複合糖質ワクチン
複合糖質ワクチンならびにこれを調製および使用する方法が記載されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年３月２３日出願の米国仮出願第６１／１６２、６１９号の出願日遡及の特典を主張し、参照によりその全体を本明細書に包含する。
【０００２】
技術分野
本発明は、複合糖質、例えば、複合糖質ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
大抵の病原菌は、通常、高分子量（高ＭＷ）表面多糖を産生し、細菌性表面を被覆し取り囲むカプセルにする。これら表面炭水化物は、移動性貪食細胞および組織定着性マクロファージ（微生物の成長と拡散を制限し、微生物原因疾患を防ぐ能力の多くを説明できる重要な宿主防衛機序を構成する細胞群）による食作用に対抗して細菌性病原体に実質的な保護を提供する（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００５）。固有の多糖構造は、様々な形で機能し、免疫系との細菌性相互作用に影響を与え、また、炭水化物の微細構造がその特性を−さらに実際に免疫応答特性そのものを−決定づけることができるパラダイムとなる。
【０００４】
数十年前、マウスを使った調査で、炭水化物はＴ細胞非依存性抗原であることが明らかになった。Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａｄｖ．Ｐｅｄｉａｔｒ．、３２：１３９−１５８（１９８５）；Ｃｏｕｔｉｎｈｏ、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．、２４５：１２−１４（１９７３）；Ｃｏｕｔｉｎｈｏ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、３：２９９−３０６（１９７３）；Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、６７：６３７５−６３８４（１９９９）；ＭｃＧｈｅｅ ｅｔ ａｌ．、ＭｉｃｒｏｂｉａｌＩｍｍｕｎｏｌ．、２８：２６１−２８０（１９８４）。精製多糖は、最低限のＩｇＧへのスイッチを伴う、特異的ＩｇＭ応答を誘導する。ＩｇＭからＩｇＧアイソタイプへの免疫グロブリンクラススイッチ誘導失敗、および抗原による再誘発後の抗体産生増加の欠如は、古典的Ｔ細胞非依存免疫応答の特徴である。多糖のタンパク質への結合によりＴ細胞ヘルプを誘発する炭水化物特異的応答が起こり、ワクチンの有効性を改善した。Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、同上；Ｓｏｏｄ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ、７：３３３−３４７（１９８８）を参照。最近の複合糖質ワクチン創出は、生物医科学における大きなサクセスストーリーの１つとなっている。大抵の免疫集団では、インフルエンザ菌タイプｂの感染症、ワクチン型の小児の肺炎球菌、および髄膜炎菌（グループＢを除く）は、ほぼ駆逐されている。Ｌｅｓｉｎｓｋｉ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋ、Ｃｕｒｒ、Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｏｒｄ．、１：３２５−３３４（２００１）；Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、３３８：２５３９−２５４７（２００３）。
【０００５】
最近の機構的パラダイムは、複合糖質ワクチンに対する防御反応は免疫系で演じられる「トリック」に基づいているということである。Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、同上；Ｌｅｓｉｎｓｋｉ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋ、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４７：１３５−１４９（２００１）．おそらく、抗多糖抗体の産生に特異的なＢ細胞が複合糖質を取り込み、共有結合タンパク質から、ＭＨＣ分子と連携してペプチドを認識するＴ細胞へ、ペプチドを提示するのであろう。Ｂ細胞の刺激（結果的に炭水化物特異的抗体の産生を伴う）およびペプチド認識ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化がＴ細胞ヘルプを生じ、これによりＩｇＧへの免疫グロブリンクラススイッチおよびメモリー応答を促進する。免疫グロブリンクラススイッチおよびＢ細胞メモリーは、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６のＣＤ２８との相互作用を経由の、ＣＤ４０のＣＤ４０リガンドとの相互作用を経由の、また、同様に他の同時刺激分子との相互作用を経由の、Ｂ細胞の同時刺激に依存する。
【０００６】
しかし、Ｔ細胞は、炭水化物を認識することができる。糖ペプチドのプロセッシングおよびＴ細胞によるＭＨＣ−Ｉ／ＩＩ提示と認識に関していくつかの報告がある。Ａｂｄｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２６：５４４−５５１（１９９６）；Ｃｏｒｔｈａｙ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２８：２５８０−２５９０（１９９８）；Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４０９（６８１６）：９７−１０１（２００１）；Ｄｚｈａｍｂａｚｏｖ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、３５：３５７−３６６（２００５）； Ｈａｎｉｓｈ ａｎｄ Ｎｉｎｋｏｖｉｃ、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ、７：３０７−３１５（２００６）；Ｈａｕｒｕｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１８０：７３９−７４４（１９９４）；Ｈｕｄｒｉｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、 ２７４：３６２７４−３６２８０（１９９９）；Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５８：３７６９−３７７８（１９９７）；Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２２：１８１９−１８２５（１９９２）； Ｖｌａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１９６：１４３５−１４４６（２００２）； Ｗｅｒｄｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９：９６１１−９６１３（２００２）．
これらの研究のほとんどは翻訳後にグリコシル化されたタンパク質のプロセッシングと提示に関し検討している。これらのエピトープは、ペプチドに結合した単純な単糖類または二糖類であるように見える。ＭＨＣ−Ｉは、単なるペプチド部位ではなく糖ペプチドのタイプのエピトープに結合することが明らかになっている。さらに、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のプロセッシングされた糖ペプチドへの結合は、ＭＨＣに結合しているグリカンおよびペプチドの両方により形成されたエピトープとＴＣＲの接触に依存することが示された。Ｈａｕｒｕｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１８０：７３９−７４４（１９９４）。例えば、Ｈｏｌｍｄａｈｌとその共同研究者は、ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）のＴ細胞認識において、エピトープグリコシレーションが重大な役割を果たすことを示した。Ｃｏｒｔｈａｙ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２８：２５８０−２５９０（１９９８）；Ｄｚｈａｍｂａｚｏｖ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、３５：３５７−３６６（２００５）；Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２２：１８１９−１８２５（１９９２）。これらの研究者は、ヒトとラットの健常な関節軟骨で免疫優性Ｔ細胞エピトープがＯ‐グリコシル化されていることを見つけた。腫瘍抗原ムチン様糖タンパク質１（ＭＵＣ１）由来の糖ペプチドエピトープの研究が特に重要である。ＨａｎｉｓｈおよびＮｉｎｋｏｖｉｃ、同上。腫瘍細胞においては、タンパク質グリコシレーションによりＣＤ４＋Ｔ細胞により認識される腫瘍特異的糖ペプチドエピトープが形成される。Ｖｌａｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）、同上；Ｗｅｒｄｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９：９６１１−９６１３（２００２）。グリコシレーションパターンの変化は、Ｔ細胞のエピトープ認識を変化させることができる。ＨａｎｉｓｈおよびＮｉｎｋｏｖｉｃ、同上。
【０００７】
過去１５年間、多糖が主要成分であるいくつかのワクチンで臨床用途への導入に成功している。これらの内、最も成功したワクチンは、複合糖質で、この場合、細菌性標的の莢膜多糖（ＣＰＳ）がタンパク質キャリアと結合し、この結合によりＴ細胞ヘルプが誘発されＩｇＭからｌｇＧへのスイッチ、持続性応答、および小児での免疫原性を促進する。これらのワクチンの成功度合いは、免役される集団やその特異的ワクチンの特性により変わる。例えば、肺炎球菌の複合体は、小児で大いに成功したが、大人では期待に応えることができなかった（Ｓｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５（５１７７）：１３８５−１３８７（１９９４））。
【０００８】
複合糖質ワクチンの調製用の基本的方針として最も広く受け入れられている仮説は、そのワクチンが、おそらく樹状細胞および／またはマクロファージによるプロセッシング後に多糖特異的Ｂ細胞により取り込まれることである。（Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆ．Ｉｍｍ．６７（１２）：６３７５−６３８４（１９９９）；Ｊｏｎｅｓ、Ａｎａｉｓ ｄａ Ａｃａｄｅｍｉａ Ｂｒａｓｉｌｅｉｒａ ｄｅ Ｃｉeｎｃｉａｓ ７７（２）：２９３−３２４（２００５））．その後に、キャリアタンパク質のペプチドエピトープがＴ細胞に提示される。たとえＴ細胞がＭＨＣ−ＩＩ結合ペプチドにより活性化されたにしても、得られたヘルプがこれらの活性化Ｔ細胞により多糖特異的Ｂ細胞に提供され、多糖特異的ＩｇＧの産生を誘導する。しかし、Ｔ細胞エピトープが、複合糖質キャリアから生成されたペプチドにより形成されたかまたは炭化水素とペプチドの両方により作られたエピトープにより形成されたか、あるいはそうでないか、については、ほとんど、ないしは全く情報がない。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、少なくとも部分的には、強化された免疫原性を有し、またそれ故に優れた治療効果を有する複合糖質ワクチンを作る方法の発見に基づいている。
【００１０】
従って、一態様では、本発明は糖化ペプチド複合体（glycated peptide conjugate）を調製する方法を提供する。この方法は、多糖（polysaccharides）集団を取得し；任意選択として多糖集団を処理し約５〜２０ｋＤａ、例えば、約１０〜１５ｋＤａ、例えば、約１０ｋＤａまたは１５ｋＤａ、の平均分子量を有するオリゴ糖の集団を作り；オリゴ糖集団を、切断可能成分（cleavable moieties）、例えば、酸不安定配列またはプロテアーゼ認識配列、例えば、カテプシンまたはカスパーゼ認識配列により相互に結合した複数の反復ペプチド単位を含むポリペプチドと接触させるステップを含み、ここで各ペプチド単位は、
（ｉ）ＭＨＣ−ＩＩ結合配列であって、５０アミノ酸以下、例えば、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、または１５アミノ酸以下、例えば、約８〜１５アミノ酸の結合配列；
（ｉｉ）１つまたは複数のリジン残基；好ましくは、末端、例えば、Ｃ末端、に１つのリジンがあり、内部リジンが無く（一部の実施形態では、各ペプチドは単一のリジン残基をＣ末端に有する）；および
任意選択として（ｉｉｉ）ＭＨＣ−ＩＩ結合配列とリジン残基を結合する１つまたは複数のアミノ酸；から構成され、
例えば、還元アミノ化によって、オリゴ糖をリジン残基に直接結合させるために十分な条件の下、ペプチド単位に対するオリゴ糖の比率が、約１：１になるようにして、
それにより糖化ペプチド複合体を調製する。
【００１１】
一部の実施形態では、各ペプチド単位が同じＭＨＣ−ＩＩ結合配列を含み；他の実施形態では、ペプチド単位が複数のＭＨＣ−ＩＩ結合配列を含む。
【００１２】
別の態様では、本発明は、糖化ペプチド／ナノ粒子複合体の調製方法を提供する。この方法は、多糖集団を取得し；任意選択で多糖集団を処理して約５〜２０ｋＤａ、例えば、約１０〜１５ｋＤａ、例えば、約１０ｋＤａまたは１５ｋＤａの平均分子量を有するオリゴ糖集団を作り；オリゴ糖集団をペプチド単位の集団と接触させるステップを含み、ここで各ペプチド単位は、
（ｉ）ＭＨＣ−ＩＩ結合配列であって、５０アミノ酸以下、例えば、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、または１５アミノ酸以下、例えば、約８〜１５アミノ酸の結合配列；
（ｉｉ）１つまたは複数のリジン残基；好ましくは、末端、例えば、Ｃ末端、に１つのリジンがあり、内部リジンが無く（一部の実施形態では、各ペプチドは単一のリジン残基をＣ末端に有する）；および
任意選択として（ｉｉｉ）ＭＨＣ−ＩＩ結合配列とリジン残基を結合する１つまたは複数のアミノ酸；から構成され、
例えば、還元アミノ化によって、オリゴ糖をリジン残基に直接結合させるために十分な条件の下、ペプチド単位に対するオリゴ糖の比率が、約１：１になるようにして、それにより糖化ペプチド複合体を調製し；生体適合性ナノ粒子を提供し；切断可能なリンカー、例えば、酸不安定配列またはプロテアーゼ認識配列、例えば、カテプシンまたはカスパーゼ認識配列を使って生体適合性ナノ粒子にペプチドＮ末端を結合させる。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、本明細書記載の方法により調製された糖化ペプチド複合体および糖化ペプチドナノ粒子複合体を提供する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、糖化ペプチド複合体を特徴とし、この糖化ペプチド複合体は、
（１）ポリペプチド部であって、切断可能成分、例えば、酸不安定配列またはプロテアーゼ認識配列、例えば、カテプシンまたはカスパーゼ認識配列、により相互に結合した複数の反復ペプチド単位を含み、ここで各ペプチド単位が、
（ｉ）ＭＨＣ−ＩＩ結合配列であって、５０アミノ酸以下、例えば、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、または１５アミノ酸以下、例えば、約８〜１５アミノ酸の結合配列；
（ｉｉ）１つまたは複数のリジン残基であって、好ましくは、末端、例えば、Ｃ末端、に１つのリジンがあり、内部リジンが無い（一部の実施形態では、各ペプチドは単一のリジン残基をＣ末端に有する）リジン残基；および
任意選択として（ｉｉｉ）ＭＨＣ−ＩＩ結合配列とリジン残基を結合する１つまたは複数のアミノ酸；から構成されるポリペプチド部；さらに
（２）好ましくは、約５〜２０ｋＤａ、例えば、約１０〜１５ｋＤａ、例えば、約１０ｋＤａまたは１５ｋＤａの平均分子量を有し、ペプチド単位に対するオリゴ糖の比率が約１：１となるようにリジン残基に直接結合したオリゴ糖部、を含む。
【００１５】
また別の態様では、本発明は、複数の糖化ポリペプチドを含む糖化ペプチド／ナノ粒子複合体を特徴とし、各糖化ポリペプチドは、
（１）ペプチド単位部であって、
（ｉ）ＭＨＣ−ＩＩ結合配列であって、５０アミノ酸以下、例えば、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、または１５アミノ酸以下、例えば、約８〜１５アミノ酸の結合配列；
（ｉｉ）１つまたは複数のリジン残基であって、好ましくは、末端、例えば、Ｃ末端、に１つのリジンがあり、内部リジンが無い（一部の実施形態では、各ペプチドは単一のリジン残基をＣ末端に有する）リジン残基；および
任意選択として（ｉｉｉ）ＭＨＣ−ＩＩ結合配列とリジン残基を結合する１つまたは複数のアミノ酸；から構成されるペプチド単位部；および
（２）オリゴ糖であって、好ましくは、約５〜２０ｋＤａ、例えば、約１０〜１５ｋＤａ、例えば、約１０ｋＤａまたは１５ｋＤａの平均分子量を有し、ペプチド単位に対するオリゴ糖の比率が約１：１となるようにリジン残基に直接結合し、糖化ペプチドがペプチド単位のＣ末端で切断可能はリンカー、例えば、酸不安定配列またはプロテアーゼ認識配列、例えば、カテプシンまたはカスパーゼ認識配列、を介して、生体適合性ナノ粒子に結合しているオリゴ糖、を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、多糖がウイルス、細菌、原虫類、および菌類からなる群より選択された病原体由来である。他の実施形態では、多糖が、腫瘍関連糖タンパク質由来である。
【００１７】
一部の実施形態では、多糖の処理が、多糖をオゾン分解または酵素消化、例えば、１つまたは複数のグリコシターゼ、に曝すことを含む。
【００１８】
一部の実施形態では、各ペプチド単位が、同じＭＨＣ−ＩＩ結合配列を含む。一部の実施形態では、ペプチド単位が、複数のＭＨＣ−ＩＩ結合配列を含む。
【００１９】
また、本発明の別の態様では、患者の免疫応答を誘導する方法を特徴とする。この方法は、本明細書記載の治療に有効な量の糖化ペプチド複合体または糖化ペプチド／ナノ粒子複合体を登用することを含む。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、薬剤的に許容可能なキャリア中の、本明細書記載の糖化ペプチド複合体および／または糖ペプチド／ナノ粒子複合体を含む組成物を提供する。
【００２１】
また、本発明は、本明細書記載の糖ペプチド複合体および／または糖化ペプチド／ナノ粒子複合体の患者の免疫応答を誘導するための使用、および患者の免疫応答を誘導するための薬剤の製造における使用も含む。この薬剤は、感染しているまたは感染のリスクのある患者、または腫瘍のあるヒトに対する感染の治療または予防手段に使用することができる。この薬剤は、本明細書記載に記載のいかなる形態であってもよく、また、単独で投与しても、例えば、アジュバントや免疫刺激薬と組み合わせて投与してもよい。
【００２２】
別に定義されていなければ、本明細書で用いられている全ての技術科学用語は、通常、本発明の属する当業者により理解されているのと同じ意味を有する。方法と材料は、本明細書中で本発明における使用を目的として記載されている；当技術分野で既知の他の適切な方法と材料もまた使用可能である。材料、方法、および実施例は説明のためのみのものであり、制限を意図するものではない。全ての出版物、特許出願、特許、配列、データベース項目、および他の本明細書の参考文献は、全体が参照によって組み込まれる。矛盾が生じた場合には、定義を含め、本明細書が優先する。
【００２３】
その他の本発明の特色と優位点は、以下の詳細な説明と図、および請求項から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＧＢＳＩＩＩの放射標識とそれに続くキャリアタンパク質／ペプチドとの結合の代表的な方法の模式図である。
【図２】図２Ａ−Ｅはラージ細胞溶解産物の免疫沈降結果を示す。図２Ａは、ラージＢ細胞エンドソームの溶解産物中で分析された［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩを示す線グラフである（１８時間インキュベーション後）。分子の大きさは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２ゲル浸透クロマトグラフィーにより測定された。細胞表面含有物は、ＨＬＡ−ＤＲ ｍＡｂで免疫沈降された。免疫共沈降産物中には［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ型は認められなかった。図２Ｂは、ラージＢ細胞エンドソームから分析された［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡを示す線グラフである（３時間、６時間、および１８時間のインキュベーション後）。ここでも、分子の大きさの分布をＳｕｐｅｒｏｓｅ １２クロマトグラフィーで求めた。図２Ｃは、マウス脾細胞表面から得て、抗体とＨＬＡＩＡ／ＩＥ複合体と共に免疫共沈降した［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡのＳｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムによる溶出プロファイルを示す線グラフである（１８時間のインキュベーション後）。図２Ｄは、ＧＢＳＩＩＩ、ＯＶＡ、またはＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡとインキュベーション（１８時間）し、続いて、ＧＢＳＩＩＩにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３結合ｍＡｂで細胞表面染色した後のＢＭＤＣのフローサイトメトリー分析結果を示すヒストグラムおよび棒グラフである。図２Ｅは、ＧＢＳＩＩＩ、ＯＶＡｐ、およびＨＬＡ−ＤＲに抗体でそれぞれ染色したＳＤＳゲルのウェスタンブロッティングにより検出されたＨＬＡ−ＤＲと糖化ペプチドエピトープの複合体を示す図である。＊各ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐバンドの定量デンシトメトリー分析は、対応するＧＢＳＩＩＩバンドで正規化して実施した。
【図３】図３Ａ−Ｂはラージ細胞の［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡおよび［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴによる免疫沈降結果を示す。図３Ａは、［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡとインキュベートした（１８時間）ラージＢ細胞からの結果を示す棒グラフである。細胞表面含有物は、ＨＬＡ−ＤＲ ｍＡｂ、および対照としてのＬＡＭＰ−１ ｍＡｂ（ＨＬＡ−ＤＱまたはＨＬＡ−ＤＰ ｍＡｂでの免疫共沈降では、ＬＡＭＰ−１バックグラウンドと比べて、ｐ＞０．０５で、優位な放射能の強化は認められなかった。データは平均±ＳＤ値として表されている。図３Ｂは、［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴをラージＢ細胞由来のＭＨＣ−ＩＩｍＡｂで免疫共沈降した結果を示す線グラフである。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２分子サイジングカラム分析（三角マーク）により低分子量ＧＢＳＩＩＩ（約１０ｋＤａ）がラージ細胞表面のＭＨＣ−ＩＩ分子に結合していることが明らかになった。陰性対照として、この実験をＭＨＣ−ＩＩ欠損ラージ細胞（ＲＪ２．２．５）で繰り返し行ったが、トリチウム標識したオリゴ糖は細胞表面で検出されなかった（四角マーク）。免疫共沈降に使われたＭＨＣ−ＩＩに対するｍＡｂの対照として、ＬＡＭＰ−１に対する抗体を使用した。この免疫沈降では、カウントは全く検出されなかった。
【図４Ａ】ラージＢ細胞（３ｘ１０６／ｍＬ／ウエル）のエンドソーム中のＧＢＳＩＩＩ［３Ｈ］−ＯＶＡ（２０μｇ、１８００ｃｐｍ／ｎｇ）の処理（プロセッシング）を示す線グラフである。ＧＢＳＩＩＩ［３Ｈ］−ＯＶＡをラージ細胞中で、単独またはＲＯＳ捕捉剤（（４Ａ）Ｄ−マンニトール、（４Ｂ）４−ＯＨ ＴＥＭＰＯ、（４Ｃ）ナトリウムピルビン酸塩）の存在下、１８時間インキュベートした。全細胞溶解産物由来の最終生成物をＳｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムで分析した。
【図４Ｂ】ラージＢ細胞（３ｘ１０６／ｍＬ／ウエル）のエンドソーム中のＧＢＳＩＩＩ［３Ｈ］−ＯＶＡ（２０μｇ、１８００ｃｐｍ／ｎｇ）の処理（プロセッシング）を示す線グラフである。ＧＢＳＩＩＩ［３Ｈ］−ＯＶＡをラージ細胞中で、単独またはＲＯＳ捕捉剤（（４Ａ）Ｄ−マンニトール、（４Ｂ）４−ＯＨ ＴＥＭＰＯ、（４Ｃ）ナトリウムピルビン酸塩）の存在下、１８時間インキュベートした。全細胞溶解産物由来の最終生成物をＳｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムで分析した。
【図４Ｃ】ラージＢ細胞（３ｘ１０６／ｍＬ／ウエル）のエンドソーム中のＧＢＳＩＩＩ［３Ｈ］−ＯＶＡ（２０μｇ、１８００ｃｐｍ／ｎｇ）の処理（プロセッシング）を示す線グラフである。ＧＢＳＩＩＩ［３Ｈ］−ＯＶＡをラージ細胞中で、単独またはＲＯＳ捕捉剤（（４Ａ）Ｄ−マンニトール、（４Ｂ）４−ＯＨ ＴＥＭＰＯ、（４Ｃ）ナトリウムピルビン酸塩）の存在下、１８時間インキュベートした。全細胞溶解産物由来の最終生成物をＳｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムで分析した。
【図５Ａ】Ｔ細胞増殖実験を示す棒グラフである。照射ＡＰＣ（１０５／ウエル）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５／ウエル）を、抗原の存在下３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートし（最適化増殖時間）、採取に先立ち３Ｈチミジンで８時間処理した。放射能の取り込みを液体シンチレーションにより測定した。各ＡＰＣ−Ｔ細胞集団に対する３Ｈカウント（ｃｐｍ）を抗原のないＡＰＣとＴ細胞混合物（陰性対照、通常２００−５００ｃｐｍの３Ｈカウントが発生）の３Ｈカウントで除算した。この数値が刺激指数（ＳＩ）である。ＡＰＣは照射されても急速に増殖できないため、３ＨカウントはＴ細胞の増殖を示す。無刺激Ｔ細胞のＳＩを１に正規化した。例えば、３のＳＩは、無刺激（抗原無添加）混合物に比べてその混合物中に３倍多いＴ細胞があると見なすことが可能である。
【図５Ｂ】Ｔ細胞増殖実験を示す棒グラフである。照射ＡＰＣ（１０５／ウエル）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５／ウエル）を、抗原の存在下３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートし（最適化増殖時間）、採取に先立ち３Ｈチミジンで８時間処理した。放射能の取り込みを液体シンチレーションにより測定した。各ＡＰＣ−Ｔ細胞集団に対する３Ｈカウント（ｃｐｍ）を抗原のないＡＰＣとＴ細胞混合物（陰性対照、通常２００−５００ｃｐｍの３Ｈカウントが発生）の３Ｈカウントで除算した。この数値が刺激指数（ＳＩ）である。ＡＰＣは照射されても急速に増殖できないため、３ＨカウントはＴ細胞の増殖を示す。無刺激Ｔ細胞のＳＩを１に正規化した。例えば、３のＳＩは、無刺激（抗原無添加）混合物に比べてその混合物中に３倍多いＴ細胞があると見なすことが可能である。
【図６】図６Ａ−ＥはＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ免疫化に応答したＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の棒グラフである。糖化ペプチドがＭＨＣ−ＩＩによりＡＰＣ表面に提示されると、ＣＤ４＋Ｔ細胞は炭水化物を認識する。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、２倍用量のＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ投与を受けた。これらのマウス由来の脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞をＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡを用いてインビトロで９日間増幅させた。Ｔ細胞分泌ＩＬ−２（図６Ａ）、ＩＬ−４（図６Ｂ）、およびＩＦＮγ（図６Ｃ）の検出のために、増幅されたＴ細胞集団、ならびに、放射未処置マウスの脾細胞のエリスポットアッセイを、異種のキャリア（ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ）に結合したＧＢＳＩＩＩを含むいくつかの抗原と共に実施した。ＴＴ免疫化マウス由来のリンパ球を使った調査の全３つのサイトカインを伴って、陽性対照として、ＴＴは単独で強い応答を誘導した。ＥＬＩＳＡを使って、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡを２回免疫したマウス由来の血清中の、ＯＶＡ（図６Ｄ）およびＧＢＳＩＩＩ（図６Ｅ）特異的なＩｇＧ抗体のサブクラスを評価した。＊ＧＢＳＩＩＩ（５０ｎｇ／ｍＬ）に対する参照抗体のＡ４０５が０．５に達したとき、Ａ４０５が０．５になった希釈度の逆数を抗体力価として記録した。
【図７】図７Ａ−ＤはＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐによる免疫化後のＴ細胞増殖を示す。野生型（ｗｔ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（７Ａ）およびＤＯ１１．１０マウス（７Ｂ）をＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐで３回免疫（２週間隔で）した。未処理照射脾臓ＡＰＣ（１０５／ウエル）を、各マウス株由来のＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５／ウエル）と４日間同時培養し、ＯＶＡｐまたはＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ（ＯＶＡｐと同量になるよう調節）で刺激した。採取８時間前に［３Ｈ］チミジンを組み込み、増殖を測定した。データは、平均±ＳＤ値として表した。陰性対照は、ＧＢＳＩＩＩ（７．５μｇ）、組み換えＯＶＡｐ（２．５μｇ）、または無抗原による刺激を含み、全陰性対照に５００ｃｐｍ未満の［３Ｈ］チミジンを組み込んだ。陽性対照として、ブドウ球菌エンテロトキシンＡで同時培養を誘導して野生型Ｔ細胞で５４、７００ｃｐｍ、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞では５００ｃｐｍ未満を組み込む。その細胞が未処理ＤＯ１１．１０マウス由来であるか、またはＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ免疫マウス由来であるかに関わらず、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＯＶＡｐに対する同様の高レベルでの応答は示されていない（７Ｃおよび７Ｄ）。ブレフェルジンＡは抗原提示をブロックし（小胞体中にＭＨＣ−ＩＩをトラップすることにより）、また、ｍＡｂとＩＡ／ＩＥ複合体はマウスＭＨＣ−ＩＩをブロックする。
【図８】図８Ａ−ＣはＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐによる免疫後の抗体力価を示す棒グラフである。ＤＯ１１．１０および野生型（ｗｔ）Ｂａｌｂ／ｃマウスをＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐで３回免疫し、ＥＬＩＳＡを使ってＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ（８Ａ）およびＧＢＳＩＩ特異的ＩｇＭ（８Ｂ）の力価を測定した。また、単独で２回免疫したＤＯ１１．１０およびｗｔマウスのＯＶＡｐ特異的ＩｇＧ力価も示す（８Ｃ）。＊参照抗体のＧＢＳＩＩＩ（５０ｎｇ／ｍＬ）に対するＡ４０５が０．５になったとき、０．５のＡ４０５が得られた希釈度の逆数を抗体力価とした。ｗｔおよびＤＯ１１．１０マウスの両方は、ＧＢＳＩＩＩやＯＶＡｐに対し免疫前に検出可能な抗体が無かった。
【図９】ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ刺激マウス由来Ｂ細胞、およびＴＴ刺激マウスまたはＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ刺激マウス由来Ｔ細胞を投与されたマウスの免疫を復活させるためのＩｇＧ応答を示す線グラフである（両群に対しｐ＜０．０１）。食塩水処理したドナーから未処理ＢおよびＴ細胞を受けたマウスを対照として使った。全群間の差は、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分析により検証した。
【図１０】図１０Ａ−Ｃは３種のワクチンＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ（９Ａ）、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ（１０Ｂ）、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐ（１０Ｃ）を模式的に表現したものである。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡとＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐは嵩高い基質様構造を有するが、他方、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐは高度に均一な単鎖構造を有する。
【図１１】ＩＩＩ−ＯＶＡおよびＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐで免疫化したマウス由来血清の存在下、ヒト血液ＰＭＮＬによるＩＩＩ型Ｂ群連鎖球菌のオプソニン化貪食作用を示す。正常なマウス血清およびＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ免疫マウス由来ウサギ血清を対照として使用した。
