なｉｎ ｖｉｖｏモデルに比較して、本発明は、レポーター遺伝子が構成的に発現されないがいしかし腫瘍退縮と関連するタンパク質若しくは酵素の発現をもたらす試験化合物への曝露後にのみ発現されるために異なる。試験されるべき化合物が循環中に入りかつ腫瘍に浸潤した場合にのみ、それはレポーターシグナルを発生させうるが、但し、それは腫瘍退縮と関連するタンパク質の発現を促進し、また、前記タンパク質のプロモーターは該レポーター遺伝子に機能しうるように連結されている。
【０００７】
該モデルは、提案された抗腫瘍性化合物のｉｎ ｖｉｖｏの製薬学的活性を試験するためのターンオーバー時間が短縮されるため、従来のｉｎ ｖｉｖｏモデルを上回り高度に有利である。従来のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいては、結果を得るのに典型的に４ないし５週かかり、本モデルにおいては、腫瘍がヒト以外の動物中で一旦形成されれば試験化合物の効果を一両日中に知ることが可能である。さらに、蛍光シグナルの輝度および再現性を鑑みれば、腫瘍は皮膚を通して見ることができかつ自動全身画像化系を使用して測定し得る。結果として、統計学的に有意の効果を得るためにより少数の動物が必要とされる。本動物モデルのさらなる一利点は、感度、および広範な濃度範囲内の試験化合物の蛍光シグナルの応答性である。この組合せは、試験化合物のｉｎ ｖｉｖｏ活性について動態のリアルタイム解析を実施しかつ観察されるところの腫瘍重量の変化と組合される場合に試験化合物の抗腫瘍効果を予測することを可能にする。特徴のこの組合せは、制限された量の試験化合物の投与後の非侵襲的画像化を可能にして（３０日という伝統的な期間の代わりに４日）、実験時間および従って試験化合物の低減、ならびに犠牲になる動物および動物施設の占有の減少につながる。
【０００８】
特定の一実施態様において、プロモーターはｐ２１プロモーターよりなる。ｐ２１タンパク質はサイクリン依存性のキナーゼ活性の阻害剤として作用しそして細胞周期の進行を効果的に停止する。ＤＮＡ損傷剤、およびそれぞれｐ５３応答配列（ＴＡＴＡボックスに関して−４５００ｂｐないし−１３００ｂｐの領域に位置する）若しくはｓｐ１部位（ＴＡＴＡボックスに関して−６０ｂｐないし＋４０ｂｐの領域に位置する）によりｐ２１プロモーターを活性化するヒストンデアセチラーゼ阻害剤を包含する多種多様な抗腫瘍薬がｐ２１プロモーターを活性化し、そしてｐ２１タンパク質の増大した発現をもたらすことが示されている。本発明の特定の一実施態様において、ｐ２１プロモーターは、ｐ５３応答配列を含まずかつ従ってＤＮＡ損傷剤に対し非応答性であることを特徴とするｐ２１の１３００ｂｐのプロモーターフラグメントよりなる。別の実施態様において、ｐ２１プロモーターはｐ５３応答配列を含んでなるｐ２１プロモーターよりなり、前記ｐ２１プロモーターはＤＮＡ損傷剤に応答性である。あるいは、ＤＮＡ損傷剤に応答性のプロモーターは、少なくとも１個のｐ５３応答配列を含んでなる単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ基礎プロモーター（ＨＳＶ−ＴＫ）のような最小プロモーターよりなる。従って、使用されるプロモーターに基づき、本発明は、ＤＮＡ損傷剤および／若しくはヒストンデアセチラーゼ阻害剤のいずれかのｉｎ ｖｉｖｏでの薬理学的効果に対して選択的なモデルを提供する。または、一般に、目的の腫瘍性剤に依存して、代替の応答配列を使用し得る。
【０００９】
−本発明の腫瘍細胞を試験されるべき化合物と接触させる段階；および
−レポーター遺伝子の発現を測定する段階
を含んでなる、抗腫瘍活性についての化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング方法を提供することもまた本発明の一目的であり；
ここで、対照レベルに比較してのレポーター遺伝子発現の増大が該化合物を抗腫瘍活性を有すると同定する。特定の一実施態様において、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質であり、そしてレポーター遺伝子の発現は発射される蛍光の量として測定される。上に説明されたとおり、本ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法についてもまた、使用されるプロモーターに依存してスクリーニングの選択性を変えることが可能である。本発明の特定の一実施態様において、該ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング法はヒストンデアセチラーゼ阻害剤に対し選択的であり、そして、ｐ２１の１３００ｂｐのプロモーターフラグメントがｐ５３応答配列を含まないことを特徴とする前記プロモーターフラグメントを含んでなる発現ベクターで安定にトランスフェクトされた腫瘍細胞を含んでなる。さらなる一実施態様において、該ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング法は例えばアクチノマイシンＤのようなＤＮＡ損傷剤に対し選択的であり、そして最低１個のｐ５３応答配列を含んでなる発現ベクターで安定にトランスフェクトされた腫瘍細胞を含んでなる。ある実施態様において、発現ベクターは、好ましくはＨＳＶ−ＴＫプロモーターのような最小プロモーターの一部として配列番号１０よりなるｐ５３応答配列を含んでなる。
【００１０】
さらなる一実施態様において、本発明は化合物の製薬学的活性をスクリーニングするためのヒト以外の動物を提供し、前記動物は本発明の安定に形質転換された腫瘍細胞を含んでなる。前記腫瘍細胞は、皮下モデルを提供するためにヒト以外の動物の皮下に、同所モデルを提供するために腫瘍起源の器官（例えば肺中の肺癌細胞）中に、腹膜モデルを提供するためにヒト以外の動物の腹腔中に、若しくは転移モデルを提供するためにヒト以外の動物の血管に外科的に移植若しくは腫瘍細胞懸濁液として注入し得る。好ましい実施態様において、腫瘍細胞は皮下モデルを提供するために皮下に注入される。
【００１１】
従って、
−本発明の腫瘍細胞をヒト以外の動物において腫瘍を形成するのに十分な量で前記ヒト以外の動物に投与する段階；
−前記ヒト以外の動物中で腫瘍を形成するのに十分な時間を腫瘍細胞に与える段階；
−もしかすると活性のある化合物を前記ヒト以外の動物に投与する段階；および
−レポーター遺伝子の発現を測定することにより腫瘍細胞に対する前記化合物の効果を評価する段階
を含んでなる、製薬学的活性についての化合物のスクリーニング方法を提供することが本発明の一目的である。製薬学的活性化合物とのインキュベーションは対照レベルに比較してレポーター遺伝子発現の増大をもたらすことができる。
【００１２】
これおよび本発明のさらなる態様は下により詳細に論考されるであろう。
［発明の詳細な記述］
ベクター
本発明は、発現レベルが生理学的状態と関連するタンパク質若しくは酵素の発現もまた制御するプロモーターに機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含んでなるベクターに関する。
【００１３】
本明細書で使用されるところの機能しうるように連結されたは、プロモーターを該プロモーターの制御下に遺伝子を発現するように正しいフレームで該遺伝子と機能可能に融合することを意味している。本明細書で使用されるところの「レポーター遺伝子」という用語は、単純で安価な方法若しくは試薬を使用して同定し得かつプロモーター領域若しくはその活性フラグメントに機能しうるように連結し得る遺伝子産物をコードする遺伝子を意味している。例えばホタルルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ若しくは蛍光タンパク質レポーター遺伝子のようなレポーター遺伝子を、転写活性を測定するために本発明のスクリーニングアッセイで使用し得る（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、Ｖｏｌ．１８５、サンディエゴ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）を参照されたい；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記もまた参照されたい）。好ましい一実施態様において、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質、とりわけＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＧｃＲｅｄよりなる群から選択される蛍光タンパク質、またはｐＤｓＲｅｄ、ｐＨｃＲｅｄ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ若しくはｐｄ２ＥＹＦＰのような不安定化蛍光タンパク質である。本発明の特定の一実施態様において、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎである。前記レポーター分子およびその遺伝子配列は当該技術分野で既知でありかつＣｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州サンディエゴにより販売される蛍光タンパク質のように商業的に入手可能である。
【００１４】
例えば核酸構築物の製造、突然変異誘発、シークェンシング、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現における核酸の操作、ならびにタンパク質の分析の技術およびプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９７に詳細に記述されている。
【００１５】
本発明のベクターはｐＣＡＴ３、ｐＧＬ２、ｐＧＬ３若しくはｐＳＶ−β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅのような商業的に入手可能なベクターから選択若しくは構築し得、そして、典型的には適切な制御配列、ならびに１個若しくはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合のアンピシリン耐性遺伝子若しくは哺乳動物ベクターのためのネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。下に例示されるとおり、本発明の一実施態様において、ベクターはｐＧＬ３ ｂａｓｉｃベクターから構築する。前記ベクター配列は当該技術分野で既知でありかつＰｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソンにより販売されるｐＧＬ３ ｂａｓｉｃベクターのように商業的に入手可能である。とりわけ、本発明のベクターは、該発現ベクターが設計される宿主細胞と適合性のみならずしかしまたそれぞれの宿主細胞中で所望の生理学的効果を有することが既知のタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよび小分子を包含する化合物にも応答性のプロモーター配列を制御配列の１つとして含有する。従って、本発明の発現ベクター中のプロモーター配列は、それが、連結されたレポーター遺伝子の発現を調節しかつ転写因子の結合若しくは遊離により活性化されることを特徴とする応答配列としてもまた知られる最低１個の制御配列要素を含んでなり、ここで、前記転写因子の存在若しくは非存在は宿主細胞の所望の生理学的条件と相関する。例えば、所望の生理学的条件が宿主細胞中での細胞周期の停止および分化を誘導することよりなる場合、該プロモーター配列は、転写因子Ｓｐ１およびＳｐ３のようなｐ２１活性化因子ならびにステロイドホルモン、神経成長因子、腫瘍壊死因子−α、ホルボールエステル、ホスファターゼ阻害剤、インターフェロンγおよびＳｍａｄ腫瘍サプレッサータンパク質のような細胞周期の停止および細胞分化の他の誘発因子への曝露に際して活性化されることが既知であるｐ２１ＷＡＦ−１／Ｃｉｐ１プロモーターの近接部分で見出されるＧＣリッチモチーフを含みうる。
【００１６】
従って、本明細書で使用されるところのプロモーターは、発現レベルが所望の生理学的条件に依存するタンパク質の発現もまた制御するｐ２１ＷＡＦ−１／Ｃｉｐ１プロモーターのような天然に存在するプロモーター、若しくは下の実施例に記述されるところのｐ２１の１３００ｂｐのプロモーターフラグメントのようなプロモーター活性を有するそのフラグメントのいずれかでありうる。特定の一実施態様において、プロモーター配列は、最小インターロイキン６（ＩＬ６）プロモーター（ｐｈｕ．ＩＬ６Ｐｌｕｃ＋ Ｐｌａｉｓａｎｃｅら（１９９７）ＭＣＢ １７、３７３３−３７４３）、最小Ｅ１Ｂプロモーター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから商業的に入手可能なｐＭＣＳｌｕｃ）、若しくはルシフェラーゼの商業的に入手可能なＴＫプロモーター（ｐＴＫｌｕｃ Ｐｒｏｍｅｇａ）のような最小プロモーター要素に機能しうるように連結されたｐ５３応答配列のような前述の制御配列要素の１つを含んでなる組換えＤＮＡ構築物よりなり、好ましくは、該プロモーター
は下述されるところのｐ２１の１３００ｂｐのプロモーターフラグメント若しくは下述されるところのｐ５３応答配列を含んでなるＨＳＶ−ＴＫ最小プロモーターよりなる。別の実施態様において、プロモーター配列は、腫瘍退縮と関連するタンパク質の発現もまた制御するプロモーター若しくはプロモーター活性を有するそのフラグメントであることができる。
【００１７】
標的細胞
別の態様において、本発明は、発現レベルが生理学的条件と関連するタンパク質若しくは酵素の発現もまた制御するプロモーターに機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含んでなる発現ベクターで安定に形質転換された標的細胞に関する。
【００１８】
上述されたところのベクター構築物は、好ましくはリポソーム、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔法および遺伝子銃の使用のような標準的なトランスフェクション法を使用するトランスフェクション若しくは形質導入のようないずれかの既知の方法によって標的細胞に導入し得る。
【００１９】
腫瘍性増殖、とりわけ癌性増殖のためのヒト以外の動物モデルを提供することが本発明のさらなる一態様であるため、本発明のベクターを、ヒト以外の動物に移植若しくは注入される場合に腫瘍を形成することが可能な標的細胞に導入することができる。適する細胞株の例は、黒色腫、肺癌株、腎癌株、結腸癌株、前立腺癌株、卵巣癌株、乳癌株、中枢神経系腫瘍株、白血病細胞株などを包含する。一実施態様において、標的細胞は卵巣癌細胞株、とりわけＡ２７８０（ＥＣＡＣＣ番号９３１１２５２０）よりなり、別の実施態様において、標的細胞は結腸直腸癌細胞株、とりわけＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４７）よりなる。さらなる標的細胞は、多様な哺乳動物細胞株、とりわけヒト細胞株を包含する多様な細胞株から選択し得る。本明細書で使用されるところの標的細胞は、ネオマイシンのような選択マーカー、メチオニナーゼのような治療的タンパク質若しくはレポーター遺伝子産物のための発現系で既に形質転換されている前述の細胞のいずれかを包含することに注目すべきである。例えば、本発明の代替の一実施態様において、ヒト以外の動物に投与される場合に腫瘍を形成することが可能な標的細胞はホタルルシフェラーゼ若しくは蛍光タンパク質（上を参照されたい）のようなレポータータンパク質をコードする発現系で既に形質転換されている。これらの細胞を本発明のベクターで形質転換してよいが、但し、発光タンパク質すなわち基礎色を提供するレポーター遺伝子および誘導可能な色を提供する本発明のベクターの放射波長は相互に重ならない。可能な組合せは、とりわけ、高められた蛍光タンパク質ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰおよびＥＹＦＰを伴うＤｓＲｅｄ；ＤｓＲｅｄを伴うＺｓＧｒｅｅｎ；ＥＹＦＰを伴うＥＧＦＰ；ＥＢＦＰを伴うＥＧＦＰ；ＥＹＦＰを伴うＥＢＦＰ；若しくはＥＹＦＰを伴うＥＣＦＰを包含する。本発明のベクターで一旦形質転換されれば、これらの細胞は、例えば、投与された腫瘍細胞が、試験化合物の抗腫瘍活性を研究するための本明細書に記述される誘導可能な系と組合せで前記ヒト以外の動物中で腫瘍を形成するのに十分な時間を有した場合に、腫瘍全体の効率的な検出を確立することを可能にする。とりわけ、試験されるべき化合物が受動拡散および／若しくは血管新生を介して腫瘍に進入するかどうかを研究するため。いずれの場合も、標的細胞の選択は検討されるべき生理学的条件に依存するであろう。あるいは、本発明の発現ベクターは有意性に達するための良好な誘導因子でのレポーター遺伝子の低いがしかし検出可能な基礎発現を有する。本実施態様において、投与された腫瘍細胞が前記ヒト以外の動物中で腫瘍を形成するのに十分な時間を有した場合に確立するのに低い基礎発現を使用し得る。これゆえに標的細胞の二重トランスフェクションは必要とされない。この有利な実施態様は本発明のベクターがレポーター遺伝子としてＺｓＧｒｅｅｎを含んでなる場合に生じた。
【００２０】
従って、腫瘍退縮と関連するタンパク質の発現もまた制御するプロモーターに機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含有する発現ベクターでトランスフェクトされて
