診断適用および臨床適用のための癌胎児抗原／未熟ラミニン受容体抗体
本発明は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに関連する疾患を検出または治療するために、単独で、または組み合わせて用いることができる、癌胎児抗原／未熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）に対する抗体に関するものである。より具体的には、抗体は、（ｉ）異なる生体液においてＯＦＡ／ｉＬＲＰを検出および測定すること、ならびに（ｉｉ）ＯＦＡ／ｉＬＲＰとモノマー形態およびその関連する疾患に対する抗体とを用いることを含む、いくつかの目的のために用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００９年３月２６日に出願された米国仮出願第６１／１６３，８１０号（この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）の出願日の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、全体として、癌胎児抗原／未熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）に関するものである。より具体的には、本発明は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに関連する疾患を検出および治療するために用いることができる抗体を提供する。
【背景技術】
【０００３】
癌胎児抗原／未熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）の最初の特徴付けは、癌胎児抗原またはラミニン受容体を研究した３つの独立したグループによって行われた［１〜３（非特許文献１〜３）］。ＯＦＡ／ｉＬＲＰは、様々な異なる癌において過剰発現する、高度に保存されるタンパク質であり、リボソームタンパク質ｐ４０として二元機能を有する［４〜２７］。ＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質は、２９５個のアミノ酸からなる一本のポリペプチド鎖からなり、約３７〜４４ｋＤａの分子量を有する。ＯＦＡ／ｉＬＲＰの構造は、最近、２．１５Åであることが解明されている［２８］。ラミニン受容体（ＬＲＰ）の成熟形態は、６７ｋＤａの分子量を有する、アセチル化ＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量体であると考えられる。構造によって、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのアミノ酸１１２から１４０の間の領域が、ＬＲＰを形成するためのＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量化に関与することが示された［２８］。６７ｋＤａのＬＲＰは、多くの正常細胞上および腫瘍細胞上にあるが、胎児細胞および腫瘍細胞がＯＦＡ／ｉＬＲＰを優先的に発現すると考えられる。したがって、発現パターンによって、ＯＦＡ／ｉＬＲＰが、癌および他の疾患を治療するための、免疫系を感作するための考えられる候補タンパク質となる［６］。ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体もまた、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの誤発現に関連することが公知の疾患の検出、診断、および治療に用いることができる。
【０００４】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体に対する最初の研究は、癌胎児抗原の側面またはラミニン受容体の側面という２つの個別の分野に該当する。胚／胎児抗原およびラミニン受容体の両方について、同年に、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対するモノクローナル抗体の最初の報告がされた［２９、３０］。胚抗原または胎児抗原に対して発生した抗体は、変性条件下で、４４ｋＤａのタンパク質と反応した［３０］。ラミニン受容体に対してこれまでに開発された抗体は、抗体結合の位置に基づいて異なる生物学的活性を有していた［２９］。ラミニンの結合をブロックする生物学的活性を有していたある領域が、モノクローナルＩｇＭ抗体によって認識された。モノクローナルＩｇＭ抗体が認識したエピトープは、ＴＥＤＷＳＡＱＰＡＴＥＤＷＳＡであった［２６］。４４ｋＤａのＯＦＡに対する研究によって、ＩｇＭモノクローナル抗体（ＭＡｂ１１５）を、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、および場合によっては発癌性の試験に用い得ることが示された［３１］。しかし、この抗体は、ＯＦＡ｜ＯＦＡ二量化領域に対して特異的に設計されたものではないため、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびＬＲＰの両方と反応する［３１］。このモノクローナル抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰまたはＬＲＰの免疫組織化学およびタンパク質精製に用いられた［１２、３２］。６７ｋＤａのラミニン受容体を検出し、かつ乳癌においてラミニン受容体の発現の増大を示したペプチドから、異なる抗体が開発された［５、３３］。いくつかの公表された原稿は、自己免疫抗体を探求する際に、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体の使用を記載している［６、９、１０、１６、１９、２０、２５、２７、３４〜３６］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｅｓｏｔ， Ｈ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ（１９８３）２（６）：ｐ８６１〜８６５
【非特許文献２】Ｍａｌｉｎｏｆｆ， Ｈ．Ｌ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８３）９６（５）：ｐ１４７５〜９
【非特許文献３】Ｒａｏ， Ｎ．Ｃ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００７）１７９（２）：ｐ１３８１〜８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰは様々な異なる疾患に関連するため、診断上のおよび臨床上の抗体の適用を開発する必要がある。これまで、ペプチドを用いて標的化抗体を開発する試みはわずかしかなく、かつ、これは１つの公表された報告に限定されている［５］。公表された報告において用いられた領域は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびラミニン受容体の両方と反応することが報告された抗体を産生した［５、２５］。したがって、様々な異なる臨床上の、診断上の、および／または獣医学上の適用を開発するために、単独で、または他の抗体と組み合わせて用いることができる、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体を開発する必要がある。一方はＯＦＡ／ｉＬＲＰを認識し得、一方はＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびＬＲＰの両方を認識し得る抗体を対で開発することにより、タンパク質の保存された性質に起因する、全ての種におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰ疾患を治療するために用いることができるか、診断するために用いることができるか、または前記疾患の試薬として作用し得る、いくつかの試験の開発が可能になる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの態様は、癌胎児抗原／未熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）の免疫原性である領域に特異的に結合する、単離された抗体を提供する。１つの実施形態では、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの免疫原性領域には、限定はしないが、（ａ）ＦＦＲＥＰＲＬＬＶＶＴＤＰＲ、（ｂ）ＶＴＤＰＲＡＤＨＱＰＬＴＥ、（ｃ）ＹＲＤＰＥＥＩＥＫＥＥＱ、または（ｄ）ＦＰＴＥＤＷＳＡＱＰＡＴＥＤのポリペプチド配列が含まれる。別の実施形態では、本発明の単離された抗体は、限定はしないがモノクローナル抗体２Ｃ６または３Ｇ７を含む、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。さらなる別の実施形態では、免疫原性領域は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量化領域に位置する。
【０００８】
本発明の抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの免疫原性領域に対して免疫化することによって産生される。抗体は、完全長ＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質と、本発明の抗体を産生するために用いられるＯＦＡ／ｉＬＲＰの免疫原性領域との両方を認識し得る。１つの実施形態では、抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的である。代替の実施形態では、抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよび成熟ＬＲＰの両方を認識する。
【０００９】
本発明の抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに関連するタンパク質または癌を検出するための様々な方法において用いることができる。
【００１０】
１つの実施形態では、抗体は、試料においてＯＦＡ／ｉＬＲＰを検出するための方法において用いられる。この方法は、
（ａ）試料を、癌胎児抗原／未熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）の領域に特異的にそれぞれ結合する第１の抗体および第２の抗体と接触させるステップであって、前記抗体の少なくとも一方がＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的であるステップ、
（ｂ）抗体をＯＦＡ／ｉＬＲＰに結合させ、ＯＦＡ／ｉＬＲＰとのサンドイッチを形成させるステップ、ならびに
（ｃ）ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体を用いて、試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲの発現を検出するステップ
を含む。
【００１１】
１つの実施形態では、抗体の一方は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよび成熟ＬＲＰの両方に結合してもよく、捕捉抗体として働き得る。もう一方の抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的であってもよく、検出抗体として働く。
【００１２】
別の実施形態では、本発明の抗体は、試料において癌を検出する方法において用いられる。この方法は、
（ａ）試料を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体と接触させるステップ、
（ｂ）試料を、ビオチン化された二次抗体と接触させるステップ、および
（ｃ）ストレプトアビジンを用いて、試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰを検出するステップ
を含み、試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰの検出が癌を示す。
【００１３】
さらなる実施形態では、本発明は、試料においてＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を決定する方法であって、
（ａ）ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体をフルオロフォアに結合体化させるステップ、
（ｂ）結合体化した抗体を試料内で接触させるステップ、および
（ｃ）蛍光偏光を用いて、試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を決定するステップ
を含む方法を提供する。
【００１４】
本発明の抗体はまた、血液試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞の量を決定する方法において用いることができる。この方法は、
（ａ）血液試料を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰｌに特異的な抗体と接触させるステップ、および
（ｂ）フローサイトメトリーを用いて、試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を決定するステップ
を含む。
【００１５】
本発明の抗体はまた、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を治療する方法において用いることができる。この方法は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌に関連する症候を改善するために十分な量の、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を有する被験体に投与するステップを含む。１つの実施形態では、抗体は、抗癌特性を有するコロイドに連結しているか、または、化学療法剤もしくはタンパク質と結合体化している。
【００１６】
本発明はまた、被験体においてＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を検出する方法を提供する。この方法は、
（ａ）ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体を、放射線不透過性の染料に結合体化させるステップ、
（ｂ）結合体化した抗体を被験体に投与するステップ、および
（ｃ）ｘ線を用いて、結合体化した抗体を検出するステップ
を含み、ｘ線によるＯＦＡ／ｉＬＲＰの検出が癌を示す。
【００１７】
本発明の別の態様は、本発明の抗体を含む医薬組成物を提供する。この組成物は、医薬用担体を含み得る。
【００１８】
本発明の上記の特徴および他の特徴、ならびにそれらを得る様式および用いる様式は、より明らかとなり、添付の図面と組み合わせて以下の記載を参照することによって、最も良く理解されよう。図面は、本発明の典型的な実施形態のみを示すものであり、したがって、本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＢＳＡ結合体ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドに対するＯＦＡ／ｉＬＲＰポリクローナル血清の滴定を示す図である。抗体抗原反応の検出には、ビオチン化されたユニバーサル二次抗体混合物を用いた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘで吸光度を測定し、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈを用いてデータを分析した。
【図２】図２は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対するＯＦＡ／ｉＬＲＰポリクローナル血清の滴定を示す図である。ビオチン化された二次抗体を用いる、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体抗原相互作用の検出。Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＴＸ ８８０でのＡ６２０での吸光度の読み取りの、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈ。
【図３】図３は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する間接ＥＬＩＳＡでランされたモノクローナル抗体２Ｃ６および３Ｇ７の希釈曲線を示す図である。
【図４】図４は、モノクローナル抗体（２Ｃ６および３Ｇ７）の反応性を決定するための、ｒＯＦＡ／ｉＬＲＰのサンドイッチＥＬＩＳＡを示す図である。生のデータを片対数グラフにプロットし、標準的なプロトコール（ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ４．３．１ ＬＳ）に従って、４パラメータロジスティックを用いて曲線当てはめ（ｃｕｒｖｅ ｆｉｔ）を行った。
【図５】図５は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの蛍光偏光を示す図である。（Ａ）生のデータをｌｏｇ表示のｘ軸にプロットした。（Ｂ）４パラメータロジスティックを用いた曲線当てはめのデータ（ｒ２＝０．９７５）ｎ＝２。
【図６】図６は、一次抗体反応のために３Ｇ７モノクローナル抗体を用いた、中度に分化したヒト浸潤性腺管癌腫であるＴ２Ｎ１Ｍ０のＩＨＣ染色を示す図である。非常に暗い領域は、細胞が大量のＯＦＡ／ｉＬＲＰを発現している場所であり、厚い沈殿物が堆積していた。
【図７】図７は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｂｌｕｅを用いて、細胞の生存能力に対する２Ｃ６抗体および３Ｇ７抗体の効果を測定した図である。抗体を添加することによって生じた生存能力の低下が、弱まった蛍光シグナルによって示される。抗体の効果およびラミニンの必要量を、ラミニン／エンタクチンで被覆したプレートまたは未処理のプレート上で成長させることによって決定した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、驚くべきことに、免疫原性ペプチドが、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの推定同位体（ｉｓｏｔｏｐｅ）領域から由来し得、かつＯＦＡ／ｉＬＲＰの特異的領域に対するこれまでに発見されていない抗体を生成するために用いられ得ることを発見した。
【００２１】
したがって、本発明の１つの態様は、癌胎児抗原／未熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）の免疫原性である領域に特異的に結合する、単離された抗体を目的とする。本発明の目的では、「単離された」抗体は、その天然環境の構成要素から同定および分離、ならびに／または回収されているものである。
【００２２】
本発明の１つの実施形態では、抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的である。抗体は、それが、周知の標準的な抗体結合条件下で、６７ｋＤａの形態のラミニン受容体ではなくＯＦＡ／ｉＬＲＰに優先的に結合する場合、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的である。このような抗体の例には、限定はしないが、３Ｇ７が含まれる。異なる実施形態では、本発明の抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよび６７ｋＤａの形態のラミニン受容体の両方を認識し得る。このような抗体の例には、限定はしないが、２Ｃ６が含まれる。さらなる実施形態では、本発明の抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量化領域に結合する。本発明の目的では、二量化領域は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量化に関与する［２８］、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ完全長タンパク質のアミノ酸１１２から１４０の間の領域である。
【００２３】
本発明の抗体は、完全長のＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質を認識し得る。それらはまた、免疫原性であるＯＦＡ／ｉＬＲＰの特異的領域、特に二量化領域を認識し得る。本発明の目的では、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの領域は、その領域に由来するポリペプチドが免疫応答を引き起こし得、かつ本発明の抗体を産生するために用いられ得る場合、免疫原性である。例えば、表２に列挙される４つの免疫原性ペプチドによって生成される抗体は、完全長のＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質、そのそれぞれの免疫原性ペプチド、およびこれらのペプチドを含むＯＦＡ／ｉＬＲＰの領域を認識し得る。
【００２４】
本発明の目的では、「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、受容体、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合し得る、免疫グロブリン分子である。本明細書において用いられる場合、この用語は、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、Ｆｖなど）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のあらゆる他の修飾された形状も含む。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭなどの、あらゆるクラスの抗体（またはそのサブクラス）が含まれ、抗体は、何らかの特定のクラスのものである必要はない。抗体の重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを、異なるクラスに割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭという、免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖の定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニットの構造および三次元形状は、周知である。
【００２５】
本発明の抗体は、さらに、抗体の少なくとも１つのＯＦＡ／ｉＬＲＰ領域によって付与される、ポリペプチドに対する親和性を有する、二重特異性分子、多特異性分子、一本鎖分子、ならびにキメラおよびヒト化分子を含むことを意図したものである。本発明の抗体にはまた、抗体の重鎖の可変ドメインまたは抗体の軽鎖の可変ドメインである、単一ドメイン抗体が含まれる。抗体の６つの天然の相補性決定領域のうち３つを含有する、抗体の重鎖の可変ドメインまたは抗体の軽鎖の可変ドメインを含むドメイン抗体を作製する方法もまた、当技術分野において公知である。例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４巻：２７７〜３０２頁、２００１年を参照されたい。
【００２６】
１つの実施形態では、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して発生した抗体は、モノクローナル抗体である。２Ｃ６および３Ｇ７などのモノクローナル抗体はまた、完全長のＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質、そのそれぞれの免疫原性ペプチド、およびこれらのペプチドを含むＯＦＡ／ｉＬＲＰの領域を認識し得る。しかし、モノクローナル抗体３Ｇ７は、成熟形態のＬＲＰ（二量体形態）を認識せず、一方、モノクローナル抗体２Ｃ６は認識する。しかし、高用量の３Ｇ７抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ二量体を崩壊させ得る。
【００２７】
本明細書において用いられる場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な複数の抗体の１抗体を言い、すなわち、集団を含む個別の抗体は、わずかに存在し得る考えられる天然の突然変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、一般に、非常に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」という修飾語は、抗体が、実質的に均質な抗体集団から得られ、かつ、何らかの特定の方法による抗体の産生が必要であるとは解釈されないという、抗体の特徴を示す。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号において記載されているような組換えＤＮＡ法によって作製することができる。モノクローナル抗体はまた、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５４頁において記載されている技術を用いて生成されるファージライブラリーから単離することができる。
【００２８】
本発明の抗体は、選択された基準に基づいてペプチドに対して免疫化することによって産生される。ペプチドの選択および選択基準は、本願と同時に出願された、「Ｏｎｃｏｆｅｔａｌ Ａｎｔｉｇｅｎ／Ｉｍｍａｔｕｒｅ Ｌａｍｉｎｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」という発明の名称の特許出願において完全に開示されており、この出願の関連する内容は、本明細書に完全に組み込まれる。一般に、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのアミノ酸配列の少なくとも一部、すなわち全体または一部を含むポリペプチドまたはペプチドが、特異的な抗体応答を引き起こし得るならば、これを抗原として用いることができ、このようにして生成された抗体は、完全長ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびこれにおいて用いられる免疫原性ペプチドの両方を認識し得る。本発明の実施形態に従うと、免疫原性ペプチドは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの異なる推定エピトープ領域に基づいて生成される。単独で、またはＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量化領域に対する抗体と組み合わせて用いるための、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する多重機能抗体の再現性および機会を増大させるために、好ましくは、抗体は、表１に列挙される領域またはエピトープに対して開発される。１つの実施形態では、１）ＦＲＥＰＲＬＬＶＶＴＤＰＲ、２）ＶＴＤＰＲＡＤＨＱＰＬＴＥ、３）ＹＲＤＰＥＥＩＥＫＥＥＱ、４）ＦＰＴＥＤＷＳＡＱＰＡＴＥＤの４つのペプチドが、本発明の抗体の生成に用いられる。
【００２９】
本発明のペプチドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどを用いる化学的合成または生化学的合成によって調製することができる。当業者に周知の方法を、合成に用いることができる。
【００３０】
本発明のペプチドを化学的に合成する場合、ペプチド合成の分野において周知の方法を用いることができる。例えば、アジド法、酸塩化物法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボジイミダゾール法、および酸化還元法などの方法を挙げることができる。固相合成または液相合成を用いることができる。市販されているペプチド合成器（例えば、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＰＳＳＭ−８）もまた用いることができる。
【００３１】
反応の後、本発明のペプチドを、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、または再結晶化などの従来の精製方法の組み合わせによって精製することができる。
【００３２】