【図１２】０．２μｇ、２μｇ、または２０μｇのＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐまたはＩＩＩ−ＯＶＡで免疫したマウスに対する用量反応アッセイ結果を示した棒グラフである。
【図１３】ＩＩＩ−ＴＴ、ＩＩＩ−ＯＶＡ、またはＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐで免疫した母に産まれ、ＩＩＩ型Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳＩＩＩ）の攻撃を受けた子の生存割合を示す棒グラフである。
【図１４】図１４Ａ−Ｂは異なる抗原の組み合わせからなる初回と２回目の投与を受けたＢＡＬＢ／ｃマウスのＧＢＳＩＩＩに対するＥＬＩＳＡによる定量的抗体力価を示す棒グラフである。（１４Ａ）：０日目に刺激され、１４日目に初回抗原刺激と追加免疫抗原の異なる組み合わせで追加免疫したマウスから２１日目に採取した血清のＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ力価（μｇ／ｍＬ）。（１４Ｂ）：ＧＢＳＩＩＩ、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ、またはＧＢＳＩＩＩ−ＴＴで刺激したマウスから１４日目に採取した血清のＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ力価（μｇ／ｍＬ）。＊＊＊ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ刺激、ＧＢＳＩＩＩ追加免疫マウスおよびＧＢＳＩＩＩ刺激、ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ追加免疫マウスは、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ刺激、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ追加免疫マウスおよびＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ刺激、ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ追加免疫マウス（ｐ＜０．０００１）の両方より有意に低いＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ力価を有していた。
【図１５Ａ】双性イオンヘパロサン（例えば、大腸菌Ｋ５多糖体）オリゴ糖誘導体の構造である。
【図１５Ｂ】双性イオンヘパロサンオリゴ糖に対し行ったヒトＴ細胞アッセイの結果を示す棒グラフである。ＳＥＡ抗原（陽性対照）に対するＴ細胞数を１００に正規化した。オリゴ糖は４μｇ／ｍｌであった。Ｔ細胞刺激を８日間にわたって測定した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
前述のように（背景を参照）、Ｔ細胞の複合糖質活性化を説明する支配的パラダイムは、たとえ炭水化物が非常に強力な共有結合（多くの場合の第二級アミン）により蛋白質に結合しているにしても、ペプチドが提示されＴ細胞に認識されるということだけである。この古典的仮説は、ＡＰＣ内の多糖で何が起こっているかや、どのようにして炭水化物とタンパク質がエンドソーム（エンドソーム内で第二級アミン結合を切断する機序は知られていない）内でばらばらになり、次いでＴ細胞にペプチドのみを提示するか、を説明できない。
【００２６】
本明細書に記載のように、糖化ペプチドは、提示専門細胞のＡＰＣにより実際にＴ細胞に提示される。さらに、本複合糖質ワクチン中でＭＨＣＩＩにより提示される炭水化物（約１０ｋＤａ）は、天然起源多糖（通常１００ｋＤａより大きく、数百万ｋＤａまで）よりずっと小さい。
【００２７】
本明細書記載の調査から得られた複合糖質ワクチンのプロセッシングと提示の機序に関する知識は、新生代ワクチンの設計と合成に適用できる。この情報は、本発明者が標的特異的、構造ベースのワクチン候補を設計することを可能にする。限定を意図するものではないが、１つの理論として、この設計は、エンドソームプロセッシングステップを（一部または全部を）省いて、ＭＨＣＩＩ経路による糖化ペプチドの提示をさらに早くする可能性がある。さらに、この設計は、投与ワクチン重量当たりで高比率の免疫原性糖化ペプチドが得られ、また、同じ用量でより強い応答得られる可能性が在り、または使用用量の減少化を可能とする。
【００２８】
このような新ワクチンには、下記のものが含まれる：
１）炭水化物、切断可能リンカーにより結合された反復Ｔ細胞エピトープ、例えば、ＯＶＡｐを含むポリペプチド構築物に共有結合で結合した、例えば、約５〜２０ｋＤａ、例えば、１０〜１５ｋＤａ、の炭水化物（Ｂ細胞受容体に効果的に架橋し、Ｂ細胞を活性化するために必要であれば、さらに小さいまたは大きい）。これは、多くの糖化ペプチド残基を生成する酸性のエンドソーム中のポリペプチドの解重合を可能にする。
２）炭水化物、切断可能リンカーにより結合された複数の異なるＴ細胞ペプチドエピトープを含むポリペプチド構築物に共有結合で結合した、例えば、約５〜２０ｋＤａ、例えば、１０〜１５ｋＤａ、の炭水化物（Ｂ細胞受容体に効果的に架橋し、Ｂ細胞を活性化するために必要であれば、さらに小さくまたは大きくてもよい）。これには、より大きなＴ細胞レパートリーの動員ができるようにすべきである。
３）Ｔ細胞エピトープ、例えば、ＯＶＡｅｘｔｐｅｐ、の１つの末端に切断可能なリンカーで共有結合した、約５〜２０ｋＤａ、例えば、１０〜１５ｋＤａの炭水化物（ＭＨＣ−ＩＩ結合多糖のサイズ）を、例えば、含む複合糖質ワクチンの糖化ペプチド抗原エピトープでコートした生体高分子ベースのナノ粒子。
【００２９】
これらの各実施形態には、下記の要素が含まれる：
Ｉ：炭水化物成分：目的の病原体または腫瘍由来の多糖またはオリゴ糖、任意選択として、約５〜２０ｋＤａ、例えば、１０〜１５ｋＤａの平均分子量を有するように処理され、またはＢ細胞受容体に効果的に架橋し、Ｂ細胞を活性化するために必要に応じさらに小さくまたは大きく；さらに、
ＩＩ：少なくとも１つのペプチド単位であって、ＭＨＣ−ＩＩ結合配列およびリジン、好ましくは１つの末端に１つのリジンを含み、このリジンに炭水化物が直接結合しているペプチド単位。
【００３０】
ペプチド単位は、樹状細胞やＢ細胞等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣ−ＩＩ分子に結合するアンカーとして作用し、このアンカーを介して炭水化物がＭＨＣ−ＩＩに結合し、Ｔ細胞に提示する。ＭＨＣ−ＩＩ結合配列は、ほとんどまたは全く分解が必要でない小さいペプチド単位として提示され、さらに炭水化物は予備消化されＡＰＣによって容易に提示可能であるより小さいサイズになるので、エンドソーム経由のプロセッシング時間が大きく縮小され、より早い免疫応答が得られる。これらの要素を特定し、選択し、調製する方法は、当技術分野でよく知られている。次に代表的要素のリストを示す。
【００３１】
炭水化物抗原
本明細書記載の組成物は、免疫応答が求められる任意の多糖、例えば、任意の病原体、例えば、ウイルス、細菌、真菌、または原虫類、から得られた多糖；糖タンパク質；または細胞、例えば、腫瘍細胞、を使って作ることができる。「多糖」は、通常、グリコシド結合により結合した単糖残基で構成される任意の直鎖または分岐高分子を意味し、従ってオリゴ糖を含む。目的の炭水化物を特定し、入手する方法は、当技術分野で既知である。例えば、Ｄｏｒｍｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１２）：６５９−６６７（２００８）を参照。
【００３２】
炭水化物含有構造体は、細菌表面に多く存在し（Ｎｉｋａｉｄｏ、ＲｅｖＩｎｆｅｃｔＤｉｓ、１０：Ｓ２７９−Ｓ２８１（１９８８））、これには、莢膜、リポ多糖、タイコ酸、ペプチドグリカン、および糖タンパク質が含まれる。ＣＰＳは数百の反復単位からなり、各単位は、１つから８つの糖類を含み、これらは、通常は（常にではないが）グリコシド結合により結合している。糖類の組成物、環形状、リンケージ位置、アノマー中心配置、異性体型、高次構造、および電荷モチーフの変動は全て、免疫性エピトープに存在する差異に寄与する。これらの構造要素のいずれも本明細書記載の方法と組成物に使用可能である。
【００３３】
一部の実施形態では、本明細書記載の複合糖質組成物は、細菌由来の炭水化物、例えば、莢膜多糖（ＣＰＳ）、を使って作られる。代表的な細菌には、肺炎球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、髄膜炎菌、インフルエンザ菌（例えば、インフルエンザ菌ｂ）、チフス菌、志賀赤痢菌、バクテロイデスフラギリス、Ａ群およびＢ群連鎖球菌、サルモネラ、大腸菌、コレラ菌、シトロバクター属、ハフニア属、プロテウス属、ブドウ球菌、および肺炎桿菌が含まれる。例えば、Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８０：２９４５-２９５０（２００６）、およびこの中の引用文献；Ｊｏｎｅｓ、Ａｎａｉｓｄａ Ａｃａｄｅｍｉａ Ｂｒａｓｉｌｅｉｒａ ｄｅ Ｃｉeｎｃｉａｓ ７７（２）：２９３−３２４（２００５）（特に表ＩとＩＩ）およびこの中の引用文献；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：２４０９-２４１８（２００８）；およびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３８：２５３９−２５４７（２００３）、を参照。
【００３４】
一部の実施形態では、本明細書記載の複合糖質組成物は、寄生生物、例えば、細胞表面炭水化物、例えば、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー（ＧＰＩ）、由来の炭水化物を使って作られる。一般的には、細菌は臨床的に関連のある細菌、すなわち、病原性（疾患の原因となる）細菌である。代表的寄生生物には、熱帯熱マラリア原虫（マラリア）；トキソプラズマ原虫（トキソプラズマ症）、および森林型熱帯リーシュマニア（リーシュマニア症）が含まれる。例えば、Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８０：２９４５-２９５０（２００６）、 およびそこに引用された文献を参照。
【００３５】
一部の実施形態では、本明細書記載の複合糖質組成物は、ウイルス由来炭水化物、例えば、ウイルスエンベロープ糖タンパク質、例えば、Ｎ−グリカン由来の炭水化物を使って作られる。一般的には、ウイルスは、臨床的に関連のあるウイルス、すなわち、病原性（疾患の原因となる）ウイルスである。代表的なウイルスには、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（例えば、ＨＩＶ−１糖タンパク質ｇｐ１２０）、ＲＳウィルス（ＲＳＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、水痘帯状疱疹、単純疱疹ウィルス２型、狂犬病、麻疹、およびエボラウイルス、が含まれる。例えば、Ｗａｎｇ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ９（２）：１９４−２０６（２００６）；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８３：２６６３−２６６９（２００２）；Ｌａｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１２２（１２）：８８９−８９８（１９９５）；Ｖａｆａｉ、Ｖａｃｃｉｎｅ １３（１４）：１３３６−１３３８（１９９５）；Ｒｕｉｇｒｏｋ ａｎｄ Ｇｅｒｌｉｅｒ、ＰＮＡＳ １０４（５２）：２０６３９-２０６４０（２００７）、を参照。
【００３６】
一部の実施形態では、本明細書記載の複合糖質組成物は、腫瘍細胞由来の炭水化物、例えば、細胞表面炭水化物、例えば、糖タンパク質由来の炭水化物を使って作られる。代表的糖タンパク質には、ムチン−１（ＭＵＣ−１）（乳癌）、ＮＥＲ−２／ｎｅｕ（乳癌）、癌治療性抗原（ＣＥＡ）（例えば、結腸直腸、肺、乳および膵癌）、ｐ５３、シアリルＴｎ（ＳＴｎ）（乳癌）；およびＧｌｏｂｏＨ（乳および前立腺癌）が含まれる。また、ガングリオシド分子（例えば、ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３）が、いくつかの癌細胞上で再度発現した。例えば、Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８０：２９４５-２９５０（２００６）、 および引用文献；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９（５）：７０７-７１６（２００４）、を参照。
【００３７】
本明細書記載の複合糖質の炭水化物部は、任意選択として天然のまたは完全な多糖を、約１０〜２０ｋＤａ、例えば、１０〜１５ｋＤａ、例えば、１０ｋＤａの平均分子量の集団に分解して調製しても良い。例えば、酸、塩基、酸化手法（例えば、活性酸素または窒素種を使って）、または酵素触媒加水分解を使って、多糖を調製する方法は当技術分野で既知である。例えば、オゾン分解を使うことができ、この方法は、例えば、Ｐａｏｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（３０）１８２７８−１８２８３（１９９０）；Ｋａｌｋａ−Ｍｏｌｌｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：７１９-７２４（２０００）；および米国特許第６、０２７、７３３号と６、２７４、１４４号に記載されている。一部の実施形態では、複数の方法を組み合わせて所望の平均分子量を有する多糖組成物を作っている。
【００３８】
多糖を分解するプロセスは、当技術分野で既知の方法、例えば、米国特許第６、０２７、７３３および６、２７４、１４４に記載のＦＰＬＣ、を使ってモニター可能で、また、所望の平均分子量になったところで停止できる。
別の実施形態では、天然のまたは完全な多糖が使用可能である。
【００３９】
ＭＨＣ−ＩＩに結合したＴ細胞エピトープ
通常、ＭＨＣ−ＩＩ結合配列は、Ｔ細胞エピトープ、例えば、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞エピトープ（Ｅｔｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４２３−４２５（１９９０））を含むペプチドである。Ｔ細胞ヘルプを誘導できる多くのＣＤ４＋エピトープは、当技術分野で既知である。例えば、Ｅｔｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．、１９９０、同上；Ｖａｌｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：７１７−７２１（１９９２）；Ｓａｄｄｅｔａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７６：５９９−６０３（１９９２）；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１４９９−１５０５（１９９２）；Ｋａｌｉｙａｐｅｒｕｍａｌ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５：３３７５−３３８０（１９９５）；Ｄｅ Ｖｅｌａｓｃｏｅｔａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：９６１−９６８（１９９５）；Ｆａｌｕｇｉｅｔａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：３８１６-３８２４（２００１）；およびＢｉｘｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ Ｖ：１７５−１８０（１９８９））を参照。
【００４０】
本発明の方法と組成物に使えるＣＤ４＋エピトープには、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風毒素（ＴＩ）、熱帯熱マラリア原虫サーカムスポロゾイト、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎核コアタンパク質、Ｈ．インフルエンザ基質タンパク質、Ｈ．インフルエンザ赤血球凝集素、Ｂ群髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、肺炎球菌毒素ニューモリシン、および熱衝撃蛋白質、例えば、ウシ結核菌およびライ菌由来の、およびこれらの組換えにより作られ遺伝的に解毒された変異体、または組み換えにより作られた緑膿菌体外毒素Ａまたはブドウ球菌体外毒素またはトキソイドの無毒変異体由来のものが含まれる。例えば、Ａｍｉｒ−Ｋｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：６５５５-６５６３（２００６）；Ａｍｉｒ−Ｋｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０：６１６５-６１７１（２００３）；およびＫoｎｅｎ−Ｗａｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１７９：４０３-１３（１９９９）を参照。
【００４１】
一部の実施形態では、ＭＨＣ−ＩＩ結合配列は、ジフテリアトキソイドの交差反応性物質（ＣＲＭ１９７）（Ｓｈｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．６５：２４２-２４７（１９９７））、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、または髄膜炎菌の外膜複合体（Ｖｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．６０：４９７７-４９８３（１９９２））、由来である。例えば、Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８０：２９４５-２９５０（２００６）、およびその引用文献を参照。
【００４２】
Ｔ細胞エピトープペプチドは、合成または組換え、例えば、当技術分野で既知の細菌系や他の細胞培養系での発現、により作ることができる。例えば、組み換え型のペプチドは、ホスト細胞中のコードした核酸から発現により生成することができる。 任意のホスト細胞が特定のワクチン系による個人の要求に応じて使用可能である。 当業者なら、適切なホスト細胞を容易に選択ならびに使用可能であろう。一部の実施形態では、細菌の操作と成長が容易であることから、細菌性ホストが組み換え型蛋白質の産生に使われる。代表的な細菌性宿主 は大腸菌である。例えば、米国特許第６、８５５、３２１号を参照。固相と溶液を組み合わせた方法も使用可能である。例えば、Ｒｉｎｉｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（４９）４１：９３０７−９３２０（１９９３）に記載の方法の改良を参照。
【００４３】
Ｔ細胞エピトープは、いかなる内部リジン残基も含まないことが好ましいが、少なくとも１つのリジン残基を末端、例えば、Ｃ末端に含むように修飾されても良い。一部の実施形態では、ただ１つのリジン残基をＣ末端またはＮ末端に有する。リジン残基の配置は、炭水化物に結合した際のペプチドのＭＨＣ−ＩＩに結合する能力を保持する必要性のみに制約されている。
【００４４】
また、一部の実施形態では、ＭＨＣ結合配列とリジン残基間に１つまたは複数のアミノ酸、すなわちスペーサー配列があってもよい。このようなスペーサー配列は、リジン以外の任意のアミノ酸でよく、また、通常、柔軟で小さなＲ基を有し、これによりＴ細胞に提示するため結合した炭化水素の立体障害を避け、最適の配置およびＭＨＣ−ＩＩに結合するペプチドエピトープに対するアクセスを可能にする。リンカー中に含むことが適切な代表的アミノ酸には、グリシン、アラニン、およびセリンが挙げられる。
【００４５】
ＭＨＣ結合配列が単一ポリペプチド中で直列に結合した場合（ナノ粒子の表面上の場合と対照的に）の実施形態では、ペプチド単位は、切断可能成分、例えば、プロテアーゼまたは他の酵素、または酸に不安定な化学成分により認識され切断されるアミノ酸配列、により結合される。多くのこのような切断可能成分が当技術分野で既知である。例えば、切断可能配列には、カテプシンに認識されるものを含んでもよい。これらは、例えば、ＣｏｎｕｓａｎｄＳｉｍｏｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ７６：１３７４-１３８２（２００８）；Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｍ．２４９：１７１−１７９（１９９７）；Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ １８（１０）：６０５（２００５）；およびＰｌuｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：４６７-４７６（２００２）に記載されている。一部の実施形態では、切断可能配列は、エンドソーム中に存在するプロテアーゼのための認識配列である。
【００４６】
酸に不安定な成分もまた当技術分野で既知であり、Ｒｉｎｉｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（４９）４１：９３０７−９３２０（１９９３）にあるように、４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）酪酸（シグマ）を含んでも良い。
【００４７】
非ペプチドＭＨＣ結合成分
一部の実施形態では、ＭＨＣ結合成分は、アミノ酸配列よりはむしろ、小分子、ポリマー、またはペプチド類似体である。この実施形態では、複合体ワクチンは、タンパク質またはペプチドでないキャリア分子と結合した細菌、ウイルス、寄生生物または腫瘍由来の多糖またはオリゴ糖を含んでもよい。当分野の技術であれば、ＭＨＣ−ＩＩ結合部位に合う適切な大きさの任意の分子を選択、使用し、静電気的な、疎水性の、ファンデルワールスの、または他の既知の２分子を相互に結合させる化学力によってその部位に結合することが可能であろう。１つの例が双性イオン分子、例えば、ポリサッカライドＡ（ＰＳＡ）のような双性イオン炭水化物である。これらは、ＭＨＣ−ＩＩへの結合を可能にする双性イオン電荷または疎水性特性等の物理化学的特性を有する合成分子であってもよい。誘導された免疫応答の標的になるべき多糖またはオリゴ糖は、このキャリア分子に結合される。キャリアがペプチドに代わりアンカーとして作用してＭＨＣ−ＩＩに結合し、本出願に記載された糖化ペプチドと類似の方式でＴ細胞受容体による標的多糖またはオリゴ糖の認識が可能となろう。これらの新規糖化キャリア分子は、ヘルパー機能および抗体産生に必要なＴ細胞応答を誘導することが可能となろう。
【００４８】
ＰＳＡのような天然の双性イオン多糖の代わりに、化学的に改良した、構造的に明確なオリゴ糖をキャリア分子として使用可能である。
【００４９】
糖化ペプチドナノ粒子
本明細書記載の糖化ペプチドに切断可能リンカーを介して結合したナノ粒子も、本発明に従って作ることができる。従って、本発明は、さらに生体適合性ナノ粒子に結合した糖化ペプチドを含む組成物を含み、任意選択でそのナノ粒子を経由してＡＰＣ、例えば、ＤＣやＢ細胞を標的にする共存抗体を一緒に含んでもよい。ＭＨＣ結合配列を含むペプチド単位がナノ粒子に結合している場合の実施形態では、各ペプチドとナノ粒子の間に切断可能成分が存在することになる。代表的ナノ粒子には、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．７：９６８-９７４（２００７）に記載されたものが含まれる。
【００５０】
本明細書記載の方法や組成物に使えるナノ粒子は、（ｉ）生体適合性がある、すなわち、製薬上妥当な量を使用した場合、生きた動物に重大な有害反応を引き起こさない；（ｉｉ）結合成分が共有結合で結合可能な特徴的官能基、（ｉｉｉ）相互作用成分のナノ粒子に対する低い非特異的結合性を示す、および（ｉｖ）溶液中で安定である、すなわち、ナノ粒子が沈殿しない、という要件を満たす物質から作られる。ナノ粒子は、単分散の（ナノ粒子一個が物質の単結晶、例えば、金属の単結晶）であっても、多分散（ナノ粒子一個が複数の結晶、例えば、２、３、または４個）であってもよい。
【００５１】
多くの生体適合性ナノ粒子、例えば、有機または無機ナノ粒子、が当技術分野で既知である。リポソーム、デンドリマー、炭素ナノマテリアルおよび高分子ミセルが有機ナノ粒子の例である。量子ドットも使用可能である。無機ナノ粒子には、金属ナノ粒子、例えば、Ａｕ、Ｎｉ、ＰｔおよびＴｉＯ２ナノ粒子が含まれる。磁気ナノ粒子もまた使用可能で、例えば、デキストランまたはＰＥＧ分子に囲まれたＦｅ２＋および／またはＦｅ３＋コアを有する１０〜２０ｎｍの球状ナノクリスタルがある。
【００５２】
一部の実施形態では、コロイド金ナノ粒子が使われ、例えば、Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１）：８３−９０（２００８）；米国特許第７０６０１２１号；７２３２４７４号；および米国特許公開公報２００８／０１６６７０６に記載されている。多機能ナノ粒子を構築し使用するための適切なナノ粒子および方法が、例えば、Ｓａｎｖｉｃｅｎｓ ａｎｄ Ｍａｒｃｏ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２６（８）：４２５−４３３（２００８）で考察されている。
【００５３】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、官能基経由で本明細書記載の糖化ペプチドに付着（結合）している。一部の実施形態では、ナノ粒子は、官能基を含むポリマーと結合しており、また、金属酸化物を相互に分散状態に保つ役割もしている。ポリマーは、合成高分子、例えば、限定されないが、ポリエチレングリコールまたはシラン、天然高分子、または合成または天然高分子の誘導体またはこれらの組み合わせ、であってもよい。親水性のポリマーが有用である。一部の実施形態では、ポリマー「コーティング」は、磁性金属酸化物の周りの連続皮膜ではなく、金属酸化物に付着し、取り囲んだ伸長ポリマー鎖の「メッシュ状」または「雲状」である。ポリマーは、デキストラン、プラナン（ｐｕｌｌａｎａｎ）、カルボキシデキストラン、カルボキシメチルデキストラン、および／または還元型カルボキシメチルデキストランを含む多糖や誘導体を含んでもよい。金属酸化物は、相互に接触しているか、またはポリマーにそれぞれ捕捉されるかまたは取り囲まれている１つまたは複数の結晶の集まりであってもよい。
【００５４】
他の実施形態では、ナノ粒子は、非高分子官能基組成物に結合している。ポリマーに結合していない安定化し、官能性を持たせたナノ粒子を合成する方法は既知であり、また、本発明の範囲にある。このような方法は、例えば、Ｈａｌｂｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、８０（５−６）：３７９−９０、１９９８に記載されている。
【００５５】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、直径で約１〜１００ｎｍ未満、例えば、約２５〜７５ｎｍ、例えば、約４０〜６０ｎｍ、または約５０〜６０ｎｍ未満の全体寸法を有する。一部の実施形態では、ポリマー成分は、例えば、コーティングの形で約５〜２０ｎｍまたはそれ以上の厚さであってもよい。ナノ粒子の全体寸法は、約１５〜２００ｎｍ、例えば、約２０〜１００ｎｍ、約４０〜６０ｎｍ；または約６０ｎｍである。
【００５６】
ナノ粒子の合成
ナノ粒子を調製可能な種々の方法があるが、いずれの方法でも、結果はナノ粒子を結合成分に結合するために使用可能な官能基を有したナノ粒子でなければならない。
【００５７】
例えば、糖化ペプチドは、機能性ポリマーまたは表面機能付加した非高分子金属酸化物に共有結合することにより酸化物ナノ粒子に結合可能である。後者の方法では、ナノ粒子は、Ａｌｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、８０（５−６）：３７９−９０（１９９８）の方法の考え方に従って合成可能である。ジメルカプトコハク酸は、ナノ粒子に結合し、カルボキシル官能基を付与する。官能基化されたとは、所望の成分をナノ粒子、例えば、本明細書記載の糖化ペプチドまたは抗体に結合するために使用されるアミノまたはカルボキシルまたはその他の反応基が存在することを意味する。
【００５８】
別の実施形態では、糖化ペプチドは、ナノ粒子に結合した官能基化されたポリマー経由でナノ粒子に結合する。一部の実施形態では、ポリマーは親水性である。具体的実施形態では、複合体は、末端アミノ、スルフヒドリル、またはリン酸塩基を有するオリゴヌクレオチド、および親水性高分子上にアミノまたはカルボキシ基を有する超常磁性鉄酸化物ナノ粒子を使って作られる。カルボキシおよびアミノ誘導体化ナノ粒子を合成するいくつかの方法がある。機能付加し、コートしたナノ粒子の合成法については、以降でさらに詳細に検討する。
【００５９】
カルボキシ官能基化したナノ粒子は、例えば、Ｇｏｒｍａｎ（国際公開番号００／６１１９１参照）の方法に従って作ることができる。カルボキシ官能基化したナノ粒子は、また、強塩基中でブロモまたはクロロ酢酸と反応させてカルボキシル基を結合することにより多糖コートナノ粒子から作ることができる。さらに、カルボキシ官能基化した粒子状物質は、無水コハク酸または無水マレイン酸等の試薬を使ってアミノからカルボキシ基へ変換することによって、アミノ機能付加したナノ粒子から作ることができる。
【００６０】
ナノ粒子寸法は、反応条件を調節することにより、例えば、米国特許第５、２６２、１７６号に記載があるように、温度を変えることにより、制御可能である。均一粒径の材料は、例えば、米国特許第５、４９２、８１４に記載されているように、遠心分離、限外濾過、またはゲル濾過を使って粒子状物質を分別することにより作ることができる。
【００６１】
また、ナノ粒子は、過ヨウ素酸塩で処理して、アルデヒド基を形成することも可能である。アルデヒド含有ナノ粒子を、次にジアミン（例えば、エチレンジアミンまたはヘキサンジアミン）と反応させて、これによりシッフ塩基を形成し、次に水素化ホウ素ナトリウムまたはシアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元することができる。
【００６２】
デキストランコートナノ粒子を、例えば、エピクロロヒドリンを使って作り、架橋することもできる。アンモニアを添加して、エポキシ基と反応させるとアミン基が生成する。Ｈｏｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０００．１１（６）：９４１−６、およびＪｏｓｅｐｈｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９９、１０（２）：１８６−９１を参照。
【００６３】
水可溶のカルボジイミドおよびエチレンジアミンまたはヘキサンジアミン等のジアミンを使ってカルボキシ官能基化したナノ粒子を、アミノ官能基化した磁性粒子状物質に変換可能である。
【００６４】
アビジンまたはストレプトアビジンをナノ粒子に結合させて、オリゴヌクレオチドまたはポリペプチド等のビオチン化結合成分と共に使用可能である。例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、７（３）：３１１−６を参照。同様に、ビオチンをナノ粒子に結合させて、アビジン標識結合成分と共に使用できる。
【００６５】
これら全ての方法で、限外濾過、透析、磁気分離、または他の手段によりナノ粒子から低分子量化合物を分離することができる。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにより、未反応糖化ペプチドをリガンドナノ粒子複合体から分離することができる。
【００６６】
一部の実施形態では、コロイド金ナノ粒子を当技術分野で既知の方法、例えば、Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１）：８３−９０（２００８）；米国特許第７０６０１２１号；７２３２４７４号；および米国特許公開公報２００８／０１６６７０６に記載のような方法を使って作成可能である。
【００６７】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、ペグ化される（例えば、米国特許第７２９１５９８号；５１４５６８４号；６２７０８０６号；７３４８０３０号、等に記載のように）。
【００６８】
一部の実施形態では、糖化ペプチドを、完全なユニットのようにナノ粒子に結合する；一部の実施形態では、ペプチド単位を、炭水化物が添加される前にナノ粒子に結合する。
【００６９】
複合糖質を構築する方法
本明細書記載の複合糖質で、ペプチドを、例えば、還元アミノ化を使って、共有結合で直接炭水化物に結合するのが好ましい。他の方法は当技術分野で既知である。例えば、Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８０：２９４５-２９５０（２００６）、および引用文献を参照。化学的リンカー、すなわち、ヘキサン酸、アジピン酸、またはその他の二官能性カップリング分子、を使わないのが好ましい。例えば、Ｊｏｎｅｓ、 Ａｎａｉｓｄａ Ａｃａｄｅｍｉａ Ｂｒａｓｉｌｅｉｒａｄｅ Ｃｉeｎｃｉａｓ ７７（２）：２９３−３２４（２００５）を参照。
【００７０】
複合糖質は当技術分野で既知の方法、例えば、他の複合糖質ワクチンを作る方法、を使って構築可能である。例えば、Ｐｕｒｃｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．６：４０４−４１４（２００７）；Ｆａｌｕｇｉｅｔａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：３８１６-３８２４（２００１）；Ｄｚｉａｄｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．１４：５９０８-５９１７（２００８）を参照。
【００７１】
代表的複合糖質
Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）複合糖質：ＧＢＳは、新生児の重篤な細菌感染の主要原因である。Ｓｃｈｕｃｈａｔ、Ｌａｎｃｅｔ、３５３：５１−５６（１９９９）。症例の約８０％で、病原体の直接母子感染により新生児のＧＢＳ感染が起こり、この病原体は健全な女性の２５〜４０％の肛門生殖器粘膜にコロニー形成する（上記Ｓｃｈｕｃｈａｔ（１９９９）論文で解説されている）。出産前に適切な抗生物質を全てのＧＢＳ陽性の女性に投与すべきである（ＧＢＳ疾患発生率を劇的に減らす処置）とする疾病管理予防センターの勧告にも拘わらず、米国だけでも、ＧＢＳは、いまでも新生児の年間２５００例の感染と１００例の死亡の原因となっている。いずれにせよ、この抗生物質治療を提供するという政策は、抗生物質抵抗の恐れのために、長期的には継続できそうもない。従って、通常、有効なワクチン接種が長期にわたるＧＢＳ疾患の発生率を減らす唯一の手段であると考えられている。