いる安定に形質転換された腫瘍細胞株を提供することが、本発明の一目的である。とりわけ、ｐ２１活性化因子に応答性であるプロモーターに機能しうるように連結された蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含んでなる、安定に形質転換された卵巣癌細胞株、好ましくはＡ２７８０細胞、好ましくは、前記プロモーターは１３００ｂｐのｐ２１プロモーター配列（配列番号１）を含んでなり、なおより好ましくは、前記プロモーター配列は１３００ｂｐのｐ２１プロモーター配列（配列番号１）よりなる。ここで、さらなる一実施態様において、蛍光タンパク質は、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＨｃＲｅｄ、またはｐＤｓＲｅｄ、ｐＨｃＲｅｄ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ若しくはｐｄ２ＥＹＦＰのような不安定化蛍光タンパク質よりなる群から選択され、そして特定の一実施態様において蛍光タンパク質はＺｓＧｒｅｅｎよりなる。好ましい一実施態様において、安定に形質転換された細胞は、それぞれの受託番号ＬＭＢＰ ５９５８ＣＢおよびＬＭＢＰ ５９５９ＣＢをもつｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００−クローン１およびｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００−クローン２として２００３年１月２０日にベルギーの微生物協調収集物（Ｂｅｌｇｉａｎ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）（ＢＣＣＭ）に寄託されたクローンから選択される。前記クローンは、商業的に入手可能なｐＧＬ３ベクター由来かつｐ２１活性化因子に応答性であるプロモーターに機能しうるように連結されたＺｓＧｒｅｅｎをコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含んでなり、前記プロモーターは１３００ｂｐのｐ２１プロモーター配列（配列番号１）を含んでなり、ここで前記クローンは、それらがＭｉｔｓｕｉ（別名ＭＳ−２７５−Ｓｈｅｒｉｎｇ−登録番号２０９７８３−８０−２）のような細胞周期の停止および細胞分化の既知の誘発因子での誘導に際して自動全身画像化系による蛍光の検出を可能にする低い基礎蛍光発現を有することを特徴とする。
これらの特徴、すなわち
−ヒト以外の動物に移植若しくは注入される場合に腫瘍を形成する能力、
−低い基礎蛍光、
−細胞周期の停止および細胞分化の既知の誘発因子への曝露に際して特定の様式で誘導可能である蛍光、ならびに
−非侵襲的な全身画像化技術を使用してあるレベルまで検出可能なこと
を鑑みれば、前記クローンは、提案された抗腫瘍性化合物のｉｎ ｖｉｖｏ製薬学的活性を研究するための重要なツールを提供する。伝統的なｉｎ ｖｉｖｏモデルに比較して、ヒト以外の動物、とりわけウサギ、モルモット、マウス、ラットおよびイヌ、好ましくはげっ歯類のような実験動物でのこれらの細胞の使用は、時間および化合物を消費する薬物動態（ＰＫ）および薬動力学（ＰＤ）研究を実施することなく薬物発見過程のより早い時点で化合物が評価されることを可能にする。
【００２１】
代替の一実施態様において、該細胞株は、最小インターロイキン６（ＩＬ６）プロモーター（ｐｈｕ．ＩＬ６Ｐｌｕｃ＋ Ｐｌａｉｓａｎｃｅら（１９９７）ＭＣＢ １７、３７３３−３７４３）、最小Ｅ１Ｂプロモーター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから商業的に入手可能なｐＭＣＳｌｕｃ）、若しくはルシフェラーゼの商業的に入手可能なＴＫプロモーター（ｐＴＫｌｕｃ Ｐｒｏｍｅｇａ）のような最小プロモーター要素に機能しうるように連結されたｐ５３応答配列のような前述の制御配列要素の１つを含んでなる組換えＤＮＡ構築物よりなるプロモーター配列を含んでなる発現ベクターで形質転換される。とりわけ、ｐ５３活性化因子に応答性であるプロモーターに機能しうるように連結された蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含んでなる安定に形質転換された結腸直腸癌細胞株若しくは卵巣癌細胞株、好ましくはＨＣＴ１１６細胞若しくはＡ２７８０細胞、好ましくは、前記プロモーターはｐ５３応答配列（配列番号１０）を含んでなり、より好ましくは、前記プロモーターは、ｐ５３応答配列（配列番号１０）を含んでなる最小ＨＳＶ−ＴＫプロモーターよりなり、なおより好ましくは、ｐ５３応答性のＨＳＶ−ＴＫプロモーター配列（配列番号１３）よりなる。ここで、さらなる一実施態様において、蛍光タンパク質はＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＨｃＲｅｄ、またはｐＤｓＲｅｄ、ｐＨｃＲｅｄ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ若しくはｐｄ２ＥＹＦＰのような不安定化蛍光タンパク質よりなる群から選択され、そして特定の一実施態様において蛍光タンパク質はＺｓＧｒｅｅｎよりなる。特定の一実施態様において、安定に形質転換された細胞は、商業的に入手可能なｐＧＬ３ベクター由来かつｐ５３活性化因子に応答性であるプロモーターに機能しうるように連結されたＺｓＧｒｅｅｎをコードする核酸配列を含有するｐ５３ＲＥ＿ＴＫ／ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎベクター（図）でトランスフェクトしたＡ２７８０若しくはＨＣＴ１１６細胞よりなり、前記プロモーターはｐ５３応答性のＨＳＶ−ＴＫプロモーター配列（配列番号１４）を含んでなり、ここで前記クローンは、それらがＤＮＡ損傷剤への曝露、低酸素、ヌクレオチド枯渇若しくは発癌活性化のようなｐ５３の活性化因子での誘導に際して自動全身画像化系による蛍光の検出を可能にする低い基礎蛍光発現を有することを特徴とする。これらの特徴、すなわち
−ヒト以外の動物に移植若しくは注入される場合に腫瘍を形成する能力、
−低い基礎蛍光、
−細胞周期の停止および細胞分化の既知の誘発因子への曝露に際して特定の方法で誘導可能である蛍光、ならびに
−非侵襲的な全身画像化技術を使用してあるレベルまで検出可能であること、
を鑑みれば、前記クローンは、提案された抗腫瘍性化合物のｉｎ ｖｉｖｏ製薬学的活性を研究するための重要なツールを提供する。伝統的なｉｎ ｖｉｖｏモデルに比較して、ヒト以外の動物、とりわけウサギ、モルモット、マウス、ラットおよびイヌ、好ましくはげっ歯類のような実験動物でのこれらの細胞の使用は、時間および化合物を消費する薬物動態（ＰＫ）および薬動力学（ＰＤ）研究を実施することなく、薬物発見過程のより早い時点で化合物が評価されることを可能にする。
【００２２】
従って、さらなる一実施態様において、本発明は、最小プロモーター要素が腫瘍退縮と関連する化合物に応答することを特徴とする、該プロモーター配列に機能しうるように連結された制御配列要素を含んでなる組換えＤＮＡ構築物よりなるプロモーター配列に機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含有する発現ベクターでトランスフェクトされている安定に形質転換された腫瘍細胞株を提供する。本明細書で使用されるところの化合物はタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよび小分子を包含する。
【００２３】
アッセイ
本発明の安定に形質転換された細胞を試験されるべき化合物と接触させること；およびレポーター遺伝子の発現を測定するを含んでなる、製薬学的活性化合物を同定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイでの上で挙げられた細胞株の使用を提供することもまた本発明の一目的である。本明細書で使用されるところの製薬学的活性化合物は、発現ベクター中に存在するプロモーター配列を活性化することが可能な化合物を指す。
【００２４】
抗腫瘍活性をもつ化合物を同定するための特定の実施態様において、前述のスクリーニング方法における安定に形質転換された細胞は、腫瘍退縮と関連する化合物に応答性であるプロモーター配列に機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含有する発現ベクターを含んでなる。従って；本発明の安定に形質転換された腫瘍細胞を試験されるべき化合物と接触させること、およびレポーター遺伝子の発現を測定するを含んでなる、抗腫瘍活性をもつ化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ同定方法を提供することが本発明の一目的である。
【００２５】
前述のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング法の好ましい一実施態様において、安定に形質転換された腫瘍細胞は、ｐ２１活性化因子に応答性であるプロモーターに機能しうるように連結された蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含んでなる安定に形質転換された卵巣癌細胞、好ましくはＡ２７８０細胞よりなり、好ましくは、前記プロモーターは１３００ｂｐのｐ２１プロモーター配列（配列番号１）を含んでなり、
なおより好ましくは、前記プロモーター配列は１３００ｂｐのｐ２１プロモーター配列（配列番号１）よりなる。ここで、さらなる一実施態様において、蛍光タンパク質はＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＨｃＲｅｄ、またはｐＤｓＲｅｄ、ｐＨｃＲｅｄ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ若しくはｐｄ２ＥＹＦＰのような不安定化蛍光タンパク質よりなる群から選択され、そして特定の一実施態様において蛍光タンパク質はＺｓＧｒｅｅｎ若しくはＺｓＲｅｄよりなる。より好ましい一実施態様において、該ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング法で使用される安定に形質転換された腫瘍細胞は、受託番号ＬＭＢＰ ５９５８ＣＢおよびＬＭＢＰ ５９５９ＣＢでＢＣＣＭに寄託されたクローンから選択される。前述のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング法の別の実施態様において、安定に形質転換された腫瘍細胞は、ｐ５３活性化因子に応答性であるプロモーターに機能しうるように連結された蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含んでなる安定に形質転換された結腸直腸癌細胞若しくは安定に形質転換された卵巣癌細胞、好ましくはＡ２７８０細胞若しくはＨＣＴ１１６細胞よりなり、好ましくは、前記プロモーターはｐ５３応答配列（配列番号１０）を含んでなり、なおより好ましくは、前記プロモーターはｐ５３応答配列を含んでなる最小ＨＳＶ−ＴＫプロモーター（配列番号１３）よりなる。ここで、さらなる一実施態様において、蛍光タンパク質はＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＨｃＲｅｄまたはｐＤｓＲｅｄ、ｐＨｃＲｅｄ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ若しくはｐｄ２ＥＹＦＰのような不安定化蛍光タンパク質よりなる群から選択され、そして特定の一実施態様において蛍光タンパク質はＺｓＧｒｅｅｎよりなる。特定の一実施態様において、該ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法で使用される安定に形質転換された細胞は、ｐ５３ＲＥ＿ＴＫ／ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎベクター（図６）でトランスフェクトしたＡ２７８０若しくはＨＣＴ１１６細胞よりなる。
【００２６】
前述のアッセイをハイスループットスクリーニングの目的に適合させ得ることが当業者により容易に認識されるであろう。例えば、蛍光の変化を測定することにより抗腫瘍活性を評価するアッセイは、蛍光イメージングプレート読取装置（（ＦＬＩＰＲＡ（Ｒ））、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と呼ばれる機器に基づいて設計し得る。その最も一般的な構成においてそれは蛍光化合物を励起しかつそれにより発射される蛍光を測定する。それは、フルオロフォアの高出力励起を生じさせるためのアルゴンイオンレーザー、９６／３８４ウェルプレートの底全体を迅速に走査するための光学系、および発射された蛍光を捕捉するための高感度の冷却ＣＣＤカメラを使用する。それは、該機器が試験剤の溶液を９６／３８４ウェルプレートのウェルに送達することを可能にする９６／３８４ウェル分注ヘッドもまた含有する。ＦＬＩＰＲアッセイは、化合物の添加前、間および後の細胞の集団からの蛍光シグナルを全部の９６／３８４ウェルから同時にリアルタイムで測定するよう設計されている。ＦＬＩＰＲアッセイは、本発明の安定に形質転換された腫瘍細胞中で機能的に活性の化合物についてスクリーニングしかつそれらを特徴づけるのにも使用しうる。
【００２７】
ｐ２１若しくはｐ５３活性化因子を同定するためにとりわけ有用なハイスループットスクリーニングアッセイは、本発明の発現ベクターで安定に形質転換された卵巣癌細胞、とりわけＡ２７８０細胞を試験化合物とともにインキュベートし、そして相互作用を可能にするための十分な時間（８〜２４時間、典型的には１２〜２４時間、とりわけ２４時間）の後に、ＦＬＩＰＲ若しくはＡｓｃｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、ベルギー・ブリュッセルから商業的に入手可能）のような自動蛍光プレート読取装置を使用して相対蛍光単位の変化を測定する単一段階の処置よりなり得る。
【００２８】
ヒト以外の動物モデル
本発明の標的細胞を含んでなるヒト以外の動物を提供することもまた本発明の一実施態様である。とりわけ、腫瘍性増殖、とりわけ癌性増殖についてのヒト以外の動物モデルを提供すること。
【００２９】
従って、本発明は、前記ヒト以外の動物において腫瘍の産生を遂げるのに十分な量の本発明の安定に形質転換された腫瘍細胞を前記ヒト以外の動物に投与することを含んでなる、腫瘍性増殖のヒト以外の動物モデルの製造方法を提供する。ここで、モデルとしての使用のための前記ヒト以外の動物は、好ましくは哺乳動物被験体、最も好ましくはモルモット、ウサギ、ラットおよびマウスなどのような便宜的な実験動物である。ヒト被験体へのより近密な類似のため霊長類もまた使用し得る。損なわれた免疫系を伴う被験体、典型的にはヌードマウス若しくはＳＣＩＤマウスのような、腫瘍の進行に感受性の被験体がとりわけ有用である。いかなる適切な脊椎動物被験体も使用し得、選択は主として便宜性および最終目的の系への類似性により決定される。該ヒト以外の動物モデルは、好ましくはヌードマウスのようなげっ歯類であり、また、腫瘍の産生を遂げるための細胞の量は典型的に１０６から１０８細胞までの範囲にわたる（例えば米国特許第６，２５１，３８４号明細書を参照されたい）。好ましくは、こうした投与は皮下でありかつ腫瘍は充実性の塊として形成される。
【００３０】
上で挙げられた動物モデルは抗腫瘍活性をもつ化合物のスクリーニング方法で使用し得る。好ましくは、前記ヒト以外の動物に投与される腫瘍細胞は、ｐ２１活性化因子に対し応答性であるプロモーターに機能しうるように連結された蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含んでなる安定に形質転換された卵巣癌細胞、好ましくはＡ２７８０細胞よりなり、好ましくは、前記プロモーターは１３００ｂｐのｐ２１プロモーター配列（配列番号１）を含んでなり、なおより好ましくは、前記プロモーター配列は１３００ｂｐのｐ ２１プロモーター配列（配列番号１）よりなる。ここで、さらなる一実施態様において、蛍光タンパク質はＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＨｃＲｅｄ、またはｐＤｓＲｅｄ、ｐＨｃＲｅｄ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ若しくはｐｄ２ＥＹＦＰのような不安定化蛍光タンパク質よりなる群から選択され、そして特定の一実施態様において、蛍光タンパク質はＺｓＧｒｅｅｎ若しくはＺｓＲｅｄよりなる。より好ましい一実施態様において、該ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング法で使用される安定に形質転換された腫瘍細胞は、受託番号ＬＭＢＰ ５９５８ＣＢおよびＬＭＢＰ ５９５９ＣＢでＢＣＣＭに寄託されたクローンから選択される。
【００３１】
代替の一実施態様において、該ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング法で使用される腫瘍細胞は、最小インターロイキン６（ＩＬ６）プロモーター（ｐｈｕ．ＩＬ６Ｐｌｕｃ＋ Ｐｌａｉｓａｎｃｅら（１９９７）ＭＣＢ １７、３７３３−３７４３）、最小Ｅ１Ｂプロモーター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから商業的に入手可能なｐＭＣＳｌｕｃ）、若しくはルシフェラーゼの商業的に入手可能なＴＫプロモーター（ｐＴＫｌｕｃ Ｐｒｏｍｅｇａ）のような最小プロモーター要素に機能しうるように連結されたｐ５３応答配列のような前述の制御配列要素の１つを含んでなる組換えＤＮＡ構築物よりなるプロモーター配列を含んでなる発現ベクターで形質転換されている。一実施態様において、該ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングで使用される安定に形質転換された腫瘍細胞は、ｐ５３活性化因子に応答性であるプロモーターに機能しうるように連結された蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含んでなる安定に形質転換された結腸直腸癌細胞若しくは安定に形質転換された卵巣癌細胞、好ましくはＡ２７８０細胞若しくはＨＣＴ１１６細胞よりなり、好ましくは、前記プロモーターはｐ５３応答配列（配列番号１０）を含んでなり、なおより好ましくは、前記プロモーターはｐ５３応答配列を含んでなる最小ＨＳＶ−ＴＫプロモーター（配列番号１３）よりなる。ここで、さらなる一実施態様において、蛍光タンパク質はＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＨｃＲｅｄ、またはｐＤｓＲｅｄ、ｐＨｃＲｅｄ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ若しくはｐｄ２ＥＹＦＰのような不安定化蛍光タンパク質よりなる群から選択され、そして特定の一実施態様において蛍光タンパク質はＺｓＧｒｅｅｎよりなる。特定の一実施態様において、該ｉｎ ｖｉｖｏの方法で使用される安定に形質転換された細胞は、ｐ５３ＲＥ＿ＴＫ／ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎベクター（図６）でトランスフェクトしたＡ２７８０若しくはＨＣＴ１１６細胞よりなる。
