複素環含有ペプチド化合物の製造方法及びゴードスポリンの類縁体
【課題】ゴードスポリン及びその類縁体の生産量を増大させる製造方法及びゴードスポリンの類縁体を提供する。
【解決手段】転写活性化因子ゴッドアール（godR）遺伝子をゴードスポリン生産微生物に形質転換することによって，ゴードスポリンの生産量を増大させたり，転写活性化因子ゴッドアール（godR）遺伝子をゴードスポリン生産微生物の染色体ＤＮＡ上に１ないしは複数個，組み込むことによって，ゴードスポリンの生産量を増大させたり，或いは，転写活性化因子ゴッドアール（godR）遺伝子をゴードスポリン生産微生物に形質転換することによって，ゴードスポリンの生産量が増大した微生物のゴッドエー(godA)遺伝子配列の塩基を置換又は欠失、挿入することによってゴードスポリン類縁体を製造する。
【解決手段】転写活性化因子ゴッドアール（godR）遺伝子をゴードスポリン生産微生物に形質転換することによって，ゴードスポリンの生産量を増大させたり，転写活性化因子ゴッドアール（godR）遺伝子をゴードスポリン生産微生物の染色体ＤＮＡ上に１ないしは複数個，組み込むことによって，ゴードスポリンの生産量を増大させたり，或いは，転写活性化因子ゴッドアール（godR）遺伝子をゴードスポリン生産微生物に形質転換することによって，ゴードスポリンの生産量が増大した微生物のゴッドエー(godA)遺伝子配列の塩基を置換又は欠失、挿入することによってゴードスポリン類縁体を製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は，複素環のうち，チアゾール環，オキサゾール環，又はメチルオキサゾール環を含有するペプチド化合物の製造方法であって，例えば，複素環含有ペプチド化合物であるゴードスポリン及びゴードスポリン類縁体を効率的に製造する方法及びゴードスポリンの類縁体に関する。
【背景技術】
【０００２】
複素環含有ペプチド化合物であるゴードスポリン(Goadsporin)は，一般式（１）で示される構造式を持ち，放線菌の二次代謝産物生産，及び胞子形成促進効果，更には生育阻害効果を有する化合物として富山県立大学の尾仲らによって発見された（例えば，非特許文献１参照）。
【０００３】
【化１】
ＧＳ−−−−（１）
【０００４】
ゴードスポリン(Goadsporin)は，上記式（１）に示すように，１９個のアミノ酸を前駆体として生合成されるペプチド化合物であり，ゴードスポリン前駆体は，リボゾームによる翻訳により生合成される。このゴードスポリン前駆体蛋白遺伝子は，ゴッドエー（godA）であり，全長１５０塩基，４９個のアミノ酸をコードしている。この内，Ｃ末端側１９個のアミノ酸部位がゴードスポリン前駆体の配列である。ゴードスポリンを生産する放線菌であるストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces sp) ＴＰ−Ａ０５８４株（受託番号：ＴＰ−Ａ０５８４，ＮＩＴＥ Ｐ−５１８）における生合成は，図１１に示すような経路で行われる。図１１に示すように，まず，菌体内ではゴードスポリン前駆体蛋白遺伝子であるゴッドエー(godA)が転写翻訳され，ゴッドエー（GodA）蛋白が発現する。次に，ゴッドビー(GodB)，ゴッドシー(GodC)蛋白によってゴッドエー(godA)蛋白は細胞膜へ係留される。その後，ゴッドディー(GodD)，ゴッドイー(GodE)，ゴッドエフ(GodF)，ゴッドジー(GodG)蛋白が，ゴッドエー(GodA)蛋白内のセリン，スレオニン，システイン残基をそれぞれオキサゾール，メチルオキサゾール，チアゾールに変換する。このように翻訳後, 修飾されたゴッドエー（GodA）蛋白は，次に, Ｎ末端から３０番目のアラニンと３１番目のアラニンの間でプロテア−ゼ酵素によって切断され，Ｃ末端側１９残基が遊離する。その遊離したＣ末端側１９残基のＮ末端がゴッドエイチ(GodH)酵素によってアセチル化修飾を受けて，ゴードスポリンが完成する（例えば，非特許文献２参照）。
【非特許文献１】H. Onaka, H. Tabata, Y. Igarashi, Y. Sato and T. Furumai, Goadsporin, a chemical substance which promotes secondary metabolism and morphogenesis in streptomycetes. I. Purification and Characterization, The Journal of Antibiotics, 54, 1036-1044, (2001)
【非特許文献２】H. Onaka, M. Nakaho, K. Hayashi, Y. Igarashi, T. Furumai, Cloning and characterization of goadsporin biosynthetic gene cluster from Streptomyces sp. TP-A0584.Microbiology, 151: 3923-3933 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで，ゴードスポリンは，放線菌の二次代謝産物生産，胞子形成促進効果，更には生育阻害効果を有する化合物であるので，放線菌の二次代謝生産をコントロールすることができれば，抗生物質等の生理活性物質の放線菌からの探索等において有用な技術となるために，その作用メカニズムの解析が行われている。同時に，ゴードスポリンは，ユニークな構造を有する化合物であり，生分解性や熱安定性にも優れていることから，医薬品，生化学試薬としての用途が期待でき，そこで，ゴードスポリンの生合成機構の解明を行うことにより，ゴードスポリンの醗酵生産への応用を目指した研究が続けられている。
【０００６】
また，今日まで，ゴードスポリン生産を増大させることに関する知見はなく，その生産量を増大させる方法は知られていない。また，ゴードスポリンの類縁体の製造に関しては，非特許文献２に記載されているように，４種類について報告されているのみであったが，ゴードスポリン類縁体は，ゴッドエー(godA)遺伝子を組み換えることにより，野生型ゴードスポリンの１２分の１程度まで生産量が減少してしまい，ゴードスポリンの製造法として実用化するには生産量を増大することが必須である。また，ゴードスポリンは，多様な類縁体が従来の製造法で製造できるかどうかは明らかではなかったが，ゴッドエー
（godA）蛋白のＣ末端側１９残基に相当する部分のゴッドエー（godA）遺伝子塩基配列を変更することによって，ゴードスポリン類縁体の化合物を生合成することができると考えられる。
【０００７】
ゴードスポリンを初めとするチアゾール環，オキサゾール環，又はメチルオキサゾール環である複素環を含有したペプチド化合物は，抗菌活性を有するために医薬品としての用途が考えられる他に，様々な用途が考えられる。しかしながら，ゴードスポリン及びその類縁体の製造は，高分子化合物であるために有機合成反応による製造方法では多段階反応となり，これまでのところ実現していなかった。ゴードスポリン等の複素環を含有したペプチド化合物について，簡便な製造方法が発明されれば，より薬効の高い類縁体を発見することができる。そのためには微生物醗酵法による製造法が有力であるが，ゴードスポリン生産野生株の生産量が少ないために，効率的な製造は難しかった。
【０００８】
この発明の目的は，遺伝子操作によりゴードスポリン等の複素環含有ペプチド化合物の生産野生株の生産量を増やし，更に，野生型ゴードスポリン等に複素環含有ペプチド化合物に比べて生産量が少なくなるゴードスポリン類縁体等の複素環含有ペプチド化合物の生産量を増やすことを特徴とする複素環含有ペプチド化合物の製造方法及びゴードスポリンの類縁体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この発明は，リボゾーム翻訳系を用いて生合成され且つ翻訳後修飾によって全て又は１部のシステイン残基がチアゾール環，セリン残基がオキサゾール環，又はスレオニン残基がメチルオキサゾール環に変換される様式で生合成されるペプチド化合物の生合成遺伝子群を用いて，遺伝子組換え可能な放線菌内で発現させることによって複素環含有ペプチド化合物を製造する方法において，
転写活性化因子遺伝子を前記ペプチド化合物の生産放線菌に形質転換することによって，前記ペプチド化合物の生産量を増大することを特徴とする複素環含有ペプチド化合物の製造方法に関する。
【００１０】
また，この複素環含有ペプチド化合物の製造方法は，前記転写活性化因子遺伝子を前記ペプチド化合物の生産放線菌の染色体ＤＮＡ上に１個又は複数個組み込むことによって，前記ペプチド化合物の生産量を増大するものである。
【００１１】
また，この複素環含有ペプチド化合物の製造方法は，リボゾーム翻訳されるペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列の塩基の１又は複数個を置換，欠失，又は挿入することによって，前記ペプチド化合物の類縁体を製造するものである。
【００１２】
この複素環含有ペプチド化合物の製造方法において，前記ペプチド化合物は，ゴードスポリンである。
【００１３】
また，前記転写活性化因子遺伝子は，ゴッドアール（godR）遺伝子である。
【００１４】
また，前記リボゾーム翻訳される前記ペプチドの前記アミノ酸配列をコードする前記遺伝子は，ゴッドエー（godA）遺伝子である。
【００１５】
また，この複素環含有ペプチド化合物の製造方法において，前記リボゾーム翻訳系を用いて生合成され且つ翻訳後修飾によって全て又は１部のシステイン残基がチアゾール環，セリン残基がオキサゾール環，又はスレオニン残基がメチルオキサゾール環に変換される様式で生合成されるペプチド化合物の生合成遺伝子群は，ゴードスポリン生合成遺伝子群である。ここで，ゴードスポリン生合成遺伝子群は，ゴッドエー（godA），ゴッドビー（godB），ゴッドシー（godC），ゴッドディー（godD），ゴッドイー（godE），ゴッドエフ（godF），ゴッドジー（godG），ゴッドエッチ（godH），ゴッドアイ（godI），及びゴッドアール（godR）の１０個の遺伝子からなるものである。
【００１６】
また，前記ゴードスポリンの類縁体は，アミノ酸の増減に影響されずに複素環形成反応が行われる。
【００１７】
また，前記ゴードスポリンの類縁体は，式２〜式４７のいずれか１つの式の構造式で表わされるものである。更に，前記ゴードスポリンの類縁体のうち，前記ゴードスポリンと同様に色素生産し，胞子形成を誘導することができる前記ゴードスポリンの類縁体は，下記の式２，式４，式５，式７，式９，式２０，式２４，式２５，及び式３６のいずれかの構造式である類縁体である。