【００７２】
ＧＢＳワクチン開発の理論的根拠は、新生児感染のリスクがＧＢＳを取り囲む莢膜多糖（ＣＰＳ）抗原に特異的な抗体の母体中レベルに逆比例するという観察に裏付けられている（ＤｅＪｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６（２）：２０５−２１３（２００４）；Ｐａｏｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、６９：６６９６−６７０１（２００１））。その意味は、防御的ＩｇＧが胎盤を介して母親から乳児に移されるということである。本明細書記載のＧＢＳに対するワクチン開発の手法は、精製ＣＰＳ抗原で調製した複合体ワクチンの生成である。全９つのＧＢＳ血清型に対する複合体ワクチンを開発し、類似血清型のＧＢＳに対して機能的に活性であるＣＰＳ特異的ＩｇＧを誘導する前臨床試験で提示した。Ｐａｏｌｅｔｔｉ ａｎｄ Ｍａｄｏｆｆ、Ｓｅｍｉｎ Ｎｅｏｎａｔｏｌ、７：３１５−３２３（２００２）。
【００７３】
Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶ型ＧＢＳ由来のＣＰＳで調製した複合体ワクチンの１相および２相臨床試験で、健康な大人において、これらの調製が安全で、高度の免疫原性を示すことが明らかになった。（ＰａｏｌｅｔｔｉおよびＭａｄｏｆｆ（２００２）の上記論文で概説）。ＧＢＳワクチン研究の長い歴史により、このワクチンが、複合糖質抗原プロセッシング、提示および刺激されたＴ細胞による応答のキャラクタリゼーションの研究のための理想的プロトタイプになっている。記載されたＧＢＳＩＩＩ複合糖質は「モデル」抗原であり、現実の、重要な疾患に関連している。
【００７４】
製剤処方
本明細書記載の治療に有効な量の１つまたは複数の組成物（すなわち、有効な（治療用）試薬として、単独またはナノ粒子に結合して、本明細書記載の複合糖質を含む）は、患者、例えば、ヒト、への投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。このような組成物は、通常、組成物および薬剤的に許容可能なキャリアを含む。本明細書で使われる用語の「薬剤的に許容可能なキャリア」は、医薬品の投与に適合する、任意かつ全ての溶媒、分散媒、被覆材、抗菌および抗真菌剤、等張吸収遅延剤、等、を含むことが意図されている。薬剤的活性物質のためのこのような媒質と試薬の使用は既知である。従来の媒質または試薬がその活性化合物と不適合である場合を除き、このような媒質は本発明の組成物に使用可能である。補充性活性化合物、例えば、リガンド分解抑制剤、もまた、組成物に組み入れることができる。
【００７５】
医薬組成物は、目的の投与経路に適合するように処方可能である。非経口、皮内、または皮下への適用に使われる溶液または懸濁液には、次の成分が含まれる：無菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒；抗菌薬、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸またはナトリウム重亜硫酸塩；キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩および浸透圧調製用薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムで調整可能である。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブル注射器または多人数用バイアル中に封入できる。
【００７６】
注射可能な用途に適した医薬組成物には、無菌注射用溶液または分散液の即時調製のための無菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液および無菌粉末が含まれる。静脈内投与に対する適切なキャリアには、生理食塩水、静菌性水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ（登録商標）（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー）または燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全てのケースで、組成物は無菌でなければならず、また、容易に注射可能である程度に流動性が必要である。製造と貯蔵の条件下で安定でなければならず、また細菌や真菌等の微生物の汚染活動に対し保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、等）、および適切なそれらの混合物を含む溶剤または分散媒であってもよい。例えば、レシチンのようなコーティングによって、分散液の場合には必要粒径の維持によって、また、界面活性剤の使用によって、適した流動度を維持可能である。微生物の活動の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、等の種々の抗菌性および抗真菌性薬剤によって達成できる。多くの場合、等張薬剤、例えば、糖質、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、を組成物中に含めることが好ましいと考えられる。注射用組成物の遷延吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン、を含めることにより生じさせることができる。
【００７７】
無菌注射用溶液は、必要に応じ、単独または上に列挙した成分の組み合わせと共に適切な溶剤中に入れた必要量の組成物（例えば、本明細書記載の試薬）を組み込み、続いて濾過滅菌することにより調製できる。通常、分散液は、活性化合物を、基本的分散媒および上に列挙したものの中から必要な他の成分を含む無菌賦形剤中に組み入れることにより調製できる。無菌注射溶液調製用の無菌粉末の場合は、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥で、これら方法により、前に濾過滅菌した溶液から有効成分プラス任意の追加の所望の成分を得ることができる。
【００７８】
経口組成物は、通常、不活性の希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセル剤に封入されるか、錠剤に圧縮成形されうる。経口治療投与の目的のため、活性化合物が賦形剤と一緒に組み入れられ、錠剤、トローチ、またはカプセル剤の形で使うことができる。また、経口組成物は、口腔洗浄薬としての用途に流動性キャリアを使って調製可能である。この場合、流動性キャリア中の化合物は、経口で適用され、うがいされ、はき出され、または飲み込まれる。薬剤的に適合したバインダー、および／またはアジュバント物質が組成物の一部として含まれてもよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ等は、下記の成分、または類似の特性の化合物のいずれかを含んでもよい：バインダー、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプンまたはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ（登録商標）（ナトリウムカルボキシメチルデンプン）、またはコーンスターチ；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳＴＥＲＯＴＥＳ（登録商標）；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味料、例えば、ショ糖またはサッカリン；または香味料、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料。
【００７９】
全身性の投与も経粘膜的または経皮的手段により可能である。経粘膜的または経皮的投与には、浸透されるべきバリアに対し適切な浸透剤が製剤中に使用される。このような浸透剤は、一般的に既知であり、例えば、経粘膜的投与に対しては、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜的投与は、点鼻薬または坐剤の使用により達成可能である。経皮的投与に対しては、活性化合物は、当技術分野で一般的に知られているように、軟膏、塗剤、ゲル、またはクリームに製剤される。
【００８０】
一実施形態では、活性化合物は、埋没物およびマイクロカプセル化したデリバリーシステムを含む放出制御処方のような、体内からの急速排除に対して化合物を保護するキャリアと共に調製される。エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを使用可能である。これらの製剤を調整する方法は当業者には自明であろう。また、市販材料が、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃから入手可能である。リポソーム懸濁液（モノクローナル抗体とウイルス抗原複合体に感染した細胞を標的にしたリポソームを含む）も薬剤的に許容可能なキャリアとして使用可能である。これらは当業者に既知の方法、例えば、米国特許第４、５２２、８１１号に記載のような方法、を使って調整可能である。
【００８１】
核酸分子は、ベクターに挿入でき、遺伝子治療ベクターとして使用可能である。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５、３２８、４７０号）または、定位注入（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ ９１：３０５４−３０５７、１９９４参照）によって、患者に送達可能である。遺伝子治療ベクターの薬剤には、受容可能希釈剤中の遺伝子治療ベクターが含まれ、または遺伝子送達賦形剤が埋め込まれた徐放基質を含むことも可能である。あるいは、全遺伝子送達ベクターが、組み換え型細胞から未変化で作られる、例えば、レトロウイルスベクター、場合は、薬剤が遺伝子デリバリーシステムを作る１つまたは複数の細胞を含んでもよい。
【００８２】
投与インストラクションと一緒に、医薬組成物を、容器、パック、またはディスペンサー中に入れることができる。一態様では、医薬組成物を、キットの一部として入れることもできる。
【００８３】
通常、医薬組成物を投与する用量により、毒性、刺激またはアレルギー反応のような望ましくない副作用もなく、予防および／または治療のための意図した目的の遂行が促進される。個人のニーズは変化するかもしれないが、製剤有効量の好適範囲の決定は、当分野の技術の範囲内で可能である。ヒト用量は、動物の研究から容易に推定可能である（Ｋａｔｏｃｓ ｅｔ ａｌ．、２７章：「レミントンの薬科学」、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、イーストン、ペンシルベニア州、１９９０）。通常、製剤の有効量を得るために必要な用量は、当業者により調節可能であるが、いくつかの因子により変化するものである。これらの因子には、受診者の年齢、健康、身体的病状、体重、タイプおよび疾患または障害の程度、もし必要なら、治療の頻度、同時実施治療の性質、および所望の効果の性質と範囲が挙げられる（Ｎｉｅｓ ｅｔ ａｌ．、３章：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ'ｓ「治療の薬理学的基礎」、第９版、Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．、ｅｄｓ．、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、ニューヨーク、ニューヨーク州、１９９６）。
【００８４】
免疫応答を誘導する方法
本明細書には、また、例えば、哺乳類動物、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳類動物の患者の免疫応答を誘導する方法も提供されている。本明細書記載の複合糖質は、例えば、ワクチンとしての使用のために、未変性多糖自体に対する免疫応答を誘導するのに特に有効である。従って、この方法には、免疫保護が必要な患者の特定、および患者の免疫応答を誘導するのに十分な量の本明細書記載の複合糖質の患者への投与が含まれる。一部の実施形態では、方法には、患者への１回または複数回の追加の投与、例えば、追加の接種が含まれる。
【００８５】
本明細書記載の方法は、任意の患者に適用可能であるが、免疫力が低下したまたは免疫不全の患者、およびワクチン接種に対し典型的な応答不良患者、ならびに感染リスクが高い人に特に有効である。このような患者には、非常に若い人（例えば、２４月齢未満の乳児）、末期腎臓疾患（ＥＳＲＤ）の患者（特に血液透析の人）、化学療法と照射治療を受けている癌患者、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの患者、アルコール中毒者、薬物乱用者、糖尿病患者、高齢者（特に長期介護施設にいる人）、侵襲性手術の患者（例えば、器官移植）、および急性期ケア環境にある他の患者が挙げられる。
【００８６】
一部の実施形態では、本明細書記載の組成物は、アジュバントまたは免疫賦活薬と同時投与される。一部の実施形態では、本明細書記載の組成物は、アジュバントまたは免疫賦活薬のいずれも伴わず投与される。
【実施例】
【００８７】
本発明はさらに下記の実施例により説明されるが、これは請求項に記載された本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１−モデル複合糖質の炭水化物部はＭＨＣ−ＩＩを介してＡＰＣ表面で発現する
複合糖質がどのようにしてＴ細胞を活性化するかについて、現在受け入れられているパラダイムは、炭水化物が非常に強力な共有結合によりタンパク質に結合（多くの場合二級アミン）しているにしても、Ｔ細胞にペプチドが提示され、認識されるということだけである。この古典的仮説では、ＡＰＣ内の多糖に何が起きているか、またはエンドソーム中でどのようにして炭水化物とタンパク質を分解し、正しいペプチドをＴ細胞に提示するか、説明できない。しかし、特定のＣＰＳ−例えば、総腸管グラム陰性偏性嫌気性菌バクテロイデスフラジリスの多糖Ａ（ＰＳＡ）−は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を介して自然免疫系を活性化し、獲得免疫系と連携して自然免疫系がこれらの分子に応答して作用する。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２０３：２８５３−２８６３（２００６）．ＰＳＡは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によりプロセッシングされ、主要組織適合性クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）経路を介してＣＤ４＋Ｔ細胞に提示される。結果的にＴ細胞が活性化される。Ｃｏｂｂ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、１１７：６７７−６８７（２００４）。本発明者等は、糖化ペプチドは、正しくプロセッシングされておれば、提示専門細胞ＡＰＣによりＴ細胞に提示されることが可能である、との仮説を立てた。この新しい概念は、複合体ワクチンおよび糖タンパク質含有ウイルスおよび細菌による感染に関し、古典的教示に反する。仮説が探究の価値があるか否かを判定するために、ＧＢＳＩＩＩを使って実験を行った。このＧＢＳＩＩＩの反復ユニット構造をモデル多糖として図１に示す。ＧＢＳＩＩＩは、古典的Ｔ細胞非依存的抗原であると考えられる。Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、６７：６３７５−６３８４（１９９９）。マウスでは、キャリアタンパク質に共有結合で結合する場合のみに、ＧＢＳＩＩＩを使った免疫化により有意な量のＩｇＧ抗体が誘導された（図１には、複合化に使われる代表的化学反応を示す）。
【００８８】
実施例２−糖化ペプチドはＡＰＣ表面に提示される
ＭＨＣＩＩ結合糖化ペプチドがＡＰＣ表面に提示されるか否かを判定するために、免疫共沈降（ｃｏ−ＩＰ）、フローサイトメトリー、およびウェスタンブロット実験を行った。最初、ＰＳＡおよびＮ−アセチル化ＰＳＡのように、純粋なＧＢＳＩＩＩがＡＰＣのエンドソーム内で解重合されるか否かを評価した。（Ｃｏｂｂ ｅｔ ａｌ．（２００４）、同上を参照）、（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５（１３）：５１８３−５１８８（２００８））にあるＰＳＡに関する報告と同じ方法を使って、放射標識したＧＢＳＩＩＩをラージＢ細胞と共に１８時間インキュベートした。次に、ミクロソームをラージ細胞から単離し、エンドソーム内のＧＢＳＩＩＩ分子の大きさ（大きさにばらつきがあり、平均で約１５ｋＤａであるが、カラムの総容積にいくつかの物質が含まれている）が元の分子（平均で１５０ｋＤａ；カラムの空隙容積に溶出）よりも有意に小さいことを確認した（図２ａ）。ｃｏ−ＩＰ実験（図２ａ）の次に、ＰＳＡの場合の報告（Ｃｏｂｂ ｅｔ ａｌ．（２００４）、同上を参照）と類似の実験を行った。表面免疫複合体をｍＡｂとＭＨＣＩＩの複合体と沈降させた。細胞を純粋な非複合多糖とインキュベートした場合、予想通り、ＭＨＣＩＩの存在下、ＧＢＳ炭水化物は細胞表面に認められなかった。これらのデータにより、複合ＧＢＳＩＩＩはエンドソーム内で解重合されるが、純粋な炭水化物はＭＨＣＩＩ分子にロードされ得ず、従って細胞表面に提示できないことが明らかである。ＰＳＡ−ＭＨＣＩＩ結合への化学反応のキーは双生イオン電荷モチーフであり、これは、非複合ＧＢＳＩＩＩ（他の炭水化物と同様に）では欠けている。３Ｈデキストランは同様にエンドソーム内でプロセッシングされることがわかった。これらの知見は、多糖にＴ細胞非依存性を与える少なくとも１つの機序が、必ずしもＡＰＣが多糖をＭＨＣ−ＩＩにロードできる大きさに解重合できないことではなく、ＭＨＣＩＩに結合できないことであることを示唆している。
【００８９】
複合糖質（［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ）のマウス脾臓単核細胞（図２Ｃ）またはラージＢ細胞（図３Ａ）とのインキュベーション後のｍＡｂとＭＨＣＩＩ複合体を使ったｃｏ−ＩＰ実験で、［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩが表面結合していることが示された。［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡを抗原とするｃｏ−ＩＰ実験では、表面結合ＧＢＳＩＩＩは、Ｃ５７Ｂｌ／６野生型マウスおよび種々のノックアウト株（図２Ｃ）由来の脾細胞上の抗ＨＬＡ−ＩＡ／ＩＥを用いて探索された。野生型およびＭＨＣＩマウス由来の脾細胞は、両方ともその表面上に炭水化物を提示した（約１０ｋＤａ）が、ＭＨＣＩＩ（Ｈ２−Ａｂ１）マウス由来細胞は、その表面にＧＢＳＩＩＩが欠けていた。ＡＰＣとしてラージＢ細胞を使ったｃｏ−ＩＰでは、ＨＬＡ−ＤＲ分子の存在下、炭水化物エピトープが細胞表面に存在したことが立証された（図３Ａ）。ＭＨＣ分子が炭水化物を提示していることおよび複合糖質ワクチン中での炭水化物提示がキャリアとしてのＯＶＡに特異的でないことを証明するために、破傷風トキソイド（［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ）に結合したＧＢＳＩＩＩの複合体を調製した。ラージＢ細胞および後者のワクチン構築物を用いたＣｏ−ＩＰ調査でも、また、ＨＬＡ−ＤＲの存在下、ＧＢＳＩＩＩがラージＢ細胞表面上に存在する（図３Ｂ）が、ＭＨＣＩＩ欠如ラージ由来細胞株、ＲＪ２．２．５の表面に存在しないことが示された。全てのｃｏ−ＩＰ実験で、ｍＡｂとＬＡＭＰ−１複合体を陰性対照として使用したが、これは細胞表面には無く、エンドソームの区画中にのみ存在している。
【００９０】
ｃｏ−ＩＰ実験の検証のために、フローサイトメトリーを使ってＡＰＣによる炭水化物エピトープの提示を調べた。マウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、ＧＢＳＩＩＩ、ＯＶＡ、またはＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡと共に１８時間インキュベートした。細胞をＧＢＳＩＩＩ特異的なフルオロフォア複合ｍＡｂを用いて４℃で標識し、次に固定した。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡインキュベートしたＢＭＤＣの膜のみＧＢＳＩＩＩ抗体で標識し、純粋な非複合ＧＢＳＩＩＩまたはＯＶＡとインキュベートした細胞の膜には標識しなかった（図２Ｄ）。
【００９１】
上記実験では、多糖がキャリアタンパク質に複合化しているときのみ、炭水化物エピトープはＭＨＣＩＩ経路で提示され屡ことが明らかになった。この観察に対する１つの説明は、ＧＢＳＩＩＩ炭水化物エピトープ（例えば、糖化ペプチド中の）に結合しているときのみ、それらのエピトープは分子結合できるということである。おそらく、共有結合で炭水化物エピトープに結合しているペプチドエピトープが生成し、ＭＨＣＩＩに結合し、そして炭水化物をＭＨＣＩＩ分子上のＡＰＣ表面に運ぶ。この可能性を、ＭＨＣＩＩタンパク質により提示されたものがペプチドに化学的に結合したＧＢＳＩＩＩであるかどうかを調べることにより検討した。キャリア分子として単一ペプチドエピトープを含む複合糖質と共にインキュベートしたラージＢ細胞の細胞表面抽出物に対してウェスタンブロット実験を行った。卵白アルブミンペプチドエピトープ、ＯＶＡ３２３−３３９、をＧＢＳＩＩＩに複合化しＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐを形成した。ＯＶＡ３２３−３３９は、ＯＶＡ（２３）のＴおよびＢ細胞エピトープを示す。このペプチドは、そのＮ末端でＮ−アセチル化されており、また、Ｃ末端で４つのアミノ酸で伸長して多糖への非ランダム結合を可能にした。この修飾は、ＭＨＣＩＩとαβＴＣＲに対する純粋なペプチド結合に影響を与えなかった。複合糖質のペプチドの炭水化物に対する比率は、重量比で、３：１であった；この値は、ペプチド分子に結合した炭水化物の８平均反復単位に相当し、多糖鎖に沿った約１０ｋＤａの糖化ペプチドエピトープを作り出す値である。１０ｋＤａの大きさは、ラージＢ細胞およびマウス脾細胞とインキュベートした多糖／タンパク質複合体の細胞表面に見つかった解重合された炭水化物の大きさに類似であった。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐおよび純粋なＧＢＳＩＩＩを、それぞれラージＢ細胞とインキュベートし、細胞表面含有物を集め、可溶化して、トリスグリシン／ポリアクリルアミドゲルで操作し、その後、ウェスタンブロット分析のため、２フッ化ポリビニリデン膜に転写した。膜をＨＬＡ−ＤＲ抗体、またはＧＢＳＩＩＩまたはＯＶＡｐに対する抗体とインキュベートした。ＨＬＡ−ＤＲ、炭水化物、およびペプチドを含む免疫複合体の全てで、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐとインキュベートした細胞から得られた細胞表面抽出物のゲル上に約８０ｋＤａにバンドが認められたが、ＧＢＳＩＩＩでインキュベートした細胞からのものでは認められなかった。（図２Ｅ）。ＨＬＡ−ＤＲαβダイマー（それ自体のペプチドを導入したまたは空の）を、前に記載したように（２４）（データは示していない）、約６５ｋＤａのＨＬＡ−ＤＲｍＡｂで標識した。炭水化物はゲル中で蛋白質よりゆっくり動くので、複合体非結合ＨＬＡ−ＤＲと糖化ペプチド-ＨＬＡ−ＤＲ複合体の間の約１５ｋＤａの大きさの差（タンパク質マーカーにより測定）は、糖化ペプチド（約１０ｋＤａ）の大きさを表している。
【００９２】
実施例３−ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡのエンドソームプロセッシング
ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡのエンドソームプロセッシングの動力学に関する予備調査も行った。３時間、６時間、または１８時間のＧＢＳＩＩＩ［３Ｈ］−ＯＶＡとのインキュベーション後、ラージ細胞のエンドソームを集めた（図２Ｂ）。結果は、プロセッシングは３時間で開始され、１８時間までに完了することを示唆している。
【００９３】
予備データは、複合体ワクチン（例えば、ＩＩＩ−ＯＶＡ）の炭水化物部がＡＰＣによりＴ細胞に提示される産物へのプロセッシングという機序に基づき取得された。活性酸素種（ＲＯＳ）による多糖プロセッシングの有望なメカニズムが明らかになった。エンドソーム中のＧＢＳＩＩＩのプロセッシングにおける活性窒素種およびグリコシダーゼの適切な役割がある。
【００９４】
ラージＢ細胞による取り込みの後、ＩＩＩ−ＯＶＡはより小さい分子に分解される（図４Ａ〜Ｃ）。分解は、ヒドロキシルラジカル捕捉剤Ｄ−マンニトール（図４Ａ）または超酸化物捕捉剤４−ヒドロキシルＴＥＭＰＯ（図４Ｂ）によって抑制されるが、ヒドロペルオキシド捕捉剤ピルビン酸塩には抑制されない（図４Ｃ）。
【００９５】
これらのデータは、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡの炭水化物部は、ＡＰＣエンドソーム／リソソーム内でＲＯＳ、最も可能性の高いものとしては超酸化物およびヒドロキシルラジカル、により解重合されることを示している。
【００９６】
ラージＢ細胞株を使ったこの結果により、複合糖質ワクチンが糖化ペプチドエピトープを含むという仮説に対する支持が得られた。要約すると、データは、キャリアタンパク質と複合している場合は、ＧＢＳＩＩＩの約１０ｋＤａの部分が、ＭＨＣＩＩ分子と結合してＡＰＣ表面で提示されるということを示唆している。
【００９７】
３つのキーとなる対照実験を行い炭水化物の提示が実験上の人為産物であったといういかなる可能性をも排除した。最初に、非複合多糖を複合多糖と比較し、非複合多糖がエンドソーム中で解重合したが、表面に提示はされなかった一方、複合化糖質はエンドソーム中の解重合も細胞表面提示も両方行われた。第２に、トリチウム標識複合糖質のプロセッシングと提示をラージ細胞とＲＪ２．２．５細胞（ＭＨＣＩＩタンパク質が欠如したラージＢ細胞株）で比較した。ＲＪ２．２．５細胞で提示が無いことによりラージ細胞で観察されたことはＭＨＣＩＩ分子によるということが明らかになった。最後に、実験全体で、モノクローナル抗体とＭＨＣＩＩ分子、抗ＨＬＡ−ＤＲ複合体と一緒に最終免疫沈降ステップを行った際、表面抽出物も対照抗体（例えば、抗ＬＡＭＰ−１抗体）と共に沈降した。この抗体は陰性対照の働きをした。
【００９８】
Ｂ細胞は、キーとなるＡＰＣであり、プロセッシングされた複合糖質ワクチンの抗原エピトープをＣＤ４＋Ｔ細胞に提示する。従って、これらのプロセッシングと提示の実験でラージＢ細胞株の使用は適切である。一次細胞でこれらの実験を検証するために、マウス脾リンパ球および骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）をＡＰＣとして使って上記実験を繰り返した。
【００９９】
実施例４−ＯＶＡペプチド（ＯＶＡｐ）特異的Ｔ細胞はＩＩＩ−ＯＶＡｐエピトープを認識しない
この実施例は、特定のペプチド（ＯＶＡｐ）を認識するＣＤ４＋Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が、そのペプチドが莢膜多糖（ＧＢＳＩＩＩ）と複合化された場合、同じペプチドを認識しなかったことを実証する実験について記載する。この実験は、糖化ペプチドエピトープの炭水化物部が特定のＴＣＲにより特異的に認識されうるという仮説を裏付ける証拠を集めるため行った。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐがＯＶＡｐ特異的Ｔ細胞クローンならびにＯＶＡｐ単独によるＴ細胞増殖を誘導しないことを示すことにより、ＩＩＩ−ＯＶＡｐがペプチド特異的Ｔ細胞により認識されることができない糖化ペプチドエピトープを有するということが示唆されることになろう。
【０１００】
卵白アルブミン抗原エピトープＯＶＡ３２３−３３９は、ＯＶＡのＴ細胞およびＢ細胞エピトープを表し、これは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける即時型過敏症応答生成と成長にとって重要である。ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８：１６６６３−１６６７０（１９９９）。ペプチドは、ＯＶＡｐの両末端にリジン基を付加（ＯＶＡｐ１９：２つのリジン基を１７ａａＯＶＡｐに追加した１９アミノ酸を指す名称）することにより設計、調製される。このペプチドを、ＧＢＳＩＩＩと複合化（ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ）し、野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の照射ＡＰＣをＢＡＬＢ／ｃまたはＯＶＡｐＴ細胞マウス（Ｄ０１１．１０）由来のＣＤ４＋Ｔ細胞と同時インキュベートするＴ細胞増殖実験を行った；Ｄ０１１．１０は、Ｔ細胞受容体を発現するＴ細胞受容体遺伝子導入系でＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａｄ）分子と連携して卵白アルブミン由来ＯＶＡペプチド３２３−３３９（ＯＶＡｐ）を認識する（図５Ａ〜Ｂ）。ＡＰＣ＋Ｔ細胞混合物をＧＢＳＩＩＩ（８．７μｇ、１０μｇＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ中のＧＢＳＩＩＩ含量に対する当量）、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ（１０μｇ）、ＯＶＡ（４．５μｇ、１０μｇＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ中のＯＶＡ含量に対する当量）、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ（１０μｇ）、ＯＶＡｐ（１．３μｇ、１０μｇＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ中のＯＶＡｐ含量に対する当量）、ＯＶＡｐ１９（１．３μｇ）で刺激した。
【０１０１】
対照として、同じ実験を抗ＨＬＡＩＡ／ＩＥ（および抗ＨＬＡＩＡ／ＩＥに対する対照としてそのアイソタイプ）を添加して繰り返し、Ｔ細胞刺激がＭＨＣＩＩ提示によることを示す。ＯＶＡｐと同じアミノ酸含量で、全体の順番が異なるスクランブルしたＯＶＡペプチド、ｓｃＯＶＡｐ、を調製した。このペプチドを使用して、ＴＣＲ特異性はＯＶＡｐに対してのみであることを示した。このスクランブルしたペプチドは、Ｔ細胞増殖性を誘導しなかった。ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ、１０ｎｇ）およびコンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ、１０ｎｇ）スーパー抗原を陽性対照として使用した（約５０〜１０００刺激指数）。
【０１０２】
本実験の全対照は完璧に機能した。ＭＨＣＩＩ分子が抗ＨＬＡＩＡ／ＩＥによりブロックされると、ＩＩＩ−ＯＶＡ（ｐ）もＯＶＡ（ｐ）もどちらもＴ細胞増殖を刺激できなかった。また、抗ＨＬＡＩＡ／ＩＥのアイソタイプが存在すると、増殖活性は元の値のままであった。このことにより、Ｔ細胞増殖性のＭＨＣＩＩ依存性が明らかである。図５Ａ〜Ｂでは、わかりやすくするため、この実験のキーとなる結果のみを示した。
【０１０３】
ＧＢＳＩＩＩは、野生型ＢＡＬＢ／ｃまたはＯＶＡＴ細胞マウス由来のＴ細胞を刺激しなかった。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡおよびＯＶＡは、２つの異なる細胞集団を選択的に刺激した。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡは、ＢＡＬＢ／ｃＴ細胞の増殖を誘導することができた（ＳＩ：２．１）が、ＯＶＡｐ特異的Ｔ細胞を刺激しなかった（ＳＩ：１．１）。他方、ＯＶＡは、ＯＶＡｐＴ細胞を刺激した（ＳＩ：３．４）が、ＢＡＬＢ／ｃＴ細胞を刺激できなかった（ＳＩ：０．８）。この観察結果は、両抗原は異なるＴ細胞エピトープを介してＴ細胞を刺激していることを示唆している。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡのエピトープはＯＶＡＴ細胞によって認識され得ないが、ＢＡＬＢ／ｃＴ細胞にはＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡエピトープを認識するＴ細胞受容体レパートリーがある。
【０１０４】
ＯＶＡｐおよびＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐの刺激に関して興味ある観察がなされた。ＯＶＡｐは、ＯＶＡｐ特異的Ｔ細胞の極端な増殖を誘導する（ＳＩ：２９３５．０）が、ＢＡＬＢ／ｃＴ細胞の刺激に関しては効果が無い（ＳＩ：０．８５）。他方、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐは、両グループのＴ細胞を刺激する（ＢＡＬＢ／ｃＴ細胞ＳＩ：４．０、ＯＶＡｐＴ細胞ＳＩ：５３．６）。この観察と同じパターンがＯＶＡとＩＩＩ−ＯＶＡの刺激でも認められた。ＢＡＬＢ／ｃＴ細胞は、ＯＶＡｐ用のＴＣＲが欠如しているが、ＩＩＩ−ＯＶＡｐの抗原エピトープを認識でき、これは、ＩＩＩ−ＯＶＡｐおよびＯＶＡｐの両方に対し１つのペプチドエピトープが存在できるだけなので、ＩＩＩ−ＯＶＡｐが糖質分子を伴ったエピトープを有していることを示唆している。この実験から導き出される別の非常に重要な潜在的結論は、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐによるＯＶＡＴ細胞刺激のＴ細胞増殖（ＳＩ：５３．６）が、同量のＯＶＡｐによる刺激（ＳＩ：２９３５．０）に比べて約６０分の一に減少しているので、ＯＶＡｐＴ細胞はＩＩＩ−ＯＶＡｐエピトープを認識しないということであった。
【０１０５】
実際、１０μｇＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ（１．３μｇＯＶＡｐ含量を有す）に比べて、ＯＶＡｐの系列希釈でもまだ良好な刺激を示した（０．１３μｇＯＶＡｐ−ＳＩ：７８１、０．０１３μｇＯＶＡｐ−ＳＩ：３５）。これらの結果は、ＩＩＩ−ＯＶＡｐが糖化ペプチドエピトープを有しており、そのエピトープが提示された場合、ＯＶＡｐＴ細胞のＴＣＲはこの糖化ペプチドを認識せず、ＯＶＡｐ刺激に比べて、これらのＴ細胞の刺激の劇的な減少を生ずることを示唆している。