【００３２】
従って、さらなる一実施態様において、本発明は、本発明のｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング法において最小プロモーター要素が腫瘍退縮と関連する化合物に応答することを特徴とする、前記プロモーター配列に機能しうるように連結された制御配列要素を含んでなる組換えＤＮＡ構築物よりなるプロモーター配列に機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含有する発現ベクターでトランスフェクトされている安定に形質転換された腫瘍細胞株の使用を提供する。
【００３３】
該ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング法で使用される場合に、前記ヒト以外の動物に投与される安定に形質転換された腫瘍細胞は、前記ヒト以外の動物において腫瘍を形成するための十分な時間を有するべきであった。腫瘍、およびとりわけキャリパーで測定可能な充実性腫瘍は、典型的には該ヒト以外の動物への安定に形質転換された腫瘍細胞の投与７〜２０日後に形成される。特定の一実施態様において、本発明のＡ２７８０形質転換細胞を使用して、およびとりわけ受託番号ＬＭＢＰ ５９５８ＣＢ若しくはＬＭＢＰ ５９５９ＣＢでＢＣＣＭに寄託された卵巣癌細胞を使用して、キャリパーで測定可能な腫瘍は細胞の注入１２日後に得られる。
【００３４】
従って、さらなる一実施態様において、本発明は；
本発明の安定に形質転換された腫瘍細胞が典型的にはヒト以外の動物の皮下に注入される１０６ないし１０８細胞を含んでなる腫瘍細胞懸濁液として投与される、本発明の腫瘍細胞をヒト以外の動物に投与する段階；および
前記ヒト以外の動物において腫瘍を形成するための十分な時間（上で概説されたところの卵巣癌細胞を使用する特定の実施態様において典型的には７〜１４日、より好ましくは９〜１２日およびとりわけ１２日よりなる）を腫瘍細胞に与える段階
を含んでなる、抗腫瘍活性をもつ化合物を同定するためのヒト以外のｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルの製造方法を提供する。
【００３５】
上で挙げられた方法に従って得ることができるヒト以外の動物モデルは；
もしかすると活性のある化合物を本発明のヒト以外の動物、好ましくは上で概説されたところの卵巣癌細胞を注入されたヌードマウスに投与する段階（ここで該もしかすると活性のある化合物は静脈内、経口および腹腔内を包含する全部の臨床上適切な投与経路により投与してよい）；ならびに
レポーター遺伝子の発現を測定することにより腫瘍細胞に対する前記もしかすると活性のある化合物の効果を評価する段階
を含んでなる、抗腫瘍活性をもつ化合物のｉｎ ｖｉｖｏ同定方法でその後使用しうる。
【００３６】
本記述を通じ、「標準的方法」、「標準的プロトコル」および「標準的手順」という用語は、分子生物学の技術の情況で使用される場合、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、編者Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９４、若しくはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．とＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー １９８９のような通常の実験室手引き書に見出されるプロトコルおよび手順として理解されるべきである。
【００３７】
本発明は後に続く実験の詳細への参照によりより良好に理解されるであろうが、しかし、当業者は、これらがその後に続く請求の範囲でより完全に記述されるところの本発明の
具体的説明にすぎないことを容易に認識するであろう。加えて、本出願を通じて多様な刊行物が引用される。これらの刊行物の開示はこれにより、本発明が属する従来技術をより完全に記述するために本出願に引用することにより組込まれる。
【実施例１】
【００３８】
材料および方法
細胞培養および試薬
Ａ２７８０細胞（ＡＴＣＣ）は、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベータ中、３７℃で、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ）は５％ＣＯ２を含む加湿インキュベータ中、３７℃で、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびゲンタマイシンを補充したマッコイ５ａ培地中で培養した。全部の細胞培養溶液はＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（メリーランド州ゲイサーズバーグ）により提供される。他の材料はＮｕｎｃにより提供される。
【００３９】
４５００ｋｂのｐ２１プロモーターフラグメントおよび１３００ｋｂのｐ２１プロモーターフラグメントの製造
ゲノムＤＮＡを、増殖しているＡ２７８０細胞から抽出しかつｐ２１プロモーターのネステッドＰＣＲ単離の鋳型として使用した。第一の増幅は、鋳型としてのゲノムＤＮＡとともにオリゴヌクレオチド対ＧＡＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＣＴＴＧＧ（配列番号２）およびＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣ（配列番号３）を使用して５５℃のアニーリング温度で２０周期の間実施した。ＴＡＴＡボックスに関して−４５５１ないし＋８８のフラグメントを含有する、生じる４．５ｋｂのフラグメントを、４．５ｋｂのフラグメントをもたらす８８℃でのアニーリングを伴う２０周期の間オリゴヌクレオチドＴＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＣＴＴＧＧ（配列番号４）およびＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣ（配列番号５）を用い、そしてその後ＴＡＴＡボックスに関して−１３００ないし＋８８のフラグメントを含有する１．３ｋｂのフラグメントをもたらす８８℃のアニーリングを伴う２０周期の間オリゴヌクレオチド対ＴＣＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＡＧＡＴＧＧＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＡＣＡＣＡＴＣ（配列番号６）およびＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣ（配列番号７）を用いて再増幅した。オリゴヌクレオチド中に存在する制限部位ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ（下線を付けた配列）をサブクローニングに使用した。
【００４０】
ｐ２１プロモーター構築物
ルシフェラーゼレポーターをｐＧＬ３−ｂａｓｉｃから除去しかつＫｐｎＩおよびＸｂａＩ制限部位でＺｓＧｒｅｅｎレポーター（ｐＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｎ１プラスミドから）により置換した。ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００は、ヒトｐ２１プロモーター領域の上で挙げられた１．３ｋｂのフラグメントのｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎへのＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ部位での挿入を介して構築した。全部の制限酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ（ドイツ）により提供される。
【００４１】
一過性トランスフェクションおよび安定なトランスフェクション
Ａ２７８０細胞を２×１０５細胞の密度で６ウェルプレートにプレーティングし、２４時間インキュベートし、そして製造元により記述されたとおりリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ベルギー・ブリュッセル）を使用することにより２μｇのｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００および０．２μｇのｐＳＶ２ｎｅｏベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、メリーランド州ゲイサーズバーグ）で１０日間選択し、そして単一細胞懸濁液を増殖させた。３週後に８０個の単一クローンを得た。
【００４２】
ｐ２１プロモーター活性の誘導
Ａ２７８０のトランスフェクトしたプールおよび選択した８０クローンを拡大しそしてウェルあたり１００００細胞で９６ウェルプレートに接種した。接種２４時間後に、標的を定めた化合物（近接のｐ２１プロモーター領域中のｓｐ１部位に影響を及ぼす）若しく
はＤＮＡ損傷剤（ｐ５３応答配列に影響を及ぼす）で細胞を追加の２４時間処理した。その後細胞を４％ＰＦＡで３０分間固定し、そしてヘキスト染色で対染色した。ＺｓＧｒｅｅｎ産生および従って蛍光に至るｐ２１プロモーターの活性化を、Ａｓｃｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、ベルギー・ブリュッセル）および蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）によりモニターした。
【００４３】
ｉｎ ｖｉｖｏ評価
選択したクローンをヌードマウスの脇腹に皮下注入し（１０７細胞／２００μｌ）そしてキャリパーで測定可能な腫瘍を１２日後に得た。第１２日以降、溶媒、２０ｍｐｋのＭｉｔｓｕｉ（別名ＭＳ−２７５−Ｓｈｅｒｉｎｇ−登録番号２０９７８３−８０−２）若しくは４０ｍｐｋのＪＮＪＸ（それぞれ１０、１０および４動物）を６日間毎日動物に経口投与した。腫瘍は、社内で開発した自動全身画像化系（ＧＦＰフィルターを装備しかつＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｒ）からのＩＭＡＱ Ｖｉｓｉｏｎソフトウェアに基づくソフトウェアパッケージにより制御されるＣＣＤカメラ 型式ＪＡＩ（Ｒ）ＣＶ−Ｍ９０に接続した蛍光立体顕微鏡 型式Ｏｌｙｍｐｕｓ（Ｒ）ＳＺＸ１２）により蛍光について評価した。
【００４４】
結果
ＨＤＡＣ阻害剤によるｐ２１の１３００ｂｐのプロモーターフラグメントのｉｎ ｖｉｔｒｏでの誘導
Ａ２７８０の安定なトランスフェクトしたプールおよび選択した８０クローンを、材料および方法に記述されたとおり、ＴＳＡ（１０−７Ｍ）、ブレオマイシン（１５ｍＵ）およびＭｉｔｓｕｉ（１０−６Ｍ）で処理した。８０クローンのうち６クローンがＴＳＡおよびＭｉｔｓｕｉ処理に応答した。これらのクローンの４個は、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎで検出可能でなかったくらい低い基礎蛍光発現を示したが、しかし蛍光顕微鏡を使用するＺｓＧｒｅｅｎ産生の人的評価により選択し得た。２個の他のクローンは測定が可能であり、そしてＴＳＡ（１０−７）により５倍およびＭｉｔｓｕｉ（１０−６）により１．２〜１．５倍の誘導を示した。
【００４５】
これら６クローンをＤＮＡ損傷剤（カンプトテシン、ブレオマイシンおよびドキソルビシン）ならびにＨＤＡＣ阻害剤（ＴＳＡ、Ｍｉｔｓｕｉ、化合物ＸおよびＳａｈａ）に対する用量応答にて評価した。クローン１は１０−７のＴＳＡに応答して５倍、１０−６ＭのＭｉｔｓｕｉに対し１．８倍および１０−６ＭのＪＮＪＸに対し３倍の誘導を示した（図１）。ＤＮＡ損傷剤はｐ２１プロモーターの１３００ｂｐのフラグメントを活性化することが可能でなかった（図１）。クローン５は同一の応答を示した（図１）。クローン２、３、４および６の誘導は該系の感度の問題によりＦｌｕｏｒｏｓｋａｎにより測定し得なかったが、しかし蛍光顕微鏡を使用することにより蛍光の増大を可視化し得た（データは示されない）。
【００４６】
ＨＤＡＣ阻害剤によるｉｎ ｖｉｖｏでのｐ２１プロモーターの誘導
マウスにクローン１、２、３および５を注入し、そして材料および方法に記述されたとおり化合物（溶媒、２０ｍｐｋのＭｉｔｓｕｉ若しくは４０ｍｐｋのＪＮＪ’９９）を投与した。基礎のＺｓＧｒｅｅｎ発現および誘導は、クローン２および３において、自動全身画像化系により検出されるには低すぎた。クローン１および５の基礎蛍光は測定が可能であり、また、ＺｓＧｒｅｅｎの誘導は第一の用量の投与３日後に非常に明瞭でありかつ５日後にプラトーに達した（図２）。
【００４７】
考察
ＴＳＡ、ＭｉｔｓｕｉおよびＳＡＨＡのような数種の既知のヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ＴＡＴＡボックスに関して−６０ｂｐから＋４０ｂｐまでの領域のネズミのｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１プロモーターのトランス活性化を誘導することが示された。この領域はわれわれのｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１の１３００ｂｐのプロモーター構築物中に存在する。われわれのデータは、これらの剤がｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００でトランスフェクトしたＡ２７８０細胞中でｉｎ ｖｉｔｒｏでＺｓＧｒｅｅｎ産生
を誘導することを確認する。ＤＮＡ損傷剤（カンプトテシン、ブレオマイシンおよびドキソルビシン）はｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１プロモーターのｐ５３依存性の調節を介してそれらの活性を発揮する。ｐ５３応答配列は、ｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１プロモーター中のより下流に１３００ｂｐのプロモーターフラグメント中に存在しない領域に位置している。これはＤＮＡ損傷剤に対する該系の非応答性を説明する。これらのデータから、われわれは、われわれのレポーター系がヒストン脱アセチル化に関する分子事象を検討するためのモデルを提供しかつ該レポーター系の特異性をｉｎ ｖｉｔｒｏで明らかにすると結論する。この概念はまた、とりわけＤＮＡ損傷剤を、若しくは応答配列を適合させることによりいずれかの他の薬物を試験するのにも使用し得る。
【００４８】
化合物のｉｎ ｖｉｖｏでの作用ははるかにより複雑であり、そして該化合物が活性の形態で循環に入り、腫瘍に達するかどうか、および腫瘍内の濃度がその生物学的活性を発揮するのに十分高いかどうかを決定するための労働集約的な動物試験を必要とする。Ｍｉｔｓｕｉ化合物が腫瘍に達し得ること、および腫瘍中で達する濃度が腫瘍が増殖するのを止めるのに十分高いことが、より複雑なＰＫ／ＰＤ研究で示された。本報告において、われわれは、Ｍｉｔｓｕｉ化合物が、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００でトランスフェクトしたＡ２７８０異種移植片中で処置４日後に蛍光を誘導することを示し、該化合物がｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍に達しかつその生物学的活性を発揮することを暗示する。これは、本系がｉｎ ｖｉｖｏでの活性についての迅速かつ正確な結論を可能にする非常に強力なｉｎ ｖｉｖｏツールであることを確認し、時間および化合物を消費するＰＫ／ＰＤ研究を実施することなく薬物発見過程のより早い時点で化合物が評価されることを可能にする。
【実施例２】
【００４９】
材料および方法
細胞培養および試薬
Ａ２７８０細胞（ＡＴＣＣ）は５％ＣＯ２を含む加湿インキュベータ中、３７℃で、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ）は５％ＣＯ２を含む加湿インキュベータ中、３７℃で、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびゲンタマイシンを補充したマッコイ５ａ培地中で培養した。全部の細胞培養溶液はＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（メリーランド州ゲイサーズバーグ）により提供される。他の材料はＮｕｎｃにより提供される。
【００５０】
ｐ５３応答配列の製造
以下のオリゴのｐ５３ＲＥフォワードＣＣＴＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＧＣＣＴＧＧＧＴＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＧＣＣＴＧＧＣ（配列番号８）およびｐ５３ＲＥリバースＴＣＧＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＣＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＣＡＧＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴ（配列番号９）をＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃから注文した。該オリゴヌクレオチド対を、アニーリング緩衝液（１５０ｍＭトリス ｐＨ７．６、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２３ｍＭ ＤＴＴ）中で６５℃で開始して５０℃、４０℃、３０℃にわたり２０℃の最終温度まで５分ごとのアニーリング温度の段階的低下によりアニーリングした。クローニングのためのＳａｃＩ／ＸｈｏＩオーバーハングをもつフラグメントが形成された（応答配列は下線を付けた配列である）（配列番号１０）：