本発明のペプチドは、その免疫原性応答を増大させるために修飾することができる。１つの実施形態では、ペプチドの改変体は、いずれかの末端にシステイン残基を含み得、これによって、キーホールリンペットヘモシアニン、オボアルブミン、血清アルブミン、またはペプチドの免疫原性応答を増大させるために用いられる他の結合体への結合体化が可能になる。表２には、結合体化のための修飾ペプチドの例が列挙されている。
【００３３】
ペプチドは、抗体を生じさせるために、様々な異なる生物において用いることができる。抗体はまた、周知のタンパク質技術に基づいて様々な異なる組換え抗体を生成させるためにクローニングすることができる。本発明の目的の１つは、完全長タンパク質に対して免疫化するのではなく、本発明のペプチドに対して免疫化し、そして、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの特異的領域に対する免疫特異性に基づいて抗体を選択することによって、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの特異的領域に対する抗体を開発することである。
【００３４】
本発明のモノクローナル抗体は、当技術分野において公知の方法を用いて生成することができる。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞を培養することによって生成することができ、ハイブリドーマ細胞によって分泌される抗体はさらに、単離または精製することができる。抗体は、例えば、タンパク質Ａ−セファロース．ＲＴＭ．、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの、従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地または腹水から単離または精製することができる。
【００３５】
本発明の抗体はまた、参照することによって本明細書に組み込まれる米国特許第４，８１６，５６７号および米国特許第６，３３１，４１５号において記載されているような組換えＤＮＡ法によって作製することができ、例えば、本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離および配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい由来源として役立つ。ＤＮＡは、単離されると、発現ベクター内に置くことができ、この発現ベクターを次に、本来は免疫グロブリンタンパク質を産生しない、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞内に移して、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、ヒトの重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列を相同なマウス配列の代わりに用いることによって（米国特許第４，８１６，５６７号）、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を、免疫グロブリンをコードする配列に共有結合させることによって、修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の定常ドメインの代用とするか、または、本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代用として、キメラ二価抗体を生じさせることができる。
【００３６】
本発明の抗体は、様々な異なる機能のために用いることができる。１つの実施形態では、本発明の抗体は、化学的アジュバント、放射線学的アジュバント、および核性アジュバントとの結合体化を介して、悪性組織を検出するために用いることができる。さらに、これらの抗体は、治療的に用いて、受動免疫、すなわち、その固有のもしくは改変された形での増大した免疫応答をもたらすために用いることができるか、または、化学的、放射線学的「種」源、微小電気装置、銀コロイド、金、二酸化チタンコロイド、バイオポリマーコロイド（すなわち、デンプン、コラーゲン、アガロースなど）、ペプチド配列、もしくはタンパク質配列に結合体化している場合には、悪性細胞の標的化された破壊を助けるために用いることができる。ＯＦＡ／ｉＬＲＰの、高度に保存される性質に起因して、抗体はまた、試薬としても用いることができ、タンパク質を発現する全ての生物と交差反応をする。
【００３７】
したがって、本発明の別の態様は、本明細書において記載される抗体またはポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。組成物の抗体またはポリペプチドは、単独で、または、化学的、放射線学的「種」源、微小電気装置、銀コロイド、金、二酸化チタンコロイド、バイオポリマーコロイド（すなわち、デンプン、コラーゲン、アガロースなど）、ペプチド配列、もしくはタンパク質配列に結合体化して使用することができ、これは、悪性細胞の標的化された破壊を助けるために用いることができる。
【００３８】
組成物はまた、薬学的に許容される担体または賦形剤を含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、当技術分野において公知であり、薬学的に効果的な物質の投与を容易にする、比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形態もしくは硬さをもたらし得るか、または、希釈剤として作用し得る。適切な賦形剤には、限定はしないが、安定剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル化剤、緩衝液、ならびに皮膚浸透増強剤が含まれる。非経口的および経口的な薬物送達のための賦形剤および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００年）において説明されている。
【００３９】
本発明の組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤される。投与経路の例には、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば、吸入）、経皮投与（局所的）、経粘膜投与、および直腸投与が含まれる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液には、注射のための水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの無菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための作用物質という構成要素が含まれ得る。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口調製物を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回用量のバイアル内に入れることができる。
【００４０】
注射での使用に適した組成物には、無菌水性溶液（水溶性の）または分散液、および無菌の注射用溶液または分散液を即時調製するための無菌粉末が含まれる。静脈内投与では、適切な担体には、生理食塩水、滅菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全てのケースにおいて、組成物は無菌でなくてはならず、注射容易性が存在する限りは流体である。これは、製造および保存の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなくてはならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒質であり得る。例えば、レシチンなどの被覆を用いることによって、分散液のケースでは所要の粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多くのケースでは、組成物内に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物内に、吸収を遅らせる作用物質、例えばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを含めることによってもたらされ得る。
【００４１】
無菌の注射用溶液は、所要の量の化合物を、上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒に組み込み、必要に応じて、その後に濾過滅菌を行うことによって、調製することができる。一般に、分散液は、化合物を、基礎となる分散媒質および上記に列挙した他の成分のうち所要のもの含有する無菌媒体内に組み込むことによって、調製される。無菌の注射用溶液を調製するための無菌粉末のケースでは、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分とあらゆるさらなる所望の成分との粉末が、先に滅菌濾過されたその溶液からもたらされる。
【００４２】
経口組成物には一般に、不活性の希釈剤または食用の担体が含まれる。経口的な治療的投与の目的では、化合物は、賦形剤と組み合わせることができ、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態で用いることができる。経口組成物はまた、マウスウォッシュとして用いるために、流体担体を用いて調製することができる。薬学的に適合した結合作用物質、および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、微結晶性セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチンなどの結合剤、デンプンもしくは乳糖などの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤、マグネシウムステアレートもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、ショ糖もしくはサッカリンなどの甘味料、またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの香料という成分または類似の性質を有する化合物のいずれかを含有し得る。
【００４３】
吸入による投与のためには、組成物は、適切な推進剤、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧された容器もしくはディスペンサー、または噴霧器から、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【００４４】
全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段によるものであり得る。経粘膜投与または経皮投与のためには、透過するべき障壁に適した浸透剤が、製剤において用いられる。このような浸透剤は、当技術分野において一般に公知であり、例えば、経粘膜投与では、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔内スプレーまたは坐剤を用いることで達成することができる。経皮投与では、化合物は、当技術分野において一般に公知であるような軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリームに製剤される。
【００４５】
本発明の組成物はまた、直腸送達のために、坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を伴った）または停留浣腸の形態で調製することができる。
【００４６】
１つの実施形態では、組成物は、インプラントおよびマイクロカプセル化された送達系を含む制御放出製剤などの、身体からの迅速な排出から化合物を保護する担体と共に調製される。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解可能な、生体適合性ポリマーを用いることができる。このような製剤を調製するための方法は、当業者には明らかである。材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液（感染細胞に標的化されたリポソームとウイルス抗原に対するモノクローナル抗体とを含む）もまた、薬学的に許容される担体として用いることができる。
【００４７】
投与を容易にするため、および投薬の均一性のために、経口組成物または非経口組成物を投薬単位形態で製剤することが有利である。本明細書において用いられる「投薬単位形態」は、治療すべき被験体への単位投薬として適した、物理的に個別の単位を言う。各単位は、所要の医薬用担体を伴って、所望の治療効果をもたらすように計算された、所定の量の活性化合物を含有する。
【００４８】
本発明の組成物は、投与のための指示と共に容器、パック、またはディスペンサーに含めて、包装された製品とすることができる。他の活性化合物もまた、組成物内に組み込むことができる。
【００４９】
本発明のさらなる態様は、正常な試料と比較して増大しているかもしくは低下しているＯＦＡ／ｉＬＲＰのエピトープ発現、ならびに／または、エピトープの発現を普段は欠いている組織（複数可）および／もしくは細胞（複数可）における発現の存在などの不適切な発現に関連する、疾患、障害、または症状を検出、診断、およびモニタリングするために、本発明の抗体およびポリペプチドを使用する方法を提供する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本方法は、癌またはＯＦＡ／ｉＬＲＰに関連するあらゆる疾患を有していることが疑われる被験体から得られた試料においてエピトープ発現を検出するステップを含む。好ましくは、この検出方法は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのエピトープ領域への抗体の結合を可能にする条件下で、試料と本発明の抗体またはポリペプチドとを接触させるステップ、および、結合のレベルが対照試料または比較試料のレベルと異なるかどうかを決定するステップを含む。本方法はまた、本明細書において記載される抗体またはポリペプチドが患者にとって適切な治療であるかどうかを決定するために有用である。
【００５１】
診断の目的では、抗体を含むポリペプチドは、限定はしないが、当技術分野において公知の放射性同位体、蛍光標識、および様々な酵素−基質標識を含む、検出可能な部分で標識することができる。標識を抗体に結合体化させる方法は、当技術分野において公知である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体を含むポリペプチドは、標識されている必要はなく、その存在は、本発明の抗体に結合する標識された抗体を用いて検出することができる。
【００５３】
本発明の抗体は、競合的結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどの、あらゆる公知のアッセイ方法において採用することができる。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７〜１５８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９８７年）。
【００５４】
抗体およびポリペプチドはまた、ｉｎ ｖｉｖｏでのイメージングなどの、ｉｎ ｖｉｖｏでの診断アッセイに用いることができる。一般に、抗体またはポリペプチドは、放射性核種（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、または３Ｈなど）で標識され、その結果、目的の細胞または組織を、免疫シンチグラフィーを用いて位置決定することができる。
【００５５】
抗体はまた、当技術分野において周知の技術を用いる、病理学における染色試薬として用いることができる。
【００５６】
本発明を、以下の詳細な実施形態および実施例を参照することによって、さらに説明する。これらの実施形態および実施例は、例示のみを目的として提供されるものであり、本明細書において記載される本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【００５７】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰの特異的領域に対する抗体の開発
ＯＦＡ／ｉＬＲＰの一連の異なる推定エピトープ領域に対する異なるペプチドの領域を用いて、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して抗体を作製する。表１は、このようなペプチドのリストを示す。ペプチドは、標準的なプロトコールに従って、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合体化される［３７〜３９］。ＫＬＨ−ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドを用いて、標準的なプロトコールに従って、マウスを免疫化する［３７、３９］。ＫＬＨ−ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドに対する３回目の免疫化の後、マウス尾部の出血から単離された血清を、標準的なプロトコールを用いて間接ＥＬＩＳＡ技術を用いて、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合体化したＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドに対してスクリーニングする（図１および表１）。簡潔に述べると、ＯＦＡ／ｉＬＲＰをＮｕｎｃ Ｓｔａｒ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｐプレート上に、４℃で一晩被覆した。プレートを洗浄し、水で３回ブロックした。尾部の出血を介して得られたマウス血清を、ＢＳＡを有するＰＢＳ−ｔ内に希釈し、室温で１時間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、ビオチン化した二次抗体を用いて、標準的な方法を用いて、抗体抗原相互作用を検出した（図１Ａ〜Ｂ）。吸光度を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＴＸ ８８０で、Ａ６２０で読み取り、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈ ５を用いてグラフにした（図１Ｃ）。バーは、免疫化ペプチド当たりの、２頭の動物からの２つの独立した実験の平均を示す。陽性対照は、ＢＳＡおよびＢＳＡ抗体で被覆した。陰性対照は、タンパク質の被覆を有していなかった。
【００５８】
ペプチドのスクリーニングに加えて、標準的なプロトコールを用いて単離されたＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して、尾部の出血を試験する［１〜３、５、２６、２９、３０］。簡潔に述べると、完全長のＯＦＡ／ｉＬＲＰを、Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｔａｒ ＭａｘｉＳｏｒｐプレート上に被覆し、３７℃で２時間にわたり、アジ化ナトリウムを有するＰＢＳ内に５μｇ／ｍｌまで希釈する。プレートを１８．２メガオームの水で３回洗浄し、５％乾燥乳粉末を有するＰＢＳ−ｔを用いて、２５℃で１時間にわたりブロックする。プレートをＰＢＳ−ｔで３回洗浄する。尾部の出血から得られた血清を、ブロック緩衝液（上記）内に希釈し、４℃で一晩インキュベートする。プレートを、上記のＰＢＳ−ｔを用いて洗浄する。抗体−抗原複合体を、ビオチンヤギ抗マウス抗体を用いて検出し、ブロック緩衝液内に希釈し、２５℃で１時間にわたりインキュベートする。プレートをＰＢＳ−ｔを用いて３回洗浄する。二次抗体を、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いて検出し、ブロック緩衝液内に希釈し、２５℃で３０分間にわたりインキュベートする。プレートを上記のように洗浄する。最終的な検出ステップは、Ｓｉｇｍａ ＦＡＳＴ（商標）ＯＰＤシステムを用いる標準的なプロトコールに従い、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３８４で読み取る。
【００５９】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰを検出するための抗体−サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて用いられる抗体
ＯＦＡ／ｉＬＲＰのＲＮＡおよびタンパク質の発現は、より侵攻性の形態の癌に関連している［２、３、５、６、８、１０、１３、１５〜１７、２０、２１、２３、２５、２６、２９、４０］。しかし、タンパク質の作用は、６７ｋＤａの形態および免疫組織化学に主に集中している。本発明の目的の１つは、異なる領域に対して設計された２つのＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体を用いる、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡを開発することである。ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な捕捉抗体用いて、存在する３７ｋＤａのＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を定量することができ、この領域外の捕捉抗体を用いて、存在する全ＯＦＡ／ｉＬＲＰを定量することができる。
【００６０】
簡潔に述べると、抗体−サンドイッチＥＬＩＳＡは、以下の標準的な技術に従う。捕捉抗体を、Ｎｕｎｃ Ｓｔａｒ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂプレート（または類似のもの）上に被覆し、それを次に、炭酸塩緩衝液内で、ＦＲＥＰＲＬＬＶＶＴＤＲＡＤＨＱＰＬＴペプチドに対する様々な異なる濃度の捕捉抗体で被覆し、４℃で一晩インキュベートする。捕捉抗体および検出抗体の最適な濃度は、「ｃｒｉｓｓ−ｃｒｏｓｓ」希釈法を用いて決定する［３９］。プレートを水で３回洗浄し、ＰＢＳ−ｔで３回洗浄する。洗浄したら、プレートを、標準的なブロック緩衝液を用いて、１時間にわたりブロックする。ブロックされたプレートをＰＢＳ−ｔで３回洗浄する。可溶性タンパク質の溶解物を、標準的なブロック緩衝液で試験し、ＯＦＡ／ｉＬＲＰを、室温で１時間から４℃で一晩、インキュベートする。最初のインキュベーションが完了したら、プレートをＰＢＳ−ｔで３回洗浄する。ＯＦＡ／ｉＬＲＰと捕捉抗体との相互作用を検出するために、二次抗体／検出抗体をブロック緩衝液内に希釈し、少なくとも１時間にわたり室温でインキュベートする。プレートをＰＢＳ−ｔを用いて３回洗浄する。検出抗体をビオチンに結合体化させる（または他の方法）。ビオチン結合体を、ストレプトアビジン／ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）または同等物で検出する。ストレプトアビジンを、適切なブロック内に希釈し、室温で３０分間にわたりインキュベートする。プレートを洗浄し、ストレプトアビジンに対するＨＲＰの酵素的結合体を、標準的なプロトコールに従って、ＳＩＧＭＡ ＦＡＳＴ（商標）ＯＰＤシステムを用いて検出する。存在するＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３８４または同等物で読み取る。検量線当てはめ法に従って、精製ＯＦＡ／ｉＬＲＰから作成された検量線を用いてＯＦＡ／ｉＬＲＰの濃度を逆算し、希釈因子を乗じる［３７］。非特異的な捕捉抗体を用い、その後、モノマー領域に対する検出抗体を用いることによって、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのモノマー形態を検出することも可能である。二量化領域外の領域に対する捕捉抗体と検出抗体との組み合わせを用いて、生体液または組織溶解物内に存在するＯＦＡ／ｉＬＲＰの総量を決定することができる。
【００６１】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰの固有の二量体形態を検出するために、標準的なＥＬＩＳＡを上記のように用いる。しかし、モノマー領域に対して発生した抗体を用いる代わりに、用いられる抗体はこの領域外のものであるが、上記で用いられる検出抗体から十分な距離を有するため、適切な結合が可能となる。６７ｋＤａのＯＦＡ／ｉＬＲＰを、以下の標準的なプロトコールに従って精製する［２、３、２６、２９］。サイズは、固有のゲル電気泳動またはサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、上記のように検証する。二量体を捕捉するための、ＦＲＥＰＲＬＬＶＶＴＤＲＡＤＨＱＰＬＴとは異なるエピトープに対する捕捉抗体を用いて、標準的なＥＬＩＳＡを行い、次に、モノマーの検出において用いられるビオチン化検出抗体を用いる。ＥＬＩＳＡは、標準的なプロトコールに従って行う［３９］。これによって、生体液および組織溶解物内に存在する二量体ＯＦＡ／ｉＬＲＰの量が決定される。性質、転移量、および他の臨床的に関連する情報についてのさらなる情報は、全ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対するモノマーＯＦＡ／ｉＬＲＰの比率によって得ることができる。
【００６２】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰの免疫組織化学的検出
上記に列挙した抗体を、癌および癌の可能性をｉｎ ｓｉｔｕで検出する方法としての免疫組織化学（ＩＨＣ）に用いることができる。類似の技術が、癌を同定するために用いられているが、それらは、６７ｋＤａのタンパク質を検出する［５、１７、４１］。ＩＨＣ法は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの検出にカスタマイズされている標準的なプロトコールに従う。プロトコールは、以下に列挙するものに類似している。
【００６３】
切断した組織を、キシレンなどの、組織の組織学的分析のための標準的なプロトコールに従って脱パラフィン化し、その後、エタノールの濃度を低下させ、少なくともＩ型のラボウォーター内に入れる。抗原の賦活化は、ｐＨ６．０に調整した０．０１Ｍのクエン酸緩衝液内での熱誘導型エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）を用いて、標準的なプロトコールに従う。エピトープ（複数可）は、直接的な加熱方法（ホットプレート）または間接的な加熱方法（マイクロ波）を用いて賦活化することができる［３７］。簡潔に述べると、脱パラフィン化した組織切片をスライドホルダー内に置き、９０℃超のクエン酸緩衝液で満たした染色皿内に置く。組織を加熱し、約１０分間にわたり９０℃超を維持する。処理時間は、組織のタイプ、組織の厚さ、および様々な他の因子に依存する。適切に処理したら、組織を、標準的な方法に従って、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−ｔ）内で３回洗浄する。組織を、湿潤チャンバ内で、標準的なＩＨＣブロック緩衝液（ＢＳＡまたは非特異的な抗体／タンパク質相互作用を減少させるために用いる他の試薬を有するＰＢＳ−ｔ）と共に、室温でインキュベートする。スライドをＰＢＳ−ｔ内で３回洗浄する。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体を、ＢＳＡまたは同等物を有するＰＢＳ−ｔ内に適切に希釈し、処理した組織と共にインキュベートする。スライドを上記のように洗浄する（３×ＰＢＳ−ｔ）。組織を、ビオチン化されたユニバーサル二次抗体（または同等物）と共にインキュベートして、ストレプトアビジンに基づいた系を用いる検出を可能にする。スライドを上記のように洗浄し、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ｜Ａｂ｜２°抗体複合体を、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ、フルオロフォア、放射性核種、または他の検出方法のいずれかに結合体化した標準的なストレプトアビジンを用いて検出する［３７、３９、４２］。組織を、標準的なプロトコールに従って可視化する。
【００６４】
蛍光偏光の定量のためのＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体の使用