【０１０６】
実施例５−糖化ペプチドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞の応答
Ｔ細胞は、特定のＭＨＣＩＩ結合炭水化物（ＺＰＳ）を認識し、この認識が生物学的に重要な結果をもたらす。ＭＨＣＩＩ結合に必要なＺＰＳの特有で重要な化学特性は、双性イオン電荷モチーフであり、これにより静電的ＺＰＳＭＨＣＩＩ結合が可能となる。非複合化ＧＢＳＩＩＩおよびほぼ全ての他の炭水化物は、双性イオン電荷モチーフが欠如しており、代わりに、その反復ユニット構造の一部として、負に帯電した基のみか、または帯電基が全くないかである。これらの知見は、多糖にＴ細胞非依存性を与える少なくとも１つの機序は、ＭＨＣＩＩに結合できないことであり、必ずしもＣＤ４＋Ｔ細胞のαβＴＣＲが炭水化物を認識できないことではないことを示唆している。
【０１０７】
Ｔ細胞増殖アッセイを行いエンドソーム中で産生され、ＡＰＣの表面に提示されたＭＨＣＩＩ結合糖化ペプチドの炭水化物部をＴ細胞が認識できるか否かを判定した。野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスをＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡで免疫し、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡにより産生されたエピトープを認識するＴ細胞のレパートリーを増幅した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をこれらのマウスの脾臓から集め、ＡＰＣの存在下、９日間インビトロでＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡによる刺激によりさらに増幅した。この手法は、ＯＶＡ（ペプチド）を認識するＴ細胞のみでなく、ＧＢＳＩＩＩエピトープ（すなわち、ペプチド結合炭水化物の認識により）を認識するＴ細胞およびＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡエピトープ（すなわち、ペプチドと炭水化物両方の認識により）を認識するＴ細胞の増殖も促進する意図があった（このようなＴ細胞があれば）。また、この手順は、９日間の同時培養期間中に、刺激されていないＴ細胞（すなわち、これらの抗原に対し特異的でないもの）を除外した。同時培養後、ＩＬ−２−、ＩＬ−４−、およびＩＦＮ−γ−産生ＣＤ４＋Ｔ細胞を増幅したＴ細胞とＡＰＣの再刺激同時培養の上澄みを使ってＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った（図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃ）。いくつかの抗原をＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用した。最初、Ｔ細胞のＯＶＡおよびＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ再刺激のためのサイトカインのプロファイルを比較した。図６Ｂおよび６Ｃに示すように、ＯＶＡは、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡに比べ有意に高いＩＦＮ−γ分泌、および有意に低いＩＬ−４分泌を誘導した。この結果は、ＯＶＡが、Ｔｈ２およびＴｈ１細胞の両方を刺激する一方、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡは、優先的にＴｈ２細胞を刺激することを示唆している。ＯＶＡ単独に比較して、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡによる多量のＩＬ−４産生は、複合糖質ワクチンに対する至適免疫応答の誘導についての有益な情報を示す可能性がある。
【０１０８】
ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ免疫マウス由来の血清中に現れたＯＶＡ特異的ＩｇＧのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ）は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の両方がＢ細胞を刺激していることを示唆し、一方、ＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１のみ）はＩＬ−４によるＢ細胞刺激を示した（図６Ｄおよび６Ｅ）。この知見は、特有のＣＤ４＋Ｔ細胞集団がＩｇＧスイッチを操作する糖化ペプチドの炭水化物部に応答することを示唆している。
【０１０９】
炭水化物応答Ｔ細胞集団の存在を確認するため、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより再度調査した。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ（前に検討済み）を使った初期の９日間の増幅後使用されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、このアッセイ中でＧＢＳＩＩＩ複合糖質を使って再刺激した。この複合糖質では、ＧＢＳＩＩＩ多糖が異なるキャリアタンパク質、破傷風トキソイド（ＴＴ）、と複合化されＧＢＳＩＩＩ−ＴＴを産生した。使用されたＴ細胞は、最初ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡで増幅されたため、ＧＢＳＩＩＩまたはＯＶＡから産生されたエピトープのみを認識した。この集団がＧＢＳＩＩＩのみを認識するＴ細胞亜集団を含んでいる場合は、それらはＴＴではなく、ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴによって刺激されるであろう。実際、図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃに示されたデータは、この仮定を検証し、Ｔ細胞集団のＧＢＳＩＩＩ多糖の認識を明確に示している。
【０１１０】
実施例６-ＯＶＡｐ特異的ＴＣＲの糖化ペプチドに対する応答
次に、Ｔ細胞応答が１つのキャリアペプチドの方向にのみ向いている複合糖質を構築した。完全長タンパク質との特定の複合体は、複合後、さらに免疫原性の強いペプチドを提示し、単独の場合のタンパク質キャリアにより提示されたペプチドより免疫原性の強いペプチドに対する強化免疫応答が得られる可能性があった。単一のペプチドＴ細胞エピトープを含むＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐを抗原として使用した。ＯＶＡｐ特異的ＴＣＲ遺伝子導入（ＤＯ１１．１０）マウスおよび野生型（ＢＡＬＢ／ｃ）マウスの両方から、各マウス株をＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐで２週おき３回免疫した後、リンパ細胞を採取した。Ｔ細胞増殖実験では、野生型（ＢＡＬＢ／ｃ）マウス由来照射ＡＰＣを、免疫ＢＡＬＢ／ｃマウス（図７Ａ）または免疫ＤＯ１１．１０マウス（図７Ｂ）由来のＣＤ４＋Ｔ細胞と共に同時インキュベートした。ｉＡＰＣ／ＣＤ４＋Ｔ−細胞混合物をインビトロで３つの抗原：ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ（１０μｇ）；ＧＢＳＩＩＩ（７．５μｇ、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐの１０−μｇ用量中のＧＢＳＩＩＩ含量に相当）；およびＯＶＡｐ（２．５μｇ、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐの１０−μｇ用量中のＯＶＡｐ含量に相当）で刺激した。
【０１１１】
ＧＢＳＩＩＩは、野生型ＢＡＬＢ／ｃまたはＯＶＡｐＴ細胞遺伝子導入マウス由来のＴ細胞を刺激しなかった。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐで免疫した野生型マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ワクチンに使われている特異的ペプチドのみが投与された場合よりも、複合体が投与された場合の方が良好に応答した（ｐ＝０．００９）；この意味するところは、ペプチドよりはむしろＧＢＳＩＩＩＯＶＡｐの炭水化物部がＴＣＲに提示されたということである。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐおよびＯＶＡｐの両方に対して同じ単一の抗原性ペプチドとの複合体の形成は、これらの２つの抗原に対する異なるＴ細胞応答が、異なるペプチドエピトープの提示によるということでは説明され得ないことを立証している。ＤＯ１１．１０ＣＤ４＋Ｔ細胞を使って、ＯＶＡｐは非常に強力な増殖応答を誘導した（２８５、０００ｃｐｍ；図７Ｂ）。重要な知見は、同時培養物がＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐで刺激された場合は、ＤＯ１１．１０ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＯＶＡｐを認識しているようには見えなかったことであった。増殖が、同量のＯＶＡｐで刺激した場合（２８５、０００ｃｐｍ）に比べ、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐで刺激したＤＯ１１．１０Ｔ細胞で約１／２３（１２、６８７ｃｐｍ）に低下した。これらの結果は、ＩＩＩ−ＯＶＡｐが、提示されても、ＤＯ１１．１０遺伝子導入ＯＶＡ特異的Ｔ細胞のＴＣＲによって認識されない糖化ペプチドエピトープを持っていることを示唆している。結果として、これらＴ細胞のＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐによる刺激は、ＯＶＡｐによる刺激に比べ激減した。また、これらの知見は、炭水化物がＡＰＣ表面上のＯＶＡｐ提示をマスキングしていることを示唆している。ブレフェルジンＡをＡＰＣ／ＣＤ４＋同時培養時に添加し、ＭＨＣＩＩの提示をブロックした場合（小胞体内部のＭＨＣＩＩ分子をトラップすることにより）、または抗ＨＬＡ−ＩＡ／ＩＥが添加されＴ細胞によるＭＨＣＩＩ認識を阻害した場合、Ｔ細胞刺激は観察されなかった。この結果は、ＭＨＣＩＩによるプロセッシングおよび提示が必要であることを確証させるものである（図７Ｃおよび７Ｄ）。さらに、ＯＶＡｐとして同じアミノ酸含量であるが、全体としては異なる配列のスクランブルしたＯＶＡペプチド、ｓｃＯＶＡｐ、を使用した。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ免疫野生型またはＤＯ１１．１０マウス由来のＡＰＣとＣＤ４＋Ｔ細胞の同時培養物は、スクランブルしたペプチドに応答しなかった（＜５００ｃｐｍ）；すなわち、ＴＣＲはＯＶＡｐ配列のみを有するペプチドに特異的であった。
【０１１２】
実施例７−Ｂ細胞による多糖特異的抗体アイソタイプスイッチ媒介
多糖特異的抗体（ＩｇＧ）の応答がペプチドエピトープの認識によるものか、または炭水化物エピトープの認識によるものなのかを判定するため、ＤＯ１１．１０ＯＶＡｐ特異的ＴＣＲ遺伝子導入マウスおよびＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐで免疫した野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスを使って、ＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ力価を測定した。ＤＯ１１．１０遺伝子導入マウスは、ＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧを産生しなかったが、一方野生型マウスは、ＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧの高い力価を示した（図８Ａ）。さらに、ＤＯ１１．１０マウスおよび野生型マウスは、同等量のＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＭを生じ、この結果は、ＤＯ１１．１０マウスにおけるＩｇＧ産生の欠如が、少ない数のＧＢＳＩＩＩ特異的Ｂ細胞によるものではないことを示している（Ｆｉｇ．８Ａ）。これらの結果は、ヘルパーＴ細胞のＴＣＲによるＧＢＳＩＩＩの認識がＢ細胞による多糖特異的ＩｇＧ分泌を誘導するという仮説を裏付けるものである。ＤＯ１１．１０マウスは、複合糖質ワクチンの炭水化物エピトープを認識するＴ細胞レパートリーが欠如しているので、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞は、Ｂ細胞の多糖特異的ＩｇＧ分泌を誘導できなかった。野生型およびＤＯ１１．１０マウスをＯＶＡｐ（無多糖）で免疫した場合、ＤＯ１１．１０マウスが、より高い力価のＯＶＡｐ特異的ＩｇＧを産生した（図８Ｃ）。後者の実験により、ＤＯ１１．１０マウスのＩｇＧ産生能力の欠如によって、ＧＢＳＩＩＩ特異的抗体産生に失敗したことの説明はできないことを示した。
【０１１３】
実施例８：Ｔ細胞はＡＰＣ表面の複合糖質と連携して提示された炭水化物に応答し得る
データは、ＰＳＡやＧＢＳＩＩＩ等の細菌性ＣＰＳが、エンドソーム中でより小さい分子にプロセッシングされうることを示唆している。これらの炭水化物は、分解された形でＡＰＣ表面上を行き交い、そこで検出されてＭＨＣＩＩに結合するように思われる。既発表研究では、生物学的に重要な結果と共に、Ｔ細胞が特定の多糖（ＺＰＳ）に応答することが明確に示されている。Ｍａｚｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、１２２：１０７−１１８（２００５）；Ｒｕｉｚ−Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ、１０２：１６７５３−１６７５８（２００５）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２０３：２８５３−２８６３（２００６）。次に、ＭＨＣＩＩにより提示された、ペプチドを介してＭＨＣＩＩに結合した炭水化物（糖化ペプチド）にＴ細胞が応答するか否かを判定した。再度、仮説は、複合糖質または糖タンパク質をプロセッシングする場合、タンパク質由来ペプチドエピトープを提示するのと同様に、ＡＰＣが糖化ペプチドをＴ細胞に対し提示するということであった。
【０１１４】
養子免疫細胞移入実験を行った。細胞ドナーＢａｌｂ／ｃマウス群は、ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴワクチンまたはＴＴ単独により初回刺激を受けた。ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ刺激マウスの脾臓由来のＢ細胞（１０８）を未処理Ｂａｌｂ／ｃレシピエント（群当たり６匹のマウス）の２つの群に移入した。これらは、また、ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ刺激またはＴＴ刺激動物由来のＣＤ４＋Ｔ細胞（０．５ｘ１０８）も受けた。ＣＤ４＋Ｔ細部および食塩水レシピエントの未処理マウス由来のＢ細胞を対象として用いた。細胞移入の２４時間後、細胞レシピエントをＧＢＳＩＩＩ−ＴＴワクチンで免疫した。ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ免疫動物由来のＴ細胞を受けたマウスの免疫応答は、ＴＴ単独で免疫された動物由来のＴ細胞を受けたマウスより、有意に向上した（ｐ＜０．０１；図９）。
【０１１５】
全レシピエントマウスが、同じプール（ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ免疫化）由来のＢ細胞を与えられたので、復活免疫化動物の応答の大きさの差異はＴ細胞ソース（ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ刺激対ＴＴ刺激ドナー）に起因する。ＴＴ免疫動物由来のＴ細胞のレシピエントよりも、ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ刺激動物由来のＴ細胞のレシピエントにおいてより好ましいペプチド（より良好なＴ細胞エピトープを伴った）が提示される可能性はある。しかし、ＴＴ免疫復活よりも、ドナーＴ細胞の方がＧＢＳＩＩＩ−ＴＴでより良好に刺激されること、すなわち、ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ刺激ドナー由来のＴ細胞が糖化ペプチドで刺激され、そのため糖化ペプチドを認識したこと、また、復活免疫化動物が複合糖質を受けたために、ＩＩＩ−ＴＴ免疫動物由来のＴ細胞を受けた動物は、今や、ペプチド単独よりも良好な糖化ペプチドを認識するＴ細胞を有すること、等も同様にあり得ることである。
【０１１６】
これらのデータは、Ｔ細胞が、ペプチドと糖化ペプチドを区別して認識するという仮説を裏付けるものである。
【０１１７】
実施例９：ペプチド複合糖質の最適化
マウスをＩＩＩ−ＯＶＡｐ１９（ＯＶＡｐ１９は１９アミノ酸を意味し、ＯＶＡの１７ａａＴＣＲ依存抗原エピトープ、ＯＶＡｐ、の各末端に付加した２つのリジン基を含む）で免疫した場合、ＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧの分泌が観察されなかった。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐがＩｇＭ−ＩｇＧスイッチを誘導できなかったことに対する推定される理由は、ＩＩＩ−ＯＶＡｐの設計に関係のあることかもしれない。この構築物中のペプチドは、ＮおよびＣ末端の両方から多糖に共有結合で結合している。この両側の結合は、高度架橋複合体中にペプチドを捕捉し、エンドソーム中でＭＨＣＩＩ分子によるペプチドの認識を最小化する可能性がある。（図１０Ｂ）。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ延長ペプチド複合体（ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐ）を設計し合成した（図１０Ｃ）。ここで、ＯＶＡｐ（３２３−３３９）をＣ末端上で４アミノ酸で延長し、リジンをＣ末端残基とした。Ｎ末端のアミノ官能性は、Ｎ末端アミンのアセチル化によりブロックした。延長ＯＶＡｐを設計し、合成した：（Ｎ−アセチル）−ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲＥＳＧＫ。このペプチドは、非常に均一な単鎖構築物をもたらすＣ末端リジン基を介してＧＢＳＩＩＩとのみ複合できる。また、延長部分（ＥＳＧＫ）は、ペプチドと糖質の間に空隙を生成し、ＭＨＣＩＩ分子のペプチドに対するアクセスを可能にする。この複合体は、標的特異的であるように設計され（タンパク質特異的免疫応答を誘発するタンパク質キャリアが無い）、また、この構築物は、高度に架橋したタンパク質複合体に比べ分子当たり１オーダー多い抗原エピトープを含む（タンパク質多糖複合体の場合の１〜２エピトープとは対照的に、多糖の１０反復単位毎に１ペプチドがあり１０〜１５糖化ペプチドエピトープになる）。
【０１１８】
４群のＢＡＬＢ／ｃ（群当たり４匹のマウス）を、１）ＧＢＳＩＩＩ単独、２）ＯＶＡ、３）ＩＩＩ−ＯＶＡ、または４）ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐで３回免疫した（０、１４、２８日目）。３５日目に集めた血液から血清を採取した。精製しＧＢＳＩＩＩに対するマウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体を使って各血清中のＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ量を定量した。図１２に示したように、用量反応分析では、ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐまたはＩＩＩ−ＯＶＡで免疫したマウスは、ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐおよびＩＩＩ−ＯＶＡの濃度の増加と共により多くのＩＩＩ−ＩｇＧを産生したことが明らかになった。
【０１１９】
ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐのＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ抗体の分泌を誘導する能力は、このワクチンが、多形核白血球（ＰＭＮＬ）によるＩＩＩ型Ｂ群連鎖球菌の食作用を誘導するのに強力である可能性を示唆している。これを試験するために、ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐで免疫したマウスの血清を使って、オプソニン化貪食作用アッセイを行った。図１１に示すように、ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐ免疫マウスからの血清は、細菌をオプソニン化し、その食作用を可能にすることに関し、ＩＩＩ−ＯＶＡ免疫マウスからの血清と同等の強力さであった。ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐ免疫マウス由来の血清は、ＩＩＩ−ＯＶＡ免疫マウス由来の血清より約７倍少ないＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧを含むことを知ると、ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐ血清のオプソニン化貪食作用を誘導する能力はＩＩＩ−ＯＶＡ血清よりもさらに大きい。
【０１２０】
新生仔マウス保護アッセイを行ってＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐの保護能力を調べた。雌マウスをＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐで免疫したが、これらの免疫雌マウスが妊娠している場合、ＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ抗体が胎盤を通過して胎児に到達する。次に、その子はＩＩＩ型Ｂ群連鎖球菌の攻撃を受けた。攻撃後０、２４、４８、および７２時間の時点でＧＳＢＩＩＩに攻撃された子のパーセント生存率を測定した。図１３に示すように、ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐ免疫母から生まれた子の生存により、ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐがＧＢＳＩＩＩの攻撃に対してマウスを保護する能力を有することが立証された。
【０１２１】
実施例１０−インビボプライミングアッセイ
糖化ペプチドの炭水化物部のＣＤ４＋Ｔ細胞による認識が、複合糖質に対する体液性免疫応答の誘導における主要因子であるか否かを判定するため、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡで初回刺激し、ＧＢＳＩＩＩＯＶＡまたはＧＢＳＩＩＩ−ＴＴで追加免疫した。ＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧの血清中レベルを測定した（図１４）。３群のマウスを対照として使った：（１）ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴで初回刺激と追加免疫したマウス、（２）ＧＢＳＩＩＩで初回刺激し、ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴで追加免疫したマウス、および（３）ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡで初回刺激し、ＧＢＳＩＩＩで追加免疫したマウス。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によるペプチド認識が、Ｂ細胞による多糖特異的ＩｇＧ分泌を誘発することが仮定されている。従って、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡで初期刺激しＧＢＳＩＩＩ−ＴＴで追加免疫したマウスに比べ、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡで初回刺激と追加免疫したマウスＧＢＳＩＩＩに対する血清ＩｇＧの方がより高い力価をしめすことが期待されよう。すなわち、初回刺激キャリアタンパク質からのペプチドに対するＴ細胞の記憶のために、同じキャリアタンパク質による初回刺激と追加免疫の方が異種のキャリアによる追加免疫よりも有意に多くのＴ細胞ヘルプを誘発すると推定できるであろう。あるいは、糖化ペプチドの炭水化物部に対するＴ細胞記憶の状態で、ＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ力価は、複合体中の同じキャリアタンパク質による追加免疫に依存しないであろう。図１４Ａに示すように、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ初期刺激マウスのＧＢＳＩＩＩ−ＴＴによる追加免疫は、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡによる初回刺激と追加免疫と類似のＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ分泌を誘導した（ｐ＞０．０５、ｎｓ）。この結果は、炭水化物特異的免疫応答を誘導するＴ細胞ヘルプは、ペプチド認識ではなく、炭水化物認識を経由して取り込まれることを示している。初回刺激後のＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ力価を図１４Ｂに示す。
【０１２２】
実施例１１．非ペプチドキャリア成分
これらの実験では、ＭＨＣ結合成分は双性イオン炭水化物、すなわち、多糖Ａ（ＰＳＡ）である。ＰＳＡは、双性イオン電荷を有し、ＭＨＣＩＩに結合する。誘導された免疫応答の標的になる多糖またはオリゴ糖がこのキャリア分子に結合する。ＰＳＡキャリアはペプチドに代わりＭＨＣＩＩに結合するためのアンカーの役割をし、標的多糖またはオリゴ糖は、本出願に記載の糖化ペプチドの場合と類似の方法により、Ｔ細胞受容体による認識に使用可能となる。これらの糖化キャリア分子は、ヘルパー機能と抗体産生に必要なＴ細胞応答を誘導する。
【０１２３】
双イオン性ヘパロサン（大腸菌Ｋ５多糖、図１５Ａ参照）オリゴ糖誘導体をＣＤ４＋Ｔ細胞刺激により試験した。双性イオンヘパロサンオリゴ糖をＴ細胞非依存性抗原と複合化し、キャリアのＭＨＣＩＩ分子への結合により、Ｔ細胞への提示を可能とした。双性イオンヘパロサンオリゴ糖に対し、ヒトＴ細胞アッセイを行った。ＳＥＡ抗原（陽性対照）に対するＴ細胞数を１００に正規化した。オリゴ糖を４μｇ／ｍｌとした。Ｔ細胞刺激を８日間にわたり測定した。
図１５Ｂに示すように、これらの構築物は、非常に高いＴ細胞増殖を誘導した。
【０１２４】
追加文献
【０１２５】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と合わせて記載したが、これまでの記述は説明を意図しているもので、本発明の範囲を限定するものではなく、添付の請求項により規定されることは理解されるべきである。他の態様、特徴、および変更は、以下の請求項の範囲に含まれる。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年３月２３日出願の米国仮出願第６１／１６２、６１９号の出願日遡及の特典を主張し、参照によりその全体を本明細書に包含する。
【０００２】
技術分野
本発明は、複合糖質、例えば、複合糖質ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００３】
大抵の病原菌は、通常、高分子量（高ＭＷ）表面多糖を産生し、細菌性表面を被覆し取り囲むカプセルにする。これら表面炭水化物は、移動性貪食細胞および組織定着性マクロファージ（微生物の成長と拡散を制限し、微生物原因疾患を防ぐ能力の多くを説明できる重要な宿主防衛機序を構成する細胞群）による食作用に対抗して細菌性病原体に実質的な保護を提供する（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２００５）。固有の多糖構造は、様々な形で機能し、免疫系との細菌性相互作用に影響を与え、また、炭水化物の微細構造がその特性を−さらに実際に免疫応答特性そのものを−決定づけることができるパラダイムとなる。
【０００４】
数十年前、マウスを使った調査で、炭水化物はＴ細胞非依存性抗原であることが明らかになった。Ｂａｒｒｅｔｔ、Ａｄｖ．Ｐｅｄｉａｔｒ．、３２：１３９−１５８（１９８５）；Ｃｏｕｔｉｎｈｏ、Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．、２４５：１２−１４（１９７３）；Ｃｏｕｔｉｎｈｏ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、３：２９９−３０６（１９７３）；Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、６７：６３７５−６３８４（１９９９）；ＭｃＧｈｅｅ ｅｔ ａｌ．、ＭｉｃｒｏｂｉａｌＩｍｍｕｎｏｌ．、２８：２６１−２８０（１９８４）。精製多糖は、最低限のＩｇＧへのスイッチを伴う、特異的ＩｇＭ応答を誘導する。ＩｇＭからＩｇＧアイソタイプへの免疫グロブリンクラススイッチ誘導失敗、および抗原による再誘発後の抗体産生増加の欠如は、古典的Ｔ細胞非依存免疫応答の特徴である。多糖のタンパク質への結合によりＴ細胞ヘルプを誘発する炭水化物特異的応答が起こり、ワクチンの有効性を改善した。Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、同上；Ｓｏｏｄ ｅｔ ａｌ．、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ、７：３３３−３４７（１９８８）を参照。最近の複合糖質ワクチン創出は、生物医科学における大きなサクセスストーリーの１つとなっている。大抵の免疫集団では、インフルエンザ菌タイプｂの感染症、ワクチン型の小児の肺炎球菌、および髄膜炎菌（グループＢを除く）は、ほぼ駆逐されている。Ｌｅｓｉｎｓｋｉ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋ、Ｃｕｒｒ、Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｏｒｄ．、１：３２５−３３４（２００１）；Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．、３３８：２５３９−２５４７（２００３）。
【０００５】
最近の機構的パラダイムは、複合糖質ワクチンに対する防御反応は免疫系で演じられる「トリック」に基づいているということである。Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、同上；Ｌｅｓｉｎｓｋｉ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｉｎｋ、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４７：１３５−１４９（２００１）．おそらく、抗多糖抗体の産生に特異的なＢ細胞が複合糖質を取り込み、共有結合タンパク質から、ＭＨＣ分子と連携してペプチドを認識するＴ細胞へ、ペプチドを提示するのであろう。Ｂ細胞の刺激（結果的に炭水化物特異的抗体の産生を伴う）およびペプチド認識ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化がＴ細胞ヘルプを生じ、これによりＩｇＧへの免疫グロブリンクラススイッチおよびメモリー応答を促進する。免疫グロブリンクラススイッチおよびＢ細胞メモリーは、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６のＣＤ２８との相互作用を経由の、ＣＤ４０のＣＤ４０リガンドとの相互作用を経由の、また、同様に他の同時刺激分子との相互作用を経由の、Ｂ細胞の同時刺激に依存する。
【０００６】
しかし、Ｔ細胞は、炭水化物を認識することができる。糖ペプチドのプロセッシングおよびＴ細胞によるＭＨＣ−Ｉ／ＩＩ提示と認識に関していくつかの報告がある。Ａｂｄｅｌ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２６：５４４−５５１（１９９６）；Ｃｏｒｔｈａｙ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２８：２５８０−２５９０（１９９８）；Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、４０９（６８１６）：９７−１０１（２００１）；Ｄｚｈａｍｂａｚｏｖ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、３５：３５７−３６６（２００５）； Ｈａｎｉｓｈ ａｎｄ Ｎｉｎｋｏｖｉｃ、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ、７：３０７−３１５（２００６）；Ｈａｕｒｕｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１８０：７３９−７４４（１９９４）；Ｈｕｄｒｉｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、 ２７４：３６２７４−３６２８０（１９９９）；Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５８：３７６９−３７７８（１９９７）；Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２２：１８１９−１８２５（１９９２）； Ｖｌａｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１９６：１４３５−１４４６（２００２）； Ｗｅｒｄｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９：９６１１−９６１３（２００２）．