【化１−１】
【００１８】
また，この発明は，下記の式２，式４，式５，式７，式９，式２０，式２４，式２５，及び式３６のいずれかの構造式で表わされる，ゴードスポリンと同様に色素生産し，胞子形成を誘導することができることを特徴とするゴードスポリンの類縁体に関する。
【化１−２】
【００１９】
ゴードスポリンは，放線菌・ストレプトマイセス・エスピー ティーピーエー０５８４（Streptomyces sp. TP-A0584 ）が生産する二次代謝産物であり，リボゾームを介して生合成されることが明らかとなっている。そこで，この発明では，はじめに生産菌にゴードスポリン生合成遺伝子群転写活性化因子であるゴッドアール（godR）遺伝子を染色体上に複数組み込むことにより，ゴードスポリン生産量を野生株の２．５倍以上に増大させたゴードスポリン生産増大株を作製した。次に，作製株のゴードスポリン構造遺伝子・ゴッドエー(godA)の塩基配列を置換することにより，ゴードスポリン類縁体を従来の方法に比べて，１４倍以上高生産する株を作製した。そして，ゴードスポリン類縁体を４７種類製造し，本製造方法において製造できるゴードスポリン類縁体の種類について明らかにし（実施例６），本願発明を完成させた。
【発明の効果】
【００２０】
この発明による複素環含有ペプチド化合物の製造方法は，上記のように構成されており，ゴードスポリン醗酵生産における生産量を増大することができ，また，従来の報告では生産量が少なかったゴードスポリン誘導体の生産も増大することができるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
−ゴードスポリン高生産株の使用−
この発明による複素環含有ペプチド化合物の製造方法は，非特許文献１に記載されている従来のゴードスポリン類縁体生産株に比べて１４．６倍の生産量が増大したゴードスポリン高生産株ゴッドエーアールツー(godA-R2) 株を使用することにより，ゴードスポリン類縁体の生産量を飛躍的に増大させることができる。ゴッドエーアールツー(godA-R2) 株は，実施例に示したようにピーティーワイエム１イーピーゴッドアール (pTYM1epgodR)プラスミドをゴードスポリン生産菌に導入することにより作製することができる。ここで，ゴッドエー（godA）遺伝子及びその周辺塩基配列を，〔配列表１〕に示す。ここで，ゴッドエー（godA）遺伝子は，１０１番目〜２５０番目の塩基である。
【００２２】
また，この発明については，ゴッドエーアールツー(godA-R2) 株以外にも，ゴッドアール（godR）遺伝子を複数コピーし，細胞内に導入する遺伝子組換え操作をすることによって，ゴッドアール（godR）の細胞内での発現量を増大させることによりゴードスポリンの生産量を増大させた微生物を使用することもできる。ここで，ゴッドアール
（godR）遺伝子及びその周辺塩基配列を，〔配列表２−１〕，及び〔配列表２−２〕に示す。ここで，ゴッドアール（godR）遺伝子は，１０１番目〜８１７番目の塩基である。
【００２３】
また，この発明については，ゴードスポリン生合成遺伝子群を別の微生物に移すことにより，ゴードスポリンを異種発現できるようになった微生物に対して，上記と同様なゴッドアール（godR）の細胞内での発現量を増大させる処理を行った微生物を使用することもできる。
【００２４】
−ゴードスポリン類縁体及びゴードスポリン製造法−
ゴードスポリン類縁体を製造するためには，上記のように，ゴッドアール（godR）遺伝子発現が増大したゴードスポリン高生産株のゴッドエー（godA）遺伝子を破壊した株に新たに変異ゴッドエー（godA）遺伝子を導入することによって，変異ゴッドエー（godA）遺伝子を高発現させることができる。この結果，ゴッドエー（godA）遺伝子の変異に従ったゴードスポリン類縁体を製造できる。新たに変異ゴッドエー（godA）遺伝子を導入するには，実施例に示したようなピーティーワイエム１９ゴッドエー（pTYM19godA) に部位特異的塩基置換法を用いて，塩基変異を導入したプラスミドを用いることができる。ゴードスポリン類縁体を製造するためには上記ピーティーワイエム１９ゴッドエー（pTYM19godA) に部位特異的塩基置換法を用いて，塩基変異を導入したプラスミド以外でも，変異ゴッドエー（godA）遺伝子を生産菌に導入できれば特にベクターの種類は問わない。変異ゴッドエー（godA）遺伝子を用いれば，ゴードスポリン類縁体は，下記式（２）〜式（４７）に示した構造式以外のゴードスポリン類縁体を製造することができることは勿論である。
【００２５】
−実施例−
実施例１及び実施例５において，ゴードスポリン生合成遺伝子群内に存在する転写因子・ゴッドアール（godR）が転写アクチベーターであることが明らかとなり，ゴッドアール（godR）を複数個，遺伝子操作によって染色体上に組み込んだ株のゴードスポリン生産が増大することを明らかにした。
【００２６】
また，実施例３及び実施例６において，これまで，ゴードスポリン類縁体の製造では，４種類しか成功していなかった類縁体作製に関しても，多様な塩基配列置換を試みた結果，本生産菌が生産することのできる類縁体の化学構造には制限があるが，少なくとも４７種類の類縁体を製造できることが明らかとなった。
【００２７】
実施例７では，いくつかのゴードスポリン類縁体においても生理活性が見出されていることを示したものである。
【００２８】
ゴードスポリン類縁体を作製するにあたり，ゴッドエー（godA）遺伝子破壊株に，再びゴッドエー（godA）遺伝子を組み込んだ復帰株（図１）が野生株同量程度のゴードスポリンを生産するのかを確認したところ，生産量が約１／１２に減少してしまった（図９）。そこで，ゴードスポリン生合成遺伝子群転写活性化因子であるゴッドアール（godR）をゴッドエー（godA）遺伝子破壊株に組み込むことによって，生産量を増加させた。図８に野生株，ゴッドエー（godA）遺伝子復帰株，ゴッドエーアールツー（godA-R2)株の染色体上における，ゴードスポリン生合成遺伝子群の様子を示した。これにより野生株の約１．２倍のゴードスポリンを生産する復帰株を得ることができた（図９）。そこで，このゴッドアール（godR）遺伝子の２倍体株（寄託番号：ＴＰ−Ａ０５８４ΔgodA−R2，ＮＩＴＥ Ｐ−５１９），ゴッドエーアールツー（godA-R2)株を利用して，ゴードスポリン類縁体の作製を行った。
ゴッドエー(godA)及び周辺部位の塩基配列を〔配列表１〕に示す。また，ゴッドエー
(godR)遺伝子及び周辺部位の塩基配列を〔配列表２−１〕と〔配列表２−２）に示す。
【００２９】
−ゴードスポリン生産菌における，耐性遺伝子，転写調節因子コピー数増加によるゴードスポリン生産量への影響−
ゴードスポリン生合成遺伝子の中でゴッドアイ（godI）が耐性遺伝子，ゴッドアール
godR) が転写調節遺伝子であるとＤＮＡ配列情報より推定された。一般的に生産物量を増大するためには，その物質に対する宿主菌株の薬剤耐性度を上げること，又は生合成遺伝子群の転写量を増大する操作による増大法が考えられる。そこで，どちらがゴードスポリン生産において有効な手段であるかを明らかにするために，ゴードスポリン生産菌の染色体にゴッドアイ（godI），ゴッドアール(godR)をそれぞれ１コピー導入した株を作製し，ゴッドアイ（godI）の２倍化株，ゴッドアール(godR)の２倍化株のゴードスポリン生産量を測定した。ゴッドアイ（godI）の２倍化株については，耐性遺伝子の増加により宿主のゴードスポリンへの耐性度が増加することが考えられた。また，ゴッドアール(godR)の２倍化株については転写調節遺伝子の増加によりゴードスポリン生合成遺伝子群の転写量が増大して生産量が増大することを期待した。ゴッドアール(godR)においては，転写因子であることまではＤＮＡ配列情報より推定できたが，転写活性化因子であるか転写阻害因子であるかまでは推定できなかったので，本実験によって転写活性化因子であることも初めて明らかになった。
【００３０】
ゴッドアイ（godI）遺伝子の２倍化株の作製
材料・試薬
・ピーティーワイエム１イーピー(pTYM1ep) （図２）
・ＰＣＲプライマー
ゴッドアイ（godI）クローニング用プライマー
godI-C 5'-TGGAAGCTTCTGCTTGCGGTCACCGGATC-3 ’
godI-N 5'-GCGACCCATATGTTCGACACTCTCTCCGA-3 ’
【００３１】
ゴッドアイ（godI）のクローニング
ゴードスポリン（goadsporin）生合成遺伝子上でゴッドアイ（godI）遺伝子のＣ末側，Ｎ末側の配列を基に，デザインしたプライマーを用いて，PCR により増幅してインサート断片（約1.6 kb）を得た。これをピーティーワイエム１イーピー(pTYM1ep) のマルチクローニングサイトにNde I ，Hind IIIでクローニングしてピーティーワイエム１イーピーゴッドアイ(pTYM1epgodI) を作製した。
【００３２】
遺伝子導入
構築したプラスミドピーティーワイエム１イーピーゴッドアイ(pTYM1epgodI) を，接合性大腸菌Ｓ１７−１を用いてＴＰ−Ａ０５８４の染色体上に組み込ませ，形質転換体
（godI２倍化株）を取得した（大腸菌の形質転換，放線菌への接合伝達法については従来公知の方法でよい）。
【００３３】
ゴッドアール(godR)２倍体株の作製
１−１：材料・試薬
・ピーティーワイエム１イーピー(pTYM1ep) （図２）
・ＰＣＲプライマー
ゴッドアール(godR)遺伝子クローニング用プライマー
godR-C-Hind 5'-GCGAAGCTTCAATCGCTATTTAGCGGCGAA-3 ’
godR-N-Nde 5'-CGCCATATGCGTGAAGGCAGCATCATAGCT-3 ’
【００３４】
ゴッドアール(godR)のクローニング
ゴードスポリン（goadsporin）生合成遺伝子上でgodR遺伝子を含む配列を基にデザインしたプライマーを用いて，ＰＣＲにより増幅してインサート断片（約０．７ｋｂ）を得た。これをpTYM1ep のマルチクローニングサイトにNde I ，Hind IIIでクローニングしてピーティーワイエム１イーピーゴッドアール(pTYM1epgodR) を作製した（図３）。
【００３５】
遺伝子導入
構築したプラスミドピーティーワイエム１イーピーゴッドアール(pTYM1epgodR) を，接合性大腸菌Ｓ１７−１を用いてＴＰ−Ａ０５８４の染色体上に組み込ませ，形質転換体
（godR２倍化株）を取得した（大腸菌の形質転換，放線菌への接合伝達法については従来公知の方法でよい）。
【００３６】
−ゴッドアイ（godI）２倍化株，ゴッドアール(godR)２倍化株のゴードスポリン生産量の確認について−