抗体を、存在するＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を決定するための蛍光偏光（ＦＰ）実験のために用いることができる。さらに、モノマーのＦＰと二量体のＦＰとの比率も可能であり得る。ＦＰはまた、細胞表面上のＯＦＡ／ｉＬＲＰの可動性を決定するためにも用いることができる。蛍光偏光実験における抗体の使用の決定は、これまでの研究に基づくが、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの定量のために特異的に開発されている［４３〜４９］。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体の使用を決定するために、モノクローナル抗体を標準的なフルオロフォアに結合体化させ、標識された抗体を、ＳＭ−２バイオビーズプロトコールに従って、遊離標識から取り除くことができる［５０］。精製したら、タンパク質の濃度および蛍光の取り込みを、フルオロフォアに対するタンパク質の比率として決定することができる。結合体化したら、抗体を適切に保存し、後に使用することができる。
【００６５】
ＦＰ実験において用いる抗体の能力を試験するために、抗体を、ＥＬＩＳＡ技術に一般に用いられる抗体濃度の決定に類似の適切な量と混合することができる［３９］。簡潔に述べると、一方の軸に沿ってはＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質の量で、および他方の軸に沿っては標識された抗体の量での、二倍希釈を有する、蛍光のために設計された９６ウェルプレートを用いる。希釈は、標準的なＦＰ緩衝液で行い、非特異的な結合を防ぐための様々な異なる添加物を含有し得る。原型的な緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水、ＮＰ４０、ウシ血清アルブミン、ウシガンマグロブリン、グリセロール、またはバックグラウンドのノイズを減少させ特異性を増大させるための他の作用物質を含有し得る。混合したら、プレートをＢｅｃｋｍａｎ ＤＴＸ ８８０内に置き、含まれるＦＰ（フルオロセイン）フィルターを用いて、用いるフルオロフォアに応じて、ウェル当たり約１秒またはその他の読み取り時間にセットする。偏光値を、ｍＰ＝［（Ｉｓ−ＩｓＢ）−（Ｉｐ−ＩｐＢ］／［（Ｉｓ−ＩｓＢ）＋（Ｉｐ−ＩｐＢ）］×１０００という方程式を用いて計算されるミリ偏光単位（ｍＰ）で測定する［４７〜４９］。最初の実験では、抗体およびＯＦＡ／ｉＬＲＰの濃度に基づいた用量応答曲線が作成される。その後、過剰な未標識抗体を競合物質として用いて、特異性および平衡を決定することができる。さらに、これから生じたデータを用いて、結合分析プロット（すなわち、スキャッチャードプロットまたは類似のもの）を逆算することができ、次にそれを抗体の有効性を決定する方法として用いることができる。最初の条件が決定されたら、ＦＰ法を用いて、異なる生体液および組織溶解物内に存在するＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を計算することができる。
【００６６】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性細胞を単離／分離するため、または血液内のＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞量を決定するための、フローサイトメトリー分析における使用
循環性の血液型の癌の総癌量を決定するために、または、転移量を決定するために、フローサイトメトリーを用いることができる。簡潔に述べると、細胞懸濁液または末梢血を得る。細胞懸濁液を３００×ｇで８から１０分間遠心分離し、上清を取り除く。細胞をフローサイトメトリー染色緩衝液（フェノールレッド、０．１％アジ化ナトリウム、および１％ウシ血清アルブミンを有さないＨＢＢＳ）内で１回洗浄し、丸底の９６ウェルプレートまたは同等物の底に、細胞懸濁液１ｍｌまたは５０から１００μｌ当たり約２×１０７個の細胞で再懸濁する。細胞懸濁液に、染色緩衝液に希釈した、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）または同等物で標識したＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体を添加する。バックグラウンドのための対照として、抗体を全く用いずに、未標識のアイソタイプ対照抗体または同等物を用いて（過剰な未標識抗体または競合ペプチド）、細胞を試験する。細胞懸濁液および適切に希釈された抗体を、穏やかに混合しながら、氷上または４℃で、２０から６０分間にわたりインキュベートする。染色された細胞懸濁液を１００μｌの染色緩衝液で３回洗浄し、３００から５００×ｇで３から１０分間遠心分離する。最後の洗浄の後、細胞を約４００μｌの染色緩衝液内に懸濁し、分析するまで、４℃で蓋をして、暗所で保存する。さらなるステップは、死滅細胞を検出するためのヨウ化プロピジウムでの対比染色、または固定ステップの追加を含み得る。製造者の指示に従って、データを回収し、標準的なプロトコールに従って分析する［３０、３９、５１］。ＦＩＴＣの直接的な結合体化、またはビオチン／ストレプトアビジン−ＦＩＴＣを用いる検出を用いて、末梢血、細胞懸濁液、または他の由来源におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性細胞の数を検出し得ることが予想される。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性細胞の総数によって、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性疾患の侵攻性および／または進行についての洞察を得ることができる。
【００６７】
この方法の代替的適用もまた、センチネルリンパ節の分析を介して乳癌の転移量を決定するために用いることができる。簡潔に述べると、センチネルリンパ節（または初期癌病巣に近いあらゆるリンパ節）を、標準的なプロトコールに従って、５ｍｌの染色緩衝液内で穏やかに崩壊させる。細胞のスラリーを、１００μｍのメッシュを通して濾過し、上記のように約２回洗浄する。得られた細胞懸得濁液を用いて、局所的な転移を定量する。
【００６８】
抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰまたはＯＦＡ／ｉＬＲＰに結合した他のタンパク質を除去し得る
ＦＲＥＰＲＬＬＶＶＴＤＲＡＤＨＱＰＬＴ抗体の位置および設計によって、タンパク質が、相互作用しているＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質を除去し得る可能性が出てくる。さらに、他の領域に対して設計された抗体を用いて、相互作用しているタンパク質を除去するかまたは前記タンパク質の結合を防ぐことができる。最初の方法は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのホモ二量体的な相互作用の除去または予防に焦点を合わせたものである。
【００６９】
抗体が、相互作用しているＯＦＡ／ｉＬＲＰ分子を除去し得るという可能性を試験するために、２つの個別の実験を行う。まず、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ二量体を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量体形態を精製する標準的なプロトコールに従って精製する。タンパク質の二量体形態を、濃度を増大させていった、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する抗体と共にインキュベートする。標準的な抗体結合緩衝液（ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎ−２０、ＢＳＡ、ＢＧＧ、または他の添加物を含有するＰＢＳ）内で、３７℃で１時間インキュベートした後、抗体による、二量体形態からモノマー形態への変換を、標準的なプロトコールに従って、非変性ポリアクリルアミドゲル上をランさせることによって決定する［３７、３８］。
【００７０】
用い得る第２の方法は、分子サイズに応じた、蛍光偏光における推定される変化を活用するものである。二量体の存在下では、主ＦＰは、抗体の回転のみに由来する。抗体が二量体を除去すると、モノマーへのシフトが生じ、蛍光偏光は変化する。
【００７１】
近接に起因する発光スペクトルを消失させるかまたは変化させるために、フルオロフォアをさらに用いることができる。２つ以上の抗体を用いて発光スペクトルを変化させることができるか、または、消失を用いてＯＦＡ／ｉＬＲＰ分子の状態および／もしくは安定性を決定することができる。
【００７２】
抗体を癌治療として用いる
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ配列を標的化するように設計された抗体を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性疾患のための治療または考えられる予防の形態として用いることができる。例えば、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を予防または治療するための試験は、標準的な細胞系を用いて、類似の動物モデルを用いて行うことができる。癌のＯＦＡ／ｉＬＲＰの予防について試験するために、抗体を、癌のチャレンジの前に齧歯動物（マウスまたはラット）に注射することができる。治療について試験するために、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体を癌のチャレンジの後に注射することができる。癌のチャレンジは、いくつかは接着性であり、いくつかは非接着性である、様々な異なる公知の癌性細胞系である。細胞を成長させ、齧歯動物モデル系に導入する。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞の量は、様々な異なる方法を介して定量することができる。さらに、尾部の静脈を介して注射された接着細胞では、肺のコロニー形成が増大する。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体の治療および／予防能力は、未治療の動物に対する、治療された肺に存在する癌細胞の数によって計算することができる。さらなる対照は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体と同一のスケジュールでの、非特異的アイソタイプ対照抗体の注射であり得る。さらに、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体は、現在の癌治療法を補強する。考えられるアレルギー反応を減少させるために、ヒトにおいて用いる前に、標準的なプロトコールに従って、抗体をクローニングおよびヒト化することができる。
【００７３】
抗体は、生物学的機能を改変させ、ＯＦＡ／ｉＬＲＰを発現する関連する疾患により生じる、改変した効果をもたらし得る
抗体は、全体的な浸潤性または標準化された基質への結合能力を改変させ得る。標準的な細胞系を、標準的なプロトコールに従って試験することができる。哺乳動物細胞および非哺乳動物細胞に対する、考えられる薬理学的影響を決定するために行われる１つの試験は、成長速度、例えば様々な異なる濃度のペプチドの存在下および不存在下での細胞の成長に対する効果と、アポトーシス、壊死、および細胞増殖に対する影響を測定することである。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞は、様々な用量のペプチドを伴う様々な異なる基底膜上で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長し得る。ペプチドの効果は、標準的な方法に従って、限定はしないが、ＤＮＡラダー、細胞死検出ＥＬＩＳＡ、カスパーゼ測定、ＴＵＮＥＬアッセイ、アネキシン−Ｖ膜改変、ＤＮＡ染色、ＦＡＳ、ｐ５３、細胞傷害性アッセイ、細胞増殖、および細胞の生存能力を含む、様々な異なる方法によって測定することができる。
【００７４】
ペプチドは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞の浸潤性を増大または減少させる能力を有し得る。これは、他のタンパク質を伴ういくつかの研究に類似した［５２〜５５］、変更されたボイデンチャンバーを用いて、様々な異なる濃度のペプチドの存在下または不存在下でＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性細胞を成長させることによって測定することができる。ペプチドはまた、細胞の接着に影響し得、標準的な方法を用いて測定され得る。接着性の培養されたＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞を、異なる細胞外マトリクスタンパク質（ＥＣＭ）の存在下で、ペプチドと共に培養する。細胞を次に、ペプチドの存在下での細胞系の相対的な付着を決定するための標準的な方法に従ってアッセイする［５６〜５９］。いくつかの他の一般に用いられる技術を、細胞の生存能力、増殖、細胞の死滅、およびアポトーシスに対するＯＦＡ／ｉＬＲＰの影響を決定するために適用することができる［３７〜３９、４２］。
【００７５】
抗体をコロイドに連結させて、抗癌活性を持たせるか、または、ｉｎ ｖｉｖｏでの癌マーカーを提供する
抗体は、様々な異なるコロイドに付着または架橋し得る。例えば、金コロイドまたは銀コロイドを用いて、共鳴光散乱または代替的方法を介して、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性細胞を同定することができる。コロイドのさらなる使用には、酸素フリーラジカルまたは類似物が含まれ得る。抗体に連結したコロイド剤は、可能性を増大させ、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞は、フリーラジカルに曝露される。
【００７６】
抗体を、Ｘ線不透過性の染料、またはＸ線と共に用いるための類似のタイプの結合体に連結させる
抗体を、放射線不透過性の染料または類似物に結合体化する［６０］。癌性状態を初期におよび正確に検出する能力は、患者の治療の選択に役立つ。抗体を放射線不透過性の染料または同等物に結合体化して、現在のｘ線に基づいた技術の有効性を増大させることが可能である。さらに、抗体を、ＭＲＩによって検出される特異的な共鳴周波数に「同調」し得る分子に連結させることができる。考えられる結合体には、限定はしないが、蛍光染料への結合体化に用いられるものに類似の抗体に付着し得る、化学的に反応性のガドリニウムに基づいた系が含まれる。一般に用いられる技術は、抗体上に見られる第１級アミンと反応するテトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル部分の付加である。未反応のＴＦＰガドリニウムは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて取り除くことができる。ヒトにおいて臨床的に用いるために、抗体はヒト化されている必要があり得る。上記に記載される方法は、標準的なプロトコールに従う。
【００７７】
概念の証拠として、活性な免疫系を有する動物モデルは必要なく、このことによって、標準的な技術の使用が可能となる［６１］。最初の研究は、ｘ線を用いる必要はないが、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体の、ｉｎ ｖｉｖｏで結合する能力を実証する必要がある。抗体または同等物は、フルオロフォア、コロイド、酵素結合体、または容易に検出され得る他の方法に結合体化する。結合体化した抗体は、様々な異なる用量で、また規定された時点で、動物に注射され、誘発された腫瘍は、抗体の結合を探すために試料採取され得る。この結合は、これを用いて診断イメージングのために腫瘍を標的化し得ることを示し得る。さらなる方法には、抗体への共有結合による連結のためにエポキシシラン誘導体または類似物で被覆され得る、金ナノ粒子の使用が含まれる［６２］。
【００７８】
抗体を化学療法剤に連結させて、および化学療法剤と結合体化させて、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞に対するものとする
従来の化学療法に関連する副作用の数を減少させるために、標的化されたアプローチを採用することができる。抗癌薬のための標的化作用物質としてＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体を用いることによって、現在の治療法の安全性および効力が増大し得る。この効率を試験する方法として、かつ概念の証拠として、抗体を、リポソーム型の系に組み込むことができ、ここで、リポソームは、化学療法剤を含有する。標的化の能力を示すために、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ細胞、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ癌細胞の混合物、および正常なヒト細胞を、細胞培養プレート内で混合することができる。混合物を添加し、類似の用量の化学療法剤、またはアイソタイプ対照抗体が組み込まれたリポソームでの細胞の治療と比較することができる。標的アプローチは、正常細胞に対する大きな影響を伴うことなく、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性細胞の高い死亡率をもたらすことが予想される。この効果は、様々な異なる標準的な技術を介して決定することができる。標準的な化学療法剤を用いることができる一方で、別の技術は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体への放射性分子の付着を用いることができる。例えば、抗体は、標準的なプロトコールに従ってヨウ素化される。
【００７９】
化学療法剤に直接的に連結させること、抗体作用物質を有するリポソーム、または化学療法剤に浸したポリアクリルアミド／アガロースビーズを生じさせることに加え、抗体を代替的送達方法に付着させることができる。カーボンナノチューブ、または化学療法剤を坦持し得る同等物を用いることが可能であり得る。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性細胞と相互作用させると、シグナルが生じて、ナノチューブが共鳴し、含有される抗癌剤が放出され得る。引き金は、様々な異なる方法であり得る。抗体は、ナノカーボン、ナノゴールド、ならびに他のナノチューブおよびナノ作用物質に連結させることができ、およびそれと結合体化させることができ、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞を標的化するために、マイクロエレクトロ／電波感受性装置または類似の装置に供することができる。抗体と抗癌剤との間で直接的に連結すると、反応性のリンカー分子は、標的化されて、抗癌剤を放出する。この例は、ＵＶまたはｘ線により切断可能な、抗体と抗癌剤との間のリンカーであり得る。ｘ線（放射線療法）の存在下では、リンカーは切断され、抗癌剤を放出し得る。別の方法は、腫瘍の微小環境にあるときに切断されるプロテアーゼ切断部位を有するペプチドリンカーを用いる。
【００８０】
抗体を、標的細胞の生物学的機能を改変する他のタンパク質に連結することができ、かつ前記タンパク質と結合体化させることができる
抗体は、特定のタイプの免疫応答のみを指示し得る。ＤＮＡワクチン接種をもたらすための、２つの異なる配列の融合が、以前に用いられている［６３］。この分子は、腫瘍または周辺領域を調節し得る生物学的に活性な配列に融合された、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体結合領域のハイブリッドである。１対の可能性は、ヒト化ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体の活性領域をクローニングすることと、それを免疫系の調節因子、細胞周期の調節因子、またはアポトーシスを誘発するタンパク質配列に融合することである。非特異的な事象を予防するためには、タンパク質を操作して、腫瘍の微小環境内になるまで不活性であり続けるようにする。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体は、プロテアーゼ切断部位のリンカーに融合され、それは次に、アポトーシスを誘発するペプチドまたは小分子に付着して、腫瘍に対する免疫応答を誘発する。２つの異なる分子の融合によって、癌細胞に対する増大した特異性を伴って標的化され得る多価抗体が可能になり得る。
【００８１】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体とマイクロエレクトロ流体装置または同等の装置との使用を、診断的に、または現在行われているスクリーニング方法として用いる
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体または活性領域を、マイクロエレクトロ流体装置上に被覆して、血流におけるリアルタイムなＯＦＡ／ｉＬＲＰの発現を測定する。装置は、癌を確認するためのモニタリング装置として機能するように、内蔵型である。抗体は、フィルムまたは他のマイクロ装置上に被覆されて、癌の検出を可能にする。１対の方法に基づいて、結合した量を決定することが可能である。まず、抗体を、規定された流量を通す分子カンチレバー上に被覆することができる。抗原と抗体との間のリアルタイムでの相互作用が生じると、被覆されたレバー上のトルクが増大する。これが次に、抵抗の変化または電荷の誘発を介して測定され得る。類似の技術を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体で被覆された薄いフィルムと共に用いることができ、抗原が結合すると、フィルム上の電荷または相互作用または電圧の変化を測定し、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの発現の変化と相関させることができる。これらの技術はＯＦＡ／ｉＬＲＰに限定されないが、あらゆる癌分子をマイクロ移植型装置として用いることができ、前記装置は、臨床医によって必要に応じて読み取られて、臨床医に、再発または転移性の疾患の進行を警告し得る。
【００８２】
腫瘍の切除において医師を支援するための、放射能、蛍光、または同等の分子に付着したＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体の使用
癌の切除の際に外科医を支援するものとして、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体の使用をフルオロフォア、放射性マーカー、染料、または同等物に組み合わせて、外科医が癌性の成長を容易に同定することを可能にする。さらに、この技術は、転移性の疾患を含有し得るリンパ節を迅速に同定するために用いることができ、例えば、現行の放射能などの、同定を可能にするための適切な結合体に連結した抗癌抗体が、センチネルリンパ節の生検に用いられる。注射した後、患者を、通常通りの手順で手術する。しかし、癌の発見またはリンパ節の検査が困難であれば、ガイガーカウンター、ＵＶ、または癌性領域の迅速な同定を可能にする他の光源を用いることができる。癌は、適切な外科治療を用いて切除される。この方法は、癌の同定／切除において非常に役立ち得る。
【００８３】
免疫沈降のための抗体の使用
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体は、新規な治療標的を同定するための免疫沈降に用いられる。細胞溶解物を、標準的なプロトコールに従って免疫沈降させる［３７、３９］。得られたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、２ｄゲル電気泳動、質量分析、または他の方法で分析することができる。得られた情報は、臨床的な診断または治療に用いることができる、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに関連する考えられるメカニズムについての洞察をもたらし得る。
【００８４】
以下の実施例は、限定はしないが本発明の範囲を例示することを意図したものである。このような実施例は、用いられ得るものの典型であるが、当業者に公知の他の手順を代わりに用いることができる。実際、当業者であれば、必要以上の実験を行うことなく、本明細書における教示に基づいて、さらなる実施形態を容易に想像し、もたらすことができる。
【実施例】
【００８５】
（実施例１）
ＯＦＡ／ｉＬＲＰモノクローナル抗体２Ｃ６および３Ｇ７を作製する方法
ＯＦＡ／ｉＬＲＰモノクローナル抗体２Ｃ６および３Ｇ７を、標準的な方法およびプロトコールを用いて、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙで作製した。ＦＲＥＰＲＬＬＶＶＴＤＰＲＣのペプチドを用いて、モノクローナル抗体３Ｇ７を生成させた。ＹＲＤＰＥＥＩＥＫＥＥＱＣのペプチドを用いて、モノクローナル抗体２Ｃ６を生成させた。
【００８６】
合成されたペプチドを、標準的なプロトコールを用いて、マレイミドで活性化したＫＬＨに結合体化した（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、Ｒｏｃｋｆｏｒｋ、ＩＬ）。結合体化したら、ＫＬＨ−ＯＦＡペプチドを用いて、ペプチド当たり２頭の異なるマウスを免疫化した。免疫化した後、尾部の出血を介して血清を得、血清を用いて、ＢＳＡ結合体ペプチドに対する抗体力価についてスクリーニングした（図１）。ペプチドに対して陽性であれば、組換えヒトＯＦＡ／ｉＬＲＰを用いて間接ＥＬＩＳＡを行って、抗体がタンパク質と反応することを検証した。これは、抗体が小ペプチドおよび完全長タンパク質に対して反応することを確実にするために行った。ペプチドおよびタンパク質に対する反応性を検証した後、脾臓細胞を骨髄腫細胞系と融合し、９６ウェル培養プレート内で選択した。生存能力を有するコロニーを生きたまま維持し、次に、ペプチドおよびＯＦＡ／ｉＬＲＰに対してスクリーニングした（上記に類似）。ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して高い活性を有するがＢＳＡで被覆したウェルに対しては高い活性を有していない、ハイブリドーマ組織培養物の上清を、免疫グロブリンの分類（ＩｇＧまたはＩｇＭ）のために選択した。ＩｇＭであったあらゆるクローンをスクリーニングから排除し、ＩｇＧを産生するハイブリドーマを、標準的なプロトコールに従って成長させた。培地から抗体をさらに精製するために、タンパク質Ｇの選択を、標準的なプロトコールに従って行った（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）。溶出した抗体の濃度を、Ａ２６０の吸光度を用いて決定し、これを２Ｃ６抗体および３Ｇ７抗体の産生のために用いた。
【００８７】
（実施例２）
ｒＨｕ ＯＦＡに対する活性についての尾部出血の分析
この研究において、組換え完全長ヒトＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する活性を分析した。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、アジ化ナトリウムを有するＰＢＳ内の１０μｇ／ｍｌの濃度のＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質で被覆した。プレートを３７℃で２時間にわたりインキュベートした。プレートを水で３回洗浄し、次に、ＰＢＳ−ｔ内で、５％脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）で少なくとも１時間にわたりブロックした。プレートをＰＢＳ−ｔで３回洗浄し、尾部出血および陽性対照を５％ＮＦＤＭに添加した。プレートを、振とうしながら、４℃で一晩インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、５％ＮＦＤＭ内に１：１００で希釈したユニバーサル二次抗体内で、室温で１時間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：２００ Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に室温で３０分間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、２００μｌのＳＩＧＭＡ ＦＡＳＴ（商標）ＯＰＤを各ウェルに添加した。反応についてプレートを観察し、５０μｌの停止液（２ｎのＨ２ＳＯ４）でプレートを停止させたが、低いバックグラウンドは依然として存在した。塩基性の終点ＥＬＩＳＡ ｗ／ＯＰＤおよび酸性停止液のための機器上で、標準的なプロトコールに従って、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３８４でプレートを読み取り、分析した。