これらの研究のほとんどは翻訳後にグリコシル化されたタンパク質のプロセッシングと提示に関し検討している。これらのエピトープは、ペプチドに結合した単純な単糖類または二糖類であるように見える。ＭＨＣ−Ｉは、単なるペプチド部位ではなく糖ペプチドのタイプのエピトープに結合することが明らかになっている。さらに、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のプロセッシングされた糖ペプチドへの結合は、ＭＨＣに結合しているグリカンおよびペプチドの両方により形成されたエピトープとＴＣＲの接触に依存することが示された。Ｈａｕｒｕｍ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、１８０：７３９−７４４（１９９４）。例えば、Ｈｏｌｍｄａｈｌとその共同研究者は、ＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）のＴ細胞認識において、エピトープグリコシレーションが重大な役割を果たすことを示した。Ｃｏｒｔｈａｙ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２８：２５８０−２５９０（１９９８）；Ｄｚｈａｍｂａｚｏｖ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、３５：３５７−３６６（２００５）；Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２２：１８１９−１８２５（１９９２）。これらの研究者は、ヒトとラットの健常な関節軟骨で免疫優性Ｔ細胞エピトープがＯ‐グリコシル化されていることを見つけた。腫瘍抗原ムチン様糖タンパク質１（ＭＵＣ１）由来の糖ペプチドエピトープの研究が特に重要である。ＨａｎｉｓｈおよびＮｉｎｋｏｖｉｃ、同上。腫瘍細胞においては、タンパク質グリコシレーションによりＣＤ４＋Ｔ細胞により認識される腫瘍特異的糖ペプチドエピトープが形成される。Ｖｌａｄ ｅｔ ａｌ．（２００２）、同上；Ｗｅｒｄｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９９：９６１１−９６１３（２００２）。グリコシレーションパターンの変化は、Ｔ細胞のエピトープ認識を変化させることができる。ＨａｎｉｓｈおよびＮｉｎｋｏｖｉｃ、同上。
【０００７】
過去１５年間、多糖が主要成分であるいくつかのワクチンで臨床用途への導入に成功している。これらの内、最も成功したワクチンは、複合糖質で、この場合、細菌性標的の莢膜多糖（ＣＰＳ）がタンパク質キャリアと結合し、この結合によりＴ細胞ヘルプが誘発されＩｇＭからｌｇＧへのスイッチ、持続性応答、および小児での免疫原性を促進する。これらのワクチンの成功度合いは、免役される集団やその特異的ワクチンの特性により変わる。例えば、肺炎球菌の複合体は、小児で大いに成功したが、大人では期待に応えることができなかった（Ｓｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５（５１７７）：１３８５−１３８７（１９９４））。
【０００８】
複合糖質ワクチンの調製用の基本的方針として最も広く受け入れられている仮説は、そのワクチンが、おそらく樹状細胞および／またはマクロファージによるプロセッシング後に多糖特異的Ｂ細胞により取り込まれることである。（Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆ．Ｉｍｍ．６７（１２）：６３７５−６３８４（１９９９）；Ｊｏｎｅｓ、Ａｎａｉｓ ｄａ Ａｃａｄｅｍｉａ Ｂｒａｓｉｌｅｉｒａ ｄｅ Ｃｉeｎｃｉａｓ ７７（２）：２９３−３２４（２００５））．その後に、キャリアタンパク質のペプチドエピトープがＴ細胞に提示される。たとえＴ細胞がＭＨＣ−ＩＩ結合ペプチドにより活性化されたにしても、得られたヘルプがこれらの活性化Ｔ細胞により多糖特異的Ｂ細胞に提供され、多糖特異的ＩｇＧの産生を誘導する。しかし、Ｔ細胞エピトープが、複合糖質キャリアから生成されたペプチドにより形成されたかまたは炭化水素とペプチドの両方により作られたエピトープにより形成されたか、あるいはそうでないか、については、ほとんど、ないしは全く情報がない。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、少なくとも部分的には、強化された免疫原性を有し、またそれ故に優れた治療効果を有する複合糖質ワクチンを作る方法の発見に基づいている。
【００１０】
従って、一態様では、本発明は糖化ペプチド複合体（glycated peptide conjugate）を調製する方法を提供する。この方法は、多糖（polysaccharides）集団を取得し；任意選択として多糖集団を処理し約５〜２０ｋＤａ、例えば、約１０〜１５ｋＤａ、例えば、約１０ｋＤａまたは１５ｋＤａ、の平均分子量を有するオリゴ糖の集団を作り；オリゴ糖集団を、切断可能成分（cleavable moieties）、例えば、酸不安定配列またはプロテアーゼ認識配列、例えば、カテプシンまたはカスパーゼ認識配列により相互に結合した複数の反復ペプチド単位を含むポリペプチドと接触させるステップを含み、ここで各ペプチド単位は、
（ｉ）ＭＨＣ−ＩＩ結合配列であって、５０アミノ酸以下、例えば、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、または１５アミノ酸以下、例えば、約８〜１５アミノ酸の結合配列；
（ｉｉ）１つまたは複数のリジン残基；好ましくは、末端、例えば、Ｃ末端、に１つのリジンがあり、内部リジンが無く（一部の実施形態では、各ペプチドは単一のリジン残基をＣ末端に有する）；および
任意選択として（ｉｉｉ）ＭＨＣ−ＩＩ結合配列とリジン残基を結合する１つまたは複数のアミノ酸；から構成され、
例えば、還元アミノ化によって、オリゴ糖をリジン残基に直接結合させるために十分な条件の下、ペプチド単位に対するオリゴ糖の比率が、約１：１になるようにして、
それにより糖化ペプチド複合体を調製する。
【００１１】
一部の実施形態では、各ペプチド単位が同じＭＨＣ−ＩＩ結合配列を含み；他の実施形態では、ペプチド単位が複数のＭＨＣ−ＩＩ結合配列を含む。
【００１２】
別の態様では、本発明は、糖化ペプチド／ナノ粒子複合体の調製方法を提供する。この方法は、多糖集団を取得し；任意選択で多糖集団を処理して約５〜２０ｋＤａ、例えば、約１０〜１５ｋＤａ、例えば、約１０ｋＤａまたは１５ｋＤａの平均分子量を有するオリゴ糖集団を作り；オリゴ糖集団をペプチド単位の集団と接触させるステップを含み、ここで各ペプチド単位は、
（ｉ）ＭＨＣ−ＩＩ結合配列であって、５０アミノ酸以下、例えば、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、または１５アミノ酸以下、例えば、約８〜１５アミノ酸の結合配列；
（ｉｉ）１つまたは複数のリジン残基；好ましくは、末端、例えば、Ｃ末端、に１つのリジンがあり、内部リジンが無く（一部の実施形態では、各ペプチドは単一のリジン残基をＣ末端に有する）；および
任意選択として（ｉｉｉ）ＭＨＣ−ＩＩ結合配列とリジン残基を結合する１つまたは複数のアミノ酸；から構成され、
例えば、還元アミノ化によって、オリゴ糖をリジン残基に直接結合させるために十分な条件の下、ペプチド単位に対するオリゴ糖の比率が、約１：１になるようにして、それにより糖化ペプチド複合体を調製し；生体適合性ナノ粒子を提供し；切断可能なリンカー、例えば、酸不安定配列またはプロテアーゼ認識配列、例えば、カテプシンまたはカスパーゼ認識配列を使って生体適合性ナノ粒子にペプチドＮ末端を結合させる。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、本明細書記載の方法により調製された糖化ペプチド複合体および糖化ペプチドナノ粒子複合体を提供する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、糖化ペプチド複合体を特徴とし、この糖化ペプチド複合体は、
（１）ポリペプチド部であって、切断可能成分、例えば、酸不安定配列またはプロテアーゼ認識配列、例えば、カテプシンまたはカスパーゼ認識配列、により相互に結合した複数の反復ペプチド単位を含み、ここで各ペプチド単位が、
（ｉ）ＭＨＣ−ＩＩ結合配列であって、５０アミノ酸以下、例えば、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、または１５アミノ酸以下、例えば、約８〜１５アミノ酸の結合配列；
（ｉｉ）１つまたは複数のリジン残基であって、好ましくは、末端、例えば、Ｃ末端、に１つのリジンがあり、内部リジンが無い（一部の実施形態では、各ペプチドは単一のリジン残基をＣ末端に有する）リジン残基；および
任意選択として（ｉｉｉ）ＭＨＣ−ＩＩ結合配列とリジン残基を結合する１つまたは複数のアミノ酸；から構成されるポリペプチド部；さらに
（２）好ましくは、約５〜２０ｋＤａ、例えば、約１０〜１５ｋＤａ、例えば、約１０ｋＤａまたは１５ｋＤａの平均分子量を有し、ペプチド単位に対するオリゴ糖の比率が約１：１となるようにリジン残基に直接結合したオリゴ糖部、を含む。
【００１５】
また別の態様では、本発明は、複数の糖化ポリペプチドを含む糖化ペプチド／ナノ粒子複合体を特徴とし、各糖化ポリペプチドは、
（１）ペプチド単位部であって、
（ｉ）ＭＨＣ−ＩＩ結合配列であって、５０アミノ酸以下、例えば、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、または１５アミノ酸以下、例えば、約８〜１５アミノ酸の結合配列；
（ｉｉ）１つまたは複数のリジン残基であって、好ましくは、末端、例えば、Ｃ末端、に１つのリジンがあり、内部リジンが無い（一部の実施形態では、各ペプチドは単一のリジン残基をＣ末端に有する）リジン残基；および
任意選択として（ｉｉｉ）ＭＨＣ−ＩＩ結合配列とリジン残基を結合する１つまたは複数のアミノ酸；から構成されるペプチド単位部；および
（２）オリゴ糖であって、好ましくは、約５〜２０ｋＤａ、例えば、約１０〜１５ｋＤａ、例えば、約１０ｋＤａまたは１５ｋＤａの平均分子量を有し、ペプチド単位に対するオリゴ糖の比率が約１：１となるようにリジン残基に直接結合し、糖化ペプチドがペプチド単位のＣ末端で切断可能はリンカー、例えば、酸不安定配列またはプロテアーゼ認識配列、例えば、カテプシンまたはカスパーゼ認識配列、を介して、生体適合性ナノ粒子に結合しているオリゴ糖、を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、多糖がウイルス、細菌、原虫類、および菌類からなる群より選択された病原体由来である。他の実施形態では、多糖が、腫瘍関連糖タンパク質由来である。
【００１７】
一部の実施形態では、多糖の処理が、多糖をオゾン分解または酵素消化、例えば、１つまたは複数のグリコシターゼ、に曝すことを含む。
【００１８】
一部の実施形態では、各ペプチド単位が、同じＭＨＣ−ＩＩ結合配列を含む。一部の実施形態では、ペプチド単位が、複数のＭＨＣ−ＩＩ結合配列を含む。
【００１９】
また、本発明の別の態様では、患者の免疫応答を誘導する方法を特徴とする。この方法は、本明細書記載の治療に有効な量の糖化ペプチド複合体または糖化ペプチド／ナノ粒子複合体を登用することを含む。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、薬剤的に許容可能なキャリア中の、本明細書記載の糖化ペプチド複合体および／または糖ペプチド／ナノ粒子複合体を含む組成物を提供する。
【００２１】
また、本発明は、本明細書記載の糖ペプチド複合体および／または糖化ペプチド／ナノ粒子複合体の患者の免疫応答を誘導するための使用、および患者の免疫応答を誘導するための薬剤の製造における使用も含む。この薬剤は、感染しているまたは感染のリスクのある患者、または腫瘍のあるヒトに対する感染の治療または予防手段に使用することができる。この薬剤は、本明細書記載に記載のいかなる形態であってもよく、また、単独で投与しても、例えば、アジュバントや免疫刺激薬と組み合わせて投与してもよい。
【００２２】
別に定義されていなければ、本明細書で用いられている全ての技術科学用語は、通常、本発明の属する当業者により理解されているのと同じ意味を有する。方法と材料は、本明細書中で本発明における使用を目的として記載されている；当技術分野で既知の他の適切な方法と材料もまた使用可能である。材料、方法、および実施例は説明のためのみのものであり、制限を意図するものではない。全ての出版物、特許出願、特許、配列、データベース項目、および他の本明細書の参考文献は、全体が参照によって組み込まれる。矛盾が生じた場合には、定義を含め、本明細書が優先する。
【００２３】
その他の本発明の特色と優位点は、以下の詳細な説明と図、および請求項から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ＧＢＳＩＩＩの放射標識とそれに続くキャリアタンパク質／ペプチドとの結合の代表的な方法の模式図である。
【図２】図２Ａ−Ｅはラージ細胞溶解産物の免疫沈降結果を示す。図２Ａは、ラージＢ細胞エンドソームの溶解産物中で分析された［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩを示す線グラフである（１８時間インキュベーション後）。分子の大きさは、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２ゲル浸透クロマトグラフィーにより測定された。細胞表面含有物は、ＨＬＡ−ＤＲ ｍＡｂで免疫沈降された。免疫共沈降産物中には［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ型は認められなかった。図２Ｂは、ラージＢ細胞エンドソームから分析された［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡを示す線グラフである（３時間、６時間、および１８時間のインキュベーション後）。ここでも、分子の大きさの分布をＳｕｐｅｒｏｓｅ １２クロマトグラフィーで求めた。図２Ｃは、マウス脾細胞表面から得て、抗体とＨＬＡＩＡ／ＩＥ複合体と共に免疫共沈降した［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡのＳｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムによる溶出プロファイルを示す線グラフである（１８時間のインキュベーション後）。図２Ｄは、ＧＢＳＩＩＩ、ＯＶＡ、またはＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡとインキュベーション（１８時間）し、続いて、ＧＢＳＩＩＩにＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６３３結合ｍＡｂで細胞表面染色した後のＢＭＤＣのフローサイトメトリー分析結果を示すヒストグラムおよび棒グラフである。図２Ｅは、ＧＢＳＩＩＩ、ＯＶＡｐ、およびＨＬＡ−ＤＲに抗体でそれぞれ染色したＳＤＳゲルのウェスタンブロッティングにより検出されたＨＬＡ−ＤＲと糖化ペプチドエピトープの複合体を示す図である。＊各ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐバンドの定量デンシトメトリー分析は、対応するＧＢＳＩＩＩバンドで正規化して実施した。
【図３】図３Ａ−Ｂはラージ細胞の［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡおよび［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴによる免疫沈降結果を示す。図３Ａは、［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡとインキュベートした（１８時間）ラージＢ細胞からの結果を示す棒グラフである。細胞表面含有物は、ＨＬＡ−ＤＲ ｍＡｂ、および対照としてのＬＡＭＰ−１ ｍＡｂ（ＨＬＡ−ＤＱまたはＨＬＡ−ＤＰ ｍＡｂでの免疫共沈降では、ＬＡＭＰ−１バックグラウンドと比べて、ｐ＞０．０５で、優位な放射能の強化は認められなかった。データは平均±ＳＤ値として表されている。図３Ｂは、［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴをラージＢ細胞由来のＭＨＣ−ＩＩｍＡｂで免疫共沈降した結果を示す線グラフである。Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２分子サイジングカラム分析（三角マーク）により低分子量ＧＢＳＩＩＩ（約１０ｋＤａ）がラージ細胞表面のＭＨＣ−ＩＩ分子に結合していることが明らかになった。陰性対照として、この実験をＭＨＣ−ＩＩ欠損ラージ細胞（ＲＪ２．２．５）で繰り返し行ったが、トリチウム標識したオリゴ糖は細胞表面で検出されなかった（四角マーク）。免疫共沈降に使われたＭＨＣ−ＩＩに対するｍＡｂの対照として、ＬＡＭＰ−１に対する抗体を使用した。この免疫沈降では、カウントは全く検出されなかった。
【図４Ａ】ラージＢ細胞（３ｘ１０６／ｍＬ／ウエル）のエンドソーム中のＧＢＳＩＩＩ［３Ｈ］−ＯＶＡ（２０μｇ、１８００ｃｐｍ／ｎｇ）の処理（プロセッシング）を示す線グラフである。ＧＢＳＩＩＩ［３Ｈ］−ＯＶＡをラージ細胞中で、単独またはＲＯＳ捕捉剤（（４Ａ）Ｄ−マンニトール、（４Ｂ）４−ＯＨ ＴＥＭＰＯ、（４Ｃ）ナトリウムピルビン酸塩）の存在下、１８時間インキュベートした。全細胞溶解産物由来の最終生成物をＳｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムで分析した。
【図４Ｂ】ラージＢ細胞（３ｘ１０６／ｍＬ／ウエル）のエンドソーム中のＧＢＳＩＩＩ［３Ｈ］−ＯＶＡ（２０μｇ、１８００ｃｐｍ／ｎｇ）の処理（プロセッシング）を示す線グラフである。ＧＢＳＩＩＩ［３Ｈ］−ＯＶＡをラージ細胞中で、単独またはＲＯＳ捕捉剤（（４Ａ）Ｄ−マンニトール、（４Ｂ）４−ＯＨ ＴＥＭＰＯ、（４Ｃ）ナトリウムピルビン酸塩）の存在下、１８時間インキュベートした。全細胞溶解産物由来の最終生成物をＳｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムで分析した。
【図４Ｃ】ラージＢ細胞（３ｘ１０６／ｍＬ／ウエル）のエンドソーム中のＧＢＳＩＩＩ［３Ｈ］−ＯＶＡ（２０μｇ、１８００ｃｐｍ／ｎｇ）の処理（プロセッシング）を示す線グラフである。ＧＢＳＩＩＩ［３Ｈ］−ＯＶＡをラージ細胞中で、単独またはＲＯＳ捕捉剤（（４Ａ）Ｄ−マンニトール、（４Ｂ）４−ＯＨ ＴＥＭＰＯ、（４Ｃ）ナトリウムピルビン酸塩）の存在下、１８時間インキュベートした。全細胞溶解産物由来の最終生成物をＳｕｐｅｒｏｓｅ １２カラムで分析した。
【図５Ａ】Ｔ細胞増殖実験を示す棒グラフである。照射ＡＰＣ（１０５／ウエル）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５／ウエル）を、抗原の存在下３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートし（最適化増殖時間）、採取に先立ち３Ｈチミジンで８時間処理した。放射能の取り込みを液体シンチレーションにより測定した。各ＡＰＣ−Ｔ細胞集団に対する３Ｈカウント（ｃｐｍ）を抗原のないＡＰＣとＴ細胞混合物（陰性対照、通常２００−５００ｃｐｍの３Ｈカウントが発生）の３Ｈカウントで除算した。この数値が刺激指数（ＳＩ）である。ＡＰＣは照射されても急速に増殖できないため、３ＨカウントはＴ細胞の増殖を示す。無刺激Ｔ細胞のＳＩを１に正規化した。例えば、３のＳＩは、無刺激（抗原無添加）混合物に比べてその混合物中に３倍多いＴ細胞があると見なすことが可能である。
【図５Ｂ】Ｔ細胞増殖実験を示す棒グラフである。照射ＡＰＣ（１０５／ウエル）およびＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５／ウエル）を、抗原の存在下３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートし（最適化増殖時間）、採取に先立ち３Ｈチミジンで８時間処理した。放射能の取り込みを液体シンチレーションにより測定した。各ＡＰＣ−Ｔ細胞集団に対する３Ｈカウント（ｃｐｍ）を抗原のないＡＰＣとＴ細胞混合物（陰性対照、通常２００−５００ｃｐｍの３Ｈカウントが発生）の３Ｈカウントで除算した。この数値が刺激指数（ＳＩ）である。ＡＰＣは照射されても急速に増殖できないため、３ＨカウントはＴ細胞の増殖を示す。無刺激Ｔ細胞のＳＩを１に正規化した。例えば、３のＳＩは、無刺激（抗原無添加）混合物に比べてその混合物中に３倍多いＴ細胞があると見なすことが可能である。
【図６】図６Ａ−ＥはＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ免疫化に応答したＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の棒グラフである。糖化ペプチドがＭＨＣ−ＩＩによりＡＰＣ表面に提示されると、ＣＤ４＋Ｔ細胞は炭水化物を認識する。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、２倍用量のＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ投与を受けた。これらのマウス由来の脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞をＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡを用いてインビトロで９日間増幅させた。Ｔ細胞分泌ＩＬ−２（図６Ａ）、ＩＬ−４（図６Ｂ）、およびＩＦＮγ（図６Ｃ）の検出のために、増幅されたＴ細胞集団、ならびに、放射未処置マウスの脾細胞のエリスポットアッセイを、異種のキャリア（ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ）に結合したＧＢＳＩＩＩを含むいくつかの抗原と共に実施した。ＴＴ免疫化マウス由来のリンパ球を使った調査の全３つのサイトカインを伴って、陽性対照として、ＴＴは単独で強い応答を誘導した。ＥＬＩＳＡを使って、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡを２回免疫したマウス由来の血清中の、ＯＶＡ（図６Ｄ）およびＧＢＳＩＩＩ（図６Ｅ）特異的なＩｇＧ抗体のサブクラスを評価した。＊ＧＢＳＩＩＩ（５０ｎｇ／ｍＬ）に対する参照抗体のＡ４０５が０．５に達したとき、Ａ４０５が０．５になった希釈度の逆数を抗体力価として記録した。
【図７】図７Ａ−ＤはＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐによる免疫化後のＴ細胞増殖を示す。野生型（ｗｔ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（７Ａ）およびＤＯ１１．１０マウス（７Ｂ）をＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐで３回免疫（２週間隔で）した。未処理照射脾臓ＡＰＣ（１０５／ウエル）を、各マウス株由来のＣＤ４＋Ｔ細胞（１０５／ウエル）と４日間同時培養し、ＯＶＡｐまたはＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ（ＯＶＡｐと同量になるよう調節）で刺激した。採取８時間前に［３Ｈ］チミジンを組み込み、増殖を測定した。データは、平均±ＳＤ値として表した。陰性対照は、ＧＢＳＩＩＩ（７．５μｇ）、組み換えＯＶＡｐ（２．５μｇ）、または無抗原による刺激を含み、全陰性対照に５００ｃｐｍ未満の［３Ｈ］チミジンを組み込んだ。陽性対照として、ブドウ球菌エンテロトキシンＡで同時培養を誘導して野生型Ｔ細胞で５４、７００ｃｐｍ、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞では５００ｃｐｍ未満を組み込む。その細胞が未処理ＤＯ１１．１０マウス由来であるか、またはＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ免疫マウス由来であるかに関わらず、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＯＶＡｐに対する同様の高レベルでの応答は示されていない（７Ｃおよび７Ｄ）。ブレフェルジンＡは抗原提示をブロックし（小胞体中にＭＨＣ−ＩＩをトラップすることにより）、また、ｍＡｂとＩＡ／ＩＥ複合体はマウスＭＨＣ−ＩＩをブロックする。
【図８】図８Ａ−ＣはＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐによる免疫後の抗体力価を示す棒グラフである。ＤＯ１１．１０および野生型（ｗｔ）Ｂａｌｂ／ｃマウスをＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐで３回免疫し、ＥＬＩＳＡを使ってＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ（８Ａ）およびＧＢＳＩＩ特異的ＩｇＭ（８Ｂ）の力価を測定した。また、単独で２回免疫したＤＯ１１．１０およびｗｔマウスのＯＶＡｐ特異的ＩｇＧ力価も示す（８Ｃ）。＊参照抗体のＧＢＳＩＩＩ（５０ｎｇ／ｍＬ）に対するＡ４０５が０．５になったとき、０．５のＡ４０５が得られた希釈度の逆数を抗体力価とした。ｗｔおよびＤＯ１１．１０マウスの両方は、ＧＢＳＩＩＩやＯＶＡｐに対し免疫前に検出可能な抗体が無かった。
【図９】ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ刺激マウス由来Ｂ細胞、およびＴＴ刺激マウスまたはＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ刺激マウス由来Ｔ細胞を投与されたマウスの免疫を復活させるためのＩｇＧ応答を示す線グラフである（両群に対しｐ＜０．０１）。食塩水処理したドナーから未処理ＢおよびＴ細胞を受けたマウスを対照として使った。全群間の差は、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓノンパラメトリック分析により検証した。
【図１０】図１０Ａ−Ｃは３種のワクチンＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ（９Ａ）、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ（１０Ｂ）、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐ（１０Ｃ）を模式的に表現したものである。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡとＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐは嵩高い基質様構造を有するが、他方、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐは高度に均一な単鎖構造を有する。
【図１１】ＩＩＩ−ＯＶＡおよびＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐで免疫化したマウス由来血清の存在下、ヒト血液ＰＭＮＬによるＩＩＩ型Ｂ群連鎖球菌のオプソニン化貪食作用を示す。正常なマウス血清およびＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ免疫マウス由来ウサギ血清を対照として使用した。
【図１２】０．２μｇ、２μｇ、または２０μｇのＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐまたはＩＩＩ−ＯＶＡで免疫したマウスに対する用量反応アッセイ結果を示した棒グラフである。
【図１３】ＩＩＩ−ＴＴ、ＩＩＩ−ＯＶＡ、またはＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐで免疫した母に産まれ、ＩＩＩ型Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳＩＩＩ）の攻撃を受けた子の生存割合を示す棒グラフである。
【図１４】図１４Ａ−Ｂは異なる抗原の組み合わせからなる初回と２回目の投与を受けたＢＡＬＢ／ｃマウスのＧＢＳＩＩＩに対するＥＬＩＳＡによる定量的抗体力価を示す棒グラフである。（１４Ａ）：０日目に刺激され、１４日目に初回抗原刺激と追加免疫抗原の異なる組み合わせで追加免疫したマウスから２１日目に採取した血清のＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ力価（μｇ／ｍＬ）。（１４Ｂ）：ＧＢＳＩＩＩ、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ、またはＧＢＳＩＩＩ−ＴＴで刺激したマウスから１４日目に採取した血清のＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ力価（μｇ／ｍＬ）。＊＊＊ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ刺激、ＧＢＳＩＩＩ追加免疫マウスおよびＧＢＳＩＩＩ刺激、ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ追加免疫マウスは、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ刺激、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ追加免疫マウスおよびＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ刺激、ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ追加免疫マウス（ｐ＜０．０００１）の両方より有意に低いＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ力価を有していた。
【図１５Ａ】双性イオンヘパロサン（例えば、大腸菌Ｋ５多糖体）オリゴ糖誘導体の構造である。
【図１５Ｂ】双性イオンヘパロサンオリゴ糖に対し行ったヒトＴ細胞アッセイの結果を示す棒グラフである。ＳＥＡ抗原（陽性対照）に対するＴ細胞数を１００に正規化した。オリゴ糖は４μｇ／ｍｌであった。Ｔ細胞刺激を８日間にわたって測定した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
前述のように（背景を参照）、Ｔ細胞の複合糖質活性化を説明する支配的パラダイムは、たとえ炭水化物が非常に強力な共有結合（多くの場合の第二級アミン）により蛋白質に結合しているにしても、ペプチドが提示されＴ細胞に認識されるということだけである。この古典的仮説は、ＡＰＣ内の多糖で何が起こっているかや、どのようにして炭水化物とタンパク質がエンドソーム（エンドソーム内で第二級アミン結合を切断する機序は知られていない）内でばらばらになり、次いでＴ細胞にペプチドのみを提示するか、を説明できない。
【００２６】
本明細書に記載のように、糖化ペプチドは、提示専門細胞のＡＰＣにより実際にＴ細胞に提示される。さらに、本複合糖質ワクチン中でＭＨＣＩＩにより提示される炭水化物（約１０ｋＤａ）は、天然起源多糖（通常１００ｋＤａより大きく、数百万ｋＤａまで）よりずっと小さい。
【００２７】
本明細書記載の調査から得られた複合糖質ワクチンのプロセッシングと提示の機序に関する知識は、新生代ワクチンの設計と合成に適用できる。この情報は、本発明者が標的特異的、構造ベースのワクチン候補を設計することを可能にする。限定を意図するものではないが、１つの理論として、この設計は、エンドソームプロセッシングステップを（一部または全部を）省いて、ＭＨＣＩＩ経路による糖化ペプチドの提示をさらに早くする可能性がある。さらに、この設計は、投与ワクチン重量当たりで高比率の免疫原性糖化ペプチドが得られ、また、同じ用量でより強い応答得られる可能性が在り、または使用用量の減少化を可能とする。
【００２８】
このような新ワクチンには、下記のものが含まれる：
１）炭水化物、切断可能リンカーにより結合された反復Ｔ細胞エピトープ、例えば、ＯＶＡｐを含むポリペプチド構築物に共有結合で結合した、例えば、約５〜２０ｋＤａ、例えば、１０〜１５ｋＤａ、の炭水化物（Ｂ細胞受容体に効果的に架橋し、Ｂ細胞を活性化するために必要であれば、さらに小さいまたは大きい）。これは、多くの糖化ペプチド残基を生成する酸性のエンドソーム中のポリペプチドの解重合を可能にする。
２）炭水化物、切断可能リンカーにより結合された複数の異なるＴ細胞ペプチドエピトープを含むポリペプチド構築物に共有結合で結合した、例えば、約５〜２０ｋＤａ、例えば、１０〜１５ｋＤａ、の炭水化物（Ｂ細胞受容体に効果的に架橋し、Ｂ細胞を活性化するために必要であれば、さらに小さくまたは大きくてもよい）。これには、より大きなＴ細胞レパートリーの動員ができるようにすべきである。
３）Ｔ細胞エピトープ、例えば、ＯＶＡｅｘｔｐｅｐ、の１つの末端に切断可能なリンカーで共有結合した、約５〜２０ｋＤａ、例えば、１０〜１５ｋＤａの炭水化物（ＭＨＣ−ＩＩ結合多糖のサイズ）を、例えば、含む複合糖質ワクチンの糖化ペプチド抗原エピトープでコートした生体高分子ベースのナノ粒子。
【００２９】
これらの各実施形態には、下記の要素が含まれる：
Ｉ：炭水化物成分：目的の病原体または腫瘍由来の多糖またはオリゴ糖、任意選択として、約５〜２０ｋＤａ、例えば、１０〜１５ｋＤａの平均分子量を有するように処理され、またはＢ細胞受容体に効果的に架橋し、Ｂ細胞を活性化するために必要に応じさらに小さくまたは大きく；さらに、
ＩＩ：少なくとも１つのペプチド単位であって、ＭＨＣ−ＩＩ結合配列およびリジン、好ましくは１つの末端に１つのリジンを含み、このリジンに炭水化物が直接結合しているペプチド単位。
【００３０】
ペプチド単位は、樹状細胞やＢ細胞等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣ−ＩＩ分子に結合するアンカーとして作用し、このアンカーを介して炭水化物がＭＨＣ−ＩＩに結合し、Ｔ細胞に提示する。ＭＨＣ−ＩＩ結合配列は、ほとんどまたは全く分解が必要でない小さいペプチド単位として提示され、さらに炭水化物は予備消化されＡＰＣによって容易に提示可能であるより小さいサイズになるので、エンドソーム経由のプロセッシング時間が大きく縮小され、より早い免疫応答が得られる。これらの要素を特定し、選択し、調製する方法は、当技術分野でよく知られている。次に代表的要素のリストを示す。
【００３１】
炭水化物抗原