ゴッドアイ（godI）２倍化株，ゴッドアール(godR)２倍化株のゴードスポリン生産パターンを図７に示した（それぞれ２個体ずつ解析）。
図７から分かるように，野生型と比較して，ゴッドアイ（godI）２倍化株ではゴードスポリン生産量は大きく変化しないが，野生型に比べてゴードスポリン生産が早い時期に起こることが示された。一方，ゴッドアール(godR)２倍化株では，ゴードスポリン生産量が大きく増加した。更に，野生型よりも早期にゴードスポリン生産量が増加し始めることが示された。
【００３７】
−実施例１−
ゴッドアール（godR）遺伝子２倍体株〔ＴＰ−Ａ０５８４ΔgodA−R2〕の作製
１−１：材料・試薬
・ピーティーワイエム１イーピー(pTYM1ep)
・ピーティーワイエム１９(pTYM19)
・ＰＣＲプライマー
ゴッドアール（godR）遺伝子クローニング用プライマー
godR-C-Hind 5’-GCGAAGCTTCAATCGCTATTTAGCGGCGAA-3 ’
godR-N-Nde 5’-CGCCATATGCGTGAAGGCAGCATCATAGCT-3 ’
ａｐｈII遺伝子特異的プライマー
aph-C 5 ’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3 ’
aph-N 5 ’-ATGATTGAACAAGATGGATTGCAC-3 ’
ｔｓｒ遺伝子特異的プライマー
tsr-C 5 ’-CTTCATATGCGGGGATCGACCGCGC-3’
tsr-N 5 ’-GACGAATCGAGGTCGAGGAACCGAG-3’
・ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）
【００３８】
１−２：プラスミドの作製
ゴードスポリン生合成遺伝子上でゴッドエー（godA）遺伝子を含むＢａｍＨＩ断片（約１．２ｋｂ）をｐＴＹＭ１９にクローニングし，図５に示すピーティーワイエム１９ゴッドエー（pTYM19epgodA) を作製した。
【００３９】
１−３：遺伝子導入
構築したプラスミドピーティーワイエム１イーピーゴッドアール(pTYM1epgodR) を，接合性大腸菌Ｓ１７−１を用いて，ゴッドエー（godA）遺伝子破壊株の染色体上に組み込ませ，形質転換体ゴッドエーアールツー（ΔgodA-R2 ）を取得した（大腸菌の形質転換，放線菌への接合伝達法については従来公知の方法でよい）。
得られた形質転換体から染色体を回収し（ＣＴＡＢ法など），ａｐｈ II 遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲにより形質転換が確実に行われたことを確認した（図４）。
次に，生産量が増加することを確認するため構築したプラスミドピーティーワイエム１９ゴッドエー(pTYM19godA)を同様の方法でΔgodA-R2 株の染色体上に組み込ませ，ゴードスポリン高生産復帰株（godA-R2)を取得した。得られた形質転換体から染色体を回収し，ｔｓｒ遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲにより形質転換が確実に行われたことを確認した（図４）。
【００４０】
−実施例２−
ゴードスポリンの定量法
２−１：材料・試薬
・Ｖ−２２
０．１％ Starch ，０．５％ Glucose, ０．３％ NZ-case, ０．２％ Yeast extract, ０．５％ tryptone,０．１％Ｋ2 ＨＰＯ4 ，０．５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ，
０．３％ＣａＣＯ3 ，ｐＨ：７．０
・ゴードスポリン生産培地
６．０％ Maltose, ４．０％ Pharmamedia, １．０％ Yeast extract,
１．０％ Diaion HP20（脱気してｐＨ調整後に混合）, ｐＨ７．０
【００４１】
２−２：放線菌の培養
得られた形質転換体を選択薬剤カナマイシン，チオストレプトンを２０μｇ／ｍｌ添加した１０ｍｌ Ｖ−２２培地に植菌した。３０℃で２日間振とう培養後，１００ｍｌのゴードスポリン生産培地に前培養液を３％植菌し，さらに５日間培養した。
【００４２】
２−３：ＨＰＬＣ分析法
培養液と等量のｎ−ＢｕＯＨを加えて６０分間激しく振とう撹拌した。これを遠心分離（６０００〜１００００ｒｐｍ，５分間) してＢｕＯＨを回収し，減圧濃縮した。
ＭｅＯＨで溶解後，フィルター濾過したものをＨＰＬＣサンプルとした。ＨＰＬＣ（
ＨＰ１１００，Hewlett Packard ）は，Ｃ１８Cadenza カラム（Φ４．６×７５ｍｍ）を使用し，カラム温度４０℃移動相：０．１％ＣＨ3 ＣＮ−０．１％ ＨＣＯＯＨ buffer ，流速０．８ｍｌ／ｍｉｎで溶出し，ＵＶ吸収スペクトルは２５４ｎｍで検出した。
【００４３】
−実施例３−
ゴードスポリン類縁体生産株の作製法
３−１：材料・試薬
・ピーティーワイエム１９ゴッドエー(pTYM19godA)
・ＰｆｕＵｌｔｒａT M ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ polymerase
・Dpn Ｉ
【００４４】
変異用プライマー
アミノ酸置換用の配列表を，〔配列表３−１〕，〔配列表３−２〕に示す。
また，アミノ酸挿入・欠失用の配列表を，〔配列表３−３〕に示す。
【００４５】
３−２：変異導入プラスミドの作製
ｐＴＹＭ１９ゴッドエー（godA）を鋳型プラスミドとして，QuikChange（登録商標）IIＸＬ Site −Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いてプロトコールに従って変異導入を行った。取得した変異導入プラスミドは，ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０を用いてシーケンスし，目的の変異が導入されているかを確認した。
【００４６】
３−３：変異導入株の作製
宿主にΔゴッドエーアールツー（ΔgodA-R2)株を用いて，１−３と同様の方法により各ゴッドエー（godA）変異株を取得した。
３−４：ゴッドエー（godA）変異株による生産物の確認
ゴードスポリンの定量法と同様に分析を行った。コントロールであるゴットエーアールツー（godA-R2 ）株のＨＰＬＣデータと比較して，類縁体と思われる各ピークをＨＰＬＣの廃液配管から直接（手動で）採取した。採取した各ピークを Positive ESI-MS にかけ，予想される分子量を参考にして構造を決定した（図１０）。
【００４７】
−実施例４−
ゴードスポリンのバイオアッセイ法
４−１：材料・試薬
・Ｂｅｎｎｅｔｔ’ｓ ｇｌｕｃｏｓｅ培地
０．１％ Yeast extract, ０．１％肉エキス（エルリッヒ),
０．２％ＮＺ Ａｍｉｎｅ Ｔｙｐｅ Ａ，１％ Ｄ（＋）−Glucose,２％Ａｇａｒ， ｐＨ：７．２
・ＮＢソフトアガー
０．８％ Nutrient broth (Wako), ０．５％ Agar
【００４８】
４−２：ペーパーディスクアッセイ
図６に示すように，滅菌済みのペーパーディスク（直径１０ｍｍ）に，２−３の方法で調製した試料をＨＰＬＣ分析の結果からゴードスポリン約１０μｇになるようにしみ込ませて乾燥させた。３ｍｌのＮＢソフトアガー( 溶かして４０℃くらいに冷ましたもの) にS.lividans TK23 の胞子液を加え，Bennett's glucose 培地に均一に撒いた。アガーが乾いたら，ペーパーディスクを中央にのせ，３２℃で3 日間培養した。
【００４９】
−実施例５−
ｇｏｄＲ２倍体株（godA-R2 株）のゴードスポリン生産量
ＨＰＬＣ分析結果を図９に示した。
野生株godA-R2 株のゴードスポリンの生産量は，野生型と比較して１．１５倍，ゴッドエー（godA）復帰株と比較して１４．６倍であった。
ゴッドアール（godR）遺伝子を２倍にすることで，ゴッドエー（godA）復帰株においても野生型と同等のゴードスポリンを生産する株を取得できた。
【００５０】
−実施例６−
取得したゴードスポリン類縁体
ゴードスポリン類縁体の構造は，置換したアミノ酸から予想できるため，その分子量をＭＳで測定することによって構造を決定した（図１０）。
これにより４７種類のゴードスポリン類縁体を取得した。表１に，それぞれ配列を示した。
【００５１】
【表１】
【００５２】
また，取得したゴードスポリン類縁体は，表１に配列が示されており，それらの構造式を下記において，一般式（２）〜一般式（４７）として示し，各構造式の上方に付した下向き矢印は，変化した構造を指している。
【００５３】
【化２】
Ａ１Ｓ −−−−（２）
【００５４】
【化３】
Ａ１Ｃ −−−−（３）
【００５５】
【化４】
Ａ１Ｇ −−−−（４）
【００５６】
【化５】
Ｔ２Ｓ −−−−（５）
【００５７】
【化６】
Ｔ２Ｃ −−−−（６）
【００５８】
【化７】
Ｖ３Ｓ −−−−（７）
【００５９】
【化８】
Ｖ３Ｃ −−−−（８）
【００６０】
【化９】
Ｓ４Ｃ −−−−（９）
【００６１】
【化１０】
Ｔ５Ｃ −−−−（１０）
【００６２】
【化１１】
Ｉ６Ｓ −−−−（１１）
【００６３】
【化１２】
Ｉ６Ｃ −−−−（１２）
【００６４】
【化１３】
Ｉ６Ｙ −−−−（１３）
【００６５】
【化１４】
Ｌ７Ｓ−１ −−−−（１４）
【００６６】
【化１５】
Ｌ７Ｓ−２ −−−−（１５）
【００６７】
【化１６】
Ｃ８Ｓ−１ −−−−（１６）
【００６８】
【化１７】
Ｃ８Ｓ−２ −−−−（１７）
【００６９】
【化１８】
Ｃ８Ａ −−−−（１８）
【００７０】
【化１９】
Ｓ９Ｃ −−−−（１９）
【００７１】
【化２０】
Ｇ１０Ｓ −−−−（２０）
【００７２】
【化２１】
Ｇ１０Ｃ −−−−（２１）
【００７３】
【化２２】
Ｇ１１Ｓ −−−−（２２）
【００７４】
【化２３】
Ｇ１１Ｃ −−−−（２３）
【００７５】
【化２４】
Ｔ１２Ｓ −−−−（２４）
【００７６】
【化２５】
Ｔ１２Ｃ −−−−（２５）
【００７７】
【化２６】
Ｔ１２Ａ −−−−（２６）
【００７８】
【化２７】
Ｌ１３Ｓ −−−−（２７）
【００７９】
【化２８】
Ｌ１３Ｃ −−−−（２８）
【００８０】
【化２９】
Ｓ１５Ｃ −−−−（２９）
【００８１】
【化３０】
Ｓ１５Ａ −−−−（３０）
【００８２】
【化３１】
Ａ１６Ｓ −−−−（３１）
【００８３】
【化３２】
Ａ１６Ｃ −−−−（３２）
【００８４】
【化３３】
Ｇ１７Ｓ −−−−（３３）
【００８５】
【化３４】
Ｃ１８Ｓ −−−−（３４）
【００８６】
【化３５】
Ｃ１８Ａ −−−−（３５）
【００８７】
【化３６】
Ｖ１９Ｓ −−−−（３６）
【００８８】
【化３７】
Ｖ１９Ｃ −−−−（３７）
【００８９】
【化３８】
Ｖ１９Ｙ −−−−（３８）