【００８８】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して設計された免疫化ペプチドの全て（表２）は、組換え完全長ＯＦＡタンパク質と反応し得る尾部出血血清を産生した。Ｃｏｇｇｉｎ博士、Ｒｏｈｒｅｒ博士、およびＢａｒｓｏｕｍ博士によって提供された、これまでに開発されたモノクローナル抗体（陽性対照）と比較すると、モノクローナル抗体が２ｍｇ／ｍｌを超える濃度であったにもかかわらず、尾部出血血清は、同様の、またはわずかに良好な結果を示した（図２）。この実験はさらに、患者および診断試料の抗体力価を決定するための、捕捉抗原としてのＯＦＡ／ｉＬＲＰの使用を実証する。
【００８９】
結果は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対するペプチド由来の抗体が、組換え完全長タンパク質を認識し得ることを示す。さらに、プレートへの組換え完全長ＯＦＡの被覆は、さらなる抗体の開発または抗ＯＦＡ免疫応答のモニタリングのためのスクリーニング方法として用いることができる。
【００９０】
（実施例３）
モノクローナル抗体の反応性を決定するためのｒＯＦＡ／ｉＬＲＰの間接ＥＬＩＳＡ
この研究において、組換えＯＦＡ／ｉＬＲＰへのＯＦＡ／ｉＬＲＰの特異的領域に対して設計されたモノクローナル抗体の免疫反応性を決定した。簡潔に述べると、Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ＨＢＸプレートを、ＰＢＳ内に２μｇ／ｍｌの濃度のＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質で被覆した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。プレートを水で３回洗浄し、次に、ＰＢＳ−ｔ内の１％ＢＳＡで少なくとも１時間にわたりブロックした。プレートをＰＢＳ−ｔで３回洗浄し、モノクローナル抗体の５倍希釈シリーズを、１：１０の高濃度および１：７８１２５０の低濃度で、８個のウェルに沿ってランさせた。プレートを、振とうしながら、４℃で一晩インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、１：５００００のビオチン化した抗マウスＩｇＧ二次抗体と共に１時間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：２５００００）と共に、室温で３０分間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ Ｔｗｏ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰマイクロウェル基質（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ）を各ウェルに添加した。反応についてプレートを観察し、５０μｌの停止液（２ｎのＨ２ＳＯ４）でプレートを停止させたが、低いバックグラウンドは依然として存在した。塩基性の終点ＥＬＩＳＡ ｗ／ＨＲＰおよびＴＭＢのための機器上で、標準的なプロトコールに従って、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘでプレートを読み取り、分析した。
【００９１】
図３の結果は、ｒＨｕ ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する間接ＥＬＩＳＡでのモノクローナル抗体２Ｃ６および３Ｇ７のランの希釈曲線を示す（ｎ＝４）。１：１０から開始し１：７８１２５０まで低下する５倍希釈物での８点の希釈シリーズは、ＯＦＡに対するモノクローナル２Ｃ６の強い反応があること、およびこのアッセイにおいて２Ｃ６抗体を用いると検出のダイナミックレンジが存在することを示す。
【００９２】
図３はまた、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する間接ＥＬＩＳＡでランされたモノクローナル抗体３Ｇ７の希釈曲線を示す。上記のものと同一の８点の希釈シリーズは、ＯＦＡに対するモノクローナル３Ｇ７の強い反応があること、およびこのアッセイにおいて３Ｇ７抗体を用いると検出のダイナミックレンジが存在することを示す（ｎ＝４）。
【００９３】
このデータは、これらのモノクローナル抗体（２Ｃ６および３Ｇ７）の両方が、完全長ＯＦＡ／ｉＬＲＰを認識し結合する能力を有することを示す。このデータは、操作された抗体を、広範な下流の診断試験に用い得る特異的様式でＯＦＡを検出するために用いることができることを実証する。これらはまた、様々な生体液において抗ＯＦＡ抗体の存在を探すための標準として用いることができる。
【００９４】
（実施例４）
モノクローナル抗体の反応性を決定するためのｒＯＦＡ／ｉＬＲＰのサンドイッチＥＬＩＳＡ
Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ＨＢＸプレートを、ＰＢＳ内に１０μｇ／ｍｌの濃度の２Ｃ６モノクローナル抗体で被覆した。プレートを室温で一晩インキュベートした。プレートを水で３回洗浄し、次に、ＰＢＳ−ｔ内の１％ＢＳＡで１時間にわたりブロックした。プレートをＰＢＳ−ｔで３回洗浄し、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの２倍希釈シリーズを、５０００ｎｇ／ｍｌの高濃度および７８．１２５ｎｇ／ｍｌの低濃度で、８個のウェルに沿ってランさせた。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ標準をＰＢＳ内の５％ＢＳＡ内で調製して、血清濃度をシミュレートした。プレートを、振とうしながら、室温で２時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、ビオチン化した３Ｇ７モノクローナル抗体と共に２時間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：２００）（Ｒ＆Ｄ）と共に、室温で３０分間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ Ｔｗｏ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰマイクロウェル基質（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ）を各ウェルに添加した。反応についてプレートを観察し、５０μｌの停止液（２ｎのＨ２ＳＯ４）でプレートを停止させたが、低いバックグラウンドは依然として存在した。塩基性の終点ＥＬＩＳＡ ｗ／ＨＲＰおよびＴＭＢのための機器上で、標準的なプロトコールに従って、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘで、４５０ｎｍでプレートを読み取り、分析した。
【００９５】
図４は、広範な濃度のＯＦＡ／ｉＬＲＰの検量線、および、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて本発明のモノクローナル抗体がそれを検出する能力を示す。このデータは、これらのモノクローナル抗体（２Ｃ６および３Ｇ７）の両方が、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検出され得る様式で完全長ＯＦＡ／ｉＬＲＰを認識し結合する能力を有することを示す。逆にすると（すなわち、３Ｇ７捕捉／２Ｃ６検出）、同様の結果が見られたが、反応の吸光度は、２Ｃ６を捕捉抗体として用いた場合よりも有意に低かった（データは示していない）。同様に、このデータは、操作された抗体を、広範な下流の診断試験に用い得る特異的様式でＯＦＡを検出するために用いることができることを実証する。このタイプのＥＬＩＳＡは、様々な生体液および組織溶解物においてＯＦＡ／ｉＬＲＰの存在を探すために用いることができる。さらに、この技術は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに基づいた治療法についての組み入れ基準／除外基準に適用することができるか、または、癌の診断として用いることができる。抗体は、タンパク質の保存領域に対して設計され、ＯＦＡ／ｉＬＲＰを発現する全ての種と交差反応する。
【００９６】
（実施例５）
ペプチド由来のモノクローナル抗体を用いた、癌胎児抗原未熟ラミニン受容体の蛍光偏光
この実験は、蛍光偏光におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰの２Ｃ６クローンの有用性を実証するものである。血清試料をシミュレートするために、全ての標準を、リン酸緩衝生理食塩水内の５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）内に希釈した。実験は、一部はＨＳＰ９０の研究に基づくものであったが、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｓｃｅｉｎｅ）−５−マレイミド標識抗体を、ＨＳＰ９０に結合し得る小さな蛍光分子であるゲルダナマイシン−ＢＯＤＩＰＹの代わりに用いた［４９、４５］。
【００９７】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰモノクローナル抗体２Ｃ６および３Ｇ７を、標準的なプロトコールに従って、フルオレセイン−５−マレイミド（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で標識した。結合していない染料は、製造者のプロトコールに従って、標準的な染料除去カラムを用いて取り除いた。抗体を標識した後、これを蛍光偏光の実験において用いた。
【００９８】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰをＰＢＳ内の５％ＢＳＡ内に、４００００ｎｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌを最上部のウェルに添加し、９６ウェルブラックプレート（Ｃｌｉｎｉｐｌａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において、ＰＢＳ内の５％ＢＳＡ内に６倍希釈した。高濃度の血清アルブミン（５％超の血清アルブミン）を用いて、血清濃度をシミュレートした。標識された抗体を、０．１％の正常なヒト血漿および０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ内に２０μｇ／ｍｌに希釈した。希釈された抗体溶液（５０μｌ）をウェルに分配し、混合し、密封し、光から覆い、４℃で一晩インキュベートした。プレートは、室温に調整できるようにし、蛍光偏光は、ＤＴＸ−８８０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａ）で測定した。蛍光の取り込み時間が０．０００１秒であったことを除いて、製造者の蛍光プロトコールを用いた。データをエクセルにエクスポートし、これまでに概説されているようにしてｍＰを計算した［４９］。生のデータを、Ｐｒｉｓｍ ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を用いてｌｏｇ表示のｘ軸にプロットし（図５Ａ）、一元ＡＮＯＶＡを用いて分析して、計算されたｍＰ値に対してバックグラウンドを比較し、４パラメータロジスティックが可能になるように変換した（図５Ｂ）（ｒ２＝０．９７５）ｎ＝２。
【００９９】
５％ＢＳＡ／ＰＢＳにおけるＯＦＡの濃度は、４００００から０．８５ｎｇ／ｍｌにわたり、１０００ｎｇ／ｍｌ（飽和による）未満から３０．８６ｎｇ／ｍｌ未満の範囲を示した（図５Ａ）。１０００ｎｇ／ｍｌを超える濃度では、シグナルは飽和し、データを変換し、４パラメータロジスティックを実施し、ｒ２＞０．９５である場合、３０．６ｎｇ／ｍｌ（５．１ｎｇ／ｍｌ）未満では、シグナルはバックグラウンドと有意には異ならなかった（図５Ｂ）。
【０１００】
結果は、ペプチド由来のＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体を、蛍光偏光を用いてＯＦＡ／ｉＬＲＰの濃度を決定するために用い得ることを実証する。検量線によってもたらされるデータは、血清、血漿、組織溶解物、またはＯＦＡ／ｉＬＲＰを含有するあらゆる溶解可能な由来源からの未知数を計算するために用いることができる、許容されるｒ２値を有していた。
【０１０１】
（実施例６）
ＯＦＡ／ｉＬＲＰの免疫組織化学的染色
この研究の目的は、正常な隣接組織においては反応を限られたものとしながら、ホルマリンで固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）６ミクロンの厚さの腫瘍切片においてＯＦＡ／ｉＬＲＰを検出する、本発明のモノクローナル抗体の能力を分析するためのものであった。
【０１０２】
マウス一次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）と共に用いるためのＭａｘＴａｇ Ｈｉｓｔｏキットが提供されるプロトコールに従って、実験を行った。簡潔に述べると、ＦＦＰＥの６ミクロンの腫瘍スライドを、キシレンで脱パラフィン化し、次に、濃度を減少させていったエタノール（ＥｔＯＨ）で再水和し、次に水で希釈し、最後にＰＢＳ内に置いた。全てのインキュベーションステップは、湿潤チャンバ内で実施した。スライド上の、組織を含有する領域にＰＡＰペンで印を付け、次に、ＰＢＳ内の１％過酸化水素および１％正常ヤギ血清内で５分間にわたりブロックして、内因性ペルオキシダーゼの活性を取り除いた。次に、スライドをＰＢＳ内で５分間にわたり３回洗浄した。一次抗体をＰＢＳ＋１％正常ヤギ血清内に１：２５０で希釈し、４℃で一晩、スライド上でインキュベートした。これまでの実験は、１：１０および１：５０の一次抗体希釈物でランし、非常に高いバックグラウンド染色を有していた。（データは示していない）。次に、スライドをＰＢＳ内で５分間にわたり３回洗浄し、次に、キットにおいて提供される二次抗体を添加し、それらを室温で３０分間にわたりインキュベートした。スライドを再び洗浄し、希釈した、キットのストレプトアビジンペルオキシダーゼ試薬を添加し、室温で３０分間にわたりインキュベートした。スライドを再び洗浄し、供給されたＤＡＢ試薬を添加し、発色についてモニタリングしながら、１５分間にわたりインキュベートした。ＤＡＢの反応は、正常な隣接組織の真のバックグラウンド染色を決定するために、製造者の推奨よりも１０分長くインキュベートすることが可能であった。次に、スライドを蒸留水で２分間にわたり３回洗浄した。ヘマトキシリン対比染色液を添加し、スライドを５分間にわたりインキュベートした。スライドを水で２分間にわたり３回、再び洗浄し、それぞれ２分間にわたり４回、１００％ＥｔＯＨで脱水し、次に、それぞれ２分間にわたりキシレンを４回交換して、クリアにした。組織を顕微鏡下で観察し、茶色の沈殿物として可視化される陽性反応およびライトブルーの核染色で評価した。
【０１０３】
染色は複数の腫瘍タイプに対してランした。図６に示されるスライドは、一次抗体としての３Ｇ７モノクローナル抗体で染色されている、中度に分化した浸潤性の乳管癌腫であるＴ２Ｎ１Ｍ０を示す代表的な切片である。スライドの染色は、アイソタイプ対照のランスライド（データは示していない）と同様に、非常に暗い黒い沈殿物から非常に明るいものにわたる。ＯＦＡ／ｉＬＲＦの発現は、これまでに試験された全ての腫瘍タイプにおいて見られている。
【０１０４】
結果は、モノクローナル抗体が、ＩＨＣ染色プロトコールに適しており、様々な異なる実験上および診断上の適用において用いられ得ることを示す。１つの考えら得る適用は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ療法への適用性のためのものであるか、または、スクリーニング／診断試験としてのものである。ＯＦＡ／ｉＬＲＰは保存領域に対して特異的に設計されるため、これらの抗体は、全ての種と交差反応する。
【０１０５】
（実施例７）
細胞の生存能力に対するＯＦＡ／ｉＬＲＰモノクローナル抗体の効果
この実験の目的は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して設計されたモノクローナル抗体が細胞の生存能力に対して何らかの影響を有しているかを決定することである。ＯＦＡ／ｉＬＲＰの性質に起因して、ＯＦＡ｜ＯＦＡからＬＲへの変換を混乱させるために設計されたモノクローナル抗体および他のタンパク質｜タンパク質相互作用を阻害するモノクローナル抗体が活性を有するであろうことが予想された。
【０１０６】
全ての細胞を、湿潤チャンバ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）内で、３７℃で、Ｌ−グルタミン、１００Ｉ．Ｕ．のペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１０％ウシ胎児血清を有するＲＰＭＩ１６４０内で成長させた。ＤＵ１４５細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、標準的なプロトコールに従って、培地において成長させた。ＤＵ１４５細胞を７５から８５％の間の密度まで成長させ、標準的なプロトコールに従って回収し、変更されたＮｅｕｂａｕｅｒブライトライン血球計を用いて計数し、４０００００個細胞／ｍｌで懸濁させた。
【０１０７】
モノクローナル抗体（２Ｃ６および３Ｇ７）を完全培地内に溶解した。適切な濃度まで希釈した後、５０μｌを、ラミニン／エンタクチン複合体（５０μｇ／ｍｌ）で被覆されているかまたは未処理の（透明な底部を有する黒色）９６ウェルアッセイプレート内に分配し（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）、５０μｌの細胞（２００００個細胞／ウェル）を一晩成長させた。２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））を細胞に添加し、それを３７℃でさらに２時間にわたりインキュベートした。細胞を、標準的な蛍光プロトコールに従って、０．００１秒の取り込み時間で、ＤＴＸ−８８０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｃ．）で読み取った。カスパーゼ活性が誘発されたかどうかを決定するために、カスパーゼ３／７の活性を、ＡｐｏＯｎｅアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて決定した。データをエクセルにエクスポートし、次に、Ｐｒｉｓｍ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）にエクスポートし、そこでプロットし、一元ＡＮＯＶＡを用いて、バックグラウンド対照（ペプチドに用いられた希釈物）との間の統計上の差について分析した。対照群（０）と処理群との間の差を決定するために、Ｄｕｎｎｅｔｓ事後試験を行った。全てのｐ＜０．０５（＊）は有意であると考えられた。
【０１０８】
ＤＵ１４５細胞の全てを、被覆されていないかまたはラミニン／エンタクチンで被覆された９６ウェルプレート上で成長させた。２Ｃ６または３Ｇ７の存在下で、細胞の生存能力に対する影響が存在した（図７ＡおよびＢ）。一元ＡＮＯＶＡによって統計的に分析すると、２Ｃ６抗体および３Ｇ７抗体は、高い濃度でも、対照群と比較して生存能力を低下させた。しかし、３Ｇ７（０．３２ｍｇ／ｍｌ）と２Ｃ６（１．２９ｍｇ／ｍｌ）との間の濃度差を考慮すると、３Ｇ７は、より優れた活性を有すると考えられる。ＡｐｏＯｎｅカスパーゼ３／７アッセイにおいて、いずれの群においても有意差は見られなかった。
【０１０９】
ＤＵ１４５細胞をいずれかの抗体の存在下で成長させると、この細胞は、ＰＢＳ単独と比較して、細胞の生存能力に対して有意な影響を有していると考えられる。カスパーゼ３／７の活性化はなく、ＡｐｏＯｎｅアッセイにおいて有意な変化は見られなかった。このことは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体が、抗癌療法として用いられる能力を有し得ることを示す。
【０１１０】
本明細書においてこれまでに説明された発明の多くの変更および変形が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われ得、したがって、添付の特許請求の範囲によって示されるような限定のみが課せられる。
【０１１１】
本明細書において引用される全ての特許および論文の参考文献は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
参考文献
【０１１３】
【化１】
【０１１４】
【化２】
【０１１５】
【化３】
【０１１６】
【化４】
【０１１７】
【化５】
【０１１８】
【化６】
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００９年３月２６日に出願された米国仮出願第６１／１６３，８１０号（この開示は、その全体が参考として本明細書に援用される）の出願日の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、全体として、癌胎児抗原／未熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）に関するものである。より具体的には、本発明は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに関連する疾患を検出および治療するために用いることができる抗体を提供する。
【背景技術】
【０００３】
癌胎児抗原／未熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）の最初の特徴付けは、癌胎児抗原またはラミニン受容体を研究した３つの独立したグループによって行われた［１〜３（非特許文献１〜３）］。ＯＦＡ／ｉＬＲＰは、様々な異なる癌において過剰発現する、高度に保存されるタンパク質であり、リボソームタンパク質ｐ４０として二元機能を有する［４〜２７］。ＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質は、２９５個のアミノ酸からなる一本のポリペプチド鎖からなり、約３７〜４４ｋＤａの分子量を有する。ＯＦＡ／ｉＬＲＰの構造は、最近、２．１５Åであることが解明されている［２８］。ラミニン受容体（ＬＲＰ）の成熟形態は、６７ｋＤａの分子量を有する、アセチル化ＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量体であると考えられる。構造によって、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのアミノ酸１１２から１４０の間の領域が、ＬＲＰを形成するためのＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量化に関与することが示された［２８］。６７ｋＤａのＬＲＰは、多くの正常細胞上および腫瘍細胞上にあるが、胎児細胞および腫瘍細胞がＯＦＡ／ｉＬＲＰを優先的に発現すると考えられる。したがって、発現パターンによって、ＯＦＡ／ｉＬＲＰが、癌および他の疾患を治療するための、免疫系を感作するための考えられる候補タンパク質となる［６］。ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体もまた、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの誤発現に関連することが公知の疾患の検出、診断、および治療に用いることができる。
【０００４】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体に対する最初の研究は、癌胎児抗原の側面またはラミニン受容体の側面という２つの個別の分野に該当する。胚／胎児抗原およびラミニン受容体の両方について、同年に、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対するモノクローナル抗体の最初の報告がされた［２９、３０］。胚抗原または胎児抗原に対して発生した抗体は、変性条件下で、４４ｋＤａのタンパク質と反応した［３０］。ラミニン受容体に対してこれまでに開発された抗体は、抗体結合の位置に基づいて異なる生物学的活性を有していた［２９］。ラミニンの結合をブロックする生物学的活性を有していたある領域が、モノクローナルＩｇＭ抗体によって認識された。モノクローナルＩｇＭ抗体が認識したエピトープは、ＴＥＤＷＳＡＱＰＡＴＥＤＷＳＡであった［２６］。４４ｋＤａのＯＦＡに対する研究によって、ＩｇＭモノクローナル抗体（ＭＡｂ１１５）を、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、および場合によっては発癌性の試験に用い得ることが示された［３１］。しかし、この抗体は、ＯＦＡ｜ＯＦＡ二量化領域に対して特異的に設計されたものではないため、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびＬＲＰの両方と反応する［３１］。このモノクローナル抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰまたはＬＲＰの免疫組織化学およびタンパク質精製に用いられた［１２、３２］。６７ｋＤａのラミニン受容体を検出し、かつ乳癌においてラミニン受容体の発現の増大を示したペプチドから、異なる抗体が開発された［５、３３］。いくつかの公表された原稿は、自己免疫抗体を探求する際に、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体の使用を記載している［６、９、１０、１６、１９、２０、２５、２７、３４〜３６］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｅｓｏｔ， Ｈ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ（１９８３）２（６）：ｐ８６１〜８６５
【非特許文献２】Ｍａｌｉｎｏｆｆ， Ｈ．Ｌ．ら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（１９８３）９６（５）：ｐ１４７５〜９
【非特許文献３】Ｒａｏ， Ｎ．Ｃ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００７）１７９（２）：ｐ１３８１〜８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰは様々な異なる疾患に関連するため、診断上のおよび臨床上の抗体の適用を開発する必要がある。これまで、ペプチドを用いて標的化抗体を開発する試みはわずかしかなく、かつ、これは１つの公表された報告に限定されている［５］。公表された報告において用いられた領域は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびラミニン受容体の両方と反応することが報告された抗体を産生した［５、２５］。したがって、様々な異なる臨床上の、診断上の、および／または獣医学上の適用を開発するために、単独で、または他の抗体と組み合わせて用いることができる、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体を開発する必要がある。一方はＯＦＡ／ｉＬＲＰを認識し得、一方はＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびＬＲＰの両方を認識し得る抗体を対で開発することにより、タンパク質の保存された性質に起因する、全ての種におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰ疾患を治療するために用いることができるか、診断するために用いることができるか、または前記疾患の試薬として作用し得る、いくつかの試験の開発が可能になる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の１つの態様は、癌胎児抗原／未熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）の免疫原性である領域に特異的に結合する、単離された抗体を提供する。１つの実施形態では、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの免疫原性領域には、限定はしないが、（ａ）ＦＦＲＥＰＲＬＬＶＶＴＤＰＲ、（ｂ）ＶＴＤＰＲＡＤＨＱＰＬＴＥ、（ｃ）ＹＲＤＰＥＥＩＥＫＥＥＱ、または（ｄ）ＦＰＴＥＤＷＳＡＱＰＡＴＥＤのポリペプチド配列が含まれる。別の実施形態では、本発明の単離された抗体は、限定はしないがモノクローナル抗体２Ｃ６または３Ｇ７を含む、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。さらなる別の実施形態では、免疫原性領域は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量化領域に位置する。