本明細書記載の組成物は、免疫応答が求められる任意の多糖、例えば、任意の病原体、例えば、ウイルス、細菌、真菌、または原虫類、から得られた多糖；糖タンパク質；または細胞、例えば、腫瘍細胞、を使って作ることができる。「多糖」は、通常、グリコシド結合により結合した単糖残基で構成される任意の直鎖または分岐高分子を意味し、従ってオリゴ糖を含む。目的の炭水化物を特定し、入手する方法は、当技術分野で既知である。例えば、Ｄｏｒｍｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１２）：６５９−６６７（２００８）を参照。
【００３２】
炭水化物含有構造体は、細菌表面に多く存在し（Ｎｉｋａｉｄｏ、ＲｅｖＩｎｆｅｃｔＤｉｓ、１０：Ｓ２７９−Ｓ２８１（１９８８））、これには、莢膜、リポ多糖、タイコ酸、ペプチドグリカン、および糖タンパク質が含まれる。ＣＰＳは数百の反復単位からなり、各単位は、１つから８つの糖類を含み、これらは、通常は（常にではないが）グリコシド結合により結合している。糖類の組成物、環形状、リンケージ位置、アノマー中心配置、異性体型、高次構造、および電荷モチーフの変動は全て、免疫性エピトープに存在する差異に寄与する。これらの構造要素のいずれも本明細書記載の方法と組成物に使用可能である。
【００３３】
一部の実施形態では、本明細書記載の複合糖質組成物は、細菌由来の炭水化物、例えば、莢膜多糖（ＣＰＳ）、を使って作られる。代表的な細菌には、肺炎球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、髄膜炎菌、インフルエンザ菌（例えば、インフルエンザ菌ｂ）、チフス菌、志賀赤痢菌、バクテロイデスフラギリス、Ａ群およびＢ群連鎖球菌、サルモネラ、大腸菌、コレラ菌、シトロバクター属、ハフニア属、プロテウス属、ブドウ球菌、および肺炎桿菌が含まれる。例えば、Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８０：２９４５-２９５０（２００６）、およびこの中の引用文献；Ｊｏｎｅｓ、Ａｎａｉｓｄａ Ａｃａｄｅｍｉａ Ｂｒａｓｉｌｅｉｒａ ｄｅ Ｃｉeｎｃｉａｓ ７７（２）：２９３−３２４（２００５）（特に表ＩとＩＩ）およびこの中の引用文献；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：２４０９-２４１８（２００８）；およびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３８：２５３９−２５４７（２００３）、を参照。
【００３４】
一部の実施形態では、本明細書記載の複合糖質組成物は、寄生生物、例えば、細胞表面炭水化物、例えば、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー（ＧＰＩ）、由来の炭水化物を使って作られる。一般的には、細菌は臨床的に関連のある細菌、すなわち、病原性（疾患の原因となる）細菌である。代表的寄生生物には、熱帯熱マラリア原虫（マラリア）；トキソプラズマ原虫（トキソプラズマ症）、および森林型熱帯リーシュマニア（リーシュマニア症）が含まれる。例えば、Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８０：２９４５-２９５０（２００６）、 およびそこに引用された文献を参照。
【００３５】
一部の実施形態では、本明細書記載の複合糖質組成物は、ウイルス由来炭水化物、例えば、ウイルスエンベロープ糖タンパク質、例えば、Ｎ−グリカン由来の炭水化物を使って作られる。一般的には、ウイルスは、臨床的に関連のあるウイルス、すなわち、病原性（疾患の原因となる）ウイルスである。代表的なウイルスには、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（例えば、ＨＩＶ−１糖タンパク質ｇｐ１２０）、ＲＳウィルス（ＲＳＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、水痘帯状疱疹、単純疱疹ウィルス２型、狂犬病、麻疹、およびエボラウイルス、が含まれる。例えば、Ｗａｎｇ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ９（２）：１９４−２０６（２００６）；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８３：２６６３−２６６９（２００２）；Ｌａｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１２２（１２）：８８９−８９８（１９９５）；Ｖａｆａｉ、Ｖａｃｃｉｎｅ １３（１４）：１３３６−１３３８（１９９５）；Ｒｕｉｇｒｏｋ ａｎｄ Ｇｅｒｌｉｅｒ、ＰＮＡＳ １０４（５２）：２０６３９-２０６４０（２００７）、を参照。
【００３６】
一部の実施形態では、本明細書記載の複合糖質組成物は、腫瘍細胞由来の炭水化物、例えば、細胞表面炭水化物、例えば、糖タンパク質由来の炭水化物を使って作られる。代表的糖タンパク質には、ムチン−１（ＭＵＣ−１）（乳癌）、ＮＥＲ−２／ｎｅｕ（乳癌）、癌治療性抗原（ＣＥＡ）（例えば、結腸直腸、肺、乳および膵癌）、ｐ５３、シアリルＴｎ（ＳＴｎ）（乳癌）；およびＧｌｏｂｏＨ（乳および前立腺癌）が含まれる。また、ガングリオシド分子（例えば、ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３）が、いくつかの癌細胞上で再度発現した。例えば、Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８０：２９４５-２９５０（２００６）、 および引用文献；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９（５）：７０７-７１６（２００４）、を参照。
【００３７】
本明細書記載の複合糖質の炭水化物部は、任意選択として天然のまたは完全な多糖を、約１０〜２０ｋＤａ、例えば、１０〜１５ｋＤａ、例えば、１０ｋＤａの平均分子量の集団に分解して調製しても良い。例えば、酸、塩基、酸化手法（例えば、活性酸素または窒素種を使って）、または酵素触媒加水分解を使って、多糖を調製する方法は当技術分野で既知である。例えば、オゾン分解を使うことができ、この方法は、例えば、Ｐａｏｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（３０）１８２７８−１８２８３（１９９０）；Ｋａｌｋａ−Ｍｏｌｌｅｔａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：７１９-７２４（２０００）；および米国特許第６、０２７、７３３号と６、２７４、１４４号に記載されている。一部の実施形態では、複数の方法を組み合わせて所望の平均分子量を有する多糖組成物を作っている。
【００３８】
多糖を分解するプロセスは、当技術分野で既知の方法、例えば、米国特許第６、０２７、７３３および６、２７４、１４４に記載のＦＰＬＣ、を使ってモニター可能で、また、所望の平均分子量になったところで停止できる。
別の実施形態では、天然のまたは完全な多糖が使用可能である。
【００３９】
ＭＨＣ−ＩＩに結合したＴ細胞エピトープ
通常、ＭＨＣ−ＩＩ結合配列は、Ｔ細胞エピトープ、例えば、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞エピトープ（Ｅｔｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４２３−４２５（１９９０））を含むペプチドである。Ｔ細胞ヘルプを誘導できる多くのＣＤ４＋エピトープは、当技術分野で既知である。例えば、Ｅｔｌｉｎｇｅｒｅｔａｌ．、１９９０、同上；Ｖａｌｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：７１７−７２１（１９９２）；Ｓａｄｄｅｔａｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７６：５９９−６０３（１９９２）；Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１４９９−１５０５（１９９２）；Ｋａｌｉｙａｐｅｒｕｍａｌ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５：３３７５−３３８０（１９９５）；Ｄｅ Ｖｅｌａｓｃｏｅｔａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：９６１−９６８（１９９５）；Ｆａｌｕｇｉｅｔａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：３８１６-３８２４（２００１）；およびＢｉｘｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ Ｖ：１７５−１８０（１９８９））を参照。
【００４０】
本発明の方法と組成物に使えるＣＤ４＋エピトープには、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、破傷風毒素（ＴＩ）、熱帯熱マラリア原虫サーカムスポロゾイト、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎核コアタンパク質、Ｈ．インフルエンザ基質タンパク質、Ｈ．インフルエンザ赤血球凝集素、Ｂ群髄膜炎菌外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、肺炎球菌毒素ニューモリシン、および熱衝撃蛋白質、例えば、ウシ結核菌およびライ菌由来の、およびこれらの組換えにより作られ遺伝的に解毒された変異体、または組み換えにより作られた緑膿菌体外毒素Ａまたはブドウ球菌体外毒素またはトキソイドの無毒変異体由来のものが含まれる。例えば、Ａｍｉｒ−Ｋｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：６５５５-６５６３（２００６）；Ａｍｉｒ−Ｋｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １７０：６１６５-６１７１（２００３）；およびＫoｎｅｎ−Ｗａｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１７９：４０３-１３（１９９９）を参照。
【００４１】
一部の実施形態では、ＭＨＣ−ＩＩ結合配列は、ジフテリアトキソイドの交差反応性物質（ＣＲＭ１９７）（Ｓｈｅｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．６５：２４２-２４７（１９９７））、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、または髄膜炎菌の外膜複合体（Ｖｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆ．Ｉｍｍｕｎ．６０：４９７７-４９８３（１９９２））、由来である。例えば、Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８０：２９４５-２９５０（２００６）、およびその引用文献を参照。
【００４２】
Ｔ細胞エピトープペプチドは、合成または組換え、例えば、当技術分野で既知の細菌系や他の細胞培養系での発現、により作ることができる。例えば、組み換え型のペプチドは、ホスト細胞中のコードした核酸から発現により生成することができる。 任意のホスト細胞が特定のワクチン系による個人の要求に応じて使用可能である。 当業者なら、適切なホスト細胞を容易に選択ならびに使用可能であろう。一部の実施形態では、細菌の操作と成長が容易であることから、細菌性ホストが組み換え型蛋白質の産生に使われる。代表的な細菌性宿主 は大腸菌である。例えば、米国特許第６、８５５、３２１号を参照。固相と溶液を組み合わせた方法も使用可能である。例えば、Ｒｉｎｉｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（４９）４１：９３０７−９３２０（１９９３）に記載の方法の改良を参照。
【００４３】
Ｔ細胞エピトープは、いかなる内部リジン残基も含まないことが好ましいが、少なくとも１つのリジン残基を末端、例えば、Ｃ末端に含むように修飾されても良い。一部の実施形態では、ただ１つのリジン残基をＣ末端またはＮ末端に有する。リジン残基の配置は、炭水化物に結合した際のペプチドのＭＨＣ−ＩＩに結合する能力を保持する必要性のみに制約されている。
【００４４】
また、一部の実施形態では、ＭＨＣ結合配列とリジン残基間に１つまたは複数のアミノ酸、すなわちスペーサー配列があってもよい。このようなスペーサー配列は、リジン以外の任意のアミノ酸でよく、また、通常、柔軟で小さなＲ基を有し、これによりＴ細胞に提示するため結合した炭化水素の立体障害を避け、最適の配置およびＭＨＣ−ＩＩに結合するペプチドエピトープに対するアクセスを可能にする。リンカー中に含むことが適切な代表的アミノ酸には、グリシン、アラニン、およびセリンが挙げられる。
【００４５】
ＭＨＣ結合配列が単一ポリペプチド中で直列に結合した場合（ナノ粒子の表面上の場合と対照的に）の実施形態では、ペプチド単位は、切断可能成分、例えば、プロテアーゼまたは他の酵素、または酸に不安定な化学成分により認識され切断されるアミノ酸配列、により結合される。多くのこのような切断可能成分が当技術分野で既知である。例えば、切断可能配列には、カテプシンに認識されるものを含んでもよい。これらは、例えば、ＣｏｎｕｓａｎｄＳｉｍｏｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ７６：１３７４-１３８２（２００８）；Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｍ．２４９：１７１−１７９（１９９７）；Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ １８（１０）：６０５（２００５）；およびＰｌuｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：４６７-４７６（２００２）に記載されている。一部の実施形態では、切断可能配列は、エンドソーム中に存在するプロテアーゼのための認識配列である。
【００４６】
酸に不安定な成分もまた当技術分野で既知であり、Ｒｉｎｉｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（４９）４１：９３０７−９３２０（１９９３）にあるように、４−（４−ヒドロキシメチル−３−メトキシフェノキシ）酪酸（シグマ）を含んでも良い。
【００４７】
非ペプチドＭＨＣ結合成分
一部の実施形態では、ＭＨＣ結合成分は、アミノ酸配列よりはむしろ、小分子、ポリマー、またはペプチド類似体である。この実施形態では、複合体ワクチンは、タンパク質またはペプチドでないキャリア分子と結合した細菌、ウイルス、寄生生物または腫瘍由来の多糖またはオリゴ糖を含んでもよい。当分野の技術であれば、ＭＨＣ−ＩＩ結合部位に合う適切な大きさの任意の分子を選択、使用し、静電気的な、疎水性の、ファンデルワールスの、または他の既知の２分子を相互に結合させる化学力によってその部位に結合することが可能であろう。１つの例が双性イオン分子、例えば、ポリサッカライドＡ（ＰＳＡ）のような双性イオン炭水化物である。これらは、ＭＨＣ−ＩＩへの結合を可能にする双性イオン電荷または疎水性特性等の物理化学的特性を有する合成分子であってもよい。誘導された免疫応答の標的になるべき多糖またはオリゴ糖は、このキャリア分子に結合される。キャリアがペプチドに代わりアンカーとして作用してＭＨＣ−ＩＩに結合し、本出願に記載された糖化ペプチドと類似の方式でＴ細胞受容体による標的多糖またはオリゴ糖の認識が可能となろう。これらの新規糖化キャリア分子は、ヘルパー機能および抗体産生に必要なＴ細胞応答を誘導することが可能となろう。
【００４８】
ＰＳＡのような天然の双性イオン多糖の代わりに、化学的に改良した、構造的に明確なオリゴ糖をキャリア分子として使用可能である。
【００４９】
糖化ペプチドナノ粒子
本明細書記載の糖化ペプチドに切断可能リンカーを介して結合したナノ粒子も、本発明に従って作ることができる。従って、本発明は、さらに生体適合性ナノ粒子に結合した糖化ペプチドを含む組成物を含み、任意選択でそのナノ粒子を経由してＡＰＣ、例えば、ＤＣやＢ細胞を標的にする共存抗体を一緒に含んでもよい。ＭＨＣ結合配列を含むペプチド単位がナノ粒子に結合している場合の実施形態では、各ペプチドとナノ粒子の間に切断可能成分が存在することになる。代表的ナノ粒子には、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．７：９６８-９７４（２００７）に記載されたものが含まれる。
【００５０】
本明細書記載の方法や組成物に使えるナノ粒子は、（ｉ）生体適合性がある、すなわち、製薬上妥当な量を使用した場合、生きた動物に重大な有害反応を引き起こさない；（ｉｉ）結合成分が共有結合で結合可能な特徴的官能基、（ｉｉｉ）相互作用成分のナノ粒子に対する低い非特異的結合性を示す、および（ｉｖ）溶液中で安定である、すなわち、ナノ粒子が沈殿しない、という要件を満たす物質から作られる。ナノ粒子は、単分散の（ナノ粒子一個が物質の単結晶、例えば、金属の単結晶）であっても、多分散（ナノ粒子一個が複数の結晶、例えば、２、３、または４個）であってもよい。
【００５１】
多くの生体適合性ナノ粒子、例えば、有機または無機ナノ粒子、が当技術分野で既知である。リポソーム、デンドリマー、炭素ナノマテリアルおよび高分子ミセルが有機ナノ粒子の例である。量子ドットも使用可能である。無機ナノ粒子には、金属ナノ粒子、例えば、Ａｕ、Ｎｉ、ＰｔおよびＴｉＯ２ナノ粒子が含まれる。磁気ナノ粒子もまた使用可能で、例えば、デキストランまたはＰＥＧ分子に囲まれたＦｅ２＋および／またはＦｅ３＋コアを有する１０〜２０ｎｍの球状ナノクリスタルがある。
【００５２】
一部の実施形態では、コロイド金ナノ粒子が使われ、例えば、Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１）：８３−９０（２００８）；米国特許第７０６０１２１号；７２３２４７４号；および米国特許公開公報２００８／０１６６７０６に記載されている。多機能ナノ粒子を構築し使用するための適切なナノ粒子および方法が、例えば、Ｓａｎｖｉｃｅｎｓ ａｎｄ Ｍａｒｃｏ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２６（８）：４２５−４３３（２００８）で考察されている。
【００５３】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、官能基経由で本明細書記載の糖化ペプチドに付着（結合）している。一部の実施形態では、ナノ粒子は、官能基を含むポリマーと結合しており、また、金属酸化物を相互に分散状態に保つ役割もしている。ポリマーは、合成高分子、例えば、限定されないが、ポリエチレングリコールまたはシラン、天然高分子、または合成または天然高分子の誘導体またはこれらの組み合わせ、であってもよい。親水性のポリマーが有用である。一部の実施形態では、ポリマー「コーティング」は、磁性金属酸化物の周りの連続皮膜ではなく、金属酸化物に付着し、取り囲んだ伸長ポリマー鎖の「メッシュ状」または「雲状」である。ポリマーは、デキストラン、プラナン（ｐｕｌｌａｎａｎ）、カルボキシデキストラン、カルボキシメチルデキストラン、および／または還元型カルボキシメチルデキストランを含む多糖や誘導体を含んでもよい。金属酸化物は、相互に接触しているか、またはポリマーにそれぞれ捕捉されるかまたは取り囲まれている１つまたは複数の結晶の集まりであってもよい。
【００５４】
他の実施形態では、ナノ粒子は、非高分子官能基組成物に結合している。ポリマーに結合していない安定化し、官能性を持たせたナノ粒子を合成する方法は既知であり、また、本発明の範囲にある。このような方法は、例えば、Ｈａｌｂｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、８０（５−６）：３７９−９０、１９９８に記載されている。
【００５５】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、直径で約１〜１００ｎｍ未満、例えば、約２５〜７５ｎｍ、例えば、約４０〜６０ｎｍ、または約５０〜６０ｎｍ未満の全体寸法を有する。一部の実施形態では、ポリマー成分は、例えば、コーティングの形で約５〜２０ｎｍまたはそれ以上の厚さであってもよい。ナノ粒子の全体寸法は、約１５〜２００ｎｍ、例えば、約２０〜１００ｎｍ、約４０〜６０ｎｍ；または約６０ｎｍである。
【００５６】
ナノ粒子の合成
ナノ粒子を調製可能な種々の方法があるが、いずれの方法でも、結果はナノ粒子を結合成分に結合するために使用可能な官能基を有したナノ粒子でなければならない。
【００５７】
例えば、糖化ペプチドは、機能性ポリマーまたは表面機能付加した非高分子金属酸化物に共有結合することにより酸化物ナノ粒子に結合可能である。後者の方法では、ナノ粒子は、Ａｌｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、８０（５−６）：３７９−９０（１９９８）の方法の考え方に従って合成可能である。ジメルカプトコハク酸は、ナノ粒子に結合し、カルボキシル官能基を付与する。官能基化されたとは、所望の成分をナノ粒子、例えば、本明細書記載の糖化ペプチドまたは抗体に結合するために使用されるアミノまたはカルボキシルまたはその他の反応基が存在することを意味する。
【００５８】
別の実施形態では、糖化ペプチドは、ナノ粒子に結合した官能基化されたポリマー経由でナノ粒子に結合する。一部の実施形態では、ポリマーは親水性である。具体的実施形態では、複合体は、末端アミノ、スルフヒドリル、またはリン酸塩基を有するオリゴヌクレオチド、および親水性高分子上にアミノまたはカルボキシ基を有する超常磁性鉄酸化物ナノ粒子を使って作られる。カルボキシおよびアミノ誘導体化ナノ粒子を合成するいくつかの方法がある。機能付加し、コートしたナノ粒子の合成法については、以降でさらに詳細に検討する。
【００５９】
カルボキシ官能基化したナノ粒子は、例えば、Ｇｏｒｍａｎ（国際公開番号００／６１１９１参照）の方法に従って作ることができる。カルボキシ官能基化したナノ粒子は、また、強塩基中でブロモまたはクロロ酢酸と反応させてカルボキシル基を結合することにより多糖コートナノ粒子から作ることができる。さらに、カルボキシ官能基化した粒子状物質は、無水コハク酸または無水マレイン酸等の試薬を使ってアミノからカルボキシ基へ変換することによって、アミノ機能付加したナノ粒子から作ることができる。
【００６０】
ナノ粒子寸法は、反応条件を調節することにより、例えば、米国特許第５、２６２、１７６号に記載があるように、温度を変えることにより、制御可能である。均一粒径の材料は、例えば、米国特許第５、４９２、８１４に記載されているように、遠心分離、限外濾過、またはゲル濾過を使って粒子状物質を分別することにより作ることができる。
【００６１】
また、ナノ粒子は、過ヨウ素酸塩で処理して、アルデヒド基を形成することも可能である。アルデヒド含有ナノ粒子を、次にジアミン（例えば、エチレンジアミンまたはヘキサンジアミン）と反応させて、これによりシッフ塩基を形成し、次に水素化ホウ素ナトリウムまたはシアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元することができる。
【００６２】
デキストランコートナノ粒子を、例えば、エピクロロヒドリンを使って作り、架橋することもできる。アンモニアを添加して、エポキシ基と反応させるとアミン基が生成する。Ｈｏｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０００．１１（６）：９４１−６、およびＪｏｓｅｐｈｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９９、１０（２）：１８６−９１を参照。
【００６３】
水可溶のカルボジイミドおよびエチレンジアミンまたはヘキサンジアミン等のジアミンを使ってカルボキシ官能基化したナノ粒子を、アミノ官能基化した磁性粒子状物質に変換可能である。
【００６４】
アビジンまたはストレプトアビジンをナノ粒子に結合させて、オリゴヌクレオチドまたはポリペプチド等のビオチン化結合成分と共に使用可能である。例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、７（３）：３１１−６を参照。同様に、ビオチンをナノ粒子に結合させて、アビジン標識結合成分と共に使用できる。
【００６５】
これら全ての方法で、限外濾過、透析、磁気分離、または他の手段によりナノ粒子から低分子量化合物を分離することができる。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにより、未反応糖化ペプチドをリガンドナノ粒子複合体から分離することができる。
【００６６】
一部の実施形態では、コロイド金ナノ粒子を当技術分野で既知の方法、例えば、Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６（１）：８３−９０（２００８）；米国特許第７０６０１２１号；７２３２４７４号；および米国特許公開公報２００８／０１６６７０６に記載のような方法を使って作成可能である。
【００６７】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、ペグ化される（例えば、米国特許第７２９１５９８号；５１４５６８４号；６２７０８０６号；７３４８０３０号、等に記載のように）。
【００６８】
一部の実施形態では、糖化ペプチドを、完全なユニットのようにナノ粒子に結合する；一部の実施形態では、ペプチド単位を、炭水化物が添加される前にナノ粒子に結合する。
【００６９】
複合糖質を構築する方法
本明細書記載の複合糖質で、ペプチドを、例えば、還元アミノ化を使って、共有結合で直接炭水化物に結合するのが好ましい。他の方法は当技術分野で既知である。例えば、Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５８０：２９４５-２９５０（２００６）、および引用文献を参照。化学的リンカー、すなわち、ヘキサン酸、アジピン酸、またはその他の二官能性カップリング分子、を使わないのが好ましい。例えば、Ｊｏｎｅｓ、 Ａｎａｉｓｄａ Ａｃａｄｅｍｉａ Ｂｒａｓｉｌｅｉｒａｄｅ Ｃｉeｎｃｉａｓ ７７（２）：２９３−３２４（２００５）を参照。
【００７０】
複合糖質は当技術分野で既知の方法、例えば、他の複合糖質ワクチンを作る方法、を使って構築可能である。例えば、Ｐｕｒｃｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．６：４０４−４１４（２００７）；Ｆａｌｕｇｉｅｔａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：３８１６-３８２４（２００１）；Ｄｚｉａｄｅｋ ｅｔ ａｌ．、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．１４：５９０８-５９１７（２００８）を参照。
【００７１】
代表的複合糖質
Ｂ群連鎖球菌（ＧＢＳ）複合糖質：ＧＢＳは、新生児の重篤な細菌感染の主要原因である。Ｓｃｈｕｃｈａｔ、Ｌａｎｃｅｔ、３５３：５１−５６（１９９９）。症例の約８０％で、病原体の直接母子感染により新生児のＧＢＳ感染が起こり、この病原体は健全な女性の２５〜４０％の肛門生殖器粘膜にコロニー形成する（上記Ｓｃｈｕｃｈａｔ（１９９９）論文で解説されている）。出産前に適切な抗生物質を全てのＧＢＳ陽性の女性に投与すべきである（ＧＢＳ疾患発生率を劇的に減らす処置）とする疾病管理予防センターの勧告にも拘わらず、米国だけでも、ＧＢＳは、いまでも新生児の年間２５００例の感染と１００例の死亡の原因となっている。いずれにせよ、この抗生物質治療を提供するという政策は、抗生物質抵抗の恐れのために、長期的には継続できそうもない。従って、通常、有効なワクチン接種が長期にわたるＧＢＳ疾患の発生率を減らす唯一の手段であると考えられている。
【００７２】
ＧＢＳワクチン開発の理論的根拠は、新生児感染のリスクがＧＢＳを取り囲む莢膜多糖（ＣＰＳ）抗原に特異的な抗体の母体中レベルに逆比例するという観察に裏付けられている（ＤｅＪｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６（２）：２０５−２１３（２００４）；Ｐａｏｌｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、６９：６６９６−６７０１（２００１））。その意味は、防御的ＩｇＧが胎盤を介して母親から乳児に移されるということである。本明細書記載のＧＢＳに対するワクチン開発の手法は、精製ＣＰＳ抗原で調製した複合体ワクチンの生成である。全９つのＧＢＳ血清型に対する複合体ワクチンを開発し、類似血清型のＧＢＳに対して機能的に活性であるＣＰＳ特異的ＩｇＧを誘導する前臨床試験で提示した。Ｐａｏｌｅｔｔｉ ａｎｄ Ｍａｄｏｆｆ、Ｓｅｍｉｎ Ｎｅｏｎａｔｏｌ、７：３１５−３２３（２００２）。
【００７３】
Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＶ型ＧＢＳ由来のＣＰＳで調製した複合体ワクチンの１相および２相臨床試験で、健康な大人において、これらの調製が安全で、高度の免疫原性を示すことが明らかになった。（ＰａｏｌｅｔｔｉおよびＭａｄｏｆｆ（２００２）の上記論文で概説）。ＧＢＳワクチン研究の長い歴史により、このワクチンが、複合糖質抗原プロセッシング、提示および刺激されたＴ細胞による応答のキャラクタリゼーションの研究のための理想的プロトタイプになっている。記載されたＧＢＳＩＩＩ複合糖質は「モデル」抗原であり、現実の、重要な疾患に関連している。
【００７４】
製剤処方
本明細書記載の治療に有効な量の１つまたは複数の組成物（すなわち、有効な（治療用）試薬として、単独またはナノ粒子に結合して、本明細書記載の複合糖質を含む）は、患者、例えば、ヒト、への投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。このような組成物は、通常、組成物および薬剤的に許容可能なキャリアを含む。本明細書で使われる用語の「薬剤的に許容可能なキャリア」は、医薬品の投与に適合する、任意かつ全ての溶媒、分散媒、被覆材、抗菌および抗真菌剤、等張吸収遅延剤、等、を含むことが意図されている。薬剤的活性物質のためのこのような媒質と試薬の使用は既知である。従来の媒質または試薬がその活性化合物と不適合である場合を除き、このような媒質は本発明の組成物に使用可能である。補充性活性化合物、例えば、リガンド分解抑制剤、もまた、組成物に組み入れることができる。
【００７５】
医薬組成物は、目的の投与経路に適合するように処方可能である。非経口、皮内、または皮下への適用に使われる溶液または懸濁液には、次の成分が含まれる：無菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒；抗菌薬、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸またはナトリウム重亜硫酸塩；キレート化剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩および浸透圧調製用薬剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムで調整可能である。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブル注射器または多人数用バイアル中に封入できる。
【００７６】
注射可能な用途に適した医薬組成物には、無菌注射用溶液または分散液の即時調製のための無菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液および無菌粉末が含まれる。静脈内投与に対する適切なキャリアには、生理食塩水、静菌性水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ ＥＬ（登録商標）（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー）または燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全てのケースで、組成物は無菌でなければならず、また、容易に注射可能である程度に流動性が必要である。製造と貯蔵の条件下で安定でなければならず、また細菌や真菌等の微生物の汚染活動に対し保護されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、等）、および適切なそれらの混合物を含む溶剤または分散媒であってもよい。例えば、レシチンのようなコーティングによって、分散液の場合には必要粒径の維持によって、また、界面活性剤の使用によって、適した流動度を維持可能である。微生物の活動の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、等の種々の抗菌性および抗真菌性薬剤によって達成できる。多くの場合、等張薬剤、例えば、糖質、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、を組成物中に含めることが好ましいと考えられる。注射用組成物の遷延吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン、を含めることにより生じさせることができる。
【００７７】
無菌注射用溶液は、必要に応じ、単独または上に列挙した成分の組み合わせと共に適切な溶剤中に入れた必要量の組成物（例えば、本明細書記載の試薬）を組み込み、続いて濾過滅菌することにより調製できる。通常、分散液は、活性化合物を、基本的分散媒および上に列挙したものの中から必要な他の成分を含む無菌賦形剤中に組み入れることにより調製できる。無菌注射溶液調製用の無菌粉末の場合は、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥で、これら方法により、前に濾過滅菌した溶液から有効成分プラス任意の追加の所望の成分を得ることができる。
【００７８】
経口組成物は、通常、不活性の希釈剤または食用キャリアを含む。これらは、ゼラチンカプセル剤に封入されるか、錠剤に圧縮成形されうる。経口治療投与の目的のため、活性化合物が賦形剤と一緒に組み入れられ、錠剤、トローチ、またはカプセル剤の形で使うことができる。また、経口組成物は、口腔洗浄薬としての用途に流動性キャリアを使って調製可能である。この場合、流動性キャリア中の化合物は、経口で適用され、うがいされ、はき出され、または飲み込まれる。薬剤的に適合したバインダー、および／またはアジュバント物質が組成物の一部として含まれてもよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ等は、下記の成分、または類似の特性の化合物のいずれかを含んでもよい：バインダー、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプンまたはラクトース、崩壊剤、例えば、アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ（登録商標）（ナトリウムカルボキシメチルデンプン）、またはコーンスターチ；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳＴＥＲＯＴＥＳ（登録商標）；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味料、例えば、ショ糖またはサッカリン；または香味料、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料。