TCCCTG CCTGGACTTG CCTGGGTCGA CCCTGCCTGG ACTTGCCTGG C
CTCGAGGGAC GGACCTGAAC GGACCCAGCT GGGACGGACC TGAACGGACC GAGCTC
【００５１】
構築物
ルシフェラーゼレポーターをｐＧＬ３−ｂａｓｉｃから除去しかつＫｐｎＩおよびＸｂａＩ制限部位でＺｓＧｒｅｅｎレポーター（ｐＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｎ１プラスミドから）により置換した。
【００５２】
ＨＳＶ−ＴＫ最小プロモーター（単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ基礎プロモーター）をＰＣＲにより得、ｐＴＫ Ｌｕｃプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＃６２５２−１）を鋳型として使用した。ｐＴＫ Ｌｕｃプラスミドのマルチクローニング部位と一緒にＨＳＶ−ＴＫ最小プロモーターを増幅するようにプライマーを設計した。増幅は、鋳型としてのプラスミドとともにオリゴヌクレオチド対ＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＣＧＣＧＴＧ（配列番号１１）およびＧＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣ（配列番号１２）を使用して５８℃のアニーリング温度で３０周期の間実施した。Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ系はＲｏｃｈｅにより提供された。オリゴヌクレオチド中に存在する制限部位ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩ（下線を付けた配列）をサブクローニングに使用した。ＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩ部位でのｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｎ１中への上で挙げられた１９７ｂｐのＰＣＲフラグメントの挿入を介して、構築物ＴＫ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎを構築した。全部の制限酵素はＲｏｃｈｅ（ドイツ）により提供される。
【００５３】
ｐ５３応答配列をその後、ＴＫ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎベクターのＳａｃＩ／ＸｈｏＩクローニング部位にＴＫプロモーターの前にクローン化して、構築物ｐ５３ＲＥ＿ＴＫ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ（図６）を得た。
【００５４】
安定なトランスフェクション
Ａ２７８０細胞およびＨＣＴ１１６細胞を４×１０５細胞の密度で６ウェルプレートにプレーティングし、２４時間インキュベートし、そして製造元により記述されたとおりリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）およびプラス試薬（Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ベルギー・ブリュッセル）を使用することにより２μｇのｐ５３ＲＥ＿ＴＫ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎおよび０．２μｇのｐＭＣ１−ｎｅｏ−Ｐｏｌｙ Ａベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、メリーランド州ゲイサーズバーグ）で１６日間選択し、そして単一細胞懸濁液を増殖させた。３週後に６０個の単一クローンをトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞から得、また、４０個の単一クローンをトランスフェクトしたＡ２７８０細胞から得た。
【００５５】
ｐ５３ＲＥ＿ｔｋ活性の誘導
Ａ２７８０およびＨＣＴ１１６のトランスフェクトしたプールおよび選択したクローンを拡大し、そしてウェルあたり２００００細胞で９６ウェルプレートに接種した。接種２４時間後に、細胞をＤＮＡ損傷剤（ｐ５３応答配列に影響を及ぼす）で追加の２４時間処理した。ＺｓＧｒｅｅｎ産生および従って蛍光に至るｐ５３ＲＥ＿ｔｋの活性化を、Ａｓｃｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、ベルギー・ブリュッセル）および蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）によりモニターした。
【００５６】
結果
ＤＮＡ損傷剤によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのｐ５３ＲＥ＿ｔｋの誘導
ＨＣＴ１１６およびＡ２７８０の安定なトランスフェクトしたプールおよび選択したクローンをアクチノマイシンＤ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。選択したクローンのうち、６個のＨＣＴ１１６クローンおよび２個のＡ２７８０クローンがアクチノマイシンＤ処理に応答した。これら８クローンについて、蛍光の最低２倍の誘導が処理に応答してＦｌｕｏｒｏｓｋａｎで検出可能であった。とりわけ、Ａ２７８０のクローン３６ならびにＨＣＴ１１６のクローン５および３６は、アクチノマイシン処理に応答しての強い誘導係数を伴う、検出可能な低い基礎蛍光発現を示した（図３）。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１Ａ】クローン１のＤＮＡ損傷剤およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）に対するｐ２１プロモーターの用量応答。細胞を、指定された化合物、すなわちＤＮＡ損傷剤カンプトテシン（ｃａｍｐ．）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏ）およびドキソルビシン（ｄｏｘ）ならびにＨＤＡＣｉ化合物ＴＳＡ、Ｍｉｔｓｕｉ、化合物ＸおよびＳＡＨＡで２４時間処理する。材料および方法に記述されるとおりＡｓｃｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎを使用して蛍光を測定した。誘導の倍数は、ＤＭＳＯ処理した細胞の蛍光により除算した誘導後の蛍光として計算した。クローン１は、１０−７ＭのＴＳＡでの処理後５倍の誘導；１０−６ＭのＭｉｔｓｕｉに対し２倍の誘導および１０−６Ｍの化合物Ｘに対し３倍の誘導を示した。
【図１Ｂ】クローン５のＤＮＡ損傷剤およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）に対するｐ２１プロモーター構築物の用量応答。細胞を、指定された化合物、すなわちＤＮＡ損傷剤カンプトテシン（ｃａｍｐ．）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏ）およびドキソルビシン（ｄｏｘ）ならびにＨＤＡＣｉ化合物ＴＳＡ、Ｍｉｔｓｕｉ、ＪＮＪ９９（Ｃｏｍｐ．Ｘ）およびＳＡＨＡで２４時間処理する。材料および方法に記述されるとおりＦｌｕｏｒｏｓｋａｎを使用して蛍光を測定した。誘導の倍数は、ＤＭＳＯ処理した細胞の蛍光により除算した誘導後の蛍光として計算した。クローン５は、１０−７ＭのＴＳＡでの処理後５倍の誘導；１０−６ＭのＭｉｔｓｕｉに対し２倍の誘導および１０−６Ｍの化合物Ｘに対し４倍の誘導を示した。
【図２】異種移植片の蛍光のｉｎ ｖｉｖｏ可視化。クローン１をヌードマウスの脇腹に皮下注入した（１０７細胞／２００μｌ）。第１２日以降、溶媒、Ｍｉｔｓｕｉ（２０ｍｐｋ）若しくは化合物Ｘ（４０ｍｐｋ）を６日間毎日動物に投与した。生存マウス中の腫瘍を、社内で開発した自動全身画像化系蛍光について評価し、そして蛍光強度を比較した。ＺｓＧｒｅｅｎの誘導は第一の用量の投与３日後に非常に明瞭であり、そして処置の開始５日後にプラトーに達した。
【図３】Ａ２７８０およびＨＣＴ１１６クローンにおけるＤＮＡ損傷剤アクチノマイシンＤに対するｐ５３ＲＥプロモーター構築物の応答。細胞をアクチノマイシンＤで２４時間処理する。蛍光を、実施例２に記述されるとおりＦｌｕｏｒｏｓｋａｎを使用して測定した。誘導の倍数は、ＤＭＳＯ処理した細胞の蛍光により除算した誘導後の蛍光として計算した。Ａ２７８０クローン３６は１０ｎｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤでの処理後２倍の誘導を示し；２ないしほぼ４倍の誘導がＨＣＴ１１６クローンで観察された。
【図４】ｐ２１ｗａｆ，ｃｉｐ１プロモーター−ＺｓＧｒｅｅｎモデルはＨＤＡＣ阻害剤の生物学的効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測する。ｐＧｌ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００でトランスフェクトしたＡ２７８０卵巣癌細胞のクローン５を、指定された濃度のＨＤＡＣ阻害剤ＳＡＨＡ（＊）、ＭＳ−２７５（Δ）、ＬＡＱ−８２４（ ）およびＴＳＡ（●）若しくは溶媒（０．１％ＤＭＳＯ）で２４時間処理した。図４Ａはｐ２１ ＥＬＩＳＡを使用して測定されたところのクローン５のｐ２１タンパク質誘導を示す。図４ＢはＡｓｃｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎを使用して測定されたところのクローン５中で誘導された蛍光を表す。ｐ２１の誘導パターンは、ｐ２１応答性のＺｓＧｒｅｅｎ発現ベクターｐＧｌ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００の誘導パターンと同一である。
【図５】ｐ２１ｗａｆ，ｃｉｐ１プロモーター−ＺｓＧｒｅｅｎモデルは個別のマウスでのＭＳ−２７５の抗腫瘍効果をｉｎ ｖｉｖｏで予測する。ヌードマウスに、ヒトＡ２７８０ｐ２１ｗａｆ，ｃｉｐ１ＺｓＧｒｅｅｎ卵巣癌細胞（１０７細胞／マウス）を皮下に注入し、そして第４日からその後、ベヒクル（対照群、２０％ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）若しくは指定された用量のＭＳ−２７５（ＱＤ）で経口で処置した。自動全身画像化系を使用して個々の腫瘍の腫瘍重量および蛍光を第２８日に評価した。
【図６】５３ＲＥ＿ＴＫ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ発現ベクター
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍性増殖、とりわけ癌性増殖のための動物モデルに関する。具体的には、該動物モデルは、製薬学的活性化合物のｉｎ ｖｉｖｏでの同定を可能にし、腫瘍退縮、腫瘍増殖の安定化若しくは転移の阻害と関連するタンパク質の発現もまた制御するプロモーターに機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含んでなる発現ベクターで安定にトランスフェクトされた腫瘍細胞の使用を含んでなる。
【背景技術】
【０００２】
長期の異種移植片研究を実施する必要を伴わずに、提案された新たな抗腫瘍薬の有効性を試験するための代表的な動物モデルに対する必要性が長い間存在している。潜在的な抗腫瘍薬が試験されている現在のｉｎ ｖｉｖｏモデルは、腫瘍細胞をヒト以外の動物に移植すること、該動物を提案された新たな抗腫瘍薬で処置すること、およびその後該動物をモニターして腫瘍の増殖に対する処置の効果を決定することを必要とする。宿主細胞の背景に対する腫瘍細胞の可視化を補助するために、多くのｉｎ ｖｉｖｏモデルは、生物発光分子のルシフェラーゼ族およびエクオリン族のようなレポーター遺伝子で安定にトランスフェクトされた腫瘍細胞を使用する。
【０００３】
抗腫瘍薬の開発におけるこれらのｉｎ ｖｉｖｏモデルの主要な欠点は制限された処理量である。すなわち、多数の動物および大量の提案された抗腫瘍性化合物が必要とされる。さらに、これらのｉｎ ｖｉｖｏモデルは、移植した腫瘍が動物中で増殖するのに十分な時間を必要とするために時間がかかる。従って、改良されたモデルが最近、特許文献１にてＬａｓｓｏｔａ Ｐ．により提案された。このモデルにおいて、抗腫瘍薬により活性化されるレポーター遺伝子をもつ腫瘍細胞を、ヒト以外の動物に移植されかつ試験されるべき化合物への該動物の曝露後に除去される生物適合性の半透性被包化装置中で増殖させる。しかしながら、該腫瘍細胞の人工的環境を鑑みれば、該腫瘍細胞の応答が、循環に入り、腫瘍組織に浸潤しそしてその生物学的効果を発揮することを化合物が必要とするｉｎ ｖｉｖｏの状況を正確に模倣するかどうかは疑問である。
【０００４】
これゆえに、上で挙げられた欠点を伴わないヒトの腫瘍性疾患の動物モデルに対する必要性を実現させるために、本発明は、提案された抗腫瘍性化合物の薬理学的活性をｉｎ ｖｉｖｏで正確に模倣する能力を有する新規動物モデルを開示する。化合物の抗腫瘍活性をモニターすることを可能にしかつ腫瘍退縮と関連するタンパク質の発現もまた制御するプロモーターに機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含有する発現ベクターでトランスフェクトされた安定に形質転換された腫瘍細胞の使用を含んでなるモデル。所望の動物モデルを提供するために、細胞は；
−動物に移植若しくは注入される場合に腫瘍を形成する能力を保持する；
−腫瘍退縮と関連するタンパク質の内因性応答と一致するシグナルを発生する；
−ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物物質の速度効果のリアルタイム分析を可能にするような良好なＳ／Ｎ比をもつシグナルを発生する；
−動物間の低い変動性を提供するような良好な再現性を伴うシグナルを発生する；および−誘導された応答の非侵襲的画像化を可能にするシグナルを発生する
べきである。
【特許文献１】２００２年７月１８日に第ＷＯ ０２／０５５７４２号明細書として公開された国際特許出願（第ＰＣＴ／ＥＰ０２／００１０６号明細書）
【発明の開示】
【０００５】
［発明の要約］
第一の態様において、本発明は、ヒト以外の動物に移植若しくは注入される場合に腫瘍を形成することが可能であることを特徴とする、腫瘍退縮と関連するタンパク質の発現もまた制御するプロモーターに機能しうるように連結されたレポーター遺伝子、好ましくは蛍光タンパク質を含有する発現ベクターで安定にトランスフェクトされた腫瘍細胞株を提供する。
【０００６】
伝統的なｉｎ ｖｉｖｏモデルに比較して、本発明は、レポーター遺伝子が構成的に発現されないがいしかし腫瘍退縮と関連するタンパク質若しくは酵素の発現をもたらす試験化合物への曝露後にのみ発現されるために異なる。試験されるべき化合物が循環中に入りかつ腫瘍に浸潤した場合にのみ、それはレポーターシグナルを発生させうるが、但し、それは腫瘍退縮と関連するタンパク質の発現を促進し、また、前記タンパク質のプロモーターは該レポーター遺伝子に機能しうるように連結されている。
【０００７】
該モデルは、提案された抗腫瘍性化合物のｉｎ ｖｉｖｏの製薬学的活性を試験するためのターンオーバー時間が短縮されるため、従来のｉｎ ｖｉｖｏモデルを上回り高度に有利である。従来のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいては、結果を得るのに典型的に４ないし５週かかり、本モデルにおいては、腫瘍がヒト以外の動物中で一旦形成されれば試験化合物の効果を一両日中に知ることが可能である。さらに、蛍光シグナルの輝度および再現性を鑑みれば、腫瘍は皮膚を通して見ることができかつ自動全身画像化系を使用して測定し得る。結果として、統計学的に有意の効果を得るためにより少数の動物が必要とされる。本動物モデルのさらなる一利点は、感度、および広範な濃度範囲内の試験化合物の蛍光シグナルの応答性である。この組合せは、試験化合物のｉｎ ｖｉｖｏ活性について動態のリアルタイム解析を実施しかつ観察されるところの腫瘍重量の変化と組合される場合に試験化合物の抗腫瘍効果を予測することを可能にする。特徴のこの組合せは、制限された量の試験化合物の投与後の非侵襲的画像化を可能にして（３０日という伝統的な期間の代わりに４日）、実験時間および従って試験化合物の低減、ならびに犠牲になる動物および動物施設の占有の減少につながる。
【０００８】
特定の一実施態様において、プロモーターはｐ２１プロモーターよりなる。ｐ２１タンパク質はサイクリン依存性のキナーゼ活性の阻害剤として作用しそして細胞周期の進行を効果的に停止する。ＤＮＡ損傷剤、およびそれぞれｐ５３応答配列（ＴＡＴＡボックスに関して−４５００ｂｐないし−１３００ｂｐの領域に位置する）若しくはｓｐ１部位（ＴＡＴＡボックスに関して−６０ｂｐないし＋４０ｂｐの領域に位置する）によりｐ２１プロモーターを活性化するヒストンデアセチラーゼ阻害剤を包含する多種多様な抗腫瘍薬がｐ２１プロモーターを活性化し、そしてｐ２１タンパク質の増大した発現をもたらすことが示されている。本発明の特定の一実施態様において、ｐ２１プロモーターは、ｐ５３応答配列を含まずかつ従ってＤＮＡ損傷剤に対し非応答性であることを特徴とするｐ２１の１３００ｂｐのプロモーターフラグメントよりなる。別の実施態様において、ｐ２１プロモーターはｐ５３応答配列を含んでなるｐ２１プロモーターよりなり、前記ｐ２１プロモーターはＤＮＡ損傷剤に応答性である。あるいは、ＤＮＡ損傷剤に応答性のプロモーターは、少なくとも１個のｐ５３応答配列を含んでなる単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ基礎プロモーター（ＨＳＶ−ＴＫ）のような最小プロモーターよりなる。従って、使用されるプロモーターに基づき、本発明は、ＤＮＡ損傷剤および／若しくはヒストンデアセチラーゼ阻害剤のいずれかのｉｎ ｖｉｖｏでの薬理学的効果に対して選択的なモデルを提供する。または、一般に、目的の腫瘍性剤に依存して、代替の応答配列を使用し得る。
【０００９】
−本発明の腫瘍細胞を試験されるべき化合物と接触させる段階；および