【００９０】
【化３９】
３Ａ４ −−−−（３９）
【００９１】
【化４０】
６Ａ７ −−−−（４０）
【００９２】
【化４１】
１０Ａ１１−−−−（４１）
【００９３】
【化４２】
１０ＡＶ１１−−−−（４２）
【００９４】
【化４３】
１０ＳＡ１１−−−−（４３）
【００９５】
【化４４】
１３Ａ１４＋Ｓ１５Ｔ−１ −−−（４４）
【００９６】
【化４５】
１３Ａ１４＋Ｓ１５Ｔ−２ −−−（４５）
【００９７】
【化４６】
Ｇ１１−ｄｅｌａｔｅ −−−−（４６）
【００９８】
【化４７】
Ｓ９＋Ｇ１１−ｄｅｌｅｔｅ−−−−（４７）
【００９９】
作製した類縁体とゴードスポリン生合成酵素の関係を表２に示した。
これらの結果から以下のことが明らかになった。
（１）アミノ酸を置換，挿入，欠失させても環形成するアミノ酸は変わらない。
（２）ゴードスポリン生合成酵素は，アミノ酸を1 ，2 個挿入してもゴードスポリン前駆体として認識する。ただし，１０Ａ１１などの中央に挿入した類縁体に比べ，３Ａ４，６Ａ７などの中央から外れたところに挿入すると生産量は減少する。
（３）ゴードスポリンを構成するアミノ酸は８種類であるが，それ以外のアミノ酸に置換しても生合成酵素は認識する。
【０１００】
【表２】
【０１０１】
−実施例７−
ゴードスポリン類縁体のバイオアッセイ法の結果
ゴードスポリン類縁体のうち，ゴードスポリンと同様に色素生産，胞子形成を誘導したものは９種類であった。それを表３に示す。
【０１０２】
【表３】
【０１０３】
表３に示すように，ゴードスポリン誘導体は，一般式２で示すＡ１Ｓ，一般式４で示すＡ１Ｇ，一般式５で示すＴ２Ｓ，一般式７で示すＶ３Ｓ，一般式９で示すＳ４Ｃ，一般式２０で示すＧ１０Ｓ，一般式２４で示すＴ１２Ｓ，一般式２５で示すＴ１２Ｃ，及び一般式３６で示すＶ１９Ｓであった。ゴードスポリン類縁体のバイオアッセイ法によって観察した際に，色素のできる円の直径は次のとおりである。＋＋は，円の直径が２０〜２９ｍｍとはっきりとした大きな色素円を示し，＋は，円の直径が１５〜１９ｍｍとはっきりとして小さな色素円を示し，また，±は，円の直径が１４ｍｍ以下のかすかに色素を誘導している状態を示す。−は，色素誘導が確認できなかったものを示す。
【０１０４】
図１１には，ゴードスポリン生合成経路が示されている。 （１）菌体内ではゴードスポリン前駆体蛋白遺伝子であるｇｏｄＡが転写翻訳され，ｇｏｄＡ蛋白が発現する。
（２）ｇｏｄＢ，ｇｏｄＣ蛋白によってｇｏｄＡ蛋白は細胞膜へ係留される。
（３）ｇｏｄＤ，ｇｏｄＥ，ｇｏｄＦ，ｇｏｄＧ蛋白が，ｇｏｄＡ蛋白内のセリン，スレオニン，システイン残基をそれぞれオキサゾール，メチルオキサゾール，チアゾールに変換する。このように翻訳後修飾されたゴッドエー（GodA）蛋白は，次にＮ末端から３０番目のアラニンと３１番目のアラニンの間でプロテアーゼ酵素によって切断され，Ｃ末端側１９残基が遊離する。
（４）遊離したＣ末端側１９残基のＮ末端がゴッドエイチ(GodH)酵素によってアセチル化修飾を受けて，ゴードスポリンが完成する。
【０１０５】
図８には，上段が野生株（TP-A0584）のゴードスポリン生合成遺伝子群を示しており，中段にｇｏｄＡ遺伝子復帰株，即ち，ｇｏｄＡ破壊株にｇｏｄＡ遺伝子を組み込んだ株のゴードスポリン生合成遺伝子群を示しており，また，下段には，ｇｏｄＡ破壊株に
ｇｏｄＡ遺伝子とｇｏｄＲ遺伝子を組み込んだ株，即ち，ｇｏｄＡ−Ｒ２株染色体上のゴードスポリン生合成遺伝子群が示されている。
【０１０６】
図４には，ｇｏｄＲ遺伝子の２倍体株のＰＣＲによる形質転換の確認が示されている。 Ａ（左側写真）は，ａｐｈ II 遺伝子特異的プライマーでＰＣＲしたサンプルである。 Ｂ（右側写真）は，ｔｓｒ遺伝子特異的プライマーでＰＣＲしたサンプルである。
（１）ＤＮＡサイズマーカー
（２）ＴＰ−Ａ０５８４（ＷＴ）ゲノムＤＮＡ
（３）ΔｇｏｄＡ株ゲノムＤＮＡ
（４）ΔｇｏｄＡ＋ｇｏｄＲ株ゲノムＤＮＡ
（５）ΔｇｏｄＡ＋ｇｏｄＡ株ゲノムＤＮＡ
（６）ΔｇｏｄＡ＋ｇｏｄＡ＋ｇｏｄＲ株ゲノムＤＮＡ
【０１０７】
図６には，ゴードスポリンのバイオアッセイ方法の工程が示されている。
図６に示すように，まず，ＮＢソフトアガーを完全に溶かし，Ｓ.lividans の胞子液を加え，Bennet's glucose 培地上に均一に蒔く。次いで，ＮＢソフトアガーが乾いたら，ゴードスポリンを染み込ませたペーパーディスクをプレートの中央に載せる。最後に，３２℃で３日間培養すると，色素生産と胞子形成が確認できる。
【０１０８】
図９には，ゴードスポリンのＨＰＬＣの分析を示している。
上段が野生株（TP-A0584）であり，中段がゴッドエー（godA）復帰株であり，下段がゴッドエーアールツー株（godA-R2)である。
【０１０９】
図１０には，マススペクトルデータの１例としてＧ１０Ｃのスペクトルを示している。 Ｇ１０Ｃの分子量は，その構造から１６５７．６４７６と予想された。
ＭＳのデータからｍ／ｚは１６５８．６５１０（〔Ｍ＋Ｈ〕+ ）の分子量が確認されたことから，これはＧ１０Ｃであると決定した。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
この発明は，ゴードスポリンを初めとするチアゾール環，オキサゾール環，又はメチルオキサゾール環である複素環を含有したペプチド化合物の簡便で増大させる製造方法及びその類縁体を提供することであって，より増産の高いゴードスポリン及びその類縁体の製造方法を提供し，生育阻害効果を有し，抗菌活性を有するため，抗生物質等の医薬品，生理活性物質等の用途に適用することができる。
【０１１１】
〔配列表〕
配列表１．ＨＴＭＬ
配列表２−１．ＨＴＭＬ
配列表２−２．ＨＴＭＬ
配列表３−１．ＨＴＭＬ
配列表３−２．ＨＴＭＬ
配列表３−３．ＨＴＭＬ
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】ゴードスポリン高生産復帰株（ｇｏｄＡ−Ｒ２）の作製法を示す説明図である。
【図２】ピーティーワイエム１イーピー(pTYM1ep) のプラスミドマップを示す説明図である。
【図３】ピーティーワイエム１イーピーゴッドアール(pTYM1epgodR) の作製方法を示す説明図である。
【図４】ゴットアール(GodR)遺伝子２倍体株の，ＰＣＲによる形質転換の確認を示す写真である。
【図５】類縁体作製の際に変異を加えるゴットエー(godA)の遺伝子配列を示す説明図である。
【図６】ゴードスポリンのペーパーディスクアッセイ法の工程を示す説明図である。
【図７】ゴッドアイ（godI）２倍化株，ゴッドアール(godR)２倍化株のゴードスポリン生産パターンを示すグラフである。
【図８】野生株（TP-A0584），ゴットエー(godA)遺伝子復帰株，ゴットエーアールツー(godA-R2) 染色体上のゴードスポリン生合成遺伝子群を示す説明図である。
【図９】ゴードスポリンのＨＰＬＣ分析結果を示すグラフである。
【図１０】Ｇ１０Ｃのマススペクトルを示すグラフである。
【図１１】ゴードスポリン生合成経路を示す説明図である。
【技術分野】
【０００１】
この発明は，複素環のうち，チアゾール環，オキサゾール環，又はメチルオキサゾール環を含有するペプチド化合物の製造方法であって，例えば，複素環含有ペプチド化合物であるゴードスポリン及びゴードスポリン類縁体を効率的に製造する方法及びゴードスポリンの類縁体に関する。
【背景技術】
【０００２】
複素環含有ペプチド化合物であるゴードスポリン(Goadsporin)は，一般式（１）で示される構造式を持ち，放線菌の二次代謝産物生産，及び胞子形成促進効果，更には生育阻害効果を有する化合物として富山県立大学の尾仲らによって発見された（例えば，非特許文献１参照）。
【０００３】
【化１】
ＧＳ−−−−（１）
【０００４】
ゴードスポリン(Goadsporin)は，上記式（１）に示すように，１９個のアミノ酸を前駆体として生合成されるペプチド化合物であり，ゴードスポリン前駆体は，リボゾームによる翻訳により生合成される。このゴードスポリン前駆体蛋白遺伝子は，ゴッドエー（godA）であり，全長１５０塩基，４９個のアミノ酸をコードしている。この内，Ｃ末端側１９個のアミノ酸部位がゴードスポリン前駆体の配列である。ゴードスポリンを生産する放線菌であるストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces sp) ＴＰ−Ａ０５８４株（受託番号：ＴＰ−Ａ０５８４，ＮＩＴＥ Ｐ−５１８）における生合成は，図１１に示すような経路で行われる。図１１に示すように，まず，菌体内ではゴードスポリン前駆体蛋白遺伝子であるゴッドエー(godA)が転写翻訳され，ゴッドエー（GodA）蛋白が発現する。次に，ゴッドビー(GodB)，ゴッドシー(GodC)蛋白によってゴッドエー(godA)蛋白は細胞膜へ係留される。その後，ゴッドディー(GodD)，ゴッドイー(GodE)，ゴッドエフ(GodF)，ゴッドジー(GodG)蛋白が，ゴッドエー(GodA)蛋白内のセリン，スレオニン，システイン残基をそれぞれオキサゾール，メチルオキサゾール，チアゾールに変換する。このように翻訳後, 修飾されたゴッドエー（GodA）蛋白は，次に, Ｎ末端から３０番目のアラニンと３１番目のアラニンの間でプロテア−ゼ酵素によって切断され，Ｃ末端側１９残基が遊離する。その遊離したＣ末端側１９残基のＮ末端がゴッドエイチ(GodH)酵素によってアセチル化修飾を受けて，ゴードスポリンが完成する（例えば，非特許文献２参照）。
【非特許文献１】H. Onaka, H. Tabata, Y. Igarashi, Y. Sato and T. Furumai, Goadsporin, a chemical substance which promotes secondary metabolism and morphogenesis in streptomycetes. I. Purification and Characterization, The Journal of Antibiotics, 54, 1036-1044, (2001)
【非特許文献２】H. Onaka, M. Nakaho, K. Hayashi, Y. Igarashi, T. Furumai, Cloning and characterization of goadsporin biosynthetic gene cluster from Streptomyces sp. TP-A0584.Microbiology, 151: 3923-3933 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで，ゴードスポリンは，放線菌の二次代謝産物生産，胞子形成促進効果，更には生育阻害効果を有する化合物であるので，放線菌の二次代謝生産をコントロールすることができれば，抗生物質等の生理活性物質の放線菌からの探索等において有用な技術となるために，その作用メカニズムの解析が行われている。同時に，ゴードスポリンは，ユニークな構造を有する化合物であり，生分解性や熱安定性にも優れていることから，医薬品，生化学試薬としての用途が期待でき，そこで，ゴードスポリンの生合成機構の解明を行うことにより，ゴードスポリンの醗酵生産への応用を目指した研究が続けられている。