【０００８】
本発明の抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの免疫原性領域に対して免疫化することによって産生される。抗体は、完全長ＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質と、本発明の抗体を産生するために用いられるＯＦＡ／ｉＬＲＰの免疫原性領域との両方を認識し得る。１つの実施形態では、抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的である。代替の実施形態では、抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよび成熟ＬＲＰの両方を認識する。
【０００９】
本発明の抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに関連するタンパク質または癌を検出するための様々な方法において用いることができる。
【００１０】
１つの実施形態では、抗体は、試料においてＯＦＡ／ｉＬＲＰを検出するための方法において用いられる。この方法は、
（ａ）試料を、癌胎児抗原／未熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）の領域に特異的にそれぞれ結合する第１の抗体および第２の抗体と接触させるステップであって、前記抗体の少なくとも一方がＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的であるステップ、
（ｂ）抗体をＯＦＡ／ｉＬＲＰに結合させ、ＯＦＡ／ｉＬＲＰとのサンドイッチを形成させるステップ、ならびに
（ｃ）ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体を用いて、試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲの発現を検出するステップ
を含む。
【００１１】
１つの実施形態では、抗体の一方は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよび成熟ＬＲＰの両方に結合してもよく、捕捉抗体として働き得る。もう一方の抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的であってもよく、検出抗体として働く。
【００１２】
別の実施形態では、本発明の抗体は、試料において癌を検出する方法において用いられる。この方法は、
（ａ）試料を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体と接触させるステップ、
（ｂ）試料を、ビオチン化された二次抗体と接触させるステップ、および
（ｃ）ストレプトアビジンを用いて、試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰを検出するステップ
を含み、試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰの検出が癌を示す。
【００１３】
さらなる実施形態では、本発明は、試料においてＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を決定する方法であって、
（ａ）ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体をフルオロフォアに結合体化させるステップ、
（ｂ）結合体化した抗体を試料内で接触させるステップ、および
（ｃ）蛍光偏光を用いて、試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を決定するステップ
を含む方法を提供する。
【００１４】
本発明の抗体はまた、血液試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞の量を決定する方法において用いることができる。この方法は、
（ａ）血液試料を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰｌに特異的な抗体と接触させるステップ、および
（ｂ）フローサイトメトリーを用いて、試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を決定するステップ
を含む。
【００１５】
本発明の抗体はまた、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を治療する方法において用いることができる。この方法は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌に関連する症候を改善するために十分な量の、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を有する被験体に投与するステップを含む。１つの実施形態では、抗体は、抗癌特性を有するコロイドに連結しているか、または、化学療法剤もしくはタンパク質と結合体化している。
【００１６】
本発明はまた、被験体においてＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を検出する方法を提供する。この方法は、
（ａ）ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体を、放射線不透過性の染料に結合体化させるステップ、
（ｂ）結合体化した抗体を被験体に投与するステップ、および
（ｃ）ｘ線を用いて、結合体化した抗体を検出するステップ
を含み、ｘ線によるＯＦＡ／ｉＬＲＰの検出が癌を示す。
【００１７】
本発明の別の態様は、本発明の抗体を含む医薬組成物を提供する。この組成物は、医薬用担体を含み得る。
【００１８】
本発明の上記の特徴および他の特徴、ならびにそれらを得る様式および用いる様式は、より明らかとなり、添付の図面と組み合わせて以下の記載を参照することによって、最も良く理解されよう。図面は、本発明の典型的な実施形態のみを示すものであり、したがって、本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＢＳＡ結合体ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドに対するＯＦＡ／ｉＬＲＰポリクローナル血清の滴定を示す図である。抗体抗原反応の検出には、ビオチン化されたユニバーサル二次抗体混合物を用いた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘで吸光度を測定し、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈを用いてデータを分析した。
【図２】図２は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対するＯＦＡ／ｉＬＲＰポリクローナル血清の滴定を示す図である。ビオチン化された二次抗体を用いる、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体抗原相互作用の検出。Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＴＸ ８８０でのＡ６２０での吸光度の読み取りの、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈ。
【図３】図３は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する間接ＥＬＩＳＡでランされたモノクローナル抗体２Ｃ６および３Ｇ７の希釈曲線を示す図である。
【図４】図４は、モノクローナル抗体（２Ｃ６および３Ｇ７）の反応性を決定するための、ｒＯＦＡ／ｉＬＲＰのサンドイッチＥＬＩＳＡを示す図である。生のデータを片対数グラフにプロットし、標準的なプロトコール（ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ４．３．１ ＬＳ）に従って、４パラメータロジスティックを用いて曲線当てはめ（ｃｕｒｖｅ ｆｉｔ）を行った。
【図５】図５は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの蛍光偏光を示す図である。（Ａ）生のデータをｌｏｇ表示のｘ軸にプロットした。（Ｂ）４パラメータロジスティックを用いた曲線当てはめのデータ（ｒ２＝０．９７５）ｎ＝２。
【図６】図６は、一次抗体反応のために３Ｇ７モノクローナル抗体を用いた、中度に分化したヒト浸潤性腺管癌腫であるＴ２Ｎ１Ｍ０のＩＨＣ染色を示す図である。非常に暗い領域は、細胞が大量のＯＦＡ／ｉＬＲＰを発現している場所であり、厚い沈殿物が堆積していた。
【図７】図７は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｂｌｕｅを用いて、細胞の生存能力に対する２Ｃ６抗体および３Ｇ７抗体の効果を測定した図である。抗体を添加することによって生じた生存能力の低下が、弱まった蛍光シグナルによって示される。抗体の効果およびラミニンの必要量を、ラミニン／エンタクチンで被覆したプレートまたは未処理のプレート上で成長させることによって決定した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明は、驚くべきことに、免疫原性ペプチドが、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの推定同位体（ｉｓｏｔｏｐｅ）領域から由来し得、かつＯＦＡ／ｉＬＲＰの特異的領域に対するこれまでに発見されていない抗体を生成するために用いられ得ることを発見した。
【００２１】
したがって、本発明の１つの態様は、癌胎児抗原／未熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）の免疫原性である領域に特異的に結合する、単離された抗体を目的とする。本発明の目的では、「単離された」抗体は、その天然環境の構成要素から同定および分離、ならびに／または回収されているものである。
【００２２】
本発明の１つの実施形態では、抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的である。抗体は、それが、周知の標準的な抗体結合条件下で、６７ｋＤａの形態のラミニン受容体ではなくＯＦＡ／ｉＬＲＰに優先的に結合する場合、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的である。このような抗体の例には、限定はしないが、３Ｇ７が含まれる。異なる実施形態では、本発明の抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよび６７ｋＤａの形態のラミニン受容体の両方を認識し得る。このような抗体の例には、限定はしないが、２Ｃ６が含まれる。さらなる実施形態では、本発明の抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量化領域に結合する。本発明の目的では、二量化領域は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量化に関与する［２８］、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ完全長タンパク質のアミノ酸１１２から１４０の間の領域である。
【００２３】
本発明の抗体は、完全長のＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質を認識し得る。それらはまた、免疫原性であるＯＦＡ／ｉＬＲＰの特異的領域、特に二量化領域を認識し得る。本発明の目的では、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの領域は、その領域に由来するポリペプチドが免疫応答を引き起こし得、かつ本発明の抗体を産生するために用いられ得る場合、免疫原性である。例えば、表２に列挙される４つの免疫原性ペプチドによって生成される抗体は、完全長のＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質、そのそれぞれの免疫原性ペプチド、およびこれらのペプチドを含むＯＦＡ／ｉＬＲＰの領域を認識し得る。
【００２４】
本発明の目的では、「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、受容体、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合し得る、免疫グロブリン分子である。本明細書において用いられる場合、この用語は、無傷のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）．ｓｕｂ．２、Ｆｖなど）、一本鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および、抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子のあらゆる他の修飾された形状も含む。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭなどの、あらゆるクラスの抗体（またはそのサブクラス）が含まれ、抗体は、何らかの特定のクラスのものである必要はない。抗体の重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを、異なるクラスに割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭという、免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖の定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニットの構造および三次元形状は、周知である。
【００２５】
本発明の抗体は、さらに、抗体の少なくとも１つのＯＦＡ／ｉＬＲＰ領域によって付与される、ポリペプチドに対する親和性を有する、二重特異性分子、多特異性分子、一本鎖分子、ならびにキメラおよびヒト化分子を含むことを意図したものである。本発明の抗体にはまた、抗体の重鎖の可変ドメインまたは抗体の軽鎖の可変ドメインである、単一ドメイン抗体が含まれる。抗体の６つの天然の相補性決定領域のうち３つを含有する、抗体の重鎖の可変ドメインまたは抗体の軽鎖の可変ドメインを含むドメイン抗体を作製する方法もまた、当技術分野において公知である。例えば、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ、Ｒｅｖ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４巻：２７７〜３０２頁、２００１年を参照されたい。
【００２６】
１つの実施形態では、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して発生した抗体は、モノクローナル抗体である。２Ｃ６および３Ｇ７などのモノクローナル抗体はまた、完全長のＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質、そのそれぞれの免疫原性ペプチド、およびこれらのペプチドを含むＯＦＡ／ｉＬＲＰの領域を認識し得る。しかし、モノクローナル抗体３Ｇ７は、成熟形態のＬＲＰ（二量体形態）を認識せず、一方、モノクローナル抗体２Ｃ６は認識する。しかし、高用量の３Ｇ７抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ二量体を崩壊させ得る。
【００２７】
本明細書において用いられる場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な複数の抗体の１抗体を言い、すなわち、集団を含む個別の抗体は、わずかに存在し得る考えられる天然の突然変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、一般に、非常に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」という修飾語は、抗体が、実質的に均質な抗体集団から得られ、かつ、何らかの特定の方法による抗体の産生が必要であるとは解釈されないという、抗体の特徴を示す。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号において記載されているような組換えＤＮＡ法によって作製することができる。モノクローナル抗体はまた、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ、３４８巻：５５２〜５５４頁において記載されている技術を用いて生成されるファージライブラリーから単離することができる。
【００２８】
本発明の抗体は、選択された基準に基づいてペプチドに対して免疫化することによって産生される。ペプチドの選択および選択基準は、本願と同時に出願された、「Ｏｎｃｏｆｅｔａｌ Ａｎｔｉｇｅｎ／Ｉｍｍａｔｕｒｅ Ｌａｍｉｎｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｆｏｒ Ｔｈｅ Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」という発明の名称の特許出願において完全に開示されており、この出願の関連する内容は、本明細書に完全に組み込まれる。一般に、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのアミノ酸配列の少なくとも一部、すなわち全体または一部を含むポリペプチドまたはペプチドが、特異的な抗体応答を引き起こし得るならば、これを抗原として用いることができ、このようにして生成された抗体は、完全長ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよびこれにおいて用いられる免疫原性ペプチドの両方を認識し得る。本発明の実施形態に従うと、免疫原性ペプチドは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの異なる推定エピトープ領域に基づいて生成される。単独で、またはＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量化領域に対する抗体と組み合わせて用いるための、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する多重機能抗体の再現性および機会を増大させるために、好ましくは、抗体は、表１に列挙される領域またはエピトープに対して開発される。１つの実施形態では、１）ＦＲＥＰＲＬＬＶＶＴＤＰＲ、２）ＶＴＤＰＲＡＤＨＱＰＬＴＥ、３）ＹＲＤＰＥＥＩＥＫＥＥＱ、４）ＦＰＴＥＤＷＳＡＱＰＡＴＥＤの４つのペプチドが、本発明の抗体の生成に用いられる。
【００２９】
本発明のペプチドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどを用いる化学的合成または生化学的合成によって調製することができる。当業者に周知の方法を、合成に用いることができる。
【００３０】
本発明のペプチドを化学的に合成する場合、ペプチド合成の分野において周知の方法を用いることができる。例えば、アジド法、酸塩化物法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボジイミダゾール法、および酸化還元法などの方法を挙げることができる。固相合成または液相合成を用いることができる。市販されているペプチド合成器（例えば、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＰＳＳＭ−８）もまた用いることができる。
【００３１】
反応の後、本発明のペプチドを、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、または再結晶化などの従来の精製方法の組み合わせによって精製することができる。
【００３２】
本発明のペプチドは、その免疫原性応答を増大させるために修飾することができる。１つの実施形態では、ペプチドの改変体は、いずれかの末端にシステイン残基を含み得、これによって、キーホールリンペットヘモシアニン、オボアルブミン、血清アルブミン、またはペプチドの免疫原性応答を増大させるために用いられる他の結合体への結合体化が可能になる。表２には、結合体化のための修飾ペプチドの例が列挙されている。
【００３３】
ペプチドは、抗体を生じさせるために、様々な異なる生物において用いることができる。抗体はまた、周知のタンパク質技術に基づいて様々な異なる組換え抗体を生成させるためにクローニングすることができる。本発明の目的の１つは、完全長タンパク質に対して免疫化するのではなく、本発明のペプチドに対して免疫化し、そして、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの特異的領域に対する免疫特異性に基づいて抗体を選択することによって、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの特異的領域に対する抗体を開発することである。
【００３４】
本発明のモノクローナル抗体は、当技術分野において公知の方法を用いて生成することができる。例えば、本発明のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞を培養することによって生成することができ、ハイブリドーマ細胞によって分泌される抗体はさらに、単離または精製することができる。抗体は、例えば、タンパク質Ａ−セファロース．ＲＴＭ．、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーなどの、従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地または腹水から単離または精製することができる。
【００３５】
本発明の抗体はまた、参照することによって本明細書に組み込まれる米国特許第４，８１６，５６７号および米国特許第６，３３１，４１５号において記載されているような組換えＤＮＡ法によって作製することができ、例えば、本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離および配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい由来源として役立つ。ＤＮＡは、単離されると、発現ベクター内に置くことができ、この発現ベクターを次に、本来は免疫グロブリンタンパク質を産生しない、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞内に移して、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。ＤＮＡはまた、例えば、ヒトの重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列を相同なマウス配列の代わりに用いることによって（米国特許第４，８１６，５６７号）、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を、免疫グロブリンをコードする配列に共有結合させることによって、修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の定常ドメインの代用とするか、または、本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインの代用として、キメラ二価抗体を生じさせることができる。
【００３６】
本発明の抗体は、様々な異なる機能のために用いることができる。１つの実施形態では、本発明の抗体は、化学的アジュバント、放射線学的アジュバント、および核性アジュバントとの結合体化を介して、悪性組織を検出するために用いることができる。さらに、これらの抗体は、治療的に用いて、受動免疫、すなわち、その固有のもしくは改変された形での増大した免疫応答をもたらすために用いることができるか、または、化学的、放射線学的「種」源、微小電気装置、銀コロイド、金、二酸化チタンコロイド、バイオポリマーコロイド（すなわち、デンプン、コラーゲン、アガロースなど）、ペプチド配列、もしくはタンパク質配列に結合体化している場合には、悪性細胞の標的化された破壊を助けるために用いることができる。ＯＦＡ／ｉＬＲＰの、高度に保存される性質に起因して、抗体はまた、試薬としても用いることができ、タンパク質を発現する全ての生物と交差反応をする。
【００３７】
したがって、本発明の別の態様は、本明細書において記載される抗体またはポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。組成物の抗体またはポリペプチドは、単独で、または、化学的、放射線学的「種」源、微小電気装置、銀コロイド、金、二酸化チタンコロイド、バイオポリマーコロイド（すなわち、デンプン、コラーゲン、アガロースなど）、ペプチド配列、もしくはタンパク質配列に結合体化して使用することができ、これは、悪性細胞の標的化された破壊を助けるために用いることができる。
【００３８】
組成物はまた、薬学的に許容される担体または賦形剤を含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、当技術分野において公知であり、薬学的に効果的な物質の投与を容易にする、比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形態もしくは硬さをもたらし得るか、または、希釈剤として作用し得る。適切な賦形剤には、限定はしないが、安定剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させるための塩、カプセル化剤、緩衝液、ならびに皮膚浸透増強剤が含まれる。非経口的および経口的な薬物送達のための賦形剤および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００年）において説明されている。
【００３９】
本発明の組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤される。投与経路の例には、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば、吸入）、経皮投与（局所的）、経粘膜投与、および直腸投与が含まれる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液には、注射のための水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの無菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための作用物質という構成要素が含まれ得る。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口調製物を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回用量のバイアル内に入れることができる。
【００４０】
注射での使用に適した組成物には、無菌水性溶液（水溶性の）または分散液、および無菌の注射用溶液または分散液を即時調製するための無菌粉末が含まれる。静脈内投与では、適切な担体には、生理食塩水、滅菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全てのケースにおいて、組成物は無菌でなくてはならず、注射容易性が存在する限りは流体である。これは、製造および保存の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなくてはならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含有する、溶媒または分散媒質であり得る。例えば、レシチンなどの被覆を用いることによって、分散液のケースでは所要の粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を用いることによって、適切な流動性を維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多くのケースでは、組成物内に、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、組成物内に、吸収を遅らせる作用物質、例えばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを含めることによってもたらされ得る。