−レポーター遺伝子の発現を測定する段階
を含んでなる、抗腫瘍活性についての化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング方法を提供することもまた本発明の一目的であり；
ここで、対照レベルに比較してのレポーター遺伝子発現の増大が該化合物を抗腫瘍活性を有すると同定する。特定の一実施態様において、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質であり、そしてレポーター遺伝子の発現は発射される蛍光の量として測定される。上に説明されたとおり、本ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法についてもまた、使用されるプロモーターに依存してスクリーニングの選択性を変えることが可能である。本発明の特定の一実施態様において、該ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング法はヒストンデアセチラーゼ阻害剤に対し選択的であり、そして、ｐ２１の１３００ｂｐのプロモーターフラグメントがｐ５３応答配列を含まないことを特徴とする前記プロモーターフラグメントを含んでなる発現ベクターで安定にトランスフェクトされた腫瘍細胞を含んでなる。さらなる一実施態様において、該ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング法は例えばアクチノマイシンＤのようなＤＮＡ損傷剤に対し選択的であり、そして最低１個のｐ５３応答配列を含んでなる発現ベクターで安定にトランスフェクトされた腫瘍細胞を含んでなる。ある実施態様において、発現ベクターは、好ましくはＨＳＶ−ＴＫプロモーターのような最小プロモーターの一部として配列番号１０よりなるｐ５３応答配列を含んでなる。
【００１０】
さらなる一実施態様において、本発明は化合物の製薬学的活性をスクリーニングするためのヒト以外の動物を提供し、前記動物は本発明の安定に形質転換された腫瘍細胞を含んでなる。前記腫瘍細胞は、皮下モデルを提供するためにヒト以外の動物の皮下に、同所モデルを提供するために腫瘍起源の器官（例えば肺中の肺癌細胞）中に、腹膜モデルを提供するためにヒト以外の動物の腹腔中に、若しくは転移モデルを提供するためにヒト以外の動物の血管に外科的に移植若しくは腫瘍細胞懸濁液として注入し得る。好ましい実施態様において、腫瘍細胞は皮下モデルを提供するために皮下に注入される。
【００１１】
従って、
−本発明の腫瘍細胞をヒト以外の動物において腫瘍を形成するのに十分な量で前記ヒト以外の動物に投与する段階；
−前記ヒト以外の動物中で腫瘍を形成するのに十分な時間を腫瘍細胞に与える段階；
−もしかすると活性のある化合物を前記ヒト以外の動物に投与する段階；および
−レポーター遺伝子の発現を測定することにより腫瘍細胞に対する前記化合物の効果を評価する段階
を含んでなる、製薬学的活性についての化合物のスクリーニング方法を提供することが本発明の一目的である。製薬学的活性化合物とのインキュベーションは対照レベルに比較してレポーター遺伝子発現の増大をもたらすことができる。
【００１２】
これおよび本発明のさらなる態様は下により詳細に論考されるであろう。
［発明の詳細な記述］
ベクター
本発明は、発現レベルが生理学的状態と関連するタンパク質若しくは酵素の発現もまた制御するプロモーターに機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含んでなるベクターに関する。
【００１３】
本明細書で使用されるところの機能しうるように連結されたは、プロモーターを該プロモーターの制御下に遺伝子を発現するように正しいフレームで該遺伝子と機能可能に融合することを意味している。本明細書で使用されるところの「レポーター遺伝子」という用語は、単純で安価な方法若しくは試薬を使用して同定し得かつプロモーター領域若しくはその活性フラグメントに機能しうるように連結し得る遺伝子産物をコードする遺伝子を意味している。例えばホタルルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ若しくは蛍光タンパク質レポーター遺伝子のようなレポーター遺伝子を、転写活性を測定するために本発明のスクリーニングアッセイで使用し得る（例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（編）、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、Ｖｏｌ．１８５、サンディエゴ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９０）を参照されたい；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記もまた参照されたい）。好ましい一実施態様において、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質、とりわけＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＧｃＲｅｄよりなる群から選択される蛍光タンパク質、またはｐＤｓＲｅｄ、ｐＨｃＲｅｄ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ若しくはｐｄ２ＥＹＦＰのような不安定化蛍光タンパク質である。本発明の特定の一実施態様において、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質ＺｓＧｒｅｅｎである。前記レポーター分子およびその遺伝子配列は当該技術分野で既知でありかつＣｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州サンディエゴにより販売される蛍光タンパク質のように商業的に入手可能である。
【００１４】
例えば核酸構築物の製造、突然変異誘発、シークェンシング、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現における核酸の操作、ならびにタンパク質の分析の技術およびプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９９７に詳細に記述されている。
【００１５】
本発明のベクターはｐＣＡＴ３、ｐＧＬ２、ｐＧＬ３若しくはｐＳＶ−β−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅのような商業的に入手可能なベクターから選択若しくは構築し得、そして、典型的には適切な制御配列、ならびに１個若しくはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合のアンピシリン耐性遺伝子若しくは哺乳動物ベクターのためのネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。下に例示されるとおり、本発明の一実施態様において、ベクターはｐＧＬ３ ｂａｓｉｃベクターから構築する。前記ベクター配列は当該技術分野で既知でありかつＰｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソンにより販売されるｐＧＬ３ ｂａｓｉｃベクターのように商業的に入手可能である。とりわけ、本発明のベクターは、該発現ベクターが設計される宿主細胞と適合性のみならずしかしまたそれぞれの宿主細胞中で所望の生理学的効果を有することが既知のタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよび小分子を包含する化合物にも応答性のプロモーター配列を制御配列の１つとして含有する。従って、本発明の発現ベクター中のプロモーター配列は、それが、連結されたレポーター遺伝子の発現を調節しかつ転写因子の結合若しくは遊離により活性化されることを特徴とする応答配列としてもまた知られる最低１個の制御配列要素を含んでなり、ここで、前記転写因子の存在若しくは非存在は宿主細胞の所望の生理学的条件と相関する。例えば、所望の生理学的条件が宿主細胞中での細胞周期の停止および分化を誘導することよりなる場合、該プロモーター配列は、転写因子Ｓｐ１およびＳｐ３のようなｐ２１活性化因子ならびにステロイドホルモン、神経成長因子、腫瘍壊死因子−α、ホルボールエステル、ホスファターゼ阻害剤、インターフェロンγおよびＳｍａｄ腫瘍サプレッサータンパク質のような細胞周期の停止および細胞分化の他の誘発因子への曝露に際して活性化されることが既知であるｐ２１ＷＡＦ−１／Ｃｉｐ１プロモーターの近接部分で見出されるＧＣリッチモチーフを含みうる。
【００１６】
従って、本明細書で使用されるところのプロモーターは、発現レベルが所望の生理学的条件に依存するタンパク質の発現もまた制御するｐ２１ＷＡＦ−１／Ｃｉｐ１プロモーターのような天然に存在するプロモーター、若しくは下の実施例に記述されるところのｐ２１の１３００ｂｐのプロモーターフラグメントのようなプロモーター活性を有するそのフラグメントのいずれかでありうる。特定の一実施態様において、プロモーター配列は、最小インターロイキン６（ＩＬ６）プロモーター（ｐｈｕ．ＩＬ６Ｐｌｕｃ＋ Ｐｌａｉｓａｎｃｅら（１９９７）ＭＣＢ １７、３７３３−３７４３）、最小Ｅ１Ｂプロモーター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから商業的に入手可能なｐＭＣＳｌｕｃ）、若しくはルシフェラーゼの商業的に入手可能なＴＫプロモーター（ｐＴＫｌｕｃ Ｐｒｏｍｅｇａ）のような最小プロモーター要素に機能しうるように連結されたｐ５３応答配列のような前述の制御配列要素の１つを含んでなる組換えＤＮＡ構築物よりなり、好ましくは、該プロモーター
は下述されるところのｐ２１の１３００ｂｐのプロモーターフラグメント若しくは下述されるところのｐ５３応答配列を含んでなるＨＳＶ−ＴＫ最小プロモーターよりなる。別の実施態様において、プロモーター配列は、腫瘍退縮と関連するタンパク質の発現もまた制御するプロモーター若しくはプロモーター活性を有するそのフラグメントであることができる。
【００１７】
標的細胞
別の態様において、本発明は、発現レベルが生理学的条件と関連するタンパク質若しくは酵素の発現もまた制御するプロモーターに機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含んでなる発現ベクターで安定に形質転換された標的細胞に関する。
【００１８】
上述されたところのベクター構築物は、好ましくはリポソーム、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔法および遺伝子銃の使用のような標準的なトランスフェクション法を使用するトランスフェクション若しくは形質導入のようないずれかの既知の方法によって標的細胞に導入し得る。
【００１９】
腫瘍性増殖、とりわけ癌性増殖のためのヒト以外の動物モデルを提供することが本発明のさらなる一態様であるため、本発明のベクターを、ヒト以外の動物に移植若しくは注入される場合に腫瘍を形成することが可能な標的細胞に導入することができる。適する細胞株の例は、黒色腫、肺癌株、腎癌株、結腸癌株、前立腺癌株、卵巣癌株、乳癌株、中枢神経系腫瘍株、白血病細胞株などを包含する。一実施態様において、標的細胞は卵巣癌細胞株、とりわけＡ２７８０（ＥＣＡＣＣ番号９３１１２５２０）よりなり、別の実施態様において、標的細胞は結腸直腸癌細胞株、とりわけＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４７）よりなる。さらなる標的細胞は、多様な哺乳動物細胞株、とりわけヒト細胞株を包含する多様な細胞株から選択し得る。本明細書で使用されるところの標的細胞は、ネオマイシンのような選択マーカー、メチオニナーゼのような治療的タンパク質若しくはレポーター遺伝子産物のための発現系で既に形質転換されている前述の細胞のいずれかを包含することに注目すべきである。例えば、本発明の代替の一実施態様において、ヒト以外の動物に投与される場合に腫瘍を形成することが可能な標的細胞はホタルルシフェラーゼ若しくは蛍光タンパク質（上を参照されたい）のようなレポータータンパク質をコードする発現系で既に形質転換されている。これらの細胞を本発明のベクターで形質転換してよいが、但し、発光タンパク質すなわち基礎色を提供するレポーター遺伝子および誘導可能な色を提供する本発明のベクターの放射波長は相互に重ならない。可能な組合せは、とりわけ、高められた蛍光タンパク質ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰおよびＥＹＦＰを伴うＤｓＲｅｄ；ＤｓＲｅｄを伴うＺｓＧｒｅｅｎ；ＥＹＦＰを伴うＥＧＦＰ；ＥＢＦＰを伴うＥＧＦＰ；ＥＹＦＰを伴うＥＢＦＰ；若しくはＥＹＦＰを伴うＥＣＦＰを包含する。本発明のベクターで一旦形質転換されれば、これらの細胞は、例えば、投与された腫瘍細胞が、試験化合物の抗腫瘍活性を研究するための本明細書に記述される誘導可能な系と組合せで前記ヒト以外の動物中で腫瘍を形成するのに十分な時間を有した場合に、腫瘍全体の効率的な検出を確立することを可能にする。とりわけ、試験されるべき化合物が受動拡散および／若しくは血管新生を介して腫瘍に進入するかどうかを研究するため。いずれの場合も、標的細胞の選択は検討されるべき生理学的条件に依存するであろう。あるいは、本発明の発現ベクターは有意性に達するための良好な誘導因子でのレポーター遺伝子の低いがしかし検出可能な基礎発現を有する。本実施態様において、投与された腫瘍細胞が前記ヒト以外の動物中で腫瘍を形成するのに十分な時間を有した場合に確立するのに低い基礎発現を使用し得る。これゆえに標的細胞の二重トランスフェクションは必要とされない。この有利な実施態様は本発明のベクターがレポーター遺伝子としてＺｓＧｒｅｅｎを含んでなる場合に生じた。
【００２０】
従って、腫瘍退縮と関連するタンパク質の発現もまた制御するプロモーターに機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含有する発現ベクターでトランスフェクトされて
いる安定に形質転換された腫瘍細胞株を提供することが、本発明の一目的である。とりわけ、ｐ２１活性化因子に応答性であるプロモーターに機能しうるように連結された蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含んでなる、安定に形質転換された卵巣癌細胞株、好ましくはＡ２７８０細胞、好ましくは、前記プロモーターは１３００ｂｐのｐ２１プロモーター配列（配列番号１）を含んでなり、なおより好ましくは、前記プロモーター配列は１３００ｂｐのｐ２１プロモーター配列（配列番号１）よりなる。ここで、さらなる一実施態様において、蛍光タンパク質は、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＨｃＲｅｄ、またはｐＤｓＲｅｄ、ｐＨｃＲｅｄ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ若しくはｐｄ２ＥＹＦＰのような不安定化蛍光タンパク質よりなる群から選択され、そして特定の一実施態様において蛍光タンパク質はＺｓＧｒｅｅｎよりなる。好ましい一実施態様において、安定に形質転換された細胞は、それぞれの受託番号ＬＭＢＰ ５９５８ＣＢおよびＬＭＢＰ ５９５９ＣＢをもつｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００−クローン１およびｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００−クローン２として２００３年１月２０日にベルギーの微生物協調収集物（Ｂｅｌｇｉａｎ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）（ＢＣＣＭ）に寄託されたクローンから選択される。前記クローンは、商業的に入手可能なｐＧＬ３ベクター由来かつｐ２１活性化因子に応答性であるプロモーターに機能しうるように連結されたＺｓＧｒｅｅｎをコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含んでなり、前記プロモーターは１３００ｂｐのｐ２１プロモーター配列（配列番号１）を含んでなり、ここで前記クローンは、それらがＭｉｔｓｕｉ（別名ＭＳ−２７５−Ｓｈｅｒｉｎｇ−登録番号２０９７８３−８０−２）のような細胞周期の停止および細胞分化の既知の誘発因子での誘導に際して自動全身画像化系による蛍光の検出を可能にする低い基礎蛍光発現を有することを特徴とする。
これらの特徴、すなわち
−ヒト以外の動物に移植若しくは注入される場合に腫瘍を形成する能力、
−低い基礎蛍光、
−細胞周期の停止および細胞分化の既知の誘発因子への曝露に際して特定の様式で誘導可能である蛍光、ならびに
−非侵襲的な全身画像化技術を使用してあるレベルまで検出可能なこと
を鑑みれば、前記クローンは、提案された抗腫瘍性化合物のｉｎ ｖｉｖｏ製薬学的活性を研究するための重要なツールを提供する。伝統的なｉｎ ｖｉｖｏモデルに比較して、ヒト以外の動物、とりわけウサギ、モルモット、マウス、ラットおよびイヌ、好ましくはげっ歯類のような実験動物でのこれらの細胞の使用は、時間および化合物を消費する薬物動態（ＰＫ）および薬動力学（ＰＤ）研究を実施することなく薬物発見過程のより早い時点で化合物が評価されることを可能にする。
【００２１】