【０００６】
また，今日まで，ゴードスポリン生産を増大させることに関する知見はなく，その生産量を増大させる方法は知られていない。また，ゴードスポリンの類縁体の製造に関しては，非特許文献２に記載されているように，４種類について報告されているのみであったが，ゴードスポリン類縁体は，ゴッドエー(godA)遺伝子を組み換えることにより，野生型ゴードスポリンの１２分の１程度まで生産量が減少してしまい，ゴードスポリンの製造法として実用化するには生産量を増大することが必須である。また，ゴードスポリンは，多様な類縁体が従来の製造法で製造できるかどうかは明らかではなかったが，ゴッドエー
（godA）蛋白のＣ末端側１９残基に相当する部分のゴッドエー（godA）遺伝子塩基配列を変更することによって，ゴードスポリン類縁体の化合物を生合成することができると考えられる。
【０００７】
ゴードスポリンを初めとするチアゾール環，オキサゾール環，又はメチルオキサゾール環である複素環を含有したペプチド化合物は，抗菌活性を有するために医薬品としての用途が考えられる他に，様々な用途が考えられる。しかしながら，ゴードスポリン及びその類縁体の製造は，高分子化合物であるために有機合成反応による製造方法では多段階反応となり，これまでのところ実現していなかった。ゴードスポリン等の複素環を含有したペプチド化合物について，簡便な製造方法が発明されれば，より薬効の高い類縁体を発見することができる。そのためには微生物醗酵法による製造法が有力であるが，ゴードスポリン生産野生株の生産量が少ないために，効率的な製造は難しかった。
【０００８】
この発明の目的は，遺伝子操作によりゴードスポリン等の複素環含有ペプチド化合物の生産野生株の生産量を増やし，更に，野生型ゴードスポリン等に複素環含有ペプチド化合物に比べて生産量が少なくなるゴードスポリン類縁体等の複素環含有ペプチド化合物の生産量を増やすことを特徴とする複素環含有ペプチド化合物の製造方法及びゴードスポリンの類縁体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この発明は，リボゾーム翻訳系を用いて生合成され且つ翻訳後修飾によって全て又は１部のシステイン残基がチアゾール環，セリン残基がオキサゾール環，又はスレオニン残基がメチルオキサゾール環に変換される様式で生合成されるペプチド化合物の生合成遺伝子群を用いて，遺伝子組換え可能な放線菌内で発現させることによって複素環含有ペプチド化合物を製造する方法において，
転写活性化因子遺伝子を前記ペプチド化合物の生産放線菌に形質転換することによって，前記ペプチド化合物の生産量を増大することを特徴とする複素環含有ペプチド化合物の製造方法に関する。
【００１０】
また，この複素環含有ペプチド化合物の製造方法は，前記転写活性化因子遺伝子を前記ペプチド化合物の生産放線菌の染色体ＤＮＡ上に１個又は複数個組み込むことによって，前記ペプチド化合物の生産量を増大するものである。
【００１１】
また，この複素環含有ペプチド化合物の製造方法は，リボゾーム翻訳されるペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列の塩基の１又は複数個を置換，欠失，又は挿入することによって，前記ペプチド化合物の類縁体を製造するものである。
【００１２】
この複素環含有ペプチド化合物の製造方法において，前記ペプチド化合物は，ゴードスポリンである。
【００１３】
また，前記転写活性化因子遺伝子は，ゴッドアール（godR）遺伝子である。
【００１４】
また，前記リボゾーム翻訳される前記ペプチドの前記アミノ酸配列をコードする前記遺伝子は，ゴッドエー（godA）遺伝子である。
【００１５】
また，この複素環含有ペプチド化合物の製造方法において，前記リボゾーム翻訳系を用いて生合成され且つ翻訳後修飾によって全て又は１部のシステイン残基がチアゾール環，セリン残基がオキサゾール環，又はスレオニン残基がメチルオキサゾール環に変換される様式で生合成されるペプチド化合物の生合成遺伝子群は，ゴードスポリン生合成遺伝子群である。ここで，ゴードスポリン生合成遺伝子群は，ゴッドエー（godA），ゴッドビー（godB），ゴッドシー（godC），ゴッドディー（godD），ゴッドイー（godE），ゴッドエフ（godF），ゴッドジー（godG），ゴッドエッチ（godH），ゴッドアイ（godI），及びゴッドアール（godR）の１０個の遺伝子からなるものである。
【００１６】
また，前記ゴードスポリンの類縁体は，アミノ酸の増減に影響されずに複素環形成反応が行われる。
【００１７】
また，前記ゴードスポリンの類縁体は，式２〜式４７のいずれか１つの式の構造式で表わされるものである。更に，前記ゴードスポリンの類縁体のうち，前記ゴードスポリンと同様に色素生産し，胞子形成を誘導することができる前記ゴードスポリンの類縁体は，下記の式２，式４，式５，式７，式９，式２０，式２４，式２５，及び式３６のいずれかの構造式である類縁体である。
【化１−１】
【００１８】
また，この発明は，下記の式２，式４，式５，式７，式９，式２０，式２４，式２５，及び式３６のいずれかの構造式で表わされる，ゴードスポリンと同様に色素生産し，胞子形成を誘導することができることを特徴とするゴードスポリンの類縁体に関する。
【化１−２】
【００１９】
ゴードスポリンは，放線菌・ストレプトマイセス・エスピー ティーピーエー０５８４（Streptomyces sp. TP-A0584 ）が生産する二次代謝産物であり，リボゾームを介して生合成されることが明らかとなっている。そこで，この発明では，はじめに生産菌にゴードスポリン生合成遺伝子群転写活性化因子であるゴッドアール（godR）遺伝子を染色体上に複数組み込むことにより，ゴードスポリン生産量を野生株の２．５倍以上に増大させたゴードスポリン生産増大株を作製した。次に，作製株のゴードスポリン構造遺伝子・ゴッドエー(godA)の塩基配列を置換することにより，ゴードスポリン類縁体を従来の方法に比べて，１４倍以上高生産する株を作製した。そして，ゴードスポリン類縁体を４７種類製造し，本製造方法において製造できるゴードスポリン類縁体の種類について明らかにし（実施例６），本願発明を完成させた。
【発明の効果】
【００２０】
この発明による複素環含有ペプチド化合物の製造方法は，上記のように構成されており，ゴードスポリン醗酵生産における生産量を増大することができ，また，従来の報告では生産量が少なかったゴードスポリン誘導体の生産も増大することができるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
−ゴードスポリン高生産株の使用−
この発明による複素環含有ペプチド化合物の製造方法は，非特許文献１に記載されている従来のゴードスポリン類縁体生産株に比べて１４．６倍の生産量が増大したゴードスポリン高生産株ゴッドエーアールツー(godA-R2) 株を使用することにより，ゴードスポリン類縁体の生産量を飛躍的に増大させることができる。ゴッドエーアールツー(godA-R2) 株は，実施例に示したようにピーティーワイエム１イーピーゴッドアール (pTYM1epgodR)プラスミドをゴードスポリン生産菌に導入することにより作製することができる。ここで，ゴッドエー（godA）遺伝子及びその周辺塩基配列を，〔配列表１〕に示す。ここで，ゴッドエー（godA）遺伝子は，１０１番目〜２５０番目の塩基である。
【００２２】
また，この発明については，ゴッドエーアールツー(godA-R2) 株以外にも，ゴッドアール（godR）遺伝子を複数コピーし，細胞内に導入する遺伝子組換え操作をすることによって，ゴッドアール（godR）の細胞内での発現量を増大させることによりゴードスポリンの生産量を増大させた微生物を使用することもできる。ここで，ゴッドアール
（godR）遺伝子及びその周辺塩基配列を，〔配列表２−１〕，及び〔配列表２−２〕に示す。ここで，ゴッドアール（godR）遺伝子は，１０１番目〜８１７番目の塩基である。
【００２３】
また，この発明については，ゴードスポリン生合成遺伝子群を別の微生物に移すことにより，ゴードスポリンを異種発現できるようになった微生物に対して，上記と同様なゴッドアール（godR）の細胞内での発現量を増大させる処理を行った微生物を使用することもできる。
【００２４】
−ゴードスポリン類縁体及びゴードスポリン製造法−
ゴードスポリン類縁体を製造するためには，上記のように，ゴッドアール（godR）遺伝子発現が増大したゴードスポリン高生産株のゴッドエー（godA）遺伝子を破壊した株に新たに変異ゴッドエー（godA）遺伝子を導入することによって，変異ゴッドエー（godA）遺伝子を高発現させることができる。この結果，ゴッドエー（godA）遺伝子の変異に従ったゴードスポリン類縁体を製造できる。新たに変異ゴッドエー（godA）遺伝子を導入するには，実施例に示したようなピーティーワイエム１９ゴッドエー（pTYM19godA) に部位特異的塩基置換法を用いて，塩基変異を導入したプラスミドを用いることができる。ゴードスポリン類縁体を製造するためには上記ピーティーワイエム１９ゴッドエー（pTYM19godA) に部位特異的塩基置換法を用いて，塩基変異を導入したプラスミド以外でも，変異ゴッドエー（godA）遺伝子を生産菌に導入できれば特にベクターの種類は問わない。変異ゴッドエー（godA）遺伝子を用いれば，ゴードスポリン類縁体は，下記式（２）〜式（４７）に示した構造式以外のゴードスポリン類縁体を製造することができることは勿論である。
【００２５】
−実施例−
実施例１及び実施例５において，ゴードスポリン生合成遺伝子群内に存在する転写因子・ゴッドアール（godR）が転写アクチベーターであることが明らかとなり，ゴッドアール（godR）を複数個，遺伝子操作によって染色体上に組み込んだ株のゴードスポリン生産が増大することを明らかにした。
【００２６】
また，実施例３及び実施例６において，これまで，ゴードスポリン類縁体の製造では，４種類しか成功していなかった類縁体作製に関しても，多様な塩基配列置換を試みた結果，本生産菌が生産することのできる類縁体の化学構造には制限があるが，少なくとも４７種類の類縁体を製造できることが明らかとなった。