【００４１】
無菌の注射用溶液は、所要の量の化合物を、上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒に組み込み、必要に応じて、その後に濾過滅菌を行うことによって、調製することができる。一般に、分散液は、化合物を、基礎となる分散媒質および上記に列挙した他の成分のうち所要のもの含有する無菌媒体内に組み込むことによって、調製される。無菌の注射用溶液を調製するための無菌粉末のケースでは、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、活性成分とあらゆるさらなる所望の成分との粉末が、先に滅菌濾過されたその溶液からもたらされる。
【００４２】
経口組成物には一般に、不活性の希釈剤または食用の担体が含まれる。経口的な治療的投与の目的では、化合物は、賦形剤と組み合わせることができ、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態で用いることができる。経口組成物はまた、マウスウォッシュとして用いるために、流体担体を用いて調製することができる。薬学的に適合した結合作用物質、および／またはアジュバント材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、ピル、カプセル、トローチなどは、微結晶性セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチンなどの結合剤、デンプンもしくは乳糖などの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはコーンスターチなどの崩壊剤、マグネシウムステアレートもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの潤滑剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、ショ糖もしくはサッカリンなどの甘味料、またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの香料という成分または類似の性質を有する化合物のいずれかを含有し得る。
【００４３】
吸入による投与のためには、組成物は、適切な推進剤、例えば二酸化炭素などのガスを含有する加圧された容器もしくはディスペンサー、または噴霧器から、エアロゾルスプレーの形態で送達される。
【００４４】
全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段によるものであり得る。経粘膜投与または経皮投与のためには、透過するべき障壁に適した浸透剤が、製剤において用いられる。このような浸透剤は、当技術分野において一般に公知であり、例えば、経粘膜投与では、洗浄剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔内スプレーまたは坐剤を用いることで達成することができる。経皮投与では、化合物は、当技術分野において一般に公知であるような軟膏剤、軟膏、ゲル、またはクリームに製剤される。
【００４５】
本発明の組成物はまた、直腸送達のために、坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を伴った）または停留浣腸の形態で調製することができる。
【００４６】
１つの実施形態では、組成物は、インプラントおよびマイクロカプセル化された送達系を含む制御放出製剤などの、身体からの迅速な排出から化合物を保護する担体と共に調製される。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解可能な、生体適合性ポリマーを用いることができる。このような製剤を調製するための方法は、当業者には明らかである。材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液（感染細胞に標的化されたリポソームとウイルス抗原に対するモノクローナル抗体とを含む）もまた、薬学的に許容される担体として用いることができる。
【００４７】
投与を容易にするため、および投薬の均一性のために、経口組成物または非経口組成物を投薬単位形態で製剤することが有利である。本明細書において用いられる「投薬単位形態」は、治療すべき被験体への単位投薬として適した、物理的に個別の単位を言う。各単位は、所要の医薬用担体を伴って、所望の治療効果をもたらすように計算された、所定の量の活性化合物を含有する。
【００４８】
本発明の組成物は、投与のための指示と共に容器、パック、またはディスペンサーに含めて、包装された製品とすることができる。他の活性化合物もまた、組成物内に組み込むことができる。
【００４９】
本発明のさらなる態様は、正常な試料と比較して増大しているかもしくは低下しているＯＦＡ／ｉＬＲＰのエピトープ発現、ならびに／または、エピトープの発現を普段は欠いている組織（複数可）および／もしくは細胞（複数可）における発現の存在などの不適切な発現に関連する、疾患、障害、または症状を検出、診断、およびモニタリングするために、本発明の抗体およびポリペプチドを使用する方法を提供する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本方法は、癌またはＯＦＡ／ｉＬＲＰに関連するあらゆる疾患を有していることが疑われる被験体から得られた試料においてエピトープ発現を検出するステップを含む。好ましくは、この検出方法は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのエピトープ領域への抗体の結合を可能にする条件下で、試料と本発明の抗体またはポリペプチドとを接触させるステップ、および、結合のレベルが対照試料または比較試料のレベルと異なるかどうかを決定するステップを含む。本方法はまた、本明細書において記載される抗体またはポリペプチドが患者にとって適切な治療であるかどうかを決定するために有用である。
【００５１】
診断の目的では、抗体を含むポリペプチドは、限定はしないが、当技術分野において公知の放射性同位体、蛍光標識、および様々な酵素−基質標識を含む、検出可能な部分で標識することができる。標識を抗体に結合体化させる方法は、当技術分野において公知である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体を含むポリペプチドは、標識されている必要はなく、その存在は、本発明の抗体に結合する標識された抗体を用いて検出することができる。
【００５３】
本発明の抗体は、競合的結合アッセイ、直接および間接サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイなどの、あらゆる公知のアッセイ方法において採用することができる。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４７〜１５８頁（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． １９８７年）。
【００５４】
抗体およびポリペプチドはまた、ｉｎ ｖｉｖｏでのイメージングなどの、ｉｎ ｖｉｖｏでの診断アッセイに用いることができる。一般に、抗体またはポリペプチドは、放射性核種（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、または３Ｈなど）で標識され、その結果、目的の細胞または組織を、免疫シンチグラフィーを用いて位置決定することができる。
【００５５】
抗体はまた、当技術分野において周知の技術を用いる、病理学における染色試薬として用いることができる。
【００５６】
本発明を、以下の詳細な実施形態および実施例を参照することによって、さらに説明する。これらの実施形態および実施例は、例示のみを目的として提供されるものであり、本明細書において記載される本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【００５７】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰの特異的領域に対する抗体の開発
ＯＦＡ／ｉＬＲＰの一連の異なる推定エピトープ領域に対する異なるペプチドの領域を用いて、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して抗体を作製する。表１は、このようなペプチドのリストを示す。ペプチドは、標準的なプロトコールに従って、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合体化される［３７〜３９］。ＫＬＨ−ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドを用いて、標準的なプロトコールに従って、マウスを免疫化する［３７、３９］。ＫＬＨ−ＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドに対する３回目の免疫化の後、マウス尾部の出血から単離された血清を、標準的なプロトコールを用いて間接ＥＬＩＳＡ技術を用いて、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合体化したＯＦＡ／ｉＬＲＰペプチドに対してスクリーニングする（図１および表１）。簡潔に述べると、ＯＦＡ／ｉＬＲＰをＮｕｎｃ Ｓｔａｒ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｐプレート上に、４℃で一晩被覆した。プレートを洗浄し、水で３回ブロックした。尾部の出血を介して得られたマウス血清を、ＢＳＡを有するＰＢＳ−ｔ内に希釈し、室温で１時間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、ビオチン化した二次抗体を用いて、標準的な方法を用いて、抗体抗原相互作用を検出した（図１Ａ〜Ｂ）。吸光度を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＴＸ ８８０で、Ａ６２０で読み取り、Ｐｒｉｓｍ Ｇｒａｐｈ ５を用いてグラフにした（図１Ｃ）。バーは、免疫化ペプチド当たりの、２頭の動物からの２つの独立した実験の平均を示す。陽性対照は、ＢＳＡおよびＢＳＡ抗体で被覆した。陰性対照は、タンパク質の被覆を有していなかった。
【００５８】
ペプチドのスクリーニングに加えて、標準的なプロトコールを用いて単離されたＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して、尾部の出血を試験する［１〜３、５、２６、２９、３０］。簡潔に述べると、完全長のＯＦＡ／ｉＬＲＰを、Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｔａｒ ＭａｘｉＳｏｒｐプレート上に被覆し、３７℃で２時間にわたり、アジ化ナトリウムを有するＰＢＳ内に５μｇ／ｍｌまで希釈する。プレートを１８．２メガオームの水で３回洗浄し、５％乾燥乳粉末を有するＰＢＳ−ｔを用いて、２５℃で１時間にわたりブロックする。プレートをＰＢＳ−ｔで３回洗浄する。尾部の出血から得られた血清を、ブロック緩衝液（上記）内に希釈し、４℃で一晩インキュベートする。プレートを、上記のＰＢＳ−ｔを用いて洗浄する。抗体−抗原複合体を、ビオチンヤギ抗マウス抗体を用いて検出し、ブロック緩衝液内に希釈し、２５℃で１時間にわたりインキュベートする。プレートをＰＢＳ−ｔを用いて３回洗浄する。二次抗体を、ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いて検出し、ブロック緩衝液内に希釈し、２５℃で３０分間にわたりインキュベートする。プレートを上記のように洗浄する。最終的な検出ステップは、Ｓｉｇｍａ ＦＡＳＴ（商標）ＯＰＤシステムを用いる標準的なプロトコールに従い、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３８４で読み取る。
【００５９】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰを検出するための抗体−サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて用いられる抗体
ＯＦＡ／ｉＬＲＰのＲＮＡおよびタンパク質の発現は、より侵攻性の形態の癌に関連している［２、３、５、６、８、１０、１３、１５〜１７、２０、２１、２３、２５、２６、２９、４０］。しかし、タンパク質の作用は、６７ｋＤａの形態および免疫組織化学に主に集中している。本発明の目的の１つは、異なる領域に対して設計された２つのＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体を用いる、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡを開発することである。ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な捕捉抗体用いて、存在する３７ｋＤａのＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を定量することができ、この領域外の捕捉抗体を用いて、存在する全ＯＦＡ／ｉＬＲＰを定量することができる。
【００６０】
簡潔に述べると、抗体−サンドイッチＥＬＩＳＡは、以下の標準的な技術に従う。捕捉抗体を、Ｎｕｎｃ Ｓｔａｒ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂプレート（または類似のもの）上に被覆し、それを次に、炭酸塩緩衝液内で、ＦＲＥＰＲＬＬＶＶＴＤＲＡＤＨＱＰＬＴペプチドに対する様々な異なる濃度の捕捉抗体で被覆し、４℃で一晩インキュベートする。捕捉抗体および検出抗体の最適な濃度は、「ｃｒｉｓｓ−ｃｒｏｓｓ」希釈法を用いて決定する［３９］。プレートを水で３回洗浄し、ＰＢＳ−ｔで３回洗浄する。洗浄したら、プレートを、標準的なブロック緩衝液を用いて、１時間にわたりブロックする。ブロックされたプレートをＰＢＳ−ｔで３回洗浄する。可溶性タンパク質の溶解物を、標準的なブロック緩衝液で試験し、ＯＦＡ／ｉＬＲＰを、室温で１時間から４℃で一晩、インキュベートする。最初のインキュベーションが完了したら、プレートをＰＢＳ−ｔで３回洗浄する。ＯＦＡ／ｉＬＲＰと捕捉抗体との相互作用を検出するために、二次抗体／検出抗体をブロック緩衝液内に希釈し、少なくとも１時間にわたり室温でインキュベートする。プレートをＰＢＳ−ｔを用いて３回洗浄する。検出抗体をビオチンに結合体化させる（または他の方法）。ビオチン結合体を、ストレプトアビジン／ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）または同等物で検出する。ストレプトアビジンを、適切なブロック内に希釈し、室温で３０分間にわたりインキュベートする。プレートを洗浄し、ストレプトアビジンに対するＨＲＰの酵素的結合体を、標準的なプロトコールに従って、ＳＩＧＭＡ ＦＡＳＴ（商標）ＯＰＤシステムを用いて検出する。存在するＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３８４または同等物で読み取る。検量線当てはめ法に従って、精製ＯＦＡ／ｉＬＲＰから作成された検量線を用いてＯＦＡ／ｉＬＲＰの濃度を逆算し、希釈因子を乗じる［３７］。非特異的な捕捉抗体を用い、その後、モノマー領域に対する検出抗体を用いることによって、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのモノマー形態を検出することも可能である。二量化領域外の領域に対する捕捉抗体と検出抗体との組み合わせを用いて、生体液または組織溶解物内に存在するＯＦＡ／ｉＬＲＰの総量を決定することができる。
【００６１】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰの固有の二量体形態を検出するために、標準的なＥＬＩＳＡを上記のように用いる。しかし、モノマー領域に対して発生した抗体を用いる代わりに、用いられる抗体はこの領域外のものであるが、上記で用いられる検出抗体から十分な距離を有するため、適切な結合が可能となる。６７ｋＤａのＯＦＡ／ｉＬＲＰを、以下の標準的なプロトコールに従って精製する［２、３、２６、２９］。サイズは、固有のゲル電気泳動またはサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、上記のように検証する。二量体を捕捉するための、ＦＲＥＰＲＬＬＶＶＴＤＲＡＤＨＱＰＬＴとは異なるエピトープに対する捕捉抗体を用いて、標準的なＥＬＩＳＡを行い、次に、モノマーの検出において用いられるビオチン化検出抗体を用いる。ＥＬＩＳＡは、標準的なプロトコールに従って行う［３９］。これによって、生体液および組織溶解物内に存在する二量体ＯＦＡ／ｉＬＲＰの量が決定される。性質、転移量、および他の臨床的に関連する情報についてのさらなる情報は、全ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対するモノマーＯＦＡ／ｉＬＲＰの比率によって得ることができる。
【００６２】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰの免疫組織化学的検出
上記に列挙した抗体を、癌および癌の可能性をｉｎ ｓｉｔｕで検出する方法としての免疫組織化学（ＩＨＣ）に用いることができる。類似の技術が、癌を同定するために用いられているが、それらは、６７ｋＤａのタンパク質を検出する［５、１７、４１］。ＩＨＣ法は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの検出にカスタマイズされている標準的なプロトコールに従う。プロトコールは、以下に列挙するものに類似している。
【００６３】
切断した組織を、キシレンなどの、組織の組織学的分析のための標準的なプロトコールに従って脱パラフィン化し、その後、エタノールの濃度を低下させ、少なくともＩ型のラボウォーター内に入れる。抗原の賦活化は、ｐＨ６．０に調整した０．０１Ｍのクエン酸緩衝液内での熱誘導型エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）を用いて、標準的なプロトコールに従う。エピトープ（複数可）は、直接的な加熱方法（ホットプレート）または間接的な加熱方法（マイクロ波）を用いて賦活化することができる［３７］。簡潔に述べると、脱パラフィン化した組織切片をスライドホルダー内に置き、９０℃超のクエン酸緩衝液で満たした染色皿内に置く。組織を加熱し、約１０分間にわたり９０℃超を維持する。処理時間は、組織のタイプ、組織の厚さ、および様々な他の因子に依存する。適切に処理したら、組織を、標準的な方法に従って、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−ｔ）内で３回洗浄する。組織を、湿潤チャンバ内で、標準的なＩＨＣブロック緩衝液（ＢＳＡまたは非特異的な抗体／タンパク質相互作用を減少させるために用いる他の試薬を有するＰＢＳ−ｔ）と共に、室温でインキュベートする。スライドをＰＢＳ−ｔ内で３回洗浄する。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体を、ＢＳＡまたは同等物を有するＰＢＳ−ｔ内に適切に希釈し、処理した組織と共にインキュベートする。スライドを上記のように洗浄する（３×ＰＢＳ−ｔ）。組織を、ビオチン化されたユニバーサル二次抗体（または同等物）と共にインキュベートして、ストレプトアビジンに基づいた系を用いる検出を可能にする。スライドを上記のように洗浄し、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ｜Ａｂ｜２°抗体複合体を、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔ、フルオロフォア、放射性核種、または他の検出方法のいずれかに結合体化した標準的なストレプトアビジンを用いて検出する［３７、３９、４２］。組織を、標準的なプロトコールに従って可視化する。
【００６４】
蛍光偏光の定量のためのＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体の使用
抗体を、存在するＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を決定するための蛍光偏光（ＦＰ）実験のために用いることができる。さらに、モノマーのＦＰと二量体のＦＰとの比率も可能であり得る。ＦＰはまた、細胞表面上のＯＦＡ／ｉＬＲＰの可動性を決定するためにも用いることができる。蛍光偏光実験における抗体の使用の決定は、これまでの研究に基づくが、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの定量のために特異的に開発されている［４３〜４９］。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体の使用を決定するために、モノクローナル抗体を標準的なフルオロフォアに結合体化させ、標識された抗体を、ＳＭ−２バイオビーズプロトコールに従って、遊離標識から取り除くことができる［５０］。精製したら、タンパク質の濃度および蛍光の取り込みを、フルオロフォアに対するタンパク質の比率として決定することができる。結合体化したら、抗体を適切に保存し、後に使用することができる。
【００６５】
ＦＰ実験において用いる抗体の能力を試験するために、抗体を、ＥＬＩＳＡ技術に一般に用いられる抗体濃度の決定に類似の適切な量と混合することができる［３９］。簡潔に述べると、一方の軸に沿ってはＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質の量で、および他方の軸に沿っては標識された抗体の量での、二倍希釈を有する、蛍光のために設計された９６ウェルプレートを用いる。希釈は、標準的なＦＰ緩衝液で行い、非特異的な結合を防ぐための様々な異なる添加物を含有し得る。原型的な緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水、ＮＰ４０、ウシ血清アルブミン、ウシガンマグロブリン、グリセロール、またはバックグラウンドのノイズを減少させ特異性を増大させるための他の作用物質を含有し得る。混合したら、プレートをＢｅｃｋｍａｎ ＤＴＸ ８８０内に置き、含まれるＦＰ（フルオロセイン）フィルターを用いて、用いるフルオロフォアに応じて、ウェル当たり約１秒またはその他の読み取り時間にセットする。偏光値を、ｍＰ＝［（Ｉｓ−ＩｓＢ）−（Ｉｐ−ＩｐＢ］／［（Ｉｓ−ＩｓＢ）＋（Ｉｐ−ＩｐＢ）］×１０００という方程式を用いて計算されるミリ偏光単位（ｍＰ）で測定する［４７〜４９］。最初の実験では、抗体およびＯＦＡ／ｉＬＲＰの濃度に基づいた用量応答曲線が作成される。その後、過剰な未標識抗体を競合物質として用いて、特異性および平衡を決定することができる。さらに、これから生じたデータを用いて、結合分析プロット（すなわち、スキャッチャードプロットまたは類似のもの）を逆算することができ、次にそれを抗体の有効性を決定する方法として用いることができる。最初の条件が決定されたら、ＦＰ法を用いて、異なる生体液および組織溶解物内に存在するＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を計算することができる。
【００６６】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性細胞を単離／分離するため、または血液内のＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞量を決定するための、フローサイトメトリー分析における使用
循環性の血液型の癌の総癌量を決定するために、または、転移量を決定するために、フローサイトメトリーを用いることができる。簡潔に述べると、細胞懸濁液または末梢血を得る。細胞懸濁液を３００×ｇで８から１０分間遠心分離し、上清を取り除く。細胞をフローサイトメトリー染色緩衝液（フェノールレッド、０．１％アジ化ナトリウム、および１％ウシ血清アルブミンを有さないＨＢＢＳ）内で１回洗浄し、丸底の９６ウェルプレートまたは同等物の底に、細胞懸濁液１ｍｌまたは５０から１００μｌ当たり約２×１０７個の細胞で再懸濁する。細胞懸濁液に、染色緩衝液に希釈した、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）または同等物で標識したＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体を添加する。バックグラウンドのための対照として、抗体を全く用いずに、未標識のアイソタイプ対照抗体または同等物を用いて（過剰な未標識抗体または競合ペプチド）、細胞を試験する。細胞懸濁液および適切に希釈された抗体を、穏やかに混合しながら、氷上または４℃で、２０から６０分間にわたりインキュベートする。染色された細胞懸濁液を１００μｌの染色緩衝液で３回洗浄し、３００から５００×ｇで３から１０分間遠心分離する。最後の洗浄の後、細胞を約４００μｌの染色緩衝液内に懸濁し、分析するまで、４℃で蓋をして、暗所で保存する。さらなるステップは、死滅細胞を検出するためのヨウ化プロピジウムでの対比染色、または固定ステップの追加を含み得る。製造者の指示に従って、データを回収し、標準的なプロトコールに従って分析する［３０、３９、５１］。ＦＩＴＣの直接的な結合体化、またはビオチン／ストレプトアビジン−ＦＩＴＣを用いる検出を用いて、末梢血、細胞懸濁液、または他の由来源におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性細胞の数を検出し得ることが予想される。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性細胞の総数によって、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性疾患の侵攻性および／または進行についての洞察を得ることができる。
【００６７】
この方法の代替的適用もまた、センチネルリンパ節の分析を介して乳癌の転移量を決定するために用いることができる。簡潔に述べると、センチネルリンパ節（または初期癌病巣に近いあらゆるリンパ節）を、標準的なプロトコールに従って、５ｍｌの染色緩衝液内で穏やかに崩壊させる。細胞のスラリーを、１００μｍのメッシュを通して濾過し、上記のように約２回洗浄する。得られた細胞懸得濁液を用いて、局所的な転移を定量する。
【００６８】
抗体は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰまたはＯＦＡ／ｉＬＲＰに結合した他のタンパク質を除去し得る
ＦＲＥＰＲＬＬＶＶＴＤＲＡＤＨＱＰＬＴ抗体の位置および設計によって、タンパク質が、相互作用しているＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質を除去し得る可能性が出てくる。さらに、他の領域に対して設計された抗体を用いて、相互作用しているタンパク質を除去するかまたは前記タンパク質の結合を防ぐことができる。最初の方法は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰのホモ二量体的な相互作用の除去または予防に焦点を合わせたものである。
【００６９】
抗体が、相互作用しているＯＦＡ／ｉＬＲＰ分子を除去し得るという可能性を試験するために、２つの個別の実験を行う。まず、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ二量体を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量体形態を精製する標準的なプロトコールに従って精製する。タンパク質の二量体形態を、濃度を増大させていった、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する抗体と共にインキュベートする。標準的な抗体結合緩衝液（ＮＰ−４０、Ｔｗｅｅｎ−２０、ＢＳＡ、ＢＧＧ、または他の添加物を含有するＰＢＳ）内で、３７℃で１時間インキュベートした後、抗体による、二量体形態からモノマー形態への変換を、標準的なプロトコールに従って、非変性ポリアクリルアミドゲル上をランさせることによって決定する［３７、３８］。