代替の一実施態様において、該細胞株は、最小インターロイキン６（ＩＬ６）プロモーター（ｐｈｕ．ＩＬ６Ｐｌｕｃ＋ Ｐｌａｉｓａｎｃｅら（１９９７）ＭＣＢ １７、３７３３−３７４３）、最小Ｅ１Ｂプロモーター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから商業的に入手可能なｐＭＣＳｌｕｃ）、若しくはルシフェラーゼの商業的に入手可能なＴＫプロモーター（ｐＴＫｌｕｃ Ｐｒｏｍｅｇａ）のような最小プロモーター要素に機能しうるように連結されたｐ５３応答配列のような前述の制御配列要素の１つを含んでなる組換えＤＮＡ構築物よりなるプロモーター配列を含んでなる発現ベクターで形質転換される。とりわけ、ｐ５３活性化因子に応答性であるプロモーターに機能しうるように連結された蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含んでなる安定に形質転換された結腸直腸癌細胞株若しくは卵巣癌細胞株、好ましくはＨＣＴ１１６細胞若しくはＡ２７８０細胞、好ましくは、前記プロモーターはｐ５３応答配列（配列番号１０）を含んでなり、より好ましくは、前記プロモーターは、ｐ５３応答配列（配列番号１０）を含んでなる最小ＨＳＶ−ＴＫプロモーターよりなり、なおより好ましくは、ｐ５３応答性のＨＳＶ−ＴＫプロモーター配列（配列番号１３）よりなる。ここで、さらなる一実施態様において、蛍光タンパク質はＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＨｃＲｅｄ、またはｐＤｓＲｅｄ、ｐＨｃＲｅｄ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ若しくはｐｄ２ＥＹＦＰのような不安定化蛍光タンパク質よりなる群から選択され、そして特定の一実施態様において蛍光タンパク質はＺｓＧｒｅｅｎよりなる。特定の一実施態様において、安定に形質転換された細胞は、商業的に入手可能なｐＧＬ３ベクター由来かつｐ５３活性化因子に応答性であるプロモーターに機能しうるように連結されたＺｓＧｒｅｅｎをコードする核酸配列を含有するｐ５３ＲＥ＿ＴＫ／ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎベクター（図）でトランスフェクトしたＡ２７８０若しくはＨＣＴ１１６細胞よりなり、前記プロモーターはｐ５３応答性のＨＳＶ−ＴＫプロモーター配列（配列番号１４）を含んでなり、ここで前記クローンは、それらがＤＮＡ損傷剤への曝露、低酸素、ヌクレオチド枯渇若しくは発癌活性化のようなｐ５３の活性化因子での誘導に際して自動全身画像化系による蛍光の検出を可能にする低い基礎蛍光発現を有することを特徴とする。これらの特徴、すなわち
−ヒト以外の動物に移植若しくは注入される場合に腫瘍を形成する能力、
−低い基礎蛍光、
−細胞周期の停止および細胞分化の既知の誘発因子への曝露に際して特定の方法で誘導可能である蛍光、ならびに
−非侵襲的な全身画像化技術を使用してあるレベルまで検出可能であること、
を鑑みれば、前記クローンは、提案された抗腫瘍性化合物のｉｎ ｖｉｖｏ製薬学的活性を研究するための重要なツールを提供する。伝統的なｉｎ ｖｉｖｏモデルに比較して、ヒト以外の動物、とりわけウサギ、モルモット、マウス、ラットおよびイヌ、好ましくはげっ歯類のような実験動物でのこれらの細胞の使用は、時間および化合物を消費する薬物動態（ＰＫ）および薬動力学（ＰＤ）研究を実施することなく、薬物発見過程のより早い時点で化合物が評価されることを可能にする。
【００２２】
従って、さらなる一実施態様において、本発明は、最小プロモーター要素が腫瘍退縮と関連する化合物に応答することを特徴とする、該プロモーター配列に機能しうるように連結された制御配列要素を含んでなる組換えＤＮＡ構築物よりなるプロモーター配列に機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含有する発現ベクターでトランスフェクトされている安定に形質転換された腫瘍細胞株を提供する。本明細書で使用されるところの化合物はタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチドおよび小分子を包含する。
【００２３】
アッセイ
本発明の安定に形質転換された細胞を試験されるべき化合物と接触させること；およびレポーター遺伝子の発現を測定するを含んでなる、製薬学的活性化合物を同定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングアッセイでの上で挙げられた細胞株の使用を提供することもまた本発明の一目的である。本明細書で使用されるところの製薬学的活性化合物は、発現ベクター中に存在するプロモーター配列を活性化することが可能な化合物を指す。
【００２４】
抗腫瘍活性をもつ化合物を同定するための特定の実施態様において、前述のスクリーニング方法における安定に形質転換された細胞は、腫瘍退縮と関連する化合物に応答性であるプロモーター配列に機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含有する発現ベクターを含んでなる。従って；本発明の安定に形質転換された腫瘍細胞を試験されるべき化合物と接触させること、およびレポーター遺伝子の発現を測定するを含んでなる、抗腫瘍活性をもつ化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ同定方法を提供することが本発明の一目的である。
【００２５】
前述のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング法の好ましい一実施態様において、安定に形質転換された腫瘍細胞は、ｐ２１活性化因子に応答性であるプロモーターに機能しうるように連結された蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含んでなる安定に形質転換された卵巣癌細胞、好ましくはＡ２７８０細胞よりなり、好ましくは、前記プロモーターは１３００ｂｐのｐ２１プロモーター配列（配列番号１）を含んでなり、
なおより好ましくは、前記プロモーター配列は１３００ｂｐのｐ２１プロモーター配列（配列番号１）よりなる。ここで、さらなる一実施態様において、蛍光タンパク質はＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＨｃＲｅｄ、またはｐＤｓＲｅｄ、ｐＨｃＲｅｄ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ若しくはｐｄ２ＥＹＦＰのような不安定化蛍光タンパク質よりなる群から選択され、そして特定の一実施態様において蛍光タンパク質はＺｓＧｒｅｅｎ若しくはＺｓＲｅｄよりなる。より好ましい一実施態様において、該ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング法で使用される安定に形質転換された腫瘍細胞は、受託番号ＬＭＢＰ ５９５８ＣＢおよびＬＭＢＰ ５９５９ＣＢでＢＣＣＭに寄託されたクローンから選択される。前述のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング法の別の実施態様において、安定に形質転換された腫瘍細胞は、ｐ５３活性化因子に応答性であるプロモーターに機能しうるように連結された蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含んでなる安定に形質転換された結腸直腸癌細胞若しくは安定に形質転換された卵巣癌細胞、好ましくはＡ２７８０細胞若しくはＨＣＴ１１６細胞よりなり、好ましくは、前記プロモーターはｐ５３応答配列（配列番号１０）を含んでなり、なおより好ましくは、前記プロモーターはｐ５３応答配列を含んでなる最小ＨＳＶ−ＴＫプロモーター（配列番号１３）よりなる。ここで、さらなる一実施態様において、蛍光タンパク質はＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＨｃＲｅｄまたはｐＤｓＲｅｄ、ｐＨｃＲｅｄ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ若しくはｐｄ２ＥＹＦＰのような不安定化蛍光タンパク質よりなる群から選択され、そして特定の一実施態様において蛍光タンパク質はＺｓＧｒｅｅｎよりなる。特定の一実施態様において、該ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法で使用される安定に形質転換された細胞は、ｐ５３ＲＥ＿ＴＫ／ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎベクター（図６）でトランスフェクトしたＡ２７８０若しくはＨＣＴ１１６細胞よりなる。
【００２６】
前述のアッセイをハイスループットスクリーニングの目的に適合させ得ることが当業者により容易に認識されるであろう。例えば、蛍光の変化を測定することにより抗腫瘍活性を評価するアッセイは、蛍光イメージングプレート読取装置（（ＦＬＩＰＲＡ（Ｒ））、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と呼ばれる機器に基づいて設計し得る。その最も一般的な構成においてそれは蛍光化合物を励起しかつそれにより発射される蛍光を測定する。それは、フルオロフォアの高出力励起を生じさせるためのアルゴンイオンレーザー、９６／３８４ウェルプレートの底全体を迅速に走査するための光学系、および発射された蛍光を捕捉するための高感度の冷却ＣＣＤカメラを使用する。それは、該機器が試験剤の溶液を９６／３８４ウェルプレートのウェルに送達することを可能にする９６／３８４ウェル分注ヘッドもまた含有する。ＦＬＩＰＲアッセイは、化合物の添加前、間および後の細胞の集団からの蛍光シグナルを全部の９６／３８４ウェルから同時にリアルタイムで測定するよう設計されている。ＦＬＩＰＲアッセイは、本発明の安定に形質転換された腫瘍細胞中で機能的に活性の化合物についてスクリーニングしかつそれらを特徴づけるのにも使用しうる。
【００２７】
ｐ２１若しくはｐ５３活性化因子を同定するためにとりわけ有用なハイスループットスクリーニングアッセイは、本発明の発現ベクターで安定に形質転換された卵巣癌細胞、とりわけＡ２７８０細胞を試験化合物とともにインキュベートし、そして相互作用を可能にするための十分な時間（８〜２４時間、典型的には１２〜２４時間、とりわけ２４時間）の後に、ＦＬＩＰＲ若しくはＡｓｃｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、ベルギー・ブリュッセルから商業的に入手可能）のような自動蛍光プレート読取装置を使用して相対蛍光単位の変化を測定する単一段階の処置よりなり得る。
【００２８】
ヒト以外の動物モデル
本発明の標的細胞を含んでなるヒト以外の動物を提供することもまた本発明の一実施態様である。とりわけ、腫瘍性増殖、とりわけ癌性増殖についてのヒト以外の動物モデルを提供すること。
【００２９】
従って、本発明は、前記ヒト以外の動物において腫瘍の産生を遂げるのに十分な量の本発明の安定に形質転換された腫瘍細胞を前記ヒト以外の動物に投与することを含んでなる、腫瘍性増殖のヒト以外の動物モデルの製造方法を提供する。ここで、モデルとしての使用のための前記ヒト以外の動物は、好ましくは哺乳動物被験体、最も好ましくはモルモット、ウサギ、ラットおよびマウスなどのような便宜的な実験動物である。ヒト被験体へのより近密な類似のため霊長類もまた使用し得る。損なわれた免疫系を伴う被験体、典型的にはヌードマウス若しくはＳＣＩＤマウスのような、腫瘍の進行に感受性の被験体がとりわけ有用である。いかなる適切な脊椎動物被験体も使用し得、選択は主として便宜性および最終目的の系への類似性により決定される。該ヒト以外の動物モデルは、好ましくはヌードマウスのようなげっ歯類であり、また、腫瘍の産生を遂げるための細胞の量は典型的に１０６から１０８細胞までの範囲にわたる（例えば米国特許第６，２５１，３８４号明細書を参照されたい）。好ましくは、こうした投与は皮下でありかつ腫瘍は充実性の塊として形成される。
【００３０】
上で挙げられた動物モデルは抗腫瘍活性をもつ化合物のスクリーニング方法で使用し得る。好ましくは、前記ヒト以外の動物に投与される腫瘍細胞は、ｐ２１活性化因子に対し応答性であるプロモーターに機能しうるように連結された蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含んでなる安定に形質転換された卵巣癌細胞、好ましくはＡ２７８０細胞よりなり、好ましくは、前記プロモーターは１３００ｂｐのｐ２１プロモーター配列（配列番号１）を含んでなり、なおより好ましくは、前記プロモーター配列は１３００ｂｐのｐ ２１プロモーター配列（配列番号１）よりなる。ここで、さらなる一実施態様において、蛍光タンパク質はＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＨｃＲｅｄ、またはｐＤｓＲｅｄ、ｐＨｃＲｅｄ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ若しくはｐｄ２ＥＹＦＰのような不安定化蛍光タンパク質よりなる群から選択され、そして特定の一実施態様において、蛍光タンパク質はＺｓＧｒｅｅｎ若しくはＺｓＲｅｄよりなる。より好ましい一実施態様において、該ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング法で使用される安定に形質転換された腫瘍細胞は、受託番号ＬＭＢＰ ５９５８ＣＢおよびＬＭＢＰ ５９５９ＣＢでＢＣＣＭに寄託されたクローンから選択される。
【００３１】
代替の一実施態様において、該ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング法で使用される腫瘍細胞は、最小インターロイキン６（ＩＬ６）プロモーター（ｐｈｕ．ＩＬ６Ｐｌｕｃ＋ Ｐｌａｉｓａｎｃｅら（１９９７）ＭＣＢ １７、３７３３−３７４３）、最小Ｅ１Ｂプロモーター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから商業的に入手可能なｐＭＣＳｌｕｃ）、若しくはルシフェラーゼの商業的に入手可能なＴＫプロモーター（ｐＴＫｌｕｃ Ｐｒｏｍｅｇａ）のような最小プロモーター要素に機能しうるように連結されたｐ５３応答配列のような前述の制御配列要素の１つを含んでなる組換えＤＮＡ構築物よりなるプロモーター配列を含んでなる発現ベクターで形質転換されている。一実施態様において、該ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングで使用される安定に形質転換された腫瘍細胞は、ｐ５３活性化因子に応答性であるプロモーターに機能しうるように連結された蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含有する発現ベクターを含んでなる安定に形質転換された結腸直腸癌細胞若しくは安定に形質転換された卵巣癌細胞、好ましくはＡ２７８０細胞若しくはＨＣＴ１１６細胞よりなり、好ましくは、前記プロモーターはｐ５３応答配列（配列番号１０）を含んでなり、なおより好ましくは、前記プロモーターはｐ５３応答配列を含んでなる最小ＨＳＶ−ＴＫプロモーター（配列番号１３）よりなる。ここで、さらなる一実施態様において、蛍光タンパク質はＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＨｃＲｅｄ、またはｐＤｓＲｅｄ、ｐＨｃＲｅｄ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ若しくはｐｄ２ＥＹＦＰのような不安定化蛍光タンパク質よりなる群から選択され、そして特定の一実施態様において蛍光タンパク質はＺｓＧｒｅｅｎよりなる。特定の一実施態様において、該ｉｎ ｖｉｖｏの方法で使用される安定に形質転換された細胞は、ｐ５３ＲＥ＿ＴＫ／ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎベクター（図６）でトランスフェクトしたＡ２７８０若しくはＨＣＴ１１６細胞よりなる。
【００３２】
従って、さらなる一実施態様において、本発明は、本発明のｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング法において最小プロモーター要素が腫瘍退縮と関連する化合物に応答することを特徴とする、前記プロモーター配列に機能しうるように連結された制御配列要素を含んでなる組換えＤＮＡ構築物よりなるプロモーター配列に機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含有する発現ベクターでトランスフェクトされている安定に形質転換された腫瘍細胞株の使用を提供する。
【００３３】
該ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニング法で使用される場合に、前記ヒト以外の動物に投与される安定に形質転換された腫瘍細胞は、前記ヒト以外の動物において腫瘍を形成するための十分な時間を有するべきであった。腫瘍、およびとりわけキャリパーで測定可能な充実性腫瘍は、典型的には該ヒト以外の動物への安定に形質転換された腫瘍細胞の投与７〜２０日後に形成される。特定の一実施態様において、本発明のＡ２７８０形質転換細胞を使用して、およびとりわけ受託番号ＬＭＢＰ ５９５８ＣＢ若しくはＬＭＢＰ ５９５９ＣＢでＢＣＣＭに寄託された卵巣癌細胞を使用して、キャリパーで測定可能な腫瘍は細胞の注入１２日後に得られる。
【００３４】
従って、さらなる一実施態様において、本発明は；
本発明の安定に形質転換された腫瘍細胞が典型的にはヒト以外の動物の皮下に注入される１０６ないし１０８細胞を含んでなる腫瘍細胞懸濁液として投与される、本発明の腫瘍細胞をヒト以外の動物に投与する段階；および
前記ヒト以外の動物において腫瘍を形成するための十分な時間（上で概説されたところの卵巣癌細胞を使用する特定の実施態様において典型的には７〜１４日、より好ましくは９〜１２日およびとりわけ１２日よりなる）を腫瘍細胞に与える段階
を含んでなる、抗腫瘍活性をもつ化合物を同定するためのヒト以外のｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルの製造方法を提供する。
【００３５】
上で挙げられた方法に従って得ることができるヒト以外の動物モデルは；
もしかすると活性のある化合物を本発明のヒト以外の動物、好ましくは上で概説されたところの卵巣癌細胞を注入されたヌードマウスに投与する段階（ここで該もしかすると活性のある化合物は静脈内、経口および腹腔内を包含する全部の臨床上適切な投与経路により投与してよい）；ならびに
レポーター遺伝子の発現を測定することにより腫瘍細胞に対する前記もしかすると活性のある化合物の効果を評価する段階
を含んでなる、抗腫瘍活性をもつ化合物のｉｎ ｖｉｖｏ同定方法でその後使用しうる。
【００３６】