【００２７】
実施例７では，いくつかのゴードスポリン類縁体においても生理活性が見出されていることを示したものである。
【００２８】
ゴードスポリン類縁体を作製するにあたり，ゴッドエー（godA）遺伝子破壊株に，再びゴッドエー（godA）遺伝子を組み込んだ復帰株（図１）が野生株同量程度のゴードスポリンを生産するのかを確認したところ，生産量が約１／１２に減少してしまった（図９）。そこで，ゴードスポリン生合成遺伝子群転写活性化因子であるゴッドアール（godR）をゴッドエー（godA）遺伝子破壊株に組み込むことによって，生産量を増加させた。図８に野生株，ゴッドエー（godA）遺伝子復帰株，ゴッドエーアールツー（godA-R2)株の染色体上における，ゴードスポリン生合成遺伝子群の様子を示した。これにより野生株の約１．２倍のゴードスポリンを生産する復帰株を得ることができた（図９）。そこで，このゴッドアール（godR）遺伝子の２倍体株（寄託番号：ＴＰ−Ａ０５８４ΔgodA−R2，ＮＩＴＥ Ｐ−５１９），ゴッドエーアールツー（godA-R2)株を利用して，ゴードスポリン類縁体の作製を行った。
ゴッドエー(godA)及び周辺部位の塩基配列を〔配列表１〕に示す。また，ゴッドエー
(godR)遺伝子及び周辺部位の塩基配列を〔配列表２−１〕と〔配列表２−２）に示す。
【００２９】
−ゴードスポリン生産菌における，耐性遺伝子，転写調節因子コピー数増加によるゴードスポリン生産量への影響−
ゴードスポリン生合成遺伝子の中でゴッドアイ（godI）が耐性遺伝子，ゴッドアール
godR) が転写調節遺伝子であるとＤＮＡ配列情報より推定された。一般的に生産物量を増大するためには，その物質に対する宿主菌株の薬剤耐性度を上げること，又は生合成遺伝子群の転写量を増大する操作による増大法が考えられる。そこで，どちらがゴードスポリン生産において有効な手段であるかを明らかにするために，ゴードスポリン生産菌の染色体にゴッドアイ（godI），ゴッドアール(godR)をそれぞれ１コピー導入した株を作製し，ゴッドアイ（godI）の２倍化株，ゴッドアール(godR)の２倍化株のゴードスポリン生産量を測定した。ゴッドアイ（godI）の２倍化株については，耐性遺伝子の増加により宿主のゴードスポリンへの耐性度が増加することが考えられた。また，ゴッドアール(godR)の２倍化株については転写調節遺伝子の増加によりゴードスポリン生合成遺伝子群の転写量が増大して生産量が増大することを期待した。ゴッドアール(godR)においては，転写因子であることまではＤＮＡ配列情報より推定できたが，転写活性化因子であるか転写阻害因子であるかまでは推定できなかったので，本実験によって転写活性化因子であることも初めて明らかになった。
【００３０】
ゴッドアイ（godI）遺伝子の２倍化株の作製
材料・試薬
・ピーティーワイエム１イーピー(pTYM1ep) （図２）
・ＰＣＲプライマー
ゴッドアイ（godI）クローニング用プライマー
godI-C 5'-TGGAAGCTTCTGCTTGCGGTCACCGGATC-3 ’
godI-N 5'-GCGACCCATATGTTCGACACTCTCTCCGA-3 ’
【００３１】
ゴッドアイ（godI）のクローニング
ゴードスポリン（goadsporin）生合成遺伝子上でゴッドアイ（godI）遺伝子のＣ末側，Ｎ末側の配列を基に，デザインしたプライマーを用いて，PCR により増幅してインサート断片（約1.6 kb）を得た。これをピーティーワイエム１イーピー(pTYM1ep) のマルチクローニングサイトにNde I ，Hind IIIでクローニングしてピーティーワイエム１イーピーゴッドアイ(pTYM1epgodI) を作製した。
【００３２】
遺伝子導入
構築したプラスミドピーティーワイエム１イーピーゴッドアイ(pTYM1epgodI) を，接合性大腸菌Ｓ１７−１を用いてＴＰ−Ａ０５８４の染色体上に組み込ませ，形質転換体
（godI２倍化株）を取得した（大腸菌の形質転換，放線菌への接合伝達法については従来公知の方法でよい）。
【００３３】
ゴッドアール(godR)２倍体株の作製
１−１：材料・試薬
・ピーティーワイエム１イーピー(pTYM1ep) （図２）
・ＰＣＲプライマー
ゴッドアール(godR)遺伝子クローニング用プライマー
godR-C-Hind 5'-GCGAAGCTTCAATCGCTATTTAGCGGCGAA-3 ’
godR-N-Nde 5'-CGCCATATGCGTGAAGGCAGCATCATAGCT-3 ’
【００３４】
ゴッドアール(godR)のクローニング
ゴードスポリン（goadsporin）生合成遺伝子上でgodR遺伝子を含む配列を基にデザインしたプライマーを用いて，ＰＣＲにより増幅してインサート断片（約０．７ｋｂ）を得た。これをpTYM1ep のマルチクローニングサイトにNde I ，Hind IIIでクローニングしてピーティーワイエム１イーピーゴッドアール(pTYM1epgodR) を作製した（図３）。
【００３５】
遺伝子導入
構築したプラスミドピーティーワイエム１イーピーゴッドアール(pTYM1epgodR) を，接合性大腸菌Ｓ１７−１を用いてＴＰ−Ａ０５８４の染色体上に組み込ませ，形質転換体
（godR２倍化株）を取得した（大腸菌の形質転換，放線菌への接合伝達法については従来公知の方法でよい）。
【００３６】
−ゴッドアイ（godI）２倍化株，ゴッドアール(godR)２倍化株のゴードスポリン生産量の確認について−
ゴッドアイ（godI）２倍化株，ゴッドアール(godR)２倍化株のゴードスポリン生産パターンを図７に示した（それぞれ２個体ずつ解析）。
図７から分かるように，野生型と比較して，ゴッドアイ（godI）２倍化株ではゴードスポリン生産量は大きく変化しないが，野生型に比べてゴードスポリン生産が早い時期に起こることが示された。一方，ゴッドアール(godR)２倍化株では，ゴードスポリン生産量が大きく増加した。更に，野生型よりも早期にゴードスポリン生産量が増加し始めることが示された。
【００３７】
−実施例１−
ゴッドアール（godR）遺伝子２倍体株〔ＴＰ−Ａ０５８４ΔgodA−R2〕の作製
１−１：材料・試薬
・ピーティーワイエム１イーピー(pTYM1ep)
・ピーティーワイエム１９(pTYM19)
・ＰＣＲプライマー
ゴッドアール（godR）遺伝子クローニング用プライマー
godR-C-Hind 5’-GCGAAGCTTCAATCGCTATTTAGCGGCGAA-3 ’
godR-N-Nde 5’-CGCCATATGCGTGAAGGCAGCATCATAGCT-3 ’
ａｐｈII遺伝子特異的プライマー
aph-C 5 ’-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3 ’
aph-N 5 ’-ATGATTGAACAAGATGGATTGCAC-3 ’
ｔｓｒ遺伝子特異的プライマー
tsr-C 5 ’-CTTCATATGCGGGGATCGACCGCGC-3’
tsr-N 5 ’-GACGAATCGAGGTCGAGGAACCGAG-3’
・ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）
【００３８】
１−２：プラスミドの作製
ゴードスポリン生合成遺伝子上でゴッドエー（godA）遺伝子を含むＢａｍＨＩ断片（約１．２ｋｂ）をｐＴＹＭ１９にクローニングし，図５に示すピーティーワイエム１９ゴッドエー（pTYM19epgodA) を作製した。
【００３９】
１−３：遺伝子導入
構築したプラスミドピーティーワイエム１イーピーゴッドアール(pTYM1epgodR) を，接合性大腸菌Ｓ１７−１を用いて，ゴッドエー（godA）遺伝子破壊株の染色体上に組み込ませ，形質転換体ゴッドエーアールツー（ΔgodA-R2 ）を取得した（大腸菌の形質転換，放線菌への接合伝達法については従来公知の方法でよい）。
得られた形質転換体から染色体を回収し（ＣＴＡＢ法など），ａｐｈ II 遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲにより形質転換が確実に行われたことを確認した（図４）。
次に，生産量が増加することを確認するため構築したプラスミドピーティーワイエム１９ゴッドエー(pTYM19godA)を同様の方法でΔgodA-R2 株の染色体上に組み込ませ，ゴードスポリン高生産復帰株（godA-R2)を取得した。得られた形質転換体から染色体を回収し，ｔｓｒ遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲにより形質転換が確実に行われたことを確認した（図４）。
【００４０】
−実施例２−
ゴードスポリンの定量法
２−１：材料・試薬
・Ｖ−２２
０．１％ Starch ，０．５％ Glucose, ０．３％ NZ-case, ０．２％ Yeast extract, ０．５％ tryptone,０．１％Ｋ2 ＨＰＯ4 ，０．５％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ，
０．３％ＣａＣＯ3 ，ｐＨ：７．０
・ゴードスポリン生産培地
６．０％ Maltose, ４．０％ Pharmamedia, １．０％ Yeast extract,
１．０％ Diaion HP20（脱気してｐＨ調整後に混合）, ｐＨ７．０
【００４１】
２−２：放線菌の培養
得られた形質転換体を選択薬剤カナマイシン，チオストレプトンを２０μｇ／ｍｌ添加した１０ｍｌ Ｖ−２２培地に植菌した。３０℃で２日間振とう培養後，１００ｍｌのゴードスポリン生産培地に前培養液を３％植菌し，さらに５日間培養した。
【００４２】
２−３：ＨＰＬＣ分析法
培養液と等量のｎ−ＢｕＯＨを加えて６０分間激しく振とう撹拌した。これを遠心分離（６０００〜１００００ｒｐｍ，５分間) してＢｕＯＨを回収し，減圧濃縮した。
ＭｅＯＨで溶解後，フィルター濾過したものをＨＰＬＣサンプルとした。ＨＰＬＣ（
ＨＰ１１００，Hewlett Packard ）は，Ｃ１８Cadenza カラム（Φ４．６×７５ｍｍ）を使用し，カラム温度４０℃移動相：０．１％ＣＨ3 ＣＮ−０．１％ ＨＣＯＯＨ buffer ，流速０．８ｍｌ／ｍｉｎで溶出し，ＵＶ吸収スペクトルは２５４ｎｍで検出した。
【００４３】
−実施例３−
ゴードスポリン類縁体生産株の作製法
３−１：材料・試薬
・ピーティーワイエム１９ゴッドエー(pTYM19godA)
・ＰｆｕＵｌｔｒａT M ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ polymerase
・Dpn Ｉ
【００４４】
変異用プライマー
アミノ酸置換用の配列表を，〔配列表３−１〕，〔配列表３−２〕に示す。