【００７０】
用い得る第２の方法は、分子サイズに応じた、蛍光偏光における推定される変化を活用するものである。二量体の存在下では、主ＦＰは、抗体の回転のみに由来する。抗体が二量体を除去すると、モノマーへのシフトが生じ、蛍光偏光は変化する。
【００７１】
近接に起因する発光スペクトルを消失させるかまたは変化させるために、フルオロフォアをさらに用いることができる。２つ以上の抗体を用いて発光スペクトルを変化させることができるか、または、消失を用いてＯＦＡ／ｉＬＲＰ分子の状態および／もしくは安定性を決定することができる。
【００７２】
抗体を癌治療として用いる
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ配列を標的化するように設計された抗体を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性疾患のための治療または考えられる予防の形態として用いることができる。例えば、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を予防または治療するための試験は、標準的な細胞系を用いて、類似の動物モデルを用いて行うことができる。癌のＯＦＡ／ｉＬＲＰの予防について試験するために、抗体を、癌のチャレンジの前に齧歯動物（マウスまたはラット）に注射することができる。治療について試験するために、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体を癌のチャレンジの後に注射することができる。癌のチャレンジは、いくつかは接着性であり、いくつかは非接着性である、様々な異なる公知の癌性細胞系である。細胞を成長させ、齧歯動物モデル系に導入する。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞の量は、様々な異なる方法を介して定量することができる。さらに、尾部の静脈を介して注射された接着細胞では、肺のコロニー形成が増大する。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体の治療および／予防能力は、未治療の動物に対する、治療された肺に存在する癌細胞の数によって計算することができる。さらなる対照は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体と同一のスケジュールでの、非特異的アイソタイプ対照抗体の注射であり得る。さらに、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体は、現在の癌治療法を補強する。考えられるアレルギー反応を減少させるために、ヒトにおいて用いる前に、標準的なプロトコールに従って、抗体をクローニングおよびヒト化することができる。
【００７３】
抗体は、生物学的機能を改変させ、ＯＦＡ／ｉＬＲＰを発現する関連する疾患により生じる、改変した効果をもたらし得る
抗体は、全体的な浸潤性または標準化された基質への結合能力を改変させ得る。標準的な細胞系を、標準的なプロトコールに従って試験することができる。哺乳動物細胞および非哺乳動物細胞に対する、考えられる薬理学的影響を決定するために行われる１つの試験は、成長速度、例えば様々な異なる濃度のペプチドの存在下および不存在下での細胞の成長に対する効果と、アポトーシス、壊死、および細胞増殖に対する影響を測定することである。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞は、様々な用量のペプチドを伴う様々な異なる基底膜上で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長し得る。ペプチドの効果は、標準的な方法に従って、限定はしないが、ＤＮＡラダー、細胞死検出ＥＬＩＳＡ、カスパーゼ測定、ＴＵＮＥＬアッセイ、アネキシン−Ｖ膜改変、ＤＮＡ染色、ＦＡＳ、ｐ５３、細胞傷害性アッセイ、細胞増殖、および細胞の生存能力を含む、様々な異なる方法によって測定することができる。
【００７４】
ペプチドは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞の浸潤性を増大または減少させる能力を有し得る。これは、他のタンパク質を伴ういくつかの研究に類似した［５２〜５５］、変更されたボイデンチャンバーを用いて、様々な異なる濃度のペプチドの存在下または不存在下でＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性細胞を成長させることによって測定することができる。ペプチドはまた、細胞の接着に影響し得、標準的な方法を用いて測定され得る。接着性の培養されたＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞を、異なる細胞外マトリクスタンパク質（ＥＣＭ）の存在下で、ペプチドと共に培養する。細胞を次に、ペプチドの存在下での細胞系の相対的な付着を決定するための標準的な方法に従ってアッセイする［５６〜５９］。いくつかの他の一般に用いられる技術を、細胞の生存能力、増殖、細胞の死滅、およびアポトーシスに対するＯＦＡ／ｉＬＲＰの影響を決定するために適用することができる［３７〜３９、４２］。
【００７５】
抗体をコロイドに連結させて、抗癌活性を持たせるか、または、ｉｎ ｖｉｖｏでの癌マーカーを提供する
抗体は、様々な異なるコロイドに付着または架橋し得る。例えば、金コロイドまたは銀コロイドを用いて、共鳴光散乱または代替的方法を介して、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性細胞を同定することができる。コロイドのさらなる使用には、酸素フリーラジカルまたは類似物が含まれ得る。抗体に連結したコロイド剤は、可能性を増大させ、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞は、フリーラジカルに曝露される。
【００７６】
抗体を、Ｘ線不透過性の染料、またはＸ線と共に用いるための類似のタイプの結合体に連結させる
抗体を、放射線不透過性の染料または類似物に結合体化する［６０］。癌性状態を初期におよび正確に検出する能力は、患者の治療の選択に役立つ。抗体を放射線不透過性の染料または同等物に結合体化して、現在のｘ線に基づいた技術の有効性を増大させることが可能である。さらに、抗体を、ＭＲＩによって検出される特異的な共鳴周波数に「同調」し得る分子に連結させることができる。考えられる結合体には、限定はしないが、蛍光染料への結合体化に用いられるものに類似の抗体に付着し得る、化学的に反応性のガドリニウムに基づいた系が含まれる。一般に用いられる技術は、抗体上に見られる第１級アミンと反応するテトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル部分の付加である。未反応のＴＦＰガドリニウムは、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて取り除くことができる。ヒトにおいて臨床的に用いるために、抗体はヒト化されている必要があり得る。上記に記載される方法は、標準的なプロトコールに従う。
【００７７】
概念の証拠として、活性な免疫系を有する動物モデルは必要なく、このことによって、標準的な技術の使用が可能となる［６１］。最初の研究は、ｘ線を用いる必要はないが、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体の、ｉｎ ｖｉｖｏで結合する能力を実証する必要がある。抗体または同等物は、フルオロフォア、コロイド、酵素結合体、または容易に検出され得る他の方法に結合体化する。結合体化した抗体は、様々な異なる用量で、また規定された時点で、動物に注射され、誘発された腫瘍は、抗体の結合を探すために試料採取され得る。この結合は、これを用いて診断イメージングのために腫瘍を標的化し得ることを示し得る。さらなる方法には、抗体への共有結合による連結のためにエポキシシラン誘導体または類似物で被覆され得る、金ナノ粒子の使用が含まれる［６２］。
【００７８】
抗体を化学療法剤に連結させて、および化学療法剤と結合体化させて、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞に対するものとする
従来の化学療法に関連する副作用の数を減少させるために、標的化されたアプローチを採用することができる。抗癌薬のための標的化作用物質としてＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体を用いることによって、現在の治療法の安全性および効力が増大し得る。この効率を試験する方法として、かつ概念の証拠として、抗体を、リポソーム型の系に組み込むことができ、ここで、リポソームは、化学療法剤を含有する。標的化の能力を示すために、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ細胞、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ癌細胞の混合物、および正常なヒト細胞を、細胞培養プレート内で混合することができる。混合物を添加し、類似の用量の化学療法剤、またはアイソタイプ対照抗体が組み込まれたリポソームでの細胞の治療と比較することができる。標的アプローチは、正常細胞に対する大きな影響を伴うことなく、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性細胞の高い死亡率をもたらすことが予想される。この効果は、様々な異なる標準的な技術を介して決定することができる。標準的な化学療法剤を用いることができる一方で、別の技術は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体への放射性分子の付着を用いることができる。例えば、抗体は、標準的なプロトコールに従ってヨウ素化される。
【００７９】
化学療法剤に直接的に連結させること、抗体作用物質を有するリポソーム、または化学療法剤に浸したポリアクリルアミド／アガロースビーズを生じさせることに加え、抗体を代替的送達方法に付着させることができる。カーボンナノチューブ、または化学療法剤を坦持し得る同等物を用いることが可能であり得る。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性細胞と相互作用させると、シグナルが生じて、ナノチューブが共鳴し、含有される抗癌剤が放出され得る。引き金は、様々な異なる方法であり得る。抗体は、ナノカーボン、ナノゴールド、ならびに他のナノチューブおよびナノ作用物質に連結させることができ、およびそれと結合体化させることができ、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞を標的化するために、マイクロエレクトロ／電波感受性装置または類似の装置に供することができる。抗体と抗癌剤との間で直接的に連結すると、反応性のリンカー分子は、標的化されて、抗癌剤を放出する。この例は、ＵＶまたはｘ線により切断可能な、抗体と抗癌剤との間のリンカーであり得る。ｘ線（放射線療法）の存在下では、リンカーは切断され、抗癌剤を放出し得る。別の方法は、腫瘍の微小環境にあるときに切断されるプロテアーゼ切断部位を有するペプチドリンカーを用いる。
【００８０】
抗体を、標的細胞の生物学的機能を改変する他のタンパク質に連結することができ、かつ前記タンパク質と結合体化させることができる
抗体は、特定のタイプの免疫応答のみを指示し得る。ＤＮＡワクチン接種をもたらすための、２つの異なる配列の融合が、以前に用いられている［６３］。この分子は、腫瘍または周辺領域を調節し得る生物学的に活性な配列に融合された、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体結合領域のハイブリッドである。１対の可能性は、ヒト化ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体の活性領域をクローニングすることと、それを免疫系の調節因子、細胞周期の調節因子、またはアポトーシスを誘発するタンパク質配列に融合することである。非特異的な事象を予防するためには、タンパク質を操作して、腫瘍の微小環境内になるまで不活性であり続けるようにする。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体は、プロテアーゼ切断部位のリンカーに融合され、それは次に、アポトーシスを誘発するペプチドまたは小分子に付着して、腫瘍に対する免疫応答を誘発する。２つの異なる分子の融合によって、癌細胞に対する増大した特異性を伴って標的化され得る多価抗体が可能になり得る。
【００８１】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体とマイクロエレクトロ流体装置または同等の装置との使用を、診断的に、または現在行われているスクリーニング方法として用いる
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体または活性領域を、マイクロエレクトロ流体装置上に被覆して、血流におけるリアルタイムなＯＦＡ／ｉＬＲＰの発現を測定する。装置は、癌を確認するためのモニタリング装置として機能するように、内蔵型である。抗体は、フィルムまたは他のマイクロ装置上に被覆されて、癌の検出を可能にする。１対の方法に基づいて、結合した量を決定することが可能である。まず、抗体を、規定された流量を通す分子カンチレバー上に被覆することができる。抗原と抗体との間のリアルタイムでの相互作用が生じると、被覆されたレバー上のトルクが増大する。これが次に、抵抗の変化または電荷の誘発を介して測定され得る。類似の技術を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体で被覆された薄いフィルムと共に用いることができ、抗原が結合すると、フィルム上の電荷または相互作用または電圧の変化を測定し、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの発現の変化と相関させることができる。これらの技術はＯＦＡ／ｉＬＲＰに限定されないが、あらゆる癌分子をマイクロ移植型装置として用いることができ、前記装置は、臨床医によって必要に応じて読み取られて、臨床医に、再発または転移性の疾患の進行を警告し得る。
【００８２】
腫瘍の切除において医師を支援するための、放射能、蛍光、または同等の分子に付着したＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体の使用
癌の切除の際に外科医を支援するものとして、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体の使用をフルオロフォア、放射性マーカー、染料、または同等物に組み合わせて、外科医が癌性の成長を容易に同定することを可能にする。さらに、この技術は、転移性の疾患を含有し得るリンパ節を迅速に同定するために用いることができ、例えば、現行の放射能などの、同定を可能にするための適切な結合体に連結した抗癌抗体が、センチネルリンパ節の生検に用いられる。注射した後、患者を、通常通りの手順で手術する。しかし、癌の発見またはリンパ節の検査が困難であれば、ガイガーカウンター、ＵＶ、または癌性領域の迅速な同定を可能にする他の光源を用いることができる。癌は、適切な外科治療を用いて切除される。この方法は、癌の同定／切除において非常に役立ち得る。
【００８３】
免疫沈降のための抗体の使用
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体は、新規な治療標的を同定するための免疫沈降に用いられる。細胞溶解物を、標準的なプロトコールに従って免疫沈降させる［３７、３９］。得られたタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、２ｄゲル電気泳動、質量分析、または他の方法で分析することができる。得られた情報は、臨床的な診断または治療に用いることができる、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに関連する考えられるメカニズムについての洞察をもたらし得る。
【００８４】
以下の実施例は、限定はしないが本発明の範囲を例示することを意図したものである。このような実施例は、用いられ得るものの典型であるが、当業者に公知の他の手順を代わりに用いることができる。実際、当業者であれば、必要以上の実験を行うことなく、本明細書における教示に基づいて、さらなる実施形態を容易に想像し、もたらすことができる。
【実施例】
【００８５】
（実施例１）
ＯＦＡ／ｉＬＲＰモノクローナル抗体２Ｃ６および３Ｇ７を作製する方法
ＯＦＡ／ｉＬＲＰモノクローナル抗体２Ｃ６および３Ｇ７を、標準的な方法およびプロトコールを用いて、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙで作製した。ＦＲＥＰＲＬＬＶＶＴＤＰＲＣのペプチドを用いて、モノクローナル抗体３Ｇ７を生成させた。ＹＲＤＰＥＥＩＥＫＥＥＱＣのペプチドを用いて、モノクローナル抗体２Ｃ６を生成させた。
【００８６】
合成されたペプチドを、標準的なプロトコールを用いて、マレイミドで活性化したＫＬＨに結合体化した（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、Ｒｏｃｋｆｏｒｋ、ＩＬ）。結合体化したら、ＫＬＨ−ＯＦＡペプチドを用いて、ペプチド当たり２頭の異なるマウスを免疫化した。免疫化した後、尾部の出血を介して血清を得、血清を用いて、ＢＳＡ結合体ペプチドに対する抗体力価についてスクリーニングした（図１）。ペプチドに対して陽性であれば、組換えヒトＯＦＡ／ｉＬＲＰを用いて間接ＥＬＩＳＡを行って、抗体がタンパク質と反応することを検証した。これは、抗体が小ペプチドおよび完全長タンパク質に対して反応することを確実にするために行った。ペプチドおよびタンパク質に対する反応性を検証した後、脾臓細胞を骨髄腫細胞系と融合し、９６ウェル培養プレート内で選択した。生存能力を有するコロニーを生きたまま維持し、次に、ペプチドおよびＯＦＡ／ｉＬＲＰに対してスクリーニングした（上記に類似）。ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して高い活性を有するがＢＳＡで被覆したウェルに対しては高い活性を有していない、ハイブリドーマ組織培養物の上清を、免疫グロブリンの分類（ＩｇＧまたはＩｇＭ）のために選択した。ＩｇＭであったあらゆるクローンをスクリーニングから排除し、ＩｇＧを産生するハイブリドーマを、標準的なプロトコールに従って成長させた。培地から抗体をさらに精製するために、タンパク質Ｇの選択を、標準的なプロトコールに従って行った（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）。溶出した抗体の濃度を、Ａ２６０の吸光度を用いて決定し、これを２Ｃ６抗体および３Ｇ７抗体の産生のために用いた。
【００８７】
（実施例２）
ｒＨｕ ＯＦＡに対する活性についての尾部出血の分析
この研究において、組換え完全長ヒトＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する活性を分析した。Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、アジ化ナトリウムを有するＰＢＳ内の１０μｇ／ｍｌの濃度のＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質で被覆した。プレートを３７℃で２時間にわたりインキュベートした。プレートを水で３回洗浄し、次に、ＰＢＳ−ｔ内で、５％脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）で少なくとも１時間にわたりブロックした。プレートをＰＢＳ−ｔで３回洗浄し、尾部出血および陽性対照を５％ＮＦＤＭに添加した。プレートを、振とうしながら、４℃で一晩インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、５％ＮＦＤＭ内に１：１００で希釈したユニバーサル二次抗体内で、室温で１時間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：２００ Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に室温で３０分間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、２００μｌのＳＩＧＭＡ ＦＡＳＴ（商標）ＯＰＤを各ウェルに添加した。反応についてプレートを観察し、５０μｌの停止液（２ｎのＨ２ＳＯ４）でプレートを停止させたが、低いバックグラウンドは依然として存在した。塩基性の終点ＥＬＩＳＡ ｗ／ＯＰＤおよび酸性停止液のための機器上で、標準的なプロトコールに従って、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３８４でプレートを読み取り、分析した。
【００８８】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して設計された免疫化ペプチドの全て（表２）は、組換え完全長ＯＦＡタンパク質と反応し得る尾部出血血清を産生した。Ｃｏｇｇｉｎ博士、Ｒｏｈｒｅｒ博士、およびＢａｒｓｏｕｍ博士によって提供された、これまでに開発されたモノクローナル抗体（陽性対照）と比較すると、モノクローナル抗体が２ｍｇ／ｍｌを超える濃度であったにもかかわらず、尾部出血血清は、同様の、またはわずかに良好な結果を示した（図２）。この実験はさらに、患者および診断試料の抗体力価を決定するための、捕捉抗原としてのＯＦＡ／ｉＬＲＰの使用を実証する。
【００８９】
結果は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対するペプチド由来の抗体が、組換え完全長タンパク質を認識し得ることを示す。さらに、プレートへの組換え完全長ＯＦＡの被覆は、さらなる抗体の開発または抗ＯＦＡ免疫応答のモニタリングのためのスクリーニング方法として用いることができる。
【００９０】
（実施例３）
モノクローナル抗体の反応性を決定するためのｒＯＦＡ／ｉＬＲＰの間接ＥＬＩＳＡ
この研究において、組換えＯＦＡ／ｉＬＲＰへのＯＦＡ／ｉＬＲＰの特異的領域に対して設計されたモノクローナル抗体の免疫反応性を決定した。簡潔に述べると、Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ＨＢＸプレートを、ＰＢＳ内に２μｇ／ｍｌの濃度のＯＦＡ／ｉＬＲＰタンパク質で被覆した。プレートを４℃で一晩インキュベートした。プレートを水で３回洗浄し、次に、ＰＢＳ−ｔ内の１％ＢＳＡで少なくとも１時間にわたりブロックした。プレートをＰＢＳ−ｔで３回洗浄し、モノクローナル抗体の５倍希釈シリーズを、１：１０の高濃度および１：７８１２５０の低濃度で、８個のウェルに沿ってランさせた。プレートを、振とうしながら、４℃で一晩インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、１：５００００のビオチン化した抗マウスＩｇＧ二次抗体と共に１時間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：２５００００）と共に、室温で３０分間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ Ｔｗｏ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰマイクロウェル基質（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ）を各ウェルに添加した。反応についてプレートを観察し、５０μｌの停止液（２ｎのＨ２ＳＯ４）でプレートを停止させたが、低いバックグラウンドは依然として存在した。塩基性の終点ＥＬＩＳＡ ｗ／ＨＲＰおよびＴＭＢのための機器上で、標準的なプロトコールに従って、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘでプレートを読み取り、分析した。
【００９１】
図３の結果は、ｒＨｕ ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する間接ＥＬＩＳＡでのモノクローナル抗体２Ｃ６および３Ｇ７のランの希釈曲線を示す（ｎ＝４）。１：１０から開始し１：７８１２５０まで低下する５倍希釈物での８点の希釈シリーズは、ＯＦＡに対するモノクローナル２Ｃ６の強い反応があること、およびこのアッセイにおいて２Ｃ６抗体を用いると検出のダイナミックレンジが存在することを示す。
【００９２】
図３はまた、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対する間接ＥＬＩＳＡでランされたモノクローナル抗体３Ｇ７の希釈曲線を示す。上記のものと同一の８点の希釈シリーズは、ＯＦＡに対するモノクローナル３Ｇ７の強い反応があること、およびこのアッセイにおいて３Ｇ７抗体を用いると検出のダイナミックレンジが存在することを示す（ｎ＝４）。
【００９３】
このデータは、これらのモノクローナル抗体（２Ｃ６および３Ｇ７）の両方が、完全長ＯＦＡ／ｉＬＲＰを認識し結合する能力を有することを示す。このデータは、操作された抗体を、広範な下流の診断試験に用い得る特異的様式でＯＦＡを検出するために用いることができることを実証する。これらはまた、様々な生体液において抗ＯＦＡ抗体の存在を探すための標準として用いることができる。
【００９４】
（実施例４）
モノクローナル抗体の反応性を決定するためのｒＯＦＡ／ｉＬＲＰのサンドイッチＥＬＩＳＡ
Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ＨＢＸプレートを、ＰＢＳ内に１０μｇ／ｍｌの濃度の２Ｃ６モノクローナル抗体で被覆した。プレートを室温で一晩インキュベートした。プレートを水で３回洗浄し、次に、ＰＢＳ−ｔ内の１％ＢＳＡで１時間にわたりブロックした。プレートをＰＢＳ−ｔで３回洗浄し、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの２倍希釈シリーズを、５０００ｎｇ／ｍｌの高濃度および７８．１２５ｎｇ／ｍｌの低濃度で、８個のウェルに沿ってランさせた。ＯＦＡ／ｉＬＲＰ標準をＰＢＳ内の５％ＢＳＡ内で調製して、血清濃度をシミュレートした。プレートを、振とうしながら、室温で２時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、ビオチン化した３Ｇ７モノクローナル抗体と共に２時間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：２００）（Ｒ＆Ｄ）と共に、室温で３０分間にわたりインキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ Ｔｗｏ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＨＲＰマイクロウェル基質（ＢｉｏＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｗｉｎｇｓ Ｍｉｌｌｓ、ＭＤ）を各ウェルに添加した。反応についてプレートを観察し、５０μｌの停止液（２ｎのＨ２ＳＯ４）でプレートを停止させたが、低いバックグラウンドは依然として存在した。塩基性の終点ＥＬＩＳＡ ｗ／ＨＲＰおよびＴＭＢのための機器上で、標準的なプロトコールに従って、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘで、４５０ｎｍでプレートを読み取り、分析した。
【００９５】
図４は、広範な濃度のＯＦＡ／ｉＬＲＰの検量線、および、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて本発明のモノクローナル抗体がそれを検出する能力を示す。このデータは、これらのモノクローナル抗体（２Ｃ６および３Ｇ７）の両方が、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検出され得る様式で完全長ＯＦＡ／ｉＬＲＰを認識し結合する能力を有することを示す。逆にすると（すなわち、３Ｇ７捕捉／２Ｃ６検出）、同様の結果が見られたが、反応の吸光度は、２Ｃ６を捕捉抗体として用いた場合よりも有意に低かった（データは示していない）。同様に、このデータは、操作された抗体を、広範な下流の診断試験に用い得る特異的様式でＯＦＡを検出するために用いることができることを実証する。このタイプのＥＬＩＳＡは、様々な生体液および組織溶解物においてＯＦＡ／ｉＬＲＰの存在を探すために用いることができる。さらに、この技術は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに基づいた治療法についての組み入れ基準／除外基準に適用することができるか、または、癌の診断として用いることができる。抗体は、タンパク質の保存領域に対して設計され、ＯＦＡ／ｉＬＲＰを発現する全ての種と交差反応する。