本記述を通じ、「標準的方法」、「標準的プロトコル」および「標準的手順」という用語は、分子生物学の技術の情況で使用される場合、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、編者Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９４、若しくはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．とＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー １９８９のような通常の実験室手引き書に見出されるプロトコルおよび手順として理解されるべきである。
【００３７】
本発明は後に続く実験の詳細への参照によりより良好に理解されるであろうが、しかし、当業者は、これらがその後に続く請求の範囲でより完全に記述されるところの本発明の
具体的説明にすぎないことを容易に認識するであろう。加えて、本出願を通じて多様な刊行物が引用される。これらの刊行物の開示はこれにより、本発明が属する従来技術をより完全に記述するために本出願に引用することにより組込まれる。
【実施例１】
【００３８】
材料および方法
細胞培養および試薬
Ａ２７８０細胞（ＡＴＣＣ）は、５％ＣＯ２を含む加湿インキュベータ中、３７℃で、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ）は５％ＣＯ２を含む加湿インキュベータ中、３７℃で、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびゲンタマイシンを補充したマッコイ５ａ培地中で培養した。全部の細胞培養溶液はＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（メリーランド州ゲイサーズバーグ）により提供される。他の材料はＮｕｎｃにより提供される。
【００３９】
４５００ｋｂのｐ２１プロモーターフラグメントおよび１３００ｋｂのｐ２１プロモーターフラグメントの製造
ゲノムＤＮＡを、増殖しているＡ２７８０細胞から抽出しかつｐ２１プロモーターのネステッドＰＣＲ単離の鋳型として使用した。第一の増幅は、鋳型としてのゲノムＤＮＡとともにオリゴヌクレオチド対ＧＡＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＣＴＴＧＧ（配列番号２）およびＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣ（配列番号３）を使用して５５℃のアニーリング温度で２０周期の間実施した。ＴＡＴＡボックスに関して−４５５１ないし＋８８のフラグメントを含有する、生じる４．５ｋｂのフラグメントを、４．５ｋｂのフラグメントをもたらす８８℃でのアニーリングを伴う２０周期の間オリゴヌクレオチドＴＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＣＴＴＧＧ（配列番号４）およびＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣ（配列番号５）を用い、そしてその後ＴＡＴＡボックスに関して−１３００ないし＋８８のフラグメントを含有する１．３ｋｂのフラグメントをもたらす８８℃のアニーリングを伴う２０周期の間オリゴヌクレオチド対ＴＣＧＧＧＴＡＣＣＧＧＴＡＧＡＴＧＧＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＡＣＡＣＡＴＣ（配列番号６）およびＡＴＡＣＴＣＧＡＧＴＧＣＣＧＣＣＧＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣ（配列番号７）を用いて再増幅した。オリゴヌクレオチド中に存在する制限部位ＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ（下線を付けた配列）をサブクローニングに使用した。
【００４０】
ｐ２１プロモーター構築物
ルシフェラーゼレポーターをｐＧＬ３−ｂａｓｉｃから除去しかつＫｐｎＩおよびＸｂａＩ制限部位でＺｓＧｒｅｅｎレポーター（ｐＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｎ１プラスミドから）により置換した。ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００は、ヒトｐ２１プロモーター領域の上で挙げられた１．３ｋｂのフラグメントのｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎへのＸｈｏＩおよびＫｐｎＩ部位での挿入を介して構築した。全部の制限酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ（ドイツ）により提供される。
【００４１】
一過性トランスフェクションおよび安定なトランスフェクション
Ａ２７８０細胞を２×１０５細胞の密度で６ウェルプレートにプレーティングし、２４時間インキュベートし、そして製造元により記述されたとおりリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ベルギー・ブリュッセル）を使用することにより２μｇのｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００および０．２μｇのｐＳＶ２ｎｅｏベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、メリーランド州ゲイサーズバーグ）で１０日間選択し、そして単一細胞懸濁液を増殖させた。３週後に８０個の単一クローンを得た。
【００４２】
ｐ２１プロモーター活性の誘導
Ａ２７８０のトランスフェクトしたプールおよび選択した８０クローンを拡大しそしてウェルあたり１００００細胞で９６ウェルプレートに接種した。接種２４時間後に、標的を定めた化合物（近接のｐ２１プロモーター領域中のｓｐ１部位に影響を及ぼす）若しく
はＤＮＡ損傷剤（ｐ５３応答配列に影響を及ぼす）で細胞を追加の２４時間処理した。その後細胞を４％ＰＦＡで３０分間固定し、そしてヘキスト染色で対染色した。ＺｓＧｒｅｅｎ産生および従って蛍光に至るｐ２１プロモーターの活性化を、Ａｓｃｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、ベルギー・ブリュッセル）および蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）によりモニターした。
【００４３】
ｉｎ ｖｉｖｏ評価
選択したクローンをヌードマウスの脇腹に皮下注入し（１０７細胞／２００μｌ）そしてキャリパーで測定可能な腫瘍を１２日後に得た。第１２日以降、溶媒、２０ｍｐｋのＭｉｔｓｕｉ（別名ＭＳ−２７５−Ｓｈｅｒｉｎｇ−登録番号２０９７８３−８０−２）若しくは４０ｍｐｋのＪＮＪＸ（それぞれ１０、１０および４動物）を６日間毎日動物に経口投与した。腫瘍は、社内で開発した自動全身画像化系（ＧＦＰフィルターを装備しかつＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｒ）からのＩＭＡＱ Ｖｉｓｉｏｎソフトウェアに基づくソフトウェアパッケージにより制御されるＣＣＤカメラ 型式ＪＡＩ（Ｒ）ＣＶ−Ｍ９０に接続した蛍光立体顕微鏡 型式Ｏｌｙｍｐｕｓ（Ｒ）ＳＺＸ１２）により蛍光について評価した。
【００４４】
結果
ＨＤＡＣ阻害剤によるｐ２１の１３００ｂｐのプロモーターフラグメントのｉｎ ｖｉｔｒｏでの誘導
Ａ２７８０の安定なトランスフェクトしたプールおよび選択した８０クローンを、材料および方法に記述されたとおり、ＴＳＡ（１０−７Ｍ）、ブレオマイシン（１５ｍＵ）およびＭｉｔｓｕｉ（１０−６Ｍ）で処理した。８０クローンのうち６クローンがＴＳＡおよびＭｉｔｓｕｉ処理に応答した。これらのクローンの４個は、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎで検出可能でなかったくらい低い基礎蛍光発現を示したが、しかし蛍光顕微鏡を使用するＺｓＧｒｅｅｎ産生の人的評価により選択し得た。２個の他のクローンは測定が可能であり、そしてＴＳＡ（１０−７）により５倍およびＭｉｔｓｕｉ（１０−６）により１．２〜１．５倍の誘導を示した。
【００４５】
これら６クローンをＤＮＡ損傷剤（カンプトテシン、ブレオマイシンおよびドキソルビシン）ならびにＨＤＡＣ阻害剤（ＴＳＡ、Ｍｉｔｓｕｉ、化合物ＸおよびＳａｈａ）に対する用量応答にて評価した。クローン１は１０−７のＴＳＡに応答して５倍、１０−６ＭのＭｉｔｓｕｉに対し１．８倍および１０−６ＭのＪＮＪＸに対し３倍の誘導を示した（図１）。ＤＮＡ損傷剤はｐ２１プロモーターの１３００ｂｐのフラグメントを活性化することが可能でなかった（図１）。クローン５は同一の応答を示した（図１）。クローン２、３、４および６の誘導は該系の感度の問題によりＦｌｕｏｒｏｓｋａｎにより測定し得なかったが、しかし蛍光顕微鏡を使用することにより蛍光の増大を可視化し得た（データは示されない）。
【００４６】
ＨＤＡＣ阻害剤によるｉｎ ｖｉｖｏでのｐ２１プロモーターの誘導
マウスにクローン１、２、３および５を注入し、そして材料および方法に記述されたとおり化合物（溶媒、２０ｍｐｋのＭｉｔｓｕｉ若しくは４０ｍｐｋのＪＮＪ’９９）を投与した。基礎のＺｓＧｒｅｅｎ発現および誘導は、クローン２および３において、自動全身画像化系により検出されるには低すぎた。クローン１および５の基礎蛍光は測定が可能であり、また、ＺｓＧｒｅｅｎの誘導は第一の用量の投与３日後に非常に明瞭でありかつ５日後にプラトーに達した（図２）。
【００４７】
考察
ＴＳＡ、ＭｉｔｓｕｉおよびＳＡＨＡのような数種の既知のヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ＴＡＴＡボックスに関して−６０ｂｐから＋４０ｂｐまでの領域のネズミのｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１プロモーターのトランス活性化を誘導することが示された。この領域はわれわれのｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１の１３００ｂｐのプロモーター構築物中に存在する。われわれのデータは、これらの剤がｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００でトランスフェクトしたＡ２７８０細胞中でｉｎ ｖｉｔｒｏでＺｓＧｒｅｅｎ産生
を誘導することを確認する。ＤＮＡ損傷剤（カンプトテシン、ブレオマイシンおよびドキソルビシン）はｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１プロモーターのｐ５３依存性の調節を介してそれらの活性を発揮する。ｐ５３応答配列は、ｐ２１ｗａｆ１，ｃｉｐ１プロモーター中のより下流に１３００ｂｐのプロモーターフラグメント中に存在しない領域に位置している。これはＤＮＡ損傷剤に対する該系の非応答性を説明する。これらのデータから、われわれは、われわれのレポーター系がヒストン脱アセチル化に関する分子事象を検討するためのモデルを提供しかつ該レポーター系の特異性をｉｎ ｖｉｔｒｏで明らかにすると結論する。この概念はまた、とりわけＤＮＡ損傷剤を、若しくは応答配列を適合させることによりいずれかの他の薬物を試験するのにも使用し得る。
【００４８】
化合物のｉｎ ｖｉｖｏでの作用ははるかにより複雑であり、そして該化合物が活性の形態で循環に入り、腫瘍に達するかどうか、および腫瘍内の濃度がその生物学的活性を発揮するのに十分高いかどうかを決定するための労働集約的な動物試験を必要とする。Ｍｉｔｓｕｉ化合物が腫瘍に達し得ること、および腫瘍中で達する濃度が腫瘍が増殖するのを止めるのに十分高いことが、より複雑なＰＫ／ＰＤ研究で示された。本報告において、われわれは、Ｍｉｔｓｕｉ化合物が、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００でトランスフェクトしたＡ２７８０異種移植片中で処置４日後に蛍光を誘導することを示し、該化合物がｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍に達しかつその生物学的活性を発揮することを暗示する。これは、本系がｉｎ ｖｉｖｏでの活性についての迅速かつ正確な結論を可能にする非常に強力なｉｎ ｖｉｖｏツールであることを確認し、時間および化合物を消費するＰＫ／ＰＤ研究を実施することなく薬物発見過程のより早い時点で化合物が評価されることを可能にする。
【実施例２】
【００４９】
材料および方法
細胞培養および試薬
Ａ２７８０細胞（ＡＴＣＣ）は５％ＣＯ２を含む加湿インキュベータ中、３７℃で、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびゲンタマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０培地中で培養した。ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ）は５％ＣＯ２を含む加湿インキュベータ中、３７℃で、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよびゲンタマイシンを補充したマッコイ５ａ培地中で培養した。全部の細胞培養溶液はＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（メリーランド州ゲイサーズバーグ）により提供される。他の材料はＮｕｎｃにより提供される。
【００５０】
ｐ５３応答配列の製造
以下のオリゴのｐ５３ＲＥフォワードＣＣＴＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＧＣＣＴＧＧＧＴＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＧＣＣＴＧＧＣ（配列番号８）およびｐ５３ＲＥリバースＴＣＧＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＣＡＧＧＧＴＣＧＡＣＣＣＡＧＧＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＣＡＧＧＧＡＧＣＴ（配列番号９）をＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃから注文した。該オリゴヌクレオチド対を、アニーリング緩衝液（１５０ｍＭトリス ｐＨ７．６、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２３ｍＭ ＤＴＴ）中で６５℃で開始して５０℃、４０℃、３０℃にわたり２０℃の最終温度まで５分ごとのアニーリング温度の段階的低下によりアニーリングした。クローニングのためのＳａｃＩ／ＸｈｏＩオーバーハングをもつフラグメントが形成された（応答配列は下線を付けた配列である）（配列番号１０）：
TCCCTG CCTGGACTTG CCTGGGTCGA CCCTGCCTGG ACTTGCCTGG C
CTCGAGGGAC GGACCTGAAC GGACCCAGCT GGGACGGACC TGAACGGACC GAGCTC
【００５１】
構築物
ルシフェラーゼレポーターをｐＧＬ３−ｂａｓｉｃから除去しかつＫｐｎＩおよびＸｂａＩ制限部位でＺｓＧｒｅｅｎレポーター（ｐＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｎ１プラスミドから）により置換した。
【００５２】
ＨＳＶ−ＴＫ最小プロモーター（単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼ基礎プロモーター）をＰＣＲにより得、ｐＴＫ Ｌｕｃプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ＃６２５２−１）を鋳型として使用した。ｐＴＫ Ｌｕｃプラスミドのマルチクローニング部位と一緒にＨＳＶ−ＴＫ最小プロモーターを増幅するようにプライマーを設計した。増幅は、鋳型としてのプラスミドとともにオリゴヌクレオチド対ＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＣＧＣＧＴＧ（配列番号１１）およびＧＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＣ（配列番号１２）を使用して５８℃のアニーリング温度で３０周期の間実施した。Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ系はＲｏｃｈｅにより提供された。オリゴヌクレオチド中に存在する制限部位ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩ（下線を付けた配列）をサブクローニングに使用した。ＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩ部位でのｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ１−Ｎ１中への上で挙げられた１９７ｂｐのＰＣＲフラグメントの挿入を介して、構築物ＴＫ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎを構築した。全部の制限酵素はＲｏｃｈｅ（ドイツ）により提供される。
【００５３】
ｐ５３応答配列をその後、ＴＫ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎベクターのＳａｃＩ／ＸｈｏＩクローニング部位にＴＫプロモーターの前にクローン化して、構築物ｐ５３ＲＥ＿ＴＫ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ（図６）を得た。
【００５４】
安定なトランスフェクション