【００７９】
全身性の投与も経粘膜的または経皮的手段により可能である。経粘膜的または経皮的投与には、浸透されるべきバリアに対し適切な浸透剤が製剤中に使用される。このような浸透剤は、一般的に既知であり、例えば、経粘膜的投与に対しては、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜的投与は、点鼻薬または坐剤の使用により達成可能である。経皮的投与に対しては、活性化合物は、当技術分野で一般的に知られているように、軟膏、塗剤、ゲル、またはクリームに製剤される。
【００８０】
一実施形態では、活性化合物は、埋没物およびマイクロカプセル化したデリバリーシステムを含む放出制御処方のような、体内からの急速排除に対して化合物を保護するキャリアと共に調製される。エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸等の生分解性、生体適合性ポリマーを使用可能である。これらの製剤を調整する方法は当業者には自明であろう。また、市販材料が、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃから入手可能である。リポソーム懸濁液（モノクローナル抗体とウイルス抗原複合体に感染した細胞を標的にしたリポソームを含む）も薬剤的に許容可能なキャリアとして使用可能である。これらは当業者に既知の方法、例えば、米国特許第４、５２２、８１１号に記載のような方法、を使って調整可能である。
【００８１】
核酸分子は、ベクターに挿入でき、遺伝子治療ベクターとして使用可能である。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５、３２８、４７０号）または、定位注入（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ ９１：３０５４−３０５７、１９９４参照）によって、患者に送達可能である。遺伝子治療ベクターの薬剤には、受容可能希釈剤中の遺伝子治療ベクターが含まれ、または遺伝子送達賦形剤が埋め込まれた徐放基質を含むことも可能である。あるいは、全遺伝子送達ベクターが、組み換え型細胞から未変化で作られる、例えば、レトロウイルスベクター、場合は、薬剤が遺伝子デリバリーシステムを作る１つまたは複数の細胞を含んでもよい。
【００８２】
投与インストラクションと一緒に、医薬組成物を、容器、パック、またはディスペンサー中に入れることができる。一態様では、医薬組成物を、キットの一部として入れることもできる。
【００８３】
通常、医薬組成物を投与する用量により、毒性、刺激またはアレルギー反応のような望ましくない副作用もなく、予防および／または治療のための意図した目的の遂行が促進される。個人のニーズは変化するかもしれないが、製剤有効量の好適範囲の決定は、当分野の技術の範囲内で可能である。ヒト用量は、動物の研究から容易に推定可能である（Ｋａｔｏｃｓ ｅｔ ａｌ．、２７章：「レミントンの薬科学」、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、イーストン、ペンシルベニア州、１９９０）。通常、製剤の有効量を得るために必要な用量は、当業者により調節可能であるが、いくつかの因子により変化するものである。これらの因子には、受診者の年齢、健康、身体的病状、体重、タイプおよび疾患または障害の程度、もし必要なら、治療の頻度、同時実施治療の性質、および所望の効果の性質と範囲が挙げられる（Ｎｉｅｓ ｅｔ ａｌ．、３章：Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ'ｓ「治療の薬理学的基礎」、第９版、Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．、ｅｄｓ．、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、ニューヨーク、ニューヨーク州、１９９６）。
【００８４】
免疫応答を誘導する方法
本明細書には、また、例えば、哺乳類動物、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳類動物の患者の免疫応答を誘導する方法も提供されている。本明細書記載の複合糖質は、例えば、ワクチンとしての使用のために、未変性多糖自体に対する免疫応答を誘導するのに特に有効である。従って、この方法には、免疫保護が必要な患者の特定、および患者の免疫応答を誘導するのに十分な量の本明細書記載の複合糖質の患者への投与が含まれる。一部の実施形態では、方法には、患者への１回または複数回の追加の投与、例えば、追加の接種が含まれる。
【００８５】
本明細書記載の方法は、任意の患者に適用可能であるが、免疫力が低下したまたは免疫不全の患者、およびワクチン接種に対し典型的な応答不良患者、ならびに感染リスクが高い人に特に有効である。このような患者には、非常に若い人（例えば、２４月齢未満の乳児）、末期腎臓疾患（ＥＳＲＤ）の患者（特に血液透析の人）、化学療法と照射治療を受けている癌患者、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの患者、アルコール中毒者、薬物乱用者、糖尿病患者、高齢者（特に長期介護施設にいる人）、侵襲性手術の患者（例えば、器官移植）、および急性期ケア環境にある他の患者が挙げられる。
【００８６】
一部の実施形態では、本明細書記載の組成物は、アジュバントまたは免疫賦活薬と同時投与される。一部の実施形態では、本明細書記載の組成物は、アジュバントまたは免疫賦活薬のいずれも伴わず投与される。
【実施例】
【００８７】
本発明はさらに下記の実施例により説明されるが、これは請求項に記載された本発明の範囲を制限するものではない。
実施例１−モデル複合糖質の炭水化物部はＭＨＣ−ＩＩを介してＡＰＣ表面で発現する
複合糖質がどのようにしてＴ細胞を活性化するかについて、現在受け入れられているパラダイムは、炭水化物が非常に強力な共有結合によりタンパク質に結合（多くの場合二級アミン）しているにしても、Ｔ細胞にペプチドが提示され、認識されるということだけである。この古典的仮説では、ＡＰＣ内の多糖に何が起きているか、またはエンドソーム中でどのようにして炭水化物とタンパク質を分解し、正しいペプチドをＴ細胞に提示するか、説明できない。しかし、特定のＣＰＳ−例えば、総腸管グラム陰性偏性嫌気性菌バクテロイデスフラジリスの多糖Ａ（ＰＳＡ）−は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を介して自然免疫系を活性化し、獲得免疫系と連携して自然免疫系がこれらの分子に応答して作用する。Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２０３：２８５３−２８６３（２００６）．ＰＳＡは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によりプロセッシングされ、主要組織適合性クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）経路を介してＣＤ４＋Ｔ細胞に提示される。結果的にＴ細胞が活性化される。Ｃｏｂｂ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、１１７：６７７−６８７（２００４）。本発明者等は、糖化ペプチドは、正しくプロセッシングされておれば、提示専門細胞ＡＰＣによりＴ細胞に提示されることが可能である、との仮説を立てた。この新しい概念は、複合体ワクチンおよび糖タンパク質含有ウイルスおよび細菌による感染に関し、古典的教示に反する。仮説が探究の価値があるか否かを判定するために、ＧＢＳＩＩＩを使って実験を行った。このＧＢＳＩＩＩの反復ユニット構造をモデル多糖として図１に示す。ＧＢＳＩＩＩは、古典的Ｔ細胞非依存的抗原であると考えられる。Ｇｕｔｔｏｒｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ、６７：６３７５−６３８４（１９９９）。マウスでは、キャリアタンパク質に共有結合で結合する場合のみに、ＧＢＳＩＩＩを使った免疫化により有意な量のＩｇＧ抗体が誘導された（図１には、複合化に使われる代表的化学反応を示す）。
【００８８】
実施例２−糖化ペプチドはＡＰＣ表面に提示される
ＭＨＣＩＩ結合糖化ペプチドがＡＰＣ表面に提示されるか否かを判定するために、免疫共沈降（ｃｏ−ＩＰ）、フローサイトメトリー、およびウェスタンブロット実験を行った。最初、ＰＳＡおよびＮ−アセチル化ＰＳＡのように、純粋なＧＢＳＩＩＩがＡＰＣのエンドソーム内で解重合されるか否かを評価した。（Ｃｏｂｂ ｅｔ ａｌ．（２００４）、同上を参照）、（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５（１３）：５１８３−５１８８（２００８））にあるＰＳＡに関する報告と同じ方法を使って、放射標識したＧＢＳＩＩＩをラージＢ細胞と共に１８時間インキュベートした。次に、ミクロソームをラージ細胞から単離し、エンドソーム内のＧＢＳＩＩＩ分子の大きさ（大きさにばらつきがあり、平均で約１５ｋＤａであるが、カラムの総容積にいくつかの物質が含まれている）が元の分子（平均で１５０ｋＤａ；カラムの空隙容積に溶出）よりも有意に小さいことを確認した（図２ａ）。ｃｏ−ＩＰ実験（図２ａ）の次に、ＰＳＡの場合の報告（Ｃｏｂｂ ｅｔ ａｌ．（２００４）、同上を参照）と類似の実験を行った。表面免疫複合体をｍＡｂとＭＨＣＩＩの複合体と沈降させた。細胞を純粋な非複合多糖とインキュベートした場合、予想通り、ＭＨＣＩＩの存在下、ＧＢＳ炭水化物は細胞表面に認められなかった。これらのデータにより、複合ＧＢＳＩＩＩはエンドソーム内で解重合されるが、純粋な炭水化物はＭＨＣＩＩ分子にロードされ得ず、従って細胞表面に提示できないことが明らかである。ＰＳＡ−ＭＨＣＩＩ結合への化学反応のキーは双生イオン電荷モチーフであり、これは、非複合ＧＢＳＩＩＩ（他の炭水化物と同様に）では欠けている。３Ｈデキストランは同様にエンドソーム内でプロセッシングされることがわかった。これらの知見は、多糖にＴ細胞非依存性を与える少なくとも１つの機序が、必ずしもＡＰＣが多糖をＭＨＣ−ＩＩにロードできる大きさに解重合できないことではなく、ＭＨＣＩＩに結合できないことであることを示唆している。
【００８９】
複合糖質（［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ）のマウス脾臓単核細胞（図２Ｃ）またはラージＢ細胞（図３Ａ）とのインキュベーション後のｍＡｂとＭＨＣＩＩ複合体を使ったｃｏ−ＩＰ実験で、［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩが表面結合していることが示された。［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡを抗原とするｃｏ−ＩＰ実験では、表面結合ＧＢＳＩＩＩは、Ｃ５７Ｂｌ／６野生型マウスおよび種々のノックアウト株（図２Ｃ）由来の脾細胞上の抗ＨＬＡ−ＩＡ／ＩＥを用いて探索された。野生型およびＭＨＣＩマウス由来の脾細胞は、両方ともその表面上に炭水化物を提示した（約１０ｋＤａ）が、ＭＨＣＩＩ（Ｈ２−Ａｂ１）マウス由来細胞は、その表面にＧＢＳＩＩＩが欠けていた。ＡＰＣとしてラージＢ細胞を使ったｃｏ−ＩＰでは、ＨＬＡ−ＤＲ分子の存在下、炭水化物エピトープが細胞表面に存在したことが立証された（図３Ａ）。ＭＨＣ分子が炭水化物を提示していることおよび複合糖質ワクチン中での炭水化物提示がキャリアとしてのＯＶＡに特異的でないことを証明するために、破傷風トキソイド（［３Ｈ］ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ）に結合したＧＢＳＩＩＩの複合体を調製した。ラージＢ細胞および後者のワクチン構築物を用いたＣｏ−ＩＰ調査でも、また、ＨＬＡ−ＤＲの存在下、ＧＢＳＩＩＩがラージＢ細胞表面上に存在する（図３Ｂ）が、ＭＨＣＩＩ欠如ラージ由来細胞株、ＲＪ２．２．５の表面に存在しないことが示された。全てのｃｏ−ＩＰ実験で、ｍＡｂとＬＡＭＰ−１複合体を陰性対照として使用したが、これは細胞表面には無く、エンドソームの区画中にのみ存在している。
【００９０】
ｃｏ−ＩＰ実験の検証のために、フローサイトメトリーを使ってＡＰＣによる炭水化物エピトープの提示を調べた。マウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、ＧＢＳＩＩＩ、ＯＶＡ、またはＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡと共に１８時間インキュベートした。細胞をＧＢＳＩＩＩ特異的なフルオロフォア複合ｍＡｂを用いて４℃で標識し、次に固定した。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡインキュベートしたＢＭＤＣの膜のみＧＢＳＩＩＩ抗体で標識し、純粋な非複合ＧＢＳＩＩＩまたはＯＶＡとインキュベートした細胞の膜には標識しなかった（図２Ｄ）。
【００９１】
上記実験では、多糖がキャリアタンパク質に複合化しているときのみ、炭水化物エピトープはＭＨＣＩＩ経路で提示され屡ことが明らかになった。この観察に対する１つの説明は、ＧＢＳＩＩＩ炭水化物エピトープ（例えば、糖化ペプチド中の）に結合しているときのみ、それらのエピトープは分子結合できるということである。おそらく、共有結合で炭水化物エピトープに結合しているペプチドエピトープが生成し、ＭＨＣＩＩに結合し、そして炭水化物をＭＨＣＩＩ分子上のＡＰＣ表面に運ぶ。この可能性を、ＭＨＣＩＩタンパク質により提示されたものがペプチドに化学的に結合したＧＢＳＩＩＩであるかどうかを調べることにより検討した。キャリア分子として単一ペプチドエピトープを含む複合糖質と共にインキュベートしたラージＢ細胞の細胞表面抽出物に対してウェスタンブロット実験を行った。卵白アルブミンペプチドエピトープ、ＯＶＡ３２３−３３９、をＧＢＳＩＩＩに複合化しＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐを形成した。ＯＶＡ３２３−３３９は、ＯＶＡ（２３）のＴおよびＢ細胞エピトープを示す。このペプチドは、そのＮ末端でＮ−アセチル化されており、また、Ｃ末端で４つのアミノ酸で伸長して多糖への非ランダム結合を可能にした。この修飾は、ＭＨＣＩＩとαβＴＣＲに対する純粋なペプチド結合に影響を与えなかった。複合糖質のペプチドの炭水化物に対する比率は、重量比で、３：１であった；この値は、ペプチド分子に結合した炭水化物の８平均反復単位に相当し、多糖鎖に沿った約１０ｋＤａの糖化ペプチドエピトープを作り出す値である。１０ｋＤａの大きさは、ラージＢ細胞およびマウス脾細胞とインキュベートした多糖／タンパク質複合体の細胞表面に見つかった解重合された炭水化物の大きさに類似であった。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐおよび純粋なＧＢＳＩＩＩを、それぞれラージＢ細胞とインキュベートし、細胞表面含有物を集め、可溶化して、トリスグリシン／ポリアクリルアミドゲルで操作し、その後、ウェスタンブロット分析のため、２フッ化ポリビニリデン膜に転写した。膜をＨＬＡ−ＤＲ抗体、またはＧＢＳＩＩＩまたはＯＶＡｐに対する抗体とインキュベートした。ＨＬＡ−ＤＲ、炭水化物、およびペプチドを含む免疫複合体の全てで、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐとインキュベートした細胞から得られた細胞表面抽出物のゲル上に約８０ｋＤａにバンドが認められたが、ＧＢＳＩＩＩでインキュベートした細胞からのものでは認められなかった。（図２Ｅ）。ＨＬＡ−ＤＲαβダイマー（それ自体のペプチドを導入したまたは空の）を、前に記載したように（２４）（データは示していない）、約６５ｋＤａのＨＬＡ−ＤＲｍＡｂで標識した。炭水化物はゲル中で蛋白質よりゆっくり動くので、複合体非結合ＨＬＡ−ＤＲと糖化ペプチド-ＨＬＡ−ＤＲ複合体の間の約１５ｋＤａの大きさの差（タンパク質マーカーにより測定）は、糖化ペプチド（約１０ｋＤａ）の大きさを表している。
【００９２】
実施例３−ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡのエンドソームプロセッシング
ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡのエンドソームプロセッシングの動力学に関する予備調査も行った。３時間、６時間、または１８時間のＧＢＳＩＩＩ［３Ｈ］−ＯＶＡとのインキュベーション後、ラージ細胞のエンドソームを集めた（図２Ｂ）。結果は、プロセッシングは３時間で開始され、１８時間までに完了することを示唆している。
【００９３】
予備データは、複合体ワクチン（例えば、ＩＩＩ−ＯＶＡ）の炭水化物部がＡＰＣによりＴ細胞に提示される産物へのプロセッシングという機序に基づき取得された。活性酸素種（ＲＯＳ）による多糖プロセッシングの有望なメカニズムが明らかになった。エンドソーム中のＧＢＳＩＩＩのプロセッシングにおける活性窒素種およびグリコシダーゼの適切な役割がある。
【００９４】
ラージＢ細胞による取り込みの後、ＩＩＩ−ＯＶＡはより小さい分子に分解される（図４Ａ〜Ｃ）。分解は、ヒドロキシルラジカル捕捉剤Ｄ−マンニトール（図４Ａ）または超酸化物捕捉剤４−ヒドロキシルＴＥＭＰＯ（図４Ｂ）によって抑制されるが、ヒドロペルオキシド捕捉剤ピルビン酸塩には抑制されない（図４Ｃ）。
【００９５】
これらのデータは、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡの炭水化物部は、ＡＰＣエンドソーム／リソソーム内でＲＯＳ、最も可能性の高いものとしては超酸化物およびヒドロキシルラジカル、により解重合されることを示している。
【００９６】
ラージＢ細胞株を使ったこの結果により、複合糖質ワクチンが糖化ペプチドエピトープを含むという仮説に対する支持が得られた。要約すると、データは、キャリアタンパク質と複合している場合は、ＧＢＳＩＩＩの約１０ｋＤａの部分が、ＭＨＣＩＩ分子と結合してＡＰＣ表面で提示されるということを示唆している。
【００９７】
３つのキーとなる対照実験を行い炭水化物の提示が実験上の人為産物であったといういかなる可能性をも排除した。最初に、非複合多糖を複合多糖と比較し、非複合多糖がエンドソーム中で解重合したが、表面に提示はされなかった一方、複合化糖質はエンドソーム中の解重合も細胞表面提示も両方行われた。第２に、トリチウム標識複合糖質のプロセッシングと提示をラージ細胞とＲＪ２．２．５細胞（ＭＨＣＩＩタンパク質が欠如したラージＢ細胞株）で比較した。ＲＪ２．２．５細胞で提示が無いことによりラージ細胞で観察されたことはＭＨＣＩＩ分子によるということが明らかになった。最後に、実験全体で、モノクローナル抗体とＭＨＣＩＩ分子、抗ＨＬＡ−ＤＲ複合体と一緒に最終免疫沈降ステップを行った際、表面抽出物も対照抗体（例えば、抗ＬＡＭＰ−１抗体）と共に沈降した。この抗体は陰性対照の働きをした。
【００９８】
Ｂ細胞は、キーとなるＡＰＣであり、プロセッシングされた複合糖質ワクチンの抗原エピトープをＣＤ４＋Ｔ細胞に提示する。従って、これらのプロセッシングと提示の実験でラージＢ細胞株の使用は適切である。一次細胞でこれらの実験を検証するために、マウス脾リンパ球および骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）をＡＰＣとして使って上記実験を繰り返した。
【００９９】
実施例４−ＯＶＡペプチド（ＯＶＡｐ）特異的Ｔ細胞はＩＩＩ−ＯＶＡｐエピトープを認識しない
この実施例は、特定のペプチド（ＯＶＡｐ）を認識するＣＤ４＋Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が、そのペプチドが莢膜多糖（ＧＢＳＩＩＩ）と複合化された場合、同じペプチドを認識しなかったことを実証する実験について記載する。この実験は、糖化ペプチドエピトープの炭水化物部が特定のＴＣＲにより特異的に認識されうるという仮説を裏付ける証拠を集めるため行った。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐがＯＶＡｐ特異的Ｔ細胞クローンならびにＯＶＡｐ単独によるＴ細胞増殖を誘導しないことを示すことにより、ＩＩＩ−ＯＶＡｐがペプチド特異的Ｔ細胞により認識されることができない糖化ペプチドエピトープを有するということが示唆されることになろう。
【０１００】
卵白アルブミン抗原エピトープＯＶＡ３２３−３３９は、ＯＶＡのＴ細胞およびＢ細胞エピトープを表し、これは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける即時型過敏症応答生成と成長にとって重要である。ＭｃＦａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８：１６６６３−１６６７０（１９９９）。ペプチドは、ＯＶＡｐの両末端にリジン基を付加（ＯＶＡｐ１９：２つのリジン基を１７ａａＯＶＡｐに追加した１９アミノ酸を指す名称）することにより設計、調製される。このペプチドを、ＧＢＳＩＩＩと複合化（ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ）し、野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の照射ＡＰＣをＢＡＬＢ／ｃまたはＯＶＡｐＴ細胞マウス（Ｄ０１１．１０）由来のＣＤ４＋Ｔ細胞と同時インキュベートするＴ細胞増殖実験を行った；Ｄ０１１．１０は、Ｔ細胞受容体を発現するＴ細胞受容体遺伝子導入系でＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａｄ）分子と連携して卵白アルブミン由来ＯＶＡペプチド３２３−３３９（ＯＶＡｐ）を認識する（図５Ａ〜Ｂ）。ＡＰＣ＋Ｔ細胞混合物をＧＢＳＩＩＩ（８．７μｇ、１０μｇＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ中のＧＢＳＩＩＩ含量に対する当量）、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ（１０μｇ）、ＯＶＡ（４．５μｇ、１０μｇＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ中のＯＶＡ含量に対する当量）、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ（１０μｇ）、ＯＶＡｐ（１．３μｇ、１０μｇＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ中のＯＶＡｐ含量に対する当量）、ＯＶＡｐ１９（１．３μｇ）で刺激した。
【０１０１】
対照として、同じ実験を抗ＨＬＡＩＡ／ＩＥ（および抗ＨＬＡＩＡ／ＩＥに対する対照としてそのアイソタイプ）を添加して繰り返し、Ｔ細胞刺激がＭＨＣＩＩ提示によることを示す。ＯＶＡｐと同じアミノ酸含量で、全体の順番が異なるスクランブルしたＯＶＡペプチド、ｓｃＯＶＡｐ、を調製した。このペプチドを使用して、ＴＣＲ特異性はＯＶＡｐに対してのみであることを示した。このスクランブルしたペプチドは、Ｔ細胞増殖性を誘導しなかった。ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ、１０ｎｇ）およびコンカナバリンＡ（ｃｏｎＡ、１０ｎｇ）スーパー抗原を陽性対照として使用した（約５０〜１０００刺激指数）。
【０１０２】
本実験の全対照は完璧に機能した。ＭＨＣＩＩ分子が抗ＨＬＡＩＡ／ＩＥによりブロックされると、ＩＩＩ−ＯＶＡ（ｐ）もＯＶＡ（ｐ）もどちらもＴ細胞増殖を刺激できなかった。また、抗ＨＬＡＩＡ／ＩＥのアイソタイプが存在すると、増殖活性は元の値のままであった。このことにより、Ｔ細胞増殖性のＭＨＣＩＩ依存性が明らかである。図５Ａ〜Ｂでは、わかりやすくするため、この実験のキーとなる結果のみを示した。
【０１０３】
ＧＢＳＩＩＩは、野生型ＢＡＬＢ／ｃまたはＯＶＡＴ細胞マウス由来のＴ細胞を刺激しなかった。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡおよびＯＶＡは、２つの異なる細胞集団を選択的に刺激した。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡは、ＢＡＬＢ／ｃＴ細胞の増殖を誘導することができた（ＳＩ：２．１）が、ＯＶＡｐ特異的Ｔ細胞を刺激しなかった（ＳＩ：１．１）。他方、ＯＶＡは、ＯＶＡｐＴ細胞を刺激した（ＳＩ：３．４）が、ＢＡＬＢ／ｃＴ細胞を刺激できなかった（ＳＩ：０．８）。この観察結果は、両抗原は異なるＴ細胞エピトープを介してＴ細胞を刺激していることを示唆している。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡのエピトープはＯＶＡＴ細胞によって認識され得ないが、ＢＡＬＢ／ｃＴ細胞にはＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡエピトープを認識するＴ細胞受容体レパートリーがある。
【０１０４】
ＯＶＡｐおよびＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐの刺激に関して興味ある観察がなされた。ＯＶＡｐは、ＯＶＡｐ特異的Ｔ細胞の極端な増殖を誘導する（ＳＩ：２９３５．０）が、ＢＡＬＢ／ｃＴ細胞の刺激に関しては効果が無い（ＳＩ：０．８５）。他方、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐは、両グループのＴ細胞を刺激する（ＢＡＬＢ／ｃＴ細胞ＳＩ：４．０、ＯＶＡｐＴ細胞ＳＩ：５３．６）。この観察と同じパターンがＯＶＡとＩＩＩ−ＯＶＡの刺激でも認められた。ＢＡＬＢ／ｃＴ細胞は、ＯＶＡｐ用のＴＣＲが欠如しているが、ＩＩＩ−ＯＶＡｐの抗原エピトープを認識でき、これは、ＩＩＩ−ＯＶＡｐおよびＯＶＡｐの両方に対し１つのペプチドエピトープが存在できるだけなので、ＩＩＩ−ＯＶＡｐが糖質分子を伴ったエピトープを有していることを示唆している。この実験から導き出される別の非常に重要な潜在的結論は、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐによるＯＶＡＴ細胞刺激のＴ細胞増殖（ＳＩ：５３．６）が、同量のＯＶＡｐによる刺激（ＳＩ：２９３５．０）に比べて約６０分の一に減少しているので、ＯＶＡｐＴ細胞はＩＩＩ−ＯＶＡｐエピトープを認識しないということであった。
【０１０５】
実際、１０μｇＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ（１．３μｇＯＶＡｐ含量を有す）に比べて、ＯＶＡｐの系列希釈でもまだ良好な刺激を示した（０．１３μｇＯＶＡｐ−ＳＩ：７８１、０．０１３μｇＯＶＡｐ−ＳＩ：３５）。これらの結果は、ＩＩＩ−ＯＶＡｐが糖化ペプチドエピトープを有しており、そのエピトープが提示された場合、ＯＶＡｐＴ細胞のＴＣＲはこの糖化ペプチドを認識せず、ＯＶＡｐ刺激に比べて、これらのＴ細胞の刺激の劇的な減少を生ずることを示唆している。
【０１０６】
実施例５−糖化ペプチドに対するＣＤ４＋Ｔ細胞の応答
Ｔ細胞は、特定のＭＨＣＩＩ結合炭水化物（ＺＰＳ）を認識し、この認識が生物学的に重要な結果をもたらす。ＭＨＣＩＩ結合に必要なＺＰＳの特有で重要な化学特性は、双性イオン電荷モチーフであり、これにより静電的ＺＰＳＭＨＣＩＩ結合が可能となる。非複合化ＧＢＳＩＩＩおよびほぼ全ての他の炭水化物は、双性イオン電荷モチーフが欠如しており、代わりに、その反復ユニット構造の一部として、負に帯電した基のみか、または帯電基が全くないかである。これらの知見は、多糖にＴ細胞非依存性を与える少なくとも１つの機序は、ＭＨＣＩＩに結合できないことであり、必ずしもＣＤ４＋Ｔ細胞のαβＴＣＲが炭水化物を認識できないことではないことを示唆している。
【０１０７】
Ｔ細胞増殖アッセイを行いエンドソーム中で産生され、ＡＰＣの表面に提示されたＭＨＣＩＩ結合糖化ペプチドの炭水化物部をＴ細胞が認識できるか否かを判定した。野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスをＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡで免疫し、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡにより産生されたエピトープを認識するＴ細胞のレパートリーを増幅した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をこれらのマウスの脾臓から集め、ＡＰＣの存在下、９日間インビトロでＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡによる刺激によりさらに増幅した。この手法は、ＯＶＡ（ペプチド）を認識するＴ細胞のみでなく、ＧＢＳＩＩＩエピトープ（すなわち、ペプチド結合炭水化物の認識により）を認識するＴ細胞およびＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡエピトープ（すなわち、ペプチドと炭水化物両方の認識により）を認識するＴ細胞の増殖も促進する意図があった（このようなＴ細胞があれば）。また、この手順は、９日間の同時培養期間中に、刺激されていないＴ細胞（すなわち、これらの抗原に対し特異的でないもの）を除外した。同時培養後、ＩＬ−２−、ＩＬ−４−、およびＩＦＮ−γ−産生ＣＤ４＋Ｔ細胞を増幅したＴ細胞とＡＰＣの再刺激同時培養の上澄みを使ってＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った（図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃ）。いくつかの抗原をＥＬＩＳＰＯＴアッセイに使用した。最初、Ｔ細胞のＯＶＡおよびＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ再刺激のためのサイトカインのプロファイルを比較した。図６Ｂおよび６Ｃに示すように、ＯＶＡは、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡに比べ有意に高いＩＦＮ−γ分泌、および有意に低いＩＬ−４分泌を誘導した。この結果は、ＯＶＡが、Ｔｈ２およびＴｈ１細胞の両方を刺激する一方、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡは、優先的にＴｈ２細胞を刺激することを示唆している。ＯＶＡ単独に比較して、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡによる多量のＩＬ−４産生は、複合糖質ワクチンに対する至適免疫応答の誘導についての有益な情報を示す可能性がある。
【０１０８】
ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ免疫マウス由来の血清中に現れたＯＶＡ特異的ＩｇＧのサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ）は、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の両方がＢ細胞を刺激していることを示唆し、一方、ＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１のみ）はＩＬ−４によるＢ細胞刺激を示した（図６Ｄおよび６Ｅ）。この知見は、特有のＣＤ４＋Ｔ細胞集団がＩｇＧスイッチを操作する糖化ペプチドの炭水化物部に応答することを示唆している。
【０１０９】
炭水化物応答Ｔ細胞集団の存在を確認するため、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより再度調査した。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ（前に検討済み）を使った初期の９日間の増幅後使用されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、このアッセイ中でＧＢＳＩＩＩ複合糖質を使って再刺激した。この複合糖質では、ＧＢＳＩＩＩ多糖が異なるキャリアタンパク質、破傷風トキソイド（ＴＴ）、と複合化されＧＢＳＩＩＩ−ＴＴを産生した。使用されたＴ細胞は、最初ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡで増幅されたため、ＧＢＳＩＩＩまたはＯＶＡから産生されたエピトープのみを認識した。この集団がＧＢＳＩＩＩのみを認識するＴ細胞亜集団を含んでいる場合は、それらはＴＴではなく、ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴによって刺激されるであろう。実際、図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃに示されたデータは、この仮定を検証し、Ｔ細胞集団のＧＢＳＩＩＩ多糖の認識を明確に示している。
【０１１０】
実施例６-ＯＶＡｐ特異的ＴＣＲの糖化ペプチドに対する応答
次に、Ｔ細胞応答が１つのキャリアペプチドの方向にのみ向いている複合糖質を構築した。完全長タンパク質との特定の複合体は、複合後、さらに免疫原性の強いペプチドを提示し、単独の場合のタンパク質キャリアにより提示されたペプチドより免疫原性の強いペプチドに対する強化免疫応答が得られる可能性があった。単一のペプチドＴ細胞エピトープを含むＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐを抗原として使用した。ＯＶＡｐ特異的ＴＣＲ遺伝子導入（ＤＯ１１．１０）マウスおよび野生型（ＢＡＬＢ／ｃ）マウスの両方から、各マウス株をＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐで２週おき３回免疫した後、リンパ細胞を採取した。Ｔ細胞増殖実験では、野生型（ＢＡＬＢ／ｃ）マウス由来照射ＡＰＣを、免疫ＢＡＬＢ／ｃマウス（図７Ａ）または免疫ＤＯ１１．１０マウス（図７Ｂ）由来のＣＤ４＋Ｔ細胞と共に同時インキュベートした。ｉＡＰＣ／ＣＤ４＋Ｔ−細胞混合物をインビトロで３つの抗原：ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ（１０μｇ）；ＧＢＳＩＩＩ（７．５μｇ、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐの１０−μｇ用量中のＧＢＳＩＩＩ含量に相当）；およびＯＶＡｐ（２．５μｇ、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐの１０−μｇ用量中のＯＶＡｐ含量に相当）で刺激した。