また，アミノ酸挿入・欠失用の配列表を，〔配列表３−３〕に示す。
【００４５】
３−２：変異導入プラスミドの作製
ｐＴＹＭ１９ゴッドエー（godA）を鋳型プラスミドとして，QuikChange（登録商標）IIＸＬ Site −Directed Mutagenesis Kit (Stratagene)を用いてプロトコールに従って変異導入を行った。取得した変異導入プラスミドは，ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０を用いてシーケンスし，目的の変異が導入されているかを確認した。
【００４６】
３−３：変異導入株の作製
宿主にΔゴッドエーアールツー（ΔgodA-R2)株を用いて，１−３と同様の方法により各ゴッドエー（godA）変異株を取得した。
３−４：ゴッドエー（godA）変異株による生産物の確認
ゴードスポリンの定量法と同様に分析を行った。コントロールであるゴットエーアールツー（godA-R2 ）株のＨＰＬＣデータと比較して，類縁体と思われる各ピークをＨＰＬＣの廃液配管から直接（手動で）採取した。採取した各ピークを Positive ESI-MS にかけ，予想される分子量を参考にして構造を決定した（図１０）。
【００４７】
−実施例４−
ゴードスポリンのバイオアッセイ法
４−１：材料・試薬
・Ｂｅｎｎｅｔｔ’ｓ ｇｌｕｃｏｓｅ培地
０．１％ Yeast extract, ０．１％肉エキス（エルリッヒ),
０．２％ＮＺ Ａｍｉｎｅ Ｔｙｐｅ Ａ，１％ Ｄ（＋）−Glucose,２％Ａｇａｒ， ｐＨ：７．２
・ＮＢソフトアガー
０．８％ Nutrient broth (Wako), ０．５％ Agar
【００４８】
４−２：ペーパーディスクアッセイ
図６に示すように，滅菌済みのペーパーディスク（直径１０ｍｍ）に，２−３の方法で調製した試料をＨＰＬＣ分析の結果からゴードスポリン約１０μｇになるようにしみ込ませて乾燥させた。３ｍｌのＮＢソフトアガー( 溶かして４０℃くらいに冷ましたもの) にS.lividans TK23 の胞子液を加え，Bennett's glucose 培地に均一に撒いた。アガーが乾いたら，ペーパーディスクを中央にのせ，３２℃で3 日間培養した。
【００４９】
−実施例５−
ｇｏｄＲ２倍体株（godA-R2 株）のゴードスポリン生産量
ＨＰＬＣ分析結果を図９に示した。
野生株godA-R2 株のゴードスポリンの生産量は，野生型と比較して１．１５倍，ゴッドエー（godA）復帰株と比較して１４．６倍であった。
ゴッドアール（godR）遺伝子を２倍にすることで，ゴッドエー（godA）復帰株においても野生型と同等のゴードスポリンを生産する株を取得できた。
【００５０】
−実施例６−
取得したゴードスポリン類縁体
ゴードスポリン類縁体の構造は，置換したアミノ酸から予想できるため，その分子量をＭＳで測定することによって構造を決定した（図１０）。
これにより４７種類のゴードスポリン類縁体を取得した。表１に，それぞれ配列を示した。
【００５１】
【表１】
【００５２】
また，取得したゴードスポリン類縁体は，表１に配列が示されており，それらの構造式を下記において，一般式（２）〜一般式（４７）として示し，各構造式の上方に付した下向き矢印は，変化した構造を指している。
【００５３】
【化２】
Ａ１Ｓ −−−−（２）
【００５４】
【化３】
Ａ１Ｃ −−−−（３）
【００５５】
【化４】
Ａ１Ｇ −−−−（４）
【００５６】
【化５】
Ｔ２Ｓ −−−−（５）
【００５７】
【化６】
Ｔ２Ｃ −−−−（６）
【００５８】
【化７】
Ｖ３Ｓ −−−−（７）
【００５９】
【化８】
Ｖ３Ｃ −−−−（８）
【００６０】
【化９】
Ｓ４Ｃ −−−−（９）
【００６１】
【化１０】
Ｔ５Ｃ −−−−（１０）
【００６２】
【化１１】
Ｉ６Ｓ −−−−（１１）
【００６３】
【化１２】
Ｉ６Ｃ −−−−（１２）
【００６４】
【化１３】
Ｉ６Ｙ −−−−（１３）
【００６５】
【化１４】
Ｌ７Ｓ−１ −−−−（１４）
【００６６】
【化１５】
Ｌ７Ｓ−２ −−−−（１５）
【００６７】
【化１６】
Ｃ８Ｓ−１ −−−−（１６）
【００６８】
【化１７】
Ｃ８Ｓ−２ −−−−（１７）
【００６９】
【化１８】
Ｃ８Ａ −−−−（１８）
【００７０】
【化１９】
Ｓ９Ｃ −−−−（１９）
【００７１】
【化２０】
Ｇ１０Ｓ −−−−（２０）
【００７２】
【化２１】
Ｇ１０Ｃ −−−−（２１）
【００７３】
【化２２】
Ｇ１１Ｓ −−−−（２２）
【００７４】
【化２３】
Ｇ１１Ｃ −−−−（２３）
【００７５】
【化２４】
Ｔ１２Ｓ −−−−（２４）
【００７６】
【化２５】
Ｔ１２Ｃ −−−−（２５）
【００７７】
【化２６】
Ｔ１２Ａ −−−−（２６）
【００７８】
【化２７】
Ｌ１３Ｓ −−−−（２７）
【００７９】
【化２８】
Ｌ１３Ｃ −−−−（２８）
【００８０】
【化２９】
Ｓ１５Ｃ −−−−（２９）
【００８１】
【化３０】
Ｓ１５Ａ −−−−（３０）
【００８２】
【化３１】
Ａ１６Ｓ −−−−（３１）
【００８３】
【化３２】
Ａ１６Ｃ −−−−（３２）
【００８４】
【化３３】
Ｇ１７Ｓ −−−−（３３）
【００８５】
【化３４】
Ｃ１８Ｓ −−−−（３４）
【００８６】
【化３５】
Ｃ１８Ａ −−−−（３５）
【００８７】
【化３６】
Ｖ１９Ｓ −−−−（３６）
【００８８】
【化３７】
Ｖ１９Ｃ −−−−（３７）
【００８９】
【化３８】
Ｖ１９Ｙ −−−−（３８）
【００９０】
【化３９】
３Ａ４ −−−−（３９）
【００９１】
【化４０】
６Ａ７ −−−−（４０）
【００９２】
【化４１】
１０Ａ１１−−−−（４１）
【００９３】
【化４２】
１０ＡＶ１１−−−−（４２）
【００９４】
【化４３】
１０ＳＡ１１−−−−（４３）
【００９５】
【化４４】
１３Ａ１４＋Ｓ１５Ｔ−１ −−−（４４）
【００９６】
【化４５】
１３Ａ１４＋Ｓ１５Ｔ−２ −−−（４５）
【００９７】
【化４６】
Ｇ１１−ｄｅｌａｔｅ −−−−（４６）
【００９８】
【化４７】
Ｓ９＋Ｇ１１−ｄｅｌｅｔｅ−−−−（４７）
【００９９】
作製した類縁体とゴードスポリン生合成酵素の関係を表２に示した。
これらの結果から以下のことが明らかになった。
（１）アミノ酸を置換，挿入，欠失させても環形成するアミノ酸は変わらない。
（２）ゴードスポリン生合成酵素は，アミノ酸を1 ，2 個挿入してもゴードスポリン前駆体として認識する。ただし，１０Ａ１１などの中央に挿入した類縁体に比べ，３Ａ４，６Ａ７などの中央から外れたところに挿入すると生産量は減少する。
（３）ゴードスポリンを構成するアミノ酸は８種類であるが，それ以外のアミノ酸に置換しても生合成酵素は認識する。
【０１００】
【表２】
【０１０１】
−実施例７−
ゴードスポリン類縁体のバイオアッセイ法の結果
ゴードスポリン類縁体のうち，ゴードスポリンと同様に色素生産，胞子形成を誘導したものは９種類であった。それを表３に示す。
【０１０２】
【表３】
【０１０３】
表３に示すように，ゴードスポリン誘導体は，一般式２で示すＡ１Ｓ，一般式４で示すＡ１Ｇ，一般式５で示すＴ２Ｓ，一般式７で示すＶ３Ｓ，一般式９で示すＳ４Ｃ，一般式２０で示すＧ１０Ｓ，一般式２４で示すＴ１２Ｓ，一般式２５で示すＴ１２Ｃ，及び一般式３６で示すＶ１９Ｓであった。ゴードスポリン類縁体のバイオアッセイ法によって観察した際に，色素のできる円の直径は次のとおりである。＋＋は，円の直径が２０〜２９ｍｍとはっきりとした大きな色素円を示し，＋は，円の直径が１５〜１９ｍｍとはっきりとして小さな色素円を示し，また，±は，円の直径が１４ｍｍ以下のかすかに色素を誘導している状態を示す。−は，色素誘導が確認できなかったものを示す。
【０１０４】
図１１には，ゴードスポリン生合成経路が示されている。 （１）菌体内ではゴードスポリン前駆体蛋白遺伝子であるｇｏｄＡが転写翻訳され，ｇｏｄＡ蛋白が発現する。
（２）ｇｏｄＢ，ｇｏｄＣ蛋白によってｇｏｄＡ蛋白は細胞膜へ係留される。
（３）ｇｏｄＤ，ｇｏｄＥ，ｇｏｄＦ，ｇｏｄＧ蛋白が，ｇｏｄＡ蛋白内のセリン，スレオニン，システイン残基をそれぞれオキサゾール，メチルオキサゾール，チアゾールに変換する。このように翻訳後修飾されたゴッドエー（GodA）蛋白は，次にＮ末端から３０番目のアラニンと３１番目のアラニンの間でプロテアーゼ酵素によって切断され，Ｃ末端側１９残基が遊離する。
（４）遊離したＣ末端側１９残基のＮ末端がゴッドエイチ(GodH)酵素によってアセチル化修飾を受けて，ゴードスポリンが完成する。
【０１０５】
図８には，上段が野生株（TP-A0584）のゴードスポリン生合成遺伝子群を示しており，中段にｇｏｄＡ遺伝子復帰株，即ち，ｇｏｄＡ破壊株にｇｏｄＡ遺伝子を組み込んだ株のゴードスポリン生合成遺伝子群を示しており，また，下段には，ｇｏｄＡ破壊株に
ｇｏｄＡ遺伝子とｇｏｄＲ遺伝子を組み込んだ株，即ち，ｇｏｄＡ−Ｒ２株染色体上のゴードスポリン生合成遺伝子群が示されている。
【０１０６】
図４には，ｇｏｄＲ遺伝子の２倍体株のＰＣＲによる形質転換の確認が示されている。 Ａ（左側写真）は，ａｐｈ II 遺伝子特異的プライマーでＰＣＲしたサンプルである。 Ｂ（右側写真）は，ｔｓｒ遺伝子特異的プライマーでＰＣＲしたサンプルである。
（１）ＤＮＡサイズマーカー
（２）ＴＰ−Ａ０５８４（ＷＴ）ゲノムＤＮＡ
（３）ΔｇｏｄＡ株ゲノムＤＮＡ
（４）ΔｇｏｄＡ＋ｇｏｄＲ株ゲノムＤＮＡ
（５）ΔｇｏｄＡ＋ｇｏｄＡ株ゲノムＤＮＡ
（６）ΔｇｏｄＡ＋ｇｏｄＡ＋ｇｏｄＲ株ゲノムＤＮＡ
【０１０７】
図６には，ゴードスポリンのバイオアッセイ方法の工程が示されている。
図６に示すように，まず，ＮＢソフトアガーを完全に溶かし，Ｓ.lividans の胞子液を加え，Bennet's glucose 培地上に均一に蒔く。次いで，ＮＢソフトアガーが乾いたら，ゴードスポリンを染み込ませたペーパーディスクをプレートの中央に載せる。最後に，３２℃で３日間培養すると，色素生産と胞子形成が確認できる。
【０１０８】
図９には，ゴードスポリンのＨＰＬＣの分析を示している。
上段が野生株（TP-A0584）であり，中段がゴッドエー（godA）復帰株であり，下段がゴッドエーアールツー株（godA-R2)である。
【０１０９】
図１０には，マススペクトルデータの１例としてＧ１０Ｃのスペクトルを示している。 Ｇ１０Ｃの分子量は，その構造から１６５７．６４７６と予想された。
ＭＳのデータからｍ／ｚは１６５８．６５１０（〔Ｍ＋Ｈ〕+ ）の分子量が確認されたことから，これはＧ１０Ｃであると決定した。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