Ａ２７８０細胞およびＨＣＴ１１６細胞を４×１０５細胞の密度で６ウェルプレートにプレーティングし、２４時間インキュベートし、そして製造元により記述されたとおりリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）およびプラス試薬（Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ベルギー・ブリュッセル）を使用することにより２μｇのｐ５３ＲＥ＿ＴＫ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎおよび０．２μｇのｐＭＣ１−ｎｅｏ−Ｐｏｌｙ Ａベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、メリーランド州ゲイサーズバーグ）で１６日間選択し、そして単一細胞懸濁液を増殖させた。３週後に６０個の単一クローンをトランスフェクトしたＨＣＴ１１６細胞から得、また、４０個の単一クローンをトランスフェクトしたＡ２７８０細胞から得た。
【００５５】
ｐ５３ＲＥ＿ｔｋ活性の誘導
Ａ２７８０およびＨＣＴ１１６のトランスフェクトしたプールおよび選択したクローンを拡大し、そしてウェルあたり２００００細胞で９６ウェルプレートに接種した。接種２４時間後に、細胞をＤＮＡ損傷剤（ｐ５３応答配列に影響を及ぼす）で追加の２４時間処理した。ＺｓＧｒｅｅｎ産生および従って蛍光に至るｐ５３ＲＥ＿ｔｋの活性化を、Ａｓｃｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、ベルギー・ブリュッセル）および蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）によりモニターした。
【００５６】
結果
ＤＮＡ損傷剤によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのｐ５３ＲＥ＿ｔｋの誘導
ＨＣＴ１１６およびＡ２７８０の安定なトランスフェクトしたプールおよび選択したクローンをアクチノマイシンＤ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。選択したクローンのうち、６個のＨＣＴ１１６クローンおよび２個のＡ２７８０クローンがアクチノマイシンＤ処理に応答した。これら８クローンについて、蛍光の最低２倍の誘導が処理に応答してＦｌｕｏｒｏｓｋａｎで検出可能であった。とりわけ、Ａ２７８０のクローン３６ならびにＨＣＴ１１６のクローン５および３６は、アクチノマイシン処理に応答しての強い誘導係数を伴う、検出可能な低い基礎蛍光発現を示した（図３）。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１Ａ】クローン１のＤＮＡ損傷剤およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）に対するｐ２１プロモーターの用量応答。細胞を、指定された化合物、すなわちＤＮＡ損傷剤カンプトテシン（ｃａｍｐ．）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏ）およびドキソルビシン（ｄｏｘ）ならびにＨＤＡＣｉ化合物ＴＳＡ、Ｍｉｔｓｕｉ、化合物ＸおよびＳＡＨＡで２４時間処理する。材料および方法に記述されるとおりＡｓｃｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎを使用して蛍光を測定した。誘導の倍数は、ＤＭＳＯ処理した細胞の蛍光により除算した誘導後の蛍光として計算した。クローン１は、１０−７ＭのＴＳＡでの処理後５倍の誘導；１０−６ＭのＭｉｔｓｕｉに対し２倍の誘導および１０−６Ｍの化合物Ｘに対し３倍の誘導を示した。
【図１Ｂ】クローン５のＤＮＡ損傷剤およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）に対するｐ２１プロモーター構築物の用量応答。細胞を、指定された化合物、すなわちＤＮＡ損傷剤カンプトテシン（ｃａｍｐ．）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏ）およびドキソルビシン（ｄｏｘ）ならびにＨＤＡＣｉ化合物ＴＳＡ、Ｍｉｔｓｕｉ、ＪＮＪ９９（Ｃｏｍｐ．Ｘ）およびＳＡＨＡで２４時間処理する。材料および方法に記述されるとおりＦｌｕｏｒｏｓｋａｎを使用して蛍光を測定した。誘導の倍数は、ＤＭＳＯ処理した細胞の蛍光により除算した誘導後の蛍光として計算した。クローン５は、１０−７ＭのＴＳＡでの処理後５倍の誘導；１０−６ＭのＭｉｔｓｕｉに対し２倍の誘導および１０−６Ｍの化合物Ｘに対し４倍の誘導を示した。
【図２】異種移植片の蛍光のｉｎ ｖｉｖｏ可視化。クローン１をヌードマウスの脇腹に皮下注入した（１０７細胞／２００μｌ）。第１２日以降、溶媒、Ｍｉｔｓｕｉ（２０ｍｐｋ）若しくは化合物Ｘ（４０ｍｐｋ）を６日間毎日動物に投与した。生存マウス中の腫瘍を、社内で開発した自動全身画像化系蛍光について評価し、そして蛍光強度を比較した。ＺｓＧｒｅｅｎの誘導は第一の用量の投与３日後に非常に明瞭であり、そして処置の開始５日後にプラトーに達した。
【図３】Ａ２７８０およびＨＣＴ１１６クローンにおけるＤＮＡ損傷剤アクチノマイシンＤに対するｐ５３ＲＥプロモーター構築物の応答。細胞をアクチノマイシンＤで２４時間処理する。蛍光を、実施例２に記述されるとおりＦｌｕｏｒｏｓｋａｎを使用して測定した。誘導の倍数は、ＤＭＳＯ処理した細胞の蛍光により除算した誘導後の蛍光として計算した。Ａ２７８０クローン３６は１０ｎｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤでの処理後２倍の誘導を示し；２ないしほぼ４倍の誘導がＨＣＴ１１６クローンで観察された。
【図４】ｐ２１ｗａｆ，ｃｉｐ１プロモーター−ＺｓＧｒｅｅｎモデルはＨＤＡＣ阻害剤の生物学的効果をｉｎ ｖｉｔｒｏで予測する。ｐＧｌ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００でトランスフェクトしたＡ２７８０卵巣癌細胞のクローン５を、指定された濃度のＨＤＡＣ阻害剤ＳＡＨＡ（＊）、ＭＳ−２７５（Δ）、ＬＡＱ−８２４（ ）およびＴＳＡ（●）若しくは溶媒（０．１％ＤＭＳＯ）で２４時間処理した。図４Ａはｐ２１ ＥＬＩＳＡを使用して測定されたところのクローン５のｐ２１タンパク質誘導を示す。図４ＢはＡｓｃｅｎｔ Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎを使用して測定されたところのクローン５中で誘導された蛍光を表す。ｐ２１の誘導パターンは、ｐ２１応答性のＺｓＧｒｅｅｎ発現ベクターｐＧｌ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００の誘導パターンと同一である。
【図５】ｐ２１ｗａｆ，ｃｉｐ１プロモーター−ＺｓＧｒｅｅｎモデルは個別のマウスでのＭＳ−２７５の抗腫瘍効果をｉｎ ｖｉｖｏで予測する。ヌードマウスに、ヒトＡ２７８０ｐ２１ｗａｆ，ｃｉｐ１ＺｓＧｒｅｅｎ卵巣癌細胞（１０７細胞／マウス）を皮下に注入し、そして第４日からその後、ベヒクル（対照群、２０％ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）若しくは指定された用量のＭＳ−２７５（ＱＤ）で経口で処置した。自動全身画像化系を使用して個々の腫瘍の腫瘍重量および蛍光を第２８日に評価した。
【図６】５３ＲＥ＿ＴＫ／ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ発現ベクター
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍退縮、腫瘍増殖の安定化若しくは転移性増殖の阻害と関連するタンパク質の発現もまた制御するプロモーターに機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含有する発現ベクターでトランスフェクトされている、安定に形質転換された腫瘍細胞。
【請求項２】
安定に形質転換された腫瘍細胞が、安定に形質転換された卵巣癌細胞若しくは結腸直腸癌細胞よりなる、請求項１に記載の腫瘍細胞。
【請求項３】
レポーター遺伝子が、好ましくはＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＨｃＲｅｄよりなる群から選択される蛍光タンパク質、またはｐＤｓＲｅｄ、ｐＨｃＲｅｄ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ若しくはｐｄ２ＥＹＦＰのような不安定化蛍光タンパク質よりなる、請求項１若しくは２に記載の腫瘍細胞。
【請求項４】
プロモーターがｐ２１プロモーター若しくはその機能的フラグメントよりなる、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の腫瘍細胞。
【請求項５】
プロモーターが１３００ｂｐのｐ２１プロモーター配列（配列番号１）を含んでなる、請求項４に記載の腫瘍細胞。
【請求項６】
プロモーターがｐ５３応答配列を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の腫瘍細胞。
【請求項７】
ｐ５３応答配列が配列、配列番号１０を有する、請求項６に記載の腫瘍細胞。
【請求項８】
プロモーターが、配列番号１３を有するｐ５３応答配列を含んでなる最小ＨＳＶ−ＴＫプロモーターよりなる、請求項６若しくは７に記載の腫瘍細胞。
【請求項９】
受託番号ＬＭＢＰ ５９５８ＣＢを有する２００３年１月２０日にｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００−クローン１としてベルギーの微生物協調収集物（Ｂｅｌｇｉａｎ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に寄託された、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の腫瘍細胞。
【請求項１０】
受託番号ＬＭＰＢ ５９５９ＣＢを有する２００３年１月２０日にｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００−クローン２としてベルギーの微生物協調収集物（Ｂｅｌｇｉａｎ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に寄託された、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の腫瘍細胞。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の安定に形質転換された腫瘍細胞を含んでなる、化合物の製薬学的活性のスクリーニングのためのヒト以外の動物モデル。
【請求項１２】
安定に形質転換された腫瘍細胞がヒト以外の動物の皮下に外科的に移植若しくは注入される、請求項１０に記載のヒト以外の動物。
【請求項１３】
ヒト以外の動物がげっ歯類である、請求項１１若しくは１２に記載のヒト以外の動物。
【請求項１４】
前記ヒト以外の動物において腫瘍を形成するのに十分な量の請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の細胞を前記ヒト以外の動物に投与することを含んでなる、請求項１１ないし１３のいずれか１つに記載のヒト以外の動物の製造方法。
【請求項１５】
ヒト以外の動物が遺伝子的に免疫無防備状態であるか若しくは前記腫瘍と同系である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の腫瘍細胞を、試験されるべき化合物と接触させる段階；および
レポーター遺伝子の発現を測定する段階
を含んでなる、抗腫瘍活性についての化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング方法。
【請求項１７】
請求項１ないし１０のいずれか１つに記載のヒト以外の動物にもしかすると活性のある化合物を投与する段階；および
レポーター遺伝子の発現を測定することにより腫瘍細胞に対する前記化合物の効果を評価する段階
を含んでなる、製薬学的活性についての化合物のスクリーニング方法。
【請求項１】
腫瘍退縮、腫瘍増殖の安定化若しくは転移性増殖の阻害と関連するタンパク質の発現もまた制御するプロモーターに機能しうるように連結されたレポーター遺伝子を含有する発現ベクターでトランスフェクトされている、安定に形質転換された腫瘍細胞。
【請求項２】
安定に形質転換された腫瘍細胞が、安定に形質転換された卵巣癌細胞若しくは結腸直腸癌細胞よりなる、請求項１に記載の腫瘍細胞。
【請求項３】
レポーター遺伝子が、好ましくはＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ＨｃＲｅｄよりなる群から選択される蛍光タンパク質、またはｐＤｓＲｅｄ、ｐＨｃＲｅｄ１、ｐｄ２ＥＧＦＰ若しくはｐｄ２ＥＹＦＰのような不安定化蛍光タンパク質よりなる、請求項１若しくは２に記載の腫瘍細胞。
【請求項４】
プロモーターがｐ２１プロモーター若しくはその機能的フラグメントよりなる、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の腫瘍細胞。
【請求項５】
プロモーターが１３００ｂｐのｐ２１プロモーター配列（配列番号１）を含んでなる、請求項４に記載の腫瘍細胞。
【請求項６】
プロモーターがｐ５３応答配列を含んでなる、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の腫瘍細胞。
【請求項７】
ｐ５３応答配列が配列、配列番号１０を有する、請求項６に記載の腫瘍細胞。
【請求項８】
プロモーターが、配列番号１３を有するｐ５３応答配列を含んでなる最小ＨＳＶ−ＴＫプロモーターよりなる、請求項６若しくは７に記載の腫瘍細胞。
【請求項９】
受託番号ＬＭＢＰ ５９５８ＣＢを有する２００３年１月２０日にｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００−クローン１としてベルギーの微生物協調収集物（Ｂｅｌｇｉａｎ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に寄託された、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の腫瘍細胞。
【請求項１０】
受託番号ＬＭＰＢ ５９５９ＣＢを有する２００３年１月２０日にｐＧＬ３−ｂａｓｉｃ−ＺｓＧｒｅｅｎ−１３００−クローン２としてベルギーの微生物協調収集物（Ｂｅｌｇｉａｎ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に寄託された、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の腫瘍細胞。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の安定に形質転換された腫瘍細胞を含んでなる、化合物の製薬学的活性のスクリーニングのためのヒト以外の動物モデル。
【請求項１２】
安定に形質転換された腫瘍細胞がヒト以外の動物の皮下に外科的に移植若しくは注入される、請求項１０に記載のヒト以外の動物。
【請求項１３】
ヒト以外の動物がげっ歯類である、請求項１１若しくは１２に記載のヒト以外の動物。
【請求項１４】
前記ヒト以外の動物において腫瘍を形成するのに十分な量の請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の細胞を前記ヒト以外の動物に投与することを含んでなる、請求項１１ないし１３のいずれか１つに記載のヒト以外の動物の製造方法。
【請求項１５】
ヒト以外の動物が遺伝子的に免疫無防備状態であるか若しくは前記腫瘍と同系である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の腫瘍細胞を、試験されるべき化合物と接触させる段階；および
レポーター遺伝子の発現を測定する段階
を含んでなる、抗腫瘍活性についての化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング方法。
【請求項１７】
請求項１ないし１０のいずれか１つに記載のヒト以外の動物にもしかすると活性のある化合物を投与する段階；および
レポーター遺伝子の発現を測定することにより腫瘍細胞に対する前記化合物の効果を評価する段階
を含んでなる、製薬学的活性についての化合物のスクリーニング方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００７−５２３６０６（Ｐ２００７−５２３６０６Ａ）
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０４５３５（Ｐ２００６−５０４５３５）
【出願日】平成１６年３月３日（２００４．３．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００２１９５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７８９８５
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【出願人】（３９００３３００８）ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ (616)
【氏名又は名称原語表記】ＪＡＮＳＳＥＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡ ＮＡＡＭＬＯＺＥ ＶＥＮＮＯＯＴＳＣＨＡＰ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月３日（２００４．３．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００２１９５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７８９８５
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【出願人】（３９００３３００８）ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ (616)
【氏名又は名称原語表記】ＪＡＮＳＳＥＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡ ＮＡＡＭＬＯＺＥ ＶＥＮＮＯＯＴＳＣＨＡＰ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]