【０１１１】
ＧＢＳＩＩＩは、野生型ＢＡＬＢ／ｃまたはＯＶＡｐＴ細胞遺伝子導入マウス由来のＴ細胞を刺激しなかった。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐで免疫した野生型マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞は、ワクチンに使われている特異的ペプチドのみが投与された場合よりも、複合体が投与された場合の方が良好に応答した（ｐ＝０．００９）；この意味するところは、ペプチドよりはむしろＧＢＳＩＩＩＯＶＡｐの炭水化物部がＴＣＲに提示されたということである。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐおよびＯＶＡｐの両方に対して同じ単一の抗原性ペプチドとの複合体の形成は、これらの２つの抗原に対する異なるＴ細胞応答が、異なるペプチドエピトープの提示によるということでは説明され得ないことを立証している。ＤＯ１１．１０ＣＤ４＋Ｔ細胞を使って、ＯＶＡｐは非常に強力な増殖応答を誘導した（２８５、０００ｃｐｍ；図７Ｂ）。重要な知見は、同時培養物がＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐで刺激された場合は、ＤＯ１１．１０ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＯＶＡｐを認識しているようには見えなかったことであった。増殖が、同量のＯＶＡｐで刺激した場合（２８５、０００ｃｐｍ）に比べ、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐで刺激したＤＯ１１．１０Ｔ細胞で約１／２３（１２、６８７ｃｐｍ）に低下した。これらの結果は、ＩＩＩ−ＯＶＡｐが、提示されても、ＤＯ１１．１０遺伝子導入ＯＶＡ特異的Ｔ細胞のＴＣＲによって認識されない糖化ペプチドエピトープを持っていることを示唆している。結果として、これらＴ細胞のＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐによる刺激は、ＯＶＡｐによる刺激に比べ激減した。また、これらの知見は、炭水化物がＡＰＣ表面上のＯＶＡｐ提示をマスキングしていることを示唆している。ブレフェルジンＡをＡＰＣ／ＣＤ４＋同時培養時に添加し、ＭＨＣＩＩの提示をブロックした場合（小胞体内部のＭＨＣＩＩ分子をトラップすることにより）、または抗ＨＬＡ−ＩＡ／ＩＥが添加されＴ細胞によるＭＨＣＩＩ認識を阻害した場合、Ｔ細胞刺激は観察されなかった。この結果は、ＭＨＣＩＩによるプロセッシングおよび提示が必要であることを確証させるものである（図７Ｃおよび７Ｄ）。さらに、ＯＶＡｐとして同じアミノ酸含量であるが、全体としては異なる配列のスクランブルしたＯＶＡペプチド、ｓｃＯＶＡｐ、を使用した。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐ免疫野生型またはＤＯ１１．１０マウス由来のＡＰＣとＣＤ４＋Ｔ細胞の同時培養物は、スクランブルしたペプチドに応答しなかった（＜５００ｃｐｍ）；すなわち、ＴＣＲはＯＶＡｐ配列のみを有するペプチドに特異的であった。
【０１１２】
実施例７−Ｂ細胞による多糖特異的抗体アイソタイプスイッチ媒介
多糖特異的抗体（ＩｇＧ）の応答がペプチドエピトープの認識によるものか、または炭水化物エピトープの認識によるものなのかを判定するため、ＤＯ１１．１０ＯＶＡｐ特異的ＴＣＲ遺伝子導入マウスおよびＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐで免疫した野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスを使って、ＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ力価を測定した。ＤＯ１１．１０遺伝子導入マウスは、ＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧを産生しなかったが、一方野生型マウスは、ＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧの高い力価を示した（図８Ａ）。さらに、ＤＯ１１．１０マウスおよび野生型マウスは、同等量のＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＭを生じ、この結果は、ＤＯ１１．１０マウスにおけるＩｇＧ産生の欠如が、少ない数のＧＢＳＩＩＩ特異的Ｂ細胞によるものではないことを示している（Ｆｉｇ．８Ａ）。これらの結果は、ヘルパーＴ細胞のＴＣＲによるＧＢＳＩＩＩの認識がＢ細胞による多糖特異的ＩｇＧ分泌を誘導するという仮説を裏付けるものである。ＤＯ１１．１０マウスは、複合糖質ワクチンの炭水化物エピトープを認識するＴ細胞レパートリーが欠如しているので、ＤＯ１１．１０Ｔ細胞は、Ｂ細胞の多糖特異的ＩｇＧ分泌を誘導できなかった。野生型およびＤＯ１１．１０マウスをＯＶＡｐ（無多糖）で免疫した場合、ＤＯ１１．１０マウスが、より高い力価のＯＶＡｐ特異的ＩｇＧを産生した（図８Ｃ）。後者の実験により、ＤＯ１１．１０マウスのＩｇＧ産生能力の欠如によって、ＧＢＳＩＩＩ特異的抗体産生に失敗したことの説明はできないことを示した。
【０１１３】
実施例８：Ｔ細胞はＡＰＣ表面の複合糖質と連携して提示された炭水化物に応答し得る
データは、ＰＳＡやＧＢＳＩＩＩ等の細菌性ＣＰＳが、エンドソーム中でより小さい分子にプロセッシングされうることを示唆している。これらの炭水化物は、分解された形でＡＰＣ表面上を行き交い、そこで検出されてＭＨＣＩＩに結合するように思われる。既発表研究では、生物学的に重要な結果と共に、Ｔ細胞が特定の多糖（ＺＰＳ）に応答することが明確に示されている。Ｍａｚｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、１２２：１０７−１１８（２００５）；Ｒｕｉｚ−Ｐｅｒｅｚ ｅｔ ａｌ．、ＰＮＡＳ、１０２：１６７５３−１６７５８（２００５）；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ、２０３：２８５３−２８６３（２００６）。次に、ＭＨＣＩＩにより提示された、ペプチドを介してＭＨＣＩＩに結合した炭水化物（糖化ペプチド）にＴ細胞が応答するか否かを判定した。再度、仮説は、複合糖質または糖タンパク質をプロセッシングする場合、タンパク質由来ペプチドエピトープを提示するのと同様に、ＡＰＣが糖化ペプチドをＴ細胞に対し提示するということであった。
【０１１４】
養子免疫細胞移入実験を行った。細胞ドナーＢａｌｂ／ｃマウス群は、ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴワクチンまたはＴＴ単独により初回刺激を受けた。ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ刺激マウスの脾臓由来のＢ細胞（１０８）を未処理Ｂａｌｂ／ｃレシピエント（群当たり６匹のマウス）の２つの群に移入した。これらは、また、ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ刺激またはＴＴ刺激動物由来のＣＤ４＋Ｔ細胞（０．５ｘ１０８）も受けた。ＣＤ４＋Ｔ細部および食塩水レシピエントの未処理マウス由来のＢ細胞を対象として用いた。細胞移入の２４時間後、細胞レシピエントをＧＢＳＩＩＩ−ＴＴワクチンで免疫した。ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ免疫動物由来のＴ細胞を受けたマウスの免疫応答は、ＴＴ単独で免疫された動物由来のＴ細胞を受けたマウスより、有意に向上した（ｐ＜０．０１；図９）。
【０１１５】
全レシピエントマウスが、同じプール（ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ免疫化）由来のＢ細胞を与えられたので、復活免疫化動物の応答の大きさの差異はＴ細胞ソース（ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ刺激対ＴＴ刺激ドナー）に起因する。ＴＴ免疫動物由来のＴ細胞のレシピエントよりも、ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ刺激動物由来のＴ細胞のレシピエントにおいてより好ましいペプチド（より良好なＴ細胞エピトープを伴った）が提示される可能性はある。しかし、ＴＴ免疫復活よりも、ドナーＴ細胞の方がＧＢＳＩＩＩ−ＴＴでより良好に刺激されること、すなわち、ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴ刺激ドナー由来のＴ細胞が糖化ペプチドで刺激され、そのため糖化ペプチドを認識したこと、また、復活免疫化動物が複合糖質を受けたために、ＩＩＩ−ＴＴ免疫動物由来のＴ細胞を受けた動物は、今や、ペプチド単独よりも良好な糖化ペプチドを認識するＴ細胞を有すること、等も同様にあり得ることである。
【０１１６】
これらのデータは、Ｔ細胞が、ペプチドと糖化ペプチドを区別して認識するという仮説を裏付けるものである。
【０１１７】
実施例９：ペプチド複合糖質の最適化
マウスをＩＩＩ−ＯＶＡｐ１９（ＯＶＡｐ１９は１９アミノ酸を意味し、ＯＶＡの１７ａａＴＣＲ依存抗原エピトープ、ＯＶＡｐ、の各末端に付加した２つのリジン基を含む）で免疫した場合、ＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧの分泌が観察されなかった。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡｐがＩｇＭ−ＩｇＧスイッチを誘導できなかったことに対する推定される理由は、ＩＩＩ−ＯＶＡｐの設計に関係のあることかもしれない。この構築物中のペプチドは、ＮおよびＣ末端の両方から多糖に共有結合で結合している。この両側の結合は、高度架橋複合体中にペプチドを捕捉し、エンドソーム中でＭＨＣＩＩ分子によるペプチドの認識を最小化する可能性がある。（図１０Ｂ）。ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ延長ペプチド複合体（ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐ）を設計し合成した（図１０Ｃ）。ここで、ＯＶＡｐ（３２３−３３９）をＣ末端上で４アミノ酸で延長し、リジンをＣ末端残基とした。Ｎ末端のアミノ官能性は、Ｎ末端アミンのアセチル化によりブロックした。延長ＯＶＡｐを設計し、合成した：（Ｎ−アセチル）−ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲＥＳＧＫ。このペプチドは、非常に均一な単鎖構築物をもたらすＣ末端リジン基を介してＧＢＳＩＩＩとのみ複合できる。また、延長部分（ＥＳＧＫ）は、ペプチドと糖質の間に空隙を生成し、ＭＨＣＩＩ分子のペプチドに対するアクセスを可能にする。この複合体は、標的特異的であるように設計され（タンパク質特異的免疫応答を誘発するタンパク質キャリアが無い）、また、この構築物は、高度に架橋したタンパク質複合体に比べ分子当たり１オーダー多い抗原エピトープを含む（タンパク質多糖複合体の場合の１〜２エピトープとは対照的に、多糖の１０反復単位毎に１ペプチドがあり１０〜１５糖化ペプチドエピトープになる）。
【０１１８】
４群のＢＡＬＢ／ｃ（群当たり４匹のマウス）を、１）ＧＢＳＩＩＩ単独、２）ＯＶＡ、３）ＩＩＩ−ＯＶＡ、または４）ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐで３回免疫した（０、１４、２８日目）。３５日目に集めた血液から血清を採取した。精製しＧＢＳＩＩＩに対するマウスＩｇＧ２ａモノクローナル抗体を使って各血清中のＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ量を定量した。図１２に示したように、用量反応分析では、ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐまたはＩＩＩ−ＯＶＡで免疫したマウスは、ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐおよびＩＩＩ−ＯＶＡの濃度の増加と共により多くのＩＩＩ−ＩｇＧを産生したことが明らかになった。
【０１１９】
ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐのＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ抗体の分泌を誘導する能力は、このワクチンが、多形核白血球（ＰＭＮＬ）によるＩＩＩ型Ｂ群連鎖球菌の食作用を誘導するのに強力である可能性を示唆している。これを試験するために、ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐで免疫したマウスの血清を使って、オプソニン化貪食作用アッセイを行った。図１１に示すように、ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐ免疫マウスからの血清は、細菌をオプソニン化し、その食作用を可能にすることに関し、ＩＩＩ−ＯＶＡ免疫マウスからの血清と同等の強力さであった。ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐ免疫マウス由来の血清は、ＩＩＩ−ＯＶＡ免疫マウス由来の血清より約７倍少ないＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧを含むことを知ると、ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐ血清のオプソニン化貪食作用を誘導する能力はＩＩＩ−ＯＶＡ血清よりもさらに大きい。
【０１２０】
新生仔マウス保護アッセイを行ってＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐの保護能力を調べた。雌マウスをＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐで免疫したが、これらの免疫雌マウスが妊娠している場合、ＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ抗体が胎盤を通過して胎児に到達する。次に、その子はＩＩＩ型Ｂ群連鎖球菌の攻撃を受けた。攻撃後０、２４、４８、および７２時間の時点でＧＳＢＩＩＩに攻撃された子のパーセント生存率を測定した。図１３に示すように、ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐ免疫母から生まれた子の生存により、ＩＩＩ−ＯＶＡｅｘｔｐｅｐがＧＢＳＩＩＩの攻撃に対してマウスを保護する能力を有することが立証された。
【０１２１】
実施例１０−インビボプライミングアッセイ
糖化ペプチドの炭水化物部のＣＤ４＋Ｔ細胞による認識が、複合糖質に対する体液性免疫応答の誘導における主要因子であるか否かを判定するため、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡで初回刺激し、ＧＢＳＩＩＩＯＶＡまたはＧＢＳＩＩＩ−ＴＴで追加免疫した。ＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧの血清中レベルを測定した（図１４）。３群のマウスを対照として使った：（１）ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴで初回刺激と追加免疫したマウス、（２）ＧＢＳＩＩＩで初回刺激し、ＧＢＳＩＩＩ−ＴＴで追加免疫したマウス、および（３）ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡで初回刺激し、ＧＢＳＩＩＩで追加免疫したマウス。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によるペプチド認識が、Ｂ細胞による多糖特異的ＩｇＧ分泌を誘発することが仮定されている。従って、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡで初期刺激しＧＢＳＩＩＩ−ＴＴで追加免疫したマウスに比べ、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡで初回刺激と追加免疫したマウスＧＢＳＩＩＩに対する血清ＩｇＧの方がより高い力価をしめすことが期待されよう。すなわち、初回刺激キャリアタンパク質からのペプチドに対するＴ細胞の記憶のために、同じキャリアタンパク質による初回刺激と追加免疫の方が異種のキャリアによる追加免疫よりも有意に多くのＴ細胞ヘルプを誘発すると推定できるであろう。あるいは、糖化ペプチドの炭水化物部に対するＴ細胞記憶の状態で、ＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ力価は、複合体中の同じキャリアタンパク質による追加免疫に依存しないであろう。図１４Ａに示すように、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡ初期刺激マウスのＧＢＳＩＩＩ−ＴＴによる追加免疫は、ＧＢＳＩＩＩ−ＯＶＡによる初回刺激と追加免疫と類似のＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ分泌を誘導した（ｐ＞０．０５、ｎｓ）。この結果は、炭水化物特異的免疫応答を誘導するＴ細胞ヘルプは、ペプチド認識ではなく、炭水化物認識を経由して取り込まれることを示している。初回刺激後のＧＢＳＩＩＩ特異的ＩｇＧ力価を図１４Ｂに示す。
【０１２２】
実施例１１．非ペプチドキャリア成分
これらの実験では、ＭＨＣ結合成分は双性イオン炭水化物、すなわち、多糖Ａ（ＰＳＡ）である。ＰＳＡは、双性イオン電荷を有し、ＭＨＣＩＩに結合する。誘導された免疫応答の標的になる多糖またはオリゴ糖がこのキャリア分子に結合する。ＰＳＡキャリアはペプチドに代わりＭＨＣＩＩに結合するためのアンカーの役割をし、標的多糖またはオリゴ糖は、本出願に記載の糖化ペプチドの場合と類似の方法により、Ｔ細胞受容体による認識に使用可能となる。これらの糖化キャリア分子は、ヘルパー機能と抗体産生に必要なＴ細胞応答を誘導する。
【０１２３】
双イオン性ヘパロサン（大腸菌Ｋ５多糖、図１５Ａ参照）オリゴ糖誘導体をＣＤ４＋Ｔ細胞刺激により試験した。双性イオンヘパロサンオリゴ糖をＴ細胞非依存性抗原と複合化し、キャリアのＭＨＣＩＩ分子への結合により、Ｔ細胞への提示を可能とした。双性イオンヘパロサンオリゴ糖に対し、ヒトＴ細胞アッセイを行った。ＳＥＡ抗原（陽性対照）に対するＴ細胞数を１００に正規化した。オリゴ糖を４μｇ／ｍｌとした。Ｔ細胞刺激を８日間にわたり測定した。
図１５Ｂに示すように、これらの構築物は、非常に高いＴ細胞増殖を誘導した。
【０１２４】
追加文献
【０１２５】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と合わせて記載したが、これまでの記述は説明を意図しているもので、本発明の範囲を限定するものではなく、添付の請求項により規定されることは理解されるべきである。他の態様、特徴、および変更は、以下の請求項の範囲に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖化ペプチド複合体を調製する方法であって：
多糖の集団を取得するステップ；
任意選択で、多糖の集団を処理して約５〜２０ｋＤａの平均分子量を有するオリゴ糖の集団を作るステップ；
オリゴ糖の集団を、切断可能成分を使って相互に結合された複数の反復ペプチド単位を含むポリペプチドと接触させるステップであって、各ペプチド単位が：
(i)MHC-II結合配列;
(ii)１つまたは複数のリジン残基;および任意選択として、
(iii)MHC-II結合配列とリジン残基を結合する１つまたは複数のアミノ酸;から構成されるステップ；
オリゴ糖を直接リジン残基に結合させるために十分な条件の下、
それにより糖化ペプチド複合体を調製するステップ；を含む方法。
【請求項２】
糖化ペプチド／ナノ粒子複合体を調製する方法であって：
多糖の集団を取得するステップ;
任意選択で、多糖の集団を処理して約５〜２０ｋＤａの平均分子量を有するオリゴ糖の集団を作るステップ；
オリゴ糖の集団を、ペプチド単位の集団と接触させるステップであって、各ペプチド単位が：
(i)MHC-II結合配列;
(ii)１つまたは複数のリジン残基;および任意選択として、
(iii)MHC-II結合配列とリジン残基を結合する１つまたは複数のアミノ酸;から構成されるステップ；
オリゴ糖を直接リジン残基に結合させるために十分な条件の下、
それにより糖化ペプチド複合体を調製するステップ；
生体適合性ナノ粒子を供給するステップ;および
ペプチドのＮ末端を切断可能なリンカーにより生体適合性ナノ粒子に結合するステップ；を含む方法。
【請求項３】
多糖がウイルス, 細菌, 原虫類,および真菌からなる群より選択される病原体由来である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
多糖が腫瘍関連糖タンパク質由来である、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
多糖の処理が多糖をオゾン分解または酵素消化に曝すことを含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
各ペプチドがＣ末端に単一リジン残基を有する、請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
切断可能成分が酸不安定配列である、請求項２記載の方法。
【請求項８】
切断可能成分がプロテアーゼ認識配列である、請求項２記載の方法。
【請求項９】
各ペプチド単位が同じMHC-II結合配列を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
ペプチド単位が複数のMHC-II結合配列を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
請求項1または３〜１０のいずれかに記載の方法により調製される糖化ペプチド複合体。
【請求項１２】
請求項２〜１０のいずれかに記載の方法により調製される糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項１３】
糖化ペプチド複合体であって：
切断可能成分により相互に結合された複数の反復ペプチド単位を含むポリペプチドであって、各ペプチド単位が：
(i)MHC-II結合配列;
(ii)１つまたは複数のリジン残基;および任意選択として、
(iii) MHC-II結合配列とリジン残基を結合する１つまたは複数のアミノ酸;から構成されるポリペプチド；
オリゴ糖であって,好ましくは、約５〜２０ｋＤａの平均分子量を有し、リジン残基に直接結合しているオリゴ糖；を含む糖化ペプチド複合体。
【請求項１４】
糖化ペプチド／ナノ粒子複合体であって：
複数の糖化ペプチドであって,それぞれが、
(i)MHC-II結合配列;
(ii)１つまたは複数のリジン残基;および任意選択として、
(iii) MHC-II結合配列とリジン残基を結合する１つまたは複数のアミノ酸;
から構成される複数のペプチド単位；
好ましくは、約５〜２０ｋＤａの平均分子量を有し、ペプチド単位のリジン残基に直接結合しているオリゴ糖；を含む糖化ペプチド；を含み、
糖化ペプチドが切断可能なリンカーを介してペプチド単位のＣ末端で生体適合性ナノ粒子に結合している糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項１５】
多糖がウイルス、細菌、原虫類、および真菌からなる群より選択される病原体由来である、請求項１３記載の糖化ペプチド複合体または請求項１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項１６】
多糖が腫瘍関連糖タンパク質由来である、請求項１３記載の糖化ペプチド複合体または請求項１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項１７】
多糖の処理が多糖をオゾン分解または酵素消化に曝すことを含む、請求項１３記載の糖化ペプチド複合体または請求項１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項１８】
各ペプチドがＣ末端に単一リジン残基を有する、請求項１３記載の糖化ペプチド複合体または請求項１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項１９】
切断可能成分が酸不安定配列である、請求項１３記載の糖化ペプチド複合体、または請求項１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項２０】
切断可能成分がプロテアーゼ認識配列である、請求項１３記載の糖化ペプチド複合体または請求項１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項２１】
各ペプチド単位が同じMHC-II結合配列を含む、請求項１３記載の糖化ペプチド複合体または請求項１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項２２】
ペプチド単位が複数のMHC-II結合配列を含む、請求項１３記載の糖化ペプチド複合体または請求項１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項２３】
患者の免疫応答を誘導する方法であって、治療有効量の請求項１１もしくは１３記載の糖化ペプチド複合体、または請求項１２もしくは１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体を投与することを含む方法。
【請求項２４】
請求項１１もしくは１３記載の糖化ペプチド複合体、または請求項１２もしくは１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体を薬剤的に許容可能なキャリア中に含む組成物。
【請求項１】
糖化ペプチド複合体を調製する方法であって：
多糖の集団を取得するステップ；
任意選択で、多糖の集団を処理して約５〜２０ｋＤａの平均分子量を有するオリゴ糖の集団を作るステップ；
オリゴ糖の集団を、切断可能成分を使って相互に結合された複数の反復ペプチド単位を含むポリペプチドと接触させるステップであって、各ペプチド単位が：
(i)MHC-II結合配列;
(ii)１つまたは複数のリジン残基;および任意選択として、
(iii)MHC-II結合配列とリジン残基を結合する１つまたは複数のアミノ酸;から構成されるステップ；
オリゴ糖を直接リジン残基に結合させるために十分な条件の下、
それにより糖化ペプチド複合体を調製するステップ；を含む方法。
【請求項２】
糖化ペプチド／ナノ粒子複合体を調製する方法であって：
多糖の集団を取得するステップ;
任意選択で、多糖の集団を処理して約５〜２０ｋＤａの平均分子量を有するオリゴ糖の集団を作るステップ；
オリゴ糖の集団を、ペプチド単位の集団と接触させるステップであって、各ペプチド単位が：
(i)MHC-II結合配列;
(ii)１つまたは複数のリジン残基;および任意選択として、
(iii)MHC-II結合配列とリジン残基を結合する１つまたは複数のアミノ酸;から構成されるステップ；
オリゴ糖を直接リジン残基に結合させるために十分な条件の下、
それにより糖化ペプチド複合体を調製するステップ；
生体適合性ナノ粒子を供給するステップ;および
ペプチドのＮ末端を切断可能なリンカーにより生体適合性ナノ粒子に結合するステップ；を含む方法。
【請求項３】
多糖がウイルス, 細菌, 原虫類,および真菌からなる群より選択される病原体由来である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
多糖が腫瘍関連糖タンパク質由来である、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
多糖の処理が多糖をオゾン分解または酵素消化に曝すことを含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
各ペプチドがＣ末端に単一リジン残基を有する、請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
切断可能成分が酸不安定配列である、請求項２記載の方法。
【請求項８】
切断可能成分がプロテアーゼ認識配列である、請求項２記載の方法。
【請求項９】
各ペプチド単位が同じMHC-II結合配列を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
ペプチド単位が複数のMHC-II結合配列を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
請求項1または３〜１０のいずれかに記載の方法により調製される糖化ペプチド複合体。
【請求項１２】
請求項２〜１０のいずれかに記載の方法により調製される糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項１３】
糖化ペプチド複合体であって：
切断可能成分により相互に結合された複数の反復ペプチド単位を含むポリペプチドであって、各ペプチド単位が：
(i)MHC-II結合配列;
(ii)１つまたは複数のリジン残基;および任意選択として、
(iii) MHC-II結合配列とリジン残基を結合する１つまたは複数のアミノ酸;から構成されるポリペプチド；
オリゴ糖であって,好ましくは、約５〜２０ｋＤａの平均分子量を有し、リジン残基に直接結合しているオリゴ糖；を含む糖化ペプチド複合体。
【請求項１４】
糖化ペプチド／ナノ粒子複合体であって：
複数の糖化ペプチドであって,それぞれが、
(i)MHC-II結合配列;
(ii)１つまたは複数のリジン残基;および任意選択として、
(iii) MHC-II結合配列とリジン残基を結合する１つまたは複数のアミノ酸;
から構成される複数のペプチド単位；
好ましくは、約５〜２０ｋＤａの平均分子量を有し、ペプチド単位のリジン残基に直接結合しているオリゴ糖；を含む糖化ペプチド；を含み、
糖化ペプチドが切断可能なリンカーを介してペプチド単位のＣ末端で生体適合性ナノ粒子に結合している糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項１５】
多糖がウイルス、細菌、原虫類、および真菌からなる群より選択される病原体由来である、請求項１３記載の糖化ペプチド複合体または請求項１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項１６】
多糖が腫瘍関連糖タンパク質由来である、請求項１３記載の糖化ペプチド複合体または請求項１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項１７】
多糖の処理が多糖をオゾン分解または酵素消化に曝すことを含む、請求項１３記載の糖化ペプチド複合体または請求項１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項１８】
各ペプチドがＣ末端に単一リジン残基を有する、請求項１３記載の糖化ペプチド複合体または請求項１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項１９】
切断可能成分が酸不安定配列である、請求項１３記載の糖化ペプチド複合体、または請求項１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項２０】
切断可能成分がプロテアーゼ認識配列である、請求項１３記載の糖化ペプチド複合体または請求項１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項２１】
各ペプチド単位が同じMHC-II結合配列を含む、請求項１３記載の糖化ペプチド複合体または請求項１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項２２】
ペプチド単位が複数のMHC-II結合配列を含む、請求項１３記載の糖化ペプチド複合体または請求項１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体。
【請求項２３】
患者の免疫応答を誘導する方法であって、治療有効量の請求項１１もしくは１３記載の糖化ペプチド複合体、または請求項１２もしくは１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体を投与することを含む方法。
【請求項２４】
請求項１１もしくは１３記載の糖化ペプチド複合体、または請求項１２もしくは１４記載の糖化ペプチド／ナノ粒子複合体を薬剤的に許容可能なキャリア中に含む組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【公表番号】特表２０１２−５２１４２３（Ｐ２０１２−５２１４２３Ａ）
【公表日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０２０２４（Ｐ２０１２−５０２０２４）
【出願日】平成２２年１月８日（２０１０．１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２０５３６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１０９３１
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５１１２３０６３５）ザ ブリガム アンド ウーメンズ ホスピタル，インク (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月１３日（２０１２．９．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月８日（２０１０．１．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２０５３６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１０９３１
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５１１２３０６３５）ザ ブリガム アンド ウーメンズ ホスピタル，インク (2)
【Ｆターム（参考）】
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