この発明は，ゴードスポリンを初めとするチアゾール環，オキサゾール環，又はメチルオキサゾール環である複素環を含有したペプチド化合物の簡便で増大させる製造方法及びその類縁体を提供することであって，より増産の高いゴードスポリン及びその類縁体の製造方法を提供し，生育阻害効果を有し，抗菌活性を有するため，抗生物質等の医薬品，生理活性物質等の用途に適用することができる。
【０１１１】
〔配列表〕
配列表１．ＨＴＭＬ
配列表２−１．ＨＴＭＬ
配列表２−２．ＨＴＭＬ
配列表３−１．ＨＴＭＬ
配列表３−２．ＨＴＭＬ
配列表３−３．ＨＴＭＬ
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】ゴードスポリン高生産復帰株（ｇｏｄＡ−Ｒ２）の作製法を示す説明図である。
【図２】ピーティーワイエム１イーピー(pTYM1ep) のプラスミドマップを示す説明図である。
【図３】ピーティーワイエム１イーピーゴッドアール(pTYM1epgodR) の作製方法を示す説明図である。
【図４】ゴットアール(GodR)遺伝子２倍体株の，ＰＣＲによる形質転換の確認を示す写真である。
【図５】類縁体作製の際に変異を加えるゴットエー(godA)の遺伝子配列を示す説明図である。
【図６】ゴードスポリンのペーパーディスクアッセイ法の工程を示す説明図である。
【図７】ゴッドアイ（godI）２倍化株，ゴッドアール(godR)２倍化株のゴードスポリン生産パターンを示すグラフである。
【図８】野生株（TP-A0584），ゴットエー(godA)遺伝子復帰株，ゴットエーアールツー(godA-R2) 染色体上のゴードスポリン生合成遺伝子群を示す説明図である。
【図９】ゴードスポリンのＨＰＬＣ分析結果を示すグラフである。
【図１０】Ｇ１０Ｃのマススペクトルを示すグラフである。
【図１１】ゴードスポリン生合成経路を示す説明図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リボゾーム翻訳系を用いて生合成され且つ翻訳後修飾によって全て又は１部のシステイン残基がチアゾール環，セリン残基がオキサゾール環，又はスレオニン残基がメチルオキサゾール環に変換される様式で生合成されるペプチド化合物の生合成遺伝子群を用いて，遺伝子組換え可能な放線菌内で発現させることによって複素環含有ペプチド化合物を製造する方法において，
転写活性化因子遺伝子を前記ペプチド化合物の生産放線菌に形質転換することによって，前記ペプチド化合物の生産量を増大することを特徴とする複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項２】
前記転写活性化因子遺伝子を前記ペプチド化合物の生産放線菌の染色体ＤＮＡ上に１個又は複数個組み込むことによって，前記ペプチド化合物の生産量を増大することを特徴とする請求項１に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項３】
前記リボゾーム翻訳されるペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子は，ゴッドエー（godA）遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項４】
リボゾーム翻訳されるペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列の塩基の１又は複数個を置換，欠失，又は挿入することによって，前記ペプチド化合物の類縁体を製造することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項５】
前記ペプチド化合物は，ゴードスポリンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項６】
前記転写活性化因子遺伝子は，ゴッドアール（godR）遺伝子であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項７】
前記リボゾーム翻訳系を用いて生合成され且つ翻訳後修飾によって全て又は１部のシステイン残基がチアゾール環，セリン残基がオキサゾール環，又はスレオニン残基がメチルオキサゾール環に変換される様式で生合成される前記ペプチド化合物の前記生合成遺伝子群は，ゴードスポリン生合成遺伝子群であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項８】
前記ゴードスポリンの類縁体は，アミノ酸の増減に影響されずに複素環形成反応が行われることを特徴とする請求項４〜７のいずれか１項に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項９】
前記ゴードスポリンの類縁体は，式２〜式４７のいずれか１つの式の構造式で表わされることを特徴とする請求項４〜８のいずれか１項に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項１０】
前記ゴードスポリンの類縁体のうち，前記ゴードスポリンと同様に色素生産し，胞子形成を誘導することができる前記ゴードスポリンの類縁体は，下記の式２，式４，式５，式７，式９，式２０，式２４，式２５，及び式３６のいずれかの構造式である類縁体であることを特徴とする請求項９に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【化１−１】
【請求項１１】
下記の式２，式４，式５，式７，式９，式２０，式２４，式２５，及び式３６のいずれかの構造式で表わされるゴードスポリンと同様に色素生産し，胞子形成を誘導することができることを特徴とするゴードスポリンの類縁体。
【化１−２】
【請求項１】
リボゾーム翻訳系を用いて生合成され且つ翻訳後修飾によって全て又は１部のシステイン残基がチアゾール環，セリン残基がオキサゾール環，又はスレオニン残基がメチルオキサゾール環に変換される様式で生合成されるペプチド化合物の生合成遺伝子群を用いて，遺伝子組換え可能な放線菌内で発現させることによって複素環含有ペプチド化合物を製造する方法において，
転写活性化因子遺伝子を前記ペプチド化合物の生産放線菌に形質転換することによって，前記ペプチド化合物の生産量を増大することを特徴とする複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項２】
前記転写活性化因子遺伝子を前記ペプチド化合物の生産放線菌の染色体ＤＮＡ上に１個又は複数個組み込むことによって，前記ペプチド化合物の生産量を増大することを特徴とする請求項１に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項３】
前記リボゾーム翻訳されるペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子は，ゴッドエー（godA）遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項４】
リボゾーム翻訳されるペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列の塩基の１又は複数個を置換，欠失，又は挿入することによって，前記ペプチド化合物の類縁体を製造することを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項５】
前記ペプチド化合物は，ゴードスポリンであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項６】
前記転写活性化因子遺伝子は，ゴッドアール（godR）遺伝子であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項７】
前記リボゾーム翻訳系を用いて生合成され且つ翻訳後修飾によって全て又は１部のシステイン残基がチアゾール環，セリン残基がオキサゾール環，又はスレオニン残基がメチルオキサゾール環に変換される様式で生合成される前記ペプチド化合物の前記生合成遺伝子群は，ゴードスポリン生合成遺伝子群であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項８】
前記ゴードスポリンの類縁体は，アミノ酸の増減に影響されずに複素環形成反応が行われることを特徴とする請求項４〜７のいずれか１項に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項９】
前記ゴードスポリンの類縁体は，式２〜式４７のいずれか１つの式の構造式で表わされることを特徴とする請求項４〜８のいずれか１項に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【請求項１０】
前記ゴードスポリンの類縁体のうち，前記ゴードスポリンと同様に色素生産し，胞子形成を誘導することができる前記ゴードスポリンの類縁体は，下記の式２，式４，式５，式７，式９，式２０，式２４，式２５，及び式３６のいずれかの構造式である類縁体であることを特徴とする請求項９に記載の複素環含有ペプチド化合物の製造方法。
【化１−１】
【請求項１１】
下記の式２，式４，式５，式７，式９，式２０，式２４，式２５，及び式３６のいずれかの構造式で表わされるゴードスポリンと同様に色素生産し，胞子形成を誘導することができることを特徴とするゴードスポリンの類縁体。
【化１−２】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００９−２２５７０３（Ｐ２００９−２２５７０３Ａ）
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−７３４７５（Ｐ２００８−７３４７５）
【出願日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年３月５日 社団法人日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会２００８年度（平成２０年度）大会講演要旨集」に発表
【出願人】（０００２３６９２０）富山県 (197)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２１日（２００８．３．２１）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年３月５日 社団法人日本農芸化学会発行の「日本農芸化学会２００８年度（平成２０年度）大会講演要旨集」に発表
【出願人】（０００２３６９２０）富山県 (197)
【Ｆターム（参考）】
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