【００９６】
（実施例５）
ペプチド由来のモノクローナル抗体を用いた、癌胎児抗原未熟ラミニン受容体の蛍光偏光
この実験は、蛍光偏光におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰの２Ｃ６クローンの有用性を実証するものである。血清試料をシミュレートするために、全ての標準を、リン酸緩衝生理食塩水内の５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）内に希釈した。実験は、一部はＨＳＰ９０の研究に基づくものであったが、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｓｃｅｉｎｅ）−５−マレイミド標識抗体を、ＨＳＰ９０に結合し得る小さな蛍光分子であるゲルダナマイシン−ＢＯＤＩＰＹの代わりに用いた［４９、４５］。
【００９７】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰモノクローナル抗体２Ｃ６および３Ｇ７を、標準的なプロトコールに従って、フルオレセイン−５−マレイミド（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で標識した。結合していない染料は、製造者のプロトコールに従って、標準的な染料除去カラムを用いて取り除いた。抗体を標識した後、これを蛍光偏光の実験において用いた。
【００９８】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰをＰＢＳ内の５％ＢＳＡ内に、４００００ｎｇ／ｍｌに希釈し、５０μｌを最上部のウェルに添加し、９６ウェルブラックプレート（Ｃｌｉｎｉｐｌａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において、ＰＢＳ内の５％ＢＳＡ内に６倍希釈した。高濃度の血清アルブミン（５％超の血清アルブミン）を用いて、血清濃度をシミュレートした。標識された抗体を、０．１％の正常なヒト血漿および０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するＰＢＳ内に２０μｇ／ｍｌに希釈した。希釈された抗体溶液（５０μｌ）をウェルに分配し、混合し、密封し、光から覆い、４℃で一晩インキュベートした。プレートは、室温に調整できるようにし、蛍光偏光は、ＤＴＸ−８８０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａ）で測定した。蛍光の取り込み時間が０．０００１秒であったことを除いて、製造者の蛍光プロトコールを用いた。データをエクセルにエクスポートし、これまでに概説されているようにしてｍＰを計算した［４９］。生のデータを、Ｐｒｉｓｍ ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ）を用いてｌｏｇ表示のｘ軸にプロットし（図５Ａ）、一元ＡＮＯＶＡを用いて分析して、計算されたｍＰ値に対してバックグラウンドを比較し、４パラメータロジスティックが可能になるように変換した（図５Ｂ）（ｒ２＝０．９７５）ｎ＝２。
【００９９】
５％ＢＳＡ／ＰＢＳにおけるＯＦＡの濃度は、４００００から０．８５ｎｇ／ｍｌにわたり、１０００ｎｇ／ｍｌ（飽和による）未満から３０．８６ｎｇ／ｍｌ未満の範囲を示した（図５Ａ）。１０００ｎｇ／ｍｌを超える濃度では、シグナルは飽和し、データを変換し、４パラメータロジスティックを実施し、ｒ２＞０．９５である場合、３０．６ｎｇ／ｍｌ（５．１ｎｇ／ｍｌ）未満では、シグナルはバックグラウンドと有意には異ならなかった（図５Ｂ）。
【０１００】
結果は、ペプチド由来のＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体を、蛍光偏光を用いてＯＦＡ／ｉＬＲＰの濃度を決定するために用い得ることを実証する。検量線によってもたらされるデータは、血清、血漿、組織溶解物、またはＯＦＡ／ｉＬＲＰを含有するあらゆる溶解可能な由来源からの未知数を計算するために用いることができる、許容されるｒ２値を有していた。
【０１０１】
（実施例６）
ＯＦＡ／ｉＬＲＰの免疫組織化学的染色
この研究の目的は、正常な隣接組織においては反応を限られたものとしながら、ホルマリンで固定されパラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）６ミクロンの厚さの腫瘍切片においてＯＦＡ／ｉＬＲＰを検出する、本発明のモノクローナル抗体の能力を分析するためのものであった。
【０１０２】
マウス一次抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）と共に用いるためのＭａｘＴａｇ Ｈｉｓｔｏキットが提供されるプロトコールに従って、実験を行った。簡潔に述べると、ＦＦＰＥの６ミクロンの腫瘍スライドを、キシレンで脱パラフィン化し、次に、濃度を減少させていったエタノール（ＥｔＯＨ）で再水和し、次に水で希釈し、最後にＰＢＳ内に置いた。全てのインキュベーションステップは、湿潤チャンバ内で実施した。スライド上の、組織を含有する領域にＰＡＰペンで印を付け、次に、ＰＢＳ内の１％過酸化水素および１％正常ヤギ血清内で５分間にわたりブロックして、内因性ペルオキシダーゼの活性を取り除いた。次に、スライドをＰＢＳ内で５分間にわたり３回洗浄した。一次抗体をＰＢＳ＋１％正常ヤギ血清内に１：２５０で希釈し、４℃で一晩、スライド上でインキュベートした。これまでの実験は、１：１０および１：５０の一次抗体希釈物でランし、非常に高いバックグラウンド染色を有していた。（データは示していない）。次に、スライドをＰＢＳ内で５分間にわたり３回洗浄し、次に、キットにおいて提供される二次抗体を添加し、それらを室温で３０分間にわたりインキュベートした。スライドを再び洗浄し、希釈した、キットのストレプトアビジンペルオキシダーゼ試薬を添加し、室温で３０分間にわたりインキュベートした。スライドを再び洗浄し、供給されたＤＡＢ試薬を添加し、発色についてモニタリングしながら、１５分間にわたりインキュベートした。ＤＡＢの反応は、正常な隣接組織の真のバックグラウンド染色を決定するために、製造者の推奨よりも１０分長くインキュベートすることが可能であった。次に、スライドを蒸留水で２分間にわたり３回洗浄した。ヘマトキシリン対比染色液を添加し、スライドを５分間にわたりインキュベートした。スライドを水で２分間にわたり３回、再び洗浄し、それぞれ２分間にわたり４回、１００％ＥｔＯＨで脱水し、次に、それぞれ２分間にわたりキシレンを４回交換して、クリアにした。組織を顕微鏡下で観察し、茶色の沈殿物として可視化される陽性反応およびライトブルーの核染色で評価した。
【０１０３】
染色は複数の腫瘍タイプに対してランした。図６に示されるスライドは、一次抗体としての３Ｇ７モノクローナル抗体で染色されている、中度に分化した浸潤性の乳管癌腫であるＴ２Ｎ１Ｍ０を示す代表的な切片である。スライドの染色は、アイソタイプ対照のランスライド（データは示していない）と同様に、非常に暗い黒い沈殿物から非常に明るいものにわたる。ＯＦＡ／ｉＬＲＦの発現は、これまでに試験された全ての腫瘍タイプにおいて見られている。
【０１０４】
結果は、モノクローナル抗体が、ＩＨＣ染色プロトコールに適しており、様々な異なる実験上および診断上の適用において用いられ得ることを示す。１つの考えら得る適用は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ療法への適用性のためのものであるか、または、スクリーニング／診断試験としてのものである。ＯＦＡ／ｉＬＲＰは保存領域に対して特異的に設計されるため、これらの抗体は、全ての種と交差反応する。
【０１０５】
（実施例７）
細胞の生存能力に対するＯＦＡ／ｉＬＲＰモノクローナル抗体の効果
この実験の目的は、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに対して設計されたモノクローナル抗体が細胞の生存能力に対して何らかの影響を有しているかを決定することである。ＯＦＡ／ｉＬＲＰの性質に起因して、ＯＦＡ｜ＯＦＡからＬＲへの変換を混乱させるために設計されたモノクローナル抗体および他のタンパク質｜タンパク質相互作用を阻害するモノクローナル抗体が活性を有するであろうことが予想された。
【０１０６】
全ての細胞を、湿潤チャンバ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）内で、３７℃で、Ｌ−グルタミン、１００Ｉ．Ｕ．のペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１０％ウシ胎児血清を有するＲＰＭＩ１６４０内で成長させた。ＤＵ１４５細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、標準的なプロトコールに従って、培地において成長させた。ＤＵ１４５細胞を７５から８５％の間の密度まで成長させ、標準的なプロトコールに従って回収し、変更されたＮｅｕｂａｕｅｒブライトライン血球計を用いて計数し、４０００００個細胞／ｍｌで懸濁させた。
【０１０７】
モノクローナル抗体（２Ｃ６および３Ｇ７）を完全培地内に溶解した。適切な濃度まで希釈した後、５０μｌを、ラミニン／エンタクチン複合体（５０μｇ／ｍｌ）で被覆されているかまたは未処理の（透明な底部を有する黒色）９６ウェルアッセイプレート内に分配し（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）、５０μｌの細胞（２００００個細胞／ウェル）を一晩成長させた。２０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））を細胞に添加し、それを３７℃でさらに２時間にわたりインキュベートした。細胞を、標準的な蛍光プロトコールに従って、０．００１秒の取り込み時間で、ＤＴＸ−８８０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｃ．）で読み取った。カスパーゼ活性が誘発されたかどうかを決定するために、カスパーゼ３／７の活性を、ＡｐｏＯｎｅアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて決定した。データをエクセルにエクスポートし、次に、Ｐｒｉｓｍ５．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ）にエクスポートし、そこでプロットし、一元ＡＮＯＶＡを用いて、バックグラウンド対照（ペプチドに用いられた希釈物）との間の統計上の差について分析した。対照群（０）と処理群との間の差を決定するために、Ｄｕｎｎｅｔｓ事後試験を行った。全てのｐ＜０．０５（＊）は有意であると考えられた。
【０１０８】
ＤＵ１４５細胞の全てを、被覆されていないかまたはラミニン／エンタクチンで被覆された９６ウェルプレート上で成長させた。２Ｃ６または３Ｇ７の存在下で、細胞の生存能力に対する影響が存在した（図７ＡおよびＢ）。一元ＡＮＯＶＡによって統計的に分析すると、２Ｃ６抗体および３Ｇ７抗体は、高い濃度でも、対照群と比較して生存能力を低下させた。しかし、３Ｇ７（０．３２ｍｇ／ｍｌ）と２Ｃ６（１．２９ｍｇ／ｍｌ）との間の濃度差を考慮すると、３Ｇ７は、より優れた活性を有すると考えられる。ＡｐｏＯｎｅカスパーゼ３／７アッセイにおいて、いずれの群においても有意差は見られなかった。
【０１０９】
ＤＵ１４５細胞をいずれかの抗体の存在下で成長させると、この細胞は、ＰＢＳ単独と比較して、細胞の生存能力に対して有意な影響を有していると考えられる。カスパーゼ３／７の活性化はなく、ＡｐｏＯｎｅアッセイにおいて有意な変化は見られなかった。このことは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰ抗体が、抗癌療法として用いられる能力を有し得ることを示す。
【０１１０】
本明細書においてこれまでに説明された発明の多くの変更および変形が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行われ得、したがって、添付の特許請求の範囲によって示されるような限定のみが課せられる。
【０１１１】
本明細書において引用される全ての特許および論文の参考文献は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
参考文献
【０１１３】
【化１】
【０１１４】
【化２】
【０１１５】
【化３】
【０１１６】
【化４】
【０１１７】
【化５】
【０１１８】
【化６】
【０１１９】
【表１】
【０１２０】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌胎児抗原／未熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）の免疫原性である領域に特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項２】
前記免疫原性領域が、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量化領域に位置する、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰの前記領域が、（ａ）ＦＦＲＥＰＲＬＬＶＶＴＤＰＲ、（ｂ）ＶＴＤＰＲＡＤＨＱＰＬＴＥ、（ｃ）ＹＲＤＰＥＥＩＥＫＥＥＱ、または（ｄ）ＦＰＴＥＤＷＳＡＱＰＡＴＥＤのポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項４】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰの前記領域が、免疫原性応答を増大させるペプチドに結合体化している、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項５】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰが、キーホールリンペットヘモシアニン、オボアルブミン、または血清アルブミンに結合体化している、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項６】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が２Ｃ６または３Ｇ７である、請求項６に記載の単離された抗体。
【請求項８】
前記領域が、ＦＲＥＰＲＬＬＶＶＴＤＰＲＣまたはＹＲＤＰＥＥＩＥＫＥＥＱＣのポリペプチド配列を含む、請求項６に記載の単離された抗体。
【請求項９】
請求項１に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記モノクローナル抗体が３Ｇ７または２Ｃ６である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
試料においてＯＦＡ／ｉＬＲＰを検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの領域に特異的に結合する第１の抗体および第２の抗体と接触させるステップであって、前記抗体の少なくとも一方がＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的である、ステップ、
（ｂ）前記抗体をＯＦＡ／ｉＬＲＰに結合させ、ＯＦＡ／ｉＬＲＰとのサンドイッチを形成させるステップ、ならびに
（ｃ）ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な前記抗体を用いて、前記試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲの発現を検出するステップ
を含む、方法。
【請求項１４】
前記抗体の一方が、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよび成熟ＬＲＰの両方に結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がＯＦＡ／ｉＬＲＰおよび成熟ＬＲＰの両方を認識し、捕捉抗体として働き、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な前記抗体が検出抗体として働く、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の抗体が３Ｇ７であり、前記第２の抗体が２Ｃ６である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
試料において癌を検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体と接触させるステップ、
（ｂ）前記試料を、ビオチン化された二次抗体と接触させるステップ、および
（ｃ）ストレプトアビジンを用いて、前記試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰを検出するステップ
を含み、前記試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰの検出が癌を示す、方法。
【請求項１８】
試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を決定する方法であって、
（ａ）ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体をフルオロフォアに結合体化させるステップ、
（ｂ）結合体化した前記抗体を試料と接触させるステップ、および
（ｃ）蛍光偏光を用いて、前記試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項１９】
血液試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞の量を決定する方法であって、
（ａ）血液試料を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体と接触させるステップ、および
（ｂ）フローサイトメトリーを用いて、前記試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項２０】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を治療する方法であって、前記ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を治療するために十分な量である、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的なある量の抗体を、前記癌を有する被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項２１】
前記抗体が、抗癌特性を有するコロイドに連結している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が化学療法剤と結合体化している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体がタンパク質と結合体化している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
被験体においてＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を検出する方法であって、
（ａ）ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体を、放射線不透過性の染料に結合体化させるステップ、
（ｂ）結合体化した前記抗体を被験体に投与するステップ、および
（ｃ）ｘ線を用いて、結合体化した前記抗体を検出するステップ
を含み、前記ｘ線によるＯＦＡ／ｉＬＲＰの検出が癌を示す、方法。
【請求項１】
癌胎児抗原／未熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）の免疫原性である領域に特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項２】
前記免疫原性領域が、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの二量化領域に位置する、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰの前記領域が、（ａ）ＦＦＲＥＰＲＬＬＶＶＴＤＰＲ、（ｂ）ＶＴＤＰＲＡＤＨＱＰＬＴＥ、（ｃ）ＹＲＤＰＥＥＩＥＫＥＥＱ、または（ｄ）ＦＰＴＥＤＷＳＡＱＰＡＴＥＤのポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項４】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰの前記領域が、免疫原性応答を増大させるペプチドに結合体化している、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項５】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰが、キーホールリンペットヘモシアニン、オボアルブミン、または血清アルブミンに結合体化している、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項６】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が２Ｃ６または３Ｇ７である、請求項６に記載の単離された抗体。
【請求項８】
前記領域が、ＦＲＥＰＲＬＬＶＶＴＤＰＲＣまたはＹＲＤＰＥＥＩＥＫＥＥＱＣのポリペプチド配列を含む、請求項６に記載の単離された抗体。
【請求項９】
請求項１に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記モノクローナル抗体が３Ｇ７または２Ｃ６である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
試料においてＯＦＡ／ｉＬＲＰを検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの領域に特異的に結合する第１の抗体および第２の抗体と接触させるステップであって、前記抗体の少なくとも一方がＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的である、ステップ、
（ｂ）前記抗体をＯＦＡ／ｉＬＲＰに結合させ、ＯＦＡ／ｉＬＲＰとのサンドイッチを形成させるステップ、ならびに
（ｃ）ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な前記抗体を用いて、前記試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲの発現を検出するステップ
を含む、方法。
【請求項１４】
前記抗体の一方が、ＯＦＡ／ｉＬＲＰおよび成熟ＬＲＰの両方に結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がＯＦＡ／ｉＬＲＰおよび成熟ＬＲＰの両方を認識し、捕捉抗体として働き、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な前記抗体が検出抗体として働く、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の抗体が３Ｇ７であり、前記第２の抗体が２Ｃ６である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
試料において癌を検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体と接触させるステップ、
（ｂ）前記試料を、ビオチン化された二次抗体と接触させるステップ、および
（ｃ）ストレプトアビジンを用いて、前記試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰを検出するステップ
を含み、前記試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰの検出が癌を示す、方法。
【請求項１８】
試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を決定する方法であって、
（ａ）ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体をフルオロフォアに結合体化させるステップ、
（ｂ）結合体化した前記抗体を試料と接触させるステップ、および
（ｃ）蛍光偏光を用いて、前記試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項１９】
血液試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌細胞の量を決定する方法であって、
（ａ）血液試料を、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体と接触させるステップ、および
（ｂ）フローサイトメトリーを用いて、前記試料におけるＯＦＡ／ｉＬＲＰの量を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項２０】
ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を治療する方法であって、前記ＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を治療するために十分な量である、ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的なある量の抗体を、前記癌を有する被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項２１】
前記抗体が、抗癌特性を有するコロイドに連結している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が化学療法剤と結合体化している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体がタンパク質と結合体化している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
被験体においてＯＦＡ／ｉＬＲＰ陽性癌を検出する方法であって、
（ａ）ＯＦＡ／ｉＬＲＰに特異的な抗体を、放射線不透過性の染料に結合体化させるステップ、
（ｂ）結合体化した前記抗体を被験体に投与するステップ、および
（ｃ）ｘ線を用いて、結合体化した前記抗体を検出するステップ
を含み、前記ｘ線によるＯＦＡ／ｉＬＲＰの検出が癌を示す、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５２２０１７（Ｐ２０１２−５２２０１７Ａ）
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０２３１３（Ｐ２０１２−５０２３１３）
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８９４８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１６７１
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５１１２３２４８８）クアンタム イミュノロジクス， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８９４８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１６７１
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５１１２３２４８８）クアンタム イミュノロジクス， インコーポレイテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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